JP2001505055A - Inactivation of HIV co-receptors as a treatment for HIV infection - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＨＩＶ−１感染の治療および／もしくは予防のための組成物および方法を提供する。とりわけ、本発明は、ＨＩＶのその標的細胞への結合に必要なコレセプターの細胞表面の発現を予防するための新規組成物および方法を使用する。   (57) [Summary] The present invention provides compositions and methods for treating and / or preventing HIV-1 infection. In particular, the present invention uses novel compositions and methods for preventing cell surface expression of co-receptors required for binding of HIV to its target cells.

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ感染の治療としてのＨＩＶコレセプターの不活性化 発明の背景 １．発明の分野 本発明は一般的にはＨＩＶ感染の分野に関する。より具体的には、それは、Ｈ ＩＶ感染の治療のための新規方法および組成物、ならびにＨＩＶ抵抗性を与える 方法に関する。 ２．関連技術の記述 ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）感染は先進国および発展途上国双方 の世界中で報告されてきた。ＨＩＶ−２感染は主として西アフリカ、ポルトガル およびブラジルで見出される。1990年時点で、米国に800,000と130万人との間の ＨＩＶに感染した個体が存在したと推定される。ＨＩＶに対するワクチン開発に 対する重要な障害物は、ＨＩＶ感染に対する免疫の機構が誤って理解されている ことである。感染した個体の全部が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症し ないであろう。実際、最近の報告は、ＨＩＶ−１感染に抵抗性である、ある一定 の個体が存在しうることを示唆している。 Ｃ−Ｃケモカインレセプター（ＣＣＲ）−５は、マクロファージ（Ｍφ）向性 のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１の主要なコレセプター(co-receptor)で ある（コッキ(Cocchi)ら、Science、270:1811-1815、1995；テン(Deng)ら、Natu re、381:661-666、1996；ドラジック(Dragic)ら、Nature、381:667-673、1996； アルカチブ(Alkhatib)ら、Science、272:1955-1958、1996；チョウ(Choe)ら、Ce ll、85:1135-1148、1996；ドランズ(Doranz)ら、Cell、85:1149-1158、1996）。 いくつかの最近の 研究は、ＣＣＲ５のホモ接合の欠損をもつ個体が、ＣＣＲ５欠損に関連した明ら かな臨床状態を伴わずにＨＩＶ−１感染に抵抗性であることを示した。ヘテロ接 合のＣＣＲ５欠損をもつＨＩＶ−１に感染した個体はより遅い疾患の進行を表わ す（リウ(Liu)ら、Cell、86:367-377、1996；サムソン(Samson)ら、Nature、382 :722-725、1996；ディーン(Dean)ら、Science、273:1856-1862、1996）。加えて 、そのリンパ球が高レベルのＣＣ−ケモカインを発現する若干の個体はＨＩＶ− １感染に部分的に抵抗性である（パクストン(Paxton)ら、Nature Med.、2:412-4 17、1996）。 前述のデータに照らせば、Ｃ−ＣレセプターへのＨＩＶ−１の結合を防止し、 そしてそれにより細胞のＨＩＶ−１感染を予防することが治療上有益であるとみ られる。これを達成するための一方法はレセプターの細胞表面の発現を予防する ことであるとみられる。タンパク質の発現の阻止を試みる多数の方法が存在する 。これらは、相同的組換え、アンチセンスおよびリボザイム技術、ならびに細胞 内でタンパク質を結合する一本鎖抗体を包含する。これらの技術のそれぞれは特 定の欠点を有する。相同的組換え技術は臨床応用で使用することが困難である一 方、アンチセンスおよびリボザイム技術は高濃度の遺伝子物質の導入を必要とし 、また、不完全かつ非特異的な効果を提示する。モノクローナル抗体のアプロー チは開発するのに長い時間がかかり、また、抗体が特異的すぎるかも知れず、従 って十分に幅広い阻害を達成することができないというさらなる複雑な状況を有 する。 従って、リンパ球がＨＩＶに細胞を感染させる機会を与えないように、Ｃ−Ｃ ケモカインレセプターがそれらの細胞表面で発現されることを防 止するための容易な効率的な技術が必要とされることが明確である。 発明の要約 本発明は、ＨＩＶ感染の治療もしくは予防およびＡＩＤＳもしくはＡＲＣ患者 での日和見感染の予防もしくは治療における使用のための組成物および方法を提 供することにより、従来技術における一定の欠点を克服することを探求する。本 発明は発現されたコレセプターの欠如によりＨＩＶ感染に抵抗性であるリンパ球 を提供する。コレセプターとは、これもまたＨＩＶ−１感染に必要であるＣＤ４ レセプター以外のＨＩＶ感染に必要であるリンパ球表面上のレセプターを意味す る。本発明の一態様では、ＨＩＶ感染に抵抗性である健全なリンパ球が患者に提 供されることができ、従ってＨＩＶ感染の間、所望の免疫細胞レベルを維持し、 こうして患者が二次感染に抵抗するのを助ける。本明細書で開示される組成物お よび方法は、所望の白血球レベルを維持することにより、ウイルス複製を阻害す るよう設計されているＡＺＴおよび／もしくはプロテアーゼ阻害剤のような他の 治療形態とともにとりわけ有効であることができる。これは、事実上、患者に抗 ウイルス療法が有効となるのに必要な時間を買う。 本発明はある幅広い局面で発現ベクターとして記述されることができ、その発 現領域は、５’から３’の向きで、プロモーター；細胞内残留シグナル配列(int racellular retention signal sequence)をコードする領域；およびケモカイン をコードする遺伝子を含んで成り；細胞内残留シグナル配列およびケモカインを コードする遺伝子は単一のイントラカイン(intrakine)転写物として発現される 。「イントラカイン」という用語は、小胞体の内腔、ゴルジ装置、リソゾーム、 細胞内小胞もしくは 他の細胞内オルガネラのような細胞内区画に保持されることがシグナル配列によ り指図されるケモカインを示すために本発明者により造り出された。本発明のベ クターは、好ましくは内部リボソーム進入部位(internal ribosome entry site) （ＩＲＥＳ）から発現される分泌性ケモカインもまたコードしうる。分泌された ケモカインは、好ましくは、発現されたイントラカインと同一のケモカインレセ プターに結合する。こうして、コレセプターの表現型のノックアウトのためＨＩ Ｖ感染に抵抗性となる形質導入された細胞は、コレセプター結合についてＨＩＶ と競争するケモカインを分泌することにより、形質導入されない感受性の細胞の 感染を阻害することもまた可能である。分泌性ケモカインおよび／もしくはイン トラカインは、レセプター結合を維持するがしかし生物学的活性を欠く突然変異 が誘発された形態のケモカインであってもまたよい。８アミノ酸がＮ末端から欠 失されるこうしたケモカイン類似物がアレンザナ・セラデドス(Arenzana-Selade dos)ら、Nature、383:400、1996（引用により本明細書に組み込まれる）により 記述される。本発明の実務において、Ｎ末端アミノ酸の１個もしくはそれ以上が 、こうしたケモカイン類似物を得るために欠失されてよい。 本発明の好ましい発現ベクターはレトロウイルスベクターであるが、しかし、 当該技術分野で既知のいずれの型のベクターも使用されてよい。例えば、アデノ ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、リポ ソーム被包化ＤＮＡもしくはＲＮＡさえ、本発明の実際に際して使用してよい。 発明者は、本明細書で小胞体残留シグナル配列の使用を立証したが、しかしなが ら、翻訳産物を上述されたような細胞内オルガネラに向けるいずれかのシグナル 配列が使用されてよ い。好ましいシグナル配列はＫＤＥＬ配列である。 本発明の発現ベクターは、好ましくは、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプター、Ｃ− Ｃケモカイン３レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターもしくはＣＸＲ４レ セプターに結合するケモカイン遺伝子産物をコードする。好ましいケモカインは ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはＳＤＦを包含するがしかしこれらに制限さ れない。 本発明は、ある幅広い局面で、細胞でのケモカインレセプターの表現型の発現 の阻害方法としてもまた記述されることができ、当該方法はケモカインレセプタ ーの細胞表面の発現を封鎖することを含んで成る。本方法は、５’から３’の向 きで、プロモーター、細胞内残留シグナル配列およびケモカインレセプター結合 ポリペプチド遺伝子をコードする核酸区分を含むベクターを得ること；そしてそ のベクターを細胞中に形質導入すること、の段階を含むこととさらに定義される ことができ；当該ベクターは細胞中に形質導入される場合に核酸配列を発現して 融合ポリペプチドを産生する。発現されるポリペプチドは、ケモカイン、８個ま でのアミノ酸のＮ末端欠失を伴うケモカインのようなケモカイン類似物、一本鎖 抗体のような抗体、もしくはレセプターを結合するペプチドであってよい。本発 明の実際に際して、当該技術分野で公知の技術を使用して、ペプチド発現ライブ ラリーから、例えば本明細書に記述されるケモカインレセプターを結合すること が可能であるペプチドを単離しうる。本明細書に記述されるような、細胞内オル ガネラにペプチド／レセプターを向けるリーダー配列との融合のような、既知の もしくは新規に発見されたかのいずれかのペプチドのいずれかの発現が、本発明 により包含されるとみられる。好ましいポリペプチドは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ −１α、 ＳＤＦ、ＨＩＶ ｇｐ１２０もしくはＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域を包含する 。 ある幅広い局面において、本発明は、細胞でのＨＩＶコレセプターの表現型の ノックアウトを含む細胞のＨＩＶ感染の阻害方法として記述されうる。本方法の 実務に際して、当該コレセプターは、好ましくは、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプタ ー、Ｃ−Ｃケモカイン３レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターもしくはＣ ＸＲ４レセプターである。表現型のノックアウトは、アンチセンス発現、ゲノム 組換えのような当該技術分野で既知のいずれかの方法、もしくは、好ましくは細 胞中で細胞内残留シグナル配列に融合されたレセプター結合ポリペプチドを発現 することによることができる。本方法の実務において、細胞内残留シグナル配列 は、融合ポリペプチドを、小胞体、ゴルジ装置、リソゾームもしくは細胞内小胞 または他の細胞内オルガネラに向ける。こうした方法の実務において、ベクター は、ウイルスベクター、もしくは例えばレトロウイルスベクターでさえあってよ く、また、細胞は、リンパ球、単球、マクロファージもしくは幹細胞であってよ い。好ましい細胞内残留シグナル配列はＫＤＥＬ配列のような小胞体シグナル配 列である。本方法のレセプター結合ポリペプチドは、好ましくは、ＣＣ−ケモカ イン、ＣＸＣケモカイン、ＣＣもしくはＣＸＣケモカインの類似物、一本鎖抗体 、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域、もしくはレ セプターに結合するペプチドである。 当該方法の例示的一態様においては、細胞が、内在性ＣＣレセプター、とりわ けＣＣＲ５、ＣＣＲ３もしくはＣＣＲ１レセプターの輸送および表面の発現を細 胞内で封鎖するために、小胞体（ＥＲ）残留シグナルに 融合されたＣＣ−ケモカイン遺伝子で形質導入される。代替の例示的一態様にお いては、細胞が、内在性ＣＸＲ４レセプターの輸送および表面の発現を細胞内で 封鎖するために、小胞体（ＥＲ）残留シグナルに融合されたＣＸＣ−ケモカイン 遺伝子で形質導入される。 本発明の別の幅広い局面は、対象にリンパ球、単球、マクロファージもしくは 幹細胞を投与することを含む、対象におけるＨＩＶ感染の治療方法であって、投 与された細胞はＨＩＶコレセプターの表現型のノックアウトを表わす。当該方法 の好ましい一態様においては、細胞が、新たに発現されたベクターを結合しかつ それを本明細書に記述されるような細胞内オルガネラ中に保持することが可能で あるポリペプチドを発現するベクターでエクスビボで形質導入される。当該細胞 は、好ましくは、自己のリンパ球、マクロファージ、単球、幹細胞もしくは異種 の幹細胞でさえあってよい。代替の一態様において、細胞はコレセプターの発現 を封鎖するのに有効なアンチセンスＲＮＡを発現しうる。 本発明の一態様はまた、本明細書で記述されるような本発明のベクターで形質 導入されたリンパ球、単球、マクロファージもしくは幹細胞を含む製薬学的組成 物を対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染の対象での白血球（ＷＢＣ）数の増 大もしくは維持方法でもある。当該方法の実務において、ＷＢＣ数は定期的にモ ニターされることができ、そしてその数がある臨界的なすなわち危険な(dangero us)レベルより下に下落する場合には、本発明の形質導入された細胞がＷＢＣ数 を所望のレベルより上に保つのに有効な量で投与されるとみられる。当該細胞は 必要とされるように数週間ないし数ヶ月ごとに再投与されるとみられる。製薬学 的組成物での細胞の静脈内注入は当該技術分野で公知であり、そして本 開示に照らして熟練した開業医により実施され得る。 図面の簡単な説明 以下の図面は本明細の一部を形成し、かつ、本発明のある局面をさらに例証す るために包含される。本発明は、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記述 と共同したこれらの図面の１個もしくはそれ以上の参照により、より良好に理解 されうる。 図１。ＣＣＲ５を表現型上でノックアウトするための戦略の概略図。リンパ球も しくは幹細胞は、細胞内で結合しかつ新規に合成されたＣＣＲ５の輸送および表 面の発現を防止する、小胞体（ＥＲ）の内腔にターゲッティングされた突然変異 されたケモカインを共発現するように遺伝子的に改変される。当該細胞は、感受 性細胞のＨＩＶ−１感染を競争的に阻害するために細胞から分泌されるべき天然 のケモカインもまた共発現する。結果として、表現型のＣＣＲ５ノックアウトで 形質導入された細胞は、ＨＩＶ−１感染に対し抵抗性であるのみならず、しかし またケモカインも産生して感受性細胞でのＨＩＶ−１感染を細胞外で阻害する。 図２。発現ベクターの構築の概略表示。ヒトＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの ｃＤＮＡ遺伝子、ならびにＥＲ残留シグナル（ＫＤＥＬ）を含有するそれらの誘 導体を、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インヴィトロジェン(Invitrogen)）にクロー ニングした。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を使用する天然のおよび 突然変異されたケモカインの共発現のためのバイシストロニック(bi-cistronic) ベクター（チェン(Chen)ら、Human Gene Ther.、7:1515-1526、1996）を構築し 、そしてレトロウイルスベクター（ｐＬＮＣＸ）（ミラー(Miller)、Curr．Top ．Microbiol．Immunol.、158:1-24、1992）にさらにクローニングした。ＣＣＲ ５の Ｎ末端に融合された短いインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）標識配列（ＹＰ ＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１）（フィールド(Field)ら、Mol．Cell．Biol.、8:2 159-2165、1988）を含有するキメラ構築物（リウ(Liu)ら、1996）もまた生じさ せた。Ψ、パッケージング配列。 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄ。ＥＲに保持されたＭＩＰ１−ＫによるＣ ＣＲ５の表面の発現の封鎖。６穴プレート上のＣＯＳ細胞を、2.5μgのｐＣＭＶ −ＨＡ−ＣＣＲ５単独でトランスフェクションしたか（図３Ｂ）、もしくは、多 様な量のｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋとともにコトランスフェクションした（図３Ｃ および図３Ｄ）。48時間後に、トランスフェクションされた細胞の懸濁液を抗Ｈ Ａ抗体（ＢＡｂＣｏ、カリフォルニア州リッチモンド）とともにインキュベーシ ョンし、そしてその後抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合物（シグマ(Sigma)）で染 色した。ＣＯＳ細胞を陰性対照として第二抗体結合物とともに直接インキュベー ションした（図３Ａ）。 図３Ｅ。ＣＣＲ５仲介性のシンシチウム形成の阻害。６穴プレート上で成長され たＨｅＬａ−Ｔ４⁺細胞を、２μgのｐＣＭＶ−ＣＣＲ５単独でトランスフェクシ ョンしたか、もしくは多様な量のケモカイン発現ベクターとともにコトランスフ ェクションした。48時間後に、トランスフェクションされた細胞をＭφ向性（Ａ ＤＡもしくはＹＵ２）またはＴ向性のエンベロープタンパク質（IIIＢ）を発現 するＣＯＳ細胞と共培養し、そして各ウェル（複製物）中のシンシチウムを12な いし24時間後に計数した。シンシチウム形成の阻害のパーセントを提示する。Ａ ＤＡおよびＹＵ２のシンシチウム形成はＭＩＰ１−ＫおよびＲＡＮＴＥＳ−Ｋの イントラカインにより効果的に阻害されたが、しかし、Ｔ向性のエンベロ ープ仲介性のシンシチウム形成はこれらのイントラカインにより阻害されなかっ た。 図４Ａ。発現ベクターの構築の概略表示。マウス脾のｃＤＮＡライブラリーから のＳＤＦ−１遺伝子をＥＲ残留シグナル（ＫＤＥＬ）をコードする配列に融合し 、そしてｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インヴィトロジェン(Invitrogen)）にクロー ニングした。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列（チェン(Chen)ら、1996 ）を使用して天然のおよび突然変異されたケモカインの共発現のためのバイシス トロニックベクターを構築し、そして、レトロウイルスベクター（ｐＬＮＣＸ） （ミラー(Miller)、1992）にさらにクローニングした。フューシン(fusin)（Ｃ ＸＣＲ４）（リウ(Liu)ら、1996）のＮ末端に融合された短いインフルエンザヘ マグルチニン（ＨＡ）標識配列（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１）（フィール ド(Field)ら、1988）を含有するキメラ構築物もまた生じさせた。Ψ、パッケー ジング配列。 図４Ｂ。ＥＲにターゲッティングされたＳＤＦで形質導入された場合の形質導入 されたリンパ球のＴ向性のＨＩＶ−１感染に対する抵抗性。菱形、ＪＫ−ＣＴＲ Ｌ；四角、ＪＫ−ＳＤＦ−ＫＤＥＬ；三角、ＪＫ−ＳＤＦ。 具体的に説明する態様の記述 本発明はＨＩＶ−１感染の治療および予防方法を提供する。とりわけ、本発明 は、Ｃ−Ｃケモカインレセプターの細胞表面の発現の新規防止方法を使用し、そ れによりＨＩＶのその標的細胞への結合を予防する。本発明は、ＨＩＶ感染の治 療および管理での使用のための新規組成物もまた提供する。 表現型のＣＣＲノックアウトはイントラカインを発現するようにリンパ球を遺 伝子的に改変することにより達成され得、これはＭφ向性のＨＩＶ−１感染に対 する許容性細胞の抵抗性をもたらす。この新規の抗ＨＩＶのアプローチの重大な 利点は以下のように概説される。すなわち、ＨＩＶ−１感染および疾患の進行に おけるＣＣＲ５の十分に証拠書類が提供された重要性、ならびにＣＣＲ５発現の 欠損に関連する不利な臨床状態の欠如を考えれば、表現型のＣＣＲ５ノックアウ トを伴う遺伝子的に改変されたリンパ球もしくは幹細胞の再注入は、個体がＨＩ Ｖ−１感染に部分的にもしくは完全に抵抗することを可能にすることができ、そ して疾患の進行を予防するもしくは遅延させることができる。 現在記述される抗ＨＩＶのアプローチは、主として、アンチセンス構築物、リ ボザイム、優性の負の突然変異体(dominant negative mutant)、イントラボディ (intrabody)もしくはＥＲに保持されるＣＤ４により、ウイルスのエンベロープ タンパク質、Ｔａｔ、Ｒｅｖもしくは逆転写酵素（ＲＴ）のようなウイルス成分 に標的を定められる。抗ＨＩＶ治療に直面する主要な問題は、ウイルス抵抗性を もたらす頻繁なウイルスの突然変異である。対照的に、本明細書に記述される新 規の抗ＨＩＶのアプローチは、細胞のレセプターに唯一標的を定められる。結果 として、頻繁なＨＩＶの突然変異はこの戦略をかわすことが不可能でありうる。 ＣＤ４レセプターは機能上欠くことができず、そして従ってこの戦略に適切な標 的でないことが注意されるべきである。 イントラカインは、ＣＣＲ５のみならず、しかしまたいくつかのＨＩＶ−１ウ イルスのコレセプターとしてもまた報告されたＣＣＲ３およびＣＣＲ１も封鎖し 、ＨＩＶ−１に対する幅広い効果を示唆する。加えて、 分泌性ケモカインによる感受性細胞の細胞外阻害と組み合わせられた表現型のＣ ＣＲノックアウトは相乗的抗ＨＩＶ効果を有することが企図される。本発明のさ らなる利点は、本アプローチが他の遺伝子治療のアプローチより少なく技術的に 挑戦的であることである。ヒトリンパ球でのＣＣＲ５発現は非常に低く（すなわ ちそれは放射標識で検出され得ない）、そして従って現在使用される発現ベクタ ーにより達成可能なイントラカインの発現レベルはＣＣＲ５を不活性化するのに 十分であることが期待される。 遺伝子治療に直面する別の潜在的問題は、外来タンパク質を発現する遺伝子的 に改変された細胞を破壊する宿主の免疫応答（細胞傷害性Ｔ細胞）である。しか しながら、本開示におけるようなヒトケモカインを発現する形質導入された細胞 は新たな抗原を生じないとみられる。加えて、本アプローチは、Ｔ向性のＨＩＶ −１のコレセプターのような他のレセプターを表現型上でノックアウトするのに 使用され得る（フェン(Feng)ら、Science、272:872-877、1996）。従って、本明 細書に記述されるような本新規戦略はＨＩＶ−１感染に有効な遺伝子治療を提供 する。 １．ヒト免疫不全ウイルス ＨＩＶは、それが逆転写酵素を含有するためレトロウイルスとして分類される 。ＨＩＶでの細胞の感染は通常細胞死をもたらす。ＨＩＶは、２個の主要な抗原 型、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を提示し、これらはエンベロープ糖タンパク質 に対する抗体反応性の差異により容易に区別可能である。ＨＩＶ−１およびＨＩ Ｖ−２は約40％の相同性を共有する。ＨＩＶ−１はＨＩＶ−２よりもＡＩＤＳの 発生でより効率的であることが報告されている。 ＨＩＶ感染の第一段階は、Ｔ４細胞、単球−マクロファージ、樹状細胞(dendr iditic cell)および中枢神経系の細胞を包含する多くの細胞型の表面上に存在す るＣＤ４レセプターへのｇｐ１２０糖タンパク質の高親和性結合である。ＣＤ４ レセプターに対するＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質の高親和性はＨＩＶの病 因の決定的段階である。なぜなら、ＣＤ４を発現する主要な細胞は標的細胞であ るからである（ダルグライシュ(Dalgleish)ら、1984；クラーツマン(Klatzmann) ら、1984；マドン(Maddon)ら、1986）。Ｔ４リンパ球細胞は免疫系の全局面で中 枢の役割を演じるため、Ｔ４リンパ球の機能の死もしくは減損は破局的な免疫機 能不全をもたらす。 ＨＩＶ感染がＴ４細胞の機能の破壊に直接つながりうるいくつかの様式が存在 する。ＨＩＶの複製はウイルスタンパク質による細胞膜の破壊の結果としてＴ４ 細胞を殺しうる。あるいは、大量のウイルスの遺伝子物質およびタンパク質の産 生が正常な細胞代謝を妨害することができ、そして最後には、ＨＩＶはリンパ様 細胞のプールの増殖の原因である前駆細胞もまた感染させかつ破壊することがで きる。 ＨＩＶ感染はまたＴ４細胞死も間接的に引き起こしうる。１個のこうした機構 において、抗ＨＩＶ免疫応答が未感染のＴ４細胞（遊離のエンベロープタンパク 質をそれらの膜に結合させるかもしくはプロセシングされた抗原を提示するかの いずれかである）に標的を定められる自己免疫現象が誘発されることが考えられ る。付加的には、ＨＩＶエンベロープタンパク質およびクラスIIの主要組織適合 遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原の双方がＣＤ４レセプターに結合するため、それら の共通の結合部位は交差反応性の抗原を表わしうる。従って、抗ＨＩＶ抗体はク ラスIIＭ ＨＣ分子を発現する未感染のＴ４細胞と反応しうる。また、抗ＨＩＶ免疫エフェ クター細胞が多くの感染した細胞を殺すことがありうる。 単球−マクロファージはインビボおよびインビトロ双方でＨＩＶ感染の標的で ある。感染はＣＤ４レセプターによりもしくは食作用を介して起こりうる。Ｔ４ 細胞と異なり、単球マクロファージは細胞溶解に抵抗性であるようである。ウイ ルスは単球マクロファージで細胞内で複製することが可能であり、ビリオンが細 胞質内小胞中に出芽する。結果として、ウイルス抗原は細胞表面で発現されるこ とができず、それにより単球−マクロファージが免疫監視を逃れることおよび感 染を他の器官に伝達することを可能にする。 感染の全段階でＨＩＶに対する広範な免疫応答が存在する。ＨＩＶ感染の経過 全体で産生される抗体、およびその後のＡＩＤＳの症状発現は、この持続性感染 症の進行の停止で無効なようである。疾患の進行の間のインビボでのＨＩＶの遺 伝子の変異型(variant)の発現は、ＨＩＶが体液性および細胞性の免疫応答をか わす一様式であるらしい。 ヒトの感染を開始ししそして感染の経過を通じて持続する大部分の一次ＨＩＶ −１ウイルスは、末梢血単核細胞中で低レベルまで複製するが、しかし不死化さ れたＴ細胞系で複製しない（シュートメイカー(Schuitemaker)ら、1991、1992； コナー(Conner)ら、1993；コナー(Conner)とホー(Ho)、1994aおよび1994b）。こ れらのウイルスは本明細書でマクロファージ向性一次単離物と称される。若干の ＨＩＶ−１に感染した個体においては、ＰＭＢＣ中でより高レベルまで複製しそ して不死化されたＣＤ４細胞系で感染させ得かつシンシチウムの形成を誘導し得 るウイルスが、感染の経過の後期に出現する（シュートメイカー(Schuitemaker) ら、19 92；コナー(Conner)ら、1993；コナー(Conner)とホー(Ho)、1994aおよび1994b） 。これらはＴ細胞系向性一次ウイルスと称される。 ２．ケモカインレセプター ＨＵＭＳＴＳＲ、ＬＣＲ−１もしくはＬＥＳＴＲと多様に命名されておりかつ ある範囲の非ヒトのＣＤ４発現細胞に感染および細胞融合を支持させることが示 されているレセプターが存在する。それはまた「フューシン(fusin)」とも命名 されている。本レセプターは本明細書でＣＸＲ４ともまた称される。ＨＵＭＳＴ ＳＲに対する抗体は、実験室で適合されたＨＩＶ−１単離物による融合および感 染を封鎖するがしかしマクロファージ向性一次ウイルスによるものを封鎖しない ことが示されている。 マクロファージ向性一次単離物（しかし実験室で適合された単離物でない）に よる感染が、β−ケモカイン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β により阻害され得ることがさらに観察されている（コッキ(Cocchi)ら、1995）。 β−ケモカインの高い内因性の発現が、血清陽性のパートナーに曝露されている 未感染の個体からのＣＤ４+Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染に対するインビトロの抵抗 性の原因であることが示唆されている（パクストン(Paxton)ら、1996）。この抵 抗性はマクロファージ向性ウイルスからのみ見られかつＴ細胞系向性ウイルスか ら見られず、また、ｇｐ１２０の構造により影響された。ＣＤ４以外でかつＨＵ ＭＳＴＳＲと別個の最低１種の他の宿主細胞表面分子が一次マクロファージ向性 ＨＩＶ単離物の進入を助長すること、および、この因子がβ−ケモカインとの相 互作用により影響されうることが示唆された。 Ｇタンパク質と結合されたレセプターは、多様な化学誘因物質、神経 伝達物質、ホルモンなどに応答する。ヘテロ三量体のＧタンパク質によりそれら のシグナルを形質導入する７回膜貫通レセプターがケモカインに応答するために 白血球により使用される（ホルク(Horuk)、1994）。ケモカインは構造的に関係 したペプチドの一族であり、これらは、炎症性損傷に白血球を召集し、顆粒球か らの顆粒内容物の回転(reels)を誘導し、インテグリンのアビディティーを調節 しそして前炎症の特性を表わす。 αケモカインすなわちＣＸＣケモカインは好中球上で作用する一方、β−ケモ カインすなわちＣＣ−ケモカインは、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球上 で作用する（バッジョリーニ(Baggiolini)ら、1994；シャール(Schall)とベーコ ン(Bacon)、1994）。従って、ＣＣケモカインレセプターは、潜在的に、ＨＩＶ −１の既知の向性と矛盾しない組織分布を表わす。多数の緊密に関係したＣＣケ モカインレセプターが存在し、その５種がリガンド結合アッセイにより特徴づけ られている。これらはＣＣＲ１、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４ およびＣＣＲ５と呼称される。 ＣＣＲ−５は７回膜貫通糖タンパク質であり、これはＥＲで合成されかつ分泌 経路により血漿膜に輸送される（サムソン(Samson)ら、Biochemistry、35:3362- 3367、1996；シュトラダー(Strader)ら、1994）。ＣＸＲ４は７回膜貫通糖タン パク質であり、これはＥＲで合成されかつ血漿膜に輸送され、ここでＣＸＲ４は そのリガンドもしくはＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質を高親和性で結合す る（シュトラダー(Strader)ら、1994）。 ３．イントラカインポリペプチド マクロファージ、リンパ球および他の細胞により産生されかつそれらのレセプ ター（ＣＣＲ−５、−３および−１）を高親和性で結合するケモカイン、ＲＮＡ ＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β（ネオテ(Neote)ら、Cell、72:415-42 5、1993；シャール(Schall)ら、J．Immunol.、141:1018-1025、1988；ゴング(Go ng)ら、J．Biol．Chem.、271:10521-10527、1996）は、とりわけマクロファージ 向性の単離物でＨＩＶ−１感染を抑制することが示されている。抑制性のＣ−Ｃ ケモカインは、マクロファージ向性のＨＩＶ−１単離物のケモカインレセプター に結合し、従って対応するｅｎｖ糖タンパク質により仲介される融合を阻害する ことにより、それらの感染阻害活性を発揮すると考えられる。 従って、ＲＮＡＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βはインビトロでのマ クロファージ向性感染の強力な阻害剤である。それらは、ＨＩＶ−１に感染した 個体からのＣＤ８+細胞および長期の高リスクの血清陰性の個体から得られたＣ Ｄ４+細胞により上昇されたレベルで産生され、そして、エクスビボでＨＩＶ− １感染に抵抗性であると考えられる。 ＳＤＦ−１はＣＸＣ−ケモカインの一構成員であり、そして骨髄由来の間質細胞 により構成的に発現される（ナガサワ(Nagasawa)、PNAS、1994；タシロ(Tashiro )、Science、1993）。ＳＤＦ−１は最近、フューシン／ＣＸＲ４の生物学的リガ ンドとして同定され、これはＴ向性のＨＩＶ−１ウイルスのコレセプターである （ネオテ(Neote)ら、1993；シャール(Schall)ら、1988；ゴング(Gong)ら、1996 ）。 ＥＲにターゲッティングされたイントラボディもしくは他の分子の細胞内結合 による膜タンパク質の細胞表面の発現の封鎖が、発明者および他者の研究（マラ スコ(Marasco)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、90: 7889-7893、1993；チェン(Chen)ら、Exp．Opin．Invest．Drugs）4:823‐833、1 995a；チェン(Chen)ら、Human Gene Therapy、5:595-601、1995b；ブオノコア(B uonocore)とローズ(Rose)、Nature、345:625-628、1990）で立証されている。ケ モカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＳＤＦ−１は、発明者により、Ｃ− Ｃケモカインレセプターの細胞表面の発現を封鎖するのに使用された。 本発明は、リガンドが小胞体にターゲッティングされうるようにケモカインレ セプターのリガンドを変えることを企図する。これらの分子は本明細書でイント ラカインと命名される。「イントラカイン」により、細胞表面でＣ−Ｃケモカイ ンレセプターに結合するがしかしリンパ球のＥＲもしくは他の細胞内オルガネラ にターゲッティングされるよう改変されているいずれかのリガンドが意味され、 こうしたリガンドは、ＣＣＲ５への結合についてＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、 ＭＩＰ−１β、およびＣＣＲ４への結合について間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ −１）を包含するがしかしこれらに制限されない。 ４．イントラカインをコードするポリヌクレオチド 本発明のポリヌクレオチドは、イントラカイン遺伝子全体、機能性のイントラ カインタンパク質ドメイン、もしくはいずれかのイントラカインポリペプチドを コードしてよい。「相補的」ポリヌクレオチドは標準的なワトソン−クリックの 相補性規則に従って塩基を対合すること(base-pairing)が可能であるものである 。すなわち、より大きなプリンはより小さなピリミジンと塩基を対合して、シト シンと対合されたグアニン（Ｇ：Ｃ）およびＤＮＡの場合はチミンと対合された アデニン（Ａ：Ｔ）もしくはＲＮＡの場合はウラシルと対合されたアデニン（Ａ ：Ｕ）のい ずれかの組み合わせを形成することができる。ハイブリダイゼーションする配列 中のイノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよ び他者のようなより少なく普遍的な塩基の包含は対合を妨害しない。 本明細書で使用されるところの「相補的配列」という用語は、それらの長さ全 体にわたって本質的に相補的でありかつ非常にほんの少数の塩基のミスマッチを 有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さ15塩基の配列は、それら が13もしくは14個の位置で相補的ヌクレオチドを有する場合に相補性と命名され てよい。もちろん、「完全に相補性」である配列は、それらの長さ全体を通じて 完全に相補的でありかつ塩基のミスマッチを有しない配列であることができる。 より低い程度の相同性をもつ他の配列もまた企図される。例えば、高相同性の 制限された領域を有するがしかし非相同領域もまた含有する遺伝子構築物（例え ばリボザイム）が設計され得る。これらの分子は、50％未満の相同性を有すると は言え、適切な条件下で標的配列に結合するとみられる。 ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ由来、すなわち特定の生物体のゲノムから 直接クローニングされてよい。しかしながら、他の態様においては、ポリヌクレ オチドは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってよい。ｃＤＮＡは鋳型としてメッセ ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されるＤＮＡである。従って、ｃＤ ＮＡはいかなる中断されたコーディング配列も含有せず、また、通常は対応する タンパク質のコーディング領域（１個もしくは複数）をほとんど独占的に含有す る。他の態様においてはポリヌクレオチドが合成的に生じられてよい。 ゲノムＤＮＡの部分をｃＤＮＡもしくは合成配列と組み合わせて特定の構築物 を生じさせることが有利でありうる。例えば、１個のイントロンが最終的構築物 で所望される場合はゲノムクローンを使用することが必要であることができる。 イントロンはイントラカインに加えて他の遺伝子由来であってよい。ｃＤＮＡも しくは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残存する部分にとってより便宜 的な制限酵素切断部位を提供することができ、そして従って配列の残部について 使用されるとみられる。 本明細書に開示される配列と異なるものを有するイントラカインの天然の変異 型が存在することが企図される。従って、本発明はイントラカインのいずれかの ポリヌクレオチド配列の使用に制限されず、しかしむしろいずれかの天然に存在 する変異型の使用を包含する。本発明はこれらの配列の化学的に合成された突然 変異体もまた包含する。 別の種類の配列の変異型はコドンの変動から生じる。20種の通常のアミノ酸の 大部分について数個のコドンが存在するため、多くの異なるＤＮＡがイントラカ インをコードし得る。以下の表の参照はこうした変異型が同定されることを可能 にすることができる。 遺伝暗号の縮重を見込めば、既知のケモカイン遺伝子のヌクレオチドと同一性 が約50％と約75％との間、もしくは約76％と約99％との間のヌクレオチドを有す る配列が好ましいであろう。「イントラカインをコードするポリヌクレオチド」 の範囲内にある配列は、細胞内の条件下で上に述べられたポリヌクレオチド区分 と塩基対をなすことが可能であるものである。 分子の定義された部分内で作成されてよくかつ許容できるレベルの同等な生物 学的活性をもつ分子をなおもたらしうる変化の数に対する制限が存在するという 概念が、生物学的に機能的同等なタンパク質もしくはペプチドの定義に固有であ ることもまた当業者により十分に理解される。生物学的に機能的同等なペプチド は、従って、アミノ酸の大部分もしくは全部ではなくあるものが置換されてよい ペプチドと本明細書で定義される。とりわけ、タンパク質のＮ末端が関係する場 合は、約16もしくはより好ましくは約５アミノ酸のみが与えられたペプチド内で 変化されてよいことが企図される。もちろん、多様な置換を伴う複数の別個のタ ンパク質／ペプチドが本発明により容易に作成されかつ使用されうる。 アミノ酸置換は一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎 水性、親水性、電荷、大きさなどを基礎とする。アミノ酸側鎖置換基の大きさ、 形状および型の分析は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが全て正に荷電し た残基であること；アラニン、グリシンおよびセリンが全て類似の大きさである こと；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが全て全般的に 類似の形状を有することを示す。従って、これらの考慮を基礎とすれば、アルギ ニン、リシンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；そしてフェ ニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン；は、本明細書で生物学的に機能 的同等物と定義される。 変化の作成ではアミノ酸のハイドロパシー指標(hydropathic index)が考慮さ れうる。各アミノ酸はそれらの疎水性および電荷の特徴を基礎としてハイドロパ シー指標を割り当てられており、これらは、イソロイシン（＋4.5）；バリン（ ＋4.2）；ロイシン（＋3.8）；フェニルアラ ニン（＋2.8）；システイン／シスチン（＋2.5）；メチオニン（＋1.9）；アラ ニン（＋1.8）；グリシン（−0.4）；トレオニン（−0.7）；セリン（−0.8）； トリプトファン（−0.9）；チロシン（−1.3）；プロリン（−1.6）；ヒスチジ ン（−3.2)；グルタミン酸（−3.5）；グルタミン（−3.5）；アスパラギン酸（ −3.5）；アスパラギン（−3.5）；リシン（−3.9）；およびアルギニン（−4.5 ）である。 タンパク質への相互に作用する生物学的機能の賦与におけるハイドロパシーア ミノ酸指標の重要性は当該技術分野で一般に理解されている（カイト(Kyte)とド ゥーリトル(Doolittle)、1982、引用により本明細書に組み込まれる）。あるア ミノ酸が類似のハイドロパシー指標もしくはスコアを有する他のアミノ酸の代わ りに用いられてよく、そして類似の生物学的活性をなお保持しうることが既知で ある。ハイドロパシー指標を基礎とした変化の作成において、そのハイドロパシ ー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものがとり わけ好ましく、そして±0.5以内のものがなおよりとりわけ好ましい。 あるアミノ酸が類似の親水性値を有する別のものの代わりに用いられ得かつ生 物学的に同等なタンパク質をなお得ることができることが理解される。米国特許 第4,554,101号に詳述されたように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当て られている。すなわち、アルギニン（＋3.0）；リシン（＋3.0）；アスパラギン 酸（＋3.0±１）；グルタミン酸（＋3.0±１）；セリン（＋0.3）；アスパラギ ン（＋0.2）；グルタミン（＋0.2）；グリシン（０）；トレオニン（−0.4）； プロリン（−0.5±１）；アラニン（−0.5）；ヒスチジン（−0.5）；システイ ン（−1.0）；メチオニン（−1.3）；バリン（−1.5）；ロイシン（−1.8）；イ ソロ イシン（−1.8）；チロシン（−2.3）；フェニルアラニン（−2.5）；トリプト ファン（−3.4）。 類似の親水性値を基礎とした変化の作成において、その親水性値が±２以内で あるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものがとりわけ好ましく、そし て±0.5以内のものがなおよりとりわけ好ましい。 部位特異的突然変異誘発。部位特異的突然変異誘発は、根底にあるＤＮＡの特 異的突然変異誘発による個々のペプチド、または生物学的に機能的同等なタンパ ク質もしくはペプチドの調製で有用な技術である。当該技術はＤＮＡ中に１個も しくはそれ以上のヌクレオチド配列変化を導入することにより前述の考慮の１個 もしくはそれ以上を組み込む配列の変異型を調製かつ試験する準備のできた能力 をさらに提供する。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列な らびに十分な数の隣接するヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド 配列の使用による突然変異体の産生が、横断されている欠失の結合部の両側で安 定な二重鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列の複雑さの一次配列を提供す ることを可能にする。典型的には、長さが約17ないし25ヌクレオチドのプライマ ーが好ましく、配列の結合部の両側の約５ないし10残基が変えられる。 一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は当該技術分野で公知である。真価を みとめられることができるように、当該技術は、典型的には、一本鎖および二本 鎖双方の形態で存在するバクテリオファージベクターを使用する。部位特異的突 然変異誘発で有用な典型的なベクターはＭ１３ファージのようなベクターを包含 する。これらのファージベクターは商業的に入手可能であり、また、それらの使 用は当業者に一般に公知であ る。二本鎖プラスミドもまた部位特異的突然変異誘発で慣例に使用され、これら は目的の遺伝子をファージからプラスミドに移す段階を排除する。 一般に、部位特異的突然変異誘発は、最初に、その配列内に所望のタンパク質 をコードするＤＮＡ配列を包含する一本鎖ベクターを得ることもしくは二本鎖ベ クターの二本の鎖を溶かす(melt)ことにより実施する。所望の突然変異された配 列をもつオリゴヌクレオチドプライマーを合成的に調製する。このプライマーを その後、一本鎖のＤＮＡ調製物とアニーリングし、そして、突然変異をもつ鎖の 合成を完了させるために大腸菌(E．coli)ポリメラーゼＩクレノウ断片のような ＤＮＡ重合酵素にかける。かようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖は 元の突然変異されない配列をコードし、そして第二の鎖は所望の突然変異をもつ 。このヘテロ二重鎖ベクターをその後使用して大腸菌(E．coli)細胞のような適 切な細胞を形質転換し、そして突然変異された配列の配置をもつ組換えベクター を包含するクローンを選択する。 部位特異的突然変異誘発を使用する選択された遺伝子の配列変異型の調製は、 潜在的に有用な種を産生する一手段として提供され、かつ、制限することを意味 されない。なぜなら、遺伝子の配列変異型が得られうる他の方法が存在するから である。例えば、所望の遺伝子をコードする組換えベクターをヒドロキシルアミ ンのような突然変異誘発剤で処理して配列変異型を得てよい。 ５．ノックアウト戦略 前述の論考に照らせば、ＨＩＶ−１感染および疾患の進行のためのＣＣＲ５の 決定的な重要性、ならびにＣＣＲ５の必須でない性質は、幹細胞もしくはリンパ 球でのＣＣＲ５のノックアウトが治療上の意味を有し うることを示唆する。本発明は、ＣＣＲ５レセプターが発現されうるリンパ球も しくは他の細胞の細胞表面でのＣＣＲ５レセプターの発現を低下、阻止もしくは ノックアウトするために、多様な方法とともに使用されてよい。これらの方法を 本明細書に下に記述する。 イントラカインのＥＲへのターゲッティング。本発明の好ましい態様において 、表現型のＣＣＲ５ノックアウトは、新規に合成されたＣＣＲ５の輸送および表 面の発現を細胞内で封鎖する小胞体（ＥＲ）残留シグナルを含有する突然変異さ れたＣＣ−ケモカイン遺伝子で細胞を形質導入することにより成し遂げられる。 「イントラカイン」と命名された細胞内ケモカインを発現するヒト末梢血リンパ 球（ＰＢＬ）がＭφ向性のＨＩＶ−１感染に抵抗することが見出された。さらに 、分泌性ケモカインならびにイントラカインがウイルス感染の付加的阻害のため 共発現された。従って、他の抗ＨＩＶのアプローチにより使用されるウイルス成 分よりはむしろ細胞のレセプターに唯一標的を定められる本新規抗ＨＩＶのアプ ローチは、ＨＩＶ−１の頻繁な突然変異を克服することができ、そして従ってＨ ＩＶ感染の遺伝子を基礎とする治療および予防にさえ重大な意味を有するはずで ある。 ＥＲの筒状の構造、および分泌系によるタンパク質の方向性の流れが組み合わ さって、ＥＲレベルでのレセプターの表現型のノックアウトを細胞表面のレセプ ター発現の阻害の極めて有効な機構にする。ＥＲへの局在化およびターゲッティ ングを意図された分子は、一般に、リーダーペプチドおよびＣ末端のＥＲ残留シ グナルを装備される。１個のこうしたシグナルがＫＤＥＬアミノ酸モチーフであ る（ムンロ(Munro)とペルハム(Pelham)、Cell、48:899-907、1987）。従って、 本発明は、ケモカ インにＥＲ残留シグナルを工作し、それによりこれらのリガンドをそれらがＣＣ Ｒタンパク質を結合するＥＲにターゲッティングし、それにより細胞表面でのそ れらの発現を予防するために、本明細書に記述された遺伝子組換え技術を使用す る。 アンチセンス。アンチセンスの方法論は、核酸が「相補的」配列と対合する傾 向があるという事実を利用する。相補性により、ポリヌクレオチドは、標準的な ワトソン−クリックの相補性規則に従って塩基を対合することが可能であるもの であることが意味される。すなわち、より大きなプリンはより小さなピリミジン と塩基を対合して、シトシンと対合されたグアニン（Ｇ：Ｃ）およびＤＮＡの場 合はチミンと対合されたアデニン（Ａ：Ｔ）もしくはＲＮＡの場合はウラシルと 対合されたアデニン（Ａ：Ｕ）のいずれかの組み合わせを形成することができる 。ハイブリダイゼーションする配列中のイノシン、５−メチルシトシン、６−メ チルアデニン、ヒポキサンチンおよび他者のようなより少なく普遍的な塩基の包 含は対合を妨害しない。 ポリヌクレオチドでの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡのターゲッティングは三重らせん の形成につながり；ＲＮＡのターゲッティングは二重らせんの形成につながるこ とができる。アンチセンスのポリヌクレオチドは、標的細胞中に導入された場合 、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、ＲＮＡのプロ セシング、輸送、翻訳および／もしくは安定性を妨害する。アンチセンスＲＮＡ 構築物もしくはこうしたアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが、インビトロ 、もしくはヒト対象を包含する宿主動物内のようなインビボのいずれかの宿主細 胞内での遺伝子の転写もしくは翻訳または双方を阻害するのに使用されてよい。 アンチセンス構築物は、プロモーターおよび他の調節領域、エクソン、イント ロンもしくは遺伝子のエクソン−イントロンの境界にさえ結合するよう設計され てよい。大部分の有効なアンチセンス構築物はイントロン／エクソンのスプライ ス部位に相補的な領域を包含することができることが企図される。従って、好ま しい一態様はイントロン−エクソンのスプライス部位の50〜200塩基内の領域に 対する相補性をもつアンチセンス構築物を包含することが提案される。若干のエ クソン配列はその標的選択性に重大に影響を及ぼすことなく当該構築物に包含さ れ得ることが観察されている。包含されるエクソン物質の量は使用される特定の エクソンおよびイントロン配列に依存して変動することができる。正常な細胞の 機能が影響を及ぼされるかどうか、もしくは相補的配列を有する関係する遺伝子 の発現が影響を及ぼされるかどうかを決定するために構築物を単にインビトロで 試験することにより、多すぎるエクソンＤＮＡが包含されるかどうかを容易に試 験し得る。 上に述べられたように、「相補性」もしくは「アンチセンス」は、それらの長 さ全体にわたって本質的に相補的でありかつ非常にほんの少数の塩基の不適正を 有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さ15塩基の配列は、それら が13もしくは14個の位置で相補的ヌクレオチドを有する場合に相補性と命名され てよい。もちろん、完全に相補性である配列は、それらの長さ全体を通じて完全 に相補的でありかつ塩基の不適正を有しない配列であることができる。より低い 程度の相同性をもつ他の配列もまた企図される。例えば、高相同性の制限された 領域を有するがしかし非相同領域もまた含有するアンチセンス構築物（例えばリ ボザイム）が設計され得る。これらの分子は、50％未満の相同性を有す るとは言え、適切な条件下で標的配列に結合するとみられる。 ゲノムＤＮＡの部分をｃＤＮＡもしくは合成配列と組み合わせて特定の構築物 を生じさせることが有利でありうる。例えば、１個のイントロンが最終的構築物 で所望される場合はゲノムクローンを使用することが必要であることができる。 ｃＤＮＡもしくは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残存する部分にとっ てより便宜的な制限酵素切断部位を提供することができ、そして従って配列の残 部について使用されるとみられる。 リボザイム。タンパク質は伝統的に核酸の触媒作用に使用されてきたとは言え 、別の分類の巨大分子がこの試みで有用として出現した。リボザイムは部位特異 的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムはエンド ヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒作用ドメインを有する（キム(Kim)とク ック(Cook)、1987；ゲルラッハ(Gerlach)ら、1987；フォスター(Forster)とシモ ンズ(Symons)、1987）。例えば、多数のリボザイムは、しばしばオリゴヌクレオ チド基質中のいくつかのリン酸エステルの１個のみを切断する高程度の特異性で リン酸エステル転位反応を促進する（クック(Cook)ら、1981；ミヒェル(Michel) とヴェストホフ(Westhof)、1990；ラインホルト−フレック(Reinhold-Hurek)と シュプ(Shub)、1992）。この特異性は、基質が、化学反応に先立つリボザイムの 内部ガイド配列(internal guide sequence)（「ＩＧＳ」）に特異的な塩基を対 合する相互作用を介して結合するという要件に帰されている。 リボザイムの触媒作用は、主として、核酸を必要とする配列特異的な切断／連 結反応の一部として観察されている（ジョイス(Joyce)、1989 ；クック(Cook)ら、1981）。例えば、米国特許第5,354,855号は、あるリボザイ ムが既知のリボヌクレアーゼのものより大きくかつＤＮＡの制限酵素のものに近 づく配列特異性をもつエンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告する。従 って、遺伝子発現の配列特異的なリボザイム仲介性の阻害は治療上の応用にとり わけ適することができる（スキャンロン(Scanlon)ら、1991；サーバー(Sarver) ら、1990）。最近、リボザイムが、それらが適用された若干の細胞系で遺伝子変 化を導き出したことが報告され；変えられた遺伝子は癌遺伝子Ｈ−ｒａｓ、ｃ− ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を包含した。この研究の大部分は、特定のリボザイ ムにより切断される特定の突然変異体コドンを基礎とする標的ｍＲＮＡの改変を 必要とした。 相同的組換え。細胞表面でのＣＣＲ５の発現を予防する別のアプローチは、相 同的組換え、すなわち「ノックアウト技術」の使用を必要とする。相同的組換え は、アンチセンスと同様、核酸の相補的配列と塩基を対合する傾向に頼る。この 例では、塩基の対合は、鎖の切断および修復が起こり得るように２個の別個の核 酸分子の相互作用を助長するようはたらく。言い換えれば、当該方法の「相同的 」な局面は、２個の相補的配列を緊密な接近にもたらす配列の相同性に頼る一方 、「組換え」の局面は、ある結合の切断および他の形成によって他者を置き換え る１個の相補的配列を提供する。 実務に置かれれば、相同的組換えは以下のように使用される。第一に、標的遺 伝子、この場合にはＣＣＲ５を宿主細胞内で選択する。ＣＣＲ５標的遺伝子に相 同的な配列を、その後、標的遺伝子を不活性にすることができるいくつかの突然 変異（終止コドン、中断など）と一緒に遺伝子 構築物に包含する。不活性化する突然変異に隣接する相同配列は突然変異に「隣 接する」と言われる。この情況において、隣接は、標的の相同配列が突然変異の 上流（５’）および下流（３’）双方に配置されることを単に意味する。これら の配列は標的遺伝子の上流および下流の若干の配列に対応するはずである。当該 構築物をその後細胞に導入し、かように細胞の配列と構築物との間の組換えを可 能にする。 実務的問題として、当該遺伝子構築物は、通常、遺伝子を中断するベヒクル(v ehicle)のはるかにより以上として作用することができる。例えば、組換え体に ついて選択することが可能であることが重要であり、そして従って構築物内に選 択可能なマーカー遺伝子を包含することが普遍的である。この遺伝子は、多様な 生物抑制性(biostatic)および殺生物性の薬物に対する抵抗性を与えることによ り、それらのゲノムＤＮＡ中に当該構築物を組込んだ細胞の選択を可能にする。 加えて、その細胞中で発現されるはずである異種遺伝子もまた当該構築物内に有 利に包含されてよい。その配置は以下のようになりうる。すなわち ．．．ベクター・５’−隣接配列・異種遺伝子・選択可能なマーカー遺伝子・隣 接配列−３’・ベクター．．． 従って、この種の構築物を用いて、単一の組換え事象において、（ｉ）内在性 遺伝子を「ノックアウト」すること、（ii）こうした事象を同定するための選択 可能なマーカーを提供すること、そして（iii）発現のための異種遺伝子を導入 すること、が可能である。 相同的組換えのアプローチの別の改良は「負」の選択可能なマーカーの使用を 必要とする。このマーカーは選択可能なマーカーと異なり、そのマーカーを発現 する細胞の死を引き起こす。従って、それは所望され ない組換え事象を同定するのに使用される。選択可能なマーカーを使用して相同 的組換え体を選択することを探求する場合には、最初のスクリーニング段階で無 作為の非配列特異的事象から生じられた組換え体から適正な相同的組換え体を同 定することが困難である。これらの組換え体は選択可能なマーカー遺伝子もまた 含有してよく、かつ、目的の異種タンパク質も発現しうるが、しかし、全ての見 込みにおいて、所望の「ノックアウト」表現型を有しないことができる。構築物 にしかし隣接領域の外側に負の選択可能なマーカーを取付けることにより、負の 選択可能なマーカーを組み込むことができる多くの無作為の組換え事象に対して 選択し得る。相同的組換えは負の選択可能なマーカーを導入しないはずである。 なぜならそれは隣接配列の外側にあるからである。 一本鎖モノクローナル抗体。細胞により合成されかつ特定の細胞区画にターゲ ッティングされる一本鎖抗体が、高度に特異的な様式で細胞の成長および代謝を 妨害するのに使用され得る。最近の応用は、成長因子レセプターの表現型のノッ クアウト、ｐ２１の機能の不活性化、およびＨＩＶ−１の複製阻害を包含する。 一本鎖抗体の製造方法は当業者に公知である。当業者はこうした方法について 米国特許第5,359,046号（引用により本明細書に組み込まれる）に注目させられ る。一本鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用してＨおよびＬ鎖の可変ドメイ ンを一緒に融合することにより創製され、それにより単一分子上で抗原結合部位 を再構成する。 一方の可変ドメインのＣ末端が15ないし25アミノ酸のペプチドすなわちリンカ ーを介して他方のＮ末端につなぎ止められる一本鎖抗体の可変断片（Ｆｖ）が、 抗原結合もしくは結合の特異性を有意に崩壊させるこ となく開発されている（ベドツィク(Bedzyk)ら、1990；チャウダリー(Chaudhary )ら、1990）。これらのＦｖは天然の抗体のＨおよびＬ鎖に存在する定常領域（ Ｆｃ）を欠く。 原則として、細胞内抗体すなわちイントラボディの高親和性および選択的結合 特性が、細胞の生理学および広範な機構による代謝を調節するのに使用され得る 。例えば、イントラボディの結合は、巨大分子の相互作用を封鎖もしくは静止さ せ、必要がありうるように活性部位を閉ざすこと、基質を引き離すこと、または 酵素を活性もしくは不活性のコンホメーションに固定することにより酵素機能を 調節するのに使用されてよい。イントラボディはまた、例えば細胞質中の転写因 子を引き離すこと、もしくは細胞表面に定められたタンパク質のＥＲ中での保持 により、それらの通常の細胞の区画からタンパク質を方向転換するのにも使用さ れてよい。この点に関して、イントラボディは、細胞表面でのＣＣＲ５の発現を 予防しそしてそれによりＨＩＶ−１の感染性を阻害するために本発明とともに有 用でありうる。 ６．発現ベクター 本出願を通じ、「発現構築物」という用語は、配列をコードする核酸の一部も しくは全部が転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含有す るいかなる型の遺伝子構築物も包含することが意味される。この転写物はタンパ ク質に翻訳されてよいが、しかしそれは翻訳される必要はない。従って、ある態 様においては、発現は、イントラカイン遺伝子の転写、およびイントラカインの ｍＲＮＡのイントラカインタンパク質産物への翻訳の双方を包含する。他の態様 においては、発現は、イントラカインもしくはその相補物をコードする核酸の転 写を包含 するのみである。 当該構築物が少なくともイントラカイン転写物の発現を遂げるためにイントラ カインのポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドがあるプロモーターの 転写制御下にあることができる。「プロモーター」は宿主細胞の合成機構(machi nery)もしくは導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を指し、遺伝子 の特異的転写を開始するのに必要とされる。「転写制御下」もしくは「操作可能 に結合される」という句はプロモーターがＲＮＡポリメラーゼの開始および当該 ポリヌクレオチドの発現を制御するために当該ポリヌクレオチドに関して正しい 位置にあることを意味する。 プロモーターという用語は、ここでは、ＲＮＡポリメラーゼIIの開始部位の周 辺にクラスター化される(clustered)一群の転写制御モジュールを指すのに使用 されることができる。プロモーターがどのように構成されるかについての考慮の 多くは、ＨＳＶのチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットに ついてのものを包含するいくつかのウイルスプロモーターの分析から生じる。よ り最近の研究により増大されたこれらの研究は、プロモーターが別個の機能モジ ュールから成ることを示しており、それぞれはおよそ７〜20bpのＤＮＡから成り 、そして転写アクチベーターもしくはリプレッサータンパク質のための１個もし くはそれ以上の認識部位を含有する。 各プロモーターの最低１個のモジュールがＲＮＡ合成の開始部位の位置を定め るよう機能する。これの最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、しか し、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーぜ遺伝子のプロモ ーター、およびＳＶ４０後期遺伝子のプロモ ーターのようなＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位 それ自身の上にある別個の要素が開始の場所を固定するのを助ける。 付加的なプロモーター要素が転写開始の頻度を調節する。典型的には、これら は開始部位の30〜110bp上流の領域に配置されるが、とは言え多数のプロモータ ーが最近、開始部位の下流に同様に機能性要素を含有することが示されている。 プロモーター要素間の間隔は頻繁に融通がきき、その結果、プロモーター機能は 要素が相互に関して逆にされるもしくは動かされる場合に保存される。ｔｋプロ モーターにおいては、プロモーター要素間の間隔は、活性が減少し始める前に、 50bp離れるまで増大され得る。プロモーターに依存して、個々の要素は協同的に もしくは独立にのいずれかで転写を活性化するよう機能し得るようである。 イントラカインのポリヌクレオチドの発現を制御するのに使用される特定のプ ロモーターは、それがターゲッティングされた細胞中で当該ポリヌクレオチドを 発現することが可能である限りは決定的に重要であるとは考えられない。従って 、ヒト細胞がターゲッティングされる場合は、ポリヌクレオチドのコーディング 領域を、ヒト細胞中で発現されることが可能であるプロモーターに隣接してかつ この制御下に位置を定めることが好ましい。一般的に言って、こうしたプロモー ターはヒトもしくはウイルスのいずれかのプロモーターを包含してよい。 多様な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロ モーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの末端反復配列 が、イントラカインのポリヌクレオチドの高レベル発現を得るのに使用され得る 。ポリヌクレオチドの発現を達成することが 当該技術分野で公知である他のウイルスもしくは哺乳動物細胞のまたは細菌ファ ージのプロモーターの使用も同様に企図されるが、ただし、発現のレベルは成長 阻害効果を生じるのに十分である。 公知の特性をもつプロモーターを使用することにより、トランスフェクション 後のポリヌクレオチドの発現のレベルおよびパターンが至適化され得る。例えば 、チロシナーゼ（黒色腫）、α−フェトプロテインおよびアルブミン（肝癌）、 ＣＣＩ１０（肺癌）ならびに前立腺特異的抗原（前立腺癌）のような、特定の細 胞で活性であるプロモーターの選択が、イントラカインのポリヌクレオチドの組 織特異的発現を可能にすることができる。表２は、本発明の情況において、イン トラカイン構築物の発現を調節するのに使用されうるいくつかの要素／プロモー ターを列挙する。この一覧はイントラカインの発現の促進に関与する全ての可能 性のある要素を網羅することを意図されないが、しかし単にその例示的であるこ とを意図される。 エンハンサーは、もともと、同一のＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されるプ ロモーターからの転写を増大させた遺伝子要素として検出された。大きな距離に わたって作用するこの能力は原核生物の転写調節の古典的研究ではほとんど前例 を有しなかった。その後の研究が、エンハンサー活性をもつＤＮＡの領域がプロ モーターにずっと類似して構成されることを示した。すなわち、それらは多くの 別個の要素から成り、そのそれぞれは１個もしくはそれ以上の転写タンパク質に 結合する。 エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は操作的である。エンハン サー領域は全体として少し離れて転写を刺激することが可能でなくてはならず； これはプロモーター領域もしくはその成分の要素に当 てはまる必要はない。他方、プロモーターは、特定の部位および特定の向きでの ＲＮＡ合成の開始を指図する１個もしくはそれ以上の要素を有しなくてはならな い一方、エンハンサーはこうした特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサ ーはしばしば重なり合いかつ連続的であり、しばしば、非常に類似のモジュール 構成を有するとみられる。 付加的には、いかなるプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核生物プ ロモーターデータベース(Eukaryotic Promoter DataBase)、ＥＰＤＢのとおり） は、イントラカイン構築物の発現を余儀なくさせる(drive)のにもまた使用され 得る。Ｔ３、Ｔ７もしくはＳＰ６の細胞質発現系の使用は別の可能な態様である 。真核生物細胞は、適切なバクテリオファージポリメラーゼが提供される場合は 、送達複合体の一部もしくは付加的な遺伝子発現ベクターのいずれかとして、あ るバクテリオファージプロモーターからの細胞質転写を支持し得る。 さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は 、イントラカイン構築物の誘導可能な発現を可能にし得る。例えば、ヒトＰＡＩ −１プロモーターの制御下のポリヌクレオチドを用いれば、発現は腫瘍壊死因子 により誘導可能である。表３はいくつかのプロモーター／インデューサーの組み 合わせを具体的に説明する。すなわち 本発明のある態様においては、細胞中での発現ベクターの送達が、発現ベクタ ー中にあるマーカーを包含することによりインビトロもしくはインビボで同定さ れうる。当該マーカーは、発現の容易な同定を可能にする、トランスフェクショ ンされた細胞に対する同定可能な変化をもたらすとみられる。通常は、薬物選択 マーカーの包含がクローニングおよび形質転換体の選択で補助する。あるいは、 単純疱疹ウイルスのチミジ ンキナーゼ（ｔｋ）（真核生物）もしくはクロラムフェニコールアセチルトラン スフェラーゼ（ＣＡＴ）（原核生物）のような酵素が使用されてよい。免疫学的 マーカーもまた使用され得る。使用される選択可能なマーカーは、それがイント ラカインをコードするポリヌクレオチドと一緒に発現されることが可能である限 りは重要であると考えられない。選択可能なマーカーのさらなる例は当業者に公 知である。 転写物の適正なポリアデニル酸化を遂げるためのポリアデニル酸化シグナルを 典型的に包含することができる。ポリアデニル酸化シグナルの性質は本発明の成 功する実務に決定的であると考えられず、また、いずれのこうした配列が使用さ れてもよい。ターミネーターもまた発現構築物の一要素として企図される。これ らの要素は、メッセージのレベルを高め、かつ、当該構築物から他の配列への全 体の読み取り(read)を最小限にするようはたらき得る。 本発明のいくつかの態様において、発現構築物はウイルス、もしくはウイルス ゲノム由来の工作された構築物を含んて成る。レセプター仲介性のエンドサイト ーシスを介して細胞に進入し、そして、いくつかの場合には宿主細胞の染色体中 に組込むあるウイルスの能力は、それらを哺乳動物細胞への遺伝子導入の魅力的 な候補とした。しかしながら、裸の(naked)ＤＮＡの直接の取り込み、ならびに ＤＮＡ複合体のレセプター仲介性の取り込みは、発現ベクターはウイルス性であ る必要はないが、しかし、代わりに、一連のｐＵＣもしくはＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ（商標）プラスミドのような哺乳動物細胞中でのコードされた遺伝子の発現を 支持することが可能であるいずれかのプラスミド、コスミドもしくはファージ構 築物であってよいことを立証した。 レトロウイルス。レトロウイルスは、逆転写の過程により感染した細胞中での それらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転化する能力を特徴とする一群の一本鎖ＲＮＡ ウイルスである（コフィン(Coffin)、1990）。生じるＤＮＡは、その場合、プロ ウイルスとして細胞の染色体中に安定に組込み、そしてウイルスタンパク質の合 成を指図する。組込みはレシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝 子配列の保持をもたらす。レトロウイルスのゲノムは、それぞれキャプシドタン パク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする３種の遺伝子（ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含有する。Ψと命名される、ｇａｇ遺伝子から 上流に見出される配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのシグナルとし て機能する。２個の末端反復配列（ＬＴＲ）の配列がウイルスゲノムの５’およ び３’端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含 有し、そして宿主細胞ゲノム中の組込みにもまた必要とされる（コフィン(Coffi n)、1990）。 レトロウイルスベクターを構築するためには、イントラカインをコードする核 酸をあるウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入して、複製不完全であ るウイルスを生じさせる。ビリオンを産生させるためには、ｇａｇ、ｐｏｌおよ びｅｎｖ遺伝子を含有するがしかしＬＴＲおよびΨ成分を含まないパッケージン グ細胞系を構築する（マン(Mann)ら、1983）。ヒトのｃＤＮＡをレトロウイルス のＬＴＲおよびΨ配列と一緒に含有する組み換えプラスミドを（例えばリン酸カ ルシウム沈殿により）この細胞系に導入する場合は、Ψ配列は組換えプラスミド のＲＮＡ転写物がウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にし、この 粒子がその後培養培地中に分泌される（ニコラス(Nicolas)とルーベンシュ タイン(Rubenstein)、1988；テミン(Temin)、1986；マン(Mann)ら、1983）。組 換えレトロウイルスを含有する培地をその後収集し、場合によっては濃縮し、そ して遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは広範な細胞型を感染させ ることが可能である。しかしながら、組込みおよび安定な発現は宿主細胞の分割 を必要とする（パスカインド(Paskind)ら、1975）。 レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするよう設計され た新規アプローチが、最近、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的 付加によるレトロウイルスの化学修飾を基礎として開発された。この修飾はシア ロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞の特異的感染を可能にし得た。 組換えレトロウイルスのターゲッティングへの異なるアプローチが設計され、 ここではレトロウイルスのエンベロープタンパク質および特異的細胞レセプター に対するビオチニル化抗体を使用した。抗体はストレプトアビジンを使用するこ とによりビオチン成分を介して結合した（ルー(Roux)ら、1989）。主要組織適合 遺伝子複合体クラスＩおよびクラスII抗原に対する抗体を使用して、それらは、 インビトロで自己向性ウイルスとともにそれらの表面抗原をもった多様なヒト細 胞の感染を立証した（ルー(Roux)ら、1989）。 アデノウイルス。ヒトアデノウイルスは、およそ36kbのゲノムの大きさをもつ 二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスである（トゥーズ(Tooze)、1981）。真核生物の遺伝 子発現のモデル系として、アデノウイルスは幅広く研究されかつ十分に特徴づけ られており、それはそれらを遺伝子導入の系としてのアデノウイルスの開発のた めの魅力的な系にしている。この群の ウイルスは成長させかつ操作するのが容易であり、また、それらはインビトロお よびインビボで幅広い宿主範囲を表わす。溶解性に感染した細胞において、アデ ノウイルスは宿主のタンパク質合成を遮断し、細胞の機構に大量のウイルスタン パク質を合成するよう指図し、そして夥しい量のウイルスを産生させることが可 能である。 そのゲノムのＥ１領域はＥ１ＡおよびＥ１Ｂを包含し、これらはウイルスゲノ ムならびにいくつかの細胞遺伝子の転写調節の原因であるタンパク質をコードす る。Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂを包含するＥ２の発現は、ウイルスの複製機能、例えば ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼおよび複製を準備する末端タンパク 質の合成を可能にする。Ｅ３遺伝子産物は細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子 による細胞溶解を予防し、また、ウイルス増殖に重要であるようである。Ｅ４タ ンパク質に関連する機能は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮 断を包含する。後期遺伝子産物はビリオンキャプシドタンパク質の大部分を包含 し、そしてこれらは主要後期プロモーター(major late promoter)からの単一の 一次転写物のプロセシングの大部分が起きた後にのみ発現される。主要後期プロ モーター（ＭＬＰ）は感染の後期の間に高効率を表わす（ストラトフォード・ペ リコーデット(Stratford-Perricaudet)とペリコーデット(Perricaudet)、1991a ）。 ウイルスゲノムの小さな部分のみがシスで必要とされるようである（トゥーズ (Tooze)、1981）ため、アデノウイルス由来のベクターは、２９３細胞のような 細胞系に関連して使用される場合に大きなＤＮＡ断片の置換についての優れた潜 在能力を提供する。Ａｄ５で形質転換されたヒト胚腎細胞系（グラハム(Graham) ら、1977）が、不可欠なウイルスタン パク質をトランスに提供するため開発されている。 外来タンパク質を細胞に送達させるためのアデノウイルスの系の特定の利点は 、（ｉ）外来ＤＮＡによりウイルスＤＮＡの比較的大きな片を置換する能力；（ ii）組換えアデノウイルスの構造上の安定性；（iii）ヒトへのアデノウイルス 投与の安全性、および（iv）癌もしくは悪性病変とのアデノウイルス感染のいず れかの既知の関連の欠如；（ｖ）高力価の組換えウイルスを得る能力；ならびに （vi）アデノウイルスの高感染性を包含する。 一般に、アデノウイルス遺伝子導入系は、Ｅ１のようなそのゲノムの一部分の 欠失により複製無能にされかつ感染のためのその能力をなお未だ保持する、組換 えの工作されたアデノウイルスを基礎とする。比較的大きな外来タンパク質をコ ードする配列は、付加的な欠失がアデノウイルスゲノム中に作成される場合に発 現され得る。例えば、Ｅ１およびＥ３双方の領域で欠失されたアデノウイルスは 、10kbまでの外来ＤＮＡをもつことが可能であり、また、２９３細胞中で高力価 まで成長され得る（ストラトフォード・ペリコーデット(Stratford-Perricaudet )とペリコーデット(Perricaudet)、1991a）。驚くべきことに、アデノウイルス 感染後のトランス遺伝子の持続性発現もまた報告されている。 アデノウイルス仲介性の遺伝子導入は、最近、真核生物細胞および動物全体へ の遺伝子導入を仲介する手段として検討されている。例えば、希な劣性遺伝子障 害、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠乏症のマウスの治療におい て、アデノウイルス構築物が正常なＯＴＣ酵素を供給するのに使用され得たこと が見出された。不幸なことに、正常レベルのＯＴＣの発現は17例中４例でのみ達 成された（ストラトフォー ド・ペリコーデット(Stratford-Perricaudet)ら、1991b）。従って、この欠損は マウスの大部分で部分的にのみ是正され、そして、生理学的もしくは表現型の変 化につながらなかった。 コットンラット(cotton rat)の肺上皮への嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタン ス調節体(transmembrane conductance regulator)（ＣＦＴＲ）の遺伝子を導入 するのにアデノウイルスを使用する試みもまた部分的に成功であったが、とは言 え、動物の上皮での導入された遺伝子の生物学的活性を評価することは可能でな かった（ローゼンフェルト(Rosenfeld)ら、1992）。再度、これらの研究は、肺 気道細胞におけるＣＦＴＲタンパク質の遺伝子導入および発現を立証したが、し かし生理学的効果を示さなかった。1991年のScienceの論文で、ローゼンフェル ト(Rosenfeld)らはα１−アンチトリプシンタンパク質の肺の発現を示したが、 しかし、再度、生理学的効果を示さなかった。事実、彼らは、彼らが観察した発 現のレベルがヒトの肺の保護に必要とされるレベルの約２％のみ、すなわち生理 学的効果に必要なもののはるかに下であったことを推定した。 ヒトα１−アンチトリプシンの遺伝子が門脈内注入により正常ラットの肝に導 入されており、そこでそれは発現され、そしてこれらのラットの血漿中への導入 されたヒトタンパク質の分泌をもたらした（ヤッフェ(Jaffe)ら、1992）。しか しながら、そしてがっかりさせることに、得られたレベルは治療的値のものであ るのに十分に高くなかった。 これらの型の結果は、アデノウイルスが生理学的に適切な効果を達成するのに 十分なタンパク質の組換え細胞内での発現を指図することが可能であることを立 証せず、また、それらは、従って、遺伝子治療に関連した使用についてのアデノ ウイルスの系の有用性を示唆しない。 ７．発現構築物としての他のウイルスベクター 他のウイルスベクターが本発明において発現構築物として使用されてよい。ワ クシニアウイルス（リッジウェイ(Ridgeway)、1988；バイクワル(Baichwal)とス グデン(Sugden)、1986；クーパー(Coupar)ら、1988）、アデノ随伴ウイルス（Ａ ＡＶ）（リッジウェイ(Ridgeway)、1988；バイクワル(Baichwal)とスグデン(Sug den)、1986；ヘルモナト(Hermonat)とムチツスカ(Muzycska)、1984）およびヘル ペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが使用されてよい。それらは多様 な哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（フリードマン(Fri edmann)、1989；リッジウェイ(Ridgeway)、1988；バイクワル(Baichwal)とスグ デン(Sugden)、1986；クーパー(Coupar)ら、1988；ホルヴィッチ(Horwich)ら、1 990）。 不完全なＢ型肝炎ウイルスの最近の認識で、多様なウイルス配列の構造−機能 の関係への新たな洞察が得られた。インビトロの研究は、当該ウイルスが、その ゲノムの80％までの欠失にもかかわらずヘルパー依存性のパッケージングおよび 逆転写についての能力を保持し得たことを示した（ホルヴィッチ(Horwich)ら、1 990）。これは、ゲノムの大きな部分が外来遺伝子物質で置き換えられ得たこと を示唆した。肝向性および持続性（組込み）は、肝に向けられる遺伝子導入にと ってとりわけ魅力的な特性であった。チャン(Chang)らは、最近、クロラムフェ ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、ポリメラーゼ、表面 および前表面のコーディング配列の代わりにアヒルのＢ型肝炎ウイルスのゲノム 中に導入した。それを鳥類の肝癌細胞系に野生型ウイルスとともにコトランスフ ェクションした。高力価の組換えウイルスを含有する 培養培地を使用して一次仔アヒル肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現 がトランスフェクション後最低24日間検出された（チャン(Chang)ら、1991）。 多重遺伝子構築物およびＩＲＥＳ。本発明のある態様においては、内部リボソ ーム結合部位（ＩＲＥＳ）要素の使用が、多重遺伝子すなわちポリシストロニッ クのメッセージを創製するのに使用される。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化キャ ップ依存性の翻訳のリボソーム走査モデル(ribosome scanning model)を迂回し そして内部部位で翻訳を開始することが可能である（ペルティエ(Pelletier)と ゾネンバーク(Sonenberg)、1988；ヤン(Jang)ら、1988）。ピコルナウィルスフ ァミリーの２種の構成員（ポリオおよび脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素（ペルテ ィエ(Pelletier)とゾネンバーク(Sonenberg)、1988）、ならびに哺乳動物のメッ セージからのＩＲＥＳ（マセジャク(Macejak)とサルノウ(Sarnow)、1991）が記 述されている。ＩＲＥＳ要素は異種の読み取り枠に結合され得る。それぞれＩＲ ＥＳにより分離される複数の読み取り枠が一緒に転写され得、ポリシストロニッ クメッセージを創製する。ＩＲＥＳ要素によって、各読み取り枠は効率的な翻訳 のためリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が単一のプロモーター／エン ハンサーを使用して効率的に発現されて単一のメッセージを転写し得る。 いずれの異種の読み取り枠もＩＲＥＳ要素に結合され得る。これは、分泌性タ ンパク質、独立の遺伝子によりコードされる多サブユニットタンパク質、細胞内 もしくは膜結合性タンパク質、および選択可能なマーカーの遺伝子を包含する。 こうして、いくつかのタンパク質の発現が、単一の構築物および単一の選択可能 なマーカーを用いて細胞中に同時に 工作され得る。 ８．遺伝子送達の方法 イントラカイン構築物の発現を遂げるためにはその発現ベクターが細胞中に送 達されなければならない。上述されたように、送達の好ましい機構はウイルス感 染を介してであり、ここで発現ベクターは感染性のアデノウイルス粒子中に被包 化される。 培養された哺乳動物細胞への発現ベクターの導入のいくつかの非ウイルスの方 法もまた本発明により企図される。これらは、リン酸カルシウム沈殿法（グラハ ム(Graham)とファン・デル・エプ(Van Der Eb)、1973；リッペ(Rippe)ら、1990 ）、ＤＥＡＥ−デキストラン（ゴパール(Gopa1)、1985）、電気穿孔法（ツール ・カスパ(Tur-Kaspa)ら、1986；ポター(Potter)ら、1984）、直接微小注入法（ ハーラント(Harland)とヴァイントラウプ(Weintraub)、1985）、ＤＮＡ負荷リポ ソーム（ニコラウ(Nicolau)とゼネ(Sene)、1982；フレイリー(Fraley)ら、1979 ）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（フェヒハイマー(F echheimer)ら、1987）、高速度微小発射体(microprojectile)を使用する遺伝子 衝撃法(gene bombardment)（ヤン(Yang)ら、1990）、ポリカチオン（ブーシフ(B oussif)ら、1995）ならびにレセプター仲介性トランスフェクション（ウ(Wu)と ウ(Wu)、1987；ウ(Wu)とウ(Wu)、1988）を包含する。これらの技術のいくつかは インビボもしくはエクスビボの使用に成功裏に適合されうる。 本発明の一態様において、発現ベクターは単に裸の組換えベクターから成って よい。構築物の導入は、細胞膜を物理的もしくは化学的に滲透化する(permeabil ize)上に挙げられた方法のいずれかにより実施されて よい。例えば、ドゥベンスキ(Dubensky)ら（1984）は、ポリオーマウイルスのＤ ＮＡをリン酸カルシウム沈殿物の形態で成体および新生マウスの肝および脾に成 功裏に注入し、活動性ウイルスの複製および急性感染を立証した。ベンヴェニス ティ(Benvenisty)とネシフ(Neshif)（1986）もまた、リン酸カルシウム沈殿され たプラスミドの直接腹腔内注入がトランスフェクションされた遺伝子の発現をも たらすことを立証した。イントラカイン構築物をコードするＤＮＡもまた類似の 様式でインビボで導入されうることが予見される。 裸のＤＮＡ発現ベクターを細胞中に導入するための本発明の別の態様は粒子衝 撃(particle bombardment)を必要としうる。本方法はＤＮＡ被覆された微小発射 体を高速度まで加速してそれらが細胞膜を貫通しそして細胞を殺すことなくそれ らに進入することを可能にする能力に依存する（クライン(Klein)ら、1987）。 小さな粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。１種のこうした 装置は電流を生じさせる高電圧放電に頼り、それは順に推進力を提供する（ヤン (Yang)ら、1990）。使用される微小発射体はタングステンもしくは金のビーズの ような生物学的に不活性の物質から成る。 ラットおよびマウスの肝、皮膚および筋組織を包含する選択された器官をイン ビボで衝撃した（ヤン(Yang)ら、1990；ゼレニン(Zelenin)ら、1991）。これは 、ガン(gun)と標的組織との間のいかなる介入する組織も排除するために組織も しくは細胞の外科的露出を必要としうる。イントラカイン構築物をコードするＤ ＮＡがこの方法を介して送達されてよい。 本発明のさらなる一態様において、発現ベクターはリポソーム中に捕 捉されてよい。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体を特徴と する小胞構造である。多重膜リポソームは水性媒体により分離される複数の脂質 層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁される場合に自発的 に生じる。脂質成分は閉鎖された構造の形成の前に自己転位を受け、そして脂質 二重層の間に水および溶解された溶質を捕捉する（ゴーシュ(Ghosh)とバクハワ ト(Bachhawat)、1991）。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体もまた企図される。 インビトロでのリポソーム媒介性のポリヌクレオチドの送達および外来ＤＮＡ の発現は非常に成功している。ウォン(Wong)ら（1980）は、培養されたニワトリ 雛の胚、ＨｅＬａおよび肝癌細胞での外来ＤＮＡのリポソーム仲介性の送達およ び発現の実行可能性を立証した。ニコラウ(Nicolau)ら（1987）は、ラットで静 脈内注入後に成功したリポソーム仲介性の遺伝子導入を成し遂げた。 本発明のある態様においてはリポソームがセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合 体形成されうる。これは細胞膜との融合を助長しそしてリポソームで被包化され たＤＮＡの細胞進入を促進することが示されている（カネダ(Kaneda)ら、1989） 。他の態様において、リポソームが核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ− １）とともに複合体形成もしくは使用されてよい（カトー(Kato)ら、1991）。な おさらなる態様においては、リポソームがＨＶＪおよびＨＭＧ−１双方とともに 複合体形成もしくは使用されてよい。こうした発現ベクターがインビトロおよび インビボでポリヌクレオチドの導入および発現で成功裏に使用されているため、 そういうわけでそれらは本発明に応用可能である。バクテリオファージのプロモ ーターがＤＮＡ構築物中で使用される場合には、リポソーム内に 適切なバクテリオファージのポリメラーゼを包含することもまた望ましいことが できる。 細胞中に発現ベクターを導入する別の機構はレセプター仲介性の送達である。 このアプローチは、ほとんど全部の真核生物細胞におけるレセプター仲介性のエ ンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。多様なレセプタ ーの細胞型特異的分布のため、この送達は高度に特異的であり得る（ウ(Wu)とウ (Wu)、1993）。レセプター仲介性の遺伝子ターゲッティングベヒクルは一般に２ 成分、すなわち細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合物質から成る。 いくつかのリガンドがレセプター仲介性の遺伝子導入に使用されている。最も広 範囲に特徴づけられたリガンドはアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ウ(Wu) とウ(Wu)、1987）およびトランスフェリン（ワグナー(Wagner)ら、1993）である 。最近、ＡＳＯＲと同一のレセプターを認識する合成の新規糖タンパク質(neogl ycoprotein)が遺伝子送達ベヒクルとして使用されており（フェルコル(Ferkol) ら、1993；ペラレス(Perales)ら、1994）、また、上皮成長因子（ＥＧＦ）もま た扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達させるのに使用されている（マイヤース(Myers )、ＥＰＯ第0273085号）。 他の態様においては、送達ベヒクルはリガンドおよびリポソームを含んでよい 。例えば、ニコラウ(Nicolau)ら（1987）はリポソーム中に取り込まれたガラク トース末端アシアロガングリオシド、ラクトシルセラミドを使用し、そして、肝 細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。従って、発現ベクタ ーもまた、リポソームを用いてもしくは用いずにいずれかの数のレセプター−リ ガンド系により肺、上皮もしくは腫瘍細胞のような細胞型に特異的に送達されう ることが実行可能 である。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）は、ＥＧＦレセプターのアップレギュ レーションを表わす多くの腫瘍細胞でイントラカイン構築物の仲介された送達の ためのレセプターとして使用されてよい。マンノースは肝細胞上のマンノースレ セプターをターゲッティングするのに使用され得る。また、ＣＤ５（ＣＬＬ）、 ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）およびＭＡＡ（黒色腫）に対 する抗体がターゲッティング部分として同様に使用され得る。 ある態様において、遺伝子導入はエクスビボの条件下でより容易に実施されう る。エクスビボ遺伝子治療は、動物からの細胞の単離、その細胞へのインビトロ でのポリヌクレオチドの送達、およびその後の動物に戻す改変された細胞の返却 (return)を指す。これは、動物からの組織／器官の外科的除去もしくは細胞およ び組織の一次培養を必要としうる。アンダーソン(Anderson)ら(米国特許第5,399 ,346号かつそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)はエクスビボの治療法を 開示する。エクスビボ培養の間に発現ベクターがイントラカイン構築物を発現し 得る。最後に、細胞が、下述される手段のいずれかにより製薬学的に許容できる 形態で、元の動物に再導入されてよいか、もしくは別個の動物に投与されてよい 。 ヒトのＨＩＶすなわちＡＩＤＳ患者の治療のためには、本発明の実施上その患 者から末梢血もしくは骨髄を得ることを包含するとみられる。末梢血リンパ球も しくは幹細胞がその場合に単離そして刺激されるとみられる。イントラカイン遺 伝子および本明細書で論考されるようないずれかのさらなる遺伝子物質がその後 、上述されたような導入系により単離された細胞に導入されるとみられる。レト ロウイルスの感染系がある 利点を提供することが企図される。形質導入された細胞はその後細胞培養物に増 殖され(expanded)そして患者に再注入される。各治療での治療頻度ならびに再注 入される細胞の数は患者の白血球数に依存するとみられ、また、個体を基礎とし て開業医により決定されるとみられる。しかしながら、治療が３ないし６ヶ月間 隔で必要とされるとみられることが企図される。 ９．治療的組成物 本発明の発現ベクターの臨床応用が企図される場合は、複合体を意図された応 用に適切な製薬学的組成物として製造することが必要であることができる。一般 に、これは、発熱性物質、ならびにヒトもしくは動物に有害であり得るいかなる 他の不純物も本質的に含まない製薬学的組成物を製造することを必然的に伴うこ とができる。また、一般に、複合体を安定にしかつ標的細胞による複合体の取り 込みを見込むための適切な塩および緩衝液を使用することを所望することもでき る。 本発明の水性組成物は、製薬学的に許容できる担体もしくは水性媒体に溶解も しくは分散された有効量の発現ベクターを含んで成る。こうした組成物は接種材 料ともまた称される。「製薬学的もしくは薬理学的に許容できる」という句は、 動物もしくはヒトに適切なように投与される場合に不利な、アレルギー性のもし くは他の不適当な反応を生じない分子の実体および組成物を指す。本明細書で使 用されるところの「製薬学的に許容できる担体」は、いずれかのかつ全部の溶媒 、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤 などを包含する。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および作用物質の使用 は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体もしくは作用物質が 有効成分と不適合性である限りを除いて当該治療的組成物でのその使用が企図さ れる。補足の有効成分もまた当該組成物中に組み込まれ得る。 遊離の塩基もしくは製薬学的に許容できる塩としての有効成分の溶液は、ヒド ロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適して混合されて水中で製造さ れ得る。分散体は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合 物および油中でもまた製造され得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これ らの製剤は微生物の成長を予防する保存剤を含有する。 本発明の発現ベクターおよび送達ベヒクルは古典的な製薬学的製剤を包含して よい。本発明の治療的組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能で ある限りはいずれかの普遍的経路を介してであることができる。これは、経口、 鼻、頬側、直腸、膣もしくは局所を包含する。あるいは、投与は、正常位、皮内 、眼内、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注入によることができる。こうし た組成物は、通常、生理学的に許容できる担体、緩衝液もしくは他の賦形剤を包 含する製薬学的に許容できる組成物として投与されるとみられる。 本発明の治療的組成物は、有利には、液体の溶液もしくは懸濁液のいずれかと して注入可能な組成物の形態で投与され；注入前に液体の溶液もしくは懸濁液に 適する固体の形態もまた製造されてよい。これらの製剤はまた乳化されてもよい 。こうした目的のための局所組成物は製薬学的に許容できる担体を含んで成る。 例えば、当該組成物は、リン酸緩衝生理的食塩水１mlあたり10mg、25mg、50mgも しくは約100mgまでのヒト血清アルブミンを含有してよい。他の製薬学的に許容 できる担体は、水性溶液、塩、保存剤、緩衝液などを包含する非毒性賦形剤を包 含する。 非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油お よびエチルオレエートのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水 、アルコール／水溶液、生理的食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンゲルブドウ糖 (Ringer's dextrose)などのような非経口ベヒクルを包含する。静脈内ベヒクル は液体および栄養素の補給物を包含する。保存剤は抗菌剤、抗酸化剤、キレート 剤および不活性ガスを包含する。当該製薬学的組成物の多様な成分のｐＨおよび 正確な濃度は公知のパラメータに従って調節される。 ＨＩＶ感染の免疫病理学的影響は、ウイルスの高親和性レセプターをもつ細胞 とのウイルスの相互作用に直接関係する。ＡＩＤＳ患者での免疫学的異常は、選 択的Ｔ細胞欠乏、低下されたインビトロのリンパ球増殖応答および抗リンパ球抗 体の存在を包含する。従って、ＨＩＶ感染は激減されたリンパ球濃度をもたらす 。ＡＩＤＳの症状を発現する患者のリンパ球測定は当該技術分野で公知であり、 本発明の組成物がＨＩＶ陽性である患者およびＡＩＤＳの症状を発現する患者の 活動性リンパ球の含有量を引き上げるのに使用され得ることが企図される。この 点で、本発明の治療的組成物は、ＡＩＤＳの症状の軽減、およびまたＨＩＶ感染 に対する抵抗性の賦与においても使用されてよい。 前に論考されたように、ＨＩＶ感染が、リンパ様細胞のプールの増殖の原因で ある前駆細胞の感染および破壊を包含するＴ４細胞機能の破壊を直接もたらすか も知れない、いくつかの様式が存在する。本発明は、従って、本発明の遺伝子構 築物を含有する細胞を含む自己および異種の骨髄移植組織を提供することによる ＨＩＶ感染の治療方法を企図する。 養子免疫療法は、ドナーからの免疫学的に活動性の細胞の単離ならび にインビトロでのクローニングおよび増殖を必要とする治療計画である。増殖さ れた治療上活動性の細胞が治療効果を得るため患者に提供される。ドナーがその 患者である場合、その導入は「自己」である。ドナーが患者と別個である場合、 この導入は「異種」である。 本発明を使用する自己骨髄移植では、血清陽性であるがしかし未だＨＩＶ感染 の特徴を発症しておらず、かつ、細胞表面でＣＣＲ発現を有しない患者からのリ ンパ球の使用を企図し、そしてこれらの細胞をイントラカインを発現するよう操 作する。これらの細胞はその後患者に移植され、それによりその患者のＨＩＶ感 染に対する抵抗性を与える。 本発明を使用する異種骨髄移植組織もまた企図される。こうした症例では、Ｈ ＬＡを適合されたドナーからのリンパ球を、イントラカインを発現するよう操作 する。こうした骨髄移植組織は、その免疫系が危うくされているＨＩＶ感染患者 で有用であることができる。 骨髄は、正常なボランティアのドナー、骨髄移植について正常なドナー、もし くは血液学的疾患の証拠のない患者の心肺手術の時点で切除された肋骨から得て よい。ヒト単核細胞の調製では、骨髄のアリコートを遠心分離チューブのような 容器中に層状にする。最初は、単核細胞を骨髄の供給源、例えば脛骨、大腿骨、 脊柱、肋骨、骨盤、胸骨、ならびに上腕骨、橈骨、尺骨、脛骨および腓骨から得 てよい。付加的には、これらの細胞は、臍帯血、末梢血もしくはサイトカインで 動員された(cytokine-mobilized)末梢血からもまた得ることができる。ヒト造血 幹細胞の他の供給源は、胚卵黄嚢、胎児肝、胎児および成人の脾ならびに血液を 包含する。 骨髄層を遠心分離して、チューブ底部の赤血球のペレット、媒体(med ia)の澄明な層、単核細胞を含有する界面層および上面の血漿媒体層を生じさせ る。界面層はその後例えば吸引を使用していてよい。1000gでのこの層の遠心分 離は最終的に単核細胞のペレットを生じる。このペレットをその後、ＦＡＣＳに よる細胞選別に適する緩衝液に再懸濁してよい。 それらが本発明のバイシストロニック(bicistronic)ケモカイン構築物を生じ るように自己Ｔリンパ球を形質導入するため、１サンプルあたりおよそ200ccの 血液サンプルを対象から単離する。リンパ球を血液サンプルから単離し、そして 、ジャンダ(Janda)ら、Manual of Clinical Microbiology、第５版、アメリカ微 生物学会(American Society for Microbiology)、ワシントンＤＣ、第19章、137 ページ；（引用により本明細書に組み込まれる）により例示されるような標準的 プロトコールに従って適切な条件下で飼養する。この様式で、およそ10¹¹個のリ ンパ球をおよそ２週間後に培養物から単離することができる。 単離された培養されたリンパ球を、それらがイントラカインおよび分泌された 形態の所望のケモカインを産生することができるように、本明細書に上述された ようなレトロウイルスもしくは他のベクターで形質導入する。これらのリンパ球 をその後、約10⁹個のリンパ球の用量が送達されるように、製薬学的に許容でき る担体中で宿主対象に再注入(reinfuse)もしくは注入(inject)して戻してよい。 投与量は、対象の免疫系の状態に依存して所望されるように２週間から６ヶ月も しくは１年までの範囲にわたる間隔で再投与してよい。例えば、対象のＷＢＣが ＨＩＶ感染により低下されている際は、形質導入されたリンパ球もしくは幹細胞 を注入して、ＨＩＶ免疫リンパ球の許容できるレベルを維持し、また、循環する ケモカインを増加させてさらなる感染を阻害しかつ他のＨＩＶ 治療手段とともに二次感染の危険を減少させることができる。 もちろん、本発明の組成物はまた、伝統的治療、例えばゾビドブジン（ＡＺＴ ）を必要とする治療と共同して使用されてもよいことが理解される。これは、Ｈ ＩＶの逆転写酵素を阻害することによりＨＩＶ複製を封鎖するジデオキシヌクレ オシドとして知られるヌクレオシド類似物の一分類の１種である。 １１．実施例 以下の実施例は本発明の好ましい態様を立証するために包含される。後に続く 実施例で開示される技術は、本発明の実務において十分に機能することが発明者 により発見された技術を代表し、そして従ってその実務に好ましい様式を構成す ると考えられ得ることが、当業者により認識されるべきである。しかしながら、 当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、本発明の技術思想および範囲から 離れることなく、開示される特定の態様においてなされ得、かつ、同様のもしく は類似の結果をなお得ることができることも認識するべきである。 実施例１ 方法 発現ベクターの構築。ヒトＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳ遺伝子を末梢血単 核細胞（ＰＢＭＣ）のｃＤＮＡからＰＣＲ（商標）増幅した。ＭＩＰ−１αおよ びＲＡＮＴＥＳ遺伝子をその後、ＰＣＲ（商標）反応によりＫＤＥＬ配列すなわ ちＳＥＫＤＥＬ、配列番号７と結合した（マラスコ(Marasco)ら、1993）。天然 のＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ならびにそれらの突然変異体をそれ ぞれ発現ベクターにクローニングした（図２）。構築物の全部をＤＮＡ配列決定 （ウェイク フォ レスト大学ＤＮＡ配列決定中枢施設(DNA sequencing core facility of Wake Fo rest University)）により確認した。 タンパク質発現の検出および免疫蛍光染色。組換えタンパク質を標識しかつ沈 降させるため、細胞を³⁵Ｓ−システインで放射標識しそして抗体で沈降させた（ チェン(Chen)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、91:2932-5936、1994）。熱変性 後にタンパク質サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により 分析し、そしてリン画像形成体(phosphorimager)により可視化した。フローサイ トメトリーアッセイのため、６×10⁵個の細胞を一次抗体とともに１時間インキ ュベーションし、次いでフルオレセイン結合物とともにインキュベーションした 。細胞をベクトン ディッキンソン(Beckton Dickinson)ＦＡＣＳｃａｎで分析 した。間接的免疫蛍光染色を記述されたように（チェン(Chen)ら、1994）実施し た。 シンシチウム形成アッセイ。皿上で成長されたＨｅＬａ−Ｔ４⁺細胞（約50％ 集密(confluence)）を、リン酸カルシウムシステム（プロメガ(Promega)）を使 用して多様な量のケモカイン発現プラスミドＤＮＡとともにｐＣＭＶ−ＣＣＲ５ でコトランスフェクションした。同時に、ＨｅＬａ細胞を、ＴもしくはＭφ向性 のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質発現ベクターでトランスフェクションした 。48時間後に、エンベロープタンパク質を発現するトランスフェクションされた ＨｅＬａ細胞（２×10⁵個）を、コトランスフェクションされたＨｅＬａ−Ｔ４⁺ 細胞（１×10⁵個）と共培養した。12ないし24時間の共培養後に各ウェル中のシ ンシチウムをバイオレットクリスタル染色後に計数した。 レトロウイルスパッケージング細胞系の発生および遺伝子導入。ＭＩ Ｐ／ＫもしくはＲＡＮＴＥＳ／Ｋ遺伝子を含有するレトロウイルスのｐＬＮＣＸ ベクター（図２）を両栄養性パッケージング細胞（ＰＡ３１７）にトランスフェ クションし、そしてトランスフェクションされた細胞の培養培地をその後使用し てＰＡ３１７細胞を感染させた。48時間後に、感染したパッケージング細胞を、 Ｇ４１８（800μg/ml）含有培地を用いて２ないし３週間選択した。Ｇ４１８抵 抗性のコロニーを二次クローニングし、そして遺伝子分析により特徴づけして、 パッケージング細胞の染色体への当該遺伝子の完全な取り込みを確認した。ヒト ＰＢＬを生じさせるため、健康な個体からのＰＢＭＣをフィコールーハイパーク (Ficoll-Hypaque)密度勾配で分離し、そして非付着性のＰＢＬを培養培地（ｒＩ Ｌ−２（1,000IU/ml）（カイロン(Chiron)、カリフォルニア州）抗ＣＤ３（５ng /ml）（ファーミンゲン(PharMingen)、カリフォルニア州）およびＰＨＡ（５μg /ml）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０／20％ＦＣＳ）中で48時間刺激した。刺 激されたＰＢＬ細胞をその後、硫酸プロタミン（５μg/ml）を含有する培養培地 中での組換えパッケージング細胞との48時間の共培養により形質導入した。形質 導入されたＰＢＬを収穫し、そして１日間培養し、次いで追加の２日間組換えパ ッケージング細胞の上清中で形質導入した。最後の形質導入後にＰＢＬを培養培 地中で数日間増殖させた。 ＨＩＶ−１感染およびＲＴアッセイ。10％ＦＣＳならびにｒＩＬ−２（1,000I U/ml）および抗ＣＤ３（５ng/ml）で補充されたＲＰＭＩ培地中のＰＢＬを、そ れぞれ600半最大組織培養物感染性用量単位(half-maximal tissue-culture infe ctious dose unit)（ＴＣＩＤ₅₀）もしくは20,000cpmのＲＴ活性のＭφもしくは Ｔ向性のＨＩＶ−１ウイルスに感染 させた。37℃で４時間のインキュベーション後、感染したＰＢＬをその後１回洗 浄し、そして培養培地に再懸濁し、そしてこれらの培養物中のＲＴ活性をその後 、記述されたように（チェン(Chen)ら、1996）測定した。 実施例２ 小胞体内腔へのケモカインのターゲッティング 突然変異されたケモカインを、新たに合成されたＣＣＲ５の輸送および表面の 発現を細胞内で封鎖するように、リンパ球のＥＲの内腔にターゲッティングした 。これは表現型のＣＣＲ５ノックアウトをもたらした（図１）。 居住性(residential)の可溶性ＥＲタンパク質の残留シグナル配列（ＫＤＥＬ ）（ムンロ(Munro)とペルハム(Pelham)、1987）と結合されたＭＩＰ−１αおよ びＲＡＮＴＥＳ、ならびにそれらの突然変異された遺伝子（ＭＩＰＩ−Ｋおよび ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ）を、Ｎｅｏマーカーをもっ発現ベクター（ｐＲｃ／ＣＭＶ） にクローニングした（図２）。天然のおよび突然変異されたケモカイン双方の共 発現のためのバイシストロニックベクターもまた、細胞内および細胞外双方でＨ ＩＶ感染を阻害するよう構築した。これらの２形態のケモカインの発現は、ケモ カインを分泌することにより感受性細胞に対する、ならびに細胞内結合により表 現型上でノックアウトのＣＣＲ５に対するウイルス感染を阻害する（図２）。 天然のおよび突然変異されたケモカインの発現および局在化を測定するため、 放射標識および免疫沈降研究を実施した。ＣＯＳ細胞をプラスミドＤＮＡでトラ ンスフェクションし、そして48時間後に³⁵Ｓ−システインで放射標識した。細胞 ライセートおよび培養培地をその後抗ヒトＭ ＩＰ−１αで免疫沈降させた。ＭＩＰ−１αに対応する１個の８Kdのタッパク質 のバンドが、ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１でトランスフェクションされた細胞の培養培地 および細胞ライセート双方で見出されたが、しかし対照の細胞ではされなかった 。 ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋでトランスフェクションされた細胞では、ＭＩＰ−１ αタンパク質が培養培地でなく細胞ライセート中に優勢に見出された。ＭＩＰ１ −Ｋの細胞の保持をさらに測定するため、トランスフェクションされた細胞を30 分間パルス放射標識し、多様な時間の間追跡し、そしてその後免疫沈降させた。 ＭＩＰ１−Ｋタンパク質は４時間を越える半減期で細胞内で安定に保持されたこ とが見出された。バイシストロニック発現ベクターでトランスフェクションされ た細胞では、ＭＩＰ１およびＭＩＰ１−Ｋ双方のタンパク質が共発現された。 天然のおよび突然変異されたケモカインの局在化を免疫蛍光染色によりさらに 検査した。ＥＲを染色するパターンがｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋでトランスフェク ションされた細胞の細胞質全体で観察された一方、核周辺のゴルジを染色するパ ターンがｐＣＭＶ−ＭＩＰ１でトランスフェクションされた細胞でみられた。天 然のおよび突然変異されたＲＡＮＴＥＳタンパク質もまた、天然のおよび突然変 異されたＭＩＰ１タンパク質と類似の様式で、トランスフェクションされた細胞 で発現された。従って、これらの結果は、突然変異されたケモカインが効果的に 発現されかつＥＲ中に安定に保持された一方、天然のケモカインは細胞から分泌 されたことを示す。 実施例３ ＣＣＲ５の表面の発現に対するイントラカインの影響 ＣＣＲ５の表面の発現に対するイントラカインの影響を検査するため、ＨＡエ ピトープ（リウ(Liu)ら、1996；フィールド(Field)ら、1988）で標識されたＣＣ Ｒ５の発現のためのベクターを構築した（図２）。フローサイトメトリーアッセ イを使用して、イントラカインを発現するベクターでコトランスフェクションさ れた細胞上でのＨＡ−ＣＣＲ５の表面の発現を測定した。 図３Ｂに示されるように、ｐＣＭＶ−ＨＡ−ＣＣＲ５単独でトランスフェクシ ョンされた場合、ＨＡ−ＣＣＲ５の細胞表面の発現が64.7％の細胞で検出された 。しかしながら、増大する量のｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋでコトランスフェクショ ンされた場合、ＨＡ−ＣＣＲ５にっいて陽性の表面染色を伴う細胞数は劇的に減 少した（図３Ｃおよび図３Ｄ）。ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋでのコトランスフェク ションは、無関係のマウス白血病ウィルスエンベロープタンパク質（マツオカ(M atsuoka)ら、J．Biol．Chem.、269:22565-22573、1994）の細胞表面の発現を妨 害しなかった。この結果はＣＣＲ５の表面の発現がイントラカインにより封鎖さ れることを立証する。 ＨＡ−ＣＣＲ５の表面の発現の封鎖がＭＩＰ１−Ｋの新規に合成されたＨＡ− ＣＣＲ５への細胞内結合の結果であるかどうかを決定するため、共免疫沈降アッ セイを実施した。ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−ＫおよびｐＣＭＶ−ＨＡ−ＣＣＲ５でコ トランスフェクションされた細胞では、ＭＩＰ１−Ｋタンパク質が抗ＨＡ抗体に より共沈降された。共免疫沈降の特異性は、抗ＨＡ抗体が、ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１ −Ｋ単独でトランスフェクションされたかもしくはウイルスのＰＴＶ Ｇタンパ ク質のような無関係のタンパク質を過剰発現するベクター（マツオカ(Matsuoka) ら、1994；チェ ン(Chen)ら、1994）でコトランスフェクションされた細胞でＭＩＰ１−Ｋを沈降 させなかったという観察結果を基礎としてさらに確認された。 ＣＣＲ５タンパク質の区別できないバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に出現しなか ったことが示されたが、とは言え特異的共免疫沈降およびフローサイトメトリー のデータは細胞中でのＨＡ−ＣＣＲ５の発現を示した。不均一なグリコシル化パ ターンもしくは他の未同定の特性は、前の研究（リウ(Liu)ら、1996；シュトラ ダー(Strader)ら、1994）で観察されたように、ポリアクリルアミドゲル上のこ れらのレセプターの異常な移動に寄与するかも知れない。総合すれば、これらの 結果は、ＥＲに保持されたイントラカインが新規に合成されたＣＣＲ５分子を結 合し、そして細胞表面へのそれらの輸送を予防することを示す。 実施例４ ＣＣＲ５に対するイントラカインの影響 ＣＣＲ５に対するイントラカインの影響をさらに検査するため、感受性のＣＣ Ｒ５／ＣＤ４仲介性のシンシチウム形成アッセイを実施した（テン(Deng)ら、19 96）。ＣＤ４を発現する形質転換された細胞（ＨｅＬａ−Ｔ４⁺）(マラスコ(Mar asco)ら、1993）を、多様な量のｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−ＫとともにｐＣＭＶ−Ｃ ＣＲ５でコトランスフェクションし、そして48時間後に、Ｍφ（ＡＤＡおよびＹ Ｕ２）もしくはＴ（IIIＢ）向性のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（チョウ( Choe)ら、1996）を発現するＨｅＬａ細胞と12ないし24時間共培養した。 図３Ｅに示されるように、ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋを発現する細胞との共培養 物中で、Ｍφ向性エンベロープ仲介性のシンシチウム形成の有意の阻害が観察さ れた。増大する量のｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋでコトラ ンスフェクションされた場合には、Ｍφ向性エンベロープ仲介性のシンシチウム 形成がほぼ完全に阻害された。しかしながら、Ｔ向性エンベロープ仲介性のシン シチウム形成はｐＣＭＶ−ＭＩＰ１−Ｋでのトランスフェクションにより阻害さ れなかった。多様な程度でのＭφ向性エンベロープタンパク質のシンシチウム形 成に対する阻害効果は、ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１、ｐＣＭＶ−ＭＩＰ１／Ｋ、ｐＣＭ Ｖ−ＲＡＮＴＥＳ、ｐＣＭＶ−ＲＡＮＴＥＳ−ＫもしくはｐＣＭＶ−ＲＡＮＴＥ Ｓ／Ｋでコトランスフェクションされた細胞でもまた観察された（図３Ｅ）。天 然の（分泌性）ＭＩＰ−１もしくはＲＡＮＴＥＳの発現によるシンシチウム形成 の阻害はＣＣＲ５上の結合部位の部分的飽和によるかも知れない。 潜在的な治療上の応用を評価するため、バイシストロニック発現カセト（ＭＩ Ｐ１／ＫおよびＲＡＮＴＥＳ／Ｋ）をマウスのレトロウイルスシャトルベクター ｐＬＮＣＸ（ミラー(Miller)、1992）にクローニングした（図２）。ケモカイン 遺伝子を含有する組換えレトロウイルスを産生する形質転換されたパッケージン グ細胞系（ＰＡ３１７）（ミラー(Miller)、1992）を生じさせ、そして特徴づけ した。新鮮なヒトＰＢＬをその後、形質転換されたパッケージング細胞との共培 養によりＭＩＰ／Ｋ遺伝子で形質導入した。形質導入後に、ケモカイン遺伝子お よびＩＲＥＳ配列に対応する特異的ＤＮＡ断片を、形質導入されたＰＢＬのゲノ ムＤＮＡからＰＣＲ（商標）により増幅した。ＭＩＰ−１およびＭＩＰ１−Ｋタ ンパク質の発現は、形質導入されたＰＢＬ中で放射標識および免疫沈降アッセイ により検出されたがしかし形質導入されないＰＢＬではされなかった。 形質導入されたもしくは模倣形質導入されたＰＢＬをその後、それぞ れＭφもしくはＴ向性のＨＩＶ−１単離物に感染させ、そして細胞培養物中のウ イルス産生を逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ（チェン(Chen)ら、1994）により検査 した。形質導入されたもしくは形質導入されないＰＢＬ（２×10⁵個）を、600Ｔ ＣＩＤ₅₀もしくは20,000cpmのＲＴの数種のＭφもしくはＴ向性のＨＩＶ−１ウ イルスに４時間等しく感染させ、そしてその後1,000IU/mlのｒＩＬ−２および抗 ＣＤ３（５μg/ml）を含有する新鮮な培養培地で置き換えた。３ないし４日ごと に各ウェル中の細胞数を計数し、そして培養培地をＲＴアッセイにかけた。バッ クグラウンドを差し引いた後の複製物ウェル中のＲＴ活性（細胞10⁵個/ml）を算 出した。低レベルのＲＴ活性のみが、Ｍφ向性のウイルスに感染した形質導入さ れたＰＢＬの培養物中で検出されたが、しかし、高レベルのＲＴ活性が対照のＰ ＢＬ培養物中で検出された。しかしながら、Ｔ向性のＨＩＶ−１ウイルスは、形 質導入されたおよび模倣形質導入された双方のＰＢＬを感染させることが可能で あった。これらの結果は、イントラカイン遺伝子で形質導入されたヒトＰＢＬが Ｍφ向性のＨＩＶ−１感染に抵抗性であることを示す。 実施例５ ＨＩＶ−１の遺伝子治療のためにＣＸＲ４レセプターを不活性化するための細胞 内ＣＸＣ−ケモカインを発現するリンパ球の遺伝子改変 ７回膜貫通区分をもつフューシン／ＣＸＣ−ケモカインレセプター（ＣＸＲ） −４はＴ向性のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−タイプ１のコレセプターであ り、これは融合およびＣＤ４陽性リンパ球への進入に必要とされる。ＨＩＶ−１ 感染のためのＣＸＲ４の決定的に重要な役割のため、発明者は、ＣＸＲ４の表現 型のノックアウトをもつリンパ球がＨ ＩＶ感染に抵抗性であるとみられると仮定した。この研究では、ＣＸＲ４の生物 学的リガンド、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ）を、リンパ球の内腔小胞体（Ｅ Ｒ）をターゲッティングするよう遺伝子的に改変した（図４Ａ）。結果として、 細胞内に保持されたＳＤＦは新規に合成されたＣＸＲ４を結合し、そして細胞表 面へのその輸送を予防した。 表現型のＣＸＲ４ノックアウトをもつリンパ球はＴ向性のＨＩＶ−１感染に抵 抗性であった。加えて、分泌性およびＥＲに保持されるケモカインの共発現をウ イルス感染の付加的阻害のため達成した。要約すれば、ＣＸＲ４コレセプターに 唯一標的を定めるこの新規アプローチは、ＨＩＶ−１の遺伝子治療のための重要 な応用を有するはずである。 マクロファージ向性のＨＩＶ−１のコレセプター、ＣＣ−ケモカインレセプタ ー（ＣＣＲ）−５の遺伝子欠損は、ＨＩＶ−１感染に対する若干の個体の生得の 抵抗性の原因であることが見出された。これらのデータは、リンパ球中のＣＸＲ ４のノックアウトが治療上の意味を有するかも知れないことを示唆する。発明者 および他者の研究において、膜タンパク質の細胞表面の発現の封鎖が、イントラ ボディもしくはＥＲにターゲッティングされた他の分子の細胞内結合により成し 遂げられた（マラスコ(Marasco)ら、1993；チェン(Chen)ら、1995a；チェン(Che n)ら、1995b；ブオノコア(Buonocore)とローズ(Rose)、1990)。本研究では、突 然変異されたＳＤＦを、新規に合成されたＣＸＲ４の輸送および表面の発現の細 胞内封鎖のためリンパ球のＥＲの内腔をターゲッティングするために生じさせた （図４Ａ）。細胞表面上にコレセプターＣＸＲ４をもたない遺伝子的に改変され たリンパ球は、Ｔ向性のＨＩＶ−１感染に抵抗性であることが見出された。 ＳＤＦ−１遺伝子を、ヒトＳＤＦ−１とのただ１個のアミノ酸の差異をもつマ ウス脾のｃＤＮＡからクローニングし、そしてその後、居住性の可溶性ＥＲタン パク質の残留シグナル配列（ＫＤＥＬ）（ムンロ(Munro)とペルハム(Pelham）、 1987)と遺伝子的に結合した。ＳＤＦ遺伝子およびその誘導体（ＳＤＦ−Ｋ）を その後、Ｎｅｏ選択マーカーをもつ発現ベクター（ｐＲｃ／ＣＭＶ）にクローニ ングした（図４Ａ）。天然のおよび突然変異されたケモカインの共発現のための バイシストロニックベクターもまた、ケモカインの細胞外分泌により感受性細胞 に対する、ならびに細胞内結合により表現型上でノックアウトのＣＸＲ４に対す るウイルス感染を阻害するために構築した（図４Ａ）。 形質導入されたリンパ球のＴ向性のＨＩＶ−１感染に対する抵抗性を図４Ｂに 示す。ＳＤＦ、ＳＤＦ−Ｋを発現する形質導入された細胞、もしくは形質導入さ れないＪｕｒｋａｔ細胞（２×10⁵個）を、600ＴＣＩＤ₅₀のＴ向性のＨＩＶ−１ ウイルスに４時間等しく感染させ、そしてその後新鮮な培養培地とともに置いた 。バックグラウンドレベルを差し引いた後の複製物ウェル中のＲＴ活性を提示す る（図４Ｂ）。 実施例６ ＣＸＣＲ４の表面の発現に対する細胞内ＳＤＦ−イントラカイン発現の影響 ＳＤＦ−１α遺伝子およびＥＲ残留シグナル配列（ＫＤＥＬ）（マラスコ(Mar asco)ら、1993）と結合された改変された遺伝子を発現ベクターにクローニング した（図２）。インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）標識(tag)（フィールド( Field)ら、1988）を含有する構築物もまたタンパク質の検出を助長するために生 じさせた。ＳＤＦ−１およびＳＤＦ− Ｋタンパク質の発現を放射標識および免疫沈降分析により測定した。ＨＡ標識に 対する抗体により沈降されたＳＤＦ−１タンパク質のバンドは、ＨＡ標識を伴う 天然のＳＤＦ−１遺伝子を含有する構築物（ｐＣＭＶ−ＳＤＦ−ＨＡ）でトラン スフェクションされたＨｅＬａ細胞の培養培地およびライセート双方で見出され た。対応するタンパク質のバンドは対照プラスミドでトランスフェクションされ た細胞で検出されなかった。しかしながら、ＳＤＦ−Ｋタンパク質はトランスフ ェクションされた細胞の培養培地でなく細胞ライセート中に優勢に見出され、天 然のＳＤＦ−１が細胞から分泌されたがしかし改変されたＳＤＦ−Ｋ（ＳＤＦ− イントラカイン）は細胞内に保持されたことを示唆した。ＳＤＦ−Ｋの細胞内保 持をさらに立証するためにパルスチェイス実験を実施した。天然のＳＤＦ−１が 細胞から効率的に分泌された一方、ＳＤＦ−イントラカインは４時間より大きな 半減期で細胞内に安定に保持されたことが示された。 ＳＤＦ−イントラカインの発現によるＣＸＣＲ４の表面の発現の阻害を、その 後、感受性のＣＸＣＲ４／ＣＤ４仲介性のシンシチウム形成アッセイ（ブルエル (Bluel)ら、1996；マラスコ(Marasco)ら、1993）を使用して検査した。12穴プレ ート上に植え付けられたＣＸＣＲ４およびＣＤ４陽性のＨｅＬａ−Ｔ４細胞を、 IIIＢエンベロープ発現体(expressor)（マラスコ(Marasco)ら、1993）およびＳ ＤＦ発現ベクターでコトランスフェクションした。エンベロープ発現体のみでト ランスフェクションされた、もしくは対照ベクターとともにコトランスフェクシ ョンされた細胞では、広範囲のシンシチウム形成が観察された。しかしながら、 ｐＣＭＶ−ＳＤＦ−Ｋでコトランスフェクションされた細胞では、多核(p olykaryon)は全く形成されないかもしくはわずかにのみ形成された。ｐＣＭＶ− ＳＤＦでのコトランスフェクションはシンシチウム形成を部分的に阻害した。３ 回の反復された研究はシンシチウム形成に対するＳＤＦ−イントラカインの一貫 した阻害効果を示した。共免疫沈降アッセイをさらに実施してイントラカィンお よびＣＸＣＲ４の可能な細胞内結合を測定した。ＳＤＦ−イントラカインは、ｐ ＣＭＶ−ＳＤＦ−ＫでトランスフェクションされたＣＸＣＲ４陽性のＨｅＬａ細 胞（ブルエル(Bluel)ら、1996）から抗ＣＸＣＲ４抗体を使用して共沈降され、 ＳＤＦ−イントラカインおよびＣＸＣＲ４の会合を示唆した。加えて、ＳＤＦ− Ｋを発現する形質導入されたリンパ球上のＣＸＣＲ４の表面の発現は、フローサ イトメトリーアッセイにより立証されたように劇的に減少した。総合すれば、こ れらの一過性アッセイからの結果は、ＳＤＦ−イントラカインが新たに合成され たＣＸＣＲ４を結合しかつ細胞表面へのその輸送を封鎖することを示唆する。 発現ベクターの構築：ヒト遺伝子との単一のアミノ酸の差異をもつマウスＳＤＦ −１α遺伝子を、プライマ−５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣ ＧＣＣＡＡＧＧＴＣ−３’（配列番号２）（Ｐ１）および５’−ＴＴＴＧＣＧＧ ＣＣＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴ−３’（配列 番号３）（ナガサワ(Nagasawa)ら、1994；シロズ(Shirozu)ら、1995）を用いて マウス脾のｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＨＡ標識配列（配列番号１と本明細書 で同定される）を、配列番号２として呼称されるプライマーおよび５’−ＴＴＴ ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡ ＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号４）を用 いるＰＣＲ反応によりＳＤＦ−１α遺伝子に結合した。ＳＤＦ−１αもしくはＳ ＤＦ−１α−ＨＡ遺伝子をその後、プライマー（Ｐ１および５’−ＴＴＴＴＣＴ ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＡＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧ ＡＡＣＡＴＣＡＴＡ−３’（配列番号５））を用いるＰＣＲ反応によりＥＲ残留 シグナル（ＳＥＫＤＥＬ）配列番号６）に結合した。これらのＤＮＡ断片をＨｉ ｎｄIII／ＸｂａＩで消化し、そして発現ベクター（ｐＲｃ／ＣＭＶ）（マラス コ(Marasco)ら、1993）にクローニングした。ＳＤＦ−１α−ＫＤＥＬ断片をレ トロウイルスベクターｐＬＮＣＸ（チェン(Chen)ら、1997）にさらにクローニン グし、そして結果として生じる構築物をＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋ／Ｎｅｏと呼称し た。ＭＮベクターＤＮＡからＰＣＲ増幅された、短くされた神経成長因子レセプ ター（ΔＮＧＦＲ）遺伝子（フィリップス(Phillips)ら、1996；ルドール(Rudol l)ら、1996）を、ネオマイシン選択マーカーを置き換えることによりＬＮＣＸ− ＳＤＦ−Ｋ／Ｎｅｏにクローニングした。構築物の全部を制限酵素消化により同 定し、かつ、ＤＮＡ配列決定により確認した。 実施例７ イントラカインを発現するリンパ球系の発生および評価 ＳＤＦ−イントラカイン発現の影響をさらに決定するため、２種のＣＤ４／Ｃ ＸＣＲ４+不死リンパ球系、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４（マラスコ(Marasc o)ら、1993；ダニエル(Daniel)ら、J．Virol．62、4123-4128、1988）を、電気 穿孔法により多様な発現ベクターでトランスフェクションし、次いでＧ４１８で 選択した（チェン(Chen)ら、1994a；チェン(Chen)ら、Nature 385、78-80、1997 ）。形質導入されたリン パ球へのＳＤＦベクターの取り込みをゲノムのＰＣＲ増幅により立証した。取り 込まれたＳＤＦ１もしくはＳＤＦ−Ｋ遺伝子の転写もまた逆転写酵素（ＲＴ）− ＰＣＲにより検出した。さらに、発現されたＳＤＦ−１は形質導入されたリンパ 球から分泌されることが見出された一方、ＳＤＦ−イントラカインはリンパ球の 内側に保持された。形質導入されたリンパ球のＣＸＣＲ４の表面の発現に対する ＳＤＦ−イントラカインの影響をフローサイトメトリーアッセイ（チェン(Chen) ら、1994a）により検査した。ＣＸＣＲ４の表面の発現はＭｏｌｔの対照で検出 されたが、しかしＭｏｌｔ−ＳＤＦ−Ｋで劇的に減少した。対照的に、匹敵する レベルのＣＤ４の表面の発現が親および形質導入された双方のＭｏｌｔで検出さ れた。細胞増殖およびＤＮＡ合成速度を包含する形質導入されたリンパ球の生物 学的特徴は、親リンパ球に類似であることが見出された。 ＳＤＦ−イントラカインの発現がＴ向性のＨＩＶ−１の進入に対する形質導入 されたリンパ球の抵抗性につながることができるかどうかを決定するためにエン ベロープ相補アッセイを使用した。このアッセイでは、トランスに発現されたＨ ＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質が、クロラムフェニコールアセチルトランス フェラーぜ（ＣＡＴ）遺伝子をコードするエンベロープ欠失プロウイルスの単一 回の複製を相補する（チェン(Chen)ら、1994b；チョウ(Choe)ら、1996）。Ｔ向 性（IIIＢ）ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質で偽分類された(pseutoty ped)組換えウイルスを産生させ、そして、組換え偽ウイルスの進入の効率を感染 後60時間の細胞中のＣＡＴ活性を測定することにより評価した。対照のリンパ球 での高レベルのＣＡＴ活性が組換えIIIＢウイルスでの感染後に検出されたが、 しかし、ＳＤＦ−イントラカインを発現する形質導入さ れたリンパ球でのＣＡＴ活性レベルは劇的に低下した。天然のＳＤＦ−１を発現 する形質導入されたリンパ球のウイルス進入の部分的阻害は、ＳＤＦ−１分泌の 間および後のＣＸＣＲ４上の結合部位の部分的飽和によるかも知れない。 ＳＤＦ−イントラカインの影響をさらに検査するため、形質導入されたもしく は対照のＭｏｌｔリンパ球を20,000cpmのＲＴのＴ向性のIIIＢウイルスに感染さ せた。Ｍｏｌｔの対照での広範囲のシンシチウム形成が感染後６日に観察された 一方、数個のシンシチウムのみがＭｏｌｔ−ＳＤＦ−Ｋ細胞培養物で観察された 。一致して、高レベルのＲＴ活性がＭｏｌｔの対照の培養物で検出されたが、し かし、低レベルのＲＴのみがＭｏｌｔ−ＳＤＦ−Ｋ培養物で検出された。天然の ＳＤＦ−１を分泌するＭｏｌｔ−ＳＤＦはウイルス感染に対し部分的に抵抗性で あった。この結果を確認するため、形質導入されたもしくは形質導入されないＪ ｕｒｋａｔリンパ球もまたIIIＢウィルスに感染させ、そしてＳＤＦ−イントラ カインの劇的な抗ＨＩＶ効果が形質導入された細胞でもまた観察された。従って 、この結果は、ＳＤＦ−イントラカインを発現する形質導入されたリンパ球が生 存可能かつＴ向性のＨＩＶ−１感染に抵抗性であることを示す。 形質転換されたリンパ球系の発生：約１×10⁶個のＭｏｌｔ−４およびＪｕｒｋ ａｔヒト不死リンパ球を、10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で補充されたＲＰＭＩ− １６４０培地中で培養し、そして電気穿孔法（ヤン(Yang)ら、Nature Biotechno logy 15、46-51、1997）により10μgのプラスミドＤＮＡでトランスフェクショ ンした。48時間後、トランスフェクションされたリンパ球をその後、800μg/ml のＧ４１８（ギブコ−ＢＲ Ｌ(Gibco-BRL)）を含有するＲＰＭＩ−１６４０／10％ＦＣＳ中で24穴プレート 上で２ないし３週間選択した。Ｇ４１８抵抗性の細胞を拾い、そして別の場所に 記述された（チェン(Chen)ら、1994a）（引用により本明細書に組み込まれる） ように制限希釈により二次クローニングした。エンベロープ相補アッセイ。10cm 皿上で成長された２９３細胞を、ｐＨＸＢΔｅｎｖＣＡＴ（20μg）およびエン ベロープタンパク質発現体（５μg）（チェン(Chen)ら、1994b；チョウ(Choe)ら 、1996）でコトランスフェクションした。48時間後に培養培地を収穫し、そして 上清中のＲＴ活性を測定した（ヤン(Yang)ら、1997）。組換えウイルス(20,000c pmのＲＴ活性）を使用して一夜インキュベーションにより標的細胞を感染させ、 そして60時間後、標的細胞をその後溶解しかつキット（プロメガ(Promega)）を 使用するＣＡＴ活性の測定に使用した。 タンパク質発現の検出およびフローサイトメトリーアッセイ。組換えタンパク質 を標識しかつ免疫沈降させるため、細胞を多様な時間の間³⁵Ｓ−システインもし くは−トランス(-Trans)で放射標識し、そして細胞ライセートおよび培養培地を その後、別の場所に記述された（チェン(Chen)ら、1996、引用により本明細書に 組み込まれる）ように抗体で沈降させた。熱変性後にタンパク質サンプルをＳＤ Ｓ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分析しそしてリン画像形成体に より可視化した。フローサイトメトリーアッセイのために、１×10⁶個のリンパ 球を一次抗体とともに１時間インキュベーションし、次いでフルオレセイン結合 物とともにインキュベーションした。細胞をその後ベクトン ディッキンソン(B ecktonDickinson)ＦＡＣＳｃａｎで分析した。 実施例８ 形質導入されたＰＢＬのＨＩＶ−１感染に対する抵抗性 以下の実施例はヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）にＨＩＶ−１感染に対する抵抗 力を与えるＳＤＦ−イントラカインの能力を立証する。最初に、ＰＢＬを、ＳＤ Ｆ−ＫおよびＮｅｏ選択マーカーを含有する組換えレトロウイルスで形質導入し （図２）、そしてＮｅｏ選択後の形質導入されたＰＢＬでのウイルス感染は劇的 に阻害された。しかしながら、一次ＰＢＬに対する非特異的毒性、形質導入効率 を確かに評価することにおける困難、およびＮｅｏ選択の延長された過程により 、形質導入された細胞上で発現する短くされたヒト神経成長因子レセプター（Δ ＮＧＦＲ）を、遺伝子導入効率を定量しかつ形質導入されたＰＢＬを単離するた めのマーカーとして使用した（フィリップス(Phillips)ら、Nature Medicine 2 、1154-1156、1996；ルドール(Rudoll)ら、Gene Therapy 3、695-705、1996）。 刺激されたＰＢＬの約７ないし10パーセントが、組換えレトロウイルスベクター （ＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋ／ΔＮＧＦＲ）、もしくは一過性にトランスフェクショ ンされたパッケージング細胞（Ｂｉｎｇ）（ペア(Pear)ら、Pro．Nat．Acad．Sc i．USA．90、8392-6、1993；ペア(Pear)ら、Methods in Molecular Biology：Me thods in Gene Therapy（ロビンス(P．Robbins)編）、（ヒューマナ プレス(Hu mana Press)、ニュージャージー州トトワ）、41-57、1997）から産生されるΔＮ ＧＦＲマーカーのみを発現する対照レトロウイルスベクター（ＭＮ）により形質 導入された。形質導入されたＰＢＬをその後、抗ＮＧＦＲ／抗ＩｇＧ磁性ビーズ キット（イムノテック インク(ImmunoTech Inc.)、メーン州ウェストブレイク ）を用いて単離した。単離後、ＰＢＬ集団の93パーセント以上がＮＧＦＲマーカ ーについて陽性であった。 ＳＤＦ−イントラカインの抗ＨＩＶ−１効果を評価するため、ＬＮＣＸ−ＳＤ Ｆ−Ｋ／ΔＮＧＦＲもしくはＭＮ対照のいずれかで形質導入された単離されたＰ ＢＬを同一のIIIＢウイルス接種材料に感染させ、そして培養物中のウイルス産 生をＲＴアッセイにより検査した。低レベルのＲＴ活性のみが、形質導入された ＰＢＬの培養物で検出されたが、しかし、高レベルのＲＴはＭＮ（対照）で形質 導入されたＰＢＬ培養物で検出された。かように、ＳＤＦ−イントラカイン遺伝 子は一次ヒトＰＢＬ中に効率的に形質導入され、そして形質導入されたＰＢＬは Ｔ向性のＨＩＶ−１感染に抵抗性であった。 形質導入されたＰＢＬの生物学的評価 ＳＤＦ−イントラカインを発現するいくつかのリンパ球系が正常な生物学的特 徴を有することが示されたとは言え、一次ヒトリンパ球に対するＳＤＦ−イント ラカインの発現の影響を検査した。従って、新鮮なヒトＰＢＬをＬＮＣＸ−ＳＤ Ｆ−Ｋ／ΔＮＧＦＲもしくはＭＮベクターで形質導入し、そして形質導入された ＰＢＬを単離した。いくつかの生物学的分析を実施した。最初に、ＬＮＣＸ−Ｓ ＤＦ−Ｋ／ΔＮＧＦＲもしくはＭＮのいずれかで形質導入されたＰＢＬをフロー サイトメトリー分析にかけた。ＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋ／ΔＮＧＦＲもしくはＭＮ で形質導入されたＰＢＬ上でのＣＤ３およびＣＤ４分子の匹敵するレベルの表面 の発現が存在した。 対照的に、ＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋ／ΔＮＧＦＲで形質導入されたＰＢＬ上でのＣ ＸＣＲ４の表面の発現は、ＭＮで形質導入されたＰＢＬ上でのＣＸＣＲ４発現と 比較された場合に劇的に減少した。これらの結果はＳＤＦ−イントラカインがＣ ＸＣＲ４の表面の発現を選択的に封鎖するこ とを示す。化学走性アッセイもまた、ケモカイン刺激に対する形質導入されたＰ ＢＬの応答性を決定するために実施した。ＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋで形質導入され たＰＢＬの組換えＳＤＦ−１の刺激に対する応答性は、対照のＭＮで形質導入さ れたＰＢＬのものと比較された場合に有意に低下した。しかしながら、ＬＮＣＸ −ＳＤＦ−ＫもしくはＭＮで形質導入されたＰＢＬは、ＣＣ−ケモカインレセプ ター（バッジョリーニ(Baggiolini)ら、1994）に結合するＭＩＰ−１αの刺激に 対し等しく感受性であった。これらの結果はＳＤＦ−イントラカインによるＣＸ ＣＲ４の選択的不活性化をさらに立証する。ＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋで形質導入さ れたＰＢＬの一部分が、おそらくＰＢＬの一部分上の残余のＣＸＣＲ４、もしく はＣＸＣＲ４以外のケモカインレセプターとのＳＤＦ−１の未同定の相互作用に より、高濃度でＳＤＦ−１に応答したことが示された。第三に、ＬＮＣＸ−ＳＤ Ｆ−Ｋ／ΔＮＧＦＲで形質導入されたＰＢＬが、ＩＬ−２産生、細胞増殖および ＤＮＡ合成で抗ＣＤ３／ＣＤ２８もしくはＰＨＡ刺激に正常に応答することもま た示された。従って、これらの結果は、ＳＤＦ−イントラカインを発現するヒト ＰＢＬが正常な生物学的活性を維持することを示唆する。 レトロウイルスベクターの産生および遺伝子の形質導入。健康な個体からのＰＢ ＭＣをフィコール−ハイパーク(Ficoll-Hypaque)密度勾配で分離し、そして非付 着性のＰＢＬを培養培地（ｒＩＬ−２（500IU/ml）（カイロン(Chiron)、カリフ ォルニア州）および抗ＣＤ３（５ng/ml）（ファーミンゲン(PharMingen)、カリ フォルニア州）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０／20％ＦＣＳ）中で48時間刺激 した。両栄養性レトロウイルスパッケージング細胞系Ｂｉｎｇを使用して組換え レトロウイルスベクタ ーを一過性に産生させた。Ｂｉｎｇ細胞を80％集密で100mm皿上で培養し、そし てリン酸カルシウムトランスフェクションキット（プロメガ(Promega)）を使用 することにより15μgのＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋ／ΔＮＧＦＲもしくはＭＮのプラ スミドＤＮＡでトランスフェクションした。48時間後に、刺激されたＰＢＬを、 ｒＩＬ−２、抗ＣＤ３および硫酸プロタミン（５μg/ml）を含有するトランスフ ェクションされたＢｉｎｇ細胞の上清中で37℃で24ないし72時間培養した。形質 導入されたＰＢＬを収穫し、そしてフローサイトメトリー分析にかけてＰＢＬ上 のＮＧＦＲマーカーを検出した。 形質導入されたＰＢＬの単離：マウスＩｇＧのＦｃ断片に向けられた親和性精製 されたヒツジポリクローナル抗体で直接被覆された１ミクロンの球形粒子、抗マ ウスＩｇＧ磁性イムノビーズ（イムノテック インク(ImmunoTech Inc.)）をＰ ＢＳ／0.2％ＢＳＡ中で20倍希釈した。緩衝溶液からのビーズの分離を、チュー ブをコバルト−サマリウム磁石支持体(magnet support)（イムノテック インク (Immuno TechInc.)）中に５分間置くことにより達成した。５ないし20μgの抗ヒ トＮＧＦＲ抗体（ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim)、インジア ナ州インジアナポリス）をＰＢＳ／0.2％ＢＳＡ中の１ないし４mgのビーズに添 加し、そして室温で15分間インキュベーションした。ＰＢＳ／1.2％ＢＳＡで洗 浄した後、0.5mg（50μl）のビーズをＰＢＳ／30％ＦＣＳ中の10⁷個のＰＢＬ１m 1に添加し、そして室温で10分インキュベーションした。ビーズ／ＰＢＬ溶液を その後、コバルト−サマリウム磁石支持体中に10分間置き、そして結合されない 細胞を含有する上清を捨てた。ビーズ／ＰＢＬのロゼットをＰＢＳ／0.2％ＢＳ Ａで２回洗浄し、そして培養培 地に37℃で24時間再懸濁した。 化学走性アッセイ：ＬＮＣＸ−ＳＤＦ−Ｋ／ΔＮＧＦＲもしくはＭＮの対照のベ クターで形質導入された５×10⁵個の単離されたＰＢＬを、0.2５％ヒト血清アル ブミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地100μlに懸濁し、そして５μm孔のポ リカーボネートトランスウェル培養物挿入物(Transwell culture insert)（コス ター(Costar)、マサチューセッツ州ケンブリッヂ）の上部室に添加した。多様な 濃度の組換えヒトＭＩＰ−１αもしくはＳＤＦ−１（Ｒ＆Ｄシステム インク(R &D System Inc.)、ミネソタ州ミネアポリス）を含有する500μlのＲＰＭＩ−１ ６４０／0.25％アルブミンをトランスウェル(Transwell)の底部室に添加した。3 7℃で３時間のインキュベーション後に底部室中の細胞数を計数し、そして移転( transmigration)のパーセントを、バックグラウンド（ケモカインの非存在）の 移転を差し引いた後に提示する（ブルエル(Bluel)ら、1996）。 本明細書に開示されかつ特許請求される組成物および／もしくは方法の全部は 、本開示に照らして過度の実験なしに作成かつ実施され得る。本発明の組成物お よび方法は好ましい態様に関して記述された一方、変動が、本明細書に記述され る組成物および／もしくは方法に、ならびに当該方法の段階もしくはその一連の 段階において、本発明の概念、技術思想および範囲から離れることなく適用され てよいことが当業者に明らかであることができる。より具体的には、化学的およ び生理学的双方で関係するある作用物質が、同一のもしくは類似の結果が達成さ れるとみられる際に本明細書に記述される作用物質の代わりに用いられてよいこ とが明らかであることができる。当業者に明らかな全てのこうした類似 の置換および改変は、付属として付けられる請求の範囲により定義されるように 、本発明の技術思想、範囲および概念内にあると考えられる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION           Inactivation of HIV co-receptors as a treatment for HIV infection                                Background of the Invention 1. Field of the invention   The present invention relates generally to the field of HIV infection. More specifically, it is H Novel methods and compositions for the treatment of IV infection and confer HIV resistance About the method. 2. Description of related technology   Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) infection is occurring in both developed and developing countries Has been reported around the world. HIV-2 infection mainly in West Africa, Portugal And found in Brazil. As of 1990, between 800,000 and 1.3 million people in the United States It is estimated that there were individuals infected with HIV. For vaccine development against HIV Key obstacle to misunderstanding of immune mechanism against HIV infection That is. All infected individuals develop acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) Will not. Indeed, recent reports have shown that certain resistance to HIV-1 infection Suggest that there may be more individuals.   CC chemokine receptor (CCR) -5 is macrophage (Mφ) tropic Major co-receptor of human immunodeficiency virus (HIV) -1 (Cocchi et al., Science, 270: 1811-1815, 1995; Deng et al., Natu) re, 381: 661-666, 1996; Dragic et al., Nature, 381: 667-673, 1996; Alkhatib et al., Science, 272: 1955-1958, 1996; Choe et al., Ce. ll, 85: 1135-1148, 1996; Doranz et al., Cell, 85: 1149-1158, 1996). Some recent Studies have shown that individuals with a homozygous CCR5 deficiency have apparently been associated with a CCR5 deficiency. It was shown to be resistant to HIV-1 infection without significant clinical status. Hetero contact HIV-1 infected individuals with combined CCR5 deficiency show slower disease progression (Liu et al., Cell, 86: 367-377, 1996; Samson et al., Nature, 382) : 722-725, 1996; Dean et al., Science, 273: 1856-1862, 1996). in addition Some individuals whose lymphocytes express high levels of CC-chemokines are HIV- 1 Partially resistant to infection (Paxton et al., Nature Med., 2: 412-4 17, 1996).   In light of the foregoing data, preventing binding of HIV-1 to the CC receptor, And it would be therapeutically beneficial to prevent HIV-1 infection of cells thereby Can be One way to achieve this is to prevent cell surface expression of the receptor It seems that it is. There are numerous ways to block protein expression . These include homologous recombination, antisense and ribozyme technologies, and cell Includes single chain antibodies that bind proteins within. Each of these technologies is unique Has certain disadvantages. Homologous recombination techniques are difficult to use in clinical applications On the other hand, antisense and ribozyme technologies require the introduction of high concentrations of genetic material. , And also exhibit incomplete and non-specific effects. Monoclonal antibody approach Switches take a long time to develop, and antibodies may be too specific, Has a more complicated situation where it is not possible to achieve broad enough inhibition. I do.   Therefore, to prevent lymphocytes from giving HIV a chance to infect cells, CC Prevent chemokine receptors from being expressed on their cell surface It is clear that easy and efficient techniques to stop are needed.                                Summary of the Invention   The present invention relates to the treatment or prevention of HIV infection and AIDS or ARC patients Compositions and methods for use in the prevention or treatment of opportunistic infections in The present invention seeks to overcome certain disadvantages in the prior art. Book The invention relates to lymphocytes that are resistant to HIV infection due to lack of expressed co-receptors I will provide a. Coreceptors are CD4s, which are also required for HIV-1 infection Non-receptor means a receptor on the surface of lymphocytes that is required for HIV infection You. In one aspect of the invention, healthy lymphocytes that are resistant to HIV infection are provided to the patient. And thus maintain desired immune cell levels during HIV infection, This will help the patient resist secondary infection. The compositions disclosed herein and And methods inhibit viral replication by maintaining desired leukocyte levels Other such as AZT and / or protease inhibitors designed to It can be particularly effective with the form of treatment. This effectively resists the patient Buy the time needed for viral therapy to be effective.   The invention can be described in a broad aspect as an expression vector, The current region is in the 5 'to 3' orientation with the promoter; intracellular residual signal sequence (int region encoding racellular retention signal sequence); and chemokines A residual signal sequence and a chemokine in the cell. The encoding gene is expressed as a single intrakine transcript . The term "intrakine" refers to the lumen of the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, lysosomes, Intracellular vesicles or The signal sequence indicates that it is retained in the intracellular compartment like other intracellular organelles. Created by the inventor to show chemokine directed. The present invention Is preferably an internal ribosome entry site Secreted chemokines expressed from (IRES) may also code. Secreted The chemokine is preferably a chemokine receptor identical to the expressed intrakine. Combine to puter. Thus, HI due to knockout of the co-receptor phenotype Transduced cells that become resistant to V infection are HIV-positive for coreceptor binding. Secretes chemokines that compete with It is also possible to inhibit infection. Secreted chemokines and / or Trakine is a mutation that maintains receptor binding but lacks biological activity May also be a chemokine in which is induced. 8 amino acids missing from N-terminus These lost chemokine analogs are found in Arenzana-Selades dos) et al., Nature, 383: 400, 1996 (incorporated herein by reference). Is described. In the practice of the present invention, one or more of the N-terminal amino acids is May be deleted to obtain such chemokine analogs.   A preferred expression vector of the present invention is a retroviral vector, however, Any type of vector known in the art may be used. For example, adeno Virus vector, adeno-associated virus vector, plasmid, cosmid, lipo Even sosome-encapsulated DNA or RNA may be used in the practice of the present invention. The inventors have demonstrated here the use of the ER residual signal sequence, but Any signal that directs the translation product to an intracellular organelle as described above Arrays are used No. A preferred signal sequence is the KDEL sequence.   The expression vector of the present invention is preferably a CC chemokine 5 receptor, C chemokine 3 receptor, CC chemokine 1 receptor or CXR4 receptor Encodes a chemokine gene product that binds to the scepter. Preferred chemokines are Include, but are not limited to, RANTES, MIP-1α or SDF Not.   The present invention provides, in one broad aspect, the expression of a chemokine receptor phenotype in a cell. Can also be described as a method of inhibiting chemokine receptors. Blocking the cell surface expression of the cell. The method is directed from 5 'to 3' Promoter, intracellular residual signal sequence and chemokine receptor binding Obtaining a vector comprising a nucleic acid segment encoding the polypeptide gene; and Transducing a vector into a cell. The vector expresses the nucleic acid sequence when transduced into the cell. Producing a fusion polypeptide. The expressed polypeptides are chemokines and up to 8 Analogs, such as chemokines with N-terminal deletion of amino acids at the single chain It may be an antibody, such as an antibody, or a peptide that binds a receptor. Departure In practice, peptide expression live is performed using techniques known in the art. Rally binding, for example, the chemokine receptors described herein Can be isolated. Intracellular ol, as described herein Known, such as fusion with a leader sequence that directs the peptide / receptor to the Or the expression of any of the newly discovered peptides Is expected to be encompassed by Preferred polypeptides are RANTES, MIP -1α, SDF, including HIV gp120 or the V3 region of HIV gp120 .   In one broad aspect, the invention relates to the HIV co-receptor phenotype in a cell. It can be described as a method of inhibiting HIV infection of cells, including knockouts. Of this method In practice, the co-receptor is preferably a CC chemokine 5 receptor. -, CC chemokine 3 receptor, CC chemokine 1 receptor or C XR4 receptor. Phenotypic knockout includes antisense expression, genomic Any method known in the art, such as recombination, or preferably, Expresses receptor-binding polypeptide fused to intracellular residual signal sequence in cells It can be by doing. In the practice of this method, an intracellular residual signal sequence Transforms the fusion polypeptide into the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, lysosomes or intracellular vesicles. Or to other intracellular organelles. In the practice of these methods, vectors Can be a viral vector, or even a retroviral vector, for example. And the cells may be lymphocytes, monocytes, macrophages or stem cells. No. A preferred intracellular residual signal sequence is an endoplasmic reticulum signal sequence such as a KDEL sequence. Column. The receptor binding polypeptide of the present method is preferably a CC-chemoka , CXC chemokines, analogs of CC or CXC chemokines, single chain antibodies HIV gp120 protein, V3 region of HIV gp120, or A peptide that binds to the scepter.   In one exemplary embodiment of the method, the cell is an endogenous CC receptor, Regulates CCR5, CCR3 or CCR1 receptor transport and surface expression ER residual signal to block in the endoplasmic reticulum Transduced with the fused CC-chemokine gene. In an alternative exemplary embodiment, In other words, cells transduce endogenous CXR4 receptor and express surface CXC-chemokine fused to endoplasmic reticulum (ER) residual signal to block Transduced with a gene.   Another broad aspect of the invention provides that the subject can be treated with lymphocytes, monocytes, macrophages or A method of treating HIV infection in a subject, comprising administering stem cells, the method comprising administering the stem cell. The given cells display a knockout of the HIV co-receptor phenotype. The method In a preferred embodiment, the cells bind the newly expressed vector and It can be retained in an intracellular organelle as described herein. Transduced ex vivo with a vector that expresses a polypeptide. The cell Is preferably an autologous lymphocyte, macrophage, monocyte, stem cell or xenogeneic May even be stem cells. In an alternative embodiment, the cell expresses a co-receptor. Can express an effective antisense RNA to block DNA.   One aspect of the present invention also provides for transduction with a vector of the invention as described herein. Pharmaceutical composition containing the introduced lymphocytes, monocytes, macrophages or stem cells Increasing white blood cell (WBC) counts in a subject infected with HIV, comprising administering to the subject a substance. It is also a big or maintenance method. In the practice of this method, the number of WBCs is periodically monitored. Can be monitored and its number is some critical or dangerous (dangero us) if it falls below the level, the transduced cells of the invention Will be administered in an amount effective to keep the above the desired level. The cells are It may be re-administered every few weeks or months as needed. Pharmacy Intravenous infusion of cells with the active composition is known in the art and It may be performed by a skilled practitioner in light of the disclosure.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The following drawings form part of the present specification and further illustrate certain aspects of the present invention. To be included. The present invention is a detailed description of certain aspects set forth herein. Better understanding by reference to one or more of these drawings in conjunction with Can be done. FIG. Schematic diagram of a strategy for knocking out CCR5 on a phenotype. Lymphocytes Alternatively, stem cells bind intracellularly and transport and express newly synthesized CCR5. Mutations targeted to the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) prevent surface expression Genetically modified to co-express the expressed chemokine. The cells are To be secreted from cells in order to competitively inhibit HIV-1 infection of sexual cells Chemokines are also co-expressed. As a result, in the phenotypic CCR5 knockout The transduced cells are not only resistant to HIV-1 infection, but They also produce chemokines and inhibit HIV-1 infection in susceptible cells extracellularly. FIG. Schematic representation of expression vector construction. Human MIP-1α and RANTES cDNA genes and their induction containing the ER residue signal (KDEL) The conductor was cloned into the pRc / CMV vector (Invitrogen). I did it. Natural and using internal ribosome entry site (IRES) sequences Bi-cistronic for co-expression of mutated chemokines The vector (Chen et al., Human Gene Ther., 7: 1515-1526, 1996) was constructed. And retroviral vectors (pLNCX) (Miller, Curr. Top . Microbiol. Immunol., 158: 1-24, 1992). CCR 5 of A short influenza hemagglutinin (HA) tag sequence fused to the N-terminus (YP YDVPDYA, SEQ ID NO: 1) (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2). 159-2165, 1988) (Liu et al., 1996). I let you. Ψ, packaging array. 3A, 3B, 3C and 3D. C by MIP1-K held in ER Blockade of CR5 surface expression. COS cells on a 6-well plate were transferred to 2.5 μg of pCMV -Transfected with HA-CCR5 alone (FIG. 3B), or Co-transfected with similar amounts of pCMV-MIP1-K (FIG. 3C And FIG. 3D). 48 hours later, the suspension of transfected cells was washed with anti-H Incubation with Antibody A (BAbCo, Richmond, CA) And then stained with anti-rabbit IgG-FITC conjugate (Sigma). Colored. Incubate COS cells directly with second antibody conjugate as negative control (FIG. 3A). FIG. 3E. Inhibition of CCR5-mediated syncytia formation. Grown on a 6-well plate HeLa-T4⁺Cells were transfected with 2 μg of pCMV-CCR5 alone. Or cotransfection with various amounts of chemokine expression vector Was taken. After 48 hours, the transfected cells were transformed with Mφ tropism (A DA or YU2) or T-tropic envelope protein (IIIB) Co-culture with the COS cells to be removed and remove the syncytium in each well (replica) to 12 After 24 hours, counting was performed. The percentage of inhibition of syncytium formation is presented. A Syncytium formation of DA and YU2 was determined by MIP1-K and RANTES-K. Effectively inhibited by intrakine, but T-tropic envelope Loop-mediated syncytium formation is not inhibited by these intrakines Was. FIG. 4A. Schematic representation of expression vector construction. From mouse spleen cDNA library Of the SDF-1 gene to a sequence encoding the ER residue signal (KDEL) And cloned into pRc / CMV vector (Invitrogen). I did it. Internal ribosome entry site (IRES) sequence (Chen et al., 1996 ) For the co-expression of native and mutated chemokines using Constructing a tronic vector and retroviral vector (pLNCX) (Miller, 1992). Fusin (C XCR4) (Liu et al., 1996) to a short influenza fused to the N-terminus. Magglutinin (HA) labeling sequence (YPYDVPDYA, SEQ ID NO: 1) (Feel Chimera constructs containing Field et al., 1988) were also generated. Ψ, package Zing array. FIG. 4B. Transduction when transduced with SDF targeted to ER Of isolated lymphocytes to T-tropic HIV-1 infection. Diamond, JK-CTR L: square, JK-SDF-KDEL; triangle, JK-SDF.                        Description of the mode to be specifically described   The present invention provides methods for treating and preventing HIV-1 infection. In particular, the invention Use a novel method of preventing the expression of CC chemokine receptors on the cell surface, This prevents the binding of HIV to its target cells. The present invention relates to the treatment of HIV infection. Also provided are novel compositions for use in therapy and management.   Phenotypic CCR knockout leaves lymphocytes to express intrakine. This can be achieved by genetically modifying this against Mφ-tropic HIV-1 infection. Permissive cells result in resistance. Significant of this new anti-HIV approach The advantages are outlined as follows. That is, HIV-1 infection and disease progression The importance of providing sufficient documentation of CCR5 in Given the lack of adverse clinical conditions associated with the deficiency, the phenotypic CCR5 knockout Reinfusion of genetically modified lymphocytes or stem cells with Can partially or completely resist V-1 infection; To prevent or delay the progress of the disease.   Currently described anti-HIV approaches are mainly based on antisense constructs, Bozyme, dominant negative mutant, intrabody (intrabody) or CD4 retained in ER, resulting in viral envelope Viral components such as protein, Tat, Rev or reverse transcriptase (RT) Can be targeted. A major problem facing anti-HIV treatment is viral resistance. It is a frequent viral mutation that results. In contrast, the new features described herein The canonical anti-HIV approach is uniquely targeted to cellular receptors. result As often, frequent HIV mutations may not be possible to bypass this strategy. The CD4 receptor is functionally indispensable, and is therefore an appropriate marker for this strategy. It should be noted that this is not the case.   Intrakine is not only CCR5, but also some HIV-1 Blocks CCR3 and CCR1, also reported as ills co-receptors. , Suggest a wide range of effects on HIV-1. in addition, Phenotypic C combined with extracellular inhibition of sensitive cells by secreted chemokines It is contemplated that CR knockout has a synergistic anti-HIV effect. The present invention The additional benefit is that this approach is less technically available than other gene therapy approaches. Being challenging. CCR5 expression in human lymphocytes is very low (ie, Which cannot be detected with a radiolabel), and therefore the currently used expression vectors Intrakine expression levels achievable by Expected to be sufficient.   Another potential problem facing gene therapy is genetically expressing foreign proteins. FIG. 3 shows the host immune response (cytotoxic T cells) that destroys the modified cells. Only A transduced cell expressing a human chemokine as in the present disclosure Does not appear to produce new antigens. In addition, this approach provides a T-tropic HIV To knock out other receptors, such as the -1 co-receptor, phenotypically Can be used (Feng et al., Science, 272: 872-877, 1996). Therefore, This novel strategy provides effective gene therapy for HIV-1 infection as described in the specification I do. 1. Human immunodeficiency virus   HIV is classified as a retrovirus because it contains reverse transcriptase . Infection of cells with HIV usually results in cell death. HIV is the two major antigens , HIV-1 and HIV-2, which are envelope glycoproteins. Can be easily distinguished by differences in antibody reactivity to HIV-1 and HI V-2 shares about 40% homology. HIV-1 is more AIDS than HIV-2 It has been reported to be more efficient in development.   The first stage of HIV infection involves T4 cells, monocyte-macrophages, dendritic cells (dendr present on the surface of many cell types, including iditic cells) and cells of the central nervous system High affinity binding of the gp120 glycoprotein to the CD4 receptor. CD4 High affinity of the envelope glycoprotein of HIV for its receptor This is the decisive stage of the cause. Because the major cells that express CD4 are target cells (Dalgleish et al., 1984; Klatzmann) Et al., 1984; Maddon et al., 1986). T4 lymphocyte cells are central to all aspects of the immune system To play a pivotal role, death or impairment of T4 lymphocyte function is a catastrophic immune system. Causes dysfunction.   There are several ways in which HIV infection can directly lead to disruption of T4 cell function I do. HIV replication occurs in T4 as a result of disruption of cell membranes by viral proteins. Can kill cells. Alternatively, production of large amounts of viral genetic material and proteins Life can interfere with normal cellular metabolism, and eventually HIV becomes lymphoid The progenitor cells responsible for the growth of the pool of cells can also be infected and destroyed. Wear.   HIV infection can also indirectly cause T4 cell death. One such mechanism In, the anti-HIV immune response was uninfected T4 cells (free envelope protein). To bind quality to their membranes or present processed antigens? May trigger an autoimmune phenomenon targeted at You. Additionally, HIV envelope proteins and major histocompatibility of class II Gene complex (MHC) antigens both bind to the CD4 receptor May represent a cross-reactive antigen. Therefore, anti-HIV antibodies are Las IIM It can react with uninfected T4 cells expressing HC molecules. In addition, anti-HIV immune It is possible that the infected cells kill many infected cells.   Monocyte-macrophages are targets for HIV infection both in vivo and in vitro is there. Infection can occur through the CD4 receptor or through phagocytosis. T4 Unlike cells, monocyte macrophages appear to be resistant to cell lysis. Wooly Ruth is a monocyte macrophage that can replicate in cells and virions are Buds in intraplasmic vesicles. As a result, viral antigens are expressed on the cell surface. The monocytes-macrophages escape immune surveillance and Allows transmission of the stain to other organs.   There is a widespread immune response to HIV at all stages of infection. History of HIV infection Whole antibody production and subsequent AIDS episodes indicate that this persistent infection It appears to be ineffective at stopping the progression of the disease. Remains of HIV in vivo during disease progression The expression of variants of the gene indicates that HIV has a humoral and cellular immune response. It seems to be one of the styles.   Most primary HIV that initiates human infection and persists throughout the course of infection -1 virus replicates to low levels in peripheral blood mononuclear cells but is immortalized Does not replicate in isolated T cell lines (Schuitemaker et al., 1991, 1992; Conner et al., 1993; Conner and Ho, 1994a and 1994b). This These viruses are referred to herein as macrophage tropic primary isolates. Some In individuals infected with HIV-1, they replicate to higher levels in PMBC and Can be infected with the immortalized CD4 cell line and induce the formation of syncytia Virus emerges later in the course of infection (Schuitemaker) Et al., 19 92; Conner et al., 1993; Conner and Ho, 1994a and 1994b). . These are referred to as primary T cell tropic viruses. 2. Chemokine receptor   Variously named HUMSTSR, LCR-1 or LESTR, and Demonstrates that a range of non-human CD4-expressing cells support infection and cell fusion There are receptors that have been identified. It is also named "fusin" Have been. This receptor is also referred to herein as CXR4. HUMST Antibodies to SR were fused and sensitized by a laboratory-adapted HIV-1 isolate. Blocks staining but not macrophage-tropic primary virus It has been shown.   For macrophage tropic primary isolates (but not laboratory-adapted isolates) Infection with β-chemokines, RANTES, MIP-1α and MIP-1β It has been further observed that it can be inhibited by C. coli (Cocchi et al., 1995). High endogenous expression of β-chemokines is exposed to seropositive partners In vitro resistance of CD4 + T cells to HIV-1 infection from uninfected individuals It has been suggested to be a sexual cause (Paxton et al., 1996). This Antigenicity is found only from macrophage tropic virus and is it a T cell tropic virus? And was affected by the structure of gp120. HU other than CD4 At least one other host cell surface molecule distinct from MSTSR is primary macrophage tropism Facilitating the entry of HIV isolates, and the fact that this factor is in phase with β-chemokines It was suggested that it could be affected by interactions.   Receptors linked to G proteins are diverse chemoattractants, Responds to transmitters, hormones, etc. By heterotrimeric G protein Of the transmembrane receptor that transduces the signal of chemokines to respond to chemokines Used by leukocytes (Horuk, 1994). Chemokines are structurally related A family of isolated peptides that recruit leukocytes for inflammatory injury and Induces the reels of their granule contents and regulates the integrin avidity And exhibit proinflammatory properties.   Alpha chemokines or CXC chemokines act on neutrophils while β-chemokines Cain or CC-chemokines are found on monocytes, lymphocytes, basophils and eosinophils. (Baggiolini et al., 1994; Schall and Baco (Bacon), 1994). Thus, the CC chemokine receptor potentially has HIV -1 represents a tissue distribution consistent with the known tropism of -1. Many closely related CC cards Mokine receptors are present, five of which are characterized by ligand binding assays Have been. These are CCR1, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4 And CCR5.   CCR-5 is a seven-transmembrane glycoprotein that is synthesized in the ER and secreted Is transported to the plasma membrane by the route (Samson et al., Biochemistry, 35: 3362- 3367, 1996; Strader et al., 1994). CXR4 is a seven-transmembrane glycotan Protein, which is synthesized in the ER and transported to the plasma membrane, where CXR4 is Binds its ligand or HIV-1 envelope protein with high affinity (Strader et al., 1994). 3. Intrakine polypeptide   Macrophages, lymphocytes and other cells produced by and their receptors Chemokines, RNAs, which bind with high affinity (CCR-5, -3 and -1) TES, MIP-1α and MIP-1β (Neote et al., Cell, 72: 415-42). 5, 1993; Schall et al. Immunol., 141: 1018-1025, 1988; Gong ng) et al. Biol. Chem., 271: 10521-10527, 1996), especially macrophages. It has been shown that tropic isolates suppress HIV-1 infection. Inhibitory CC Chemokines are chemokine receptors for HIV-1 isolates that are macrophage tropic And thus inhibits fusion mediated by the corresponding env glycoprotein Thus, it is considered that they exert their infection inhibitory activity.   Therefore, RNATES, MIP-1α and MIP-1β are in vitro markers. It is a potent inhibitor of clophage tropic infection. They were infected with HIV-1 CD8 + cells from individuals and C from long-term, high-risk, seronegative individuals Produced at elevated levels by D4 + cells and ex vivo HIV- 1 It is considered to be resistant to infection. SDF-1 is a member of CXC-chemokines and stromal cells from bone marrow Constitutively expressed (Nagasawa, PNAS, 1994; Tashiro ), Science, 1993). SDF-1 has recently been approved for the biological ligations of Fucin / CXR4. Which is a T-tropic HIV-1 virus coreceptor (Neote et al., 1993; Schall et al., 1988; Gong et al., 1996. ).   Intracellular binding of intrabodies or other molecules targeted to the ER Blockade of cell surface expression of membrane proteins by Inventors and others (Mala Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893, 1993; Chen et al., Exp. Opin. Invest. Drugs) 4: 823-833, 1 995a; Chen et al., Human Gene Therapy, 5: 595-601, 1995b; Buonocore (B uonocore) and Rose (Nature, 345: 625-628, 1990). Ke Mokine RANTES, MIP-1α and SDF-1 have been described by the inventors as C- It was used to block cell surface expression of the C chemokine receptor.   The present invention is directed to chemokine receptors so that ligands can be targeted to the endoplasmic reticulum. It is contemplated to change the ligand of the scepter. These molecules are referred to herein as Named Rakine. "Intrakine" enables CC chemokai on the cell surface ER or other intracellular organelles of lymphocytes Any ligand that has been modified to be targeted to Such ligands include RANTES, MIP-1α, for binding to CCR5. Stromal cell-derived factor-1 (SDF) for binding to MIP-1β and CCR4 -1), but is not limited thereto. 4. Polynucleotides encoding intrakine   The polynucleotide of the present invention comprises the whole intrakine gene, A cytokine protein domain, or any of the intrakine polypeptides You can code it. A "complementary" polynucleotide is a standard Watson-Crick It is possible to base-pairing according to the rules of complementarity . That is, a larger purine pairs with a smaller pyrimidine and a base to form a cytoplasm. Guanine (G: C) paired with syn and thymine in the case of DNA Adenine (A: T) or, in the case of RNA, adenine (A : U) Any combination of the shifts can be formed. Hybridization sequence Inosine, 5-methylcytosine, 6-methyladenine, hypoxanthine and And the inclusion of less universal bases such as others does not interfere with pairing.   As used herein, the term "complementary sequence" refers to the entire length thereof. Essentially complementary and very few base mismatches throughout the body Means a polynucleotide sequence having For example, a sequence 15 bases in length Are named complementarity if they have complementary nucleotides at 13 or 14 positions May be. Of course, sequences that are "perfectly complementary" It can be a sequence that is completely complementary and has no base mismatches.   Other sequences with a lower degree of homology are also contemplated. For example, high homology Gene constructs that have restricted regions but also contain heterologous regions (eg, Ribozymes) can be designed. These molecules have less than 50% homology Nevertheless, it appears to bind to the target sequence under appropriate conditions.   Polynucleotides are derived from genomic DNA, that is, from the genome of a particular organism. It may be cloned directly. However, in other embodiments, the polynucleotide is Otides can be complementary DNA (cDNA). cDNA is used as a template DNA prepared by using RNA (mRNA). Therefore, cD NA does not contain any interrupted coding sequences and usually corresponds to Contains almost exclusively the coding region (s) of the protein You. In other embodiments, the polynucleotide may be produced synthetically.   Specific constructs combining parts of genomic DNA with cDNA or synthetic sequences May be advantageous. For example, one intron is the final construct If desired, it may be necessary to use genomic clones. Introns may be derived from other genes in addition to intrakine. cDNA Or synthesized polynucleotides are more convenient for the rest of the construct Can provide a unique restriction enzyme cleavage site, and thus for the rest of the sequence It is expected to be used.   Natural variants of intrakine having a sequence that differs from the sequences disclosed herein It is contemplated that a type exists. Therefore, the present invention relates to any of the intrakines Not limited to the use of polynucleotide sequences, but rather any naturally occurring And the use of such variants. The present invention provides a chemically synthesized version of these sequences. Variants are also included.   Another type of sequence variant results from codon variation. Of 20 normal amino acids Because of the presence of a few codons for most, many different DNA Can code in. References in the table below allow these variants to be identified Can be  Expecting the degeneracy of the genetic code, identity to nucleotides of known chemokine genes Has between about 50% and about 75%, or between about 76% and about 99%, nucleotides A preferred arrangement would be preferred. "Polynucleotide encoding intrakine" Sequences within the range of the polynucleotide segment described above under intracellular conditions And a base pair.   An acceptable level of equivalent organism that may be created within a defined part of the molecule That there is a limit on the number of changes that can still result in molecules with biological activity The concept is specific to the definition of a biologically functionally equivalent protein or peptide. Is also well understood by those skilled in the art. Biologically functional equivalent peptide Thus, some but not most or all of the amino acids may be substituted Peptide is defined herein. Especially when the N-terminus of the protein is involved In a peptide given only about 16 or more preferably about 5 amino acids. It is contemplated that it may be varied. Of course, multiple distinct tags with various permutations Proteins / peptides can easily be made and used according to the invention.   Amino acid substitutions generally involve the relative similarity of the amino acid side-chain substituents, for example, their sparseness. Based on aqueous, hydrophilic, charge, size, etc. The size of the amino acid side chain substituent, Analysis of shape and type shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged. Residues; alanine, glycine, and serine are all similar in size That phenylalanine, tryptophan and tyrosine are all Indicates a similar shape. Therefore, based on these considerations, Nin, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; Nylalanine, tryptophan and tyrosine; are biologically functional herein Is defined as a target equivalent.   Amino acid hydropathic index is taken into account when making changes. Can be. Each amino acid is hydropathic based on its hydrophobicity and charge characteristics. Sea index is assigned, these are isoleucine (+4. 5); valine ( +4. 2); leucine (+3. 8); Phenylara Nin (+2. 8); cysteine / cystine (+2. 5); methionine (+1. 9); ara Nin (+1. 8); glycine (−0. 4); threonine (−0. 7); serine (−0. 8); Tryptophan (−0. 9); tyrosine (−1. 3); proline (−1. 6); Histige (−3. 2); glutamic acid (−3. 5); glutamine (−3. 5); aspartic acid ( −3. 5); Asparagine (−3. 5); lysine (−3. 9); and arginine (−4. Five ).   Hydropathia in conferring interacting biological functions on proteins The importance of the amino acid indicator is generally understood in the art (Kyte and Doe). Doolittle, 1982, incorporated herein by reference). A Amino acids replace other amino acids with similar hydropathic indices or scores It is known that they may still retain similar biological activity. is there. In creating changes based on hydropathic indicators, -Substitution of amino acids whose indices are within ± 2 is preferred, and those within ± 1 are preferred. Particularly preferred, and ± 0. Even less than 5 are even more particularly preferred.   One amino acid can be used in place of another having a similar hydrophilicity value and It is understood that physically equivalent proteins can still be obtained. US Patent The following hydrophilicity values are assigned to amino acid residues as detailed in 4,554,101 Have been. That is, arginine (+3. 0); lysine (+3. 0); Asparagine Acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+3. 0 ± 1); serine (+0. 3); Asparaghi (+0. 2); Glutamine (+0. 2); glycine (0); threonine (-0. Four); Proline (-0. 5 ± 1); alanine (−0. 5); histidine (-0. 5); Si stay (-1. 0); methionine (−1. 3); Valine (-1. 5); leucine (−1. 8); solo Isin (-1. 8); tyrosine (−2. 3); phenylalanine (−2. 5); trypto Fan (−3. Four).   In making changes based on similar hydrophilicity values, the hydrophilicity values should be within ± 2. Substitution of certain amino acids is preferred, those within ± 1 are particularly preferred, and ± 0. Even less than 5 are even more particularly preferred.   Site-directed mutagenesis. Site-directed mutagenesis is a feature of the underlying DNA. Individual peptides by heterologous mutagenesis, or biologically functional equivalent proteins This is a useful technique for preparing proteins or peptides. This technology is not used in DNA Or one of the above considerations by introducing more nucleotide sequence changes. Ability to prepare and test variants of sequences that incorporate or more To provide further. Site-directed mutagenesis is the process of obtaining the DNA sequence of a desired mutation. Specific oligonucleotides that code for a sufficient number of adjacent nucleotides for reading The production of mutants using the sequence is safe on both sides of the junction of the deletion being traversed. Provides primary sequences large and complex enough to form stable duplexes To be able to Typically, a primer of about 17 to 25 nucleotides in length Preferably, about 5 to 10 residues on each side of the junction of the sequence are changed.   In general, techniques for site-directed mutagenesis are known in the art. True value As can be identified, the techniques are typically single-stranded and double-stranded. Use a bacteriophage vector that exists in both strands. Site-specific bump Typical vectors useful in mutagenesis include vectors such as M13 phage. I do. These phage vectors are commercially available and their use Is generally known to those skilled in the art. You. Double-stranded plasmids are also routinely used in site-directed mutagenesis, Eliminates the step of transferring the gene of interest from the phage to the plasmid.   In general, site-directed mutagenesis involves first, To obtain a single-stranded vector containing a DNA sequence encoding This is accomplished by melting the two strands of the reactor. Desired mutated arrangement An oligonucleotide primer with an array is prepared synthetically. This primer It is then annealed with a single-stranded DNA preparation and the To complete the synthesis, E. coli (E. coli) polymerase Klenow fragment Apply to DNA polymerase. Thus a heteroduplex is formed, where one strand is Encodes the original unmutated sequence, and the second strand carries the desired mutation . This heteroduplex vector is then used in E. coli (E. coli) cells Recombinant vector for transforming cut cells and having a mutated sequence arrangement Is selected.   Preparation of sequence variants of a selected gene using site-directed mutagenesis Provided as a means of producing potentially useful species and means limiting Not done. Because there are other ways that sequence variants of genes can be obtained It is. For example, a recombinant vector encoding the desired gene Sequence variants may be obtained by treatment with a mutagenic agent such as 5. Knockout strategy   In light of the foregoing discussion, the use of CCR5 for HIV-1 infection and disease progression Critical importance, as well as the non-essential nature of CCR5, Knockout of CCR5 in the sphere has therapeutic significance Suggest that The present invention also provides a lymphocyte capable of expressing the CCR5 receptor. Or to reduce, prevent or reduce the expression of the CCR5 receptor on the cell surface of other cells. It may be used with a variety of methods to knock out. These methods Described herein below.   Targeting intrakine to ER. In a preferred embodiment of the present invention The phenotypic CCR5 knockout is responsible for the transport and expression of newly synthesized CCR5. Mutation containing an endoplasmic reticulum (ER) residual signal that blocks surface expression in cells This is achieved by transducing cells with the selected CC-chemokine gene. Human peripheral hemolymph expressing intracellular chemokines named "intrakine" The spheres (PBL) were found to resist Mφ-tropic HIV-1 infection. further , Secreted chemokines and intrakines inhibit additional viral infection Co-expressed. Therefore, the viral composition used by other anti-HIV approaches New anti-HIV app can be uniquely targeted to cellular receptors rather than minutes Roach can overcome the frequent mutations of HIV-1 and thus Even gene-based treatment and prevention of IV infections could be significant is there.   Combines the cylindrical structure of the ER with the directional flow of proteins through the secretory system By the way, the knockout of the receptor phenotype at the ER level is Make it a very effective mechanism of inhibition of the expression of the protein. Localization and target to ER The molecule intended for carrying is generally a leader peptide and a C-terminal ER residue. Equipped with Gunnar. One such signal is the KDEL amino acid motif. (Munro and Pelham, Cell, 48: 899-907, 1987). Therefore, The present invention Engineer the ER residue signal into the Targeting the ER that binds the R protein, and thereby its cell surface To prevent their expression, use the genetic recombination techniques described herein. You.   Antisense. Antisense methodologies tend to bind nucleic acids to “complementary” sequences. Take advantage of the fact that there is a tendency. Due to complementarity, polynucleotides are standard Capable of pairing bases according to the Watson-Crick complementation rule Is meant to be That is, larger purines are smaller pyrimidines Of guanine (G: C) and DNA paired with cytosine Adenine (A: T) paired with thymine or uracil for RNA Any combination of paired adenine (A: U) can be formed . Inosine, 5-methylcytosine, 6-me Less universal base packets such as tiladenine, hypoxanthine and others Contain does not disturb the pairing.   Targeting double-stranded (ds) DNA with polynucleotides is a triple helix RNA targeting leads to double helix formation. Can be. When the antisense polynucleotide is introduced into the target cell Specifically binds to their target polynucleotides, and Impedes sexing, transport, translation and / or stability. Antisense RNA The construct or the DNA encoding such an antisense RNA is used in vitro. Or any host cell in vivo, such as in a host animal, including a human subject. It may be used to inhibit the transcription or translation of a gene or both in the vesicle.   Antisense constructs contain promoters and other regulatory regions, exons, Or even exon-intron boundaries of genes May be. Most effective antisense constructs are intron / exon splices. It is contemplated that a region complementary to the DNA site may be included. Therefore, preferred One preferred embodiment is in the region within 50-200 bases of the intron-exon splice site. It is proposed to include an antisense construct with complementarity to it. Some d The exon sequence is included in the construct without significantly affecting its target selectivity. It has been observed that this can be done. The amount of exon material included depends on the specific It can vary depending on exon and intron sequences. Of normal cells Whether function is affected, or related genes with complementary sequences Constructs simply in vitro to determine if expression of Testing can easily determine if too much exon DNA is included. You can experiment.   As noted above, "complementarity" or "antisense" is their length. That are essentially complementary throughout the entirety and have very few base mismatches. Means a polynucleotide sequence having For example, a sequence 15 bases in length Are named complementarity if they have complementary nucleotides at 13 or 14 positions May be. Of course, sequences that are perfectly complementary will be perfect over their entire length. And a sequence that is complementary to and has no base mismatch. Lower Other sequences with a degree of homology are also contemplated. For example, high homology restricted Antisense constructs that have regions but also contain heterologous regions (eg, (Bozyme) can be designed. These molecules have less than 50% homology Nevertheless, it appears to bind to the target sequence under appropriate conditions.   Specific constructs combining parts of genomic DNA with cDNA or synthetic sequences May be advantageous. For example, one intron is the final construct If desired, it may be necessary to use genomic clones. The cDNA or synthesized polynucleotide is used in the remaining part of the construct. And provide a more convenient restriction enzyme cleavage site, and It is expected to be used for parts.   Ribozyme. Although proteins have traditionally been used to catalyze nucleic acids, Another class of macromolecules has emerged as useful in this effort. Ribozymes are site-specific RNA-protein complex that cleaves nucleic acids in a statistical manner. Ribozymes are end It has a specific catalytic domain possessing nuclease activity (Kim and Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Shimo (Symons, 1987). For example, many ribozymes are often oligonucleosides. With a high degree of specificity that cleaves only one of several phosphate esters in the tide substrate Promotes the phosphoryl ester transfer reaction (Cook et al., 1981; Michel) And Westhof, 1990; with Reinhold-Hurek Shub, 1992). This specificity is attributed to the fact that the substrate Base pairs specific to the internal guide sequence ("IGS") Attributable to the requirement to bind through interlocking interactions.   The catalytic activity of ribozymes is mainly due to sequence-specific cleavage / sequences that require nucleic acids. It has been observed as part of the closing reaction (Joyce, 1989) Cook et al., 1981). For example, U.S. Pat. Is larger than that of a known ribonuclease and close to that of a DNA restriction enzyme. We report that it can act as an endonuclease with good sequence specificity. Obedience Thus, sequence-specific ribozyme-mediated inhibition of gene expression is not suitable for therapeutic applications. Can be suitable (Scanlon et al., 1991; Server (Sarver) Et al., 1990). Recently, ribozymes have been genetically modified in some cell lines to which they have been applied. It has been reported that the transformation led to the oncogene H-ras, c- fos and HIV genes were included. Most of this work has been with specific ribozymes. Modification of target mRNA based on specific mutant codons cleaved by Needed.   Homologous recombination. Another approach to preventing the expression of CCR5 on the cell surface is Requires the use of homologous recombination, a "knockout technique". Homologous recombination Relies on the propensity to pair bases with the complementary sequence of a nucleic acid, similar to antisense. this In the example, base pairing is performed in two separate nuclei such that strand breakage and repair can occur. It works to promote the interaction of acid molecules. In other words, the "homologous" Aspects rely on sequence homology to bring two complementary sequences into close proximity, while The "recombination" aspect replaces others by breaking some bonds and forming others One complementary sequence is provided.   In practice, homologous recombination is used as follows. First, the target remains The gene, in this case CCR5, is selected in the host cell. Suitable for CCR5 target gene Some sudden mutations that could inactivate the target gene, followed by homologous sequences Genes along with mutations (stop codons, interruptions, etc.) Include in the construct. Homologous sequences adjacent to the mutation that inactivate Contact. " In this context, the flanks indicate that the target homologous sequence is mutated. It simply means being located both upstream (5 ') and downstream (3'). these Should correspond to some sequence upstream and downstream of the target gene. The The construct is then introduced into the cell, thus permitting recombination between the cell sequence and the construct. Make it work.   As a practical matter, the gene construct usually contains a gene disrupting vehicle (v ehicle) can act as much more. For example, for recombinant It is important that it is possible to select for It is common to include selectable marker genes. This gene is diverse By providing resistance to biostatic and biocidal drugs And allows selection of cells that have incorporated the construct into their genomic DNA. In addition, heterologous genes that should be expressed in the cell are also present in the construct. May be included. The arrangement can be as follows. Ie . . . Vector, 5'-flanking sequence, heterologous gene, selectable marker gene, flanking Tangent sequence-3 'vector. . .   Thus, using this type of construct, in a single recombination event, the (i) endogenous "Knocking out" genes, (ii) selecting to identify such events Providing a possible marker and (iii) introducing a heterologous gene for expression It is possible to   Another improvement in the approach of homologous recombination has been the use of "negative" selectable markers. I need. This marker is different from the selectable marker and expresses that marker Cause cell death. Therefore, it is desired Used to identify any recombination events. Homologous using selectable markers If you are seeking to select suitable recombinants, Identify homologous recombinants from those resulting from a random nonsequence-specific event. Is difficult to determine. These recombinants also have selectable marker genes. And may also express the heterologous protein of interest, however, In some cases, it may not have the desired “knockout” phenotype. Building However, by installing a negative selectable marker on the outside of the adjacent area, For many random recombination events that can incorporate selectable markers You can choose. Homologous recombination should not introduce a negative selectable marker. Because it is outside the adjacent sequence.   Single chain monoclonal antibody. Synthesized by cells and targeted to specific cell compartments Single-chain antibodies are used to regulate cell growth and metabolism in a highly specific manner. Can be used to obstruct. A recent application has been the phenotypic knockout of growth factor receptors. Clotting, inactivation of p21 function, and inhibition of HIV-1 replication.   Methods for producing single-chain antibodies are known to those skilled in the art. Those of ordinary skill in the art Attention is directed to US Patent No. 5,359,046, which is incorporated herein by reference. You. Single chain antibodies use a variable peptide domain of the heavy and light chains using short peptide linkers. Are created by fusing together the antigen binding site on a single molecule. Reconfigure.   A peptide having 15 to 25 amino acids at the C-terminus of one of the variable domains, The variable fragment (Fv) of a single-chain antibody tethered to the other N-terminus via It can significantly disrupt antigen binding or the specificity of binding. (Bedzyk et al., 1990; Chaudhary ) Et al., 1990). These Fvs are derived from the constant regions (in the heavy and light chains of the natural antibody). Lacks Fc).   In principle, high affinity and selective binding of intrabody or intrabody Properties can be used to regulate cell physiology and metabolism by a wide range of mechanisms . For example, intrabody binding blocks or arrests macromolecular interactions. Closing the active site as necessary, separating the substrate, or Immobilize the enzyme in an active or inactive conformation to enhance enzyme function May be used to adjust. Intrabodies may also be involved in transcription factors, Separating offspring or retaining proteins defined on the cell surface in the ER Are also used to redirect proteins from their normal cellular compartments. May be. In this regard, intrabodies regulate CCR5 expression on the cell surface. It is useful with the present invention to prevent and thereby inhibit the infectivity of HIV-1. Can be for 6. Expression vector   Throughout this application, the term “expression construct” also refers to the portion of the nucleic acid that encodes the sequence. Or a nucleic acid encoding a gene product that is capable of being transcribed in its entirety. It is meant to encompass any type of genetic construct. This transcript is May be translated, but it need not be translated. Therefore, some form In some embodiments, expression is dependent on transcription of the intrakine gene, and intrakine Includes both translation of mRNA into Intrakine protein product. Other aspects In expression, the expression is dependent on the transcription of a nucleic acid encoding intrakine or its complement. Include photo Just do it.   In order for the construct to achieve at least intrakine transcript expression, Of a promoter that has a polynucleotide that encodes a polynucleotide of Cain It can be under transcription control. The “promoter” is the host cell's synthesis mechanism (machi nery) or the DNA sequence recognized by the introduced synthetic machinery Is required to initiate specific transcription of "Under transfer control" or "Operable" The phrase "is bound to" means that the promoter initiates RNA polymerase and Correct for the polynucleotide to control expression of the polynucleotide Means to be in position.   The term promoter is used herein to refer to the region around the start site of RNA polymerase II. Used to refer to a group of transcription control modules that are clustered into edges Can be done. Consideration of how the promoter will be structured Many are associated with thymidine kinase (tk) of HSV and the SV40 early transcription unit. Stems from the analysis of several viral promoters, including Yo These studies, augmented by more recent studies, show that promoters have distinct functional In each case, each consisting of approximately 7 to 20 bp of DNA. And one for the transcription activator or repressor protein Or more recognition sites.   At least one module in each promoter positions the start site for RNA synthesis Function as follows. The best-known example of this is the TATA box, but only And the promoter of the mammalian terminal deoxynucleotidyl transferase gene. Promoter and SV40 late gene promoter In some promoters that lack the TATA box, such as A separate element on its own helps fix the starting location.   Additional promoter elements regulate the frequency of transcription initiation. Typically, these Is located 30 to 110 bp upstream of the start site, but many promoters Has recently been shown to contain a functional element downstream of the start site as well. The spacing between promoter elements is often flexible, so that promoter function is Saved when elements are inverted or moved with respect to each other. tk pro In motors, the spacing between promoter elements is determined by the time before activity begins to decrease. It can be increased up to 50 bp away. Depending on the promoter, the individual elements cooperate Or, independently, it appears to be able to function to activate transcription.   Specific processes used to control the expression of intrakine polynucleotides The promoter in the cell to which it is targeted. It is not considered critical as long as it can be expressed. Therefore If human cells are targeted, the polynucleotide coding Region adjacent to a promoter capable of being expressed in human cells and Preferably, the position is determined under this control. Generally speaking, these promotions The promoter may include either a human or viral promoter.   In various embodiments, the human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene pro Motor, SV40 early promoter and Rous sarcoma virus terminal repeats Can be used to obtain high level expression of intrakine polynucleotides . Achieving polynucleotide expression Other viral or mammalian cell or bacterial files known in the art. The use of chromosome promoters is also contemplated, except that the level of expression Sufficient to produce an inhibitory effect.   Transfection by using a promoter with known properties The level and pattern of expression of subsequent polynucleotides can be optimized. For example Tyrosinase (melanoma), α-fetoprotein and albumin (liver cancer), Specific cells such as CCI10 (lung cancer) and prostate specific antigen (prostate cancer) The selection of a promoter that is active in the vesicle depends on the set of intrakine polynucleotides. Tissue-specific expression can be allowed. Table 2 shows that in the context of the present invention, Some elements / promoters that can be used to regulate the expression of the trakine construct List the parameters. This list contains all the possibilities involved in enhancing the expression of intrakines It is not intended to cover potential elements, but merely to be illustrative. And intended.   Enhancers are originally located at distant locations on the same DNA molecule. As a genetic element that increased transcription from the promoter. Over a large distance This ability to work across is almost unprecedented in classical studies of prokaryotic transcriptional regulation Did not have. Subsequent studies have identified regions of DNA with enhancer activity It has been shown to be configured much like a motor. That is, they are many It consists of separate elements, each of which forms one or more transcribed proteins. Join.   The basic distinction between enhancers and promoters is operational. Enhan The sir region must be capable of stimulating transcription at a distance as a whole; This corresponds to the elements of the promoter region or its components. It doesn't have to be true. A promoter, on the other hand, is Must have one or more elements that direct the initiation of RNA synthesis On the other hand, enhancers lack this specificity. Promoters and enhancers Are often overlapping and continuous, and often very similar modules It appears to have a configuration.   In addition, any promoter / enhancer combination (eukaryotic (See Eukaryotic Promoter DataBase, EPDB) Is also used to drive the expression of the intrakine construct. obtain. Use of a T3, T7 or SP6 cytoplasmic expression system is another possible embodiment . Eukaryotic cells can be used when the appropriate bacteriophage polymerase is provided. As part of the delivery complex or as an additional gene expression vector. May support cytoplasmic transcription from a bacteriophage promoter.   Furthermore, the choice of a promoter that is regulated in response to certain physiological signals is , May allow for inducible expression of the intrakine construct. For example, human PAI Using a polynucleotide under the control of the -1 promoter, the expression is Can be guided by Table 3 shows some promoter / inducer combinations. The matching will be specifically described. Ie  In one embodiment of the invention, the delivery of the expression vector in the cell comprises the expression vector. Identified in vitro or in vivo by including a marker in the Can be. The marker is used for transfection, allowing easy identification of expression. It will result in identifiable changes to the cells that have been implanted. Usually drug selection Inclusion of the marker aids in cloning and selection of transformants. Or, Herpes simplex virus Kinase (tk) (eukaryote) or chloramphenicol acetyl tran Enzymes such as spherase (CAT) (prokaryotes) may be used. Immunological Markers can also be used. The selectable marker used is As long as it can be expressed together with the polynucleotide encoding rakine. Is not considered important. Further examples of selectable markers will be available to those of skill in the art. Is knowledge.   A polyadenylation signal to achieve proper polyadenylation of the transcript Typically can be included. The nature of the polyadenylation signal is a feature of the present invention. It is not deemed critical to successful practice and any such arrays are not used. It may be. Terminators are also contemplated as part of the expression construct. this These elements increase the level of the message and provide a complete It can work to minimize body read.   In some embodiments of the invention, the expression construct is a virus, or a virus. Comprising engineered constructs derived from the genome. Receptor-mediated endosite Enter the cell via lysis and, in some cases, into the chromosome of the host cell. The ability of certain viruses to integrate into cells makes them attractive for gene transfer into mammalian cells. Candidate. However, direct uptake of naked DNA, and Receptor-mediated uptake of the DNA complex indicates that the expression vector is viral. It is not necessary, but instead, a series of pUCs or Bluescripts. Expression of the encoded gene in mammalian cells, such as the t ™ plasmid Any plasmid, cosmid or phage construct that can be supported Prove that it can be a structure.   Retro virus. Retroviruses in cells infected by the process of reverse transcription A group of single-stranded RNAs characterized by their ability to convert their RNA into double-stranded DNA It is a virus (Coffin, 1990). The resulting DNA is then It integrates stably into the chromosome of the cell as a virus, and combines viral proteins. Instruct order. Integration is viral inheritance in recipient cells and their progeny Results in the retention of child arrays. The retroviral genome is capsidtan Three genes encoding protein, polymerase enzyme and envelope components ( gag, pol and env). From the gag gene named Ψ Sequences found upstream serve as signals for packaging the genome into virions. Function. The sequence of the two terminal repeats (LTR) is 5 'and 5' of the viral genome. And 3 'end. These include strong promoter and enhancer sequences. And is also required for integration in the host cell genome (Coffin n), 1990).   In order to construct a retroviral vector, the nucleus encoding intrakine Insertion of an acid into the viral genome in place of a viral sequence Virus. To produce virions, gag, pol and Containing the E. coli and env genes but not the LTR and Ψ components A cell line is constructed (Mann et al., 1983). Retrovirus for human cDNA Recombinant plasmid containing the LTR and Ψ sequences of When introduced into this cell line (by lucium precipitation), the RNA transcripts can be packaged in viral particles, The particles are then secreted into the culture medium (Nicolas and Rubens Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). set The medium containing the modified retrovirus is then collected, optionally concentrated, and And use it for gene transfer. Retroviral vectors can infect a wide range of cell types It is possible to However, integration and stable expression are (Paskind et al., 1975).   Designed to allow specific targeting of retroviral vectors New approaches have recently been introduced to the chemical application of lactose residues to the viral envelope. It was developed based on the chemical modification of retroviruses by addition. This modification is It could allow specific infection of hepatocytes via the roglycoprotein receptor.   Different approaches to recombinant retrovirus targeting have been designed, Here is the retroviral envelope protein and specific cellular receptors Was used. Use streptavidin for the antibody. And via a biotin component (Roux et al., 1989). Major organizational compatibility Using antibodies against the gene complex class I and class II antigens, Diverse human cells with their surface antigens along with the autotrophic virus in vitro Vesicle infection was demonstrated (Roux et al., 1989).   Adenovirus. Human adenovirus has a genome size of approximately 36 kb It is a double-stranded DNA tumor virus (Tooze, 1981). Eukaryotic inheritance Adenovirus has been extensively studied and well characterized as a model system for offspring expression That have led to the development of adenoviruses as gene transfer systems. Attractive system. Of this group Viruses are easy to grow and manipulate and they are in vitro and And a broad host range in vivo. In lytically infected cells, Virus shuts off host protein synthesis and causes large amounts of viral proteins to Can direct the synthesis of protein and produce large quantities of virus. Noh.   The E1 region of the genome includes E1A and E1B, which are Encoding proteins that are responsible for the transcriptional regulation of genes and several cellular genes You. Expression of E2, including E2A and E2B, is a function of viral replication, eg, DNA binding protein, DNA polymerase and terminal proteins that prepare for replication Enables synthesis of quality. E3 gene product is a cytotoxic T cell and tumor necrosis factor It appears to be important for virus lysis and also for virus growth. E4 TA Protein-related functions include DNA replication, late gene expression, and host cell blockade. Exclusion. Late gene products include most of the virion capsid protein And these are a single from the major late promoter. It is only expressed after most of the processing of the primary transcript has occurred. Major late-stage professionals Motor (MLP) shows high efficiency during late stages of infection (Stratford Ricottet (Stratford-Perricaudet) and Pericodet (Perricaudet), 1991a ).   Only a small portion of the viral genome appears to be required in cis (Tows (Tooze), 1981). Excellent latency for replacement of large DNA fragments when used in connection with cell lines Provide competence. Human embryonic kidney cell line transformed with Ad5 (Graham Et al., 1977), an essential virus protein It is being developed to provide protein to trans.   A particular advantage of the adenovirus system for delivering foreign proteins to cells is (I) the ability to replace relatively large pieces of viral DNA with foreign DNA; ii) structural stability of the recombinant adenovirus; (iii) adenovirus in humans Safety of administration and (iv) adenovirus infection with cancer or malignancy (V) the ability to obtain high titers of recombinant virus; and (Vi) Includes the high infectivity of adenovirus.   In general, the adenovirus gene transfer system comprises a part of the genome, such as E1. Recombination rendered replication incompetent by the deletion and still retaining its capacity for infection Based on the engineered adenovirus. Relatively large foreign protein Coding sequences are generated if additional deletions are made in the adenovirus genome. Can be revealed. For example, an adenovirus deleted in both the E1 and E3 regions , Can have foreign DNA up to 10 kb, and have a high titer in 293 cells. (Stratford-Perricaudet ) And Perricaudet, 1991a). Surprisingly, adenovirus Sustained expression of the transgene after infection has also been reported.   Adenovirus-mediated gene transfer has recently spread to eukaryotic cells and whole animals As a means to mediate gene transfer of E. coli. For example, rare recessive genetic disorders Harm, in the treatment of mice with ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency The adenovirus construct could be used to supply the normal OTC enzyme Was found. Unfortunately, normal levels of OTC expression reached only 4 of 17 cases (Strato Four Stratford-Perricaudet et al., 1991b). Therefore, this defect It is only partially corrected in the majority of mice and changes in physiological or phenotypic Did not lead to   Cystic fibrosis transmembrane conductor to the lung epithelium of the cotton rat Introduces transmembrane conductance regulator (CFTR) gene Attempts to use adenoviruses to do so have also been partially successful. However, it is not possible to assess the biological activity of the introduced gene in animal epithelium. (Rosenfeld et al., 1992). Again, these studies show that the lungs Demonstration of gene transfer and expression of CFTR protein in airway cells, But showed no physiological effect. In a 1991 Science dissertation, Rosenfell (Rosenfeld) et al. Showed lung expression of α1-antitrypsin protein, However, again, they did not show any physiological effects. In fact, they The current level is only about 2% of the level required for protection of the human lung, ie It was estimated that what was needed for the biological effect was well below.   Human α1-antitrypsin gene is introduced into normal rat liver by intraportal injection Where it is expressed and introduced into the plasma of these rats Resulting in secretion of the human protein (Jaffe et al., 1992). Only However, and disappointingly, the levels obtained are of therapeutic value. Was not high enough to run.   These types of results indicate that adenoviruses need to achieve physiologically relevant effects. Demonstrate that it is possible to direct the expression of sufficient protein in recombinant cells. No evidence, and they are therefore not adeno-specific for use in connection with gene therapy. Does not suggest the utility of the viral system. 7. Other viral vectors as expression constructs   Other viral vectors may be used as the expression construct in the present invention. Wa Xinia virus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), adeno-associated virus (A AV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden) den), 1986; Hermonat and Muzycska, 1984) and Hel A vector derived from a virus, such as a pesvirus, may be used. They are diverse Provide some attractive features for various mammalian cells (Friedman (Fri edmann), 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sug Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1 990).   Recent recognition of imperfect hepatitis B virus, structure-function of diverse viral sequences New insights into the relationship. In vitro studies have shown that the virus Helper-dependent packaging and deletion up to 80% of the genome It was shown that the ability for reverse transcription could be retained (Horwich et al., 1). 990). This means that large parts of the genome could be replaced by foreign genetic material Suggested. Liver tropism and persistence (integration) are It was a particularly attractive characteristic. Chang and colleagues recently Nicol acetyltransferase (CAT) gene, polymerase, surface And duck hepatitis B virus genome in place of the front surface coding sequence Introduced during. Cotransfection with wild-type virus to avian liver cancer cell line Was taken. Contains high titers of recombinant virus The culture medium was used to infect primary duck hepatocytes. Stable CAT gene expression Was detected for a minimum of 24 days after transfection (Chang et al., 1991).   Multigene construct and IRES. In one aspect of the invention, the internal ribosomes The use of the element binding site (IRES) element Used to create a message for The IRES element is a 5 'methylated Bypass the ribosome scanning model for tip-dependent translation And it is possible to start translation at internal sites (with Pelletier) Sonenberg, 1988; Jang et al., 1988). Picornawisov IRES elements (Perte from two members of the family, polio and encephalomyocarditis) Pelletier and Sonenberg, 1988), and mammalian Written by IRES from Sage (Macejak and Sarnow, 1991) Has been described. IRES elements can be bound to heterogeneous open reading frames. Each IR Multiple reading frames separated by ES can be transferred together, Create a message. Each open reading frame is efficiently translated by the IRES element Is accessible to ribosomes. Multiple genes in a single promoter / en Hansers can be used to express efficiently and transcribe a single message.   Any heterogeneous open reading frame can be linked to the IRES element. This is a secretory Proteins, multi-subunit proteins encoded by independent genes, intracellular Alternatively, it includes a membrane-associated protein and a selectable marker gene. Thus, the expression of several proteins is a single construct and a single selectable At the same time using various markers Can be engineered. 8. Gene delivery method   To achieve expression of the intrakine construct, the expression vector must be delivered into cells. Must be reached. As mentioned above, the preferred mechanism of delivery is viral Via staining, where the expression vector is encapsulated in infectious adenovirus particles. Be transformed into   Some non-viral methods of introducing expression vectors into cultured mammalian cells The method is also contemplated by the present invention. These are calcium phosphate precipitation methods (Graha Graham and Van Der Eb, 1973; Rippe et al., 1990. ), DEAE-dextran (Gopa1, 1985), electroporation (tool ・ Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direct microinjection method ( Harland and Weintraub, 1985), DNA-loaded liposome Sosomes (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979) ) And lipofectamine-DNA complex, cell sonication (Fechheimer (F echheimer) et al., 1987), Genes using high-velocity microprojectiles Gene bombardment (Yang et al., 1990), polycations (Bushif (B oussif) et al., 1995) and receptor-mediated transfection (Wu) Wu, 1987; Wu and Wu, 1988). Some of these technologies are It can be successfully adapted for in vivo or ex vivo use.   In one aspect of the invention, the expression vector consists solely of a naked recombinant vector. Good. Introduction of the construct physically or chemically permeabilizes the cell membrane (permeabil implemented by any of the methods listed above Good. For example, Dubensky et al. (1984) describe the polyoma virus D NA is formed on the liver and spleen of adult and newborn mice in the form of calcium phosphate precipitate. Successful injections demonstrated active viral replication and acute infection. Ben Venice Benenvenisty and Neshif (1986) were also precipitated with calcium phosphate. Direct intraperitoneal injection of plasmids Proven to work. DNA encoding the intrakine construct is also similar. It is envisaged that they can be introduced in vivo in a fashion.   Another aspect of the present invention for introducing a naked DNA expression vector into a cell is particle bombardment. May require particle bombardment. The method uses DNA-coated microfiring. Accelerate the body to high speeds so that they penetrate the cell membrane and do not kill cells Depending on the ability to enter them (Klein et al., 1987). Several devices have been developed for accelerating small particles. One of these The device relies on a high voltage discharge to create a current, which in turn provides the driving force (Yan (Yang) et al., 1990). The microprojectiles used are tungsten or gold beads. Consisting of such biologically inert substances.   Inject selected organs, including rat and mouse liver, skin and muscle tissue Shocked in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). this is The organization to eliminate any intervening organization between the gun and the target organization Alternatively, surgical exposure of the cells may be required. D encoding the intrakine construct NA may be delivered via this method.   In a further aspect of the invention, the expression vector is captured in a liposome. May be caught. Liposomes are characterized by a phospholipid bilayer membrane and an internal aqueous medium Vesicle structure. Multilamellar liposomes are multiple lipids separated by an aqueous medium With layers. They are spontaneous when phospholipids are suspended in excess aqueous solution Occurs. The lipid component undergoes self rearrangement before the formation of a closed structure, and the lipid component Entrap water and dissolved solutes between the bilayers (Ghosh and Bak Hawa Bachhawat, 1991). Lipofectamine-DNA complexes are also contemplated.   In vitro liposome-mediated delivery of polynucleotides and foreign DNA Has been very successful. Wong et al. (1980) describe cultured chickens. Liposome-mediated delivery of foreign DNA in chick embryos, HeLa and hepatoma cells and And the feasibility of expression was demonstrated. Nicolau et al. (1987) reported that rats Successful liposome-mediated gene transfer after intravenous injection was achieved.   In one embodiment of the invention, the liposome is complexed with Sendai virus (HVJ) It can be formed. This facilitates fusion with the cell membrane and is encapsulated in liposomes. DNA has been shown to promote cell entry (Kaneda et al., 1989). . In other embodiments, the liposome is a nuclear non-histone chromosomal protein (HMG- It may be complexed or used together with 1) (Kato et al., 1991). What In a further aspect, the liposome is co-localized with both HVJ and HMG-1. It may be complexed or used. Such expression vectors can be used in vitro and Because of its successful use in polynucleotide transduction and expression in vivo, That is why they are applicable to the present invention. Bacteriophage promo If the protein is used in a DNA construct, It may also be desirable to include an appropriate bacteriophage polymerase. it can.   Another mechanism for introducing an expression vector into a cell is receptor-mediated delivery. This approach involves receptor-mediated effects in almost all eukaryotic cells. Utilizes the selective uptake of macromolecules by cell cytosis. Variety of receptors This delivery can be highly specific due to the cell type-specific distribution of (Wu), 1993). Receptor-mediated gene targeting vehicles are generally 2 It consists of components, a cell receptor specific ligand and a DNA binding substance. Several ligands have been used for receptor-mediated gene transfer. Widest The ligands characterized by the range are asialoorosomucoids (ASOR) (Wu) And transferrin (Wagner et al., 1993). . Recently, a novel synthetic glycoprotein that recognizes the same receptor as ASOR (neogl ycoprotein) has been used as a gene delivery vehicle (Ferkol) Perales et al., 1994) and also epidermal growth factor (EGF). Used to deliver genes to squamous cell carcinoma cells (Myers ), EPO-0273085).   In other embodiments, the delivery vehicle may include a ligand and a liposome . For example, Nicolau et al. (1987) reported that galactose was incorporated into liposomes. Use toose-terminal asialoganglioside, lactosylceramide, and Increased uptake of the insulin gene by the cells was observed. Therefore, the expression vector Can also be used with or without liposomes in any number of receptor libraries. Can be delivered specifically to cell types such as lung, epithelium or tumor cells by the gand system Can be done It is. For example, epidermal growth factor (EGF) upregulates the EGF receptor. Mediated delivery of the intrakine construct in many tumor cells May be used as a receptor for Mannose is mannose on hepatocytes Can be used to target sceptors. CD5 (CLL), Against CD22 (lymphoma), CD25 (T cell leukemia) and MAA (melanoma) A similar antibody can be used as a targeting moiety as well.   In some embodiments, gene transfer may be more easily performed under ex vivo conditions You. Ex vivo gene therapy involves the isolation of cells from animals and in vitro Delivery of polynucleotides and subsequent return of modified cells back to the animal (return). This involves surgical removal of tissues / organs from the animal or cells and organs. And primary culture of the tissue may be required. Anderson et al. (U.S. Pat. No. 346 and incorporated herein in its entirety) Disclose. The expression vector expresses the intrakine construct during ex vivo culture. obtain. Finally, the cells are pharmaceutically acceptable by any of the means described below. In form, it can be reintroduced to the original animal or administered to a separate animal .   For the treatment of human HIV or AIDS patients, the practice of the present invention To obtain peripheral blood or bone marrow from a subject. Peripheral blood lymphocytes Alternatively, the stem cells would then be isolated and stimulated. Intracaine remains The gene and any further genetic material as discussed herein Would be introduced into the isolated cells by the introduction system as described above. Leto There is rovirus infectious system It is contemplated to provide advantages. The transduced cells are then expanded into cell culture. Expanded and reinjected into the patient. Treatment frequency and re-injection for each treatment The number of cells inserted will depend on the patient's white blood cell count and is It is likely to be determined by a practitioner. However, treatment for 3 to 6 months It is contemplated that this would be required at intervals. 9. Therapeutic composition   If clinical application of the expression vector of the present invention is contemplated, the complex may be It may be necessary to manufacture a suitable pharmaceutical composition for use. General In addition, this may be a pyrogenic substance, as well as any It entails producing a pharmaceutical composition essentially free of other impurities. Can be. Also, generally, the complex is stabilized and the target cell takes up the complex. It may also be desirable to use appropriate salts and buffers to allow for You.   The aqueous composition of the present invention can also be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or aqueous medium. Or a dispersed effective amount of the expression vector. These compositions are inoculants Also called fees. The phrase "pharmaceutically or pharmacologically acceptable" Allergic if disadvantageous when administered to animals or humans as appropriate Refers to molecular entities and compositions that do not produce other undesired reactions. Used in this specification "Pharmaceutically acceptable carrier" as used is any and all solvents , Dispersion media, coating agents, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and absorption delaying agents And the like. Use of such media and agents for pharmaceutically active ingredients Are known in the art. Any conventional media or agents Its use in the therapeutic compositions is contemplated except as long as it is incompatible with the active ingredient. It is. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.   Solutions of the active ingredients as free bases or pharmaceutically acceptable salts are Produced in water, suitably mixed with a surfactant such as roxypropylcellulose Can be Dispersions include glycerol, liquid polyethylene glycol, and their mixtures It can also be produced in foods and oils. Under normal conditions of storage and use, These preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.   The expression vectors and delivery vehicles of the invention encompass classic pharmaceutical formulations Good. The administration of the therapeutic composition of the present invention will allow the target tissue to be available via that route. To some extent it can be via any of the universal routes. This is oral, Includes nasal, buccal, rectal, vaginal or topical. Alternatively, administration may be in the normal, intradermal By intraocular, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal or intravenous injection. Like this Compositions usually include a physiologically acceptable carrier, buffer or other excipient. It will be administered as a pharmaceutically acceptable composition containing.   Therapeutic compositions of the invention are advantageously combined with either a liquid solution or suspension. Administered in the form of an injectable composition; in a liquid solution or suspension before injection. Suitable solid forms may also be prepared. These formulations may also be emulsified . Topical compositions for such purpose comprise a pharmaceutically acceptable carrier. For example, the composition may contain as much as 10 mg, 25 mg, 50 mg per ml of phosphate buffered saline. Alternatively, it may contain up to about 100 mg of human serum albumin. Other pharmaceutically acceptable Possible carriers include non-toxic excipients, including aqueous solutions, salts, preservatives, buffers and the like. Include. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil and And injectable organic esters such as ethyl oleate. The aqueous carrier is water , Alcohol / water solution, physiological saline solution, sodium chloride, Ringer's dextrose (Ringer's dextrose) and the like. Intravenous vehicle Include liquid and nutrient supplements. Preservatives are antibacterial, antioxidant, chelate Agents and inert gases. PH and pH of various components of the pharmaceutical composition The exact concentration is adjusted according to known parameters.   The immunopathological effects of HIV infection are based on cells with high affinity receptors for the virus. Is directly related to the interaction of the virus with. Immunological abnormalities in AIDS patients Alternative T cell depletion, reduced in vitro lymphoproliferative response and anti-lymphocyte anti- Includes the presence of the body. Thus, HIV infection results in depleted lymphocyte concentrations . Lymphocyte measurement in patients who develop symptoms of AIDS is known in the art, Of patients who are HIV positive and those who develop symptoms of AIDS It is contemplated that it can be used to increase the content of active lymphocytes. this In this regard, the therapeutic compositions of the present invention may reduce the symptoms of AIDS and also HIV infection May also be used in conferring resistance to   As discussed previously, HIV infection is responsible for the proliferation of a pool of lymphoid cells. Directly resulting in disruption of T4 cell function, including infection and destruction of certain progenitor cells There may be several styles. The present invention therefore relates to the genetic structure of the present invention. By providing autologous and xenogeneic bone marrow transplants containing architectural containing cells Methods of treating HIV infection are contemplated.   Adoptive immunotherapy involves the isolation and isolation of immunologically active cells from a donor. Is a therapeutic regimen that requires cloning and propagation in vitro. Multiplied The therapeutically active cells are provided to the patient for therapeutic effect. Donor If you are a patient, the introduction is "self." If the donor is separate from the patient, This introduction is "heterogeneous".   Autologous bone marrow transplantation using the present invention is seropositive but still HIV-infected From patients who do not develop the characteristics of CCR and do not have cell surface CCR expression Contemplate the use of lymphocytes and manipulate these cells to express intrakines. Make. These cells are then transplanted into a patient, thereby causing the patient to have HIV sensitivity. Gives resistance to dyeing.   Xenogeneic bone marrow transplants using the present invention are also contemplated. In these cases, H Engineering Lymphocytes from an LA-Adapted Donor to Express Intrakine I do. These bone marrow transplants are used in HIV-infected patients whose immune system has been compromised. Can be useful in   Bone marrow is a normal volunteer donor, a normal donor for bone marrow transplantation, Or from ribs resected at the time of cardiopulmonary surgery in patients without evidence of hematological disease Good. For the preparation of human mononuclear cells, aliquots of bone marrow should Layer in container. Initially, mononuclear cells are used to provide bone marrow sources, such as the tibia, femur, From the spine, ribs, pelvis, sternum, and humerus, radius, ulna, tibia and fibula May be. In addition, these cells can be umbilical cord blood, peripheral blood or cytokines. It can also be obtained from cytokine-mobilized peripheral blood. Human hematopoiesis Other sources of stem cells include embryonic yolk sac, fetal liver, fetal and adult spleen, and blood. Include.   Centrifuge the bone marrow layer to remove the red blood cell pellet, medium (med ia) to produce a clear layer, an interface layer containing mononuclear cells and a plasma medium layer on top. You. The interface layer may then use, for example, suction. Centrifuge this layer at 1000g The detachment ultimately results in a pellet of mononuclear cells. This pellet is then submitted to FACS May be resuspended in a suitable buffer.   They yield the bicistronic chemokine constructs of the present invention. About 200 cc per sample to transduce autologous T lymphocytes A blood sample is isolated from the subject. Isolating lymphocytes from a blood sample; and , Janda et al., Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. American Society for Microbiology, Washington DC, Chapter 19, 137 Pages; standard as exemplified by (incorporated herein by reference) Keep under appropriate conditions according to the protocol. In this style, about 10¹¹Number of The hempocytes can be isolated from the culture after approximately two weeks.   Isolated cultured lymphocytes from which they were intrakine and secreted So that it can produce a form of the desired chemokine, as described herein above. Transduced with such a retrovirus or other vector. These lymphocytes Then about 10⁹Pharmaceutically acceptable so that a dose of lymphocytes is delivered. It may be reinfused or injected back into the host subject in a suitable carrier. Dosages may range from two weeks to six months as desired, depending on the condition of the subject's immune system. Or at intervals ranging up to one year. For example, if the target WBC is Transduced lymphocytes or stem cells when reduced by HIV infection To maintain acceptable levels of HIV immune lymphocytes and to circulate Increase chemokine to inhibit further infection and other HIV The risk of secondary infection can be reduced along with the therapeutic measures.   Of course, the compositions of the present invention may also be used for traditional treatments, such as zovidobudine (AZT) It is understood that they may be used in conjunction with treatments that require). This is H Dideoxynucleotides that block HIV replication by inhibiting IV reverse transcriptase One of a class of nucleoside analogs known as osides. 11. Example   The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the invention. Follow The technology disclosed in the embodiments is considered to function sufficiently in the practice of the present invention. And thus constitute a preferred mode for its practice. It should be recognized by those skilled in the art that However, Many modifications will occur to those skilled in the art, in light of the present disclosure, from the spirit and scope of the invention. Without departing, it may be made in the specific embodiments disclosed, and It can also be appreciated that similar results can still be obtained.                                 Example 1                                   Method   Construction of expression vector. Human MIP-1α and RANTES genes were PCR ™ amplification was performed from nuclear cell (PBMC) cDNA. MIP-1α and And the RANTES gene were then KDEL sequenced by PCR ™ reaction. SEKDEL, which binds to SEQ ID NO: 7 (Marasco et al., 1993). Natural MIP-1α and RANTES genes and their mutants Each was cloned into an expression vector (FIG. 2). DNA sequencing of all constructs (Wake for Resting University DNA sequencing core facility of Wake Fo rest University)).   Detection of protein expression and immunofluorescent staining. Label and precipitate the recombinant protein To let the cells fall³⁵Radiolabeled with S-cysteine and precipitated with antibody ( Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2932-5936, 1994). Heat denaturation Later, the protein sample was electrophoresed on SDS-polyacrylamide gel. Analyzed and visualized by phosphorimager. Flow rhino 6x10 for tomometry assay^FiveIncubate individual cells with primary antibody for 1 hour And then incubated with fluorescein conjugate . Analyze cells with Beckton Dickinson FACScan did. Indirect immunofluorescence staining was performed as described (Chen et al., 1994). Was.   Syncytium formation assay. HeLa-T4 grown on plate⁺Cells (about 50% Confluence) and calcium phosphate system (Promega) PCMV-CCR5 with various amounts of chemokine expression plasmid DNA For co-transfection. At the same time, HeLa cells were converted to T or Mφ tropism. HIV-1 envelope protein expression vector . 48 hours later, transfected expressing envelope protein HeLa cells (2 × 10^Five) Were co-transfected with HeLa-T4⁺ Cells (1 × 10^Five). After 12 to 24 hours of co-culture, Incitium was counted after violet crystal staining.   Development and gene transfer of retroviral packaging cell lines. MI PLNCX of retrovirus containing P / K or RANTES / K gene Transfer vector (Figure 2) to amphotropic packaging cells (PA317) And then use the culture medium of the transfected cells. To infect PA317 cells. 48 hours later, infected packaging cells are Selection was performed for 2 to 3 weeks using a medium containing G418 (800 μg / ml). G418 The resistant colonies were secondarily cloned and characterized by genetic analysis, Complete incorporation of the gene into the chromosome of the packaging cells was confirmed. Human To generate PBL, PBMCs from healthy individuals are (Ficoll-Hypaque) separated on a density gradient and non-adherent L-2 (1,000 IU / ml) (Chiron, CA) anti-CD3 (5 ng) / ml) (PharMingen, CA) and PHA (5 μg / ml) supplemented with RPMI-1640 / 20% FCS) for 48 hours. thorn The infused PBL cells are then cultured in a culture medium containing protamine sulfate (5 μg / ml). Was transduced by co-culturing with recombinant packaging cells for 48 hours. Trait The introduced PBLs are harvested and cultured for one day, and then for an additional two days Transduction was performed in the supernatant of the packaging cells. Culture PBLs after the last transduction Grow for several days in the ground.   HIV-1 infection and RT assay. 10% FCS and rIL-2 (1,000I U / ml) and PBL in RPMI medium supplemented with anti-CD3 (5 ng / ml). 600 half-maximal tissue-culture infe ctious dose unit) (TCID₅₀) Or Mφ with 20,000 cpm RT activity or Infected with T-tropic HIV-1 virus I let it. After 4 hours incubation at 37 ° C., the infected PBLs are then washed once. And resuspended in culture medium, and the RT activity in these cultures was subsequently determined. Measured as described (Chen et al., 1996).                                 Example 2                Targeting chemokines to the endoplasmic reticulum lumen   The mutated chemokines can be used to transport and synthesize newly synthesized CCR5. Targeted to the ER lumen of lymphocytes to block expression intracellularly . This resulted in a phenotypic CCR5 knockout (FIG. 1).   Residual signal sequence of resident soluble ER protein (KDEL ) (Munro and Pelham, 1987). And RANTES, and their mutated genes (MIPI-K and RANTES-K) was converted to an expression vector (pRc / CMV) having a Neo marker. (FIG. 2). Both natural and mutated chemokines Bicistronic vectors for expression are also available in both intracellular and extracellular Constructed to inhibit IV infection. Expression of these two forms of chemokines is Secretes Caine to sensitive cells, as well as Inhibits viral infection of the knockout CCR5 on the present type (FIG. 2).   To measure the expression and localization of native and mutated chemokines, Radiolabeling and immunoprecipitation studies were performed. Transform COS cells with plasmid DNA Transfection, and 48 hours later³⁵Radiolabeled with S-cysteine. cell The lysate and culture medium are then added to anti-human M Immunoprecipitated with IP-1α. One 8 Kd tapper corresponding to MIP-1α Is the culture medium of cells transfected with pCMV-MIP1 And cell lysates, but not in control cells .   In cells transfected with pCMV-MIP1-K, MIP-1 The alpha protein was found predominantly in the cell lysate but not in the culture medium. MIP1 To further determine the retention of -K cells, transfected cells Pulse radiolabeled for minutes, followed for various times, and then immunoprecipitated. MIP1-K protein was stably retained in cells with a half-life of more than 4 hours. Was found. Transfected with a bicistronic expression vector In both cells, both MIP1 and MIP1-K proteins were co-expressed.   Further localization of native and mutated chemokines by immunofluorescence staining Inspected. ER staining pattern was transfected with pCMV-MIP1-K Cells that were observed throughout the cytoplasm of the transfected cells, while staining the Golgi around the nucleus. Turns were seen in cells transfected with pCMV-MIP1. Heaven Natural and mutated RANTES proteins are also native and mutated. Cells transfected in a manner similar to the different MIP1 proteins Was expressed. Thus, these results indicate that the mutated chemokines Natural chemokines are secreted from cells while expressed and stably retained in the ER Indicates that it was done.                                 Example 3             Effect of Intrakine on Surface Expression of CCR5   To test the effect of intrakine on CCR5 surface expression, HA CC labeled with pitope (Liu et al., 1996; Field et al., 1988) A vector for expression of R5 was constructed (FIG. 2). Flow cytometry assembly Cotransfected with a vector that expresses intrakine using HA-CCR5 surface expression on the isolated cells was measured.   As shown in FIG. 3B, pCMV-HA-CCR5 alone was transfected. Cell-surface expression of HA-CCR5 was detected in 64.7% of the cells . However, co-transfection with increasing amounts of pCMV-MIP1-K Cell number with surface staining positive for HA-CCR5 Slightly (FIGS. 3C and 3D). Cotransfection with pCMV-MIP1-K Is an unrelated mouse leukemia virus envelope protein (Matsuoka (M atsuoka) et al. Biol. Chem., 269: 22565-22573, 1994). Did not harm. This result indicates that the expression of CCR5 surface was blocked by intrakine. To prove that   Blockade of HA-CCR5 surface expression is due to the newly synthesized HA- of MIP1-K. To determine if it was the result of intracellular binding to CCR5, Say was implemented. pCMV-MIP1-K and pCMV-HA-CCR5 In transfected cells, MIP1-K protein is converted to anti-HA antibody More co-sedimentation. The specificity of the co-immunoprecipitation was that the anti-HA antibody was pCMV-MIP1 -K alone transfected or viral PTV G protein Vectors that overexpress irrelevant proteins such as proteins (Matsuoka Et al., 1994; Choi MIP1-K in cells co-transfected (Chen et al., 1994). This was further confirmed based on the observation that no action was taken.   Indistinguishable band of CCR5 protein does not appear on SDS-PAGE Specific co-immunoprecipitation and flow cytometry Data showed expression of HA-CCR5 in the cells. Heterogeneous glycosylated proteins Turns or other unidentified properties have been described in previous studies (Liu et al., 1996; As observed in Strader et al., 1994), this May contribute to the abnormal migration of these receptors. Taken together, these The results show that the intrakine retained in the ER binds the newly synthesized CCR5 molecule. And prevent their transport to the cell surface.                                 Example 4                   Effect of Intrakine on CCR5   To further examine the effect of intrakine on CCR5, the sensitive CC An R5 / CD4-mediated syncytia formation assay was performed (Deng et al., 19). 96). Transformed cells expressing CD4 (HeLa-T4⁺) (Marasco (Mar asco) et al., 1993), using pCMV-C with varying amounts of pCMV-MIP1-K. Co-transfected with CR5 and 48 hours later, Mφ (ADA and Y U2) or T (IIIB) tropic HIV-1 envelope protein (butterfly ( Choe) et al., 1996) with HeLa cells expressing 12-24 hours.   As shown in FIG. 3E, co-culture with cells expressing pCMV-MIP1-K No significant inhibition of Mφ tropic envelope-mediated syncytium formation was observed in Was. Cotra with increasing amounts of pCMV-MIP1-K If transfected, Mφ tropic envelope-mediated syncytia Formation was almost completely inhibited. However, T-tropic envelope-mediated synths Citium formation was inhibited by transfection with pCMV-MIP1-K. Was not. Syncytium form of Mφ tropic envelope protein in various degrees The inhibitory effects on maturation were as follows: pCMV-MIP1, pCMV-MIP1 / K, pCMV-MIP1 / K V-RANTES, pCMV-RANTES-K or pCMV-RANTE It was also observed in cells co-transfected with S / K (FIG. 3E). Heaven Syncytium formation by expression of natural (secretory) MIP-1 or RANTES May be due to partial saturation of the binding site on CCR5.   To evaluate potential therapeutic applications, a bicistronic expressing cassette (MI P1 / K and RANTES / K) are retroviral shuttle vectors for mice It was cloned into pLNCX (Miller, 1992) (FIG. 2). Chemokine Transformed packaging producing recombinant retrovirus containing gene Generated and characterized a cell line (PA317) (Miller, 1992) did. Fresh human PBL is then co-cultured with the transformed packaging cells The cells were transduced with the MIP / K gene by feeding. After transduction, the chemokine genes and And specific DNA fragments corresponding to the IRES sequences were Amplified from PCR DNA by PCR ™. MIP-1 and MIP1-K Protein expression was determined by radiolabeling and immunoprecipitation assays in transduced PBLs. But not in untransduced PBL.   The transduced or mock transduced PBLs are then And infected M-1 or T-tropic HIV-1 isolates, and Inspect ills production by reverse transcriptase (RT) assay (Chen et al., 1994) did. Transduced or untransduced PBL (2 × 10^FivePieces), 600T CID₅₀Or several Mφ or T-tropic HIV-1 cells with 20,000 cpm RT Virus for 4 hours and then 1,000 IU / ml rIL-2 and anti- Replaced with fresh culture medium containing CD3 (5 μg / ml). Every 3 or 4 days The number of cells in each well was counted and the culture medium was subjected to RT assay. Bag RT activity in replicate wells after subtracting background (cell 10^FivePcs / ml) Issued. Only low levels of RT activity were transduced by Mφ tropic virus. However, high levels of RT activity were detected in cultures of Detected in BL culture. However, the T-tropic HIV-1 virus does not Capable of infecting both transduced and mimetic transduced PBLs. there were. These results indicate that human PBLs transduced with the intrakine gene It shows that Mφ is resistant to HIV-1 infection.                                 Example 5 Cell for inactivating CXR4 receptor for HIV-1 gene therapy Modification of lymphocytes expressing intracellular CXC-chemokines   Fusin / CXC-chemokine receptor (CXR) with seven transmembrane segments -4 is a T-tropic human immunodeficiency virus (HIV) -type 1 coreceptor This is required for fusion and entry into CD4 positive lymphocytes. HIV-1 Due to the critical role of CXR4 for infection, the inventor Lymphocytes with type knockout are H It was assumed that it appeared to be resistant to IV infection. In this study, CXR4 organisms Biological ligand, stromal cell-derived factor-1 (SDF), was transferred to the luminal endoplasmic reticulum (E R) was genetically modified to target (FIG. 4A). as a result, Intracellularly retained SDF binds newly synthesized CXR4 and cell surface Prevented its transport to the surface.   Lymphocytes with a phenotypic CXR4 knockout are resistant to T-tropic HIV-1 infection. It was resistant. In addition, co-expression of secreted and ER retained chemokines Achieved due to additional inhibition of ills infection. In summary, CXR4 co-receptors This uniquely targeted approach is important for HIV-1 gene therapy It should have various applications.   Macrophage tropic HIV-1 co-receptor, CC-chemokine receptor -(CCR) -5 gene deficiency is associated with some individuals' innate response to HIV-1 infection. It was found to be the cause of the resistance. These data indicate that CXR in lymphocytes This suggests that a knockout of 4 may have therapeutic implications. Inventor And others have shown that blockade of cell surface expression of membrane proteins has Formed by intracellular binding of the body or other molecules targeted to the ER. (Marasco et al., 1993; Chen et al., 1995a; Chen n) et al., 1995b; Buonocore and Rose, 1990). In this study, The mutated SDF can be used to express the trafficking and surface expression of newly synthesized CXR4. Generated to target the ER lumen of lymphocytes for intravesicular blockade (FIG. 4A). Genetically modified without co-receptor CXR4 on cell surface Lymphocytes were found to be resistant to T-tropic HIV-1 infection.   The SDF-1 gene is identified as having a single amino acid difference from human SDF-1. Cloned from mouse spleen cDNA and then Protein residual signal sequence (KDEL) (Munro and Pelham, 1987). SDF gene and its derivative (SDF-K) Then, clone the expression vector (pRc / CMV) with Neo selection marker. (FIG. 4A). For co-expression of natural and mutated chemokines Bicistronic vectors are also sensitive cells due to extracellular secretion of chemokines. Against CXR4, which is knocked out phenotypically by intracellular binding (FIG. 4A).   The resistance of the transduced lymphocytes to T-tropic HIV-1 infection is shown in FIG. 4B. Show. SDF, transduced cells expressing SDF-K, or transduced cells Jurkat cells (2 × 10^FivePieces), 600 TCID₅₀T-1 HIV-1 Virus was equally infected for 4 hours and then placed with fresh culture medium . Display RT activity in duplicate wells after subtracting background levels (FIG. 4B).                                 Example 6 Effect of intracellular SDF-intrakine expression on CXCR4 surface expression   SDF-1α gene and ER residue signal sequence (KDEL) (Marasco (Mar Asco) et al., 1993) Cloning the modified gene into an expression vector (Fig. 2). Influenza hemagglutinin (HA) tag (field) Constructs containing Field), et al., 1988) were also produced to facilitate protein detection. I was SDF-1 and SDF- K protein expression was measured by radiolabeling and immunoprecipitation analysis. For HA label The SDF-1 protein band precipitated by the corresponding antibody is accompanied by HA labeling. Transcription with a construct containing the native SDF-1 gene (pCMV-SDF-HA) Found in both culture medium and lysate of the transfected HeLa cells Was. The corresponding protein band was transfected with the control plasmid. Was not detected in the cells. However, SDF-K protein is not transfected. Cells in the cell lysate rather than in the culture medium of the Natural SDF-I was secreted from the cells, but the modified SDF-K (SDF- Intrakine) was retained in the cells. Intracellular preservation of SDF-K A pulse chase experiment was performed to further prove retention. Natural SDF-1 While secreted efficiently from cells, SDF-intrakine was greater than 4 hours It was shown to be stably retained in the cells with a half life.   Inhibition of CXCR4 surface expression by expression of SDF-intrakine Later, a sensitive CXCR4 / CD4-mediated syncytium formation assay (Bruell) (Bluel) et al., 1996; Marasco et al., 1993). 12 hole pre CXCR4 and CD4 positive HeLa-T4 cells implanted on the plate IIIB envelope expressor (Marasco et al., 1993) and S Co-transfected with DF expression vector. Only with envelope expression Cotransfection with transfected or control vector Extensive syncytium formation was observed in the conditioned cells. However, In cells co-transfected with pCMV-SDF-K, multinucleated (p olykaryon) was not formed at all or only slightly formed. pCMV- Co-transfection with SDF partially inhibited syncytia formation. 3 Repeated studies show consistency of SDF-intrakine on syncytium formation Showed an inhibitory effect. Further co-immunoprecipitation assays were performed to And possible intracellular binding of CXCR4 was measured. SDF-intrakine is p CXCR4-positive HeLa cells transfected with CMV-SDF-K Coprecipitated using anti-CXCR4 antibody from vesicles (Bluel et al., 1996) Suggested association of SDF-intrakine and CXCR4. In addition, SDF- Surface expression of CXCR4 on transduced lymphocytes expressing K Dramatically reduced as demonstrated by itometry assays. Overall, this The results from these transient assays indicate that SDF-intrakine was newly synthesized. Suggests that CXCR4 binds and blocks its transport to the cell surface. Construction of expression vector: mouse SDF with single amino acid difference from human gene The -1α gene was replaced with Primer-5'-TTAAGCTTCGCGCCATGAAC GCCAAGGTC-3 '(SEQ ID NO: 2) (P1) and 5'-TTTGCGG CCGCTTACTTGTTTAAAGCCTCTCCAGGT-3 '(sequence No. 3) (Nagasawa et al., 1994; Shirozu et al., 1995) PCR amplification was performed from mouse spleen cDNA. HA tag sequence (SEQ ID NO: 1 and With a primer designated as SEQ ID NO: 2 and 5'-TTT TCTAGATTAAGCATAATCTGGAACATCATACGGATA CTTGTTTAAAAGCCTTCTCCAG-3 '(SEQ ID NO: 4) Was bound to the SDF-1α gene by PCR. SDF-1α or S The DF-1α-HA gene was then replaced with primers (P1 and 5′-TTTTCT AGATTACAGCTCGTCCTTCTCGCTAGCATAATCTGG ER residue by PCR reaction using AACATCATA-3 '(SEQ ID NO: 5) Signal (SEKDEL) SEQ ID NO: 6). These DNA fragments are converted to Hi ndIII / XbaI and digested with an expression vector (pRc / CMV) (Malath (Marasco et al., 1993). SDF-1α-KDEL fragment Torovirus vector pLNCX (Chen et al., 1997) further cloned And the resulting construct is called LNCX-SDF-K / Neo. Was. Truncated nerve growth factor receptor PCR amplified from MN vector DNA (ΔNGFR) gene (Phillips et al., 1996; Rudol) l) et al., 1996), by replacing the neomycin selectable marker with LNCX- It was cloned into SDF-K / Neo. All of the constructs were digested by restriction digestion. And confirmed by DNA sequencing.                                 Example 7            Development and evaluation of a lymphocyte line that expresses intrakine   To further determine the effect of SDF-intrakine expression, two CD4 / C XCR4 + immortal lymphocyte lines, Jurkat and Molt-4 (Marasc o) et al., 1993; Daniel et al. Virol. 62, 4123-4128, 1988) Transfected with various expression vectors by perforation method, then Selected (Chen et al., 1994a; Chen et al., Nature 385, 78-80, 1997. ). Transduced phosphorus Incorporation of the SDF vector into papilla was demonstrated by PCR amplification of the genome. take Transcription of the inserted SDF1 or SDF-K gene is also performed by reverse transcriptase (RT)- It was detected by PCR. In addition, the expressed SDF-1 is transduced lymphoid SDF-intrakine was found to be secreted from Held inside. For transduced lymphocyte CXCR4 surface expression Effect of SDF-intrakine on flow cytometry assay (Chen Et al., 1994a). CXCR4 surface expression detected with Molt control But was dramatically reduced with Molt-SDF-K. In contrast, comparable Levels of CD4 Surface Expression Detected in Both Parental and Transduced Molts Was. Transduced lymphocyte organisms including cell growth and DNA synthesis rates The biological characteristics were found to be similar to the parent lymphocytes.   Expression of SDF-intrakine transduces T-tropic HIV-1 entry Lymphocytes to determine if they can lead to resistance A envelope complementation assay was used. In this assay, trans-expressed H IV-1 envelope glycoprotein is chloramphenicol acetyl trans A single envelope-deficient provirus encoding the Ferrase (CAT) gene Complements the rounds of replication (Chen et al., 1994b; Choe et al., 1996). For T Pseudotyped with an envelope glycoprotein from the baculovirus (IIIB) virus (pseutoty ped) produce recombinant virus and infect the efficiency of entry of the recombinant pseudovirus Evaluation was made by measuring CAT activity in the cells 60 hours later. Control lymphocytes High levels of CAT activity were detected after infection with the recombinant IIIB virus, However, transduced cells expressing SDF-intrakine CAT activity levels in isolated lymphocytes dropped dramatically. Expresses native SDF-1 Partial inhibition of virus entry of transduced lymphocytes into It may be due to partial saturation of the binding site on CXCR4 between and after.   To further examine the effects of SDF-intrakine, transduced or Infected control Molt lymphocytes with 20,000 cpm of RT T-tropic IIIB virus. I let you. Extensive syncytium formation in Molt controls was observed 6 days post-infection On the other hand, only a few syncytia were observed in Molt-SDF-K cell cultures . Consistently, high levels of RT activity were detected in Molt control cultures, but However, only low levels of RT were detected in Molt-SDF-K cultures. Natural Molt-SDF secreting SDF-1 is partially resistant to viral infection. there were. To confirm this result, transduced or untransduced J urkat lymphocytes are also infected with the IIIB virus and SDF-intra. The dramatic anti-HIV effect of Cain was also observed in the transduced cells. Therefore This result indicates that transduced lymphocytes expressing SDF-intrakine Shows that it is viable and resistant to T-tropic HIV-1 infection. Development of transformed lymphoid lineage: about 1 × 10⁶Molt-4 and Jurk at human immortal lymphocytes were supplemented with RPMI-supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). Culture in 1640 medium and electroporation (Yang et al., Nature Biotechno Transfection with 10 μg of plasmid DNA according to logy 15, 46-51, 1997). I did. After 48 hours, the transfected lymphocytes were then 800 μg / ml G418 (Gibco-BR L (Gibco-BRL)) in RPMI-1640 / 10% FCS containing 24-well plates Selected for 2-3 weeks above. Pick up G418-resistant cells and go elsewhere (Chen et al., 1994a) (incorporated herein by reference). Was cloned by limiting dilution as described above. Envelope complementation assay. 10cm 293 cells grown on the dish were washed with pHXBΔenvCAT (20 μg) and enzyme. Velocity protein expression (5 μg) (Chen et al., 1994b; Choe et al.) , 1996). Harvest the culture medium after 48 hours, and RT activity in the supernatant was measured (Yang et al., 1997). Recombinant virus (20,000c pm RT activity) to infect target cells by overnight incubation, And after 60 hours, the target cells are then lysed and the kit (Promega) is It was used to measure the CAT activity used. Detection of protein expression and flow cytometry assays. Recombinant protein Cells for various times to label and immunoprecipitate³⁵S-cysteine if Or -Trans, and the cell lysate and culture medium It was then described elsewhere (Chen et al., 1996, incorporated herein by reference). (Incorporated). SD after heat denaturation Analyzed by electrophoresis on S-polyacrylamide gel and converted to phosphor imager More visualized. 1x10 for flow cytometry assay⁶Lymph nodes Incubate the spheres with the primary antibody for 1 hour, then bind fluorescein Incubated with the Cells are then transferred to Becton Dickinson (B (eckton Dickinson) FACScan.                                 Example 8            Resistance of transduced PBL to HIV-1 infection   The following example demonstrates the resistance of human peripheral blood lymphocytes (PBL) to HIV-1 infection. Demonstrate the ability of SDF-Intrakine to empower. First, PBL is converted to SD Transduced with a recombinant retrovirus containing FK and Neo selectable marker (Figure 2), and viral infection with transduced PBLs after Neo selection is dramatic Was inhibited. However, non-specific toxicity to primary PBL, transduction efficiency Due to the difficulties in reliably assessing and the extended process of Neo selection , A shortened human nerve growth factor receptor expressed on transduced cells (Δ NGFR) was used to quantify gene transfer efficiency and isolate transduced PBLs. (Phillips et al., Nature Medicine 2 Rudoll et al., Gene Therapy 3, 695-705, 1996). About 7 to 10 percent of the stimulated PBLs are (LNCX-SDF-K / ΔNGFR) or transient transfection Packaging cells (Bing) (Pear et al., Pro. Nat. Acad. Sc. i. USA. 90, 8392-6, 1993; Pear et al., Methods in Molecular Biology: Me thods in Gene Therapy (P. Robbins), (Humana Press (Hu mana Press), Totowa, NJ, 41-57, 1997). Characterized by a control retroviral vector (MN) expressing only the GFR marker Introduced. The transduced PBLs were then transformed into anti-NGFR / anti-IgG magnetic beads. Kit (ImmunoTech Inc., Westbreak, Maine) ). After isolation, more than 93 percent of the PBL population had NGFR markers Positive.   To evaluate the anti-HIV-1 effect of SDF-intrakine, LNCX-SD Isolated P transduced with either FK / ΔNGFR or MN control BL was infected with the same IIIB virus inoculum and virus production in culture Raws were examined by RT assay. Only low levels of RT activity were transduced High levels of RT were detected in cultures of PBL but not in MN (control). Detected in the introduced PBL culture. Thus, SDF-intrakine genetics The offspring are efficiently transduced into primary human PBL, and the transduced PBL is It was resistant to T-tropic HIV-1 infection. Biological evaluation of transduced PBL   Some lymphoid lines expressing SDF-intrakine have normal biological characteristics. SDF-integrity on primary human lymphocytes The effect of rakine expression was examined. Therefore, fresh human PBL was prepared using LNCX-SD Transduced with FK / ΔNGFR or MN vector and transduced PBL was isolated. Several biological analyzes were performed. First, LNCX-S Flow PBL transduced with either DF-K / ΔNGFR or MN Cytometric analysis was performed. LNCX-SDF-K / ΔNGFR or MN Levels of CD3 and CD4 molecules on PBLs transduced with Expression was present. In contrast, C on PBLs transduced with LNCX-SDF-K / ΔNGFR XCR4 surface expression is different from CXCR4 expression on PBLs transduced with MN. Dramatically reduced when compared. These results indicate that SDF-intrakine Selective blockade of XCR4 surface expression And Chemotaxis assays are also performed with transduced P on chemokine stimulation. Performed to determine BL responsiveness. Transduced with LNCX-SDF-K Responsiveness of PBL to stimulated recombinant SDF-1 was determined by transduction with control MN. Significantly decreased when compared to that of the PBLs. However, LNCX -PBLs transduced with SDF-K or MN were used for CC-chemokine receptor. Stimulating MIP-1α binding to ter (Baggiolini et al., 1994) Were equally sensitive. These results indicate that CX by SDF-intrakine Further evidence of selective inactivation of CR4. Transduced with LNCX-SDF-K The portion of the PBL that was removed is probably the residual CXCR4 on a portion of the PBL, or Is associated with an unidentified interaction of SDF-1 with chemokine receptors other than CXCR4. It was shown that the cells responded to SDF-1 at a higher concentration. Third, LNCX-SD PBLs transduced with FK / ΔNGFR show IL-2 production, cell proliferation and DNA synthesis may respond normally to anti-CD3 / CD28 or PHA stimulation. Was shown. Therefore, these results indicate that humans expressing SDF-intrakine Suggests that PBLs maintain normal biological activity. Retroviral vector production and gene transduction. PB from healthy individuals MCs were separated on a Ficoll-Hypaque density gradient and The adherent PBL was added to the culture medium (rIL-2 (500 IU / ml) (Chiron, Caliph). Ornia) and anti-CD3 (5 ng / ml) (PharMingen, potassium) 48 hours in RPMI-1640 / 20% FCS) did. Recombination using the amphotropic retrovirus packaging cell line Bing Retro virus vector Was transiently produced. Bing cells are grown on a 100 mm dish at 80% confluence and Use calcium phosphate transfection kit (Promega) To obtain 15 μg of LNCX-SDF-K / ΔNGFR or MN Transfected with Sumid DNA. 48 hours later, the stimulated PBL is Transfer containing rIL-2, anti-CD3 and protamine sulfate (5 μg / ml) The cells were cultured at 37 ° C. for 24 to 72 hours in the supernatant of the ligated Bing cells. Trait Harvest the introduced PBLs and subject them to flow cytometry analysis on the PBLs. NGFR markers were detected. Isolation of transduced PBL: affinity purification directed to Fc fragment of mouse IgG 1 micron spherical particles directly coated with a modified sheep polyclonal antibody US IgG magnetic immunobeads (ImmunoTech Inc.) Diluted 20-fold in BS / 0.2% BSA. Separation of the beads from the buffer solution To a cobalt-samarium magnet support (Immunotech, Inc.) (Immuno TechInc.)) For 5 minutes. 5 to 20 μg of anti-human NGFR antibodies (Boehringer Mannheim, India) (Indianapolis, Na.) To 1-4 mg beads in PBS / 0.2% BSA And incubated for 15 minutes at room temperature. Wash with PBS / 1.2% BSA After purification, 0.5 mg (50 μl) beads were added to 10% PBS / 30% FCS.⁷PBL1m Added to 1 and incubated at room temperature for 10 minutes. Bead / PBL solution Then place in cobalt-samarium magnet support for 10 minutes and not bonded The supernatant containing the cells was discarded. Bead / PBL rosette in PBS / 0.2% BS A twice, and culture medium Resuspended at 37 ° C for 24 hours. Chemotaxis assay: control of LNCX-SDF-K / ΔNGFR or MN 5 × 10^FiveOf the isolated PBLs were combined with 0.25% human serum Suspend in 100 μl of RPMI-1640 medium containing bumin and add 5 μm pore Recarbonate Transwell culture insert (COS) (Costar, Cambridge, MA). Various Concentration of recombinant human MIP-1α or SDF-1 (R & D System, Inc. (R & D System Inc.), Minneapolis, MN) containing 500 μl of RPMI-1 640 / 0.25% albumin was added to the bottom chamber of Transwell. Three After incubation at 7 ° C. for 3 hours, the number of cells in the bottom chamber was counted and transferred ( transmigration) of the background (absence of chemokine) Present after transfer is deducted (Bluel et al., 1996).   All of the compositions and / or methods disclosed and claimed herein are Can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. The composition of the present invention While the methods and methods have been described with reference to the preferred embodiments, the variations have been described herein. Composition and / or method, as well as the steps of the method or a series thereof. In the stages, the present invention is applied without departing from the concept, technical idea and scope. It may be apparent to those skilled in the art. More specifically, chemical and An agent that is relevant to both physiological and physiological May be used in place of the agents described herein when they appear to be And can be obvious. All such similarities obvious to one skilled in the art Substitutions and modifications as defined by the appended claims. , Within the spirit, scope and concept of the invention.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年７月２日（１９９８．７．２） 【補正内容】 請求の範囲 １．発現領域が、 プロモーター； 細胞内残留シグナル配列をコードする領域；および ケモカインをコードする遺伝子 を含んで成り； 最低１種の細胞内残留シグナル配列およびケモカインをコードする遺伝子が細胞 内に残留するケモカインをコードする転写物として前記プロモーターから発現さ れる、発現ベクター。 ２．分泌性ケモカインをコードする遺伝子をさらに含んで成る、請求の範囲１の 発現ベクター。 ３．前記分泌性ケモカインをコードする前記遺伝子が内部リボソーム進入部位か ら発現される、請求の範囲２の発現ベクター。 ４．レトロウイルスベクターとしてさらに特定される、請求の範囲１の発現ベク ター。 ５．前記細胞内残留シグナル配列が小胞体残留シグナル配列である、請求の範囲 １の発現ベクター。 ６．前記小胞体残留シグナル配列がＫＤＥＬ配列である、請求の範囲５の発現ベ クター。 ７．前記ＫＤＥＬ配列がアミノ酸配列ＳＥＫＤＥＬ、配列番号６を有する、請求 の範囲６の発現ベクター。 ８．前記ケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプター、Ｃ−Ｃケモカイ ン３レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターおよびＣＸＲ４レセプターから 成る群の最低１種のレセプターに結合するケモカイン をコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 ９．前記ケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプターに結合するケモカ インをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １０．前記ＣＣケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン３レセプターに結合する ケモカインをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １１．前記ＣＣケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターに結合する ケモカインをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １２．前記ＣＸＣケモカイン遺伝子が、ＣＸＲ４レセプターに結合するケモカイ ンをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １３．分泌性ケモカインが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはＳＤＦである 、請求の範囲２の発現ベクター。 １４．前記分泌性ケモカインが細胞内に残留するケモカインと同一のケモカイン レセプターに結合する、請求の範囲２の発現ベクター。 １５．１個もしくはそれ以上のアミノ酸が、細胞内に残留するケモカインおよび ／もしくは分泌性ケモカインのＮ末端から欠失される、請求の範囲１４の発現ベ クター。 １６．前記細胞内残留シグナル配列が、発現されたタンパク質を小胞体、ゴルジ 装置、リソゾーム、細胞内小胞もしくは他の細胞区画に向ける、請求の範囲１の 発現ベクター。 １７．細胞中のケモカインレセプターの表現型の発現の阻害方法であって、当該 方法が、前記レセプターを結合しかつそれを細胞内区画に向けるポリペプチドを 前記細胞中で発現することにより前記ケモカインレセプターの細胞表面の発現を 封鎖することを含んで成る方法。 １８．プロモーター、細胞内残留シグナル配列およびケモカインレセプ ターに結合するポリペプチド遺伝子をコードする核酸区分を含んで成るベクター を得ること；ならびに 前記ベクターを前記細胞に形質導入すること、 の段階を含んで成るものとしてさらに特定される、請求の範囲１７の方法であっ て； 前記ベクターが、前記細胞に形質導入される場合に、前記プロモーターの転写制 御下に前記細胞内残留シグナル配列およびケモカインレセプターに結合するポリ ペプチド遺伝子を発現して融合ポリペプチドを産生する方法。 １９．前記ポリペプチドがケモカイン、ケモカイン類似物、抗体、サイトカイン もしくはペプチドである、請求の範囲１８の方法。 ２０．前記ポリペプチドがケモカインである、請求の範囲１９の方法。 ２１．前記ポリペプチドが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ、ＨＩＶ ｇ ｐ１２０もしくはＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域である、請求の範囲１８の方法 。 ２２．前記ケモカインがＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはＳＤＦである、請 求の範囲２０の方法。 ２３．最低１種のＨＩＶコレセプターを結合しかつそれを細胞内区画に向けるポ リペプチドを細胞中で発現することによる前記細胞での前記レセプターの表現型 のノックアウトを含んで成る、前記細胞のＨＩＶ感染の阻害方法。 ２４．前記コレセプターが、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン ３レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターもしくはＣＸＲ４レセプターから 成る群の最低１種である、請求の範囲２３の方法。 ２５．前記細胞中で細胞内残留シグナル配列に融合されたレセプターに結合する ポリペプチドを発現するものとしてさらに特定される、請求の範囲２３の方法。 ２６．前記細胞内残留シグナル配列が、融合ポリペプチドを小胞体、ゴルジ装置 、リソゾーム、細胞内小胞もしくは細胞内オルガネラに向ける、請求の範囲２５ の方法。 ２７．前記細胞内残留シグナル配列がＫＤＥＬ配列である、請求の範囲２６の方 法。 ２８．前記レセプターに結合するポリペプチドが、ＣＣ−ケモカイン、ＣＸＣケ モカイン、ＣＣもしくはＣＸＣケモカインの類似物、一本鎖抗体、ＨＩＶ ｇｐ １２０タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域、またはレセプターに結合す るペプチドである、請求の範囲２５の方法。 ２９．前記細胞が、最低１種の内在性ＣＣレセプターの輸送および表面の発現を 細胞内で封鎖するために小胞体（ＥＲ）残留シグナルに融合されたＣＣ−ケモカ イン遺伝子で形質導入される、請求の範囲２４の方法。 ３０．前記発現がウイルスベクターからである、請求の範囲２５の方法。 ３１．前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求の範囲３０ の方法。 ３２．前記細胞がリンパ球、単球、マクロファージもしくは幹細胞である、請求 の範囲２３の方法。 ３３．前記ＣＣレセプターがＣＣＲ５、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１レセプターの最 低１種を包含する、請求の範囲２９の方法。 ３４．前記細胞が、最低１種の内在性ＣＸＲ４レセプターの輸送および表面の発 現を細胞内で封鎖するために小胞体（ＥＲ）残留シグナルに融 合されたＣＸＣ−ケモカイン遺伝子で形質導入される、請求の範囲２４の方法。 ３５．対象でのＨＩＶ感染の治療のための発現ベクターであって、前記発現ベク ターが、 プロモーター； 細胞内残留シグナル配列をコードする領域；および ケモカインをコードする遺伝子 を含んで成る発現領域、 を包含し； 細胞内残留シグナル配列およびケモカインをコードする遺伝子が前記プロモータ ーから細胞内に残留するケモカインをコードする転写物として発現され； また、前記発現ベクターが、前記対象のリンパ球、単球、マクロファージもしく は幹細胞に投与され、かつ、前記細胞が最低１種のＨＩＶコレセプターの表現型 のノックアウトを表わす発現ベクター。 ３６．前記細胞が前記ベクターでエクスビボで形質導入される、請求の範囲３５ の発現ベクター。 ３７．前記幹細胞が自己幹細胞である、請求の範囲３６の発現ベクター。 ３８．製薬学的に許容できる溶液中に含有される、請求の範囲３５の発現ベクタ ー。 ３９．請求の範囲１のベクターで形質導入されたリンパ球、単球、マクロファー ジもしくは幹細胞を含んで成る製薬学的組成物をＨＩＶ感染の対象に投与するこ とを含んで成る、前記対象での白血球数の増加方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] July 2, 1998 (1998.7.2) [Correction contents]                                The scope of the claims 1. The expression region is   promoter;   A region encoding a residual intracellular signal sequence; and   Gene encoding chemokine Comprising; The gene encoding at least one intracellular residual signal sequence and a chemokine is a cell Expressed as transcripts encoding chemokines remaining in the promoter. Expression vector. 2. 2. The method of claim 1, further comprising a gene encoding a secreted chemokine. Expression vector. 3. Whether the gene encoding the secretory chemokine is an internal ribosome entry site The expression vector according to claim 2, which is expressed from the expression vector. 4. 2. The expression vector of claim 1, further specified as a retroviral vector. Tar. 5. The claim, wherein the intracellular residual signal sequence is an endoplasmic reticulum residual signal sequence. 1 expression vector. 6. The expression vector according to claim 5, wherein the ER residual signal sequence is a KDEL sequence. Doctor. 7. The KDEL sequence has the amino acid sequence SEKDEL, SEQ ID NO: 6. 6. The expression vector of range 6. 8. The chemokine gene is a CC chemokine 5 receptor, a CC chemokine. 3 receptor, CC chemokine 1 receptor and CXR4 receptor Chemokines that bind to at least one receptor of the group The expression vector according to claim 1, which encodes 9. Chemokine wherein the chemokine gene binds to CC chemokine 5 receptor 2. The expression vector according to claim 1, which encodes an in. 10. The CC chemokine gene binds to CC chemokine 3 receptor 2. The expression vector according to claim 1, which encodes a chemokine. 11. The CC chemokine gene binds to CC chemokine 1 receptor 2. The expression vector according to claim 1, which encodes a chemokine. 12. The chemokine wherein the CXC chemokine gene binds to a CXR4 receptor The expression vector according to claim 1, which encodes an expression vector. 13. The secreted chemokine is RANTES, MIP-1α or SDF The expression vector according to claim 2. 14． The secretory chemokine is the same chemokine as the chemokine remaining in the cell. 3. The expression vector according to claim 2, which binds to a receptor. 15. One or more amino acids are present in chemokines and 15. The expression vector according to claim 14, wherein the expression vector is deleted from the N-terminal of the secretory chemokine. Doctor. 16. The intracellular residual signal sequence allows the expressed protein to be expressed in the endoplasmic reticulum, Claim 1 directed to a device, lysosome, intracellular vesicle or other cellular compartment. Expression vector. 17． A method of inhibiting the expression of a chemokine receptor phenotype in a cell, comprising: The method comprises the steps of: binding a polypeptide that binds the receptor and directs it to an intracellular compartment. By expressing in the cell, the chemokine receptor is expressed on the cell surface. A method comprising blocking. 18. Promoter, intracellular residual signal sequence and chemokine receptor Comprising a nucleic acid segment encoding a polypeptide gene that binds to a protein Obtaining; and   Transducing the vector with the cell, 18. The method of claim 17, further specified as comprising the steps of: hand; When the vector is transduced into the cell, transcription of the promoter is regulated. Under the control of the polymorphism binding to the intracellular residual signal sequence and the chemokine receptor A method for producing a fusion polypeptide by expressing a peptide gene. 19. Wherein said polypeptide is a chemokine, chemokine analog, antibody, cytokine 20. The method of claim 18, wherein the method is a peptide. 20. 20. The method of claim 19, wherein said polypeptide is a chemokine. 21. The polypeptide is RANTES, MIP-1α, SDF, HIV g 19. The method of claim 18, which is the V3 region of p120 or HIV gp120. . 22. Wherein the chemokine is RANTES, MIP-1α or SDF; 20. The method of claim 20. 23. A port that binds at least one HIV co-receptor and directs it to the intracellular compartment Phenotype of the receptor in the cell by expressing the repeptide in the cell A method for inhibiting HIV infection of said cells, comprising the knockout of: 24. The coreceptor is a CC chemokine 5 receptor, a CC chemokine; 3 receptor, CC chemokine 1 receptor or CXR4 receptor 24. The method of claim 23, which is at least one member of the group consisting of: 25. Binds to the receptor fused to the intracellular residual signal sequence in the cell 24. The method of claim 23, further specified as expressing a polypeptide. 26. The intracellular residual signal sequence allows the fusion polypeptide to enter the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus 25. A lysosome, intracellular vesicle or intracellular organelle. the method of. 27. The method according to claim 26, wherein the intracellular residual signal sequence is a KDEL sequence. Law. 28. The polypeptide binding to the receptor is CC-chemokine, CXC Mokines, analogs of CC or CXC chemokines, single chain antibodies, HIV gp Binds to the V.120 protein, the V3 region of HIV gp120, or the receptor 26. The method of claim 25, which is a peptide. 29. The cells are capable of transporting at least one endogenous CC receptor and expressing the surface. CC-chemoka fused to endoplasmic reticulum (ER) residual signal for intracellular sequestration 25. The method of claim 24, wherein the method is transduced with an in-gene. 30. 26. The method of claim 25, wherein said expression is from a viral vector. 31. 30. The method of claim 30, wherein said viral vector is a retroviral vector. the method of. 32. Wherein the cells are lymphocytes, monocytes, macrophages or stem cells. The method of range 23. 33. The CC receptor is the most preferred of the CCR5, CCR3 and CCR1 receptors. 30. The method of claim 29, comprising at least one. 34. The cells are capable of transporting at least one endogenous CXR4 receptor and developing the surface. Melts the ER residual signal to block the current inside the cell 25. The method of claim 24, wherein the method is transduced with the combined CXC-chemokine gene. 35. An expression vector for treating HIV infection in a subject, said expression vector comprising: Is   promoter;   A region encoding a residual intracellular signal sequence; and   Gene encoding chemokine An expression region comprising: Including; A gene encoding an intracellular residual signal sequence and a chemokine, Expressed as a transcript encoding a chemokine remaining in the cell from the cell; The expression vector may be a lymphocyte, monocyte, macrophage, or macrophage of the subject. Is administered to a stem cell and said cell is at least one HIV co-receptor phenotype. An expression vector showing knockout of E. coli. 36. 35. The cell of claim 35, wherein said cells are transduced ex vivo with said vector. Expression vector. 37. The expression vector according to claim 36, wherein said stem cell is an autologous stem cell. 38. 36. The expression vector of claim 35 contained in a pharmaceutically acceptable solution. - 39. Lymphocytes, monocytes, macrophages transduced with the vector of claim 1 Administering a pharmaceutical composition comprising di- or stem cells to a subject infected with HIV. A method of increasing white blood cell count in said subject, comprising:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バイ，シユエフアン 中華人民共和国シアン・シンギン10・アパ ートメント504 (72)発明者 チエン，ジ−ダイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27103 ウインストン―サレム・クエンストリー トイー２ 1902────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, F I, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD , SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Bai, Shiyu Juan             People's Republic of China Sian Singing 10 Apa             Statement 504 (72) Inventor Chain, J-Die             United States North Carolina 27103               Winston-Salem Quintree             Toy 2 1902

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．発現領域が、 プロモーター； 細胞内残留シグナル配列をコードする領域；および ケモカインをコードする遺伝子 を含んで成り； 前記細胞内残留シグナル配列および前記ケモカインをコードする遺伝子が単一の イントラカイン転写物として前記プロモーターから発現される、発現ベクター。 ２．分泌性ケモカインをコードする遺伝子をさらに含んで成る、請求の範囲１の 発現ベクター。 ３．前記分泌性ケモカインをコードする前記遺伝子が内部リボソーム進入部位か ら発現される、請求の範囲２の発現ベクター。 ４．レトロウイルスベクターとしてさらに特定される、請求の範囲１の発現ベク ター。 ５．前記細胞内残留シグナル配列が小胞体残留シグナル配列である、請求の範囲 １の発現ベクター。 ６．前記小胞体残留シグナル配列がＫＤＥＬ配列である、請求の範囲５の発現ベ クター。 ７．前記ＫＤＥＬ配列がアミノ酸配列ＳＥＫＤＥＬ、配列番号６を有する、請求 の範囲６の発現ベクター。 ８．前記ケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプター、Ｃ−Ｃケモカイ ン３レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターもしくはＣＸＲ４レセプターに 結合するケモカインをコードする、請求の範囲１の発 現ベクター。 ９．前記ケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプターに結合するケモカ インをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １０．前記ＣＣケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン３レセプターに結合する ケモカインをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １１．前記ＣＣケモカイン遺伝子が、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターに結合する ケモカインをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １２．前記ＣＸＣケモカイン遺伝子が、ＣＸＲ４レセプターに結合するケモカイ ンをコードする、請求の範囲１の発現ベクター。 １３．コードされるケモカインが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはＳＤＦ である、請求の範囲２の発現ベクター。 １４．前記分泌性ケモカインがケモカインレセプターに結合する、請求の範囲２ の発現ベクター。 １５．１個もしくはそれ以上のアミノ酸が、コードされるケモカインのＮ末端か ら欠失される、請求の範囲１４の発現ベクター。 １６．前記細胞内残留シグナル配列が、発現されたタンパク質を小胞体、ゴルジ 装置、リソゾーム、細胞内小胞もしくは他の細胞区画に向ける、請求の範囲１の 発現ベクター。 １７．細胞中のケモカインレセプターの表現型の発現の阻害方法であって、当該 方法が前記ケモカインレセプターの細胞表面の発現を封鎖することを含んで成る 方法。 １８．プロモーター、細胞内残留シグナル配列およびケモカインレセプターに結 合するポリペプチド遺伝子をコードする核酸区分を含んで成るベクターを得るこ と；ならびに 前記ベクターを前記細胞に形質導入すること、 の段階を含んで成るものとしてさらに特定される、請求の範囲１７の方法であっ て； 前記ベクターが、前記細胞に形質導入される場合に、前記プロモーターの転写制 御下に前記細胞内残留シグナル配列およびケモカインレセプターに結合するポリ ペプチド遺伝子を発現して融合ポリペプチドを産生する方法。 １９．前記ポリペプチドがケモカイン、ケモカイン類似物、抗体もしくはペプチ ドである、請求の範囲１８の方法。 ２０．前記ポリペプチドがケモカインである、請求の範囲１９の方法。 ２１．前記ポリペプチドが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ、ＨＩＶ ｇ ｐ１２０もしくはＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域である、請求の範囲１８の方法 。 ２２．前記ケモカインがＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはＳＤＦである、請 求の範囲２０の方法。 ２３．細胞でのＨＩＶコレセプターの表現型のノックアウトを含んで成る、前記 細胞のＨＩＶ感染の阻害方法。 ２４．前記コレセプターが、Ｃ−Ｃケモカイン５レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン ３レセプター、Ｃ−Ｃケモカイン１レセプターもしくはＣＸＲ４レセプターであ る、請求の範囲２３の方法。 ２５．前記細胞中で細胞内残留シグナル配列に融合されたレセプターに結合する ポリペプチドを発現するものとしてさらに特定される、請求の範囲２４の方法。 ２６．前記細胞内残留シグナル配列が、融合ポリペプチドを小胞体、ゴ ルジ装置、リソゾーム、細胞内小胞もしくは細胞内オルガネラに向ける、請求の 範囲２５の方法。 ２７．前記細胞内残留シグナル配列がＫＤＥＬ配列である、請求の範囲２６の方 法。 ２８．前記レセプターに結合するポリペプチドが、ＣＣ−ケモカイン、ＣＸＣケ モカイン、ＣＣもしくはＣＸＣケモカインの類似物、一本鎖抗体、ＨＩＶ ｇｐ １２０タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３領域、またはレセプターに結合す るペプチドである、請求の範囲２５の方法。 ２９．前記細胞が、内在性ＣＣレセプターの輸送および表面の発現を細胞内で封 鎖するために小胞体（ＥＲ）残留シグナルに融合されたＣＣ−ケモカイン遺伝子 で形質導入される、請求の範囲２４の方法。 ３０．前記発現がウイルスベクターからである、請求の範囲２５の方法。 ３１．前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求の範囲３０ の方法。 ３２．前記細胞がリンパ球、単球、マクロファージもしくは幹細胞である、請求 の範囲２３の方法。 ３３．前記ＣＣレセプターがＣＣＲ５、ＣＣＲ３もしくはＣＣＲ１レセプターで ある、請求の範囲２９の方法。 ３４．前記細胞が、内在性ＣＸＲ４レセプターの輸送および表面の発現を細胞内 で封鎖するために小胞体（ＥＲ）残留シグナルに融合されたＣＸＣ−ケモカイン 遺伝子で形質導入される、請求の範囲２４の方法。 ３５．対象でのＨＩＶ感染の治療のための発現ベクターであって、前記発現ベク ターが、 プロモーター； 細胞内残留シグナル配列をコードする領域；および ケモカインをコードする遺伝子 を含んで成る発現領域、 を包含し； 前記細胞内残留シグナル配列および前記ケモカインをコードする遺伝子が前記プ ロモーターから単一のイントラカイン転写物として発現され；また、前記発現ベ クターが、前記対象のリンパ球、単球、マクロファージもしくは幹細胞に投与さ れ、かつ、前記細胞がＨＩＶコレセプターの表現型のノックアウトを表わす発現 ベクター。 ３６．前記細胞が前記ベクターでエクスビボで形質導入される、請求の範囲３５ の発現ベクター。 ３７．前記幹細胞が自己幹細胞である、請求の範囲３６の発現ベクター。 ３８．製薬学的に許容できる溶液中に含有される、請求の範囲３５の発現ベクタ ー。 ３９．請求の範囲１のベクターで形質導入されたリンパ球、単球、マクロファー ジもしくは幹細胞を含む製薬学的組成物をＨＩＶ感染の対象に投与することを含 んで成る、前記対象での白血球数の増加方法。[Claims] 1. The expression region is   promoter;   A region encoding a residual intracellular signal sequence; and   Gene encoding chemokine Comprising; The gene encoding the intracellular residual signal sequence and the chemokine is a single An expression vector that is expressed from the promoter as an intrakine transcript. 2. 2. The method of claim 1, further comprising a gene encoding a secreted chemokine. Expression vector. 3. Whether the gene encoding the secretory chemokine is an internal ribosome entry site The expression vector according to claim 2, which is expressed from the expression vector. 4. 2. The expression vector of claim 1, further specified as a retroviral vector. Tar. 5. The claim, wherein the intracellular residual signal sequence is an endoplasmic reticulum residual signal sequence. 1 expression vector. 6. The expression vector according to claim 5, wherein the ER residual signal sequence is a KDEL sequence. Doctor. 7. The KDEL sequence has the amino acid sequence SEKDEL, SEQ ID NO: 6. 6. The expression vector of range 6. 8. The chemokine gene is a CC chemokine 5 receptor, a CC chemokine. 3 receptor, CC chemokine 1 receptor or CXR4 receptor The invention of claim 1 which encodes a binding chemokine. Current vector. 9. Chemokine wherein the chemokine gene binds to CC chemokine 5 receptor 2. The expression vector according to claim 1, which encodes an in. 10. The CC chemokine gene binds to CC chemokine 3 receptor 2. The expression vector according to claim 1, which encodes a chemokine. 11. The CC chemokine gene binds to CC chemokine 1 receptor 2. The expression vector according to claim 1, which encodes a chemokine. 12. The chemokine wherein the CXC chemokine gene binds to a CXR4 receptor The expression vector according to claim 1, which encodes an expression vector. 13. The chemokines encoded are RANTES, MIP-1α or SDF The expression vector according to claim 2, which is: 14． 3. The method of claim 2, wherein said secreted chemokine binds to a chemokine receptor. Expression vector. 15. If the one or more amino acids is at the N-terminus of the encoded chemokine 15. The expression vector according to claim 14, wherein the expression vector is deleted from the expression vector. 16. The intracellular residual signal sequence allows the expressed protein to be expressed in the endoplasmic reticulum, Claim 1 directed to a device, lysosome, intracellular vesicle or other cellular compartment. Expression vector. 17． A method of inhibiting the expression of a chemokine receptor phenotype in a cell, comprising: The method comprises sequestering cell surface expression of said chemokine receptor. Method. 18. Connects to promoter, intracellular residual signal sequence and chemokine receptor Obtaining a vector comprising a nucleic acid segment encoding a matching polypeptide gene. And; and   Transducing the vector with the cell, 18. The method of claim 17, further specified as comprising the steps of: hand; When the vector is transduced into the cell, transcription of the promoter is regulated. Under the control of the polymorphism binding to the intracellular residual signal sequence and the chemokine receptor A method for producing a fusion polypeptide by expressing a peptide gene. 19. The polypeptide is a chemokine, chemokine analog, antibody or pepti 19. The method of claim 18, wherein the method is 20. 20. The method of claim 19, wherein said polypeptide is a chemokine. 21. The polypeptide is RANTES, MIP-1α, SDF, HIV g 19. The method of claim 18, which is the V3 region of p120 or HIV gp120. . 22. Wherein the chemokine is RANTES, MIP-1α or SDF; 20. The method of claim 20. 23. Comprising knocking out the phenotype of the HIV co-receptor in the cell, A method for inhibiting HIV infection of cells. 24. The coreceptor is a CC chemokine 5 receptor, a CC chemokine; 3 receptor, CC chemokine 1 receptor or CXR4 receptor 24. The method of claim 23. 25. Binds to the receptor fused to the intracellular residual signal sequence in the cell 25. The method of claim 24, further specified as expressing a polypeptide. 26. The intracellular residual signal sequence converts the fusion polypeptide to the endoplasmic reticulum, Directed to a lugi device, lysosome, intracellular vesicle or intracellular organelle The method of range 25. 27. The method according to claim 26, wherein the intracellular residual signal sequence is a KDEL sequence. Law. 28. The polypeptide binding to the receptor is CC-chemokine, CXC Mokines, analogs of CC or CXC chemokines, single chain antibodies, HIV gp Binds to the V.120 protein, the V3 region of HIV gp120, or the receptor 26. The method of claim 25, which is a peptide. 29. The cells block intracellular trafficking and surface expression of endogenous CC receptors. CC-chemokine gene fused to endoplasmic reticulum (ER) residue signal for chaining 25. The method of claim 24, wherein the method is transduced with: 30. 26. The method of claim 25, wherein said expression is from a viral vector. 31. 30. The method of claim 30, wherein said viral vector is a retroviral vector. the method of. 32. Wherein the cells are lymphocytes, monocytes, macrophages or stem cells. The method of range 23. 33. The CC receptor is a CCR5, CCR3 or CCR1 receptor 30. The method of claim 29. 34. The cells are capable of translocating the endogenous CXR4 receptor and expressing its surface intracellularly. CXC-chemokine fused to endoplasmic reticulum (ER) residual signal to block with 25. The method of claim 24, wherein the method is transduced with a gene. 35. An expression vector for treating HIV infection in a subject, said expression vector comprising: Is   promoter;   A region encoding a residual intracellular signal sequence; and   Gene encoding chemokine An expression region comprising: Including; The intracellular residual signal sequence and the gene encoding the chemokine are Expressed as a single intrakine transcript from the promoter; Is administered to the subject's lymphocytes, monocytes, macrophages or stem cells. And the cells exhibit expression of a phenotype knockout of the HIV co-receptor. vector. 36. 35. The cell of claim 35, wherein said cells are transduced ex vivo with said vector. Expression vector. 37. The expression vector according to claim 36, wherein said stem cell is an autologous stem cell. 38. 36. The expression vector of claim 35 contained in a pharmaceutically acceptable solution. - 39. Lymphocytes, monocytes, macrophages transduced with the vector of claim 1 Administering a pharmaceutical composition comprising di- or stem cells to a subject infected with HIV. A method of increasing white blood cell count in said subject.