JP2001504689A - Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist - Google Patents

Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist

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Abstract

(57)【要約】 新規の多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質、多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質をコードするＤＮＡ、多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質の製造方法、および多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質の使用方法が開示される。   (57) [Summary] Novel multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein, DNA encoding multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein, method for producing multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein, and multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein A method of use is disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】 多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト 本特許願は、１９９６年１０月２５日提出の合衆国暫定特許願連続第６０／０ ２９，６２９号明細書のタイトル３５、合衆国コード§１１９の下で優先枢を主 張するものである。 発明の技術分野 本発明は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストに関する。これら多機能 性キメラ造血レセプターアゴニストは、キメラ分子の各個成分の一つ以上の活性 を保有し、また改善された造血細胞刺激活性および（または）改善された活性プ ロフイルを示すこともあり、そして後者は個々の造血成長因子と関連した望まし くない、生物活性の減少を包含し、かつ（または）物理的性質の向上（溶解性、 安定性および能率の増大を含む）を示すこともある。 発明の背景 骨髄細胞の分化および（または）増殖を刺激するコロニー刺激因子（ＣＳＦ） は、それらが造血幹細胞誘導細胞のレベル降下を回復させる治療の可能性を有す るという理由から大いに関心を集めた。ヒトおよびネズミ両系におけるＣＳＦは 、それらの活性に従って同定され、識別された。例えば、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ− ＣＳＦ）およびマクロフアージーＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）は、それぞれ好中性の顆 粒球とマクロフアージのコロニーの容器内形成を促進するのに対し、ＧＭ−ＣＳ Ｆおよびインターロイキン−３（ＩＬ−３）は、より広い活性をもち、マクロフ アージ、好中性および好酸性両方の顆粒球コロニーの形成を促進する。ＩＬ−３ はまたマスト、巨核球ならびに純粋および混合赤芽球コロニーの形成を促進する 。 Ｕ．Ｓ．４，８７７，７２９およびＵ．Ｓ．４，９５９，４５５は、テナガザ ルＩＬ−３ｃＤＮＡおよび推論上のヒトＩＬ−３ＤＮＡ配列ならびにそれらが暗 号を指定しているタンパク質のアミノ酸配列を開示している。そこに開示された ｈＩＬ−３はタンパク質のアミノ酸配列における８位にプロリンでなくセリンを もつ。 国際特許願（ＰＣＴ）ＷＯ８８／００５９８は、テナガザルおよびヒト様のＩ Ｌ−３を開示している。ｈＩＬ−３は、ｓｅｒ8−＞ｐｒｏ8置換を含む。ｃｙｓ をＳｅｒにより置換することによってジスルフィド橋をこわし、そしてグリコシ ル化部位の一つ以上のアミノ酸を置換することが示唆されている。 Ｕ．Ｓ．４，８１０，６４：３は、ヒトＧ−ＣＳＦをコード化するＤＮＡ配列 を開示している。 ＷＯ９１／０２７５４は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３とがらなる融合タンパク質 を開示している。このタンパク質はＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３単独と比べて増 大した生物活性をもつ。多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの成分として 、非グリコシル化ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ類縁タンパク質を開示している。 ＷＯ９２／０４４５５は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ− １１ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦからなる群から選ばれるリンホカインに融合したＩ Ｌ−３から構成された融合タンパク質を開示している。 ＷＯ９５／２１１９７およびＷＯ９５／２１２５４は、広い多機能性造血特性 をもつ有能な融合タンパク質を開示している。 ＧＢ２，２８５，４４６は、ｃ−ｍｐｌリガンド（トロンボポイエチン）およ び種々な形のトロンボポイエチンに関するものであり、これらは、巨核球および 巨核球前駆体の複製、分化および成熟に影響することが示され、血小板減少症の 治療に使用できるかも知れない。 ＥＰ６７５，２０１Ａは、ｃ−ｍｐｌリガンド（巨核球成長および発達因子） （ＭＧＤＦ）、ｃ−ｍｐｌリガンドの対立遺伝子変異体、およびポリエチレング コールといった水溶性重合体に付着させたｃ−ｍｐｌリガンドに関する。 ＷＯ９５／２１９２０は、ネズミおよびヒトのｃ−ｍｐｌリガンドおよびその ポリペプチド断片を提供している。このタンパク質は、生体内および生体外治療 において血小板産生の促進に有用である。 Ｌｉｎ、Ｆ−Ｋ．による米国特許第４，７０３，００８号明細書は、エリトロ ポイエチンをコード化するｃＤＮＡ配列、エリトロポイエチンの調製法と使用を 開示している。 ＷＯ９１／０５８６７は、ＥＰＯ（Ａｓｎ69)、ＥＰＯ（Ａｓｎ125， Ｓｅｒ127）、ＥＰＯ（Ｔｈｒ125）、およびＥＰＯ（Ｐｒｏ124，Ｔｈｒ125）と いったヒトエリトロポイエチンより多数の炭水化物付着部位をもつヒトエリトロ ポイエチン類縁体を開示している。 ＷＯ９４／２４１６０は、高い活性、特定的には２０、４９、７３、１４０、 １４３、１４６、１４７および１５４位のアミノ酸置換を有するエリトロポイエ チンムレインを開示している。 ＷＯ９４／２８３９１は、天然ｆｌｔ３リガンドタンパク質配列およびｆｌｔ ３リガンドをコード化するｃＤＮＡ配列、ｃＤＮＡを移入した宿主細胞にｆｌｔ ３リガンドを発現させる方法ならびに造血障害をもつ患者をｆｌｔ３リガンドに より治療する方法を開示している。 米国特許第５，５５４，５１２号明細書は、単離タンパク質としてのヒトｆｌ ｔ３リガンド、ｆｌｔ３リガンドをコード化するＤＮＡ、ｆｌｔ３リガンドをコ ード化するｃＤＮＡを移入した宿主細胞、およびｆｌｔ３リガンドで患者を治療 する方法を指向している。 ＷＯ９４／２６８９１は、２９個のアミノ酸を挿入した単離体およびその断片 を含めて、哺乳動物のｆｌｔ３リガンドを提供する。タンパク質アミノ酸配列の再配列 進化におけるＤＮＡ配列の再配列は、タンパク質の構造と機能の多様性をつく り出す上で重要な役割を演じている。遺伝子複製とエキソンの再編成は、とりわ け基本的突然変異の割合は低いので、迅速に多様性をつくり出し、それによって 生物に競合的優位性を与える重要な機構を提供する（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：１９１−２００，１９９２）。 組換えＤＮＡ法の出現は、タンパク質の折りたたみ、構造および機能に及ぼす 配列転位の効果の研究を可能にした。新配列をつくり出す際に用いられる方法は 、タンパク質のアミノ酸配列の線状再編成により関係づけられる、天然のタンパ ク質対のそれと類似する(Cunningham，等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．76: 3218-3222，1979；Teather&Erfle，J．Bacteriol．172：3837-3841，1990;Schim ming等，Eur．J．Biochem．204：13-19，1992；Yamiuchi and Minamikawa，FEBS Lett．260:127-130,1991；MacGregor等，FEBS Lett．378: 263-266)。タンパク質に対するこの型の再配列の最初の容器内適用がＧｏｌｄｅ ｎｂｅｒｇとＣｒｅｉｇｈｔｏｎにより記述された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１ ６５：４０７−４１３，１９８３）。新しいＮ−末端は元の配列の内部部位（切 断点）のところで選び、新しい配列は、最初のＣ末端のところか、その付近にあ るアミノ酸に達するまで、切断点から最初の順序と同じアミノ酸順序をもつ。こ の時点で、新しい配列は、直接的に、あるいは追加の配列部分（リンカー）を経 て、最初のＮ−末端のところの、あるいはその付近のアミノ酸に結合され、そし てこの新しい配列は、それがもとの配列の切断点部位に対してＮ−末端となるア ミノ酸のところまたはその付近の点に達するまで、もとの順序と同じ順序で続き 、そしてこの残基が鎖の新しいＣ−末端を形成する。 この方法は大きさが５８から４６２アミノ酸に及ぶタンパク質に適用された(G oldenberg&Creighton，J．Mol．Biol．165:407-413，1983；Li&Coffino,Mol．Ce ll．Biol．13:2377-2383，1993)。試みたタンパク質は、主としてａ−らせん（ インターロイキン−４；Ｋｒｅｉｔｍａｎ等，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７：３１１− ３１８，１９９５），ｂ−シート（インターロイキン−１；Ｈｏｒｌｉｃｋ等， Ｐｒｏｔｅｌｎ Ｅｎｇ．５：４２７−４３１，１９９２），あるいは両者の混 合（酵母 ホスホリボシル アントラニレート イソメラーゼ；Ｌｕｇｅｒ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２０６−２１０，１９８９）を有するタンパク質を含 めて、広範囲の構造分類を代表した。タンパク質機能の広いカテゴリーはこれら 配列再編成の研究で表わされる： 酵素 Ｔ４ リゾチーム Zhang等，Bichemistry 32:12311-12318,1993;Z hang等，Nature Struct．Biol.1:434-438(1995 ) ジヒドロ葉酸レダクターゼ Buchwalder等，Biochemistry 31:1621-1630,19 94;Protasova等，Prot．Eng．7:1373-1377，19 95) リボヌクレアーゼ Ｔ１ Mullins等，J．Am．Chem．Soc．116:5529-5533 ，1994;Garrett等，Protein Science 5:204-211，1996) バチルス グルカンス Hahn等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.91:10 417-10421，1994)アスパルテートトランスカルバモイラーゼ Yang & Schachman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A ．90:11980-11984，1993)ホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ Luger 等，Science 243:206-210(1989;Luger 等，Prot．Eng．3:249-258，1990) ペプシン／ペプシノーゲン Lin等,Protein Science 4:159-166，1995)グリセルアルデヒド -3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ Vignais等，Protein Science 4:994-1 000，1995)オルニチンデカルボキシラーゼ Li & Coffino，Mol．Cell．Biol．13:2377-238 3，1993) 酵母 ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ Ritco-Vonsovici 等，Biochemistry3 4:16543-16551，1995) 酵素阻害剤 塩基性膵臓 トリプシン阻害剤 Goldenberg & Creighton，J．Mol．Biol.165:4 07-413，1983) サイトカイン インターロイキン−１ｂ Horlick等，Protein Eng．5:427-431，1992) インターロイキン−４ Kreitman等，Cytokine 7:311-318，1995) チロシン キナーゼ 認識 ドメイン ａ−スペクトリン ＳＨ３ ドメイン Viguera，等，J．Mol．Biol．247:670 -681，1995) トランスメンブラン タンパク質 キメラ タンパク質 インターロイキン−４−Kreitman等，Proc．Natl．Acad. シュードモナス Sci．U.S.A．91:6889-6893，1994)。 エキソトキシン これら研究の結果は、非常に変動した。多くの場合、より低い活性、溶解性、 または熱力学的安定性が観察された（Ｅ．ｃｏｌｉ ジヒドロ葉酸レダクターゼ 、アスパルテート トランスカルバモイラーゼ、 ホスホリボシル アントラニ レート イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナ ーゼ、オルニチン デカルボキシラーゼ、ｏｍｐ Ａ、酵母ホスホグリセレート デヒドロゲナーゼ）。他の場合では、配列転換したタンパク質は、その自然の対 照物と殆ど同一の多くの性質を有するようであった（塩基性膵臓トリプシン阻害 剤、Ｔ４リゾチーム、リボヌクレアーゼＴ１、バチルスｂ−グルカナーゼ、イン ターロイキン−１ｂ、ａ−スペクトリンＳＨ３ドメイン、ペプシノーゲン、イン ターロイキン−４）。例外的な場合では、天然配列の幾つかの性質に勝る予想外 の向上が見られた。例えば、再配列したａ−スペクトリンＳＨ３ドメイン配列に 対する溶解性およびリフォールジング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）割合、および転移 インターロイキン−４−シュードモナス エキソトキシン融合分子のレセプター 親和性および抗腫瘍活性が観察された(Kreitman等，Proc．Natl．Acad．Sci.U.S .A．91:6889-6893，1994；Kreitman等，Cancer Res．55:3357-3363，1995)。 これらの型の研究に対する主要な動機づけは、タンパク質の折たたみと安定性 における狭域および広域相互作用の役割を研究することであった。この型の配列 再編成は、もとの配列においては広域の相互作用の部分集合を、新配列における 狭域相互作用に変換し、またその逆も成り立つ。これら配列再編成の多くが、少 なくとも若干の活性をもつコンホメーションに到達しうるという事実は、タンパ ク質の折たたみが多重折たたみ経路により起こるという説得力のある証拠である （Ｖｉｇｕｅｒａ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｌｏｌ．２４７：６７０−６８１，１９９ ５）。ａ−スペクトリンのＳＨ３ドメインの場合では、ヘアピン状の折り返しに 相当する位置での新末端の選択が、安定性は幾分低いが、それでも折りたたむこ とのできるタンパク質を生じた。 ここで引用した研究に用いられた内部切断点の位置は、もっぱらタンパク質の 表面上に見出され、両端あるいは中点に向かって明瞭な偏りがなく、線形配列中 に隈なく分布する（もとのＮ−末端から切断点までの相対距離における変動は、 全配列長さの約１０から８０％である）。これら研究において、最初のＮ−末端 とＣ−末端とをつなぐリンカーは０から９残基にわたった。一つの場合において は（Ｙａｎｇ＆Ｓｃｈａｃｈｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１９８０−１１９８４，１９９３）、配列の一部分をもと のＣ−末端セグメントから欠失させ、この端を切り取ったＣ−末端からもとのＮ −末端への連結を行なった。柔軟な親水性残基、例えばＧｌｙおよびＳｅｒ、が しばしばリンカーに使われる。Ｖｉｇｕｅｒａ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４ ７：６７０−６８１，１９９５）は、もとのＮ−およびＣ−末端を３または４残 基リンカーとつなぐことを比較した。３残基リンカーの方が熱力学的に不安定で あった。Ｐｒｏｔａｓｏｖａ等（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：１３７３−１３ ７７，１９９４）は、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼのもとのＮ−末端 をつなぐ際に３または５残基リンカーを使用したところ、３残基リンカーのみ好 収量でタンパク質を生成した。発明の要約 造血タンパク質は、式： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1を有するアミノ 酸配列からなり、 上記式中のＲ1とＲ2は、それぞれ独立に （Ｉ）式：［ここで、Ｎ−末端から任意に１−６個のアミノ酸を、またＣ−末端から１−５ 個のアミノ酸を、前記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失させる ことができ； また、Ｎ−末端をＣ−末端へ直接つなぐか、あるいはＮ−末端をＣ−末端へつ なぐことのできる、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミノ酸：のところにもつことのできるリンカー（Ｌ2）を介してＮ−末端をＣ−末端につ なぐ］ を有する修飾ＥＰＯアミノ酸配列からなる、ヒトＥＰＯレセプターアゴニストポ リペプチド； （II）式［ここで、前記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチドのＣ−末端から任 意に１−２３個のアミノ酸を欠失させることができ；またＮ−末端をＣ−末端へ 直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端をＣ−末端へつなぐことが でき、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミノ酸：のところにもつことができる）を介してつなぐ］ を有する修飾幹細胞因子アミノ酸配列からなる、ヒト幹細胞因子レセプターアゴ ニストポリペプチド； （III）式：［ここで、下記ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチドのＣ−末端から１ −７個のアミノ酸を任意に欠失させ；またＮ−末端はＣ−末端へ直接つなぐか、 あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端をＣ−末端へつなぐことができ、そして新 しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミノ酸： のところにもつことができる）を介してつなぐ］ を有する修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列からなる、ヒトｆｌｔ−３レセプ ターアゴニストポリペプチド； （IV）式：［式中、１位のXaaはThr,Ser,Arg,TyrまたはGly； ２位のXaaはProまたはLeu； ３位のXaaはLeu,Arg,TyrまたはSer； 13位のXaaはPhe,Ser,His,ThrまたはPro； 16位のXaaはLys,Pro,Ser,ThrまたはHis； 17位のXaaはCys,Ser,Gly,Ala,Ile,TyrまたはArg; 18位のXaaはLeu,Thr,Pro,His,IleまたはCys； 22位のXaaはArg,Tyr,Ser,ThrまたはAla； 24位のXaaはIle,Pro,TyrまたはLeu； 27位のXaaはAsp,またはGly； 30位のXaaはAla,Ile,LeuまたはGly； 34位のXaaはLysまたはSer； 36位のXaaはCysまたはSer； 42位のXaaはCysまたはSer； 43位のXaaはHis,Thr,Gly,Val,Lys,Trp,Ala,Arg,Cys,またはLeu； 44位のXaaはPro,Gly,Arg,Asp,Val,Ala,His,Trp,Gln,またはThr； 46位のXaaはGlu,Arg,Phe,Arg,IleまたはAla； 47位のXaaはLeuまたはThr； 49位のXaaはLeu,Phe,ArgまたはSer； 50位のXaaはLeu,Ile,His,ProまたはTyr； 54位のXaaはLeuまたはHis； 64位のXaaはCysまたはSer； 67位のXaaはGln,Lys,LeuまたはCys； 70位のXaaはGln,Pro,Leu,ArgまたはSer； 74位のXaaはCysまたはSer； 104位のXaaはAsp,GlyまたはVal； 108位のXaaはLeu,Ala,Val,Arg,Trp,GlnまたはGly； 115位のXaaはThr,His,LeuまたはAla； 120位のXaaはGln,Gly,Arg,LysまたはHis； 123位のXaaはGlu,Arg,PheまたはThr； 144位のXaaはPhe,His,Arg,Pro,Leu,GlnまたはGlu； 146位のXaaはArgまたはGln； 147位のXaaはArgまたはGln； 156位のXaaはHis,GlyまたはSer； 159位のXaaはSer,Arg,Thr,Tyr,ValまたはGly； 162位のXaaはGlu,Leu,GlyまたはTrp； 163位のXaaはVal,Gly,ArgまたはAla； 169位のXaaはArg,Ser,Leu,ArgまたはCys； 170位のXaaはHis,ArgまたはSer； そして、修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から、Ｎ−末端から任意に１−１１個 のアミノ酸を、またＣ−末端から１−５個のアミノ酸を任意に欠失させることが でき、また Ｎ−末端はＣ−末端へ直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端をＣ −末端へつなぐことができ、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミ ノ酸： のところにもつことができる）を介してつなぐ］ を有する修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列からなる、ポリペプチド； （Ｖ）式： ［式中、17位のXaaはSer,Lys,Gly,Asp,Met,Gln,またはArg； 18位のXaaはAsn,His,Leu,Ile,Phe,Arg,またはGln； 19位のXaaはMet,Phe,Ile,Arg,Gly,Ala,またはCys； 20位のXaaはIle,Cys,Gln,Glu,Arg,Pro,またはAla； 21位のXaaはAsp,Phe,Lys,Arg,Ala,Gly,Glu,Gln,,Asn,Thr,SerまたはVal； 22位のXaaはGlu,Trp,Pro,Ser,Ala,His,Asp,Asn,Gln,Leu,ValまたはGly； 23位のXaaはIle,Val,Ala,Gly,Trp,Lys,Phe,Leu,Ser,またはArg； 24位のXaaはIle,Gly,Val,Arg,Ser,Phe,またはLeu； 25位のXaaはThr,His,Gly,Gln,Arg,Pro,またはAla； 26位のXaaはHis,Thr,Phe,Gly,Arg,Ala,またTrp； 27位のXaaはLeu,Gly,Arg,Thr,Ser,またはAla； 28位のXaaはLys,Arg,Leu,Gln,Gly,Pro,ValまたはTrp； 29位のXaaはGln,Asn,Leu,Pro,Arg,またはVal； 30位のXaaはPro,His,Thr,Gly,Asp,Gln,Ser,Leu,またはLys； 31位のXaaはPro,Asp,Gly,Als,Arg,Leu,またはGln； 32位のXaaはLeu,Val,Arg,Gln,Asn,Gly,Als,またはGlu； 33位のXaaはPro,Leu,Gln,Ala,Thr,またはGlu； 34位のXaaはLeu,Val,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,Thr,Arg,Ala,Phe,IleまたはMet； 35位のXaaはLeu,Ala,Gly,Asn,Pro,Gln,またはVal； 36位のXaaはAsp,Leu,またはVal； 37位のXaaはPhe,Ser,Pro,Trp,またはIle； 38位のXaaはAsn,またはAla； 40位のXaaはLeu,Trp,またはArg； 41位のXaaはAsn,Cys,Arg,His,Met,またはPro； 42位のXaaはGly,Asp,Ser,Cys,Asn,Lys,Thr,Leu,Val,Glu,Phe,Tyr,Ile,Metまたは Ala； 43位のXaaはGlu,Asn,Tyr,Leu,Phe,Asp,Ala,Cys,Gln,Arg,Thr,GlyまたはSer； 44位のXaaはAsp,Ser,Leu,Arg,Lys,Thr,Met,Trp,Glu,Asn,Gln,AlaまたはPro； 45位のXaaはGln,Pro,Phe,Val,Met,Leu,Thr,Lys,Trp,Asp,Asn,Arg,Ser,Ala,Ile,G luまたはHis； 46位のXaaはAsp,Phe,Ser,Thr,Cys,Glu,Asn,Gln,Lys,His,Ala,Tyr,Ile,Valまたは Gly； 47位のXaaはIle,Gly,Val,Ser,Arg,Pro,またはHis； 48位のXaaはLeu,Ser,Cys,Arg,Ile,His,Phe,Glu,Lys,Thr,Ala,Met,ValまたはAsn ； 49位のXaaはMet,Arg,Ala,Gly,Pro,Asn,His,またはAsp； 50位のXaaはGlu,Leu,Thr,Asp,Tyr,Lys,Asn,Ser,Ala,Ile,Val,His,Phe,Metまたは Gln； 51位のXaaはAsn,Arg,Met,Pro,Ser,Thr,またはHis； 52位のXaaはAsn,His,Arg,Leu,Gly,Ser,またはThr； 53位のXaaはLeu,Thr,Ala,Gly,Glu,Pro,Lys,Ser,またはMet； 54位のXaaはArg,Asp,Ile,Ser,Val,Thr,Gln,Asn,Lys,His,AlaまたはLeu； 55位のXaaはArg,Thr,Val,Ser,Leu,またはGly； 56位のXaaはPro,Gly,Cys,Ser,Gln,Glu,Arg,His、Thr,Ala,Tyr,Phe,Leu,Valまた はLys； 57位のXaaはAsnまたはGly； 58位のXaaはLeu,Ser,Asp,Arg,Gln,Val,またはCys； 59位のXaaはGlu Tyr,His,Leu,Pro,またはArg； 60位のXaaはAla,Ser,Pro,Tyr,Asn,またはThr； 61位のXaaはPhe,Asn,Glu,Pro,Lys,Arg,またはSer； 62位のXaaはAsn,His,Val,Arg,Pro,Thr,Asp,またはIle； 63位のXaaはArg,Tyr,Trp,Lys,Ser,His,Pro,またはVal； 64位のXaaはAla,Asn,Pro,Ser,またはLys； 65位のXaaはVal,Thr,Pro,His,Leu,Phe,またはSer； 66位のXaaはLys,Ile,Arg,Val,Asn,Glu,またはSer； 67位のXaaはSer,Ala,Phe,Val,Gly,Asn,Ile,Pro,またはHis； 68位のXaaはLeu,Val,Trp,Ser,Ile,Phe,Thr,またはHis； 69位のXaaはGln,Ala,Pro,Thr,Glu,Arg,Trp,Gly,またはLeu； 70位のXaaはAsn,Leu,Val,Trp,Pro,またはAla； 71位のXaaはAla,Met,Leu,Pro,Arg,Glu,Thr,Gln,Trp,またはAsn； 72位のXaaはSer,Glu,Met,Ala,His,Asn,Arg,またはAsp； 73位のXaaはAla,Glu,Asp,Leu,Ser,Gly,Thr,またはArg； 74位のXaaはIle,Met,Thr,Pro,Arg,Gly,Ala； 75位のXaaはGlu,Lys,Gly,Asp,Pro,Trp,Arg,Ser,Gln,またはLeu； 76位のXaaはSer,Val,Ala,Asn,Trp,Glu,Pro,Gly,またはAsp； 77位のXaaはIle,Ser,Arg,Thr,またはLeu； 78位のXaaはLeu,Ala,Ser,Glu,Phe,Gly,またはArg； 79位のXaaはLys,Thr,Asn,Met,Arg,Ile,Gly,またはAsp； 80位のXaaはAsn,Trp,Val,Gly,Thr,Leu,Glu,またはArg； 81位のXaaはLeu,Gln,Gly,Ala,Trp,Arg,Val,またはLys； 82位のXaaはLeu,Gln,Lys,Trp,Arg,Asp,Glu,Asn,His,Thr,Ser,Ala,Tyr,Phe,Ile,M etまたはVal； 83位のXaaはPro,Ala,Thr,Trp,Arg,またはMet； 84位のXaaはCys,Glu,Gly,Arg,Met,またはVal； 85位のXaaはLeu,Asn,Val,またはGln； 86位のXaaはPro,Cys,Arg,Ala,またはLys； 87位のXaaはLeu,Ser,Trp,またはGly； 88位のXaaはAla,Lys,Arg,Val,またはTrp； 89位のXaaはThr,Asp,Cys,Leu,Val,Glu,His,Asn,またはSer； 90位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Gly,Asp,Ile,またはMet； 91位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Phe,Leu,Asp,またはHis； 92位のXaaはPro,Phe,Arg,Ser,Lys,His,Ala,Gly,IleまたはLeu； 93位のXaaはThr,Asp,Ser,Asn,Pro,Ala,Leu,またはArg； 94位のXaaはArg,Ile,Ser,Glu,Leu,Val,Gln,Lys,His,Ala,またはPro； 95位のXaaはHis,Gln,Pro,Arg,Val,Leu,Gly,Thr,Asn,Lys,Ser,Ala,Trp,Phe,Ile, またはTyr； 96位のXaaはPro,Lys,Tyr,Gly,Ile,またはThr； 97位のXaaはIle,Val,Lys,Ala,またはAsn； 98位のXaaはHis,Ile,Asn,Leu,Asp,Ala,Thr,Glu,Gln,Ser,Phe,Met,Val,Lys,Arg,T yrまたはPro； 99位のXaaはIle,Leu,Arg,Asp,Val,Pro,Gln,Gly,Ser,Phe,またはHis； 100位のXaaはLys,Tyr,Leu,His,Arg,Ile,Ser,Gln,またはPro； 101位のXaaはAsp,Pro,Met,Lys,His,Thr,Val,Tyr,Glu,Asn,Ser,Ala,Gly,Ile,Leu, またはGln； 102位のXaaはGly,Leu,Glu,Lys,Ser,Tyr,またはPro； 103位のXaaはAsp,またはSer； 104位のXaaはTrp,Val,Cys,Tyr,Thr,Met,Pro,Leu,Gln,Lys,Ala,Phe,またはGly； 105位のXaaはAsn,Pro,Ala,Phe,Ser,Trp,Gln,Tyr,Leu,Lys,Ile,Asp,またはHis； 106位のXaaはGlu,Ser,Ala,Lys,Thr,Ile,Gly,またはPro； 108位のXaaはArg,Lys,Asp,Leu,Thr,Ile,Gln,His,Ser,AlaまたはPro； 109位のXaaはArg,Thr,Pro,Glu,Tyr,Leu,Ser,またはGly； 110位のXaaはLys,Ala,Asn,Thr,Leu,Arg,Gln,His,Glu,Ser,またはTrp； 111位のXaaはLeu,Ile,Arg,Asp,またはMet； 112位のXaaはThr,Val,Gln,Tyr,Glu,His,Ser,またはPhe； 113位のXaaはPhe,Ser,Cys,His,Gly,Trp,Tyr,Asp,Lys,Leu,Ile,ValまたはAsn； 114位のXaaはTyr,Cys,His,Ser,Trp,Arg,またはLeu； 115位のXaaはLeu,Asn,Val,Pro,Arg,Ala,His,Thr,Trp,またはMet； 116位のXaaはLys,Leu,Pro,Thr,Met,Asp,Val,Glu,Arg,Trp,Ser,Asn,His,Ala,Tyr, Phe,Gln,またはIle； 117位のXaaはThr,Ser,Asn,Ile,Trp,Lys,またはPro； 118位のXaaはLeu,Ser,Pro,Ala,Glu,Cys,Asp,またはTyr； 119位のXaaはGlu,Ser,Lys,Pro,Leu,Thr,Tyr,またはArg； 120位のXaaはAsn,Ala,Pro,Leu,His,Val,またはGln； 121位のXaaはAla,Ser,Ile,Asn,Pro,Lys,Asp,またはGly； 122位のXaaはGln,Ser,Met,Trp,Arg,Phe,Pro,His,Ile,Tyr,またはCys； 123位のXaaはAla,Met,Glu,His,Ser,Pro,Tyr,またはLeu； また、１から１４個のアミノ酸を修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら任意に欠失でき、そして（または）１から１５個のアミノ酸をＣ−末端から任 意に欠失でき；Ｘａａにより表示されたアミノ酸のうち０から４４個は天然（１ −１３３）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは異なり；また Ｎ−末端はＣ−末端へ直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端を Ｃ−末端へつなぐことができ、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれア ミノ酸：のところにもつことができる）を介してつながれる］ を有する修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列からなる、ポリペプチド； （VI）式：［式中、 １１２位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； １１３位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； １１４位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； １１５位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；そして Ｎ−末端は、Ｃ−末端へ直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端 をＣ−末端へつなぐことができ、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれ アミノ酸： のところにもつことができる）を介してつながれる］ を有する修飾ヒトｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列からなる、ポリペプチド； （VII）式：［式中、 17位のXaaはSer,Lys,Gly,Asp,Met,Gln,またはArg； 18位のXaaはAsn,His,Leu,Ile,Phe,Arg,またはGln； 19位のXaaはMet,Phe,Ile,Arg,Gly,Ala,またはCys； 20位のXaaはIle,Cys,Gln,Glu,Arg,Pro,またはAla； 21位のXaaはAsp,Phe,Lys,Arg,Ala,Gly,Glu,Gln,Asn,Thr,SerまたはVal； 22位のXaaはGlu,Trp,Pro,Ser,Ala,His,Asp,Asn,Gln,Leu,ValまたはGly； 23位のXaaはIle,Val,Ala,Gly,Trp,Lys,Phe,Leu,Ser,またはArg； 24位のXaaはIle,Gly,Val,Arg,Ser,Phe,またはLeu； 25位のXaaはThr,His,Gly,Gln,Arg,Pro,またはAla； 26位のXaaはHis,Thr,Phe,Gly,Arg,Ala,またはTrp； 27位のXaaはLeu,Gly,Arg,Thr,Ser,またはAla； 28位のXaaはLys,Arg,Leu,Gln,Gly,Pro,ValまたはTrp； 29位のXaaはGln,Asn,Leu,Pro,Arg,またはVal； 30位のXaaはPro,His,Thr,Gly,Asp,Gln,Ser,Leu,またはLys； 31位のXaaはPro,Asp,Gly,Ala,Arg,Leu,またはGln； 32位のXaaはLeu,Val,Arg,Gln,Asn,Gly,Ala,またはGlu； 33位のXaaはPro,Leu,Gln,Ala,Thr,またはGlu； 34位のXaaはLeu,Val,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,Thr,Arg,Ala,Phe,IleまたはMet； 35位のXaaはLeu,Ala,Gly,Asn,Pro,GlnまたはVal； 36位のXaaはAsp,Leu,またはVal； 37位のXaaはPhe,Ser,Pro,Trp,またはIle； 38位のXaaはAsn,またはAla； 40位のXaaはLeu,Trp,またはArg； 41位のXaaはAsn,Cys,Arg,Leu,His,Met,またはPro； 42位のXaaはGly,Asp,Ser,Cys,Asn,Lys,Thr,Leu,Val,Glu,Phe,Tyr,Ile,Metまたは Ala； 43位のXaaはGlu,Asn,Tyr,Leu,Phe,Asp,Ala,Cys,Gln,Arg,Thr,GlyまたはSer； 44位のXaaはAsp,Ser,Leu,Arg,Lys,Thr,Met,Trp,Glu,Asn,Gln,AlaまたはPro； 45位のXaaはGln,Pro,Phe,Val,Met,Leu,Thr,Lys,Trp,Asp,Asn,Arg,Ser,Ala,Ile,G luまたはHis； 46位のXaaはAsp,Phe,Ser,Thr,Cys,Glu,Asn,Gln,Lys,His,Ala,Tyr,Ile,Valまたは Gly； 47位のXaaはIle,Gly,Val,Ser,Arg,Pro,またはHis； 48位のXaaはLeu,Ser,Cys,Arg,Ile,His,Phe,Glu,Lys,Thr,Ala,Met,ValまたはAsn ； 49位のXaaはMet,Arg,Ala,Gly,Pro,Asn,His,またはAsp； 50位のXaaはGlu,Leu,Thr,Asp,Tyr,Lys,Asn,Ser,Ala,Ile,Val,His,Phe,Metまたは Gln； 51位のXaaはAsn,Arg,Met,Pro,Ser,Thr,またはHis； 52位のXaaはAsn,His,Arg,Leu,Gly,Ser,またはThr； 53位のXaaはLeu,Thr,Ala,Gly,Glu,Pro,Lys,Ser,またはMet； 54位のXaaはArg,Asp,Ile,Ser,Val,Thr,Gln,Asn,Lys,His,AlaまたはLeu； 55位のXaaはArg,Thr,Val,Ser,Leu,またはGly； 56位のXaaはPro,Gly,Cys,Ser,Gln,Glu,Arg,His,Thr,Ala,Tyr,Phe,Leu,Valまたは Lys； 57位のXaaはAsnまたはGly； 58位のXaaはLeu,Ser,Asp,Arg,Gln,Val,またはCys； 59位のXaaはGlu,Tyr,His,Leu,Pro,またはArg； 60位のXaaはAla,Ser,Pro,Tyr,Asn,またはThr； 61位のXaaはPhe,Asn,Glu,Pro,Lys,Arg,またはSer； 62位のXaaはAsn,His,Val,Arg,Pro,Thr,Asp,またはIle； 63位のXaaはArg,Tyr,Trp,Lys,Ser,His,Pro,またはVal； 64位のXaaはAla,Asn,Pro,Ser,またはLys； 65位のXaaはVal,Thr,Pro,His,Leu,Phe,またはSer； 66位のXaaはLys,Ile,Arg,Val,Asn,Glu,またはSer； 67位のXaaはSer,Ala,Phe,Val,Gly,Asn,Ile,Pro,またはHis； 68位のXaaはLeu,Val,Trp,Ser,Ile,Phe,Thr,またはHis； 69位のXaaはGln,Ala,Pro,Thr,Glu,Arg,Trp,Gly,またはLeu； 70位のXaaはAsn,Leu,Val,Trp,Pro,またはAla； 71位のXaaはAla,Met,Leu,Pro,Arg,Glu,Thr,Gln,Trp,またはAsn； 72位のXaaはSer,Glu,Met,Ala,His,Asn,Arg,またはAsp； 73位のXaaはAla,Glu,Asp,Leu,Ser,Gly,Thr,またはArg； 74位のXaaはIle,Met,Thr,Pro,Arg,Gly,Ala； 75位のXaaはGlu,Lys,Gly,Asp,Pro,Trp,Arg,Ser,Gln,またはLeu； 76位のXaaはSer,Val,Ala,Asn,Trp,Glu,Pro,Gly,またはAsp； 77位のXaaはIle,Ser,Arg,Thr,またはLeu； 78位のXaaはLeu,Ala,Ser,Glu,Phe,Gly,またはArg； 79位のXaaはLys,Thr,Asn,Met,Arg,Ile,Gly,またはAsp； 80位のXaaはAsn,Trp,Val,Gly,Thr,Leu,Glu,またはArg； 81位のXaaはLeu,Gln,Gly,Ala,Trp,Arg,Val,またはLys； 82位のXaaはLeu,Gln,Lys,Trp,Arg,Asp,Glu,Asn,His,Thr,Ser,Ala,Tyr,Phe,Ile,M etまたはVal； 83位のXaaはPro,Ala,Thr,Trp,Arg,またはMet； 84位のXaaはCys,Glu,Gly,Arg,Met,またはVal； 85位のXaaはLeu,Asn,Val,またはGln； 86位のXaaはPro,Cys,Arg,Ala,またはLys； 87位のXaaはLeu,Ser,Trp,またはGly； 88位のXaaはAla,Lys,Arg,Val,またはTrp; 89位のXaaはThr,Asp,Cys,Leu,Val,Glu,His,Asn,またはSer； 90位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Gly,Asp,Ile,またはMet； 91位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Phe,Leu,Asp,またはHis； 92位のXaaはPro,Phe,Arg,Ser,Lys,His,Ala,Gly,Ile,またはLeu； 93位のXaaはThr,Asp,Ser,Asn,Pro,Ala,Leu,またはArg； 94位のXaaはArg,Ile,Ser,Glu,Leu,Val,Gln,Lys,His,Ala,またはPro； 95位のXaaはHis,Gln,Pro,Arg,Val,Leu,Gly,Thr,Asn,Lys,Ser,Ala,Trp,Phe,Ile, またはTyr； 96位のXaaはPro,Lys,Tyr,Gly,Ile,またはThr； 97位のXaaはIle,Val,Lys,Ala,またはAsn； 98位のXaaはHis,Ile,Asn,Leu,Asp,Ala,Thr,Glu,Gln,Ser,Phe,Met,Val,Lys,Arg,T yrまたはPro； 99位のXaaはIle,Leu,Arg,Asp,Val,Pro,Gln,Gly,Ser,Phe,またはHis； 100位のXaaはLys,Tyr,Leu,His,Arg,Ile,Ser,Gln,またはPro； 101位のXaaはAsp,Pro,Met,Lys,His,Thr,Val,Tyr,Glu,Asn,Ser,Ala,Gly,Ile,Leu, またはGln； 102位のXaaはGly,Leu,Glu,Lys,Ser,Tyr,またはPro； 103位のXaaはAsp,またはSer； 104位のXaaはTrp,Val,Cys,Tyr,Thr,Met,Pro,Leu,Gln,Lys,Ala,Phe,またはGly； 105位のXaaはAsn,Pro,Ala,Phe,Ser,Trp,Gln,Tyr,Leu,Lys,Ile,Asp,またはHis； 106位のXaaはGlu,Ser,Ala,Lys,Thr,Ile,Gly,またはPro； 108位のXaaはArg,Lys,Asp,Leu,Thr,Ihe,Gln,His,Ser,AlaまたはPro； 109位のXaaはArg,Thr,Pro,Glu,Tyr,Leu,Ser,またはGly； 110位のXaaはLys,Ala,Asn,Thr,Leu,Arg,Gln,His,Glu,Ser,またはTrp； 111位のXaaはLeu,Ile,Arg,Asp,またはMet； 112位のXaaはThr,Val,Gln,Tyr,Glu,His,Ser,またはPhe； 113位のXaaはPhe,Ser,Cys,His,Gly,Trp,Tyr,Asp,Lys,Leu,Ile,ValまたはAsn； 114位のXaaはTyr,Cys,His,Ser,Trp,Arg,またはLeu； 115位のXaaはLeu,Asn,Val,Pro,Arg,Ala,His,Thr,Trp,またはMet； 116位のXaaはLys,Leu,Pro,Thr,Met,Asp,Val,Glu,Arg,Trp,Ser,Asn,His,Ala,Tyr, Phe,Gln,またはIle； 117位のXaaはThr,Ser,Asn,Ile,Trp,Lys,またはPro； 118位のXaaはLeu,Ser,Pro,Aht,Glu,Cys,Asp,またはTyr； 119位のXaaはGlu,Ser,Lys,Pro,Leu,Thr,Tyr,またはArg； 120位のXaaはAsn,Ala,Pro,Leu,His,Val,またはGln； 121位のXaaはAla,Ser,Ile,Asn,Pro,Lys,Asp,またはGly； 122位のXaaはGln,Ser,Met,Trp,Arg,Phe,Pro,His,Ile,Tyr,またはCys； 123位のXaaはAla,Met,Glu,His,Ser,Pro,Tyr,またはLeu； ここで、修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端からは１から１４個のアミ ノ酸を任意に欠失させ、そして（または）１から１５個のアミノ酸をＣ−末端か ら任意に欠失させることができ；そしてＸａａにより表示されたアミノ酸のうち １から４４個は、天然（１−１３３）ヒトインターロイキン−３の対応するアミ ノ酸と異なる］ を有する修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列からなる、ポリペプチド； および （VIII）コロニー刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン か らなる群から選ばれる因子、 からなる群から選ばれ、そしてＬ1はＲ1をＲ2に結合させることのできるリン カーであるが、ただし 少なくともＲ1かＲ2のいずれかは式（Ｉ）、（II）、または（III）を有する ポリペプチドから選ばれることを条件とし； 前記造血タンパク質は、任意にその直前に（メチオニン-1）、（アラニン-1） または（メチオニン-2、アラニン-1）を置くことができる。 上記ポリペプチド（Ｉ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（Ｉ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は次の通りである： 本発明に係るＥＰＯレセプターアゴニストはアミノ酸置換（例えば、ＷＯ９４ ／２４１６０に記載のもの、あるいはＡｓｎ24Ａｓｎ83）およびＡｓｎ126にお けるグリコシル化部分の一つ以上を他のアミノ酸、例えば（しかし、これに限定 されない）ＡｓｐまたはＧｌｕ、に変える）、欠失および（または）挿入を含む ことができる。また、本発明ＥＰＯレセプターアゴニストはもとのタンパク質の Ｎ−末端およびＣ−末端のいずれかまたは両方にアミノ酸欠失を、そして（また は）前に示した式中の配列再編成タンパク質の新しいＮ−末端およ び（または）Ｃ−末端からの欠失を有しうることも企図されている。 上記ポリペプチド（II）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は、それぞれ次の通りである： 上記ポリペプチド（II）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は、それぞれ６４−６５、６５−６６、９２−９３およ び９３−９４である。 上記ポリペプチド（III）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることの できる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（III）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることの できる最も好ましい切断点は、３９−４０、６５−６６、８９−９０、９９−１ ００および１００−１０１である。 上記ポリペプチド（IV）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（IV）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は３８−３９、４８−４９、９６−９７、１２５−１２ ６、１３２−１３３および１４１−１４２である。 上記ポリペプチド（Ｖ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（Ｖ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は、３４−３５、６９−７０および９０−９１である。 上記ポリペプチド（VI）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（VI）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は、８１−８２、１０８−１０９、１１５−１１６、１ １９−１２０、１２２−１２３および１２５−１２６である。 本発明に係る多機能性レセプターアゴニストはまた次式： により表わすことができる。式中、 Ｘ1は、残基１のところをアミノ末端として順次１からＪまで番号を付けたア ミノ酸残基をもつもとのタンパク質の残基ｎ＋１からＪまでの配列に相当するア ミノ酸配列からなるペプチドであり； Ｌは任意のリンカーであり； Ｘ2は、最初のタンパク質の残基１からｎまでのアミノ酸配列からなるペプチ ドであり； Ｙ1は、残基１のところをアミノ末端として順次１からｋまで番号をつけたア ミノ酸残基を有するもとのタンパク質の残基ｎ＝１からｋまでの配列に相当する アミノ酸配列からなるペプチドであり； Ｙ2は最初のタンパク質の残基１からｎまでのアミノ酸配列からなるペプチド であり； Ｌ1とＬ2は任意のペプチドスペーサーであり； ｎは１からＪ−１にわたる整数であり； 各ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ０か１であり； ａおよびｅは０か１のいずれかであるが、ただしａとｅが両方とも０となるこ とはできず；そして Ｔ1およびＴ2はタンパク質である。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、キメラ分子の個々 のタンパク質成分中にアミノ酸置換、欠失および（または）挿入を含むことがで きる。また本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、最初のタンパク 質のＮ−末端およびＣ−末端のいずれまたは両方にアミノ酸欠失を、そして（あ るいは）前記式において配列再編成タンパク質の新しいＮ−末端および（または ）Ｃ−末端からの欠失を有しうることも企図されている。 本発明の特に適当な一具体例において、Ｎ−末端をＣ−末端につなぐ上式のリ ンカー（Ｌ）、（Ｌ1）または（Ｌ2）は、 からなる群から選ばれるポリペプチドである。 更に、本発明は多機能性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化するヌク レオチド配列からなる組換え発現ベクター、関連微生物発現系、および多機能性 キメラ造血レセプターアゴニストに関するものである。本発明はまた多機能性キ メラ造血レセプターアゴニストを含む医薬組成物ならびに多機能性キメラ造血レ セプターアゴニストの使用法に関するものである。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの生体内使用に加えて 、容器内使用は、患者に注入する前に、骨髄および血液細胞の活性化と増殖を促 進する能力を含む筈であると想像される。もう一つの企図された使用は、樹脂状 細胞の生体内および生体外生産に向けてである。 融合タンパク質の親和性低下は、少なくとも一部は、キメラ分子中に取り入れ られたとき、その自然のコンホメーションを個々の分子が達成できないこと、あ るいは融合タンパク質の個々の部分の活性部位間の立体障害によると考えられる 。本発明は、キメラ分子の個々の成分に匹敵するかそれより大きい結合親和性を もつ新規多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを提供することによってこれ らの不利益を克服するものである。 図面の簡単な説明 図１は、タンパク質の配列再編成を概略的に説明している。未変性タンパク質 のＮ−末端（Ｎ）とＣ−末端（Ｃ）をリンカーを介してつなぐか、または直接つ なぐ。タンパク質を切断点で開いて新しいＮ−末端（新Ｎ）と新しいＣ−末端（ 新Ｃ）をつくり出すと、その結果新しい線状アミノ酸配列をもつタンパク質を 生ずる。再配列分子は線状分子として新規合成することができ、最初のＮ−末端 とＣ−末端とをつなぐ、そして切断点でタンパク質を開くという段階を通過しな いかも知れない。 図２は、新しいタンパク質をつくり出すための方法Ｉのスキームを示す。前記 タンパク質においては、自然のままのタンパク質の最初のＮ−末端とＣ−末端を リンカーでつなぎ、異なるＮ−末端とＣ−末端のタンパク質をつくり出している 。示した例では、配列の再編成の結果として、最初のタンパク質のアミノ酸９７ のところに生じた新しいＮ−末端、アミノ酸１１（ａ．ａ．１−１０は欠失）に リンカー領域を経由して接続された最初のＣ−末端（ａ．ａ．１７４）および最 初の配列のアミノ酸９６につくり出された新しいＣ−末端をもつタンパク質をコ ード化する新遺伝子を得る。 図３は、新しいタンパク質をつくり出すための方法IIのスキームを示す。この 場合、自然のままのタンパク質の最初のＮ−末端とＣ−末端をリンカー無しでつ なぎ、異なるＮ−末端とＣ−末端のタンパク質をつくり出す。示した例では、配 列の再編成の結果として、最初のタンパク質のアミノ酸９７につくり出された新 しいＮ−末端、最初のＮ−末端に接続された最初のＣ−末端（ａ．ａ．１７４） および最初の配列のアミノ酸９６につくり出された新しいＣ−末端をもつタンパ ク質をコード化する新遺伝子を得る。 図４は、新しいタンパク質をつくり出すための方法IIIのスキームを示す。こ の場合、自然のままのタンパク質の最初のＮ−末端とＣ−末端をリンカーでつな ぎ、異なるＮ−末端およびＣ−末端のタンパク質をつくり出す。示した例では、 配列の再編成の結果として、最初のタンパク質のアミノ酸９７につくり出された 新しいＮ−末端、アミノ酸１にリンカー領域を経て接続された最初のＣ−末端（ ａ．ａ．１７４）、および最初の配列のアミノ酸９６につくり出された新しいＣ −末端をもつタンパク質をコード化する新遺伝子を得る。 図５はｆｌｔ３レセプターアゴニストｐＭＯＮ３２３３２、ｐＭＯＮ３２３３ ３、ｐＭＯＮ３２３３４およびｐＭＯＮ３２３３５からなる多機能性レセプター アゴニストの、ＭＵＴＺ−２細胞増殖検定法で組換え未変性ｆｌｔ３（Ｇｅｎｚ ｙｍｅ）と比べた生物活性を示す。 図６は、Ｌｉｎ等（ＰＮＡＳ ８２：７５８０−７５８４，１９８５）の配列 に基づいたヒトの熟成ＥＰＯをコード化するＤＮＡ配列を示す。 図７ａおよび７ｂは、Ｍａｒｔｉｎ等（Ｃｅｌｌ ６３：２０３−２１１，１ ９９０）の配列に基づいた自然のままの幹細胞因子をコード化するＤＮＡ配列を 示す。 図８は、Langley等（Archives of Bichemistry and Biophysica 311:55-61,19 94）の配列に基づいた可溶性幹細胞因子をコード化するＤＮＡ配列を示す。 図９ａおよび９ｂは、Lyman等（Oncogene 11:1165-1172,1995）から得たｆｌ ｔ３リガンドの２０９アミノ酸成熟形をコード化するＤＮＡ配列を示す。発明の詳細な説明 本発明は、共有結合したポリペプチドから形成される多機能性キメラ造血レセ プターアゴニストを包含するものであり、これらの各々は異なる特異的細胞レセ プターを経由して相補的生物活動を開始させる作用をする。造血は一連の複雑な 細胞現象を必要とし、この場合、幹細胞はあらゆる主要な系統において成熟しつ つある細胞の大集団を絶えずつくり出す。現在造血増殖活性を有する少なくとも ２０種の既知調節物質がある。これら増殖調節物質の大部分は一つの型あるいは 他の型のコロニー形成を容器内で促進しうるだけであり、各調節物質により促進 されるコロニー形成の正確なパターンは全く特有のものである。二種の調節物質 が正確に同じパターンのコロニー形成を促進しないことは、コロニー数により、 あるいは更に重要なこととしては、発達しつつあるコロニーをつくり上げている 細胞の系統と成熟パターンにより評価される通りである。増殖応答は、単純化さ れた容器内培養系で最も容易に分析できる。三つの全く異なるパラメーター、即 ちコロニーの大きさの変化、コロニー数の変化および細胞系統を区別できる。二 つ以上の因子が始原細胞に対して作用することがあり、より多数の後代の形成を 誘発することによりコロニーの大きさを増大させる。二つ以上の因子が多数の始 原細胞を増殖させるかもしれない。それは、もっぱら一つの因子に対して応答す る始原細胞の別個の部分集合が存在するためか、あるいは若干の始原細胞が応答 しうる前に、二つ以上の因子による刺激を必要とするからである。二つ以上の因 子の使用による細胞上の更に他のレセプターの活性化は、最初は異なっている信 号経路が核に達する共通の最終経路に合体するので、有糸***信号を高めるよう である（Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：２７，１９８９）。他の機構 は相乗作用を説明できるであろう。例えば、もし信号を出す一つの経路が、第二 の因子により起こるもう一つの信号経路の中間的活性化により制限されたとすれ ば、これは超加成的応答を生ずるかも知れない。ある場合には、一つのレセプタ ー型の活性化が他のレセプターの高められた発現を誘発しうる（Ｍｅｔｃａｌｆ 、Ｂｌｏｏｄ ８２：３５１５−３５２３，１９９３）。二つ以上の因子が一つ の因子よりも異なるパターンの細胞系統を生ずることがある。多機能性キメラ造 血レセプターアゴニストの使用は、どの単一因子によっても不可能な増殖応答か ら生ずる潜在的な臨床上の利点をもつかも知れない。 造血因子および他の成長因子のレセプターは、関連するタンパク質を二つの別 個の群に分離できる、即ち（１）チロシンレセプター、例えば上皮成長因子、Ｍ −ＣＳＦに対するもの（Ｓｈｅｒｖ，Ｂｌｏｏｄ，７５：１，１９９０）および ＳＣＦに対するもの（Ｙａｒｄｅｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３３４１，１９８７ ）および（２）造血レセプター、これはチロシンキナーゼ領域は含まないが、そ の細胞外領域に明瞭な相同性を示す（Ｂａｚａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６ ９３４−６９３８，１９９０）。後者の群に包含されるものとして次のものが挙 げられる： エリトロポイエチン(EPO)(D'Andrea等，Cell 57:277，1989)，GM-CSF(Gearing等 ，EMBO J．8:3667，1989)，IL-3(Kitamura等，Cell 66:1165，1991)，G-CSF(Fuk unaga等，J．Bio．Chem．265:14008-15，1990)，IL-4(Harada等，PNAS USA 87:8 57，1990)，IL-5(Takaki等，EMBO J．9:4367，1990)，IL-6(Yamasaki等，Scienc e 241:825，1988)，IL-7(Goodwin等，Cell 60:941-51，1990)，LIF（Gearing等 ，EMBO J．10:2839，1991）およびIL-2(Cosman等，Mol-Immunol．23:935-94，19 86)。 後者の群のレセプターの大部分は、異種二量体として高親和性形で存在する。リ ガンド結合後、その特異的ａ−鎖は少なくとも一つの他のレセプター鎖（ｂ−鎖 、ｇ−鎖）と関係づけられるようになる。これら因子の多くは、共通のレセプタ ーサブユニットを共有する。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５に対するａ − 鎖は同じｂ−鎖を共有し(Kitamura等，Cell 66:1165，1991)，Takaki等，EMBO J ．10:2833-8，1991),そしてＩＬ−６，ＬＩＦおよびＩＬ−１１に対するレセプ ター複合体は共通のｂ−鎖（ｇｐ１３０）を共有する(Taga等，Cell 58:573-81 ，1989;Gearing等，Science 255:1434-7，1992)。ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ− ７，ＩＬ−９およびＩＬ−１５のレセプター複合体は、共通のｇ−鎖を共有する (Kondo等，Science 262:1874，1993;Russell等，Science 266:1042-1045，1993; Noguchi等，Science 262:1877，1993;Giri等，EMBO J．13:2822-2830，1994)。 多様に作用する造血因子の使用は、因子産生細胞およびそれらの誘発系に置か れた要求を軽減することにより潜在的利点を有するかも知れない。もし細胞が因 子を産生する能力に制限があるとすれば、因子の各々の要求される濃度を低下さ せることにより、そしてそれらを合わせて用いることにより、因子産生細胞に対 する要求を有効に減らすことができるであろう。多重に作用する造血因子を使用 することによって、必要とされる因子の量が低下し、多分不利な副作用の可能性 が減るかも知れない。 本発明に係る新規化合物は、 Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2，Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1，Ｒ1−Ｒ2，およびＲ2−Ｒ1 （式中、Ｒ1およびＲ2は上で定義した通りである） からなる群から選ばれる式により表わされる。Ｒ2は、なるべくは、Ｒ1と異なる 、しかし相補的な、活性をもつコロニー促進因子がよい。相補的な活性とは、他 の細胞モジュレーターに対する応答を高めるか変化させる活性を意味する。Ｒ1 ポリペプチドは、Ｒ2ポリペプチドに直接つなぐか、またはリンカー部分を経て つながれる。「直接」という用語は、ポリペプチドがペプチバリンカー無しにつ ながれた多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを定義するものである。従っ て、Ｌ1はＲ1およびＲ2の両方が枠内でつながれる化学結合またはポリペプチド 部分を表わし、最も普通には、Ｌ1はＲ1とＲ2が、Ｒ1のカルボキシ末端をＬ1の アミノ末端に、またＬ1−のカルボキシ末端をＲ2のアミノ末端につなぐアミド結 合によりつながれた線状ペプチドである。「枠内でつながれる」とは、Ｒ1およ びＲ2をコード化するＤＮＡの読み枠間に翻訳停止あるいは中断が無いこと を意味する。 他の成長因子、即ちコロニー促進因子（ＣＳＦ）、の一覧（これだけに限らな い）は、（Ｉ）、（II）または（III）に結合させることができるサイトカイン 、リンホカイン、インターロイキン、造血成長因子であり、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ− ＣＳＦ，ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られている）、 Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、IL-1，IL-4，IL-2，IL-3，IL-5， IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，LIF，flt3/flk 2リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球 分化因子および幹細胞因子（ＳＣＦ）（スチール因子またはｃ−キットリガンド としても知られている）を含む。更にまた、本発明は修飾Ｒ1またはＲ2分子ある いはこれらＲ1またはＲ2分子をコード化する変異あるいは修飾ＤＮＡ配列の使用 を包含する。本発明はまたＲ1またはＲ2がｈＩＬ−３変異体、ｃ−ｍｐｌリガン ド変異体、またはＧ−ＣＳＦ変異体である多機能性キメラ造血レセプターアゴニ ストをも包含するものである。「ｈＩＬ−３変異体」は、アミノ酸置換および（ または）ＷＯ９４／１２６３８、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９５／００６ ４６に開示されたような欠失したｈＩＬ−３の部分を有するｈＩＬ−３分子、な らびにこの分野で知られる他の変異体として定義される。「ｃ−ｍｐｌリガンド 変異体」は、米国特許願連続番号０８／３８３，０３５に開示された。アミノ酸 置換および（または）欠失ｃ−ｍｐｌリガンドの部分を有するｃ−ｍｐｌリガン ド分子、ならびにこの分野で公知の他の変異体として定義される。「Ｇ−ＣＳＦ 変異体」は、本明細書中に開示されたアミノ酸置換および（または）欠失Ｇ−Ｃ ＳＦの部分を有するＧ−ＣＳＦ分子、ならびにこの分野で公知の他の変異体とし て定義される。上記一覧に加えて、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２ ６３８に教示されたＩＬ−３変異体、ＷＯ９７／１２９７７に開示されたＧ−Ｃ ＳＦLレセプターアゴニスト、ＷＯ９７／１２９７８に開示されたｃ−ｍｐｌレ セプターアゴニスト、ＷＯ９７／１２９７９に開示されたＩＬ−３レセプターア ゴニストは、本発明に係るＲ1またはＲ2となりうる。本明細書中に用いた「ＩＬ −３変異体」は、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２６３８に教示され たＩＬ−３変異体を指す。本明細書で用いた「融合タンパク質」 は、ＷＯ９５／２１１９７およびＷＯ９５／２１２５４に教示された融合タンパ ク質を指す。本明細書中で用いた「Ｇ−ＣＳＦレセプターアゴニスト」は、ＷＯ ９７／１２９７８に開示されたＧ−ＣＳＦレセプターアゴニストを指す。本明細 書中で用いた「ｃ−ｍｐｌレセプターアゴニスト」は、ＷＯ９７／１２９７８に 開示されたｃ−ｍｐｌレセプターアゴニストを指す。本明細書中で用いた「ＩＬ −３レセプターアゴニスト」は、ＷＯ９７／１２９７９に開示されたＩＬ−３レ セプターアゴニストを指す。本明細書中で用いた「多機能性レセプターアゴニス ト」は、ＷＯ９７／１２９８５に教示された多機能性レセプターアゴニストを指 す。 連結基（Ｌ1）は、一般に１個から５００個のアミノ酸の長さを有するポリペ プチドである。２分子をつなぐリンカーは、（１）二つの分子が折りたたまれて 互に独立して作用するように、（２）二つのタンパク質の機能領域を妨害しうる 強制された二次構造を出現させる傾向を有しないように、（３）機能性タンパク 質領域を妨害しうる疎水性の特性を最少にもつように、そして（４）一つの細胞 上でＲ1とＲ2がそれらの対応するレセプターと同時に相互作用しうるように、Ｒ1 とＲ2の立体的な分離を設けるように計画するのがよい。典型的には、たわみ易 いタンパク質領域における表面アミノ酸はＧｌｙ，ＡｓｎおよびＳｅｒを含む。 Ｇｌｙ，ＡｓｎおよびＳｅｒを含むアミノ酸配列の実質的にどの入れ替えもリン カー配列に対する上記の基準を満すことが期待される筈である。他の中性アミノ 酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａ、もリンカー配列に使用できる。更に他のアミノ 酸も、他機能性キメラ造血レセプターアゴニストの構成を容易にするため、リン カー配列に独特の制限部位をつけ加えるので、リンカーに含めることができる。 本発明に係る特に適当なＬ1リンカーは、式： の群から選ばれる配列を含む。 高度に柔軟性のあるリンカーの一例は、繊維状バクテリアオファージ、例えば バクテリオファージＭ１３またはｆｄのｐIIIタンパク質中に存在するグリシン およびセリンに富むスペーサー部である（Ｓｃｈａｌｌｅｒ等、ＰＮＡＳ ＵＳ Ａ ７２：７３７−７４１，１９７５）。この領域は、ｐIII表面タンパク質の 二つの領域間に長いたわみ性のスペーサー部を提供する。このスペーサー部は次 のアミノ酸配列からなる： 本発明は、エンドペプチダーゼ認識配列を含むリンカーも包含する。このよう な切断部位は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの個々の成分を分離し て、それらが適切に折りたたまれているかそして容器内で活性があるかどうかを 決定するために貴重であるかも知れない。種々なエンドペプチダーゼの例として 、プラスミン、エンテロキナーゼ、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織プラスミ ノーゲン活性化物質、クロストリペイン、キモシン、コラゲナーゼ、ラッセルク サリヘビの毒液プロテアーゼ、ポストプロリン切断酵素、Ｖ８プロテアーゼ、ト ロンビンおよびＸａ因子が挙げられるが、これらに限定されない。 重鎖免疫グロブリンＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤあるいはＩｇＥのヒンジ 領域から得られるペプチドリンカーセグメントは、付着ポリペプチド間に角張っ た関係を与える。システインがセリンで置き換えられたヒンジ領域が特に有用で ある。特に適当な本発明リンカーは、システインがセリンに変わったネズミＩｇ Ｇガンマー２ｂヒンジ領域から誘導された配列である。これらリンカーはまたエ ンドペプチダーゼ切断部位を含むこともある。このようなリンカーの例として下 記の配列が挙げられる： しかし、本発明は用いたリンカー配列の形、寸法または数によって制限を受け ず、リンカーについての唯一の必要条件は、それが機能上、多機能性キメラ造血 レセプターアゴニストの折りたたみおよび働きを妨害しないことである。リンカーＬ2の決定 Ｒ1および（または）Ｒ2に使用されるリンカーＬ2のアミノ酸配列の長さは、 経験的に、あるいは構造上の情報から得られる案内を用いて、あるいはこれら二 つの方法を併用して選ぶことができる。 構造上の情報が手に入らない場合には、試験を行なうために小さいリンカー系 列を調製することができる。それには、０から５０Åの範囲にまたがるようにそ の長さを変え、そして表面露出と一致させるためにその配列を選ぶ(親水性，Hop p & Woods，Mol．Immunol．20:483-489，1983)，Kyte & Doolittle，J．Mol．Bi ol．157:105-132;溶媒暴露表面積，Lee & Richards，J．Mol．Biol．55:379-400 ，1971）設計およびＲ1またはＲ2のコンホメーションを乱すことなく必要なコン ホメーションをとる能力（コンホメーション的にたわみ易い；Karplus & Schulz ，Naturwissenschaften 72:212-213，1985）を利用する。残基１個当り２．０か ら３．８Åの翻訳平均を仮定すると、これは、試験長が０から３０残基となるこ とを意味し、０から１５残基が特に適当な範囲である。このような実験的系列の 代表例は、ｎ回反復される（ｎは１，２，３または４である）「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」のようなカセット配列を用いてリンカーを組立てることであ ろう。当業者は、リンカーとして役立ちうる、長さまたは組成の種々と変わる多 くのこのような配列があり、第一に考慮すべきことは、それらが過度に長くもな ければ短かくもないということである（Sandhu,Critical Rev，Biotech．12:437 -462，1992参照）。もしこれら配列が長過ぎると、エントロピー効果によって三 次元の折りたたみが不安定化するようであり、また折りたたみが動力学的に実際 的でなくなるかも知れず、そしてもしこれらが短か過ぎると、張力的あるいは立 体的ないずみのため、分子を不安定化するようである。 タンパク質の構造上の情報の解析における専門家は、ｃ−アルファー炭素間の 距離として定義される鎖端間の距離を用いることにより、使用すべき配列の長さ を限定でき、あるいはリンカーの経験による選択で試験せねばならない可能性の 数を少なくとも制限できることを認識するであろう。当業者はまた時には、ｘ− 線回折または核磁気共鳴分光法のデータから導かれる構造モデルでは、ポリペプ チド鎖の両端の位置が明確にされないこと、そしてもしそれが本当であるならば 、要求されるリンカーの長さを適切に算定するために、この状況を考慮する必要 があることをも認識するであろう。それらの位置が明確に述べられている残基か ら、鎖の両端に配列が類似した二つの残基を選び、それらのｃ−アルファー炭素 間の距離を用いてそれらの間のリンカーに対するおよその長さを計算する。計算 された長さを規準として使用して、次にある範囲の残基数をもつリンカーを選ぶ （２から３．８Å／残基を用いて計算）。これらのリンカーは、最初の配列を必 要に応じて短かくしたりあるいは長くしたりした配列から構成することができ、 そして長くしたときは、前述したようにたわみ易くそして親水性にするように追 加残基を選ぶことができ；あるいは任意に、一連のリンカー（一例は前記「Ｇ１ ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」カセット法である）を使用する代りに、最初の配 列を使用することができ、あるいは任意に、最初の配列と適当な長さをもつ新し い配列とのコンビネーションを使用してもよい。Ｒ1およびＲ2のアミノ末端およびカルボキシル末端の決定 生物学的に活性のある状態に折りたたむことができるＲ1およびＲ2の配列は、 最初のポリペプチド鎖中から、開始（アミノ末端）位置と終止（カルボキシル末 端）位置を適当に選ぶと同時に、上記のようなリンカー配列Ｌ2を用いることに より調製できる。アミノ末端とカルボキシル末端は、下記の指標を用いて、切断 点領域と呼ばれる共通の配列の範囲内から選ばれる。このようにして、新規アミ ノ酸配列は、同じ切断点領域内からアミノ末端とカルボキシル末端とを選ぶこと によりつくり出される。多くの場合、新しい末端の選択は、カルボキシル末端の 最初の位置がアミノ末端のそれより直ぐ先にあるようになるであろう。しかし、 当業者は、領域内のどの場所の末端の選択も機能すること、そしてこれらは新し い配列のアミノおよびカルボキシル部分への付加あるいは欠失いずれかに効果的 に通じるであろうことを認識するであろう。 タンパク質の一次アミノ酸配列が、生物学的機能の発現に必要な三次元構造へ の折りたたみを要求するということは分子生物学の中核的な主義である。タンパ ク質単結晶のｘ−線回折あるいはタンパク質溶液の核磁気共鳴分光法を用いて、 三次元構造の情報を得、そして解釈する方法は当業者にとって公知である。切断 点領域の確認と関係のある構造上の情報に関する例として、タンパク質二次構造 の位置および型(アルファーおよび３−１０らせん、平行および逆平行ベーター シート、鎖の反転および旋回、および輪；Kabsch & Sander，Biopolymers 22:25 77-2637，1983)，アミノ酸残基の溶媒暴露度、残基相互の相互作用の程度と型（ Chothia，Ann．Rev．Biochem．53:537-572，1984）、およびポリペプチド鎖に沿 ったコンホメーションの静的および動的分布(Alber & Mathews，Methods Enzymo l，154:511-533，1987)が包含される。ある場合には、残基の溶媒暴露について 更に情報が知られている；一例は炭水化物の翻訳後の付着部位であり、これは必 然的にタンパク質表面上である。構造上の実験情報が手に入らない、あるいは得 ることが不可能である場合には、タンパク質の三次構造および二次構造、溶媒の 接近し易さ、ならびに旋回および輪の存在を予想するために、一次アミノ酸配列 を分析する方法も利用できる。直接構造法が実行不可能な場合には、表面暴露を 実験的に測定するための生化学的方法も時として応用できる；例えば、表面暴露 を推論するために、制限タンパク質分解の後、鎖切断部位の確認の方法を用いる (Gentile & Salvatore，Eur．J．Biochem．218:603-621，1993)。 従って、実験的に誘導された構造上の情報か、または予想による方法のいずれ かを用いることにより(例えば、Srinivisan & Rose Proteins:Struct.，Funct． & Genetics，22：81-99，1995)、親アミノ酸配列を詳しく調べて、これらが二次 構造および三次構造を維持するために完全か不完全かに従って領域を分類する。 周期的な二次構造（アルファーおよび３−１０らせん、平行および逆平行ベータ ーシート）に含まれることが知られる領域内の配列の存在は避けるべき領域であ る。同様にして、溶媒暴露の程度の低いことが観察される、あるいは予想される 、アミノ酸配列の領域は、いわゆるタンパク質の疎水性芯部の一部であろうと思 われるので、これもアミノ末端およびカルボキシル末端の選択に対して避けるべ きである。これとは著しく違って、表面旋回または輪の中にあることが知られる 、または予想される、領域、そしてとりわけ生物活性の発現に必要でないことが 分かっている領域は、ポリペプチド鎖の末端が位置するのに好適な部位である。 上 記基準に基づいて特に適当とされるアミノ酸配列の連続範囲は切断点領域と呼ぶ 。 更に他のペプチド配列も、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク 質（例えば、ポリーＨｉｓ）の精製または同定を容易にするために加えることが できる。特異的単クローン抗体による多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト タンパク質の迅速な検定と簡便な精製を可能にすると思われる高度に抗原性のペ プチドも加えることができる。 「変異体（ｍｕｔａｎｔ）アミノ酸配列」、「変異体（ｍｕｔａｎｔ）タンパ ク質」、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）タンパク質」、「ムレイン」、または「変 異体ポリペプチド」は、アミノ酸欠失、置換、またはその両方のために未変性配 列から変わったアミノ酸配列、あるいは未変性配列から内在的につくられた変異 体のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を有するポリペプチド を指す。「未変性（自然のままの）配列」とは、野生型あるいは天然型の遺伝子 またはタンパク質と同一のアミノ酸または核酸配列を指す。 造血成長因子は、ヒト造血始原細胞によるコロニー形成を促進する能力により 特徴づけることができる。生ずるコロニーには赤芽球、顆粒球、巨核球、顆粒球 マクロファージおよびそれらの混合が含まれる。造血成長因子の多くは、最初は 霊長類で、その後ヒトで実行された研究において、骨髄機能および末梢血球数を 治療上有益なレベルまで回復させる能力が実証された。造血成長因子のこれら生 物活性の多く、あるいはすべては信号の導入と高親和性レセプター結合を含む。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、単一因子と比較した とき、同じ位の、あるいは更に大きい生物活性を有するといった、あるいは半減 期の向上または不利な副作用の減少、あるいはこれら特性の併合を有することに よって、有用な特性を発揮できる。 アゴニスト活性を殆どあるいは全くもたない多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストは、拮抗物質として、免疫学または免疫療法への使用に供される抗体調 製用の抗原として、遺伝プローブとして、あるいは他の有用なｈＩＬ−３ムテイ ン（ｍｕｔｅｉｎ）をつくるために用いられる中間体として役立ちうる。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質の生物活性 は、因子依存性細胞系列におけるＤＮＡ合成により、あるいは容器内骨髄検定に おいてコロニー形成単位を数えることにより測定できる。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、作用が単一の造血アゴニ ストと比較して改善された治療プロフィルをもつ。例えば、本発明に係る若干の 多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、他の造血アゴニストと比較して類 似の、あるいはもっと強力な成長因子活性を有し、同様な、あるいは相応の、副 作用増加を有しない。 本発明は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質をコード化す るＤＮＡ配列、大体類似していて実質的に同じ機能を果すＤＮＡ配列、および本 発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化するＤＮＡとは 、遺伝暗号の縮重のためだけで相違するＤＮＡ配列をも包含する。また本発明に は、オリゴヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドおよび変異体ＤＮＡ を組み立てるために使われるオリゴヌクレオチド中間体も包含される。 現在この分野で標準の遺伝工学技術(米国特許第４，９３５，２３３号およびS ambrook等，"Molecular Cloning A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor L aboratory，1989)を本発明に係るＤＮＡ配列の構築に使用できる。一つのこのよ うな方法は、カセット変異誘発（Wells等，Gene 34:315-323，1985）であり、こ の場合プラスミド中の暗号配列の部分を、二つの制限部位の間の遺伝子の部分に 望むアミノ酸置換をコード化する合成オリゴヌクレオチドで置き換える。 望む遺伝子をコード化する相補的合成オリゴヌクレオチドの対をつくり、相互 にアニーリングすることができる。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、求める 遺伝子のアミノ酸に対する配列をコード化するが、ただし置換されたものおよび （または）配列から欠失したものを除く。 プラスミドＤＮＡは選ばれた制限エンドヌクレアーゼで処理し、次にアニーリ ングしたオリゴヌクレオチドに結合させることができる。結合した混合物を用い て適格なＪＭ１０１細胞を適当な抗生物質に対する耐性細胞へ変換できる。単一 コロニーを拾い、望む遺伝子をもつプラスミドを同定するために、制限分析およ び（または）ＤＮＡ配列決定によりプラスミドＤＮＡを調べることができる。 ＤＮＡ配列の少なくとも一つを他のコロニー促進因子のＤＮＡ配列で置き換え た新規多機能性造血アゴニストのＤＮＡ配列のクローン化は、中間ベクターの使 用により成し逐げられる。別法として、ある遺伝子を、他の遺伝子を含むベクタ ー中に直接クローン化することができる。ＤＮＡ配列を結合するために、また失 なわれた配列を置き換えるために、リンカーおよびアダプターを使用できるが、 この場合制限部位は対象領域に対して内部である。従って、一つのポリペプチド 、ぺプチドリンカー、および他のポリペプチドをコード化する遺伝物質（ＤＮＡ ）を、細菌、酵母、昆虫の細胞または哺乳動物細胞の変換に用いる適当な発現ベ クター中に挿入する。変換された有機体を増殖させ、タンパク質を標準技術によ り単離する。それ故に、生じた生成物は新しいタンパク質であって、リンカー領 域により第二のコロニー促進因子に結合されたコロニー促進因子をもつ。 本発明のもう一つの面は、これら新規多機能性キメラ造血レセプターアゴニス トの発現に使用するプラスミドＤＮＡベクターを提供することである。これらベ クターは、本発明に係る新規ペプチドをコード化する前記新規ＤＮＡ配列を含む 。多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを発現しうる微生物を変換すること のできる適当なベクターには、用いた宿主細胞に従って選ばれる転写および翻訳 の調節配列に結合された多機能性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化す るヌクレオチド配列からなる発現ベクターが含まれる。 前記の修飾配列を取り込むベクターは本発明に包含され、そして多機能性キメ ラ造血レセプターアゴニストポリペプチドの製造に役立つ。本法に用いられるベ クターはまた本発明に係るＤＮＡコード化配列と機能的に共同して選ばれた調節 配列を含み、このものは選ばれた宿主細胞中でその複製および発現を方向づけで きる。 本発明のもう一つの方向として、新規多機能性キメラ造血レセプターアゴニス トの製造法が提供される。本発明方法は、新規多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストの発現をコード化するＤＮＡ配列を含むべクターで変換された適当な細 胞または細胞系を培養するものである。適当な細胞あるいは細胞系は細菌の細胞 である。例えば、E．coliの株は、生物工学の分野でよく知られた宿主細胞であ る。このような株の例として、E．coli株JM101(Yanish-Perron等，Gene 33:103- 119，1985)およびMON105（Obukowicz等，Applied Environmental Microbiology 58:1511-1523，1992）が挙げられる。また、バクテリオファージ Mu（Weinberg等，Gene 126:25-33，1993）に基づいたE．coliに対する染色体発 現ベクターを利用する多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質の発 現も本発明に包含される。B.subtilisの種々な株も本法に使用できる。当業者に とって公知の酵母細胞の多くの株も、本発明ポリペプチドの発現に対する宿主細 胞として利用できる。E.coli細胞質で発現させたとき、本発明多機能性キメラ造 血レセプターアゴニストをコード化する遺伝子はまた遺伝子の５’末端にコドン を加えてタンパク質のＮ−末端のところにＭｅｔ-2−Ａｌａ-1あるいはＭｅｔ-1 をコード化するように構築できる。E．coliの細胞質つくられるタンパク質のＮ 末端は、発現時にメチオニンがＮ−末端から切除されるように、メチオニンアミ ノペプチダーゼによる(Ben Bassat等，J．Bac．169:751-757，1987)また多分他 のペプチダーゼによる翻訳後処理によって影響を受ける。本発明多機能性キメラ 造血レセプターアゴニストは、Ｎ−末端にＭｅｔ-1，Ａｌａ-1またはＭｅｔ-2− Ａｌａ-1を有する多機能性キメラ造血レセプターアゴニストペプチドを含みうる 。これら変異体多機能性キメラ造血レセプターアゴニストはまた分泌シグナルペ プチドをＮ−末端へ融合することによりE．coliで発現される。このシグナルペ プチドは分泌過程の一部としてポリペプチドから切断される。E．coliにおける 遺伝子の高レベル発現を成し遂げるための追加的戦略はSavvas，C．M．（Microb iological Reviews 60:512-538，1996）に見出される。 またチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような、哺乳動物細胞も 本発明への使用に適している。哺乳動物細胞における外来遺伝子の一般的発現方 法は、Kaufman，R．J.，1987）Genetic Engineering，Principles and Methods ，Vol．9，J．K．Setlow，editor，Plenum Press，New Yorkに論評されている。 哺乳動物細胞内で機能しうる強力なプロモーターが真核の分泌シグナルペプチド コード化領域の転写を推進する発現ベクターが構築される。前記領域は、多機能 性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化する領域へ翻訳的に結合される。 例えば、pc DNA I/Neo，pRc/RSU，およびpRc/CMV（Invitrogen Corp.,サン ジ ェゴ、カリフォルニア州から得られる）のようなプラスミドを使用できる。真核 分泌シグナルペプチドコード化領域は遺伝子そのものに由来してもよく、あるい は他の分泌哺乳動物タンパク質から得てもよい(Bayne，M．L．等，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 84:2638-2642，1987)。遺伝子を含むベクターの構築後、ベクタ ーＤＮＡを哺乳動物細胞中に移入する。このような細胞は、例えば、COS7，HeLa ，BHK，CHO、またはマウスＬ−系統でよい。これら細胞を、例えばＤＭＥＭ培地 （JRH Scientific）で培養できる。培地中に分泌されたポリペプチドは、細胞の 移入後あるいは抗生物質耐性に対する選択の後に安定な細胞系の確立後、２４− ７２時間の過渡的発現の後に、標準の生化学的方法により回収できる。適当な哺 乳動物宿主細胞の選択ならびに変換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物 の生産と精製はこの分野で公知である。例えば、Gething and Sambrook，Nature ，293:620-625，1981)、あるいは別法としてKaufman等，Mol．Cell．Biol.，5(7 ):1750-1759，1985）あるいはHowley等、米国特許第４，４１９，４４６号参照 。他の適当な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１細胞系である。同様に有用な哺乳 動物細胞系はＣＶ−１細胞系である。 望む場合には、本発明方法において、宿主細胞として昆虫細胞を利用できる。 例えば、Miller等，Genetic Engineering，8:277-298(Plenum Press 1986)およ びそこに引用された参考文献参照。更にまた、バキュロウィルスベクターを使用 する昆虫細胞での外来遺伝子の一般的発現法は、Summers，M．D.およびSmith，G ．E.，1987−バキュロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養手順の方法のマニュ アル、Texas Agricultunal Experiment Station Bulletin No．1555に記載され ている。バキュロウィルス伝達ベクターからなる発現ベクターを構築するが、こ の場合、強力なバキュロウィルスプロモーター（例えば、ポリヘドロンプロモー ター）が、真核分泌シグナルペプチドコード化領域の転写を推進する。該領域は 、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストポリペプチドをコード化する領域へ 翻訳的に結合される。例えば、プラスミドpVL 1392(Invitrogen Corp.，サンジ ェゴ、カリフォルニア州から得られる)を使用できる。多機能性キメラ造血レセ プターアゴニストポリペプチドをコード化する遺伝子を運ぶベクターの構築後、 このＤＮＡ２マイクログラムを、昆虫細胞、株ＳＦ９、中へ、バキュロウィルス ＤＮＡ（Summers & Smith，1987参照）１マイクログラムと共に同時移入する。 多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを運ぶ純粋な組換えバキュロウィルス を用いて、例えばExcell 401無血清培地（JRH Biosciences，Lenexa，カンサス 州）中で培養した細胞を感染させる。培地中に分泌された多機能性キメラ造血レ セプターアゴニストは、標準の生化学的方法で回収できる。多機能性キメラ造血 レセプターアゴニストタンパク質を発現する哺乳動物あるいは昆虫の細胞から得 た上澄は、最初幾つかの市販濃縮装置のいずれかを用いて濃縮できる。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、造血系統あるいはそれら の併合系統の背髄性、赤芽球性、リンパ系、あるいは巨核球の細胞の濃度減少に よって特徴づけられる疾患の治療に有用である。更に、これらアゴニストは、骨 髄性細胞および（または）リンパ系細胞の成熟を活性化するために使用できる。 本発明ポリペプチドによる治療を受けるのに適した症状には、白血球減少症があ る。この病気は末梢血液中の循環する白血球の数の減少である。白血球減少症は ある種のウィルスまたは放射線に対する暴露により誘発される。これは種々な形 式の癌療法、例えば化学療法剤、放射線に対する暴露、ならびに感染症や出血の 副作用であることが多い。本発明に係るこれら多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストによる白血球減少症の治療は、現在入手できる薬剤を用いる治療により 起こる望ましくない副作用を避けることができる。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、好中球減少症の治療に、 例えば無形成性貧血、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、チェディアッ ク・東症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、白血病、背髄形成異常症候群およ び骨髄線維症といった症状の治療に有用である。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、血小板減少症の治療また は予防に有用であろう。血小板減少症に対する現在唯一の治療法は血小板輸注で あり、この方法は経費が高く、感染（ＨＩＶ，ＨＢＶ）および同種免疫の重大な 危険をもたらす。本多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは血小板輸注の必 要性を軽減あるいは減少させることができる。遺伝的欠陥、例えばファンコニ貧 血、ウィスコット−アルドリッチ、あるいはメイヘグリン症候群から、重篤な血 小板減少症が起こることがある。後天性血小板減少症は、例えば免疫血小板減少 症紫斑病、全身性紅斑性狼瘡、溶血性貧血、あるいは胎児・母体間不適合におけ るように自己または同種抗体から起こることがある。更にまた、血小板減少症に おいては、脾腫大、汎発性血管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、人工心臓弁 の感染症が起こりうる。癌の化学療法および（または）放射線療法からも重篤な 血小板減少症が起こりうる。血小板減少症はまた癌、リンパ腫、白血病または線 維症による髄侵入からも起こりうる。 本発明に係る多機能キメラ造血レセプターアゴニストは、末梢血中の造血始原 細胞および幹細胞の起動に役立つ。末梢血由来の始原細胞は、自家髄移植の固定 の際、患者を再構成する場合に有効であることが示された。Ｇ−ＣＳＦおよびＧ Ｍ−ＣＳＦを含めて造血成長因子は、末梢血中の循環始原細胞および幹細胞の数 を高めることが示された。このことは末梢幹細胞収集のための操作を単純化し、 必要な成分除去の数を減らすことによって手順コストを劇的に引下げる。多機能 キメラ造血レセプターアゴニストは、幹細胞の起動に役立ち、末梢幹細胞移植の 効率を更に高めることができる。 本発明に係る多機能キメラ造血レセプターアゴニストは、造血前駆体および幹 細胞の生体外拡張にも役立つ。コロニー促進因子（ＣＳＦ）、例えばｈＩＬ−３ は、高用量化学療法後、しばしばこのような治療の結果として起こる好中球減少 症および血小板減少症を治療するために、単独で、他のＣＳＦと共同して、ある いは骨髄移植と併合して投与された。しかし、重篤な好中球減少症および血小板 減少症の期間は完全には除かれない。単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球 を含む）および巨核球からなる骨髄性系統は、生命をおびやかすことがある感染 症および出血の防止に重要である。好中球減少症および血小板減少症はまた病気 、遺伝的障害、薬物、毒素、放射線および従来からの腫瘍学療法といった多くの 療法処置の結果でもありうる。 骨髄移植がこの患者集団の治療に使用されて来た。しかし、骨髄の使用に関連 して、（１）骨髄、脾臓、または末梢血中の幹細胞の数が制限される、（２）移 植片対宿主病、（３）移植片拒絶、および（４）腫瘍細胞による可能な汚染を含 めて、妥協して処理した造血系を再構成するために幾つかの問題がある。幹細胞 は、骨髄、脾臓、および末梢血中の有核細胞の非常に小さい百分率を占める。よ り多数の幹細胞が造血回復を促進するような用量応答が存在する。従って、幹細 胞の容器内展開は造血の回復および患者の生存を高めるに違いない。同種間提供 者からの骨髄が移植用骨髄を得るために使用されて来た。しかし、ＨＬＡ適合同 胞提供者と受容者においても移植片対宿主病および移植片拒絶が骨髄移植を制限 している。同種間骨髄移植に代るものは、自家骨髄移植である。自家骨髄移植に おいては、患者自身の骨髄の若干を、骨髄切除療法、例えば、高用量化学療法、 に先立ち採取し、その後患者へ移植し戻す。自家移植片は、移植片対宿主病およ び移植片拒絶の危険を取り除く。しかし、自家骨髄移植は、髄中の幹細胞の数が 限られていることおよび腫瘍細胞による可能な汚染に関して依然問題を提出する 。幹細胞数の制約は幹細胞の生体外展開によって克服できる。その上、幹細胞は 、髄移植の腫瘍細胞汚染を減らすため、ＣＤ３４＋といった特異的表面抗原の存 在に基づき、幹細胞を特異的に単離できる。 下記特許は、幹細胞、ＣＤ３４＋細胞の分離、造血因子をもつ細胞の培養、造 血障害をもつ患者の処置に対する細胞の使用、および細胞拡張ならびに遺伝子治 療に対する造血因子の使用に関して、更に詳細事項を含んでいる。 ５，０６１，６２０は、特定の目的のための細胞から幹細胞を分離することに より提供されるヒト造血幹細胞からなる組成物に関する。 ５，１９９，９４２は、（１）患者から造血始原細胞を得；（２）ＩＬ−３、 ｆｌｔ３リガンド、ｃ−キットリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳ Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質およびこれらのコンビネーションからなる群から選 ばれる、成長因子をもつ細胞の生体外展開；（３）細胞製剤を患者へ投与する、 ことからなる自家造血細胞移植の方法を記載している。 ５，２４０，８５６は、細胞分離過程を自動的に制御するための装置を含む細 胞分別器に関する。 ＷＯ９１／１６１１６は、標的細胞を細胞混合物から選択的に単離し、分ける 装置および方法を記載している。 ＷＯ９１／１８９７２は、中空繊維バイオリアクターを使用して、骨髄細胞の 浮遊液をインキュベートすることによる、骨髄の容器内培養法を記載している。 ＷＯ９２／１８６１５は、サイトカインの特別な混合物を含む培地中で、移植 に用いるために、骨髄細胞を維持しかつ拡張する方法に関する。 ＷＯ９３／０８２６８は、（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞を他の細胞から分離し、（ ｂ）分離した細胞を選択的培地で、幹細胞が選択的に展開されるようにインキ ュベートするという工程からなる、幹細胞を選択的に展開する方法を記載してい る。 ＷＯ９３／１８１３６は、末梢血から誘導された哺乳動物細胞の容器内維持法 を記載している。 ＷＯ９３／１８６４８は、ヒト好中球前駆細胞を高含有量の骨髄芽球および前 骨髄球と共に含有してなり、そして遺伝的あるいは後天的な好中球減少症治療用 の組成物に関する。 ＷＯ９４／０８０３９は、ｃ−キットタンパク質を発現する細胞を選択するこ とにより、ヒト造血幹細胞を濃厚化する方法を記載している。 ＷＯ９４／１１４９３は、カウンターフロー傾しゃ法を用いて単離される幹細 胞集団（ＣＤ３４＋で、大きさは小である）を記載している。 ＷＯ９４／２７６９８は、不均一細胞混合物から核形成不均一細胞集団を選択 的に分離するための、イムノアフィニティー分離と連続流動遠心分離とを併合す る方法に関する。 ＷＯ９４／２５８４８は、標的細胞の収集および処理のための細胞分離装置を 記載している。 ＩＬ−１ａ，ＩＬ−３，ＩＬ−６あるいはＧＭ−ＣＳＦを含む培養中ヒト骨髄 から得られる造血始原細胞の高度に濃厚化されたＣＤ３４＋前駆体の長期培養が Brandt等，J．Clin．Invest．86:932-941，1990に議論されている。 本発明の一面は、幹細胞の選択的生体外展開のための方法を提供することにあ る。「幹細胞」という用語は、全能性造血幹細胞ならびに初期前駆体および始原 細胞を指し、これらは骨髄、脾臓または末梢血から単離できる。用語「展開」と は細胞の分化と増殖を指す。本発明は、幹細胞の選択的生体外展開のための方法 を提供するものであり、本法は（ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）前記 の分離された幹細胞を、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質（ 複数のことがある）を含む選択的培地で培養し、そして（ｃ）前記幹細胞を回収 する、という諸工程からなる。幹細胞、ならびに前駆細胞（始原細胞）（好中球 、赤血球、血小板などになるように運命づけられている）は、大抵の他の細胞か ら、これら細胞の表面上に存在するＣＤ３４といった個々の始原細胞マーカー 抗原の存否により、そして（または）形態学的特徴により区別できる。高度に濃 厚化されたヒト幹細胞フラクションの表現型は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋およ びｌｉｎ−と報告されているが、本発明はこの幹細胞集団の展開に制限されない 。ＣＤ３４＋に富むヒト幹細胞フラクションは、報告された幾つかの方法、例え ばＣＤ３４＋と云った表面抗原に対して向けられた抗体を使用するアフィニティ ーカラムまたはビーズ、磁気ビーズまたはフローサイトメトリー、により分離で きる。更にまた、カウンターフロー傾しゃ法といった物理的分離法を用いて造血 始原細胞を濃厚化することもできる。ＣＤ３４＋始原細胞は不均一であり、異な る系統に付随する細胞表面付着分子の共同発現の存否により特徴づけられた幾つ かの小集団に分割される。最も未成熟な始原細胞は、既知系統付随マーカー、例 えばＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ３８、を発原せず、ＣＤ９０（ｔｈｙ−１）を発原 するかも知れない。他の表面抗原、例えばＣＤ３３，ＣＤ３８，ＣＤ４１，ＣＤ ７１，ＨＬＡ−ＤＲまたはｃ−ｋｉｔも造血始原細胞を選択的に単離するために 使用できる。分離された細胞は、培養フラスコ、無菌バッグ中で、または中空繊 維中で、選ばれた培地でインキュベートできる。細胞を選択的に展開するために 、種々なコロニー促進因子を利用できる。骨髄の生体外展開に利用されて来た代 表的因子の例として、ｃ−ｋｉｔリガンド，ＩＬ−３，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳ Ｆ，ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−１１，ｆｌｔ−３リガンドまたはこれらのコン ビネーションが挙げられる。幹細胞の増殖は、幹細胞および他の細胞の数を、標 準技術（例えば、ヘマサイトメーター（hemacytometer）、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ ）により、あるいはインキュベーション前後でのフローサイトメトリーにより、 数えることによってモニターできる。 幹細胞の生体外展開の幾つかの方法において、種々なコロニー促進因子、例え ばｃ−ｋｉｔリガンド(Brandt等，Blood 83:1507-1514[1994]，McKenna等，Bloo d 86:3413-3420[1995])，IL-3(Brandt等，Blood 83:1507-1514[1994],Sato等，B lood 82:3600-3609[1993])，G-CSF(Sato等，Blood 82:3600-3609[1993])，GM-CS F(Sato等，Blood 82:3600-3609[1993])，IL-1(Muench等，Blood 81:3463-3473[1 993])，IL-6(Sato等，Blood 82:3600-3609[1993]),IL-11(Lemoli等，Exp．Hem． 21:1668-1672[1993]，Sato等，Blood 82:3600- 3609[1993])，flt-3リガンド（McKenna等，Blood 86:3413-3420[1995]）および （または）そのコンビネーション（Brandt等，Blood 83:1507-1514[1994],Haylo ck等,Blood 80:1405-1412[1992]，Koller等，Biotechnology 11:358-363[1993] ，(Lemoli等，Exp．Hem．21:1668-1672[1993])，McKenna等，Blood 86:3413-342 0[1995]，Muench等，Blood 81:3463-3473[1993]，Patchen等，Biotherapy 7:13- 26[1994]，Sato等，Blood 82:3600-3609[1993]，Smith等，Exp．Hem．21:870-87 7[1993]，Steen等，Stem Cells 12:214-224[1994],Tsujino等，Exp．Hem．21:13 79-1386[1993]）を使用する幾つかの選択法および展開を利用する方法が報告さ れた。個々のコロニー促進因子のうち、ｈＩＬ−３は末梢血ＣＤ３４＋細胞の展 開において最も強力な一つであることが示された(Sato等，Blood 82:3600-3609[ 1993]，Kobayashi等，Blood 73:1836-1841[1989])。しかし、単一因子は多重因 子のコンビネーションと同じ位有効であるとは示されなかった。本発明は、単一 因子単独よりも効果的な多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを利用する生 体外展開法を提供するものである。 本発明のもう一つの面は、培地を入れた培養容器中に細胞を接種することから なる造血前駆体細胞を維持しそして（または）展開する方法を提供することであ る。前記培地は、ストローマ細胞系、例えばＨＳ−５に暴露することにより整調 し（WO96/02662，Roecklein and Torok-Strob，Blood 85:997-1105，1995）そし て本発明多機能性造血キメラレセプターアゴニストで補充したものである。 また、本発明に係る多機能性造血キメラレセプターアゴニストの用途の中に血 液銀行業務の応用面があることも構想されている。この場合、ＥＰＯレセプター アゴニストを患者に与えて血球数を増加させ、ある医学的手順に先立ち患者から 血液生成物を取出す。この血液生成物を貯蔵し、医学的手続きの後患者に輸血し 戻す。更にまた、多機能性造血キメラレセプターアゴニストの用途の中に、血液 提供に先立ち、多機能性造血キメラレセプターアゴニストを血液提供者に投与し て血球数を増加させ、それによって提供者が一層多くの血液を安全に提供できる ようにするという利用法もあるであろう。 成長因子のもう一つの計画された臨床上の使用は、遺伝子治療のための造血前 駆体および幹細胞の容器内活性化にある。造血始原細胞は生存期間が長く、そし て身体全体に隈なくそれらの娘細胞が分布しているので、造血始原細胞は、生体 外遺伝子移入のための良い候補である。造血始原細胞または幹細胞のゲノム中に 関心のある遺伝子を取り込ませるためには、細胞***およびＤＮＡ複製を促進す る必要がある。造血幹細胞は非常に短い頻度で循環する。このことは、成長因子 が遺伝子導入の増進に役立ち、それによって遺伝子治療に対する臨床的期待が高 まることを意味する。遺伝子治療の可能性のある応用面(Crystal，Science 270: 404-410[1995]参照）の例として、（１）多くの先天的代謝障害および免疫不全 の治療(Kay and Woo，Trends Genet．10:253-257[1994])、（２）神経学的障害( Friedmann,Trends Genet．10:210-214[1994])、（３）癌（Culver and Blaese， Trends Genet．10:174-178[1994]）および（４）伝染病(Gilboa and Smith，Tre nds Genet．10:139-144[1994])が挙げられる。 遺伝物質を宿主細胞中に導入する、当業者にとって公知の幾つかの方法がある 。ウィルス性および非ウィルス性両方の幾つかのベクターが、治療用遺伝子を一 次細胞中に移すために開発された。ウィルスを基本とするベクターには（１）複 製不全組換えレトロウイルス(Boris-Lawrie and Temin，Curr．Opin．Genet．De v.3:102-109[1993]，Boris-Lawrie and Temin，Annal．New York Acad．Sci.716 :59-71[1994]，Miller，Current Top．Microbiol．Immunol．158:1-24[1992])お よび複製不全組換えアデノウィルス(Berkner，BioTechniques 6:616-629[1998] ，Berkner，Current Top．Microbiol．Immunol．158:39-66[1992],Brody and Cr ystal，Annal．New York Acad．Sci．716:90-103[1994]がある。非ウィルス基本 ベクターには、タンパク質／ＤＮＡ複合体(Cristiano等，PNAS USA．90:2122-21 26[1993]，Curiel等，PNAS USA 88:8850-8854[1991]，Curiel,Annal．New York Acad．Sci．716:36-58[1994])，エレクトロポレーションおよびリポソーム媒介 投与法、例えば陽イオン性リポソーム類(Farhood等，Annal.New York Acad．Sci ．716:23-35[1994])が包含される。 本発明は、改善された生物学的活性、例えば単一コロニー促進因子によっては 見られない活性、を有する多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質 を利用する方法を提供するという点において、新しい遺伝物質を導入した、造血 細胞を展開させる現行法の改良法を提供する。 多くの薬物は、骨髄抑制あるいは造血不全を起こすことがある。このような薬 物の例は、ＡＺＴ，ＤＤＬ、アルキル化剤および抗代謝産物（化学療法に使用さ れる）、抗生物質、例えばクロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル 、ダウノマイシンおよびサルファ剤、フェノチアゾン、トランキライザー、例え ばメプロバメート、鎮痛剤、例えばアミノピリンおよびジピロン、抗けいれん薬 、例えばフェニトインまたはカルバマゼピン、抗甲状腺薬、例えばプロピルチオ ウラシルおよびメチマゾールおよび利尿剤である。本発明に係る多機能性キメラ 造血レセプターアゴニストは、これら薬物で治療された患者にしばしば起こる骨 髄抑制または造血不全の防止または治療に有用である。 造血不全は、ウィルス、微生物、あるいは寄生虫による感染症の結果として、 また腎臓病あるいは腎臓不全に対する処置、例えば透析の結果としても起こりう る。本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、このような造血不全の 治療に有用である。 造血不全の治療法として、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを含む医 薬組成物の患者への投与がある。本発明多機能キメラ造血レセプターアゴニスト はまた、造血前駆細胞を患者に注射する前に、これら細胞を本発明多機能キメラ 造血レセプターアゴニストタンパク質で容器内処理することにより、造血前駆体 細胞の活性化と増幅を行なうためにも有用である。 例えば、Ｔおよび（または）Ｂリンパ球における種々な免疫不全、あるいは免 疫障害、例えば慢性関節リウマチ、も、本発明多機能キメラ造血レセプターアゴ ニストでの処置により有利な影響を受ける。免疫不全は、ウィルス感染症、例え ばＨＴＬＶＩ，ＨＴＬＶII，ＨＴＬＶIII、重い放射線暴露、癌療法の結果であ り、あるいは他の医学的処置の結果でもある。本発明多機能性キメラ造血レセプ ターアゴニストは、血小板減少症（血小板欠乏）、あるいは貧血を含めて、他の 血球欠乏症の治療に、単独で、または他のコロニー促進因子と併合して使用する こともできる。これら新規ポリペプチドに適した他の使用は、骨髄移植から回復 中の患者の生体内および生体外治療であり、また診断的あるいは治療的使用に向 けて標準法により発生させた単クローンおよび多クローン抗体の展開においてで ある。 本発明の他の面は、前述した諸症状の治療に向けての方法および治療組成物で ある。このような組成物は、治療上有効な量の一種以上の本発明多機能キメラ造 血レセプターアゴニストを製薬上容認しうる担体との混合物として含有する。こ の組成物は、非経口的に、静脈内に、または皮下に投与できる。本発明において 、使用に供される治療組成物を投与する場合には、発熱物質を含まない、非経口 的に容認できる水溶液の形をとるのがよい。このような非経口的に容認しうるタ ンパク質溶液の製造は、ｐＨ、等張性、安定性などを当然考慮した専門分野の裁 量内にある。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストのもう一つの意図した用途は 、免疫化に向けた補助剤として使用すべき、前駆体からの多数の樹枝状細胞の発 生に対してである。樹枝状細胞は免疫系において非常に重要な役割を演じている 。これらは休止Ｔ細胞の活性化に最も能率的に働く専門の抗原提供細胞であり、 生体内で単純なＴ細胞の活性化のための、従って一次免疫応答の開始のための主 要な抗原提供細胞である。これらは、腫瘍特異的溶性抗原（Ａｇ）を取り込み、 処理し、そして提供する。樹枝状細胞は、単純Ｔ細胞を密集させ、そして主要組 織適合性複合体（ＭＨＣ）および共同促進性分子の発現調節、サイトカインの産 生、およびリンパ器官に向かっての移動を早めることによりＡｇとの出会いに応 答する独特の能力をもつ。樹枝状細胞は、ＣＤ４−依存性免疫反応のための新生 抗原に対して宿主を感作するのに中心的重要性をもつので、これらはまた腫瘍免 疫の発生と調節に非常に重要な役割を演じている。 樹枝状細胞は顆粒球およびマクロファージに共通の骨髄ＣＤ３４＋前駆体に由 来し、純粋な樹枝状細胞コロニーを生ずる別個の樹枝状細胞コロニー形成単位（ ＣＦＵ−ＤＣ）の存在がヒトで確立されている。その上、ポスト−ＣＦＵＣＤ１ ４＋中間体が、明確なサイトカイン条件の下で樹枝状細胞あるいはマクロファー ジ経路に沿って分化する潜在能力について記述された。このビポテンシャル（bi potential）前駆体は、骨髄、臍帯血、および末梢血中に存在する。樹枝状細胞 は、培養樹枝状細胞の成熟を詳細に表わす特異的な細胞表面マーカー、例えばCD 1a+，CD3-，CD4-，CD20-,，CD40+，CD80+，およびCD83+に基づいて単離できる。 樹枝状細胞に基づく戦略は、腫瘍および感染作用因子に対する免疫応答を高め る方法を提供する。ＡＩＤＳは樹状細胞に基づく治療を使用できるもう一つの病 気である。それは、樹状細胞がＨＩＶ−１複製の増進に主要な役割を演じること ができるからである。免疫療法は、癌患者からの樹状細胞の誘発、外科的に取り 出された腫瘍塊から導かれる腫瘍Ａｇへの容器内暴露、および腫瘍患者へのこれ ら細胞の再注入を必要とする。腫瘍細胞の比較的粗製の膜調製物は、腫瘍抗原の 分子同定の必要性を避けて、腫瘍抗原の給源として十分であろう。腫瘍抗原はま た合成ペプチド、炭水化物、または核酸配列でもよい。更にまた本発明に係る多 機能性キメラ造血レセプターアゴニストのようなサイトカインの同時投与は、腫 瘍免疫の誘導を更に容易にすることができる。本発明多機能性キメラ造血レセプ ターアゴニストを、腫瘍患者へ他の造血成長因子と共に、あるいは単独で投与す ることにより、樹状細胞の数を増加させ、内因性腫瘍抗原を樹状細胞上に存在さ せるという免疫療法が生体内設定で可能であることが予測される。また、生体内 免疫療法は外因性抗原を用いても可能であるとする構想もある。また、免疫療法 治療は、本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを単独で、あるいは他 の造血成長因子と共に、患者へ投与し、患者から樹状細胞前駆体または成熟樹状 細胞を取り出し、樹状細胞を抗原に暴露し、そして樹状細胞を患者に戻すことに よる、樹状細胞前駆体あるいは成熟樹状細胞の起動を含みうることも構想される 。更にまた、取り出された樹状細胞を、本発明に係る多機能性キメラ造血レセプ ターアゴニスト単独と、あるいは他の造血成長因子と共に生体外培養して、抗原 への暴露に先立ち樹状細胞の数を増加させる。樹状細胞を基本とする戦略はまた 自己免疫疾患における免疫応答を減少させる方法も提供する。 樹状細胞に関する研究は、この細胞を十分な数で、また合理的に純粋な形で調 製する際の困難により著しく妨げられて来た。生体外細胞展開の設定においては 、顆粒球−マクロファージコロニー促進因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と腫瘍壊死因子− α（ＴＮＦ−α）とが、骨髄、臍帯血、または末梢血から回収された造血始原細 胞（ＣＤ３４＋細胞）からの樹状細胞の生体外誘発で共同し、ｆｌｋ−２／ｆｌ ｔ−３リガンドとｃ−ｋｉｔリガンド（幹細胞因子〔ＳＣＦ〕）が相乗作用する ことにより樹状細胞のＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ−α誘導発生を高める(Siena，S.等 Experimental Hematology 23:1463-1471，1995)。また、免疫療法に供するのに 十分量の樹状細胞を得るため、本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴ ニストを使用する樹状細胞前駆体または成熟樹状細胞の生体外展開法も提供され る。 前記症状の治療法に含まれる投薬計画は、薬剤の作用を変化させる種々な因子 、例えば患者の体調、体重、性別および食餌、感染の軽重、投与回数および他の 臨床的因子を考慮して主治医により決定されるであろう。一般に、一日計画は、 体重１キログラム当り多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質０． ２−１５０μｇ／ｋｇの範囲内でよい。投与量は、与えられた多機能性キメラ造 血レセプターアゴニストタンパク質の活性に関して調節されるであろうが、投与 計画は体重１キログラム当り０．１マイクログラム／日といった低用量および１ ミリグラム／日といった高用量を含みうることに注目しても不合理ではない筈で ある。更にまた、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの投与量を、体重１ キログラム当り０．２−１５０マイクログラムの範囲より高くも低くも調節すべ き特殊な環境が存在する。それらには、他のコロニー促進因子あるいは成長因子 のＩＬ−３変異体との共同投与；化学療法薬剤および（または）放射線との共同 投与；グリコシル化多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質の使用 ；および本明細書中で以前に述べた種々な特許関連刊行物が含まれる。前述した 通り、治療法および組成物は、他のヒト因子との共同投与も含みうる。本発明ポ リペプチドとの同時または連続，共同投与に供される他の適当なコロニー促進因 子（ＣＳＦ）、サイトカイン、リンホカイン、造血成長因子およびインターロイ キンα一覧（これだけに限らない）には、GM-CSF，G-CSF，c-mplリガンド(TPOま たはMGDFとしても知られる），M-CSF，エリトロポイエチン(EPO)，IL-1，IL-4,I L-2，IL-3，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13,IL-1 5，IL-16，LIF，f1t3/f1k2リガンド、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子及び 好酸性分化因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）（スチール因子またはｃ−ｋｉｔリガン ドとしても知られる）、あるいはこれらのコンビネーションが包含される。上記 投与量は、治療組成物中のこのような追加成分を補償するように調節されるであ ろう。治療を受ける患者の進行は血液学的プロフイルの定期的な評価、例えば血 球数計数などによりモニターできる。材料および方法 特に断らない限り、すべての特製化学薬品は、Sigma，Co．（セントルイス、 ＭＯ）から得た。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼはNew Engl and Biolabs（ベバーリイ、ＭＡ）またはBoehringer Mannheim（インディアナポ リス、ＩＮ）から得た。E.coli 株の転換 E.coli株、例えばＤＨ５ａTM(Llfe Technologies，Gaithersburg，MD)および ＴＧ１（Amersham Corp.，アーリントンハイツ、ＩＬ）を連結反応の転換に使用 し、また哺乳動物細胞移入のためのプラスミドＤＮＡ源とする。E.coli株、例え ばJM101(Yanisch-Perron,等，Gene，33:103-119，1985)およびMON105（Obukowic z，等，Appl．and Envir．Micr.,58:1511-1523，1992）を、細胞質または細胞周 辺腔において本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの発現に使用でき る。 MON105 ATCC#55204:F-，ラムダ-，IN(rrnD，rrE)1，rpoD+，rpoH358 DH5aTM:F-，phi80d1acZdeltaM15,デルタ(1acZYA-argF)U169，deoR，recAl,endAl ，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE441amda-，thi-1，gyrA96，re1A1 TG1:デルタ(lac-pro)，supE，thi-1，hsdD5/F’(traD36，proA+B，lacIq,lacZde ltaM15) JM101ATCC#33876:delta(pro lac)，supE，thi，F’(traD36，proA+B+，lacIq,la cZdeltaM15) ＤＨ５ａTMサブクローニング（Subcloning）能率細胞は応答能のある細胞とし て購入し、製造業者のプロトコールを用いてすぐ転換に供されるが、E.coli株Ｔ Ｇ１とＭＯＮ１０５は、両者共ＣａＣｌ2法を用いてＤＮＡを取り込む受容能を 付与するようにする。典型的には、２０から５０ｍｌの細胞をＬＢ培地（１％Ｂ ａｃｔｏ−トリプトン、０．５％Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、１５０ｍＭ ＮａＣ ｌ）中で、Baush & Lomb Spectronic分光光度計（Rochester，NY）によって測定 したとき、６００ナノメーターにおいて約１．０光学密度単位の密度まで増殖さ せた。細胞を遠心により集め、５分の１培養体積のＣａＣｌ2溶液（５０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．４）中に再浮遊させ、 ４℃に３０分保持した。細胞を再び遠心により集め、１０分の１培養体積のＣａ Ｃｌ2溶液中に再浮遊させた。連結ＤＮＡをこれら細胞０．２ｍｌへ加え、試料 を４℃で３０−６０分保持した。試料を４２℃に２分間移行させ、１．０ｍｌの ＬＢを加えた後試料を３７℃で１時間振盪した。これら試料からの細胞を、アム ピシリン耐性転換体を選別するときには、アムピシリン（１００マイクログラム ／ｍｌ、ｕｇ／ｍｌ）を、あるいはスペクチノマイシン耐性転換体を選別すると きには、スペクチノマイシン（７５ｕｇ／ｍｌ）を含むプレート（ＬＢ培地＋１ ．５％Ｂａｃｔｏ−寒天）上に広げる。プレートを３７℃で一晩インキュベート する。コロニーを拾い、ＬＢ＋適当な抗生物質（１００ｕｇ／ｍｌのアムピシリ ンまたは７５ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン）中に接種し、振りまぜながら３ ７℃で培養する。新しいＮ−末端／Ｃ−末端をもつ遺伝子の創作法 方法Ｉ．リンカー領域（Ｌ2）を含む新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子 の創作。 最初のＣ−末端とＮ−末端を隔てるリンカー領域（Ｌ2）を含む新しいＮ−末 端／Ｃ−末端をもつ遺伝子は、L．S．Mullins,等（J．Am．Chem．Soc．116,5529 -5533，1994）により述べられた方法に本質的に従ってつくられる。ポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の多段階を用いて、タンパク質の一次アミノ酸配列を コード化するＤＮＡ配列を再編成させる。これら工程を図２に示す。 最初の段階においては、最初のプライマーセット（「新しい出発点」および「 リンカー出発点」）を用いて、最初の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新し いＮ−末端部分、次いで最初のタンパク質のＣ−末端およびＮ−末端を連結する リンカー（Ｌ2）をコード化する配列を含むＤＮＡ断片（「断片出発点」）をつ くり出しそして増幅する。第二段階においては、二番目のプライマーセット（「 新しい停止点」および「リンカー停止点」）を用いて、最初の遺伝子配列から、 上で用いたと同じリンカー、次いで新しいタンパク質の新しいＣ−末端部分をコ ード化するＤＮＡ断片（断片停止点」）をつくり出し、そして増幅する。「新し い出発点」および「新しい停止点」プライマーは、新しい遺伝子を発現プラスミ ド中にクローン化させる適当な制御部位を含むうよに設計される。典型的 なＰＣＲ条件は、９５℃２分間融解１サイクル、９４℃１分間変性２５サイクル 、５０℃１分問アニーリング、そして７２℃１分間拡張；＋７２℃７分間拡張１ サイクルである。Perkin Elmer Gene Amp PCR Core試薬キットを用いる。１０ ０ｕｌの反応は、各プライマー１００ｐモルおよびテンプレートＤＮＡ１ｕｇ； および１×ＰＣＲ緩衝剤、２００ｕＭｄＧＴＰ，２００ｕＭｄＡＴＰ，２００ｕ ＭｄＴＴＰ，２００ｕＭｄＣＴＰ，２．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラ ーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡ熱サイ クラー（Perkin Elmer Corporation，ノルウォーク，CT）で実行する。 「断片出発点」および「断片停止点」は、リンカー領域に相補的配列を、そし てリンカーの両側に２個のアミノ酸をコード化する配列を有し、そして３番目の ＰＣＲ段階で互につなげられ新しいタンパク質をコード化する完全な長さの遺伝 子をつくる。ＤＮＡ断片「断片出発点」および「断片停止点」を１％ＴＡＥゲル 上で分解し、エチジウムブロマイドで染色し、Qiaex Gel Extractionキット（Qi agen）を用いて単離する。これら断片を等モル量ずつ合わせ、70℃で10分加熱し 、徐冷して「リンカー出発点」および「リンカー停止点」におけるこれらの共有 配列を経てアニールする。三番目のＰＣＲ段階においては、このアニールされた 断片へ、プライマー「新しい出発点」および「新しい停止点」を加えて完全な長 さの新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子をつくり出しそして増幅する。典型的なＰ ＣＲ条件は、９５℃２分間融解１サイクル；９４℃１分間変性、６０℃１分間ア ニーリングそして７２℃１分間拡張；＋７２℃７分間拡張１サイクルである。Pe rkin Elmer Gene Amp PCR Core試薬キットを用いる。１００ｕｌの反応は、各プ ライマー１００ｐモルおよび約０．５ｕｇのＤＮＡ；１×ＰＣＲ緩衝剤、２００ ｕＭｄＧＴＰ，２００ｕＭｄＡＴＰ，２００ｕＭｄＴＴＰ，２００ｕＭｄＣＴＰ ，２．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を 含む。ＰＣＲ反応物はWizard PCR Prepsキット（Promega）を用いて精製する。 方法II．リンカ-領域を有しない新規Ｎ−末端／Ｃ−末端をもつ遺伝子の創作。 最初のＮ−末端およびＣ−末端をつなぐリンカーを有しない新規Ｎ−末端／Ｃ −末端遺伝子は、ＰＣＲ増幅および平滑断端連結の二段階を用いてつくられる。 これら工程を図３に示す。最初の段階においては、プライマーセット（「新しい 出発点」および「Ｐ−ｂｌ出発点」）を用いて、最初の遺伝子配列から、新しい タンパク質の新しいＮ−末端部分をコード化する配列を含むＤＮＡ断片（「断片 出発点」）をつくり出し、そして増幅する。二番目の段階においては、プライマ ーセット（「新しい停止点」および「Ｐ−ｂｌ停止点」）を用いて、遺伝子配列 から、新しいタンパク質の新しいＣ−末端部分をコード化する配列を含むＤＮＡ 断片（「断片停止点」）をつくり出し、そして増幅する。「新しい出発点」およ び「新しい停止点」プライマーは、新しい遺伝子の発現ベクター中へのクローン 化を見込む適当な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、９ ５℃２分間融解１サイクル；９４℃１分間変性２５サイクル、５０℃４５秒間ア ニーリグおよび７２℃４５秒間拡張である。Deep Ventポリメラーゼ(New Englan d Biolabs)を用いて製造業者により推奨された条件におけるオーバーハングの発 生を減らす。「Ｐ−ｂｌ出発点」および「Ｐ−ｂｌ停止点」プライマーを、５’ 端のところでホスホリル化して「断片出発点」および「断片停止点」相互の後の 平滑断端連結を助ける。１００ｕｌ反応は、１５０ｐモルの各プライマーおよび １ｕｇの鋳型ＤＮＡ；および１×Vent緩衝剤(New England Biolabs)，３００ｕ ＭｄＧＴＰ，３００ｕＭｄＡＴＰ，３００ｕＭｄＴＴＰ，３００ｕＭｄＣＴＰ， および１単位Deep Ventポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡ 熱サイクラー（Perkin Elmer Corporation，ノルウォーク，CT）で実行する。Ｐ ＣＲ反応生成物はWizard PCR Prepsキット(Promega)を用いて精製する。 これらプライマーは、新しい遺伝子の発現ベクター中へのクローニングを見込 む適当な制限部位を含むように設計される。典型的には、「断片出発点」はＮｃ ｏＩ制限部位をつくり出すように設計され、「断片停止点」はＨｉｎｄIII制限 部位をつくり出すように設計される。制限消化反応物は、Magic DNA Clean-up S ystemキット(Promega)を用いて精製される。断片出発点および停止点を１％ＴＡ Ｅゲル上で分割し、エチジウムブロマイドで染色し、Qiaex Gel Extractionキッ ト（Qiagen）を用いて単離する。これら断片を合わせ、ｐＭＯＮ３９３４の〜３ ８００塩基対ＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄ・ベクター断片の両端へ、５０℃で１０分間加 熱することによりアニールし、徐冷する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Boehringer Mannheim)を使用して三つの断片を互に連結する。その結果、完全な長さの新し いＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を含むが得られる。連結反応物の一部を用いてE.co li株ＤＨ５α細胞を転換させる(Life Technologies Gaithersburg，MD)。プラス ミドＤＮＡを下記のように精製し、配列を確認する。 方法III．縦列重複法による新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子の創作 R.A.Horlick,等(Protein Eng．5:427-431，1992)に記載の方法に基づき新規Ｎ −末端／Ｃ−末端遺伝子をつくることができる。新規Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子 のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ−ＣＲ）増幅は、縦列に重複させた鋳型ＤＮＡを用 いて行なわれる。段階を図３に示す。 縦列重複鋳型ＤＮＡは、クローン化によりつくる。このものは遺伝子の２コピ ーの最初のＣ−末端およびＮ−末端を接続するリンカーをコード化するＤＮＡ配 列により分けられた遺伝子の２コピーを含む。特別なプライマーセットを用いて 、完全な長さの新規Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を、縦列に重複した鋳型ＤＮＡか らつくり出し、そして増幅する。、これらプライマーは新しい遺伝子の発現ベク ター中へのクローン化を見込む適当な制限部位を含むように設計される。典型的 なＰＣＲ条件は９５℃２分間融解１サイクル；９４℃１分間変性２５サイクル、 ５０℃１分間アニリーングおよび７２℃１分間拡張；＋７２℃７分間拡張１サイ クルである。Perkin Elmer Gene Amp PCR Core試薬キット(Perkin Elmer Corpor ation，ノルウォーク，CT)を使用する。１００ｕｌ反応は、各プライマー１００ ｐモルおよび鋳型ＤＮＡ１ｕｇ；および１×ＰＣＲ緩衝剤、２００ｕＭｄＧＴＰ ，２００ｕＭｄＡＴＰ、２００ｕＭｄＴＴＰ，２００ｕＭｄＣＴＰ，２．５単位 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む。ＰＣ Ｒ反応はモデル４８ＯＤＮＡ熱サイクラー(Perkin Elmer Corporation，ノルウ ォーク，CT)で実行する。ＰＣＲ反応物はWizard PCR Prepsキット(Promega)を用 いて精製する。新規Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子の多機能性レセプターアゴニスト発現ベクター中 へのクローニング 新規Ｎ−末端/c−末端遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼで消化して末端をつ くり出す。これら末端は他のコロニー促進因子遺伝子を含む発現ベクター中へ の挿入に適合しうる。この発現ベクターも同様に制限エンドヌクレアーゼで消化 され、適合性末端を形成する。精製後、遺伝子およびベクターＤＮＡを合わせ、 Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。この連結反応の一部を用いてE.coliを 転換する。プラスミドＤＮＡを精製し、配列して正しい挿入を確証する。正確な クローンをタンパク質発現のため培養する。ＤＮＡの単離および特徴づけ プラスミドＤＮΛは、幾つかの異なる方法により、そして当業者にとって公知 の市販キットを用いて単離できる。少数のこのような方法をここに示す。プラス ミドＤＮＡは、Promega Wizard1Miniprepキット(マジソン，WI)，Qiazen QIAwel lプラスミド単離キット（Chatsworth，CA）またはQiagen Plasmid Midiキットを 用いることにより単離される。これらキットは、プラスミドＤＮＡ単離に対する 方法と同じ一般手順に従う。手短かに言えば、細胞を遠心（５０００×ｇ）によ りペレット化し、連続ＮａＯＨ／酸処理でプラスミドＤＮＡを解放し、細胞破片 を遠心（１００００×ｇ）により除く。上澄（プラスミドＤＮＡを含む）を、Ｄ ＮＡ−結合性樹脂を含むカラム上に充填し、カラムを洗浄し、プラスミドＤＮＡ をＴＥで溶出する。対象とするプラスミドを含むコロニーについてスクリーング の後、E.coli細胞をＬＢ＋適当な抗生物質５０〜１００ｍｌ中に接種し、振盪し ながらエアーインキュベーター中３７℃で一晩培養する。精製されたプラスミド ＤＮＡを用いてＤＮＡ配列化、更に制限酵素消化、ＤＮＡ断片の追加的サブクロ ーニング、および哺乳動物細胞E.coliまたは他の細胞中への移入に供する。配列の確認 精製プラスミドＤＮＡをｄＨ2Ｏ中に再浮遊させ、Bausch and Lomb Spectroni c 601UV分光計で、２６０／２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定 量する。配列を決める混合物へ５％ＤＭＳＯを添加することにより通常修飾され る製造者の示唆したプロトコルに従い、ABI PRISMTMDyeDeoxyTMターミネーター 配列化学(Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation，Lincol n City，CA)キット（Part Number 401388または402078）を用いてＤＮＡ試料の 配列を決める。配列決定の反応は、モデル４８０ＤＮＡ熱 サイクラー(Perkin Elmer Corporation，ノルウォーク，CT)を用い推奨された増 幅条件に従って実行する。試料をcentvi-sepTMスピンカラム(Princeton Separat ions，アデルフィア，NJ)で精製して過剰の色素ターミネーターを除去し、凍結 乾燥する。蛍光色素標識した配列決定反応物を脱イオンホルムアミド中に再浮遊 させ、ＡＢＩモデル,３７３Ａ自動化ＤＮＡシーケンサーを使用して変性４．７ ５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル上で配列決定する。重複するＤＮＡ配列 断片を分析し、Sequencher DNA分析ソフトウェア(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)を使用してマスターＤＮＡコンチグス(contigs)に組み込む。哺乳動物細胞における多機能性レセプターアゴニストの発現 哺乳動物細胞移入／条件を整えた培地の調製 ＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ）からＢＨＫ−２１細胞系を得ることができる。 ２ｍＭ（ｍＭ）Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補なった Dulbecco修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ／高−グルコース）中で細胞を培養する。 この組成物をＢＨＫ増殖培地と呼ぶ。選択培地は、４５３単位／ｍｌのハイドロ マイシンＢ（Calbiochem，サンジェゴ，CA）で補なったＢＨＫ増殖培地である。 ＢＨＫ−２１細胞系は、プラスミドｐＭＯＮ３３５９上に見出されたＩＥ１１０ プロモーターをトランス活性化するＨＳＶトランス活性タンパク質ＶＰ１６で前 以て安定に移入された(Hippenmeyer等，Bio/Technology，1037-1041頁，1993参 照)。ＶＰ１６タンパク質は、ＩＥ１１０プロモーターの後に挿入された遺伝子 の発現を推進する。トランス活性化タンパク質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ−２１ 細胞はＢＨＫ−ＶＰ１６と称される。プラスミドｐＭＯＮ１１１８(Highkin等， Poultry Sci.，70:970-981，1991)は、ＳＶ４０プロモーターからハイグロマイ シン耐性遺伝子を発現する。同様なプラスミドはＡＴＣＣ，ｐＳＶ２−ｈｐｈか ら入手できる。 ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞を６０ミリメートル（ｍｍ）の組織培養皿中に細胞３× １０5個／皿の量で移入２４時間前に接種する。対象遺伝子を含むプラスミドＤ ＮＡ１０ｕｇ、ハイグロマイシン耐性プラスミド３ｕｇ，ｐＭＯＮ１１１８，お よびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ」TM８０ｕｇ／皿を含 む３ｍｌの「ＯＰＴＩＭＥＭ」TM(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)中で細胞を16 時間移入する。その後培地を吸引し、３ｍ１の増殖培地と置き換えた。移入後４ ８時間で、各皿から培地を集め、活性について検定した（仮の整調培地）。細胞 をトリプシン−ＥＤＴＡにより皿から取り出し、１：１０に希釈し、１０ｍｌの 選択培地を含む１００ｍｍ組織培養皿に移す。選択培地中に約７日後、耐性細胞 は直径数ミリメートルのコロニーに育つ。これらコロニーを濾紙（コロニーとほ ぼ同じ寸法に切り、トリプシン／ＥＤＴＡに浸した）で皿から取り出し、１ｍｌ の選択培地を含む２４穴プレートの各穴に移した。コロニーを融合するまで発育 させた後、整調した培地を再検定し、陽性クローンを増殖培地中に展開させた。E.coli における多機能性レセプターアゴニストの発現 対象プラスミドを含むE.coli株ＭＯＮ１０５またはＪＭ１０１を、Ｍ９＋カザ ミノ酸培地中、New Brunswick Scientific（Edison，ニュージャージー）から得 られるエアーインキュベーターＭｏｄｅｌ Ｇ２５で振盪しつつ３７℃で増殖さ せる。増殖を、それが１．０の値に達するまでＯＤ６００でモニターし、この時 点で０．１Ｎ ＮａＯＨ中ナリジキシン酸（１０ミリグラム／ｍｌ）を５０μｇ ／ｍｌの最終濃度まで加える。次に培養を３７度で更に３から４時間振盪する。 培養期間中、望む遺伝子生成物の産生を最高にするために、培養中に隈なく高度 の通気を維持する。細胞を光学顕微鏡下で封入体（ＩＢ）の存在について検査す る。培養の１ｍｌ部分を取り出し、ペレット化細胞を煮沸し、それらを還元性緩 衝剤および電気泳動を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを経由して処理することによりタ ンパク質含量の分析に供する(Maniatis等，Molecular Cloning:A Laboratory Mo nual，1982)。培養を遠心して（５０００×ｇ）細胞をペレット化する。封入体調製、抽出、リフォールディング、透析、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、 ならびにE.coli中に封入体として集積する多機能性キメラ造血レセプターアゴニ ストの特性表示 封入体の単離： ３３０ｍｌ E.coli培養から得た細胞ペレットを、１５ｍｌの超音波処理緩衝 液（１０ｍＭ２−アミノ−２−（ビドロキシメチル）１，３−プロパンジオール 塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ），ｐＨ８．０＋１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅ ＤＴＡ）に再浮遊させる。これら再浮遊細胞を、Sonicator Cell Disruptor（Mo del W-375，Heat-Systems-Ultrasonics，Inc.，ファーミングデール，ニューヨ ーク）のミクロチッププロ・−ブを使用して超音波処理する。超音波処理緩衝液 中の三ラウンドの超音波処理とそれに続く遠心を用いて細胞を粉砕し、封入体（ ＩＢ）を洗浄する。超音波処理の最初のラウンドは３分のバースト、次いで１分 のバースト、および最終二ラウンドの超音波処理は各１分間である。 封入体ペレットから得られるタンパク質の抽出およびリフォールデイング： 最後の遠心工程の後、ＩＢペレットを１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ９．５，８Ｍ尿素および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中に再浮遊 させ、室温で約４５分かきまぜて発現タンパク質を変性させる。 抽出溶液を７０ｍｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５および２．３Ｍ 尿素を含むビーカーへ移し、おだやかにかきまぜながら４℃の空気に１８から４ ８時間暴露してタンパク質をリフォールディングさせる。リフォールディングを 、Vydac（Hesperia，Ca.）C18逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ Ｃ）カラム(０．４６×２５ｃｍ）上での分析によりモニターする。０．１％ト リフクオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む４０％から６５％アセトニトリルの直線勾配を 用いてリフォールドをモニターする。この勾配を３０分にわたり１．５ｍｌ／分 の流速で展開する。一般に変性タンパク質はリフォールドタンパク質よりも遅れ て勾配中に溶出する。 精製： リフォールドに続いて、汚染E.coliタンパク質を酸沈殿により除く。リフォー ルド溶液のｐＨは、１５％（ｖ／ｖ）酢酸（ＨＯＡｃ）を用いることによりｐＨ ５．０からｐＨ５．２に滴定された。この溶液を４℃で２時間かきまぜ、次に１ ２，０００×ｇで２０分遠心して不溶タンパク質をペレット化する。 酸沈殿段階から生じた上澄を、３，５００ドルトンの分子量カットオフ（ＭＷ ＣＯ）を有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３膜を用いて透析する。この透析は、計 １８時間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０の４１（５０倍過剰）２回 交換に対して行なう。透析は試料の伝導性を低下させ、ＤＥＡＥクロマトグラフ ィーに先立ち尿素を除く。次に試料を遠心して（１２，０００×ｇで２０分）、 透析後の不溶タンパク質をペレット化する。 イオン交換クロマトグラフィーに対してはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−Ｓｃａｌ ｅ ＤＥＡＥ２ カラム（７×５２ｍｍ）を用いる。カラムは、平衡化緩衝液中 に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、および０から５００ｍＭ塩化ナト リウム（ＮａＣｌ）勾配を含む緩衝液中で平衡化させ、４５カラム容以上を用い てタンパク質を溶出する。実験操作中ずっと１．０ｍｌ／分の流速を用いる。勾 配を横切ってカラム分画（２．０ｍｌ／分画）を集め、Vydac（Hesperia，Ca.） C18カラム（０．４６×２５ｃｍ）上のＲＰ ＨＰＬＣにより分析する。０．１ ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む４０％から６５％の直線勾配を用いる。こ の勾配を３０分にわたり１．５ｍｌ／分の流速で展開する。次に、集めた分画を 、１０ｍＭ酢酸アンモニウムＮＨ4Ａｃ），ｐＨ４．０の４１（５０〜５００倍 過剰）２回交換に対して透析する。透析は３，５００ドルトンのＭＷＣＯをもつ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３膜を用いて行なう。最後に０．２２μｍシリンジフィ ルター（μＳｔａｒ ＬＢシリンジフィルター、ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、 Ｍａ．）を用いて試料を無菌濾過し、４℃で貯蔵する。 ある場合には、折たたまれたタンパク質を、適当なマトリックスに付けたｍＡ ｂｓまたはレセプターサブユニットのようなアフィニティー試薬を用いてアフィ ニティー精製できる。別法として（あるいは更に）、各種クロマトグラフィー法 、例えばイオン交換、ゲル濾過あるいは疎水性クロマトグラフィーまたは逆相Ｈ ＰＬＣ、のいずれかを用いて精製をなし遂げることができる。 これらおよび他のタンパク質精製法は、Methods in Enzymology，Volume 182 ｀Guide to Protein Purification'Murray編Deutscher，Academic Press，San D iego，CA（1990）に詳述されている。 タンパク質特性表示： 精製されたタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレー質量分析、お よびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。タンパク質定量はアミノ酸組成、ＲＰ− ＨＰＬＣ、およびブラッドフォードタンパク質定量によりなされる。ある場合に は、トリプシンペプチド地図作成を、エレクトロスプレー質量分析と共に実施す ることによりタンパク質の実体を確認する。生物活性ヒトインターロイキン−３に対するＡＭＬ増殖検定法 因子依存性細胞系AML 193をAmerican Type Culture Collection（ATCC，ロッ クビル，MD）から得た。これら細胞系は、急性骨髄性白血病をもつ患者から確立 されたもので、成長因子依存性細胞系であり、ＧＭ−ＣＳＦ添加培地で高い増殖 を示した。(Lange，B.，等，Blood 70:192，1987；Valtieri，M.，等，J.Immuno l．138:4042，1987)。ＡＭＬ１９３細胞がヒトＩＬ−３の存在下で増殖する能力 を詳しく報じられた(Santoli，D.，等，J．Immunol．139:348，1987)。細胞系変 異体ＡＭＬ１９３ １．３が使用された。これは、成長因子を洗い流し、サイト カイン依存性ＡＭＬ１９３細胞を成長因子に対して飢餓状態に２４時間置くこと によりＩＬ−３で長期培養に適合させた。次に細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ− ３を含む培地中２４ウェルプレートで、１×１０5個細胞／ウェルの量で再塗布 する。細胞をＩＬ−３中で迅速に増殖させるために約２７か月かかった。これら 細胞を、ＡＭＬ１９３ １．３として、その後組織培養培地（下記参照）をヒト ＩＬ−３で補填することにより維持した。 ＡＭＬ１９３ １．３細胞は、細胞浮遊液を２５０×ｇで１０分間遠心し、次 いで上澄をデカンテーションすることにより、冷ハンクス液（HBSS，Gibco,Gran d Island,NY）で６回洗浄した。ペレット化細胞をＨＢＳＳ中に再浮遊させ、６ 回の洗浄サイクルが終るまでこの手順を繰り返す。この手順で６回洗浄した細胞 を、組織培養培地中に、生存能のある細胞２×5から５×１０5個／ｍｌにわたる 密度で再浮遊させた。この培地はIscove'ｓ修飾Dulbecco's培地(IMDM,Hazelton ，Lenexa，KS)をアルブミン、トランスフェリン、脂質および２−メルカプトエ タノールで補うことにより調製される。ウシアルブミン（Boehringer-Mannheim, インジアナポリス，IN）を５００μｇ／ｍｌで加え；ヒトトランスフェリン(Boe hringer-Mannheim，インジアナポリス，IN)を１００μｇ／ｍｌで加え；ダイズ 脂質(Boehringer-Mannheim，インジアナポリス，IN)を５０μｇ／ｍｌで加え； そして２−メルカプトエタノール(Sigma，セントルイス，MO)を５×１０-5Ｍで 加える。 ヒトインターロイキン−３あるいは多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト タンパク質の連続希釈液を、９６ウェルＣｏｓｔａｒ３５９６組織培養プレート で、上記のように補なった組織培養培地中で三重系列としてつくる。各ウェルは 、連続希釈が終了したとき、インターロイキン−３あるいは多機能性キメラ造血 レセプターアゴニストタンパク質を含有する培地５０μｌを含んだ。対照ウェル は組織培養培地単独（負の対照）を含んだ。各ウェルへ、上記のように調製した ＡＭＬ１９３ １．３細胞浮遊液を、各ウェル中に５０μｌ（２．５×１０4個 細胞）をピペットで採ることにより加える。組織培養プレートを３７℃で、加湿 空気中５％ＣＯ2を用いて３日間インキュベートする。３日目に、５０μｌの組 織培養培地中に、０．５μＣｉ 3Ｈ−チミジン（２Ｃｉ／ｍＭ，New England N uclear,ボストン，MA）を加える。培養を加湿空気中５％ＣＯ2を用いて３７℃で １８−２４時間インキュベートする。水洗サイクル次いで７０％エタノール洗浄 サイクルを利用したＴＯＭＴＥＣ細胞ハーベスター（ＴＯＭＴＥＣ，Ｏｒａｎｇ ｅ，ＣＴ）を使用することにより、細胞ＤＮＡをガラスフィルターマット(Pharm acia LKB，Gaithersburg，MD)上に採る。フィルターマットを風乾し、次に試料 バッグ中に入れ、これへシンチレーション液(ScintiverseII，Fisher Scientifi c，St．Louis，MOまたはBetaplate Scintillation Fluid，Pharmacia LKB，Gait hersburg，MD)を加える。個々の組織培養ウェルから生ずる試料のベーター線放 出を、ＬＫＢ ＢｅｔａＰｌａｔｅモデル１２０５シンチレーションカウンター (Pharmacia LKB，Gaithersburg，MD)で計数し、データを各組織培養ウェルから 細胞中に取り込まれた3Ｈ−チミジンのカウント／分として表わす。各ヒトイン ターロイキン−３製剤または多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク 質製剤の活性は、インターロイキン−３または多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストの勾配をつけた濃度により誘発される細胞増殖（3Ｈ−チミジン取り込 み）を測定することにより定量される。典型的には、０．０５ｐＭ−１０5ｐＭ の濃度範囲がこれら検定で定量される。インターロイキン−３または多機能性キ メラ造血レセプターアゴニストタンパク質の用量を測ることにより活性を決定す る。前記用量は、最大増殖の５０％を与える量（ＥＣ50）であり、これは０．５ ×（試験したインターロイキン−３のあらゆる濃度の三重の培養のうち、１ウェ ル当り取り込まれた3Ｈ−チミジンの最大平均カウント数／分−イ ンターロイキン−３を欠いた三重の培養に観察された3Ｈ−チミジン取り込みに より測ったバックグランド増殖）に等しい。このＥＣ50値はまた生物活性１単位 と等価である。どの検定も相対活性レベル帰属できるように比較の標準として自 然のままのインターロイキン−３を用いて実施される。 典型的には、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質を、系列の ２倍希釈で滴定された２０００ｐＭから０．０６ｐＭの濃度範囲で試験した。 各試料に対する活性は、データに四−パラメーターロジステイックモデルを適 合させることにより、最大応答の５０％を与える濃度により決定される。試料に 対する上方安定期（最大応答）および比較の標準が異ならなかったことが観察さ れた。従って、各試料に対する相対的効力計算は、試料に対するＥＣ50計算およ び上に示された標準から決定された。ＡＭＬ１９３．１．３細胞はｈＩＬ−３、 ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｈＧ−ＣＳＦに応答して増殖する。従って、下記の追加検 定は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質のＧ−ＣＳＦレセプ ターアゴニスト部分が活性であることを実証するために、幾つかの試料について 実行した。増殖検定は、ｈＩＬ−３レセプターアゴニスト部分へ中和性単クロー ン抗体を加えたり、差引いたりした、多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト を用いて実行した。更に、因子Ｘａ切断部位をもつ融合分子を開裂させ、次に精 製し、分子の半分を増殖活性について検定した。これらの実験は、多機能性キメ ラ造血レセプターアゴニストタンパク質の両成分とも活性であることを示した。ＴＦ１ ｃ−ｍｐｌリガンド依存性増殖検定 ｃ−ｍｐｌリガンド増殖活性は、多能性ヒト細胞系ＴＦ１(Kitamura等，J.Cel l Physiol 140:323-334[1989])サブクローンを用いて検定できる。ＴＦ１細胞は ｈ−ＩＬ３（１００Ｕ／ｍｌ）に保たれている。ｃ−ｍｐｌリガンドに応答する サブ−クローンを確定するため、ｃ−ｍｐｌリガンドの１−１５３形を発現する 遺伝子で移入されたＢＨＫ細胞から得られる１０％上澄を含む継代培地に細胞を 保持する（ｐＭＯＮ２６４４８）。細胞の大部分は死ぬが、細胞のサブセットは 生き残る。希釈クローン化後、ｃ−ｍｐｌリガンド応答クローンを選び、これら 細胞を、検定設定の前田こ、継代培地へ０．３×１０6個細胞／ｍｌの密度に分 ける。これら細胞に対する継代培地は次の通りである：ＲＰＭＩ１６４０ （Ｇｉｂｃｏ），１０％ＦＢＳ（Ｈａｒｌａｎ，ロット＃９１２０６），移入Ｂ ＨＫ細胞からの１０％ｃ−ｍｐｌリガンド上澄、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００ｕｇ／ｍｌペニ シリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）。翌日、細胞を採取し、ＲＰＭＩま たはＩＭＤＭ培地中で２回洗浄し、最後にＡＴＬまたは検定培地中で洗浄する。 ＡＴＬ培地は下記成分からなる：ＡＴＬ１０００ｍｌ当り、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃ ｏ）、５００ｕｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１００ｕｇ／ｍｌヒトトランスフ ェリン、５０ｕｇ／ｍｌダイズ脂質、４×１０−８Ｍベーターメルカプトエタノ ールおよび２ｍｌＡ９９０９（Ｓｉｇｍａ，抗生物質溶液）。細胞を、９６ウェ ル低蒸発プレート（Ｃｏｓｔａｒ）で、検定培地中、最終密度０．２５×１０6 個細胞／ｍｌに（最終体積５０ｕｌ）希釈する。移入クローンからの一時上澄（ 整調培地）を、５０ｕｌの体積で、二重試料として最終濃度５０％で加え、最終 的希釈１．８％まで３倍に希釈する。１ｎｇ／ｍｌから出発し、３倍希釈を用い て０．００１４ｎｇ／ｍｌに希釈したＩＬ−３変異体ｐＭＯＮ１３２８８の用量 曲線の三重試料を正の対照として含める。プレートを５％ＣＯ2、３７℃でイン キュベートする。培養６日目に、０．５Ｃｉの３Ｈ／ウェル（ＮＥＮ）で２０ｕ ｌ／ウェルの体積でプレートを短時間標識し、５％ＣＯ2、３７℃で４時間イン キュベートする。プレートを回収し、Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンターでカウント する。ＭＵＴＺ−２細胞増殖検定 ヒト骨髄性白血病細胞系のＭＵＴＺ−２といった細胞系(German Collection o f Microorganisms and Cell Cultures，DSM ACC 271)を用いて、ｆｌｔ３レセプ ターアゴニストの細胞増殖活性を測定する。ＭＵＴＺ−２培養は、増殖培地中に 組換え未変性ｆｌｔ３リガンド（２０−１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて保持する。 検定の設定１８時間前に、ＭＵＴＺ−２細胞をＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で３ 回洗浄し、ＩＭＤＭ培地単独中に０．５−０．７×１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で 再浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートしてｆｌｔ３リガンドの細胞 を飢餓状態にする。検定の日、標準およびｆｌｔ３レセプターアゴニストを、無 菌の組織培養処理９６ウェルプレートで、検定培地中望む最終濃度の２倍より上 まで希釈する。ｆｌｔ３レセプターアゴニストおよび標準を三重に試験する。Ａ 列を除きすべてのウェルに５０μｌの検定培地を入れる。７５μｌのｆｌｔ３レ セプターアゴニストまたは標準をＡ列へ加え、この列から２５μｌを採り、プレ ートの残り（Ｂ列からＧ列まで）について連続希釈（１：３）を行なう。Ｈ列は 培地だけの対照として残す。飢餓状態にしたＭＵＴＺ−２細胞をＩＭＤＭ培地で ２回洗浄し、５０μｌの検定培地中に再浮遊させた。各ウェルへ５０μｌの細胞 を加えると、最終濃度０．２５×１０Ｅ６細胞／ｍｌになる。細胞を含む検定プ レートを３７℃、５％ＣＯ2で４４時問インキュベートする。次に各ウェルを、 ２０μｌの体積中トリチル化チミジン１μＣｉ／ウェルで４時間標識する。次に プレートを回収し、カウントする。他の容器内（インビトロ）細胞ベース増殖検定 当業者にとって公知の、他の容器内細胞ベース検定法もまた、ＡＭＬ１９３． １．３細胞増殖検定に記載の方法と同様にして、分子からなる因子により、多機 能性キメラ造血レセプターアゴニストの活性を測定するために有であるかも知れ ない。下記は他の有用な検定法の例である。 ＴＦ１増殖検定：ＴＦ１はｈＩＬ−３に相当する多能性ヒト細胞系である(Kit amura等，J．Cell Physiol 140:323-334[1989])。 ３２Ｄ増殖検定：３２ＤはマウスＩＬ−３依存性細胞系で、ヒトＩＬ−３には 相当しないが、制限種でないヒトＧ−ＣＳＦに相当する。 Ｂａｆ／３増殖検定：Ｂａｆ／３はマウスＩＬ−３依存性細胞系であり、ヒト ＩＬ−３またはヒトｃ−ｍｐｌリガンドには相当しないが、制限種でないヒトＧ −ＣＳＦに相当する。 Ｔ１１６５増殖検定：Ｔ１１６５はＩＬ−６依存性マウス細胞系（Ｎｏｒｄａ ｎ等、１９８６）であり、ＩＬ−６およびＩＬ−１１に相当する。ヒト血漿クロ ットｍｅｇ−ＣＳＦ検定：巨核球コロニー形成活性の検定に使用（Ｍａｚｕｒ等 、１９８１）。移入細胞系 ： マウスＢａｆ／３細胞系といった細胞系は、この細胞系が有しないコロニー促 進因子レセプター、例えばヒトＧ−ＣＳＦレセプターあるいはヒトｃ−ｍｐｌレ セプターを用いて移入することができる。これら移入された細胞系は、そのレセ プターが細胞系に移入されたリガンドの活性を測定するために使用できる。 一つのこのような移入Ｂａｆ／３細胞系は、ｃ−ｍｐｌ応答細胞系からつくら れ、そしてプラスミドｐｃＤＮＡ３の多数のクローン化部位中にクローン化され たライブラリーからｃ−ｍｐｌをコード化するＣＤＮＡをクローン化することに よりつくられた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンジェゴ Ｃａ．）。Ｂａｆ／３細 胞をエレクトロポレーションによりプラスミドで移入した。細胞をマウスＩＬ− ３の存在下、Ｗｅｈｉ整調培地中でＧ４１８選択下に培養した。クローンは限定 希釈により確立された。 同様にして、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターをＢａｆ／３細胞系に移入することが でき、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの生物活性の決定に使用できる 。ｃ−ｍｐｌリガンド増殖活性の分析 方法 １．骨髄増殖検定 ａ．ＣＤ３４＋細胞精製： 正常な同種間髄提供者から、告知に基づく同意後、骨髄吸引物（１５−２０ｍ ｌ）を得た。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で希釈 （１：３）し、３０ｍｌを１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇ ｍａ）上に重層し、３００ＲＣＦで３０分遠心した。単核界面層を集め、ＰＢＳ で洗浄した。ＣＤ３４＋細胞を、単核細胞調製物から、製造業者の説明書(CellP ro，Inc.，Bothell WA)に従いアフィニティーカラムを用いて濃縮した。濃厚化 の後、フローサイトメトリー分析を用いてＣＤ３４＋細胞の純度を測定したとこ ろ平均７０％であった。この分析はフイコエリトリンに複合したフルオレセイン および抗−ＣＤ３８に結合させた抗ＣＤ３４単クローン抗体を使用する(Bector Dickinson，サンジョーズ，CA)。 細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（Bio-Whittaker，ウォーカーズビル，MD）中に ４０，０００個細胞／ｍｌで再浮遊させ、１ｍｌを１２−ウェル組織培養プレー ト（Ｃｏｓｔａｒ）に塗布した。成長因子ｒｈＩＬ−３を１００ｎｇ／ｍｌで加 え（ｐＭＯＮ５８７３）を若干のウェルに加えた。ｈＩＬ３変異体は１０ｎｇ／ ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌで用いた。ｃ−ｍｐｌリガンドまたは多機能性キメラ 造血レセプターアゴニストをコード化するプラスミドで移入したＢＨＫ細胞から 得た調整培地を、培養（およそ１０％希釈）１ｍｌへ加えた上澄１００μｌの添 加により試験した。細胞を３７℃加湿インキュベーター中５％ＣＯ2において、 ８−１４日間３７℃でインキュベートした。 ｂ．細胞採取と分析： 培養期間の終りに、各条件に対する全細胞数を得た。蛍光分析および倍数性決 定のため、細胞を巨核細胞緩衝液（ＭＫ緩衝液、１３．６ｍＭクエン酸ナトリウ ム、１ｍＭテオフィリン、２．２μｍ ＰＧＥ１、１１ｍＭグルコース、３％ｗ ／ｖ ＢＳＡ、ＢＳＡ中、ｐＨ７．４）（Tomer等，Blood 70:1735-1742,1987） 中で洗浄し、抗−ＣＤ４１ａＦＩＴＣ抗体を含むＭＫ緩衝液（１：２００）ＡＭ ＡＣ、ウエストブルック、ＭＥ）５００μｌに再浮遊させ、ＭＫ緩衝液中で洗浄 した。ＤＮＡ分析のため、細胞を０．５％Tween 20(Fisher，Fair Lawn NJ)を含 むＭＫ緩衝液中で氷上２０分間透過性を上げ、次いで０．５％Tween−２０およ び１％パラホルムアルデヒド(Fisher Chemical)中で３０分固定し、次いで５５ ％ｖ／ｖＭＫ緩衝液（２００ｍＯｓｍ）中ＲＮＡ−アーゼ（４００Ｕ／ｍｌ）を 含むプロピジウムヨーダイド（Calbiochem，La Jolla Ca）（５０μｇ／ｍｌ） 中氷上で１−２時間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳｃａｎまたはＶａ ｎｔａｇｅフローサイトメーター（Bacton Dickinson，サンジョーズ，CA）で分 析した。緑の蛍光（ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ）を、赤の蛍光（ＰＩ）に対する線形 および対数信号と共に集め、ＤＮＡ倍数性を決定した。全細胞を集めてＣＤ４１ ＋である細胞のパーセントを決定した。ＬＹＳＩＳ（Becton Dickinson,サンジ ョーズ，CA）によるソフトウェアを用いてデータ分析を実行した。ＣＤ４１抗原 を発現する細胞のパーセントは、フローサイトメトリー分析（パーセント）から 得た。ＣＤ４１＋細胞／ｍｌの絶対（Ａｂｓ）数は、 （Ａｂｓ）＝（細胞カウント）*（パーセント）／１００ により計算した。 ２．巨核細胞繊維素血餅検定 高ＣＤ３４＋集団を前記のように単離した。細胞を２５，０００個細胞／ｍｌ の密度で、サイトカイン（複数のことがある）と共に、あるいは無しに、基本Ｉ ｓｃｏｖｅｓ ＩＭＤＭ培地を０．３％ＢＳＡ、０．４ｍｇ／ｍｌ ａｐｏ−ト ランスフェリン、６．６７μＭ ＦｅＣｌ2、２５μｇ／ｍｌＣａＣｌ2、２５μ ｇ／ｍｌ Ｌ−アスパラギン、５００μｇ／ｍｌ ｅ−アミノ−ｎ−カプロン酸 およびペニシリン／ストレプトマイシンで補なった培地中に浮遊させた。３５ｍ ｍプレート中に塗布する前にトロンビンを加えて（０．２５単位／ｍｌ）血餅形 成を開始させた。細胞を３７℃加湿インキュベーター中５％ＣＯ2で１３日間３ ７℃でインキュベートし．た。この培養期間の終りに、プレートをメタノール： アセトン（１：３）で固定し、風乾し、−２００℃で染色まで貯蔵した。ペルオ キシダーゼ免疫細胞化学染色法を使用し（Zymed，Histostain-SP．サンフランシ スコ，CA）、これに抗−ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２およびＣＤ６１からなる一次単ク ローン抗体のカクテルを用いた。染色後コロニーを数え、陰性、ＣＦＵ−ＭＫ（ 小さいコロニー、フォーカス１−２個、そして約２５細胞未満）、ＢＦＵ−ＭＫ （大きい、多フォーカスコロニー、細胞２５個＜を含む）あるいは混合コロニー （陽性および陰性細胞の混合物）として分類した。メチルセルロース検定 この検定法は、コロニー促進因子が正常な骨髄細胞を刺激して容器内で種々な 型の造血コロニーをつくる能力を反映している(Bradley等，Aust．Exp Biol.Sci ．44:287-300，1966)，Pluznik等，J．Cell Comp．Physio 66:319-324,1965)。 方法 約３０ｍｌの新鮮、正常、健康な骨髄吸引物を、告知に基づく同意後の個人か ら得る。無菌条件下で、試料を、５０ｍｌ円錐形チューブ（＃２５３３９−５０ Corning，Corning MD)中 １×ＰＢＳ（＃１４０４０．０５９ Life Technolog ies，Gaithersburg,MD.）溶液で希釈する（１：５）。希釈試料下にフィコール （Histopaque 1077 Sigma H-8889）を重層し、３０分遠心した（３００×ｇ）。 単核細胞帯を除き、１×ＰＢＳ中で２回、１％ＢＳＡ ＰＢＳ(Cellpro Co.，Bo thel，WA)で１回洗浄した。単核細胞を数え、ＣＤ３４＋細胞を、Ceprate LC（C D34）kit（Cellpro Co.，Bothel，WA）カラムを用いて選ぶ。 この分別を実行するのは、骨髄内のすべての幹細胞および始原細胞がＣＤ３４表 面抗原を示すからである。 培養を三重に設定する。３５×１０ｍｍペトリ皿（Ｎｕｎｃ＃１７４９２６） 中で最終体積１．０ｍｌとした。培養培地はTerry Fox Labs．（Hcc-4230培地(T erryFoxLabs，Vancouver，B．C.，カナダ）から購入し、この培地へエリトロポ イエチン（Amgen，Thousand Oaks，CA.）を加える。３，０００−１０，０００ ＣＤ３４＋細胞／皿を加える。哺乳動物細胞またはE.coliから精製した組換え ＩＬ−３、および多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質（移入哺 乳動物細胞から得た調整培地中、あるいは移入哺乳動物細胞またはE.coliから得 た調整培地から精製）を加えて．００１ｎＭから１０ｎＭにわたる最終濃度を得 る。組換えｈＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦ，ｃ−ｍｐｌリガンドおよび多機能キメラ 造血レセプターアゴニストは社内で供給された。G-CSF(Newpogen)はAmgen（Thou sand Oaks Calf.）から得た。３ｃｃシリンジを用いて培養を再浮遊させ、１． ０ｍｌ／皿ずつ分与する。対照（ベースライン応答）培養にはコロニー促進因子 を与えなかった。正の対照培養は調整培地を用いる（ＰＨＡ促進ヒト細胞：Terr y Fox Lab．H2400)。培養を加湿空気中３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートする 。細胞５０個より多いと規定される造血コロニーは、４０×対物コンビネーショ ンを具えたNikonインバーテッド フェーズ（inverted phase）顕微鏡を使用し て、ピーク応答の日（１０−１１日）に数える。５０個より少ない細胞を含む細 胞グループはクラススターと呼ぶ。他方、コロニーはそれらをスライド上に広げ そして染色することにより同定でき、あるいはこれらを拾い出し、再浮遊させ、 染色のためシトスピンスライド上に吐出してもよい。ヒト臍帯血造血成長因子検定 造血コロニー促進因子（ＣＳＦ）活性の容器内検定に対しては、過髄細胞が伝 統的に使用される。しかし、ヒトの骨髄は常に入手できるとは限らず、そして提 供者間で相当な変動がある。臍帯血は、造血幹細胞および前駆体の給源として骨 髄に匹敵しうる(Broxmeyer等，PNAS USA 89:4109-113，1992；Mayani等，Blood 81:3252-3258，1993)。骨髄とは著しく異なり、臍帯血は常時入手容易である。 また、数人の提供者から新しく得られた細胞を溜めておくことにより検定の変り 易さを減少させること、あるいはこの目的のために低温保存された細胞バンクを つくり出すことの可能性もある。培養条件を調節することにより、そして（また は）系特異的マーカーについて分析することにより、顆粒球／マクロファージコ ロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）について、巨核細胞ＣＳＦ活性について、あるいは高増 殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）活性について特異的に検定することが 可能である。 方法 単核細胞（ＭＮＣ）を、標準密度勾配（１，０７７ｇ／ｍｌ Histopaque）を使 用して、採取２４時間以内に臍帯血から単離する。臍帯血ＭＮＣを、幾つかの手 順、例えばＣＤ１４−，ＣＤ３４＋細胞に対しては免疫電磁（immunomagnetic） 選択；ＳＢＡ−，ＣＤ３４＋画分に対しては、Applied Immune Science(Santacl ara，CA)から得られる被覆フラスコを用いるパンニング（panning）；およびCel lpro（Bothell，WA）アビジンカラムを用いるＣＤ３４＋選択、により幹細胞お よび前駆体について更に濃縮した。新しく単離したか、または低温保存したＣＤ ３４＋細胞に富む画分を検定に用いる。試料の各系列希釈（濃度範囲１ｐＭから １２０４ｐＭ）に対する二重培養を、追加成長因子無しに０．９％メチルセルロ ースを含む培地１ｍｌ中に１×１０4個の細胞を用いて調製する（Stem Cell Tec hnologies，Vancouver，BC.から得られるMethocult H4230）。ある実験において は、Methocult H4230、または幹細胞因子（ＳＣＦ）、の代りに、エリトロポイ エチン（ＥＰＯ）を含むMethocult H4330（５０ｎｇ／ｍｌ）(Biosource Intern ational，Camarillo，CA)を加えた。７−９日間の培養後、＞３０個の細胞を含 むコロニーを数えた。評点記録において、主観的な偏向を除くため、検定を盲目 評点記録した。 変異体をつくり出すために、そしてそれらを細菌、哺乳動物細胞または昆虫細 胞で発現させるために使用できる組換えＤＮＡ法、求めるたんぱく質の精製およ びリフォールディング、ならびにタンパク質の生物活性を決定する検定法につい てのこれ以上の詳細は、同時提出特許願WO 95/00646，WO 94/12639，WO 94/1263 8，WO 95/20976，WO 95/21197，WO 95/20977，WO 95/21254およびUS 08/383，03 5に見出すことができ、これらは参考として全体的に取り入れている。 当業者にとって公知の更に詳細事項は、T．Maniatis,等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)，およびその中 に引用された参考文献（参考としてここに取り入れている）；ならびにJ.Sambro ok，等，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harb or Laboratory，1989)およびその中に引用された参考文献（参考としてここに取 り入れている）に見出すことができる。 以下の例は本発明をより詳細に例示するが、本発明は決してこれらの具体例に 限定されるものではないことを理解されたい。例１ 親ＢＨＫ発現ベクターの作成 Ａ．哺乳動物発現プラスミドからのＡｆ１III部位の除去 ｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３１４６（ＷＯ９１／１２６３８）遺 伝子およびマウスＩｇＧ２ｂリンカー断片のフレーム内および３’にＮｃｏＩ− ＨｉｎｄIIIまたはＡｆ１III−ＨｉｎｄIII遺伝子断片を受け入れるために、新 しい哺乳動物発現ベクターを作成した。まず第１に、単一のＡｆ１III部位を、 ｐＭＯＮ３９３４（これは、ｐＭＯＮ３３５９の誘導体である）から除去した。 ｐＭＯＮ３３５９は、哺乳動物発現カセットを含むｐＵＣ１８ベースのベクター である。このカセットは、その後ろに修飾ヒトＩＬ−３シグナルペプチド配列と ＳＶ４０後期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナル（これは、ｐＵＣ１８ポ リリンカー中にサブクローニングされている）を有する単純ヘルペスウイルスプ ロモーターＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）である（ヒッペンマイアー（Ｈｉ ｐｐｅｎｍｅｙｅｒ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，ｐｐ．１ ０３７−１０４１を参照）。細胞の外への遺伝子産物の分泌を促進する修飾ヒト ＩＬ−３シグナル配列は、その両側に５’末端にＢａｍＨＩ部位と３’末端にユ ニークなＮｃｏＩ部位が存在する。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を 、以下に示す（制限酵素部位を上に示す）。Ｎｃｏｉ部位内のＡＴＧ（メチオニ ン）部位は、シグナルペプチドのイニシエーターＡＴＧのフレーム内にある（下 線を引いてある）： Ａｆ１IIIで消化して単一のＡｆ１IIIを除去し、ＤＮＡポリメラーゼとヌクレ オチドを加えてオーバーハングを充填した。消化したＤＮＡ断片を、マジック ＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｇｉｃ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い て連結した。連結反応物をＤＨ５α（登録商標）に形質転換し、細胞をＬＢ寒天 ＋アンピシリンに広げた。Ａｆ１IIIとＨｉｎｄIIIを用いる制限解析により、個 々のコロニーをＡｆ１III部位の喪失についてスクリーニングすると、Ａｆ１III 部位が除去されている場合は単一の断片を得られた。得られたプラスミドをｐＭ ＯＮ３０２７５と名付けた。 Ｂ．ｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６／ＩｇＧ２ｂカセットのｐ ＭＯＮ３０２７５への転移 ｐＭＯＮ３０２４５からのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片（約４２５塩基対）を 、ｐＭＯＮ３０２７５のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片（約３８００塩基対）に連 結した。ｐＭＯＮ３０２４５（ＷＯ９４／１２６３８）は、マウスＩｇＧ２ｂヒ ンジ断片に結合 したｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６をコードする遺伝子を含有 する。ＩｇＧ２ｂヒンジのすぐ３’とＨｉｎｄIII部位の５’は、Ａｆ１III部位 である。遺伝子は、ｈＩＬ−３変種ｐＭＯＮ１３４１６／ＩｇＧ２ｂヒンジと同 じフレーム内にあるＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片またはＡｆ１III−ＨｉｎｄIII 断片としてＡｆ１III−ＨｉｎｄIII部位中にクローン化して、新規のキメラを作 成することができる。ＮｃｏＩ部位とＡｆ１III部位は適合性のあるオーバーハ ングを有し、連結するであろうが、認識部位はなくなっている。マウスＩｇＧ２ ｂヒンジ領域に結合したｐＭＯＮ１３４１６を有するｈＩＬ−３変種をコードす る、（配列番号１）のＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３０３０４は、 このクローニングの結果であった。例２ ダイマー鋳型のｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）遺伝子の１つのコピーを含有 する中間体プラスミドの作成 後ろにユニークなＥｃｏＲＩ認識部位が続くｃ−ｍｐｌ（１−１５３）リガン ドのコード配列を有するプラスミドＤＮＡを作成するために逆転写酵素／ポリメ ラーゼチェイン反応（ＲＴ／ＰＣＲ）により遺伝子を単離する。ｃ−ｍｐｌリガ ンドメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の供給源について、ヒト胎児（ロット＃ ３８１３０）および成人肝（ロット＃４６０１８）Ａ＋ＲＮＡは、クロンテク（ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（パロアルト、カリホルニア州）から得られる。第１の鎖の ｃＤＮＡ反応は、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）（サンジエゴ、カリ ホルニア州）から得られるｃＤＮＡサイクル（登録商標）キット（ｃＤＮＡ Ｃ ｙｃｌｅTM Ｋｉｔ）を使用して行う。ＲＴ反応において、ランダムプライマー とオリゴｄＴプライマーを使用して、ヒトおよび胎児肝ｍＲＮＡの組合せからｃ ＤＮＡを作成する。アミノ酸１−１５３をコードするｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子 断片について、ＲＴ産物は、前進プライマー：ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号３ １７）と逆プライマー：Ｅｃｏｍｐｌのプライマーの組合せとともに、前駆体の 鋳型として作用する。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩプライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンド遺 伝子（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号＃３３４１０またはデ・サ ウバジ（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５３３−５３８（ １９９４））にアニーリングし、ｃ−ｍｐｌリガンドの第１コドン（Ｓｅｒ＋１ ）のすぐ５’にＮｃｏＩ制限酵素部位をコードする。ＮｃｏＩ制限酵素部位は、 Ｓｅｒ＋１の前のメチオニンとアラニンコドンをコードし、Ａｌａコドンとｃ− ｍｐｌリガンドの最初の４つのコドン（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）およびＰｒｏ ）のコドン縮重を有する。Ｅｃｏｍｐｌプライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンドの塩 基＃７２０−７３７にアニーリングし、Ａｒｇ−１５３のすぐ後のｃ−ｍｐｌリ ガンド遺伝子と同じフレーム内のＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）をコードする 。ＥｃｏＲＩ部位は、Ａｒｇ−１５３の後ろにＧｌｕとＰｈｅを作成する。約４ ８０塩基対のＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＭＯＮ３ ９９３（約４５５０塩基対）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩベクター断片に連結した。 ｐＭＯＮ３９９３は、ｐＭＯＮ３３５９（例１に記載）の誘導体である。ＩＥ１ １０プロモーターとｐｏｌｙ−Ａシグナルの間のユニークなＢａｍＨＩ部位とし てサブクローニングしたヒトＩＬ−３シグナルペプチド配列は、その３’末端に ＮｃｏＩ部位を有し、後ろにユニークなＥｃｏＲＩ部位が続く。ｃ−ｍｐｌリガ ンドアミノ酸１−１５３（配列番号４６７）をコードする、（配列番号２）のＤ ＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ２６４５８は、このクローニングの 結果であった。例３ ダイマー鋳型の第２の遺伝子を含有する親プラスミドの作成 アミノ酸１（Ｓｅｒ）で開始し、アミノ酸１５３（Ａｒｇ）の後ろに終止コド ンを有するｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子断片の増幅のために、例２からのＲＴ反応 物は、以下のプライマーの組合せを有するＰＣＲの鋳型として機能する：ｃ−ｍ ｐｌＮｃｏＩ（配列番号３１７）（前進プライマー）およびｃ−ｍｐｌＨｉｎｄ III（配列番号３１９）（逆プライマー）。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号３１ ７）は例２に記載されている。ｃ−ｍｐｌリガンドの塩基＃７１６−７３７にア ニーリングするｃ−ｍｐｌＨｉｎdIII（配列番号３１９）は、最終コドンＡｒｇ153 のすぐ後ろに終止コドンとＨｉｎｄIII制限酵素を付加する。 ＲＴ ｃＤＮＡ試料から２種類のＰＣＲ産物が作成され、１つはアミノ酸１１ ２−１１５のコドンが欠失し、１つはこれらのコードの欠失は無い。哺乳動物発 現ベクターｐＭＯＮ３９３４への転移のために、ｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ産物 （約４８０塩基対）をＮｃｏＩとＨｉｎｄIII制限酵素で消化する。ｐＭＯＮ３ ９３４は、ＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化され（約３８００塩基対）、ＰＣＲ産 物を受け入れるであろう。 ｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１−１５３（配列番号５４６）をコードするプラ スミドｐＭＯＮ３２１３２（配列番号８４）は、このクローニングの結果であっ た。ｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１−１５３（配列番号５４８）をコードするプ ラスミドｐＭＯＮ３２１３４（配列番号８６）は、このクローニングの結果であ った。コドン１１２−１１５の欠失（Δ１１２−１１５）を有するｃ−ｍｐｌリ ガンドアミノ酸１−１５３（配列番号５４７）をコードするプラスミドｐＭＯＮ ３２１３３（配列番号８５）は、このクローニングの結果であった。例４ 第２のｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子中に１１２−１１５欠失を有するＰＣＲダイマ ー鋳型５Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３３（アミノ酸１１２−１１５の欠失を有する）の１キロ塩基対のＮｃ ｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１III ５Ｌ合成オリゴヌクレオチドリ ンカー５Ｌ−５’（配列番号３２２）と５Ｌ−３’（配列番号３２３）とともに して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンカーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３３のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも連結により保持されないであろう。ｐＭ ＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３３のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するであ ろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５４８はこのクローニングの結果であり、Ｇｌｕ ＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号７８３）リンカーを介して、アミノ 酸１１２−１１５（配列番号４６８）の欠失を含有するアミノ酸１−１５３ｃ− ｍｐｌリガンドに融合したアミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする （配列番号３）のＤＮＡ配列を含有する。例５ ＰＣＲダイマー鋳型４Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１ III ４Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー４Ｌ−５’（配列番号３２０）と４Ｌ −３’（配列番号３２１）とともに連結して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを 作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンガーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも連結により保持されないであろう。ｐＭ ＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するであ ろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５００はこのクローニングの結果であり、Ｇｌｕ ＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号２２３）リンカー（４Ｌ）を 介して、アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４６９）に融合した アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする（配列番号４）のＤＮＡ配 列を含有する。例６ ＰＣＲダイマー鋳型５Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１ III ５Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー５Ｌ−５’（配列番号３２２）と５Ｌ −３’（配列番号３２３）とともに連結して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを 作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンカーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも、連結により保持されないであろう。ｐ ＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するで あろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５０１はこのクローニングの結果であり、Ｇｌ ｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号７８３）リンカー（５Ｌ）を介し て、アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４７０）に融合したアミ ノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする（配列番号４）のＤＮＡ配列を 含有する。 例７ＰＣＲダイマー鋳型８Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３４の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１ III ８Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー８Ｌ−５’（配列番号３２２）と８Ｌ −３’（配列番号３２３）とともに連結して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを 作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンカーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３４のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも、連結により保持されないであろう。ｐ ＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３４のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するで あろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５０２はこのクローニングの結果であり、Ｇｌ ｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号２２４ ）リンカー（８Ｌ）を介して、アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列 番号４７１）に融合したアミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする（ 配列番号６）のＤＮＡ配列を含有する。例８〜４４ 新しいＮ−末端とＣ−末端を有する新規ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の作成 Ａ．新規ｃ−ｍｐｌリガンド受容体アゴニストをコードする遺伝子のＰＣＲ作成 方法III（ホーリック（Ｈｏｒｌｉｃｋ）ら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．５：４２７ −４３３，１９９２）を使用して、ｃ−ｍｐｌリガンド受容体アゴニストを作成 した。ダイマー鋳型、ｐＭＯＮ２８５００、２８５０１、２８５０２または２８ ５４８と、下記の合成プライマーセットの１つを使用してＰＣＲ反応を行なった （最初の数字は、元々の配列中の最初のアミノ酸の位置を示す。例えば３１−５ ’と３１−３’は、元々の配列の残基３１に対応するコドンで始まる配列につい て、それぞれ５’および３’プライマーを意味する。）。 ３１−５’（配列番号３２６）と３１−３’（配列番号３２７）、３５−５’ （配列番号３２８）と３５−３’（配列番号３２９）、３９−５’（配列番号３ ３０）と３９−３’（配列番号３３１）、４３−５’（配列番号３３２）と４３ −３’（配列番号３３３）、４５−５’（配列番号３３４）と４５−３’（配列 番号３３５）、４９−５’（配列番号３３６）と４９−３’（配列番号３３７） 、８２−５’（配列番号３３８）と８２−３’（配列番号３３９）、１０９−５ ’（配列番号３４０）と１０９−３’（配列番号３４１）、１１５−５’（配列 番号３４２）と１１５−３’（配列番号３４３）、１２０−５’（配列番号３４ ４）と１２０−３’（配列番号３４５）、１２３−５’（配列番号３４６）と１ ２３−３’（配列番号３４７）、１２６−５’（配列番号３４８）と１２６−３ ’（配列番号３４９）。 ＰＣＲ反応に使用される鋳型とオリゴヌクレオチドセットを表４に示す。作成 した生成物は約４８０塩基対であり、マジックＰＣＲクリーンアップキット（Ｍ ａｇｉｃ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ）を用いて精製した。 Ｂ．キメラの作成のための哺乳動物発現ベクターへの新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴ ニスト遺伝子のサブクローニング ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト遺伝子ＰＣＲ産物を、哺乳動物発現ベクターへの 転移のために、ＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIまたはＡｆ１IIIとＨｉｎｄIII制限酵素 （約４７０塩基対）で消化した。発現ベクターｐＭＯＮ３０３０４を、ＮｃｏＩ とＨｉｎｄIII（約４２００塩基対）で消化し、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ−Ｈｉｎ ｄIIIまたはＡｆ１III−ＨｉｎｄIII断片として受け入れる。ＰＣＲ産物の制限 消化物と得られるプラスミドを表４に示す。 例４５ ｐＭＯＮ１５９６０の作成 新しいＮ−末端とＣ−末端を有する、Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17をコードするＤＮ Ａ配列を含有するプラスミドを作成するための中間体プラスミドｐＭＯＮ１５９ ６０の作成。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（エー・シー・ワイ・チャン（Ｃｈａ ｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．）とエス・エヌ・コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）Ｊ．Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６，１９７８）ＤＮＡを、制限酵 素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで消化して、３０９２塩基対の塩基対ＨｉｎｄIII、 ＢａｍＨＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３０３７（ＷＯ９５／２１２５４ ）ＤＮＡをＢｇｌIIとＦｓｐＩで消化して、６１６塩基対のＢｇｌII、ＦｓｐＩ 断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３０３７ＤＮＡの第２の試料をＮｃｏＩとＨ ｉｎｄIIIで消化して、５５６塩基対のＮｃｏＩ、ＨｉｎｄIII断片を得た。合成 ＤＮＡオリゴヌクレオチド１ＧＧＧＳｆｏｒ（配列番号３８０）と１ＧＧＧＳｒ ｅｖ（配列番号３８１）を互いにアニーリングし、次にＡｆ１IIIとＦｓｐＩで 消化して、２１塩基対のＡｆ１III、ＦｓｐＩ断片を得た。制限断片を連結し、 連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形 質転換した。形質転換体細菌を、アンピシリン含有プレート で選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析して正しい挿入体 を確認した。例４６ ｐＭＯＮ１５９８１の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９８１の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド３８終止点（配列番 号３６９）と３９開始点（配列番号３６８）をプライマーとして使用するＰＣＲ 反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した。増 幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対のＨｉ ｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨｉｎ ｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片を 得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシリ ン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析し て正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９８１は、以下のアミノ酸 配列をコードする（配列番号７８）のＤＮＡ配列を含有する： 例４７ ｐＭＯＮ１５９８２の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９８２の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド９６終止点（配列番 号３７１）と９７開始点（配列番号３７０）をプライマーとして使用するＰＣＲ 反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した。増 幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対のＨｉ ｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨｉｎ ｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片を 得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシリ ン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析し て正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９８２は、以下のアミノ酸 配列をコードする（配列番号７９）のＤＮＡ配列を含有する： 例４８ ｐＭＯＮ１５９６５の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９６５の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６ＯＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮΛオリゴヌクレオチド１４２終止点（配列 番号３７７）と１４１開始点（配列番号３７６）をプライマーとして使用するＰ ＣＲ反応において、鋳型とし-C使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した 。増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対の Ｈｉｎｄlll、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨ ｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断 片を得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピ シリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解 析して正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９６５は、以下のアミ ノ酸配列をコードする（配列番号８０）のＤＮＡ配列を含有する： 例４９ ｐＭＯＮ１５９６６の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９６６の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド１２６終止点（配列 番号３７２）と１２５開始点（配列番号３７３）をプライマーとして使用するＰ ＣＲ反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した 。増幅した断片を制限酵素ＨｉｎdIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対のＨ ｉｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨｉ ｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片 を得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシ リン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析 して正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９６６は、以下のアミノ 酸配列をコードする（配列番号８１）のＤＮＡ配列を含有する： 例５０ ｐＭＯＮ１５９６７の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９６７の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド１３２終止点（配列 番号３７５）と１３３開始点（配列番号３７４）をプライマーとして使用するＰ ＣＲ反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した 。増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対の ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨ ｉ ｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片 を得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシ リン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析 して正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９６７は、以下のアミノ 酸配列をコードする（配列番号８２）のＤＮＡ配列を含有する： 例５１ 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの 作成のために使用される中間体プラスミドであるｐＭＯＮ１３１８０の作成 プラスミドｐＭＯＮ１３０４６（ＷＯ９５／２１２５４）ＤＮＡを制限エンド ヌクレアーゼＸｍａＩとＳｎａＢＩで消化して、４０１８塩基対のベクター断片 を得た。４０１８塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片を、マジックＤＮＡクリー ンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅ ｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を 用いて精製した（ここで２５塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ挿入体断片は保持さ れない）。Ｘａ因子切断部位をコードする配列を除去するために、合成オリゴヌ クレオチドの相補対ｇｌｙｘａ１（配列番号３７８）とｇｌｙｘａ２ （配列番号３７９）を設計した。これらのオリゴヌクレオチドはまた、正しく組 み立てるとＸｍａＩとＳｎａＢＩ末端を与える。プライマーｇｌｙｘａ１とｇｌ ｙｘａ２を、アニーリング緩衝液（２０mMトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０mMＭ ｇＣｌ2、５０mMＮａＣｌ）中で７０℃で１０分加熱し静かに冷却して、アニー リングさせた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用し て、ｐＭＯＮ１３０４６からの４０１８塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片を、 組み立てたオリゴヌクレオチドと連結させた。連結反応物の一部を使用して、大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メ リーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を 選択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＰＣＲベースの測定法を 使用して解析した。選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡを配列決定して 、オリゴヌクレオチドの正しい挿入を確認した。得られるプラスミドをｐＭＯＮ １３１８０（配列番号８８）と名付けた。例５２ 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの 作成のために使用される中間体プラスミドであるｐＭＯＮ１３１８１の作成 プラスミドｐＭＯＮ１３０４７（ＷＯ９５／２１２５４）ＤＮＡを制限エンド ヌクレアーゼＸｍａＩとＳｎａＢＩで消化して、４０６３塩基対のベクター断片 を得た。４０６３塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片を、マジックＤＮＡクリー ンシステムアップキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅ ｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を 用いて精製した（ここで２５塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ挿入体断片は保持さ れない）。Ｘａ因子切断部位をコードする配列を除去するために、合成オリゴヌ クレオチドの相補対ｇｌｙｘａ１（配列番号３７８）とｇｌｙｘａ２（配列番号 ３７９）を設計した。これらのオリゴヌクレオチドはまた、正しく組み立てると ＸｍａＩとＳｎａＢＩ末端を与える。プライマーｇｌｙｘａ１とｇｌｙｘａ２を 、アニーリング緩衝液中で７０℃で１０分加熱し静かに冷却して、ア ニーリングさせた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使 用して、ｐＭＯＮ１３０４７からの４０６３塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片 を、組み立てたオリゴヌクレオチドと連結させた。連結反応物の一部を使用して 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ） 、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細 菌を選択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＰＣＲベースの測定 法を使用して解析した。選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡを配列決定 して、オリゴヌクレオチドの正しい挿入を確認した。得られるプラスミドをｐＭ ＯＮ１３１８１（配列番号８７）と名付けた。例５３ ｐＭＯＮ１３１８２の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８２中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［３８終止点（配列番号３６９）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。プライマー［３９開始点と３８終止点］を使用して、 アニーリングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端 Ｇ−ＶＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏ Ｉで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコン シン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、 インディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一 部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形 質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入 体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８２と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８２で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８２は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１７）のＤＮＡ配列を含有する： 例５４ ｐＭＯＮ１３１８３の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８３中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から「断片開始点」を作成し増幅した。プライマー セット［３８終止点（配列番号３６９）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。３９開始点と３８終止点を使用して、アニーリン グした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１I IIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓ ｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州 ）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデ ィアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用 いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換 体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確 認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８３と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８３で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８３は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１８）のＤＮＡ配列を含有する： 例５５ ｐＭＯＮ１３１８４の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８４中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［９６終止点（配列番号３７１）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。９７開始点と９６終止点を使用して、アニーリングし た断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅ ｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間 体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８４と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８４で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１９）のＤＮＡ配列を含有する： 例５６ ｐＭＯＮ１３１８５の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８５中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［９６終止点（配列番号３７１）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。９７開始点と９６終止点を使用して、アニーリングし た断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓ ｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８５と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８５で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２０）のＤＮＡ配列を含有する： 例５７ ｐＭＯＮ１３１８６の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８６中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７３）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１２６開始点と１２５終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１I IIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓ ｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州 ）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデ ィアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用 いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換 体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確 認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８６と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８６で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８６は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２１）のＤＮＡ配列を含有する： 例５８ ｐＭＯＮ１３１８７の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８７中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７３）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１２６開始点と１２５終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間 体プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランドリ州を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８７と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８７で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８７は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２２）のＤＮＡ配列を含有する： 例５９ ｐＭＯＮ１３１８８の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８８中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１３３開始点と１３２終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８８と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８８で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８８は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２３）のＤＮＡ配列を含有する： 例６０ ｐＭＯＮ１３１８９の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８９中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１３３開始点と１３２終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１I IIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓ ｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州 ）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデ ィアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用 いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ）、メリーランドリ州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転 換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を 確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８９と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８９で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８９は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２４）のＤＮΛ配列を含有する： 例６１ ｐＭＯＮ１３１９０の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１９０中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１４２開始点と１４１終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間 体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９０と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９０で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９０は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２５）のＤＮＡ配列を含有する： 例６２ ｐＭＯＮ１３１９１の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１９１中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１４２開始点と１４１終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９１と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９１で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９１は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２６）のＤＮＡ配列を含有する： 例６３ ｐＭＯＮ１３１９２の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９２中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［３８終 止点（配列番号３６９）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使用して、プ ラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片終止点を作 成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片終 止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断片開始点と 終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏＩ−Ｈｉｎ ｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳ Ｆ Ｓｅｒ１７遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限 エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０２３塩基対のベクタ ー断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉ ｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製した制限断 片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用 して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲー サーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した 。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを 単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿 入を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９２と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９２で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９２は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２７）のＤＮＡ配列を含有する： 例６４ ｐＭＯＮ１３１９３の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９３中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［３８終止点（配列番号３６９）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化 し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断 片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃ ｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳ Ｆ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エ ンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のベクタ ー断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉ ｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製した制限断 片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデイアナポリス、インディアナ州）を使用 して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲー サーズバーグ（Ｇａｌｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した 。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを 単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られたプラスミ ドをｐＭＯＮ１３１９３と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９３で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９３は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２８）のＤＮＡ配列を含有する： 例６５ ｐＭＯＮ２５１９０の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ２５１９０中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［９６終 止点（配列番号３７１）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使用して、プ ラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片終止点を作 成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片終 止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断片開始点と 終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏＩ−Ｈｉｎ ｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０２３塩 基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキッ ト（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精 製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディア ナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を 形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラス ミドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得ら れたプラスミドをｐＭＯＮ２５１９０と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ２５１９０で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ２５１９０は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２９）のＤＮＡ配列を含有する： 例６６ ｐＭＯＮ２５１９１の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ２５１９１中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［９６終止点（配列番号３７１）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化 し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断 片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏ Ｉ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩 基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキッ ト（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精 製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディア ナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＤＨ５α細胞Ｃライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を 形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラス ミドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得ら れたプラスミドをｐＭＯＮ２５１９１と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ２５１９１で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ２５１９１は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３０）のＤＮＡ配列を含有する： 例６７ ｐＭＯＮ１３１９４の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ１３１９４中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７１）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０２３塩 基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキッ ト（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精 製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディア ナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｌ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）相 を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラ スミドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得 られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９４と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｌ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９４で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３１）のＤＮＡ配列を含有する： 例６８ ｐＭＯＮ１３１９５の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９５中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７３）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎdIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０６８塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９５と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９５で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３２）のＤＮＡ配列を含有する： 例６９ ｐＭＯＮ１３１９６の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９６中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色 し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔ ａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限 エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０２３塩基対のベク ター断片を得て、これをマジックＤＮΛクリーンアップシステムキット（Ｍａｇ ｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏ ｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製した制限 断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使 用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲ ーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換し た。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡ を単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られたプラス ミドをｐＭＯＮ１３１９６と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９６で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９６は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３３）のＤＮＡ配列を含有する： 例７０ ｐＭＯＮ１３１９７の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９７中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し噌幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０６８塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９７と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９７で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９７は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３４）のＤＮＡ配列を含有する： 例７１ ｐＭＯＮ１３１９８の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ１３１９８中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０２３塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞Ｃライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９８と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９８で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９８は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３５）のＤＮＡ配列を含有する： 例７２ ｐＭＯＮ１３１９９の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ１３１９９中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０６８塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９９と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９９で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９９は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３６）のＤＮＡ配列を含有する： 例７３ 縦列に複製したプラスミド鋳型Ｓｙｎｔａｎ１の作成 縦列に複製したｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６鋳型Ｓｙｎｔ ａｎ１を作成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する連結により、３つのＤＮＡを 結合させた。３つのＤＮＡは：１）ＢｓｔＥIIとＳｎａＢＩで消化した、ｈＩＬ −３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６を含有するｐＭＯＮ１３０４６；２） 合成オリゴヌクレオチドのアニーリングした相補対である、Ｌ１ｓｙｎ．ｆｏｒ （配列番号３５２）とＬ１ｓｙｎ．ｒｅｖ（配列番号３５３）（これは、元々の タンパク質のＣ−末端とＮ−末端を連結するリンカーをコードする配列と、少量 の周りのｐＭＯＮ１３４１６配列を含有し、正しく組み立てるとＢｓｔＥIIとＣ ｌａＩ末端を与える）；および３）ＣｌａＩ（ＤＮＡは、ｄａｍ−細胞ＤＭ１（ ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で増殖され ている）とＳｎａＢＩにより、ｐＭＯＮ１３０４６から消化したｈＩＬ−３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の一部、である。消化したＤＮＡを０．９ ％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃ ｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１）を使用して単離した。 連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。ミニプレップ （Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを形質転換体から単離し、ＰＣＲベースの測定法を 使用して形質転換体をスクリーニングした。選択した形質転換体からのプラスミ ドＤＮＡを配列決定して、正しい鋳型を得た。得られたプラスミドをｓｙｎｔａ ｎ１と名付け、これは（配列番号７）のＤＮＡ配列を含有する。例７４ 縦列に複製したプラスミド鋳型ｓｙｎｔａｎ３の作成 縦列に複製したｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６鋳型ｓｙｎｔ ａｎ３を作成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する連結により、３つのＤＮＡを 結合させた。３つのＤＮＡは：１）ＢｓｔＥIIとＳｎａＢＩで消化した、ｈＩＬ −３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６を含有するｐＭＯＮ１３０４６；２） 合成オリゴヌクレオチドのアニーリングした相補対である、Ｌ３ｓｙｎ．ｆｏｒ （配列番号３５４）とＬ３ｓｙｎ．ｒｅｖ（配列番号３５５）（これは、元々の タンパク質のＣ−末端とＮ−末端を連結するリンカーをコードする配列と、少量 の周りのｐＭＯＮ１３４１６配列を含有し、正しく組み立てるとＢｓｔＥIIとＳ ｎａＢＩ末端を与える）；および３）ＣｌａＩ（ＤＮＡは、ｄａｍ−細胞ＤＭ１ （ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で増殖さ れている）とＳｎａＢＩにより、ｐＭＯＮ１３０４６から消化したｈＩＬ−３受 容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の一部、である。消化したＤＮＡを０．９％ ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌ ｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１）を使用して単離した。 連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。ミニプレッ プ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを形質転換体から単離し、ＰＣＲベースの測定法 を使用して形質転換体をスクリーニングした。選択した形質転換体からのプラス ミドＤＮＡを配列決定して、正しい鋳型を得た。得られたプラスミドをｓｙｎｔ ａｎ３と名付け、これは（配列番号８）のＤＮＡ配列を含有する。例７５ ｐＭＯＮ３１１０４の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０４中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３５開始点（配列番号３ ５６）と３４ｒｅｖ（配列番号３５７）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏｌとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニストｐ ＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片は 、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア 州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質 転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミド ＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドを ｐＭＯＮ３１１０４と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０４で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号９）のＤＮＡ配列を含有する： 例７６ ｐＭＯＮ３１１０５の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０５中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［７０開始点（配列番号３ ５８）と６９ｒｅｖ（配列番号３５９）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製 した消化ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ １３１８９ＤＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択し た。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ３１１０５と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭ０Ｎ３１１０５で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１０）のＤＮＡ配列を含有する： 例７７ ｐＭＯＮ３１１０６の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０６中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９１開始点（配列番号３ ６０）と９０ｒｅｖ（配列番号３６１）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択し た。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ３１１０６と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０６で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０６は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１１）のＤＮＡ配列を含有する： 例７８ ｐＭＯＮ３１１０７の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０７中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１０１開始点（配列番号 ３６２）と１００ｒｅｖ（配列番号３６３）］を使用して、中間体プラスミドＳ ｙｎｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新 しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニストｐ ＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片は 、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア 州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質 転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミド ＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドを ｐＭＯＮ３１１０７と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０７で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０７は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１２）のＤＮＡ配列を含有する： 例７９ ｐＭＯＮ３１１０８の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０８中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３５開始点（配列番号３ ５６）と３４ｒｅｖ（配列番号３５７）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。．消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離 し、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ １０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮ Λ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９Ｄ ＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニスト ｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換Ｉ．た。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択 した。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得ら れたプラスミドをｐＭＯＮ３１１０８と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１−をｐＭＯＮ３１１０８で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０８は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１３）のＤＮＡ配列を含有する： 例８０ ｐＭＯＮ３１１０９の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０９中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［７０開始点（配列番号３ ５８）と６９ｒｅｖ（配列番号３５９）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インデ．ィアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮ Ａ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９Ｄ ＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニスト ｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片 は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリー ン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニ ア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミド をｐＭＯＮ３１１０９と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０９で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０９は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１４）のＤＮＡ配列を含有する： 例８１ ｐＭＯＮ３１１１０の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１１０中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９１開始点（配列番号３ ６０）と９０ｒｅｖ（配列番号３６１）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択し た。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ３１１１０と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１１０で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１０は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１５）のＤＮＡ配列を含有する： 例８２ ｐＭＯＮ３１１１１の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１１１中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１０１開始点（配列番号 ３６２）と１００ｒｅｖ（配列番号３６３）］を使用して、中間体プラスミドＳ ｙｎｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新 しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮΛ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インデ．ィアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮ Ａ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９Ｄ ＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニスト ｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片 は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリー ン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニ ア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミド をｐＭＯＮ３１１１１と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１１１で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１１は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１６）のＤＮＡ配列を含有する： 例８３ ｐＭＯＮ３１１１２の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１２の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８９ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２２２（ＷＯ９４／１２６３９ 、米国出願第０８／４１１，７９６号）をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、２ ８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１．０％アガロー スゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯＸＡ１．ＲＥＱ （配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５１）をアニーリ ングし、ｐＭＯＮ１３２２２からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を用いて、ｐＭＯ Ｎ１３１８９からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結混合物の一部を 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した。形質転換体細 菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限 解 析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１２は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３７）のＤＮＡ配列を含有する： ｐＭＯＮ３１１１３の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１３の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９７ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２３９（ＷＯ９４／１２６３９ 、米国出願第０８／４１１，７９６号）をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、２ ８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１．０％アガロー スゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯＸＡ１．ＲＥＱ （配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５１）をアニーリ ングし、ｐＭＯＮ１３２３９からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を用いて、ｐＭＯ Ｎ１３１９７からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結混合物の一部を 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した。形質転換体細 菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限 解析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定して正しい挿入 体を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１３は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３８）のＤＮＡ配列を含有する： 例８５ ｐＭＯＮ３１１１４の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１４の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８９ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２３９（Ｗ０９４／１２６３９ 、米国出願第０８／４１１，７９６号）をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、２ ８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１．０％アガロー スゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯＸＡ１．ＲＥＱ （配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５１）をアニーリ ングし、ｐＭＯＮ１３２３９からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を用いて、ｐＭＯ Ｎ１３１８９からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結混合物の一部を 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した。形質転換体細 菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限 解析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定して正しい挿入 体を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３９）のＤＮＡ配列を含有する： 例８６ ｐＭＯＮ３１１１５の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１５の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９７ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２２２をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩ で消化して、２８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１ ．０％アガロースゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯ ＸＡ１．ＲＥＱ（配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５ １）をアニーリングし、ｐＭＯＮ１３２２２からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を 用いて、ｐＭＯＮ１３１９７からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結 混合物の一部を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した 。形質転換体細菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡ を単離し、制限解析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定 して正しい挿入体を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号４０）のＤＮＡ配列を含有する： 例８７ 多機能性造血受容体アゴニストタンパク質のインビトロ活性の測定 多機能性造血受容体アゴニストタンパク質のタンパク質濃度は、アフィニティ 精製したポリクローナル抗体ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定す ることができる。あるいはタンパク質濃度は、アミノ酸組成分析により測定する ことができる。多機能性造血受容体アゴニストの生物活性は、多くのインビトロ 測定法で測定することができる。例えばｈＩＬ−３受容体やＧ−ＣＳＦ受容体に 結合する多機能性造血受容体アゴニストは、ｈＩＬ−３および／またはＧ−ＣＳ Ｆ受容体を発現する細胞株を使用する細胞増殖測定法により測定することができ る。そのような測定法の１つは、ＡＭＬ−１９３細胞増殖測定法である。ＡＭＬ −１９３細胞は、ＩＬ−３とＧ−ＣＳＦに応答し、ＩＬ−３／Ｇ−ＣＳＦ多機能 性造血受容体アゴニストの組合せ生物活性の測定を可能にする。この種の別の測 定法は、ＴＦ１細胞増殖測定法である。 さらに、マウスＩＬ−３依存性細胞株であるＭ−ＮＦＳ−６０（ＡＴＣＣ．Ｃ ＲＬ１８３８）または３２Ｄのような他の因子依存性細胞株を使用してもよい。 ＩＬ−３の活性は種特異的であるが、Ｇ−ＣＳＦはそうではなく、従ってＩＬ− ３／Ｇ−ＣＳＦ多機能性造血受容体アゴニストのＧ−ＣＳＦ成分の生物活性は独 立に測定することができる。あるリガンドに対する受容体を発現しない細胞株（ 例えば、ＢＨＫまたはマウスＢａｆ／３）は、所望の受容体をコードする遺伝 子を含有するプラスミドでトランスフェクションすることができる。そのような 細胞株の例は、ｈＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションしたＢａＦ３である （ＢａＦ３／ｈＧ−ＣＳＦ）。これらの細胞株中の多機能性造血受容体アゴニス トの活性は、ｈＩＬ−３もしくはＧ−ＣＳＦ単独とまたは一緒に比較することが できる。ＢａＦ３／ｈＧ−ＣＳＦ細胞増殖測定法とＴＦ１細胞増殖測定法で測定 される本発明の多機能性造血受容体アゴニストの例の生物活性を、表５と表６に 示す。多機能性造血受容体アゴニストの生物活性は、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ 受容体結合活性を有する標準タンパク質ｐＭＯＮ１３０５６（ＷＯ９５／２１２ ５４）と比較して相対的活性として表す。ＢａＦ３／ｃ−ｍｐｌ細胞増殖測定法 とＴＦ１細胞増殖測定法で測定される本発明の多機能性造血受容体アゴニストの 例の生物活性を、表７と表８に示す。ｎｄ＝測定せず* 多機能性造血受容体アゴニストの生物活性は、標準タンパク質ｐＭＯＮ１３０ ５６と比較して相対活性として表す。ｎ＝３以上。ｎｄ＝測定せず+ 多機能性造血受容体アゴニストの生物活性（ｎ＝１または２）は、標準タンパ ク質ｐＭＯＮ１３０５６と比較して相対活性として表す。 「＋」は、分子がｐＭＯＮ１３０５６に匹敵することを示す。 *ｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）に対する、ｃ−ｍｐｌ受容体でトランス フェクションしたＢａｆ３細胞株で測定した活性。 +ｐＭＯＮ１３０５６に対して測定した活性。 同様に、所望の多機能性造血受容体アゴニストの生物活性を測定するのに、当 業者に公知の他の因子依存性細胞株を使用することができる。メチルセルロース 測定法を使用して、造血始原細胞の拡張およびインビトロの異なる型の造血コロ ニーのパターンに及ぼす多機能性造血受容体アゴニストの効果を測定することが できる。メチルセルロース測定法は、１００，０００個の投入細胞あたりの始原 細胞の頻度を測定するため、前駆体頻度の推定値を与える。長期の間質依存性培 養物は、原始的造血始原細胞、特に幹細胞を区別するのに使用されている。この 測定法は、多機能性造血受容体アゴニストが、非常に原始的な始原細胞および／ または幹細胞の拡張を刺激するかどうかを決定するのに使用することができる。 さらに、多機能性造血受容体アゴニストにより刺激される原始的始原細胞の頻度 を示す、限界希釈培養を行うことができる。 例８８ ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２６３８に記載のＰＣＲ突然変異誘 発法を使用して、単一のまたは複数のアミノ酸置換を有するＧ−ＣＳＦ変種を作 成した。これらのおよび他の変種（すなわち、アミノ酸置換、挿入、または欠失 、およびＮ−末端またはＣ−末端伸長）は、当業者により、合成遺伝子組み立て または部位特異的突然変異誘発（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：７８６４−８７８５［１９８５］；クンケル（Ｋｕｎ ｋｅｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８− ４９２［１９８５］；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラークロ ーニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト リー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州［１９８９］、ＷＯ９４／１２６３９およびＷ Ｏ９４／１２６３８を参照）を含む他の種々の方法を使用して作成することがで きるであろう。これらの置換は、１回に１つ、または他のアミノ酸置換、および ／または欠失、および／または挿入および／または伸長と組合せて作成すること ができる。配列の変化を証明した後、産生のためにプラスミドＤＮＡを、適当な 哺乳動物細胞、昆虫細胞または細菌株（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））にト ランスフェクションすることができる。活性のあるＧ−ＣＳＦの公知の変種とし ては、１位（ＴｈｒからＳｅｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ），２位（ＰｒｏからＬｅ ｕ）、３位（ＬｅｕからＡｒｇまたはＳｅｒ）、および１７位（ＣｙｓからＳｅ ｒ）の置換、およびアミノ酸１〜１１の欠失（クガ（Ｋｕｇａ）ら、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃｌａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ ．１５９：１０３−１１１（１９８９））がある。これらのアミノ酸置換変種は 、新しいＮ−末端および新しいＣ−末端が作成されるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニス トを作成するための鋳型として使用することができる。Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換 変種の例を表９に示す。例８９ Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種の生物活性測定 Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種は、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクショ ンしたＢａｆ／３細胞株を使用して、細胞増殖活性について測定することができ る。Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種の例の生物活性を、未変性のヒトＧ−ＣＳＦに 比較して表９に示す。「＋」は、未変性のものに匹敵する活性を示し、「−」は 、有意に低下しているかまたは測定できる活性は全くないことを示す。 *未変性のｈＧ−ＣＳＦに対する活性 ｎｄ＝測定せず例９０ ｆｌｔ３リガンドをコードするｃＤＮＡの単離 ＮＣＯＦＬＴ、ＨＩＮＤ１６０、およびＨＩＤ１６５ＰＣＲプライマーを使用 してヒト骨髄ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から（ 製造業者の推奨する条件に従って）、３つのｆｌｔ３リガンドクローンを増幅し た。これらの増幅ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢＨＫ発現ベクターｐＭＯＮ５７２ ３中にクローン化して、ｐＭＯＮ３０２３７（ＮＣＯＦＬＴ＋ＨＩＮＤ１６ ０）、ｐＭＯＮ３０２３８（ＮＣＯＦＬＴ＋ＨＩＮＤ１６５）、および欠失コロ ニーｐＭＯＮ３０２３９（ＮＣＯＦＬＴ＋ＨＩＮＤ１６５）を作成した。ｐＭＯ Ｎ２０２３９の欠失は、アミノ酸残基８９から１０６である。例９１ いくつかの方法といくつかの型のリンカーを使用して、配列を並べ替えたｆｌ ｔ３受容体アゴニストを作成した。ムリンズ（Ｍｕｌｌｉｎｓ）らが記載した２ 工程ＰＣＲ法（各最終の配列を並べ替えた分子の前の半分と後ろの半分を第１の 工程で別々に作成し、次に第１の反応工程の対になった生成物を第２の工程で一 緒にして、外来性プライマーの非存在下で伸長する）を使用して、切断点３９／ ４０）６５／６６、および８９／９０を有するリンカーペプチド（ＳｅｒＧｌｙ ＧｌｙＡｓｎＧｌｙ）Ｘ（ここでＸ＝１、２、または３）を含有する作成体の第 １のセットを作成した。例えば、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙ 配列番号７ ８６、およびＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙ 配列番号７８７、およびＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙ ＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙ 配列番号７８８アミノ酸リンカ ーを有する８９／９０切断点前駆体分子（それぞれ、ｐＭＯＮ３２３２６、ｐＭ ＯＮ３２３２７、およびｐＭＯＮ３２３２８）を作成するために、６つの初期Ｐ ＣＲ産物を作成した。以下のプライマー対を第１の工程のＰＣＲ反応で使用した ：ａ）８９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂ；ｂ）８９Ｆｏｒ／ＬＩＯＢ；ｃ）８９Ｆｏｒ／Ｌ１ ５Ｂ；ｄ）８９Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ；ｅ）８９Ｒｅｖ／Ｌ１０Ａ；およびｆ）８９Ｒ ｅｖ／Ｌ１５Ａ。同じアプローチを使用して、ｐＭＯＮ３２３２１（３９／４０ 切断点、プライマー対３９Ｆｏｒ／Ｌ１０Ｂおよび３９Ｒｅｖ／Ｌ１０Ａ）およ びｐＭＯＮ３２３２５（６５／６６切断点、プライマー対６５Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂお よび６５Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ）前駆体を作成した。下記のもの以外は、以後のすべて のＰＣＲ反応は、ＰＣＲオプチマイザーキット（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ）（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））の成分と製造業者の推奨 するプロトコールに従う増幅条件を使用した。反応は以下のように設定した：５ ０pmolの各プライマー、１０μｌの５×緩衝液Ｂ［３００mMトリス−塩酸（ｐＨ ８．５）、１０mM ＭｇＣｌ2、７５mM（ＮＨ4）2ＳＯ4］、５Ｕの Ｔａｑポリメラーゼ、および１０Ｏngの熱変性ＤＮＡ（この例ではｐＭＯＮ３０ ２３８）鋳型を一緒にし、ｄＨ2Ｏで最終容量を４５μｌにした。反応物を８０ ℃で１〜５分プレインキュベートし、次に各反応物に１０mM ｄＮＴＰを５μｌ 加え、９４℃で２分熱変性してから、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ ｍｅｒ）モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラーで増幅した。以下の条件で７回 のＤＮＡ増幅サイクルを行なった：９４℃で１分熱変性、６５℃で２分アニーリ ング、次に７２℃で３分伸長。９４℃で１分熱変性と次に７２℃で４分アニーリ ング／伸長をさらに２３サイクル行い、次に７２℃で最後の７分の伸長サイクル を行なった。ｐＭＯＮ３２３２８以外は、ＰＣＲ増幅産物は１．２％ＴＡＥアガ ロースゲルで流し、適切なサイズのバンド（主要な増幅産物）を切り出し、ジー ンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製した。試 料を１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。ウィザードＰＣＲクリーンアップキット （Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅ ｇａ））を使用して、ｐＭＯＮ３２３２８の増幅産物を直接精製し、５０μｌの ｄＨ2ＯでＤＮＡを溶出した。鋳型の量を１μｇに増加させ、ＰＣＲ増幅条件を 以下のように変化させて、ｐＭＯＮ３２３２２の前駆体（３９／４０切断点、プ ライマー対３９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂおよび３９Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ）を作成するための方 法を修飾した：９４℃１分、６５℃２分、および７２℃２．５分を６サイクル、 次に９４℃１分、７０℃２分、および７２℃２分を１５サイクル、次に７２℃で ７分伸長を１サイクル。 第２のＰＣＲ工程では、第１のＰＣＲ工程からのゲル精製した前駆体を、以下 のようにプライマー／鋳型の組合せとして使用した：各前駆体分子５μｌ（すな わち、ｐＭＯＮ３２３２８についてプライマー対８９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂおよび８９ Ｒｅｖ／Ｌ５ＡからのＰＣＲ産物）、１０μｌの５×緩衝液Ｂ、５ＵのＴａｑポ リメラーゼ、および２４μｌのｄＨ2Ｏ。反応物を８０℃で５分加熱し、５μｌ の１０mM ｄＮＴＰを加え、反応物を９４℃で２分熱変性した。ＤＮＡ増幅条件 は以下の通りであった：９４℃１分、６９℃２分を１５サイクル、次に７２℃で ３分伸長。完全に伸長させるために、最後のサイクルの後に、７２℃で７分の伸 長工程を１回行なった。８０度のインキュベーション時間を２分に短縮し、サイ クルの数をｐＭＯＮ３２３２５について１０サイクルに減らした（ＰＣＲ産物６ ５Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂと６５Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ）。ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａ ｎ）IIを使用して、適当なサイズのＰＣＲ反応産物を、１．２％ＴＡＥアガロー スゲルでゲル精製した。ｐＭＯＮ３２３２２（３９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂと３９Ｒｅｖ ／Ｌ５Ａ）についてアニーリング温度を６８℃に下げ、伸長時間を２分に短縮し た。さらにＰＣＲ産物をウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用 して、供給業者の推奨するプロトコールに従って精製した。第２のＰＣＲ工程を 、ｐＭＯＮ３２３２６（８９Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｂと８９Ｒｅｖ／Ｌ１５ΛのＰＣＲ 産物）について以下のように修飾した。試料緩衝液（５×緩衝液Ｂ、Ｄ、または Ｊ−ＰＣＲオプチマイザーキット（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ））を 除いて、上記と同様にして３セットのＰＣＲ反応物を設定した。緩衝液ＤとＪの 組成は、ｐＨまたは［ＭｇＣｌ2］のみで異なる。緩衝液Ｄの［ＭｇＣｌ2］は３ ．５mMであり、緩衝液ＪのｐＨは９．５である。プロトコールを修飾して、ＰＣ Ｒサイクル数を２０に上げ、サイクル１０、１５および２０の最後に１５μｌの アリコートを取った。各アリコートの時点の５μｌを、１．２％ＴＢＥアガロー スゲルで増幅物質の存在について分析した。緩衝液Ｂ、Ｄ，およびＪのＰＣＲ反 応混合物の残りをプールし、次にウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉ ｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ）を使用して精製した。ＤＮＡは５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。 ２つの標準化消化条件の１つを使用して、第２工程ＰＣＲ反応からの精製試料 をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化した。ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）I Iで消化した試料について、１０μｌのＤＮＡを、２０μｌの反応物中で各７． ５ＵのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで３７℃で２時間反応させて消化し、１．１％Ｔ ＡＥアガロースゲルで再度ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）IIを用いてゲ ル精製した。連結の準備のできた試料を１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。ｐＭ ＯＮ３２３２２について２０μｌの試料を、５０μｌの反応容量で各２０ＵのＮ ｃｏＩとＨｉｎｄIIIで、３７℃で３時間消化した。０．１容量の３Ｍ ＮａＯ Ａｃ（ｐＨ５．５）と２．５容量のＥｔＯＨを加え、混合し、−２０℃で一晩保 存した。シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｍｋ２０２マイクロフュージ中で４℃で１３，０ ００ｒｐｍで２０分ペレット化して、ＤＮＡを回収した。ＤＮＡペレットを、冷 却した７０％ＥｔＯＨですすぎ、凍結乾燥し、１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した 。例９２ 別のアプローチを使用して、ｐＭＯＮ３２３２０（３９／４０切断点、１５ア ミノ酸リンカー）、ｐＭＯＮ３２３２３（６５／６６切断点、１５ＡＡリンカー ）、およびｐＭＯＮ３２３２４（６５／６６切断点、１０アミノ酸リンカー）を 作成した。ＢａｍＨＩ部位へのクローニングを可能にし正しい読みとり枠を維持 するためにフレーム内にあるプライマーに、ＢａｍＨＩ制限部位を取り込むため に、新しいプライマー（Ｌ１５Ｃ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｅ）を設計した。最初の工 程のＰＣＲ反応条件は、ｐＭＯＮ３２３２２に記載のものと同様に行なったが、 以下のセットのプライマー対を使用した：６５Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと６５Ｒｅｖ／ Ｌ１５Ｅ（ｐＭＯＮ３２３２４）；３９Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと３９Ｒｅｖ／Ｌ１５ Ｃ（ｐＭＯＮ３２３２０）；および６５Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと６５Ｒｅｖ／Ｌ１５ Ｃ（ｐＭＯＮ３２３２３）。ＰＣＲ反応生成物を、前記したようにウィザードＰ ＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ ）を使用して精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。試料を、ＮｃｏＩ／Ｂａ ｍＨＩ（３０Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと６５Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄ）またはＢａｍＨＩ／Ｈ ｉｎｄIII（３９Ｒｅｖ／Ｌ１５Ｃ、６５Ｒｅｖ／Ｌ１５Ｃ、および６５Ｒｅｖ ／Ｌ１５Ｅ）で消化した。制限消化を以下のように行なった：最終反応容量３０ μｌ中の、１０μｌの精製ＰＣＲ反応生成物、３μｌの１０×汎用制限緩衝液、 １５ＵのＮｃｏＩもしくはＨｉｎｄIII、１５ＵのＢａｍＨＩ。反応物を３７℃ で９０分インキュベートし、ＰＣＲ産物をジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ）IIを使用して１．１％ＴＡＥアガロースゲルで精製した。連結の準備のできた ＤＮＡを１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。 以下のように３成分（ｐＭＯＮ３２３２０、ｐＭＯＮ３２３２３、またはｐＭ ＯＮ３２３２４）または２成分（ｐＭＯＮ３２３２１、ｐＭＯＮ３２３２２、ｐ ＭＯＮ３２３２５、ｐＭＯＮ３２３２６、ｐＭＯＮ３２３２７およびｐＭＯＮ３ ２３２８）連結反応で、エビ（ｓｈｒｉｍｐ）アルカリ性ホスファターゼ（ＳＡ Ｐ）で処理した、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ３９７７（ＢＨＫ哺 乳動物発現ベクター）に挿入体を連結させた：２．５μｌの挿入体（ｐＭＯＮ３ ２３２０、ｐＭＯＮ３２３２３、およびｐＭＯＮ３２３２４のいずれかのプライ マー対の２μｌ）を、標準的連結条件を使用して、１０μｌの反応物中で５０ng のベクターに加えた。各反応物の２μｌを、製造業者の推奨するプロトコールに 従って、１００μｌの化学的にコンピタントなＤＨ５α細胞（ギブコ／ビーアー ルエル（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で形質転換した。２５μｌと２００μｌのアリコ ートを、５０μg/mlアンピシリン含有ＬＢプレートに蒔き、一晩インキュベート した。単離したコロニーを取り上げ、キアゲンＤＮＡミジプレップ（Ｑｉａｇｅ ｎ ＤＮＡ ｍｉｄｉｐｒｅｐ）キットを使用して、５０mlの一晩培養物からＤ ＮＡを調製した。Ａ２６０／２８０の吸光度によりＤＮＡを定量し、１μｇの鋳 型をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼで消化した後、アガロース ゲル電気泳動により正しい挿入体のサイズを証明した。予測されたサイズの挿入 体を含有する試料を、ベクター特異的プライマーを使用して、自動蛍光ＤＮＡシ ーケンサーモデル３７３Ａ（パーキン・エルマー・エービーアイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ）を使用して、両方の配向で配列決定した。配列決定反応 は、２０μｌの反応容量でパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）モ デル４８０ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、以下のように行なった：１μ ｇの鋳型、３．２pmolのプライマー、１μｌのＤＭＳＯ、９．５μｌのＴａｑタ ーミネータージデオキシプレミックス（パーキン・エルマー・エービーアイ（Ｐ ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ））を一緒にし、２５サイクルの以下の配列決 定増幅を行なった：９４℃で３０秒、５０℃で１５秒アニーリング、次に６０℃ で４分の伸長サイクル。試料をセントリセプ（Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ）スピンカ ラム（プリンストン・セパレーションズ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎｓ））を使用して製造業者の推奨するプロトコールに従って精製し、凍結 乾燥し、配列解析を行なった。予測されるアミノ酸配列を有する試料を、解析の ために選択し、ｐＭＯＮ番号を割り当てた。例９３ ｐＭＯＮ３２３２０、ｐＭＯＮ３２３２３、およびｐＭＯＮ３２３２４を作成 するのに使用したものと同じアプローチを使用して、３９／４０切断点を含有す る２つの配列を並べ替えた配列（ｐＭＯＮ３２３４８とｐＭＯＮ３２３５０）中 に、第２のタイプのリンカー（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ）Ｘ（ここで、 Ｘ＝２または３）を導入した。プライマー対は以下の通りである：ｐＭＯＮ３２ ３４８については３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３と３３９Ｒｅｖ２／３３９− １０Ｆｏｒ３の組合せ、ｐＭＯＮ３２３５０については３３９Ｆｏｒ２／３３９ Ｒｅｖ３と３３９Ｒｅｖ２／３３９−１５Ｆｏｒ３の組合せを使用して、３つの ＰＣＲ増幅産物を作成した。各ＰＣＲ増幅を以下のように設定した：１００ngの 熱変性ｐＭＯＮ３２３２０、５０pmolの各プライマー対、１０μｌの５×緩衝液 Ｂ、５ＵのＴａｑポリメラーゼおよびｄＨ2Ｏを、最終容量４５μｌななるよう に加えた。反応物を、前記したようにプレインキュベートした。以下の条件で１ ５サイクルの増幅を行なった：９４℃で１分熱変性、次に７０℃で２分のアニー リング工程、そして７２℃で３分の伸長。最後のサイクル後、７２℃の７分の伸 長工程を１回行なった。プライマー対３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３、３３９ Ｒｅｖ２／３３９−１０Ｆｏｒ３、および３３９Ｒｅｖ２／３３９−１５Ｆｏｒ ２のＰＣＲ増幅産物を、ウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用 して精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３ プライマー対のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化物は以下の通り：８μｌのＤＮＡ鋳型 を、２０μｌの反応容量中で２μｌの汎用制限緩衝液および各１０ＵのＮｃｏＩ とＢａｍＨＩと混合し、３７℃で９０分インキュベートした。消化産物を、ジー ンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II直接精製プロトコールを使用して精製し、 連結の準備のできたＤＮＡを１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。３３９Ｒｅｖ２ ／３３９−１０Ｆｏｒ３と３３９Ｒｅｖ２／３３９−１５Ｆｏｒ２増幅産物につ いての制限消化と以後の精製は、３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３アンプリコン の場合と同様に行なったが、ＮｃｏＩの代わりに１０ＵのＨｉｎｄIIIを使用し た。５０ngのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理しゲル精製したｐＭＯＮ３９ ７７、０．５μｌの３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３アンプリコン、１μｌの３ ３９Ｒ ｅｖ２／３３９−１０Ｆｏｒ３（ｐＭＯＮ３２３４８）または３３９Ｒｅｖ２／ ３３９−１５Ｆｏｒ３（ｐＭＯＮ３２３５０）アンプリコン、５ＵのＴ４ＤＮＡ リガーゼ、および１μｌの１０×リガーゼ緩衝液を１０μｌの反応容量で加えて 、周囲温度で６０分で標準的連結反応を行なった。最後のＤＮＡ配列確認までの 以後の工程は前記したように行なった。例９４ 可変の（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）Ｘ繰り返しモチーフを有する第３のタイ プのリンカーを、モジュールで作成した鋳型からの配列並べ替えｆｌｔ３受容体 アゴニストの別のセットに取り込んだ。これらのリンカーの長さは以下の通りで ある：６ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９ ２）、７ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ 配列番 号７９３）、１０ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９４）、１３ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌ ｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ 配列番号 ７９５）、１５ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳ ｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９６）；および ２１ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ 配列番号７９７）アミノ酸残基。これらのモジュラー鋳型（各々が、ユニーク な長さのＢａｍＨＩ含有リンカーにより分離されたｈｆｌｔ３リガンドのダイマ ーを含む）を、以下のように作成した。６つの中間体プラスミド鋳型（ＦＬ３Ｎ 、ＦＬ７Ｎ、ＦＬ１１Ｎ、ＦＬ３Ｃ、ＦＬ４Ｃ，およびＦＬ１０Ｃ）を、対にな ったプライマーと鋳型としてのｐＭＯＮ３０２３８を使用して、ｐＭＯＮ３２３ ２２について使用した条件と同様のサイクル条件を使用して、ＰＣＲにより作成 した。各反応について、５０pmolの各プライマーを、１００ngの熱変性鋳型に加 え、ｐＭＯＮ３２３２２について記載したように反応物を組み立てた。サイクル 条件は以下の通りである：９４℃１分；６５℃２分、および７２℃２．５分を７ サイクル；次に９４℃１分、７０℃２分、および７２℃２．５分を１０サイクル 。サイクル反応の最後に７２℃で７分の伸長を１回行なった。各中間体を作成す るの に使用したプライマー対は以下の通りである：Ｎ−ｔｅｒｍ／ＦＬＮ３（ＦＬ３ Ｎ）；Ｎ−ｔｅｒｍ／ＦＬＮ７（ＦＬ７Ｎ）；Ｎ−ｔｅｒｍ／ＦＬＮ１１（ＦＬ １１Ｎ）；Ｃ−ｔｅｒｍ／ＦＬＣ３（ＦＬ３Ｃ）；Ｃ−ｔｅｒｍ／ＦＬＣ４（Ｆ Ｌ４Ｃ）；およびＣ−ｔｅｒｍ／ＦＬＣ１０（ＦＬ１０Ｃ）。ＰＣＲ増幅産物を ウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製し、５０μｌの ｄＨ2Ｏに溶出した。第１のサブセット（ＦＬ３Ｎ、ＦＬ７Ｎ、およびＦＬ１１ Ｎ）の精製ＤＮＡをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化し、前記したようにゲル精製し 、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ／Ｓａｐ処理したｐＳＥ４２０ベクターＤＮＡ（インビ トロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に連結させた。第２のサブセット（ＦＬ３Ｃ 、ＦＬ４Ｃ、およびＦＬ１０Ｃ）の中間体鋳型を同一の方法で作成したが、Ｎｃ ｏＩの代わりにＨｉｎｄIIIを使用した。最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の 工程は前記したように行なった。例９５ 最終的な６つの鋳型を作成するために、ｐＳＥ４２０中の中間体の２つのサブ セットを、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ（ＦＬ３Ｎ、ＦＬ７Ｎ、ＦＬ１１Ｎ−サブセッ ト１）またはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII（ＦＬ３Ｃ、ＦＬ４Ｃ、およびＦＬ１０ Ｃ−サブセット２）で消化し、前記したようにジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅ ａｎ）IIを使用してゲル精製した。各サブセットから１つの中間体アンプリコン を、反応あたりＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３９７７に連 結させ、以下の組合せを使用して前記したようにＤＨ５α細胞中で形質転換して 特定のリンカー長さを作成する：６ＡＡリンカー（ＦＬ３ＮとＦＬ３Ｃ）、７Ａ Ａリンカー（ＦＬ３ＮとＦＬ４Ｃ）、１０ＡＡリンカー（ＦＬ７ＮとＦＬ３Ｃ） 、１３ＡＡリンカー（ＦＬ３ＮとＦＬ１０Ｃ）、１５ＡＡリンカー（ＦＬ１１Ｎ とＦＬ４Ｃ）、および２１ＡＡリンカー（ＦＬ１１ＮとＦＬ１０Ｃ）。前記の６ つの組合せのそれぞれからの単一のコロニーから、５０ml一晩培養物でＤＮＡを 調製し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII制限解析により正しい挿入体サイズについて解 析し、鋳型として使用した。プライマー対３０Ｆｏｒ／３９Ｒｅｖ（３９／４０ 切断点）；６５Ｆｏｒ／６５Ｒｅｖ（６５／６６切断点）およ び８９Ｆｏｒ／８９Ｒｅｖ（８９／９０切断点）を使用して、ｐＭＯＮ３２３２ ２について記載したように各鋳型をＰＣＲ増幅したが、各プライマー７５pmolを 使用した。増幅条件は以下のように変更した：９４℃１分、７０℃２分、７２℃ ２．５分を６サイクル；次に９４℃１分、７２℃３分を９サイクル。サイクル反 応の最後に７２℃で６分の伸長を行い、生成物の完全な伸長の充分な時間を与え た。試料をウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃ ｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製し、 ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで２重消化した。これらの増幅産物を、再度ウィザード ＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉ ｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製した。さらに、３９／４０ 切断点についてのすべての６つの異なるリンカー長の分子を、ＮｃｏＩ／Ｈｉｎ ｄIII／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３９７７に単一のタンパク質としてクローン化 した（ｐＭＯＮ３２３６５、ｐＭＯＮ３２３６６、ｐＭＯＮ３２３６７、ｐＭＯ Ｎ３２３６８、ｐＭＯＮ３２３６９および３２３７０）。最終的なＤＮＡ配列確 認までの以後の工程は前記したように行なった。例９６ ＩｇＧ２ｂリンカーを介して未変性のｆｌｔ３リガンドまたは配列並べ替えｆ ｌｔ３受容体アゴニスト（例９１〜９３）に結合したｐＭＯＮ１３４１６（ＷＯ ９４／１２６３８）の、ＩＬ−３受容体アゴニストからなる多機能性キメラ受容 体アゴニスト分子をコードする遺伝子を作成した。所望の配列並べ替えｆｌｔ３ 受容体アゴニスト分子を含有する挿入体を、親プラスミドからＮｃｏＩ／Ｈｉｎ ｄIII制限断片として単離し、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰで消化したｐＭ ＯＮ３０３０４に連結させた。最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程は前記 したように行なった。ＩＬ−３受容体アゴニスト（ｐＭＯＮ１３４１６から）お よび配列並べ替えｆｌｔ３受容体アゴニストを含む多機能性キメラ分子をコード するＤＮＡ配列を含有する、得られたプラスミドを表９に示す。 例９７ ＩｇＧ２ｂリンカーを介して未変性のｆｌｔ３リガンドまたは配列並べ替えｆ ｌｔ３受容体アゴニスト（例９１〜９３）に連結したｐＭＯＮ１３２８８（ＷＯ ９４／１２６３８）の、ＩＬ−３受容体アゴニストからなる多機能性キメラ受容 体アゴニスト分子をコードする遺伝子を作成した。所望の配列並べ替えｆｌｔ３ 受容体アゴニスト分子を含有する挿入体を、親プラスミドからＮｃｏＩ／Ｈｉｎ ｄIII制限断片として単離し、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰで消化したｐＭ ＯＮ３０３１１に連結させた。最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程は前記 したように行なった。ＩＬ−３受容体アゴニスト（ｐＭＯＮ１３２８８から）お よび配列並べ替えｆｌｔ３受容体アゴニストを含む多機能性キメラ分子をコード するＤＮＡ配列を含有する、得られたプラスミドを表１０に示す。 例９８ 鋳型としてｐＭＯＮ３２３６０とｐＭＯＮ３２３６２プラスミドＤＮＡを使用 して、プライマー対Ｎ−ｔｅｒｍ／１３４ｒｅｖとＮ−ｔｅｒｍ／１３９ｒｅｖ を使用して、未変性のｆｌｔ３リガンド分子のＣ−末端の終止コドンをフレーム 内ＳｎａＢＩ制限部位で置換することにより、キメラ分子のＮ−末端に配列並べ 替えｈｆｌｔ３受容体アゴニスト成分を有する２つのキメラ分子を作成した。反 応混合物を、ｐＭＯＮ３２３２２について前記したように準備した。サイクル条 件は以下の通りである：９４℃１分、６５℃２分、および７２℃２．５分を７サ イクル、そしてアニーリング温度を６５℃から７０℃にあげてさらに１０サイク ルの増幅サイクルを行なった。試料をウィザードＰＣＲクリーンアップキット（ Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）とプロトコールを使用し て精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出し、各試料の２０μｌをＮｃｏＩとＳｎａ ＢＩで消化した。プラスミドｐＭＯＮ２６４３１ＤＮＡをＮｃｏＩとＳｎａＢＩ で消化し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化ＰＣＲ反応物と連結させた。コンピタント なＤＨ５α細胞の形質転換と、、最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程は前 記したように行なった。例９９ 記載のプライマー２８／２９（２８Ｆｏｒ／２８Ｒｅｖ）、３４／３５（３４ Ｆｏｒ／３４Ｒｅｖ）、６２／６３（６２Ｆｏｒ／６２Ｒｅｖ）、９４／９５（ ９４Ｆｏｒ／９４Ｒｅｖ）、および９８／９９（９８Ｆｏｒ／９８Ｒｅｖ）を使 用して、前記したように１０および１５アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ Ｓｅｒ）ｘを増幅して、５つの追加のｈｆｌｔ３リガンド切断点を作成した。得 られたＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化して、前記のようにＡｆ１I II／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰで消化したｐＭＯＮ３０３１１に連結させた。コンピ タントなＤＨ５α細胞の形質転換と、最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程 は前記したように行なった。例１００ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での配列並べ替えｈｆｌｔ３受容体アゴニストの発 現の増強のために、縮重コドンをコードするＮ−末端特異的プライマーを使用し て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＯＮ５７２３中で１−１３４およ び１−１３９型の未変性のｈｆｌｔ３リガンドを再操作した。プライマー対ＦＨ ３ＡＦｏｒ／ＳＣＦ．ｒｅｖ（Ａｌａ２）およびＦｌｔ２３Ｆｏｒ／ＳＣＦ（Ｇ ｌｙ２）を使用して、ｐＭＯＮ２３２２２について記載した反応条件を使用して 、未変性のｆｌｔ３リガンドをコードする配列のＮ−末端縮重混合物をＰＣＲ増 幅したが、増幅サイクルの数は１５サイクルの９５℃１分、５５℃２分、および ７２℃２．５分に減らした。アンプリコンをウィザードＰＣＲクリーンアップキ ット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏ ｍｅｇａ））を使用して精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。ＮｃｏＩ／Ｈ ｉｎｄIIIを用いる制限消化とジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）IIを用い る以後のゲル精製は、前記したように行なった。挿入体は、ＮｃｏＩ／ ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理したゲル精製したｐＭＯＮ５７２３プラスミドＤＮＡ に連結させ、前記したようにコンピタントなＤＨ５α細胞に形質転換した。形質 転換細胞のアリコートを、７５μg/mlのスペクチノマイシンを含有するＬＢ寒天 培地に蒔いて、３７℃で１４〜１６時間インキュベートし、コロニー数を数えた 。コロニーを確認した後、各形質転換混合物の残りを、７５μg/mlのスペクチノ マイシンを含有するＬＢ培地２×５ml中で３７℃で一晩（１４〜１６時間）イン キュベートした。ウィザードＤＮＡ３７３ΛミニプレップＫｉｔ（Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ ３７３Ａ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ ）を、推奨されるプロトコールに従って使用して、ミニプレップＤＮＡを調製し た。精製したミニプレップＤＮＡを５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出し、１〜２μｌを 使用して、化学的にコンピタントなＭＯＮ２Ｏ７細胞を形質転換した。２５μｌ および２００μｌのアリコートを、７５μg/mlのスペクチノマイシンを含有する ＬＢ培地プレートに蒔き、３７℃で１２〜１５時間インキュベートした。元々の 各プライマー対である４０〜５０ウェルの単離したコロニーを選択し、ＬＢ／ス ペクチノマイシンマスタープレート上に画線し、３７℃でさらに４〜６時間イン キュベートした。 個々の配列並べ替えｈｆｌｔ３受容体アゴニストクローンを、９６ウェルマイ クロタイターフォーマット中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のためにスクリーニ ングして、改良された発現レベルについて選択した。ウェルあたり１００μｌの 最小Ｍ９培地（１％カザミノ酸を含む）を、単一コロニーにより接種し（各ｈｒ ｌｔ３ＰＣＲプライマー対について４０〜５０単離体を解析した）、３７℃で２ ００ｒｐｍで３〜４時間インキュベートし、新たに調製した１mg/mlのナリジキ シン酸（０．１Ｎ ＮａＯＨ中）５μｌ／ウェル加えて誘導した。３７℃でさら に４時間インキュベーション（Ｉ＝４）後、各ウェルから約５〜１０μｌのアリ コートを採取し、屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ ｂｏｄｉｅｓ）について光学 顕微鏡により分析し、結果を、細胞の総数に対する屈折体を含有する細胞のおよ そのパーセントとしてスコア化した。最も高い発現レベルを有するクローンを、 以下のように１０mlのベンチトップスケール発現試験のために選択した。一晩培 養物５mlを、３７℃で７５μg/mlのスペクチノマイシンの存在下でＬＢ培地中で 増殖させた。１２５mlの振盪フラスコ中の１０mlの新たに調製した最小Ｍ９（１ ％カザミノ酸を含む）に、充分な一晩細胞を接種して初期の読み値２０クレット （Ｋｌｅｔｔ）単位を達成し、次に約１１０〜１５０クレット（Ｋｌｅｔｔ）単 位の密度に達する（Ｉ＝０）まで振盪しながら３７℃で約３〜４時間インキュベ ートし、５０μｌの新たに調製したナリジキシン酸（０．１Ｎ ＮａＯＨ中１０ mg/ml）で誘導した。１mlのアリコートを採取し、細胞をミクロフュージ中で１ 分間ペレット化した。吸引して上清を除去し、ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 するまで−２０℃で保存した。誘導した細胞の残りを、３７℃で振盪しながらさ らに４時間インキュベートし、この時点（Ｉ＝４）で、細胞密度（クレット（Ｋ ｌｅｔｔ）単位）を測定した。各試料から１mlのアリコートを採取し、ペレット 化し、前記したように保存した。各フラスコから別の５〜１０μｌアリコートを 採取し、屈折体の存在について光学顕微鏡により分析した。ペレット化した試料 を、Ｉ＝４クレット（Ｋｌｅｔｔ）価に等しい容量（μｌ）の２×添加緩衝液（ １％β−メルカプトエタノールを含む）に再懸濁し、５分間沸騰させ、６〜７μ ｌを１２％または１４％トリスーグリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ノベ ックス（Ｎｏｖｅｘ））に添加し、９０ボルトで９０分電気泳動した。ゲルを固 定し、染色し、推奨プロトコール（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ））に従って乾燥の ために調製した。この時点で、Ｉ＝０試料と比較した時予測されるサイズに対応 する単一の誘導タンパク質バンド（Ｉ＝４）の増強発現レベルに基づくスケール アップ発酵のために、クローンを選択した。 ミジプレップ（Ｍｉｄｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを、前記したように高レベルの誘導 タンパク質を発現する選択されたクローンからも調製し、ＤＮＡ配列確認までの 工程は、前記した通りに行なった。これらのクローンを、ｐＭＯＮ３２３２９、 ｐＭＯＮ３２３３０、ｐＭＯＮ３２３４１、およびｐＭＯＮ３２３４２と名付け た。例１０１ ＩＬ−３受容体アゴニスト（ｐＭＯＮ１３２８８から）と未変性のｆｌｔ３リ ガンドを含む多機能性受容体アゴニストキメラ分子のセットを、ＥｃｏＲＩ中の 発現についても作成した。ｐＭＯＮ３２３６４とｐＭＯＮ３２３７７からの多機 能性受容体アゴニストキメラ分子をコードする遺伝子を、親ベクターからＮｃｏ Ｉ／ＨｉｎｄIIIで消化して放出させ、ｐＭＯＮ５６７７ベクターに連結させ、 ＭＯＮ２０７細胞に形質転換し、前記したように単一の単離体を取り上げた。こ れらの作成体を、ｐＭＯＮ３２３９４（ｐＭＯＮ３２３６４からの挿入体）およ びｐＭＯＮ３２３９５（ｐＭＯＮ３２３７７からの挿入体）と名付けた。例１０２ 約１０ngのプラスミドｐＭＯＮ２７１８４を鋳型として用いて５０pmolのプラ イマーＦＬＴＡＦＬＳＩとＦＬＴＲＩＮを使用して、端を切り取ったＦｌｔ３受 容体を１．４ＫｂのＰＣＲ産物として単離した。成熟コード配列の最初のＡｓｎ コドンのすぐ５’にＡｆ１III制限部位を、ならびに推定トランスメンブラン領 域のすぐ５’のＥｃｏＲＩ制限部位を、得るためにプライマーを設計した。反応 物を、標準的反応条件を使用してＡｆ１IIIとＥｃｏＲＩで消化し、ＮｃｏＩ／ ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＭＯＮ２６４５８中に連結させた。このプラスミド は、以下のＤＮＡ配列を含有する：ＩＬ−３シグナル配列をコードする、５’− ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧ ＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＴ Ｔ−３’ 配列番号８５７。この配列は、５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含有 し、ＢａｍＨＩ部位の３’にシグナル配列の最初のアミノ酸としてＡＴＧメチオ ニンを有する。このシグナル配列は細胞により切断され、シグナル配列のＮｃｏ Ｉ部位を、ＰＣＲ反応で産生した受容体のＡｆ１III部位に融合して作成された ５’Ｍｅｔ／Ａｌａが残る。受容体のすべての端を切り取った型はＩＬ−３シグ ナル配列とともに、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化物（ｈＩＬ３Ｌ／ｈＦｆｌｔ３ Ｒ）としてベクターから切り出すすることができた。 ｐＭＯＮ３０２９８（ｈＧ−ＣＳＦＲ）の触媒性ドメインを再操作して、以下 のようにＰＣＲによりトランスメンブラン／細胞質結合で、フレーム内制限部位 を作成する。０．５μｇの熱変性ｐＭＯＮ３０２９８に、１００pmolの各プライ マーＨＧＣＦｆｏｒとＨＧＣＦｒｅｖ、１０μｌの５×緩衝液Ｊ、５ＵのＴａｑ ポリメラーゼ、およびｄＨ2Ｏを、前記したように最終容量４５μｌになるよう に加えた。ＰＣＲ増幅は以下のように行なった：６サイクル（９４℃１分、６４ ℃２分、および７０℃３分）、次に９サイクル（９４℃１分、７０℃４分）。７ ０℃で７分の最後の１分間の伸長を行なった。各ＰＣＲ反応物１０μｌを、前記 したようにジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）IIを使用してゲル精製し、ｄ Ｈ2Ｏ中に溶出した。試料を、２０μｌの反応物中で１０ＵずつのＥｃｏＲＩと ＨｉｎｄIIIで３７℃で９０分間消化した。前記したように再度試料をゲル精製 （ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II）し、１０μｌのｄＨ2Ｏ中に溶出 した。２μｌの挿入体を、前記したように１０μｌの反応物中のＮｃｏＩ／Ｈｉ ｎｄIII／ホスファターゼ処理したｐＳＥ４２０ベクター５０ngに連結させた。 コンピタントなＤＨ５α細胞の形質転換と、最後のＤＮＡ配列確認までの以後の 工程は前記したものと同様に行なった。次に選択したクローンを配列決定して、 フレーム内のＥｃｏＲＩ部位の存在ならびに正しいＧ−ＣＳＦＲ触媒性ドメイン ＤＮＡ配列の確認を証明した。予測された配列を含有するクローンを、前記した ようにＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ゲル精製した。ｈＧ−ＳＣＦＲ（Ｅ ｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII）とｈＩＬ３Ｌ／ｈＦｌｔ３Ｒ（ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ Ｉ）断片の精製した挿入体を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII／ホスファターゼ処理 したｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ ））に連結させた。コンピタントなＤＨ５α細胞の形質転換と、最後のＤＮＡ配 列確認までの以後の工程は前記したものと同様に行なった。例１０３ 前記したダイマー鋳型中間体を使用して、配列並べ替えＦｌｔ３リガンドをコ ードする追加の遺伝子を作成した。１５アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ Ｓｅｒ）3ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９５を有する配列並べ替えｆｌｔ３ 受容体アゴニストについて、ダイマー中間体Ｆｌｔ４Ｃ．ｓｅｑとＦｌｔ１１Ｎ ．ｓｅｑを鋳型として使用した。Ｆｌｔ３３リガンドアミノ酸残基２９／２９、 ３４／３５、６２／６３、９４／９５、および９８／９９に対応する切断点を、 ＰＣＲベースのアプローチにより、ＰＣＲオプチマイザーキット（ＰＣＲ Ｏｐ ｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と以下 のプライマー対を使用して作成した：例９４に記載のように、Ｆｌ２９Ｆｏ ｒ／ＦＬ２９Ｒｅｖ、ＦＬ３５Ｆｏｒ／ＦＬ３５Ｒｅｖ、ＦＬ６３Ｆｏｒ／ＦＬ ６３Ｒｅｖ、ＦＬ９５Ｆｏｒ／ＦＬ９５Ｒｅｖ、ＦＬ９９Ｆｏｒ／ＦＬ９９Ｒｅ ｖ。増幅条件は以下の通りである：７サイクルの９４℃１分、６２℃２分、およ び７０℃２．５分；１２サイクルの９４℃１分、６８℃２分、および７０℃２． ５分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。予測される挿入体サイズに対応する ＰＣＲ産物をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、前記したようにジーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II（Ｂｉｏ１０１）を使用して製造業者の推奨するプロ トコールに従ってゲル精製した。試料を、最終容量１０μｌでｄＨ2Ｏに再懸濁 した。挿入体を単一の遺伝子として哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ３９３４（Ｎ ｃｏＩ／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理した）中にクローン化し、それぞれｐＭＯＮ ３５７１２、ｐＭＯＮ３５７１３、ｐＭＯＮ３５７１４、ｐＭＯＮ３５７１５、 ｐＭＯＮ３５７１６、ｐＭＯＮ３５７１７、およびｐＭＯＮ３５７１８と名付け た。 ２８／２９、３４／３５、６２／６３、９４／９５、および９８／９９切断点 プライマー対の、精製した制限消化したＰＣＲ産物を、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII ／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３０３１１中にクローニングして、ｐＭＯＮ１３２８ ８（ＷＯ９４／１２６３８）によりコードされるＩＬ−３受容体アゴニスト（本 明細書において「ＩＬ−３受容体アゴニストＩ」と呼ぶ）を含むキメラタンパク 質をコードする遺伝子、および配列並べ替えＦｌｔ３リガンドを、調製した。得 られたプラスミドを、それぞれｐＭＯＮ３２３９８、ｐＭＯＮ３５７００、ｐＭ ＯＮ３５７０２、ｐＭＯＮ３５７０４、およびｐＭＯＮ３５７０６と名付けた。 さらに、同じプライマー対をダイマー鋳型中間体Ｆｌｔ７Ｎ．ｓｅｑとＦｌｔ３ Ｃ．ｓｅｑとともに使用して、１０アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅ ｒ）2ＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９３を作成した、これらのＩＬ−３受容体アゴ ニストＩ／Ｆｌｔ３Ｌキメラタンパク質の型：それぞれｐＭＯＮ３２３９７、ｐ ＭＯＮ３２３９９、ｐＭＯＮ３５７０１、ｐＭＯＮ３５７０３、およびｐＭＯＮ ３５７０５。例１０４ ２１アミノ酸残基リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）5Ｇｌｙ 配列番号 ７９６を含有するＩＬ−３受容体アゴニストＩ／Ｆｌｔ３Ｌキメラタンパク質を コードする遺伝子を、同様のＰＣＲアプローチにより、ダイマー鋳型中間体Ｆｌ ｔ１１Ｎ．ｓｅｑとＦｌｔ１０Ｃ．ｓｅｑおよび以下のプライマー対を使用して 作成した：Ｆｌｔ３６／３６Ｒｅｖ、Ｆｌｔ３７／３７Ｒｅｖ、Ｆｌｔ３８／３ ８Ｒｅｖ、Ｆｌｔ３９／３９Ｒｅｖ、Ｆｌｔ４１／４１Ｒｅｖ、Ｆｌｔ４２／４ ２Ｒｅｖ、およびＦｌｔ４３／４３Ｒｅｖ。これらのプライマー対は、以下のＦ ｌｔ３リガンド切断点３５／３６；３６／３７；３７／３８；３８／３９；４０ ／４１；４１／４２；および４２／４３（３９／４０切断点はすでにｐＭＯＮ３ ２３７６として作成された）に対応し、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ増 幅のために使用した：インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ＰＣＲオプチマ イザーキット（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ）（緩衝液Ｂ）を使用して 、７サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および７０℃２．５分；１５サイクル の９４℃１分、７０℃４分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。ＤＮＡ配列確 認後に、これらの作成体をそれぞれｐＭＯＮ３５７３３、ｐＭＯＮ３５７３４、 ｐＭＯＮ３５７３５、ｐＭＯＮ３５７３６、ｐＭＯＮ３５７３８、ｐＭＯＮ３５ ７３９、ｐＭＯＮ３５７４０、ｐＭＯＮ３５７４１、ｐＭＯＮ３５７４２、およ びｐＭＯＮ３５７４３と名付けた。ＰＣＲ取り込みエラーにより、配列並べ替え Ｆｌｔ３キメラパートナーの２つのアミノ酸置換（ｐＭＯＮ３５７４１、３５／ ３６切断点；およびｐＭＯＮ３５７４３、４２／４３切断点）およびこのシリー ズの一部として作成され試験された、Ｆｌｔ３Ｌ残基中の、２つのアミノ酸置換 Ｑ133からＲ133およびＱ100からＲ100およびＬ112から112を含有する１つの作成 体（ｐＭＯＮ３５７４２、３８／３９切断点）の、２つの単一のアミノ酸置換を 引き起こした。 交互のＦｌｔ３Ｌ切断点が、前記したＦｌｔ３リガンドアミノ酸残基２８／２ ９、３４／３５、６２／６３、６５／６６、８９／９０、９４／９５、および９ ８／９９に対応する、追加のＦｌｔ３Ｌ／１１−３受容体アゴニストＩキメラタ ンパク質をまた、１５アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）3Ｇｌｙ ＧｌｙＧｌｙ鋳型Ｆｌｔ４ＣおよびＦｌｔ１１Ｎを用いて作成した。ＰＣＲ反応 混合物は例１０３に記載したものと同様であったが、配列並べ替えＦｌｔ３残基 のＣ−末端をコードする逆プライマーは、ＳｎａＢＩ認識配列を有するＨｉｎｄ III制限部位で置換して修飾した。ＰＣＲ増幅サイクルパラメータは以下の通り である：７サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および７０℃２．５分；１４サ イクルの９４℃１分、７０℃４分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。ＰＣＲ クリーンアップ、制限消化、および精製は、前記したように行なった。挿入体は 、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ２６４３１（ＩｇＧ２ｂリン カー／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ残基を含有するＢＨＫ発現ベクター）に以下 のように連結させた：１０μｌの反応容量中、５０ngの処理したベクター、挿入 体（１０：１ 挿入体：ベクター）、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ギブコビー アールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））、および１μｌの１０×リガーゼ緩衝液。 連結物を、周囲温度で１時間インキュベートし、次に２μｌの各連結物を取り、 これを使用して１００μｌの化学的にコンピタントなＤＨ１０Ｂ（あるいは、Ｄ Ｈ５α）細胞（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を製造業者の推奨 するプロトコールに従って形質転換した。各形質転換混合物の５分の１および２ ５分の１容量を、適当な抗生物質マーカーを補足したＬＢ寒天プレートに蒔いて 、３７℃で一晩（１４〜１６時間）インキュベートした。単離したコロニーを取 り上げ、前記したようにキアゲンミジプレップ（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｄｉｐｒｅ ｐ）プロトコールを使用してＤＮＡを調製した。 選択したクローンの配列解析を、２８／２９切断点（ｐＭＯＮ３５７１９）、 ３４／３５切断点（ｐＭＯＮ３５７２０）、６２／６３切断点（ｐＭＯＮ３５７ ２１）、６５／６６切断点（ｐＭ０Ｎ３５７２２）、８９／９０切断点（ｐＭＯ Ｎ３５７２３）、および９８／９９切断点（ｐＭＯＮ３５７２５）切断点につい て確認した。ｐＭＯＮ３５７２６は、９４／９５切断点について１つのアミノ酸 置換（Ｌｅｕ９４からＰｈｅ９４）を有する。３９／４０のＦｌｔ３Ｌ切断点お よび１０、１５、および２１ＡＡの異なるアミノ酸リンカー長さを有するＦｌｔ ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメラ作成体は、ｐＭＯＮ３５７０７、ｐＭ ＯＮ３５７０８、ｐＭＯＮ３５７０９、ｐＭＯＮ３５７１０、およびｐＭＯＮ３ ５７１１により示される。これらの作成体は、以下の鋳型の１つのＰＣＲ増幅に より生成した：ｐＭＯＮ３２３７３、ｐＭＯＮ３２３７５、またはｐＭＯＮ３２ ３７６、およびＦｌｔ３Ｌ特異的プライマー対３９Ｎ ＴＥＲＭ-１／ＳＮＡＢ ＩＣ ＴＥＲＭ。前記したように標準的ＰＣＲ反応混合物を設定し、ＤＮＡ生成 物を以下のパラメータを使用して増幅した：７サイクルの９４℃１分、６２℃２ 分、および７０℃２．５分；１２サイクルの９４℃１分、６８℃、２分、および ７０℃２．５分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。予測される挿入体サイズ に対応するＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩとＳｎａＢＩで完全に消化し、ゲル精製し、 前記したようにＦｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ２ｂ／Ｉ１−３受容体アゴニストＩキメラタ ンパク質として、哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ２６４３１（ＮｃｏＩ／Ｓｎａ ＢＩ／ＳＡＰ処理した）中にクローン化した。これらの作成体の２つは、配列並 べ替えＦｌｔ３キメラパートナー中にＰＣＲ取り込みエラーを有し、このためア ミノ酸置換Ｆ96からＬ96、Ｅ58からＧ58が起きた（ｐＭＯＮ３５７１０とｐＭＯ Ｎ３５７１１）。例１０５ 別のシリーズのキメラタンパク質である、前記したＦｌｔ３Ｌリガンドアミノ 酸残基３５／３６、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４１／４２、４２／ ４３、および６５／６６に対応する切断点と２１アミノ酸リンカーを有する配列 並べ替えＦｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩもまた、選択されたＩＬ−３ 受容体アゴニストＩ／配列並べ替えＦｌｔ３Ｌ作成体を鋳型として使用して作成 した（下記表１１を参照）。１つの例外は、１５アミノ酸リンカー鋳型（ｐＭＯ Ｎ３５７１５）を使用して６５／６６切断点、ｐＭＯＮ３５７１１を作成したこ とである。 表１１ Ｆｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ ＩＬ−３受容体アゴニストＩ／Ｆｌ ｔ３Ｌ ｐＭＯＮ３５７１９−３５７２５を作成するのに使用したものと同じ制限部位 をコードするプライマー対を使用した。逆プライマー３６Ｒｅｖ’、３７Ｒｅｖ ’、３８Ｒｅｖ’、３９Ｒｅｖ’、４１Ｒｅｖ’、４２Ｒｅｖ’、および４３Ｒ ｅｖ’を使用して、フレーム内ＳｎａＢＩ部位を作成した。同じ前進プライマー ＦＬｔ３６、ＦＬｔ３７、ＦＬｔ３８、ＦＬｔ３９、ＦＬｔ４１、ＦＬｔ４２、 およびＦＬｔ４３を使用した。ＰＣＲ反応混合物は、前記したものと同じである が、ｐＭＯＮ３５７１１を除いて、増幅条件は以下のように修飾した：１８サイ クルの９４℃１分、６８℃２分、および７０℃２．５分；次に７２℃７分の伸長 を１サイクル。。ｐＭＯＮ３５７７１については、増幅条件は以下の通りである ：６サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および７０℃２．５分；１５サイクル の９４℃１分、および７０℃４分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。例１０ ４に記載のように、Ｆｌｔ３特異的ＰＣＲ増幅産物を制限消化し、精製し、ｐＭ ＯＮ２６４３１（ＩｇＧ２ｂ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ残基を含有するＢＨ Ｋ発現ベクター）中にクローン化した。 １つの変種ｐＭＯＮ３２１７９を、ＰＣＲプライマー対Ｆｌｔ４０／３４Ｒｅ ｖとダイマー鋳型中間体Ｆｌｔ１１Ｎ．ｓｅｑとＦｌｔ１０Ｃ．ｓｅｑを使用し て３４／４０切断点として作成した。ＰＣＲ増幅条件と以後のクローニングは、 ｐＭＯＮ３５７１１をクローン化するのに使用したものと同一である。 ３つの追加のＦｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメラ（３８／３９切 断点）を設計し作成して、交互のリンカー長さと組成の影響を試験した。ｐＭＯ Ｎ３５７０９を鋳型として使用して、ＧｌｙＳｅｒリンカー長を拡張して、プラ イマー対ＢａｍＦｏｒ１／３８Ｒｅｖ（反応生成物をＰＣＲ Ａと呼ぶ）とＦｌ ｔ３８／ＢａｍＲｅｖ１（反応生成物をＰＣＲ Ｂと呼ぶ）を使用してモチーフ （ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）7Ｇｌｙを有する２９アミノ酸残基を包含させた 。増幅条件は以下の通りである：６サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および ７０℃２．５分；１５サイクルの９４℃１分、および７０℃４分；次に最後に７ ２℃７分を１サイクル。得られたＰＣＲ産物を、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ク リーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ（ＰＣ ＲＡ）またはＢａｍＨＩ／ＳｎａＢＩ（ＰＣＲ Ｂ）で消化し、ゲル精製し、前 記したようにｐＭＯＮ２６４３１（ＩｇＧ２ｂリンカー／ＩＬ−３受容体アゴニ ストＩ残基を有するＢＨＫ発現ベクター）に連結させた。得られた作成体を配列 決定して確認し、ｐＭＯＮ３５７７４と呼んだ。これと比較して、ＧｌｙＳｅｒ リンカーは、単一のアミノ酸置換を有する未変性のＦｌｔ３Ｌアミノ酸残基１４ ０−１５４（ｐＭＯＮ３５７７５）または１４０−１６０（ｐＭＯＮ３５７７６ ）により置換されているという点で、ｐＭＯＮ３５７７５と３５７７６は異なっ ていた。ＰＣＲ反応条件はｐＭＯＮ３５７７４について記載したものと同じであ るが、以下のプライマー対を使用した：３８Ｆｏｒ／Ｎａｖｆｏｒおよび３８Ｒ ｅｖ／ＮａｖＲｅｖＳ（ｐＭＯＮ３５７７５）；および３８Ｆｏｒ／Ｎａｖｆｏ ｒおよび３８Ｒｅｖ／ＮａｖＲｅｖＬ（ｐＭＯＮ３５７７６）。ＢａｍＨＩの代 わりにＫａｓＩを使用したが、それ以外はこれらのＰＣＲ増幅産物のクローニン グ工程は、ｐＭＯＮ３５７７４について使用したものと同一であった。配列解析 により、ｐＭＯＮ３５７７５と３５７７６の両方について、複数の単離体中でＰ ＣＲに誘導されたエラーが明らかになった。最終的な正しい配列を得るために、 選択されたサブクローンをＮａｒＩ／ＳｎａＢＩとＮｃｏＩ／ＮａｒＩで再消化 し、 これらのゲル精製断片を使用して、所望の作成体を再クローニングすることが必 要であった。ＢＨＫ一過性物質として試験するために、いくつかのＦｌｔ３Ｌキ メラ分子も作成した。ＩｇＧ２ｂリンカーにより連結された２つの未変性のＦｌ ｔ３Ｌ分子からなるｐＭＯＮ３２１７３を、以下のようにして２つの既存の分子 から組み立てた：ｐＭＯＮ３２３９３からのＮｃｏｌ／ＳｎａＢＩ Ｆｌｔ３Ｌ 含有挿入体を、ゲル精製したＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで切断したｐＭＯＮ３２３７ ７（ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメラパートナーは分離されている）に連結さ せた。同様に、ｐＭＯＮ３５７２７（３９／４０切断点、１５アミノ酸リンカー ）を、ｐＭＯＮ３５７０８からのＦｌｔ３Ｌ挿入体（ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入 体として）を使用して、ゲル精製したｐＭＯＮ３２３７５（ＩＬ−３受容体アゴ ニストＩキメラパートナーは分離されている）に組み立てた。第３のＦｌｔ３Ｌ ダイマーｐＭＯＮ３２１６８（３９／４０切断点、２１アミノ酸リンカー）を以 下のように組み立てた：ｐＭＯＮ３２１６５からのＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入体 （ｐＭＯＮ３２１６３のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片とｐＭＯＮ３５７０９のＢａ ｍＨＩ／ＨｉｎｄIII断片を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ５７２３ にサブクローニングすることにより組み立てた、ｐＭＯＮ３５７０９の大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）相当物）。ｐＭＯＮ３２１６５からのＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入 体（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）とｐＭＯＮ３２３７６から のＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIII挿入体（ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３ ９／４０）Ｌ２１）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生ベクターｐＭＯＮ５７２３ 中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１６７を作成した。次にｐＭＯＮ３２ １６７からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体をｐＭＯＮ３０３０４にサブクロー ニングし、ｐＭＯＮ３２１６８と呼んだ。例１０６ 制限消化しゲル精製した断片を使用して、既存の分子から、一連の３量体分子 ［それぞれが２つのＦｌｔ３Ｌ残基とＩＬ−３受容体アゴニストＩまたはＩＬ− ３受容体アゴニストII（ｐＭＯＮ１３４１６（ＷＯ９４／１２６３８）によりコ ードされるＩＬ−３受容体アゴニストであり、本明細書において「ＩＬ−３受容 体アゴニストII」と呼ぶ）の１つのコピーからなる］を作成した。ｐＭＯＮ３５ ７２８は、ｐＭＯＮ３２３７５からＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ（Ｆｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ ２ｂ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ）挿入体を使用し、ｐＭＯＮ３５７０８から ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII（ＩＬ−３受容体アゴニストＩ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ ３Ｌ）挿入体を使用して、組み立てた。次に２つの断片をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄII I／ＳＡＰ処理した哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ３９３４に再連結させ、前記 したようにサブクローニングした。ｐＭＯＮ３２１７３からのＮｃｏｌ／Ｈｉｎ ｄIII断片をｐＭＯＮ３０３０４のＡｆｌIII／ＨｉｎｄIII部位に連結させて、 ｐＭＯＮ３２２０５（ＩＬ−３受容体アゴニストII／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３１− １３９／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３ １−１３９）を組み立てた。同様のアプローチ を使用して、ｐＭＯＮ３２２０６（ＩＬ−３受容体アゴニストII／ＩｇＧ２ｂ／ Ｆｌｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２ １）を作成した。ｐＭＯＮ３２１６７からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片をゲル 精製し、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII消化ｐＭＯＮ３０３０４（これは、ＩＬ−３受 容体アゴニストII／ＩｇＧ２ｂ残基を有する）中にサブクローニングした。ｐＭ ＯＮ３２１７０からのゲル精製したＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体を中間体ｐＭ ＯＮ３２１９８（Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII）中にサブクローニングして、プラス ミドｐＭＯＮ３２２０７（Ｆｌｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌ ｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２１））／Ｇ−ＣＳＦ）を組み立てた。ｐＭＯＮ３０３ ２０（ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦとして）からのゲル精製したＳｎａＢＩ挿入体を 、ＳｎａＢＩ消化した／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３２１７３中にサブクローニン グして、ｐＭＯＮ３２２０８（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳ Ｆ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９）を組み立てた。ｐＭＯＮ３２１７３ からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体を、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII消化したｐＭ ＯＮ３Ｏ３Ｏ９（これはＧ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂを含有する）中にサブクローニ ングして、ｐＭＯＮ３２２０４を組み立てた。ｐＭＯＮ３２１９０からのＮｃｏ Ｉ／ＳａｃＩ挿入体とｐＭＯＮ３２１７１からのＳａｃＩ／ＨｉｎｄIII挿入体 を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ３０３０４中にサブクローニング して、ｐＭＯＮ３２１９５（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／Ｉ ｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ／Ｆｌｔ３ １−１３９（３９／４０）Ｌ ２１）を組み立てた。ｐＭＯＮ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂとして）か らのＮｃｏＩ／Ａｆ１III断片を、ＮｃｏＩ／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３２１６ ８（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ１ −１３９）中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１９６（Ｇ−ＣＳＦ／Ｉｇ Ｇ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３ Ｌ １−１３９）を組み立て、ＤＮＡ配列と制限解析により配向を確認した。ｐ ＭＯＮ３２１６７（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）／Ｌ２１／ＩｇＧ２ ｂ／Ｆ１ｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII 挿入体を、ｐＭＯＮ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ）のＡｆ１III／Ｈｉ ｎｄIII部位中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１９７（Ｇ−ＣＳＦ／Ｉ ｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）を作成した。例１０８ ＩＬ−３受容体アゴニストＩまたはＩＬ−３受容体アゴニストIIをキメラパー トナーとしてＧ−ＣＳＦで置換することにより、ＢＨＫ一過性物質として一連の Ｆｌｔ３Ｌ含有分子を作成した。ＢＨＫベクターｐＭＯＮ３９３４を使用して一 過性に発現され作成されたキメラタンパク質について、Ｇ−ＣＳＦ残基は、１７ 位でＳｅｒまたはＣｙｓをコードすることができた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発 現について使用したかまたは哺乳動物発現系で非一過性に発現された分子につい て、Ｇ−ＣＳＦパートナーの１７位はＳｅｒのみをコードした。ＢＨＫ発現作成 体として両方の配向で未変性のＦｌｔ３ＬとＧ−ＣＳＦのキメラを作成した：Ｇ −ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ（ｐＭＯＮ３０２３９）およびＦｌｔ３Ｌ／ ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ（ｐＭＯＮ３２１７５）。ｐＭＯＮ３０２３９は、ｐＭ ＯＮ３０２３８（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化物として）からのＦｌｔ３Ｌ １ −１３９挿入体を、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIIIで消化したｐＭＯＮ３０３０９（こ れはＧ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂを含有する）中にサブクローニングして組み立て、 ｐＭＯＮ３２１７５は、ｐＭＯＮ３２３９３からのゲル精製したＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩ挿入体から、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ２６４２０（これは ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する）を使用して作成した。第３の未 変性のＧ−ＣＳＦ／Ｆｌｔ３Ｌキメラ分子であるｐＭＯＮ３２１９１は、ＩｇＧ ２ｂキメラリンカーの代わりにＧｌｙＳｅｒリンカーを有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）発現のために設計されている点で、ｐＭＯＮ３２１７５とは異なる。ｐＭ ＯＮ３２１９１は、ｐＭＯＮ３２３９３からの同じゲル精製したＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩ挿入体を使用して、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３１１２３（ これはＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する）中に、組み立てた。ＢＨＫ 相当物であるｐＭＯＮ３５７６７は、ｐＭＯＮ３２１９１からのゲル精製したＮ ｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIキメラ遺伝子を、ＢＨＫベクターｐＭＯＮ３９３４中にサ ブクローニングすることにより組み立てた。例１０９ ＩＬ−３受容体アゴニストＩ成分をＧ−ＣＳＦで置換することにより、２つの シリーズの配列並べ替えＦｌｔ３Ｌキメラを作成した。配向Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ ２Ｂ/配列並べ替えＦｌｔ３Ｌを有する第１のセットは、基本的に以下のように 組み立てた：ｐＭＯＮ３０２３９（Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １− １３９）をＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ベクター含有Ｇ−ＣＳＦ残基を 前記のようにゲル精製した。以下の表１２に示す適切なＩＬ−３受容体アゴニス トＩ／Ｆｌｔ３Ｌ作成体からのＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIII消化した挿入体を、ｐ ＭＯＮ３０２３９（ＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIII）中にサブクローニングした。 表１２ Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ作成体とそのＩＬ−３受容体アゴニストＩ 類似体 ｐＭＯＮ３２１６３からのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ挿入体とｐＭＯＮ３２７３０ からのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII挿入体を使用して、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII消 化したｐＭＯＮ３０３０９中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１６９（Ｇ −ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）を組み 立てた。このシリーズの３つの分子は、直接のＩＬ−３受容体アゴニストＩに対 応するものを持たない。第１のｐＭＯＮ３９９１４は、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII で消化したＢＨＫ発現ベクターｐＭＯＮ３０３０９（これはＧ−ＣＳＦ／ＩｇＧ ２ｂを含有する）と、ｐＭＯＮ３２２４３（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIとして）か らのＦｌｔ３ １−１３９（３９／４０）Ｌ２９挿入体を使用して組み立てた。 ｐＭＯＮ３９９１５について、ｐＭＯＮ３２２４２からのＦｌｔ３Ｌ １−１５ ４（３９／４０）遺伝子（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体として）を、親ベクタ ーｐＭＯＮ３０３０９中にサブクローニングした。ｐＭＯＮ３９９１６はｐＭＯ Ｎ３９９１５と全く同様に組み立てたが、ｐＭＯＮ３２２５２からのＦｌｔ３Ｌ １−１６０（３９／４０）挿入体を使用した。ｐＭＯＮ３２２４２、３２２４ ３、および３２３５２は、非キメラ、配列並べ替えＦｌｔ３Ｌ遺伝子（ＮｃｏＩ ／ＨｉｎｄIIIとして）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現作成体である。 最後に、ｐＭＯＮ３５７９９からの挿入体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現 のためにｐＭＯＮ５７２３（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片として）中にサブクロ ーニングした。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生プラスミドを、ｐＭＯＮ３９９ ０４と名付けた。例１１０ 配向Ｆｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦを有する多くの第２シリーズのＧ− ＣＳＦキメラはまた、表１３に示すようにそのＩＬ−３受容体アゴニストＩ類似 体として作成した。 表１３ Ｆｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ作成体とそのＩＬ−３受容体アゴニストＩ 類似体 これらの作成体は、上記表中のＦｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメ ラタンパク質からのＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化ｐＭＯＮ３６１１３（ＩｇＧ２ｂ ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有するＢＨＫベクター）と特異的ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ 消化配列並べ替えＦＩｔ３Ｌ挿入体を使用して、組み立てた。得られたプラスミ ドを、ｐＭＯＮ３２１７０、ｐＭＯＮ３２８７１、ｐＭＯＮ３２２７１、ｐＭＯ Ｎ３２１７２、ｐＭＯＮ３２１７４、ｐＭＯＮ３５７５１、ｐＭＯＮ３５７５２ 、ｐＭＯＮ３５７５３、ｐＭＯＮ３５７５４、ｐＭＯＮ３５７５５、ｐＭＯＮ３ ５７５６、ｐＭＯＮ３５７５７、ｐＭＯＮ３５７５８、ｐＭＯＮ３５７５９、ｐ ＭＯＮ３５７６０、ｐＭＯＮ３５７６１、ｐＭＯＮ３５７６２、ｐＭＯＮ３５７ ６３、ｐＭＯＮ３５７６４、ｐＭＯＮ３５７６５、ｐＭＯＮ３５７６６、ｐＭＯ Ｎ３５７６７、ｐＭＯＮ３５７６８、ｐＭＯＮ３５７７０、ｐＭＯＮ３５７７２ 、ｐＭＯＮ３５７７３、ｐＭＯＮ３５７７７、ｐＭＯＮ３５７７８、ｐＭＯＮ３ ５７７９、ｐＭＯＮ３５７８０、ｐＭＯＮ３５７８２、およびｐＭＯＮ３９９０ ８と名付けた。 ｐＭＯＮ３５７７７とｐＭＯＮ３５７８８はＰＣＲにより作成し、ｐＭＯＮ３ ５７７５とｐＭＯＮ３５７７６について記載したものと同じＮｃｏＩ／ＮａｒＩ とＮａｒＩ／ＳｎａＢＩ挿入体から組み立てたが、ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝 子を含有する親ベクターとしてＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３５７５ １を使用した。ｐＭＯＮ３５７７８の３９／４０切断点相当物を作成するために 、プライマー対Ｆｌｔ４０／ＳｎａＢＩ Ｃ−ｔｅｒｍを使用してｐＭＯＮ３５ ７７８鋳型を再増幅した。増幅条件は、ｐＭＯＮ３５７７１について記載したも のと同様であるが、最初のＴannealを６６から５５℃に下げた。得られた作成体 をｏｐＭＯＮ３５７８２（Ｆｌｔ３ １−１６０（３９／４０）／ＩｇＧ２ｂ／ Ｇ−ＣＳＦ）と名付けた。 ｐＭＯＮ３２１７０（Ｆｌｔ３ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ Ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ２６４３０（これ はＩｇＧ２Ｂ／Ｇ−ＣＳＦを含有する）中に連結させた、ｐＭＯＮ３２１６５か らＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入体を使用して組み立てた。ｐＭＯＮ３５７６４（Ｆ ｌｔ３Ｌ（３８／３９）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は以下のようにクロ ーン化した：配列並べ替えＦｌｔ３Ｌ挿入体を、鋳型としてｐＭＯＮ３５７３６ とプライマー対Ｆｌｔ３９／３９Ｒｅｖを使用してＰＣＲ増幅した。増幅条件は 、ｐＭＯＮ３５７７１について使用したものと同じであるが、最初のＴannealを ６６から５６℃に下げた。ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したＰＣＲ増幅物を、Ｉｇ Ｇ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ ３５７５４中にサブクローニングした。ｐＭＯＮ３５７６８（Ｆｌｔ３Ｌ（３８ ／３９）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は、Ｆｌｔ３キメラパートナーの残 基１５に突然変異（ＳｅｒからＰｈｅ）を有する。ｐＭＯＮ３５７６２（Ｆｌｔ ３鋳型ｐＭＯＮ３５７３９）、ｐＭＯＮ３５７６３（Ｆｌｔ３鋳型３５７３８） 、ｐＭＯＮ３５７５８（Ｆｌｔ３鋳型３５７４０）、ｐＭＯＮ３５７７０（Ｆｌ ｔ３Ｌ鋳型としてｐＭＯＮ３５７４３）は、ｐＭＯＮ３５７６４について記載し たものと全く同様にして作成した。ｐＭＯＮ３５７６０中の配列並べ替えＦｌｔ ３遺伝子のＳ125からＦ125への突然変異体であるｐＭＯＮ３５７７２を、Ｆｌｔ ３鋳型としてのｐＭＯＮ３５７１５とプライマー対６５Ｆ ｏｒ／６５ＳｎａＢＩを使用して、ＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲサイク ル条件は、前記したｐＭＯＮ３５７３３、ｐＭＯＮ３５７３４、ｐＭＯＮ３５７ ３５およびｐＭＯＮ３５７３６からのＦｌｔ３遺伝子を増幅するのに使用したも のと同一である。ｐＭＯＮ３５７６１は、ｐＭＯＮ３５７５８中の配列並べ替え Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子のＱ133からＲ133への突然変異体である。ｐＭＯＮ３５７７３ （Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３８／３９）Ｌ２９／ＩｇＧ２Ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は 、ｐＭＯＮ３５７７４について前記したようにクローン化したが、ＩｇＧ２ｂ／ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有するｐＭＯＮ２６４３０（ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ／ＳＡ Ｐ処理した）を親ベクターとして使用した。 ３９／４０切断点相当物を作成するために、ＰＣＲ増幅反応でプライマー対Ｆ ｌｔ４０／ＳｎａＢＩ Ｃ−ｔｅｒｍとともにｐＭＯＮ３５７７３を鋳型として 使用した。増幅は、ｐＭＯＮ３５７７１について前記したものと全く同様に行な った。ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化した増幅産物をｐＭＯＮ２６４３０（ＮｃｏＩ ／ＳｎａＢＩ／ＳＡＰ処理した）中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ３５７７９ （Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２９／ＩｇＧ２Ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）を 得た。ｐＭＯＮ３５７８０はｐＭＯＮ３５７７９の変種であり、配列並べ替えＦ ｌｔ３キメラパートナー中の単一のアミノ酸突然変異（Ｌ60からｐ60へ）をコー ドする。ｐＭＯＮ３２１９０（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ ＧＳ／Ｇ−ＣＳＦ）は、交互のＧｌｙＳｅｒキメラリンカーを有し、これはｐＭ ＯＮ３２１７０のＩｇＧ２ｂリンカーを置換している。ｐＭＯＮ３２１６５（大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＯＮ５７２３中のＦｌｔ３Ｌ １−１３ ９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ）からのＮ ｃｏＩ／ＳｎａＢＩ断片Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子を、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐ ＭＯＮ３１１２３中にサブクローニングした。ＢＨＫ発現相当物であるｐＭＯＮ ３５７６６は、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片として全Ｆｌｔ３Ｌ／ＧｌｙＳｅｒ ／Ｇ−ＣＳＦキメラ挿入体をサブクローニングすることにより作成した。 ｐＭＯＮ３９９０８はｐＭＯＮ３５７７９に類似しているが、Ｆｌｔ３Ｌアミ ノ酸残基１３３−１６０は、アミノ酸配列ＶＥＴＶＦＨＲＶＳＱＤＧＬＤＬＬＴ Ｓ 配列番号７９８（これは、Ｆｌｔ３Ｌ（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受 け入れ番号ＨＳＵ２９８７４）の交互のスプライス変種と相同的である）により 置換されている。ｐＭＯＮ３２１９０は、以下のセットのプライマー対Ｆｌｔ４ ０／ＸｂａＲｅｖとＳｎａＢＩＣｔｅｒｍ／ＸｂａＦｏｒとともにＰＣＲ鋳型と して使用した。増幅条件は、ｐＭＯＮ３５７７１について前記したように行なっ たが、最初のＴannealを６６から６４℃に下げた。ゲル精製したＰＣＲ増幅産物 を、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ（Ｆｌｔ４０／ＸｂａＲｅｖ ＰＣＲ産物）またはＸｂ ａＩ／ＳｎａＢＩ（ＳｎａＢＩＣｔｅｒｍ／ＸｂａＦｏｒ ＰＣＲ産物）で消化 し、ｐＭＯＮ２６４３０（ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ／ＳＡＰ処理した）中にサブク ローニングした。ｐＭＯＮ３２２７３（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０） Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）を、プライマー対ＦｌｔＣｏｎＮｃｏ／Ｇｒ ｅｖとともにｐＭＯＮ３５７７７のＰＣＲにより作成して、３８／３９Ｆｌｔ３ Ｌ残基を３９／４０として再増幅した。精製したアンプリコンをＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３２１９１中にサブク ローニングし、ｐＭＯＮ３２２５９と名付けた（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生用 ）。ＢＨＫ発現のために、ｐＭＯＮ３２２５９からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿 入体をｐＭＯＮ３９３４（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII）中にサブクローニングした 。例１０３ 別のシリーズのキメラタンパク質を作成し、ここでＦｌｔ３Ｌパートナーは１ つまたは２つのＣｙｓ突然変異を有した（表ＸＩＡとＸＩＢ）。鋳型としてのｐ ＭＯＮ３２１９１とプライマー対Ｃ１Ｆｏｒ／Ｃ３ＲｅｖとＣ３Ｆｏｒ／１３９ Ｒｅｖを使用してＰＣＲにより２つの反応で、ｐＭＯＮ３５７９０（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ4→Ｓ4、Ｃ85→Ｓ85）／ＧＳ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））を作 成した。鋳型としてのｐＭＯＮ３２１９１とプライマー対Ｃ５Ｆｏｒ／Ｃ６Ｒｅ ｖとＣ５Ｒｅｖ／Ｎ−ｔｅｒｍを使用してＰＣＲにより、ｐＭＯＮ３５７９１（ Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ93→Ｓ93、Ｃ132→Ｓ132）／ＧＳ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓ ｅｒ１７））を作成した。増幅条件は、ｐＭＯＮ３５７７１について前記したよ うに行なったが、最初のＴannealを６６から６４℃に下げた。第１ラウンドのア ンプリコン（各１０μｌ）を使用して第２ラウンドのＰ ＣＲを行い、次にＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで消化し、Ｎｃｏ Ｉ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３２１９１中にサブクローニングした。第２ラ ウンドのＰＣＲ増幅条件は、以下のように修飾した：最初のＴannealを６８℃に 上げ、サイクル数を６から１５に上げた。追加の増幅は必要なかった。これらの 作成体ｐＭＯＮ３５７８７（Ｃ4→Ｓ4、Ｃ85→Ｓ85）とｐＭＯＮ３５７８８（Ｃ93 →Ｓ93、Ｃ132→Ｓ132）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のために使用した。 正しく突然変異したＦｌｔ３Ｌ／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦキメラ挿入体をＮｃ ｏＩ／ＨｉｎｄIII断片としてｐＭＯＮ３９３４中にサブクローニングして、Ｂ ＨＫ発現相当物ｐＭＯＮ３５７９０と３５７９１を作成した。鋳型としてのｐＭ ＯＮ３２１９１とプライマー対ＦＬＤ１Ｒｅｖ／ＦｌｔＮＴｅｒｍを使用してＰ ＣＲにより、ｐＭＯＮ３５７９２（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３２（Ｃ132→Ｓ132）／ ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））を作成した。鋳型としてのｐＭＯＮ ３２１９１とプライマー対ＦＬＭ１Ｒｅｖ／ＦｌｔＮＴｅｒｍを使用してＰＣＲ により、ｐＭＯＮ３９９０５（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ132→Ｓ132）／Ｇｌ ｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））を作成した。ｐＭＯＮ３９９０６（Ｆｌ ｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ127→Ｓ127／Ｃ32→Ｓ132）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳ Ｆ（Ｓｅｒ１７））は、配列並べ替えＦｌｔ３Ｌパートナーの残基１２７に１つ のアミノ酸置換を含有し、これはｐＭＯＮ３９９０５のＰＣＲ増幅中のＰＣＲ誘 導性のエラーの結果である。ｐＭＯＮ３２２７６（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３ ９／４０）Ｌ２１（Ｃ4→Ｓ4、Ｃ85→Ｓ85）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅ ｒ１７））は、２ラウンドのＰＣＲにより作成した。３つの初期アンプリコンを 作成した：ＰＣＲ１（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／８５Ｎ ）；ＰＣＲ７（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対４Ｎ／８５Ｓ）；および ＰＣＲ４（ｐＭＯＮ３２１９８鋳型とプライマー対４Ｓ／３６０５Ｒｅｖ）。第 ２ラウンドのために、ＰＣＲ１、４、および７を、組合せ混合物中で再増幅し、 ＰＣＲ Ａを得た。ＰＣＲＡを精製し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで消化し、ｐＭＯ Ｎ３０２７７（ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ）にサブクローニングした。次に３つ の作成体を、同様の方法で作成した。ｐＭＯＮ３２２７７（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ １７）／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌ ｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１（Ｃ4→Ｓ4／Ｃ85→Ｓ85））第１ラウ ンドＰＣＲは、３つの初期アンプリコンを生成した：ＰＣＲ１（ｐＭＯＮ３２１ ９０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／８５Ｎ）；ＰＣＲ７（ｐＭＯＮ３２１９０鋳 型とプライマー対４Ｎ／８５Ｓ）；およびＰＣＲ６（ｐＭＯＮ３２１６９鋳型と プライマー対４Ｓ／３６０５Ｒｅｖ）。第２ラウンドのために、ＰＣＲ１、６、 および７を、組合せ混合物中で再増幅し、ＰＣＲ Ｂを得た。ＰＣＲ Ｂを精製 し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）／ＩｇＧ２Ｂ）にサブクローニングした 。ｐＭＯＮ３２２７８（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１（Ｃ93→ Ｓ93／Ｃ132→Ｓ132）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））第１ラウン ドＰＣＲは、３つの初期アンプリコンを生成した：ＰＣＲ２（ｐＭＯＮ３２１９ ０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／９３Ｎ）；ＰＣＲ８（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型 とプライマー対１３２Ｎ／９３Ｓ）；およびＰＣＲ３（ｐＭＯＮ３２１９８鋳型 とプライマー対１３２Ｓ／３６０５Ｒｅｖ）。第２ラウンドのために、ＰＣＲ２ 、３、および８を、組合せ混合物中で再増幅し、ＰＣＲ Ｃを得た。ＰＣＲ Ｃ を精製し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで消化し、ｐＭＯＮ３０２７７（ＧｌｙＳｅｒ ／Ｇ−ＣＳＦ）にサブクローニングした。ｐＭＯＮ３２２７９ Ｇ−ＣＳＦ（Ｓ ｅｒ１７）／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１（Ｃ93 →Ｓ93／Ｃ132→Ｓ132）第１ラウンドＰＣＲは、３つの初期アンプリコンを生成 した：ＰＣＲ２（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／９３Ｎ）； ＰＣＲ８（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対１３２Ｎ／９３Ｓ）；および ＰＣＲ５（ｐＭＯＮ３２１６９鋳型とプライマー対１３２Ｓ／３６０５Ｒｅｖ） 。第２ラウンドのために、ＰＣＲ２、５、および８を、組合せ混合物中で再増幅 し、ＰＣＲ Ｄを得た。ＰＣＲ Ｄを精製し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し 、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１ ７）／ＩｇＧ２Ｂ）にサブクローニングした。例１１２ ｐＭＯＮ３９９０９（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＧＳ／ Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２））は、両方のタンパク質で配列が 並べ替えられている２つのＦｌｔ３／Ｇ−ＣＳＦキメラタンパク質の１つである 。Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＧｌｙＳｅｒ遺伝子を含むｐ ＭＯＮ３２１９８からのＮｃｏＩ／Ａｆ１III断片を、ＮｃｏＩ／ＳＡＰ処理し たｐＭＯＮ２５１８７（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２）の単一の コピーを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生プラスミド）中にサブクローニン グした。ＤＮＡ配列確認後、キメラ挿入体をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片として ｐＭＯＮ３９３４中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ３９９０９と名付けた。ｐ ＭＯＮ３９９１０（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２／ＩｇＧ２Ｂ／ Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）を、鋳型としてのｐＭＯＮ２５ １８７とプライマー対ＧＰＦｏｒ１／ＧＰＲｅｖ２を使用して作成した。増幅条 件は、ｐＭＯＮ３９９０８について使用したものと同一である。ＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩ消化したＧ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２）を、ＩｇＧ２Ｂ／ Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１遺伝子を含有するｐＭＯＮ３２３ ７６のＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ部位にサブクローニングした。例１１３ ｐＭＯＮ４００００は、ＮＳ０細胞中で発現するためのＧ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１ ７）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１を含有する ｐＣ１ｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））から修飾した産生プラスミドであ る（ｐＭＯＮ３２１６９はＢＨＫ相当物である）。ｐＭＯＮ４００００は、ＣＭ Ｖ ＩＥプロモーター／エンハンサー成分、ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）／ＧｌｙＳｅ ｒ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１のすぐ上流にＩＬ−３リーダ ー配列、端を切り取ったチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙ Ａシグナル配列、およびいくつかのＤＮＡｓｅ１高感受性領域（ＩｇＨ３ｍｉｎ ＬＣＲの一部）を含有する。例１１４ 多機能性キメラ造血受容体アゴニストの生物活性 表１４ インビトロ多機能性キメラ造血受容体アゴニストバイオアッセイ凡例：+ ：対照と比較して力価の低下（右へシフト）++ ：対照と同等の力価（２倍以内）+++ ：対照と比較して力価の上昇（左へシフト） １対照と比較して：ｐＭＯＮ３０２４７ ２対照と比較して：ｐＭＯＮ３２３５２ ３適当な同時添加対照と比較して ４クローンｐＭＯＮ４００００とｐＭＯＮ４０００２のプール中で分析例１１５ 生物活性測定 表１５ エクスビボ多機能性キメラ造血受容体アゴニストバイオアッセイ 表１５続き１凡例：+ ：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦと比較して活性の低下（文献の対 照）++ ：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦと比較して同等の活性（（文献の 対照）（２０％以内））+++ ：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦと比較して活性の上昇（文献の 対照） 培養条件：Ｘ−Ｖｉｖｏ１０培地、３７℃、５％ＣＯ2、１１日間インキュベー ション ２凡例：+ ：ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＮＦａ、ＳＣＲと比較して活性の低下（文献の対照）++ ：ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦａ、ＳＣＲと比較して同等の活性（（文献の対照）（ ２０％以内））+++ ：ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＮＦａ、ＳＣＲと比較して活性の上昇（文献の対照） 培養条件：１００ng／mlのＧＭ-ＣＳＦ、１００ng／mlのＴＮＦａ、２０ng／ml のＳＣＦ補足ＩＭＤＭ−２０培地、３７℃、５％ＣＯ2で１８〜２２日間ＭＦＲ アゴニストＩ＝ｐＭＯＮ３１１４０（ＷＯ９５／２１１９７） ＭＦＲアゴニストII＝ｐＭＯＮ２８５７１（ＷＯ９７／１２９８５） 造血エクスビボ拡張測定法 ヒト骨髄のＣＤ３４+濃縮始原細胞を単離し、サイトカイン拡張能力の評価の ために、Ｘ−Ｖｉｖｏ１０＋１％ＨＳＡ中５×１０4細胞／mlで、試験サイトカ インおよび対照とともに培養した。細胞を拡張し、細胞増殖に依存してほぼ５日 目に５×１０4細胞／mlで新しい培地とサイトカインで再度プレートに蒔いた。 １０日目に細胞を採取し、性状解析した。プレートから細胞を採取し、１×１０6 細胞／mlの濃度に希釈した。総細胞拡張を測定し、細胞を、メチルセルロース 中で拡張前および後ＣＦＵ（ステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メトカルト（Ｍｅｔｈｏｄｃｕｌｔ）ＨＣＣ３５３ ４）により造血始原細胞について性状解析した。拡張した細胞はまた、フローサ イトメトリーによりリガーゼ特異的フェノタイピングについて性状解析した：Ｃ Ｄ１１ｂ（ＰＥ）／ＣＤ１５（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４１ａ （ＦＩＴＣ）。 樹状細胞エクスビボ拡張測定法 ヒト骨髄のＣＤ３４+濃縮始原細胞を単離し、拡張能力の評価のために、ＩＭ ＤＭ／２０％ＦＣＳ中２×１０5細胞／mlで、試験サイトカインおよび対照とと もに培養した。細胞を拡張し、細胞増殖に依存してほぼ５日目に５×１０4細胞 ／mlで新しい培地とサイトカインで再度プレートに蒔いた。１８〜２２日目に細 胞を採取し、性状解析した。総細胞拡張を測定した。拡張した細胞を、系統特異 的フェノタイピングについてフローサイトメトリーにより性状解析した：ＨＬＡ −ＤＲ＋（ＰＥ）／ＣＤ１ａ＋（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６＋（ＰＥ）／ＣＤ１ａ＋ （ＦＩＴＣ）、ＣＤ１９−（ＦＩＴＣ）。樹状細胞拡張倍率を、総細胞拡張×％ ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１ａ＋として測定した。細胞の機能活性は、１元混合リン パ球反応を使用して測定した。、洗浄し照射した培養樹状細胞を、９６ウェルマ イクロタイタープレート中の同種レスポンダー末梢血単核細胞に段階的な量で添 加した。抗原提示細胞として作用する樹状細胞の能力を、3Ｈチミジン取り込み により測定した応答性細胞調製物中の刺激された増殖の程度により測定した。例１１６ 受容体結合 表１６ 受容体結合解析： データは、３重測定で測定した少なくとも３つの実験からの平均”ＳＥＭとして 表すが、ｐＭＯＮ３２３６０では実験は（２）回しか行わなかった。 キメラ分子を含有するＦｌｔ−３アゴニストのアフィニティを、受容体結合測 定法で評価した。Ｆｌｔ３−Ｆｃを直接固定化してＢＩＡＣＯＲＥ解析を行ない 、会合定数および解離定数を測定してＫd値を計算した。キメラ分子と、ＢａＦ ３細胞中でトランスフェクションしたＧ−ＣＳＦ受容体との、またはＢＨＫ細胞 中で発現されるＩＬ−３受容体の”サブユニットとの、相互作用を評価するため に、競合結合測定法を利用した。これらの細胞を使用する競合測定法は、アゴニ スト特異的放射性リガンドを使用し、用量応答曲線のロジット−ログ解析を使用 して、競合キメラについてのＩＣ50値を得た。例１１７ インビボ生物活性 表１７ マウスインビボ多機能性キメラ造血受容体アゴニスト測定データ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｐＭＯＮ３０２４７、ｐＭＯＮ３２３４２またはｐ ＭＯＮ３２３６０（１５０μｇ／日）またはｐＭＯＮ３２１９１（２００μｇ／ 日）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、２００μｇ／日）を、１０日間皮下 注射した。１１日目に、心臓穿刺により致死出血を行なった。全血にっいて白血 球数を得た。末梢血白血球は、勾配遠心分離（ヒストペーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑ ｕｅ））と次に塩化アンモニウム溶解を行い、さらに赤血球を除去して、得た。 直接フルオレセインまたはフィコエリトリン結合モノクローナル抗体（ファルミ ンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用するフローサイトメトリーのために、 細胞を染色した。染色前に非特異Ｆｃ受容体結合を、ＦｃＢｌｏｃｋ（ファルミ ンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用してブロックした。ＦａｃＳｃａｎフ ローサイトメトメーター（ベクトン／ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ））で細胞を解析した。陽性細胞のパーセントを、積分により決定し 、ＷＢＣ計測に基づき表現型の数を計測した。処理した動物の牌臓を無菌的に採 取し、針でＲＰＭＩ培地中で細かく切断した。５ｃｃシリンジのプランジャーの 平らな端を使用し、次に綿栓で濾過して固まりを除去 して、細胞懸濁液を得た。塩化アンモニウム溶解により赤血球を除去し、細胞を 洗浄し、再懸濁し、コールターカウンター（コールターエレクトロニクス（Ｃｏ ｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ））を使用して計測した。前記したように 細胞をフローサイトメトリーのために調製した。表現型は、陽性表現型と総脾臓 ＷＢＣ数のパーセントに基づく細胞／脾臓の数として表した。１．５×１０5脾 臓細胞／１mlを、メチルセルロースの３重測定のウェルにマウスサイトカインｗ ／ｏエリスロポエチン（ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ＣｅｌｌＴｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で蒔いて、ＣＦＵ培養物を得た。培養物を３７℃で１０ 日間インキュベートし、倒立顕微鏡で計測した。ＣＦＵは、＞５０細胞を有する 細胞のコロニーとして定義した。ＣＦＵ／脾臓の増加倍率を測定した（ＣＦＵ総 数／試験化合物の脾臓／ＣＦＵの総数／ＭＳＡ対照の脾臓）。末梢血のＭＳＡ対 照値は、Ｉ−Ａb+／ＣＤ１１ｃ+とＩ−Ａb+／ＣＤ８ｃ+について、それぞれ１５ および３４７細胞／μｌであった。脾臓ＷＢＣのＭＳＡ対照値は、Ｉ−Ａb+／Ｃ Ｄ１１ｃ+とＩ−Ａb+／ＣＤ８ｃ+について、２および１×１０6細胞／脾臓であ った。 さらなる説明がなくても前記説明を利用して、当業者は本発明を最大限に利用 できると考えられる。従って以後の好適な実施態様は単に例示のためのみであり 、決して本発明の開示の残りの部分を限定するものではない。 タンパク質精製およびバイオアッセイのような分子生物学的方法に関するさら なる詳細は、ＷＯ９４／１２６３９、ＷＯ９４／１２６３８、ＷＯ９５／２０９ ７６、ＷＯ９５／２１１９７、ＷＯ９５／２０９７７、ＷＯ９５／２１２５４お よびＷＯ９６／２３８８８に見い出すことができるが、これらはその全体が参照 により本明細書に組み込まれる。 本明細書に引用される全ての参考文献、特許または出願は、その全体が本明細 書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。 種々の他の例は、本発明の開示を読んだ後に、本明細書の精神と範囲から逸脱 することなく当業者には明らかであろう。全てのそのような他の例は、添付した 請求の範囲に含まれることが意図されている。 （２）配列番号：８５８の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１７４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝１位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒ ｇ、ＴｙｒまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２ （Ｄ）他の情報：／注＝２位置に存在するＸａａはＰｒｏまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３ （Ｄ）他の情報：／注＝３位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙ ｒまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１３ （Ｄ）他の情報：／注＝１３位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈ ｉｓ、ＴｈｒまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６ （Ｄ）他の情報：／注＝１６位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１７ （Ｄ）他の情報：／注＝１７位置に存在するＸａａはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇ ｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１８ （Ｄ）他の情報：／注＝１８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐ ｒｏ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２２ （Ｄ）他の情報：／注＝２２位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓ ｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２４ （Ｄ）他の情報：／注＝２４位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔ ｙｒまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２７ （Ｄ）他の情報：／注＝２７位置に存在するＸａａはＡｓｐまたはＧｌｙ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３０ （Ｄ）他の情報：／注＝３０位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌ ｅｕまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３４ （Ｄ）他の情報：／注＝３４位置に存在するＸａａはＬｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３６ （Ｄ）他の情報：／注＝３６位置に存在するＸａａはＣｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４２ （Ｄ）他の情報：／注＝４２位置に存在するＸａａはＣｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４３ （Ｄ）他の情報：／注＝４３位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＣｙｓまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４４ （Ｄ）他の情報：／注＝４４位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａ ｒｇ、ＡＳＰ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４６ （Ｄ）他の情報：／注＝４６位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｐ ｈｅ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４７ （Ｄ）他の情報：／注＝４７位置に存在するＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４９ （Ｄ）他の情報：／注＝４９位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ａ ｒｇまたはＳｅｒ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５０ （Ｄ）他の情報：／注＝５０位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈ ｉｓ、ＰｒｏまたはＴｙｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５４ （Ｄ）他の情報：／注＝５４位置に存在するＸａａはＬｅｕまたはＨｉｓ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６４ （Ｄ）他の情報：／注＝５４位置に存在するＸａａはＣｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６７ （Ｄ）他の情報：／注＝６７位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌ ｅｕまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７０ （Ｄ）他の情報：／注＝７０位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌ ｅｕ、ＡｒｇまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７４ （Ｄ）他の情報：／注＝７４位置に存在するＸａａはｃｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０４ （Ｄ）他の情報：／注＝１０４位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｇｌｙま たはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０８ （Ｄ）他の情報：／注＝１０８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１５ （Ｄ）他の情報：／注＝１１５位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｈｉｓ、 ＬｅｕまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２０ （Ｄ）他の情報：／注＝１２０位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｇｌｙ、 Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２３ （Ｄ）他の情報：／注＝１２３位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ａｒｇ、 ＰｈｅまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１４４ （Ｄ）他の情報：／注＝１４４位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｈｉｓ、 Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＧｌｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１４６ （Ｄ）他の情報：／注＝１４６位置に存在するＸａａはＡｒｇまたはＧｌ ｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１４７ （Ｄ）他の情報：／注＝１４７位置に存在するＸａａはＡｒｇまたはＧｌ ｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１５６ （Ｄ）他の情報：／注＝１５６位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｇｌｙま たはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１５９ （Ｄ）他の情報：／注＝１５９位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ａｒｇ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６２ （Ｄ）他の情報：／注＝１６２位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｌｅｕ、 ＧｌｙまたはＴｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６３ （Ｄ）他の情報：／注＝１６３位置に存在するＸａａはＶａｌ、Ｇｌｙ、 ＡｒｇまたはＡｌａ： （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６９ （Ｄ）他の情報：／注＝１６９位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｓｅｒ、 Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１７０ （Ｄ）他の情報：／注＝１７０位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ａｒｇま たはＳｅｒ； （ｘｉ）配列：配列番号：８５８（２）配列番号：８５９の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さ：１３３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１７ （Ｄ）他の情報：／注＝１７位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇ ｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１８ （Ｄ）他の情報：／注＝１８位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌ ｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１９ （Ｄ）他の情報：／注＝１９位置に存在するＸａａはＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉ ｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２０ （Ｄ）他の情報：／注＝２０位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＰｒｏまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２１ （Ｄ）他の情報：／注＝２１位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌ ｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまた はＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２２ （Ｄ）他の情報：／注＝２２位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐ ｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまた はＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２３ （Ｄ）他の情報：／注＝２３位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＳｅｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２４ （Ｄ）他の情報：／注＝２４位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖ ａｌ、Ａｒｇ、ｓｅｒ、ｐｈｅ、Ｌｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２５ （Ｄ）他の情報：／注＝２５位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇ ｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＰｒｏまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２６ （Ｄ）他の情報：／注＝２６位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２７ （Ｄ）他の情報：／注＝２７位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｙ、Ａ ｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２８ （Ｄ）他の情報：／注＝２８位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｌ ｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＴｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２９ （Ｄ）他の情報：／注＝２９位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌ ｅｕ、ｐｒｏ、ＡｒｇまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３０ （Ｄ）他の情報：／注＝３０位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＬ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３１ （Ｄ）他の情報：／注＝３１位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３２ （Ｄ）他の情報：／注＝３２位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ａ ｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３３ （Ｄ）他の情報：／注＝３３位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｎ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＧｌｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３４ （Ｄ）他の情報：／注＝３４位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉ ｌｅまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３５ （Ｄ）他の情報：／注＝３５位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇ ｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３６ （Ｄ）他の情報：／注＝３６位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｌｅｕまた はＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３７ （Ｄ）他の情報：／注＝３７位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐ ｒｏ、ＴｒｐまたはＩｌｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３８ （Ｄ）他の情報：／注＝３８位置に存在するＸａａはＡｓｎまたはＡｌａ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｌｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４０ （Ｄ）他の情報：／注＝４０位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｔｒｐまた はＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４１ （Ｄ）他の情報：／注＝４１位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｃｙｓ、Ａ ｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、ＭｅｔまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４２ （Ｄ）他の情報：／注＝４２位置に存在するＸａａはＧｌｙ、Ａｓｐ、Ｓ ｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔ ｙｒ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４３ （Ｄ）他の情報：／注＝４３位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｔ ｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｙまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４４ （Ｄ）他の情報：／注＝４４位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌ ｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａ ｌａまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４５ （Ｄ）他の情報：／注＝４５位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐ ｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４６ （Ｄ）他の情報：／注＝４６位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓ ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔ ｙｒ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４７ （Ｄ）他の情報：／注＝４７位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖ ａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＰrｏまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４８ （Ｄ）他の情報：／注＝４８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃ ｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍ ｅｔ、ＶａｌまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４９ （Ｄ）他の情報：／注＝４９位置に存在するＸａａはＭｅｔ、Ａｒｇ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＡｓｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５０ （Ｄ）他の情報：／注＝５０位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈ ｉｓ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５１ （Ｄ）他の情報：／注＝５１位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｍ ｅｔ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５２ （Ｄ）他の情報：／注＝５２位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ａ ｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５３ （Ｄ）他の情報：／注＝５３位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＭ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５４ （Ｄ）他の情報：／注＝５４位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａまた はＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５５ （Ｄ）他の情報：／注＝５５位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖ ａｌ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５６ （Ｄ）他の情報：／注＝５６位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃ ｙｓ，Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５７ （Ｄ）他の情報：／注＝５７位置に存在するＸａａはＡｓｎまたはＧｌｙ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５８ （Ｄ）他の情報：／注＝５８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ａ ｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５９ （Ｄ）他の情報：／注＝５９位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈ ｉｓ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＡｒｇ： （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６０ （Ｄ）他の情報：／注：６０位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｐ ｒｏ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６１ （Ｄ）他の情報：／注＝６１位置に存在するＸａａはＰｈｅ、ＡＳｎ、Ｇ ｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６２ （Ｄ）他の情報：／注＝６２位置に存在するＸａａはＡＳｎ、Ｈｉｓ、Ｖ ａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＩｌｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６３ （Ｄ）他の情報：／注＝６３位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔ ｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６４ （Ｄ）他の情報：／注＝６４位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｐ ｒｏ、ｓｅｒまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６５ （Ｄ）他の情報：／注＝６５位置に存在するＸａａはＶａｌ、Ｔｈｒ、Ｐ ｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６６ （Ｄ）他の情報：／注＝６６位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｉｌｅ、Ａ ｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６７ （Ｄ）他の情報：／注＝６７位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｐ ｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＰｒｏまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６８ （Ｄ）他の情報：／注＝６８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔ ｒｐ、Ｓｅr、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｈｒまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６９ （Ｄ）他の情報：／注＝６９位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ａｌａ、Ｐ ｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７０ （Ｄ）他の情報：／注＝７０位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖ ａｌ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７１ （Ｄ）他の情報：／注：７１位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｍｅｔ、Ｌ ｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＴｒｐまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７２ （Ｄ）他の情報：／注＝７２位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍ ｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＡｓｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７３ （Ｄ）他の情報：／注＝７３位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７４ （Ｄ）他の情報：／注＝７４位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔ ｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７５ （Ｄ）他の情報：／注＝７５位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇ ｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７６ （Ｄ）他の情報：／注＝７６位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ｖａｌ、Ａ ｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＡ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７７ （Ｄ）他の情報：／注＝７７位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｓｅｒ、Ａ ｒｇ、ＴｈｒまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７８ （Ｄ）他の情報：／注＝７８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｓ ｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７９ （Ｄ）他の情報：／注＝７９位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＡｓｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８０ （Ｄ）他の情報：／注＝８０位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖ ａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８１ （Ｄ）他の情報：／注＝８１位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇ ｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒp、Ａｒｇ、ＶａｌまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８２ （Ｄ）他の情報：／注＝８２位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌ ｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａ ｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８３ （Ｄ）他の情報：／注＝８３位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８４ （Ｄ）他の情報：／注＝８４位置に存在するＸａａはＣｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｙ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８５ （Ｄ）他の情報：／注＝８５位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｓｎ、Ｖ ａｌまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８６ （Ｄ）他の情報：／注＝８６位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｃｙｓ、Ａ ｒｇ、ＡｌａまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８７ （Ｄ）他の情報：／注＝８７位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔ ｒｐまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８８ （Ｄ）他の情報：／注＝８８位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｌｙｓ、Ａ ｒｇ、ＶａｌまたはＴｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８９ （Ｄ）他の情報：／注＝８９位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｃ ｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｔｌ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９０ （Ｄ）他の情報：／注＝９０位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＩｌｅまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９１ （Ｄ）他の情報：／注＝９１位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９２ （Ｄ）他の情報：／注＝９２位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９３ （Ｄ）他の情報：／注＝９３位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓ ｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９４ （Ｄ）他の情報：／注＝９４位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓ ｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＰｒｏ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９５ （Ｄ）他の情報：／注＝９５位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐ ｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａ ｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＩｌｅまたはＴｙｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９６ （Ｄ）他の情報：／注＝９６位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔ ｙｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９７ （Ｄ）他の情報：／注＝９７位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌ ｙｓ、ＡｌａまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９８ （Ｄ）他の情報：／注＝９８位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｉｌｅ、Ａ ｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍ ｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９９ （Ｄ）他の情報：／注＝９９位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１００ （Ｄ）他の情報：／注＝１００位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｔｙｒ、 Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎまたは……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０１ （Ｄ）他の情報：／注＝１０１位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｐｒｏ、 Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、 Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０２ （Ｄ）他の情報：／注＝１０２位置に存在するＸａａはＧｌｙ、Ｌｅｕ、 Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０３ （Ｄ）他の情報：／注＝１０３位置に存在するＸａａはＡｓｐまたはＳｅ ｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０４ （Ｄ）他の情報：／注＝１０４位置に存在するＸａａはＴｒｐ、Ｖａｌ、 Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、 ＰｈｅまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０５ （Ｄ）他の情報：／注＝１０５位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｐｒｏ、 Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、 ＡｓｐまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０６ （Ｄ）他の情報：／注＝１０６位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｓｅｒ、 Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０８ （Ｄ）他の情報：／注＝１０８位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒ ｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０９ （Ｄ）他の情報：／注＝１０９位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｈｒ、 Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＳｅｒまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１０ （Ｄ）他の情報：／注＝１１０位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ａｌａ、 Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＳｅｒまたはＴｒ ｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１１ （Ｄ）他の情報：／注＝１１１位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、 Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１２ （Ｄ）他の情報：／注＝１１２位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｖａｌ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＰｈｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１３ （Ｄ）他の情報：／注＝１１３位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｓｅｒ、 Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、 ＶａｌまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１４ （Ｄ）他の情報：／注＝１１４位置に存在するＸａａはＴｙｒ、Ｃｙｓ、 Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１５ （Ｄ）他の情報：／注＝１１５位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｓｎ、 Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１６ （Ｄ）他の情報：／注＝１１６位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｌｅｕ、 Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、 Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＩｌｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１７ （Ｄ）他の情報：／注＝１１７位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｓｅｒ、 Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＬｙｓまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１８ （Ｄ）他の情報：／注＝１１８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、ｓｅｒ、 ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、ＡｓｐまたはＴｙｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１９ （Ｄ）他の情報：／注＝１１９位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｓｅｒ、 Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２０ （Ｄ）他の情報：／注＝１２０位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ａｌａ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、ＶａｌまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２１ （Ｄ）他の情報：／注＝１２１位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、 Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２２ （Ｄ）他の情報：／注＝１２２位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｓｅｒ、 Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＣｙ ｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２３ （Ｄ）他の情報：／注＝１２３位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｍｅｔ、 Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、ＴｙｒまたはＬｅｕ； （ｘｉ）配列：配列番号：８５９（２）配列番号：８６０の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さ：１５３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１２ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１２は削除されているか、あるいはＬｅｕ 、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１３ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１３は削除されているか、あるいはＰｒｏ 、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１４ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１４は削除されているか、あるいはＰｒｏ 、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１５ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１５は削除されているか、あるいはＧｌｎ 、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎ； （ｘｉ）配列：配列番号：８６０ （２）配列番号：８６１の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ）ｎの場合およ びｎが整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６１ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６２の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ）ｎの場 合およびｎが整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６２ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６３の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ） ｎの場合およびｎが整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６３ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６４の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙ ｎ ｓｅｒ）ｎの場合およびｎが 整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６４ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６５の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ａｌａｇｌｙｓｅｒ）ｎの場合およびｎが 整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６５ ＸａａDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                  Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist   This application is a pending US Provisional Patent Application Serial No. 60/0/25, filed October 25, 1996. Title 35 of 29,629, primarily preferred under United States Code §119. It is something to stretch.                              TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION   The present invention relates to multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists. These multifunctional Sex chimeric hematopoietic receptor agonists are responsible for one or more activities of each component of the chimeric molecule. And have improved hematopoietic cell stimulating activity and / or improved activity It may also show rofil, and the latter is desirable in relation to individual hematopoietic growth factors. Not include a decrease in biological activity and / or enhance physical properties (solubility, (Including increased stability and efficiency).                                Background of the Invention   Colony stimulating factor (CSF) that stimulates differentiation and / or proliferation of bone marrow cells Have therapeutic potential when they restore reduced levels of hematopoietic stem cell-derived cells Attracted a lot of interest. CSF in both human and murine strains Were identified and identified according to their activity. For example, granulocyte-CSF (G- CSF) and macrophage CSF (M-CSF) While promoting the formation of colonies of granulocytes and macrophages in the container, GM-CS F and interleukin-3 (IL-3) have broader activities and Promotes the formation of both large, neutrophilic and acidophilic granulocyte colonies. IL-3 Also promotes the formation of masts, megakaryocytes and pure and mixed erythroid colonies .   U. S. 4,877,729 and U.S. Pat. S. 4,959,455 is Tenagaza IL-3 cDNA and inferred human IL-3 DNA sequences and their Discloses the amino acid sequence of the protein designating the number. Disclosed there hIL-3 has serine instead of proline at position 8 in the amino acid sequence of the protein. Have.   International Patent Application (PCT) WO 88/00588 describes gibbons and human-like I L-3 is disclosed. hIL-3 is a ser8-> Pro8Including substitutions. cys To break the disulfide bridge by substituting Ser with It has been suggested to replace one or more amino acids at the site of cleavage.   U. S. 4,810,64: 3 is a DNA sequence encoding human G-CSF Is disclosed.   WO91 / 02754 is a fusion protein comprising GM-CSF and IL-3 Is disclosed. This protein is increased compared to GM-CSF or IL-3 alone. Has great biological activity. As a component of multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist Discloses non-glycosylated IL-3 and GM-CSF analogous proteins.   WO92 / 04455 describes IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL- I fused to a lymphokine selected from the group consisting of 11EPO and G-CSF Disclosed is a fusion protein composed of L-3.   WO 95/21197 and WO 95/21254 describe broad multifunctional hematopoietic properties Discloses a competent fusion protein having   GB 2,285,446 is a c-mpl ligand (thrombopoietin) and And various forms of thrombopoietin, which are megakaryocytes and It has been shown to affect megakaryocyte precursor replication, differentiation and maturation, May be used for treatment.   EP 675,201A is a c-mpl ligand (megakaryocyte growth and development factor) (MGDF), allelic variants of c-mpl ligand, and polyethylene glycols C-mpl ligand attached to a water-soluble polymer such as Cole.   WO 95/21920 describes murine and human c-mpl ligands and their Polypeptide fragments are provided. This protein is used for in vivo and in vitro treatments Is useful for promoting platelet production.   Lin, FK. U.S. Pat. No. 4,703,008 to Eritro CDNA sequence encoding poietin, preparation and use of erythropoietin Has been disclosed.   WO 91/05867 is an EPO (Asn69), EPO (Asn125, Ser127), EPO (Thr125), And EPO (Pro124, Thr125)When Human erythropoietin with more carbohydrate attachment sites than human erythropoietin A poietin analog is disclosed.   WO 94/24160 has high activity, specifically 20, 49, 73, 140, Erythropoie having amino acid substitutions at positions 143, 146, 147 and 154 Chimren is disclosed.   WO 94/28391 describes the native flt3 ligand protein sequence and flt CDNA sequence encoding the 3 ligand, flt was added to the host cell into which the cDNA had been transferred. Method for expressing triligand and patients with hematopoietic disorders as flt3 ligand A method of better treatment is disclosed.   U.S. Pat. No. 5,554,512 describes human fl as an isolated protein. t3 ligand, DNA encoding flt3 ligand, flt3 ligand Treating patients with host cells transfected with cDNA to be loaded and flt3 ligand How to be oriented.   WO 94/26891 is an isolate having 29 amino acids inserted and a fragment thereof. And providing a mammalian flt3 ligand.Rearrangement of protein amino acid sequence   Rearrangement of DNA sequences in evolution creates diversity in protein structure and function Plays an important role in launching. Gene duplication and exon rearrangement The rate of basic mutations is low, creating diversity quickly, Provides an important mechanism for conferring a competitive advantage on organisms (Doolittle, Pr. protein Science 1: 191-200, 1992).   The advent of recombinant DNA technology has implications for protein folding, structure and function It enabled the study of the effects of sequence transposition. The method used to create a new array is , A natural tamper related by the linear rearrangement of the amino acid sequence of a protein (Cunningham, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 3218-3222, 1979; Teather & Erfle, J.M. Bacteriol. 172: 3837-3841, 1990; Schim ming et al., Eur. J. Biochem. 204: 13-19, 1992; Yamiuchi and Minamikawa, FEBS  Lett. 260: 127-130,1991; MacGregor et al., FEBS Lett. 378: 263-266). The first in-vessel application of this type of rearrangement to proteins was Golde nberg and Creighton (J. Mol. Biol. 1). 65: 407-413, 1983). The new N-terminus is located at an internal site At the first C-terminus, or near it. Have the same amino acid order as the first order from the breakpoint until the amino acid is reached. This At this point, the new sequence may be directly or via an additional sequence portion (linker). To the amino acid at or near the first N-terminus, and The new sequence of the lever is an N-terminal end to the breakpoint site of the original sequence. Continue in the same order as the original order until you reach a point at or near the amino acid And this residue forms the new C-terminus of the chain.   This method was applied to proteins ranging in size from 58 to 462 amino acids (G oldenberg & Creighton, J. Mol. Biol. 165: 407-413, 1983; Li & Coffino, Mol. Ce ll. Biol. 13: 2377-2383, 1993). The attempted proteins are mainly a-helical ( Interleukin-4; Kreitman et al., Cytokine 7: 311- 318, 1995), b-sheet (Interleukin-1; Horrick et al., Proteln Eng. 5: 427-431, 1992), or a mixture of the two. (Yeast phosphoribosyl anthranilate isomerase; Luger et al., Science 243: 206-210, 1989). First, they represent a wide range of structural classes. These broad categories of protein functions Sequence rearrangement studies are represented by: enzyme T4 lysozyme Zhang et al., Bichemistry 32: 12311-12318,1993; Z                               hang et al., Nature Struct. Biol. 1: 434-438 (1995                               ) Dihydrofolate reductase Buchwalder et al., Biochemistry 31: 1621-1630,19                               94; Protasova et al., Prot. Eng. 7: 1373-1377, 19                               95) Ribonuclease T1 Mullins et al. Am. Chem. Soc. 116: 5529-5533                               , 1994; Garrett et al., Protein Science.                               5: 204-211, 1996) Bacillus glucans Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91: 10                               417-10421, 1994) Aspartate transcarbamoylase Yang & Schachman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.                               . 90: 11980-11984, 1993) Phosphoribosyl anthranilate isomerase Luger et al., Science 243: 206-210 (1989; Luger)                               Et al., Prot. Eng. 3: 249-258, 1990) Pepsin / Pepsinogen Lin et al., Protein Science 4: 159-166, 1995) Glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase Vignais et al., Protein Science 4: 994-1                                       000, 1995) Ornithine decarboxylase Li & Coffino, Mol. Cell. Biol. 13: 2377-238                               3, 1993) Yeast Phosphoglycerate dehydrogenase Ritco-Vonsovici etc., Biochemistry3                                       4: 16543-16551, 1995) Enzyme inhibitors Basic pancreatic trypsin inhibitor Goldenberg & Creighton, J. et al. Mol. Biol. 165: 4                               07-413, 1983) Cytokine Interleukin-1b Horlick et al., Protein Eng. 5: 427-431, 1992) Interleukin-4 Kreitman et al., Cytokine 7: 311-318, 1995) Tyrosine kinase Recognition domain a-Spectrin SH3 domain Viguera, et al. Mol. Biol. 247: 670                                       -681, 1995) Transmembrane protein Chimeric protein Interleukin-4-Kreitman et al., Proc. Natl. Acad. Pseudomonas Sci. U.S.A. 91: 6889-6893, 1994). Exotoxin   The results of these studies have been very variable. Often lower activity, solubility, Alternatively, thermodynamic stability was observed (E. coli dihydrofolate reductase) , Aspartate transcarbamoylase, phosphoribosyl anthrani Rate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena Ase, ornithine decarboxylase, omp A, yeast phosphoglycerate Dehydrogenase). In other cases, the transduced protein is its natural counterpart. Appeared to have many properties almost identical to control (basic pancreatic trypsin inhibition Agent, T4 lysozyme, ribonuclease T1, Bacillus b-glucanase, Tarleukin-1b, a-spectrin SH3 domain, pepsinogen, in Tarleukin-4). In exceptional cases, unexpected properties over some properties of the native sequence Improvement was seen. For example, the rearranged a-spectrin SH3 domain sequence Solubility and refolding ratio, and metastasis Interleukin-4-pseudomonas exotoxin fusion molecule receptor Affinity and antitumor activity were observed (Kreitman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. .A. 91: 6889-6893, 1994; Kreitman et al., Cancer Res. 55: 3357-3363, 1995).   The primary motivation for these types of studies is protein folding and stability Was to study the role of narrow and broad interactions in the field. An array of this type Reorganization involves a subset of global interactions in the original sequence, It translates into a narrow-range interaction and vice versa. Many of these rearrangements are small The fact that it is possible to reach a conformation with some activity at least Persuasive evidence that dendritic folding occurs via multiple folding pathways (Viguera et al., J. Mol. Bol. 247: 670-681, 199. 5). In the case of the SH3 domain of a-spectrin, the hairpin-like fold Selection of the new end at the corresponding position, although somewhat less stable, still collapses And yielded a protein that can be   The location of the internal breakpoint used in the studies cited here is exclusively for protein Found on the surface, with no apparent bias towards the ends or midpoint, in a linear array (The variation in the relative distance from the original N-terminus to the breakpoint is About 10 to 80% of the total sequence length). In these studies, the first N-terminal The linker connecting to the C-terminus spanned from 0 to 9 residues. In one case (Yang & Schachman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 11980-11984, 1993). From the C-terminal segment of N -Ligation to the ends was performed. Flexible hydrophilic residues such as Gly and Ser Often used for linkers. Viguera et al. (J. Mol. Biol. 24 7: 670-681, 1995), leaving 3 or 4 residues at the original N- and C-termini. The connection with the base linker was compared. The 3-residue linker is more thermodynamically unstable there were. Protasova et al. (Protein Eng. 7: 1373-13) 77, 1994). the original N-terminus of E. coli dihydrofolate reductase When a 3 or 5 residue linker was used to connect Protein was produced in yield.Summary of the Invention   Hematopoietic proteins have the formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1Amino with Consisting of an acid sequence,   R in the above formula1And RTwoAre independent of each other Formula (I):[Where 1-6 amino acids are arbitrarily selected from the N-terminal and 1-5 amino acids from the C-terminal. Amino acids are deleted from the EPO receptor agonist polypeptide It is possible;   Also, connect the N-terminal directly to the C-terminal, or connect the N-terminal to the C-terminal. The new C-terminus and the N-terminus can be replaced with amino acids:Linker (LTwo)) To connect the N-terminal to the C-terminal. Name] A human EPO receptor agonist comprising a modified EPO amino acid sequence having Repeptide; (II) Formula[Here, from the C-terminal of the stem cell factor receptor agonist polypeptide, Optionally, 1-23 amino acids can be deleted; and N-terminal to C-terminal Connect directly or use a linker (LTwo) (Connecting the N-terminus to the C-terminus The new C-terminus and N-terminus can be replaced by amino acids:Can be connected at the same time)] A stem cell factor receptor agon comprising a modified stem cell factor amino acid sequence having Nist polypeptide; Formula (III):[Here, 1 from the C-terminal of the following flt-3 receptor agonist polypeptide -7 amino acids are optionally deleted; and the N-terminus is directly linked to the C-terminus; Alternatively, the linker (LTwo) (N-terminus can be linked to C-terminus and new New C-terminal and N-terminal are each amino acid: Can be connected at the same time)] Human flt-3 receptor consisting of a modified flt-3 ligand amino acid sequence having Teragonist polypeptide; Formula (IV):[Wherein Xaa at position 1 is Thr, Ser, Arg, Tyr or Gly; Xaa at position 2 is Pro or Leu; Xaa at position 3 is Leu, Arg, Tyr or Ser; Xaa at position 13 is Phe, Ser, His, Thr or Pro; Xaa at position 16 is Lys, Pro, Ser, Thr, or His; Xaa at position 17 is Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr or Arg; Xaa at position 18 is Leu, Thr, Pro, His, Ile or Cys; Xaa at position 22 is Arg, Tyr, Ser, Thr or Ala; Xaa at position 24 is Ile, Pro, Tyr, or Leu; Xaa at position 27 is Asp or Gly; Xaa at position 30 is Ala, Ile, Leu or Gly; Xaa at position 34 is Lys or Ser; Xaa at position 36 is Cys or Ser; Xaa at position 42 is Cys or Ser; Xaa at position 43 is His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys, or Leu; Xaa at position 44 is Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln, or Thr; Xaa at position 46 is Glu, Arg, Phe, Arg, Ile, or Ala; Xaa at position 47 is Leu or Thr; Xaa at position 49 is Leu, Phe, Arg or Ser; Xaa at position 50 is Leu, Ile, His, Pro or Tyr; Xaa at position 54 is Leu or His; Xaa at position 64 is Cys or Ser; Xaa at position 67 is Gln, Lys, Leu or Cys; Xaa at position 70 is Gln, Pro, Leu, Arg or Ser; Xaa at position 74 is Cys or Ser; Xaa at position 104 is Asp, Gly or Val; Xaa at position 108 is Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln or Gly; Xaa at position 115 is Thr, His, Leu or Ala; Xaa at position 120 is Gln, Gly, Arg, Lys or His; Xaa at position 123 is Glu, Arg, Phe or Thr; Xaa at position 144 is Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln or Glu; Xaa at position 146 is Arg or Gln; Xaa at position 147 is Arg or Gln; Xaa at position 156 is His, Gly, or Ser; Xaa at position 159 is Ser, Arg, Thr, Tyr, Val or Gly; Xaa at position 162 is Glu, Leu, Gly or Trp; Xaa at position 163 is Val, Gly, Arg, or Ala; Xaa at position 169 is Arg, Ser, Leu, Arg or Cys; Xaa at position 170 is His, Arg, or Ser; Then, from the modified human G-CSF amino acid sequence, 1-11 arbitrarily from the N-terminus Can be arbitrarily deleted and 1-5 amino acids from the C-terminus can be deleted. Can and again The N-terminus connects directly to the C-terminus or a linker (LTwo) (N-terminal is C -The new C-terminal and the N-terminal can be Nonoic acid: Can be connected at the same time)] A polypeptide consisting of a modified human G-CSF amino acid sequence having: Equation (V): [Wherein Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Arg; Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Gln; Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Cys; Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Ala; Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser or Val; Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val or Gly; Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser, or Arg; Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Leu; Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Ala; Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Trp; Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Ala; Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val, or Trp; Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Val; Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu, or Lys; Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Als, Arg, Leu, or Gln; Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Als, or Glu; Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Glu; Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile or Met; Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln, or Val; Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val; Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile; Xaa at position 38 is Asn or Ala; Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg; Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, His, Met, or Pro; Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met or Ala; Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly or Ser; Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala or Pro; Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu or His; Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val or Gly; Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, or His; Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val or Asn ; Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His, or Asp; Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met or Gln; Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or His; Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Thr; Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser, or Met; Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala or Leu; Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gly; Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val or Is Lys; Xaa at position 57 is Asn or Gly; Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Cys; Xaa at position 59 is Glu Tyr, His, Leu, Pro, or Arg; Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Thr; Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Ser; Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp, or Ile; Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro, or Val; Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser, or Lys; Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Ser; Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Ser; Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro, or His; Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr, or His; Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly, or Leu; Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Ala; Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp, or Asn; Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg, or Asp; Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr, or Arg; Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala; Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln, or Leu; Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly, or Asp; Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu; Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Arg; Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly, or Asp; Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu, or Arg; Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val, or Lys; Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val; Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Met; Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Val; Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln; Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys; Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly; Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp; Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn, or Ser; Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile, or Met; Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp, or His; Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile, or Leu; Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu, or Arg; Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala, or Pro; Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr; Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Thr; Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn; Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr or Pro; Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe, or His; Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro; Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln; Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, or Pro; Xaa at position 103 is Asp or Ser; Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly; Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His; Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro; Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala or Pro; Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly; Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp; Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met; Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe; Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn; Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, or Leu; Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met; Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile; Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, or Pro; Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr; Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg; Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, or Gln; Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly; Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys; Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, or Leu;   In addition, 1 to 14 amino acids may be modified from the N-terminal of the modified human IL-3 amino acid sequence. And can optionally be deleted and / or 1 to 15 amino acids are assigned from the C-terminus. 0 to 44 of the amino acids designated by Xaa can be naturally deleted (1 -133) unlike the corresponding amino acid of human interleukin-3;   The N-terminus connects directly to the C-terminus or a linker (LTwo) (N-terminal A new C-terminus and N-terminus can be connected to the C-terminus, respectively. Amino acids:Can be connected at the same time) A polypeptide consisting of a modified human IL-3 amino acid sequence having: Formula (VI):[Where,   Xaa at position 112 deletes this or Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp, or Met;   Xaa at position 113 deletes this, or Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, or Met;   Xaa at position 114 deletes this, or Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, or Met;   Xaa at position 115 deletes this or Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, or Asn; and   The N-terminus connects directly to the C-terminus or a linker (LTwo) (N-terminal Can be connected to the C-terminus, and the new C-terminus and N-terminus can be amino acid: Can be connected at the same time) A polypeptide consisting of a modified human c-mpl ligand amino acid sequence having: (VII) Formula:[Where, Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Arg; Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Gln; Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Cys; Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Ala; Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser or Val; Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val or Gly; Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser, or Arg; Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Leu; Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Ala; Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Trp; Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Ala; Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val, or Trp; Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Val; Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu, or Lys; Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Gln; Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala, or Glu; Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Glu; Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile or Met; Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln or Val; Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val; Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile; Xaa at position 38 is Asn or Ala; Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg; Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Pro; Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met or Ala; Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly or Ser; Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala or Pro; Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu or His; Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val or Gly; Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, or His; Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val or Asn ; Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His, or Asp; Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met or Gln; Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or His; Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Thr; Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser, or Met; Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala or Leu; Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gly; Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val or Lys; Xaa at position 57 is Asn or Gly; Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Cys; Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Arg; Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Thr; Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Ser; Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp, or Ile; Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro, or Val; Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser, or Lys; Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Ser; Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Ser; Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro, or His; Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr, or His; Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly, or Leu; Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Ala; Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp, or Asn; Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg, or Asp; Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr, or Arg; Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala; Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln, or Leu; Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly, or Asp; Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu; Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Arg; Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly, or Asp; Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu, or Arg; Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val, or Lys; Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val; Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Met; Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Val; Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln; Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys; Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly; Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp; Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn, or Ser; Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile, or Met; Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp, or His; Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile, or Leu; Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu, or Arg; Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala, or Pro; Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr; Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Thr; Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn; Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr or Pro; Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe, or His; Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro; Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln; Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, or Pro; Xaa at position 103 is Asp or Ser; Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly; Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His; Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro; Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ihe, Gln, His, Ser, Ala or Pro; Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly; Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp; Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met; Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe; Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn; Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, or Leu; Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met; Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile; Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, or Pro; Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Aht, Glu, Cys, Asp, or Tyr; Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg; Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, or Gln; Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly; Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys; Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, or Leu;   Here, 1 to 14 amino acids from the N-terminus of the modified human IL-3 amino acid sequence The amino acid is optionally deleted and / or 1 to 15 amino acids are added to the C-terminus. And any of the amino acids designated by Xaa 1-44 are the corresponding amino acids of natural (1-133) human interleukin-3. Different from acid) A polypeptide consisting of a modified human IL-3 amino acid sequence having:   and   (VIII) Colony stimulating factor, cytokine, lymphokine, interleukin Or A factor selected from the group consisting of   Selected from the group consisting of1Is R1To RTwoPhosphorus that can be bound to Car, but   At least R1Or RTwoHas the formula (I), (II), or (III) Subject to being selected from a polypeptide;   The hematopoietic protein may optionally be immediately preceding (methionine-1), (Alanine-1) Or (methionine-2, Alanine-1) Can be put.   Since new C-terminal and N-terminal are created in the above polypeptide (I) More preferred breakpoints are as follows:   Since new C-terminal and N-terminal are created in the above polypeptide (I) The most preferred break points that can be obtained are:   The EPO receptor agonists according to the present invention may have amino acid substitutions (eg, WO94 / 24160, or Asntwenty fourAsn83) And Asn126In One or more of the glycosylation moieties can be replaced by other amino acids, such as (but not limited to) (Not changed) to Asp or Glu), including deletions and / or insertions be able to. In addition, the EPO receptor agonist of the present invention Amino acid deletions at either or both the N- and C-termini, and (also Shows the new N-terminus and the new N-terminus of the rearranged protein in the formula shown earlier. It is also contemplated that they may have deletions from the C-terminus.   Since new C-terminal and N-terminal are created in the above polypeptide (II), More preferred breakpoints are as follows:   Since new C-terminal and N-terminal are created in the above polypeptide (II), The most preferred break points that can be obtained are 64-65, 65-66, 92-93 and And 93-94.   Creating new C- and N-termini in said polypeptide (III) Possible more preferred break points are as follows:   Creating new C- and N-termini in said polypeptide (III) The most preferred break points possible are 39-40, 65-66, 89-90, 99-1. 00 and 100-101.   Since a new C-terminal and N-terminal are created in the polypeptide (IV), More preferred breakpoints are as follows:   Since a new C-terminal and N-terminal are created in the polypeptide (IV), The most preferred break points to be found are 38-39, 48-49, 96-97, 125-12. 6, 132-133 and 141-142.   Since new C-terminal and N-terminal are created in the polypeptide (V), More preferred breakpoints are as follows:   Since new C-terminal and N-terminal are created in the polypeptide (V), The most preferred breakpoints to be found are 34-35, 69-70 and 90-91.   Since new C-terminal and N-terminal are created in the above polypeptide (VI) More preferred breakpoints are as follows:   Since new C-terminal and N-terminal are created in the above polypeptide (VI) The most preferred break points to be cut are 81-82, 108-109, 115-116, 1 19-120, 122-123 and 125-126.   The multifunctional receptor agonist according to the present invention may also have the formula: Can be represented by Where:   X1Is an amino acid that is numbered sequentially from 1 to J with the amino terminal at residue 1. A sequence corresponding to the sequence from residues n + 1 to J of the original protein having amino acid residues A peptide consisting of a amino acid sequence;   L is an optional linker;   XTwoIs a peptide consisting of the amino acid sequence of residues 1 to n of the first protein. Is;   Y1Is an amino acid numbered sequentially from 1 to k with residue 1 as the amino terminus. Corresponds to the sequence of residues n = 1 to k of the original protein with amino acid residues A peptide consisting of an amino acid sequence;   YTwoIs a peptide consisting of the amino acid sequence of residues 1 to n of the first protein Is;   L1And LTwoIs an optional peptide spacer;   n is an integer ranging from 1 to J-1;   Each b, c, and d is 0 or 1, respectively;   a and e are either 0 or 1, provided that both a and e are 0. Can not be; and   T1And TTwoIs a protein.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist according to the present invention is an individual chimeric molecule. Amino acid substitutions, deletions and / or insertions in the protein components of Wear. Further, the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention comprises the first protein Amino acid deletions at either or both the N- and C-termini of Or the new N-terminus of the rearranged protein in the above formula and (or It is also contemplated that there may be deletions from the C-terminus.   In one particularly suitable embodiment of the present invention, the above formula connecting the N-terminus to the C-terminus (L), (L1) Or (LTwo) Or a polypeptide selected from the group consisting of:   Further, the present invention relates to a nucleic acid encoding a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist. Recombinant expression vector comprising leotide sequences, related microbial expression systems, and multifunctionality The present invention relates to a chimeric hematopoietic receptor agonist. The present invention also provides a multifunctional key. Pharmaceutical composition containing mela hematopoietic receptor agonist and multifunctional chimeric hematopoietic receptor The present invention relates to the use of a scepter agonist.   In addition to the in vivo use of the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist according to the present invention In-container use promotes bone marrow and blood cell activation and proliferation before infusion into patients It is supposed to include the ability to proceed. Another contemplated use is resinous For in vivo and in vitro production of cells.   The reduced affinity of the fusion protein is at least partially incorporated into the chimeric molecule. That individual molecules cannot achieve their natural conformation when Or steric hindrance between the active sites of individual parts of the fusion protein . The present invention provides binding affinities comparable to or greater than the individual components of the chimeric molecule. By providing a novel multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist These disadvantages are overcome.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 schematically illustrates the sequence rearrangement of a protein. Native protein The N-terminus (N) and the C-terminus (C) of the Name. The protein is opened at the breakpoint to open a new N-terminal (new N) and a new C-terminal ( When a new C) is created, the result is a protein with a new linear amino acid sequence. Occurs. Rearranged molecules can be newly synthesized as linear molecules, with the first N-terminal Through the C-terminus and opening the protein at the breakpoint. Maybe.   FIG. 2 shows the scheme of Method I for creating a new protein. Said In proteins, the first N- and C-termini of the native protein are Linking with a linker to create different N-terminal and C-terminal proteins . In the example shown, amino acids 97 of the first protein were At the new N-terminal, amino acid 11 (aa.1-10 deleted) The first C-terminus (aa 174) and the last connected via the linker region A new C-terminal protein created at amino acid 96 of the first sequence Obtain a new gene to be transformed.   FIG. 3 shows the scheme of Method II for creating a new protein. this In some cases, the first N-terminus and C-terminus of the native protein are joined without a linker. Ligation creates different N-terminal and C-terminal proteins. In the example shown, the distribution A new sequence created at amino acid 97 of the first protein as a result of the row rearrangement New N-terminus, first C-terminus connected to first N-terminus (aa 174) And a new C-terminal protein created at amino acid 96 of the first sequence Obtain new genes encoding proteins.   FIG. 4 shows the scheme of Method III for creating a new protein. This In this case, the first N-terminal and C-terminal of the native protein are connected with a linker. To create different N- and C-terminal proteins. In the example shown, Created at amino acid 97 of the first protein as a result of sequence rearrangement A new N-terminus, the first C-terminus connected to amino acid 1 via a linker region ( a. a. 174), and a new C created at amino acid 96 of the first sequence. Obtaining a new gene encoding a protein with a terminus;   FIG. 5 shows the flt3 receptor agonists pMON32332, pMON3233. 3, a multifunctional receptor consisting of pMON32334 and pMON32335 The agonist, recombinant native flt3 (Genz) in the MUTZ-2 cell proliferation assay yme).   FIG. 6 shows the sequence of Lin et al. (PNAS 82: 7580-7584, 1985). 1 shows a DNA sequence encoding human mature EPO based on E. coli.   Figures 7a and 7b show the results of Martin et al. (Cell 63: 203-211, 1). 990). A DNA sequence encoding a pristine stem cell factor based on the sequence of Show.   FIG. 8 shows Langley et al. (Archives of Bichemistry and Biophysica 311: 55-61, 19). 94 shows a DNA sequence encoding a soluble stem cell factor based on the sequence of 94).   FIGS. 9a and 9b show the fl obtained from Lyman et al. (Oncogene 11: 1165-1172, 1995). 1 shows the DNA sequence encoding the 209 amino acid mature form of the t3 ligand.Detailed description of the invention   The present invention relates to a multifunctional chimeric hematopoietic receptor formed from covalently linked polypeptides. And each of these different distinct cellular receptors. It acts to initiate complementary biological activities via putters. Hematopoiesis is a complex series Requires cellular phenomena, in which stem cells become mature in all major lineages. A large population of cells is constantly produced. Currently have at least hematopoietic proliferative activity There are 20 known modulators. Most of these growth regulators are of one type or Only other types of colony formation can be promoted in the container, and each regulator promotes The exact pattern of colony formation performed is quite unique. Two regulators Does not promote the exact same pattern of colony formation, depending on the number of colonies, Or, more importantly, creating a growing colony As assessed by cell lineage and maturation pattern. Proliferative response is simplified The easiest analysis can be performed with a culture system in a container. Three completely different parameters, instantly Changes in colony size, number of colonies, and cell lines can be distinguished. two One or more factors may act on progenitor cells, causing more progeny to form Induce to increase colony size. If more than one factor May proliferate progenitor cells. It responds exclusively to one factor May be due to the presence of a distinct subset of progenitor cells, or some Before they can be stimulated by more than one factor. More than one factor Activation of additional receptors on cells by the use of offspring Signal pathways merge into a common final pathway to the nucleus, so enhance mitotic signaling (Metcalf, Nature 339: 27, 1989). Other mechanisms Could explain synergy. For example, if one signal path is Limited by intermediate activation of another signal pathway caused by a factor If so, this may result in a superadditive response. In some cases, one receptor -Type activation can elicit enhanced expression of other receptors (Metcalf , Blood 82: 3515-3523, 1993). Two or more factors are one May give rise to a different pattern of cell lines than the factor. Multifunctional chimera construction Is the use of blood receptor agonists a proliferative response impossible with any single factor? May have potential clinical benefits.   Hematopoietic factor and other growth factor receptors separate related proteins into two separate forms. Individual groups, ie (1) tyrosine receptors such as epidermal growth factor, M -For CSF (Sherv, Blood, 75: 1, 1990) and For SCF (Yarden et al., EMBO J. 6: 3341, 1987). ) And (2) the hematopoietic receptor, which does not contain the tyrosine kinase domain, (Bazan, PNAS USA 87: 6) 934-6938, 1990). The following are included in the latter group: Can be: Erythropoietin (EPO) (D'Andrea et al., Cell 57: 277, 1989), GM-CSF (Gearing et al.) , EMBO J .; 8: 3667, 1989), IL-3 (Kitamura et al., Cell 66: 1165, 1991), G-CSF (Fuk J. Unaga et al. Bio. Chem. 265: 14008-15, 1990), IL-4 (Harada et al., PNAS USA 87: 8 57, 1990), IL-5 (Takaki et al., EMBO J. 9: 4367, 1990), IL-6 (Yamasaki et al., Scienc e 241: 825, 1988), IL-7 (Goodwin et al., Cell 60: 941-51, 1990), LIF (Gearing et al. , EMBO J .; 10: 2839, 1991) and IL-2 (Cosman et al., Mol-Immunol. 23: 935-94, 19). 86). Most of the latter group of receptors exist in high affinity form as heterodimers. Re After gand binding, the specific a-chain will have at least one other receptor chain (b-chain). , G-chain). Many of these factors are common receptors -Share subunits. A for GM-CSF, IL-3 and IL-5 − The chains share the same b-chain (Kitamura et al., Cell 66: 1165, 1991), and Takaki et al., EMBO J. . 10: 2833-8, 1991), and receptors for IL-6, LIF and IL-11. Ter complexes share a common b-chain (gp130) (Taga et al., Cell 58: 573-81). Gearing et al., Science 255: 1434-7, 1992). IL-2, IL-4, IL- 7, The receptor complex of IL-9 and IL-15 shares a common g-chain (Kondo et al., Science 262: 1874, 1993; Russell et al., Science 266: 1042-1045, 1993; Noguchi et al., Science 262: 1877, 1993; Giri et al. 13: 2822-2830, 1994).   The use of multi-acting hematopoietic factors places a premium on factor-producing cells and their triggering systems. May have potential benefits by reducing the demands made. If cells If the ability to produce offspring is limited, lower the required concentration of each of the factors. By combining and using them together, Would be able to effectively reduce the demands made. Uses multi-acting hematopoietic factors Doing so reduces the amount of factors needed and may have potentially adverse side effects May decrease.   The novel compound according to the present invention is     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwo, And RTwo-R1 (Where R1And RTwoIs as defined above) Is represented by an equation selected from the group consisting of RTwoIs preferably R1Different from An active, but complementary, colony promoting factor is preferred. Complementary activities are other Refers to an activity that enhances or alters the response of a cell to a cell modulator. R1 The polypeptide may be RTwoConnect directly to the polypeptide or via a linker moiety Be connected. The term "direct" means that the polypeptide binds without the peptibalinker. It defines an advanced multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist. Follow And L1Is R1And RTwoChemical bonds or polypeptides that are both linked in frame Part, most commonly L1Is R1And RTwoIs R1The carboxy terminus of L1of At the amino terminus, L1The carboxy terminus of-TwoAmide bond to the amino terminus of It is a linear peptide joined together. "Connected within the frame" means R1And And RTwoTranslation stop or interruption between reading frames of DNA encoding Means   A list of other growth factors, namely colony promoting factors (CSF), including but not limited to Is a cytokine that can be bound to (I), (II) or (III) , Lymphokines, interleukins, hematopoietic growth factors, GM-CSF, G- CSF, c-mpl ligand (also known as TPO or MGDF), M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3 / flk 2 ligand, human growth hormone, B-cell growth factor, B-cell differentiation factor, eosinophil Differentiation factor and stem cell factor (SCF) (steel factor or c-kit ligand Also known as). Furthermore, the present invention provides a modified R1Or RTwoThere is a molecule Or these R1Or RTwoUse of mutated or modified DNA sequences encoding molecules Is included. The present invention also provides R1Or RTwoIs a hIL-3 mutant, c-mpl ligand Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agoni that is a mutant of G-CSF It also includes strikes. "HIL-3 variants" refer to amino acid substitutions and ( Or) WO94 / 12638, WO94 / 12639 and WO95 / 006 HIL-3 molecule having a deleted portion of hIL-3 as disclosed in US Pat. And defined as other variants known in the art. "C-mpl ligand "Variants" were disclosed in US patent application Ser. No. 08 / 383,035. amino acid C-mpl ligand having portions of substituted and / or deleted c-mpl ligands And other variants known in the art. "G-CSF A "variant" refers to an amino acid substitution and / or deletion GC disclosed herein. A G-CSF molecule having a portion of SF, as well as other variants known in the art. Is defined as In addition to the above list, WO94 / 12639 and WO94 / 12 638, IL-3 variants, GC disclosed in WO 97/12977 SFL receptor agonist, c-mpl receptor disclosed in WO 97/12978 Septer agonist, IL-3 receptor disclosed in WO97 / 12979 The gonist uses the R according to the present invention.1Or RTwoIt can be. As used herein, “IL -3 variants "are taught in WO 94/12639 and WO 94/12638. IL-3 mutant. "Fusion protein" as used herein Is a fusion tamper taught in WO95 / 21197 and WO95 / 21254. Quality. As used herein, “G-CSF receptor agonist” is WO 97/12978 refers to the G-CSF receptor agonist. This specification The “c-mpl receptor agonist” used in this document is described in WO 97/12978. Refers to the disclosed c-mpl receptor agonist. As used herein, “IL The "3-3 receptor agonist" is an IL-3 receptor disclosed in WO 97/12979. Refers to a scepter agonist. As used herein, "multifunctional receptor agonis" "G" refers to the multifunctional receptor agonist taught in WO 97/12985. You.   Linking group (L1) Is a polypeptide generally having a length of 1 to 500 amino acids. It is a pseudo. The linker connecting two molecules is (1) when the two molecules are folded (2) can interfere with functional regions of two proteins so that they act independently of each other (3) The functional protein should not have a tendency to reveal forced secondary structures. To have hydrophobic properties that can interfere with the cytoplasmic region, and (4) one cell R on1And RTwoSo that they can interact simultaneously with their corresponding receptors,1 And RTwoIt is better to plan to provide a three-dimensional separation. Typically flexible Surface amino acids in the protein region include Gly, Asn and Ser. Substantially any exchange of amino acid sequences, including Gly, Asn and Ser It should be expected that the above criteria for the car arrangement will be met. Other neutral amino Acids such as Thr and Ala can also be used for the linker sequence. Still other amino Acid is also used to facilitate the construction of multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists. A unique restriction site is added to the Kerr sequence so that it can be included in the linker.   Particularly suitable L according to the present invention1The linker has the formula: And a sequence selected from the group of   One example of a highly flexible linker is a filamentous bacteriophage, such as Glycine present in the pIII protein of bacteriophage M13 or fd And a spacer moiety rich in serine (Schaller et al., PNAS US A 72: 737-741, 1975). This region is the pIII surface protein Provides a long flexible spacer portion between the two regions. This spacer part is next Consists of the amino acid sequence of:   The invention also encompasses a linker comprising an endopeptidase recognition sequence. like this Cleavage sites separate the individual components of a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist. To make sure they are properly folded and active in the container It may be valuable to decide. Examples of various endopeptidases , Plasmin, enterokinase, kallikrein, urokinase, tissue plasmin Nogen activator, clostripain, chymosin, collagenase, Russelk Venom proteases of the snake, postproline cleaving enzyme, V8 protease, Include, but are not limited to, thrombin and factor Xa.   Heavy chain immunoglobulin IgG, IgA, IgM, IgD or IgE hinge The peptide linker segment obtained from the region is angular between the attached polypeptides. Give a relationship. The hinge region in which cysteine is replaced with serine is particularly useful. is there. A particularly suitable linker of the invention is a murine Ig in which cysteine has been changed to serine. Sequence derived from the G gamma-2b hinge region. These linkers also It may also include a peptidase cleavage site. Examples of such linkers are: The following sequence is mentioned:  However, the invention is limited by the shape, size or number of linker sequences used. The only requirement for the linker is that it is functional, multifunctional chimeric hematopoietic It does not interfere with the folding and function of the receptor agonist.Determination of the linker L 2   R1And / or RTwoL used forTwoThe length of the amino acid sequence of Using guidance obtained empirically or from structural information, or You can choose a combination of the two methods.   If structural information is not available, use a small linker system to perform the test. Rows can be prepared. It should span the range of 0 to 50 °. Length and choose its sequence to match surface exposure (hydrophilic, Hop p & Woods, Mol. Immunol. 20: 483-489, 1983), Kyte & Doolittle, J. et al. Mol. Bi ol. 157: 105-132; solvent exposed surface area, Lee & Richards, J. Mol. Mol. Biol. 55: 379-400 , 1971) Design and R1Or RTwoRequired conformation without disturbing the conformation of Ability to take home (formally flexible; Karplus & Schulz , Naturwissenschaften 72: 212-213, 1985). 2.0 per residue Assuming a translation average of 3.8 ら, this translates to a test length of 0 to 30 residues. And 0 to 15 residues are a particularly suitable range. Of such an experimental series A representative example is "Gly-Gly" repeated n times (n is 1, 2, 3, or 4). -Gly-Ser "to assemble the linker using a cassette sequence. Would. One of ordinary skill in the art will appreciate that a variety of lengths or compositions can serve as linkers. There are many such arrays, and the first thing to consider is that they are not too long. It is not short if it is not (Sandhu, Critical Rev, Biotech. 12: 437 -462, 1992). If these sequences are too long, entropy effects will cause Dimensional folding appears to be destabilizing, and folding is dynamically May not be the target, and if these are too short, It appears to destabilize the molecule due to physical swelling.   Experts in the analysis of protein structural information have identified c-alpha-carbon The length of the sequence to be used by using the distance between the chain ends, defined as the distance May be limited, or may need to be tested with the choice of linker experience It will be appreciated that the number can be at least limited. Those skilled in the art will also sometimes find that x- In structural models derived from X-ray diffraction or nuclear magnetic resonance spectroscopy data, polypep That the positions of both ends of the tide chain are not defined, and if that is true This situation needs to be considered in order to properly calculate the required linker length You will also recognize that there is. Are residues whose positions are explicitly stated? Choose two residues with similar sequences at both ends of the chain and their c-alpha carbon The distance between them is used to calculate the approximate length for the linker between them. Calculation Using the lengths given as a criterion, select the next linker with a range of residue numbers (Calculated using 2 to 3.8 ° / residue). These linkers require the first sequence. It can be composed of shorter or longer sequences as needed, When the length is extended, add flexibility and hydrophilicity as described above. Additional residues can be selected; or, optionally, a series of linkers (one example is described above in "G1 y-Gly-Gly-Ser "cassette method). Columns can be used, or optionally, a new array with the appropriate length Combinations with different sequences may be used.Determination of the amino and carboxyl termini of R 1 and R 2   R that can be folded into a biologically active state1And RTwoThe array of From the first polypeptide chain, start (amino terminal) position and end (carboxyl terminal) End) The position is appropriately selected, and at the same time, the linker sequence LTwoTo use Can be prepared. Amino terminal and carboxyl terminal are cleaved using the following indices. It is selected from within a common array called a point region. In this way, a new net For amino acid sequence, select amino terminal and carboxyl terminal from the same breakpoint region. Created by In many cases, the choice of a new end The first position will be shortly before that of the amino terminus. But, One skilled in the art will appreciate that the choice of the ends at any point within the region will work, and these will be new. Effective for addition or deletion of amino and carboxyl moieties in undefined sequences Will recognize that   Primary amino acid sequence of protein turns into three-dimensional structure necessary for expression of biological function Demanding a folding is a core tenet of molecular biology. Tampa Using x-ray diffraction of crystalline single crystals or nuclear magnetic resonance spectroscopy of protein solutions, Methods for obtaining and interpreting three-dimensional structural information are known to those skilled in the art. Cutting For an example of structural information relevant to the confirmation of a point region, see the protein secondary structure Position and type (alpha and 3-10 helix, parallel and anti-parallel beta Sheets, chain flips and swivels, and loops; Kabsch & Sander, Biopolymers 22:25 77-2637, 1983), Degree of solvent exposure of amino acid residues, degree and type of interaction between residues ( Chothia, Ann. Rev. Biochem. 53: 537-572, 1984), and along the polypeptide chain. And dynamic distributions of different conformations (Alber & Mathews, Methods Enzymo 1, 154: 511-533, 1987). In some cases, solvent exposure of residues Further information is known; one example is the post-translational attachment site for carbohydrates, which is essential. Naturally on the protein surface. Unable to obtain or obtain structural experimental information If this is not possible, the tertiary and secondary structure of the protein, Primary amino acid sequence to predict accessibility and the presence of turns and rings A method of analyzing is also available. Where direct structuring is not feasible, surface exposure Biochemical methods for experimental measurements can sometimes be applied; eg, surface exposure Use a method of confirming the strand break site after restriction proteolysis to infer (Gentile & Salvatore, Eur. J. Biochem. 218: 603-621, 1993).   Therefore, either experimentally derived structural information or a predictive method (For example, Srinivisan & Rose Proteins: Struct., Funct. & Genetics, 22: 81-99, 1995), closely examine the parent amino acid sequence, Classify regions according to whether they are complete or incomplete to maintain structure and tertiary structure. Periodic secondary structure (alpha and 3-10 helix, parallel and anti-parallel beta The presence of sequences within the region known to be included in the You. Similarly, low or expected low levels of solvent exposure Thought that the region of the amino acid sequence would be part of the so-called hydrophobic core of the protein. This should also be avoided for the choice of amino and carboxyl termini. It is. Notably different from this, known to be in a surface turn or in a wheel Or expected regions, and especially those not required for the expression of biological activity The known region is a suitable site for locating the end of the polypeptide chain. Up A continuous range of an amino acid sequence that is particularly suitable based on the above criteria is called a breakpoint region. .   Still other peptide sequences include multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist proteins. Added to facilitate purification or identification of quality (eg, poly-His) it can. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist by specific monoclonal antibody Highly antigenic markers that may allow for rapid assay and convenient purification of proteins Peptides can also be added.   “Mutant amino acid sequence”, “mutant protein” "Variant protein", "murein", or "mutant" An `` heterologous polypeptide '' is a native polypeptide due to amino acid deletions, substitutions, or both. Amino acid sequence that is unusual in the sequence, or mutation that is intrinsically made from the native sequence Polypeptide having an amino acid sequence encoded by a body nucleotide sequence Point to. "Native (native) sequence" refers to a wild-type or natural gene Or the same amino acid or nucleic acid sequence as the protein.   Hematopoietic growth factors rely on their ability to promote colony formation by human hematopoietic progenitor cells. Can be characterized. The resulting colonies include erythroblasts, granulocytes, megakaryocytes, granulocytes Macrophages and mixtures thereof. Many hematopoietic growth factors are initially In studies performed in primates and subsequently in humans, bone marrow function and peripheral blood cell counts were The ability to return to therapeutically beneficial levels has been demonstrated. These sources of hematopoietic growth factor Many or all of the product activity involves signal transduction and high affinity receptor binding. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists according to the present invention compared to a single factor Sometimes have the same or even greater biological activity, or halve To have a longer lifespan, reduce adverse side effects, or have a combination of these properties Therefore, useful characteristics can be exhibited.   Multifunctional chimeric hematopoietic receptor with little or no agonist activity Gonists are used as antagonists to prepare antibody preparations for use in immunology or immunotherapy. As an antigen for production, as a genetic probe, or other useful hIL-3 mutants. It can serve as an intermediate used to make a mutein.   Biological activity of multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein according to the present invention Can be used for DNA synthesis in factor-dependent cell lines or for in-vessel bone marrow assays. In this case, it can be measured by counting the colony forming units.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention has a single action It has an improved therapeutic profile compared to strike. For example, some of the present invention Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists are comparable to other hematopoietic agonists. Have a similar or more potent growth factor activity, and Has no increased effect.   The present invention encodes a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein DNA sequences that are substantially similar and perform substantially the same function, and What is the DNA encoding the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist according to the invention? And DNA sequences that differ only because of the degeneracy of the genetic code. Also according to the present invention Are polypeptides and mutant DNAs encoded by the oligonucleotides Oligonucleotide intermediates used to assemble are also included.   Genetic engineering techniques currently standard in this field (U.S. Pat. No. 4,935,233 and ambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor L aboratory, 1989) can be used to construct the DNA sequence of the present invention. This one One such method is cassette mutagenesis (Wells et al., Gene 34: 315-323, 1985). In this case, the part of the coding sequence in the plasmid is replaced with the part of the gene between the two restriction sites. Replace with a synthetic oligonucleotide encoding the desired amino acid substitution.   Create complementary synthetic oligonucleotide pairs that encode the desired genes and Can be annealed. The DNA sequence of the oligonucleotide is determined Encodes the sequence for the amino acid of the gene, but with substitutions and (Or) Excluding those deleted from the sequence.   Plasmid DNA is treated with the selected restriction endonuclease and then annealed. Can be bound to the labeled oligonucleotide. Using the combined mixture And convert competent JM101 cells into cells resistant to the appropriate antibiotic. single Pick colonies and perform restriction analysis and identify plasmids with the desired gene. Plasmid DNA can be examined by DNA sequencing.   Replacing at least one of the DNA sequences with the DNA sequence of another colony promoting factor The cloning of the DNA sequence of a novel multifunctional hematopoietic agonist was performed using an intermediate vector. It is done by use. Alternatively, a vector containing one gene Can be cloned directly into In order to bind DNA sequences, Linkers and adapters can be used to replace the altered sequence, In this case, the restriction site is inside the target region. Thus, one polypeptide , Peptide linkers, and genetic material encoding other polypeptides (DNA ) Is transformed into a bacterial, yeast, insect cell or mammalian cell suitable expression vector. Insert into the reactor. Propagate the transformed organism and convert the protein using standard techniques. Isolated. Therefore, the resulting product is a new protein and the linker region Having the colony promoting factor bound to the second colony promoting factor by the region.   Another aspect of the present invention relates to these novel multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonis. To provide a plasmid DNA vector used for expression of the plasmid. These The novel DNA sequence encoding the novel peptide according to the present invention. . Converting a microorganism capable of expressing a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist Suitable vectors include those selected for transcription and translation according to the host cell used. Encodes a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist linked to a regulatory sequence And an expression vector comprising a nucleotide sequence.   Vectors incorporating the modified sequences described above are encompassed by the present invention and are multifunctional Useful for the production of hematopoietic receptor agonist polypeptides. The vehicle used in this method The regulator may also be selected in functional cooperation with the DNA coding sequence of the present invention. Sequence, which directs its replication and expression in a selected host cell. Wear.   Another aspect of the present invention is a novel multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonis And a method for manufacturing the same. The method of the present invention provides a novel multifunctional chimeric hematopoietic receptor The appropriate vector transformed with the vector containing the DNA sequence encoding gonist expression. Culturing cells or cell lines. Suitable cells or cell lines are bacterial cells It is. For example, E. E. coli strains are well-known host cells in the field of biotechnology. You. Examples of such strains include: coli strain JM101 (Yanish-Perron et al., Gene 33: 103- 119, 1985) and MON105 (Obukowicz et al., Applied Environmental Microbiology) 58: 1511-1523, 1992). Also bacteriophage E. based on Mu (Weinberg et al., Gene 126: 25-33, 1993). Chromosome development for E. coli Generation of multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein using current vector The present invention is also included in the present invention. Various strains of B. subtilis can also be used in this method. For those skilled in the art Many strains of yeast cells, known in the art, also provide host cells for expression of the polypeptides of the invention. Available as vesicles. When expressed in the E. coli cytoplasm, the multifunctional chimera of the present invention The gene encoding the blood receptor agonist also has a codon at the 5 'end of the gene. At the N-terminus of the protein-2-Ala-1Or Met-1 Can be constructed to encode E. N of protein produced in E. coli cytoplasm The ends are methionine amino acids such that methionine is truncated from the N-terminus during expression. Nopeptidase (Ben Bassat et al., J. Bac. 169: 751-757, 1987) and possibly others Affected by post-translational processing with peptidases. The multifunctional chimera of the present invention Hematopoietic receptor agonists have Met at the N-terminus.-1, Ala-1Or Met-2− Ala-1May comprise a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist peptide having . These mutant multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists also By fusing the peptide to the N-terminus, expressed in E. coli. This signal The peptide is cleaved from the polypeptide as part of the secretory process. E. in coli Additional strategies for achieving high level expression of genes are described in Savvas, C. et al. M. (Microb iological Reviews 60: 512-538, 1996).   Mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) Suitable for use in the present invention. General expression of foreign genes in mammalian cells The method is described in Kaufman, R .; J. , 1987) Genetic Engineering, Principles and Methods , Vol. 9, J. K. Setlow, editor, Plenum Press, New York. Eukaryotic secretory signal peptide is a strong promoter that can function in mammalian cells An expression vector is constructed that drives transcription of the coding region. The area is multifunctional Is translationally linked to the region encoding the sex chimeric hematopoietic receptor agonist. For example, pc DNA I / Neo, pRc / RSU, and pRc / CMV (Invitrogen Corp. , Sanji (Obtained from Ego, Calif.) Can be used. Eukaryotic The secretory signal peptide coding region may be derived from the gene itself or May be obtained from other secreted mammalian proteins (Bayne, M .; L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2638-2642, 1987). After construction of the vector containing the gene, the vector -Transfer the DNA into mammalian cells. Such cells include, for example, COS7, HeLa , BHK, CHO, or mouse L-strain. These cells are used, for example, in DMEM medium (JRH Scientific). The polypeptide secreted into the medium is After establishment of a stable cell line after transfer or selection for antibiotic resistance, After 72 hours of transient expression, it can be recovered by standard biochemical methods. Suitable baby Selection and transformation, culture, amplification, screening and products of mammalian host cells Production and purification are well known in the art. For example, Gething and Sambrook, Nature 293: 620-625, 1981), or alternatively, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. , 5 (7 1750-1759, 1985) or Howley et al., U.S. Pat. No. 4,419,446. . Another suitable mammalian cell line is the monkey COS-1 cell line. Equally useful feeding The animal cell line is a CV-1 cell line.   If desired, insect cells can be utilized as host cells in the method of the invention. For example, Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986) and See the references cited therein. Furthermore, use baculovirus vector General methods for expression of foreign genes in insect cells are described in Summers, M .; D. And Smith, G . E. , 1987-Baculovirus vector and method for insect cell culture procedures Al, Texas Agricultunal Experiment Station Bulletin No. Described in 1555 ing. An expression vector consisting of a baculovirus transfer vector is constructed. In the case of a strong baculovirus promoter (eg, polyhedron promoter) ) Drives the transcription of the eukaryotic secretory signal peptide coding region. The area is To the region encoding the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist polypeptide Translationally combined. For example, plasmid pVL 1392 (Invitrogen Corp. , Sanji Ego, California) can be used. Multifunctional chimeric hematopoietic dress After construction of a vector carrying a gene encoding a putter agonist polypeptide, Two micrograms of this DNA was transferred into insect cells, strain SF9, into a baculovirus. Co-transfect with 1 microgram of DNA (see Summers & Smith, 1987). Pure recombinant baculovirus carrying a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist Using, for example, Excell 401 serum-free medium (JRH Biosciences, Lenexa, Kans. Infect cells cultured in (State). Multifunctional chimeric hematopoietic secreted into the medium Scepter agonists can be recovered by standard biochemical methods. Multifunctional chimeric hematopoiesis Obtained from mammalian or insect cells that express the receptor agonist protein The supernatant can first be concentrated using any of several commercially available concentrators.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention may be a hematopoietic lineage or Reduced spinal, erythroid, lymphoid, or megakaryocyte cell concentration Therefore, it is useful for the treatment of a disease characterized by. In addition, these agonists It can be used to activate maturation of medullary cells and / or lymphoid cells. Symptoms suitable for treatment with a polypeptide of the invention include leukopenia. You. The disease is a decrease in the number of circulating white blood cells in the peripheral blood. Leukopenia Induced by exposure to certain viruses or radiation. This is a variety of shapes Forms of cancer therapy, including exposure to chemotherapeutic agents, radiation, and infection and bleeding Often a side effect. These multifunctional chimeric hematopoietic receptors according to the present invention The treatment of leukopenia with gonists is based on treatment with currently available drugs. Undesirable side effects that occur can be avoided.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention is used for treating neutropenia, For example, aplastic anemia, periodic neutropenia, idiopathic neutropenia, Ku-Higashi syndrome, systemic lupus erythematosus (SLE), leukemia, spinal dysplasia syndrome and It is useful for treating conditions such as myelofibrosis.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention is useful for treating thrombocytopenia or May be useful for prevention. Currently the only treatment for thrombocytopenia is platelet infusion Yes, this method is expensive and has significant consequences for infections (HIV, HBV) and alloimmunity. Brings danger. This multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist is necessary for platelet transfusion. The necessity can be reduced or reduced. Genetic defects such as Fanconi poverty Serious blood from blood, Wiscott-Aldrich, or Mayhagulin syndrome Platelet reduction may occur. Acquired thrombocytopenia is, for example, immune thrombocytopenia. Purpura, systemic lupus erythematosus, hemolytic anemia, or fetal-maternal incompatibility As may occur from autologous or alloantibodies. Furthermore, thrombocytopenia Splenomegaly, generalized intravascular coagulation, thrombotic thrombocytopenic purpura, artificial heart valve Infections can occur. Serious from cancer chemotherapy and / or radiation therapy Thrombocytopenia can occur. Thrombocytopenia is also cancer, lymphoma, leukemia or line It can also result from a medullary invasion due to fibrosis.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist according to the present invention is a hematopoietic progenitor in peripheral blood. Helps activate cells and stem cells. Progenitor cells derived from peripheral blood are fixed for autologous marrow transplantation At that time, it was shown to be effective in reconstituting the patient. G-CSF and G Hematopoietic growth factors, including M-CSF, determine the number of circulating progenitor and stem cells in peripheral blood. Has been shown to enhance. This simplifies the procedure for collecting peripheral stem cells, Dramatically reduce procedural costs by reducing the number of required component removals. Multifunctional Chimeric hematopoietic receptor agonists help stem cells start Efficiency can be further increased.   The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist according to the present invention comprises a hematopoietic precursor and a stem It is also useful for in vitro expansion of cells. Colony promoting factor (CSF), such as hIL-3 Neutropenia often occurs as a result of such treatment after high-dose chemotherapy Alone, in combination with other CSFs to treat dysfunction and thrombocytopenia Or in combination with bone marrow transplantation. However, severe neutropenia and platelets The period of reduction is not completely excluded. Monocytes (macrophages), granulocytes (neutrophils And myeloid lineage consisting of megakaryocytes can cause life-threatening infections Important in the prevention of illness and bleeding Neutropenia and thrombocytopenia are also diseases , Genetic disorders, drugs, toxins, radiation and traditional oncology therapies It can also be the result of a therapeutic treatment.   Bone marrow transplantation has been used to treat this patient population. But related to bone marrow use (1) the number of stem cells in bone marrow, spleen, or peripheral blood is limited; Including graft-versus-host disease, (3) graft rejection, and (4) possible contamination by tumor cells. In addition, there are several problems to reconstitute a compromised hematopoietic system. Stem cells Accounts for a very small percentage of nucleated cells in bone marrow, spleen, and peripheral blood. Yo There is a dose response such that more stem cells promote hematopoietic recovery. Therefore, Expansion of the vesicles in the container must enhance hematopoietic recovery and patient survival. Same kind offer Bone marrow from humans has been used to obtain bone marrow for transplantation. However, HLA conformity Graft-versus-host disease and graft rejection limit bone marrow transplantation in cell donors and recipients are doing. An alternative to allogeneic bone marrow transplantation is autologous bone marrow transplantation. For autologous bone marrow transplantation In some of the patient's own bone marrow, bone marrow ablation therapy, such as high-dose chemotherapy, Prior to transplantation and then transplanted back into the patient. Autografts are used for graft versus host disease and And the risk of graft rejection. However, autologous bone marrow transplantation reduces the number of stem cells in the marrow. Still submitting issues regarding limitations and possible contamination by tumor cells . The limitation on the number of stem cells can be overcome by in vitro expansion of stem cells. Besides, stem cells In order to reduce tumor cell contamination of marrow transplantation, the presence of specific surface antigens such as CD34 + Based on the location, stem cells can be specifically isolated.   The following patents are directed to isolation of stem cells, CD34 + cells, culture of cells having hematopoietic factors, Use of cells for the treatment of patients with blood disorders, and cell expansion and gene therapy Further details are involved regarding the use of hematopoietic factors for therapy.   5,061,620 describes the separation of stem cells from cells for specific purposes. The present invention relates to a composition comprising human hematopoietic stem cells provided by   5,199,942 (1) obtain hematopoietic progenitor cells from a patient; (2) IL-3, flt3 ligand, c-kit ligand, GM-CSF, IL-1, GM-CS Selected from the group consisting of F / IL-3 fusion proteins and combinations thereof. Ex vivo expansion of cells having growth factors; (3) administering a cell preparation to a patient; And a method for autologous hematopoietic cell transplantation.   No. 5,240,856 include devices for automatically controlling the cell separation process. It relates to a cell sorter.   WO 91/16116 selectively isolates and separates target cells from a cell mixture An apparatus and method are described.   WO 91/18972 describes the use of hollow fiber bioreactors to treat bone marrow cells. Describes a method of culturing bone marrow in a container by incubating a suspension.   WO 92/18615 is intended for transplantation in media containing a special mixture of cytokines. And methods for maintaining and expanding bone marrow cells for use in bone marrow cells.   WO 93/08268 (a) separates CD34 + stem cells from other cells, b) Incubate the separated cells in a selective medium so that the stem cells are selectively developed. The method of selectively expanding stem cells. You.   WO 93/18136 describes a method for maintaining mammalian cells derived from peripheral blood in a container Is described.   WO 93/18648 describes human neutrophil progenitor cells as a high content myeloblast and Contained with myeloid cells, for the treatment of genetic or acquired neutropenia The composition of   WO 94/08039 selects cells expressing the c-kit protein. Describes a method for enriching human hematopoietic stem cells.   WO 94/11493 discloses stem cells isolated using a counterflow tilting method. A vesicle population (CD34 +, small in size) is described.   WO 94/27698 selects nucleated heterogeneous cell populations from heterogeneous cell mixtures Combines immunoaffinity separation with continuous flow centrifugation for efficient separation How to do.   WO 94/25848 discloses a cell separation device for the collection and processing of target cells. It has been described.   Human bone marrow in culture containing IL-1a, IL-3, IL-6 or GM-CSF -Term culture of highly enriched CD34 + precursors of hematopoietic progenitor cells obtained from Brandt et al. Clin. Invest. 86: 932-941, 1990.   One aspect of the present invention is to provide a method for selective in vitro expansion of stem cells. You. The term "stem cells" refers to totipotent hematopoietic stem cells and early precursors and progenitors. Refers to cells, which can be isolated from bone marrow, spleen or peripheral blood. The term "deployment" Refers to cell differentiation and proliferation. The present invention relates to a method for selective in vitro expansion of stem cells. Wherein the method comprises: (a) separating stem cells from other cells; Isolated stem cells from a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein ( And (c) recovering said stem cells. The various steps. Stem cells and progenitor cells (progenitor cells) (neutrophils , Red blood cells, platelets, etc.) Et al., Individual progenitor cell markers such as CD34 present on the surface of these cells They can be distinguished by the presence or absence of the antigen and / or by their morphological characteristics. Highly dense The phenotype of the thickened human stem cell fraction is CD34 +, Thy-1 + and And the invention is not limited to the expansion of this stem cell population . The human stem cell fraction enriched in CD34 + has been described by several methods, such as Using antibodies directed against a surface antigen such as CD34 + -Separation by column or beads, magnetic beads or flow cytometry Wear. Furthermore, hematopoiesis is performed using a physical separation method such as a counterflow tilting method. Progenitor cells can also be enriched. CD34 + progenitor cells are heterogeneous and Of cells characterized by the presence or absence of coexpression of cell surface adhesion molecules associated with different strains Divided into small groups. Most immature progenitor cells are known lineage-associated markers, e.g. For example, it does not originate HLA-DR or CD38, but originates from CD90 (thy-1). Maybe. Other surface antigens such as CD33, CD38, CD41, CD 71, HLA-DR or c-kit may also be used to selectively isolate hematopoietic progenitor cells. Can be used. Separated cells can be used in culture flasks, sterile bags, or hollow fibers. Can be incubated in selected media in fibers. To selectively expand cells Various colony promoting factors can be used. A bill that has been used for in vitro expansion of bone marrow Examples of representative factors include c-kit ligand, IL-3, G-CSF, GM-CS F, IL-1, IL-6, IL-11, flt-3 ligand or a combination thereof. A combination. Stem cell proliferation measures the number of stem cells and other cells. Quasi-technology (eg, hemacytometer, CFU, LTCIC) ) Or by flow cytometry before and after incubation You can monitor by counting.   In some methods of in vitro expansion of stem cells, various colony promoting factors, such as For example, c-kit ligand (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514 [1994]; McKenna et al., Blood d 86: 3413-3420 [1995]), IL-3 (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514 [1994], Sato et al., B lood 82: 3600-3609 [1993]), G-CSF (Sato et al., Blood 82: 3600-3609 [1993]), GM-CS F (Sato et al., Blood 82: 3600-3609 [1993]), IL-1 (Muench et al., Blood 81: 3463-3473 [1 993]), IL-6 (Sato et al., Blood 82: 3600-3609 [1993]), IL-11 (Lemoli et al., Exp. Hem. 21: 1668-1672 [1993], Sato et al., Blood 82: 3600- 3609 [1993]), flt-3 ligand (McKenna et al., Blood 86: 3413-3420 [1995]) and (Or) its combination (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514 [1994], Haylo ck et al., Blood 80: 1405-1412 [1992]; Koller et al., Biotechnology 11: 358-363 [1993]. , (Lemoli et al., Exp. Hem. 21: 1668-1672 [1993]), McKenna et al., Blood 86: 3413-342. 0 [1995], Muench et al., Blood 81: 3463-3473 [1993], Patchen et al., Biotherapy 7: 13- 26 [1994], Sato et al., Blood 82: 3600-3609 [1993], Smith et al., Exp. Hem. 21: 870-87 7 [1993], Steen et al., Stem Cells 12: 214-224 [1994], Tsujino et al., Exp. Hem. 21:13 79-1386 [1993]). Was. Among the individual colony-promoting factors, hIL-3 is an expansion of peripheral blood CD34 + cells. It has been shown to be one of the most powerful in opening (Sato et al., Blood 82: 3600-3609 [ 1993], Kobayashi et al., Blood 73: 1836-1841 [1989]). However, a single factor is a multiple factor It was not shown to be as effective as a child combination. The present invention is a single Factors utilizing multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists more effective than factor alone It provides an extracorporeal deployment method.   Another aspect of the invention is to inoculate cells into a culture vessel containing a medium. To provide a method for maintaining and / or expanding hematopoietic progenitor cells You. The medium is paced by exposure to a stromal cell line, eg, HS-5. (WO96 / 02662, Roecklein and Torok-Strob, Blood 85: 997-1105, 1995) And supplemented with the multifunctional hematopoietic chimeric receptor agonist of the present invention.   In addition, some of the uses of the multifunctional hematopoietic chimeric receptor agonist according to the present invention include blood. It is envisioned that there will be applications for liquid banking. In this case, the EPO receptor An agonist is given to the patient to increase blood cell counts and Remove blood products. This blood product is stored and transfused into the patient after medical procedures. return. Furthermore, some applications of multifunctional hematopoietic chimeric receptor agonists include blood Prior to donation, a multifunctional hematopoietic chimeric receptor agonist was administered to the blood donor. Increase blood cell count, which allows donors to provide more blood safely There may be uses to do so.   Another planned clinical use of growth factors is in pre-hematopoiesis for gene therapy. In activation of the precursor and stem cells in the container. Hematopoietic progenitor cells have a long survival time and Hematopoietic progenitor cells are living organisms because their daughter cells are distributed throughout the body. It is a good candidate for exogene transfer. In the genome of hematopoietic progenitor or stem cells Promote cell division and DNA replication to incorporate the gene of interest Need to be Hematopoietic stem cells circulate very briefly. This is a growth factor Can help increase gene transfer, thereby increasing clinical expectations for gene therapy It means to get around. Potential applications of gene therapy (Crystal, Science 270: 404-410 [1995]), (1) many congenital metabolic disorders and immunodeficiencies (Kay and Woo, Trends Genet. 10: 253-257 [1994]), (2) Neurological disorders ( Friedmann, Trends Genet. 10: 210-214 [1994]), (3) Cancer (Culver and Blaese, Trends Genet. 10: 174-178 [1994]) and (4) Infectious diseases (Gilboa and Smith, Tre nds Genet. 10: 139-144 [1994]).   There are several methods known to those skilled in the art for introducing genetic material into host cells. . Some vectors, both viral and non-viral, combine therapeutic genes. Developed for transfer into subsequent cells. Virus-based vectors include (1) multiple Defective recombinant retrovirus (Boris-Lawrie and Temin, Curr. Opin. Genet. De v. 3: 102-109 [1993], Boris-Lawrie and Temin, Annal. New York Acad. Sci. 716 : 59-71 [1994], Miller, Current Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24 [1992]) And replication-defective recombinant adenovirus (Berkner, BioTechniques 6: 616-629 [1998] , Berkner, Current Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-66 [1992], Brody and Cr ystal, Annal. New York Acad. Sci. 716: 90-103 [1994]. Non-virus basic Vectors include protein / DNA complexes (Cristiano et al., PNAS USA. 90: 2122-21 26 [1993], Curiel et al., PNAS USA 88: 8850-8854 [1991], Curiel, Annal. New york Acad. Sci. 716: 36-58 [1994]), electroporation and liposome-mediated Administration methods such as cationic liposomes (Farhood et al., Annal. New York Acad. Sci . 716: 23-35 [1994]).   The present invention provides for improved biological activity, such as by a single colony promoting factor. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein with unseen activity Hematopoiesis that introduces new genetic material in that it provides a way to utilize An improved method of the current method for expanding cells is provided.   Many drugs can cause myelosuppression or hematopoietic failure. Such drugs Examples of drugs are AZT, DDL, alkylating agents and antimetabolites (used in chemotherapy). Antibiotics such as chloramphenicol, penicillin, ganciclovir , Daunomycin and sulfa drug, phenothiazone, tranquilizer, e.g. Meprobamate, analgesics such as aminopyrine and dipyrone, anticonvulsants E.g., phenytoin or carbamazepine, antithyroid drugs such as propylthio Uracil and methimazole and diuretics. Multifunctional chimera according to the present invention Hematopoietic receptor agonists are commonly found in patients treated with these drugs. It is useful for preventing or treating myelosuppression or hematopoietic failure.   Hematopoietic failure is the result of an infection caused by a virus, microorganism, or parasite. It can also occur as a result of treatment for kidney disease or failure, such as dialysis You. The multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention has such a hematopoietic dysfunction. Useful for treatment.   Physicians containing multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists as a treatment for hematopoietic failure There is administration of the drug composition to the patient. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention Before injection of hematopoietic progenitor cells into a patient, the cells can Hematopoietic progenitors can be treated in a container with a hematopoietic receptor agonist protein. It is also useful for activating and expanding cells.   For example, various immunodeficiencies in T and / or B lymphocytes, or immune Epidemiological disorders, such as rheumatoid arthritis, also include the multifunctional chimeric hematopoietic receptor jaw of the present invention. It is beneficially affected by treatment with a nyst. Immunodeficiency is a viral infection, for example For example, the results of HTLVI, HTLVII, HTLVIII, heavy radiation exposure, and cancer therapy Or other medical treatment. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor of the present invention Teragonists may be used in other ways, including thrombocytopenia (thrombocytopenia) or anemia. Used alone or in combination with other colony-promoting factors to treat blood cell deficiency You can also. Other suitable uses for these novel polypeptides recover from bone marrow transplantation In vivo and in vitro treatment of diagnosing patients and for diagnostic or therapeutic use. In the development of monoclonal and polyclonal antibodies generated by standard methods. is there.   Another aspect of the present invention is a method and therapeutic composition for treating the aforementioned conditions. is there. Such a composition may comprise a therapeutically effective amount of one or more multifunctional chimeric constructs of the invention. The blood receptor agonist is contained as a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. This Can be administered parenterally, intravenously or subcutaneously. In the present invention Parenteral, pyrogen-free when administering therapeutic compositions to be used It may be in the form of an aqueous solution that is reasonably acceptable. Such parenterally acceptable tablets The production of protein solutions is a specialized field of judgment that takes into account pH, isotonicity, stability, etc. In quantity.   Another intended use of the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the invention is Generation of large numbers of dendritic cells from precursors to be used as adjuvants for immunization For raw. Dendritic cells play a crucial role in the immune system . These are specialized antigen donor cells that work most efficiently in activating resting T cells, Primarily for the activation of simple T cells in vivo and thus for the initiation of a primary immune response It is an important antigen-providing cell. They take up tumor-specific soluble antigens (Ag), Process and deliver. Dendritic cells cluster simple T cells and Regulation of expression of tissue-compatible complex (MHC) and costimulatory molecules, production of cytokines Responds to encounter with Ag by accelerating movement towards raw and lymphatic organs Has the unique ability to answer. Dendritic cells are new to CD4-dependent immune responses Because of their central importance in sensitizing the host to antigens, these are also It plays a very important role in the outbreak and regulation of epidemics.   Dendritic cells are derived from bone marrow CD34 + precursors common to granulocytes and macrophages. Separate dendritic cell colony forming units that come and give rise to pure dendritic cell colonies ( (CFU-DC) has been established in humans. Besides, post-CFUCD1 The 4+ intermediate is a dendritic cell or macrophage under defined cytokine conditions The potential for differentiating along the di-path was described. This bipotential (bi potential) precursors are present in bone marrow, umbilical cord blood, and peripheral blood. Dendritic cells Are specific cell surface markers that detail the maturation of cultured dendritic cells, e.g. CD It can be isolated based on 1a +, CD3-, CD4-, CD20-, CD40 +, CD80 +, and CD83 +.   Dendritic cell-based strategies boost immune response to tumors and infectious agents Provide a way to AIDS is another disease that can use dendritic cell-based therapy I'm worried. It is important that dendritic cells play a major role in enhancing HIV-1 replication Because it can be. Immunotherapy involves the induction of dendritic cells from cancer patients and surgical In-vessel exposure to tumor Ag derived from the delivered tumor mass and this to tumor patients Require reinfusion of cells. A relatively crude membrane preparation of tumor cells is Bypassing the need for molecular identification would be sufficient as a source of tumor antigen. Tumor antigen Or a synthetic peptide, carbohydrate, or nucleic acid sequence. Furthermore, the multiple Co-administration of cytokines such as functional chimeric hematopoietic receptor agonists Induction of tumor immunity can be further facilitated. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor of the present invention Teragonists administered to tumor patients with other hematopoietic growth factors or alone Increases the number of dendritic cells and allows endogenous tumor antigens to be present on dendritic cells. It is anticipated that immunotherapy to be possible will be possible in an in vivo setting. Also in vivo Some envision that immunotherapy may be possible using exogenous antigens. Also immunotherapy Treatment may be with the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention alone or with other Administered to patients with hematopoietic growth factor Removing the cells, exposing the dendritic cells to the antigen, and returning the dendritic cells to the patient It is also envisioned that this may involve the activation of dendritic cell precursors or mature dendritic cells . Furthermore, the extracted dendritic cells are used as the multifunctional chimeric hematopoietic receptor according to the present invention. In vitro culture with teragonist alone or with other hematopoietic growth factors Increase the number of dendritic cells prior to exposure to Dendritic cell-based strategies also Also provided are methods for reducing an immune response in an autoimmune disease.   Studies on dendritic cells have shown that cells are prepared in sufficient numbers and in a reasonably pure form. It has been severely hampered by difficulties in manufacturing. In setting up cell expansion in vitro , Granulocytes-macrophage colony promoting factor (GM-CSF) and tumor necrosis factor- α (TNF-α) is a hematopoietic progenitor collected from bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood. Collaborate with the in vitro induction of dendritic cells from vesicles (CD34 + cells), flk-2 / fl t-3 ligand and c-kit ligand (stem cell factor [SCF]) act synergistically Enhances GM-CSF + TNF-α-induced development of dendritic cells (Siena, S. et al. etc Experimental Hematology 23: 1463-1471, 1995). Also, to provide for immunotherapy In order to obtain a sufficient amount of dendritic cells, the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agon according to the present invention is used. In vitro methods for dendritic cell precursors or mature dendritic cells using nysts are also provided. You.   The regimen involved in the treatment of the above symptoms depends on various factors that alter the action of the drug. E.g., patient's physical condition, weight, gender and diet, severity of infection, number of doses and other It will be determined by the attending physician in view of clinical factors. In general, a daily plan is Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein per kilogram of body weight It may be in the range of 2-150 μg / kg. Dosage is given for a given multifunctional chimera Will be modulated with respect to the activity of the blood receptor agonist protein, The plan is for 0.1 kg per kilogram of body weight. As low as 1 microgram / day and 1 It should not be unreasonable to note that high doses, such as milligrams / day, can be included is there. Furthermore, the dose of the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist is adjusted to a body weight of 1 0 per kilogram. Should be adjusted above or below the 2-150 microgram range There is a special environment. They include other colony promoting or growth factors With IL-3 variants; co-administration with chemotherapeutic agents and / or radiation Administration; use of glycosylated multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein And various patent-related publications mentioned earlier in this specification. I mentioned earlier As such, therapies and compositions may include co-administration with other human factors. The present invention Other suitable colony-promoting factors for simultaneous or sequential co-administration with the peptide Offspring (CSF), cytokines, lymphokines, hematopoietic growth factors and interleukins Kin-alpha list (but not limited to) includes GM-CSF, G-CSF, c-mpl ligand (TPO or Or MGDF), M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, I L-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-1 5, IL-16, LIF, f1t3 / f1k2 ligand, B-cell growth factor, B-cell differentiation factor and Eosinophilic differentiation factor, stem cell factor (SCF) (steel factor or c-kit Ligan) Or combinations of these. the above Dosage will be adjusted to compensate for such additional ingredients in the therapeutic composition. Would. The progress of the patient undergoing treatment will be assessed by regular assessment of the hematological profile, such as blood It can be monitored by counting the number of spheres.Materials and methods   Unless otherwise noted, all specialty chemicals are manufactured by Sigma, Co. (St. Louis, MO). Restriction endonucleases and T4 DNA ligase are available from New Engl and Biolabs (Beverly, MA) or Boehringer Mannheim (Indianapolis) Squirrel, IN).E.coli Conversion of shares   E. coli strains such as DH5aTM(Llfe Technologies, Gaithersburg, MD) and TG1 (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) used for conversion of ligation reaction And a source of plasmid DNA for mammalian cell transfer. E.coli strains, for example For example, JM101 (Yanisch-Perron, et al., Gene, 33: 103-119, 1985) and MON105 (Obukowic z, et al., Appl. and Envir. Micr., 58: 1511-1523, 1992). Can be used for expression of the multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist of the present invention in the peripheral cavity You. MON105 ATCC # 55204: F-, lambda-, IN (rrnD, rrE) 1, rpoD +, rpoH358 DH5aTM: F-, phi80d1acZdeltaM15, Delta (1acZYA-argF) U169, deoR, recAl, endAl , HsdR17 (rk-, mk +), phoA, supE441amda-, thi-1, gyrA96, re1A1 TG1: Delta (lac-pro), supE, thi-1, hsdD5 / F '(traD36, proA + B, lacIq, lacZde ltaM15) JM101ATCC # 33876: delta (pro lac), supE, thi, F '(traD36, proA + B +, lacIq, la cZdeltaM15)   DH5aTMSubcloning efficiency cells should be responsive cells. And immediately subjected to conversion using the manufacturer's protocol. G1 and MON105 are both CaClTwoThe ability to take up DNA using the method To be granted. Typically, 20 to 50 ml of cells are placed in LB medium (1% B acto-trypton, 0.5% Bacto-yeast extract, 150 mM NaC l) Measured by Baush & Lomb Spectronic spectrophotometer (Rochester, NY) When grown to a density of about 1.0 optical density units at 600 nanometers. I let you. Cells are collected by centrifugation and one-fifth culture volume of CaClTwoSolution (50 mM CaClTwo, 10 mM Tris-Cl, pH 7.4). It was kept at 4 ° C. for 30 minutes. Cells are collected again by centrifugation and 1/10 culture volume of Ca ClTwoResuspended in solution. The ligated DNA was added to 0.2 ml of these cells, Was kept at 4 ° C. for 30-60 minutes. The sample was transferred to 42 ° C. for 2 minutes and 1.0 ml After adding LB, the sample was shaken at 37 ° C. for 1 hour. Cells from these samples were When selecting picicillin-resistant transformants, use ampicillin (100 micrograms). / Ml, ug / ml) or spectinomycin resistant transformants At this time, a plate containing spectinomycin (75 ug / ml) (LB medium + 1 . 5% Bacto-agar). Incubate plate at 37 ° C overnight I do. Pick colonies and LB + appropriate antibiotic (100 ug / ml ampicillin) Or 75 ug / ml of spectinomycin) and shake for 3 hours. Incubate at 7 ° C.Method for creating a gene having a new N-terminal / C-terminal Method I. Linker region (LTwoHaving a new N-terminus / C-terminus Creation.   A linker region separating the first C-terminus and the N-terminus (LTwoNew N-end including Genes with a terminal / C-terminal are described in L. et al. S. Mullins, et al. (J. Am. Chem. Soc. 116, 5529). -5533, 1994). Polymerer The primary amino acid sequence of a protein is determined using multiple stages of the ze-chain reaction (PCR) amplification. Rearrange the encoding DNA sequence. These steps are shown in FIG.   In the first stage, the first set of primers ("new starting point" and "new starting point") From the initial gene sequence, a new protein The N-terminal part, then the C-terminal and N-terminal of the first protein Linker (LTwo) Are included ("fragment starting points"). Extract and amplify. In the second step, a second set of primers (" From the first gene sequence using the “new breakpoint” and “linker breakpoint”) Coupling the same linker used above, followed by the new C-terminal portion of the new protein A DNA fragment to be encoded (fragment stop point) is created and amplified. "new New Start and New Stop primers express new genes Designed to contain the appropriate control sites to be cloned into the plasmid. Typical PCR conditions are: 1 cycle of melting at 95 ° C for 2 minutes, 25 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 minute Annealing at 50 ° C. for 1 minute and extension at 72 ° C. for 1 minute; extension 1 at + 72 ° C. for 7 minutes It is a cycle. Use the Perkin Elmer Gene Amp PCR Core reagent kit. 10 0 ul reaction was performed with 100 pmol of each primer and 1 ug of template DNA; And 1 × PCR buffer, 200 uMdGTP, 200 uMdATP, 200 u MdTTP, 200uMdCTP, 2.5 units AmpliTaq DNA Polymer And 2 mM MgClTwoincluding. The PCR reaction was performed using a model 480 DNA thermocycle. Run at Clar (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT).   The “fragment start point” and “fragment stop point” contain the sequence complementary to the linker region. And has a sequence encoding two amino acids on each side of the linker, and a third Full-length inheritance linked together at the PCR stage to encode a new protein Make a child. DNA fragments "fragment start point" and "fragment stop point" were analyzed with 1% TAE gel. Above, stained with ethidium bromide, and purified with Qiaex Gel Extraction Kit (Qiex agen). These fragments are combined in equimolar amounts and heated at 70 ° C for 10 minutes. Slowly cool and share these at the “linker starting point” and “linker stopping point” Anneal through the array. In the third PCR step, this annealed Add the primer "new starting point" and "new stopping point" to the fragment A new N-terminal / C-terminal gene is created and amplified. Typical P The CR conditions were as follows: 1 cycle of melting at 95 ° C for 2 minutes; denaturation at 94 ° C for 1 minute; One cycle of annealing and extension at 72 ° C for 1 minute; extension at + 72 ° C for 7 minutes. Pe Use rkin Elmer Gene Amp PCR Core reagent kit. 100 ul of reaction is 100 pmoles of primer and about 0.5 ug DNA; 1 × PCR buffer, 200 uMdGTP, 200uMdATP, 200uMdTTP, 200uMdCTP , 2.5 units AmpliTaq DNA polymerase and 2 mM MgClTwoTo Including. The PCR reaction is purified using the Wizard PCR Preps kit (Promega). Method II. Creation of a new N-terminal / C-terminal gene without a linker region.   Novel N-terminus / C without linker connecting initial N-terminus and C-terminus -The end gene is created using two steps: PCR amplification and blunt end ligation. These steps are shown in FIG. In the first step, the primer set ("new Starting point "and" P-bl starting point ") A DNA fragment containing the sequence encoding the new N-terminal portion of the protein ("fragment Create a starting point ") and amplify. In the second stage, the primer Gene set ("new breakpoint" and "P-bl breakpoint") DNA containing a sequence encoding a new C-terminal portion of a new protein Fragments ("fragment stops") are created and amplified. "New starting point" and And “new stop” primers are used to clone new genes into expression vectors. It is designed to include appropriate restriction sites to allow for the transformation. Typical PCR conditions are 9 1 cycle of melting at 5 ° C for 2 minutes; 25 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 45 seconds. Knee rig and extension at 72 ° C. for 45 seconds. Deep Vent polymerase (New Englan d Biolabs) to generate overhangs at the conditions recommended by the manufacturer. Reduce life. The "P-bl start point" and "P-bl stop point" primers were Phosphorylate at the ends to "fragment start" and "fragment stop" Helps smooth stump connection. A 100 ul reaction was performed with 150 pmol of each primer and 1 ug of template DNA; and 1 × Vent buffer (New England Biolabs), 300 u MdGTP, 300uMdATP, 300uMdTTP, 300uMdCTP, And 1 unit Deep Vent polymerase. PCR reaction is model 480 DNA Run on a thermal cycler (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT). P The CR reaction product is purified using the Wizard PCR Preps kit (Promega).   These primers allow for the cloning of new genes into expression vectors. Designed to include appropriate restriction sites. Typically, the "fragment starting point" is Nc Designed to create an oI restriction site, the "fragment stop" is a HindIII restriction Designed to create a site. Restriction digest reaction was performed with Magic DNA Clean-up S Purified using the ystem kit (Promega). 1% TA for fragment start and stop points Separate on E-gel, stain with ethidium bromide, and use Qiaex Gel Extraction kit. (Qiagen). These fragments were combined and 〜3 of pMON3934. Add 10 min at 50 ° C. to both ends of the 800 base pair NcoI / Hind vector fragment. Anneal by heating and cool slowly. T4 DNA ligase (Boehringer The three fragments are ligated together using Mannheim). As a result, a full length new Containing N-terminal / C-terminal genes. E.co. using a portion of the ligation reaction Transform li strain DH5α cells (Life Technologies Gaithersburg, MD). plus The mid DNA is purified as described below and the sequence is confirmed. Method III. Creation of new N-terminal / C-terminal gene by tandem duplication method   New N based on the method described in R.A. Horlick, et al. (Protein Eng. 5: 427-431, 1992). -Terminal / C-terminal genes can be created. Novel N-terminal / C-terminal gene Polymerase chain reaction (P-CR) amplification uses tandemly overlapping template DNA It is done. The steps are shown in FIG.   The tandemly overlapping template DNA is made by cloning. This is two copies of the gene DNA coding for a linker connecting the first C-terminal and the N-terminal of the Contains two copies of the gene, separated by rows. With a special primer set The new full-length N-terminal / C-terminal gene was ligated with tandemly duplicated template DNA. Create and amplify. These primers are It is designed to include appropriate restriction sites allowing for cloning into the vector. Typical PCR conditions were: 1 cycle of melting at 95 ° C for 2 minutes; Annealing at 50 ° C for 1 minute and extending at 72 ° C for 1 minute; Kuru. Perkin Elmer Gene Amp PCR Core Reagent Kit (Perkin Elmer Corpor ation, Norwalk, CT). A 100 ul reaction is performed for each primer 100 pmol and 1 ug of template DNA; and 1 × PCR buffer, 200 uMdGTP , 200uMdATP, 200uMdTTP, 200uMdCTP, 2.5 units AmpliTaq DNA polymerase and 2 mM MgClTwoincluding. PC The R reaction is a model 48O DNA thermal cycler (Perkin Elmer Corporation, Norway). (Oak, CT). PCR reactions use Wizard PCR Preps kit (Promega) And purify.Novel N-terminal / C-terminal gene multifunctional receptor agonist expression vector Cloning to   The new N-terminal / c-terminal gene is digested with restriction endonuclease to Get out. These ends are inserted into an expression vector containing another colony promoting factor gene. Can be inserted. This expression vector is also digested with restriction endonucleases. To form compatible ends. After purification, the gene and vector DNA are combined, Ligation is performed using T4 DNA ligase. Using part of this ligation reaction, Convert. The plasmid DNA is purified and sequenced to confirm correct insertion. Accurate The clone is cultured for protein expression.DNA isolation and characterization   Plasmid DNΛ can be prepared by several different methods and is known to those skilled in the art. Can be isolated using a commercially available kit. Here are a few such methods. plus Mid DNA, Promega Wizard1Miniprep kit (Madison, WI), Qiazen QIAwel l Use plasmid isolation kit (Chatsworth, CA) or Qiagen Plasmid Midi kit It is isolated by using. These kits are for plasmid DNA isolation. Follow the same general procedure as the method. Briefly, cells were centrifuged (5000 × g). And pelleted by continuous NaOH / acid treatment to release plasmid DNA Is removed by centrifugation (10000 × g). Supernatant (containing plasmid DNA) Packing onto a column containing NA-binding resin, washing the column, Is eluted with TE. Screen for colonies containing the plasmid of interest. Afterwards, the E. coli cells are inoculated in 50-100 ml of LB + appropriate antibiotics and shaken. Incubate overnight at 37 ° C in an air incubator while maintaining the temperature. Purified plasmid DNA sequencing using DNA, further restriction enzyme digestion, additional subcloning of DNA fragments And transfer into mammalian cells E. coli or other cells.Check the sequence   Purified plasmid DNATwoResuspend in O, Bausch and Lomb Spectroni c Determined by measuring the absorbance at 260/280 nm on a 601 UV spectrometer. Weigh. Usually modified by adding 5% DMSO to the sequencing mixture ABI PRISM according to the protocol suggested by the manufacturerTMDyeDeoxyTMTerminator Sequence chemistry (Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation, Lincol n City, CA) kit (Part Number 401388 or 402078) Determine the arrangement. The sequencing reaction was performed using model 480 DNA heat. Recommended increase using cycler (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT) Execute according to the width condition. Centvi-sepTMSpin column (Princeton Separat ions, Adelphia, NJ) to remove excess dye terminator and freeze dry. Resuspend fluorescent dye-labeled sequencing reactions in deionized formamide 4.7 denaturation using ABI model, 373A automated DNA sequencer Sequence on a 5% polyacrylamide-8M urea gel. Duplicate DNA sequences Analyze the fragments and use Sequencher DNA analysis software (Gene Codes Corporation, Ann.  Arbor, MI) to incorporate into master DNA contigs.Expression of multifunctional receptor agonists in mammalian cells Mammalian cell transfer / preparation of conditioned media   The BHK-21 cell line can be obtained from ATCC (Rockville, MD). Supplemented with 2 mM (mM) L-glutamine and 10% fetal bovine serum (FBS) Culture cells in Dulbecco modified Eagle's medium (DMEM / high-glucose). This composition is called BHK growth medium. Selection medium is 453 units / ml hydro BHK growth medium supplemented with mycin B (Calbiochem, San Diego, CA). The BHK-21 cell line contains the IE110 found on plasmid pMON3359. HSV transactive protein VP16, which transactivates the promoter (See Hippenmeyer et al., Bio / Technology, pp. 1037-1041, 1993.) See). The VP16 protein is a gene inserted after the IE110 promoter. Promote the expression of BHK-21 expressing transactivator protein VP16 The cell is called BHK-VP16. Plasmid pMON1118 (Highkin et al., Poultry Sci., 70: 970-981, 1991) describes hygromycin from the SV40 promoter. Expresses a syn-resistance gene. A similar plasmid is ATCC, pSV2-hph. Available from   BHK-VP16 cells were plated 3x cells in a 60 millimeter (mm) tissue culture dish. 10FiveInoculate 24 hours before transfer in pieces / dish. Plasmid D containing the target gene NA 10 ug, hygromycin resistant plasmid 3 ug, pMON1118, And Gibco-BRL "LIPOFECTAMINE"TM80 ug / dish included 3ml "OPTIMEM"TM(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) Populate time. The medium was then aspirated and replaced with 3 ml of growth medium. After transfer 4 At 8 hours, media was collected from each dish and assayed for activity (temporary conditioned media). cell Was removed from the dish with trypsin-EDTA, diluted 1:10 and 10 ml Transfer to a 100 mm tissue culture dish containing the selection medium. After about 7 days in selective medium, resistant cells Grows into colonies several millimeters in diameter. Filter these colonies with filter paper (colony and Cut to the same size, soaked in trypsin / EDTA) Was transferred to each well of a 24-well plate containing the selective medium. Grow until colonies fuse After the pacing, the conditioned media was re-tested and positive clones were developed in growth media.E.coli Of multifunctional receptor agonists in mice   E. coli strain MON105 or JM101 containing the plasmid of interest was transferred to M9 + Obtained from New Brunswick Scientific (Edison, NJ) in amino acid medium Grown at 37 ° C with shaking in an air incubator Model G25 Let Growth was monitored at OD600 until it reached a value of 1.0, at which time 50 μg of nalidixic acid (10 mg / ml) in 0.1 N NaOH Add to a final concentration of / ml. The culture is then shaken at 37 degrees for an additional 3 to 4 hours. During the culture period, ensure that the production of the desired gene product is maximized during culture. Maintain ventilation. Cells are examined under a light microscope for the presence of inclusion bodies (IB) You. Remove a 1 ml portion of the culture, boil the pelleted cells and remove them Processing by SDS-PAGE using an adjuvant and electrophoresis For analysis of protein content (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mo nual, 1982). The culture is centrifuged (5000 × g) to pellet the cells.Inclusion body preparation, extraction, refolding, dialysis, DEAE chromatography, And multifunctional chimeric hematopoietic receptor agoni accumulate as inclusion bodies in E. coli Characteristic display of strike Isolation of inclusion bodies:   The cell pellet from the 330 ml E. coli culture was transferred to 15 ml of sonication buffer. Liquid (10 mM 2-amino-2- (vidroxymethyl) 1,3-propanediol Hydrochloride (Tris-HCl), pH 8.0 + 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (E DTA). These resuspended cells are used as Sonicator Cell Disruptor (Mo del W-375, Heat-Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, New York Sonication using the microtip probe of step (a). Sonication buffer The cells were ground using three rounds of sonication followed by centrifugation and the inclusion bodies ( Wash IB). The first round of sonication is a 3 minute burst, then 1 minute And the last two rounds of sonication are for 1 minute each. Extraction and refolding of proteins from inclusion body pellets:   After the last centrifugation step, the IB pellet was washed with 10 ml of 50 mM Tris-HCl. , PH 9.5, resuspended in 8 M urea and 5 mM dithiothreitol (DTT) And stir at room temperature for about 45 minutes to denature the expressed protein.   The extraction solution was mixed with 70 ml of 5 mM Tris-HCl, pH 9.5 and 2.3 M. Transfer to a beaker containing urea and gently stir in air at 4 ° C for 18-4. Expose for 8 hours to refold the protein. Refolding , Vydac (Hesperia, Ca.) C18 reversed-phase high-pressure liquid chromatography (RP-HPL) C) Monitor by analysis on a column (0.46 × 25 cm). 0.1% A linear gradient from 40% to 65% acetonitrile containing reflex acetic acid (TFA) To monitor refold. The gradient was raised to 1.5 ml / min over 30 minutes. Deploy at a flow rate of. Denatured proteins generally lag behind refolded proteins To elute in the gradient. Purification:   Following refolding, contaminating E. coli proteins are removed by acid precipitation. Refor The pH of the solution is adjusted by using 15% (v / v) acetic acid (HOAc). It was titrated from 5.0 to pH 5.2. Stir the solution at 4 ° C for 2 hours, then add 1 Centrifuge at 2,000 × g for 20 minutes to pellet insoluble protein.   The supernatant resulting from the acid precipitation step is subjected to a molecular weight cut off (MW Dialysis using a Spectra / Por3 membrane with (CO). This dialysis 18 hours, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 41 (50-fold excess) twice Perform for exchange. Dialysis reduces the conductivity of the sample and causes DEAE chromatography. Remove urea prior to The sample is then centrifuged (12,000 xg for 20 minutes) Pellet insoluble protein after dialysis.   Bio-Rad Bio-Scal for ion exchange chromatography e Use a DEAE2 column (7 × 52 mm). Column is in equilibration buffer 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, and 0 to 500 mM NaCl Equilibrate in a buffer containing a lithium (NaCl) gradient and use more than 45 column volumes. To elute the protein. A flow rate of 1.0 ml / min is used throughout the experimental procedure. Devil Column fractions (2.0 ml / fraction) were collected across the column and Vydac (Hesperia, Ca.) Analyze by RP HPLC on a C18 column (0.46 × 25 cm). 0.1 A linear gradient from 40% to 65% with% trifluoroacetic acid (TFA) is used. This Is developed at a flow rate of 1.5 ml / min over 30 minutes. Next, the collected fractions 10 mM ammonium acetate NHFourAc), pH 4.0 41 (50-500 times) Dialyze against (excess) 2 changes. Dialysis has a MWCO of 3,500 daltons This is performed using a Spectra / Por3 film. Finally 0.22μm syringe filter Luter (μStar LB syringe filter, costar, Cambridge, Ma. The sample is aseptically filtered using) and stored at 4 ° C.   In some cases, the folded protein was added to a mA Affinity reagents such as bs or receptor subunits Can be purified. Alternatively (or additionally) various chromatographic methods For example, ion exchange, gel filtration or hydrophobic chromatography or reversed phase H Purification can be accomplished using either PLC.   These and other protein purification methods are described in Methods in Enzymology, Volume 182. ｀ Guide to Protein Purification'Murray, edited by Deutscher, Academic Press, San D iego, CA (1990). Protein characterization:   The purified protein was analyzed by RP-HPLC, electrospray mass spectrometry, And by SDS-PAGE. Protein quantification is based on amino acid composition, RP- It is done by HPLC and Bradford protein quantification. In some cases Performs tryptic peptide mapping with electrospray mass spectrometry This confirms the identity of the protein.AML proliferation assay for bioactive human interleukin-3   The factor-dependent cell line AML 193 was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Kuville, MD). These cell lines have been established from patients with acute myeloid leukemia GM-CSF-supplemented medium, growth factor dependent cell line showed that. (Lange, B., et al., Blood 70: 192, 1987; Valtieri, M., et al., J. Immuno l. 138: 4042, 1987). Ability of AML193 cells to grow in the presence of human IL-3 (Santoli, D., et al., J. Immunol. 139: 348, 1987). Cell lineage Variant AML193 1.3 was used. This will wash away growth factors and reduce Placing Cain-dependent AML193 cells starved for growth factors for 24 hours Adapted for long-term culture with IL-3. The cells are then transferred to 100 U / ml IL- 1x10 in a 24-well plate in medium containingFiveRe-applied in cells / well I do. It took about 27 months for the cells to grow rapidly in IL-3. these The cells were converted to AML193 1.3, and then the tissue culture medium (see below) was replaced with human. Maintained by supplementing with IL-3.   AML193 1.3 cells were obtained by centrifuging the cell suspension at 250 xg for 10 minutes. By decanting the supernatant, cold Hanks solution (HBSS, Gibco, Gran d Island, NY). Resuspend the pelleted cells in HBSS, 6 Repeat this procedure until the last wash cycle has been completed. Cells washed 6 times in this procedure With 2 x viable cells in tissue culture mediumFiveFrom 5 × 10FiveOver pcs / ml Resuspend at density. This medium is Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM, Hazelton , Lenexa, KS) for albumin, transferrin, lipids and 2-mercaptoe Prepared by supplementing with ethanol. Bovine albumin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) at 500 μg / ml; human transferrin (Boe hringer-Mannheim, Indianapolis, IN) at 100 μg / ml; soybean Add lipid (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) at 50 μg / ml; 5 × 10 2 mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO)-FiveIn M Add.   Human interleukin-3 or multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist Serial dilutions of protein were added to 96-well Costar 3596 tissue culture plates. Thus, a triple series is prepared in the tissue culture medium supplemented as described above. Each well When serial dilution is completed, interleukin-3 or multifunctional chimeric hematopoiesis 50 μl of medium containing receptor agonist protein was included. Control well Contained tissue culture medium alone (negative control). To each well, prepared as above AML193 1.3 cell suspension was added to each well in an amount of 50 μl (2.5 × 10FourPieces Cells) by pipetting. Humidify the tissue culture plate at 37 ° C 5% CO in airTwoIncubate with for 3 days. On the third day, a 50 μl set 0.5 μCi in the woven culture mediumThreeH-thymidine (2 Ci / mM, New England N uclear, Boston, MA). 5% CO in humidified airTwoAt 37 ° C using Incubate for 18-24 hours. Wash cycle followed by 70% ethanol wash Cell harvester using a cell cycle (TOMTEC, Orange) e, CT) to convert the cell DNA into a glass filter mat (Pharm acia LKB, Gaithersburg, MD). Air dry the filter mat and then sample Put in a bag and add scintillation liquid (Scintiverse II, Fisher Scientifi c, St. Louis, MO or Betaplate Scintillation Fluid, Pharmacia LKB, Gait hersburg, MD). Beta emission of samples from individual tissue culture wells Out, LKB BetaPlate model 1205 scintillation counter (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) and count data from each tissue culture well. Taken up in cellsThreeExpressed as H-thymidine counts / minute. Each human in Tarleukin-3 preparation or multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein Activity of the intermediate preparation is determined by interleukin-3 or multifunctional chimeric hematopoietic receptor Cell proliferation induced by the gonist's graded concentration (ThreeH-thymidine uptake ). Typically, 0.05 pM-10FivepM Are determined in these assays. Interleukin-3 or multifunctional key Determine activity by measuring the dose of melahematopoietic receptor agonist protein You. The dose is the amount that gives 50% of maximal growth (EC50), Which is 0.5 X (one well of triplicate cultures of all concentrations of interleukin-3 tested) Captured per leThreeH-thymidine maximum average count / min-a Was observed in triplicate cultures lacking interleukin-3ThreeFor H-thymidine incorporation (Background propagation as measured by the above). This EC50Value is also one unit of biological activity Is equivalent to All assays are self-contained as comparison standards so that relative activity levels can be assigned. Performed using pristine Interleukin-3.   Typically, a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein is Testing was performed in a concentration range from 2000 pM to 0.06 pM, titrated at two-fold dilution.   The activity for each sample was determined by applying a 4-parameter logistic model to the data. The combination determines the concentration that gives 50% of the maximum response. On the sample It was observed that the upper stable period (maximum response) for Was. Therefore, the relative potency calculation for each sample is the EC50Calculation and And the standards indicated above. AML193.1.3 cells are hIL-3, Proliferates in response to hGM-CSF and hG-CSF. Therefore, the following additional inspection G-CSF receptor, a multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein To demonstrate that the teragonist moiety is active, several samples Ran. Proliferation assays are performed by neutralizing monoclones to the hIL-3 receptor agonist moiety. Multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist with or without added antibody Was performed using Further, the fusion molecule having the factor Xa cleavage site is cleaved and then purified. And half of the molecules were assayed for proliferative activity. These experiments are multifunctional Both components of the hematopoietic receptor agonist protein were shown to be active.TF1 c-mpl ligand-dependent proliferation assay   The c-mpl ligand proliferating activity was determined by the pluripotent human cell line TF1 (Kitamura et al., J. Cel. l Physiol 140: 323-334 [1989]). TF1 cells h-IL3 (100 U / ml). Responds to c-mpl ligand To identify sub-clones, express the 1-153 form of c-mpl ligand Cells were placed in a subculture medium containing 10% supernatant obtained from the transfected BHK cells. Hold (pMON26448). Most of the cells die, but a subset of the cells survive. After dilution cloning, c-mpl ligand responsive clones were selected and Transfer the cells to the subculture medium in the assay setting6Minutes to a density of individual cells / ml I can. The passage medium for these cells is as follows: RPMI1640 (Gibco), 10% FBS (Harlan, Lot # 91206), Transfer B 10% c-mpl ligand supernatant from HK cells, 1 mM sodium pyruvate ( Gibco), 2 mM glutamine (Gibco), and 100 ug / ml peni Syrin-streptomycin (Gibco). The next day, cells are harvested and Or twice in IMDM medium and finally in ATL or assay medium. ATL medium consists of the following components: IMDM (Gibc o), 500 ug / ml bovine serum albumin, 100 ug / ml human transfection Erin, 50 ug / ml soybean lipid, 4 × 10 −8 M beta-mercaptoethanol And 2 ml A9909 (Sigma, antibiotic solution). Cells are transferred to 96 wells. In a low evaporation plate (Costar) in assay medium, final density 0.25 × 106 Dilute to individual cells / ml (50 ul final volume). Temporary supernatant from the transferred clone ( Pacing media) in a volume of 50 ul, as a duplicate, at a final concentration of 50%, Dilute 3 fold to 1.8%. Starting from 1 ng / ml and using 3-fold dilution Of IL-3 mutant pMON13288 diluted to 0.0014 ng / ml A triplicate of the curve is included as a positive control. Plate 5% COTwoAt 37 ° C Cubate. On day 6 of culture, 20 u with 0.5 Ci 3H / well (NEN) Briefly label the plate with a volume of 1 / well and add 5% CO2Two4 hours at 37 ° C Cubate. Collect plate and count on Betaplate counter I do.MUTZ-2 cell proliferation assay   A cell line such as the human myeloid leukemia cell line MUTZ-2 (German Collection o) f Using microorganisms and Cell Cultures, DSM ACC 271), The cell growth activity of the teragonist is measured. The MUTZ-2 culture is grown in a growth medium. Retain with recombinant native flt3 ligand (20-100 ng / ml). Eighteen hours before setting up the assay, MUTZ-2 cells were plated in IMDM medium (Gibco) for 3 hours. Washes twice and at a concentration of 0.5-0.7 × 10E6 cells / ml in IMDM medium alone. Re-suspend, 37 ° C, 5% COTwoIncubate with flt3 ligand cells Starve. Assay day, no standard and no flt3 receptor agonist Bacterial tissue culture treated 96-well plate, more than twice the desired final concentration in assay medium Dilute to. The flt3 receptor agonist and standard are tested in triplicate. A Fill all wells except the column with 50 μl of assay medium. 75 μl of flt3 Add a sceptor agonist or standard to row A, take 25 μl from this row, Perform serial dilutions (1: 3) for the rest of the plate (B to G). Column H is Leave as medium only control. Starved MUTZ-2 cells in IMDM medium Washed twice and resuspended in 50 μl assay medium. 50 μl cells to each well To a final concentration of 0.25 × 10E6 cells / ml. Assay kit containing cells Rate at 37 ° C, 5% COTwoAnd incubate for 44 hours. Then each well Label for 4 hours with 1 μCi / well of tritiated thymidine in a volume of 20 μl. next Collect and count plates.Cell-based proliferation assay in other containers (in vitro)   Other in-vessel cell-based assays known to those skilled in the art are also described in AML193. In the same manner as described in 1.3 Cell proliferation assay, May be useful for measuring the activity of potent chimeric hematopoietic receptor agonists Absent. The following are examples of other useful assays.   TF1 proliferation assay: TF1 is a pluripotent human cell line corresponding to hIL-3 (Kit amura et al. Cell Physiol 140: 323-334 [1989]).   32D proliferation assay: 32D is a mouse IL-3-dependent cell line, human IL-3 Not equivalent but corresponds to human G-CSF which is not a restricted species.   Baf / 3 proliferation assay: Baf / 3 is a mouse IL-3-dependent cell line, human Human G, which does not correspond to IL-3 or human c-mpl ligand but is not a restricted species -Corresponds to CSF.   T1165 proliferation assay: T1165 is an IL-6 dependent mouse cell line (Norda 1986), which corresponds to IL-6 and IL-11. Human plasma chroma Meg-CSF assay: used for assaying megakaryocyte colony forming activity (Mazur et al.) 1981).Transferred cell line :   Cell lines, such as the mouse Baf / 3 cell line, are colony-promoting Receptor, for example, human G-CSF receptor or human c-mpl receptor. It can be transferred using a scepter. These transferred cell lines are The putter can be used to measure the activity of the ligand transferred to the cell line.   One such transfected Baf / 3 cell line was created from a c-mpl responsive cell line. And cloned into multiple cloning sites of plasmid pcDNA3. Cloning of the cDNA encoding c-mpl from the library (Invitrogen, San Diego Ca.). Baf / 3 thin The cells were transfected with the plasmid by electroporation. Cells were transformed into mouse IL- 3 in the presence of G418 in Wehi pacing medium. Clones are limited Established by dilution.   Similarly, transferring the human G-CSF receptor to the Baf / 3 cell line Can be used to determine the biological activity of multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonists .Analysis of c-mpl ligand proliferating activity Method     1. Bone marrow proliferation assay     a. CD34 + cell purification:   Bone marrow aspirates (15-20 m 1) was obtained. Dilute cells with phosphate buffered saline (PBS, Gibco-BRL) (1: 3), and 30 ml of Histopaque-1077 (Sig ma), and centrifuged at 300 RCF for 30 minutes. Collect the mononuclear interface layer and add PBS And washed. CD34 + cells were prepared from the mononuclear cell preparation by the manufacturer's instructions (CellP ro, Inc., Bothell WA) using an affinity column. Thickening After that, the purity of CD34 + cells was measured using flow cytometry analysis. The filtration average was 70%. This analysis shows that fluorescein conjugated to phycoerythrin And using anti-CD34 monoclonal antibody conjugated to anti-CD38 (Bector Dickinson, San Jose, CA).   Cells were placed in X-Vivo10 medium (Bio-Whittaker, Walkersville, MD). Resuspend at 40,000 cells / ml and 1 ml in 12-well tissue culture plate (Costar). Growth factor rhIL-3 was added at 100 ng / ml. (PMON5873) was added to some wells. 10 ng / hIL3 mutant Used from ml to 100 ng / ml. c-mpl ligand or multifunctional chimera From BHK cells transfected with a plasmid encoding a hematopoietic receptor agonist The obtained conditioned medium was added to 100 ml of the supernatant added to 1 ml of culture (about 10% dilution). And tested. Cells are incubated in a 37 ° C. humidified incubator with 5% CO 2TwoAt Incubated at 37 ° C for 8-14 days.     b. Cell collection and analysis:   At the end of the culture period, total cell numbers for each condition were obtained. Fluorescence analysis and polyploidy For determination, cells were placed in megakaryocyte buffer (MK buffer, 13.6 mM sodium citrate). 1 mM theophylline, 2.2 μm PGE1, 11 mM glucose, 3% w / V BSA, in BSA, pH 7.4) (Tomer et al., Blood 70: 1735-1742,1987). In anti-CD41a FITC antibody in MK buffer (1: 200) AM (AC, Westbrook, ME) Resuspend in 500 μl and wash in MK buffer did. For DNA analysis, cells were loaded with 0.5% Tween 20 (Fisher, Fair Lawn NJ). Permeability on ice for 20 minutes in MK buffer, then 0.5% Tween-20 and And 1% paraformaldehyde (Fisher Chemical) for 30 minutes, then 55% RNA-ase (400 U / ml) in% v / v MK buffer (200 mOsm) Containing propidium iodide (Calbiochem, La Jolla Ca) (50 μg / ml) Incubate on medium ice for 1-2 hours. Cells are FACScan or Va Negative flow cytometer (Bacton Dickinson, San Jose, CA) Was analyzed. The green fluorescence (CD41a-FITC) is linear relative to the red fluorescence (PI). And together with the log signal, the DNA ploidy was determined. Collect all cells and use CD41 The percentage of cells that were + was determined. LYSIS (Becton Dickinson, Sanji Data analysis was performed using software from the University of California, CA. CD41 antigen Percentage of cells expressing is determined by flow cytometry analysis (percent) Obtained. The absolute (Abs) number of CD41 + cells / ml is     (Abs) = (cell count)*(Percent) / 100 Was calculated by 2. Megakaryocyte fibrin clot assay   The high CD34 + population was isolated as described above. Cells are 25,000 cells / ml With or without cytokine (s) at a density of scoves IMDM medium with 0.3% BSA, 0.4 mg / ml apo- Transferrin, 6.67 μM FeClTwo, 25 μg / ml CaClTwo, 25μ g / ml L-asparagine, 500 μg / ml e-amino-n-caproic acid And suspended in medium supplemented with penicillin / streptomycin. 35m Add thrombin (0.25 units / ml) before applying to plate Was started. Cells are incubated in a 37 ° C. humidified incubator with 5% CO 2Two13 days for 3 Incubate at 7 ° C. Was. At the end of this culture period, the plate was washed with methanol: Fix with acetone (1: 3), air dry and store at -200 ° C until staining. Peru Oxidase immunocytochemical staining was used (Zymed, Histostain-SP. San Francesco). Sco, CA), and a primary monoclonal antibody consisting of anti-CD41a, CD42 and CD61. A cocktail of lawn antibodies was used. After staining, colonies were counted and negative, and CFU-MK ( Small colonies, 1-2 foci, and less than about 25 cells), BFU-MK (Including large, multi-focus colonies, <25 cells) or mixed colonies (Mixture of positive and negative cells).Methyl cellulose assay   In this assay, colony-stimulating factors stimulate normal bone marrow cells to (Bradley et al., Aust. Exp Biol. Sci. . 44: 287-300, 1966), Pluznik et al. Cell Comp. Physio 66: 319-324, 1965). Method   Approximately 30 ml of fresh, normal, healthy bone marrow aspirate can be given to the individual after consent given Get. Under sterile conditions, samples were transferred to a 50 ml conical tube (# 25339-50). 1 × PBS in Corning, Corning MD) (# 14040.059 Life Technolog) ies, Gaithersburg, MD.) solution (1: 5). Ficoll under the diluted sample (Histopaque 1077 Sigma H-8889) was overlaid and centrifuged for 30 minutes (300 × g). Except for the mononuclear cell zone, twice in 1 × PBS, 1% BSA PBS (Cellpro Co., Bo thel, WA). Mononuclear cells were counted and CD34 + cells were transferred to Ceprate LC (C D34) Select using a kit (Cellpro Co., Bothel, WA) column. This differentiation is performed because all stem and progenitor cells in the bone marrow have CD34 expression. This is because it indicates a surface antigen.   Cultures are set up in triplicate. 35 × 10 mm Petri dish (Nunc # 174926) To a final volume of 1.0 ml. The culture medium was Terry Fox Labs. (Hcc-4230 medium (T erryFoxLabs, Vancouver, B. C., Canada). Add Yetin (Amgen, Thousand Oaks, CA.). 3,000-10,000   Add CD34 + cells / dish. Recombinant purified from mammalian cells or E. coli IL-3 and multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist protein (transferred In conditioned media obtained from milk cells, or from transfected mammalian cells or E. coli. Purified from the conditioned medium). Final concentrations ranging from 001 nM to 10 nM were obtained. You. Recombinant hIL-3, GM-CSF, c-mpl ligand and multifunctional chimera Hematopoietic receptor agonists were supplied in-house. G-CSF (Newpogen) is based on Amgen (Thou sand Oaks Calf.). Resuspend the culture using a 3 cc syringe. Dispense 0 ml per dish. Colony-promoting factor for control (baseline response) culture Did not give. Positive control cultures use conditioned media (PHA promoted human cells: Terr y Fox Lab. H2400). Culture at 37 ° C, 5% CO in humidified airTwoIncubate with . Hematopoietic colonies defined as having more than 50 cells are 40 × objective combination Using a Nikon inverted phase microscope equipped with And count on the day of the peak response (10-11 days). Cells containing less than 50 cells The cell group is called a class star. On the other hand, colonies spread them on slides And can be identified by staining, or they can be picked up, resuspended, It may be discharged onto a cytospin slide for staining.Human cord blood hematopoietic growth factor assay   For in-vessel assays of hematopoietic colony-stimulating factor (CSF) activity, hypermedullary cells Used systematically. However, human bone marrow is not always available and There is considerable variation between providers. Cord blood is used as a source of hematopoietic stem cells and precursors by bone Comparable to the pith (Broxmeyer et al., PNAS USA 89: 4109-113, 1992; Mayani et al., Blood 81: 3252-3258, 1993). Unlike bone marrow, cord blood is readily available at all times. In addition, storing new cells obtained from several donors can change the assay. Reduced ease, or use cryopreserved cell banks for this purpose There is also the possibility of creating it. By adjusting the culture conditions, and (also A) By analyzing for system specific markers, granulocyte / macrophage Ronnie (CFU-GM), megakaryocyte CSF activity or increased To specifically assay for fertile colony forming cells (HPP-CFC) activity It is possible. Method Mononuclear cells (MNC) were purified using a standard density gradient (1,077 g / ml Histopaque). And is isolated from cord blood within 24 hours of collection. Cord blood MNC with several hands Order, eg, immunomagnetic for CD14−, CD34 + cells Selection; Applied Immune Science (Santacl ara, CA), and panning using a coated flask obtained from CD34 + selection using lpro (Bothell, WA) avidin column allows stem cells and And the precursor was further concentrated. Freshly isolated or cryopreserved CD The fraction enriched in 34+ cells is used for the assay. Sample serial dilutions (from 1 pM concentration range) 1204 pM) with 0.9% methylcellulose without additional growth factors. 1x10 in 1 ml of medium containingFour(Stem Cell Tec) Methocult H4230 obtained from hnologies, Vancouver, BC. In an experiment Replaces Methocult H4230, or stem cell factor (SCF), with erythropoi Methocult H4330 containing ethyne (EPO) (50 ng / ml) (Biosource Intern ational, Camarillo, CA). After 7-9 days of culture, contain> 30 cells Colonies were counted. Blind test to eliminate subjective bias in scoring The score was recorded.   To create mutants, and to convert them into bacteria, mammalian cells or insect cells. Recombinant DNA methods that can be used for expression in cells, purification and purification of the desired protein. And refolding, and assays to determine the biological activity of proteins For further details, see co-filed patent applications WO 95/00646, WO 94/12639, WO 94/1263. 8, WO 95/20976, WO 95/21197, WO 95/20977, WO 95/21254 and US 08 / 383,03 5, which are incorporated by reference in their entirety.   Further details known to those skilled in the art can be found in T.W. Maniatis, etc.Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), and References incorporated herein by reference; and J. Sambro ok, etc.Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harb or Laboratory, 1989) and the references cited therein (herein incorporated by reference). ).   The following examples illustrate the invention in more detail, but the invention is in no way limited to these specific examples. It should be understood that this is not a limitation.Example 1 Construction of parent BHK expression vector A. Removal of Af1III site from mammalian expression plasmid   hIL-3 receptor agonist pMON13146 (WO91 / 12638) In frame and 3 'of the gene and mouse IgG2b linker fragment, NcoI- To accept HindIII or Af1III-HindIII gene fragments, a new A new mammalian expression vector was created. First, a single Af1III site It was removed from pMON3934, which is a derivative of pMON3359. pMON3359 is a pUC18-based vector containing a mammalian expression cassette It is. This cassette is followed by a modified human IL-3 signal peptide sequence. SV40 late polyadenylation (poly-A) signal (this is the pUC18 Herpes simplex virus plasmid (subcloned in relinker) Motor motor IE110 (-800 to +120) (Hippenmeier (Hi ppenmeyer) et al., Bio / Technology, 1993, pp. 1 037-1041). Modified humans that promote the secretion of gene products out of cells The IL-3 signal sequence has a BamHI site at the 5 'end on both sides and a user at the 3' end. There is a unique NcoI site. A DNA sequence encoding a signal peptide (Restriction enzyme sites are shown above). ATG (methioni) in Ncoi site The site is in the frame of the signal peptide initiator ATG (bottom). With a line):   Digestion with Af1III removes a single Af1III, DNA polymerase and nucleic acid Otide was added to fill the overhang. Magic digested DNA fragment PCR cleanup kit (Magic PCR Clean up kit) ) (Promega) and T4 DNA ligase Connected. The ligation reaction was transformed into DH5α® and the cells were transferred to LB agar. + Spread to ampicillin. By restriction analysis using Af1III and HindIII, Screening each colony for loss of the Af1III site revealed that Af1III If the site was removed, a single fragment was obtained. The obtained plasmid was pM Named ON30275. B. hIL-3 receptor agonist pMON13416 / p of IgG2b cassette Transfer to MON30275   The NcoI-HindIII fragment (about 425 base pairs) from pMON30245 was , Linked to the NcoI-HindIII fragment (about 3800 base pairs) of pMON30275. Tied. pMON30245 (WO94 / 12638) is a mouse IgG2b human Binding to the fragment Containing the gene encoding the isolated hIL-3 receptor agonist pMON13416 I do. Immediately 3 'of the IgG2b hinge and 5' of the HindIII site are the Af1III sites It is. The gene is identical to the hIL-3 variant pMON13416 / IgG2b hinge. NcoI-HindIII fragment or Af1III-HindIII in the same frame It was cloned into the Af1III-HindIII site as a fragment to create a new chimera. Can be achieved. NcoI and Af1III sites are compatible overhauls It will carry and link, but the recognition site is gone. Mouse IgG2 b encodes a hIL-3 variant having pMON13416 bound to the hinge region Plasmid pMON30304 containing the DNA sequence of (SEQ ID NO: 1) The result of this cloning.Example 2 Contains one copy of the c-mpl ligand (1-153) gene of the dimer template Of intermediate plasmid   C-mpl (1-153) ligand followed by a unique EcoRI recognition site Reverse transcriptase / polymer to generate plasmid DNA with the coding sequence of The gene is isolated by the Rase Chain Reaction (RT / PCR). c-mpl Riga For the source of messenger RNA (mRNA), human embryos (lot # 38130) and adult liver (Lot # 46018) A + RNA were purchased from Clontech ( Clontech) (Palo Alto, Calif.). Of the first chain The cDNA reaction was performed using InVitrogen (San Diego, California). CDNA Cycle® kit (cDNA C ycleTM  Kit). In the RT reaction, a random primer From human and fetal liver mRNA combinations using oligo dT primers and Create DNA. C-mpl ligand gene encoding amino acids 1-153 For the fragment, the RT product was the forward primer: c-mplNcoI (SEQ ID NO: 3). 17) and a reverse primer: the precursor combination with the primer of Ecompl Acts as a template. The c-mplNcoI primer is a c-mpl ligand Gene (GeneBank accession number # 33410 or de sa De Sauvage et al., Nature 369: 533-538 ( 1994)) and the first codon of the c-mpl ligand (Ser + 1). ) Encodes an NcoI restriction enzyme site 5 '. The NcoI restriction enzyme site is Encodes methionine and alanine codon before Ser + 1, Ala codon and c- mpl ligand first four codons (Ser, Pro, Ala) and Pro ) Codon degeneracy. Ecompl primer is a salt of c-mpl ligand Anneal the groups # 720-737 and add the c-mpl library immediately after Arg-153. Encodes an EcoRI site (GAATTC) in the same frame as the Gand gene . The EcoRI site creates Glu and Phe behind Arg-153. About 4 The 80 base pair PCR product was purified, digested with NcoI and EcoRI, and pMON3 It was ligated to an NcoI-EcoRI vector fragment of 993 (about 4550 base pairs). pMON3993 is a derivative of pMON3359 (described in Example 1). IE1 10 unique BamHI site between promoter and poly-A signal The subcloned human IL-3 signal peptide sequence has a 3 ' It has an NcoI site followed by a unique EcoRI site. c-mpl Riga D of (SEQ ID NO: 2) encoding amino acid 1-153 (SEQ ID NO: 467) Plasmid pMON26458 containing the NA sequence was constructed for this cloning. It was a result.Example 3 Generation of parent plasmid containing second gene of dimer template   Beginning at amino acid 1 (Ser) and terminating after amino acid 153 (Arg) RT amplification from Example 2 for amplification of the c-mpl ligand gene fragment with The product functions as a template for PCR with the following primer combinations: cm plNcoI (SEQ ID NO: 317) (forward primer) and c-mplHind III (SEQ ID NO: 319) (reverse primer). c-mplNcoI (SEQ ID NO: 31) 7) is described in Example 2. Access to base # 716-737 of c-mpl ligand The c-mplHindIII (SEQ ID NO: 319) to be quenched has the final codon Arg153 A stop codon and a HindIII restriction enzyme are added immediately after.   Two PCR products were generated from the RT cDNA sample, one was amino acid 11 Two to 115 codons are deleted, one without the deletion of these codes. From mammals For transfer to the current vector pMON3934, the c-mpl ligand PCR product (About 480 base pairs) is digested with NcoI and HindIII restriction enzymes. pMON3 934 is digested with NcoI and HindIII (about 3800 base pairs) and Will accept things.   A plasmid encoding the c-mpl ligand amino acids 1-153 (SEQ ID NO: 546) Smid pMON32132 (SEQ ID NO: 84) was the result of this cloning. Was. coding for c-mpl ligand amino acids 1-153 (SEQ ID NO: 548) Rasmid pMON32134 (SEQ ID NO: 86) is the result of this cloning. Was. C-mpl library with deletion of codons 112-115 (Δ112-115) Plasmid pMON encoding Gand amino acids 1-153 (SEQ ID NO: 547) 32133 (SEQ ID NO: 85) was the result of this cloning.Example 4 PCR dimer with 112-115 deletion in the second c-mpl ligand gene -Preparation of mold 5L   The 3.7 kb BstXI / EcoRI fragment of pMON26458 was converted to pMO 1 kilobase pair Nc of N32133 (with deletion of amino acids 112-115) The oI / BstXI fragment was ligated with EcoRI / Af1III 5L synthetic oligonucleotide Along with 5L-5 '(SEQ ID NO: 322) and 5L-3' (SEQ ID NO: 323) This creates a PCR template to create a new type of c-mpl ligand.   The EcoRI end of this linker is linked to the EcoRI end of pMON26458. Will tie. The Af1III end of this linker is the Nc of pMON32133. Ligation to the oI site, none of the restriction sites will be retained by the ligation. pM ON26458 and the BstXI site of pMON32133 are similarly ligated. Would. Plasmid pMON28548 is the result of this cloning, Via a PheGlyGlyAsnMet (SEQ ID NO: 783) linker, amino Amino acids 1-153c- containing a deletion of acids 112-115 (SEQ ID NO: 468). encodes amino acid 1-153c-mpl ligand fused to mpl ligand (SEQ ID NO: 3).Example 5 Preparation of PCR dimer template 4L   The 3.7 kb BstXI / EcoRI fragment of pMON26458 was converted to pMO A 1 kilobase pair NcoI / BstXI fragment of N32132 was ligated with EcoRI / Af1 III 4L synthetic oligonucleotide linkers 4L-5 '(SEQ ID NO: 320) and 4L -3 '(SEQ ID NO: 321) to link a new type of c-mpl ligand Create a PCR template to create.   The EcoRI end of this linker is linked to the EcoRI end of pMON26458. Will tie. The AfIII end of this ringer is the Nc of pMON32132. Ligation to the oI site, none of the restriction sites will be retained by the ligation. pM ON26458 and the BstXI site of pMON32132 are similarly linked. Would. Plasmid pMON28500 is the result of this cloning, PheGlyGlyAsnMetAla (SEQ ID NO: 223) linker (4L) Via amino acid 1-153c-mpl ligand (SEQ ID NO: 469) DNA sequence encoding amino acid 1-153c-mpl ligand (SEQ ID NO: 4) Contains columns.Example 6 Preparation of 5L PCR dimer template   The 3.7 kb BstXI / EcoRI fragment of pMON26458 was converted to pMO A 1 kilobase pair NcoI / BstXI fragment of N32132 was ligated with EcoRI / Af1 III 5L synthetic oligonucleotide linkers 5L-5 '(SEQ ID NO: 322) and 5L -3 '(SEQ ID NO: 323) to link a new type of c-mpl ligand Create a PCR template to create.   The EcoRI end of this linker is linked to the EcoRI end of pMON26458. Will tie. The Af1III end of this linker is the Nc of pMON32132 Ligation to the oI site, none of the restriction sites will be retained by the ligation. p MON26458 and the BstXI site of pMON32132 are similarly linked. There will be. Plasmid pMON28501 is the result of this cloning, via uPheGlyGlyAsnMet (SEQ ID NO: 783) linker (5L) Amino acid fused to amino acid 1-153c-mpl ligand (SEQ ID NO: 470) The DNA sequence of SEQ ID NO: 4, which encodes a noic acid 1-153c-mpl ligand, contains. Example 7Preparation of PCR dimer template 8L   The 3.7 kb BstXI / EcoRI fragment of pMON26458 was converted to pMO A 1 kilobase pair NcoI / BstXI fragment of N32134 was ligated with EcoRI / Af1. III 8L synthetic oligonucleotide linkers 8L-5 '(SEQ ID NO: 322) and 8L -3 '(SEQ ID NO: 323) to link a new type of c-mpl ligand Create a PCR template to create.   The EcoRI end of this linker is linked to the EcoRI end of pMON26458. Will tie. The AfIII end of this linker is the Nc of pMON32134. Ligation to the oI site, none of the restriction sites will be retained by the ligation. p MON26458 and the BstXI site of pMON32134 are similarly ligated. There will be. Plasmid pMON28502 is the result of this cloning, uPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetAla (SEQ ID NO: 224) ) Via a linker (8L), the amino acid 1-153c-mpl ligand (sequence No. 471) encoding the amino acid 1-153c-mpl ligand fused to It contains the DNA sequence of SEQ ID NO: 6).Examples 8 to 44 Construction of a novel c-mpl ligand gene having a new N-terminus and C-terminus A. PCR construction of a gene encoding a novel c-mpl ligand receptor agonist   Method III (Horrick et al., Prot. Eng. 5: 427). -433,1992) to create c-mpl ligand receptor agonists did. Dimer template, pMON28500, 28501, 28502 or 28 PCR was performed using 548 and one of the following synthetic primer sets: (The first number indicates the position of the first amino acid in the original sequence. For example, 31-5 'And 31-3' refer to the sequence beginning with the codon corresponding to residue 31 of the original sequence. Means 5 'and 3' primers, respectively. ).   31-5 '(SEQ ID NO: 326) and 31-3' (SEQ ID NO: 327), 35-5 ' (SEQ ID NO: 328), 35-3 '(SEQ ID NO: 329), 39-5' (SEQ ID NO: 3) 30) and 39-3 '(SEQ ID NO: 331), 43-5' (SEQ ID NO: 332) and 43 -3 '(SEQ ID NO: 333), 45-5' (SEQ ID NO: 334) and 45-3 '(SEQ ID NO: No. 335), 49-5 '(SEQ ID NO: 336) and 49-3' (SEQ ID NO: 337) , 82-5 '(SEQ ID NO: 338) and 82-3' (SEQ ID NO: 339), 109-5 '(SEQ ID NO: 340) and 109-3' (SEQ ID NO: 341), 115-5 '(sequence No. 342), 115-3 '(SEQ ID NO: 343), 120-5' (SEQ ID NO: 34) 4) and 120-3 '(SEQ ID NO: 345), 123-5' (SEQ ID NO: 346) and 1 23-3 '(SEQ ID NO: 347), 126-5' (SEQ ID NO: 348) and 126-3 '(SEQ ID NO: 349).   Table 4 shows templates and oligonucleotide sets used in the PCR reaction. Create The resulting product is approximately 480 base pairs and is a magic PCR cleanup kit (M magic PCR Clean up kit) (Promega) ). B. Novel c-mpl receptor jaw into mammalian expression vector for chimera construction Subcloning of Nist gene   c-mpl receptor agonist gene PCR product into mammalian expression vector For transfer, NcoI and HindIII or Af1III and HindIII restriction enzymes (About 470 base pairs). The expression vector pMON30304 was replaced with NcoI And HindIII (about 4200 base pairs), and the PCR product was digested with NcoI-Hin. Accepted as dIII or AflIII-HindIII fragment. PCR product limitations Table 4 shows the digests and the resulting plasmids. Example 45 Creation of pMON15960   G-CSF Ser with new N- and C-termini17DN that codes Intermediate plasmid pMON159 for making a plasmid containing the A sequence Create 60. Plasmid pACYC177 (ACW Chang (Cha ng, A .; C. Y. ) And S. N. Cohen (J. B acteriol. 134: 1141-1156, 1978). Digested with prime HindIII and BamHI to give 3092 base pairs HindIII, A BamHI fragment was obtained. Plasmid pMON13037 (WO95 / 21254) ) The DNA is digested with BglII and FspI and the 616 bp BglII, FspI A fragment was obtained. A second sample of plasmid pMON13037 DNA was prepared with NcoI and H Digestion with indIII yielded a 556 bp NcoI, HindIII fragment. Synthesis DNA oligonucleotides 1GGGSfor (SEQ ID NO: 380) and 1GGGSr ev (SEQ ID NO: 381) were annealed to each other and then with Af1III and FspI. Digestion yielded a 21 base pair Af1III, FspI fragment. Concatenate restriction fragments, The ligation mixture was used to form E. coli K-12 strain JM101. The quality has changed. Transformant bacteria are plated on ampicillin-containing plates Was selected. Isolate plasmid DNA and analyze by restriction analysis to determine correct insert It was confirmed.Example 46 Creation of pMON15981   Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Creation of pMON15981. Plasmid pMON15960 DNA was replaced with restriction enzyme S digested with mal and ligated with the synthetic DNA oligonucleotide 38 end point (SEQ ID NO: No. 369) and the 39 start point (SEQ ID NO: 368) as primers In the reaction, a 576 bp DNA fragment was amplified using it as a template. Increase The widened fragment was digested with the restriction enzymes HindIII and NcoI and 558 bp Hi ndIII and NcoI fragments were obtained. Plasmid pMON13181 DNA was converted to Hin After digestion with dIII and Af1III, a HindIII and Af1III fragment of 4068 base pairs was digested. Obtained. These restriction fragments were ligated and the ligation mixture was used to transform E. coli (E.c. oli) K-12 strain JM101 was transformed. Transformant bacteria are Selected on the plate containing Plasmid DNA was isolated and analyzed by restriction analysis. To confirm the correct insert. Plasmid pMON15981 contains the following amino acids: Contains the DNA sequence encoding the sequence (SEQ ID NO: 78): Example 47 Creation of pMON15982   Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Creation of pMON15982. Plasmid pMON15960 DNA was replaced with restriction enzyme S digested with mal and ligated with the synthetic DNA oligonucleotide 96 end point (SEQ ID NO: No. 371) and the 97 start point (SEQ ID NO: 370) as primers In the reaction, a 576 bp DNA fragment was amplified using it as a template. Increase The widened fragment was digested with the restriction enzymes HindIII and NcoI and 558 bp Hi ndIII and NcoI fragments were obtained. Plasmid pMON13181 DNA was converted to Hin After digestion with dIII and Af1III, a HindIII and Af1III fragment of 4068 base pairs was digested. Obtained. These restriction fragments were ligated and the ligation mixture was used to transform E. coli (E.c. oli) K-12 strain JM101 was transformed. Transformant bacteria are Selected on the plate containing Plasmid DNA was isolated and analyzed by restriction analysis. To confirm the correct insert. Plasmid pMON15982 contains the following amino acids: Contains the DNA sequence encoding the sequence (SEQ ID NO: 79): Example 48 Creation of pMON15965   Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Creation of pMON15965. Plasmid pMON1596O DNA was replaced with restriction enzyme S digested with maI and ligated with the synthetic DN 合成 oligonucleotide 142 end point (sequence No. 377) and the 141 starting point (SEQ ID NO: 376) as primers In the CR reaction, a 576 bp DNA fragment was amplified using -C as a template. . The amplified fragment was digested with the restriction enzymes HindIII and NcoI and digested with 558 bp. A Hindlll, NcoI fragment was obtained. Plasmid pMON13181 DNA was converted to H Digested with indIII and Af1III to cut 4068 base pairs of HindIII and Af1III I got a piece. These restriction fragments were ligated and the ligation mixture was used to transform E. coli (E. . E. coli) K-12 strain JM101 was transformed. Transformant bacteria Selected on sylin-containing plates. Isolate plasmid DNA and resolve by restriction analysis. Analysis confirmed the correct insert. Plasmid pMON15965 contains the following plasmids: It contains the DNA sequence encoding the acid sequence (SEQ ID NO: 80): Example 49 Creation of pMON15966   Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Creation of pMON15966. Plasmid pMON15960 DNA was replaced with restriction enzyme S digested with mal and ligated with the synthetic DNA oligonucleotide 126 end point (sequence No. 372) and the 125 starting point (SEQ ID NO: 373) as primers A 576 base pair DNA fragment was amplified as a template in a CR reaction. . The amplified fragment was digested with the restriction enzymes HindIII and NcoI and 558 bp H The indIII, NcoI fragment was obtained. Plasmid pMON13181 DNA was Hi digested with ndIII and Af1III to obtain a 4068 base pair HindIII and Af1III fragment I got These restriction fragments were ligated and the ligation mixture was used to transform E. coli (E. E. coli) K-12 strain JM101 was transformed. Transformant bacteria are Selected on phosphorus containing plates. Isolate plasmid DNA and analyze by restriction analysis To confirm the correct insert. Plasmid pMON15966 contains the following amino acids: Contains the DNA sequence encoding the acid sequence (SEQ ID NO: 81): Example 50 Creation of pMON15967   Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Creation of pMON15967. Plasmid pMON15960 DNA was replaced with restriction enzyme S digested with mal and ligated with the synthetic DNA oligonucleotide 132 end point (sequence No. 375) and 133 start point (SEQ ID NO: 374) as primers A 576 base pair DNA fragment was amplified as a template in a CR reaction. . The amplified fragment was digested with the restriction enzymes HindIII and NcoI and digested with 558 bp. HindIII and NcoI fragments were obtained. Plasmid pMON13181 DNA was converted to H i digested with ndIII and Af1III to obtain a 4068 base pair HindIII and Af1III fragment I got These restriction fragments were ligated and the ligation mixture was used to transform E. coli (E. E. coli) K-12 strain JM101 was transformed. Transformant bacteria are Selected on phosphorus containing plates. Isolate plasmid DNA and analyze by restriction analysis To confirm the correct insert. Plasmid pMON15967 contains the following amino acids: Contains the DNA sequence encoding the acid sequence (SEQ ID NO: 82): Example 51 Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Construction of pMON13180, an intermediate plasmid used for construction   Plasmid pMON13046 (WO95 / 21254) restriction endonuclease DNA Digested with nucleases XmaI and SnaBI to obtain a 4018 base pair vector fragment I got The 4018 base pair XmaI-SnaBI fragment was Up system kit (Magical DNA Clean-up System) m kit) (Promega, Madison, Wis.) (Where the 25 base pair Xmal-SnaBI insert fragment was retained). Not). To remove the sequence encoding the factor Xa cleavage site, a synthetic oligonucleotide was used. Nucleotide complementation pairs glyxa1 (SEQ ID NO: 378) and glyxa2 (SEQ ID NO: 379) was designed. These oligonucleotides are also correctly assembled. Upon completion, Xmal and SnaBI ends are provided. Primers glyxa1 and gl yxa2 was added to an annealing buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM gClTwo, 50 mM NaCl) at 70 ° C. for 10 minutes, cool gently, I let it ring. T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Boehrin) ger Mannheim), Indianapolis, Indiana) The 4018 base pair XmaI-SnaBI fragment from pMON13046 was Ligation was performed with the assembled oligonucleotide. Using some of the ligation reactants, E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Life Te) technologies, Gaithersburg, (Leanland). Transformant bacteria on plates containing ampicillin Selected. Isolate plasmid DNA from transformants and use PCR-based assays And analyzed. Sequencing plasmid DNA from selected transformants The correct insertion of the oligonucleotide was confirmed. The resulting plasmid is called pMON 13180 (SEQ ID NO: 88).Example 52 Plasmid containing a DNA sequence encoding a multifunctional hematopoietic receptor agonist Construction of pMON13181, an intermediate plasmid used for construction   Plasmid pMON13047 (WO95 / 21254) DNA restriction end A 4063 base pair vector fragment digested with nucleases XmaI and SnaBI I got The 4063 base pair XmaI-SnaBI fragment was System Up Kit (Magic DNA Clean-up System) m kit) (Promega, Madison, Wis.) (Where the 25 base pair Xmal-SnaBI insert fragment was retained). Not). To remove the sequence encoding the factor Xa cleavage site, a synthetic oligonucleotide was used. Glyxa1 (SEQ ID NO: 378) and glyxa2 (SEQ ID NO: 379). These oligonucleotides can also be assembled correctly Xmal and SnaBI ends are provided. Primers glyxa1 and glyxa2 Heat at 70 ° C. for 10 minutes in annealing buffer and gently cool. Kneeled. T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Boehr (Inner Mannheim), Indianapolis, Indiana) Using a 4063 base pair XmaI-SnaBI fragment from pMON13047 Was linked to the assembled oligonucleotide. Using some of the ligation reactants , E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Life) Technologies, Gaithersburg , Maryland). Transformants on plates containing ampicillin Bacteria were selected. Isolate plasmid DNA from transformants and perform PCR-based measurements Analyzed using the method. Sequence plasmid DNA from selected transformants The correct insertion of the oligonucleotide was confirmed. The resulting plasmid was pM ON13181 (SEQ ID NO: 87).Example 53 Creation of pMON13182   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [39 start point (SEQ ID NO: 36) 8) and the L-11 starting point (SEQ ID NO: 364)] in pMON13037 G-CSF Ser17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [38 end point (SEQ ID NO: 369) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] G-CSF Ser in plasmid pMON1303717Fragment from sequence An end point was created and amplified. Using primers [39 start and 38 end] From the annealed fragment start and end points, a new full-length N-terminus / C-terminus G-VSF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13180 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Nco I to obtain a vector fragment of 4023 base pairs, which was Lean-up system kit (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega, Madison, Wiscons) (Singh, China). The purified restriction fragments are combined together and T4 DNA ligated. -Se (Boehringer Mannheim), (Indianapolis, Indiana). One of the ligation reactants The E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) Life Technologies, Gaithersburg burg, Maryland). Shaped with ampicillin-containing plate Transformant bacteria were selected. Isolate and sequence plasmid DNA for correct insertion I checked my body. The resulting plasmid was named pMON13182.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13182.   Plasmid pMON13182 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 17) containing the DNA sequence: Example 54 Creation of pMON13183   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [39 start point (SEQ ID NO: 36) 8) and the L-11 starting point (SEQ ID NO: 364)] in pMON13037 G-CSF Ser17A "fragment start point" was created from the sequence and amplified. Primer Set [38 end point (SEQ ID NO: 369) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 39 start and 38 end points, New full-length N-terminal / C-terminal G-CSF from the fragment start and end points   Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13181 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af1I. Digestion with II yielded a vector fragment of 4068 base pairs, which was Lean-up system kit (Magic DNA Clean-up Sys) tem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) ). The purified restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase ( Boehringer Mannheim, India (Dianapolis, Indiana). Use part of the ligation reaction E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Lif e Technologies, Gaithersburg g), Maryland). Transform on plates containing ampicillin Somatic bacteria were selected. Isolate the plasmid DNA and sequence to confirm the correct insert. I accepted. The resulting plasmid was named pMON13183.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13183.   Plasmid pMON13183 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 18) contains the DNA sequence: Example 55 Creation of pMON13184   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [97 start point (SEQ ID NO: 37) 0) and the L-11 start point (SEQ ID NO: 364)] in pMON13037. G-CSF Ser17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [96 end point (SEQ ID NO: 371) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] G-CSF Ser in plasmid pMON1303717Fragment from sequence An end point was created and amplified. Anneal using 97 start and 96 end points. New N-terminal / C-terminal G-CSSFSe from the fragment start and end points r17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Middle The plasmid pMON13180 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af Digestion with 1III to give a vector fragment of 4023 base pairs, which was A Cleanup System Kit (Magic DNA Clean-up S ystem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) (Province). Combine the purified restriction fragments with T4 DNA ligator Ze (Boehringer Mannheim) (Indianapolis, Indiana). Part of the ligation reactant Using E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (L if Technologies, Gaithersburg rug), Maryland). Traits on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Plasmid DNA is isolated and sequenced for correct insert It was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13184.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13184.   Plasmid pMON13184 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 19) containing the DNA sequence: Example 56 Creation of pMON13185   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [97 start point (SEQ ID NO: 37) 0) and the L-11 start point (SEQ ID NO: 364)] in pMON13037. G-CSF Ser17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [96 end point (SEQ ID NO: 371) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] G-CSF Ser in plasmid pMON1303717Fragment from sequence An end point was created and amplified. Anneal using 97 start and 96 end points. New N-terminal / C-terminal G-CSSF S from the fragment start and end points er17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13181 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af 1III to obtain a 4068 base pair vector fragment, which was A Cleanup System Kit (Magic DNA Clean-up S ystem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) (Province). Combine the purified restriction fragments with T4 DNA ligator Ze (Boehringer Mannheim) (Indianapolis, Indiana). Part of the ligation reactant Using E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (L if Technologies, Gaithersburg rug), Maryland). Traits on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Plasmid DNA is isolated and sequenced for correct insert It was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13185.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13185.   Plasmid pMON13185 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 20) containing the DNA sequence: Example 57 Creation of pMON13186   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [126 starting point (SEQ ID NO: 3 72) and the L-11 start point (SEQ ID NO: 364)] using pMON13037 G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [125 end point (SEQ ID NO: 373) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 126 start and 125 end points, From the ring fragment start and end points, a new full-length N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13180 was replaced with the restriction endonucleases HindIII and Af1I. Digestion with II yielded a vector fragment of 4023 base pairs, which was Lean-up system kit (Magic DNA Clean-up Sys) tem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) ). The purified restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase ( Boehringer Mannheim, India (Dianapolis, Indiana). Use part of the ligation reaction E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Lif e Technologies, Gaithersburg g), Maryland). Transform on plates containing ampicillin Somatic bacteria were selected. Isolate the plasmid DNA and sequence to confirm the correct insert. I accepted. The resulting plasmid was named pMON13186.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. E. coli strain JM101 was transformed with pMON13186.   Plasmid pMON13186 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 21) containing the DNA sequence: Example 58 Creation of pMON13187   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [126 starting point (SEQ ID NO: 3 72) and the L-11 start point (SEQ ID NO: 364)] using pMON13037 G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [125 end point (SEQ ID NO: 373) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 126 start and 125 end points, From the ring fragment start and end points, a new full-length N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Magic DNA cleanup system kit digested with oI and HindIII (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega (Promega), Madison, Wisconsin). Middle The plasmid pMON13181 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af. 1III to obtain a 4068 base pair vector fragment, which was A Cleanup System Kit (Magic DNA Clean-up S ystem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) (Province). Combine the purified restriction fragments with T4 DNA ligator Ze (Boehringer Mannheim) (Indianapolis, Indiana). Part of the ligation reactant Using E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (L if Technologies, Gaithersburg urge), Maryland County. Traits on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Plasmid DNA is isolated and sequenced for correct insert It was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13187.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13187.   Plasmid pMON13187 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 22) containing the DNA sequence: Example 59 Creation of pMON13188   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [133 start point (SEQ ID NO: 3 74) and the L-11 starting point (SEQ ID NO: 364)] using pMON13037 G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [132 end point (SEQ ID NO: 375) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 133 start points and 132 end points, Annie From the ring fragment start and end points, a new full-length N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13180 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af Digestion with 1III to give a vector fragment of 4023 base pairs, which was A Cleanup System Kit (Magic DNA Clean-up S ystem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) (Province). Combine the purified restriction fragments with T4 DNA ligator Ze (Boehringer Mannheim) (Indianapolis, Indiana). Part of the ligation reactant Using E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (L if Technologies, Gaithersburg rug), Maryland). Traits on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Plasmid DNA is isolated and sequenced for correct insert It was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13188.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13188.   Plasmid pMON13188 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 23) containing the DNA sequence: Example 60 Creation of pMON13189   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [133 start point (SEQ ID NO: 3 74) and the L-11 starting point (SEQ ID NO: 364)] using pMON13037 G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [132 end point (SEQ ID NO: 375) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 133 start points and 132 end points, Annie From the ring fragment start and end points, a new full-length N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13181 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af1I. Digestion with II yielded a vector fragment of 4068 base pairs, which was Lean-up system kit (Magic DNA Clean-up Sys) tem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) ). The purified restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase ( Boehringer Mannheim, India (Dianapolis, Indiana). Use part of the ligation reaction E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Lif e Technologies, Gaithersburg g), Maryland). Transform on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Isolate the plasmid DNA and sequence to determine the correct insert confirmed. The resulting plasmid was named pMON13189.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. E. coli) strain JM101 was transformed with pMON13189.   Plasmid pMON13189 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 24) contains the DNΛ sequence: Example 61 Creation of pMON13190   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [142 starting point (SEQ ID NO: 3 76) and the L-11 starting point (SEQ ID NO: 364)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [141 end point (SEQ ID NO: 377) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 142 start and 141 end, Annie From the ring fragment start and end points, a new full-length N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Magic DNA cleanup system kit digested with oI and HindIII (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega (Promega), Madison, Wisconsin). Middle The plasmid pMON13180 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af Digestion with 1III to give a vector fragment of 4023 base pairs, which was A Cleanup System Kit (Magic DNA Clean-up S ystem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) (Province). Combine the purified restriction fragments with T4 DNA ligator Ze (Boehringer Mannheim) (Indianapolis, Indiana). Part of the ligation reactant Using E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (L if Technologies, Gaithersburg rug), Maryland). Traits on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Plasmid DNA is isolated and sequenced for correct insert It was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13190.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13190.   Plasmid pMON13190 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 25) containing the DNA sequence: Example 62 Creation of pMON13191   Using Method I described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [142 starting point (SEQ ID NO: 3 76) and the L-11 starting point (SEQ ID NO: 364)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [141 end point (SEQ ID NO: 377) and L-11 end point (SEQ ID NO: 365)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Using 142 start and 141 end, Annie From the ring fragment start and end points, a new full-length N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. Digest with oI and HindIII and use Magic DNA Cleanup System Kit ( Magic DNA Clean-up System kit) (Promega ( Promega), Madison, Wis.). Intermediate Plasmid pMON13181 was transformed with the restriction endonucleases HindIII and Af 1III to obtain a 4068 base pair vector fragment, which was A Cleanup System Kit (Magic DNA Clean-up S ystem kit) (Promega, Madison, Wisconsin) (Province). Combine the purified restriction fragments with T4 DNA ligator Ze (Boehringer Mannheim) (Indianapolis, Indiana). Part of the ligation reactant Using E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (L if Technologies, Gaithersburg rug), Maryland). Traits on plates containing ampicillin Transformed bacteria were selected. Plasmid DNA is isolated and sequenced for correct insert It was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13191.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13191.   Plasmid pMON13191 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 26) containing the DNA sequence: Example 63 Creation of pMON13192   Using Method II described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [39 start point (SEQ ID NO: 36) 8) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)] in pMON13037 A fragment starting point was prepared from the G-CSF sequence and amplified. Primer set [38 end Stop point (SEQ ID NO: 369) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] G-CSF Ser in Rasmid pMON1303717Create fragment end point from sequence And amplified. The start of the fragment was digested with the restriction endonuclease NcoI, The breakpoint was digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification, With the end points together, the approximately 3800 base pair NcoI-Hin of pMON3934 It was ligated to the dIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) ), CA) using a full-length new N-terminal / C-terminal G-CS The F Ser17 gene was isolated. Restrict intermediate plasmid pMON13180 Digested with the endonucleases HindIII and AfIII to obtain a 4023 base pair vector -Fragment was obtained, and this was used as a magic DNA cleanup system kit (Magi). cDNA Clean-up System kit) (Promega ega), Madison, Wis.). Refined restriction The pieces are combined and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Boehri) nger Mannheim), Indianapolis, Indiana) And connected. Using a portion of the ligation reaction, E. coli strain DH5 α cells (Life Technologies, Game (Gaithersburg, Md.) . Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmid DNA Isolate and sequence for correct insertion of new genes Was confirmed. The resulting plasmid was named pMON13192.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13192.   Plasmid pMON13192 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 27) containing the DNA sequence: Example 64 Creation of pMON13193   Using Method II described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [39 start point (SEQ ID NO: 36) 8) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)] in pMON13037 G-CSF Ser17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [38 end point (SEQ ID NO: 369) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)]. G-CSF Ser in plasmid pMON1303717Fragment from sequence An end point was created and amplified. Digest the fragment start with the restriction endonuclease NcoI The fragment end was digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification, Combining the one start and end points together, the Nc of about 3800 base pairs of pMON3934 It was ligated to the oI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) ), CA) using a full-length new N-terminal / C-terminal G-CS F Ser17The gene was isolated. Restriction plasmid pMON13181 Digested with nucleases HindIII and Af1III to give a 4068 bp vector -Fragment was obtained, and this was used as a magic DNA cleanup system kit (Magi). cDNA Clean-up System kit) (Promega ega), Madison, Wis.). Refined restriction The pieces are combined and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Boehri) nger Mannheim), Indianapolis, Indiana) And connected. Using a portion of the ligation reaction, E. coli strain DH5 α cells (Life Technologies, Game (Galthersburg, MD) was transformed. . Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmid DNA Isolation and sequencing confirmed the correct insertion of the new gene. Obtained plasm This was named pMON13193.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13193.   Plasmid pMON13193 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 28) containing the DNA sequence: Example 65 Creation of pMON25190   Using method 11 described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [97 start point (SEQ ID NO: 37) 0) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)] in pMON13037. A fragment starting point was prepared from the G-CSF sequence and amplified. Primer set [96 end Stop point (SEQ ID NO: 371) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] G-CSF Ser in Rasmid pMON1303717Create fragment end point from sequence And amplified. The start of the fragment was digested with the restriction endonuclease NcoI, The breakpoint was digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification, With the end points together, the approximately 3800 base pair NcoI-Hin of pMON3934 It was ligated to the dIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) (Vista), Calif.) Using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 80 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII, resulting in 4023 salts A base pair vector fragment was obtained, and this was used as a magic DNA cleanup system kit. (Magic DNA Clean-up System kit) (Prome (Promega, Madison, Wis.). Spirit The restriction fragments thus prepared are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim ( Boehringer Mannheim), Indianapolis, India Na State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli (E. i) strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technology) es), Gaithersburg, MD Transformation. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. plus Mid DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Get The resulting plasmid was named pMON25190.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON25190.   Plasmid pMON25190 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 29) containing the DNA sequence: Example 66 Creation of pMON25191   Using Method II described in Materials and Methods, a new N- powder was added to pMON25191. End / C-terminal genes were created. Primer set [97 start point (SEQ ID NO: 37) 0) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)] in pMON13037. G-CSF Ser17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [96 end point (SEQ ID NO: 371) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)]. G-CSF Ser in plasmid pMON1303717Fragment from sequence An end point was created and amplified. Digest the fragment start with the restriction endonuclease NcoI The fragment end was digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification, Combining the one start and end points together, the Nco of about 3800 base pairs of pMON3934 It was ligated to the I-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) (Vista), Calif.) Using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 81 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII, resulting in 4068 salts A base pair vector fragment was obtained, and this was used as a magic DNA cleanup system kit. (Magic DNA Clean-up System kit) (Prome (Promega, Madison, Wis.). Spirit The restriction fragments thus prepared are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim ( Boehringer Mannheim), Indianapolis, India Na State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli (E. i) strain DH5α cells C Life Technologies (Life Technology) es), Gaithersburg, MD Transformation. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. plus Mid DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Get The resulting plasmid was named pMON25191.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON25191.   Plasmid pMON25191 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 30) containing the DNA sequence: Example 67 Creation of pMON13194   Using method 11 described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [126 starting point (SEQ ID NO: 3 72) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [125 end point (SEQ ID NO: 371) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Fragment start with restriction endonuclease NcoI Digestion and the fragment end point were digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification , With the fragment start and end points together, the approximately 3800 base pair N of pMON3934. It was ligated to the coI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) (Vista), Calif.) Using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 80 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII, resulting in 4023 salts A base pair vector fragment was obtained, and this was used as a magic DNA cleanup system kit. (Magic DNA Clean-up System kit) (Prome (Promega, Madison, Wis.). Spirit The restriction fragments thus prepared are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim ( Boehringer Mannheim), Indianapolis, India Na State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli (E. l) strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technology) es), Minister of Gaithersburg, Maryland Was transformed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plastic Smid DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Profit The resulting plasmid was named pMON13194.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. l) Strain JM101 was transformed with pMON13194.   Plasmid pMON13194 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 31) containing the DNA sequence: Example 68 Creation of pMON13195   Using Method II described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [126 starting point (SEQ ID NO: 3 72) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [125 end point (SEQ ID NO: 373) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Fragment start with restriction endonuclease NcoI Digestion and the fragment end point were digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification , With the fragment start and end points together, the approximately 3800 base pair N of pMON3934. It was ligated to the coI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) ), California) using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 81 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII to obtain 4068 bases. Obtain a pair of vector fragments and use this as a magic DNA cleanup system kit (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega (Promega), Madison, Wisconsin). Purification The obtained restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (B) oehringer Mannheim), Indianapolis, Indiana State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. ) Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) s), Gaithersburg, MD The quality has changed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmi DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Obtained The resulting plasmid was named pMON13195.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13195.   Plasmid pMON13195 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 32) containing the DNA sequence: Example 69 Creation of pMON13196   Using Method II described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [133 start point (SEQ ID NO: 3 74) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [132 end point (SEQ ID NO: 375) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Fragment start with restriction endonuclease NcoI Digestion and the fragment end point were digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification , With the fragment start and end points together, the approximately 3800 base pair N of pMON3934. It was ligated to the coI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. Separate digested DNA on 1% TAE gel and stain with ethidium bromide And Geneclean (Bio101, Vista) a), California) using the full-length new N-terminal / C-terminal GC SF Ser17The gene was isolated. Restrict intermediate plasmid pMON13180 After digestion with the endonucleases HindIII and AfIII, a 4023 base pair vector was digested. And obtains a magic fragment, which is used as a magic DNＤ cleanup system kit (Mag). ic DNA Clean-up System kit) (Promega (Madison, Madison, Wis.). Refined restrictions The fragments are combined and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Boehr (Inner Mannheim), Indianapolis, Indiana) And connected. Using a portion of the ligation reaction, the E. coli strain DH 5α cells (Life Technologies, (Gaithersburg, Md.) Was. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmid DNA Was isolated and sequenced to confirm the correct insertion of the new gene. Got plus The mid was named pMON13196.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13196.   Plasmid pMON13196 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 33) containing the DNA sequence: Example 70 Creation of pMON13197   Using Method II described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [133 start point (SEQ ID NO: 3 74) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [132 end point (SEQ ID NO: 375) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array The end point of the fragment was created and the width was miso. Fragment start with restriction endonuclease NcoI Digestion and the fragment end point were digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification , With the fragment start and end points together, the approximately 3800 base pair N of pMON3934. It was ligated to the coI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) (Vista), Calif.) Using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 81 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII to obtain 4068 bases. Obtain a pair of vector fragments and use this as a magic DNA cleanup system kit (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega (Promega), Madison, Wisconsin). Purification The obtained restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (B) oehringer Mannheim), Indianapolis, Indiana State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. ) Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) s), Gaithersburg, MD The quality has changed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmi DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Obtained The resulting plasmid was named pMON13197.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13197.   Plasmid pMON13197 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 34) containing the DNA sequence: Example 71 Creation of pMON13198   Using method 11 described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [142 starting point (SEQ ID NO: 3 76) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [141 end point (SEQ ID NO: 377) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Fragment start with restriction endonuclease NcoI Digestion and the fragment end point were digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification , With the fragment start and end points together, the approximately 3800 base pair N of pMON3934. It was ligated to the coI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) (Vista), Calif.) Using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 80 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII to obtain 4023 bases. Obtain a pair of vector fragments and use this as a magic DNA cleanup system kit (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega (Promega), Madison, Wisconsin). Purification The obtained restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (B) oehringer Mannheim), Indianapolis, Indiana State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. ) Strain DH5α cells C Life Technologies (Life Technology) s), Gaithersburg, MD The quality has changed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmi DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Obtained The resulting plasmid was named pMON13198.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13198.   Plasmid pMON13198 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 35) containing the DNA sequence: Example 72 Creation of pMON13199   Using method 11 described in Materials and Methods, a new N- End / C-terminal genes were created. Primer set [142 starting point (SEQ ID NO: 3 76) and the P-bl start point (SEQ ID NO: 366)]. G-CSF Ser within17A fragment starting point was created from the sequence and amplified. Primer set [141 end point (SEQ ID NO: 377) and P-bl end point (SEQ ID NO: 367)] Using the G-CSF Ser in plasmid pMON13037.17From an array A fragment end point was created and amplified. Fragment start with restriction endonuclease NcoI Digestion and the fragment end point were digested with the restriction endonuclease HindIII. After purification , With the fragment start and end points together, the approximately 3800 base pair N of pMON3934. It was ligated to the coI-HindIII vector fragment.   The above intermediate plasmid is a new full-length N-terminal / C-terminal G-CSF Ser17Containing the gene and quenched by the restriction endonucleases NcoI and HindIII. It has become. The digested DNA was separated on a 1% TAE gel and stained with ethidium bromide. , Geneclean (Bio101, Vista) (Vista), Calif.) Using the full-length new N-terminus / C- Terminal G-CSF Ser17The gene was isolated. Intermediate plasmid pMON131 81 was digested with the restriction endonucleases HindIII and AfIII to obtain 4068 bases. Obtain a pair of vector fragments and use this as a magic DNA cleanup system kit (Magic DNA Clean-up System kit) (Promega (Promega), Madison, Wisconsin). Purification The obtained restriction fragments are combined, and T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (B) oehringer Mannheim), Indianapolis, Indiana State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. ) Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) s), Gaithersburg, MD The quality has changed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmi DNA was isolated and sequenced to confirm correct insertion of the new gene. Obtained The resulting plasmid was named pMON13199.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON13199.   Plasmid pMON13199 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 36) contains the DNA sequence: Example 73 Preparation of plasmid template Syntan1 replicated in tandem   Tandemly replicated hIL-3 receptor agonist pMON13416 template Synt To make an1, T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Bo) By ligation using an Ehringer Mannheim), the three DNAs Combined. The three DNAs were: 1) hIL digested with BstEII and SnaBI PMON13046 containing the -3 receptor agonist pMON13416; 2) L1syn., An annealed complementary pair of synthetic oligonucleotides. for (SEQ ID NO: 352) and L1syn. rev (SEQ ID NO: 353) (this is the original A sequence encoding a linker connecting the C-terminus and the N-terminus of the protein; Contains the pMON13416 sequence around BstEII and C and 3) ClaI (DNA is from dam-cell DM1 (giving the laI end) Proliferated in Life Technologies (Life Technologies) HIL-3 receptor digested from pMON13046 by SnaBI Part of the body agonist pMON13416. 0.9 digested DNA % TAE gel, stained with ethidium bromide and Geneclean (Genec). lean) (Bio101).   Using a part of the ligation reaction, E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies), Gaithersburg ( Gaithersburg, MD). Mini prep (Miniprep) DNA was isolated from transformants and PCR-based assays were performed. Transformants were used to screen. Plasmid from selected transformants The DNA was sequenced to obtain the correct template. The obtained plasmid is Named n1 and contains the DNA sequence of (SEQ ID NO: 7).Example 74 Construction of tandemly replicated plasmid template syntan3   Tandemly replicated hIL-3 receptor agonist pMON13416 template synt To create an3, a T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim (Bo) By ligation using an Ehringer Mannheim), the three DNAs Combined. The three DNAs were: 1) hIL digested with BstEII and SnaBI PMON13046 containing the -3 receptor agonist pMON13416; 2) L3syn., An annealed complementary pair of synthetic oligonucleotides. for (SEQ ID NO: 354) and L3syn. rev (SEQ ID NO: 355) (this is the original A sequence encoding a linker connecting the C-terminus and the N-terminus of the protein; Contains the pMON13416 sequence around BstEII and S and 3) ClaI (DNA is in dam-cell DM1). (Life Technologies) HIL-3 receptor digested from pMON13046 by SnaBI. A part of the receptor agonist pMON13416. 0.9% digested DNA Separated on a TAE gel, stained with ethidium bromide, GeneClean ean) (Bio101).   Using a part of the ligation reaction, E. coli strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies), Gaithersburg ( Gaithersburg, MD). Mini press Miniprep DNA is isolated from transformants and PCR-based assays Was used to screen for transformants. Plus from selected transformants The mid DNA was sequenced to obtain the correct template. The resulting plasmid is named an3, which contains the DNA sequence of (SEQ ID NO: 8).Example 75 Creation of pMON31104   Using method III described in Materials and Methods, a new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [35 start point (SEQ ID NO: 3 56) and 34rev (SEQ ID NO: 357)] using the intermediate plasmid Syn. new full-length hIL-3 receptor agonist pMON13416 from tan1 N-terminal / C-terminal genes were created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A ligase (Boehringer Mannhei m), Indianapolis, Indiana) The fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189DN A is previously digested with Ncol and SnaBI to give the hIL3 receptor agonist p The MON13416 coding sequence has been removed and the 4254 base pair vector fragment , Separated by 0.8% TAE gel, stained with ethidium bromide, and (Geneclean) (Bio101, Vista, California) State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) ), Gaithersburg, MD Converted. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmid DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. The resulting plasmid It was named pMON31104.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. E. coli strain JM101 was transformed with pMON31104.   Plasmid pMON31104 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 9) contains the DNA sequence: Example 76 Creation of pMON31105   Using Method III described in Materials and Methods, a new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [70 starting point (SEQ ID NO: 3 58) and 69rev (SEQ ID NO: 359)] using the intermediate plasmid Syn. new full-length hIL-3 receptor agonist pMON13416 from tan1 N-terminal / C-terminal genes were created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A Ligase (Boehringer Mannheim (Boehringer) Mannheim), Indianapolis, Indiana) The digested DNA fragment was ligated to the expression vector pMON13189. pMON 13189 DNA was digested with NcoI and SnaBI in advance, and The body agonist pMON13416 coding sequence has been removed and a 4254 base pair Vector fragments were separated on a 0.8% TAE gel and stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio101, Vista) , Calif.). Using a portion of the ligation reaction, E. coli ( E. FIG. E. coli strain DH5α cells (Life Technologies strategies, Gaithersburg, Melilla Was transformed. Select transformant bacteria on plates containing ampicillin Was. Plasmid DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. Obtained The resulting plasmid was named pMON31105.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pM0N31105.   Plasmid pMON31105 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 10) containing the DNA sequence: Example 77 Creation of pMON31106   Using method III described in Materials and Methods, new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [91 starting point (SEQ ID NO: 3 60) and 90 rev (SEQ ID NO: 361)] using the intermediate plasmid Syn. new full-length hIL-3 receptor agonist pMON13416 from tan1 N-terminal / C-terminal genes were created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A ligase (Boehringer Mannhei m), Indianapolis, Indiana) The fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189DN A is digested with NcoI and SnaBI in advance, and The body agonist pMON13416 coding sequence has been removed and a 4254 base pair Vector fragments were separated on a 0.8% TAE gel and stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio101, Vista) , Calif.). Using a portion of the ligation reaction, E. coli ( E. FIG. E. coli strain DH5α cells (Life Technologies strategies, Gaithersburg, Melilla Was transformed. Select transformant bacteria on plates containing ampicillin Was. Plasmid DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. Obtained The resulting plasmid was named pMON31106.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON31106.   Plasmid pMON31106 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 11) containing the DNA sequence: Example 78 Creation of pMON31107   Using the method III described in Materials and Methods, the new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [101 starting point (SEQ ID NO: 362) and 100 rev (SEQ ID NO: 363)] using the intermediate plasmid S New full-length hIL-3 receptor agonist pMON13416 from yntan1 A new N-terminal / C-terminal gene was created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A ligase (Boehringer Mannhei m), Indianapolis, Indiana) The fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189DN A was previously digested with NcoI and SnaBI to give the hIL3 receptor agonist p The MON13416 coding sequence has been removed and the 4254 base pair vector fragment , Separated by 0.8% TAE gel, stained with ethidium bromide, and (Geneclean) (Bio101, Vista, California) State). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) ), Gaithersburg, MD Converted. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmid DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. The resulting plasmid It was named pMON31107.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON31107.   Plasmid pMON31107 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 12) contains the DNA sequence: Example 79 Creation of pMON31108   Using the method III described in Materials and Methods, a new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [35 start point (SEQ ID NO: 3 56) and 34rev (SEQ ID NO: 357)] using the intermediate plasmid Syn. tan3 to hIL-3 receptor agonist pMON13416 full-length new N-terminal / C-terminal genes were created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. . Separate digested DNA fragments on 1% TAE gel And stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio 101, Vista, Calif.). T4D NA Ligase (Boehringer Mannhe im), Indianapolis, Ind.) Λ The fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189D NA is digested with NcoI and SnaBI in advance, and the hIL3 receptor agonist The pMON13416 coding sequence has been removed and the 4254 base pair Vector fragments were separated on a 0.8% TAE gel and stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio101, Vista) , Calif.). Using a portion of the ligation reaction, E. coli ( E. FIG. E. coli strain DH5α cells (Life Technologies strategies, Gaithersburg, Melilla Transformation). Was. Select transformant bacteria on plates containing ampicillin did. Plasmid DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. Get The resulting plasmid was named pMON31108.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101- was transformed with pMON31108.   Plasmid pMON31108 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 13) containing the DNA sequence: Example 80 Creation of pMON31109   Using the method III described in Materials and Methods, new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [70 starting point (SEQ ID NO: 3 58) and 69rev (SEQ ID NO: 359)] using the intermediate plasmid Syn. tan3 to hIL-3 receptor agonist pMON13416 full-length new N-terminal / C-terminal genes were created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A ligase (Boehringer Mannhei m), Inde. Purified Digested DN Using Indianapolis, IN The A fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189D NA is digested with NcoI and SnaBI in advance, and the hIL3 receptor agonist A 4254 base pair vector fragment from which the pMON13416 coding sequence has been removed. Was separated on a 0.8% TAE gel, stained with ethidium bromide, and then Geneclean (Bio101, Vista, California) A.). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. ) Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) s), Gaithersburg, MD The quality has changed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmi DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. Obtained plasmid Was named pMON31109.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON31109.   Plasmid pMON31109 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 14) containing the DNA sequence: Example 81 Creation of pMON31110   Using method III described in Materials and Methods, a new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [91 starting point (SEQ ID NO: 3 60) and 90 rev (SEQ ID NO: 361)] using the intermediate plasmid Syn. tan3 to hIL-3 receptor agonist pMON13416 full-length new N-terminal / C-terminal genes were created and amplified.   The resulting DNA fragment containing the new gene was digested with the restriction endonuclease Nc. It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A ligase (Boehringer Mannhei m), Indianapolis, Indiana) The fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189DN A is digested with NcoI and SnaBI in advance, and The body agonist pMON13416 coding sequence has been removed and a 4254 base pair Vector fragments were separated on a 0.8% TAE gel and stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio101, Vista) , Calif.). Using a portion of the ligation reaction, E. coli ( E. FIG. E. coli strain DH5α cells (Life Technologies strategies, Gaithersburg, Melilla Was transformed. Select transformant bacteria on plates containing ampicillin Was. Plasmid DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. Obtained The resulting plasmid was named pMON31110.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON31110.   Plasmid pMON31110 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 15) containing the DNA sequence: Example 82 Creation of pMON31111   Using Method III described in Materials and Methods, new N- A terminal / C-terminal gene was created. Primer set [101 starting point (SEQ ID NO: 362) and 100 rev (SEQ ID NO: 363)] using the intermediate plasmid S New full-length hIL-3 receptor agonist pMON13416 from yntan3 A new N-terminal / C-terminal gene was created and amplified.   The resulting DNΛ fragment containing the new gene was cloned into the restriction endonuclease Nc It was digested with oI and SnaBI. The digested DNA fragments were separated on a 1% TAE gel. , Stained with ethidium bromide, Geneclean (Bio1) 01, Vista, Calif.). T4DN A ligase (Boehringer Mannhei m), Inde. Purified Digested DN Using Indianapolis, IN The A fragment was ligated into the expression vector pMON13189. pMON13189D NA is digested with NcoI and SnaBI in advance, and the hIL3 receptor agonist A 4254 base pair vector fragment from which the pMON13416 coding sequence has been removed. Was separated on a 0.8% TAE gel, stained with ethidium bromide, and then Geneclean (Bio101, Vista, California) A.). Using a portion of the ligation reaction, E. coli was used. ) Strain DH5α cells (Life Technologies (Life Technologies) s), Gaithersburg, MD The quality has changed. Transformant bacteria were selected on ampicillin-containing plates. Plasmi DNA was isolated and sequenced to confirm the correct insert. Obtained plasmid Was named pMON31111.   For protein expression and protein isolation from inclusion bodies, E. coli (E. col. i) Strain JM101 was transformed with pMON31111.   Plasmid pMON31111 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 16) containing the DNA sequence: Example 83 Creation of pMON31112   Multifunctional hematopoietic receptor agoni that activates hIL-3 receptor and G-CSF receptor Construction of plasmid pMON31112 containing a DNA sequence encoding the target. Plasmid pMON13189 DNA was digested with restriction enzymes NcoI and XmaI , NcoI, XmaI vector fragments were obtained, which were run on a 0.8% agarose gel. Isolated and purified. The second plasmid, pMON13222 (WO94 / 12639) US application Ser. No. 08 / 411,796), digested with NcoI and EcoRI, An NcoI and EcoRI fragment of 81 base pairs was obtained. This fragment was agarose 1.0% Isolated and purified on sgel. Two oligonucleotides SYNNOXA1. REQ (SEQ ID NO: 350) and SYNNOXA2. REQ (SEQ ID NO: 351) Using a 281 base pair DNA fragment from pMON13222. It was ligated to the DNA vector fragment from N13189. Then a portion of the concatenated mixture Was transformed into E. coli K-12 strain JM101. Transformants Bacteria were selected on plates containing ampicillin. Isolate plasmid DNA and restrict Solution Analysis to verify the presence of the EcoRV fragment, sequenced and correct insert It was confirmed.   Plasmid pMON31112 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 37) containing the DNA sequence: Creation of pMON31113   Multifunctional hematopoietic receptor agoni that activates hIL-3 receptor and G-CSF receptor Construction of plasmid pMON31113 containing a DNA sequence encoding the target. Plasmid pMON13197 DNA was digested with restriction enzymes NcoI and XmaI , NcoI, XmaI vector fragments were obtained, which were run on a 0.8% agarose gel. Isolated and purified. The second plasmid, pMON13239 (WO94 / 12639) US application Ser. No. 08 / 411,796), digested with NcoI and EcoRI, An NcoI and EcoRI fragment of 81 base pairs was obtained. This fragment was agarose 1.0% Isolated and purified on sgel. Two oligonucleotides SYNNOXA1. REQ (SEQ ID NO: 350) and SYNNOXA2. REQ (SEQ ID NO: 351) Using a 281 base pair DNA fragment from pMON13239. It was ligated to the DNA vector fragment from N13197. Then a portion of the concatenated mixture Was transformed into E. coli K-12 strain JM101. Transformants Bacteria were selected on plates containing ampicillin. Isolate plasmid DNA and restrict Analyze by analysis to prove the presence of the EcoRV fragment, sequence and correct insertion I checked my body.   Plasmid pMON31113 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 38) containing the DNA sequence: Example 85 Creation of pMON31114   Multifunctional hematopoietic receptor agoni that activates hIL-3 receptor and G-CSF receptor Construction of plasmid pMON31114 containing a DNA sequence encoding the target. Plasmid pMON13189 DNA was digested with restriction enzymes NcoI and XmaI , NcoI, XmaI vector fragments were obtained, which were run on a 0.8% agarose gel. Isolated and purified. The second plasmid pMON13239 (W094 / 12639) US application Ser. No. 08 / 411,796), digested with NcoI and EcoRI, An NcoI and EcoRI fragment of 81 base pairs was obtained. This fragment was agarose 1.0% Isolated and purified on sgel. Two oligonucleotides SYNNOXA1. REQ (SEQ ID NO: 350) and SYNNOXA2. REQ (SEQ ID NO: 351) Using a 281 base pair DNA fragment from pMON13239. It was ligated to the DNA vector fragment from N13189. Then a portion of the concatenated mixture Was transformed into E. coli K-12 strain JM101. Transformants Bacteria were selected on plates containing ampicillin. Isolate plasmid DNA and restrict Analyze by analysis to prove the presence of the EcoRV fragment, sequence and correct insertion I checked my body.   Plasmid pMON31114 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 39) contains the DNA sequence: Example 86 Creation of pMON31115   Multifunctional hematopoietic receptor agoni that activates hIL-3 receptor and G-CSF receptor Construction of plasmid pMON31115 containing a DNA sequence encoding the strike. Plasmid pMON13197 DNA was digested with restriction enzymes NcoI and XmaI , NcoI, XmaI vector fragments were obtained, which were run on a 0.8% agarose gel. Isolated and purified. The second plasmid, pMON13222, was replaced with NcoI and EcoRI. To obtain a 281 base pair NcoI and EcoRI fragment. This fragment is . It was isolated and purified on a 0% agarose gel. Two oligonucleotides SYNNO XA1. REQ (SEQ ID NO: 350) and SYNNOXA2. REQ (SEQ ID NO: 35) 1) and the 281 base pair DNA fragment from pMON13222 was Used to ligate to the DNA vector fragment from pMON13197. Then connect A portion of the mixture was transformed into E. coli K-12 strain JM101. . Transformant bacteria were selected on plates containing ampicillin. Plasmid DNA Was isolated and analyzed by restriction analysis to prove the presence of the EcoRV fragment and to sequence To confirm the correct insert.   Plasmid pMON31115 encodes the following amino acid sequence (SEQ ID NO: No. 40) containing the DNA sequence: Example 87 Measurement of in vitro activity of multifunctional hematopoietic receptor agonist proteins   The protein concentration of the multifunctional hematopoietic receptor agonist protein depends on the affinity Measured using a purified polyclonal antibody-based sandwich ELISA Can be Alternatively, protein concentration is measured by amino acid composition analysis be able to. The biological activity of multifunctional hematopoietic receptor agonists is It can be measured by a measuring method. For example, for hIL-3 receptor and G-CSF receptor The binding multifunctional hematopoietic receptor agonist is hIL-3 and / or G-CS Can be measured by a cell proliferation assay using a cell line expressing the F receptor. You. One such assay is the AML-193 cell proliferation assay. AML -193 cells respond to IL-3 and G-CSF, and IL-3 / G-CSF multifunction It allows the determination of the combined biological activity of a sex hematopoietic receptor agonist. Another measurement of this kind A common method is the TF1 cell proliferation assay.   Furthermore, a mouse IL-3-dependent cell line, M-NFS-60 (ATCC.C Other factor-dependent cell lines such as RL1838) or 32D may be used. The activity of IL-3 is species-specific, whereas G-CSF is not, and therefore IL- 3 / The biological activity of the G-CSF component of the G-CSF multifunctional hematopoietic receptor agonist is It can be measured upright. Cell lines that do not express receptors for certain ligands ( For example, BHK or mouse Baf / 3) are genetically encoding the desired receptor. Can be transfected with a plasmid containing the offspring. like that An example of a cell line is BaF3 transfected with the hG-CSF receptor (BaF3 / hG-CSF). The multifunctional hematopoietic receptor agonis in these cell lines Can be compared with hIL-3 or G-CSF alone or together. it can. Measured with BaF3 / hG-CSF cell proliferation assay and TF1 cell proliferation assay Table 5 and Table 6 show the biological activities of examples of the multifunctional hematopoietic receptor agonists of the present invention. Show. The biological activity of multifunctional hematopoietic receptor agonists is IL-3 and G-CSF Standard protein pMON13056 having receptor binding activity (WO95 / 212) 54) and expressed as relative activity compared to 54). BaF3 / c-mpl cell proliferation assay Of the multifunctional hematopoietic receptor agonist of the present invention measured by the TF1 cell proliferation assay The biological activities of the examples are shown in Tables 7 and 8.nd = not measured* The biological activity of the multifunctional hematopoietic receptor agonist is based on the standard protein pMON130 Expressed as relative activity compared to 56. n = 3 or more.nd = not measured+ The biological activity of a multifunctional hematopoietic receptor agonist (n = 1 or 2) Expressed as relative activity compared to cytoplasmic pMON13056. "+" Indicates that the molecule is comparable to pMON13056. *Trans c-mpl receptor for c-mpl ligand (1-153)   Activity measured in transfected Baf3 cell line.   +Activity measured against pMON13056.   Similarly, to determine the biological activity of a desired multifunctional hematopoietic receptor agonist, Other factor-dependent cell lines known to those of skill in the art can be used. Methyl cellulose Hematopoietic progenitor cell expansion and different types of hematopoietic cells in vitro using the assay Measuring the effects of multifunctional hematopoietic receptor agonists on knee patterns it can. Methylcellulose assay is based on 100,000 primitive cells per input cell. To measure the frequency of the cells, an estimate of the precursor frequency is provided. Long-term interstitial culture Nutrition has been used to distinguish primitive hematopoietic progenitor cells, especially stem cells. this Assays indicate that the multifunctional hematopoietic receptor agonist is a very primitive progenitor cell and / or Alternatively, it can be used to determine whether to stimulate stem cell expansion. Furthermore, the frequency of primitive progenitor cells stimulated by multifunctional hematopoietic receptor agonists And limiting dilution culture can be carried out. Example 88   PCR mutagenesis as described in WO 94/12639 and WO 94/12638 Generating G-CSF variants with single or multiple amino acid substitutions using the strategy Done. These and other variants (ie, amino acid substitutions, insertions, or deletions) , And N-terminal or C-terminal extensions) by those skilled in the art Or site-directed mutagenesis (Taylor et al., Nucl. Ac ids Res. , 13: 7864-8785 [1985]; Kunkel. kel) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488- 492 [1985]; Sambrook et al., Molecular Clos. Cleaning, Laboratory Manual (Molecular Cloning: A La (boratory Press), Cold Spring Harbor Laboratory Lee Press (Cold Spring Harbor Laboratory)   Press), Cold Spring Harbor (Cold Spring Harbor) Harbor), New York [1989], WO 94/12639 and W. O94 / 12638). Will be able to. These substitutions can be made one at a time, or other amino acid substitutions, and Making in combination with / or deletion and / or insertion and / or extension Can be. After demonstrating sequence changes, plasmid DNA for production is Infect mammalian cells, insect cells or bacterial strains (eg, E. coli). Can be transfected. A known variant of active G-CSF 1st position (from Thr to Ser, Arg or Gly), 2nd position (from Pro to Le u), position 3 (Leu to Arg or Ser), and position 17 (Cys to Se) r) and deletion of amino acids 1-11 (Kuga et al., Bioch). emicla and Biophysical Research Comm . 159: 103-111 (1989)). These amino acid substitution variants G-CSF receptor agonis where new N-terminus and new C-terminus are created Can be used as a template for making G-CSF amino acid substitution Examples of variants are shown in Table 9.Example 89 Measurement of biological activity of G-CSF amino acid substitution variant   G-CSF amino acid substitution variants are transfected at the human G-CSF receptor. Baf / 3 cell lines can be used to measure cell proliferation activity. You. The biological activity of an example of a G-CSF amino acid substitution variant is changed to native human G-CSF Table 9 shows a comparison. “+” Indicates activity comparable to the native, “−” indicates activity , Indicating that there is significantly reduced or no measurable activity. *Activity against native hG-CSF   nd = not measuredExample 90 Isolation of cDNA encoding flt3 ligand   Uses NCOFLT, HIND160, and HID165 PCR primers From human bone marrow poly A + RNA (Clontech) Amplify the three flt3 ligand clones (according to the manufacturer's recommendations). Was. These amplified PCR products were gel-purified and the BHK expression vector pMON572 3 and cloned into pMON30237 (NCOFLT + HIND16 0), pMON30238 (NCOFLT + HIND165), and deletion Knee pMON30239 (NCOFLT + HIND165) was made. pMO The deletion at N20239 is from amino acid residues 89 to 106.Example 91   The sequence rearranged fl using several methods and several types of linkers A t3 receptor agonist was created. 2 described by Mullins et al. Step PCR method (the first half and the back half of each rearranged molecule were replaced with the first half) In the second step, the paired products of the first reaction step are combined in a second step. And extend in the absence of the exogenous primer). 40) Linker peptide with 65/66, and 89/90 (SerGly GlyAsnGly) of constructs containing X (where X = 1, 2, or 3) One set was created. For example, SerGlyGlyAsnGly SEQ ID NO: 7 86, and SerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGly   SEQ ID NO: 787, and SerGlyGlyAsnGlySerGlyGly AsnGlySerGlyGlyAsnGly SEQ ID NO: 788 amino acid linker -/ 89/90 breakpoint precursor molecules (pMON32326, pM, respectively) ON32327, and pMON32328) to create the six initial P A CR product was made. The following primer pairs were used in the first step PCR reaction : A) 89For / L5B; b) 89For / LIOB; c) 89For / L1. 5B; d) 89 Rev / L5A; e) 89 Rev / L10A; and f) 89R. ev / L15A. Using the same approach, pMON32321 (39/40 Breakpoints, primer pairs 39For / L10B and 39Rev / L10A) and And pMON32325 (65/66 breakpoint, primer pair 65For / L5B and And 65Rev / L5A) precursor were prepared. Everything thereafter except for: PCR reaction is performed using a PCR optimizer kit (PCR Optimizer). Kit) (InVitrogen) ingredients and manufacturer's recommendations Amplification conditions according to the protocol used were used. The reaction was set up as follows: 5 0 pmol of each primer, 10 μl of 5 × buffer B [300 mM Tris-HCl (pH 8.5) 10 mM MgClTwo, 75 mM (NHFour)TwoSOFour] 5U Taq polymerase and 100 ng of heat-denatured DNA (in this example, pMON30 238) Combine the molds and add dHTwoThe final volume was brought to 45 μl with O. 80 reactants Preincubate for 1-5 minutes at 5 ° C., then add 5 μl of 10 mM dNTP to each reaction In addition, after heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, Perkin Elmer (Perkin Elmer) was used. mer) Model 480 DNA Amplified in thermal cycler. 7 times under the following conditions DNA amplification cycles were performed: heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 65 ° C for 2 minutes. And then extended at 72 ° C. for 3 minutes. Heat denaturation at 94 ° C for 1 minute followed by annealing at 72 ° C for 4 minutes 23 additional stretching / extension cycles, followed by a final 7 minute extension cycle at 72 ° C. Was performed. Except for pMON32328, the PCR amplification product was 1.2% TAE agar Run on a low gel and cut out the appropriate size band (major amplification product). Purification was performed using Geneclean II (Bio101). Trial Add 10 μl of dHTwoResuspended in O. Wizard PCR cleanup kit (Wizard PCR Clean up kit) (Promega Using ga)), the amplification product of pMON32328 was directly purified and 50 μl of dHTwoThe DNA was eluted with O. Increase the amount of template to 1 μg and change the PCR amplification conditions The precursor of pMON32322 (39/40 breakpoint, To create the Limer pair 39For / L5B and 39Rev / L5A) The method was modified: 6 cycles of 94 ° C for 1 minute, 65 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2.5 minutes, Then 15 cycles of 94 ° C for 1 minute, 70 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes, then at 72 ° C. One cycle of 7 minute extension.   In the second PCR step, the gel-purified precursor from the first PCR step was Used as primer / template combination as follows: 5 μl of each precursor molecule (sun That is, primer pairs 89For / L5B and 89 for pMON32328 Rev / L5A PCR product), 10 μl of 5 × buffer B, 5 U of Taq Remelase and 24 μl dHTwoO. The reaction was heated at 80 ° C. for 5 minutes and 5 μl Of 10 mM dNTP was added and the reaction was heat denatured at 94 ° C. for 2 minutes. DNA amplification conditions Was as follows: 15 cycles of 1 minute at 94 ° C, 2 minutes at 69 ° C, then at 72 ° C. Extension for 3 minutes. After the last cycle, extend for 7 minutes at 72 ° C for complete extension. One long step was performed. Reduced the 80 ° incubation time to 2 minutes, The number of cells was reduced to 10 cycles for pMON32325 (PCR product 6 5For / L5B and 65Rev / L5A). Geneclean n) Using II, transfer the appropriately sized PCR reaction product to 1.2% TAE agarose. Gel purification was performed on Sgel. pMON32322 (39For / L5B and 39Rev / L5A), the annealing temperature was reduced to 68 ° C. and the extension time was reduced to 2 minutes. Was. Furthermore, the PCR product can be used for Wizard PCR Cleanup Kit (Wizard).   Use PCR Clean up kit (Promega) And purified according to the protocol recommended by the supplier. The second PCR step , PMON32326 (89 For / L15B and 89 Rev / L15Λ PCR) Product) was modified as follows. Sample buffer (5x buffer B, D, or J-PCR Optimizer Kit (PCR Optimizer Kit) Except for this, three sets of PCR reactions were set up as described above. Buffer D and J The composition is pH or [MgClTwo] Alone. Buffer D [MgClTwo] Is 3 . 5 mM and the pH of buffer J is 9.5. Modification of the protocol to PC R Increase the number of cycles to 20 and add 15 μl at the end of cycles 10, 15 and 20 I took an aliquot. 5 μl of each aliquot time point was added to 1.2% TBE agarose Swell analyzed for the presence of amplification material. PCR reaction of buffers B, D and J Pool the remainder of the reaction mixture and then use the Wizard PCR Cleanup Kit (Wi zard PCR Clean up kit) (Promega) ). DNA is 50 μl dHTwoEluted in O.   Purified sample from the second step PCR reaction using one of two standardized digestion conditions Was digested with NcoI / HindIII. Geneclean I For samples digested with I, 10 μl of DNA was added to each 7. The reaction was digested with 5 U of NcoI / HindIII at 37 ° C. for 2 hours, and digested with 1.1% T Regenerate the gel on Gene Clean II on AE agarose gel. Purified. 10 μl dH of the sample ready for ligationTwoResuspended in O. pM For ON32322, 20 μl of sample was used in a reaction volume of 50 μl and 20 U of N The digestion was carried out with coI and HindIII at 37 ° C. for 3 hours. 0.1 volume of 3M NaO Ac (pH 5.5) and 2.5 volumes of EtOH are added, mixed and kept at -20 ° C overnight. Existed. 13.0 at 4 ° C. in a Sigma Mk202 microfuge The DNA was recovered by pelleting at 00 rpm for 20 minutes. Cool the DNA pellet Rinsed with 70% EtOH, freeze-dried and 10 μl dHTwoResuspended in O .Example 92   Using another approach, pMON32320 (39/40 breakpoint, 15 a Amino acid linker), pMON32323 (65/66 breakpoint, 15AA linker) ), And pMON32324 (65/66 breakpoint, 10 amino acid linker) Created. Enables cloning into BamHI site and maintains correct reading frame To incorporate a BamHI restriction site into the in-frame primer , New primers (L15C, L15D, L15E) were designed. First mechanic The PCR reaction conditions were the same as those described in pMON32322. The following set of primer pairs was used: 65For / L15D and 65Rev / L15E (pMON32324); 39For / L15D and 39Rev / L15 C (pMON32320); and 65For / L15D and 65Rev / L15 C (pMON32323). The PCR reaction product is transferred to Wizard P as described above. CR Cleanup Kit (Wizard PCR Clean up kit) ) And 50 μl of dHTwoEluted in O. Samples were prepared using NcoI / Ba mHI (30 For / L15D and 65 For / L15D) or BamHI / H indIII (39 Rev / L15C, 65 Rev / L15C, and 65 Rev) / L15E). Restriction digestion was performed as follows: final reaction volume 30 10 μl purified PCR reaction product in μl, 3 μl 10 × universal restriction buffer, 15U NcoI or HindIII, 15U BamHI. Reaction at 37 ° C Incubate for 90 minutes in GeneClean. ) II and purified on a 1.1% TAE agarose gel. Ready for consolidation DNA is added to 10 μl of dHTwoResuspended in O.   The three components (pMON32320, pMON32323, or pM ON32324) or two components (pMON32321, pMON32322, p MON32325, pMON32326, pMON32327 and pMON3 2328) In the ligation reaction, shrimp alkaline phosphatase (SA) P) treated with NcoI / HindIII digested pMON3977 (BHK The insert was ligated to a mammalian expression vector): 2.5 μl of the insert (pMON3 2320, pMON32323, or pMON32324 2 μl of the mer pair) was added to 50 ng in a 10 μl reaction using standard ligation conditions. Was added to the vector. Add 2 μl of each reaction to the protocol recommended by the manufacturer. Therefore, 100 μl of chemically competent DH5α cells (Gibco / Beer) Transformation was performed with luer (Gibco / BRL). 25 μl and 200 μl aliquots Plate on LB plate containing 50 μg / ml ampicillin and incubate overnight did. The isolated colonies are picked and Qiagen DNA midiprep (Qiage) n DNA midiprep) kit from 50 ml of overnight culture. NA was prepared. DNA was quantified by absorbance of A260 / 280, and 1 μg After digesting the form with NcoI / HindIII restriction endonuclease, the agarose The correct insert size was verified by gel electrophoresis. Inserting the predicted size The sample containing the cells is subjected to autofluorescent DNA sequencing using vector-specific primers. -Sequencer Model 373A (Perkin Elmer AB)   The sequence was sequenced in both orientations using Elmer ABI). Sequencing reaction Is a Perkin Elmer model with a reaction volume of 20 μl. Using a Dell 480 DNA thermal cycler, performed as follows: 1μ g template, 3.2 pmol primers, 1 μl DMSO, 9.5 μl Taq tag -Minatorage Deoxy Premix (Perkin Elmer AB Eye (P erkin Elmer ABI)) and combine 25 cycles of the following sequencing Constant amplification was performed: annealing at 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 15 seconds, then 60 ° C. 4 minute extension cycle. The sample was centrifuged (Centri-Sep) Lamb (Princeton Separats) purified according to the manufacturer's recommended protocol and frozen. It was dried and sequenced. A sample having the predicted amino acid sequence is used for analysis. And assigned a pMON number.Example 93   Create pMON32320, pMON32323, and pMON32324 Using the same approach that was used to (PMON32348 and pMON32350) The second type of linker (SerGlyGlySerGly) X (where X = 2 or 3) was introduced. The primer pairs are as follows: pMON32 For 348, 339For2 / 339Rev3 and 339Rev2 / 339- 10For3 combination, 339For2 / 339 for pMON32350 Using a combination of Rev3 and 339 Rev2 / 339-15For3, three A PCR amplification product was made. Each PCR amplification was set up as follows: 100 ng Thermally denatured pMON32320, 50 pmol of each primer pair, 10 μl of 5 × buffer B, 5U Taq polymerase and dHTwoO to a final volume of 45 μl Added to Reactions were pre-incubated as described above. 1 under the following conditions Five cycles of amplification were performed: heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, then annealing at 70 ° C. for 2 minutes. Ring step and extension at 72 ° C. for 3 minutes. After the last cycle, extend at 72 ° C for 7 minutes. One long step was performed. Primer pair 339For2 / 339Rev3, 339 Rev2 / 339-10For3 and 339Rev2 / 339-15For 2 PCR amplification product, Wizard PCR Cleanup Kit (Wizard)   Use PCR Clean up kit (Promega) And purified with 50 μl dHTwoEluted in O. 339For2 / 339Rev3 The NcoI / BamHI digest of the primer pair is as follows: 8 μl of DNA template Was combined with 2 μl of universal restriction buffer and 10 U of NcoI in a 20 μl reaction volume. And BamHI and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. Digestion products Purified using the Geneclean II direct purification protocol, The DNA ready for ligation was added to 10 μl dHTwoResuspended in O. 339 Rev2 / 339-10For3 and 339Rev2 / 339-15For2 amplification products Restriction digestion and subsequent purification are performed using the 339For2 / 339 Rev3 amplicon. , But using 10 U of HindIII instead of NcoI. Was. 50 ng of NcoI / HindIII / SAP treated and gel purified pMON39 77, 0.5 μl 339For2 / 339 Rev3 amplicon, 1 μl 3 39R ev2 / 339-10For3 (pMON32348) or 339Rev2 / 339-15For3 (pMON32350) amplicon, 5U T4 DNA Ligase and 1 μl of 10 × ligase buffer were added in a reaction volume of 10 μl A standard ligation reaction was performed at ambient temperature for 60 minutes. Until the last DNA sequence confirmation Subsequent steps were performed as described above.Example 94   Third tie with variable (GlyGlyGlySer) X repeat motif Sequence linker from the template created in the module, the flt3 receptor Incorporated into another set of agonists. The length of these linkers is Yes: 6AA linker (GlyGlyGlySerGlyGly SEQ ID NO: 79 2), 7AA linker (GlyGlyGlySerGlyGlyGly SEQ ID NO: No. 793), 10AA linker (GlyGlyGlySerGlyGlyGly) SerGlyGly SEQ ID NO: 794), 13AA linker (GlyGlyGl ySerGlyGlyGlySlyGlyGlyGlySerGly SEQ ID NO: 795), 15AA linker (GlyGlyGlySerGlyGlyGlyS erGlyGlyGlySerGlyGlyGly SEQ ID NO: 796); 21AA linker (GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly GlyGlySerGlyGlyGlySlyGlyGlyGlySerGly   SEQ ID NO: 797) amino acid residue. These modular molds (each unique Dimer of hflt3 ligand separated by long BamHI-containing linker -) Were created as follows. Six intermediate plasmid templates (FL3N , FL7N, FL11N, FL3C, FL4C, and FL10C) Using the primers and pMON30238 as template, pMON323 Prepared by PCR using the same cycling conditions as used for 22 did. For each reaction, 50 pmol of each primer was added to 100 ng of heat denatured template. The reaction was assembled as described for pMON32322. cycle The conditions are as follows: 1 minute at 94 ° C; 2 minutes at 65 ° C, and 2.5 minutes at 72 ° C. Cycle; 10 cycles of 94 ° C for 1 minute, 70 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2.5 minutes . One 7-minute extension at 72 ° C. was performed at the end of the cycling reaction. Create each intermediate Of The following primer pairs were used: N-term / FLN3 (FL3 N); N-term / FLN7 (FL7N); N-term / FLN11 (FL 11N); C-term / FLC3 (FL3C); C-term / FLC4 (F L4C); and C-term / FLC10 (FL10C). PCR amplification products Wizard PCR Cleanup Kit (Wizard PCR Clean up kit) (Promega) and 50 μl of dHTwoEluted in O. The first subset (FL3N, FL7N, and FL11 N) The purified DNA was digested with NcoI / BamHI and gel purified as described above. PSE420 vector DNA treated with NcoI / BamHI / Sap Ligation to trogen (InVitrogen). The second subset (FL3C , FL4C, and FL10C) were prepared in the same manner, but with Nc HindIII was used instead of oI. After the final DNA sequence confirmation The steps were performed as described above.Example 95   To create the final six templates, two sub-subs of the intermediate in pSE420 Set the NcoI / BamHI (FL3N, FL7N, FL11N-subset G) or BamHI / HindIII (FL3C, FL4C and FL10 C-subset 2) and Geneclean as described above. an) Gel purification using II. One intermediate amplicon from each subset To NcoI / HindIII / SAP treated pMON3977 per reaction And transformed in DH5α cells as described above using the following combination Create specific linker lengths: 6AA linkers (FL3N and FL3C), 7A A linker (FL3N and FL4C), 10AA linker (FL7N and FL3C) , 13AA linkers (FL3N and FL10C), 15AA linkers (FL11N And FL4C), and a 21AA linker (FL11N and FL10C). 6 above DNA was collected from a single colony from each of the three combinations in a 50 ml overnight culture. Prepared and solved for correct insert size by NcoI / HindIII restriction analysis And used as a template. Primer pair 30For / 39Rev (39/40 Cutting point); 65For / 65Rev (65/66 cutting point) and And 89For / 89Rev (89/90 breakpoint) using pMON3232 Each template was PCR amplified as described for 2, but with 75 pmol of each primer. used. The amplification conditions were changed as follows: 94 ° C for 1 minute, 70 ° C for 2 minutes, 72 ° C. 6 cycles of 2.5 minutes; then 9 cycles of 94 ° C for 1 minute, 72 ° C for 3 minutes. Cycle anti At the end of the reaction, a 6-minute extension at 72 ° C. was performed to allow sufficient time for complete extension of the product. Was. Samples can be prepared using Wizard PCR Cleanup Kit (Wizard PCR C) purified using lean up kit (Promega), Double digestion was performed with NcoI / HindIII. Transfer these amplification products to the wizard again. PCR cleanup kit (Wizard PCR Clean up ki) t) Purified using (Promega). In addition, 39/40 All six different linker length molecules for the breakpoint were identified as NcoI / Hin Cloned as a single protein into dIII / SAP treated pMON3977 (PMON32365, pMON32366, pMON32367, pMO N32368, pMON32369 and 32370). Final DNA sequence confirmation Subsequent steps until recognition were performed as described above.Example 96   Native flt3 ligand or sequence rearrangement via IgG2b linker pMON13416 (WO) bound to lt3 receptor agonists (Examples 91-93) 94/12638), a multifunctional chimeric receptor comprising an IL-3 receptor agonist A gene encoding a somatic agonist molecule was created. Desired sequence rearrangement flt3 The insert containing the receptor agonist molecule was cloned from the parent plasmid into NcoI / Hin pM isolated as a dIII restriction fragment and digested with AflIII / HindIII / SAP Connected to ON30304. The subsequent steps up to final DNA sequence confirmation are described above. Performed as described. IL-3 receptor agonists (from pMON13416) and And multi-functional chimeric molecules comprising a rearranged flt3 receptor agonist The resulting plasmid containing the DNA sequence of interest is shown in Table 9. Example 97   Native flt3 ligand or sequence rearrangement via IgG2b linker pMON13288 (WO) linked to lt3 receptor agonists (Examples 91-93) 94/12638), a multifunctional chimeric receptor comprising an IL-3 receptor agonist A gene encoding a somatic agonist molecule was created. Desired sequence rearrangement flt3 The insert containing the receptor agonist molecule was cloned from the parent plasmid into NcoI / Hin pM isolated as a dIII restriction fragment and digested with AflIII / HindIII / SAP Connected to ON30311. The subsequent steps up to final DNA sequence confirmation are described above. Performed as described. IL-3 receptor agonists (from pMON13288) and And multi-functional chimeric molecules comprising a rearranged flt3 receptor agonist The resulting plasmid containing the DNA sequence of interest is shown in Table 10. Example 98   Using pMON32360 and pMON32362 plasmid DNA as template And the primer pairs N-term / 134rev and N-term / 139rev Is used to frame the stop codon at the C-terminus of the native flt3 ligand molecule. Sequence at the N-terminus of the chimeric molecule by substitution at the internal SnaBI restriction site. Two chimeric molecules with a replacement hflt3 receptor agonist component were created. Anti The reaction mixture was prepared as described above for pMON32322. Cycle Article The conditions were as follows: 94 ° C for 1 minute, 65 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2.5 minutes for 7 days. Cycle and annealing temperature from 65 ° C to 70 ° C for another 10 cycles Amplification cycles were performed. Samples are transferred to Wizard PCR Cleanup Kit ( Wizard PCR Clean up kit) and protocol And purified with 50 μl dHTwoO and elute 20 μl of each sample with NcoI and Sna Digested with BI. Plasmid pMON26431 DNA was replaced with NcoI and SnaBI. And ligated with the NcoI / SnaBI digestion PCR reaction. Competent Before the transformation of DH5α cells and final confirmation of DNA sequence Performed as described.Example 99   Described primers 28/29 (28 For / 28 Rev), 34/35 (34 For / 34 Rev), 62/63 (62 For / 62 Rev), 94/95 ( 94For / 94Rev) and 98/99 (98For / 98Rev). The 10 and 15 amino acid linkers (GlyGlyGly Ser) x was amplified to create five additional hflt3 ligand breakpoints. Profit The resulting PCR product was digested with NcoI / HindIII and Af1I Ligated into pMON30311 digested with II / HindIII / SAP. Compilation Transformation of Tanto DH5α cells and subsequent steps until final DNA sequence confirmation Was performed as described above.Example 100   Sequence rearrangement of hflt3 receptor agonist in E. coli For current enhancements, N-terminal specific primers encoding degenerate codons were used. In the E. coli expression vector pMON5723, 1-134 and And native hflt3 ligands of type 1-139 were re-engineered. Primer pair FH 3AFor / SCF. rev (Ala2) and Flt23For / SCF (G ly2) using the reaction conditions described for pMON23222 PCR amplification of N-terminal degenerate mixture of native flt3 ligand encoding sequence Despite the breadth, the number of amplification cycles was 15 cycles of 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and Reduced to 72 ° C for 2.5 minutes. Wizard amplicon cleanup key Kit (Wizard PCR Clean up kit) (Promega and purified using 50 μl of dHTwoEluted in O. NcoI / H Restriction digestion using indIII and Geneclean II The subsequent gel purification was performed as described above. The insert was NcoI / HindIII / SAP treated gel purified pMON5723 plasmid DNA And transformed into competent DH5α cells as described above. Trait Aliquots of the transformed cells were made on LB agar containing 75 μg / ml spectinomycin. Plated on medium, incubated at 37 ° C. for 14-16 hours, and counted the number of colonies . After colonies were identified, the remainder of each transformation mixture was replaced with 75 μg / ml spectino. Incubate overnight (14-16 hours) at 37 ° C. in 2 × 5 ml of LB medium containing mycin Cubbed. Wizard DNA373 Miniprep Kit (Wizard   DNA 373A Miniprep kit) (Promega (Promega) ) According to the recommended protocol to prepare miniprep DNA Was. Purify the miniprep DNA with 50 μl dHTwoEluted in O and 1-2 μl Was used to transform chemically competent MON2O7 cells. 25 μl And 200 μl aliquots contain 75 μg / ml spectinomycin Plated on LB medium plates and incubated at 37 ° C. for 12-15 hours. original For each primer pair, 40-50 wells of isolated colonies were selected and LB / s Streak on a pectinomycin master plate and incubate at 37 ° C for an additional 4-6 hours. Cubbed.   Individual sequence reordered hflt3 receptor agonist clones were Screening for E. coli expression in clotiter format To select for improved expression levels. 100 μl per well A minimal M9 medium (containing 1% casamino acid) was inoculated by a single colony (each hr 40-50 isolates were analyzed for the lt3 PCR primer pair), 2 Incubate at 00 rpm for 3-4 hours and add freshly prepared 1 mg / ml Induction was carried out by adding 5 μl / well of succinic acid (in 0.1 N NaOH). At 37 ° C After 4 hours of incubation (I = 4), approximately 5-10 μl of aliquots from each well Take the coat and optics for the refractile bodies Analyze by microscope and compare the results to the total number of cells containing the refractors relative to the total number of cells. Scored as a percentage. The clone with the highest expression level is Selected for a 10 ml bench top scale expression test as follows. Overnight culture 5 ml of the nutrients are grown in LB medium at 37 ° C. in the presence of 75 μg / ml spectinomycin. Propagated. 10 ml of freshly prepared minimum M9 (1 in a 125 ml shake flask % Casamino acid) with enough overnight cells to give an initial reading of 20 klet. (Klett) units, then about 110-150 Klett units Incubate at 37 ° C. for about 3-4 hours with shaking until density of And add 50 μl of freshly prepared nalidixic acid (10 in 0.1 N NaOH). mg / ml). A 1 ml aliquot is taken and the cells are placed in a microfuge for 1 Pelleted for minutes. The supernatant is removed by suction, and the pellet is analyzed by SDS-PAGE. Stored at -20 ° C until done. The rest of the induced cells is shaken at 37 ° C. At this point (I = 4) at which point the cell density (Klett (K Lett unit) was measured. Take a 1 ml aliquot from each sample and pellet And stored as described above. Another 5-10 μl aliquot from each flask Collected and analyzed by light microscopy for the presence of refractors. Pelletized sample With a volume (μl) of 2 × loading buffer (I = 4 Klett number) (Containing 1% β-mercaptoethanol), boil for 5 minutes, and 1 to 12% or 14% Tris-glycine SDS polyacrylamide gel (November (Novex) and electrophoresed at 90 volts for 90 minutes. Solidify the gel And stained and dried according to the recommended protocol (Novex). Prepared for At this point, corresponds to the expected size when compared to the I = 0 sample Scale based on enhanced expression levels of a single induced protein band (I = 4) Clones were selected for up fermentation.   Midiprep DNA was converted to high levels of induction as described above. Prepared from selected clones that express the protein, The steps were performed as described above. These clones were designated as pMON32329, Named pMON32330, pMON32341, and pMON32342 Was.Example 101   IL-3 receptor agonist (from pMON13288) and native flt3 A set of multifunctional receptor agonist chimera molecules, including Gand, was constructed in EcoRI Expression was also made. Multiple machines from pMON32364 and pMON32377 A gene encoding a potential receptor agonist chimera molecule was transferred from the parent vector to Nco Digested with I / HindIII to release, ligated into pMON5677 vector, MON207 cells were transformed and single isolates were picked as described above. This These constructs were designated as pMON32394 (insert from pMON32364) and And pMON32395 (insert from pMON32377).Example 102   Using about 10 ng of plasmid pMON27184 as template, 50 pmol of plasmid Using a immersion FLTAFLSI and FLTRIN, a trimmed Flt3 The receptor was isolated as a 1.4 Kb PCR product. First Asn of mature coding sequence Af1III restriction site immediately 5 'to the codon, as well as the putative transmembrane region Primers were designed to obtain an EcoRI restriction site just 5 'of the region. reaction The product was digested with AfIII and EcoRI using standard reaction conditions and NcoI / It was ligated into the EcoRI digested plasmid pMON26458. This plasmid Contains the following DNA sequence: 5'-encoding the IL-3 signal sequence GGATCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCTCTG CTCCAACTCCTGGTCCGCCCCCGCCATGGCTAAAGCT T-3 'SEQ ID NO: 857. This sequence contains a BamHI restriction site at the 5 'end ATG methionine was added at the 3 'of the BamHI site as the first amino acid of the signal sequence. Has nin. This signal sequence is cleaved by the cell and the signal sequence Nco The I site was created by fusing to the AfIII site of the receptor generated in the PCR reaction. 5'Met / Ala remains. The truncated version of the receptor is IL-3 sig. Along with the null sequence, the BamHI / EcoRI digest (hIL3L / hFflt3 R) could be excised from the vector.   Re-engineering the catalytic domain of pMON30298 (hG-CSFR), By transmembrane / cytoplasmic binding by PCR as in Create To 0.5 μg of heat-denatured pMON30298, 100 pmol of each ply Mer HGCFfor and HGCFrev, 10 μl of 5 × buffer J, 5 U of Taq Polymerase and dHTwoO to a final volume of 45 μl as described above. Added to PCR amplification was performed as follows: 6 cycles (94 ° C. for 1 minute, 64 C for 2 minutes, and 70 C for 3 minutes), followed by 9 cycles (94 C for 1 minute, 70 C for 4 minutes). 7 A final 1 minute extension at 0 ° C. for 7 minutes was performed. 10 μl of each PCR reaction was added to the Gel purification using Geneclean II as described HTwoEluted in O. Samples were combined with 10 U each of EcoRI in a 20 μl reaction. Digested with HindIII at 37 ° C. for 90 minutes. Gel purification of the sample again as described above (Geneclean II) and 10 μl dHTwoEluted in O did. 2 μl of insert was added to NcoI / Hi in 10 μl reaction as described above. Ligation was performed with 50 ng of the ndIII / phosphatase treated pSE420 vector. Transformation of competent DH5α cells and subsequent DNA sequence confirmation The steps were performed as described above. Next, the selected clones are sequenced, The presence of an EcoRI site in the frame and the correct G-CSFR catalytic domain Confirmation of the DNA sequence was verified. Clones containing the predicted sequence were identified as described above. Was digested with EcoRI / HindIII and gel purified. hG-SCFR (E coli / HindIII) and hIL3L / hFlt3R (BamHI / EcoR). I) Treatment of the purified insert of the fragment with BamHI / HindIII / phosphatase PcDNA3.1 (-) vector (InVitrogen) )). Transformation of competent DH5α cells and final DNA transfer The subsequent steps up to column confirmation were performed in the same manner as described above.Example 103   Using the dimer template intermediate described above, sequence rearranged Flt3 ligand Additional genes to be loaded were created. 15 amino acid linker (GlyGlyGly Ser)ThreeGlyGlyGly Sequence rearrangement flt3 having SEQ ID NO: 795 For receptor agonists, the dimer intermediate Flt4C. seq and Flt11N . seq was used as a template. Flt33 ligand amino acid residue 29/29, The cutting points corresponding to 34/35, 62/63, 94/95, and 98/99 are By the PCR-based approach, the PCR Optimizer Kit (PCR Op timizer Kit (Invitrogen) and the following Were prepared using the following primer pairs: F129Fo as described in Example 94. r / FL29Rev, FL35For / FL35Rev, FL63For / FL 63Rev, FL95For / FL95Rev, FL99For / FL99Re v. The amplification conditions were as follows: 7 cycles of 94 ° C for 1 minute, 62 ° C for 2 minutes, and And 70 ° C for 2.5 minutes; 12 cycles of 94 ° C for 1 minute, 68 ° C for 2 minutes, and 70 ° C for 2 minutes. 5 min; then one final cycle at 72 ° C. for 7 min. Corresponds to the expected insert size The PCR product was digested with NcoI and HindIII, and gene clean as described above. (Geneclean) II (Bio101) using the manufacturer's recommended professional Gel purification was performed according to the protocol. Samples were prepared in dH in a final volume of 10 μl.TwoResuspend in O did. Using the insert as a single gene, the mammalian expression vector pMON3934 (N coI / HindIII / SAP treated) and pMON 35712, pMON35713, pMON35714, pMON35715, Named pMON35716, pMON35717, and pMON35718 Was.   28/29, 34/35, 62/63, 94/95, and 98/99 breakpoints The purified restriction digested PCR product of the primer pair was purified by Af1III / HindIII / SAP-treated cloned into pMON30311 and cloned into pMON1328 8 (WO94 / 12638) encoded by IL-3 receptor agonist (this Chimeric protein comprising "IL-3 receptor agonist I" in the specification) The gene encoding the quality and the sequence rearranged Flt3 ligand were prepared. Profit The resulting plasmids were used as pMON32398, pMON35700, pM Named ON35702, pMON35704, and pMON35706. In addition, the same primer pair was used with the dimer template intermediate Flt7N. seq and Flt3 C. Used with seq, a 10 amino acid linker (GlyGlyGlySe) r)TwoGlyGly SEQ ID NO: 793 generated these IL-3 receptor jaws. Nist I / Flt3L chimeric protein type: pMON32397, p, respectively MON32399, pMON35701, pMON35703, and pMON 35705.Example 104   21 amino acid residue linker (GlyGlyGlySer)FiveGly sequence number IL-3 receptor agonist I / Flt3L chimeric protein containing 796 The encoding gene was transformed into a dimer template intermediate Fl by a similar PCR approach. t11N. seq and Flt10C. Using seq and the following primer pairs Created: Flt36 / 36Rev, Flt37 / 37Rev, Flt38 / 3 8Rev, Flt39 / 39Rev, Flt41 / 41Rev, Flt42 / 4 2 Rev, and Flt43 / 43 Rev. These primer pairs have the following F lt3 ligand breakpoint 35/36; 36/37; 37/38; 38/39; 40 / 41; 41/42; and 42/43 (the 39/40 breakpoint was already pMON3 2376) and PCR amplification using the following cycle conditions: Used for width: InVitrogen PCR Optima Using Iser Kit (PCR Optimizer Kit) (Buffer B) 7 cycles of 94 ° C for 1 minute, 66 ° C for 2 minutes, and 70 ° C for 2.5 minutes; 15 cycles 1 minute at 94 ° C., 4 minutes at 70 ° C .; DNA sequence confirmation After recognition, these constructs were pMON35733, pMON35734, respectively. pMON35735, pMON35736, pMON35738, pMON35 739, pMON35740, pMON35741, pMON35742, and And pMON35743. Sequence rearrangement due to PCR import error Two amino acid substitutions of the Flt3 chimeric partner (pMON35741, 35 / 36 breakpoints; and pMON35743, 42/43 breakpoints) and this series. Two amino acid substitutions in the Flt3L residue created and tested as part of Q133To R133And Q100To R100And L112From112One containing Two single amino acid substitutions in the body (pMON35742, 38/39 breakpoint) Provoked.   Alternate Flt3L breakpoints are associated with the aforementioned Flt3 ligand amino acid residues 28/2. 9, 34/35, 62/63, 65/66, 89/90, 94/95, and 9 Additional Flt3L / 11-3 receptor agonist I chimera corresponding to 8/99 The protein also contains a 15 amino acid linker (GlyGlyGlySer).ThreeGly Created using GlyGly templates Flt4C and Flt11N. PCR reaction The mixture was similar to that described in Example 103, except that the sequence rearranged Flt3 residues The reverse primer encoding the C-terminus of Hind has a SnaBI recognition sequence Modified by substitution at the III restriction site. PCR amplification cycle parameters are as follows 7 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 66 ° C. for 2 minutes, and 70 ° C. for 2.5 minutes; Cycle at 94 ° C for 1 minute, 70 ° C for 4 minutes; then finally 72 ° C for 7 minutes. PCR Cleanup, restriction digestion, and purification were performed as described above. The insert is PMON26431 (IgG2b phosphorylated) treated with NcoI / SnaBI / SAP Car / BHK expression vector containing IL-3 receptor agonist I residue) Ligation as follows: 50 ng of treated vector, insert in 10 μl reaction volume Body (10: 1 insert: vector), 1 unit of T4 DNA ligase (Gibcobee Arb (Gibco BRL)), and 1 μl of 10 × ligase buffer. The ligation was incubated for 1 hour at ambient temperature, then 2 μl of each ligation was removed, Using this, 100 μl of chemically competent DH10B (or D H5α) cells (Gibco BRL) recommended by the manufacturer Transformation was carried out according to the following protocol. One fifth and two of each transformation mixture One fifth volume is plated on LB agar plates supplemented with appropriate antibiotic markers , 37 ° C overnight (14-16 hours). Pick the isolated colony And, as described above, Qiagen midiprep. p) DNA was prepared using the protocol.   Sequence analysis of the selected clones was performed at the 28/29 breakpoint (pMON35719), 34/35 cut point (pMON35720), 62/63 cut point (pMON357 21), 65/66 breakpoint (pM0N35722), 89/90 breakpoint (pMO N35723) and the 98/99 breakpoint (pMON35725) Confirmed. pMON35726 has one amino acid at the 94/95 breakpoint With a substitution (Leu94 to Phe94). 39/40 Flt3L break point With different amino acid linker lengths of 10, 15 and 21 AA The 3L / IL-3 receptor agonist I chimera construct was pMON35707, pM ON35708, pMON35709, pMON35710, and pMON3 Shown by 5711. These constructs are used for PCR amplification of one of the following templates: Generated from: pMON32373, pMON32375, or pMON32 376, and Flt3L specific primer pair 39N TERM-1 / SNAB IC TERM. Set up a standard PCR reaction mixture as described above and generate DNA The product was amplified using the following parameters: 7 cycles of 94 ° C for 1 minute, 62 ° C for 2 minutes. And 70 ° C for 2.5 minutes; 12 cycles of 94 ° C for 1 minute, 68 ° C for 2 minutes, and 70 ° C. for 2.5 minutes; then a final cycle of 72 ° C. for 7 minutes. Expected insert size Was completely digested with NcoI and SnaBI, gel-purified, As described above, Flt3L / IgG2b / I1-3 receptor agonist I chimera As a protein, a mammalian expression vector pMON26431 (NcoI / Sna (BI / SAP treated). Two of these constructs are sequence aligned. There was a PCR incorporation error in the replacement Flt3 chimera partner, which Amino acid substituted F96To L96, E58To G58(PMON35710 and pMO N35711).Example 105   Another series of chimeric proteins, the aforementioned Flt3L ligand amino Acid residues 35/36, 36/37, 38/39, 40/41, 41/42, 42 / Sequences with breakpoints corresponding to 43 and 65/66 and a 21 amino acid linker The reordered Flt3L / IL-3 receptor agonist I was also selected IL-3 Prepared using receptor agonist I / sequence rearranged Flt3L construct as template (See Table 11 below). One exception is the 15 amino acid linker template (pMO N35715) was used to create the 65/66 cut point, pMON35711. And                                  Table 11 Flt3L / IL-3 receptor agonist I IL-3 receptor agonist I / Fl t3L  The same restriction sites used to create pMON35719-35725 Was used. Reverse primer 36 Rev ', 37 Rev ', 38 Rev', 39 Rev ', 41 Rev', 42 Rev ', and 43R ev 'was used to create an in-frame SnaBI site. Same forward primer FLt36, FLt37, FLt38, FLt39, FLt41, FLt42, And FLt43 were used. PCR reaction mixture is the same as described above However, except for pMON35711, the amplification conditions were modified as follows: Elongation of the loop at 94 ° C for 1 minute, 68 ° C for 2 minutes, and 70 ° C for 2.5 minutes; then 72 ° C for 7 minutes For one cycle. . For pMON35771, the amplification conditions are as follows: : 6 cycles of 94 ° C for 1 minute, 66 ° C for 2 minutes, and 70 ° C for 2.5 minutes; 15 cycles 1 minute at 94 ° C. and 4 minutes at 70 ° C .; then finally one cycle at 72 ° C. for 7 minutes. Example 10 The Flt3-specific PCR amplification product was restriction digested, purified, and ON26431 (BH containing IgG2b / IL-3 receptor agonist I residue) K expression vector).   One variant, pMON32179, was used to generate a PCR primer pair Flt40 / 34Re. v and the dimer template intermediate Flt11N. seq and Flt10C. using seq Was created as a 34/40 cutting point. PCR amplification conditions and subsequent cloning Identical to that used to clone pMON35711.   Three additional Flt3L / IL-3 receptor agonist I chimeras (38/39 cuts) Breakpoints) were designed and created to test the effect of alternating linker length and composition. pMO The GlySer linker length was extended using N35709 as a template to Immer versus BamFor1 / 38Rev (reaction product is called PCR A) and Fl Motif using t38 / BamRev1 (reaction product is called PCR B) (GlyGlyGlySer)7Included 29 amino acid residues with Gly . The amplification conditions were as follows: 6 cycles of 1 minute at 94 ° C, 2 minutes at 66 ° C, and 2.5 minutes at 70 ° C .; 1 minute at 94 ° C. for 15 cycles, and 4 minutes at 70 ° C .; One cycle at 2 ° C for 7 minutes. The obtained PCR product is used for promega (Promega) Clean up using the Lean Up Kit, and use NcoI / BamHI (PC RA) or BamHI / SnaBI (PCR B), gel purified and As noted, pMON26431 (IgG2b linker / IL-3 receptor agoni (BHK expression vector having a strike I residue). Array the resulting constructs Determined and confirmed and called pMON35774. GlySer The linker is a native Flt3L amino acid residue 14 with a single amino acid substitution. 0-154 (pMON35775) or 140-160 (pMON35776) PMON35775 and 35776 differ in that they are replaced by I was PCR reaction conditions were the same as described for pMON35774. However, the following primer pairs were used: 38For / Navfor and 38R ev / NavRevS (pMON35775); and 38For / Navfo r and 38 Rev / NavRevL (pMON35776). BamHI's fee Instead, KasI was used, except for the cloning of these PCR amplification products. The logging step was identical to that used for pMON35774. Sequence analysis Has shown that PMON in multiple isolates for both pMON35775 and 35776 An error induced by the CR became apparent. To get the final correct sequence, Re-digest the selected subclone with NarI / SnaBI and NcoI / NarI And These gel-purified fragments must be used to reclone the desired construct. It was important. Several Flt3L keys were tested for testing as BHK transients. Mera molecules were also created. Two native Fl linked by an IgG2b linker pMON32173 consisting of a t3L molecule was converted to two existing molecules as follows. Assembled from: Ncol / SnaBI Flt3L from pMON32393 The containing insert was pMON3237 cut with gel purified NcoI / SnaBI. 7 (IL-3 receptor agonist I chimeric partner is isolated) I let you. Similarly, pMON35727 (39/40 breakpoint, 15 amino acid linker) ) With the Flt3L insert from pMON35708 (NcoI / SnaBI insert) Gel-purified pMON32375 (IL-3 receptor jaw) The Nist I chimera partner has been isolated). Third Flt3L Dimer pMON32168 (39/40 breakpoint, 21 amino acid linker) Assembled as follows: NcoI / SnaBI insert from pMON32165 (NcoI / BamHI fragment of pMON32163 and Ba of pMON35709 The mHI / HindIII fragment was digested with NcoI / HindIII digested pMON5723. E. coli (pMON35709) assembled by subcloning into E. FIG. coli) equivalents). NcoI / SnaBI insertion from pMON32165 From the body (Flt3L 1-139 (39/40) L21) and pMON32376 SnaBI / HindIII insert (IgG2b / Flt3L 1-139 (3 9/40) L21) was transformed into an E. coli production vector pMON5723. Subcloned into it to create pMON32167. Next, pMON32 The NcoI / HindIII insert from 167 was subcloned into pMON30304. And called pMON32168.Example 106   Using a restriction digested and gel purified fragment, a series of trimer molecules can be [Each of the two Flt3L residues and the IL-3 receptor agonist I or IL- 3 receptor agonist II (pMON13416 (WO94 / 12638)) Is an IL-3 receptor agonist that is loaded, and is referred to herein as "IL-3 receptor Consisting of one copy of "body agonist II"). pMON35 728 is derived from pMON32375 by NcoI / EcoRI (Flt3L / IgG 2b / IL-3 receptor agonist I) Using pMON35708 EcoRI / HindIII (IL-3 receptor agonist I / IgG2b / Flt 3L) Assembled using insert. Next, the two fragments were combined with NcoI / HindII. Re-ligated to I / SAP-treated mammalian expression vector pMON3934, Subcloned as described. Ncol / Hin from pMON32173 The dIII fragment was ligated into the AflIII / HindIII site of pMON30304, pMON32205 (IL-3 receptor agonist II / IgG2B / Flt31- 139 / IgG2B / Flt3 1-139). A similar approach Using pMON32206 (IL-3 receptor agonist II / IgG2b / Flt3L (39/40) L21 / IgG2b / Flt3L (39/40) L2 1) was created. Gel the NcoI / HindIII fragment from pMON32167 Purified and AflIII / HindIII digested pMON30304 (this is IL-3 (Having a receptor agonist II / IgG2b residue). pM The gel purified NcoI / HindIII insert from ON32170 was converted to the intermediate pM Subcloning into ON32198 (AflIII / HindIII) Mid pMON32207 (Flt3L (39/40) L21 / IgG2b / Fl t3L (39/40) L21)) / G-CSF) was assembled. pMON303 20 (as IgG2b / G-CSF) with gel purified SnaBI insert Subclonin in SnaBI digested / SAP treated pMON32173 And pMON32208 (Flt3L 1-139 / IgG2b / G-CS F / IgG2b / Flt3L 1-139) was assembled. pMON32173 NcoI / HindIII insert from AflIII / HindIII digested pM ON3O3O9 (which contains G-CSF / IgG2b) To assemble pMON32204. Nco from pMON32190 I / SacI insert and SacI / HindIII insert from pMON32171 Was subcloned into NcoI / HindIII digested pMON30304 To pMON32195 (Flt3L 1-139 (39/40) L21 / I gG2b / G-CSF / Flt3 1-139 (39/40) L 21) was assembled. pMON30309 (as G-CSF / IgG2b) The NcoI / Af1III fragment was treated with NcoI / SAP-treated pMON3216 8 (Flt3L 1-139 (39/40) L21 / IgG2b / Flt3L1 -139) and cloned into pMON32196 (G-CSF / Ig G2b / Flt3L 1-139 (39/40) L21 / IgG2b / Flt3 L1-139) was assembled, and the orientation was confirmed by DNA sequence and restriction analysis. p MON32167 (Flt3L 1-139 (39/40) / L21 / IgG2 b / F1t3L 1-139 (39/40) L21) NcoI / HindIII The insert was constructed using the AflIII / Hi of pMON30309 (G-CSF / IgG2b). Subcloning into the ndIII site, pMON32197 (G-CSF / I gG2b / Flt3L 1-139 (39/40) L21 / IgG2b / Flt 3L 1-139 (39/40) L21) was prepared.Example 108   IL-3 receptor agonist I or IL-3 receptor agonist II By replacing with G-CSF as a toner, a series of BHK A Flt3L containing molecule was created. Using the BHK vector pMON3934, For the transiently expressed and produced chimeric protein, the G-CSF residue is 17 Could encode Ser or Cys. From E. coli For molecules used for current or non-transiently expressed in mammalian expression systems Thus, position 17 of the G-CSF partner coded Ser only. Creation of BHK expression A chimera of native Flt3L and G-CSF was generated in both orientations as follows: -CSF / IgG2b / Flt3L (pMON30239) and Flt3L / IgG2b / G-CSF (pMON32175). pMON30239 is pM Flt3L 1 from ON30238 (as NcoI / HindIII digest) The -139 insert was digested with AflIII / HindIII in pMON30309 (this Which contains G-CSF / IgG2b) and is assembled by subcloning into pMON32175 is a gel purified NcoI / Sn from pMON32393. From the aBI insert, NcoI / SnaBI digested pMON26420 (this was (Containing the IgG2b / G-CSF gene). Third not yet PMON32191, a denatured G-CSF / Flt3L chimeric molecule, is an IgG With a GlySer linker in place of the 2b chimeric linker, E. coli (E.co. li) differs from pMON32175 in that it is designed for expression. pM ON32191 is the same gel purified NcoI / Sn from pMON32393. Using the aBI insert, NcoI / SnaBI digested pMON31123 ( This contains the GlySer / G-CSF gene). BHK The equivalent, pMON35767, was gel purified N from pMON32191. The coI / HindIII chimera gene was placed in the BHK vector pMON3934. It was assembled by bulk cloning.Example 109   By replacing the IL-3 receptor agonist I component with G-CSF, two A series of sequence rearranged Flt3L chimeras were generated. Oriented G-CSF / IgG The first set with 2B / sequence permutation Flt3L is basically as follows: Assembled: pMON30239 (G-CSF / IgG2B / Flt3L1- 139) was digested with SnaBI / HindIII to remove vector-containing G-CSF residues. Gel purification was performed as described above. Suitable IL-3 receptor agonists shown in Table 12 below The SnaBI / HindIII digested insert from the I / Flt3L construct was It was subcloned into MON30239 (SnaBI / HindIII).                                  Table 12 G-CSF / IgG2b / Flt3L construct and its IL-3 receptor agonist I Analog   NcoI / BamHI insert from pMON32163 and pMON32730 AflIII / HindIII digestion using the BamHI / HindIII insert from Was subcloned into pMON30309, -CSF / IgG2b / Flt3L 1-139 (39/40) L21) I stood up. The three molecules in this series are directed against the direct IL-3 receptor agonist I. Have no response. The first pMON39914 is Af1III / HindIII Expression vector pMON30309 digested with G-CSF / IgG 2b) and pMON32243 (as NcoI / HindIII) These were assembled using the Flt3 1-139 (39/40) L29 insert. For pMON39915, Flt3L 1-15 from pMON32242 4 (39/40) gene (as NcoI / HindIII insert) -Subcloned into pMON30309. pMON39916 is pMO Assembled exactly as N39915, but Flt3L from pMON32252   A 1-160 (39/40) insert was used. pMON32242, 3224 3, and 32352 are non-chimeric, rearranged Flt3L genes (NcoI / HindIII) (E. coli) expression construct. Finally, the insert from pMON35799 was expressed in E. coli. For subcloning into pMON5723 (as NcoI / HindIII fragment). Learning. This E. coli production plasmid was transferred to pMON399 04.Example 110   Many second series of G- with orientation Flt3L / IgG2b / G-CSF The CSF chimera also has its IL-3 receptor agonist I analog as shown in Table 13. Created as a body.                                  Table 13 Flt3L / IgG2b / G-CSF construct and its IL-3 receptor agonist I Analog  These constructs were identified as Flt3L / IL-3 receptor agonist I chime in the table above. NcoI / SnaBI digested pMON36113 (IgG2b / BHK vector containing G-CSF gene) and specific NcoI / SnaBI The digested sequence rearranged Flt3L insert was used to assemble. Obtained plasm PMON32170, pMON32871, pMON32271, pMO N32172, pMON32174, pMON35751, pMON35752 , PMON35753, pMON35754, pMON35755, pMON3 5756, pMON35757, pMON35758, pMON35759, p MON35760, pMON35761, pMON35762, pMON357 63, pMON35764, pMON35765, pMON35766, pMO N35767, pMON35768, pMON35770, pMON35772 , PMON35773, pMON35777, pMON35778, pMON3 5779, pMON35780, pMON35782, and pMON3990 I named 8.   pMON35777 and pMON35788 were created by PCR, NcoI / NarI as described for 5775 and pMON35776 And the NarI / SnaBI insert, but with the IgG2b / G-CSF gene. NcoI / SnaBI digested pMON3575 as parent vector containing offspring 1 was used. To create a 39/40 breakpoint equivalent of pMON35778 PMON35 using primer pair Flt40 / SnaBI C-term The 778 template was reamplified. The amplification conditions were as described for pMON35771. As in the first but the first TannealFrom 66 to 55 ° C. The resulting construct Was converted to opMON35782 (Flt3 1-160 (39/40) / IgG2b / G-CSF).   pMON32170 (Flt3 1-139 (39/40) L21 / IgG2 B / G-CSF) was obtained from NMON / SnaBI digested pMON26430 (this Contains IgG2B / G-CSF), pMON32165 or Were assembled using the NcoI / SnaBI insert. pMON35764 (F lt3L (38/39) L21 / IgG2b / G-CSF) was cloned as follows: The sequence rearranged Flt3L insert was used as a template for pMON35736 And the primer pair Flt39 / 39Rev. The amplification conditions are , PMON35771, but with the first TannealTo Reduced from 66 to 56 ° C. NcoI / SnaBI digested PCR amplified product was NcoI / SnaBI digested pMON containing G2b / G-CSF gene It was subcloned into 35754. pMON35768 (Flt3L (38 / 39) L21 / IgG2b / G-CSF) is the remaining of the Flt3 chimeric partner It has a mutation at group 15 (Ser to Phe). pMON35762 (Flt 3 template pMON35739), pMON35763 (Flt3 template 35738) , PMON35758 (Flt3 template 35740), pMON35770 (Fl3 pMON35743) as a t3L template describes pMON35764. Was created in exactly the same way as Sequence Rearrangement Flt in pMON35760 S of three genes125To F125PMON35772, a mutant to 3. pMON35715 as template and primer pair 65F was cloned by PCR using or / 65SnaBI. PCR cycle The conditions are as follows: pMON35733, pMON35734, pMON357 35 and pMON35736 were used to amplify the Flt3 gene from pMON35736. Is the same as pMON35761 is a sequence rearrangement in pMON35758 Q of Flt3L gene133To R133Is a mutant to pMON35773 (Flt3L 1-139 (38/39) L29 / IgG2B / G-CSF) , PMON35774, cloned as described above, but with IgG2b / PMON26430 containing the G-CSF gene (NcoI / SnaBI / SA) P-treated) was used as the parent vector.   To generate a 39/40 breakpoint equivalent, primer pair F pMON35773 as template with lt40 / SnaBI C-term used. Amplification is performed exactly as described above for pMON35771. Was. The NcoI / SnaBI digested amplification product was digested with pMON26430 (NcoI / SnaBI / SAP treated) and pMON35779 (Flt3L 1-139 (39/40) L29 / IgG2B / G-CSF) Obtained. pMON35780 is a variant of pMON35779, and the sequence rearrangement F A single amino acid mutation in the lt3 chimeric partner (L60To p60To) Do. pMON32190 (Flt3L 1-139 (39/40) L21 / GS / G-CSF) has an alternating GlySer chimeric linker, which Replaces the IgG2b linker of ON32170. pMON32165 (large Flt3L1-13 in Enterobacteriaceae (E. coli) expression vector pMON5723 N from 9 (39/40) L21 / IgG2b / IL-3 receptor agonist I) The coI / SnaBI fragment Flt3L gene was digested with NcoI / SnaBI digested p It was subcloned into MON31123. PMON, a BHK expression equivalent 35766 is the entire Flt3L / GlySer as an NcoI / HindIII fragment. / G-CSF chimera insert was created by subcloning.   pMON39908 is similar to pMON35779, but with Flt3L amino acids. The amino acid residues 133-160 have the amino acid sequence VETVFHRVSQDGLDLLT. S SEQ ID NO: 798 (this is Flt3L (GenBank) Accession number HSU29874) is homologous to the alternate splice variant) Has been replaced. pMON32190 contains the following set of primer pairs Flt4 PCR template with 0 / XbaRev and SnaBICTerm / XbaFor Used. Amplification conditions were as described above for pMON35771. But the first TannealFrom 66 to 64 ° C. Gel-purified PCR amplification products With NcoI / XbaI (Flt40 / XbaRev PCR product) or Xb digested with aI / SnaBI (SnaBICTerm / XbaFor PCR product) Sub-channels in pMON26430 (NcoI / SnaBI / SAP processed). Loaned. pMON32273 (Flt3L 1-139 (39/40) L21 / IgG2b / G-CSF) with a primer pair FltConNco / Gr ev together with 38 / 39Flt3 by PCR of pMON35777. The L residue was reamplified as 39/40. Purify the amplicon with NcoI / Sn digested with aBI and subcloned into NcoI / SnaBI digested pMON32191. Cloned and named pMON32259 (for E. coli production) ). NcoI / HindIII insert from pMON32259 for BHK expression The input was subcloned into pMON3934 (NcoI / HindIII) .Example 103   Create another series of chimeric proteins, where the Flt3L partner is 1 It had one or two Cys mutations (Tables XIA and XIB). P as a template MON32191 and primer pairs C1For / C3Rev and C3For / 139 In two reactions by PCR using Rev, pMON35790 (Flt3L 1-139 (CFour→ SFour, C85→ S85) / GS / G-CSF (Ser17)) Done. PMON32191 as template and primer pair C5For / C6Re v and C5Rev / N-term by pMON35791 (PCR) Flt3L 1-139 (C93→ S93, C132→ S132) / GS / G-CSF (S er17)). The amplification conditions were as described above for pMON35771. But the first TannealFrom 66 to 64 ° C. The first round Second round of P using amplicons (10 μl each) Perform a CR, then purify the PCR product, digest with NcoI / SnaBI, Subcloned into I / SnaBI digested pMON32191. 2nd la The conditions of the PCR amplification of Wund were modified as follows:annealTo 68 ° C The number of cycles was increased from 6 to 15. No additional amplification was required. these Creation object pMON35787 (CFour→ SFour, C85→ S85) And pMON35788 (C93 → S93, C132→ S132) Was used for E. coli expression. Correctly mutated Flt3L / GlySer / G-CSF chimeric insert was inserted into Nc Subcloning into pMON3934 as an oI / HindIII fragment HK expression equivalents pMON35790 and 35791 were created. PM as template ON32191 and primer pair FLD1Rev / FltNTerm By CR, pMON35792 (Flt3L 1-132 (C132→ S132) / GlySer / G-CSF (Ser17)) was prepared. PMON as template PCR using 32191 and primer pair FLM1Rev / FltNTTerm Allows pMON39905 (Flt3L 1-139 (C132→ S132) / Gl ySer / G-CSF (Ser17)) was prepared. pMON39906 (Fl t3L 1-139 (C127→ S127/ C32→ S132) / GlySer / G-CS F (Ser17)) is one at residue 127 of the sequence rearranged Flt3L partner. Amino acid substitutions, which were induced during PCR amplification of pMON39905. It is the result of a conductivity error. pMON32276 (Flt3L 1-139 (3 9/40) L21 (CFour→ SFour, C85→ S85) / GlySer / G-CSF (Se r17)) was created by two rounds of PCR. Three initial amplicons Created: PCR1 (pMON32190 template and primer pair G10L / 85N PCR7 (pMON32190 template and primer pair 4N / 85S); and PCR4 (pMON32198 template and primer pair 4S / 3605Rev). No. For two rounds, PCR 1, 4, and 7 were reamplified in the combination mixture, PCR A was obtained. PCRA was purified, digested with NcoI / SnaBI, and pMO It was subcloned into N30277 (GlySer / G-CSF). Next three Was constructed in a similar manner. pMON32277 (G-CSF (Ser 17) / IgG2B / Fl t3L 1-139 (39/40) L21 (CFour→ SFour/ C85→ S85)) 1st lau PCR generated three initial amplicons: PCR1 (pMON321 PCR7 (pMON32190 casting with 90 templates and primer pair G10L / 85N) Template and primer pair 4N / 85S); and PCR6 (with pMON32169 template). Primer pair 4S / 3605Rev). For the second round, PCR1,6, And 7 were reamplified in the combinatorial mixture to give PCR B. Purify PCR B And digested with NcoI / HindIII and pMON digested with NcoI / HindIII. 30309 (G-CSF (Ser17) / IgG2B) . pMON32278 (Flt3L 1-139 (39/40) L21 (C93→ S93/ C132→ S132) / GlySer / G-CSF (Ser17)) First Round PCR generated three initial amplicons: PCR2 (pMON3219). 0 template and primer pair G10L / 93N); PCR8 (pMON32190 template) And primer pair 132N / 93S); and PCR3 (pMON32198 template). And primer pair 132S / 3605 Rev). For the second round, PCR2 , 3, and 8 were reamplified in the combination mixture to obtain PCR C. PCR C Was purified, digested with NcoI / SnaBI, and pMON30277 (GlySer / G-CSF). pMON32279 G-CSF (S er17) / IgG2B / Flt3L 1-139 (39/40) L21 (C93 → S93/ C132→ S132) First round PCR generates three initial amplicons Performed: PCR2 (pMON32190 template and primer pair G10L / 93N); PCR8 (pMON32190 template and primer pair 132N / 93S); and PCR5 (pMON32169 template and primer pair 132S / 3605Rev) . For the second round, PCR 2, 5, and 8 were reamplified in the combinatorial mixture Then, PCR D was obtained. PCR D was purified and digested with NcoI / HindIII. , NcoI / HindIII digested pMON30309 (G-CSF (Ser1 7) Subcloned into / IgG2B).Example 112   pMON39909 (Flt3L 1-139 (39/40) L21 / GS / G-CSF (Ser17) (133/132)) has sequences in both proteins. One of the two Flt3 / G-CSF chimeric proteins that are rearranged . P containing the Flt3L 1-139 (39/40) L21 / GlySer gene The NcoI / Af1III fragment from MON32198 was treated with NcoI / SAP. PMON25187 (G-CSF (Ser17) (133/132) E. coli production plasmid containing the copy) I did it. After confirming the DNA sequence, the chimeric insert was converted to an NcoI / HindIII fragment. It was subcloned into pMON3934 and named pMON39909. p MON39910 (G-CSF (Ser17) (133/132 / IgG2B / Flt3L 1-139 (39/40) L21) was converted to pMON25 as a template. 187 and a primer pair GPFor1 / GPRev2. Amplification strip The case is the same as that used for pMON39908. NcoI / Sn aBI digested G-CSF (Ser17) (133/132) was converted to IgG2B / PMON323 containing the Flt3L 1-139 (39/40) L21 gene It was subcloned into 76 NcoI / SnaBI sites.Example 113   pMON40000 is a G-CSF (Ser1) for expression in NS0 cells. 7) Contains / GlySer / Flt3L 1-139 (39/40) L21. Production plasmid modified from pC1neo (Promega) (PMON32169 is the equivalent of BHK). pMON40000 is CM VIE promoter / enhancer component, CSF (Ser17) / GlySe r / Flt3L 1-139 (39/40) IL-3 reader just upstream of L21 -Sequence, thymidine kinase promoter truncated, SV40 late poly A signal sequence and several DNAse1 hypersensitive regions (IgH3min (Part of LCR).Example 114 Biological activity of multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist                                  Table 14        In vitro multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist bioassayUsage Guide:+ : Lower titer compared to control (shift to right)++ : Titer equivalent to control (within 2 times)+++ : Increase in titer compared to control (shift to left) 1 compared to control: pMON30247 2 compared to control: pMON32352 3 Compared to appropriate co-added controls Analysis in pool of 4 clones pMON40000 and pMON40002Example 115 Biological activity measurement                                  Table 15        Ex vivo multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist bioassay                               Table 15 continued1 Legend:+ : Decreased activity compared to IL-3, IL-6, SCF, G-CSF See)++ : Equivalent activity as compared to IL-3, IL-6, SCF, and G-CSF ((of literature) Control) (within 20%)+++ : Increased activity compared to IL-3, IL-6, SCF, and G-CSF (see Control) Culture conditions: X-Vivo10 medium, 37 ° C, 5% COTwo, 11 days incubation Option 2 Legend:+ : Decreased activity compared to GM-CSF, TNFa, SCR (control of literature)++ : Equivalent activity compared to GM-CSF, TNFa and SCR ((Literature control) ( Within 20%))+++ : Increased activity compared to GM-CSF, TNFa, SCR (reference in literature) Culture conditions: 100 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml TNFa, 20 ng / ml SCF supplemented IMDM-20 medium, 37 ° C, 5% COTwoMFR for 18-22 days Agonist I = pMON31140 (WO95 / 21197) MFR agonist II = pMON28571 (WO97 / 12985) Hematopoietic ex vivo expansion assay   Human bone marrow CD34+Isolate enriched progenitor cells and evaluate cytokine expansion potential 5 x 10 in X-Vivo10 + 1% HSAFourTest cells in cells / ml Incubated with in and controls. Expand cells, almost 5 days depending on cell growth 5 × 10 in eyesFourPlated again in cells / ml with fresh media and cytokines. On day 10, cells were harvested and characterized. Cells are collected from the plate and 1 × 106 Diluted to a concentration of cells / ml. Measure total cell expansion and cultivate cells with methylcellulose Before and after expansion in CFU (StemCell T technologies, Methocult HCC353 The properties of hematopoietic progenitor cells were analyzed in 4). The expanded cells are also Ligase-specific phenotyping was characterized by itometry: C D11b (PE) / CD15 (FITC), CD34 (FITC), CD41a (FITC). Dendritic cell ex vivo expansion assay   Human bone marrow CD34+To isolate enriched progenitor cells and to assess expansion capacity, IM 2 × 10 in DM / 20% FCSFiveCells / ml with test cytokines and controls The cells were cultured. Cells are expanded and 5 × 10 5 on almost day 5 depending on cell growth.Fourcell Re-plated with fresh media and cytokines / ml. Fine on day 18-22 The vesicles were collected and characterized. Total cell expansion was measured. Expanded cells are lineage specific Phenotyping was characterized by flow cytometry: HLA -DR + (PE) / CD1a + (FITC), CD86 + (PE) / CD1a + (FITC), CD19- (FITC). The dendritic cell expansion ratio was calculated as the total cell expansion ×%. Measured as HLA-DR + / CD1a +. The functional activity of cells is It was measured using the papilla reaction. Washed and irradiated cultured dendritic cells were transferred to 96 well Add stepwise amounts to allogeneic responder peripheral blood mononuclear cells in microtiter plates Added. The ability of dendritic cells to act as antigen presenting cells,ThreeH thymidine uptake It was determined by the degree of stimulated proliferation in the responsive cell preparation as measured by.Example 116 Receptor binding                                  Table 16                             Receptor binding analysis: Data are averaged as "SEM" from at least three experiments measured in triplicate As shown, the experiments were performed only (2) times with pMON32360.   The affinity of the Flt-3 agonist containing the chimeric molecule was determined by receptor binding assay. It was evaluated by a standard method. Flt3-Fc was directly immobilized and BIACORE analysis was performed. , The association constant and the dissociation constantdThe value was calculated. Chimeric molecule and BaF With G-CSF receptor transfected in 3 cells or BHK cells To evaluate the interaction with the "subunit" of the IL-3 receptor expressed in The competitive binding assay was used. A competitive assay using these cells is Use logit-log analysis of dose response curves using strike-specific radioligands And the IC for the competitive chimera50Value.Example 117 In vivo biological activity                                  Table 17        Mouse in vivo multifunctional chimeric hematopoietic receptor agonist measurement data  In C57BL / 6 mice, pMON30247, pMON32342 or pMON MON32360 (150 μg / day) or pMON32191 (200 μg / day) Days) or mouse serum albumin (MSA, 200 μg / day) subcutaneously for 10 days Injected. On day 11, lethal bleeding was performed by cardiac puncture. Whole blood and white blood The ball count was obtained. Peripheral blood leukocytes were subjected to gradient centrifugation (Histopaq ue)) and then ammonium chloride dissolution and red blood cells were removed to obtain. Direct fluorescein or phycoerythrin binding monoclonal antibodies (Falmi For flow cytometry using Pharmingen) Cells were stained. Before staining, non-specific Fc receptor binding was determined by FcBlock (Pharma Pharmingen). FacScan Low cytometer (Becton / Dickinson (Becton / Dick) (inson)). The percentage of positive cells is determined by integration , The number of phenotypes was measured based on WBC measurements. Aseptically collect the tiles of the treated animal Taked and minced in RPMI medium with needle. 5cc syringe plunger Use flat end, then filter through cotton plug to remove lump Thus, a cell suspension was obtained. Red blood cells are removed by lysis of ammonium chloride, and cells are Wash, resuspend, Coulter Counter (Coulter Electronics (Co) (Ultra Electronics)). As mentioned above Cells were prepared for flow cytometry. Phenotypes are positive phenotype and total spleen Expressed as number of cells / spleen based on percent of WBC number. 1.5 × 10FiveSpleen The mouse cytokine w was added to the wells of triplicate measurement of methylcellulose / O Erythropoietin (Stem CellTechs) hnologies)) to obtain a CFU culture. Culture at 10 ° C at 37 ° C. Incubated for days and counted on an inverted microscope. CFU has> 50 cells Defined as a colony of cells. The increase rate of CFU / spleen was measured (CFU total). (Number / spleen of test compound / total number of CFU / spleen of MSA control). Peripheral blood MSA vs. Illumination value is IAb +/ CD11c+And IAb +/ CD8c+About 15 And 347 cells / μl. The MSA control value of spleen WBC was IAb +/ C D11c+And IAb +/ CD8c+For 2 and 1 × 106Cells / spleen Was.   Without further elaboration, it is intended that one skilled in the art use the preceding description to utilize the present invention to its fullest extent. It is considered possible. Therefore, the following preferred embodiments are for illustration only. In no way limit the rest of the disclosure.   Further information on molecular biological methods such as protein purification and bioassays For details, see WO94 / 12639, WO94 / 12638, WO95 / 209. 76, WO95 / 21197, WO95 / 20977, WO95 / 21254 and And WO 96/23888, which are incorporated by reference in their entirety. Hereby incorporated by reference.   All references, patents or applications cited herein are incorporated by reference in their entirety. And incorporated herein by reference as if set forth herein.   Various other examples may depart from the spirit and scope of this specification after reading the present disclosure. It will be apparent to those skilled in the art without doing so. All such other examples are attached It is intended to be included in the claims. (2) Information of SEQ ID NO: 858 (I) Features of the array:       (A) Length: 174 amino acids       (B) type: amino acid       (C) Number of chains: unknown       (D) Topology: unknown (Ii) Sequence type: protein (Ix) Sequence features:       (A) A symbol representing a feature; Modified-site       (B) Location: 1       (D) Other information: Note: Xaa at position 1 is Thr, Ser, Ar g, Tyr or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 2       (D) Other information: / Note = Xaa at position 2 is Pro or Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 3       (D) Other information: / Note = Xaa at position 3 is Leu, Arg, Ty r or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 13       (D) Other information: / Note = Xaa at position 13 is Phe, Ser, H is, Thr or Pro; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 16       (D) Other information: Note: Xaa at position 16 is Lys, Pro, S er, Thr or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 17       (D) Other information: Note: Xaa at position 17 is Cys, Ser, G ly, Ala, Ile, Tyr or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 18       (D) Other information: / Note = Xaa at position 18 is Leu, Thr, P ro, His, Ile or Cys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 22       (D) Other information: / Note = Xaa at position 22 is Arg, Tyr, S er, Thr or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 24       (D) Other information: / Note = Xaa at position 24 is Ile, Pro, T yr or Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 27       (D) Other information: / Note = Xaa at position 27 is Asp or Gly ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 30       (D) Other information: / Note = Xaa at position 30 is Ala, Ile, L eu or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 34       (D) Other information: / Note = Xaa at position 34 is Lys or Ser ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 36       (D) Other information: / Note = Xaa at position 36 is Cys or Ser ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 42       (D) Other information: / Note = Xaa at position 42 is Cys or Ser ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 43       (D) Other information: Note: Xaa at position 43 is His, Thr, G ly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys or Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 44       (D) Other information: / Note = Xaa at position 44 is Pro, Gly, A rg, ASP, Val, Ala, His, Trp, Gln or Thr; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 46       (D) Other information: Note: Xaa at position 46 is Glu, Arg, P he, Arg, Ile or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 47       (D) Other information: Note: Xaa at position 47 is Leu or Thr ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 49       (D) Other information: Note: Xaa at position 49 is Leu, Phe, A rg or Ser (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 50       (D) Other information: Note: Xaa at position 50 is Leu, Ile, H is, Pro or Tyr; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 54       (D) Other information: / Note = Xaa at position 54 is Leu or His ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 64       (D) Other information: / Note = Xaa at position 54 is Cys or Ser ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 67       (D) Other information: / Note = Xaa at position 67 is Gln, Lys, L eu or Cys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 70       (D) Other information: / Note = Xaa at position 70 is Gln, Pro, L eu, Arg or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 74       (D) Other information: / Note = Xaa at position 74 is cys or Ser ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 104       (D) Other information: Note: Xaa at position 104 is Asp, Gly, etc. Or Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 108       (D) Other information: / Note = Xaa at position 108 is Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 115       (D) Other information: Note: Xaa at position 115 is Thr, His, Leu or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 120       (D) Other information: Note: Xaa at position 120 is Gln, Gly, Arg, Lys or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 123       (D) Other information: / Note = Xaa at position 123 is Glu, Arg, Phe or Thr; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 144       (D) Other information: Note: Xaa at position 144 is Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln or Glu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 146       (D) Other information: / Note = Xaa at position 146 is Arg or Gl n; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 147       (D) Other information: / Note = Xaa at position 147 is Arg or Gl n; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 156       (D) Other information: Note: Xaa at position 156 is His or Gly. Or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 159       (D) Other information: Note: Xaa at position 159 is Ser, Arg, Thr, Tyr, Val or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 162       (D) Other information: / Note = Xaa at position 162 is Glu, Leu, Gly or Trp; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 163       (D) Other information: Note: Xaa at position 163 is Val, Gly, Arg or Ala: (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 169       (D) Other information: Note: Xaa at position 169 is Arg, Ser, Leu, Arg or Cys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 170       (D) Other information: / Note: Xaa at position 170 is His or Arg. Or Ser; (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 858(2) Information of SEQ ID NO: 859 (1) Features of array:       (A) Length: 133 amino acids       (B) type: amino acid       (C) Number of chains: single strand       (D) Topology: linear (Ii) Sequence type: protein (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 17       (D) Other information: Note: Xaa at position 17 is Ser, Lys, G ly, Asp, Met, Gln or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 18       (D) Other information: / Note = Xaa at position 18 is Asn, His, L eu, Ile, Phe, Arg or Gln; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 19       (D) Other information: Note: Xaa at position 19 is Met, Phe, I le, Arg, Gly, Ala or Cys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 20       (D) Other information: / Note = Xaa at position 20 is Ile, Cys, G ln, Glu, Arg, Pro or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 21       (D) Other information: / Note = Xaa at position 21 is Asp, Phe, L ys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser or Is Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 22       (D) Other information: / Note = Xaa at position 22 is Glu, Trp, P ro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val or Is Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 23       (D) Other information: Note: Xaa at position 23 is Ile, Val, A la, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 24       (D) Other information: / Note = Xaa at position 24 is Ile, Gly, V al, Arg, ser, phe, Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 25       (D) Other information: Note: Xaa at position 25 is Thr, His, G ly, Gln, Arg, Pro or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 26       (D) Other information: / Note = Xaa at position 26 is His, Thr, P he, Gly, Arg, Ala, Trp; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 27       (D) Other information: / Note = Xaa at position 27 is Leu, Gly, A rg, Thr, Ser or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 28       (D) Other information: / Note = Xaa at position 28 is Lys, Arg, L eu, Gln, Gly, Pro, Val or Trp; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 29       (D) Other information: / Note = Xaa at position 29 is Gln, Asn, L eu, pro, Arg or Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 30       (D) Other information: / Note = Xaa at position 30 is Pro, His, T hr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu or L ...; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 31       (D) Other information: Note: Xaa at position 31 is Pro, Asp, G ly, Ala, Arg, Leu or Gln; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 32       (D) Other information: Note: Xaa at position 32 is Leu, Val, A rg, Gln, Asn, Gly, Ala or Glu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 33       (D) Other information: Note: Xaa at position 33 is Pro, Leu, G ln, Ala, Thr or Glu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 34       (D) Other information: / Note = Xaa at position 34 is Leu, Val, G ly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, I le or Met; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 35       (D) Other information: / Note = Xaa at position 35 is Leu, Ala, G ly, Asn, Pro, Gln or Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 36       (D) Other information: Note: Xaa at position 36 is Asp, Leu or Is Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 37       (D) Other information: / Note = Xaa at position 37 is Phe, Ser, P ro, Trp or Ile; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 38       (D) Other information: / Note = Xaa at position 38 is Asn or Ala ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol representing characteristics: Modified-site       (B) Location: 40       (D) Other information: Note: Xaa at position 40 is Leu, Trp or Is Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 41       (D) Other information: / Note = Xaa at position 41 is Asn, Cys, A rg, Leu, His, Met or Pro; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 42       (D) Other information: / Note = Xaa at position 42 is Gly, Asp, S er, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, T yr, Ile, Met or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 43       (D) Other information: / Note = Xaa at position 43 is Glu, Asn, T yr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, G ly or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 44       (D) Other information: / Note = Xaa at position 44 is Asp, Ser, L eu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, A la or Pro; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 45       (D) Other information: Note: Xaa at position 45 is Gln, Pro, P he, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, A rg, Ser, Ala, Ile, Glu or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 46       (D) Other information: / Note = Xaa at position 46 is Asp, Phe, S er, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, T yr, Ile, Val or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 47       (D) Other information: Note: Xaa at position 47 is Ile, Gly, V al, Ser, Arg, Pro or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 48       (D) Other information: / Note = Xaa at position 48 is Leu, Ser, C ys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, M et, Val or Asn; 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(Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 54       (D) Other information: / Note = Xaa at position 54 is Arg, Asp, I le, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala or Is Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 55       (D) Other information: / Note = Xaa at position 55 is Arg, Thr, V al, Ser, Leu or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 56       (D) Other information: / Note = Xaa at position 56 is Pro, Gly, C ys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, P he, Leu, Val or Lys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 57       (D) Other information: Note: Xaa at position 57 is Asn or Gly ; (Ix) Sequence features:       (A) A symbol representing a feature; Modified-site       (B) Location: 58       (D) Other information: / Note = Xaa at position 58 is Leu, Ser, A sp, Arg, Gln, Val or Cys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 59       (D) Other information: Note: Xaa at position 59 is Glu, Tyr, H is, Leu, Pro or Arg: (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 60       (D) Other information: / Note: Xaa at position 60 is Ala, Ser, P ro, Tyr, Asn or Thr; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 61       (D) Other information: Note: Xaa at position 61 is Phe, ASn, G lu, Pro, Lys, Arg or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 62       (D) Other information: Note: Xaa at position 62 is ASn, His, V al, Arg, Pro, Thr, Asp or Ile; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 63       (D) Other information: / Note = Xaa at position 63 is Arg, Tyr, T rp, Lys, Ser, His, Pro or Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 64       (D) Other information: / Note = Xaa at position 64 is Ala, Asn, P ro, ser or Lys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 65       (D) Other information: / Note = Xaa at position 65 is Val, Thr, P ro, His, Leu, Phe or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 66       (D) Other information: / Note = Xaa at position 66 is Lys, Ile, A rg, Val, Asn, Glu or Ser; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 67       (D) Other information: / Note = Xaa at position 67 is Ser, Ala, P he, Val, Gly, Asn, Ile, Pro or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 68       (D) Other information: / Note = Xaa at position 68 is Leu, Val, T rp, Ser, Ile, Phe, Thr or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 69       (D) Other information: / Note = Xaa at position 69 is Gln, Ala, P ro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly, or L ...; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 70       (D) Other information: Note: Xaa at position 70 is Asn, Leu, V al, Trp, Pro or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 71       (D) Other information: / Note: Xaa at position 71 is Ala, Met, L eu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp or Asn; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 72       (D) Other information: Note: Xaa at position 72 is Ser, Glu, M et, Ala, His, Asn, Arg or Asp; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 73       (D) Other information: / Note = Xaa at position 73 is Ala, Glu, A sp, Leu, Ser, Gly, Thr or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 74       (D) Other information: Note: Xaa at position 74 is Ile, Met, T hr, Pro, Arg, Gly or Ala; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 75       (D) Other information: Note: Xaa at position 75 is Glu, Lys, G ly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln or Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 76       (D) Other information: / Note = Xaa at position 76 is Ser, Val, A la, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly or A ...; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 77       (D) Other information: / Note = Xaa at position 77 is Ile, Ser, A rg, Thr or Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 78       (D) Other information: / Note = Xaa at position 78 is Leu, Ala, S er, Glu, Phe, Gly or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 79       (D) Other information: / Note = Xaa at position 79 is Lys, Thr, A sn, Met, Arg, Ile, Gly or Asp; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 80       (D) Other information: Note: Xaa at position 80 is Asn, Trp, V al, Gly, Thr, Leu, Glu or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 81       (D) Other information: Note: Xaa at position 81 is Leu, Gln, G ly, Ala, Trp, Arg, Val or Lys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 82       (D) Other information: / Note = Xaa at position 82 is Leu, Gln, L ys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, A la, Tyr, Phe, Ile, Met or Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 83       (D) Other information: Note: Xaa at position 83 is Pro, Ala, T hr, Trp, Arg or Met; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 84       (D) Other information: / Note = Xaa at position 84 is Cys, Glu, G ly, Arg, Met or Val; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 85       (D) Other information: / Note = Xaa at position 85 is Leu, Asn, V al or Gln; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 86       (D) Other information: Note: Xaa at position 86 is Pro, Cys, A rg, Ala or Lys; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 87       (D) Other information: / Note = Xaa at position 87 is Leu, Ser, T rp or Gly; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 88       (D) Other information: Note: Xaa at position 88 is Ala, Lys, A rg, Val or Trp; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 89       (D) Other information: / Note = Xaa at position 89 is Thr, Asp, C ys, Leu, Val, Gltl, His, Asn or S ...; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 90       (D) Other information: / Note = Xaa at position 90 is Ala, Pro, S er, Thr, Gly, Asp, Ile or Met; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 91       (D) Other information: / Note = Xaa at position 91 is Ala, Pro, S er, Thr, Phe, Leu, Asp or His; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 92       (D) Other information: / Note = Xaa at position 92 is Pro, Phe, A rg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile or Leu; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 93       (D) Other information: / Note = Xaa at position 93 is Thr, Asp, S er, Asn, Pro, Ala, Leu or Arg; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 94       (D) Other information: Note: Xaa at position 94 is Arg, Ile, S er, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala or Pro ; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 95       (D) Other information: Note: Xaa at position 95 is His, Gln, P ro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, A la, Trp, Phe, Ile or Tyr; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 96       (D) Other information: / Note = Xaa at position 96 is Pro, Lys, T yr, Gly, Ile or Thr; (Ix) Sequence features:       (A) Symbol indicating feature: Modified-site       (B) Location: 97       (D) Other information: / Note = Xaa at position 97 is Ile, Val, L ys, Ala or Asn; 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【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月１日（１９９８．１２．１） 【補正内容】 1. 下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1およびＲ2は、下記群から独立して選択され； （Ｉ）下記式で表わされる修飾ＥＰＯアミノ酸配列を包含するヒトＥＰＯレセ プターアゴニストポリペプチド： 式中、Ｎ−末端からの１〜６アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ア ミノ酸は、上記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失していてもよ く； 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩ）下記式で表わされる修飾幹細胞因子アミノ酸配列を包含する、ヒト幹 細胞因子レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜２３アミノ酸は、上記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチ ドのＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩＩ）下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を包含す る、ヒトｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜７アミノ酸は、上記ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＶ）下記式で表わされる修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり； 位置２のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＬｅｕであり； 位置３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒであり； 位置１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏであり ； 位置１６のＸａａは、Ｌｙｓ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓであり ； 位置１７のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＣｙ ｓであり； 位置２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり ； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 位置２７のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置３０のＸａａは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置３６のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４２のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４３のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ ｌａ、Ａｒｇ、ｃｙｓ、またはＬｅｕであり； 位置４４のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈ ｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒであり； 位置４６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＡｌ ａであり； 位置４７のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり； 位置４９のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり； 位置５０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり ； 位置５４のＸａａは、Ｌｅｕ、またはＨｉｓであり； 位置６４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＣｙｓであり； 位置７０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり ； 位置７４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり； 位置１０８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｙであり； 位置１１５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、またはＡｌａであり； 位置１２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであ り； 位置１２３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＴｈｒであり； 位置１４４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｕであり； 位置１４６のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１４７のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１５６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置１５９のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、またはＧ ｌｙであり； 位置１６２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり； 位置１６３のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり； 位置１６９のＸａａは、Ａｒｇ、ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｙｓであ り； 位置１７０のＸａａは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＳｅｒである； 式中、Ｎ−末端からの１〜１１アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ アミノ酸は、上記修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から欠失していてもよく；そ して 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有することが できるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （Ｖ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポリペプ チド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＴｒＰ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎまた はＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、ｐｈｅ、ｓｅｒ、ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、ＡＳＰ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、ＡＳＰ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、ｓｅｒ、またはＬｙｓであ り； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはｐｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列の Ｃ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の０〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違しており；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩ）下記式で表わされる修飾ヒトｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列を包含 する、ポリペプチド： 式中、 位置１１２のＸａａは、欠失しているか、あるいはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１３のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１４のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１５のＸａａは、欠失しているか、あるいはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩＩ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ま たはＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり；位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ま たはＬｅｕであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであり ； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ．Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであ り； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ −３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； および （ＶＩＩＩ）コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイ キンおよび造血成長因子からなる群から選択される因子； そして 各式中、Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直接に先行されていてもよい； ただしＲ1またはＲ2の少なくとも一方は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ Ｉ）で表わされるポリペプチドから選択される。 2. （補正なし） 3. （補正なし） 4. （補正なし） 5. （補正なし） 6. （補正なし） 7. （補正なし） 8. （補正なし） 9. （補正なし） 10．上記コロニイ刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ ｓｅｒ17、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉ Ｌ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１ ３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ −細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子および幹細胞因子（ＳＣＦ ）からなる群から選択される、請求項１、２または６に記載の造血タンパク質。 11．上記コロニイ刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17、Ｇ−ＣＳ Ｆ Ａｌａ17およびｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）からなる群から選択される、 請求項１０に記載の造血タンパク質。 12．上記請求項１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 13．上記請求項２の造血タンパク質をコードする核酸分子。 14．上記請求項３の造血タンパク質をコードする核酸分子。 15．上記請求項４の造血タンパク質をコードする核酸分子。 16．上記請求項５の造血タンパク質をコードする核酸分子。 17．上記請求項６の造血タンパク質をコードする核酸分子。 18．上記請求項７の造血タンパク質をコードする核酸分子。 19．上記請求項８の造血タンパク質をコードする核酸分子。 20．上記請求項９の造血タンパク質をコードする核酸分子。 21．上記請求項１０の造血タンパク質をコードする核酸分子。 22．上記請求項１１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 23．下記群から選択される、請求項１２に記載の核酸分子： 24．造血タンパク質の製造方法であって、請求項１２、１３、１４、１５、１ ６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３に記載の核酸分子を含有す る複製可能なベクターにより形質転換またはトランスフェクションされたホスト 細胞を、上記造血タンパク質の発現を可能にする方法で、適当な栄養条件下に増 殖させ、次いで上記造血タンパク質を採取する、ことを包含する製造方法。 25．請求項１、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク 質および医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。 26．患者において、造血細胞の産生を刺激する方法であって、有効量の請求項 １、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク質を、上記患 者に投与する段階を包含する方法。 27．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し；次いで （ｂ）上記培養した細胞を採取する、 工程を包含する方法。 28．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し；次いで （ｃ）上記培養した細胞を採取する； 工程を包含する方法。 29．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し； （ｃ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 30．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｅ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 31．ヒト遺伝子治療方法であって、 （ａ）患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）上記造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞中にＤＮＡを導入し； （ｅ）上記形質導入した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記形質導入した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する方法。 32．上記造血細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２７、２８、２９、３０ または３１に記載の方法。 33．上記造血細胞が、末梢血液細胞である、請求項２７、２８、２９、３０、 または３１に記載の方法。 34．樹状細胞の産生方法であって、 （ａ）造血始原細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）またはＣＤ３４＋細 胞を、他の細胞から分離し；次いで （ｂ）上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、請求項１、２、３または４ に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する； 工程を包含する方法。 35．（ｃ）上記培養する造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞に抗原を適用する 工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。 36．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項３４に記載の方法。 37．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項３５に記載の方法。 38．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、請求項 １、２、３または４に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与する段階を包含 する処置方法。 39．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ− ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパク質、および多 機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種または２種以上の 因子を投与することをさらに包含する、請求項３８に記載の方法。 40．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項３８に記載の方 法。 41．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項３９に記載の方 法。 42．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与することによって、 樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を動員し； ｂ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹 状細胞を取り出し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す、 段階を包含する処置方法。 43．段階ａ）において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合 タンパク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、 １種または２種以上の因子を投与することをさらに包含する、請求項４２に記載 の方法。 44．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４２に記載の方法。 45．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４３に記載の方法。 46．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４４に記載の方法。 47．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦＮ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タ ンパク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１ 種または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４５に記載の方法。 48．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記ヒトから造血始原細胞またはＣ Ｄ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し；次いで ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻す； 段階を包含する処置方法。 49．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記患者から上記造血始原細胞また はＣＤ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す； 段階を包含する処置方法。 50．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。 51．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。 52．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 53．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 54．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 55．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５１に記載の方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] December 1, 1998 (1998.12.1) [Correction contents]   1. a hematopoietic protein comprising an amino acid sequence represented by the following formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1   In each formula, R1And RTwoIs independently selected from the following groups:   (I) a human EPO receptor containing a modified EPO amino acid sequence represented by the following formula: Puter agonist polypeptide:   Wherein 1-6 amino acids from the N-terminus and / or 1-5 amino acids from the C-terminus The amino acid may be deleted from the EPO receptor agonist polypeptide. ;   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And a phosphorus having a novel C-terminus and an N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Car (LTwo) Via the C-terminus:  (II) a human stem comprising a modified stem cell factor amino acid sequence represented by the following formula: Cell factor receptor agonist polypeptides:  In the formula, 1 to 23 amino acids are the stem cell factor receptor agonist polypeptide May be deleted from the C-terminus of the   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And phosphorus having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Car (LTwo) Via the C-terminus:  (III) a modified flt-3 ligand amino acid sequence represented by the following formula: A human flt-3 receptor agonist polypeptide:   Wherein 1 to 7 amino acids are the above flt-3 receptor agonist polypeptides May be deleted from the C-terminus of   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:  (IV) a polypeptide comprising a modified human G-CSF amino acid sequence represented by the following formula: Ripeptide:   Where:   Xaa at position 1 is Thr, Ser, Arg, Tyr, or Gly; Xaa at position 2 is Pro or Leu;   Xaa at position 3 is Leu, Arg, Tyr, or Ser;   Xaa at position 13 is Phe, Ser, His, Thr, or Pro ;   Xaa at position 16 is Lys, pro, ser, Thr, or His ;   Xaa at position 17 is Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Leu, Thr, Pro, His, Ile, or Cy. s;   Xaa at position 22 is Arg, Tyr, Ser, Thr, or Ala ;   Xaa at position 24 is Ile, Pro, Tyr, or Leu;   Xaa at position 27 is Asp or Gly;   Xaa at position 30 is Ala, Ile, Leu, or Gly;   Xaa at position 34 is Lys or Ser;   Xaa at position 36 is Cys or Ser;   Xaa at position 42 is Cys or Ser;   Xaa at position 43 is His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, A la, Arg, cys, or Leu;   Xaa at position 44 is Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, H is, Trp, Gln, or Thr;   Xaa at position 46 is Glu, Arg, Phe, Arg, Ile, or Al. a;   Xaa at position 47 is Leu or Thr;   Xaa at position 49 is Leu, Phe, Arg, or Ser;   Xaa at position 50 is Leu, Ile, His, Pro, or Tyr. ;   Xaa at position 54 is Leu or His;   Xaa at position 64 is Cys or Ser;   Xaa at position 67 is Gln, Lys, Leu, or Cys;   Xaa at position 70 is Gln, Pro, Leu, Arg, or Ser. ;   Xaa at position 74 is Cys or Ser;   Xaa at position 104 is Asp, Gly, or Val;   Xaa at position 108 is Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln, Or Gly;   Xaa at position 115 is Thr, His, Leu, or Ala;   Xaa at position 120 is Gln, Gly, Arg, Lys, or His. R;   Xaa at position 123 is Glu, Arg, Phe, or Thr;   Xaa at position 144 is Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln, Or Glu;   Xaa at position 146 is Arg or Gln;   Xaa at position 147 is Arg, or Gln;   Xaa at position 156 is His, Gly, or Ser;   Xaa at position 159 is Ser, Arg, Thr, Tyr, Val, or G. ly;   Xaa at position 162 is Glu, Leu, Gly, or Trp;   Xaa at position 163 is Val, Gly, Arg, or Ala;   Xaa at position 169 is Arg, ser, Leu, Arg, or Cys. R;   Xaa at position 170 is His, Arg, or Ser;   Where 1-11 amino acids from the N-terminus and / or 1-5 amino acids from the C-terminus Amino acids may be deleted from the modified human G-CSF amino acid sequence; do it   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a new C-terminus and an N-terminus at the following amino acid sites, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus: (V) a polypep containing a modified human IL-3 amino acid sequence represented by the following formula: Chid:  Where:   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, G lu, Gln, Asn, Thr, Ser, or Val;   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, A sp, Asn, Gln, Leu, Val, or Gly;   Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, TrP, Lys, P he, Leu, Ser, or Arg;   Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, ser, or Al. a;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, V al, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Va. l;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, S er, Leu, or Lys;   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, A la or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Gl. u;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, G ln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile, or Met;   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln or Is Val;   Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val;   Xaa at position 37 is phe, ser, pro, Trp, or Ile. ;   Xaa at position 38 is Asn, or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, ASP, Ser, Cys, Asn, Lys, T hr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met, or Al a;   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, A la, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, or Ser;   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, M et, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, or Pro;   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, T hr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu, or His;   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, A sn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, or Gl y;   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, or Or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, P he, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, or Asn ;   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, H is, or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, A sn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, or Gl n;   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or Or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, L ys, Ser, or Met;   Xaa at position 54 is Arg, ASP, Ile, Ser, Val, Thr, G ln, Asn, Lys, His, Ala, or Leu;   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gl. y;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, A rg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, or Ly s;   Xaa at position 57 is Asn, or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Ar. g;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Th. r;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, A sp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, P ro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, ser, or Lys. R;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Or Ser;   Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Or Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, I le, Pro, or His;   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, T hr, or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, T rp, Gly, or Leu;   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Al a;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, T hr, Gln, Trp, or Asn;   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, A rg, or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, T hr, or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, A la;   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, A rg, ser, Gln, or Leu;   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, P ro, Gly, or Asp;   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu ;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, G ly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, G lu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, V al, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, G lu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val;   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Me. t;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Va. l;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln;   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys ;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp. ;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, H is, Asn, or Ser;   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, I le or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, A sp, or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, A la, Gly, Ile, or Leu;   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, L eu, or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, G ln, Lys, His, Ala, or Pro;   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, G ly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr;   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Th. r;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn. ;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, T hr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr, or Pro;   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, G ln, Gly, Ser, Phe, or His;   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or pro;   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln;   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, Or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly;   Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His;   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro;   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, or Pro;   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly;   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp;   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met. R;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe;   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn;   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, Or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met;   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile;   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, Or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr;   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg;   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, Or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly;   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys;   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr or Leu;   Wherein the 1-14 amino acids are the N-terminal of the modified human IL-3 amino acid sequence And / or 1-15 amino acids may comprise the modified human IL-3 amino acid sequence May be deleted from the C-terminus; and   Wherein 0 to 44 of the amino acids represented by Xaa correspond to the natural (1-133) ) Differs from the corresponding amino acid of human interleukin-3;   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:   (VI) a modified human c-mpl ligand amino acid sequence represented by the following formula: The polypeptide:  Where:   Xaa at position 112 is missing or Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp, or Met;   Xaa at position 113 is missing or Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, or Met;   Xaa at position 114 is deleted or Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, or Met;   Xaa at position 115 is missing or Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, or Asn; and   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:  (VII) a polypeptide containing a modified human IL-3 amino acid sequence represented by the following formula: Ripeptide:  Where:   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, G lu, Gln, Asn, Thr, Ser, or Val;   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, A sp, Asn, Gln, Leu, Val, or Gly;   Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, P he, Leu, ser, or Arg;   Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Al. a;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, V al, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Va. l;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, S er, Leu, or Lys;   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, A la or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Gl. u;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, G ln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile, or Met;   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln, or Or Val;   Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val;   Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile ;   Xaa at position 38 is Asn, or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, T hr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met, or Al a;   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, A la, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, or Ser;   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, M et, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, or Pro;   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, T hr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu, or His;   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, A sn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, or Gl y;   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, pro, or Or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, P he, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, or Asn ;   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, H is, or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, A sn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, or Gl n;   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or Or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, L ys, Ser or Met; Xaa at position 54 is Arg, Asp, I le, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala, Ma Or Leu;   Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, G ln, Asn, Lys, His, Ala, or Leu;   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gl. y;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, A rg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, or Ly s;   Xaa at position 57 is Asn, or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Ar. g;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Th. r;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, A sp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, P ro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser, or Lys. ;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Or Ser;   Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Or Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, I le, pro, or His;   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, T hr, or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, T rp, Gly, or Leu;   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Al a;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg. Glu, T hr, Gln, Trp, or Asn;   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, A rg, or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, T hr, or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, A la;   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, A rg, Ser, Gln, or Leu;   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, P ro, Gly, or Asp;   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu. R;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, G ly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, G lu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, V al, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, G lu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val;   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Me. t;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Va. l;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln;   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys ;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp. ;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, H is, Asn, or Ser;   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, I le or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, A sp, or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, A la, Gly, Ile, or Leu;   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, L eu, or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, G ln, Lys, His, Ala, or Pro;   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, G ly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr;   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Th. r;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn. ;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, T hr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr, or Pro;   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, G ln, Gly, Ser, Phe, or His;   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro;   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln;   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, Or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly;   Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His;   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro;   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, or Pro;   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly;   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp;   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met. R;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe;   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn;   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, Or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met;   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile;   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, Or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr;   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg;   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, Or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, pro, Lys, Asp, or Gly;   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys;   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr or Leu;   Wherein the 1-14 amino acids are the N-terminal of the modified human IL-3 amino acid sequence And / or from 1 to 15 amino acids may be modified from the modified human IL -3 amino acid sequence may be deleted from the C-terminus; and   Wherein the amino acids 1-44 represented by Xaa correspond to the natural (1-133) ) Differs from the corresponding amino acid of human interleukin-3; and   (VIII) Colony stimulating factor, cytokine, lymphokine, interleukin A factor selected from the group consisting of kins and hematopoietic growth factors; And   In each formula, L1Is R1To RTwoA linker that can be attached to   If desired, the hematopoietic protein may be (methionine-1), (Alanine-1) Or (Methionine-2, Alanine-1) May be preceded directly by   Where R1Or RTwoAt least one of the formula (I), (II) or (II) It is selected from the polypeptides represented by I).   2. (no correction)   3. (no correction)   4. (no correction)   5. (no correction)   6. (no correction)   7. (no correction)   8. (no correction)   9. (no correction)   Ten. The colony stimulating factor is GM-CSF, G-CSF, G-CSF ser17, C-mpl ligand (TPO), M-CSF, erythropoietin ( EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, I L-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-1 3, IL-15, LIF, flt3 / flk2 ligand, human growth hormone, B Cell growth factor, B-cell differentiation factor, eosinophil differentiation factor and stem cell factor (SCF The hematopoietic protein according to claim 1, 2 or 6, which is selected from the group consisting of:   11． The colony stimulating factor is G-CSF, G-CSF Ser17, G-CS F Ala17And c-mpl ligand (TPO). The hematopoietic protein according to claim 10.   12． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 1.   13. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 2.   14. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 3.   15． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 4.   16． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 5.   17． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 6.   18． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 7.   19. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 8.   20. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 9.   twenty one. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 10.   twenty two. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 11.   twenty three. 13. The nucleic acid molecule of claim 12, selected from the following group:   twenty four. A method for producing a hematopoietic protein, comprising the steps of: 6. A nucleic acid molecule according to 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, or 23. Host transformed or transfected with a replicable vector Cells are expanded under appropriate nutrient conditions in a manner that allows expression of the hematopoietic proteins. And producing the hematopoietic protein.   twenty five. The hematopoietic protein according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 or 10. A pharmaceutical composition comprising a quality and a pharmaceutically acceptable carrier.   26. A method for stimulating hematopoietic cell production in a patient, comprising the steps of: The hematopoietic protein according to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 or 10, Administering to a subject.   27. A method of selectively ex vivo expanding hematopoietic cells,   (A) using the culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1, Culturing; then   (B) collecting the cultured cells, A method comprising the steps of:   28. A method of selectively ex vivo expanding hematopoietic cells,   (A) separating hematopoietic cells from other cells;   (B) a culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Culturing blood cells; then   (C) collecting the cultured cells; A method comprising the steps of:   29. A method for treating a patient having a hematopoietic disorder,   (A) removing hematopoietic cells from the patient;   (B) using the culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1, Culturing;   (C) harvesting the cultured cells;   (D) transplanting the cultured cells into the patient; A treatment method comprising a step.   30. A method for treating a patient having a hematopoietic disorder,   (A) removing hematopoietic cells from the patient;   (B) separating hematopoietic cells from other cells;   (C) a culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Culturing blood cells;   (D) harvesting the cultured cells;   (E) transplanting the cultured cells into the patient; A treatment method comprising a step.   31. A method of human gene therapy,   (A) removing hematopoietic cells from the patient;   (B) separating the hematopoietic cells from other cells;   (C) a culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Culturing blood cells;   (D) introducing DNA into the cultured cells;   (E) harvesting the transduced cells;   (D) transplanting the transduced cells into the patient; A method comprising steps.   32. 31. The hematopoietic cell is a CD34 + cell. Or the method of 31.   33. 29. The hematopoietic cell is a peripheral blood cell. Or the method of 31.   34. A method for producing dendritic cells, comprising:   (A) Hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells Vesicles are separated from other cells;   (B) The hematopoietic progenitor cell or CD34 + cell according to claim 1, 2, 3, or 4. Culturing in a growth medium containing the hematopoietic protein described in 1). A method comprising the steps of:   35. (C) Applying an antigen to hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells to be cultured 35. The method of claim 34, further comprising the step of:   36. The growth medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion tan One selected from the group consisting of protein, and a multifunctional receptor agonist 35. The method of claim 34, wherein the method further comprises two or more factors.   37. The growth medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion tan One selected from the group consisting of protein, and a multifunctional receptor agonist Or the method of claim 35, further comprising two or more factors.   38. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease, comprising: Administering the hematopoietic protein according to 1, 2, 3 or 4 to the human. Treatment method to do.   39. GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SCF), flt- Triligands, IL-3, IL-3 variants, IL-3 variant fusion proteins, and multiple One or more selected from the group consisting of functional receptor agonists 39. The method of claim 38, further comprising administering the agent.   40. 39. The method of claim 38, further comprising administering an antigen to said patient. Law.   41. 40. The method of claim 39, further comprising administering an antigen to said patient. Law.   42. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease,   a) administering the hematopoietic protein of claim 1 to the human; Recruit dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells;   b) the above dendritic cell precursor cells or mature tree by blood sweep or pheresis; Removing the dendritic cells;   c) applying an antigen to said dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells;   d) returning the dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells to which the antigen has been applied to the human. You A treatment method comprising a step.   43. In step a), GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor ( SCF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion Selected from the group consisting of proteins, and multifunctional receptor agonists, 43. The method of claim 42, further comprising administering one or more factors. the method of.   44. 2. The dendritic cell precursor cell or mature dendritic cell from step b) according to claim 1, Culturing in a growth medium containing the hematopoietic protein according to 2, 3, or 4. 43. The method of claim 42, further comprising:   45. 2. The dendritic cell precursor cell or mature dendritic cell from step b) according to claim 1, Culturing in a growth medium containing the hematopoietic protein according to 2, 3, or 4. 44. The method of claim 43, further comprising:   46. The growth medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion tan One selected from the group consisting of protein, and a multifunctional receptor agonist 45. The method of claim 44, wherein the method further comprises two or more factors.   47. The growth medium is GM-CSFN, IL-4, TNF-α, stem cell factor ( SCF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion 1 selected from the group consisting of proteins, and multifunctional receptor agonists. 46. The method of claim 45, further comprising a species or two or more factors.   48. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease,   a) Hematopoietic progenitor cells or C from said human by blood sweep or pheresis Removing D34 + cells;   b) a growth medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Progenitor cells or CD34 + cells are cultured and dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells Produces; then   c) returning said dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells to said human; A treatment method comprising a step.   49. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease,   a) the hematopoietic progenitor cells or Removes CD34 + cells;   b) a growth medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Progenitor cells or CD34 + cells are cultured and dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells To produce;   c) applying an antigen to said dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells;   d) returning the dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells to which the antigen has been applied to the human. You; A treatment method comprising a step.   50. Prior to culture, hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells are separated from other cells. 49. The method of claim 48, further comprising the step of releasing.   51. Prior to culture, hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells are separated from other cells. 50. The method of claim 49, further comprising the step of releasing.   52. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 51. The method of claim 50, further comprising one or more factors.   53. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 51. The method of claim 50, further comprising one or more factors.   54. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 51. The method of claim 50, further comprising one or more factors.   55. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 52. The method of claim 51, further comprising one or more factors.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 14/52 14/52 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フェン，イーキン アメリカ合衆国ミズーリ，セントルイス, ミッション コート 423 (72)発明者 マッキャーン，ジョン，ピー. アメリカ合衆国ミズーリ，ワイルドウッ ド，バブラー メドウズ ドライブ 18612 (72)発明者 サマーズ，ニーナ，エル. アメリカ合衆国ミズーリ，セントチャール ズ，サドルメイカー 1203 (72)発明者 スタテン，ニコラス，アール. アメリカ合衆国ミズーリ，セントルイス, クイーン アン プレース 859 (72)発明者 ストリーター，フィリップ，アール. アメリカ合衆国ミズーリ，グレンコー，ポ ンド ロード 1555 (72)発明者 マイナリイ，ジョン，シー. アメリカ合衆国ミズーリ，セントルイス, ブリストルコーン コート 5824 (72)発明者 ミンスター，ナンシイ，アイ. アメリカ合衆国ミズーリ，チェスターフィ ールド，クラークソン ウッズ 16080 (72)発明者 ウオルフ，スーザン，エル. アメリカ合衆国ミズーリ，ボールウイン, ウッドモア オークス ドライブ 1719──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 7/06 A61P 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 37/02 C07K 14/475 C07K 14/475 14/52 14/52 C12P 21/02 C C12P 21/02 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH) , KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC , LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Fen, Ekin Missouri, United States of America, St. Louis, Mission Court 423 (72) Inventor McCann, John, P. Missouri, USA , Wildwood, Bubbler Meadows Drive 18612 (72) Inventor Summers, Nina, El. Saddlemaker, Missouri, St. Charles, USA 1203 (72) Inventor Staten Nicholas, Earl. United States Missouri, St. Louis, Queen Anne Place 859 (72) Inventor Streeter, Philip, Earl. United States Missouri, Glencoe, Pond Road 1555 (72) Inventor Minary, John, Sea. Bristol Cone Court 5824 (72) Minster, Nancy, I. Inventor, Missouri, Chesterfield, United States, Clarkson Woods 16080 (72) Inventor, Wolf, Susan, El. Missouri, United States, Ballwin, Woodmore Oaks Drive 1719

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1. 下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1およびＲ2は、下記群から独立して選択され； （Ｉ）下記式で表わされる修飾ＥＰＯアミノ酸配列を包含するヒトＥＰＯレセ プターアゴニストポリペプチド： 式中、Ｎ−末端からの１〜６アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ア ミノ酸は、上記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失していてもよ く、 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩ）下記式で表わされる修飾幹細胞因子アミノ酸配列を包含する、ヒト幹 細胞因子レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜２３アミノ酸は、上記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチ ドのＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ る、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリ ンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩＩ）下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を包含す る、ヒトｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜７アミノ酸は、上記ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＶ）下記式で表わされる修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり； 位置２のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＬｅｕであり； 位置３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒであり； 位置１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏであり ； 位置１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓであり ； 位置１７のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＣｙ ｓであり； 位置２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり ； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 位置２７のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置３０のＸａａは、Ａｈａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置３６のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４２のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４３のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ ｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはＬｅｕであり； 位置４４のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈ ｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒであり； 位置４６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＡｌ ａであり； 位置４７のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり： 位置４９のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり； 位置５０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり ； 位置５４のＸａａは、Ｌｅｕ、またはＨｉｓであり； 位置６４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＣｙｓであり； 位置７０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり ； 位置７４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり； 位置１０８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｙであり； 位置１１５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、またはＡｌａであり； 位置１２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであ り； 位置１２３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＴｈｒであり； 位置１４４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｕであり； 位置１４６のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１４７のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１５６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置１５９のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、またはＧ ｌｙであり； 位置１６２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり； 位置１６３のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり； 位置１６９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｙｓであ り； 位置１７０のＸａａは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＳｅｒである； 式中、Ｎ−末端からの１〜１１アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ アミノ酸は、上記修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から欠失していてもよく；そ して 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有することが できるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （Ｖ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポリペ プチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｈａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎまた はＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａsn、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙs、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであ り； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり： 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｉｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｐｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列の Ｃ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の０〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違しており；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩ）下記式で表わされる修飾ヒトｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列を包含 する、ポリペプチド：式中 位置１１２のＸａａは、欠失しているか、あるいはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１３のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１４のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１５のＸａａは、欠失しているか、あるいはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩＩ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ま たはＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであり ； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅt、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅr、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ,、Ｇｌｕ、 Ｈｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり： 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｉｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 ｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ −３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； および （ＶＩＩＩ）コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイ キンおよび造血成長因子からなる群から選択される因子； そして 各式中、Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されていてもよい； ただしＲ1またはＲ2の少なくとも一方は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ Ｉ）で表わされるポリペプチドから選択される、そして、 2. 下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1およびＲ2は、下記群から独立して選択され； （Ｉ）下記式で表わされる修飾ＥＰＯアミノ酸配列を包含する、ヒトＥＰＯレ セプターアゴニストポリペプチド： 式中、Ｎ−末端からの１〜６アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ア ミノ酸は、上記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失していてもよ く；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩ）下記式で表わされる修飾幹細胞因子アミノ酸配列を包含する、ヒト幹 細胞因子レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜２３アミノ酸は、上記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチ ドのＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩＩ）下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を包含す る、ヒトｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜７アミノ酸は、ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチドのＣ −末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＶ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポリ ペプチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎまた はＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｒ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙs、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであり ； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ −３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； （Ｖ）コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキンお よび造血成長因子からなる群から選択される因子； そして 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； 各式中、上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1 ）または（メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されているいてもよい ； ただしＲ1またはＲ2の少なくとも一方は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ Ｉ）で表わされるポリペプチドから選択される。 3. （ＩＶ）のポリペプチドが、下記群から選択される、請求項２に記載の造 血タンパク質： 4．下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1は、下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を 包含するポリペプチドであり： 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： 各式中、Ｒ2は、下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含す るポリペプチドであり： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅt、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒp、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、ＩＩｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、ＩＩｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅr、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ま たはＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ，Ｇ ｌｎ，Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅr、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＨｉＳ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであ り； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、また はＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＴｒＰ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｒＰ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅt、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、ＡｓnNＰｒo,．Ａｌａ）Ｐｈe,．Ｓｅr,．Ｔｒｐ）Ｇ ｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、ＨｉＳ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、ＨｉＳ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトインターロイキン−３アミノ酸配列 のＮ−末端から削除欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、 上記修飾ヒトインターロイキン−３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していても よく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； そして 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； そして 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直接に先行されているいてもよい。 5．Ｒ2が、下記群から選択される、請求項４に記載の造血タンパク質： 6．下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する、造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1は、下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を 包含するポリペプチドであり： 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合しており： 各式中、Ｒ2は、コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インター ロイキンおよび造血成長因子からなる群から選択される因子であり； 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； そして 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）また は（メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されていてもよい。 7．下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1は、下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を 包含する、ポリペプチドであり： 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合しており： 各式中、Ｒ2は、下記式で表わされる修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を包含 するポリペプチドであり： 式中、 位置１のＸａａは、Ｔｈr、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり； 位置２のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＬｅｕであり； 位置３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒであり； 位置１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏであり ； 位置１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓであり ； 位置１７のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＣｙ ｓであり； 位置２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり ； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 位置２７のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置３０のXａａは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置３６のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４２のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４３のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ ｌａ、Ａｒｇ、ｃｙｓ、またはＬｅｕであり； 位置４４のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈ ｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒであり； 位置４６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＡｌ ａであり； 位置４７のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり； 位置４９のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり； 位置５０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり ； 位置５４のＸａａは、Ｌｅｕ、またはＨｉｓであり； 位置６４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＣｙｓであり； 位置７０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり ； 位置７４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり； 位置１０８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｙであり； 位置１１５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、またはＡｌａであり； 位置１２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであ り； 位置１２３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＴｈｒであり； 位置１４４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｕであり； 位置１４６のＸａａは、Ａｒ−ｇ、またはＧｌｎであり； 位置１４７のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１５６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置１５９のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、またはＧ ｌｙであり； 位置１６２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり； 位置１６３のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり； 位置１６９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｙｓであ り； 位置１７０のＸａａは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＳｅｒである； 式中、Ｎ−末端からの１〜１１アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ アミノ酸は、上記修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から欠失していてもよく；そ して 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合しており： 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； そして 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されているいてもよい。 8．上記リンカー（Ｌ2）が下記群から選択される、請求項１、２、３、４、５ 、６または７に記載の造血タンパク質： 9．上記タンパク質が、下記群から選択される、請求項１に記載の造血タンパ ク質： 11．上記コロニイ刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦＮＧ−ＣＳＦｓｅｒ17 、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７ 、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉ Ｌ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞 成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子および幹細胞因子（ＳＣＦ）から なる群から選択される、請求項１、２または６に記載の造血タンパク質。 12．上記コロニイ刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17、Ｇ−ＣＳ Ｆ Ａｌａ17およびｃ−mplリガンド（ＴＰＯ）からなる群から選択される、請 求項１１に記載の造血タンパク質。 13．上記請求項１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 14．上記請求項２の造血タンパク質をコードする核酸分子。 15．上記請求項３の造血タンパク質をコードする核酸分子。 16．上記請求項４の造血タンパク質をコードする核酸分子。 17．上記請求項５の造血タンパク質をコードする核酸分子。 18．上記請求項６の造血タンパク質をコードする核酸分子。 19．上記請求項７の造血タンパク質をコードする核酸分子。 20．上記請求項８の造血タンパク質をコードする核酸分子。 21．上記請求項９の造血タンパク質をコードする核酸分子。 22．上記請求項１０の造血タンパク質をコードする核酸分子。 23．上記請求項１１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 24．下記群から選択される、請求項１３に記載の核酸分子： 25．造血タンパク質の製造方法であって、請求項１３、１４、１５、１６、１ ７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４に記載の核酸分子を含有す る複製可能なベクターにより形質転換またはトランスフェクションされたホスト 細胞を、上記造血タンパク質の発現を可能にする方法で、適当な条件下に増殖さ せ、次いで上記造血タンパク質を採取する、ことを包含する製造方法。 26．請求項１、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク 質および医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。 27．患者において、造血細胞の産生を刺激する方法であって、有効量の請求項 １、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク質を、上記患 者に投与する段階を包含する方法。 28．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し；次いで （ｂ）上記培養した細胞を採取する、 工程を包含する方法。 29．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し；次いで （ｃ）上記培養した細胞を採取する； 工程を包含する方法。 30．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し； （ｃ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 31．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｅ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 32．ヒト遺伝子治療方法であって、 （ａ）患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）上記造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞中にＤＮＡを導入し； （ｅ）上記形質導入した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記形質導入した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する方法。 33．上記造血細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２８、２９、３０、３１ または３２に記載の方法。 34．上記造血細胞が、末梢血液細胞である、請求項２８、２９、または３０、 ３１または３２に記載の方法。 35．樹状細胞の産生方法であって、 （ａ）造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、他の細胞から分離し；次いで （ｂ）上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、請求項１、２、３または４ に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する； 工程を包含する方法。 36．（ｃ）上記培養する造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞に抗原を適用する 工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。 37．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、IL−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項３５に記載の方法。 38．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項３６に記載の方法。 39．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、請求項 １、２、３または４に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与する段階を包含 する処置方法。 40．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ− ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパク質、および多 機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種または２種以上の 因子を投与することをさらに包含する、請求項３９に記載の方法。 41．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項３９に記載の方 法。 42．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項４０に記載の方 法。 43．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与することによって、 樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を動員し； ｂ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹 状細胞を取り出し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す、 段階を包含する処置方法。 44．段階ａ）において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タ ンパク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１ 種または２種以上の因子を投与することをさらに包含する、請求項４３に記載の 方法。 45．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４３に記載の方法。 46．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４４に記載の方法。 47．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦＮＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４５に記載の方法。 48．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４６に記載の方法。 49．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記ヒトから造血始原細胞またはＣ Ｄ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し；次いで ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻す； 段階を包含する処置方法。 50．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記患者から上記造血始原細胞また はＣＤ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す； 段階を包含する処置方法。 51．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。 52．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。 53．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５１に記載の方法。 54．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 55．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５１に記載の方法。 56．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５２に記載の方法。[Claims]   1. a hematopoietic protein comprising an amino acid sequence represented by the following formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1   In each formula, R1And RTwoIs independently selected from the following groups:   (I) a human EPO receptor containing a modified EPO amino acid sequence represented by the following formula: Puter agonist polypeptide:   Wherein 1-6 amino acids from the N-terminus and / or 1-5 amino acids from the C-terminus The amino acid may be deleted from the EPO receptor agonist polypeptide. And   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And phosphorus having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Car (LTwo) Via the C-terminus:  (II) a human stem comprising a modified stem cell factor amino acid sequence represented by the following formula: Cell factor receptor agonist polypeptides:  In the formula, 1 to 23 amino acids are the stem cell factor receptor agonist polypeptide May be deleted from the C-terminus of the   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And each having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions: Anchor (LTwo) Via the C-terminus:  (III) a modified flt-3 ligand amino acid sequence represented by the following formula: A human flt-3 receptor agonist polypeptide:   Wherein 1 to 7 amino acids are the above flt-3 receptor agonist polypeptides May be deleted from the C-terminus of   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:   (IV) a polypeptide comprising a modified human G-CSF amino acid sequence represented by the following formula: Ripeptide:   Where:   Xaa at position 1 is Thr, Ser, Arg, Tyr, or Gly;   Xaa at position 2 is Pro or Leu;   Xaa at position 3 is Leu, Arg, Tyr, or Ser;   Xaa at position 13 is Phe, Ser, His, Thr, or Pro ;   Xaa at position 16 is Lys, Pro, Ser, Thr, or His ;   Xaa at position 17 is Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Leu, Thr, Pro, His, Ile, or Cy. s;   Xaa at position 22 is Arg, Tyr, Ser, Thr, or Ala ;   Xaa at position 24 is Ile, Pro, Tyr, or Leu;   Xaa at position 27 is Asp or Gly;   Xaa at position 30 is Aha, Ile, Leu, or Gly;   Xaa at position 34 is Lys or Ser;   Xaa at position 36 is Cys or Ser;   Xaa at position 42 is Cys or Ser;   Xaa at position 43 is His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, A la, Arg, Cys, or Leu;   Xaa at position 44 is Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, H is, Trp, Gln, or Thr;   Xaa at position 46 is Glu, Arg, Phe, Arg, Ile, or Al. a;   Xaa at position 47 is Leu or Thr:   Xaa at position 49 is Leu, Phe, Arg, or Ser;   Xaa at position 50 is Leu, Ile, His, Pro, or Tyr. ;   Xaa at position 54 is Leu or His;   Xaa at position 64 is Cys or Ser;   Xaa at position 67 is Gln, Lys, Leu, or Cys;   Xaa at position 70 is Gln, Pro, Leu, Arg, or Ser. ;   Xaa at position 74 is Cys or Ser;   Xaa at position 104 is Asp, Gly, or Val;   Xaa at position 108 is Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln, Or Gly;   Xaa at position 115 is Thr, His, Leu, or Ala;   Xaa at position 120 is Gln, Gly, Arg, Lys, or His. R;   Xaa at position 123 is Glu, Arg, Phe, or Thr;   Xaa at position 144 is Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln, Or Glu;   Xaa at position 146 is Arg or Gln;   Xaa at position 147 is Arg, or Gln;   Xaa at position 156 is His, Gly, or Ser;   Xaa at position 159 is Ser, Arg, Thr, Tyr, Val, or G. ly;   Xaa at position 162 is Glu, Leu, Gly, or Trp;   Xaa at position 163 is Val, Gly, Arg, or Ala;   Xaa at position 169 is Arg, Ser, Leu, Arg, or Cys. R;   Xaa at position 170 is His, Arg, or Ser;   Where 1-11 amino acids from the N-terminus and / or 1-5 amino acids from the C-terminus Amino acids may be deleted from the modified human G-CSF amino acid sequence; do it   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a new C-terminus and an N-terminus at the following amino acid sites, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:   (V) a polypeptide comprising a modified human IL-3 amino acid sequence represented by the following formula: Pseudo:  Where:   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, G lu, Gln, Asn, Thr, Ser, or Val;   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, A sp, Asn, Gln, Leu, Val, or Gly;   Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, P he, Leu, Ser, or Arg;   Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Al. a;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, V al, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Va. l;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, S er, Leu, or Lys;   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, A la or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Gl. u;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, G ln, Thr, Arg, Aha, Phe, Ile, or Met;   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln or Is Val;   Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val;   Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile ;   Xaa at position 38 is Asn, or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, T hr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met, or Al a;   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, A la, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, or Ser;   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, M et, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, or Pro;   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, T hr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu, or His;   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, A sn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, or Gl y;   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, or Or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, P he, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, or Asn ;   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, H is, or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, A sn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, or Gl n;   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or Or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, L ys, Ser, or Met;   Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, G ln, Asn, Lys, His, Ala, or Leu;   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gl. y;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, A rg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, or Ly s;   Xaa at position 57 is Asn, or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Ar. g;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Th. r;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, A sp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, P ro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser, or Lys. R;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Or Ser;   Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Or Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, I le, Pro, or His;   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, T hr, or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, T rp, Gly, or Leu;   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Al a;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, T hr, Gln, Trp, or Asn;   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, A rg, or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, T hr, or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, A la;   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, A rg, Ser, Gln, or Leu;   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, P ro, Gly, or Asp;   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu ;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, G ly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, G lu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, V al, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, G lu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val;   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Me. t;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Va. l;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln:   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys ;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp. ;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, H is, Asn, or Ser;   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, I le or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, A sp, or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, A la, Gly, Ile, or Leu;   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, L eu, or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, G ln, Lys, His, Ala, or Pro;   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, G ly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr;   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Th. r;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn. ;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, T hr, Giu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr, or Pro;   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, G ln, Gly, Ser, Phe, or His;   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro;   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln;   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, Or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly;   Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His;   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro;   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Aps, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, or Pro;   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly;   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp;   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met. R;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe;   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn;   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, Or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met;   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile;   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, Or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr;   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg;   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, Or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly;   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys;   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr or Leu;   Wherein the 1-14 amino acids are the N-terminal of the modified human IL-3 amino acid sequence And / or 1-15 amino acids may comprise the modified human IL-3 amino acid sequence May be deleted from the C-terminus; and   Wherein 0 to 44 of the amino acids represented by Xaa correspond to the natural (1-133) ) Differs from the corresponding amino acid of human interleukin-3;   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:   (VI) a modified human c-mpl ligand amino acid sequence represented by the following formula: The polypeptide:In the formula   Xaa at position 112 is missing or Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp, or Met;   Xaa at position 113 is missing or Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, or Met;   Xaa at position 114 is deleted or Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, or Met;   Xaa at position 115 is missing or Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, or Asn; and   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:  (VII) a polypeptide containing a modified human IL-3 amino acid sequence represented by the following formula: Ripeptide:  Where:   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, G lu, Gln, Asn, Thr, Ser, or Val;   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, A sp, Asn, Gln, Leu, Val, or Gly;   Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, P he, Leu, Ser, or Arg;   Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Al. a;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, V al, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Va. l;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, S er, Leu, or Lys;   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, A la or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Gl. u;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, G ln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile, or Met;   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln, or Or Val;   Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val;   Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile ;   Xaa at position 38 is Asn, or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, T hr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met, or Al a;   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, A la, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, or Ser;   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, M et, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, or Pro;   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, T hr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu, or His;   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, A sn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, or Gl y;   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, or Or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, P he, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, or Asn ;   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, H is, or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, A sn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, or Gl n;   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or Or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, L ys, Ser, or Met;   Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, G ln, Asn, Lys, His, Ala, or Leu;   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gl. y;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, A rg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, or Ly s;   Xaa at position 57 is Asn, or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Ar. g;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Th. r;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, A sp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, P ro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser, or Lys. ;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Or Ser;   Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Or Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, I le, Pro, or His;   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, T hr, or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, T rp, Gly, or Leu;   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Al a;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, T hr, Gln, Trp, or Asn;   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, A rg, or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, T hr, or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, A la;   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, A rg, Ser, Gln, or Leu;   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, P ro, Gly, or Asp;   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu ;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, G ly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, G lu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, V al, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, G lu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val;   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Me. t;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Va. l;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln;   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys ;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp. ;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn, or Ser;   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, I le or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, A sp, or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, A la, Gly, Ile, or Leu;   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, L eu, or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, G ln, Lys, His, Ala, or Pro;   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, G ly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr;   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Th. r;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn. ;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, T hr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr, or Pro;   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, G ln, Gly, Ser, Phe, or His:   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro;   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Giu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln;   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, Or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly;   Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His;   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro;   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, or Pro;   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly;   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp;   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met. R;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe;   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn;   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, Or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met;   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile;   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, Or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, sp, or Tyr;   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg;   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, Or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly;   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys;   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr or Leu;   Wherein the 1-14 amino acids are the N-terminal of the modified human IL-3 amino acid sequence And / or from 1 to 15 amino acids may be modified from the modified human IL -3 amino acid sequence may be deleted from the C-terminus; and   Wherein the amino acids 1-44 represented by Xaa correspond to the natural (1-133) ) Differs from the corresponding amino acid of human interleukin-3; and   (VIII) Colony stimulating factor, cytokine, lymphokine, interleukin A factor selected from the group consisting of kins and hematopoietic growth factors; And   In each formula, L1Is R1To RTwoA linker that can be attached to   If desired, the hematopoietic protein may be (methionine-1), (Alanine-1) Or (Methionine-2, Alanine-1) May be preceded immediately by   Where R1Or RTwoAt least one of the formula (I), (II) or (II) Selected from the polypeptides represented by I), and   2. A hematopoietic protein containing an amino acid sequence represented by the following formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1   In each formula, R1And RTwoIs independently selected from the following groups:   (I) a human EPO protein containing a modified EPO amino acid sequence represented by the following formula: Scepter agonist polypeptide:  Wherein 1-6 amino acids from the N-terminus and / or 1-5 amino acids from the C-terminus The amino acid may be deleted from the EPO receptor agonist polypeptide. And;   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:  (II) a human stem comprising a modified stem cell factor amino acid sequence represented by the following formula: Cell factor receptor agonist polypeptides:  In the formula, 1 to 23 amino acids are the stem cell factor receptor agonist polypeptide May be deleted from the C-terminus of the   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:  (III) a modified flt-3 ligand amino acid sequence represented by the following formula: A human flt-3 receptor agonist polypeptide:   Where 1 to 7 amino acids are the Ct of the flt-3 receptor agonist polypeptide -May be deleted from the terminus; and   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:   (IV) a poly-amino acid comprising a modified human IL-3 amino acid sequence represented by the following formula: peptide:   Where:   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, G lu, Gln, Asn, Thr, Ser, or Val;   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, A sp, Asn, Gln, Leu, Val, or Gly;   Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, P he, Leu, Ser, or Arg;   Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Al. a;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, V al, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Va. l;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, S er, Leu, or Lys;   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, A la or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Gl. u;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, G ln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile, or Met;   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln or Is Val;   Xaa at position 36 is Asr, Leu, or Val;   Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile ;   Xaa at position 38 is Asn, or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, T hr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met, or Al a;   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, A la, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, or Ser;   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, M et, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, or Pro;   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, T hr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu, or His;   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, A sn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, or Gl y;   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, or Or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, P he, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, or Asn ;   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, H is, or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, A sn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, or Gl n;   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or Or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, L ys, Ser, or Met;   Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, G ln, Asn, Lys, His, Ala, or Leu;   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gl. y;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, A rg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, or Ly s;   Xaa at position 57 is Asn, or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Ar. g;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Th. r;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, A sp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, P ro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser, or Lys. ;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Or Ser;   Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Or Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, I le, Pro, or His;   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, T hr, or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, T rp, Gly, or Leu;   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Al a;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, T hr, Gln, Trp, or Asn;   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, A rg, or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, T hr, or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, A la;   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, A rg, Ser, Gln, or Leu;   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, P ro, Gly, or Asp;   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu ;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, G ly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, G lu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, V al, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, G lu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val;   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Me. t;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Va. l;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln;   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys ;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp. ;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, H is, Asn, or Ser;   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, I le or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, A sp, or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, A la, Gly, Ile, or Leu;   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, L eu, or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, G ln, Lys, His, Ala, or Pro;   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, G ly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, Or Tyr;   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Th. r;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn. ;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, T hr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr, or Pro;   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, G ln, Gly, Ser, Phe, or His;   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro;   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln;   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, Or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly;   Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His;   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro;   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, or Pro;   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly;   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp;   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met. R;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe;   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn;   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, Or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met;   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile;   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, Or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr;   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg;   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, Or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly;   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, or Cys;   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, or Leu;   Wherein the 1-14 amino acids are the N-terminal of the modified human IL-3 amino acid sequence And / or from 1 to 15 amino acids may be modified from the modified human IL -3 amino acid sequence may be deleted from the C-terminus; and   Wherein the amino acids 1-44 represented by Xaa correspond to the natural (1-133) ) Differs from the corresponding amino acid of human interleukin-3;   (V) colony stimulating factor, cytokine, lymphokine, interleukin and And a factor selected from the group consisting of hematopoietic growth factor; And   In each formula, the above L1Is R1To RTwoA linker that can be attached to   In each formula, the hematopoietic protein is optionally (methionine-1), (Alanine-1 ) Or (methionine-2, Alanine-1) May be preceded immediately by ;   Where R1Or RTwoAt least one of the formula (I), (II) or (II) It is selected from the polypeptides represented by I).   3. The method according to claim 2, wherein the polypeptide of (IV) is selected from the following group. Blood protein:  Four. A hematopoietic protein comprising an amino acid sequence represented by the following formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1   In each formula, R1Represents a modified flt-3 ligand amino acid sequence represented by the following formula: Included polypeptides are:   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Linker (LTwo) Via the C-terminus:   In each formula, RTwoIncludes a modified human IL-3 amino acid sequence represented by the following formula: Is a polypeptide that:  Where:   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, or Or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, G lu, Gln, Asn, Thr, ser, or Val;   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, A sp, Asn, Gln, Leu, Val, or Gly;   Xaa at position 23 is IIe, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, P he, Leu, Ser, or Arg;   Xaa at position 24 is IIe, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, or Or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, or Or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, or Al. a;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, V al, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, or Va. l;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, S er, Leu, or Lys;   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, or Or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, A la or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, or Gl. u;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, G ln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile, or Met;   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln, or Or Val;   Xaa at position 36 is Asp, Leu, or Val;   Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp, or Ile ;   Xaa at position 38 is Asn, or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp, or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, or Or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, T hr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met, or Al a;   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, A la, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, or Ser;   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, M et, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, or Pro;   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, T hr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, G lu, or His;   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, A sn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, or Gl y;   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, pro, or Or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, P he, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, or Asn ;   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, H is, or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, A sn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, or Gl n;   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, or Or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, or Or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, L ys, Ser, or Met;   Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, G ln, Asn, Lys, His, Ala, or Leu;   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu, or Gl. y;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, A rg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, or Ly s;   Xaa at position 57 is Asn, or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, or Or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro, or Ar. g;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Th. r;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, or Or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, A sp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Thr, Trp, Lys, Ser, HiS, P ro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, pro, Ser, or Lys. R;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, or Or Ser; Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, or Is Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, I le, Pro, or His;   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, T hr, or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, T rp, Gly, or Leu;   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro, or Al a;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, T hr, Gln, Trp, or Asn;   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, A rg, or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, T hr, or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, A la;   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, A rg, Ser, Gln, or Leu;   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, P ro, Gly, or Asp;   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr, or Leu ;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, or Or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, G ly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, G lu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, TrP, Arg, V al, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, G lu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, M et or Val;   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, or Me. t;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met, or Va. l;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val, or Gln;   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys ;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp, or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val, or Trp. ;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, H is, Asn, or Ser;   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, I le or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, A sp, or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, A la, Gly, Ile, or Leu;   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, L eu, or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, G ln, Lys, His, Ala, or Pro;   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, G ly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, TrP, Phe, Ile, Or Tyr;   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Th. r;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala, or Asn. ;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, T hr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, T yr, or Pro;   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, G ln, Gly, Ser, Phe, or His;   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, or Pro;   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, Or Gln;   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, Or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, or Gly;   Xaa at position 105 is AsnNPro,. Ala) Phe,. Ser,. Trp) G ln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, or His;   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, or Pro;   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, or Pro;   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, or Gly;   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, or Trp;   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp, or Met. R;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe;   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, HiS, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, or Asn;   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, Or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, or Met;   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, or Ile;   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, Or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr;   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg;   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, Or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, pro, Lys, Asp, or Gly;   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, HiS, Ile, Tyr, or Cys;   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr or Leu;   Wherein the 1-14 amino acids are the modified human interleukin-3 amino acid sequence And / or 1 to 15 amino acids may be deleted from the N-terminus of The modified human interleukin-3 may be deleted from the C-terminus of the amino acid sequence Well; and   Wherein the amino acids 1-44 represented by Xaa correspond to the natural (1-133) ) Differs from the corresponding amino acid of human interleukin-3; And   In each formula, the above L1Is R1To RTwoA linker that can be attached to And   If desired, the hematopoietic protein may be (methionine-1), (Alanine-1) Or (Methionine-2, Alanine-1) May directly precede it.   Five. RTwoIs selected from the following group:   6． A hematopoietic protein comprising an amino acid sequence represented by the following formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1   In each formula, R1Represents a modified flt-3 ligand amino acid sequence represented by the following formula: Included polypeptides are:  Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And phosphorus having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Car (LTwo)) To the C-terminus:   In each formula, RTwoAre colony-stimulating factors, cytokines, lymphokines, A factor selected from the group consisting of leukin and hematopoietic growth factor;   In each formula, the above L1Is R1To RTwoA linker that can be attached to And   If desired, the hematopoietic protein may be (methionine-1), (Alanine-1)Also Is (methionine-2, Alanine-1) May immediately precede it.   7． A hematopoietic protein comprising an amino acid sequence represented by the following formula:     R1-L1-RTwo, RTwo-L1-R1, R1-RTwoOr RTwo-R1   In each formula, R1Represents a modified flt-3 ligand amino acid sequence represented by the following formula: Is a polypeptide, including:   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And phosphorus having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Car (LTwo)) To the C-terminus:   In each formula, RTwoIncludes a modified human G-CSF amino acid sequence represented by the following formula: Is a polypeptide that:  Where:   Xaa at position 1 is Thr, Ser, Arg, Tyr, or Gly;   Xaa at position 2 is Pro or Leu;   Xaa at position 3 is Leu, Arg, Tyr, or Ser;   Xaa at position 13 is Phe, Ser, His, Thr, or Pro ;   Xaa at position 16 is Lys, Pro, Ser, Thr, or His ;   Xaa at position 17 is Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr, or Or Arg;   Xaa at position 18 is Leu, Thr, Pro, His, Ile, or Cy. s;   Xaa at position 22 is Arg, Tyr, Ser, Thr, or Ala ;   Xaa at position 24 is Ile, pro, Tyr, or Leu;   Xaa at position 27 is Asp or Gly;   Xaa at position 30 is Ala, Ile, Leu, or Gly;   Xaa at position 34 is Lys or Ser;   Xaa at position 36 is Cys or Ser;   Xaa at position 42 is Cys or Ser;   Xaa at position 43 is His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, A la, Arg, cys, or Leu;   Xaa at position 44 is Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, H is, Trp, Gln, or Thr;   Xaa at position 46 is Glu, Arg, Phe, Arg, Ile, or Al. a;   Xaa at position 47 is Leu or Thr;   Xaa at position 49 is Leu, Phe, Arg, or Ser;   Xaa at position 50 is Leu, Ile, His, Pro, or Tyr. ;   Xaa at position 54 is Leu or His;   Xaa at position 64 is Cys or Ser;   Xaa at position 67 is Gln, Lys, Leu, or Cys;   Xaa at position 70 is Gln, Pro, Leu, Arg, or Ser. ;   Xaa at position 74 is Cys or Ser;   Xaa at position 104 is Asp, Gly, or Val;   Xaa at position 108 is Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln, Or Gly;   Xaa at position 115 is Thr, His, Leu, or Ala;   Xaa at position 120 is Gln, Gly, Arg, Lys, or His. R;   Xaa at position 123 is Glu, Arg, Phe, or Thr;   Xaa at position 144 is Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln, Or Glu;   Xaa at position 146 is Ar-g, or Gln;   Xaa at position 147 is Arg, or Gln;   Xaa at position 156 is His, Gly, or Ser;   Xaa at position 159 is Ser, Arg, Thr, Tyr, Val, or G. ly;   Xaa at position 162 is Glu, Leu, Gly, or Trp;   Xaa at position 163 is Val, Gly, Arg, or Ala;   Xaa at position 169 is Arg, Ser, Leu, Arg, or Cys. R;   Xaa at position 170 is His, Arg, or Ser;   Where 1-11 amino acids from the N-terminus and / or 1-5 amino acids from the C-terminus Amino acids may be deleted from the modified human G-CSF amino acid sequence; do it   Wherein the N-terminus can be linked directly or the N-terminus can be linked to the C-terminus. And phosphorus having a novel C-terminus and N-terminus at the following amino acid positions, respectively. Car (LTwo)) To the C-terminus:  In each formula, the above L1Is R1To RTwoA linker that can be attached to And   If desired, the hematopoietic protein may be (methionine-1), (Alanine-1) Or (Methionine-2, Alanine-1) May immediately precede it.   8． The above linker (LTwo) Is selected from the following group: Hematopoietic protein according to 6, 6 or 7:   9． The hematopoietic tamper according to claim 1, wherein the protein is selected from the following group. Quality:   11． The colony stimulating factor is GM-CSF, G-CSFNG-CSFser17 , C-mpl ligand (TPO), M-CSF, erythropoietin (EPO ), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7 , IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, I L-15, LIF, flt3 / flk2 ligand, human growth hormone, B-cell From growth factor, B-cell differentiation factor, eosinophil differentiation factor and stem cell factor (SCF) The hematopoietic protein according to claim 1, 2 or 6, which is selected from the group consisting of:   12． The colony stimulating factor is G-CSF, G-CSF Ser17, G-CS F Ala17And c-mpl ligand (TPO). 12. The hematopoietic protein according to claim 11.   13. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 1.   14. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 2.   15． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 3.   16． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 4.   17． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 5.   18． A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 6.   19. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 7.   20. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 8.   twenty one. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 9.   twenty two. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 10.   twenty three. A nucleic acid molecule encoding the hematopoietic protein of claim 11.   twenty four. 14. The nucleic acid molecule according to claim 13, selected from the following group:   twenty five. A method for producing a hematopoietic protein, comprising the steps of: Containing the nucleic acid molecule of 7, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24. Host transformed or transfected with a replicable vector Cells are grown under suitable conditions in a manner that allows for the expression of the hematopoietic proteins. And then collecting the hematopoietic protein.   26. The hematopoietic protein according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 or 10. A pharmaceutical composition comprising a quality and a pharmaceutically acceptable carrier.   27. A method for stimulating hematopoietic cell production in a patient, comprising the steps of: The hematopoietic protein according to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 or 10, Administering to a subject.   28. A method of selectively ex vivo expanding hematopoietic cells,   (A) using the culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1, Culturing; then   (B) collecting the cultured cells, A method comprising the steps of:   29. A method of selectively ex vivo expanding hematopoietic cells,   (A) separating hematopoietic cells from other cells;   (B) a culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Culturing blood cells; then   (C) collecting the cultured cells; A method comprising the steps of:   30. A method for treating a patient having a hematopoietic disorder,   (A) removing hematopoietic cells from the patient;   (B) using the culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1, Culturing;   (C) harvesting the cultured cells;   (D) transplanting the cultured cells into the patient; A treatment method comprising a step.   31. A method for treating a patient having a hematopoietic disorder,   (A) removing hematopoietic cells from the patient;   (B) separating hematopoietic cells from other cells;   (C) a culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Culturing blood cells;   (D) harvesting the cultured cells;   (E) transplanting the cultured cells into the patient; A treatment method comprising a step.   32. A method of human gene therapy,   (A) removing hematopoietic cells from the patient;   (B) separating the hematopoietic cells from other cells;   (C) a culture medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Culturing blood cells;   (D) introducing DNA into the cultured cells;   (E) harvesting the transduced cells;   (D) transplanting the transduced cells into the patient; A method comprising steps.   33. 30. The hematopoietic cell is a CD34 + cell. Or the method of 32.   34. 30. The hematopoietic cell is a peripheral blood cell, 29, 29, or 30, 31. The method according to 31 or 32.   35. A method for producing dendritic cells, comprising:   (A) separating hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells from other cells;   (B) The hematopoietic progenitor cell or CD34 + cell according to claim 1, 2, 3, or 4. Culturing in a growth medium containing the hematopoietic protein described in 1). A method comprising the steps of:   36. (C) Applying an antigen to hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells to be cultured 36. The method of claim 35, further comprising the step of:   37. The growth medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 36. The method of claim 35, further comprising one or more factors.   38. The growth medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion tan One selected from the group consisting of protein, and a multifunctional receptor agonist 37. The method of claim 36, wherein the method further comprises two or more factors.   39. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease, comprising: Administering the hematopoietic protein according to 1, 2, 3 or 4 to the human. Treatment method to do.   40. GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SCF), flt- Triligands, IL-3, IL-3 variants, IL-3 variant fusion proteins, and multiple One or more selected from the group consisting of functional receptor agonists 40. The method of claim 39, further comprising administering the agent.   41. 40. The method of claim 39, further comprising administering an antigen to said patient. Law.   42. 41. The method of claim 40, further comprising administering an antigen to the patient. Law.   43. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease,   a) administering the hematopoietic protein of claim 1 to the human; Recruit dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells;   b) the above dendritic cell precursor cells or mature tree by blood sweep or pheresis; Removing the dendritic cells;   c) applying an antigen to said dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells;   d) returning the dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells to which the antigen has been applied to the human. You A treatment method comprising a step.   44. In step a), GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor ( SCF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion 1 selected from the group consisting of proteins, and multifunctional receptor agonists. 44. The method of claim 43, further comprising administering one or more factors. Method.   45. 2. The dendritic cell precursor cell or mature dendritic cell from step b) according to claim 1, Culturing in a growth medium containing the hematopoietic protein according to 2, 3, or 4. 44. The method of claim 43, further comprising:   46. 2. The dendritic cell precursor cell or mature dendritic cell from step b) according to claim 1, Culturing in a growth medium containing the hematopoietic protein according to 2, 3, or 4. 45. The method of claim 44, further comprising:   47. The growth medium is GM-CSFNIL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion tan One selected from the group consisting of protein, and a multifunctional receptor agonist 47. The method of claim 45, wherein the method further comprises two or more factors.   48. The growth medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (S CF), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion tan One selected from the group consisting of protein, and a multifunctional receptor agonist 47. The method of claim 46, further comprising two or more factors.   49. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease,   a) Hematopoietic progenitor cells or C from said human by blood sweep or pheresis Removing D34 + cells;   b) a growth medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Progenitor cells or CD34 + cells are cultured and dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells Produces; then   c) returning said dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells to said human; A treatment method comprising a step.   50. A method of treating a human suffering from a tumor, an infection or an autoimmune disease,   a) the hematopoietic progenitor cells or Removes CD34 + cells;   b) a growth medium containing the hematopoietic protein according to claim 1; Progenitor cells or CD34 + cells are cultured and dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells To produce;   c) applying an antigen to said dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells;   d) returning the dendritic cell precursor cells or mature dendritic cells to which the antigen has been applied to the human. You; A treatment method comprising a step.   51. Prior to culture, hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells are separated from other cells. 50. The method of claim 49, further comprising the step of releasing.   52. Prior to culture, hematopoietic progenitor cells or CD34 + cells are separated from other cells. 51. The method of claim 50, further comprising the step of releasing.   53. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 52. The method of claim 51, further comprising one or more factors.   54. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 51. The method of claim 50, further comprising one or more factors.   55. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 52. The method of claim 51, further comprising one or more factors.   56. The culture medium is GM-CSF, IL-4, TNF-α, stem cell factor (SC F), flt-3 ligand, IL-3, IL-3 variant, IL-3 variant fusion protein And a multifunctional receptor agonist. 53. The method of claim 52, further comprising one or more factors.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP0973900A1 (en) * 1997-04-11 2000-01-26 G.D. Searle & Co. flt3 LIGAND CHIMERIC PROTEINS
BR9905867A (en) * 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Recombinant human erythropoietin-producing cell line and the recombinant human erythropoietin produced by this cell
WO2002101047A1 (en) * 2001-06-12 2002-12-19 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying compounds that modulate epo primary response gene 1, eprg1, activities
DE60236522D1 (en) 2001-07-11 2010-07-08 Maxygen Inc G-CSF CONJUGATES
JP4809767B2 (en) 2003-08-18 2011-11-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Expression vectors, polypeptide display libraries, and methods for their production and use
RU2007149238A (en) 2005-06-01 2009-07-20 Максиджен Холдингз Лтд. (Ky) PEGylATED GKSF POLYPEPTIDES AND METHODS FOR PRODUCING THEM
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7666817B2 (en) 2005-08-31 2010-02-23 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
WO2007098548A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-07 Apollo Life Sciences Limited A molecule and chimeric molecules thereof
WO2009014726A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
US10071109B2 (en) 2013-11-06 2018-09-11 Molecular Templates, Inc. Predictive biomarker for hypoxia-activated prodrug therapy
JP2022527322A (en) * 2019-03-28 2022-06-01 オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (FLT3L) -based chimeric protein

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992006116A1 (en) * 1990-09-28 1992-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid growth factors
US5376367A (en) * 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US6057133A (en) * 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5635599A (en) * 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands

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