JP2001504492A

JP2001504492A - ６―ペプチジルアミノ―１―ナフタレンスルホンアミド・モエッティを含むペプチドミメティック体

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Publication number: JP2001504492A
Application number: JP52381898A
Authority: JP
Inventors: ブテナス、ザウリアス; ジー．マン、ケネス
Original assignee: ブテナス、ザウリアス; ジー．マン、ケネス
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2001-04-03
Also published as: EP1007078A1; WO1998022125A1; AU735722B2; CA2272095A1; US6566493B1; EP1007078A4; AU5587098A

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）に示す化合物、あるいは薬剤として受け入れ可能な無害の塩であって、Ｒ₁がベンジル基、あるいは式（ａ）のペプチドであり、Ｒ₃とＲ₄は遊離あるいは保護アミノ酸側鎖を独立に表し、Ｒ₅はヒドロキシ、アルコキシ、ベンゾキシ、アミノ酸、あるいはペプチド残基であり、Ｒ₂はアミノ酸、あるいはペプチド残基である化合物が開示されており、この化合物は、酵素に対して高い特異性を持つ活性化されたタンパク質Ｃの阻害剤である。また、本発明は、式（II）に示す化合物、あるいは薬剤として受け入れ可能な塩であって、Ｒ₃とＲ₄は遊離あるいは保護アミノ酸側鎖を独立に表し、Ｒ₅はヒドロキシ、アルコキシ、ベンゾキシ、アミノ酸、あるいはペプチド残基であり、Ｒ₆はスルホンアミド窒素原子を介してペプチド基に付加された６−アミノナフタレンスルホンアミド、あるいは末端窒素原子を介してペプチド基に付加された遊離、あるいは保護のどちらかのアミノ基である化合物をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】６−ペプチジルアミノ−１−ナフタレンスルホンアミド・モエッティを含むペプチドミメティック体発明の背景発明の分野本発明は概略的には合成ペプチド成分を含有する新規な化合物に関連するものである。より特定すると、本発明は基質が血液凝固過程のプロモータである活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する天然基質のペプチド凝症（mimetics）に関連するものである。本発明はさらに抗凝血過程の阻害および血液中に於ける凝固過程の促進におけるこのような化合物の使用に関するものである。関連技術の説明活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は血液凝固および繊維素溶解に含まれるセリンプロテアーゼである。これは塩基性アミノ酸がscissile結合のカルボニル基を提供してペプチド、エステル、またはアミド結合を選択的に加水分解するプロテアーゼであるという意味でトリプシン様のものとして記述することができよう。インビボ（in vivo）における酵素の特異性は、目的とするリジンのアミノ基側およびカルボキシル基側または基質プロテインのアルギニン残基に配位する特定のアミノ酸鎖の結合領域をプロテアーゼ中に含んだ構造因子の多様な複合官能基である。短いペプチド基質が種々のプロテアーゼから識別するための十分な情報を内包するように設計しうるというアイデアは各活性部位が唯一の側鎖結合ポケット列から構成されるという発想に基づいている。ローソンら（J.Biol.Chem.267:48344843,1992）は組織片や燐脂質の存在下または不存在下でVIIａ因子の酵素活性を直接測定するために使用することが可能な蛍光基質［６−（Ｍｅｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）アミノ−１−（ジメチル）ナフタレンスルホンアミドについて議論しており、これを本発明に取り入れて組み込んでいる。ブテナスら（Biochem.31:5399-5411,1992）は、６−アミノ−１−ナフタレンスルホンアミドの合成について記述し、これらの化合物がプロテアーゼのペプチド基質内の検出基として用いることができることを示唆しており、これを本発明に取り入れて組み込んでいる。ブテナスら（Anal.Biochem.225:231-241,1995）は、ＡＰＣの検出に有効な６ −アミノ−２−ナフタレンスルホンアミドおよび６ペプチジル−２−アミノナフタレンスルホンアミドを内包するアミノナフタレンスルホンアミドおよびペプジルアミノナフタレンスルホンアミドの種々の異性体を議論しておりこれを本発明に取り入れて組み込んでいる。米国特許第５３９９４８７号は、式：の化合物を開示している。ここで、Ｒ₁は水素、低アルキル、アルケニル、アルキニル、サイクロアルキル、アルキルサイクロアルキル、サイクロアルキルアルキルまたはフェニルアルキルである。Ｒ₂は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、サイクロアルキル、アルキルサイクロアルキル、サイクロアルキルアルキルまたはフェニルアルキルである。またＮＲ₁Ｒ₂は窒素ヘテロサイクルを形成し、Ｒ₃は水素、アミノ酸またはペプチド残基である。これらの化合物はタンパク質加水分解酵素の活性度を決定するためのアッセイの基質としてあるいは酵素阻害剤としての官能基といえる。発明の概要本発明は式Ｉ：の化合物あるいはその薬剤学的に受容可能な塩を提供する。ここでＲ₁は式で表されるベンジル基またはペプチドである。またＲ₃およびＲ₄はフリーのまたは保護されたアミノ酸側鎖であり、Ｒ₅は水酸基、アルコキシ、ベンゾキシおよびアミノ酸またはペプチド残基であり、Ｒ₂はアミノ酸またはペプチド残基である。式Ｉの化合物はこの特定の酵素に高い特異性を有するＡＰＣ阻害剤を提供する。本発明はまた式II：で表される化合物またはその薬剤学的に受容可能な塩を提供する。ここで、Ｒ₃ 、Ｒ₄およびＲ₅は式Ｉと同じである。そしてＲ₆はスルホンアミドの窒素原子を介してペプチド基に結合した６−アミノナフタレンスルホンアミドまたは末端の窒素原子を介してペプチド基に結合したフリーのあるいは保護されたアミノ基である。式ＩおよびIIの化合物は組織因子（組織トロンボプラスチン）経路阻害剤（ＴＦＰＩ）によって凝固因子VIIａおよびＸａの阻害から保護する。これらの化合物はまた血液凝固のインビトロ（in vitro）再構成モデルにおいてトロンビン生成速度を促進する。本発明は血液凝固のプロモータを提供するものである。式ＩおよびIIの化合物は血液中の抗凝血過程の高い選択性をもつ阻害剤である。プリ凝血剤の活性度は部分的には抗凝血剤の経路阻害に依存する。抗トロンビンIII、ＡＰＣおよびＴＦＰＩは血液凝固を反対の傾向で制御する。式Ｉの化合物はこの酵素に結合して高い活度を有するＡＰＣの阻害剤として使用できるが加水分解の速度が遅くまたは全く分解されない。結論として、本発明は血液中の抗凝固過程を妨害しまたは阻害するための有用な化合物を提供するものである。さらに、これらの化合物は血液凝固のインビトロ再構成モデルにおけるプロトロンビンの活性度を加速するものである。これら３つの効果をまとめると、式ＩおよびIIの化合物は正常、VIII因子欠陥、およびIX因子欠陥の血漿の血塊時間を減少させるのである。また全血の場合も同様である。図面の簡単な説明図１は、抑制剤濃度と基質の加水分解の割合との関係を示す図であり、ＡＰＣ用の混合物の抑制定数（Ｋ₁）の結果を示している。この分析では、原色体基体スペクトロジームＴＨの異なる３種類の濃度（１００、２００、及び６００μＭ）が使用された。図２は、因子VIIa／組織因子が０．５ｐＭで始められたときの時間とトロビンの発生との関係を示す図である。白丸は、存在する全ての凝固したタンパク質を示す；黒丸は、存在する全ての凝固したタンパク質、タンパク質Ｃ（ＰＣ）、及びトロンボモジュリン（Ｔｍ）を示す；白三角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、及び化合物＃９を示す；黒三角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、及び化合物＃１を示す。図３は、因子VIIa／組織因子が１．２５ｐＭで始められたときの時間とトロビンの発生との関係を示す図である。黒四角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、及びＴｍを示す；白四角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、及びＴｍを示す、因子VIIIは存在しない；白ダイヤモンド形は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、及び化合物＃１を示す、因子VIIIは存在しない；黒ダイヤモンド形は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、及び化合物＃９を示す、因子VIIIは存在しない。図４は、化合物＃１及び＃９の濃度に対する因子VIIa／組織因子活性度の関係を示す図である。白四角は、存在する因子VIIa／組織因子及び化合物＃９を示す；黒四角は、存在する因子VIIa ／組織因子、及び化合物＃１を示す；白丸は、存在する因子VIIa／組織因子、化合物＃９、及び組織因子経路抑制剤（ＴＦＰＩ）を示す；黒丸は、存在する因子 VIIa／組織因子、化合物＃１、及びＴＦＰＩを示す。図５は、化合物＃１及び＃９の濃度に対する因子Xa活性度の関係を示した図である。白丸は、存在する因子Xa及び化合物＃９を示す；黒四角は、存在する因子 Xa及び化合物＃１を示す；白丸は、存在する因子Xa、化合物＃９、及びＴＦＰＩを示す；黒丸は、存在する因子Xa、化合物＃１、及びＴＦＰＩを示す。図６は、因子VIIa／組織因子が１．２５ｐＭで始められたときの時間とトロビンの発生との関係を示す図である。白丸は、存在する全ての凝固したタンパク質及びＴＦＰＩを示す；黒丸は、存在する全ての凝固したタンパク質、及びＴＦＰＩを示す、因子VIIIは存在しない；白三角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＴＦＰＩ、及び化合物＃９を示す、因子VIIIは存在しない；黒三角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＴＦＰＩ、及び化合物＃１を示す、因子VIIIは存在しない。図７は、因子VIIa／組織因子が１．２５ｐＭで始められたときの時間とトロビンの発生との関係を示す図である。白丸は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、及びＴＦＰＩを示す；黒丸は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、及びＴＦＰＩを示す、因子VIIIは存在しない；白三角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、ＴＦＰＩ、及び化合物＃９を示す、因子VIIIは存在しない；黒三角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、ＴＦＰＩ、及び化合物＃１を示す、因子VIIIは存在しない；四角は、存在する全ての凝固したタンパク質、ＰＣ、Ｔｍ、ＴＦＰＩ、及び化合物＃１及び＃９を示す、因子VIIIは存在しない。図８は、因子VIIa／組織因子が１．２５ｐＭで始められたときの時間とトロビンの発生との関係を示す図であある。白丸は、存在する全ての凝固したタンパク質を示す；黒丸は、存在する全ての凝固したタンパク質及び化合物＃１を示す；三角は、存在する全ての凝固したタンパク質及び化合物＃９を示す；四角は、存在する全ての凝固したタンパク質及び化合物＃２６を示す。発明の詳細な説明本発明は、式Ｉの化合物を提供する：又は薬学的に許容できる毒性のないその塩を提供する；ここで、Ｒ₁は、ベンジル基又は次式のペプチドであるここでＲ₃及びＲ₄は、自由な又は保護されたアミノ酸の側鎖を表し、Ｒ₅は、水酸基、アルコキシル基、ベンゾルオキシ、及びアミノ酸又はペプチド残基を表している；そしてＲ₂は、アミノ酸又はペプチド残基である。式Ｉの化合物は、この特定の酵素に対し高い特異性を有するＡＰＣ反応抑制剤を提供する。本発明は、式IIの化合物又は薬学的に許容できるその塩をも提供する：ここでＲ₃、Ｒ₄及びＲ₅は、式Ｉにおけるのと同じであり；そしてＲ₆は、スルホンアミド窒素原子を介してペプチド基に取り付けられた６−アミノナフタレンスルホンアミド又は終端の窒素原子を介してペプチド基に取り付けられた自由又は保護されたアミノ基である。本発明は、式IIIの化合物をも提供するここで、Ｒ₁は、上記において式Ｉに定義されたのと同じである；Ｒは、アミノ酸又はペプチド残基を表す；そしてＲ₂は、Ｌ−アルギン、Ｄ−アルギン、ホモアルギン又はβ−ホモアルギンからなる側鎖を表す。本発明の典型的な化合物は、これは式Ｉによって包含されているが、それらの毒性がなく薬学的に許容できる塩を含む。毒性がなく薬学的に許容できる塩は、例えば塩化水素酸、燐酸、臭化水素酸、硫酸、スルフィン酸、蟻酸、トルエン酸、スルホン酸、ヨウ化水素酸、酢酸、トリフルオル酢酸又は類似の酸の塩を含む。当業者は、幅広い種類の毒性がなく薬学的に許容できる他の塩を認めるであろう。本発明の化合物は、本技術分野で既知のあらゆる種類の合成方法の他、米国特許5,399,487号公報に記載された方法を用いて、比較的高い収率で適当に合成される。米国特許5,399,487号公報は、言及することによりそっくりそのままここに導入されたものとする。ペプチド残基は、例えばαペプチドボンドによって結合された少なくとも２つのアミノ酸を含む基を意味する。本発明のペプチド残基は、現存する天然産物のタンパク質分解過程、ブロック化されるアミノ酸の化学合成、又は試験管内のセルを用いた分子生物学的アプローチにより得ることができる。アミノ酸、又はペプチド残基の調製で使用されたアミノ酸は、自然に又は人工的に生じたアミノ酸のいずれでもよい。ペプチド残基は、随意に、種々のアミノ又はカルボキシル保護基を含むことであってもよい。代表的な保護基は、“ＢＯＣ”基、すなわち、 t-ブトキシカルボニル、“Ｚ”基、すなわち、ベンジルオキシカルボニル、“ＦＭＯＣ”基、すなわち、フルオレニルメトキシカルボニル、“Ｂｚ”基、すなわち、ベンジル、“Ｅｔ”基、すなわち、エチル、“Ｍｅ”基、すなわち、メチル、及び“Ｂｚｌ”基、すなわち、ベゾイルである。タンパク質分解酵素用の反応抑制剤は、セリンプロテアーゼに対し高い親和力で相互作用し、酵素の活性化した領域をブロックする式Ｉの化合物を意味する。アミノ酸側鎖は、アミノ酸カルボキシル基に対するアルファカーボン上の置換基を意味する。血管の損傷の結果として内皮下から誘導された組織因子がさらされ、プラズマセリンプロテーゼ、因子VIIa、と酵素錯体を形成したときに血液凝固のカスケードの引き金が引かれる。因子VIIa／組織因子錯体は、因子X及び因子IXを酵素因子Xa及び因子IXaに活性化する。その補足因子、因子VIIIa、とともに錯体中にある因子IXaは、因子VIIa／組織因子錯体よりも約５０倍高い割合で因子Xを活性化する。次に、因子Xaは、因子VIIを活性化し、さらに因子IX及び因子Xの活性を高める。因子Xaの主な役割は、因子Vaとともにプロトビナーゼ錯体、及び、プロトロンビンをトロンビンへの活性化に導くリン脂質膜面を形成することである。トロンビンは、溶解性のフィブリノーゲンに付着し、フィブリンを形成する。フィブリンは、重合し、非溶解性の血塊を形成する。血液凝固カスケードは、血液凝固の天然抑制剤、組織因子経路抑制剤（ＴＦＰＩ）、活性化されたタンパク質Ｃ（ＡＰＣ）及び抗トロビンIII（ＡＴ−III）、によって抑制される。血液凝結連鎖の本質的補助因子であるＶ（ａ）とVIII（ａ）は、表１に示したサイトに開裂している。これら開裂の結果として補助因子の機能は失われる。ＴＦＰＩは凝結タンパク因子VIIａとＸａを抑制する。表１ＡＰＣ天然基質開裂サイトのシーケンスＡＰＣを特定的に抑制でき、かつＴＦＰＩの作用を抑えることのできるいかなる化合物も、血友病Ａと血友病Ｂの治療に役立つであろう。式Ｉ及びIIの化合物は、ＡＰＣ（実施例２及び３を見よ）に対して高度に選択的な抑制剤である。式Ｉ、II及びIIIの化合物は、凝結タンパクをＴＦＰＩ（実施例３を見よ）による不活性化から保護することができるし、血液凝結の再構築インヴィトロモデル（実施例４を見よ）においてトロンビンの生成を促進することができる。本発明の化合物は、ＡＰＣを抑制し、ＴＦＰＩを不活性化し、血液凝結連鎖を促進するために用いることができる。そのような化合物は、競合する、特定のＡＰＣ抑制剤として働き、天然基質因子Ｖ(a)とVIII(a)とともにこのプロテアーゼの反応速度を低減するであろう。このようにしてこれらの化合物は、インヴィヴォ／インヴィトロいずれにおいても、これらの酵素の天然タンパク分解活動を低減するであろう。これらの化合物は、VIIａ因子とＸａ因子がＴＦＰＩによって抑制を受けることから守る働きもする。これらは、トロンビン生成の加速化によって血液凝血プロセスを促進する。６−アミノアシル結合の加水分解速度が遅い（この系統の他の化合物の加水分解速度と比較して）化合物は、抑制剤として特に有用である。本発明の与えられた化合物が効果を有し、酵素の特定の抑制剤となるか否かは、抑制定数を測定することによって簡単に判断することができる。例えば、Alan Fershr，Enzvme St ructure and Mechanism ，W.H．Freeman and Company，New York，1985を参照されたい。この記載内容は、これらの結合パラメータ測定技術の議論のために、ここに引例として取り込むこととする。式ＩからIIIの化合物の総合的効果は、凝結分析(clotting as say)或いは全血液凝結分析(whole blood coagulation analysis)にて、血液凝結の再構築モデル [J.H.LawsonらのJ.Biol，Chem．269，23357-23366(1994)]において判断することができる-Randらのblood 88，3432-3445(1996)。本発明のこれらの側面の全ては、前記した反応に起因する凝血速度増加の恩恵を受けうる患者へのこの化合物の投与によって実施化することができる。この化合物は、血小板作用（動脈）とトロンビン作用（静脈）の両方の凝血プロセスを含めて、先天的、後天的な血友病や機械的な外傷など、既存の他の薬物療法でトロンビンの活度を高めることによって改善しうる疾病乃至疾患の治療において特に有用である。生体外で用いられるときも、この組成物は同様に、現在入手可能な他の凝血源の代わりに利用される。式Ｉ、II、IIIの化合物は、口から、局所において、或いは非経口的に、吸入、噴霧、又は直腸において、従来の無毒性の製薬として受け入れられるキャリア、助剤、媒体を含有した投薬単位構成によって、投与されることができる。ここで“非経口的"との語は、皮下注射、静脈注射、筋内注射、胸骨部内注射、或いは注入技術(infusion techniques)などを含む。さらに、式Ｉ、II、IIIの化合物と、製薬として受け入れられるキャリアから成る、製薬構成も与えられる。式Ｉ、IIの一又はそれ以上の化合物は、一又はそれ以上の、無毒性で、製薬的に受け入れられるキャリア及び／又は希釈剤及び／又は助剤、さらに所望により他の活性成分とともに存在することができる。式Ｉ、II、IIIの化合物を含む製薬組成物は、口内使用に適した形状であることができる。例えば、錠剤、トローチ、菱形錠剤、水系又は油系懸濁液、分散可能粉末、或いは顆粒、エマルジョン、硬質又は軟質カプセル、或いはシロップ、エリキシルであることができる。口内使用を意図した組成物は、製薬組成物の製造技術の分野において知られた如何なる方法に従っても調製されることができる。そのような組成物は、製薬として上質であって味の良いものを与えるために、甘味剤、香味料、着色材、防腐剤からなるグループより選択される一又はそれ以上の助剤を含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した、無毒性で、製薬として受け入れられる補形薬との混合物の形で、その活性成分を含有するのである。これらの補形薬は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、燐酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチ、アルギン酸などの粒状化、粉砕した助剤、スターチ、ゲラチン、アカシアなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの潤滑剤であることができる。錠剤は、塗布が施されていないものでもよいが、胃腸内において分解、吸収を遅延させるために、公知の手法によってコーティングが施されてあってもよい。コーティングによって、より長時間にわたって効果を維持できる。例えば、グリセリルモノステレート、グリセリルジステレートなどの遅延材料を用いることができる。口内使用のための調剤例としては、活性成分が炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどの不活性固体希釈剤と混合された硬質ゲラチンカプセルとして、或いは、活性成分が水又はピーナッツ油、液体パラフィン、オリーブ油などの油系媒体と混合された軟質ゲラチンカプセルとして与えられることができる。水系懸濁液は、水系懸濁液を作るのに適した補形薬と混合した形でその活性材料分を含む。そのような補形薬は沈殿防止剤であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、メチルセルロース、ハイドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴムなどである。分散剤或いは湿潤剤は、天然に存在する燐脂質であることができる。例えば、レシチン、すなわちアルキレンオキサイドの脂肪酸との縮合物である。また例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル、すなわちエチレンオキサイドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合物である。また例えば、ヘプタデカエチレンオキセタノール(oxycetanol)、すなわちエチレンオキサイドの脂肪酸から誘導される部分エステルとの縮合物である。また例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸エステルなどのヘキシトール、すなわちエチレンオキサイドと脂肪酸から誘導される部分エステルとの縮合物、及びヘキシトール無水物である。また例えば、ポリエチレンソルビトールモノオレイン酸エステルである。水系懸濁液はまた、一又はそれ以上の防腐剤をを含んでいてもよい。例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾネート、一又はそれ以上の着色剤、一又はそれ以上の香味料、サッカロース、サッカリンなどの一又はそれ以上の甘味剤などを含んでいてもよい。油系懸濁液は、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、或いはココナツ油などの植物油中、或いは液体パラフィンなどの鉱油中に活性成分を懸濁することによって調合される。油系懸濁液は、蜜ろう、硬質パラフィン、セチルアルコールなどの濃化剤を含んでいてもよい。上で列挙したような甘味剤、香味料も、味の良い口内用調製物を与えるために添加することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤を添加することによって保存されることができる。調整に適した分散可能な粉末及び微粒子、又は水の添加による水性懸濁液により、活性成分を、分散又は湿潤剤と、懸濁剤と、一又はそれ以上の種類の保存剤との混合物とする。適切な分散又は湿潤剤、及び懸濁剤は、既に、上述した通りものにより例示される。追加の賦形剤、例えば、甘味料、香料及び着色剤を加えてもよい。本発明の医薬組成物を、水中油型エマルジョンの形態としてもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油又はアラキス油、又は鉱物油、例えば液体パラフィン又はこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、天然発生ガム、例えばガムアカシア又はガムトラガカント、天然発生ホスファチド、例えば大豆油、レシチン、及び脂肪酸及びヘキシトール無水から誘導される部分エステル誘導体エステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。エマルジョンは甘味料及び香料を含んでいてもよい。シロップ及びエリキシルは、甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースと共に調合してもよい。本医薬組成物は、無菌注射用の水性又は油性の懸濁液としてもよい。この懸濁液は、上記の適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知の技術により調合してもよい。無菌注射の調合は、無毒の経口許容の希釈剤又は溶媒中の無菌注射溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としてもよい。許容される賦形剤及び溶媒の中でも、水、リンガー溶液及び等張食塩水を使用することができる。さらに、無菌の固定油は、従来から、溶媒又は懸濁媒体として使用される。本目的のために、合成モノ−又はジグリセリドを含む不揮発性の固定油の、どれを使用してもよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を使用した注射用の調合への使用が見出された。式Ｉ、II及びIIIの化合物は、薬物を直腸投与するための坐薬の形態で投与してもよい。これらの化合物は、薬物を適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより調合してもよく、非刺激性の賦形剤は常温で固体であるが、直腸内温度では液体であるため、薬物を放出する直腸内において溶解する。これら材料は、ココアバター及びポリエチレングリコールである。式Ｉ及びIIの化合物は、無菌媒体内において経口にて投与してもよい。本薬物は、使用する賦形剤及び濃度に依存して、賦形剤内で懸濁又は溶解させてよい。好ましくは、局所麻酔、保存剤及び緩衝剤の様な補助剤を賦形剤に溶解することができる。投与レベルは一日に体重kgあたり約0.1mgから約140mgのオーダーが、上記の状態（一日に患者あたり約0.5mg又は7g）の治療において有用である。キャリア物質と組み合わせて単一の投与形態を形成する活性成分の量は、患者及び特定の投与形態に依存して異なる。投与単位の形態は、一般に約1mgから約500mgの活性成分を含むであろう。しかしながら、個々の患者に対する特定の投与レベルは、使用する特定化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路及び排泄率を含めた種々のファクターに依存する。本発明の化合物の合成の例は、スキームＩ及びIIに示す化合物２４（実施例１）に基づいて示される。当業者であれば、次の実施例で示す様に、出発物質を変更してもよく、化合物を生成するため用いられる追加の工程が本願発明に含まれることが理解できよう。スキームＩスキームIIここで、 SuOH − Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド DDC − １,３−ジシクロヘキシルカルボジイミド TEA − トリエチルアミン HH − ヒドラジンモノヒドレート本明細書において開示された、特許を含めた全ての記載及び参考文献は、参考文献としてここに組み込まれる。本願発明は、記載された特定の化合物及び手順に発明の範囲及び精神が制限されることなく構成された次の実施例により、さらに説明される。実施例１ペプチドは、アンダーソン，G.W.、ツィマーマン．J.E.及びカラハン，F.H.（１９６４年）ジャーナルオブケミカルソサエティ８６巻１８３９〜１８４２頁(A nderson，G.W.，Zimmerman．J.E. & Callahan，F.H.（1964）J.Am．Chem．Soc． 86:1839-1842.)に従って調製される。６−ペプリジルアミノ−２−ナフタレンスルフォンアミドは実質的に公知方法と共に米国特許No.5,399,487に記載される方法に従って調製される。反応性基、例えばフリー窒素は必要に応じて保護される。Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈａｒｇ−ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨの合成（この発明において提示される全ての化合物についての典型的な手順）（スキームＩ及びII）Ａ．Ｂｏｃ−Ｌ−ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−ＯＨの合成．当モル量のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを乾燥した１，４−ジオキサンに溶解し、溶液を４℃に冷却し、当モル量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加えた。反応混合物は、４ ℃で終夜維持し、沈澱した１，３−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾別し、濾液は溶剤留去して乾燥した。ジ−Ｂｏｃ−リジンのスクシンイミドエステルはイソプロパノール／ヘキサンから結晶化した。このエステルは、乾燥１，４−ジオキサンに溶解し、等分子量のＨ₂Ｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＮａ及びＮａＨＣＯ₃の水溶液に加えた。反応混合物は室温で終夜維持し、１，４−ジオキサンを留去し、残渣溶液は濃ＨＣｌでｐＨ２の酸性にした。沈澱したＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨは濾別し、水で洗浄して乾燥した。このジペプチドは、乾燥１，４−ジオキサンに溶解し、等分子量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、溶液は４℃に冷却して、等分子量のＤＣＣを加えた。反応混合物は４℃で終夜維持し、沈澱したＤＣＵを濾別し、濾液は溶剤留去して乾燥した。スタシンイミドエステルＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＳｕはイソプロパノール／ヘキサンから結晶化した。このエステルは、乾燥１，４−ジオキサンに溶解して等分子量のＨ₂Ｎ−Ｔｈｒ−ＯＮａ及びＮａＨＣＯ₃の水溶液に加えた。反応混合物は室温で終夜維持し、１，４−ジオキサンを留去し、残渣溶液は濃ＨＣｌでｐＨ２の酸性にした。沈澱したＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−ＯＨは濾別し、水で洗浄して乾燥した。Ｂ．Ｈａｒｇ−ＡＮＳＮ−ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ塩酸塩の合成．ジペプチドＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ） −Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨのスクシンイミドエステルは、パートＡで記載したように調製した。ジペプチドは、トリフルオロ酢酸に溶解し、溶液は室温で１時間放置し、乾燥ジエチルエーテルに投入した。沈澱したＨ₂Ｎ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚトリフルオロアセテートは濾別し、ジエチルエーテルで洗浄して乾燥した。このジペプチドは、アセトンに溶解し、２倍等量のトリエチルアミン及び等量の６−フタルイミド−２−ナフタレンスルホニルクロリドを加えた。反応混合物は、室温で８時間維持し、アセトンを留去し、残渣は水で処理した。沈澱したフタルイミド−ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ（Ｚ） −Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚは濾別し、水で洗浄し、乾燥した。この化合物は、メタノールに溶解し、溶液は加熱して沸騰させ、２倍等量のヒドラジンヒドレートを添加した。反応混合物は室温で１６時間維持し、沈澱したフタルヒドラジドを濾別し、濾液は溶剤留去して乾燥した。ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）− ＯＢｚはメタノールから結晶化し、濾過し、乾燥して次の行程で用いた。この化合物及び等分子量のＦｍｏｃ−Ｈａｒｇ−ＯＨ塩酸塩を乾燥ピリジンに溶解し、 −２０℃に冷却して、等分子量のＤＣＣを添加した。反応混合物は−２０℃で０．５時間、４℃で２時間、そして室温で１６時間維持した。沈澱したＤＣＵは濾過し、ピリジンを留去し、残渣油分はＣＨＣｌ₃−ＰｒＯＨ（３：１）に溶解した。この溶液は水、２Ｎ塩酸、２％Ｎ₄ＨＯＨ及び再度水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄を用いて乾燥し、溶剤留去して乾燥した。Ｆｍｏｃ−Ｈａｒｇ−ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ塩酸塩はイソプロパノールから結晶化した。この化合物はジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）に溶解し、過剰のトリエチルアミンを加え、反応混合物は室温で終夜維持した。ＤＭＦＡを留去し、乾燥ジエチルエーテルを用いてＨａｒｇ−ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ塩酸塩を沈澱させた。Ｃ．Ｈ−ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈａｒｇ−ＡＮＳＮ−ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨの合成．等分子量のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ− ＯＨ及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールをＤＭＦＡに溶解し、溶液は−２０ ℃に冷却し、等分子量のＤＣＣを加えた。反応混合物は、４℃で１時間維持した。等分子量のＨａｒｇ−ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚ塩酸塩のＤＭＦＡ溶液を加え、反応混合物は、４℃で１．５時間、そして室温で１７時間維持した。沈澱したＤＣＵは濾別し、溶剤を留去し、残渣油分はｎ−ブタノール−酢酸エチル（１：１）に溶解した。この溶液は、５％ＮａＨＣＯ₃、１０％ＫＨＳＯ₄及び水で洗浄した。有機溶液を濃縮し、乾燥ジエチルエーテルを用いてＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｈａｒｇ−ＡＮＳＮ −Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＢｚを沈澱させた。乾燥した生成物は、ピリジニウムポリヒドロゲンフルオリドに溶解し、アニソールを加え、溶液を室温で１時間放置した。ＨＦ及びピリジンを留去し、残渣を０．２Ｎ酢酸で処理した。沈澱したクルードのＨ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈａｒｇ−ＡＮＳＮ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ六酢酸塩を濾別し、水で洗浄して乾燥した。合成した化合物の精製は、クロマトグラフィにより、セファデックス(Sephade x)ＬＨ−２０カラム（１×１００cm）上で溶離液としてメタノールを用いて行った。上記の手順により実質的に以下の化合物が合成された。発明の好ましい化合物は、化合物No．２７、２８、３８、１８、１７及び３７（好ましさが減少する順に並べられている）である。発明の特に好ましい化合物は化合物NO．１、２５、２９、３６、３３及び９（好ましさが減少する順に並べられている）である。実施例２阻害定数アッセイメチルスルホキシドに１０ｍＭの溶液すなわち阻害剤を作成し、その後ＨＢＳで１００μＭまで希釈した。得られた１００μＭ溶液の種々の量を１００μＭスペクトロジム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ）ＴＨを含有するＨＢＳに加えた。阻害剤の最終濃度を０，１，２，３，５，７，１０及び１５μＭとした。ＡＰＣを５ｎＭの最終濃度に添加して、基質加水分解の速度を監視した。基質加水分解の転化速度を計算し、図１に示すように阻害剤濃度に対してプロット化した。２００μＭ及び６００μＭスペクトロジムＴＨを用いて実験を繰り返した。最初の実験において、阻害剤及びＡＰＣの濃度は次のようであった。基質加水分解の転化速度を再び阻害剤濃度に対してプロット化した。これら３つのプロットの交点が阻害定数値（２．１μＭ）を与える。本発明の化合物のためのＫ₁を以下の表２に示す。表２同様なバックボーン構造及び変化する保護基（表２）を有する１７の化合物（化合物１及び９〜２４）に関する阻害定数の分析は、これらすべての化合物がＡＰＣ及び第Ｘａ因子を競合的に阻害することを示す。ＡＰＣのための阻害定数は、化合物１８における１．１μＭから化合物１３における２８０μＭまで広範囲に変化する。これらの定数は、阻害剤のＰ及びＰ’構造並びにこれらの構造におけるブロック基の位置に大きく従属することを示す。Ｐ構造においてＨａｒｇだけを含む化合物９は、ＡＰＣの比較的弱い阻害剤であり、比較的高いＫ₁（９０ μＭ）を有する。他方、第Ｖ／Ｖａ因子Ａｒｇ³⁰⁶切断部位のＰ₁−Ｐ₄構造並びにＰ’構造のアミノナフタレンベンジルスルホンアミドを含む化合物１３は、２８０μＭＫ₁でＡＰＣに対してかなり低い親和性を示す。Ａｒｇ³⁰⁶切断部位のＰ₁−Ｐ₄，Ｐ’₃，Ｐ’₄構造を含む化合物１０〜１２は、２８μＭ〜３９μＭの範囲でＫ₁を有する。これら３つの阻害剤のすべての官能基は、種々の保護基によって完全にブロックされることを強調することが必要である。ブロック基の選択的な脱離は、合成された阻害剤の効率を増加させる。従って、ブロックされたＣ−末端カルボキシル機能だけを備えた化合物２３及び２４は、上述の完全にブロックされたアナログよりも低いＫ₁（それぞれ１５μＭ及び７．９μＭ）を有する。さらに、これら２つの化合物（２３及び２４）のＫ₁の比較は、芳香族ベンジル基が脂肪族メチル基に対して望ましいことを示している。ＡＰＣに対する阻害剤親和性に関するブロック基の影響をさらに分析すると、Ｐ構造においてＬｙｓの少なくとも１つのブロックされていない側鎖並びにＰ’構造において完全にブロックされた官能基を含む化合物は、ＡＰＣに対する最も高い親和性を有する（化合物１及び１４〜１９）という結論に至る。ＡＰＣに対するこれらの阻害剤のＫ₁は、１．１μＭから２．３μＭまで変化し、ブロックされていない側鎖を備えたＬｙｓの位置（Ｐ₁ またはＰ₄）によって影響されない（化合物１５と１９の比較）。さらに、両方のＬｙｓ（化合物１６〜１８）の側鎖からの、または、さらにＮ−末端アミノ基（化合物１）からのブロック基の同時脱離は、ＡＰＣに対する阻害剤の親和性に重大な変化を生じさせない。しかしながら、両方のＬｙｓの側鎖がブロックされ、Ｐ₄ＬｙｓのＮ−末端アミノ基だけがブロックされていない場合には、阻害剤のＫ₁は、わずかに上昇する（化合物２０；Ｋ₁４．５μＭ）。ベンジル保護基を備えたＰ₂Ｔｈｒ側鎖のブロックは、ＡＰＣに対する阻害剤の親和性に影響しない（化合物１６と２１の比較）。Ｐ₁位置におけるＨａｒｇとβ−Ｈａｒｇ（化合物１７）またはＤ−Ａｒｇ（化合物１８）との置換により作成された阻害剤は、最初の化合物１６のもの（それぞれ２．３μＭ，１．１μＭ及び１．３μＭ）と同様なＫ₁を有する。表２に示すすべての阻害剤は、第Ｘａ因子の弱い阻害剤であり（第Ｘａ因子／ＡＰＣのＫ₁比は、化合物１６のための５７０ほどに達する）、トロンビンを（ほとんど）阻害しない。実施例３この組織因子経路のトロンビンに対する実験が、蛋白Ｃ（ＰＣ）経路の存在下で血液凝固の再構成モデルにおけるトロンビン生成について化合物１及び９の影響を立証するために行われた（図２）。組織因子（０．５ｎＭ）が、７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）と２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）とからなる４００μＭのＰＣＰＳ小胞内に入れ、再脂質化した。再脂質化した組織因子を、３７℃で２０分間ＨＢＳ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，０．１５ＭＮａｃｌ，２ｍＭＣａＣｌ，ｐＨ７．４）において１．０ｐＭの第ＶＩＩａ因子とともにインキュベートして、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体を形成した。他の蛋白は、プラズマ濃度で用いられた。２０ｎＭの第Ｖ因子、０．７ｎＭの第ＶＩＩＩ因子及び１０ｎＭのトロンボモデュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）を第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体に加えた。反応は、チモーゲン及び阻害剤混合物：１．４μＭのプロトロンビン、１７０ｎＭの第Ｘ因子、９０ｎＭの第ＩＸ因子、７０ｎＭのＰＣ及び４０μＭの化合物１または９（すべて最終濃度）の添加により開始した。対照実験において、阻害剤は不存在であった。第ＶＩＩａ因子の最終濃度は０．５ｐＭであり、組織因子の最終濃度は０．２５ｎＭであった。選択された時点で、２００μＭクロマトジェニック・基質・スペクトロジムＴＨを用いたトロンビン・アミドリティック（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性アッセイのために、５μｌのアリコートが取り除かれ、ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ，０．１５ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）において４０ｍＭのＥＤＴＡ中にクエンチした。実施例４この組織因子経路のトロンビンに対する実験が、ＡＰＣ経路の存在下でかつ第ＶＩＩＩ因子の不存在下で血液凝固の再構成モデルにおけるトロンビン生成について化合物１及び９の影響を立証するために行われた（図３）。組織因子（０．５ｎＭ）が、７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）と２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）とからなる４００μＭのＰＣＰＳ小胞内に入れ、再脂質化した。再脂質化した組織因子を、３７℃で２０分間ＨＢＳ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，０．１５ＭＮａｃｌ，２ｍＭＣａＣｌ，ｐＨ７．４）において２．５ｐＭの第ＶＩＩａ因子とともにインキュベートして、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体を形成した。他の蛋白は、プラズマ濃度で用いられた。２０ｎＭの第Ｖ因子及び１０ｎＭのトロンボモデュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）を第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体に加えた。反応は、チモーゲン及び阻害剤混合物：１．４μＭのプロトロンビン、１７０ｎＭの第Ｘ因子、９０ｎＭの第ＩＸ因子、７０ｎＭの蛋白Ｃ及び４０μＭの化合物１または９（すべて最終濃度）の添加により開始した。対照実験において、第ＶＩＩＩ因子は存在したが、阻害剤は不存在であった。第ＶＩＩａ因子の最終濃度は１．２５ｐＭであり、組織因子の最終濃度は０．２５ｎＭであった。選択された時点で、２００μＭクロマトジェニック・基質・スペクトロジムＴＨを用いたトロンビン・アミドリティック（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性アッセイのために、５μｌのアリコートが取り除かれ、ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ，０．１５ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）において４０ｍＭのＥＤＴＡ中にクエンチした。実施例５この組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）実験が、ＴＦＰＩによる第ＶＩＩａ因子／組織因子阻害について化合物１及び９の影響を立証するために行われた（図４）。組織因子（１０ｎＭ）が、７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）と２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）とからなる２００μＭのＰＣＰＳ小胞内に入れ、再脂質化した。再脂質化した組織因子を、３７℃で２０分間ＨＢＳ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，０．１５ＭＮａｃｌ，２ｍＭＣａＣｌ，ｐＨ７．４）において４ｎＭの第ＶＩＩａ因子とともにインキュベートして、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体を形成した。８ｎＭのＴＦＰＩ及び阻害剤を選択された濃度（０〜２４μＭ）で第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体に加え、その混合物を２分間インキュベートし、酵素複合体のアミドリティック（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性を、２００μＭクロマトジェニック・基質・スペクトロジムＸａの加水分解速度により評価した。実施例６この組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の実験を行い、ＴＦＰＩによる第Ｘａ因子に対する化合物（conpound）１および９の影響を確立した（図５）。８ｎＭのＴＦＰＩおよび選択された濃度（０〜２４μＭ）のインヒビターをＨＢＳ中、４ｎＭの第Ｘａ因子に添加し、混合物を２分間インキュベートし、第Ｘａ因子のアミド分解（amidolytic）活性を２００μＭの染色体性の基質スペクトロザイムＸａ（Spectrozyme Xa）の加水分解速度により調べた。実施例７トロンビンへの組織因子の経路の実験を行い、ＴＦＰＩの存在下および第VIII 因子の不存在下で、血液凝固の再構成されたモデルでのトロンビンの生成について化合物１および９の影響を調べた（図６）。組織因子（０．５ｎＭ）を７５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と２５％のホスファチジルセリン（ＰＳ）から構成された小胞中に入れ再脂質化した。再脂質化された組織因子をＨＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７．４）中で、２．５ｐＭの第VIIａ因子とともに２０分、３７℃でインキュベートし、第VIIａ因子／組織因子複合体を形成させた。他のタンパク質は血漿濃度で用いた。２０ｎＭの第Ｖ因子を第VIIａ因子／組織因子複合体に加えた。反応の開始はチモーゲンとインヒビターとの混合物（１，４μＭのプロトロンビン、１７０ｎＭの第Ｘ因子、９０ｎＭの第IX因子、２．５ｎＭのＴＦＰＩ、および４０μＭの化合物１または９（全ての濃度は最終濃度である））を添加することによって行った。対照実験においては、第VIII因子を存在させ、インヒビターは存在させなかった。第VIIａ因子の最終濃度は１．２５ｐＭで、組織因子の最終濃度は０．２５ｎＭであった。２００μＭの染色体性の基質スペクトロザイムＴＨ（Spectrozyme TH）を用いてトロンビンのアミド分解活性のアッセイを行うために、一定の時間で、５μｌのアリコートを取り出し、ＴＢＳ（２０ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の４０ｎＭのＥＤＴＡに入れてクエンチした。実施例８トロンビンへの組織因子の経路の実験を行い、ＡＰＣ経路およびＴＦＰＩの存在下、第VIII因子が存在しない状態で血液凝固の再構成されたモデルにおけるトロンビンの生成について、化合物１および９の影響を調べた（図７）。組織因子（０．５ｎＭ）を、７５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）および２５％のホスファチジルセリン（ＰＳ）から構成される４００μＭのＰＣＰＳ小胞に入れ再脂質化させた。再脂質化された組織因子をＨＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７．４）中の２．５ｐＭの第VIIａ因子とともに、２０分間３７℃でインキュベートし、第VIIａ因子／組織因子複合体を形成させた。他のタンパク質は血漿濃度で用いた。２０ｎＭの第Ｖ因子と１０ｎＭのトロンボモデュリンを第VIIａ因子／組織因子複合体に添加した。反応の開始はチモーゲンとインヒビターとの混合物（１．４μＭのプロトロンビン、１７０ｎＭの第Ｘ因子、９０ｎＭの第IX因子、７０ｎＭのＡＰＣ、２．５ｎＭのＴＦＰＩ、および４０μＭの化合物１または９、もしくはそれらの両方（各々２０μＭ）（全ての濃度は最終濃度である））を添加することによって行った。対照実験においては、第VIII因子を存在させ、インヒビターを存在させない。第VIIａ因子の最終濃度は１．２５ｐＭであり、組織因子の最終濃度は０．２５ｎＭであった。一定の時間に、５μｌのアリコートを取り出し、２００μＭの染色体性の基質スペクトロザイムＴＨを用いてトロンビンアミド分解活性アッセイのためにＴＢＳ（２０ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の４０ｍＭのＥＤＴＡでクエンチした。トロンビンの濃度を標準直線から計算した。実施例９トロンビンへの組織因子経路の実験を行い、血液凝固の再構成されたモデルにおいてトロンビンの生成に対する化合物１、９および２６の影響を調べた（図８）。組織因子（０．５ｎＭ）を７５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）および２５％のホスファチジルセリン（ＰＳ）から構成された４００μＭの小胞に入れ再脂質化した。再脂質化した組織因子をＨＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７．４）中の２．５ｐＭの第VIIａ因子とともに、２０分間３７℃でインキュベートし、第VIIａ因子／組織因子複合体を形成した。他のタンパク質は血漿濃度で用いた。２０ｎＭの第Ｖ因子と０．７ｎＭの第VIII因子を第VIIａ因子／組織因子複合体へ添加した。反応の開始はチモーゲンとインヒビターとの混合物（１．４μＭのプロトロンビン、１７０ｎＭの第Ｘ因子、９０ｎＭの第IX因子、および４０μＭの化合物１、９、もしくは２６（全ての濃度は最終濃度である））を添加することによって行った。対照実験としては、インヒビターを存在させなかった。第VIIａ因子の最終濃度は１．２５ｐＭであり、組織因子の最終濃度は０．２５ｎＭであった。一定の時間に５μｌのアリコートを取り出し、２００μＭの染色体性の基質スペタトロザイムＴＨを用いるトロンビンアミド分解活性アッセイ用に、ＴＢＳ（２０ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中、４０ｍＭのＥＤＴＡに入れてクエンチした。図２に示した実験結果（実施例３）はＰＣが存在しない条件において（白丸）、トロンビン生成の上昇する相（explosive phase）が開始の約２分後に見られる。プロテインＣ経路は開始相を約１０分間延長し、トロンビン生成の最大速度を減少している（黒丸）。化合物１もしくは９の存在は、ＰＣ経路の存在を完全に補い、トロンビン生成速度をＰＣが存在しない場合よりも高い限度にまでシフトする（三角）。この効果はＡＰＣによる第Ｖａ因子と第VIIIａ因子の不活性化の遅れと、凝血カスケードの促進化とにより引き起こされる。同様の結果が実施例４（図３）で得られている。第VIII因子が存在しないとき（白丸）、すなわち、血友病Ａの状態と同じような状況において、トロンビン生成の上昇する相が約３分ほど遅れる。しかし、化合物１もしくは９が存在するとき、第VIII因子が存在しないことは完全に補われる（ダイヤ型）。さらに、トロンビン生成の上昇する相は、第VIII因子が存在する対照実験よりも早期に生じている（黒丸）。化合物１の存在下および第VIII因子が存在しないとき（白ダイヤ型）のトロンビン生成の最大速度は、対照実験もしくは化合物９が存在するときよりも顕著に大きかった。この化合物１の効果は、化合物９よるものよりもこの化合物のＡＰＣに対するより高い親和性に起因し、従って、ＡＰＣによる不活性化に対する第Ｖａ因子および第VIIIａ因子のより効率的な保護に起因するものである。第VIIａ因子／組織因子複合体および第Ｘａ因子のインビボにおける既知のインヒビターのうちで、ＴＦＰＩが最も効率的であると思える。下記に示した実験結果は明確に、ＴＦＰＩが第VIIａ因子／組織因子複合体または第Ｘａ因子により開始される酵素的反応の速度を顕著に遅くらせ、反応を停止さえする、ことを示している。図４および図５に示されたデータは、ＴＦＰＩの存在下において、第VIIａ因子／組織因子複合体（図４、実施例５）や第Ｘａ因子（図５、実施例６）の活性がＴＦＰＩが存在しないときに示されるものより数％減少していることを示している。テストした両化合物（＃１および＃９）は両方の酵素、第Ｘａ因子および第VIIａ因子／組織因子複合体に関して濃度依存的にＴＦＰＩの影響を減少することができる。それらはＴＦＰＩによる抑制に対して類似した効率的な保護を示す。従って、第VIIａ因子／組織因子複合体のアミド分解活性を５０％回復させるのに必要な化合物１の濃度は１０μＭであり、化合物９の必要な濃度は１１ μＭである。両化合物は第Ｘａ因子の保護の場合には効率がよくない。従って、第Ｘａ因子のアミド分解活性を５０％回復させるのに必要な化合物１の濃度は２６μＭであり、一方、このような効率に達するのに必要な化合物９の濃度は２６ μＭとなる。実験の複雑性を増加し、ＴＦＰＩの存在下でトロンビンへの組織因子経路の再構成されたモデルにおいてトロンビン生成を促進する化合物１および９の能力をテストした（実施例７，図６）。この実験の結果は、ＴＦＰＩがトロンビン生成の上昇する相を遅らせることを示している（白丸）。さらに、第VIII因子が存在しないとき、トロンビン生成の遅れた相（lag phase）が有意に延びており、反応の最大速度は約１０倍ほど、対照実験（黒丸）よりも低い。化合物１および９は第VIII因子が存在しないことを補うばかりか、反応が対照実験よりもより早く上昇するトロンビン生成相に達するようにする（三角）。これらのデータはＴＦＰＩによる不活性化から系内の酵素や酵素的な複合体を保護することを示している。実施例８に記載された実験（図７）で、血友病Ａの場合にインビボで生じる状況と同じような状況、すなわち凝血カスケードが凝血のアンタゴニストの存在下（ＴＦＰＩおよびＰＣ経路）で、第VIII因子が存在しない状況で開始される状況（黒丸）を作り出した。これらの条件下で、トロンビン生成は僅かにしか検出できず、３０分以内に上昇する相に達することもない。化合物１もしくは９の存在下（三角）またはそれらの等モル混合物（四角）の存在下において、第VIII因子が存在しないことは完全に補われた。反応の遅れた相はＴＦＰＩからの酵素の保護により減少し、一方、ＡＰＣの阻害はトロンビン生成の最大速度を増加する原因となった。化合物１もしくは９が存在したとき、図２、３、６、７に示された実験におけるトロンビン生成の過度な速度は、これらの化合物が凝血のインヒビターが存在しない系内においてトロンビン生成を増加することができるか否かという疑問を生じる。従って、次のトロンビンへの組織因子経路の実験はプロテインＣおよびＴＦＰＩが存在しない条件で行った。図８（実施例９）に示されるデータは、化合物１、９、および２６がトロンビン生成の遅れた相（lag phase）を減少できることを明確に示している。化合物１および２６は、またプロトロンビン活性化の最大速度を上昇することができる。従って、実施例２〜９に示されたデータは、本願発明で示される化合物が以下の理由により潜在的なプロ血液凝固体（procoagulant）であることを示している。１．ＡＰＣの抑制２．ＴＦＰＩからの第VIIａ因子／組織因子複合体の保護３．凝血カスケードの促進化実施例１０血しょう凝固実験は、合成された化合物の影響を立証するようにインビボで血しょう凝固時間について行われた（テーブル３）。一つの試験管内に入れられたクエン酸化された血しょう１００μｌとＨＢＳ１００μｌと、別の試験管内に入れられたＰＣＰＳで再脂質化された組織因子を含むＨＢＳ中の２５ｍＭＣａＣｌ₂１００μｌと選択された合成化合物（ＤＭＳＯ中で１０ｍＭ貯蔵液）とが、３７℃で２分間インキュベートされた。二つの試験管の中身は一緒に混ぜ合わされ、血しょう凝固時間は目に見えるように立証された。最終的な反応物質の濃度は、組織因子／ＰＣＰＳ０．６２５ｎＭ／２．５μＭ、合成化合物４０μＭである。対照実験において、合成化合物はなく、対応する量のＤＭＳＯが存在した。実施例１１血液凝固実験は、合成された化合物の影響を立証するようにインビボで血液凝固時間について行われた（テーブル４）。１ｍｌの新鮮な血液は、コーントリプシン阻害剤５０μｇ／ｍｌと５０ｎＭＰＣＰＳで再脂質化された２５ｐＭ組織因子と２０μＭ化合物２５−２７とを含む試験管の中に注入された。血液凝固時間は目に見えるように立証された。対照実験において、化合物はなく、２μｌのＤＭＳＯが存在した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マン、ケネスジー. アメリカ合衆国 05458 ヴァーモント州グランドアイルイーストショーアロードサウス 72

Claims

【特許請求の範囲】１．式に示す化合物、あるいは薬剤として受け入れ可能な無害の塩であって、Ｒ₁がベンジル基、あるいは式のペプチドであり、Ｒ₃とＲ₄は、遊離あるいは保護アミノ酸側鎖を独立に表し、Ｒ₅は、ヒドロキシ、アルコキシ、ベンゾキシ、アミノ酸、あるいはペプチド残基であり、Ｒ₂はアミノ酸、あるいはペプチド残基である化合物。２．式に示す化合物、あるいは薬剤として受け入れ可能な塩であって、Ｒ₃とＲ₄は、遊離あるいは保護アミノ酸側鎖を独立に表し、Ｒ₅は、ヒドロキシ、アルコキシ、ベンゾキシ、アミノ酸、あるいはペプチド残基であり、Ｒ₆は、スルホンアミド窒素原子を介してペプチド基に付加された６−アミノナフタレンスルホンアミド、あるいは末端窒素原子を介してペプチド基に付加された遊離、あるいは保護のどちらかのアミノ基である化合物。３．式に示す化合物、あるいは薬剤として受け入れ可能な塩であって、Ｒ₁がベンジル基、あるいは式のペプチドであり、Ｒ₃とＲ₄は、遊離あるいは保護アミノ酸側鎖を独立に表し、Ｒ₅は、ヒドロキシ、アルコキシ、ベンゾキシ、アミノ酸、あるいはペプチド残基であり、Ｒはアミノ酸、あるいはペプチド残基を表し、Ｒ₂は、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモアルギニン、あるいはβ−ホモアルギニンの側鎖を表している化合物。４．Ｒ₂は、Ｌ−、あるいはＤ−アルギニン、ホモアルギニン、あるいはβ−ホモアルギニンである請求項１に記載の化合物。５．Ｒ₂は、カルボキシル末端でＬ−、あるいはＤ−アルギニン、ホモアルギニン、あるいはβ−ホモアルギニンを有するペプチドである請求項１に記載の化合物。６．下記から成る基から選択された化合物。