JP2001503376A

JP2001503376A - Cobalt-Schiff base compounds

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Publication number: JP2001503376A
Application number: JP52223997A
Authority: JP
Inventors: ミード、トーマス・ジェー; タケウチ、トシヒコ; グレイ、ハリー・ビー; サイモン、メルヴィン; リューイ、アンジェリーク・ワイ
Original assignee: カルフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー
Priority date: 1995-12-12
Filing date: 1996-12-12
Publication date: 2001-03-13
Also published as: AU1333697A; EP1021176A1; WO1997021431A1; AU720841B2; EP1021176A4; IL124844A0; CA2240183A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、２価もしくは３価のコバルトが水溶性の四配位のシッフ塩基によって配位されているコバルト化合物に関する。この四配位のシッフ塩基は好ましくは配位原子として、２個の窒素原子と２個の酸素原子を含んでいる。本発明の化合物は、ポリペプチドや核酸のような標的分子部分を含んでおり、チロンビンなどの酵素を阻害するように用いられ、またジンクフィンガー蛋白質を阻害する。 (57) [Summary] The present invention relates to a cobalt compound in which divalent or trivalent cobalt is coordinated by a water-soluble tetracoordinate Schiff base. The four-coordinate Schiff base preferably contains two nitrogen atoms and two oxygen atoms as coordination atoms. The compounds of the present invention contain a target molecule moiety, such as a polypeptide or nucleic acid, and are used to inhibit enzymes such as thyrombin, and also inhibit zinc finger proteins.

Description

【発明の詳細な説明】コバルト・シッフ塩基化合物［技術分野］本発明は、コバルト化合物およびそのような化合物を用いてタンパク質の生物活性を低減させる方法に関するものである。［背景技術］近年、生物活性を持つ金属錯体や含金属タンパク質の構造の解明が大きく進んだため、医薬への金属の利用がめざましく発展してきた。現在のところ、３価のＣｏ(III)を含むコバルト含有化合物類には抗ウイルス活性、抗腫瘍活性および抗菌活性があることが分っており、さらに炎症や火傷の治療にも利用できることが明らかにされている（米国特許第４８６６０５４、４８６６０５３、５０４９５５７、５１０６８４１、５１４２０７６、５２１００９６号およびウーレイらによる「エイジェント・アンド・アクション」（Agents and Actions）誌、３５巻、２４４頁、（１９９２年）を参照）。これらの錯体は下記のような基本構造を有している。これらの錯体は活性酸素や超酸化物の拮抗剤であると考えられているため、炎症のようなフリーラジカルを伴なう症状を鎮めるものと考えられている。さらに、イソプロピルサリチル酸のＣｏ(II)錯体が作られ、これに細胞毒性があることが報告されている（ランフォードらによる「ジャーナル・ケミカル・ソサイティ・ダルトン・トランスアクション」（J.Chem.Soc.Dalton Trans.）誌、１９９３年、３３９３頁参照）。また、窒素マスタードが配位した、ある種のＣｏ(III)錯体を酸化すると、拡散性の細胞毒として作用する活性脂肪族マスタードを遊離する（ウエアーらによる「ジャーナル・メディカル・ケミストリー」（J.Med.Chem.）誌、３６巻、１８３９頁（１９９３年）参照）。［発明の開示］本発明の目的は、標的分子（分子部分を含む）を含有するコバルト化合物を含めた、新しいコバルト化合物を提供することである。さらに本発明は、これらのコバルト化合物を用いて、酵素のようなタンパク質の活性を阻害する方法を提供することも目的とする。上記の目的を達成するため、水溶性四座配位シッフ塩基Ｃｏ(II)錯体からなる物質を提供する。さらに、下記第１式の構造を持つ化合物を提供する。（第１式）第１式において、ＣｏはＣｏ(II)でもＣｏ(III)でもよく、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄ 、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈は、それぞれ、水素、アルキル基、アリール基、疎水性有機酸、アルキルアルコール、アルコール、アルキルアミン基、アミン基、もしくは標的分子である。また、第１式において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄が、それぞれ、水素、アルキルもしくはアリールである化合物も提供する。また、第１式のコバルト化合物にタンパク質が結合した、タンパク−コバルト化合物錯体も提供する。さらに、選択したタンパク質と第１式の化合物とを接触させて、選択したタンパク質を失活させる方法を提供する。加えて、ジンクフィンガー・タンパク質と上記のコバルト化合物とを接触させて、ジンクフィンガー・タンパク質を失活させる方法を提供する。［図面の簡単な説明］第１図には、トロンビンの失活を示した。２５℃で３．０７×１０^-9Ｍのトロンビンについてアメリカン・ダイアゴノスティック（American Diagnostic）社製のスペクトロザイム（Spectrozyme）THを用いて調べた。反応は、温度制御して、ヒューレット・パッカード社ＨＰ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計によって４０６ｎｍでモニターした。すべての実験は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のポリエチレングリコール、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８で行った。Ｃｏ(III)カルボキシプロピル(ＮＨ₃)₂（図中ではC o(carboxypropyl)と表記した）は、ペプチドNH₂-GGGdFPR-CO-NH₂（図中ではペプチドｄＦＰＲと表記した）の活性部位と結合する。測定された失活は、Co(carbo xypropyl)(NH₃)₂、ペプチド、およびＣｏ(III)acacen(NH₃)₂C1（図中ではCo(aca cen)と表記した）を上回っている。このことは、コバルト化合物に結合した公知の阻害剤は、結合していないものの阻害活性に比べて、酵素阻害能力が大幅に増加することを示している。第２図には、Ｃｏ(III)(acacen-GGGFPR)(NH₃)₂の構造を示している。第３Ａ図及び第３Ｂ図には、酵素失活速度の温度依存性が、配位子交換速度に関係していることを示した。（Ａ）：温度依存性（実施例３を参照）、（Ｂ）：配位子交換速度（実施例３を参照）。第４図には[CoIII(acacen)(NH₃)₂]Clによるトロンビンの阻害を示した。トロンビンは、（Ａ）では０ＭのＣｏ(III)と、（Ｂ）では２．５ｍＭのＣｏ(III) と共に室温で１２時間インキュベートした。３０分毎に３０秒かけてスペクトルを測定し、市販の物質を酵素が加水分解することで生じるｐ−ニトロアニリンの遊離をモニターした。第５図には、トロンビンの阻害が、阻害剤の濃度、インキュベート時間・インキュベートの温度に依存することを示した。第６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈおよび６Ｉ図には、本発明のコバルト化合物で合成されたものの構造を示した。特に記載していない限り化合物は、すべてＣｏ(III)化合物である。［発明を実施するための最良の形態］以下に述べるように、本発明は、タンパク質表面のヒスチジンのような機能部位と交換もしくは結合して、機能部位とコバルト化合物の錯体を形成することでタンパク質の生物活性を失活させることのできるコバルト化合物に関するものである。本発明のコバルト化合物はＣｏ(II)（以下、Ｃｏ⁺²と表記することもある）でも、Ｃｏ(III)（以下、Ｃｏ⁺³と表記することもある）でも用いることができる。一般に、Ｃｏ(II)化合物は４つまで配位原子を持つことができ、一つだけ軸配位子を持つことができるし、水分子が一方もしくは両方の軸配位子の位置で弱く結合することも可能である。同様にＣｏ(III)化合物は６つまで配位原子を持つことができ、そのうち２つをここでは軸配位子の位置とする。『軸配位子』とは、ここでは、一般に下記の構造式における第５あるいは第６番目の配座に位置している配位子Ｌ₁もしくはＬ₂を意味する。理論的に制約を受けるものではないが、本発明のコバルト化合物は、軸配座での配位子の交換もしくは付加によって生物活性を持たせることが可能である。本発明のコバルト化合物の生物活性は、新しい配位子、最も好ましくはヒスチジン側鎖のイミダゾールの窒素が結合することによって生じるものである。おそらく、標的のタンパク質が生物活性を示すために、コバルト化合物の新しい配位子となるアミノ酸が必要なのであろう。従って、以下に詳しく述べるように、活性部位のヒスチジンを使う酵素のようなタンパク質や、例えば重要な金属イオンと結合するためにヒスチジンを使うタンパク質は、コバルト化合物の軸配座にヒスチジンが結合して、通常の生体機能反応に寄与できなくなるために失活することになる。コバルトがＣｏ(III)の場合、Ｃｏ(III)錯体はある特定の２つの軸配位子を持って合成され、それから、例えば、タンパク質に加えられると、元からの軸配位子に代って、タンパク質由来の１つあるいはそれ以上の配位子が置き代わる。このようなことは、タンパク質の軸配位子のコバルト化合物に対する親和性が元からの軸配位子よりも強い場合でも、あるいは新しい配位子を高濃度で存在させて軸配位子の平衡をタンパク質由来の軸配位子が結合するようにした場合でも起こる。従って、このようにしてＣｏ(III)錯体は、軸配位子を他の配位子で置換することができる。理論的に制約を受けるものではないが、コバルトがＣｏ(II)の場合、このような化合物は特定の条件の下で一つの軸配位子を持つ。本発明のＣｏ(II)化合物は軸配位子のない状態で合成することが好ましい。タンパク質と共にインキュベートすると、ヒスチジン側鎖のイミダゾールの窒素原子のようなタンパク質中の特定の部位が軸配位子となり、強く結合したタンパク質−コバルト化合物錯体ができる。このようなことは、シッフ塩基の４つの原子が配位したＣｏ(II)化合物が、例えば、イミダゾール部位に結合し、酸化されてＣｏ(III)化合物になる場合に起こる。これは、Ｃｏ(II)化合物がタンパク質と結合することで酸化されてＣｏ(III)化合物になるので、ある意味で還元反応であると考えることもできる。このようにして、イミダゾール軸配位子は第５の配位原子となり、強く結合する。好ましい態様は、目的とする標的タンパク質に含まれるヒスチジン中のアミノ酸側鎖のイミダゾール窒素原子が新しい軸配位子となっているものである。実施例およびここでの開示では、特にこのヒスチジンについての態様について述べるが、どのような『コバルト反応性アミノ酸』でも新しい軸配位子とすることが可能である。『コバルト反応性アミノ酸』とは本発明のコバルト化合物に軸配位子として結合することができるものを言う。上記のように、ヒスチジン側鎖のイミダゾールの窒素が特に好ましいが、この他にも、トリプトファン側鎖の芳香族インドールの窒素原子、システインおよびメチオニン側鎖の硫黄原子、アルギニン、リシン、アスパラギンあるいはグルタミンなどのアミノ基を軸配位子とする態様も可能である。これらの部位は酸性条件下では軸配位子として好適な電子供与体ではないので、タンパク質または酵素を含む溶液のｐＨによって使用できるかどうかが決まる。本発明は、好適な新しい軸配位子を有するタンパク質と錯体を形成するコバルト化合物を提供するものである。一つの態様として、本発明はＣｏ(II)の水溶性四座配位シッフ塩基化合物を提供するものである。『四座配位』とは、Ｃｏ(II)の配位子であるシッフ塩基化合物が４つの配位原子を持っていることを意味する。好ましい態様は、２つの窒素原子と２つの酸素原子が配位原子となっているものである。『シッフ塩基』とは、置換したイミンを意味する。置換基は以下に述べるようなものである。一般にシッフ塩基は、アミンと脂肪族アルデヒドとの縮合反応によって生成し、アゾメチンの窒素原子上で置換が起きたものである。『コバルト化合物』とはコバルト原子と結合した四座配位シッフ塩基を意味する。このシッフ塩基は置換されていても、置換されていなくてもよく、コバルトはＣｏ(II)でもＣｏ(III)でもよい。好ましい態様では、コバルト化合物は第１式に示すような構造を有している。（第１式）この態様においては、ＣｏはＣｏ(II)でもＣｏ(III)でもよく、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃ 、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈は、それぞれ、水素、アルキル基、アリール基、疎水性有機酸、アルキルアルコール、アルコール、アルキルアミン基・アミン基、もしくは標的分子である。ＣｏがＣｏ(II)の場合、Ｒ₁からＲ₈のうち少なくとも一つは、化合物が水溶性となるような親水性基でる。ＣｏがＣｏ(III)の場合、Ｒ₁からＲ₈のうち少なくとも一つは、標的分子である。『アルキル』もしくは『アルキル基』あるいは文意上これらと同じ言葉は、直鎖もしくは分鎖アルキル基を意味するが、直鎖アルキル基が好ましい。分鎖の場合、一箇所もしくはそれ以上の場所で分岐しているかもしれないが、特に言及しない限り、どこで分岐していてもよい。また、アルキル基の定義には、Ｃ₅あるいはＣ₆といった環状アルキル基も含める。場合によっては、二つのＲ基が環状構造の一部となっていて、両者が環状構造を通じてつながることもある。アルキル基の炭素数は１から２０（Ｃ₁〜Ｃ₂₀）であり、好ましくは、１から１０（Ｃ₁〜Ｃ₁₀）、さらに好ましくはＣ₁から約Ｃ₅までである。しかし、ある態様ではアルキル基は大きくてもよく、直鎖アルキル基の場合は特にそうである。メチル基は特に好ましい。『アリール』もしくは『アリール基』とは、フェニル、ベンジル、ナフチルおよびピリジン、フラン、チオフェン、ピロール、インドール、プリンなどのヘテロ環の芳香族環、および窒素、酸素、硫黄あるいはリンなどを含むヘテロ環などを含む芳香族環を意味する。アルキル基およびアリール基は置換されていてもよく、例えば、フェニル基は置換されたフェニル基でもよい。好適な置換基の例としては、アルキルおよびアリール基、塩素、臭素、フッ素のようなハロゲン、アミン、カルボン酸、ニトロ基などが挙げられるが、もちろん、これらに限定されるものではない。『親水性有機酸』あるいは文意上これらと同じ言葉は、一つもしくはそれ以上のカルボキシル基−ＣＯＯＨを持つアルキル基、すなわち、カルボン酸を意味する。すでに述べているように、アルキル基は置換されていても、置換されていなくてもよい。少なくとも一つのカルボキシル基がアルキル炭素についたＣ₁からＣ₂₀のアルキル基が用いられるが、Ｃ₁〜Ｃ₅が好ましい。特に好ましい態様は、アルキル基の末端にアルボキシル基がついているものである。他の好ましい親水性有機酸の例としては、ホスホン酸系やスルホン酸系を挙げることができる。好ましい親水性有機酸はプロピオン酸である。一つの好ましい態様は、Ｒ基のうちの一つのみが親水性有機酸であるものである。Ｃｏ(III)の場合、このような化合物は電気的に中性なので、血液脳関を通ることができる。特に好ましいものは、下記第２式に示した構造を持つものである。（第２式）さらに、第２式に示したアルキル基の長さを変えて、カルボキシル基が「グルリ」と回って軸配位子となるのを促進したり、妨害したりすることができる。『アミン』とは、−ＮＲＲ’基を意味する。この態様においては、ＲとＲ’とは同じでも異っていてもよく、水素、アルキルあるいはアリールである。好ましい−ＮＲＲ’基は、−ＮＨ₂である。『アリールアミン基』とは、先に定義した−ＮＲＲ’基を有する、先に定義したアルキル基である。先に定義したように、アルキル基は置換されていても、置換されてなくてもよい。好ましいアリールアミン基はｎ−プロピルアミンおよびｎ−ブチルアミンである。『アルキルアルコール』とは、−ＯＨ基を有するアルキル基を意味する。先に定義したように、アルキル基は置換されていても、置換されていなくてもよい。アルキルアルコールはアルキル基によって１級、２級あるいは３級のいずれでもよい。好ましい態様においては、アルキルアルコールは直鎖１級アルコールで、一般に少なくとも３つの炭素を有するものである。好ましいアルキルアルコールの例としては、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−ペンチルアルコール、ｎ−ヘプチルアルコール、ｎ−オクチルアルコールなどを挙げることができるが、もちろん、これらに限定されるものではない。ここで『アルコール』とは−ＯＨ基を意味する。一つの好ましい態様は、Ｒ₁からＲ₈のうち一つが標的分子になっているものである。Ｒ基の一つのみが標的分子になっていることが好ましい。別の態様では、二つ以上のＲ基が標的分子となっていてもよい。第１式のＣｏがＣｏ(III)の場合、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈のうち少なくとも一つは、標的分子である。ここで「標的分子」とは、標的となる蛋白質との間で特異的な相互作用を示す機能性分子群を意味する。これにより、本発明のコバルト化合物が特定の標的蛋白質に向かって標的を定めることを可能になる。すなわち、このコバルト化合物は、標的の蛋白質と特異的に結合するか、あるいは連係することのできる標的分子（標的化合物あるいは標的分子部分）と共有結合により結合している。たとえば、本発明のコバルト化合物は、プロテアーゼを阻害することが知られているポリペプチド阻害剤を含んでいてもよく、これにより、標的蛋白質上の機能性部位におけるコバルト化合物の局在濃度を効果的に増加させることができる。限定するものではないが、適当な標的分子としては、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ホルモン（蛋白質性のホルモンおよびステロイドホルモンを包含する）、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体等を挙げることができる。好ましい例としては、Ｒ基の一つとして標的分子を含むコバルト化合物は、蛋白質（酵素であっても、酵素でなくてもどちらでもよい）を阻害することができるものである。「蛋白質の阻害」という言葉は、蛋白質の生物学的活性が、阻害剤の結合によって、減少するか、除去されることを意味する。酵素の場合には、阻害は、酵素活性の減少あるいは失活をもたらす。たとえば、プロテアーゼ基質あるいは阻害剤を含むポリペプチドをコバルト化合物のＲ基として用いて、選択的にプロテアーゼを阻害するようにさせるることができる。同様に、転写因子のような特定の核酸に結合する蛋白質に特異的に結合することのできる核酸をＲ基として有するコバルト化合物を用いて、選択的に転写因子を阻害することもできる。これらの標的化処理されたコバルト化合物は、蛋白質の標的部位に優先的に結合して、他の部位や他の蛋白質に対する非特異的な結合に対して、その部位に有為な地位を与える。この結果、得られる化合物は、他の部位と相互作用に関与する分子がより少なくなり、また他の蛋白質の阻害の為の副作用を低減させることができるため、より低い濃度でも、高い効果を示すようになる。２次的な相互作用によってもまた、標的に存在する時間を増加させるため、リガンド（配位子）交換の機会を増加させる。特定のタンパク質に対するコバルト化合物を設計する場合、コバルト化合物がイミダゾール部位あるいは他の反応性軸配位子部位と高い親和性を持っているため、コバルト化合物は活性部位と必ずしも完全に結合しなくてもよいことを理解すべきである。むしろ、重要な事は、コバルト化合物が目的とする軸配位子部位に接近できることである。例えば、酵素の活性残基を狙う場合、コバルト化合物は一般に典型的な酵素基質や阻害剤よりも大きくてはならない。目的とする生物活性部位との外圏での相互作用は、コバルト化合物試薬の正味の大きさや表面の特性によって決る。外圏での相互作用が最良になるように、コバルト化合物試薬の大きさ、電荷、柔軟性、立体化学、表面特性などを調整する。従って、目的とするタンパク質や酵素の性質を利用して適当な阻害剤を設計する。また、実施例で示したように、タンパク質の活性部位あるいはその近傍でのコバルト化合物の局所的な濃度を増加させることで、コバルト化合物の結合を充分に増加させ、それによってタンパク質の生物活性を阻害して、酵素の阻害ならば、Ｋ_m値やＫ₁値を効果的に減少させることができる。標的蛋白質が、ヒスチジンあるいは他のコバルトに対する反応性（これが作用的には重要である）を示すアミノ酸を持っていることが知られている場合には、Ｃｏ(II)とＣｏ(III)のいずれをも用いることができるが、Ｃｏ(III)が好ましい。標的蛋白質の作用的な機構が不明である場合にも、Ｃｏ(II)とＣｏ(III)のいずれも用いることができるが、Ｃｏ(II)が好ましい。好ましい例としては、コバルトに反応性を示すアミノ酸が標的分子の結合部位に近接する例を挙げることができる。『ポリペプチド』とは２から１５のアミノ酸残基がペプチド結合によって共有結合してなる化合物を意味する。好ましい態様には、２から８ぐらいまでのアミノ酸のものが用いられるが、４から６ぐらいまでのものが最も好ましい。以下に述べるように、アミノ酸類似物も用いることができるが、天然のＬ体のアミノ酸を用いることが好ましい。特定の条件下では、たった一つのアミノ酸残基をポリペプチドとしてもよい。さらに、ある種の態様では、好ましくはないが、ポリペプチドが大きく、ほとんどタンパク質になっているくらいのものを用いることもできる。ポリペプチドとしてグリコシレートで処理されたものを用いるのも、一つの態様である。ポリペプチドの定義には、擬ペプチド構造やアミノ酸類似物も含まれる。従って、例えば、非天然側鎖や非天然の結合のものを、例えば、生体内で分解されるのを妨げたり遅らせたりするために用いることができる。また、アミノ酸側鎖は（Ｒ）体もしくはＤ体でもよい。さらに、通常はペプチド結合、すなわちペプチドカルバモイル基−ＣＯＮＨ−で結合しているアミノ酸が擬ペプチド結合によって結合していてもよい。このような擬ペプチド結合の例として、−ＣＨ₂-ＮＨ− 、−ＣＯ−ＣＨ₂-、アザペプチドおよびレトロインバージョン結合などが挙げられる。本明細書で『核酸』とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはデオキシヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む分子を意味する。一般に、核酸はヌクレオチドが３から約５０のオリゴヌクレオチドであるが、約１２から約３６ぐらいまでのヌクレオチドが好ましく、少なくとも２１のヌクレオチドがあることが特に好ましい。溶解性を得るために核酸を単独で用いる場合、核酸は小さくしてもよく、場合によっては一つのヌクレオチドでもよい。ヌクレオチドは天然のものでもよく、合成ヌクレオチドでも、あるいは天然と合成ヌクレオチドのいかなる組み合せでもよいが、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニンおよびグアニンが好ましい。以下に詳しく述べるように、核酸には遺伝子ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびセンスあるいはアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレチドを含める。核酸は一重らせんでも、二重らせんでも、部分的に一重らせんあるいは二重らせんを含んでいるものでもよい。特に好ましい態様は、例えば、ジンクフィンガー転写因子を対象とする場合、核酸は二重らせんにする。このようにするとジンクフィンガータンパク質が核酸の二重らせんの大きな溝に結合する。一般に核酸にはホスホジエステル結合が含まれているが、場合によっては、核酸は以下に述べるような、類似の骨格を有していてもよい。このようなものの例としては、ホスホロアミド（ビューケージらによる Tetrahedron誌 49(10):1925 (1993)およびそこに記載の参考文献、レットシンガーによるJ.Org.Chem．誌35:3 800(1970)、スプリンザルらによる Eur.J.Biochem.誌 81:579(1977)、レットシンガーらによるNucl.Acids Res．誌14:3487(1986)、サワイらによるChem.Lett. 誌 805(1984)、レットシンガーらによるJ.Am.Chem.Soc．誌110:4470（1988）およびパウエルらによるChemca Scripta 誌 26:141 91986を参照）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｏ−メチルホスホロアミド結合（エクスタイン著、『0ligonucleotides and Analogues;A practical Approach』Oxford Univer sity Press発行を参照）、ペプチド核酸結合（エグホーンによるJ．Am.Chem.Soc .誌 114:1895(1992)、メイヤーらによるChem.Int.Ed.Engl.誌 31:1008(1992)、ニールセンによるNature 誌 365:566(1993)を参照）などが挙げられる。これらのリボース・リン酸エステル骨格の修飾は、コバルト化合物の付加を容易にするために行なってもよいし、また、以下に述べるように、生理学的環境でのこれらの分子の安定性を増し、半減期を延ばすために行なってもよい。本明細書で用いられている『炭水化物』は、一般式Ｃ_x（Ｈ₂Ｏ）_yで表わされる化合物を意味する。単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類のいずれもが、この定義に包含され、また、グリコシド結合によいって結合している種々の糖分子の重合物も含まれる。特に好ましい炭水化物は、グリコシル化された蛋白質（ガラクトース、マンノース、フコース、ガラクトサミン、（特にＮ−アセチルグルコサミン）、グロコサミン、グルコース、そしてシアル酸などのモノマーやオリゴマーが含まれる）、そして特に細胞表面受容体のようなある種の受容体に対する結合を許容するグリコシル化成分である。炭水化物の他の例としては、グルコース、リボース、ラクトース、ラフィノース、フルクトース、そして他の生物学的に重要な炭水化物のモノマーや重合物を挙げることができる。本明細書で用いられている『脂質』は、脂肪、脂肪油、ワックス、燐脂質、糖脂質、テルペン、脂肪酸、そしてグリセリドを意味するが、特にはトリグリセリドを意味する。この脂質の定義には、エイコサノイド、ステロイド、そしてステロールが包含され、その内のいくらかが、プロスタグランジン、オピエート、そしてコレステロールなどのようなホルモンであってもよい。ホルモンには、ステロイドホルモンと蛋白性のホルモンが含まれ、またエピネフリン、チロキシン、オキシトシン、インスリン、チロイド刺激ホルモン、カルシトシン、コリオゴナドトロピン、コルチコトロピン、濾胞刺激ホルモン、グルカゴン、ロイテナイジングホルモン、リポトロピン、メラノサイト刺激ホルモン、ノレピネフィリン、パラチロイドホルモン、バソプレシン、エンケファリン、セラトニン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、そしてグルココルチコイドであってもよい。受容体（レセプタ）リガンドの例としては、細胞表面受容体のような受容体に結合するリガンドを挙げることができ、その例としては、ホルモン、脂質、蛋白質、糖蛋白質、信号伝達体、成長因子、サイトカイン等を挙げることができる。好ましい例では、標的分子は、Ｃｏ(II)もしくはコバルト化合物の溶解性と調整して選ぶ。従って、例えば、アミノ酸残基あるいはヌクレオチドの実際の配列に制限されることはない。また、これまでに述べたように、標的分子は、特定の蛋白質あるいは酵素に標的を合せるように選ばれる。従って、例えば、標的分子がポリペプチドである場合においては、アミノ酸の実際の配列が重要となる。第１式のＲ₁からＲ₈のうちの少なくとも一つがポリペプチドになっているものも、一つの好適な態様である。この態様では、目的とするタンパク質や酵素が阻害されるようなポリペプチドを選択する。例えば、目的とする酵素がプロテアーゼならば、ポリペプチドは酵素基質か阻害剤の反応部位を模したものか含むものとする。ポリペプチドが阻害剤を含む場合、阻害剤は可逆的なものであっても、また不可逆的なものでもよい。ポリペプチドの配列はプロテアーゼの活性部位にポリペプチドが結合できるようなものを選択する。ポリペプチドおよびポリペプチドとコバルト化合物との結合部位は、ヒスチジン活性部位とコバルトとの相互作用が最大になるように選択する。これは、以下に説明するように、ポリペプチドはコバルト化合物とＮ末端、Ｃ末端、あるいは一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖を介して内部で結合できるからである。従来からよく知られているように、多くの酵素のヒスチジン活性部位は、酵素基質（もしくは阻害剤）の結合部位であるＳ１−Ｓ１’位に近接している。例えば、セリンおよびシスチンプロテアーゼがそうである。従って、好適な態様においては、ヒスチジン活性部位とコバルトとの相互作用が最適になるように選択する。例えば、基質もしくは阻害剤のおよそＰ４からＰ１までの残基（これは酵素の結合部位のＳ４位からＳ１位を占める）をポリペプチドが有していて、コバルト化合物とＣ末端（Ｐ１）で結合していると、酵素の活性部位、特にヒスチジン活性部位とコバルト化合物との立体相互作用は最大になる。また、ポリペプチドはＰ１’からＰ４’までの残基（これはＳ１’位からＳ４’位に対応する）を有し、Ｎ末端（Ｐ１）で結合していてもよい。さらに、ポリペプチドがＰ１からＰ１’にわたってあり、Ｐ１あるいはＰ１’残基もしくはその近傍で内部結合しているような態様でも、ヒスチジン活性部位とコバルト化合物との相互作用は同様に最大になる。このようなタイプの結合については以下に述べる。しかし、上述のように、阻害を起すためには相互作用は完全である必要はなく、活性部位の近傍でのコバルト化合物の局所的な濃度が充分であれば阻害は起こる。従って、本発明では公知の酵素基質を阻害剤として使用することができるし、また公知の阻害剤の効率も、例えばＫ₁の減少などによって増加させることができる。従来より、種々のプロテアーゼに対する酵素基質や阻害剤が数多く知られている。これらはヒスチジン活性部位あるいはヒスチジンが配位する中心金属を持っているものであるが、さらに、結晶構造が分っている酵素の構造的な特徴を利用して適当なコバルト化合物を設計することもできる。さらに、基質や阻害剤の表面の電荷や疎水性などの性質を利用した態様も可能である。コバルト化合物に結合することでポリペプチド阻害剤のＫ₁が減少するようなものも一つの好ましい態様である。すなわち、阻害剤がコバルト化合物に結合することで、よりよい阻害剤になるのである。従って、コバルト化合物は、他の部位に付いて無駄になる分子が少ないので、低濃度でも効果的である。Ｒ基の少なくとも一つが、特定のタンパク質もしくは酵素にコバルト化合物が効果を与えるような核酸になっているものも好ましい態様の一つである。たとえば、標的タンパク質がジンクフィンガータンパク質のような、生物活性に重要な少なくとも一つのヒスチジンを持つタンパク質と結合した核酸であってもよい。核酸と結合したジンクフィンガータンパク質で知られているように、各々のジンクフィンガーは核酸の３つの塩基対と結合もしくは相互作用している。従って、タンパク質と結合する核酸として使用する核酸の実際の配列は、目的とするタンパク質に依って変える。核酸配列および目的とする結合タンパク質は公知である。ポリペプチドに関しては、コバルト化合物は核酸と様々な位置、様々な方法で結合する。なお、具体的な方法については後述する。結合部位は、コバルト化合物と結合する金属イオン（もしくはヒスチジン活性部位）にとって重要な、ヒスチジンのようなコバルト反応性アミノ酸の相互作用が最大になるように選択する。好ましい態様としては、核酸の骨格が、コバルト化合物と結合できるような官能基を含むように修飾されているものが挙げられる。このような官能基は、核酸の５’もしくは３’末端、あるいは内部のヌクレオチドに導入される。例えば、アミノ修飾をしたヌクレオチドを含む核酸は公知の方法によって合成できる（例えば、イマザワらによるJ.Org.Chem.誌 44:2039-2041(1979)、ミラーらによるNu cleosides，Nucleotides 誌 12:785-792(1993)およびWO95/15971、およびこれらに記載の参考文献を参照）。この態様においては、アミノ基はリボホスフェート骨格の２’位または３’位に導入され、これによって核酸は５’または３ ’末端、あるいは内部のヌクレオチドでコバルトに結合する。これらのアミノ基は核酸とコバルト化合物を結びつけるのに利用される。あるいは、ホスホロアミドやホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを含むヌクレオチド二量体、Ｏ−メチルホスホロアミド結合などを作り、合成の際に核酸のどの部位にも導入してもよいし、以下に述べるように、公知の方法を用いて、結合に使われる窒素原子や硫黄原子を導入してもよい。さらに、公知の方法を用いて骨格あるいは連絡部にリン原子を導入してもよい（例えば、ソンらによるAngew.Chem.Intl.Ed .Engl．誌 32:666-690(1993)、マグニーらによるNucleic Acid Res.誌 22:920-9 28(1994)を参照）。第１式でＣｏがＣｏ(II)である場合、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つは、Ｃｏ(II)化合物が水溶性となるような親水性基である。一つのＲ基のみが親水性基で、他のＲ基は唯一の親水性Ｒ基がＣｏ(II)化合物に充分な水溶性を付与するように選択されているような態様もある。Ｒ₁が、例えばｎ−プロピルアルコールのような親水性基になっているものは好ましい態様である。また、２、３、４、５、６、７あるいは８のＲ基が親水性基になっている態様も考えられる。親水性基が、標的分子であることが好ましく、特にポリペプチドもしくは核酸であることが好ましい。なお、ここで『水溶性』とは、Ｃｏ(II)化合物が水溶液あるいは他の生理学的な緩衝液や溶液に対して、かなり大きい溶解性を持つということを意味する。溶解性は様々な方法で測定することができる。例えば、溶解性は合衆国薬局方によって測定・分類される。本発明のＣｏ(II)化合物は『きわめて溶けやすい』（溶質１部を溶かすのに必要な溶媒が１部未満）、『溶けやすい』（溶質１部を溶かすのに必要な溶媒が１部から１０部）、『やや溶けやすい』（溶質１部を溶かすのに必要な溶媒が１０部から３０部）、『やや溶けにくい』（溶質１部を溶かすのに必要な溶媒が３０部から１００部）あるいは『溶けにくい』（溶質１部を溶かすのに必要な溶媒が１００部から１０００部）のいずれかである。また、コバルトを含む化合物は一般に色がついているので、無色の水溶液に加えた場合は、溶液に色がつくことで使用に支障ないくらい溶解していることが分る。例えば、多くのＣｏ(II)シッフ塩基錯体は黄色もしくはオレンジ色である。特定のＣｏ(II)化合物が水溶液に溶けるかどうかの点を試験するのは公知の手順で可能である。例えば、上述したように、無色の水溶液にＣｏ(II)シッフ塩基錯体を加え、溶液に色がつけば溶解していることが分る。また、１部のＣｏ(II) 化合物を溶かすのに必要な溶媒の部数を測定してもよいし、ｇｍ／ｍＬ単位での溶解性を測定してもよい。第１式で示されるコバルト化合物が位置特異的な親水性を有している態様も好ましい。すなわち、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄が水素、アルキルもしくはアリールのいずれかになっている疎水性基で、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つが親水性基になっているものである。しかし、公知の方法に従い、他の組み合わせによって両親媒性にすることも可能である。このことは、以下に述べるように、位置特異的な親水性によってタンパク質もしくは酵素の表面あるいは活性部位の近傍にコバルト化合物が近づくことができるようになるので、特に望ましい。理論上の制約がなければ、この位置特異的な親水性／疎水性を持つことでコバルト化合物は、一般に親水的な部分と疎水的な部分とを両方持っているタンパク質や酵素と、さらに効果的に相互作用をすることが可能になる。本発明の特に好ましい態様は、下記第４式で示される構造を持つものである。第４式は、Ｒ₁がｎ−プロピルアルコール、Ｒ₂が水素、Ｒ₃がメチル、Ｒ₆がメチル、Ｒ₇が水素、そしてＲ₈がメチルで、Ｒ₄とＲ₅とは水素になったものである。（第４式）この態様では、ＣｏはＣｏ(II)もしくはＣｏ(III)のいずれでもよい。第５式および第６式で示される構造も、また、好ましい。（第５式）（第６式）コバルト化合物が、酸化還元電位、酸化安定性あるいは化合物の軸配位子（軸リガンド）交換能力などを変化させる基を有しているものも、好ましい態様である。例えば、本発明の多くのＣｏ(II)錯体は空気酸化に対して敏感である。すなわち、空気中の酸素存在下で、これらの錯体は酸化される。従って、これらＣｏ (II)錯体は空気のない状態で合成、使用されることが好ましい。さらに、上記のことから、Ｃｏ錯体が空気中でも安定となるように、さらに修飾してもよい。例えば、本発明の錯体のメチルのＲ基をトリフロロメチル基で置換すると、金属の酸化電位が変化して空気酸化に対して安定な金属錯体が得られる。例えば、市販の１，１，１−トリフロロ−２，４−ペンタンジオンを用いて、ここで示したＣｏ(II)錯体のトリフロロメチル誘導体を合成することができる。さらに、シッフ塩基の大きな環を塩素化するような、よく知られた修飾によっても、これらの錯体の空気酸化に対する安定性を大幅に向上させることができる。従って、トリフロロメチル基を単独で用いても、あるいは環の塩素化と組み合わせて用いても、水溶性で空気に対して安定なＣｏ(II)大環状錯体を得ることができる。上記のようなタイプの誘導体は、他の化合物との反応が好適になるように、錯体の酸化還元電位を調整するように作られる。同様に、電子供与性基もしくは電子吸引性基を導入することによって、コバルト化合物の軸配位子の交換能力を変えることができる。実施例に示したように、Ｒ₁およびＲ₈の位置にトリフロロメチルのＲ基を導入すると、Ｃｏ(III)化合物の新しい軸配位子に対する反応性は、根本的になくなる。電子供与性基もしくは電子吸引性基は、Ｒ₁および／またはＲ₈の位置に導入することが好ましい。この位置は合成しやすいだけでなく、電子的なカップリングにも好適な位置である。また、Ｒ₂および／またはＲ₇の位置も好ましい。さらに、Ｒ₃およびＲ₆の位置に電子供与性基を導入することも可能であるが、Ｒ₃および／またはＲ₆に電子吸引性基があると、ここに示すスキームでは化合物を合成することが困難である。好ましい電子吸引性基の例としては、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ、この順で電子を吸引する力は弱くなる）、フェニルおよびニトロフェニルのような置換フェニル基、アミンおよび四級アミン、チオール、ニトロ基、カルボキシ基、ニトリル、アルキンおよびアルカン、スルホニルおよび、その他の公知のものなどを挙げることができるが、これに限定されるものではない。好ましい電子供与性基の例としては、−ＯＣＨ₃、メチル、カルボキシレートおよびエーテルが挙げられるが、これに限定されるものではない。Ｒ基を一旦決めたら、本発明のコバルト化合物の合成は以下に述べるようにして行なう。一般に、本発明のコバルト化合物は下記のスキームＩに示すようにして合成する。これはコスタらによるジャーナル・オルガノメタリック・ケミストリー（J. Organometal.Chem.）誌6:181(1966)に記載されている一般的な方法を利用したものである。上記の記事には、アセチルアセトン・エチレンジアミン（ａｃａｃｅｎ）のような、本発明で使用する配位子を作るのに利用できる組成物誘導体の合成が記載されている。（スキームＩ）化合物１（エチレンジアミン：『ｅｎ』）、２および４は、公知の一般的な方法によって合成できる。化合物２と４は脂肪族β−ジケトンで、化合物２は脂肪族アミンである。化合物２、３および４が、下記のスキームIIにおける化合物６、７および８の共鳴構造であることは当業者には理解できるであろう。化合物６および８はアセチルアセトン誘導体（『ａｃａｃ』）であり、化合物７は『モノａｃａｃｅｎ』生成物である。（スキームII）ＣｏがＣｏ(III)の場合、軸配位子は通常、最後の段階で導入する。Ｒ基に標的分子、特にポリペプチドや核酸を付けるような場合、コバルト化合物にはカルボキシ基およびアミノ基を持つものが用いられる。カルボン酸を有するコバルト化合物は、下記のスキームIIIに示すようにして合成する。（スキームIII）コバルト化合物のアミノ誘導体は以下のようにして合成される。（スキームIV）公知のように、ＮＣＳ基はこの後にカップリングに利用することができる。Ｒ基が標的分子、特にポリペプチドもしくは核酸の場合、コバルト化合物は一般に３つの段階を経て得られる。第１に、標的分子と結合できる官能部分を有する、中心となるコバルト化合物を合成する。例えば、アミン、カルボキシ基、メルカプト基などで中心となるコバルト化合物を合成する。次に、標的分子を含むＲ基を合成する。これにも結合できる官能部分をつけておく。場合によっては、標的分子以外の反応性基は、中心コバルト化合物の官能基と反応しないように保護しておく。例えば、アルギニンのようなアミノ基を含むアミノ酸側鎖は反応しないように保護しておく必要があるかもしれないが、態様によっては、アミノ酸側鎖の官能基で結合することもある。保護基およびこれを使う技術は公知のものが用いられる。中心コバルト化合物とＲ基を合成してから、次ぎに官能基を反応させてこれらを結合する。場合によっては、直接に結合することもある。例えば、実施例に示したように、Ｒ基がカルボキシ基のコバルト化合物はポリペプチドのアミノ末端と直接に結合する。また、アミノ基の官能部分を持つコバルト化合物なら、Ｃ−末端と結合する。公知のように、この直接結合反応は、有機溶媒もしくは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボイミド（ＥＤＣ）のようなカップリング剤を用いて行なわれる（一般的な参考書としては、マーチによるAdvanced Organic Chemistry，3rd Ed．Kiley & Sons社(1985)、また、１９９４年版Pierce Chemical Campany catalogのtechnical section on cross- linkers，pages 155-200を参照）。二つの官能分子（分子部分）を、公知のように連結剤（リンカー）を用いて結び付ける態様も好ましいものである。例えば、二つのアミノ基は公知の安定な二官能性基を用いて結び付けることができる。このようなものの例には、ホモ二官能性あるいはヘテロ二官能性リンカーが挙げられる（Pierce Catalog and Hand bookの１５５−２００頁を参照）。また、公知のリンカー（Pierce Catalogを参照）を用いて、カルボキシ基（ポリマーのものでも細胞の標的部分でもよいが）を誘導することもできる。例えば、カルボジイミドはアミンのような、良い求核試薬によって、カルボキシ基を攻撃しやすいように活性化する（トーシリンらの Critical Rev．Therapeutic Drug Carrier Systems誌7(4):275-308(1991)を参照）。メルカプト基をヘテロ二官能性リンカーでアミンやカルボキシ基に付けてもよい。もちろん、上記の方法以外にも、多くの方法で結び付けることが可能である。重要な点は、この結び付けによって、標的分子の性質を大きく変えないことである。すなわち、それらが、結び付け後もまだ、標的となるタンパク質に結合できるようにしておくことである。これは以下に述べるように簡単に確認できる。標的分子の複数の官能基は、共有結合カップリングに利用できる、たとえば、アルコール、アミノ酸、そしてカルボキシ基である。あるいは、標的分子に、例えば、官能部分を持つリンカーを加えることで、官能部分を持つように誘導してもよい。ポリペプチドをＲ基として用いる場合、ポリペプチドのアミノ基を利用することが好ましい。Ｎ末端のアミノ基、あるいは、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、トリプトファンなどのアミン基のようなアミノ酸側鎖のアミノ基が利用できる。同様にして、メチオニンやシステインの側鎖の硫黄原子を利用して結びつけを行なってもよい。また、グルタミン酸やアスパラギン酸の側鎖のカルボキシ基も利用できる。Ｒ基が核酸の場合、多くの部位でコバルト化合物と共有結合で結びつくことができる。核酸のリボホスフェート骨格を修飾して官能部分を含むようにするのも好ましい態様である（ミードらによる英語版Angewante hemie誌34(3):352-354(1 995)およびそこに記載の参考文献、および上記のイマザワら、ミラーらの文献を参照）。例えば、公知の方法によって糖の２’あるいは３’位にアミノ基付けたものも一つの好ましい態様である。アミノ基が加えられた付加的なヌクレオチドを核酸に加えてもよい。すなわち、実施例で示したように、一つあるいはそれ以上の『エクストラ』ヌクレオチドを狙いの核酸に加える。あるいは、二つのヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を、公知の方法によって、ホスファーアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートあるいはＯ−メチルホスホロアミド結合に変えてもよい。それから窒素あるいは硫黄原子を官能部分として用いる。結合を変えたものを含めたヌクレオチド二量体は、ヌクレオチドのどの部位に付けてもよい。ヌクレオチド塩基それ自身の官能基を利用してもよい。このようなものの例としては、アデノシンおよびシステインのアミノ基、チミンで知られている修飾塩基などが挙げられる（例えば、テルサーらによるJ.Amer.Chem.So c．誌111:7221-7226(1991)、アングリッシュらによるAngew.Chem.誌103:629-646 (1991)およびAngew.Chem.Int.Ed.Engl.誌30:613-629(1991)、グッドチャイルドによるBiocnjugate Chem．1:165-187(1991)、ブルンらによるJ.Amer.Chem.Soc．誌113:8153-8159(1991)を参照）。官能基を持った核酸は、その後、上記のポリペプチドのところで述べたように、直接もしくはリンカーを介してコバルト化合物に加えることができる。同様にして、標的の炭水化物、脂質、そしてホルモンなどの他の標的分子もまた、公知の技術を用いて、結合のために官能基を含むように変性してもよく、あるいは連結性化合物（リンカー）を用いて官能基を持つような誘導体としてもよい。上記に述べたように、カップリングのための官能基は標的分子（標的分子部分）の標的蛋白質への結合を妨げるようであってはならないし、好ましくは結合に何等影響を与えないことである。一般に、これらの官能性基を有する標的分子部分は周知の技術を用いて得ることができる。合成さえできれば、本発明のコバルト化合物は、多くのことに利用できる。最も広義には、Ｃｏ（II）化合物は水溶液中で還元剤として利用できる。本発明のコバルト化合物を、一般的な制菌または殺菌剤、抗菌剤および／または抗ウイルス剤など、典型的あるいはその他の治療薬としての応用も態様の一つである。例えば、典型的な抗菌剤は、よく知られているように洗剤や消毒剤組成物に利用されている。抗菌剤や抗ウイルス剤を治療薬に使用することはよく知られている。組成物の制菌または殺菌、抗菌および抗ウイルス活性は公知の方法で調べることができる。例えば、殺菌活性は、米国特許第５０４９５５７号の実施例ＶＩに記載されている方法で測ることができる。生体内およびガラス器具内での抗ウイルス活性は合衆国特許第５２１００９６号に記載された方法で測定することができる。本発明のコバルト化合物は、標識タンパク質に対しても利用できる。本発明のＣｏ(II)化合物は軸配位子なしで合成することが好ましく、Ｃｏ(III)化合物は一般に二つの軸配位子をつけて合成される。タンパク質とのインキュベーションによって、タンパク質の特定の部位が軸配位子となり強く結合したタンパク質− コバルト化合物錯体が形成される。コバルトを含む化合物は分光学に検知できるので、標識タンパク質として利用できる。好ましいタンパク質の軸配位子はヒスチジン側鎖のイミダゾールである。従って、タンパク質表面あるいは溶媒との組み合わせで一つあるいはそれ以上のヒスチジン残基を持つタンパク質は、本発明のコバルト化合物を利用することで標識できる。この態様では、本発明のコバルト化合物を標的蛋白質に加えるか、あるいは接触させる。過剰なコバルト化合物を除き、Ｃｏ(III)化合物が付いた標識タンパク質を分光光度計で検知する。Ｃｏ(III)化合物は、２８０ｎｍから５００ｎｍの広い範囲で検知できるが、２８０、３３８および４５１ｎｍで検知するのが一般的である。タンパク質とつながったコバルト化合物の化学量論量は、タンパク質表面もしくは活性部位を、どれだけ軸配位子とすることができるかによって変わってくるが、これは分光光度計によって従来の方法で測定できる。従って、例えば、四つのヒスチジンを持っているタンパク質は、一般に四つのコバルト化合物と結合できる。また、上記のことから、本発明のコバルト化合物はタンパク質表面の性質を探るのにも利用できる。タンパク質に結びつけたり、あるいはタンパク質を標識する場合、コバルト化合物は、標準的な方法で、アフィニティ・クロマトグラフィー・カラムに結合させることもできる。このようなカラムは、試料からタンパク質を分離するのに用いることができる。例えば、コバルト錯体の性質に応じて、試料からタンパク質を除いたり、活性部位あるいはその近傍にヒスチジンを持つような特定のタンパク質を試料中の他のタンパク質から分離するすることができる。本発明のコバルト化合物を酵素阻害剤として利用するのも好ましい態様の一つである。阻害のメカニズムはタンパク質標識のメカニズムと同様である。この態様においては、酵素は、本発明のコバルト化合物の軸の位置で結合できるような部分を一つもしくはそれ以上持っている。そのような一つもしくはそれ以上の部分な酵素活性にとっても機能的な面で重要であるので、本発明のコバルト化合物と結合することによって失活することになる。例えば、触媒となる活性部位の残基がヒスチジンである酵素や酵素活性にヒスチジンが機能的に重要であるような酵素が、特に好ましい。セリンプロテアーゼ（トリプシン、サブチリジン、キモトリプシン、エラスターゼ、トロンビン、Ｘａ因子、リゾチーム、その他の公知のもの）、カテプシンやインターロイキン転換酵素などのようなシステインプロテアーゼ、ＲＮＡｓｅＨ、サーモリシン、ラクタートデヒドロゲナーゼなどの酵素は、すべてヒスチジンを活性部位に持っているので、本発明の化合物によって阻害することができる。この態様では、コバルト化合物は標的酵素に接触させられる。活性部位のヒスチジン側鎖のイミダゾールは、コバルト化合物に軸配位子として結合する。Ｃｏ (II)の場合、この結合と同時もしくは急速に酸化が起こりＣｏ(II)化合物は、酵素−Ｃｏ(III)化合物錯体を形成する。これを『酸化還元カップリング』という。結合［Ｃｏ(II)化合物の場合は、それに酸化］によって酵素の阻害が起こる。失活の正確な機構は不明であるが、いくつかの可能性が考えられる。結合したコバルト化合物［結合および酸化後はＣｏ(III)化合物になっている］が、立体障害となって酵素活性を阻害しているのかもしれない。すなわち、コバルト化合物が触媒活性部位もしくはその近傍に結合しているかもしれない。あるいは、触媒となるヒスチジンと結合することで、コバルト化合物が触媒機構を阻害しているのかもしれない。さらに、Ｃｏ(II)の場合には、活性部位の機能的に重要な部分がＣｏ(II)化合物によって還元されて酵素が失活するという可能性もある。コバルト化合物による酵素の失活が事実上、不可逆であるのも好ましい態様である。酵素の反応性軸配位子は、トリプトファンの側鎖、もしくはシステイン、メチオニン、アルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸塩あるいはグルタミン酸塩の側鎖インドールであってもよい。上述したように、これらの部分が使用できるかどうかは、タンパク質もしくは酵素を含む溶液のｐＨによっていて、プロトン供与が起こる状態では、これらの部分は軸配位子として好適な良い電子供与体ではない。以上のようにして、上記のような基を活性部位に持つ酵素や機能的に重要なトリプトファン、システイン、メチオニンを持つ酵素は、上述のように本発明のコバルト化合物によって失活させることができる。さらに、本発明のコバルト化合物によって金属タンパク質も失活させることができる。一般に、金属タンパク質の金属はヒスチジン、システイン、メチオニンなどの配位子を持っている。一つもしくはそれ以上のこれらの残基がコバルト化合物によって失活させられると、金属原子の結合は減少するか、なくなってしまうので、生体活性が弱められるか消滅してしまう。このような金属タンパク質の例としては、『ジンクフィンガー』タンパク質およびヘムエリトリンのようなタンパク質と結合した核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。ジンクフィンガータンパク質はヒスチジンとシステインで亜鉛イオンに結合している（ベルグによるAnn.Rev．Biophy.Chem誌19:405-421(1990)、Science誌232:485(1 986)、Prog.Inorg.Chem.誌37:143(1989)を参照）。ジンクフィンガータンパク質は核酸と結合し、遺伝子調整過程で様々な役割りを演ずることが分ってきた。ジンクフィンガータンパク質には、転写因子および他の核酸に結合する遺伝子調整タンパク質が含まれ（上記のベルグによるScience誌を参照）、真核生物、原核生物およびウイルスに見られる。本発明のコバルト化合物による失活に適した他のジンクフィンガータンパク質には、ステロイドや甲状腺ホルモン受容体の部分と結合した核酸やヒト腫瘍誘発遺伝子生成物ＧＬＩ（パブレツチらによるScienc e誌261:1701(1993)、キンツラーらによるNature誌332:371(1988)を参照。なお、これには五つのジンクフィンガー領域が含まれている）。一つもしくはそれ以上のジンクフィンガー領域が少なくとも一つのヒスチジンで亜鉛と結合していることが好ましく、二つのヒスチジンを使っているタンパク質が好ましい。金属がシステインによって排他的に結合している場合もある。セリンおよびシステインプロテアーゼを阻害するのも好ましい態様である。カルボニックアンヒドラーゼを阻害するのも好ましい態様である。カルボニックアンヒドラーゼは、糖尿病、緑内障などの眼病、卒中、痙攣などに関係している。従って、本発明のＣｏ(II)錯体のようなカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤は、これらの症状の治療に有用である。上記のように、Ｃｏ(II)錯体を高眼圧や緑内障の治療に用いるのは有用な態様である。カルボニックアンヒドラーゼは高眼圧に関係しており、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤が、動物やヒトの眼圧を下げるのに有効であることが示されている（シャリーらによるExperimental Eye Res.誌58(1):107-116(1994)、ラッサムらによるEye誌7(Pt5):697-702(1993)、グニングらによるGraefes Archive f or Clinical and Experimental Opthalomology誌231(7):384(1993)を参照）。Ｃｏ(II)錯体を卒中や痙攣の治療に用いるのも有用な態様である。カルボニックアンヒドラーゼIIを除いたマウスは、化学的な方法で引き起こす卒中に対して抵抗力が増加するし、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤で前処理すると正常なマウスでも、化学的な方法で引き起こす卒中に対して抵抗力が増加する（ベリスクらによるEpilepsy Res.誌14(2):115-121(1993)を参照）。Ｃｏ(II)錯体を糖尿病や腎機能障害の治療に用いるのも有用な態様である。カルボニックアンヒドラーゼのレベルの上昇は、糖尿病のような代謝の病気や高血圧症と関連があり、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤がこれらの治療に役立つことが示唆されている（パルーらによるBiochem.International誌26(5):809-820 (1992)、同誌23(4):779-89(1991)、ドッジソンらによるArch.Biochem.Biophys. 誌277(2):410-4(1990)、ハンドックらによるClinical Sci.誌81(4):457-64(1991 )を参照）。コバルト化合物を腫瘍細胞のタンパク質や酵素の阻害に用いるのも好ましい態様である。上記のように、Ｃｏ(III)（ａｃａｃｅｎ）化合物は軸配位子を異った配位子に交換することができる。これは一つの軸配位子をゆっくりと失い５配位の中間体を経て、それから別の適当な配位子が結合するという解離機構によって起こる。多くのコバルト化合物にとって、配位子交換は遅い過程である。なぜなら、八面体ｄ⁶錯体から一つの配位子が除かれると、配位子場の安定化エネルギーが大きく損なわれるからである（ヒューイらによるHarperCollins社N.Y.刊n organic Chemistry:Principle of Structure and Reactivity，4th Ed.の第１３章を参照）。一般に、配位子交換は遅い。例えば、イミダゾール過剰の水中での [Co(III)(acacen)(NH₃）₂]Clのアンモニアとイミダゾールの交換は２５℃、１時間で半分で、温度が上昇すると交換速度は速くなる。しかし、コバルト(II)への還元が起こると、電子は反結合性ｄ_z2軌道へ入るので軸配位子は不安定になる。軸配位子を不可逆的に失う、典型的な一電子還元電位は約−３６０ｍＶ vsＮＨＥ（ダビューらによるTransition Met.Chem.,誌7;149(1982)を参照）。この性質は『酸化還元スイッチ』と呼ばれ、コバルト化合物の反応性を制御するのに用いることができる。例えば、腫瘍の特定部分は代謝と血流異常のため、しばしば酸素不足になっているので、正常細胞よりもこのような環境の方が還元反応はより起きやすくなっている（Ａ．Ｃ．サートレールによるCancer Research誌(1988)4 8,775、ブラウンらによるJ.Nat.CancerInst．83:178(1991)を参照）。ハロゲンなどの置換基によってコバルトａｃａｃｅｎ化合物の還元電位を上げることで、正常細胞では還元が起こらずに、腫瘍細胞で還元が起こるようにすることができる。ウエアーと共同研究者らは同様な方法で、ガン細胞内で選択的にコバルトに結合した細胞毒を放出する試みをしている（ウエアーらによる上記の文献を参照）。コバルト化合物の阻害剤としての効果は、公知の方法によってテストすることができる。標的となるタンパク質が酵素の場合、公知の酵素阻害剤のテストと同様にしてテストする。一般に、調べる阻害剤の存在下と非存在下で酵素の働きを調べ、反応動力学的なパラメターを公知の方法によって算出する。与えられた酵素を阻害するのに必要なコバルト化合物阻害剤の量は、タンパク質の標識のところで述べたように、酵素表面の反応性軸配位子の数によって変化する。例えば、一つの活性部位のヒスチジンと他の『表面』ヒスチジンが二つあるような酵素では、コバルト化合物阻害剤と酵素の比は，一般に少なくとも３：１必要である。上記のように、酵素に結合する総量は分光光度計によって測定できる。Ｃｏ(II)化合物阻害剤を、対応するＣｏ(III)化合物を還元することで、直接に作るのも好ましい態様の一つである。ここで『対応するＣｏ(III)化合物』とは、Ｃｏ(II)化合物と全く同じＲ基を持つＣｏ(III)化合物を意味する。一般に、Ｃｏ(III)化合物はアミン、２−メチルイミダゾール、水などの軸配位子で合成されるが、もちろんこれに限定はされない。この態様では、まずＣｏ(III)化合物を合成し、それからの還元によってＣｏ( III)がＣｏ(II)になるような条件下で酵素に加える。これには何通りかの方法がある。例えば、生体内でも、生体外でも、酵素の環境そのものがＣｏ(III)がＣｏ(II)になるような、Ｃｏ(III)化合物にとって還元的であってもよい。あるいは、Ｃｏ(III)化合物が電子受容基をＲ基の一つとして持っていれば、そのままの状態で電子受容基が電子を受取り、その電子をＣｏ(III)に与えることで還元が起こってＣｏ(II)体になる。このような電子受容基の好適な例としては、メチル・ビオローゲン（Ｎ，Ｎ−ジメチル−４、４’−ビピリジン）などのカチオン、エチルまたはプロピル・ビオローゲン、その他の公知のものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。さらに、化合物の還元電位は、化合物を、例えば生体内のグルタチオンのような特定の環境に置いて還元することで調節することができる。生じたＣｏ(II)化合物は、その後、上記のように酵素の反応性軸配位子と反応して酵素を失活させる。従って、Ｃｏ(II)化合物が直接に生じる。すなわち、Ｃｏ(III)化合物を酵素に加えると、還元されてＣｏ(II)化合物になり、それが酵素を阻害するのである。この態様では、Ｃｏ(III)化合物は与えられた酸化状態では、目的とする標的酵素に対して不活性であってもよいが、第２酸化状態で標的酵素を失活させる。この機構があるので、生体内でも、生体外でも、不活性な形のコバルト化合物をそのまま加えても、特定の還元環境下で活性なＣｏ(II)化合物となる。本発明の化合物は、治療上有効な量を配合した医薬組成物にしてもよい。ここで『治療上有効な量』とは、投薬した効果が生じる量を意味する。正確な量は治療すべき病状や阻害するタンパク質に依存し、公知の方法によって当業者が確認することができる。本発明の医薬組成物を水溶性にし、コバルト化合物に加えて薬学上受け入れられるキャリヤーを含ませるのは好ましい態様の一つである。この医薬組成物は様々な形で投与することができる。例えば、経口、皮下注射、静脈注射、腹膜への投与、局部投与などであるが、これに限定されるものではない。本発明のコバルト化合物によって特定のタンパク質や酵素を阻害する方法も提供する。すなわち、標的とするタンパク質をコバルト化合物に接触もしくはさらすことで阻害する。このコバルト化合物は第１式に示したような構造を持っていることが好ましい。このコバルト化合物は、標的分子の付加よって特定のタンパク質を狙うことが可能になる。また、ジンクフィンガータンパク質をコバルト化合物に接触させることで阻害する方法も提供する。ここで『ジンクフィンガータンパク質の阻害』とは、ジンクフィンガータンパク質の生体活性をコバルト化合物と接触させることで減少もしくは消失させることを言う。一般に、ジンクフィンガータンパク質がタンパク質と結合した核酸である場合、このことはジンクフィンガーがもはや核酸とかなりの程度、結合しないことを意味する。従来から、様々なＣｏ(III)化合物が知られている。下記の第７式で示されるこれらの化合物は、第１式で示される化合物と同様に、ジンクフィンガータンパク質の失活に有効である。従って、ＣｏがＣｏ(III)である場合、Ｒ₁からＲ₈のうち少なくとも一つが、ポリペプチドもしくは核酸のような標的分子である必要はないが、そうである方が好ましい。そして同様に、ＣｏがＣｏ(II)である場合、Ｒ基のうち少なくとも一つが親水基である必要はないが、そうである方が好ましい。（第７式）第７式において、Ｒ_AとＲ_Fは同じでも異っていてもよく、それぞれ、アルキル基、フェニル基あるいはフェニル基の置換体である。Ｒ_BとＲ_Eは同じでも異っていてもよく、それぞれ、水素、分岐のないアルキル基、ハロゲンあるいは下記の構造を持つ基である。ここでＲ_Gは水素、アルコキシド基、アルキル基またはＯＨであり、Ｒ_CとＲ_Dは同じでも異っていてもよく、それぞれ、水素またはアルキル基である。以下に実施例を示し、上述してきた本発明についてさらに詳細に述べるとともに、本発明の様々な利用を示す。ただし、これら実施例は本発明を説明するために示すのであって、決して本発明を限定するものではない。ここで引用した文献は参考のために使用したものである。［実施例１］コバルト化合物の合成 [Co^III(acacen)(NH₃)₂]CI試料は、ツビ・ドリ（Zvi Dori）より貰った。アセチルアセトン、ベンゾイルアセトン、エチレンジアミンおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）はアルドリッチ社（ミルウォーキー、ＷＩ）より得た。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ，Ｔｒｉｚｍａ塩基）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３− エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）はシグマ社（セントルイス、ＭＯ）より得た。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）はＪ．Ｔ．ベーカー（フィリップスバーグ、ＮＪ）より得た。酢酸コバルト四水塩はＥＭサイエンス社（ギブスタウン、ＮＪ）より得た。ヒトａ−トロンビンおよび検査試薬スペクトロザイムＴＨ（Ｈ−Ｄ−ヘキサヒドロチロシル− Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン−ｐ−ニトロアニリドジアセテート）はアメリカンジアグノスティカ社（グリーニッジ、ＣＴ）より購入した。抗トロンビン性は、固相法を用いてカリフォルニア工科大学ベックマンン研究所生体高分子合成グループのによるアミドによって測定した。弱い陽イオン交換樹脂セファデックスＧ−２５はファーマシア社（ウプサラ、スエーデン）より得た。酵素反応はフォトダイオードアレイ分光光度計によって分光学的に追跡した。限外口過の材料はアミコン社（ベバリー、ＭＡ）より得た。ＨＰＬＣはＶｙｄａｃ逆相カラムを用いた。¹Ｈ−ＮＭＲは３００メガヘルツのＦＴ−ＮＭＲによって測定した。用いた溶媒はＥＭオムニソルブＭｅＯＨ、および残存する酸を除くためにアンモニア処理をしたオムニソルブＣＨ₂Ｃｌ₂フルカ社（バクス、スイス）純正溶媒ＭｅＯＨおよびジオキサン、カンタムケミカル社（ツコラ、ＩＬ）製無水エタノールである。蒸留水はバーンステッド・ナノピュアーシステムによって得た。用いた試薬はすべて、純正試薬である。ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎの合成脱酸素した２００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂に、１０ｍＬのアセチルアセトン（ａｃａｃ、０．０９７４モル）を加え、２５０ｍＬの滴下漏斗へ管で導入した。この滴下漏斗を、１００ｍＬの脱酸素したＣＨ₂Ｃｌ₂と３２．６ｍＬのエチレンジアミン（ｅｎ、０．４８８モル）が入った５００ｍＬの三つ首フラスコに装着し、ａｃａｃを含む溶液をｅｎ溶液に滴下した。反応液をｐＨ５．５の０．２ＮａＰｉ５０ｍＬで抽出した。有機層を分離し、−２０℃の冷蔵庫中に一晩放置した。得られた溶液をロ紙でロ過し、溶媒を真空除去した。得られた化合物は、新たに調製したシリカゲルクロマトグラフィーで、ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：Ｅｔ₃Ｎが９５：５：０．５（体積比）の混合溶媒を展開液にして、さらに精製した。得られたモノａｃａｃｅｎはＮＭＲによって同定した。モノａｃａｃｅｎ（０．５ｇ、３．５×１０^-3モル）を５ｍＬのエタノールに溶かし、７−ヒドロキシ−２，４−ヘプタンジオン（０．５１ｇ、３．５×１０^-3 モル）を加えた。ジオンを従来の方法（Ｍ．Ｒ．デティーによるJ.Org.Chem．誌44:2073-2077(1979)を参照）によって合成した。４時間反応をさせた後、溶媒を真空除去した。得られた化合物は、新鮮なシリカゲルクロマトグラフで、ＣＨ₂ Ｃｌ₂：ＭｅＯＨが９３：７（体積比）の混合溶媒を展開液にして、さらに精製した。得られたヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎはＮＭＲによって同定した。Ｃｏ(II)ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎの合成ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎ（０．２５ｇ、９．４×１０^-4モル）を、不活性雰囲気のグローブボック内で２ｍＬの脱酸素したメタノールに溶かした。この溶液にCo(II)(CH₃COO-)₂(H₂0)₄（０．２３３８ｇ、９．４×１０^-4モル）を加えた。反応混合物を、さらに３０分攪拌した。反応容器を密封し、溶媒を真空除去した。この化合物はそれ以上、精製しないで用いた。[Co(III) ヒドロキシプロピルacacen(NH₃)₂]CH₃COOの合成上記のようにしてヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎを酢酸コバルトと反応させたが、反応容器を密封した後、無水アンモニアのガスを反応液にバブルさせ、続いて空気にさらした。溶媒を真空除去し、生成物をアルミナカラムでニートなメタノールを展開液にして精製した。試料はＮＭＲによって同定した。ａｃａｃｅｎの合成２０ｍＬのエタノールに２０ｍＬのａｃａｃ（０．０９７３モル）を加えた。この溶液に滴下漏斗を用いて６．５ｍＬのエチレンジアミン（０．０９７３モル）を加えた。溶液を４℃の冷蔵庫で一晩放置してから、無水ジエチルエステル（ＭＰ＝１１０．１〜１１１．１）によって３回、結晶を析出させた。[Co(III)acacen(NH₃)₂]Cl の合成２４９．０８ｇの酢酸コバルト・６Ｈ₂Ｏ（１モル）を１．７５０ｌのメタノールに溶かし、溶液をワットマンＮｏ．１で濾過した。ａｃａｃｅｎ（１モル）を１５０ｍＬのメタノールに懸濁させた。シリカゲルの乾燥カラムを通して乾燥させた窒素ガスを反応液に１５分間バブルした。酢酸コバルト溶液を滴下（０．５時間かけて）して、茶橙色になった溶液を室温で窒素雰囲気下２時間放置して反応させてから、フラスコの開封して空気にさらし、液中にＮＨ₃ガスをバブルした。溶液をロータリーエバポレーターによって濃縮した。当量の塩化ナトリウムを最小限の水に溶かしたものを加え、大きな容器に注ぎこみ、放置してゆっくりと結晶化させた。茶色の結晶を濾別し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。非対称もしくは『混合』配位子の合成 ”ａｃａｃｅｎ”（スキームIIの化合物９）：無水エタノール中に溶かした１当量のエチレンジアミンをエタノール中に溶かした２当量のアセチルアセトンに攪拌しながら加えた。３０分後、混合物を冷蔵庫に入れ、白色結晶を沈殿させた。生成物をガラスフィルターで吸引濾過し、ジエチルテーテルで洗った。これはベンゼンで望みの純度になるまで再結晶することができる。生成した結晶の融点は１１１℃であった。 ”モノａｃａｃｅｎ”（スキームIIの化合物７）：ａｃａｃとｅｎの１：１縮合生成物は文献の方法（クロスらによるC.R.Acad.S c.,Ser.II誌294:173(1982)を参照）でクロロホルムをＣＨ₂Ｃｌ₂に置き換えることによって合成した。得られた黄色油状物は、しばしばａｃａｃｅｎを含んでいるが、これは他のジケトンを加える前か後にシリカのクロマトグラフィーで、９７ＣＨ₂Ｃｌ₂／３ＭｅＯＨ／０．５ＴＥＡを展開液にして除去できる。 ”ｂｚａｃａｃａｃｅｎ”（第１式でＲ₁Ｒ₃およびＲ₆がメチルで、Ｒ₂およびＲ₇ が水素で、Ｒ₈がフェニルのもの）：１当量のベンゾイルアセトンをＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かしたものを、モノａｃａｃｅｎのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液に加える。溶媒を除去すると、ａｃａｃｅｎを不純物として含む白い結晶が得られる。シリカのクロマトグラフで、９７ＣＨ₂Ｃｌ₂／３ＭｅＯＨ／０．５ＴＥＡを展開液にして精製した。 ”ａｃｉｄｅｎ”（スキームIIIの化合物１１）１当量の４，６−ジオキソヘプタン酸をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かした溶液を、１当量のエチレンジアミンのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液に加えると、すぐに不溶性の１：１縮合物が沈殿した。生成物を濾別し、真空乾燥した。融点は１４０℃で分解した。繰り返し試みたが、４，６−ジオキソヘプタン酸とモノａｃａｃｅｎとの直接反応は起こらなかった。脱水状態であっても、明らかに、この酸基が分解をもたらすようであった。ジケトンを中和するため過剰のトリエチルアミンを加えても、満足のいく結果は得られなかった。 ”ａｃａｃａｃｉｄｅｎ”（スキームIIIの化合物１３）１当量のａｃｉｄｅｎをフルカ純正ＭｅＯＨに加え懸濁させた。１当量のトリエチルアミンと２〜２．５当量のａｃａｃを加え、混合物を一晩攪拌すると、黄色の溶液になった。蒸発乾燥させると橙色のオイル粗製物が得られた。シリカクロマトグラフで、イミン結合の加水分解を防ぐため０．５％のＴＥＡを加えたメタノール５％−２５％の傾斜ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を用いて精製した。溶媒を真空除去してから、エタノールから再結晶してベージュ色の固体を得た。Ｍ⁺は予想の通り２８２であった。 [Co(III)(acacen)(NH₃)₂]Cl：ツビ・ドリ(Zvi Dri、テクニオン、ハイファ、イスラエル）から得た方法。１当量のａｃａｃｅｎを真空中で脱気し、アルゴン雰囲気下に置いた。乾燥、脱気したメタノールをフラスコ内に管を通して導入した。１当量の酢酸コバルトも同様に取り扱い、得られた紫色の溶液を管を通して配位子の無色溶液に加えた。アルゴンン雰囲気下、２時間攪拌すると、溶液の色が紫から橙色に変化するのが観測できた。溶液にアンモニアガスを吹きこみバブルさせてから、フラスコを開封して空気にさらした。反応液を４時間攪拌してアンモニアと反応させたのち、溶媒を真空除去した。赤色の溶液を濾過し、ホットプレート上で濃縮した。飽和塩化ナトリウム水溶液を加えると茶色の生成物が沈殿した。エタノールから再結晶して、黄褐色の粉末を得た。 [Co(III)(acacaciden)(NH₃)₂]Cl：配位子をacacacidenにする以外は、上記と同様に行なった。粗製反応物は沈殿しなかったが、酢酸アンモニウム水溶液を用いてイオン交換樹脂で精製し、揮発性バッファーを除いたら、明褐色の粉末が得られた。Ｍ⁺は予想の通り３７３であった。ＧＧＧｄＦＰＲアミドのペプチド合成：ペプチドはベックマンン研究所生体高分子合成グループ（カリフォルニア工科大学）によって合成させた。合成は、ABI Model 430A ペプチド合成装置によるメリーフィールド固相合成で、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸誘導体を用いてｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上で行なわれた。末端のＢｏｃ保護基はトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）によって除去した。側鎖保護基およびペプチド−樹脂結合はＨＦ条件（９０％ＨＦ、５％ｐ−クレゾール、５％ｐ−チオクレゾール）で除去した。真空下でＨＦを除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄した。それから、ペプチドを１０％の酢酸水溶液に溶かし、濾過して樹脂を除いた。粗製ペプチド溶液をゲル濾過し、陽イオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ２にかけて、スカベンジャーを除いた。ペプチドをさらに、ＶｙｄａｃＣ８逆相ＨＰＬＣで、線形勾配６−２６％のアセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡで、２．０ｍＬ／分の流速で、３０分かけて精製した。結合生成物［第２式に示したCo(III)(acacen-GGFPR)(NH₃)₂］：このペプチドのコバルト化合物を結合させるに際しての潜在的な問題は、ペプチドのアルギニン側鎖が、プロトン化されていてもいなくてもＮ−末端よりも反応性が高いことである（ボザンスキーによるPeptide Chemistry:A Practical Te xtbook，スプリンガー−ベルク・ベルリン社１９８８年刊を参照）。アルギニンはＰＫ_aが約１２．０なので容易にプロトン化されるが、そのため親水ペプチドが、多くのカップリグ反応で用いられるジオキサンのような有機溶媒に溶けなくなる。そこで、我々は水溶性のカップリグ試薬である１−（３−ジメチルアミノ −プロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いた。反応を通じて起こる加水分解を補填するために１０倍過剰のＥＤＣが必要である。副生成物として尿素が多量に生じるので、アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＣＯ５フィルターを通すか、抽出するかして、粗製物の有機溶液を得た。さらに、親水性ペプチドのＨＰＬＣによる精製では、保持を助けるために溶離溶媒に少量の有機酸が必要である。このような酸は結合していない配位子のイミン結合を攻撃するので、精製はフリーの配位子がない状態で行なったが、Ｃ８からＣ１８の逆相も、順相のシアノカラムも混合物を再溶解するのには効果的でなかった。逆相で、酢酸アンモニウムバッファーとアセトニトリルを使った処理を行なったが、イミン結合の加水分解による生成物のある程度の分解は、依然としてあった。このことを避けるために、ペプチドに結合させる前に配位子に金属を導入することでイミンを保護した。合成は以下のようにして行なった。すなわち、［Co(III)(acacaciden)(NH₃)₂ ］を５℃で、ｐＨ８の０．１ＭのＨＥＰＥＳバッファーに溶かした。同じバッファーに１当量のペプチドを溶かしたものを加えた。５当量のＥＤＣを直接加えて、４時間後に、さらに５当量のＥＤＣを加えた。反応液を５℃で一晩攪拌した後、凍結乾燥して赤褐色の生成物を得た。粗生成物を酢酸アンモニウムを溶離液とした陽イオン交換樹脂（Pharmacia G-25）で精製したところ、二つの生成物が得られた。いずれも赤色だったことからコバルトを含有していることがわかり、¹ Ｈ −ＮＭＲスペクトルの７．２８および７．２０ｐｐｍにおける信号からフェニルアラニンを含んでいることも分った。この両者の質量スペクトルによると、溶離液中の最初の方は、軸配位子を失い、おそらくはアルギニンに置き替っているようであった。これはアルギニンがデプロトネーションされて全体の電荷が＋１になったため早く溶離したものと考えられる。また質量スペクトルによって第２のバンドに求める生成物があることが分った。最初のＭ⁺は９３２で２番目のＭ⁺は１０６６だった。目的生成物の二酢酸塩の計算上の質量は１０６２である。［実施例２］カルボニックアンヒドラーゼの阻害Ｃｏ(III)化合物の阻害作用ウシ・カルボニックアンヒドラーゼ（２０ｍｇ、６．７×１０^-7モル、カルバイオケム）を０．５ｍＬのＴｒｉｓバッファーに溶かした。この溶液に３０ｍｇのＣｏ(III)ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎ（３０ｍｇ、７．６×１０^-5モル）を０．５ｍＬの水に溶かしたものを加えた。得られた溶液を４８時間インキュベートした。過剰のコバルト錯体をＰＤ−１０ゲル濾過カラムでＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．０５Ｍ）を用いて、タンパク質から分離した。このＣｏ(III )錯体とインキュベートした酵素は１００％活性を維持していた。Ｃｏ(III)化合物の阻害作用ウシ・カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｍｇ、１×１０^-6モル）を３ｍＬの脱気したＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．０５Ｍ）に溶かした試料を二つ作った。一方の試料に、Ｃｏ(II)ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎ（３０ｍｇ、９× １０^-5モル）を加えた。他方のウシ・カルボニックアンヒドラーゼの試料は参照試料とした。溶液を不活性雰囲気下（グローブボックス）でインキュベートして４８時間と９６時間のインキュベートの後、それぞれの試料から１ｍＬづつ取り除いた。それからタンパク質を空気にさらし、過剰のＣｏ(II)ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎをＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Pharmacia社）でＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．０５Ｍ）を用いて、タンパク質から分離した。タンパク質の酵素活性は、ｐ−ニトロフェニルアセテートを基質として用いて測定した（ポッカーらによるBiochem誌6:668-678(1967)を参照）。結果を以下に示す。Ｃｏ(II)ヒドロキシプロピルａｃａｃｅｎによるカルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）の阻害インキュベーション時間ＣＡの阻害（％）４８時間３３．８％９６時間４３．２％［実施例３］サーモリシンの阻害サーモリシン（２５０００００単位、Calbiochem）を２０ｍＬのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．２、０．１Ｍ、２．５ＭＮａＢｒ、０．００１ＭＣａＣｌ₂ ）に溶かし、４℃で放置した。酵素濃度をＥ_1% ²⁸⁰＝１７．６５、分子量３４６００で求めた。この溶液を、さらにSuperdex 75（Phermacia）カラムを用いたＦＰＬＣゲル濾過カラムで０．１ＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．２、０．１Ｍ −ＮａＢｒ、０．０１ＣａＣｌ₂）を使って精製した。このストック溶液は４ ℃で保存した。サーモリシンの基質として、Ｎ−［３−（２−フリル）アクリロイル］グリシルＬ−ロイシンアミド（ＦＡＧＬＡ）をシグマ社から得た。この基質をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、バッファーで希釈して、最終的には、濃度０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０、０．１ＮａＢｒ、１０ｍＭＣａＣｌ₂（ＤＭＦの最終濃度は２５％、フェダーらによるBiochem．誌9:2784-2791( 1970)を参照）のストック溶液を調製した。すべての測定で、酵素と基質の濃度は、それぞれ５０ｎＭと２．０ｍＭであった。サーモリシンのペプチダーゼ活性は、酵素によってＦＡＧＬＡが加水分解されるために３４６ｎｍの吸光度が減少するのを追跡することで測定した。初速度は１０％以下の反応液で測定した。サーモリシン（２×１０^-4モル）を[Co(III)(acacen)(NH₃)₂]Cl（５ｍＭ）とともに、ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０、０．０１Ｍ、０．００５ＭＣａＣｌ₂）中でインキュベートした。サーモリシンの濃度は５×１０^-8Ｍであり、コバルト阻害剤の濃度は１．２５×１０^-5Ｍであった。結果を下記および第３図に示した。サーモリシンの阻害インキュベーション時間阻害（％）４５分４６．２％１９０分６３．９％３２２分７７．７％０．１ＭのＴｒｉｓ、０．1ＭＮａＢｒ、０．０１ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．２（操作バッファー）にコバルト化合物を溶かした溶液に、サーモリシンのストック溶液を混合し、最終的には酵素濃度１０ｍＭ、コバルト濃度２．５ｍＭの溶液を調製した。これをコバルト化合物を含まない参照試料とともに、２５℃または３７℃で数時間インキュベートした。これらの溶液から周期的に５ｍＬづつ採取して、４９５ｍＬの操作バッファーと５００ｍＬのＦＡＧＬＡストック溶液を含むキュベットに加え、上記のように３４６ｎｍの吸光度の減少を追跡することで酵素活性を測定した。すべての酵素活性の測定は２５℃で行った。結果は第３図に示した。配位子交換の実験を第３Ｂ図に示した。この実験は、コバルト化合物とサーモリシン上のヒスチジン残基との結合を、イミダゾールとビスアミン生成物Co(III )(acacen)(NH₃)₂との結合を調べることで模したものである。１．３５ｍＭのCo( III)(acacen)(NH₃)₂を操作バッファー中で０．１Ｍのイミダゾールとインキュベートした。イミダゾールとＮＨ₃との交換によって４２０ｎｍに吸収が現れるのを２５℃と３７℃でモニターした。酵素阻害とモデルとしたコバルト錯体の配位子交換の温度依存性とが類似していることは、ヒスチジン残基による配位子交換が酵素阻害の律速過程になっていることを示唆している。コバルト化合物と活性部位ヒスチジンとの結合は以下のようにして確かめた。１０μＭのサーモリシンの操作バッファー溶液（０．１ＭのＴｒｉｓ、０．１ＭＮａＢｒ、０．０１ＭＣａＣｌ₂、ｐＨ７．２）をCo(III)(acacen)(NH₃)₂Cl（５ｍＭ）と２５゜Ｃで、阻害剤であるホスファーアミドンの存在下と非存在下でインキュベートした。ホスファーアミドン（Ｎ−α−Ｌ−ラムノピラニシルオキシホスホＯ−Ｌ−ラウシル−Ｌ−トリプトファン、５０μＭ）のＫ₁はｐＨ７．５で３２ｎＭであると報告されている（キタギシらによるJ.Biochem．誌95:529- 534(1977)を参照）。ホスファーアミドンはサーモリシンの活性部位に結合し、その酵素−阻害剤錯体は結晶構造学的に特定されている（ウィーバーらによるJ. Mol.Bio．誌114:119-132(1977)を参照）。コバルト化合物と一晩インキュベーションした後、Superdex 75（Phermacia）カラムを用いたＦＰＬＣゲル濾過カラムで０．１ＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９、５ｍＭ・ＣａＣｌ₂）を使って阻害剤を酵素から分離した。得られた溶液をＰＤ−１０カラム(Phermacia)を用いて、Ｔｒｉｓ操作バッファーに移し同定した。阻害剤を除いた後、コバルト錯体による不可逆的な失活による酵素活性の測定にかかる程度の減少はなかった。この活性酵素の分光スペクトルによって、酵素には２つのコバルト錯体が結合していることが分った。コバルト錯体によって完全に失活してしまったサーモリシンの分光スペクトルからは、それぞれの酵素分子に対して３当量のコバルト化合物が結合していることが分った。活性部位の保護が、サーモリシンの阻害剤を妨げ、また、１当量のコバルト化合物の酵素との結合を妨げるので、酵素の失活は、酵素活性部位に１つのコバルト化合物が結合することの結果として起こる。［実施例４］トロンビンの阻害トロンビンを最初の標的酵素に選んだ。トロンビンの結晶構造はタンパク質データバンク（例えば、ファイル１ＰＰＢ、ボーデらによるEMBO J.誌8:3467(1989 )を参照）に記載されている。トロンビンは、ヒスチジン残基を含め、活性機構がよく解明されている３４ｋＤセリンプロテアーゼである。血液凝固は生体にとって重要であるが、好ましくない血餅は、深刻な命にかかわる事態を引き起こす。トロンビンは、その構造と機構がよく分っており、活性の検査も容易で、しかも抗トロンビン薬は卒中の治療薬として有用であるので、この実験の対象とした。トロンビン阻害検査：すべての血液由来のものについて、血液由来の病原体の感染を避けるために適切な処理を行なった。トロンビンを採取（０．７５Ｍ塩化ナトリウム保存液中３０μＭ、１ｍＬ）し、１００μＬづつに分け、それぞれを２μｍの濾過をした、きれいな０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で１０ｍＬに希釈し、１ｍＬづづに分けて試料とした。それぞれの試料は使用するまで−８０℃ で冷凍保存した。このタンパク質は−２０℃で保存してはならない。なぜなら、その温度はトロンビン−塩混合物の共融点に近すぎ、凍結−解凍を繰り返すとタンパク質に損傷を与えるからである。１０ｎＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）および５００ｍＭの塩化ナトリウムで検査バッファーを調製し、ｐＨを８にした。以下の記載は製造者の指示である。すなわち、５μモルのスペクトロザイムＴＨを、１０００ｍＬのナノピュアーの水に溶かした。一連の[Co(III)(acacaciden)(NH₃)₂]Cl溶液は、１６．６ｍｇの化合物を０．７５ＭのＮａＣｌに溶かし、その一部を、それぞれコバルト濃度が４．７ｍＭから４．７ｎＭの範囲になるように希釈した。精製した原材料も検査した。トロンビンはン阻害剤とともに動作バッファー中で、第１図に示した時間だけインキュベートした（トロンビン、バッファー、阻害剤の総体積は９９２ｍＬであった）。このインキュベートの後、基質のスペクトロザイムＴＨを加え（５ｍＭのスペクトロザイムを８ｍＬ）、トロンビン触媒加水分解速度を４０６ｎｍでモニターした。この実験におけるトロンビンの最終濃度は３ｎＭで、基質の濃度は４０ｍＭであった。阻害剤の濃度は第１図に示した。加水分解の速度は飽和− 時間プロットの直線部分から求めた。パーセント活性は、阻害剤によるスペクトロザイムの加水分解速度を、阻害剤なしでの加水分解の速度で割った数に１００を乗じて求めた。上記のようにして調製したトロンビンの容器を温水で解凍した。これを１００ μＬづつ１００μｌのコバルトａｃａｃｅｎ溶液試料に加えた。一つの１００μ Ｌトロンビン試料を１００μＬの０．７５ＭＮａＣｌで希釈して参照試料として用いた。それぞれの試料は検査の前に必要に応じてインキュベートした。９８０μＬの検査バッファーを１．０ｍＬ、１ｃｍの石英製キュベットに入れ、２５ ℃になるまで放置した（ヒューレット・パッカード・ペルテー社製恒温セルホルダー）。１０μＬの試料をセルの内容物に完全に混ぜた。分光光度計は３０秒毎に測定するようにセットし、その３０秒の間に、１０μＬのスペクトロザイムＴＨをセルの内容物に加え、キャップ付きのセルを数回ひっくりかえして、良く混ざるようにしてから、分光光度計内のセルを入れ替える。４０６ｎｍでの吸光度だけで充分であったが、２５０ｎｍから５００ｎｍまで３０秒毎に１０分間スキャンした。一連の測定の後、参照試料を放置して加水分解させ、終点を決定する前に終了した。４０６ｎｍにおける吸光度から、下記の式で表わされる擬一次反応速度定数を求めた。 −ｌｎ［（Ａ_∞−Ａ_t）／（Ａ_∞−Ａ₀）］＝ｋｔここでＡ∞は終了時の吸光度、Ａ₀は最初の吸光度（近似的には最初の試料のデータ）およびＡ_tは各々の時刻ｔにおける吸光度。プロットの直線フィトの傾き（典型的にはＲ²＞０．９９）からｋを求めた。阻害剤を入れていない参照試料との比較から、各々のコバルト含有試料の相対活性を決定した。参照試料はタンパク質の減成をチェックするため周期的に繰り返し用いた。最初に修飾していない[Co(III)(acacen)(NH₃)₂]Clによるトロンビンの阻害を調べた。０．１μＭのトロンビンと２．５ｍＭの[Co(III)(acacen)(NH₃)₂]Clを含む溶液を室温で２４時間インキュベートした。参照試料として同じソースからのトロンビンを阻害剤なしで同じ長さの時間インキュベートした。それぞれのインキュベートした試料から一部を取り、２５℃で市販の基質スペクトロザイムＴＨを過剰にして測定した。なお、このスペクトロザイムＴＨは、タンパク質加水分解によって発色性のｐ−ニトロアニリンを放出する。ｐ−ニトロアニリンの擬一次反応生成を分光光度計でモニターし、それぞれのサンプルについて反応速度定数を算出した。参照試料の活性は正常であったが、コバルトを含む試料は完全に失活した（第ｘｘ図）。なお、コバルトに結合していない配位子はなんの効果も示さなかった。同様の実験を不活性雰囲気下で、水溶性Ｃｏ(II)ヒドロキシプロピルacacenを上記と同様の濃度で用いて行なった。インキュベートの後、試料も参照試料も、両方ともに空気にさらしてコバルトを酸化した。やはり、コバルトを含む試料では活性の減少が見られた。驚くべきことには、Ｃｏ(III)化合物の方がＣｏ(II) 化合物よりも、より効果的であった（参照試料に対して、Ｃｏ(III)は０％活性でありＣｏ(II)は４２％活性だった）。これは、おそらく他の系（バガーらによるJ.Inorg.Biochem．誌52:165(1993)を参照）で見られるように、Ｃｏ(III)化合物全体の電荷が阻害剤を活性部位に引き付ける助けになっているものと考えられる。 [Co(III)(acacen)(NH₃)₂]Clの実験はコバルト濃度が２．４ｍＭから２．４ｎＭの範囲で、繰り返し行なった。インキュベーションは２５℃で１２時間行なった（第ｘｘ図）。コバルト濃度が２４μＭの低さでもタンパク質を阻害した。５ ℃という低い温度でのインキュベーションではトロンビンの阻害開始が遅くなったが、これはＣｏ(III)の配位子交換が遅くなることに対応している。５℃で３時間後には、すべてのコバルト濃度範囲にわたって部分的な阻害が観測された。上記の２５℃での測定では、活性は、コバルト濃度が高くなるほど、インキュベーション時間が長くなるほど失活した。コバルト化合物が入っていない参照試料の活性は、すべての時間で安定であった。酵素に結合するコバルト錯体のだいたいの数を決定するために、最初に阻害されたタンパク質を分子ふるいカラムに通し、結合していないコバルト錯体を除いてから、純粋なトロンビンと純粋なコバルト化合物のモル吸光係数が分っている少なくとも二つの波長で吸光度を測定した。この測定から、ベールの法則に基いて各々の濃度を求めることができる。二つの試料について測定したところ、酵素当りのコバルトの数は５−８となった。トロンビンにはヒスチジンは５つしかないが他の残基や静電的に結合しているものを差し引くことはできない。 dPheProArgを含むペプチドによるトロンビンの阻害トロンビンの活性部位に特異的に結合するコバルト錯体にするには、錯体に認識する要素を付ける必要がある。dPhe-Pro-Argという配列のトリペプチドは、トロンビンの阻害剤として知られており、アルギニンはＰ１アスパルタートに強固に結合する。GGdFPR、GGGdFPR、GGFPRおよびGGGFPRをアミドとして得て、トロンビンに対する阻害を調べた。結晶構造および類似のペプチドの阻害データ（バジェスらによるInt.J.Peptide Protein Res．誌12:217(1978)を参照）から予想されるように、dPheを含有しているペプチドがより優れた阻害剤であることが分った。これは、このようなペプチドは天然の異性体よりも、より効果的に疎水的な結合部位に接近できるためである。(Gly)₃dPheProArgのＫ₁は約２０９μＭである。トロンビンに対するＣｏ(III)−ペプチド化合物（二つのピークは陽イオン交換樹脂によるもの）の阻害を、それ以上の精製をすることなしに調べた。それぞれの濃度は、モル吸光係数が[Co(III)(acacen)(NH₃)₂］Cl（7700M^-1cm^-1）と同じであると仮定して決定した。その結果、１μＭ以下の濃度で阻害がおき、[Co( III)(acacen)(NH₃)₂]Clあるいはペプチド単独の場合とは桁違いであった。［実施例５］ジンクフィンガー転写因子の阻害コバルト化合物がジンクフィンガーが一致した配列に結合するのを妨げることを示すために、二つのモデルで実験をした。一方は、三つのＣＣＨＨジンクフィンガーを持つヒトＳｐ１転写因子であり、他方はレトロウィルスのヌクレオキャプシッド・タンパク質の最初のジンクフィンガー領域に相当する合成ペプチドである。Ｓｐ１結合の阻害２０ｕＬのバインディングバッファー(25mM Tris pH8.0、100mM KCl、2mM DTT 、100uM ZnCl₂、10%グリセロール）と２５ｎｇのＳｐ１（プロメガ社）を含む試料を、４０ｆモルの３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドとともに、様々な濃度のコバルトキレート錯体（軸配位子としてＮＨ₃もしくはイミダゾールを持つＣｏ( III)ａｃａｃｅｎ）の存在下もしくは非存在下でインキュベートし、ゲル移動およびフィルター保持検査によって評価した。ゲル移動：試料を室温、１００Ｖ、０．５ＸＴＢＥで４％ポリアクリルアミド・ゲル（８０：１）にかけた。ゲルは、この試料の導入に先立って３０分間、準備稼動させておいた。この実験によって、コバルト錯体の存在がＳｐ１が一致したオリゴヌクレチドに結合するのを阻害することが示された。フィルター保持検査：上記の試料をニトロセルロース（0.45um フィルター、シュライヒャー・アンド・シュエル社）に塗布し、洗浄バッファー（100mM HEPE S、pH7.5、1mM EDTA）で２回洗浄した。膜をＦｉｌｔｒｏｎ−Ｘ（ナショナルダイアグノテック社）とともに室温で１５分間インキュベートし、結合の数を液体シンチレーション計数管（ベックマン・インスツルメント社）によって検知した。コバルト化合物の量が増すに従い、フィルターに結合している数が減少していたことから、Ｓｐ１とオリゴヌクレオチドとの結合が損なわれていることが分った。合成レトロウィルス・ジンクフィンガーの構造破壊ＨＩＶ・ヌクレオキャプシッド・タンパク質の最初のジンクフィンガー領域に相当する１８アミノ酸ペプチドを合成して、一連の構造の研究を行なった。ジンクフィンガーの立体構造：２５ｍＭのリン酸バッファーｐＨ７．０中に溶かした０．１ｍｇ・ｍＬのペプチド溶液の円二色性スペクトルをとって調べた。亜鉛がないとペプチドは不規則なコイル構造に特徴的なスペクトルを示すが、亜鉛があるとスペクトルは劇的に変化し、タイプII型とジンクフィンガーを示すスペクトルになった。ジンクフィンガー構造の破壊：３５０ｎＬのＤ₂Ｏに溶かした４ｍｇのペプチドのプロトンＮＭＲスペクトルを測定した。亜鉛がない場合のスペクトルには、配位していないヒスチジンからのプロトンに相当するピークも含めて、芳香族領域に多重線ピークが表われていた。これらのピークは亜鉛の存在下では消え、代って金属に結合したヒスチジンからのプロトンに相当するピークが表われた。コバルト化合物が存在するとスペクトルは劇的に変化し、ペプチドの構造が乱されていることが分った。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Cobalt-Schiff base compounds [Technical field] The present invention relates to cobalt compounds and the production of proteins using such compounds. It relates to a method for reducing the activity. [Background Art] In recent years, the elucidation of the structures of biologically active metal complexes and metal-containing proteins has greatly advanced. Therefore, the use of metals in medicine has been remarkably developed. At present, cobalt-containing compounds containing trivalent Co (III) are antiviral Activity, anti-tumor and antibacterial activities, as well as inflammation and burns. It has been shown that it can also be used for treatment (US Pat. No. 4,866,054, 4 860553, 5049557, 5106841, 514076, 52100 No. 96 and "Agents and Actions" by Woolley et al. (Agents and Actions), 35, 244 (1992)). These complexes have the following basic structure. Since these complexes are considered to be active oxygen and superoxide antagonists, It is thought to relieve symptoms associated with free radicals such as sickness. In addition, a Co (II) complex of isopropylsalicylic acid was made, which was cytotoxic. (Ranford et al., “Journal Chemical Solutions” Saity Dalton Transaction "(J. Chem. Soc. Dalton Trans.) Magazine, 1993, p. 3393). Oxidation of certain Co (III) complexes coordinated with nitrogen mustard also expands. Releases active aliphatic mustard, which acts as a diffuse cytotoxin (according to Weir et al.). Journal Medical Chemistry (J.Med.Chem.), 36 volumes, 1 839 (1993)). [Disclosure of the Invention] It is an object of the present invention to include a cobalt compound containing a target molecule (including a molecular moiety). To provide a new cobalt compound. Furthermore, the present invention Provide a method for inhibiting the activity of a protein such as an enzyme using a cobalt compound The purpose is also to do. In order to achieve the above object, it comprises a water-soluble tetradentate Schiff base Co (II) complex Provide the substance. Further, the present invention provides a compound having a structure of the following first formula. (Formula 1) In the first formula, Co may be Co (II) or Co (III), and R₁, R_Two, R_Three, R_Four , R_Five, R₆, R₇And R₈Represents hydrogen, an alkyl group, an aryl group, Aqueous organic acids, alkyl alcohols, alcohols, alkylamine groups, amine groups, Or a target molecule. In the first formula, R₁, R_Two, R_ThreeAnd R_FourAre hydrogen and alk, respectively. Also provided are compounds that are aryl or aryl. Further, a protein-cobalt in which a protein is bound to a cobalt compound of the first formula Compound complexes are also provided. Further, the selected protein is brought into contact with the compound of the first formula to form the selected protein. A method for inactivating the protein is provided. In addition, the zinc finger protein is brought into contact with the above-mentioned cobalt compound. To inactivate zinc finger proteins. [Brief description of drawings] FIG. 1 shows the inactivation of thrombin. 3.07 × 10 at 25 ° C.^-9M Toro About American Binary (American Diagnostic) It was examined using Spectrozyme TH manufactured by KK. The reaction is temperature controlled Hewlett-Packard HP8452A diode array spectrophotometer Therefore, it was monitored at 406 nm. All experiments were performed with 10 mM Tris, 10 mM mM HEPES, 0.1% polyethylene glycol, 0.5M sodium chloride And pH 7.8. Co (III) carboxypropyl (NH_Three)_Two(C in the figure o (carboxypropyl)) is the peptide NH_Two-GGGdFPR-CO-NH_Two(Pep in the figure (Designated as ptide dFPR). The measured inactivation was determined by Co (carbo xypropyl) (NH_Three)_Two, Peptide, and Co (III) acacen (NH_Three)_TwoC1 (Co (aca cen))). This is due to the known Inhibitors have significantly increased enzyme inhibitory capacity compared to unbound but inhibitory activity. It is shown that it adds. FIG. 2 shows that Co (III) (acacen-GGGFPR) (NH_Three)_TwoThe structure of is shown. FIGS. 3A and 3B show that the temperature dependence of the enzyme inactivation rate is related to the ligand exchange rate. Related. (A): temperature dependence (see Example 3), (B): Ligand exchange rate (see Example 3). FIG. 4 shows [CoIII (acacen) (NH_Three)_Two] Cl showed inhibition of thrombin. Toro (A) 0 M Co (III) and (B) 2.5 mM Co (III). For 12 hours at room temperature. Spectrum every 30 minutes for 30 seconds Is measured, and p-nitroaniline generated by hydrolysis of a commercially available substance by an enzyme is measured. Release was monitored. FIG. 5 shows that the inhibition of thrombin depends on the concentration of the inhibitor, It was shown to be dependent on the temperature of the cuvate. Figures 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H and 6I show the present invention. The structure of the compound synthesized with the light cobalt compound is shown. Unless otherwise noted All compounds are Co (III) compounds. [Best Mode for Carrying Out the Invention] As described below, the present invention relates to a functional part such as histidine on a protein surface. Exchanges with or binds to the site to form a complex of the functional site and the cobalt compound. Cobalt compounds that can inactivate biological activities of proteins is there. The cobalt compound of the present invention is Co (II) (hereinafter referred to as Co (II)).⁺²In some cases) Also Co (III) (hereinafter referred to as Co (III)⁺³May be used). . In general, a Co (II) compound can have up to four coordination atoms, and only one And water molecules are weak at one or both axial ligands It is also possible to combine. Similarly, Co (III) compounds have up to six coordination atoms Two of which are here the positions of the axial ligands. What is "axial ligand"? Here, generally located at the fifth or sixth conformation in the structural formula Ligand L₁Or L_TwoMeans While not being bound by theory, the cobalt compounds of the present invention have an axial conformation. It is possible to impart biological activity by exchanging or adding a ligand of Book The biological activity of the cobalt compounds of the invention may be a new ligand, most preferably histidine. This is caused by the bonding of the nitrogen of the side chain imidazole. Probably In order for the target protein to show biological activity, a new ligand of cobalt compound Need some amino acids. Therefore, as described in detail below, Proteins such as enzymes that use histidine at the top position, and important metal ions, for example. Proteins that use histidine for binding have histidine in the axial conformation of the cobalt compound. Gin binds and becomes inactive because it cannot contribute to normal biological function reactions Become. When the cobalt is Co (III), the Co (III) complex has two specific axial ligands. And then, for example, when added to a protein, the original axial configuration The offspring are replaced by one or more ligands from the protein. This Is the origin of the affinity of the axial ligand of the protein for the cobalt compound? Even if they are stronger than these axial ligands, or if new ligands are present in high concentrations The axial ligand equilibrium occurs even when the protein-derived axial ligand is bound. You. Thus, in this way, the Co (III) complex replaces the axial ligand with another ligand. Can be Without being bound by theory, this is where cobalt is Co (II). Such compounds have one axial ligand under certain conditions. The Co (II) compound of the present invention It is preferred to synthesize in the absence of an axial ligand. Incubate with protein In the case of a histidine side chain, such as the nitrogen atom of imidazole, A certain site becomes an axial ligand, and a strongly bound protein-cobalt compound complex is formed. Wear. This is because Co (II) compounds, in which four atoms of Schiff bases are coordinated, For example, when bound to an imidazole moiety and oxidized to a Co (III) compound Happens. This is because the Co (II) compound is oxidized by binding to the protein, Since it becomes an o (III) compound, it can be considered that it is a reduction reaction in a sense. In this way, the imidazole axial ligand becomes the fifth coordinating atom and binds tightly . In a preferred embodiment, the amino acid in histidine contained in the target protein of interest is The imidazole nitrogen atom in the acid side chain is a new axial ligand. Implementation The examples and disclosure herein describe embodiments specifically for this histidine. However, any “cobalt-reactive amino acid” can be a new axial ligand Noh. "Cobalt-reactive amino acid" is an axial ligand for the cobalt compound of the present invention. Say what can be combined as. As described above, the histidine side chain The nitrogen of dazole is particularly preferred, but other than this, the aromatic amine of the tryptophan side chain may be used. Ndole nitrogen atom, cysteine and methionine side chain sulfur atom, arginine With amino groups such as lysine, lysine, asparagine or glutamine as axial ligands It is also possible. These sites are suitable electron donors under acidic conditions as axial ligands. Since it is not the body, can it be used depending on the pH of the solution containing the protein or enzyme? Will be decided. The present invention relates to a method for forming a complex with a protein having a suitable novel axial ligand. A compound. In one embodiment, the present invention provides a water-soluble tetradentate Schiff base compound of Co (II). To offer. “Tetracoordination” means that a Schiff base compound, which is a ligand of Co (II), has four coordination elements. Meaning having a child. A preferred embodiment is two nitrogen atoms and two oxygens An atom is a coordinating atom. "Schiff base" refers to a substituted imine. Substituents are described below It is something. In general, Schiff bases react in the condensation reaction of amines with aliphatic aldehydes. Thus, it is produced and substitution occurs on the nitrogen atom of azomethine. "Cobalt compound" means a tetradentate Schiff base bonded to a cobalt atom You. The Schiff base may be substituted or unsubstituted, May be Co (II) or Co (III). In a preferred embodiment, the cobalt compound has a structure as shown in Formula 1. (Formula 1) In this embodiment, Co may be Co (II) or Co (III) and R₁, R_Two, R_Three , R_Four, R_Five, R₆, R₇And R₈Represents a hydrogen, an alkyl group, an aryl group, respectively. , Hydrophobic organic acids, alkyl alcohols, alcohols, alkylamine groups and amines Group or target molecule. When Co is Co (II), R₁To R₈Less of One is a hydrophilic group that makes the compound water-soluble. Co is for Co (III) If R₁To R₈At least one of them is a target molecule. "Alkyl" or "alkyl" or literally these same words are A chain or branched alkyl group is meant, but a straight chain alkyl group is preferred. A place for splitting May branch at one or more places, As long as there is no branch, it may be branched anywhere. In addition, the definition of the alkyl group includes C_Fiveis there I C₆And the like. Optionally, the two R groups are cyclic They are part of a structure and may be connected through an annular structure. The alkyl group has 1 to 20 carbon atoms (C₁~ C₂₀), Preferably from 1 10 (C₁~ C_Ten), More preferably C₁From about C_FiveUp to. But there is In embodiments, the alkyl group may be large, especially for straight chain alkyl groups. . Methyl groups are particularly preferred. “Aryl” or “aryl group” refers to phenyl, benzyl, naphthyl, And pyridine, furan, thiophene, pyrrole, indole, purine, etc. Aromatic aromatic rings and heterocyclic rings containing nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus, etc. Means an aromatic ring containing Alkyl and aryl groups may be substituted, for example, a phenyl group It may be a substituted phenyl group. Examples of suitable substituents include alkyl and Reel group, halogen such as chlorine, bromine, fluorine, amine, carboxylic acid, nitro And the like. Of course, the group is not limited thereto. "Hydrophilic organic acids" or literally these same words are one or more Alkyl group having a carboxyl group -COOH, that is, a carboxylic acid You. As already mentioned, alkyl groups can be substituted or unsubstituted. You may not. C with at least one carboxyl group attached to the alkyl carbon₁From C₂₀Is used, but C is₁~ C_FiveIs preferred. Particularly preferred embodiments are Alkoxy group is attached to the terminal of the alkyl group. Other preferred hydrophilic Examples of the organic acid include phosphonic acids and sulfonic acids. Good A preferred hydrophilic organic acid is propionic acid. One preferred embodiment is one in which only one of the R groups is a hydrophilic organic acid. You. In the case of Co (III), such compounds are electrically neutral and therefore pass through the blood-brain barrier. Can be Particularly preferred are those having a structure represented by the following formula (2). You. (Formula 2) Further, by changing the length of the alkyl group shown in the formula (2), the carboxyl group becomes And promote or prevent it from becoming an axial ligand. "Amine" refers to the group -NRR '. In this embodiment, R and R ' May be the same or different and are hydrogen, alkyl or aryl. Preferred -NRR 'group is -NH_TwoIt is. An “arylamine group” is as defined above having an —NRR ′ group as defined above. Is an alkyl group. As defined above, an alkyl group may be substituted It may not be replaced. Preferred arylamine groups are n-propylamine and n-butylamine. “Alkyl alcohol” means an alkyl group having an —OH group. First As defined, an alkyl group can be substituted or unsubstituted. Alkyl alcohols can be primary, secondary or tertiary depending on the alkyl group. Good. In a preferred embodiment, the alkyl alcohol is a linear primary alcohol, Generally, it has at least 3 carbons. Preferred alkyl alcohol Examples of n-propyl alcohol, n-butyl alcohol, n-pentyl Alcohol, n-heptyl alcohol, n-octyl alcohol, etc. However, the present invention is not limited to these. Here, “alcohol” means an —OH group. One preferred embodiment is R₁To R₈One of which is the target molecule is there. Preferably, only one of the R groups is the target molecule. In another aspect, Two or more R groups may be the target molecule. If Co in the first formula is Co (III) If R₁, R_Two, R_Three, R_Four, R_Five, R₆, R₇And R₈At least one of the Molecule. Here, "target molecule" indicates a specific interaction with the target protein It means a group of functional molecules. This allows the cobalt compound of the present invention to It makes it possible to target towards white matter. That is, this cobalt compound Is the target component that can specifically bind or associate with the target protein. (A target compound or a target molecule portion) by a covalent bond. for example For example, the cobalt compounds of the present invention are known to inhibit proteases. It may contain a repeptide inhibitor, thereby providing a functional site on the target protein. Can effectively increase the local concentration of the cobalt compound. Limit Although not intended, suitable target molecules include polypeptides, nucleic acids, carbohydrates, Lipids, hormones (including proteinaceous hormones and steroid hormones), Growth factors, receptor ligands, antigens, antibodies and the like can be mentioned. As a preferred example, a cobalt compound containing a target molecule as one of the R groups is Can inhibit white matter (either enzyme or non-enzyme) Things. The term "protein inhibition" refers to the biological activity of a protein Means reduced or eliminated by the binding of the agent. In the case of enzymes, Inhibition results in decreased or inactivated enzyme activity. For example, a protease substrate Alternatively, using a polypeptide containing an inhibitor as the R group of the cobalt compound, Protease can be inhibited. Similarly, for transcription factors A nucleic acid capable of specifically binding to a protein that binds to a specific nucleic acid such as Can also selectively inhibit transcription factors using cobalt compounds You. These targeted cobalt compounds preferentially target protein target sites Binds to that site for non-specific binding to other sites or other proteins. Give significant status. The resulting compound is involved in interacting with other sites Reduce the number of molecules involved and reduce the side effects of inhibiting other proteins. Therefore, even at a lower concentration, a high effect is exhibited. Secondary mutual The effect also increases the time spent on the target by increasing the amount of ligand (ligand) ) Increase exchange opportunities. When designing a cobalt compound for a specific protein, the cobalt compound High affinity for imidazole sites or other reactive axial ligand sites Understand that the cobalt compound does not have to be completely bonded to the active site Should. Rather, it is important that the cobalt compound That you can approach. For example, when targeting an active residue of an enzyme, a cobalt compound Should generally not be larger than typical enzyme substrates or inhibitors. Target organism Interactions with the active site in the outer sphere are dependent on the net size and surface It depends on the characteristics. Cobalt reagents for best interaction in the outer sphere Adjust the size, charge, flexibility, stereochemistry, surface properties, etc. Therefore, the purpose Design appropriate inhibitors using the properties of proteins and enzymes to be used. Also, the embodiment As shown in, the cobalt compound at or near the active site of the protein Increasing the local concentration sufficiently increases the binding of the cobalt compound, This inhibits the biological activity of the protein, and if the enzyme is inhibited, K_mValue or K₁value Can be effectively reduced. If the target protein reacts to histidine or other cobalt (this Is important to have an amino acid) Both Co (II) and Co (III) can be used, but Co (III) is preferred . Even when the mechanism of action of the target protein is unknown, Co (II) and Co (III) Although a shift can be used, Co (II) is preferable. A preferred example is Koba One example is when an amino acid that is reactive to it can. 2 to 15 amino acid residues are shared by peptide bonds A compound formed by bonding. Preferred embodiments include from about 2 to about 8 Formic acid is used, but from about 4 to about 6 is most preferred. less than As noted, amino acid analogs can be used, but the natural L-form amino acids It is preferable to use Under certain conditions, only one amino acid residue It may be a peptide. Further, in certain embodiments, although not preferred, polypeptides It is also possible to use a large peptide that is almost protein it can. It is also possible to use a polypeptide treated with glycosylate as a polypeptide. It is one aspect. The definition of polypeptide also includes pseudopeptide structures and amino acid analogs. Follow For example, non-natural side chains or non-natural bonds can be decomposed in vivo, for example. Can be used to prevent or delay Also, the amino acid side chain The (R) -form or the D-form may be used. In addition, usually peptide bonds, ie pepti Amino acids linked by a docarbamoyl group -CONH- May be combined. An example of such a pseudopeptide bond is -CH_Two-NH- , -CO-CH_Two-, Azapeptide and retroinversion binding, etc. It is. As used herein, “nucleic acid” refers to DNA or RNA, or deoxynucleotide. A molecule containing both tides and ribonucleotides is meant. Generally, nucleic acids are nucleo The tide is from 3 to about 50 oligonucleotides, but from about 12 to about 36 Are preferred, especially having at least 21 nucleotides. preferable. When nucleic acids are used alone for solubility, the nucleic acids may be smaller. In some cases, it may be a single nucleotide. Nucleotides are natural Or any combination of natural and synthetic nucleotides. Uracil, adenine, thymine, cytosine, guanine and Anine is preferred. As described in detail below, nucleic acids include gene DNA, cDN A and oligonucleotides containing sense or antisense nucleic acids are included. Nuclear Acid may be single or double helix, partially single or double helix May be included. A particularly preferred embodiment is, for example, zinc finger rolling. When targeting a transcription factor, the nucleic acid is made into a double helix. If you do this, The swinger protein binds to the large groove of the double helix of the nucleic acid. Nucleic acids generally contain phosphodiester bonds, but in some cases, The acid may have a similar backbone, as described below. Example of something like this Examples include phosphoramides (by Tuerahedron, 49 (10): 1925 (1993) and references cited therein, Lett Singer, J. Org. Chem. Magazine 35: 3 800 (1970); Springer et al., Eur.J. Biochem. 81: 579 (1977); Nucl.Acids Res. 14: 3487 (1986), Sawai et al., Chem. Lett. J. Am. Chem. Soc. By Ret Singer et al., 805 (1984). Magazine 110: 4470 (1988) And Powell et al., Chemca Scripta 26: 141 91986), phosphorothio Eate, phosphorodithioate, o-methyl phosphoroamide linkage (Ecstein Author, 0ligonucleotides and Analogues; A practical Approach, Oxford Univer sity Press), peptide nucleic acid binding (J. Am. Chem. Soc by Eghorn) Journal 114: 1895 (1992), Chem. Int.Ed.Engl. See Nielsen's Nature 365: 566 (1993)). these Modification of the ribose / phosphate ester skeleton facilitates the addition of cobalt compounds Or in a physiological environment, as described below. This may be done to increase the stability of the molecule and increase the half-life. As used herein, “carbohydrate” has the general formula C_x(H_TwoO)_yRepresented by Compound. Monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides all Included in the definition and also of various sugar molecules linked for or Polymers are also included. Particularly preferred carbohydrates are glycosylated proteins (gala). Cose, mannose, fucose, galactosamine (especially N-acetylglucose) Monomers and oligos, such as samamine), glucosamine, glucose, and sialic acid. And especially for certain receptors, such as cell surface receptors It is a glycosylation component that allows binding. Other examples of carbohydrates include glucose , Ribose, lactose, raffinose, fructose, and other biological Important carbohydrate monomers and polymers. As used herein, "lipid" refers to fats, fatty oils, waxes, phospholipids, sugars. Means lipids, terpenes, fatty acids, and glycerides, especially triglycerides Means This definition of lipids includes eicosanoids, steroids, and Roles are included, some of which are prostaglandins, opiates, It may be a hormone such as cholesterol. Hormones include Lloyd hormones and proteinaceous hormones are included, as well as epinephrine, thyroxine, Oxytocin, insulin, thyroid stimulating hormone, calcitocin, coriogona Dotropin, corticotropin, follicle-stimulating hormone, glucagon, reutenage Hormone, lipotropin, melanocyte stimulating hormone, norepinephrine, Parathyroid hormone, vasopressin, enkephalin, seratonin, estra Diols, progesterone, testosterone, cortisone, and glucocorti It may be a coid. Examples of receptor (receptor) ligands include cell surface receptors. A ligand that binds to a receptor, such as a receptor, may be mentioned, for example, Hormones, lipids, proteins, glycoproteins, signal carriers, growth factors, cytokines, etc. Can be mentioned. In a preferred example, the target molecule is adjusted to the solubility of Co (II) or a cobalt compound. And choose. Thus, for example, the actual sequence of amino acid residues or nucleotides It is not limited to. Also, as mentioned earlier, the target molecule is a specific It is chosen to target the protein or enzyme. Thus, for example, When the offspring is a polypeptide, the actual sequence of the amino acids is important. R of the first formula₁To R₈At least one of which is a polypeptide Is also a preferred embodiment. In this embodiment, the target protein or enzyme is inhibited. Select the polypeptide that will be harmed. For example, if the enzyme of interest is a protease, the polypeptide may be an enzyme substrate or inhibitor. It shall include or include the reaction site of the harmful agent. Where the polypeptide contains an inhibitor In that case, the inhibitor may be reversible or irreversible. Polypep The sequence of the tide should be such that the polypeptide can bind to the active site of the protease. select. The binding site between the polypeptide and the polypeptide and the cobalt compound is histidine. Are selected to maximize the interaction between the active site and cobalt. This is As described in the above, the polypeptide can be N-terminal, C-terminal, or This is because they can be linked internally via one or more amino acid side chains. As is well known, the histidine active site of many enzymes is It is close to the S1-S1 'position, which is the binding site for the substrate (or inhibitor). example For example, serine and cystine proteases. Therefore, in a preferred mode Should be selected to optimize the interaction of the histidine active site with cobalt. You. For example, the residues from about P4 to P1 of the substrate or inhibitor (this is the enzyme Occupying positions S4 to S1 of the binding site of The compound at the C-terminus (P1), the active site of the enzyme, especially histidine The steric interaction between the active site and the cobalt compound is maximized. Also, polypeptides Has residues P1 'to P4' (which correspond to positions S1 'to S4'). Alternatively, they may be bonded at the N-terminus (P1). Further, when the polypeptide is P1 to P 1 ', with internal bonds at or near the P1 or P1' residue In some embodiments, the interaction between the histidine active site and the cobalt compound is similar To be the largest. This type of coupling is described below. But above The interaction does not need to be complete for the inhibition to occur, as in Inhibition occurs if the local concentration of the nearby cobalt compound is sufficient. Therefore, in the present invention, known enzyme substrates can be used as inhibitors, In addition, the efficiency of known inhibitors, for example, K₁Can be increased by decreasing Wear. Many enzyme substrates and inhibitors have been known for various proteases. ing. These include the histidine active site or the central metal to which histidine coordinates. Have the structural features of the enzyme whose crystal structure is known. It is also possible to design an appropriate cobalt compound by utilizing it. In addition, substrates and inhibitors An embodiment utilizing properties such as surface charge and hydrophobicity is also possible. By binding to cobalt compounds, the polypeptide inhibitor K₁Decreases Those are also one preferred embodiment. That is, the inhibitor binds to the cobalt compound. That makes it a better inhibitor. Therefore, the cobalt compound is It is effective even at low concentrations because fewer molecules are wasted on the position. At least one of the R groups has a cobalt compound on a particular protein or enzyme. A preferred embodiment is a nucleic acid which gives an effect. for example If the target protein is important for biological activity, such as zinc finger protein It may be a nucleic acid bound to a protein having at least one histidine. As is known for zinc finger proteins bound to nucleic acids, The link finger binds or interacts with three base pairs of the nucleic acid. Therefore The actual sequence of the nucleic acid used as the nucleic acid binding to the protein Varies depending on the protein. The nucleic acid sequence and the binding protein of interest are known. You. With respect to polypeptides, cobalt compounds can be combined with nucleic acids in different locations and in different ways. Join. A specific method will be described later. The binding site is a cobalt compound His which is important for the metal ion (or histidine active site) that binds Choose to maximize the interaction of cobalt-reactive amino acids like thiidine . In a preferred embodiment, the nucleic acid has a backbone capable of binding to a cobalt compound. Those modified to include a functional group are included. Such functional groups are At the 5 'or 3' end, or at an internal nucleotide. For example, Nucleic acids containing amino-modified nucleotides can be synthesized by known methods (eg, For example, J. Org. Chem. 44: 2039-2041 (1979) by Imazawa et al., Nu by Miller et al. cleosides, Nucleotides 12: 785-792 (1993) and WO95 / 15971, and these (See references). In this embodiment, the amino group is ribophosphine Introduced at the 2 'or 3' position of the moat backbone, whereby the nucleic acid is 5 'or 3' Binds to cobalt at the 'end or internal nucleotide. These amino groups Is used to link nucleic acids to cobalt compounds. Alternatively, phosphoramido Nucleotide dimer containing phosphorothioate, phosphorodithioate, etc. , O-methyl phosphoroamide bond, etc. Or, as described below, using known methods. An elemental atom or a sulfur atom may be introduced. Further, using a known method, the skeleton or Phosphorus atoms may be introduced into the liaison (eg, Angew. Chem. Intl. Ed. .Engl. 32: 666-690 (1993); Nucleic Acid Res. 22: 920-9 by Magney et al. 28 (1994)). When Co is Co (II) in the first equation, R₁, R_Two, R_Three, R_Four, R_Five, R₆, R₇You And R₈At least one is a hydrophilic group that makes the Co (II) compound water-soluble. is there. Only one R group is a hydrophilic group, and the other R group is a single hydrophilic R group converted to Co (II). In some embodiments, the compound is selected to provide sufficient water solubility. R₁But For example, those having a hydrophilic group such as n-propyl alcohol are preferable. It is an aspect. In addition, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 R groups become hydrophilic groups. Is also conceivable. Preferably, the hydrophilic group is the target molecule, especially It is preferably a peptide or nucleic acid. Here, “water-soluble” means that the Co (II) compound is an aqueous solution or other physiological It means that it has considerable solubility in various buffers and solutions. Dissolution Solvability can be measured in various ways. For example, solubility is according to the United States Pharmacopeia. Is measured and classified. The Co (II) compound of the present invention is “extremely soluble” (soluble Less than 1 part of solvent needed to dissolve 1 part of solute), "easy to dissolve" (dissolve 1 part of solute (1 to 10 parts of solvent needed), "Slightly soluble" (dissolves 1 part of solute) 10 to 30 parts of solvent needed), "Slightly soluble" (dissolve 1 part of solute) 30 to 100 parts of the solvent required) or "sparingly soluble" (1 part of solute (100 parts to 1000 parts of the solvent required for the residue). Also, Since compounds containing chlorobenzene are generally colored, when added to a colorless aqueous solution, It turns out that the solution has been dissolved to the extent that it does not interfere with its use due to color. For example, Many Co (II) Schiff base complexes are yellow or orange in color. It is a known technique to test whether a particular Co (II) compound is soluble in aqueous solution. It is possible in order. For example, as described above, a Co (II) Schiff base is added to a colorless aqueous solution. The complex is added and the solution is colored to indicate that it has dissolved. Also, one part of Co (II) The number of parts of the solvent required to dissolve the compound may be measured, or in gm / mL. Solubility may be measured. An embodiment in which the cobalt compound represented by the first formula has regiospecific hydrophilicity is also preferable. Good. That is, R₁, R_Two, R_ThreeAnd R_FourIs hydrogen, alkyl or aryl R is a hydrophobic group_Five, R₆, R₇And R₈At least one of Is a hydrophilic group. However, according to known methods, other combinations It is also possible to make it amphiphilic by means of a combination. This is, as described below, , Surface or active site of protein or enzyme due to site-specific hydrophilicity Is particularly desirable because it allows the cobalt compound to approach the vicinity of. If there is no theoretical limitation, this site-specific hydrophilicity / hydrophobicity Compounds are generally proteins that have both hydrophilic and hydrophobic parts And enzymes can interact more effectively. A particularly preferred embodiment of the present invention has a structure represented by the following formula (4). The fourth equation is R₁Is n-propyl alcohol, R_TwoIs hydrogen, R_ThreeIs methyl, R₆But Le, R₇Is hydrogen, and R₈Is methyl and R_FourAnd R_FiveIs hydrogen. (Formula 4) In this embodiment, Co may be either Co (II) or Co (III). Structures represented by Formulas 5 and 6 are also preferred. (Equation 5) (Equation 6) Cobalt compounds can be identified as redox potential, oxidation stability or compound axial ligands (axial Ligands having a group that changes the exchange capacity and the like are also preferred embodiments. You. For example, many Co (II) complexes of the present invention are sensitive to air oxidation. sand That is, these complexes are oxidized in the presence of oxygen in the air. Therefore, these Co The (II) complex is preferably synthesized and used in the absence of air. Further, from the above, further modifications were made so that the Co complex was stable in air. May be decorated. For example, the methyl R group of the complex of the present invention is replaced with a trifluoromethyl group. In this case, the oxidation potential of the metal changes, and a metal complex stable against air oxidation is obtained. You. For example, using commercially available 1,1,1-trifluoro-2,4-pentanedione The trifluoromethyl derivative of the Co (II) complex shown here can be synthesized . In addition, well-known modifications, such as chlorination of the large ring of Schiff bases, However, the stability of these complexes against air oxidation can be greatly improved. . Therefore, the trifluoromethyl group can be used alone or in combination with ring chlorination. Even when used together, it is possible to obtain a water-soluble and air-stable Co (II) macrocyclic complex. it can. Derivatives of the type described above are complexed so as to favor reactions with other compounds. Made to regulate the redox potential of the body. Similarly, by introducing an electron donating group or an electron withdrawing group, The ability of the compound to exchange axial ligands can be varied. As shown in the examples, R₁And R₈When the R group of trifluoromethyl is introduced at the position of Is essentially insensitive to new axial ligands. An electron donating group or The electron-withdrawing group is R₁And / or R₈Is preferably introduced at the position. this The position is not only easy to synthesize, but also suitable for electronic coupling. Also, R_TwoAnd / or R₇Is also preferred. Further, R_ThreeAnd R₆In the position Although it is possible to introduce an electron donating group,_ThreeAnd / or R₆Electronic suction When there is a sex group, it is difficult to synthesize a compound according to the scheme shown here. Good Preferred examples of the electron-withdrawing group include halogens (F, Cl, Br and I, in this order). Weakens the ability to attract electrons), substitutions such as phenyl and nitrophenyl Phenyl, amine and quaternary amine, thiol, nitro, carboxy, Tolyl, alkyne and alkane, sulfonyl and other known ones But not limited thereto. Preferred electron donating property Examples of groups include -OCH_Three, Methyl, carboxylate and ethers However, the present invention is not limited to this. Once the R group has been determined, the synthesis of the cobalt compound of the present invention is described below. Do it. Generally, the cobalt compounds of the present invention are synthesized as shown in Scheme I below. You. This is the journal organometallic chemistry by Costa et al. (J. Organometal.Chem.) 6: 181 (1966). It is. The above article includes acetylacetone / ethylenediamine (acace n) the composition derivatives available for making the ligands used in the present invention, such as n) Is described. (Scheme I) Compound 1 (ethylenediamine: “en”), 2 and 4 are known general compounds It can be synthesized by the method. Compounds 2 and 4 are aliphatic β-diketones and compound 2 is a fatty Aromatic amine. Compounds 2, 3 and 4 are compound 6 in Scheme II below. , 7 and 8 will be understood by those skilled in the art. Compound 6 And 8 are acetylacetone derivatives ("acac"), and compound 7 is acacen 'product. (Scheme II) When Co is Co (III), the axial ligand is usually introduced at the last stage. When attaching a target molecule, particularly a polypeptide or nucleic acid, to the R group, a cobalt compound Those having a carboxy group and an amino group are used. With carboxylic acid The cobalt compound is synthesized as shown in Scheme III below. (Scheme III)The amino derivative of a cobalt compound is synthesized as follows. (Scheme IV) As is known, the NCS group can subsequently be used for coupling. When the R group is a target molecule, especially a polypeptide or nucleic acid, the cobalt compound Generally, it is obtained through three steps. First, it has a functional moiety that can bind to the target molecule To synthesize a central cobalt compound. For example, amines, carboxy groups, Synthesize a cobalt compound that is the center with a rucapto group. Next, include the target molecule Synthesize the R group. Add a functional part that can bind to this as well. In some cases, Reactive groups other than the target molecule are kept from reacting with the functional group of the central cobalt compound. Protect. For example, amino acid side chains containing amino groups such as arginine will react. May need to be protected, but in some embodiments amino acids In some cases, the bond is made by a functional group on the side chain. Protecting groups and techniques using them are known Is used. After synthesizing the central cobalt compound and R group, then react the functional group And combine them. In some cases, they may be directly bonded. For example As shown in Examples, a cobalt compound in which the R group is a carboxy group is a polypeptide Directly to the amino terminus of In addition, cobalt compounds having a functional moiety of an amino group If it is, it binds to the C-terminal. As is well known, this direct binding reaction involves organic solvents as well. Alternatively, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbimide (EDC ) Is performed using a coupling agent such as Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Kiley & Sons (1985) Technical section on cross- of the 1994 edition of Pierce Chemical Campany catalog linkers, pages 155-200). The two functional molecules (molecular portions) are linked using a linking agent (linker) in a known manner. The attachment mode is also preferable. For example, two amino groups are known stable It can be linked using a functional group. Examples of such things are Functional or heterobifunctional linkers (Pierce Catalog and Hand book, pages 155-200). In addition, known linkers (see Pierce Catalog) ) Using a carboxy group (whether polymeric or targeted at the cell) Can also be induced. For example, carbodiimides are good nucleophiles, like amines The carboxy group is activated by a reagent so that it is easily attacked (Tocilin et al. Critical Rev. See Therapeutic Drug Carrier Systems 7 (4): 275-308 (1991) ). Mercapto group can be attached to amine or carboxy group with heterobifunctional linker Good. Of course, it is possible to connect in many ways other than the above method. You. The important point is that this connection does not significantly alter the properties of the target molecule. is there. That is, they still bind to the target protein after binding. It is to be able to do it. This can be easily confirmed as described below. Multiple functional groups on the target molecule are available for covalent coupling, for example, Alcohols, amino acids, and carboxy groups. Alternatively, the target molecule For example, by adding a linker with a functional moiety, Is also good. When polypeptide is used as R group, use amino group of polypeptide Is preferred. N-terminal amino group, or arginine, asparagine Such as amine groups such as glutamine, lysine, histidine, and tryptophan. The amino group of the amino acid side chain can be used. Similarly, the side of methionine and cysteine The linking may be performed using a sulfur atom in the chain. Also, glutamic acid and ass A carboxy group on the side chain of the formic acid can also be used. When the R group is a nucleic acid, it can be covalently linked to the cobalt compound at many sites. it can. Modification of the ribophosphate backbone of nucleic acids to include functional moieties A preferred embodiment (Mead et al., English version of Angewante hemie 34 (3): 352-354 (1 995) and the references cited therein, and the above-mentioned references of Imazawa et al. And Miller et al. reference). For example, an amino group was added at the 2 'or 3' position of a sugar by a known method. Those are also one preferred embodiment. Additional nucleotides with added amino groups May be added to the nucleic acid. That is, as shown in the embodiment, one or more Add the above "extra" nucleotides to the target nucleic acid. Or two nuku The phosphodiester bond between the leotides can be converted to phosphoramidite by known methods. , Phosphorothioate, phosphorodithioate or O-methyl phosphoroate It may be changed to a mid bond. Then use a nitrogen or sulfur atom as the functional moiety You. Nucleotide dimers, including those with altered bonds, It may be attached to. The functionality of the nucleotide base itself may be utilized. This Examples of such are the amino groups of adenosine and cysteine, known by thymine. (For example, J. Amer. Chem. So by Telther et al.) c. 111: 7221-7226 (1991); Angew.Chem. 103: 629-646 by English et al. (1991) and Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 30: 613-629 (1991), Good Child Biocnjugate Chem. 1: 165-187 (1991), Brun et al., J. Amer. Chem. Soc. Journal 113: 8153-8159 (1991)). The nucleic acid with the functional group is then As described for peptides, cobalt compounds can be used directly or via a linker. Can be added to things. Similarly, other target molecules, such as target carbohydrates, lipids, and hormones. Alternatively, it may be modified using a known technique to include a functional group for conjugation. Alternatively, a derivative having a functional group using a linking compound (linker) may be used. No. As described above, the functional group for coupling is the target molecule (the target molecule portion). Min) should not interfere with the binding to the target protein, and preferably Is not affected at all. In general, target molecules having these functional groups The parts can be obtained using known techniques. As long as it can be synthesized, the cobalt compound of the present invention can be used for many purposes. Most In a broad sense, the Co (II) compound can be used as a reducing agent in an aqueous solution. The cobalt compound of the present invention may be used as a general bacteriostatic or bactericide, an antibacterial and / or Is one of the modes of application as a typical or other therapeutic agent such as an antiviral agent It is. For example, a typical antimicrobial agent is a detergent or disinfectant composition, as is well known. It is used for things. Well-known use of antibacterial and antiviral drugs in therapeutics Have been. The bacteriostatic or antibacterial, antibacterial and antiviral activities of the compositions can be determined by known methods. Can be. For example, bactericidal activity is described in Example VI of US Pat. No. 5,049,557. It can be measured in the manner described. Anti-wiping in vivo and in glassware Ruth activity can be measured by the method described in US Pat. No. 5,210,096. Wear. The cobalt compound of the present invention can also be used for labeled proteins. Of the present invention Preferably, the Co (II) compound is synthesized without an axial ligand, and the Co (III) compound is In general, it is synthesized with two axial ligands. Incubation with proteins A specific site of the protein becomes an axial ligand, and the protein is strongly bound A cobalt compound complex is formed. Compounds containing cobalt can be detected spectroscopically Therefore, it can be used as a labeled protein. His protein is the preferred axial ligand It is imidazole of a thiidine side chain. Therefore, the combination with the protein surface or solvent Proteins having one or more histidine residues in combination are Can be labeled by using a cobalt compound of In this embodiment, the cobalt compound of the present invention is added to the target protein or Touch. Except for the excess cobalt compound, the labeled tamper with the Co (III) compound The quality is detected with a spectrophotometer. Co (III) compounds range from 280 nm to 500 nm 280, 338 and 451 nm General. The stoichiometry of the cobalt compound associated with the protein is Depends on how much the active site can be an axial ligand However, this can be measured in a conventional manner by a spectrophotometer. So, for example, four Histidine-containing proteins generally bind to four cobalt compounds Wear. Further, from the above, the cobalt compound of the present invention was used to investigate the properties of the protein surface. You can also use it. Bind to or label proteins In some cases, cobalt compounds can be analyzed by affinity chromatography using standard methods. It can also be attached to a column. Such columns can be used to extract protein from the sample. Can be used to separate quality. For example, depending on the nature of the cobalt complex, Remove protein from sample or have histidine at or near active site Certain proteins such as can be separated from other proteins in the sample You. One of the preferred embodiments of utilizing the cobalt compound of the present invention as an enzyme inhibitor It is. The mechanism of inhibition is similar to that of protein labeling. This state In some embodiments, the enzyme is capable of binding at the axial position of the cobalt compound of the present invention. Has one or more parts. One or more such parts Since it is important in terms of function also for proper enzyme activity, the cobalt compound of the present invention Will be deactivated by combining with For example, an enzyme whose catalytic active site residue is histidine or histone activity Enzymes in which tisidine is functionally important are particularly preferred. Serine protease (Trypsin, subtilisin, chymotrypsin, elastase, thrombin, X factor a, lysozyme, and other known substances), cathepsin and interleukin translocation Cysteine proteases such as exchange enzymes, RNAse H, thermolysin, Enzymes such as cactate dehydrogenase all have histidine in the active site. Can be inhibited by the compounds of the present invention. In this aspect, the cobalt compound is contacted with the target enzyme. Active site hiss The imidazole in the side chain of thiidine binds to the cobalt compound as an axial ligand. Co In the case of (II), oxidation occurs simultaneously or rapidly with this binding, and the Co (II) compound is To form an element-Co (III) compound complex. This is called “redox coupling” . Binding (in the case of a Co (II) compound, oxidation to it) results in inhibition of the enzyme. The exact mechanism of inactivation is unknown, but several possibilities are possible. Combined co Baltic compound [Co (III) compound after bonding and oxidation] It may be harmful and inhibit enzyme activity. That is, the cobalt compound May be bound at or near the catalytically active site. Alternatively, the catalyst Cobalt compound inhibits the catalytic mechanism by binding to histidine Maybe. Furthermore, in the case of Co (II), functionally important parts of the active site May be reduced by the Co (II) compound to inactivate the enzyme. In a preferred embodiment, the inactivation of the enzyme by the cobalt compound is practically irreversible. is there. The reactive axial ligand of the enzyme is the side chain of tryptophan, or cysteine or methyl. Onine, arginine, lysine, asparagine, glutamine, aspartate Alternatively, it may be a side chain indole of glutamate. As mentioned above, this The availability of these parts depends on the pH of the solution containing the protein or enzyme. Thus, in the state where proton donation occurs, these moieties are preferred as axial ligands. Not a good good electron donor. As described above, the above group is used as the active site. Enzymes with functionally important tryptophan, cysteine, and methionine Can be inactivated by the cobalt compound of the present invention as described above. Further, the metalloproteins can be inactivated by the cobalt compound of the present invention. it can. Generally, the metals of metalloproteins are histidine, cysteine, and methionine. Have a ligand such as One or more of these residues are cobaltated When deactivated by a compound, the bonding of metal atoms is reduced or eliminated. The biological activity is weakened or extinguished. Such a metalloprotein Examples include "zinc finger" proteins and proteins such as hemerythrin. Examples include, but are not limited to, nucleic acids bound to proteins. gin Kufinger protein binds zinc ion with histidine and cysteine (Ann. Rev. Biophy. Chem 19: 405-421 (1990); Science 232: 485 (1 986), Prog. Inorg. Chem. 37: 143 (1989)). Zinc finger protein Has been found to bind to nucleic acids and play various roles in the process of gene regulation. The Nk finger proteins include gene regulation that binds transcription factors and other nucleic acids Contains proteins (see Science by Berg above), eukaryotes, prokaryotes Found in organisms and viruses. Other suitable for deactivation by the cobalt compound of the present invention Zinc finger proteins include parts of steroids and thyroid hormone receptors Nucleic acid conjugated with DNA and the human tumor-inducing gene product GLI (Scienc See e-journal 261: 1701 (1993) and Nature journal 332: 371 (1988) by Kintzler et al. In addition, It contains five zinc finger regions). One or more That the zinc finger region is bound to zinc by at least one histidine. Is preferable, and a protein using two histidines is preferable. Metal In some cases, they are exclusively connected by stains. Inhibiting serine and cysteine proteases is also a preferred embodiment. It is also a preferred embodiment to inhibit carbonic anhydrase. Carboni Quanhydrase is associated with eye diseases such as diabetes and glaucoma, stroke, and convulsions. You. Accordingly, carbonic anhydrase inhibitors such as the Co (II) complexes of the present invention Is useful in treating these conditions. As described above, it is a useful embodiment to use the Co (II) complex for treatment of high intraocular pressure and glaucoma. It is. Carbonic anhydrase is associated with high intraocular pressure and Inhydrase inhibitors have been shown to be effective in lowering intraocular pressure in animals and humans (Experimental Eye Res. 58 (1): 107-116 (1994) by Shari et al. Eye et al. 7 (Pt5): 697-702 (1993) by Sam et al., Graefes Archive f by Gunning et al. or Clinical and Experimental Opthalomology, 231 (7): 384 (1993)). It is also a useful embodiment to use the Co (II) complex for treating stroke and convulsions. Carboni Mice excluding quanhydrase II are resistant to stroke caused by chemical methods Increased resistance and normal with pretreatment with carbonic anhydrase inhibitor Mice have increased resistance to stroke caused by chemical methods (veri See Spy et al., Epilepsy Res. 14 (2): 115-121 (1993)). It is also a useful embodiment to use the Co (II) complex for treating diabetes and renal dysfunction. Mosquito Elevated levels of rubonic anhydrase can cause metabolic diseases such as diabetes and high blood pressure. Associated with pressure, carbonic anhydrase inhibitors can help in these treatments (Palou et al., Biochem. International 26 (5): 809-820). (1992), ibid. 23 (4): 779-89 (1991), Arch.Biochem.Biophys. Journal 277 (2): 410-4 (1990), Clinical Sci. By Handuck et al. 81 (4): 457-64 (1991) )). Preferred use of cobalt compounds for inhibition of tumor cell proteins and enzymes It is like. As described above, Co (III) (acacen) compounds differ in their axial ligands. Ligands can be exchanged. This is due to the slow loss of one axial ligand Via a dissociation mechanism, through which a suitable intermediate binds. Happen. For many cobalt compounds, ligand exchange is a slow process. why Then octahedron d⁶When one ligand is removed from the complex, the ligand field stabilization energy Energy is greatly impaired (Huey et al., HarperCollins N.Y. organic Chemistry: 13th of Principle of Structure and Reactivity, 4th Ed. Section). Generally, ligand exchange is slow. For example, in imidazole excess water [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Exchange of ammonia and imidazole of Cl at 25 ℃, 1 hour Halfway between, the exchange rate increases with increasing temperature. However, to cobalt (II) When the reduction occurs, the electrons become antibonded d_z2As it enters orbit, the axial ligand becomes unstable. A typical one-electron reduction potential, irreversibly losing the axial ligand, is about -360 mV vs NH E (see Transition Met. Chem., Dubu et al., 7: 149 (1982)). This property Is called a “redox switch” and is used to control the reactivity of cobalt compounds. Can be For example, certain parts of a tumor are often acidic due to metabolism and abnormal blood flow. In this environment, the reduction reaction is more intense than in normal cells because of the element deficiency. It is easy to get up (Cancer Research, 1988) 8,775, Brown et al., J. Nat. CancerInst. 83: 178 (1991)). halogen Increase the reduction potential of cobalt acacene compounds by substituents such as This allows the reduction to occur in tumor cells without reduction in normal cells. Can be. In a similar manner, Weir and co-workers have selectively co-located in cancer cells. Attempts are being made to release Baltic-bound cytotoxins (see the above sentence by Weir et al.). Dedication). The effect of cobalt compounds as inhibitors should be tested by known methods Can be. If the target protein is an enzyme, perform the same tests as for known enzyme inhibitors. And test. Generally, the action of the enzyme in the presence and absence of the inhibitor being investigated Investigation and reaction kinetic parameters are calculated by known methods. The amount of cobalt compound inhibitor required to inhibit a given enzyme depends on the amount of protein As described under Quality Labeling, depends on the number of reactive axial ligands on the enzyme surface I do. For example, one active site histidine and two other “surface” histidines. For such enzymes, the ratio of cobalt compound inhibitor to enzyme is generally at least 3: 1 is required. As mentioned above, the total amount bound to the enzyme can be measured with a spectrophotometer. Wear. The Co (II) compound inhibitor is directly reduced by reducing the corresponding Co (III) compound. Is also one of the preferred embodiments. Here, “corresponding Co (III) compound” Means a Co (III) compound having exactly the same R group as the Co (II) compound. In general And Co (III) compounds are combined with axial ligands such as amines, 2-methylimidazole, and water. But it is of course not limited to this. In this embodiment, a Co (III) compound is first synthesized and then reduced to Co (III). Add to the enzyme under conditions such that III) becomes Co (II). There are several ways to do this is there. For example, the enzyme environment itself is Co (III) C It may be reductive to the Co (III) compound such that it becomes o (II). There Is, if the Co (III) compound has an electron accepting group as one of the R groups, The electron accepting group receives an electron in the state of and the electron is given to Co (III) to reduce Occurs to form a Co (II) body. Preferred examples of such an electron accepting group include methyl Cations such as le viologen (N, N-dimethyl-4,4'-bipyridine) , Ethyl or propyl viologen, and other known ones. Yes, but not limited to this. In addition, the reduction potential of the compound By placing the substance in a specific environment, such as glutathione in vivo, Can be adjusted. The resulting Co (II) compound is then converted to the enzyme as described above. Reacts with the reactive axial ligand to inactivate the enzyme. Therefore, the Co (II) compound is directly Occurs. That is, when a Co (III) compound is added to an enzyme, it is reduced to Co (II). It becomes a compound, which inhibits the enzyme. In this embodiment, the Co (III) compound May be inactive for a given target enzyme in a given oxidation state Deactivates the target enzyme in the second oxidation state. Because of this mechanism, even in vivo, In vitro, even if the inactive form of the cobalt compound is added as it is, a specific reducing environment It becomes an active Co (II) compound below. The compounds of the present invention may be formulated into pharmaceutical compositions in therapeutically effective amounts. here By "therapeutically effective amount" is meant an amount that produces the effect of a medication. The exact amount is cure Depending on the condition to be treated and the protein to be inhibited, confirmed by those skilled in the art by known methods can do. Making the pharmaceutical composition of the present invention water-soluble and adding Including a pharmaceutically acceptable carrier is one of the preferred embodiments. This Can be administered in various forms. For example, oral, subcutaneous injection, static Intravenous injection, peritoneal administration, topical administration, but not limited to . A method for inhibiting a specific protein or enzyme by the cobalt compound of the present invention is also provided. Offer. That is, contact or exposure of the target protein to the cobalt compound Inhibit by doing. This cobalt compound has the structure shown in Formula 1. Preferably. This cobalt compound is a specific protein by the addition of a target molecule. It is possible to aim for quality. In addition, inhibition by contacting zinc finger protein with cobalt compound It also provides a way to do that. Here, “inhibition of zinc finger protein” means Contact with cobalt compounds reduces the bioactivity of Kufinger protein Or disappear. Generally, zinc finger proteins are protein If the nucleic acid is bound to a protein, this means that the zinc finger is no longer To the extent that they do not combine. Conventionally, various Co (III) compounds have been known. Have been. These compounds represented by the following formula 7 are compounds represented by the formula 1 Like the product, it is effective in inactivating zinc finger proteins. Therefore, Co If Co (III), then R₁To R₈At least one of the polypeptides Alternatively, it need not be a target molecule such as a nucleic acid, but it is preferred. Soshi Similarly, when Co is Co (II), at least one of the R groups is a hydrophilic group. It is not necessary, but preferred. (Equation 7) In the seventh equation, R_AAnd R_FMay be the same or different; Group, a phenyl group or a substituted phenyl group. R_BAnd R_EAre the same but different May be hydrogen, an unbranched alkyl group, halogen, or It is a group with a structure. Where R_GIs hydrogen, an alkoxide group, an alkyl group or OH;_CAnd R_DIs They may be the same or different and are each hydrogen or an alkyl group. Examples will be shown below, and the present invention described above will be described in further detail. The various uses of the present invention are shown below. However, these examples are provided to illustrate the present invention. And does not limit the invention in any way. References cited here Is used for reference. [Example 1] Synthesis of cobalt compound [Co^III(acacen) (NH_Three)_Two] CI samples were obtained from Zvi Dori. Ase Tylacetone, benzoylacetone, ethylenediamine and triethylamine (TEA) was obtained from Aldrich (Milwaukee, WI). Tris (Hid Roxymethyl) aminomethane (Tris, Trizma base), polyethylene glycol Recall (PEG8000) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3- Ethyl carbodiimide (EDC) was obtained from Sigma (St. Louis, MO). N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HE PES) is described in J.I. T. Obtained from Baker (Philippsburg, NJ). Coba acetate Luto tetrahydrate was obtained from EM Science (Gibbstown, NJ). Human a-toro And the test reagent Spectrozyme TH (HD-hexahydrotyrosyl- L-alanyl-L-asparagine-p-nitroanilide diacetate) is It was purchased from Candiagnostica (Greenwich, CT). Antithrombin properties Uses the solid-phase method to synthesize biopolymers at the California Institute of Technology Beckmann Laboratory Determined by amide by group. Weak cation exchange resin Sephadec SuG-25 was obtained from Pharmacia (Uppsala, Sweden). Enzyme reaction Tracked spectrophotometrically with a photodiode array spectrophotometer. Material of extra mouth Was obtained from Amicon (Beverly, MA). HPLC uses Vydac reverse phase column Using.¹1 H-NMR was measured by FT-NMR at 300 MHz. for The solvent used was EM Omnisolve MeOH and ammonia to remove residual acid. Omnisolve CH_TwoCl_TwoFluka (Bax, Switzerland) genuine solvent Me OH and dioxane, absolute ethanol manufactured by Quantum Chemical Company (Tucola, IL) It is. Distilled water was obtained with a Bernstead Nanopure system. Using All reagents are genuine reagents.Synthesis of hydroxypropyl acasen 200 ml of deoxygenated CH_TwoCl_TwoThen, 10 mL of acetylacetone (aca) c, 0.0974 mol) and introduced into a 250 mL dropping funnel via tube. This drop The lower funnel was filled with 100 mL of deoxygenated CH._TwoCl_TwoAnd 32.6 mL of ethylenedi Attached to a 500 mL three-necked flask containing the amine (en, 0.488 mol) , Acac was added dropwise to the en solution. The reaction solution was treated with 0.2Na of pH 5.5. Extracted with 50 mL of Pi. The organic layer was separated and left in a refrigerator at −20 ° C. overnight. . The resulting solution was filtered through a paper filter and the solvent was removed in vacuo. The resulting compound is In silica gel chromatography prepared in_TwoCl_Two: MeOH: Et_ThreeN Was used as a developing solution with a mixed solvent of 95: 5: 0.5 (volume ratio) to further purify. Profit The obtained mono-acacen was identified by NMR. Monoacacen (0.5 g, 3.5 × 10^-3Mol) in 5 mL of ethanol Dissolve and add 7-hydroxy-2,4-heptanedione (0.51 g, 3.5 × 10^-3 Mol) was added. Diones were prepared in a conventional manner (MR Detty, J. Org. Chem. Journal 44: 2073-2077 (1979)). After reacting for 4 hours, solvent Was removed in vacuo. The resulting compound was purified on fresh silica gel chromatograph_Two Cl_Two: Further purification using a mixed solvent of MeOH of 93: 7 (volume ratio) as a developing solution did. The obtained hydroxypropyl acacen was identified by NMR.Synthesis of Co (II) hydroxypropyl acasen Hydroxypropyl acasen (0.25 g, 9.4 × 10^-FourMole) Dissolved in 2 mL of deoxygenated methanol in an active atmosphere glove box. This Solution of Co (II) (CH_ThreeCOO-)_Two(H_Two0)_Four(0.2338 g, 9.4 × 10^-FourMole) I got it. The reaction mixture was stirred for another 30 minutes. Seal the reaction vessel and remove the solvent in vacuo. I left. This compound was used without further purification.[Co (III) Synthesis of hydroxypropyl acacen (NH ₃ ) ₂ ] CH ₃ COO Reaction of hydroxypropyl acasen with cobalt acetate as described above However, after the reaction vessel was sealed, anhydrous ammonia gas was bubbled through the reaction And exposed to the air. The solvent is removed in vacuo and the product is neatly filtered on an alumina column. Purification was performed using tanol as a developing solution. The sample was identified by NMR.Synthesis of acacen 20 mL of acac (0.0973 mol) was added to 20 mL of ethanol. 6.5 mL of ethylenediamine (0.0973 mol) was added to this solution using a dropping funnel. ) Was added. The solution was left overnight in a refrigerator at 4 ° C., then dried with anhydrous diethyl ester ( MP = 110.1 to 111.1) to precipitate crystals three times.[Co (III) acacen (NH ₃ ) ₂ ] Cl Synthesis of 249.08 g of cobalt acetate 6H_TwoO (1 mol) is converted to 1.750 l of methano Dissolved in Whatman No. Filtered through 1. acacen (1 mol) Was suspended in 150 mL of methanol. Dry through silica gel drying column The nitrogen gas was bubbled into the reaction solution for 15 minutes. A cobalt acetate solution was added dropwise (0. 5 hours) and leave the brown-orange solution at room temperature under a nitrogen atmosphere for 2 hours After the reaction, open the flask and expose to air, and add NH 3 to the solution._ThreeBubble gas did. The solution was concentrated by a rotary evaporator. Equivalent sodium chloride Water in a minimum amount of water, pour it into a large container and leave it slowly And crystallized. The brown crystals were filtered off, washed with methanol and dried.Synthesis of asymmetric or "mixed" ligands "Acacen" (compound 9 of Scheme II): Dissolve 1 equivalent of ethylenediamine dissolved in absolute ethanol in ethanol It was added to 2 equivalents of acetylacetone with stirring. After 30 minutes, chill the mixture It was put in a refrigerator and white crystals were precipitated. The product is suction filtered through a glass filter and Washed with ethyl ether. This can be recrystallized with benzene to the desired purity. Can be. The melting point of the generated crystal was 111 ° C. "Monoacacen" (Compound 7 of Scheme II): The 1: 1 condensation product of acac and en is described in the literature (Cross et al., C.R. Acad. c., see Ser. II, 294: 173 (1982))._TwoCl_TwoReplace this with And synthesized. The resulting yellow oil often contains acacen. This can be achieved by chromatography on silica before or after the addition of the other diketone. And 97CH_TwoCl_Two/ 3 MeOH / 0.5 TEA can be removed using a developing solution. "Bzacacen" (R in the first formula₁R_ThreeAnd R₆Is methyl and R_TwoAnd R₇ Is hydrogen and R₈Is phenyl): One equivalent of benzoylacetone is converted to CH_TwoCl_TwoWhat was dissolved in the monoacace CH of n_TwoCl_TwoAdd to solution. When the solvent is removed, acacen becomes an impurity A white crystal is obtained. 97CH on silica chromatography_TwoCl_Two/ 3Me Purification was performed using OH / 0.5 TEA as a developing solution. "Aciden" (Compound 11 of Scheme III) One equivalent of 4,6-dioxoheptanoic acid is converted to CH_TwoCl_Two1 equivalent CH of ethylenediamine_TwoCl_TwoInsoluble 1: 1 condensate immediately upon addition to solution Precipitated. The product was filtered off and dried under vacuum. Melting point was 140 ° C. Reeling The direct reaction between 4,6-dioxoheptanoic acid and monoacacen was Did not happen. Obviously, even when dehydrated, this acid group can lead to decomposition It was. It is satisfactory to add excess triethylamine to neutralize diketone No results were obtained. "Acacaciden" (compound 13 of Scheme III) One equivalent of aciden was added to and suspended in pure Fluka MeOH. 1 equivalent of bird Ethylamine and 2-2.5 equivalents of acac were added and the mixture was stirred overnight, It became a color solution. Evaporation to dryness gave an orange oil crude. Silicak In the chromatograph, add 0.5% TEA to prevent hydrolysis of the imine bond. Thananol 5% -25% CH_TwoCl_TwoPurified using the solution. Remove solvent in vacuo It was then recrystallized from ethanol to give a beige solid. M⁺Is expected 282. [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Cl: Method obtained from Zvi Dri (Technion, Haifa, Israel). 1 An equivalent amount of acasen was degassed in vacuo and placed under an argon atmosphere. Drying, degassing Methanol was introduced into the flask through a tube. Same for 1 equivalent of cobalt acetate The resulting purple solution was added to a colorless solution of the ligand through a tube. A After stirring for 2 hours in the atmosphere of Lugon, the color of the solution was observed to change from purple to orange. I was able to measure. Ammonia gas is blown into the solution to bubble, then open the flask And then exposed to air. The reaction solution was stirred for 4 hours to react with ammonia, and then dissolved. The medium was removed in vacuo. The red solution was filtered and concentrated on a hot plate. Saturated salt Upon addition of aqueous sodium chloride solution, a brown product precipitated. Recrystallized from ethanol As a result, a tan powder was obtained. [Co (III) (acacaciden) (NH_Three)_Two] Cl: The procedure was as described above, except that the ligand was acacaciden. Crude reaction precipitates However, purification with ion exchange resin using aqueous ammonium acetate solution Upon removal of the acidic buffer, a light brown powder was obtained. M⁺Is 373 as expected there were. Peptide synthesis of GGGdFPR amide: Peptides are from the Beckmann Institute Biopolymer Synthesis Group (California Institute of Technology) University). Synthesis is performed on an ABI Model 430A peptide synthesizer. Maryfield solid-phase synthesis provides N-tert-butyloxycarbonyl (Boc ) Using p-methylbenzhydrylamine (MBHA) resin with amino acid derivative It was done in. The terminal Boc protecting group was removed by trifluoroacetic acid (TFA). Was. The side chain protecting groups and the peptide-resin bond were subjected to HF conditions (90% HF, 5% p- Resole, 5% p-thiocresol). After removing HF under vacuum, The peptide / resin was washed with ether. Then, put the peptide in 10% aqueous acetic acid Dissolved in the solution and filtered to remove the resin. Gel filtration of the crude peptide solution The scavenger was removed through the exchange resin AG1-X2. Further peptide Vydac C8 reverse phase HPLC with linear gradient 6-26% acetonitrile / water / 0 . 1 Purified with% TFA at a flow rate of 2.0 mL / min over 30 minutes. Ligation product [Co (III) (acacen-GGFPR) (NH_Three)_Two]: A potential problem in binding the cobalt compounds of this peptide is The arginine side chain of the tide is more reactive than the N-terminal, whether protonated or not. (Peptide Chemistry: A Practical Te by Bozansky) xtbook, Springer-Berk Berlin, 1988). Arginine Is PK_aIs approximately 12.0, so it is easily protonated. Is insoluble in organic solvents such as dioxane used in many coupling reactions Become. Therefore, we use the water-soluble coupling reagent, 1- (3-dimethylamino). -Propyl) -3-ethylcarbodiimide (EDC) was used. Starting through a reaction A 10-fold excess of EDC is needed to make up for this hydrolysis. As a by-product As urea is generated in large quantities, Amicon YCO5 filter Pass through or extract to obtain the crude organic solution. In addition, HPLC purification of hydrophilic peptides elutes to aid retention Requires a small amount of organic acid in the solvent. Such acids are immiscible with unbound ligands. Purification was performed in the absence of free ligands, as they attack Neither the reverse phase of C18 nor the normal phase cyano column is effective in re-dissolving the mixture. won. In reverse phase, treat with ammonium acetate buffer and acetonitrile. However, some degradation of the product due to hydrolysis of the imine bond remains Was To avoid this, add a metal to the ligand before attaching it to the peptide. The imine was protected by introduction. The synthesis was performed as follows. That is, [Co (III) (acacaciden) (NH_Three)_Two Was dissolved in 0.1 M HEPES buffer at pH 8 at 5 ° C. Same buff A solution prepared by dissolving one equivalent of the peptide was added to the gel. Add 5 equivalents of EDC directly After 4 hours, another 5 equivalents of EDC were added. After stirring the reaction at 5 ° C. overnight Lyophilized to give a reddish brown product. The crude product is eluted with ammonium acetate Purification on a purified cation exchange resin (Pharmacia G-25) yielded two products. Was done. All were red, indicating that they contained cobalt,¹ H Phenyl from the signals at 7.28 and 7.20 ppm of the NMR spectrum It was also found to contain alanine. According to the mass spectra of both, elution The first in the liquid has lost its axial ligand, probably replaced by arginine It was. This is because arginine is deprotonated and the overall charge is +1 It is thought that it eluted early because it became no longer. In addition, the second The band was found to have the desired product. First M⁺Is 932 and the second M⁺Is 1066. The calculated mass of the desired product diacetate is 1062. Example 2 Inhibition of Carbonic AnhydraseInhibitory effect of Co (III) compound Bovine carbonic anhydrase (20 mg, 6.7 × 10^-7Mol, carb Iochem) was dissolved in 0.5 mL of Tris buffer. 30 mg in this solution Co (III) hydroxypropyl acasen (30 mg, 7.6 × 10^-FiveMole ) Was dissolved in 0.5 mL of water. The resulting solution is incubated for 48 hours. I was vate. Excess cobalt complex is tris buffered with a PD-10 gel filtration column. (PH 8, 0.05M). This Co (III ) The enzyme incubated with the complex maintained 100% activity.Inhibitory effect of Co (III) compound Bovine carbonic anhydrase (30 mg, 1 × 10^-6Mol) to 3 mL Make two samples dissolved in degassed Tris buffer (pH8, 0.05M) Was. On one sample, Co (II) hydroxypropyl acasen (30 mg, 9 × 10^-FiveMol) was added. See bovine carbonic anhydrase sample for reference A sample was used. Incubate the solution under an inert atmosphere (glove box) After 48 hours and 96 hours of incubation, remove 1 mL from each sample Removed. The protein is then exposed to air and excess Co (II) hydroxyprop Lucacen was subjected to Tris buffer using a PD-10 gel filtration column (Pharmacia). (PH 8, 0.05M). Protein Enzyme activity was measured using p-nitrophenyl acetate as a substrate (Pocket See Biochem, 6: 668-678 (1967) by Kerr et al.). The results are shown below. Co (II) hydroxypropyl by acacen Inhibition of carbonic anhydrase (CA) Incubation time Inhibition of CA (%) 48 hours 33.8% 96 hours 43.2% Example 3 Inhibition of Thermolysin Thermolysin (2500000 units, Calbiochem) in 20 mL Tris buffer Fur (pH 7.2, 0.1 M, 2.5 M NaBr, 0.001 M CaCl_Two ) And left at 4 ° C. Enzyme concentration to E_1% ²⁸⁰= 17.65, molecular weight 346 00. This solution was further subjected to F using a Superdex 75 (Phermacia) column. 0.1 M Tris buffer (pH 7.2, 0.1 M -NaBr, 0.01 CaCl_Two). This stock solution contains 4 Stored at ° C. N- [3- (2-furyl) acryloyl is used as a substrate for thermolysin. [Ill] glycyl L-leucinamide (FAGLA) was obtained from Sigma. This group Dissolved in dimethylformamide (DMF) and diluted with buffer to give the final Has a concentration of 0.1 M Tris, pH 7.0, 0.1 NaBr, 10 mM Ca Cl_Two(The final concentration of DMF is 25%, Feder et al., Biochem. 9: 2784-2791 ( 1970)). Enzyme and substrate concentrations for all measurements Was 50 nM and 2.0 mM, respectively. Peptidase activity of thermolysin Decreases the absorbance at 346 nm due to hydrolysis of FAGLA by the enzyme It was measured by tracking what you did. The initial rate was measured with a reaction solution of 10% or less. Thermolysin (2 × 10^-FourMol) with [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Cl (5mM) In both cases, HEPES buffer (pH 7.0, 0.01 M, 0.005 M Ca Cl_Two). Thermolysin concentration is 5 × 10^-8M, Cobalt inhibitor concentration is 1.25 × 10^-FiveM. The results are shown below and in FIG. It was shown to. Inhibition of thermolysin Incubation time Inhibition (%) 45 minutes 46.2% 190 minutes 63.9% 322 minutes 77.7% 0.1 M Tris, 0.1 M NaBr, 0.01 CaCl_TwoPH 7.2 (The buffer for thermolysin) And finally a solution with an enzyme concentration of 10 mM and a cobalt concentration of 2.5 mM. Was prepared. This is combined with a reference sample without the cobalt compound at 25 ° C. or Incubated at 37 ° C. for several hours. Collect 5mL of these solutions periodically To contain 495 mL of working buffer and 500 mL of FAGLA stock solution. In addition to the cuvette, follow the decrease in absorbance at 346 nm as described above. Enzyme activity was measured. All enzyme activity measurements were performed at 25 ° C. The result is Fig. 3. It was shown to. An experiment of ligand exchange is shown in FIG. 3B. This experiment was conducted with a cobalt compound The binding to the histidine residue on lysine is determined by imidazole and the bisamine product Co (III ) (acacen) (NH_Three)_TwoIt is imitated by examining the bond with. 1.35 mM Co ( III) (acacen) (NH_Three)_TwoIn an operating buffer with 0.1 M imidazole I did it. Imidazole and NH_ThreeThe absorption at 420nm Was monitored at 25 ° C and 37 ° C. Similarity of enzyme inhibition with temperature dependence of ligand exchange of cobalt complexes modeled That ligand exchange by histidine residues is the rate-limiting process of enzyme inhibition. Suggests that The binding between the cobalt compound and the active site histidine was confirmed as follows. Operation buffer solution of 10 μM thermolysin (0.1 M Tris, 0.1 M NaBr, 0.01M CaCl_Two, PH 7.2) with Co (III) (acacen) (NH_Three)_TwoCl ( 5 mM) and 25 ° C. in the presence and absence of the inhibitor phosphamide. Incubated. Phosphoramide (N-α-L-rhamnopyranisyloxy) Cyphospho OL-lausyl-L-tryptophan, 50 μM)₁Has a pH of 7. 5 was reported to be 32 nM (Kitagishi et al., J. Biochem. 95: 529- 534 (1977)). Phosphoramidon binds to the active site of thermolysin, The enzyme-inhibitor complex has been crystallographically characterized (Weaver et al. Mol. Bio. Journal 114: 119-132 (1977)). Cobalt compound and overnight incubation FPLC gel filtration column using Superdex 75 (Phermacia) column With 0.1 M Tris buffer (pH 9, 5 mM CaCl 2)_TwoInhibit using The agent was separated from the enzyme. The resulting solution was purified using a PD-10 column (Phermacia). , Transferred to Tris operation buffer and identified. After removing the inhibitor, the cobalt complex The irreversible inactivation did not reduce the extent to which the enzyme activity was measured. this According to the spectrum of the active enzyme, two cobalt complexes are bound to the enzyme. I found out. Thermolysin completely inactivated by the cobalt complex From the spectrum, 3 equivalents of the cobalt compound are found for each enzyme molecule. It was found to be bound. Active site protection interferes with thermolysin inhibitors, In addition, the inactivation of the enzyme is prevented because it prevents the binding of one equivalent of the cobalt compound to the enzyme. Occurs as a result of the binding of one cobalt compound to the elementary active site. Example 4 Inhibition of Thrombin Thrombin was chosen as the first target enzyme. The crystal structure of thrombin is Data bank (for example, file 1PPB, EMBO J. 8: 3467 (1989) by Bode et al.) ))). Thrombin, including histidine residues, Is a well-characterized 34 kD serine protease. Blood coagulation in the body Important, but undesired clots can cause serious life-threatening events. You. Thrombin has a well-defined structure and mechanism, and its activity can be easily tested. Because anti-thrombin drugs are useful as treatments for stroke, Was. Thrombin inhibition test: For all blood-derived Appropriate treatment was performed to avoid infection. Collect thrombin (0.75M chloride (30 μM in sodium stock solution, 1 mL), and divide into 100 μL aliquots. Dilute to 10 mL with a clean 0.75 M aqueous sodium chloride solution, filtered 2 μm. The sample was separated into 1 mL samples. -80 ° C until each sample is used And stored frozen. This protein should not be stored at -20 ° C. Because The temperature is too close to the eutectic point of the thrombin-salt mixture, and freeze-thaw is repeated. This is because it damages the protein. 10 nM Tris, 10 mM HEPES, 0.1% polyethylene glyco Buffer (PEG 8000) and 500 mM sodium chloride Prepared and brought to pH 8. The following is a manufacturer's instruction. That is, 5μ Spectrozyme TH was dissolved in 1000 mL of nanopure water. one [Co (III) (acacaciden) (NH_Three)_Two] Cl solution was used to add 16.6 mg of compound to 0.75 M NaCl, and a part of each of them was dissolved at a cobalt concentration of 4.7 mM to 4 mM. . Diluted to a range of 7 nM. Purified raw materials were also examined. Thrombin in the working buffer with the thrombin inhibitor for the time shown in FIG. Incubate (total volume of thrombin, buffer and inhibitor is 992 mL) there were). After this incubation, the substrate Spectrozyme TH was added (5 m M spectrozyme 8 mL), thrombin catalyzed hydrolysis rate at 406 nm Monitored. The final concentration of thrombin in this experiment was 3 nM and the concentration of substrate Was 40 mM. The inhibitor concentrations are shown in FIG. The rate of hydrolysis is saturated It was determined from the linear part of the time plot. Percent activity is measured by inhibitor The rate of hydrolysis of rosyme divided by the rate of hydrolysis without inhibitor is 100 Multiplied. The container of thrombin prepared as described above was thawed with warm water. This is 100 Each μL was added to 100 μl of the cobalt acacen solution sample. One 100μ The L thrombin sample was diluted with 100 μL of 0.75 M NaCl to obtain a reference sample. Used. Each sample was incubated as needed before testing. 98 Place 0 μL of test buffer in 1.0 mL, 1 cm quartz cuvette, ℃ (Hewlett-Packard Pelte thermostatic cell holder) Dar). 10 μL of the sample was mixed thoroughly with the contents of the cell. Spectrophotometer every 30 seconds And within the 30 seconds, 10 μL of Spectrozyme T Add H to the contents of the cell, and invert the capped cell several times to mix well. After that, replace the cells in the spectrophotometer. Absorbance at 406 nm Was sufficient, but a scan was performed for 10 minutes every 30 seconds from 250 nm to 500 nm. I did it. After a series of measurements, the reference sample is left to hydrolyze and determine the end point Ended before. From the absorbance at 406 nm, the pseudo-first-order reaction rate constant represented by the following equation was calculated. I asked. −ln [(A_∞-A_t) / (A_∞-A₀)] = Kt Where A∞ is the absorbance at the end, A₀Is the first absorbance (approximately Data) and A_tIs the absorbance at each time t. The slope of the plot's linear phyto (Typically R^Two> 0.99). Reference test without inhibitor The relative activity of each cobalt-containing sample was determined by comparison with the sample. The reference sample is It was used periodically to check for protein degradation. First unmodified [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Cl inhibits thrombin Examined. 0.1 μM thrombin and 2.5 mM [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Cl The containing solution was incubated at room temperature for 24 hours. From the same source as the reference sample Of thrombin were incubated for the same length of time without inhibitor. Each An aliquot is taken from the incubated sample and the commercially available substrate Spectrozyme T H was measured in excess. In addition, this spectrozyme TH is a protein hydrolyzate. Decomposition releases chromogenic p-nitroaniline. pseudo-p-nitroaniline Monitor the primary reaction production with a spectrophotometer and determine the reaction rate for each sample. Constants were calculated. The activity of the reference sample was normal, but the sample containing cobalt was complete (Fig. Xx). What effect does ligand not binding to cobalt have? Also did not show. In a similar experiment, under an inert atmosphere, water-soluble Co (II) hydroxypropyl Performed using the same concentration as above. After incubation, both the sample and the reference sample Both were exposed to air to oxidize the cobalt. After all, with a sample containing cobalt Showed a decrease in activity. Surprisingly, the Co (III) compound is better than Co (II) More effective than compound (0% activity Co (III) relative to reference sample) And Co (II) was 42% active). This is probably due to other systems (Bagger et al. J. Inorg. Biochem. Journal 52: 165 (1993)). It is thought that the charge of the whole thing has helped attract the inhibitor to the active site You. [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Cl experiments were performed with cobalt concentrations ranging from 2.4 mM to 2.4 n. Repeatedly in the range of M. Incubation at 25 ° C for 12 hours (FIG. Xx). Proteins were inhibited even at cobalt concentrations as low as 24 μM. 5 Incubation at temperatures as low as ° C delays the onset of thrombin inhibition However, this corresponds to the slow ligand exchange of Co (III). 3 at 5 ° C After time, partial inhibition was observed over the entire cobalt concentration range. In the above measurement at 25 ° C., the activity increased as the cobalt concentration increased. The longer the solution time, the more inactive. Reference sample without cobalt compound Activity was stable at all times. To determine the approximate number of cobalt complexes that bind to the enzyme, Protein through a molecular sieve column to remove unbound cobalt complexes Since the molar extinction coefficient of pure thrombin and pure cobalt compound is known Absorbance was measured at at least two wavelengths. From this measurement, based on Beer's law, To obtain the respective concentrations. When measured for two samples, the enzyme The number of cobalt per hit was 5-8. Thrombin has only 5 histidines However, other residues and those that are electrostatically bound cannot be subtracted. Inhibition of thrombin by peptides containing dPheProArg To obtain a cobalt complex that specifically binds to the active site of thrombin, It is necessary to attach an element to know. The tripeptide with the sequence dPhe-Pro-Arg Known as an inhibitor of thrombin, arginine is strong on P1 aspartate To join. GGdFPR, GGGdFPR, GGFPR and GGGFPR were obtained as amides and The inhibition on the bin was examined. Crystal structure and inhibition data for similar peptides Int. J. Peptide Protein Res. 12: 217 (1978)). As can be seen, peptides containing dPhe were found to be better inhibitors. Was. This is because such peptides are more effectively hydrophobic than the natural isomers. This is because the binding site can be accessed. (Gly)_ThreedPheProArg K₁Is about 209 μM You. Co (III) -peptide compound for thrombin (two peaks are cation exchange Inhibition by the exchange resin) was investigated without further purification. Each The concentration of each of these was determined by the molar extinction coefficient [Co (III) (acacen) (NH_Three)_Two] Cl (7700M^-1cm^-1Same as) Were determined assuming the same. As a result, inhibition occurred at a concentration of 1 μM or less, and [Co ( III) (acacen) (NH_Three)_Two] It was orders of magnitude different from the case of Cl or peptide alone. [Example 5] Inhibition of zinc finger transcription factor Cobalt compounds prevent zinc fingers from binding to matched sequences In order to show the results, experiments were conducted with two models. One is three CCHH zinc filters Is a human Sp1 transcription factor that carries the chromosome, while the other is A synthetic peptide corresponding to the first zinc finger region of the pseudo protein is there. Inhibition of Sp1 binding 20 uL of binding buffer (25 mM Tris pH 8.0, 100 mM KCl, 2 mM DTT , 100uM ZnCl_Two, 10% glycerol) and 25 ng of Sp1 (Promega). The material was mixed with 40 fmoles of 32P-labeled oligonucleotide at various concentrations. Cobalt chelate complex (NH2 as axial ligand_ThreeOr Co with imidazole ( III) Incubate in the presence or absence of acacen), And by filter retention test. Gel migration: 4% polyacrylic acid at room temperature, 100V, 0.5X TBE Run on mid gel (80: 1). The gel is allowed to stand for 30 minutes prior to the introduction of this sample. , Had been ready for operation. According to this experiment, it was confirmed that the presence of the cobalt complex It was shown to inhibit binding to matched oligonucleotides. Filter retention test: Use the above sample with nitrocellulose (0.45um filter, Schleicher & Sewell) and wash buffer (100 mM HEPE) (S, pH 7.5, 1 mM EDTA). The membrane is replaced with Filtron-X (National (Iagnotech) at room temperature for 15 minutes to determine the number of bonds Detected by scintillation counter (Beckman Instruments) . As the amount of cobalt compound increases, the number bound to the filter decreases. This indicates that the binding between Sp1 and the oligonucleotide is impaired. Was.Structural disruption of synthetic retrovirus zinc finger In the first zinc finger region of HIV / nucleocapsid protein The corresponding 18 amino acid peptide was synthesized and a series of structural studies were performed. Three-dimensional structure of zinc finger: in 25 mM phosphate buffer pH 7.0 Circular dichroism spectra of the dissolved 0.1 mg / mL peptide solution were examined. . Without zinc, the peptide shows a spectrum characteristic of an irregular coil structure, The spectrum changes dramatically in the presence of zinc, indicating type II and zinc fingers It became a spectrum. Destruction of zinc finger structure: 350 nL D_Two4 mg of pep dissolved in O The proton NMR spectrum of the tide was measured. The spectrum without zinc is , Including peaks corresponding to protons from uncoordinated histidine, Multiplet peaks appeared in the region. These peaks disappear in the presence of zinc, Instead, a peak corresponding to a proton from histidine bound to the metal appeared. The spectrum changes dramatically in the presence of cobalt compounds, disrupting the structure of the peptide. I found out.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年７月１４日（１９９７．７．１４）【補正内容】【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】【図６】【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１月１２日（１９９８．１．１２）【補正内容】多くのＣｏ(II)シッフ塩基錯体は黄色もしくはオレンジ色である。特定のＣｏ(II)化合物が水溶液に溶けるかどうかの点を試験するのは公知の手順で可能である。例えば、上述したように、無色の水溶液にＣｏ(II)シッフ塩基錯体を加え、溶液に色がつけば溶解していることが分る。また、１部のＣｏ(II) 化合物を溶かすのに必要な溶媒の部数を測定してもよいし、ｇｍ／ｍＬ単位での溶解性を測定してもよい。第１式で示されるコバルト化合物が位置特異的な親水性を有している態様も好ましい。すなわち、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄が水素、アルキルもしくはアリールのいずれかになっている疎水性基で、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つが親水性基になっているものである。しかし、公知の方法に従い、他の組み合わせによって両親媒性にすることも可能である。このことは、以下に述べるように、位置特異的な親水性によってタンパク質もしくは酵素の表面あるいは活性部位の近傍にコバルト化合物が近づくことができるようになるので、特に望ましい。理論上の制約がなければ、この位置特異的な親水性／疎水性を持つことでコバルト化合物は、一般に親水的な部分と疎水的な部分とを両方持っているタンパク質や酵素と、さらに効果的に相互作用をすることが可能になる。本発明の特に好ましい態様は、下記第３式で示される構造を持つものである。第３式は、Ｒ₁がｎ−プロピルアルコール、Ｒ₂が水素、Ｒ₃がメチル、Ｒ₆がメチル、Ｒ₇が水素、そしてＲ₈がメチルで、Ｒ₄とＲ₅とは水素になったものである。（第３式）この態様では、ＣｏはＣｏ(II)もしくはＣｏ(III)のいずれでもよい。第４式および第５式で示される構造も、また、好ましい。（第４式）（第５式）コバルト化合物が、酸化還元電位、酸化安定性あるいは化合物の軸配位子（軸リガンド）交換能力などを変化させる基を有しているものも、好ましい態様である。例えば、本発明の多くのＣｏ(II)錯体は空気酸化に対して敏感である。すなわち、空気中の酸素存在下で、これらの錯体は酸化される。従って、これらＣｏ (II)錯体は空気のない状態で合成、使用されることが好ましい。さらに、上記のことから、Ｃｏ錯体が空気中でも安定となるように、さらに修飾してもよい。例えば、本発明の錯体のメチルのＲ基をトリフロロメチル基で置換すると、金属の酸化電位が変化して空気酸化に対して安定な金属錯体が得られ物を、例えば生体内のグルタチオンのような特定の環境に置いて還元することで調節することができる。生じたＣｏ(II)化合物は、その後、上記のように酵素の反応性軸配位子と反応して酵素を失活させる。従って、Ｃｏ(II)化合物が直接に生じる。すなわち、Ｃｏ(III)化合物を酵素に加えると、還元されてＣｏ(II)化合物になり、それが酵素を阻害するのである。この態様では、Ｃｏ(III)化合物は与えられた酸化状態では、目的とする標的酵素に対して不活性であってもよいが、第２酸化状態で標的酵素を失活させる。この機構があるので、生体内でも、生体外でも、不活性な形のコバルト化合物をそのまま加えても、特定の還元環境下で活性なＣｏ(II)化合物となる。本発明の化合物は、治療上有効な量を配合した医薬組成物にしてもよい。ここで『治療上有効な量』とは、投薬した効果が生じる量を意味する。正確な量は治療すべき病状や阻害するタンパク質に依存し、公知の方法によって当業者が確認することができる。本発明の医薬組成物を水溶性にし、コバルト化合物に加えて薬学上受け入れられるキャリヤーを含ませるのは好ましい態様の一つである。この医薬組成物は様々な形で投与することができる。例えば、経口、皮下注射、静脈注射、腹膜への投与、局部投与などであるが、これに限定されるものではない。本発明のコバルト化合物によって特定のタンパク質や酵素を阻害する方法も提供する。すなわち、標的とするタンパク質をコバルト化合物に接触もしくはさらすことで阻害する。このコバルト化合物は第１式に示したような構造を持っていることが好ましい。このコバルト化合物は、標的分子の付加よって特定のタンパク質を狙うことが可能になる。また、ジンクフィンガータンパク質をコバルト化合物に接触させることで阻害する方法も提供する。ここで『ジンクフィンガータンパク質の阻害』とは、ジンクフィンガータンパク質の生体活性をコバルト化合物と接触させることで減少もしくは消失させることを言う。一般に、ジンクフィンガータンパク質がタンパク質と結合した核酸である場合、このことはジンクフィンガーがもはや核酸とかなりの程度、結合しないことを意味する。従来から、様々なＣｏ(III)化合物が知られている。下記の第６式で示されるこれらの化合物は、第１式で示される化合物と同様に、ジンクフィンガータンパク質の失活に有効である。従って、ＣｏがＣｏ(III)である場合、Ｒ₁からＲ₈のうち少なくとも一つが、ポリペプチドもしくは核酸のような標的分子である必要はないが、そうである方が好ましい。そして同様に、ＣｏがＣｏ(II)である場合、Ｒ基のうち少なくとも一つが親水基である必要はないが、そうである方が好ましい。（第６式）第７式において、Ｒ_AとＲ_Fは同じでも異っていてもよく、それぞれ、アルキル基、フェニル基あるいはフェニル基の置換体である。Ｒ_BとＲ_Eは同じでも異っていてもよく、それぞれ、水素、分岐のないアルキル基、ハロゲンあるいは下記の構造を持つ基である。ここでＲ_Gは水素、アルコキシド基、アルキル基またはＯＨであり、Ｒ_CとＲ_Dは同じでも異っていてもよく、それぞれ、水素またはアルキル基である。以下に実施例を示し、上述してきた本発明についてさらに詳細に述べるとともに、本発明の様々な利用を示す。ただし、これら実施例は本発明を説明するために示すのであって、決して本発明を限定するものではない。ここで引用した文献は参考のために使用したものである。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] July 14, 1997 (1997.7.14) [Content of Amendment] [Fig. 1] FIG. 2 FIG. 3 FIG. 4 FIG. 5 FIG. 6 [Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] January 12, 1998 (1998.1.12) [Content of Amendment] Many Co (II) Schiff base complexes are yellow or orange Color. It is possible to test whether a specific Co (II) compound is soluble in an aqueous solution by a known procedure. For example, as described above, a Co (II) Schiff base complex is added to a colorless aqueous solution, and if the solution is colored, it is understood that the solution is dissolved. Further, the number of parts of the solvent necessary for dissolving one part of the Co (II) compound may be measured, or the solubility in gm / mL may be measured. An embodiment in which the cobalt compound represented by the first formula has regiospecific hydrophilicity is also preferable. That is, R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are hydrophobic groups in which hydrogen, alkyl or aryl is any one of R ₅ , R ₆ , R ₇ and R ₈ are hydrophilic groups. Is what it is. However, it is also possible to make it amphiphilic with other combinations according to known methods. This is particularly desirable because, as described below, the regiospecific hydrophilicity allows the cobalt compound to approach the surface of the protein or enzyme or near the active site. Without theoretical constraints, this regiospecific hydrophilicity / hydrophobicity allows cobalt compounds to be more effective with proteins and enzymes that generally have both hydrophilic and hydrophobic moieties. It becomes possible to interact. A particularly preferred embodiment of the present invention has a structure represented by the following formula (3). The third formula is that R ₁ is n-propyl alcohol, R ₂ is hydrogen, R ₃ is methyl, R ₆ is methyl, R ₇ is hydrogen, and R ₈ is methyl, and R ₄ and R ₅ are hydrogen. It is something. (3rd formula) In this embodiment, Co may be either Co (II) or Co (III). Structures represented by Formulas 4 and 5 are also preferred. (Formula 4) (Equation 5) In a preferred embodiment, the cobalt compound has a group that changes the oxidation-reduction potential, oxidation stability, or the ability of the compound to exchange an axial ligand (axial ligand). For example, many Co (II) complexes of the present invention are sensitive to air oxidation. That is, these complexes are oxidized in the presence of oxygen in the air. Therefore, these Co (II) complexes are preferably synthesized and used in the absence of air. Further, from the above, the Co complex may be further modified so as to be stable in the air. For example, when the R group of the methyl of the complex of the present invention is substituted with a trifluoromethyl group, the oxidation potential of the metal is changed to obtain a metal complex that is stable against air oxidation, such as glutathione in vivo. It can be adjusted by reducing in a specific environment. The resulting Co (II) compound then reacts with the reactive axial ligand of the enzyme to deactivate the enzyme as described above. Thus, a Co (II) compound is formed directly. That is, when a Co (III) compound is added to an enzyme, it is reduced to a Co (II) compound, which inhibits the enzyme. In this embodiment, the Co (III) compound may be inactive for the target enzyme of interest in a given oxidation state, but deactivates the target enzyme in a second oxidation state. Because of this mechanism, even if an inactive form of the cobalt compound is added as it is in vivo or in vitro, it becomes a Co (II) compound that is active under a specific reducing environment. The compounds of the present invention may be formulated into pharmaceutical compositions in therapeutically effective amounts. Here, “therapeutically effective amount” means an amount at which the administered effect is produced. The exact amount depends on the condition to be treated and the protein to be inhibited, and can be ascertained by those skilled in the art by known methods. It is a preferred embodiment to make the pharmaceutical composition of the present invention water-soluble and to include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the cobalt compound. The pharmaceutical composition can be administered in various forms. Examples include, but are not limited to, oral, subcutaneous injection, intravenous injection, peritoneal administration, topical administration, and the like. A method for inhibiting a specific protein or enzyme by the cobalt compound of the present invention is also provided. That is, the target protein is inhibited by contacting or exposing it to a cobalt compound. This cobalt compound preferably has a structure as shown in the first formula. This cobalt compound makes it possible to target a specific protein by adding a target molecule. Also provided is a method of inhibiting a zinc finger protein by contacting the zinc finger protein with a cobalt compound. Here, “inhibition of zinc finger protein” means that the biological activity of zinc finger protein is reduced or eliminated by contact with a cobalt compound. In general, if the zinc finger protein is a nucleic acid associated with the protein, this means that the zinc finger no longer binds to the nucleic acid to a significant extent. Conventionally, various Co (III) compounds have been known. These compounds represented by the following formula (6) are effective in inactivating zinc finger proteins, similarly to the compounds represented by the formula (1). Thus, when Co is Co (III), at least one of R ₁ to R ₈ need not be, but is preferably, a target molecule such as a polypeptide or nucleic acid. Similarly, when Co is Co (II), at least one of the R groups does not need to be a hydrophilic group, but is preferably. (Equation 6) In the Equation 7, R _A and R _F is may be the same or different, each a substituted of alkyl group, a phenyl group or a phenyl group. R _B and R _E may be the same or different and are each hydrogen, an unbranched alkyl group, halogen, or a group having the following structure. Here, R _G is hydrogen, an alkoxide group, an alkyl group or OH, and R _C and R _D may be the same or different, and are each a hydrogen or an alkyl group. The following examples are provided to further illustrate the invention described above and illustrate various uses of the invention. However, these examples are provided to illustrate the present invention and do not limit the present invention in any way. The references cited here are used for reference.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 // Ｃ０７Ｆ 15/06 Ｃ０７Ｆ 15/06 (72)発明者タケウチ、トシヒコアメリカ合衆国、カルフォルニア州 94111、サン・フランシスコ、ページ・ストリート 1279 (72)発明者グレイ、ハリー・ビーアメリカ合衆国、カルフォルニア州 91106、パサデナ、イースト・カルフォルニア・ブルヴァード 1415イー (72)発明者サイモン、メルヴィンアメリカ合衆国、カルフォルニア州 91108、サン・マリノ、オールド・ミル・ロード 1075 (72)発明者リューイ、アンジェリーク・ワイアメリカ合衆国、カルフォルニア州 91106、パサデナ、マグノリア＃６、808────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 9/99 C12N 9/99 // C07F 15/06 C07F 15/06 (72) Inventor Takeuchi, Toshihiko United States of America San Francisco, California, 94111, Page Street 1279 (72) Inventor Gray, Harry Bee United States of America, 91106, California, Pasadena, East California Boulevard 1415 e (72) Inventor Simon, Melvin United States of America, Old Mill Road, San Marino, California, 10810, 1075 (72) Inventor Louie, Angelique W. Magnolia # 6, 106106, Pasadena, California, United States of America. 808

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の構造式を持つ化合物：ここで、ＣｏはＣｏ(II)もしくはＣｏ(III)、Ｒ₁は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₂は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₃は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₄は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₅は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₆は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₇は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、そしてＲ₈は水素、アルキル、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子であり、ＣｏがＣｏ(III)である場合、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つは標的分子であり、ＣｏがＣｏ(II)である場合、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つは、この化合物が水溶液に溶解できるようにする親水性基である。２．ＣｏがＣｏ(II)である、請求の範囲第１項に記載の化合物。３．Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つが標的分子である、請求の範囲第２項に記載の化合物。４．Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈の少なくとも一つがポリペプチドもしくは核酸である、請求の範囲第２項に記載の化合物。５．ＣｏがＣｏ(III)である、請求の範囲第１項に記載の化合物。６．Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄のそれぞれが水素、アルキルもしくはアリールである、請求の範囲第１項に記載の化合物。７．さらに第１の軸配位子を有している請求の範囲第１項に記載の化合物。８．タンパク質とそれに接続している化合物からなるタンパク質−コバルト化合物錯体であって、前記コバルト化合物が請求の範囲第１項で示した構造を有する錯体。９．タンパク質が酵素である、請求の範囲第８項に記載の錯体。１０．選択したタンパク質を阻害する方法であって、前記選択したタンパク質を請求の範囲第１項の化合物に接触させることを特徴とする方法。１１．前記タンパク質が酵素である、請求項１０に記載の方法。１２．ジンクフィンガー・タンパク質を阻害する方法であって、前記ジンクフィンガー・タンパク質を下記の構造を有する化合物に接触させることを特徴とする方法：ここで、ＣｏはＣｏ(II)もしくはＣｏ(III)、Ｒ₁は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₂は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₃は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₄は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₅は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₆は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、Ｒ₇は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子、そしてＲ₈は水素、アルキル、アリール、疎水性有機酸、アルキルアミン、アミン、アルキルアルコール、アルコール、もしくは標的分子である。１３．Ｒ₁が、Ｎ−ヒドロキシプロピル、Ｒ₂が水素、Ｒ₃がメチル、Ｒ₄がメチル、Ｒ₅が水素、Ｒ₆がメチルで、Ｒ₁₀とＲ₁₁とが水素である、請求の範囲第１項に従う組成物。１４．水溶性の四座配位シッフ塩基のＣｏ⁺²錯体を含む組成物。１５．請求の範囲第１項に記載の化合物がさらに第一の軸配位子を有している、請求の範囲第１項に従う組成物。[Claims] 1. Compounds having the following structural formula: Where Co is Co (II) or Co (III), R ₁ is hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acid, alkylamine, amine, alkyl alcohol, alcohol or target molecule, R ₂ is hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acids, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule,, R ₃ is hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule,, R ₄ is hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acids, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule,, R ₅ is hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule,, R ₆ is hydrogen, Alkyl, hydrophobic organic acid, alkylamine, amine, alkyl alcohol , Alcohols or target molecule,, R ₇ is hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule, and R _8, are hydrogen, alkyl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine , An alkyl alcohol, an alcohol, or a target molecule, wherein when Co is Co (III), at least one of R ₁ , R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ and R ₈ is When the target molecule is Co and Co is Co (II), at least one of R ₁ , R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ and R ₈ is a compound in which the compound is dissolved in an aqueous solution. A hydrophilic group that enables 2. The compound according to claim 1, wherein Co is Co (II). 3. R _1, R _2, at least one of _{_{_{R 3, R 4, R 5}}} , R 6, R 7 and R ₈ are the target molecule, a compound according to claim 2. 4. _{_{_{R 1, R 2, R 3}}} , R 4, R 5, at least one of R _6, R ₇ and R ₈ are polypeptides or nucleic acid compound according to claim 2. 5. 2. The compound according to claim 1, wherein Co is Co (III). 6. The compound according to claim 1, wherein each of R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ is hydrogen, alkyl or aryl. 7. 2. The compound according to claim 1, further comprising a first axial ligand. 8. A protein-cobalt compound complex comprising a protein and a compound connected to the protein, wherein the cobalt compound has a structure shown in claim 1. 9. 9. The complex according to claim 8, wherein the protein is an enzyme. 10. A method for inhibiting a selected protein, the method comprising contacting the selected protein with the compound of claim 1. 11. 11. The method according to claim 10, wherein said protein is an enzyme. 12. A method of inhibiting a zinc finger protein, comprising contacting the zinc finger protein with a compound having the structure: Where Co is Co (II) or Co (III), R ₁ is hydrogen, alkyl, aryl, hydrophobic organic acid, alkylamine, amine, alkyl alcohol, alcohol, or target molecule, R ₂ is hydrogen, alkyl, Aryl, hydrophobic organic acid, alkylamine, amine, alkyl alcohol, alcohol, or target molecule, R ₃ is hydrogen, alkyl, aryl, hydrophobic organic acid, alkylamine, amine, alkyl alcohol, alcohol, or target molecule, R ₄ is hydrogen, alkyl, aryl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule,, R ₅ is hydrogen, alkyl, aryl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, alcohol or target molecule, R ₆ is hydrogen, alkyl, A Lumpur, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule, R ₇ is hydrogen, alkyl, aryl, hydrophobic organic acid, alkyl amines, amine, alkyl alcohol, or a target molecule, And R ₈ is hydrogen, alkyl, aryl, a hydrophobic organic acid, an alkylamine, an amine, an alkyl alcohol, an alcohol, or a target molecule. 13. R ₁ is N-hydroxypropyl, R ₂ is hydrogen, R ₃ is methyl, R ₄ is methyl, R ₅ is hydrogen, R ₆ is methyl, and R ₁₀ and R ₁₁ are hydrogen. A composition according to claim 1. 14． A composition comprising a water soluble tetradentate Schiff base Co ⁺² complex. 15. A composition according to claim 1, wherein the compound according to claim 1 further has a first axial ligand.