JP2001503011A - ペプチドと、その合成方法と、それをベースにした医薬品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 下記配列(I)で表されるペプチド：X-Tyr-Y-Phe-Z-A I（ここで、 AはOHまたは置換基を有するアミド(Ｃ₁-Ｃ₃)である）。上記配列(I)で表されるペプチドはアミノ酸ＺのＣ末端部分より開始してペプチド酸を除々に成長させる方法で得られる。Ｃ末端部分は置換基を有するアミドか保護されたカルボキシル基であり、これにN-保護されたアノ酸を混合無水物法または活性エーテル法によって結合させ、次いでN-保護された基を取り除き、さらにN-保護されたアミノ酸を添加してテトラまたはペンタペプチドを生成させ、これをパラジウム触媒の存在下でブロック解除して目的物質を単離する。このペプチドとそれをベースとする組成物はアヘン類似特性を顕著に示す医薬として使用され、体重増加を促すと供に成長領域の活性および体毛を含む表皮層の発達を促進させる同化作用促進特性を有する。このペプチドの生物刺激特性は創傷の治癒および修復プロセスにおいても明らかである。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドと、その合成方法と、それをベースにした医薬品 研究の分野および範囲 本発明は化学、医学、獣医学の分野へ適用でき、さらに生物学的に活性なペプ チドの分野にも関連する。本発明はさらに、新規なペプチド含有医薬組成物とこ のペプチドを誘導し、合成する方法にも関するものである。 本発明の新規化合物は広範囲の生物活性で利用でき、生きた組織の体重増加、 上皮腺の成長活性の刺激、体毛の成長、創傷や瘢痕の治癒および同化作用活性速 度の向上といった生物プロセスに影響を与え、さらに鎮痛活性を有している。 従来の科学的研究 若い生物および成熟した生物での全ての代謝プロセスにホルモンか係わってい ることは周知である。 その機能は自らかホルモン活性特性を有するペプチドによっても行われ、ペプ チドはさらに別のホルモンを調節する機能も有し、この別のホルモンが他の生物 の機能を制御する。 このような天然の組み合わせは極めて限られており、そのため、世界中の研究 機関の多くはより高レベルの活性を有するペプチドと、それらペプチドの天然の 対応物の合成・単離方法とを開発してきた（欧州特許第0136720号，1984年、欧 州特許第0137904号，1984年）。 さらに、生物体内には見られない独特な特性を有する新規なペプチドも合成さ れた。こうしたペプチドの中に成長に関与す るホルモンを制御する特別なペプチド群が存在する。そうしたペプチドの１つは 血中の成長ホルモン含有率のレベルを増加させ（ＰＣＴ 89/07111号，1989年： ＰＣＴ 91/16923号，1991年）、他のペプチドは血中の成長ホルモン含有率のレ ベルを低下させる（フランス国特許第2235701号，1978年；フランス国第2532308 号，1982年）。 最近、人間の表皮層の成長レベルを向上させるペプチド（ＰＣＴ 90/13570号 ，1990年）と、恒温動物の体毛成長を刺激するメタロペプチド（ＰＣＴ 91/074 31号，1991年）が合成された。動物の体毛を脱落させる別の種類のペプチドも合 成されている（フランス国特許第2487677号，1982年）。 ペプチドから各種の組成物や組み合わせを造り出すことによって各種の代謝プ ロセスを制御できることが明らかになっている。しかし、特定の目的に向けた組 み合わせおよび化合物を造り出すことがより望ましい。 米国特許第4680283号（1987年）に記載のような多機能活性を有するペプチド の数は現時点では少ない。この特許に記載の合成ペプチドは広範囲で有効な活性 を示す。このペプチドは生物刺激物質(biostimulator)であることが分かってお り、その使用および投与中にこのペプチドがモルヒネ類似の麻酔効果を示すこと が観察されている。 アヘンに類似の効果を有するこの合成ペプチドは熱心に研究されているが、残 念なことに、このようなモルヒネ効果を有する組み合わせは自然界では稀れであ り、複製と合成は非常に困難である（米国特許第4042682号，1977年）。こうし た状況が刺激になって合成品の組み合わせが発達してきた（米国特許第4681871 号，1987年；欧州特許第0112036号，1983年；欧州特 許第0221019号，1986年）。 近年、アヘンに類する効果を備えた多くのペプチドが、脳虚血症の臨床治療（ ドイツ国特許第3447720号，1985年；米国特許第4684624号，1987年）、妊娠中の 女性の痛みの緩和（欧州特許第0099173号，1984年）および従来治療と組み合わ せた場合に特に有効な鎮痛化合物（欧州特許第096592号，1983年；欧州特許第99 286号，1984年；米国特許第4123523号，1978年）として広く用いられるようにな っている。 一方、現在公知の合成ペプチドの組み合わせは、より有効になるために必要な 特性を備えていないため、現代医学の全ての要求に十分答えられるものではなく 、所望の効果を得るためには、これらのペプチドを多量に投与する必要があり、 好ましくない副作用の危険も増大する。 本発明の発見 本発明のペプチドは実験および医療目的用に提供される。本発明のペプチドと その全ての組成物はアヘン類似物質として類似の目的に使用することかでき、体 重増加、成長効果および皮膚や体毛の成長を促す目的で同化作用促進特性をする 物質として使用できる。本発明のペプチドの生物刺激特性は修復プロセスおよび 創傷の治癒にも適している。 本発明ペプチドの単離には最近の効果的なペプチド合成方法を用いる。こうし た最近の方法を用いることによって最小限の材料で、少ない操作段階で、多量の 最終生成物を得ることができる。 本発明ペプチドの配列を下記に示す。配列NO.１ X-Tyr-Y-Phe-Z-A （ここで、AはOHまたは置換基を有するアミド(Ｃ₁-Ｃ₃)であり、 Argはアルギニン、Ornはオルニチン、Lysはリジン、Harはホモアルギニン、Cy tはシトルリン、Alaはアラニン、Valはバリン、Leuはロイシン、Lleはイソロイ シン、Pheはフェニルアラニン、Asnはアスパラギン、Trpはトリプトファン、 Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、Tyrはチロシン、Hypはヒドロ キシプロリン、Cysはシステイン、Cys-Cysはシスタイル−シスチン、Metはメチ オニン、Hisはヒスチジン、Aspはアスパラギン酸、Gluはグルタミン酸、Glyはグ リシン、Glnはグルタミンである） 配列NO.１のペプチドの誘導はアミノ酸ＺのＣ末端部分より開始してペプチド 酸を除々に成長させる方法で行う。Ｃ末端部分は置換基を有するアミドか保護さ れたカルボキシル基で、これにN-保護されたフェニルアラニンを混合無水物法ま たは活性エーテル法で結合させ、次いでN-保護された基を取り除き、さらに活性 エーテルまたは混合無水物を添加した後にN-保護されたアミノ酸を添加し、N-保 護された基を取り除き、さらにN-保護されたアミノ酸を添加する。ペプチド鎖の 合成の終了後にテトラまたはペンタペプチドを放出させて、パラジウム触媒を用 いて水素化して最終生成物を得る。 最終生成物のペプチドは黄色または灰色かかった白色粉末の状態で提供され、 この粉末は水溶性でアルコールにはあまり溶けず、クロロホルムには全く溶けな い。 表１はブタノール、酢酸および水の3:1:1混合物に溶解した配列NO.１のペプチ ドの物理化学的性質を「Ｒ_fB」で、クロロホルム、メタノール、32％酢酸の60:4 5:20混合物に溶解した配列NO.１ペプチドの物理化学的性質を「Ｒ_fA」で表し、 さらに（α）²⁰ｄも示してある。 表１の続き この新たに発見されたペプチドは生物学的活性を有する成分として医薬品の調 製で使用することができる。そのような医薬組成物は有効量のペプチドと、生物 学活性を有する成分と併せて使用可能な担体とを含む。 この組成物は経口および非経口投与と、注射用の形に配合することができる。 組成物中のペプチド含有量は一般に0.001〜0.1％（好ましくは0.001〜0.01％ ）である。ペプチドの量はそれが液体または固体のいずれの状態で使用されるか によって変化する。ペプチドを含む医薬組成物を得るためには、ペプチドを40〜 70℃の温度で担体と混合する必要がある。混合物は溶液の状態で温度70℃では24 時間、温度20℃では３年間安定である。 注射薬としては蒸留水、生理溶液および緩衝溶液を含む任意の製剤用溶媒が使 用できる。ペプチドと溶媒と比率は0.001％〜0.01％にすることができる。 注射用溶液を調製するために用いられる方法は伝統的な重量測定体積方法(wei gh volume method)である。予め計量された所定量のペプチド粉末に対して適切 な量の溶媒を添加し、所望の注射用混合物を製造する。その後、混合物を滅菌濾 過システムを用いて濾過し、試験管またはアンプルに分配する。得られる混合物 は化学物質または他の添加物を全く含有しない透明な液体であり、安定である。 経口投与用の固体ペプチドはタブレット、粉末またはカプセル型にすることが でき、それをベースとした他の活性成分、例えば着色剤および香料を添加するこ ともできる。ペプチドと添加物との比率は混合物の目的に応じて0.001％〜0.01 ％にすることができる。 新規ペプチドの生物学的機能の研究の結果、この新規ペプチドは広範囲の活性 で使用できることが分かった。 研究の結果、この新規ペプチドは毒性を持たないことも判明している。このペ プチドの毒性レベルＬＤ₅₀を測定するために24匹の白ネズミ（体重はそれぞれ18 ｇ）を用い、実験中は全てのネズミを同じ条件で同じ餌を与えて飼育した。全て の試験群において、ネズミは50％がオスで50％がメスである。 試験の24時間前から試験終了まで、ネズミは温度一定で換気を行った飼育箱に 入れて飼育した。試験開始２時間前に餌および水の供給を停止した。ネズミは各 ６匹ずつの４つのグループに分けた。第１〜第３群のネズミには、0.2mlのペプ チド／水混合物（投与量はそれぞれ800、1100および1400mg／kg）を腹腔注射し た。４番目のグループである対照群には同量の生理溶液を注射した。試験の次の 段階として七日間（昼夜に渡って）ネズミを観察し、その間ＬＤ₅₀の値を計算し た。試験期間中、被験動物の挙動および状況にはなんら変化は見られず、ペプチ ド注射に伴う病的症状は全く見られなかった。試験期間中死亡した動物はなく、 動物の体重は全て正常に増加した。器官の重量は全て正常な範囲内であった。 試験の結果、上記の量でペプチドを投与した場合、動物に対する害はなく、さ らに毒性も検出されないことが分かった。 次に、下記ペプチド配列の好ましい誘導化方法の例を示す： H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH A）BOC-Phe-Gly-oBzlの合成 10.7ｇ(40mmol)のBoc-Phe-OHと4.8ml（40.1mmol）のN-メチルモルホリンとを5 0mlのジメチルホルムアミドに溶解して調製した溶液を−15℃に冷却し、この溶 液に、攪拌しながら、5.6 ｇ（40.1mmol）のイソブチリンクロロホルメートを添加する。２分後、グリシン のP-トルエンスルホネートベンジルエステルを50mlのジメチルホルムアミドに溶 解して調製した溶液（氷冷したもの）を上記冷却混合物に添加する。反応混合物 を−15℃で30分間攪拌し、続いて室温で２時間攪拌する。減圧下、ジメチルホル ムアミドを留去する。残留物に100mlの酢酸エチルを添加し、混合物を２％硫酸 溶液50mlで２回洗浄後、重炭酸ナトリウムの飽和溶液80mlで２回洗浄し、中性の 反応を示すまで水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。 次いで、酢酸エチル層を減圧蒸留する。酢酸エチル中、エーテルおよびヘキサ ンを添加して残留物を再結晶する。 収量 16.4ｇ（98.2％） 融点 135.2℃ Ｒ_f＝0.71（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール3:6:1） Ｒ_f＝0.62（酊酸エチル／ヘキサン1:1） B）BOC-D-Ala-Phe-Gly-oBzlの合成 トリフルオロ酢酸50％クロロホルム溶液80mlに16.4ｇ(39.8mmol)のBOD-Phe-Gl y-oBzlを溶解する。一時間後、減圧下に溶媒を留去して油状の固体を得る。この 残留物に150mlのジエチルエーテルを加えて再結晶する。残留物を濾過し、エー テルで洗浄および乾燥させる。 収量：16.2g（99.8％） MP TFA H-Phe-Gly-oBzl＝135℃ Ｒ_f＝0.34（クロロホルム／メタノール＝9:1） 7.5ｇ(39.7mmol)のBOC-D-Ala-OHと4.6mg（40.0mmol）のN−メチルモルホリン とを5０mlのジメチルホルムアミドに添加した 混合物を−15℃に冷却し、溶液を攪拌しながら5.6ｇ(40.3mmol)のイソブチルク ロロホルメートを添加する。２分後16.2ｇ(40.4mmol)のH-Phe-Gly-oBzlトリフル オロアセテートと4.6ml(40.0mmol)のN-メチルモルホリンとを50mlのジメチルホ ルムアミドに添加した混合物を上記の混合物に添加する。反応混合物を−30℃で 30分間攪拌し、続いて室温で２時間攪拌する。減圧下、ジメチルホルムアミドを 留去し、残留物に100mlの酢酸エチルを添加し、２％硫酸溶液で２回洗浄し（各5 0mg）、重炭酸ナトリウムを大量に含む溶液で２回洗浄し（各80mg）、中性の反 応を示すまで水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、次いで酢酸エチル層 を減圧蒸留し、残留物をエーテルから再結晶する。 収量 14.5g（75.9％） 融点 140℃ Ｒ_f＝0.79（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール6:3:1） Ｒ_f＝0.55（クロロホルム／メタノール9:1） C）BOC-Try-(BOC)-D-Ala-Phe-Gly-oBzlの合成 トリフルオロ酢酸50％クロロホルム溶液80mlに14.4ｇ(29.8nmol)のBOD-D-Ala- Phe-Gly-oBzlを溶解する。一時間後、溶媒を留去して油状物質を得る。この残留 物を50mlのジメチルホルムアミドに溶解し、この溶液に3.4mg（29.8mmol）のN- メチルモルホリンを添加する。11.4ｇ(30.0mmol)のBOC-Tyr-(BOC)-OH-と3.45ml （30.0mmol）のN-メチルモルホリンとを50mlのジメチルホルムアミドに添加した 混合物を−15℃に冷却し、攪拌しながら4.27ｇ（30.3mmol）のイソブチルクロロ ホルメートを添加する。２分後、この混合物に14.3ｇ（mmol）のベンジルエーテ ルトリペプチド：H-D-Ala-Phe-Gly-oBzlを添加する。反応混合物を−15℃で30分 間攪拌し、続いて室温で２時間攪拌する。減圧下、ジメチルホルムアミドを留去 し、残留物に100mlの酢酸エチルを添加し、２％硫酸溶液で２回洗浄し（各50ml ）、重炭酸ナトリウムを大量に含む溶液で２回洗浄し（各80ml）、中性の反応を 示すまで水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥する。続いて、酢酸エチ ル層を減圧蒸留し、残留物を再結晶する。 収量 18.5g（83.4％） 融点 133.5℃ Ｒ_f＝0.62（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール6:3:1） Ｒ_f＝0.57（クロロホルム／メタノール9:1） D）BOC-Arg(NO2)-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oBzlの合成 トリフルオロ酢酸50％クロロホルム溶液80mlに9.8ｇ（13.1mmol)のBOC-Tyr-(B OC)-D-Ala-Phe-Gly-oBzlを溶解する。一時間後、溶媒を留去して油状物質を得る 。残留物をエーテルから再結晶する。 収量 9.68ｇ（100％） 9.6ｇ（13.0mmol）のTFA-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oBzlを150mlのジメチルホルムア ミドに溶解し、この溶液に1.5ml(13.0mmol)のN-メチルモルホリン、5.2ｇ(14.6m mol)のBOC-Arg(NO2)-OH-1/2TFH、1.97ｇ(14.6mmol)のオキシベンゾトリアゾール を添加する。反応混合物に3.0ｇ(14.0mmol)のジシクロペキシルカルボジイミド を添加しながら攪拌下に−10℃まで冷却する。その後、混合物を室温で72時間攪 拌する。ジシクロペキシルウレアを濾過し、溶媒を減圧留去して、残留物に100m lの酢酸エ チルを添加し、２％硫酸溶液で２回洗浄し（各50ml）、重炭酸ナトリウムの混合 物80mlで２回洗浄し、中性の反応を示すまで水でリンスし、無水硫酸ナトリウム を用いて乾燥する。 酢酸エチル層を減圧蒸留する。残留物を再結晶する。 収量 9.6ｇ（87.2％） 融点 176.7℃ Ｒ_f＝0.70(クロロホルム／酢酸エチル／メタノール／酢酸 6:3:1:0.5） Ｒ_f＝0.23（クロロホルム／メタノール９：１） E）H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OHの合成 9.6ｇ(13.6mmol)のBOC-Arg(NO2)-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oBzlを60mlのギ酸に溶解 する。1.0ｇのパラジウム触媒を用いて水素添加を６時間行う。触媒を濾過し、1 00mlの水を添加しながらギ酸を減圧留去し、残留物をジエチルエーテルに添加す る。残留物を濾過し、エーテルで洗浄後に乾燥する。 収量 6.9ｇ（100％） Ｒ_f＝0.44（ブタノール／酢酸／水3:1:1） ペプチドの精製は吸着剤セファデックス(Sephadex G-25)を充填したカラムと 、0.1Ｍ〜1.0Ｍのピリジンアセテート濃度勾配を設けた緩衝液とを用いて行うイ オン交換クロマトグラフィーで行った。 物理化学調査の結果、ペプチドH-Arg-Tyr-D-A1a-Phe-G1y-OHの分子量は612.6 で、直鎖構造を有し、外観は黄色がかった白色粉末で、水に溶解し、アルコール にはあまり溶解せず、クロロホルムには全く溶解しない。 250〜300mmのＵＶスペクトルは275+/-mm、282+/-mmに肩部を有し、0.1％水溶 液のpHは5.0〜0.７である。実施例２ この実施例は、H-Arg-Tyr-D-0rn-Phe-D-Ala-OHで表されるペプチドの合成方法 の概略を説明するものである。 a）Z-Phe-D-Ala-OHの合成 9.68ｇ(20.0mmol)のZ-Phe-OPfpを20mlのテトラヒドロフランに溶解し、2.3ｇ( 25.6mmol)のH-D-Ala-OHをpH8.5の水５mlに溶解して成る溶液を添加する。反応混 合物を室温で24時間攪拌する。溶媒を減圧下に留去し、70mlの酢酸エチルを添加 し、さらに２％硫酸70mlを添加してpH＝２〜３とする。70mlの酢酸エチルを用い て２回、ペプチドの抽出を行い、中性の反応が得られるまで飽和塩化ナトリウム 溶液を用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。その後減圧下に溶媒を留 去し、オイル状の生成物を得る。最終生成物をエーテルとヘキサンから再結晶す る。 収量 7.6ｇ（97.7％） Ｒ_f＝0.40（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール／酢酸 ＝6:3:1:0.1） Ｒ_f＝0.53（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/16/1） Ｒ_f＝0.58（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/9/1） 融点＝153-154℃ （α）²⁰＋/-3.2（Ｃ＝１MeOH）。 b）BOC-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OHの合成 6.5ｇ(18.0mmol)のZ-Phe-D-Ala-OHを15mlのメタノールおよ び２mlのギ酸に溶解する。0.2ｇのパラジウム触媒を添加して３時間水素を吹き 込む。触媒を濾過し、減圧下で溶媒を留去する。残留物にエーテルを添加する。 残留物を濾過し、エーテルで洗浄して乾燥する。 収量 H-Phe-D-Ala-OH：4.3ｇ（98.1％） Ｒ_f＝0.01（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール／酢酸 ＝6:3:1:0.1） Ｒ_f＝0.45（酢酸／クロロホルム／メタノール＝1/3/2） 8.0ｇ(15.0mmol)のBoc-D-Orn(Z)-OPfpペンタフルオフェニルエステルを15mlの ジオキサンに溶解し、混合しながら、4.3ｇ(17.7mmol)のH-Phe-D-Ala-OHをpH8.5 の水に溶解して成る溶液を添加する。反応混合物を室温で24時間攪拌する。溶媒 を減圧下に留去し、（a）と同様の方法で処理する。生成する混合物を酢酸エチ ル、エーテルおよびヘキサンから再結晶する。 収量 6.92ｇ（74.4％） Ｒ_f＝0.44（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/16/1） Ｒ_f＝0.32（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール＝6/3/1） 融点＝145℃ c）BOC-Tyr-(Bxl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OHの合成 3.3ｇ(5.6mmol)のBOC-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OHをトリフルオロ酢酸の50％クロ ロホルム溶液10mlに溶解する。一時間後溶媒を減圧留去し、残留物にエーテルを 添加する。生成物を濾過し、エーテルで洗浄して乾燥する。 収量 3.0ｇ（100％） 3.0ｇ(5.4mmol)のB0C-Tyr(Bzl)-OPfpを10mlのジメチルホルムアミドに溶解す る。3.0ｇ(5.8mmol)のTHA-H-D-Orn(Z) -Phe-D-Ala-OHおよび0.25ml(5.7mmol)のジエチルイソプロピルアミンを添加する 。 反応混合物を室温で24時間攪拌する。24時間後、溶媒を減圧留去し、70mlの酢 酸エチルと70mlの２％硫酸溶液（pH＝２〜３）とを添加する。70mlの酢酸エチル を用いてペプチドを抽出し、中性の反応が得られるまで飽和塩化ナトリウム溶液 を用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。その後、減圧下に溶媒を留 去し、オイル状の物質を得る。続いて残留物を酢酸エチルとエーテルから再結晶 する。 収量 4.1ｇ（82.0％） Ｒ_f＝0.47（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/16/1） Ｒ_f＝0.35（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/16/1） d）Z3-Arg-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OHの合成 0.9ｇ(1.1mmol)のBOC-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OHをトリフルオロ酢酸の 50％クロロホルム溶液５mlに溶解する。一時間後溶媒を減圧留去し、残留物にエ ーテルを添加する。残留物を濾過し、エーテルで洗浄して乾燥する。 収量 0.8ｇ（100％） 0.65ｇ(1.1mmol)のZ3-Arg-OPfpを、５mlのジオキサンおよび1.57mlのジメチル ホルムアミドに溶解し、0.８ｇ(1.0 mmol)のTFA-H-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Al a-OHおよび0.12ml(1.0mmol）のジエチルイソプロピルアミンを添加する。 反応混合物を室温で24時間攪拌する。その後溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを 加え、残渣を濾過する。残留物を酢酸エチルで再結晶する。 収量 1.88g（92.0％） Ｒ_f＝0.51（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/16/1） Ｒ_f＝0.34（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール／酢酸 ＝653/l/0.1） Ｒ_f＝0.53（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/9/1） 融点138-143℃ e）H-Arg-Tyr-D-Orn-Phe-D-Ala-OHの合成。 0.5ｇ(0.39mmol)のZ3-Arg-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ara-OHを３mlの酢酸およ び２mmのギ酸に溶解し、0.62ｇの炭化パラジウムを添加して、３時間水素を吹き 込む。その後触媒を濾過し、減圧下に溶媒を留去する。 得られた化合物を水に溶解し、シラソルブ（Silasorb C-18）（10mkm）を吸着 剤として充填した1.6×25cmカラムと、アセトニトリル／0.01Ｍトリエチルアミ ンアンモニアセテート(pH＝6.0)の混合溶媒とを用いた逆相クロマトグラフィー によって上記生成物を精製した。 収量 0.20ｇ（80.8％）実施例３ この実施例では、H-Arg-Tyr-D-Orn-Arg-D-Ala-OHで表されるペプチドの合成方 法の概略を説明する。 0.9ｇ(0.14mmol)のH-Arg-Tyr-D-Orn-Phe-D-Ala-OHグアニジルを１Ｎ水酸化ナ トリウム溶液５mlに溶解する。反応混合物を室温で７日間（昼夜）攪拌し、シラ ソルブ(Silasorb C-8)(10mkm)を吸着剤として充填した1.6×25cmカラムを用いて アセトニトリルに0.05％トリフルオロ酢酸の濃度勾配を設けた逆相液体クロマト グラフィーによって上記反応混合物を精製した。 収量 0.087ｇ（76.9％）実施例４ この実施例では、H-Tyr-D-Orn-Phe-D-Glu-聞で表されるペプチドの合成方法の 概略を説明する。 a）BOC-Phe-D-Glu(oBzl)2の調製 14.7ｇ(10.0mmol)のH-D-Glu-OHを54mlのベンジルアルコールに溶解し、17.2ｇ (10.0mmol)のP-トルエンスルホン酸を添加する。その後、これをDino-Stark装置 で12時間70〜80℃に加熱する。その間同じ速度で起こる水の除去に対する置換分 としてベンゾールを添加する。その後、混合物をメタノールを用いて結晶化させ 、イソプロパンを用いて再結晶する。 収量 Tos-H-D-Glu(oBzl)2;25.96ｇ（80.0％） 融点 116℃ 2.2ｇ(5.1mmol)のBOC-Phe-OPfpを５mlのジオキサンに溶解し、攪拌しながら、 1.9ｇ(5.2mmol)のTos-H-D-Glu(OBzI)2と0.5ml（5.2mmol）のトリエチルアミンと を５mlの塩化メチレンおよび５mlのジオキサンに添加してなる溶液を添加する。 反応混合物を室温で24時間攪拌する。その後、減圧下に溶媒を留去し、オイルを 100mlの酢酸エチルに溶解し、２％の硫酸溶液100mlを用いて２回洗浄し、さらに ５％の重炭酸ナトリウム溶液100mlを用いて２回洗浄する。その後、中性の反応 が得られるまで混合物を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥する。減 圧下に酢酸エチルを留去し、残留物をヘキサンを用いて結晶化する。 収量 3.2ｇ（98.5％） Ｒ_f＝0.81（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール＝6/3/1） Ｒ_f＝0.78（酢酸／クロロホルム／メタノール／＝0.5/16/1 融点 162℃ b）BOC-D-Orn(Z)-Phe-D-G1u(OBzl)2の合成 2.1ｇ(3.7mmol)のBOC-Phe-D-Glu(OBzl)2を、トリフルオロ酢酸の50％クロロホ ルム溶液20mlに溶解する。一時間後、溶媒を減圧留去し、油状の残留物を10mlの テトラヒドロフランに溶解し、0.47mlのジエチルイソプロピルアミンおよび2.0 ｇ(3.8mmol）のBOC-D-Orn(Z)-OPfpを添加する。反応混合物を室温で24時間攪拌 する。その後、溶媒を減圧留去し、次いでオイルを100mlの酢酸エチルに溶解す る。２％の硫酸溶液を100mlずつ用いて２回洗浄し、５％の重炭酸ナトリウムを1 00mlずつ用いて２回洗浄する。中性の反応が得られるまで水で洗浄し、無水硫酸 ナトリウムを用いて乾燥する。続いて減圧下に酢酸エチルを留去し、酢酸エチル とヘキサンとを用いて残留物を再結晶する。 収量 3.0ｇ（88.2％） Ｒ_f＝0.88（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール＝6:3:1） Ｒ_f＝0.85（酢酸エチル／クロロホルム／メタノール ＝0.5/9/1） 融点 156℃ c）BOC-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2の合成 0.91ｇ(1.1mmol)のBOC-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2をトリフルオロ酢酸の50％ クロロホルム溶液10mlに溶解する。一時間後、溶媒を減圧留去し、油状の残留物 を15mlのジオキサンに溶解し、0.10ml（1.0mmol）のジエチルイソプロピルアミ ンおよ び0.54ｇ(1.0mmol)のBOC-Tyr(Bzl)-OPfpを添加する。反応混合物を室温で24時間 攪拌する。その後、溶媒を減圧留去し、次いでオイルを100mlの酢酸エチルに溶 解する。２％の硫酸溶液を100mlずつ用いて２回洗浄し、５％の重炭酸ナトリウ ム溶液を100mlずつ用いて２回洗浄する。中性の反応が得られるまで水で洗浄し 、無水硫酸ナトリウムを用いて脱水する。続いて減圧下に酢酸エチルを留去し、 酢酸エチルとエーテルとを用いて残留物を再結晶する。 収量 1.1ｇ（93.2％） Ｒ_f＝0.89（クロロホルム／酢酸エチル／メタノール＝6:3:1） Ｒ_f＝0.83（酢酸／クロロホルム／メタノール＝0.5/16:1） 融点 158-160℃ e）H-Tyr-Orn-Phe-D-G1u-OHの合成 0.16g(0.15mmol)のBOC-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2を２mlのメタノ ールに溶解し、２mlのギ酸と0.2ｇのパラジウムカーボンを加え、４時間水素を 吹き込む。その後触媒を濾過し、減圧下に溶媒を留去する。続いてオイルを、ト リフルオロ酢酸の70％水溶液５mlに溶解する。一時間後、減圧下に溶媒を留去す る。残留物を最小量のメタノールに溶解し、水で希釈して、吸着剤シラソルブ(S ilasorb C-8)(10mkm)を充填した1.6×25cmカラムを用いてアセトニトリルに0.05 ％トリフルオロ酢酸の濃度勾配を設けて行う非常に効果的な逆相液体クロマトグ ラフィーにより精製する。 収量 0.07g（98.8％） 当業者は本発明の上記方法を変更・改良して別の方法を見出すことが可能であ る。実施例５ この実施例ではペプチドの持つアヘン類似活性を評価するための各種試験を説 明する。 アヘン類似活性は単離した組織についてインビトロで行う従来型の試験方法： ＧＰＩ試験(Guang T.A Kosterlitz H．W，「モルヒネに類する薬剤の作用物質 および拮抗物質が単離されたモルモットの回腸に及ぼす作用」“Agonist and an tagonistaction of morphine like drugs on the quinea pigs isolatedileum” //Br．J．Pharmac．Chmother-1966-V.27 N 3.P.514-527)、ＭＶＤ試験(Hughs J ．Kosterlitz H.W．Leslie F.M，「マウスのアドレナリン伝達に対するモルヒネ の影響は種々であった。麻酔薬の作用物質と拮抗物質の有効性評価」“Effect o f morphine on adrenergic transmission in the mouse wasdifferent．Assessm ent of agonist and antagonist potenciesofnarcotic.”//Br．J．Pharmacol-1 975-V.53，N3-P，371-381)で検討した。また、インビトロの高温プレート試験で アヘン類活性を測定する試験(AuKier S.I．「antinjiceptiveおよび麻酔薬の拮 抗物質活性を限定するための新規ホットプレート試験」“new hot plate tests to qualigy antinjiceptive and narcotic antagonist activities”//Eur．J ．Pharmacol-174-V.27 Ni p.1-4)とラットを用いたテイルフリック(Tail flick) 試験（D'amour F.E.SmithD.L．「損失を定量するための方法」“amethod for de termining loss”Exp．Ther.-1974-V.72Ni-p.74-79）を用いた。 テイルフリック法によるラットを用いた試験 ペプチド（投与量0.005mg／kg）をラットに鼻腔内投与して 鎮痛活性を調べた。242ユニットの真の鎮痛効果は、ペプチドH-Arg-Tyr-D-Ala-P he-Gly-OHに特徴的なものであった。一連のペプチドが有する阿片類似活性に関 する検討結果を表２に示す。 何らかの生物学的影響を引き起こすペプチドの最小投与量は１〜10mkg／kgで あることがわかる。 ペプチドと、ペプチドをベースとする他の誘導体の生物活性をマウス、ラット 、ミンク、鳥、魚、若い雄牛および豚を用いて検討した。実施例６ この実施例では、若いラットとマウスの体重増加に対するペプチドの影響の概 略を示す。 a）生後一ヵ月のラットより成る４つのグループについて試験を行った。対照群 １には生理溶液0.1mlを投与した。試験群２、３、４には体重１kgあたり0.1、0. 5、1.0mkgのペプチドを静脈注射で投与した。４つのグループのラットの体重を ５日ごとに測定し、同時にそれらの食物摂取状況を観察した。試験は35日間継続 して行った。精度＜0.05の結果を表３に示す。 表３ 1.0mkg／kgのペプチドを投与した第４群のラットで最大の体重増加が見られた 。 ラットの合計食物摂取量を表４に示す。 表４ 各群の食物摂取状況を細かく観察したか差は見られず、このことによってペプ チドには同化作用促進活性があるという結論が得られる。 b）この試験は、NMRI系の生後一ヵ月のマウスよりなる７つのグループを用いて 行った。マウスには自由に食物および水を摂取させた。第１群には0.1mlの生理 溶液を注入（経口）し、第２、３および４群のマウスにはそれぞれ1.0mkg／kg、 10.0mkg／kgおよび100mkg／kgのペプチドを水と供に注入（経口）した。第５、 ６および７群のマウスには、30日間の試験期間中毎日、0.1mkg／kg、0.5mkg／kg および1.0mkg／kgのペプチドを水溶液の状態で静脈に注射した。30日間の試験期 間中、週２回の割合でマウスの体重を測定し、同時に毎日の食物摂取をモニター した。 体重増加の結果は表５に示す。 表５ ＊−経口投与 ＊＊−静脈注射 ペプチドの投与方法として最も効果的なのは投与量が1mkg／kgとなるようにペ プチド水溶液を経口投与する方法である。 24時間ごとに測定した各群の食物消費量の平均値を以下に示す。 表６ この結果、1.0mkg／kgのペプチド水溶液を経口投与される一 方で食物摂取量が最も多かった動物群が最大の体重増加を示すことがわかる。 ペプチドを投与すると動物の体重が増加し、食物摂取量も増えることがわかる 。１ｇの食物摂取によって得られる体重の増加が、そのペプチドの商業的用途に おける指標となる。結果を表７に示す。 表７ １グラムの食物摂取によって得られる最大の体重増力旧よ、ペプチド水溶液を 10.0m kg／kgの割合で投与した場合に見られ、この試験群の正味体重増加は対照 群の体重増加よりも36.5％高かった。実施例７ この実施例では皮膚および体毛成長の形態学的変化に対するペプチドの影響の 概略を示す。 試験は、NMRI系のマウスよりなる４つのグループについて行った。第１群は対 照群であり、その他の群にはそれぞれ第２群が1.0mkg／kg、第３群が10.0mkg／k gおよび第４群が100.0mkg ／kgとなるようにペプチドを投与した。 バイオプシー（生検）を行った後、動物の首筋部分から５×５mmの皮膚サンプ ルを摂取し、リリー(lili)法に従って48時間試験した。皮膚をアルコールで処理 し、24時間顔料に浸漬する。次の段階ではセロジン中で処理を行う。レハルド(R ehard)社製の解剖用メスを用いて組織学的試料を作製する。試料を軸方向に並べ 、切断縁を従来のエオシン法で染色する。 厚さ10mkmの組織学的試料を検討する際、表皮と真皮の量を調べた。試験群お よび対照群の動物について、アフトンジロフ(Aftondilov)法に従って１mmごとに 体毛小胞の数を数えた。 100.0mkg／kg、10．0mkg／kg、1.00mkg／kgのペプチドを投与されたマウスは 対照群と比べて体毛小胞の数がそれぞれ14％、19％および22％増加したことがわ かる。 動物群の皮膚試料からは、100.0mkg／kgを投与された第４試験群に属する動物 の過角化症領域に表皮層の成長が見られることが判った。10．0mkg／kgを投与さ れた第３群の動物も第４群に類似の変化を示した。表皮の厚さも増加していた。 第２群では上皮の成長領域における活性が観察され、さらに皮下脂肪組織の状態 も良好であった。 上記の試験群は首筋部分の体毛の成長を示した。それぞれの動物から10本の体 毛を取って１ミクロンの精度で測定し、各試験群の平均を算出した。結果を表８ に示す。 表８ ペプチドを10および100mkg／kgの投与量で与えた場合、マウスの体毛成長に対 して刺激効果があることは明らかである。 以上の試験ではペプチドは全く毒性を示さなかった。ペプチドはさらに上皮の 活性、表皮層の成長、体毛小胞の密度と量の増加と、生きた組織の体積増加を刺 激することが示された。実施例８ この実施例では魚の尾鰭の再生に対するペプチドの影響を示す。若い鯉とマス を用いて試験した。 濃度1.0mg／ｌのペプチド溶液中で魚を２ヶ月間飼育した。試験期間中、尾鰭 の再生を観察した（試験群と対照群は識別のために尾鰭をトリミングして印を付 けた）。対照群の尾鰭を測定したところ再生された部分の長さは(mkm)183+/-23 であり、試験群の測定値は268+/-26であって、対照群の測定値に比べて少なくと も1.5倍の長さであった。試験群における再生プロセスの速度は鯉を用いた対照 群に比べて1.5倍であった。 ペプチドが成長刺激特性を有することは明らかであり、治癒目的に使用するこ とが可能である。 ウサギの血液中の赤血球凝集素のタイターおよびコイのペプチド血清を１週間 処理したところ、タイターサイズは1.95倍に 増加した。 この試験結果から得られる結論として、ペプチドの影響下にある魚はバクテリ アや原生動物の感染からの回復力が強く、外的要因に対する適応力も強い。実施例９ この実施例ではミンクおよび北極キツネの体重増加に対するペプチドの影響を 説明する。 試験のために、生後２ヵ月の若い北極キツネとミンクを使用した。それぞれの 動物について３つの試験群（試験群２〜３）と１つの対照群（試験群１）とを設 けた。 第２試験群には体重１kgあたり10mkgのペプチドをフードサプリメントの形で 与えた。 第３試験群には、10mkg／kgのペプチドを10日間与えた後10日間投与を中断し 、これを動物が死ぬまで続けた。 第４試験群には第１群と同様にペプチドを投与するが、投与量を体重１kg当り 20mkgとした。 試験開始から１ヵ月後、動物の体重を測定した。その結果、対照群に比べて試 験群の雌雄間に差が見られた。結果を表９に示す。結果は平均からの偏差と平均 値で示されており、これらは学生が計算した値である。 表９ この結果、いずれの動物種においても、第３試験群のメスは20m kg／kgのペプ チドを投与された時に６％の体重増加を示すことがわかる。ミンクのオスは26％ の体重増加を示し、キツネのオスは21％の体重増加を示した。実施例10 この実施例では、ミンクおよび北極キツネの毛皮の品質に対するペプチドの影 響を説明する。 試験条件および方法は実施例９と同様である。 動物を死亡させた後、毛皮の面積を測定し、毛皮の品質を判定する。対照群と 比べて全ての試験群で毛皮面積の増加が観察され、全体的な品質は高いレベルに 維持されていた。ミンクの試験群の数字の増加は、第２群で105％、第３群で108 ％、第４群で108％であった。北極キツネに関する結果は、第２群が 112％、第３群が107％で、第４群が106％であった。実施例11 この実施例では子豚の体重増加に対するペプチドの影響の概略を説明する。 試験には母親から離乳させた子豚を７つのグループに分けて使用した。子豚は 生後４〜５ヶ月である。第１群の子豚は対照として扱い、その他６つのグループ は試験群とした。第２、第３および第４の試験群にはそれぞれ体重１kg当り1.0m kg、5.0mkgおよび10.0mkgのペプチドをフードサプリメントとして与えた。この 投与量で毎月20日間投与を行い、10日間投与を中断した。残りの３つの試験群に は、0.01％のペプチド水溶液を毎月５日間注射によって投与し、残りの25日間は 投与を中断した。第５、６および７群へのペプチド投与量はそれぞれ体重１kg当 り0.1、0.5および1.0mkgとした。試験は100日間継続した。試験結果を表10に示 す。 表10 *−経口投与 **−注射投与 試験の結果、動物への投与量が多いほど良い結果が得られることがわかる。体 重１kg当り10.0mkgのペプチドを経口摂取した第４試験群は対照群に比べて30％ 高い体重増加を示した。体重１Kg当り1.0mKgのペプチドを注射の形で投与された 第７試験群は対照群よりも18％高い体重増加を示した。 試験の結果、ペプチドの使用によって試験動物の血液の生化学的指標に悪影響 はなく、正常値からのずれも生じないことがわかる。ペプチドは試験動物の筋肉 重量を増加させる効果を有していた。実施例12 この実施例では、オスのヒヨコ(rooster chick)の体重増加に対するペプチド の影響を概略説明する。 養鶏用として用いられるＰ−46型の雄鳥に対して試験を行った。雄鳥は生後24 時間である。試験用の雄鳥を各13羽ずつの５つのグループに分けた。第１群は対 照群として用い、残りの４群は試験群とした。第２、第３、第４および第５試験 群の雄鳥には、それぞれ体重１kg当り８、12、16および20mkgのペプチドを餌に 混ぜて与えた。 ヒヨコが10週齢に達するまで、この種の家禽に適した配合飼料を与えた。 試験群および対照群のヒヨコは全て試験期間中生存していた。目視観察の結果 、試験群は積極的に全ての餌を食べ、対照群と比べて外見的な変化はなかった。 試験の詳細を表11に示す。 表11 第３〜５試験群における平均体重増加は対照群に比べて13〜23％大きく、餌の 量は同じ比率で低下した。第２〜第５試験群の餌消費量は対照群に比べて、第２ 群で2.4％、第３群で17.1％、第４群で14.9％、第５群では14.4％低下している ことがわかる。 試験群の雄鳥の肉の品質について官能試験を行ったところ対照群の雄鳥に比べ て色、におい、堅さおよび味の品質に変化はないことが示された。実施例13 この実施例では、若い雄牛の体重増加に対するペプチドの影響を説明する。 試験には、生後２ヵ月の子牛をそれぞれ12頭ずつ、７つのグループに分けて用 いた。第１群を対照群とし、残りの６つのグループを試験群とした。第２、第３ および第４群にはそれぞれ1.0、5.0および10.0mkg／kgのペプチドを水溶液の状 態で空腹時に経口投与した。残りの第５、第６および第７群にはそれぞれ体重１ kg当り0.1、0.5および1.0mkgのペプチドを0.01％水溶液の状態で注射した。 臨床的および生理学的観察の結果、いずれの試験群でも通常と変わった点は見 られなかった。 表12に示した結果より、経口投与および静脈注射のいずれの場合も、ペプチド は雄牛の成長および体重増加に対してプラスの影響を与えることが証明される。 表12 *−経口投与 **−静脈注射 投与量最大の時に最も良い結果が得られる。 ペプチドを水溶液の形で経口投与(体重１kg当り10mkg)したところ60日の測定 期間中、24時間の平均体重増加量は583ｇと記録され、この値は対照よりも172ｇ 多かった。水溶液の状態で注射による投与を行った場合(体重１kg当り１mkg)さ らに高い値が得られた。24時間の平均体重増加は627ｇであり、この値は対照群 よりも217ｇ多かった。実施例14 この実施例は魚の体重増加に対するペプチドの影響の概略を説明するものであ る。 a)ペプチド溶液を入れた水槽に２時間コイを泳がせた（濃度0.25mg／ｌ）。魚に はそれぞれ目印を付け、体重を測定してから循環水槽システムに入れた。コイに は１日当り元の体重の３％に当たる量の乾燥餌を与えた。 20日後、魚を取り出して体重を測定した。体重測定結果を表13に示す。 表13 ペプチド処理されたコイは平均23.0％の体重増加を示し、個体間のばらつきは 18.9〜31.0％であった。 b）この試験は体重0.5ｇのマスの稚魚を用いて行った。魚をペプチド溶液（濃度 1.0mKg／ｌ）中で２ヶ月間飼育した。その結果、対照群の魚の平均体重は2.83g 、試験群では3.86ｇであった。従って、対照群と比べた場合の試験群の成長率は 36.4％ である。実施例15 実施例１に従って合成した生物活性を有する成分をベースにしたペプチド含有 率が0.001〜0.1％（最も好ましくは0.001〜0.01％）の医薬組成物を調製した。 動物用のフードサプリメントおよび液体に使用されるウォーターカーボハイド レート(water carbohydrate)およびその他の担体を組成物で使用した。 フードサプリメントの調製は、ペプチド粉末を水または餌と混合して行う。混 合物に添加する食物の量は所望の軟らかさまたは試験条件によって決定する。 a）魚を用いた試験では、魚を濃度1.0mg／ｌのペプチド水溶液に入れた。 b）実施例１に従って生物活性を有する成分をベースとした医薬組成物を調製し た。この組成物はペプチド含有率0.001％で調製され、子牛の飲み水へ混合する ためのものである。混合剤は水にした。 c）実施例１に従って生物活性を有する成分をベースとした医薬組成物を調製し た。この組成物はペプチド含有率0.001％で調製されており、子豚の飲み水へ混 合するためのものである。混合剤は水にした。 商業的用途 実施例５〜14に概略を説明したペプチドおよびそれをベースとする医薬組成物 は医薬および農業における多種多様な用途で利用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/00 (72)発明者 ディーギン，ブラディスラブ イサコビィ ッチ ロシア国 121609 モスクワ ウリ．オー セナヤ デ．４ コルプ．１ カヴェ. 276 (72)発明者 ヤローバ，エレーナ ピェトロブナ ロシア国 121609 モスクワ ウリ．オー セナヤ デ．４ コルプ．１ カヴェ. 145 【要約の続き】 除して目的物質を単離する。このペプチドとそれをベー スとする組成物はアヘン類似特性を顕著に示す医薬とし て使用され、体重増加を促すと供に成長領域の活性およ び体毛を含む表皮層の発達を促進させる同化作用促進特 性を有する。このペプチドの生物刺激特性は創傷の治癒 および修復プロセスにおいても明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記配列Ｉを有するペプチド： X-Tyr-Y-Phe-Z-A I （ここで、 AはOHまたは置換基を有するアミド(Ｃ₁-Ｃ₃)である） ２．請求項１に記載の配列Ｉで表されるペプチドの活性成分と 希釈剤または充填剤との混合物より成る医薬組成物。 ３．液体である請求項２に記載の医薬組成物。 ４．個体である請求項２に記載の医薬組成物。 ５．注射液である請求項３に記載載の医薬組成物。 ６．経口または非経口投与される請求項４に記載の医薬組成物。 ７．ペプチド含有率が0.001％〜0.01％である請求項３に記載の医薬組成物。 ８．ペプチド含有率が0.001％〜0.1％である実施例４に記載の医薬組成物。 ９．Ｃ末端部分が置換基を有するアミドか保護されたカルボキシル基であり、こ れにN-保護されたフェニルアラニンを混合無水物法または活性エーテル法によっ て結合させ、次いでN-保護された基を取り除き、さらに活性エーテルまたは混合 無水物を添加した後にN-保護されたアミノ酸を添加し、N-保護された基を取り除 き、さらにN-保護されたアミノ酸を添加し、ペプチド鎖の合成が終了した後にテ トラまたはペンタペプチドを放出させ、パラジウム触媒を用いた水素化し、最終 生成物を得る、アミノ酸ＺのＣ末端部分より開始してペプチド酸を除々に成長さ せる方法によって配列NO.１のペプチドを誘導する方法。 10．請求項９に記載の方法を無水溶液中で行い、その場合開始化合物はアミノ酸 のベンジルエーテルとトリブチロキシカルボニルフェニルアラニンとし、酸性溶 液中のトリブチロキシカルボニルを予め除去した後、この混合物にトリブチロキ シカルボニルフェニルアラニン酸を添加し、パラジウム触媒の存在下で水素を添 加し、イオン交換クロマトグラフィーによって最終生成物を得る方法。 11．吸着剤セファデックス(Sephadex G25)のカラムで0.1Ｍ〜1.0Ｍのピリジンア セテート濃度勾配を設けた緩衝溶液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによ ってペプチドの精製を行う請求項10に記載の方法。