【発明の詳細な説明】
CD33様タンパク質をコードするヌクレオチド配列
発明の背景
発明の分野
本発明は、新規のCD33様タンパク質に関する。特に、CD33様タンパク
質をコードする単離された核酸分子を提供する。さらに、組換えCD33様ポリ
ペプチド並びに組換えベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明はさらに、腫
瘍性または炎症性の疾患の診断または予後に有用な方法およびCD33様ポリペ
プチドを発現している細胞を標的とする治療的処置を提供する。
背景の情報
CD33は、造血系の細胞にその発現が限定される67kDの糖タンパク質を
認識する一連のモノクローナル抗体(MoAbs)により、ヒトの骨髄細胞上で
はじめて同定された(Peiper S.C.ら,in Knapp W,Dorken B,Gilks WR,Riebe
r EP,Schmidt RE,Stein H,von dem Borne AEG(編):Leucocyte Typing IV.Wh
ite Cell Differentiation Antigens.Oxford,UK,Oxford University 1989,p
814;Pierelli L.ら,Br J Haematol 84:24(1993);Andrews R.G.ら,Blood 62:1
24,(1983);Griffin J.D.ら,Leuk Res 8:521(1984))。CD33は、造血幹細胞
には存在しないが、混成コロニー形成細胞の部分集団において、はじめて検出さ
れる(Pierelli L.ら,Br J Haematol 84:24(1993);Griffin J.D.ら,Leuk
Res 8:521(1984))。その後、発現が顆粒球で下方調節されるが単球と組織マク
ロファージによって維持されるまで、骨髄単球経路にしたがって発現が続く(Pi
erelli L.ら,Br J Haematol 84:24(1993);Bernstein I.D.ら,J.Cljn.Inv
est 79:1153(1987))。造血系内のCD33の発現パターンは、骨髄細胞分化の
調節における潜在的役割を示している。しかし、その同定が10年前であるにも
かかわらず(Andrews R.G.ら,Blood 62:124,(1983))、CD33の機能とび結
合特性はいまだに分かっていない。
CD33MoAbは、骨髄性白血病細胞(急性骨髄性白血病[AML]仏米英
分類(French-American-British classification)MI−7)とリンパ系由来の
通常のCD33陰性細胞との区別が可能な急性白血病の免疫診断において非常に
重要である。(Griffin J.D.ら,Leuk Res 8:521(1984);Matutes E.ら,Haemat
ol Oncol 3:179(1985);Bain B.J.,Immunological cytogenetic and other mark
ers,in Bain BJ(編);Lulaemia Diagnosis:A Guide to FAB Classification.
London,UK,Gower Medical,1990,p6l)。これは、正確な分類が予後の予測お
よび治療法の選択に必須であるにもかかわらず形態学的な判断基準が不充分ある
、AMLのより幼若な形態にとって特に価値がある。CD33MoAbはまた、
特に移植前かまたは化学療法に耐性である疾患の場合、主としてAML患者の骨
髄を除くために、予備的な試験的治療にいて用いられてきた。(Robertson M.J.
ら,Blood 79:2229(1992);Applibaum F.R.ら,Transplantation 54:829(1992);C
aron P.C.ら,Cancer 73:1049(1994))。このように、CD33の重要性ゆえに
、CD33様タンパク質活性を有するさらなるポリペプチドをコードする核酸分
子を同定し、単離することが明らかに必要である。
発明の要約
本発明は、そのアミノ酸配列が第1図(配列番号2)に示されるCD33様タ
ンパク質またはそのポリペプチドの断片をコードする核酸配列を含んでなる単離
された核酸分子を提供する。CD33様タンパク質遺伝子は、その開始コドンが
第1図(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列の37〜39番に存在し、約
15アミノ酸残基のリーダー配列を有し、推定分子量が約60kDaである、約
551アミノ酸残基のタンパク質をコードする読み取り枠を含んでいる。
別の態様では、本発明は、1996年4月25日にATCC受託番号9752
1として寄託されたクローンのcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有
するCD33様ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ま
しくは、該核酸分子は、上記の寄託されたcDNAによってコードされる成熟ポ
リペプチドをコードする。
本発明の好ましい核酸断片には、以下のものをコードする単離された核酸分子
が含まれる:CD33様タンパク質細胞外領域(第1図(配列番号2)の約16
〜約422番のアミノ酸残基)を含んでなるポリペプチド;CD33様タンパク
質膜貫通領域(第1図(配列番号2)の約423〜約464番のアミノ酸残基)
を含んでなるポリペプチド;CD33様タンパク質細胞内領域(第1図(配列番
号2)の約465〜約551番のアミノ酸残基)を含んでなるポリペプチド;お
よび膜貫通領域のすべてまたは一部が削除されている、細胞外および細胞内領域
を含んでなるポリペプチド。
本発明の更なる態様には、本明細書に記載のいずれかの核酸分子と少なくとも
90%同一、およびより好ましくは少なくとも95%、97%、98%または9
9%同一であるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子が含まれる。
本発明はさらに、本発明の単離されたDNA分子を含んでなるベクター、その
組換えベクターにより遺伝的に処理を施された宿主細胞、および組換え技術によ
るCD33様ポリペプチドまたはその断片の製造を提供する。
本発明のポリペプチドには、寄託されたcDNAによってコードされるポリペ
プチド、配列番号2のポリペプチド(特に成熟ポリペプチド)、並びに寄託され
たcDNAによってコードされるポリペプチドまたは配列番号2のポリペプチド
のアミノ酸配列と少なくとも90%類似、より好ましくは少なくとも95%類似
するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。さらに、本発明のポリペプ
チドには、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチドまたは配列番
号2のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも80%同一、より好ましくは少
なくとも90%または95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含
まれる。
本発明の好ましいポリペプチド断片には、以下のものを含んでなるポリペプチ
ドが含まれる:CD33様タンパク質細胞外領域;CD33様タンパク質膜貫通
領域;CD33様タンパク質細胞内領域;または膜貫通領域が削除されている、
CD33様タンパク質細胞外領域および細胞内領域。
本発明はさらに、腫瘍性または炎症性疾患の診断において有用な方法を提供し
、その方法はCD33様タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルまたは哺乳
類細胞または体液における遺伝子コピー数を分析すること、およびその遺伝子発
現
レベルまたはコピー数を、標準のCD33様タンパク質遺伝子発現レベルまたは
遺伝子コピー数と比較することを含み、それにより、標準に対する遺伝子発現レ
ベルまたは遺伝子コピー数の増加が、ある種の腫瘍性または炎症性疾患の指標と
なる。本発明によれば、上記の方法は予後の指標としても有用である。
別の態様では、白血病患者の移植片に由来する白血病性の造血系細胞を除くた
めのin vitro法が提供される。この方法は、抗CD33様タンパク質モノクロー
ナル抗体(MoAb)と補体によって、CD33様抗原を含む造血系細胞を患者
から得られた骨髄から除去することを含んでなる。
更なる態様では、本発明は、本発明のCD33様抗原を発現している腫瘍細胞
を選択的に死滅させるか、または増殖を阻止するためのin vivo法であって、C
D33様タンパク質レセプターシグナル伝達経路を阻止するに有効な量のアンタ
ゴニストを患者に投与することを含んでなる方法を提供する。本発明によれば、
CD33様タンパク質のこのようなアンタゴニストの患者への投与は、炎症性疾
患の処置にも有用である。
更なる態様では、CD33様タンパク質を発現している細胞に特異的なイムノ
トキシンを、腫瘍細胞を選択的に死滅させるために提供する。本発明のイムノト
キシンはさらに、上記の方法に従えば、in vitroでの白血病造血系CD33+細
胞の除去に有用である。
図面の簡単な説明
第1図は、CD33様タンパク質のヌクレオチド(配列番号1)および推定ア
ミノ酸(配列番号2)配列を示す。約1〜15番のアミノ酸は、シグナルペプチ
ドを示し(最初の下線の配列)、約16〜約422番のアミノ酸は細胞外領域を
示し(最初と2番目の下線の間の配列)、約423〜約464番のアミノ酸配列
は膜貫通領域を示し(2番目の下線の配列)、そして約465〜約551番のア
ミノ酸配列は細胞内領域を示す(残りの配列)。
第2図は、本発明のCD33様タンパク質(配列番号2)とヒト分化抗原CD
33(配列番号3)との間のアミノ酸配列の類似の領域を示すアミノ酸配列の比
較である。
第3図は、ヒトCD33様タンパク質mRNA発現の組織分布を示すノーザン
ブロットである。
詳細な記載
本発明は、クローニングされたcDNAの配列決定によって決定された第1図
(配列番号2)に示されるアミノ酸配列を有するCD33様タンパク質をコード
するポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子を提供する。本発明のC
D33様タンパク質は、ヒトの分化抗原(CD33)(第2図)に関して配列の
相同性を共有する。第1図(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列は、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション,12301 Park Lawn Drive,Rockvil
le,Maryland 20852において1996年4月25日に受託され、アクセス番号9
7521を付与された、HMQCD14クローンを配列決定することにより得ら
れる。
核酸分子
特記しない限り、本明細書中のDNA分子を配列決定することによって決定さ
れたヌクレオチド配列はすべて、自動化されたDNAシクエンサー(Applied Bi
osystems,Inc.のモデル373のような)を用いて決定し、本明細書中の決定さ
れたDNA分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はすべて、上
記のように決定されたDNA配列の翻訳によって推定した。したがって、この自
動化された方法によって決定されたDNA配列に関して当分野で知られているよ
うに、本明細書中のいずれかのヌクレオチド配列がいくつかのエラーを含んでい
るかもしれない。オートメーションによって決定されたヌクレオチド配列は、配
列決定されたDNA分子の実際のヌクレオチド配列と、典型的には少なくとも約
90%同一、より典型的には少なくとも約95%〜少なくとも99.9%同一で
ある。実際の配列は、当分野によく知られている手動のDNA配列決定法を含む
他の方法によって、より精密に決定し得る。当分野において知られているように
、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列における1個の挿入また
は欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その
よ
うな挿入または欠失を起点として、決定されたヌクレオチド配列によってコード
される推定アミノ酸配列は、配列決定されたDNA分子によって実際にコードさ
れたアミノ酸配列と完全に異なるであろう。
特記しない限り、本明細書に記載の「ヌクレオチド配列」はそれぞれ、デオキ
シリボヌクレオチド(A、G、CおよびTと略す)の配列として表する。しかし
、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」は、DNA分子また
はポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、RN
A分子またはポリヌクレオチドについては特定のデオキシヌクレオチド配列のそ
れぞれのチミジンデオキシヌクレオチド(T)がリボヌクレオチドウリジン(U
)で置換されている、リボヌクレオチド(A、G、CおよびU)の対応する配列
を意図する。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略号を用いて記載された配列
番号1を有するRNA分子への言及は、配列番号1のそれぞれのデオキシヌクレ
オチドA、GまたはCが、対応するリボヌクレオチドA、GまたはCで置換され
ており、それぞれのデオキシヌクレオチドTがリボヌクレオチドUで置換されて
いる配列を有するRNA分子を示すことを意図している。
このように、1つの態様では、CD33様タンパク質をコードする単離された
核酸分子が提供される。「単離された」核酸分子とは、その天然の環境から除去
された核酸分子、DNAまたはRNAを意図する。例えば、ベクター中に含まれ
ている組換えDNA分子は、本発明の目的からすると単離されていると考えられ
る。単離されたDNA分子の更なる例には、ヘテロローガスな宿主細胞中で維持
される組換えDNA分子または(部分的にまたは実質的に)精製された溶液中の
DNA分子が含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のDNA分子のin v
itro RNA転写物が含まれる。本発明の単離された核酸分子にはさらに、合成
によって製造されたそのような分子が含まれる。
第1図に示されるようなヌクレオチド配列などのような、本明細書に記載され
た情報を用いて、CD33様タンパク質をコードする本発明の核酸分子を、mR
NAを出発物質として使用するcDNAのクローニングするための方法のような
標準的なクローニングおよびスクリーニング法を用いて得ることができる。本発
明の実例として、第1図に記載の核酸分子は、ヒトの活性化された単球に由来す
るcDNAライブラリーにおいて発見された。さらに、該遺伝子は、以下のタイ
プのヒトの細胞に由来するcDNAライブラリーにおいてもみられた:ヒト好酸
球、脾臓、慢性リンパ球白血病、ヒト活性化好中性細胞およびヒト扁桃。
CD33様タンパク質遺伝子は、その開始コドンが第1図(配列番号1)に示
されるヌクレオチド配列の37〜39番であり、推定されるリーダー配列が約1
5アミノ酸残基であり、その推定分子量が約60kDである、約551アミノ酸
残基の完全長タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでい
る。推定の成熟CD33様タンパク質のアミノ酸配列は、第1図(配列番号2)
のアミノ酸残基16番〜551番に示されている。成熟CD33様タンパク質は
、3つの主要な構造領域を有している。これらには、リガンド結合領域を含み、
第1図(配列番号1)のアミノ酸残基約16番〜約422番に対応すると推定さ
れる細胞外領域が含まれている。成熟細胞外領域は、分子量が約45kDで、長
さ約407アミノ酸であると推定される。もうひとつの領域は、第1図(配列番
号2)の約423番〜約464番の残基に対応すると推定される膜貫通領域であ
る。さらにもうひとつの領域は、第1図(配列番号2)の約465番〜約551
番のアミノ酸残基に対応すると推定される細胞内領域である。第1図(配列番号
2)に示されるCD33様タンパク質は、アクセス番号M23197でGenB
ankにアクセスできるヒトの分化抗原CD33と約53%同一であり、約64
%類似している。当業者が認識し得るように、上に記載した配列決定のエラーの
可能性、並びに異なる既知のタンパク質においてリーダーの開裂部位に可変性が
あるために、寄託されたcDNAによってコードされる実際の完全長のCD33
様タンパク質(リーダーを含む)は約551アミノ酸を含むが、545〜560
アミノ酸の範囲のいずれかであり得るし、このタンパク質の実際のリーダー配列
は約15アミノ酸であるけれども約12〜約18アミノ酸の範囲のいずれかであ
り得る。当業者は、使用した判断基準によっては、上記のCD33様タンパク質
領域の正確な「位置(address)」に関して意見が異なるかもしれない。したが
って、例えば、第1図(配列番号2)のCD33様タンパク質の細胞外、細胞内
および膜貫通領域の正確な所在は、その領域を定義づける為に使用した判断基準
によってわずかに変化するかもしれない(例えば、正確な「位置」は、第1図に
示され
る位置と比較して約1〜5残基異なることもある)。
示したように、本発明の核酸分子はmRNAのようなRNA、または例えばク
ローニングによって得られたかまたは合成によって製造されたcDNAおよびゲ
ノムDNAを含むDNAの形態であってよい。DNAは二本鎖または一本鎖であ
ってよい。一本鎖DNAは、センス鎖としても知られているコード鎖であってよ
く、またはアンチセンス鎖としても知られている非コード鎖であってもよい。
本発明の単離された核酸分子は、その開始コドンが第1図(配列番号1)に示
されるヌクレオチド配列の37〜39番にあるオープンリーディングフレーム(
ORF)を含んでなるDNA分子、さらに、ORFの全部または一部が実質的に
異なる配列を含んでなるが、遺伝コードの縮重のためCD33様タンパク質また
はその断片を依然としてコードする、開始コドンが第1図(配列番号1)に示し
たヌクレオチド配列の37〜39番にあるDNA分子を含んでいる。勿論、遺伝
コードは当分野のおいてよく知られている。したがって、上記の縮重変異体を作
成することは当業者には慣用的なことであろう。
別の態様では、本発明は、1996年4月25日にATCC受託番号9752
1として寄託されたクローンのcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有
するCD33様ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ま
しくは、核酸分子は、上記の寄託されたcDNAによってコードされる成熟ポリ
ペプチドをコードする。
本発明はさらに、第1図(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列または上
記の寄託されたcDNAに含まれるCD33様タンパク質遺伝子のヌクレオチド
配列を有する単離された核酸分子、または上記配列の1つに相補的な配列を有す
る核酸分子を提供する。このような単離された分子、特にDNA分子は、染色体
とのin situハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングやノーザンブロッ
ティング解析によるCD33様タンパク質遺伝子のヒト組織における発現を検出
するためのプローブとして有用である。以下詳細に記載するように、ある組織に
おけるCD33様タンパク質遺伝子発現の増大を検出することは新生物の指標で
ある。
本発明はさらに、本明細書中に記載した単離された核酸分子の断片に関する。
寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または第1図(配列番号1)に示したヌ
クレオチド配列を有する単離された核酸分子の断片は、少なくとも約15nt、
およびより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも
約30nt、およびさらにより好ましくは少なくとも約40ntの長さであり、
本明細書中で記述される診断用プローブおよびプライマーとして有用な断片を意
図する。勿論、長さ50〜1500ntのより大きな断片もまた、寄託されたc
DNAまたは第1図(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列の、全部でない
としても大部分に対応する断片と同様に本発明に有用である。例えば、少なくと
も長さ約20ntの断片は、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または第1
図(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列に由来する20またはそれ以上の
隣接した塩基を含む断片を意図する。該遺伝子は寄託されており、第1図(配列
番号1)に示されるヌクレオチド配列が提供されているので、このようなDNA
断片を作成することは当業者には常套的であろう。例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ開裂または超音波処理によるせん断を容易に使用して様々なサイズの断片を
作成することができよう。あるいは、そのような断片を合成によって作成するこ
とができよう。
本発明の好ましい核酸断片には、以下のものをコードする核酸分子が含まれる
:CD33様タンパク質細胞外領域を含んでなるポリペプチド(第1図(配列番
号1)のアミノ酸残基約16番〜約422番);CD33様タンパク質膜貫通領
域を含んでなるポリペプチド(第1図(配列番号2)のアミノ酸残基約423番
〜約464番);CD33様タンパク質細胞内領域を含んでなるポリペプチド(
第1図(配列番号2)のアミノ酸残基約465番〜約551番);膜貫通領域の
全部または一部が削除されているCD33様タンパク質細胞外および細胞内領域
を含んでなるポリペプチド。
別の態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で、上記の本発明の核酸分子のポリヌクレオチドの一部、例えばATCC受託番
号97521に含まれるcDNAクローンとハイブリダイズするポリペプチドを
含んでなる単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件」は、50%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl
,
15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、
5×Denhardt's溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mL変性、せ
ん断サケ***DNAを含む溶液中の42℃での一晩のインキュベーションの後、
約65℃の0.1×SSC中でフィルターの洗浄することを意図する。ポリヌク
レオチドの「一部」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、言及するポリ
ヌクレオチドの少なくとも15ヌクレオチド(nt)、およびより好ましくは少
なくとも約20nt、さらに好ましくは少なくとも約30nt、さらにより好ま
しくは少なくとも約30〜70ntとハイブリダイズするポリヌクレオチド(D
NAまたはRNA)を意図する。これらは、上記および以下により詳細に記載す
る診断用プローブおよびプライマーとして有用ある。
勿論、言及するポリヌクレオチド(例えば寄託されたcDNAクローン)のよ
り大きな部分、例えば言及するポリヌクレオチドの長さ50〜750ntの部分
、またはさらに全長に匹敵する長さとハイブリダイズするポリヌクレオチドもま
た、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または第1図(配列番号1)に示さ
れるのヌクレオチド配列の、全部でないとしても大部分に対応するポリヌクレオ
チドと同様、本発明のプローブとして有用である。「少なくとも20ntの長さ
」のポリヌクレオチドの一部は、例えば、言及するポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列(例えば、寄託されたcDNAまたは第1図(配列番号1)に示される
ヌクレオチド配列)に由来する20またはそれ以上の隣接したヌクレオチドを意
図する。示すように、そのような部分は、例えば、参考のためその全開示が本明
細書の一部を構成するMolecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Sambr
ook,J.,Fritsh,E.F.およびManiatis,T.編(1989),Cold Spring Harbor Lab
oratory Pressに記載されているように、慣用のDNAハイブリダイゼーション
技術に従うプローブとしてかまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的
配列の増幅のためのプライマーとして、診断上有用である。
勿論、ポリA配列(第1図(配列番号2)に示されるCD33様cDNAの3
'末端ポリA配列のような)またはT(またはU)残基の相補的な連続配列にの
みハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリA連続配列またはその相補鎖(
例えば、実際上いずれかの二本鎖cDNAクローン)を含むいかなる核酸分子と
もハイブリダイズし得るので、本発明の核酸の一部とハイブリダイズさせるため
に使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
示すように、CD33様ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は以下の
ものが含まれるがこれらに限られない:成熟ポリペプチドそれ自身のコード配列
;成熟ポリペプチドのコード配列と約15アミノ酸のリーダーまたは分泌配列を
コードする配列などの更なる配列、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−
タンパク質配列;前述の更なるコード配列を有しまたは無さず、以下の更なる非
コード配列を有する成熟ポリペプチドのコード配列、その配列は、イントロンお
よび、例えば転写、mRNAプロセシング(例えばスプライシングおよびポリア
デニル化シグナルを含む)、リボソーム結合およびmRNAの安定性において役
割を担っている転写され翻訳されない配列などの非コード5'および3'配列を含
むがそれに限られない;更なる機能をもたらず更なるアミノ酸をコードする更な
るコード配列。このように、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、あるペ
プチドをコードする配列などのマーカー配列に融合し、そのペプチドは、その融
合したポリペプチドの精製を容易にすることができる。本発明のこの態様におけ
るある好ましい具体例では、マーカー配列は、なかでもpQEベクター(Quigen
,Inc)において与えられるtagのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、
なかでも、その多くが商業的に入手可能である。Gentzら,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86:821-824(1989)に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジ
ンは融合タンパク質の便利な精製をもたらす。HA tagは、インフルエンザ
ヘマグルチニンタンパク質から得られるエピトープに対応する精製に有用なもう
ひとつのペプチドであり、例えば、Wilsonら,Cell 37:767(1984)に記載されて
いる。
本発明はさらに、CD33様タンパク質の断片、同族体または誘導体をコード
する本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、アレル変異体のような天然
に存在するものであってよい。「アレル変異体」は、生物の染色体上の所定の座
を占有している遺伝子の、それに代わるいくつかの形態のうちの1つを意図する
。非天然の変異体は、当分野に知られた突然変異誘発技術を用いて製造すること
ができる。
そのような変異体には、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって生じるも
のが含まれる。置換、欠失または付加は、1またはそれ以上のヌクレオチドが関
与し得る。変異体は、コードまたは非コード領域またはその両方において変化し
ていてもよい。コード領域における変化により、保存的または非保存的なアミノ
酸置換、欠失または付加を生じることができる。
これらのうち特に好ましいのは、CD33様タンパク質またはその一部の特性
および活性を変えないサイレント置換、付加および欠失である。また、これに関
して特に好ましいのは、保存的置換である。
本発明の更なる態様には、以下のものに対して少なくとも90%同一、および
より好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%同一であるヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子を含む
:(a)第1図(配列番号2)に示されるまたはATCC受託番号97521に
含まれるcDNAクローンによってコードされるような完全なアミノ酸配列(推
定のリーダー配列を含む)を有する完全長CD33様ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列;(b)第1図(配列番号2)に示されるまたはATCC受託
番号97521に含まれるcDNAクローンによってコードされるようなアミノ
酸配列を有する成熟CD33ポリペプチド(リーダー配列が除去された完全長ポ
リペプチド)をコードするヌクレオチド配列;(c)第1図(配列番号2)に示
されるまたはATCC受託番号97521に含まれるcDNAクローンによって
コードされるようなアミノ酸配列を有するCD33様タンパク質細胞外領域をコ
ードするヌクレオチド配列;(d)第1図(配列番号2)に示されるまたはAT
CC受託番号97521に含まれるcDNAクローンによってコードされるよう
なアミノ酸配列を有するCD33様タンパク質細胞内領域をコードするヌクレオ
チド配列;(e)第1図(配列番号2)に示されるまたはATCC受託番号97
521に含まれるcDNAクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を
有するCD33様タンパク質膜貫通領域をコードするヌクレオチド配列;(f)
第1図(配列番号2)に示されるまたはATCC受託番号97521に含まれる
cDNAクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を有するCD33様
タンパク質細胞外領域および細胞内領域(膜貫通領域の全部または一部が除去さ
れている)をコードするヌクレオチド配列;または(g)(a)〜(f)のヌクレ
オチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
CD33様ポリペプチドをコードする言及するヌクレオチド配列に例えば少な
くとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列が、CD33様ポリペプチドをコードする言及す
るヌクレオチド配列の100ヌクレオチドにつき5つまでの突然変異をそのポリ
ヌクレオチド配列が含んでもよいということ以外は、その言及する配列と同一で
あることを意図する。言いかえれば、言及するヌクレオチド配列に少なくとも9
5%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その
言及する配列のヌクレオチドの5%までは、欠失または別のヌクレオチドで置換
されていてもよいか、またはその言及する配列のヌクレオチドの総数の5%まで
の数のヌクレオチドをその言及する配列に挿入してもよい。言及する配列のこれ
らの突然変異は、その言及するヌクレオチド配列の5'または3'末端の位置また
はこれら末端の位置の間のどこかにおいて、その言及する配列内で個別にかまた
はその言及する配列内の1またはそれ以上の隣接した群として分散して存在し得
る。
実際的な問題として、いずれかの特定の核酸分子が、例えば第1図に示したヌ
クレオチド配列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列と少なく
とも90%、95%、97%、98%または99%同一であるヌクレオチド配列
を有しているかどうかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis P
ackage,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research
Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)などの既知のコンピュータプ
ログラムを使用して慣用的に決定することができる。Bestfitは、SmithとWaterm
an(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))の局所的相同性アルゴ
リズムを使用して2つの配列間の相同性が最良のセグメントを見つけ出す。特定
の配列が、本発明の言及する配列と例えば少なくとも95%同一であるかどうか
を決定するために、Bestfitまたは他のいずれかの配列アラインメントプログラ
ムを使用する場合、勿論、言及するヌクレオチド配列の全長にわたって同一性の
百分率を計算し、言及する配列のヌクレオチドの総数の5%までの相同性の
相違が許容されるようにパラメーターをセットする。
本願は、CD33様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードするかどう
かに関係なく上記の核酸配列に少なくとも90%、95%、97%、98%また
は99%同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がCD33様タ
ンパク質活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者は、例
えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プ
ライマーとしてその核酸分子を如何にして使用するかを知っているであろうから
である。CD33様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードしない本発明
の核酸分子の使用には、とりわけ、以下のものが含まれる:(1)CD33様タ
ンパク質またはcDNAライブラリー由来のそのアレル変異体をコードする遺伝
子の単離;(2)Vermaら,Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques
,Pergamon Press,New York(1988)に記載されているようなCD33様遺伝子の
染色体上の正確な位置を得るための、***中期染色体スプレッド(spread)との
in situハイブリダイゼーション(FISH);および(3)特定の組織におけ
るCD33様mRNAの発現を検出するためのノーザンブロット解析が含まれる
。
しかし、CD33様タンパク質活性を有するポリペプチドを実際にコードする
上記核酸配列と少なくとも90%、95%、97%、98%または99%同一で
ある核酸分子が好ましい。「CD33様タンパク質活性を有するポリペプチド」
とは、ある特定の生物学的分析で測定したときに本発明のCD33様ポリペプチ
ドの活性と同様であるが同一である必要はない活性を示すポリペプチドを意図す
る。
例えば、固相結合アッセイでは、本発明のCD33様タンパク質は、CD33
およびシアロアドヘジンと同様な方法で、赤血球(RBC)へのシアル酸依存の
粘着を媒介し得る。(このアッセイは、その内容が本明細書の一部を構成するFr
eeman,S.D.ら,Blood 85(8):2005-2012(1995)に詳細に記載されている)。特
に、ヒトの赤血球(RBC)を酵素で修飾し、独特の結合によってシアル酸を持
たせることができる(Paulson JC.ら,Methods Enzymol.138:162(1987))。こ
れは、シアル酸依存の粘着分子の特異性を特徴付る有用な実験的方法を提供す
る。簡潔に言えば、このアッセイは、Fc−CD33様タンパク質を、上記のC
D33様タンパク質cDNAの細胞外部分のポリメラーゼ連鎖反応増幅によって
作成し、Fc発現ベクターpIGへクローニングし(Simmons DL:Cloning cells
urface molecules by transient expression in mammalian cells,in Hartley
DA(編):Cellular Interactions in Development-A Practical Approach.Oxf
ord,UK,IRL,1993,p93)、次いでFreeman,S.D.ら,85(8):2005-2012(1995)
に記載されているようにCOS−1細胞において発現させることを含む。COS
細胞上清をトランスフェクト後約6日目に集め、前掲のSimmons DLに記載のよう
にFc−CD33様タンパク質をプロテインAセファロースで精製する。
固相結合アッセイは、Kelm,S.ら,Curr Biol 4:965(1994)に記載されている
ように、酵素を結合した免疫吸収剤アッセイプレートをFc−CD33様タンパ
ク質でコーティングすること、およびFreemn,S.D.ら,Blood 85(8):2005-2012(
1995)に記載されているようにシアル酸残基を1またはそれ以上の構造において
有している放射能標識したRBCを適当な濃度で加えること(例えば、4×106
細胞/mL)を含む。30分後、付着しなかったおよび弱く付着した細胞を洗
浄により除く。それぞれのウェルにおいて結合した細胞の百分率を以下のように
計算する:(cpm結合/cpm添加量)×100。本発明のCD33様ポリペ
プチドはシアル酸依存的にRBCに結合するであろう。
このように、本発明により、「CD33様タンパク質活性を有するポリペプチ
ド」は、上記アッセイにおいてRBCに結合もするポリペプチドを含む。言いか
えれば、サイドバイサイドの比較において、CD33様タンパク質を用いる上記
のRBC結合の百分率は、「CD33様タンパク質活性を有するポリペプチド」
の候補を使用して得られる百分率と同様(即ち50%以上は違わない、好ましく
は25%以上違わない)であろう。
別の態様では、上記の結合アッセイは、CD33様タンパク質活性の可能性の
あるアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングするのに有用である。こ
の方法は、アゴニストとまたはアンタゴニスト候補(抗CD33様タンパク質抗
体のような)が、CD33様タンパク質のRBCに対するシアル酸依存の結合を
、標準的な結合レベル、即ちアゴニストまたはアンタゴニスト候補不在でのRB
C
に対するCD33様タンパク質結合の程度、と比較して増強するかまたは阻害す
るかを決定することを含む。
勿論、遺伝コードの縮重のために、当業者は、上記の核酸配列と少なくとも9
0%、95%、97%、98%または99%同一であるヌクレオチド配列を有す
る数多くの核酸分子が「CD33様タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコ
ードし得るということを即座に認識するであろう。実際には、すべての縮重変異
体は同じポリペプチドをコードするので、上記の比較アッセイを行わなくてもこ
のことは当業者には明らかであろう。縮重変異体ではない核酸分子に関して、か
なりの数のものも、CD33様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードす
るであろうことは、当分野においてさらに認識される。なぜならば、当業者は、
それほどまたは全くタンパク質の機能に有意に影響しないようなアミノ酸置換(
例えば、ある脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置換すること)について熟
知しているからである。
例えば、表現型に関してサイレントなアミノ酸置換を如何にして行うかについ
ての手引きがBowie,J.U.ら,“Deciphering the Message in Protein Sequences
:Tolerance to Amino Acid Substitutions,”Science 247:1306-1310(1990)に
記載されており、その中で著者は、変化に対するアミノ酸配列の許容を調べる2
つの主要な方法があることを示している。第1の方法は、進化の過程に依存して
いるもので、そこでは突然変異体が自然選択によって許容されるかまたは排除さ
れる。第2の方法は、遺伝子工学を用いてクローニングされた遺伝子の特定の位
置にアミノ酸変化を導入し、選択またはスクリーニングにより機能を維持する配
列を同定する。著者が述べているように、これらの研究により、タンパク質はア
ミノ酸置換に関して意外にも耐性であることが分かった。著者はさらに、どのよ
うなアミノ酸変化が、そのタンパク質のある特定の位置で寛容でありそうかにつ
いて示している。例えば、たいていの内部に埋め込まれたアミノ酸残基は無極性
の側鎖を必要とするが、表面の側鎖の2、3の特徴は一般的に保存される。他の
そのような表現型的にサイレントな置換は、参考のために引用する前掲のBowie
,J.U.らに記載されている。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、その組換えベ
クターにより遺伝的に処理を施された宿主細胞、および組換え技術によるCD3
3様ポリペプチドまたはその断片の製造に関する。
感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクションおよび形質転換
などのよく知られた技術を用いて組換え構築物を宿主細胞に導入することができ
る。ベクターは、例えばプラスミド、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイル
スベクターであってよい。レトロウイルスベクターは、複製能を有していても複
製欠陥であってもよい。後者の場合、レトロウイルスの増殖は、一般に相補的(
complementing)宿主細胞においてのみ起こる。
ポリペプチドは、宿主における増殖のための選択可能なマーカーを含むベクタ
ーに連結することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム
沈殿などの沈殿において導入するかまたは荷電した脂質との複合体において導入
する。ベクターがウイルスである場合、適当なパッケージング細胞系を使用して
in vitroでパッケージングした後、宿主細胞にトランスフェクトすることができ
る。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドにシス作用制御領域を含むベクターであ
る。適当なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補的ベクターに
よって供給されるかまたは宿主細胞に導入されるとそのベクター自身から供給さ
れる。
これに関してある特定の好ましい態様では、ベクターは、導入可能および/ま
たは細胞のタイプに特異的である特異的発現をもたらす。中でも特に好ましい導
入可能なベクターは、扱いやすい環境因子、例えば温度や付加的栄養素などによ
る発現を誘導することができるベクターである。
本発明に有用な発現ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母
染色体エレメント、ウイルス例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽性狂犬病ウイルスおよびレ
トロウイルスから得られるベクター、およびそれらの組合せに由来するベクター
例えばコスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージ遺伝エ
レメントから得られるベクターが含まれる。
DNA挿入は、適当なプロモーター、いくつか挙げると、例えばファージラム
ダPLプロモーター、E.coli lac、trpおよびtacプロモーター、SV40初期
および後期プロモーターおよびレトロウイルスLTRのプロモーターのようなプ
ロモーターに作動可能なように連結する。他の適当なプロモータは当業者によく
知られている。発現構築物は、転写開始、終止のための部位、および転写領域に
は翻訳のためのリボソーム結合領域を含む。構築物によって発現する成熟転写物
のコード部分は、翻訳開始のAUGを先頭に含み、適切に位置する終止コドンを
翻訳されるポリペプチドの最後に位置する。
示されるように、発現ベクターは好ましくは選択可能なマーカーを含む。その
ようなマーカーには、真核細胞カルチャーのためのジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性およびE.coliまたは他の細菌において培養するためのテ
トラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。適当な宿主の代表的な例には、
E.coli、ストレプトミセス、ネズミチフス菌のような細菌細胞;酵母のような
真菌細胞;ショウジョウバエS2およびSpodoptera Sf9のような昆虫細胞;CH
O、COSおよびボーズメラノーマのような動物細胞;および植物細胞が含まれ
る。上記の宿主細胞のための適当な培地と条件は当分野で知られている。
Quiagenから入手可能であるpQE70、pQE60およびpQE−9;pB
Sベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、Stratageneから入手
可能なpNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A;およびPharma
ciaから入手可能なptrc99a、pKK233−3、pKK233−3、p
DR540、pRIT5は細菌において使用するのに好ましいベクターである。
なかでも好ましい真核ベクターは、Stratageneから入手可能なpWLNEO、p
SV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;およびPharmaciaから入手
可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLである。他の適当なベク
ターは当業者に明らかである。
なかでも本発明において使用するための既知の細菌プロモーターには、E.col
i lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモ
ーター、ラムダPR、PLプロモーターおよびtrpプロモーターが含まれる。
適当な真核プロモーターには、CMV即初期(immediate early)プロモーター
、HSVチミジンキナ−ゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター
、ラウス肉腫ウイルス(“RSV”)のプロモーターなどのレトロウイルスLT
Rのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Iプロモーターなどのメタ
ロチオネインプロモーターが含まれる。
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、
DEAEデキストラン介在のトランスフェクション、カチオン脂質介在のトラン
スフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染または他
の方法によって行うことができる。そのような方法は、例えば、Davisら,Basic
Methods in Molecular Biology(1986)などの多くの標準的な実験マニュアルに
記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、エン
ハンサー配列をベクター内に挿入することによって増強することができる。エン
ハンサーは、通常約10〜300bpの、所定の宿主細胞タイプにおけるプロモ
ーターの転写活性を増加するように作用するDNAのシス作用エレメントである
。エンハンサーの例には、bp100〜270の複製起点の後側に位置するSV
40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製
起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含
まれる。
小胞体の管、細胞周辺腔、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌
のため、発現したポリペプチドに適当な分泌シグナルを組み込むことができる。
シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってよく、またはヘテロローガス
なシグナルであってもよい。
ポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾された形態で発現させることがで
き、分泌シグナルだけでなくさらなるヘテロローガスな機能性領域を含むことが
できる。即ち、例えば更なるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域をポリペプ
チドのN末端に付加して、精製の間のまたはその後の処理と保存の間の、宿主細
胞における安定性と持続性を改善することができる。また、ペプチド部分をポリ
ペプチドに付加して精製を容易にすることができる。
CD33様タンパク質を、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを含むよく知られた方法によって、組換え培養細胞から回収し精製するこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を
精製に使用する。
本発明のポリペプチドには、天然の精製された産物、化学的合成法の産物およ
び、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む原核または真
核宿主から組換え技術により製造された産物が含まれる。組換え製造法に使用さ
れる宿主によって、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていることもあ
るし、グリコシル化されていないこともある。さらに、本発明のポリペプチドは
、ある場合には宿主が関与する過程の結果として、最初の修飾されたメチオニン
残基を含んでいてもよい。
CD33様ポリペプチドおよび断片
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列また
は第1図(配列番号2)に示されるアミノ酸配列を有する単離されたCD33様
ポリペプチド、または上記ポリペプチドの一部を含んでなるペプチドまたはポリ
ペプチドを提供する。「ペプチド」および「オリゴペプチド」なる語は、(通常
認識されているように)同義語と考えられ、それぞれの語は文脈の前後関係から
必要に応じて互換的に使用して、ペプチジル結合によって結合した少なくとも2
つのアミノ酸の鎖を示すことができる。本明細書中の「ポリペプチド」なる語は
、10アミノ酸残基以上を含む鎖について用いられる。本明細書中のすべてのオ
リゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右へ、アミノ末端か
らカルボキシ末端の方向で記載する。
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、天然の環境から除去された
ポリペプチドまたはタンパク質を意図する。例えば、宿主において発現した組換
えにより製造されるポリペプチドおよびタンパク質は、いずれかの適当な技術、
例えばSmithおよびJohnson,Cene 67:31-110(1988)に記載された1段階精製法に
よって実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様、本発明の目的
からすると単離されていると考えられる。
当業者は、CD33様ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質
の構造または機能に対する有意な影響なしに変化させることができることを認識
するであろう。配列のそのような違いを考えるならば、タンパク質の活性を決定
している決定的な領域が存在するであろうということを忘れてはならない。その
ような領域は、細胞外領域を構成する残基を含んでいてもよい。三次構造を形成
する残基を置換することは一般的に可能ではあるが、但し、同様の機能を発揮す
る残基を使用する。他の例では、その変化がタンパク質の決定的でない領域で起
こる場合、残基の種類は全く重要でないであろう。
したがって、本発明はさらに、実質的にCD33様ポリペプチド活性を示すか
、または以下に記載のタンパク質断片のようなCD33様タンパク質の領域を含
むCD33様ポリペプチドの変異体を含む。このような突然変異体には、欠失、
挿入、逆位、反復、および種類の置換(例えば、ある親水性残基を別の種類のも
のに置換することであるが、概して、強い疎水性残基は強い親水性残基と置換し
ない)が含まれる。わずかな変化または「中性の」アミノ酸置換は、一般には、
活性にはほとんど影響しないであろう。
保存的置換として典型的にみられるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、L
euおよびIleのなかでのあるものを別のものに置換すること;ヒドロキシル
残基SerおよびThr間の相互交換、酸性残基AspとGluの交換、アミド
残基AsnとGlnの置換、塩基性残基LeuとArgの交換および芳香族残基
Phe、Tyrのなかでの置換である。
上で示したように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレント(即ち、機能に
対して有意の有害な影響を及ぼしそうでない)でありそうかについての更なる手
引きは、Bowie,J.U.ら,“Deciphering the Message in Protein Sequences:To
lerance to Amino Acid Substitutions,”Science 247:1306-1310(1990)にみら
れる。
本発明のポリペプチドはリーダーを含む寄託されたcDNAによってコードさ
れるポリペプチド、寄託されたcDNAによってコードされるリーダーが削除さ
れた成熟ポリペプチド(即ち、成熟タンパク質)、リーダーを含む第1図(配列
番号2)のポリペプチド、リーダーを含まない第1図(配列番号2)のポリペプ
チド、並びに本明細書に記載のポリペプチドと少なくとも90%類似、より好ま
しくは少なくとも95%類似、さらにより好ましくは少なくとも97%、98%
または99%類似であるポリペプチドを含む。本発明のさらなるポリペプチドに
は、本明細書に記載のポリペプチドど少なくとも80%同一、より好ましくは少
なくとも90%または95%同一、さらにより好ましくは少なくとも97%、9
8%または98%同一であるポリペプチドを含み、さらに、少なくとも30アミ
ノ酸より好ましくは少なくとも50アミノ酸を有する、そのようなポリペプチド
の一部を含む。
2つのポリペプチドに関する「%類似」とは、Bestfitプログラム(Wisconsin
Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group
,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)および
類似性を決定するためのデフォールトセッティング(default setting)を用い
て、2つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって求められる類似
性のスコアを意図する。Bestfitは、SmithとWaterman(Advances in Applied Mat
hematics 2:482-489(1981))の局所的相同性アルゴリズムを使用して2つの配列
間の相同性が最良のセグメントを見つけ出す。
CD33様ポリペプチドの言及するアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば
95%「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチド配列
が、CD33様ポリペプチドの言及するアミノ酸の100アミノ酸それぞれにつ
き5つまでのアミノ酸変化を有し得ることを除いては、そのポリペプチドのアミ
ノ酸配列がその言及する配列と同一であることを意図する。言いかえれば、言及
するアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを得るには、その言及する配列の5%までのアミノ酸残基が、欠失または別
のヌクレオチドで置換されていてもよいか、またはその言及する配列のアミノ酸
残基の総数の5%までの数のアミノ酸をその言及する配列に挿入してもよい。言
及する配列のこれらの変化は、その言及するアミノ酸配列のアミノまたはカルボ
キシ末端の位置でかまたはこれらの末端の位置の間のどこかで、その言及する配
列の残基のなかで個別的にか、またはその言及する配列内の1またはそれ以上の
隣接した群として分散して存在し得る。
実際的な問題として、いずれかの特定のポリペプチドは、例えば第1図(配列
番号2)に示されるアミノ酸配列または寄託されたcDNAクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列またはその一部と少なくとも90%、95%、97%、
98%または99%同一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Seq
uence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,Uni
versity Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)のような既
知のコンピュータプログラムを使用して常套的に決定することができる。Bestfi
tまたは他のいずれかの配列アラインメントプログラムを使用して、ある特定の
配列が本発明の言及する配列と例えば少なくとも95%同一であるかどうかを決
定する場合は、勿論、言及するアミノ酸配列の全長にわたって同一性の百分率を
計算し、言及する配列のアミノ酸の総数の5%までの相同性の相違が許容される
ようパラメーターをセットする。
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを有する部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」とは、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を引き起
こすタンパク質の一部分であると定義される。これらの免疫原性エピトープは、
その分子上での2,3の位置に限られると考えられている。他方、抗体が結合し
得るタンパク質分子の領域は「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の
免疫原性エピトープは、一般に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ge
ysen,H.M.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1984)参照。
抗原性エピトープを有する(即ち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を
含む)ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模
倣した比較的短い合成ペプチドが、その部分的に模倣されたタンパク質と反応す
る抗血清を誘導することが常套的に可能であるということは当分野においてよく
知られている。例えば、Sutcliffe,J.G.ら,Science 219:660-666(1984)参照。
タンパク質反応性血清を誘導することが可能なペプチドは、タンパク質のプライ
マリーな配列にしばしば表示され、一組の単純な化学的規則によって特徴付るこ
とができ、そして完全なタンパク質の免疫優性領域(即ち、免疫原性エピトープ
)にもアミノまたはカルボキシ末端にも限られない。著しく疎水性であるペプチ
ドおよび6またはそれ以下の残基のペプチドは、通常、模倣タンパク質に結合す
る抗体の誘導には効果的でない;より長い、可溶性のペプチド、特にプロリン残
基を含むペプチドは一般的に効果的である。Sutcliffeら,前掲661。例えば、イ
ンフルエンザウイルスヘマグルチニンHA1ポリペプチド鎖の配列の75%をカ
バーしている8〜39残基を含む、これらガイドラインにしたがって設計された
20のペプチドのうち18のペプチドは、HA1タンパク質または完全なウイル
スと反応する抗体を誘導し;MuLVポリメラーゼ由来のペプチドの12のうち
12と、狂犬病ウイルス糖タンパク由来の18のうち18が、それぞれのタンパ
ク質を沈殿させる抗体を誘導した。
したがって、本発明の抗原性エピトープを有するペプチドおよびポリペプチド
は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を
惹起するのに有用である。例えば、抗原エピトープを有するペプチドで免疫され
たドナー由来の脾臓細胞の融合によって得られたハイブリドーマは、一般に天然
のタンパク質と反応する抗体を分泌する。Sutcliffeら,前掲663。抗原性エピト
ープを有するペプチドまたはポリペプチドによって惹起される抗体は、模倣タン
パク質を検出するのに有用であり、異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロ
セシングを受けるタンパク質前駆体の様々な領域の運命を追跡するために使用す
ることができる。該ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質に関する
様々な定性的または定量的分析、例えば競合アッセイにおいて使用することがで
きる。なぜなら短いペプチド(即ち約9アミノ酸)でさえも、免疫沈降分析にお
いて、結合してより大きなペプチドにとって代わり得ることが示されているから
である。例えばWilson,I.A.ら,Cell 37:767-778 p777(1984)参照。本発明の抗
ペプチド抗体もまた模擬タンパク質の精製、例えば、当分野においてよく知られ
ている方法を用いる吸着クロマトグラフィーによる精製に有用である。
上記の指針にしたがって設計された抗原性エピトープを有する本発明のペプチ
ドおよびポリペプチドは、好ましくは少なくとも7の、より好ましくは少なくと
も9の、および最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の配列を、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列内に含んでいた。しかしながら、約30〜約50アミノ
酸または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さおよび全
アミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きい部分を含
むペプチドまたはポリペプチドもまた、模倣タンパク質と反応する抗体を誘導す
るのに有用である。好ましくは、エピトープを有するペプチドのアミノ酸配列を
選択して水性溶媒中での実質的な溶解性を得ることがでる(即ち、配列が比較的
親水性の残基を含み、疎水性の高い配列は好ましくは避ける);プロリン残基を
含む配列が特に好ましい。
本発明のエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分
子を用いる組換え法を含む、ペプチドまたはポリペプチドを製造するためのいず
れかの慣用的な方法によって製造することができる。例えば、エピトープを有す
る短いアミノ酸配列は、組換え生産および精製の間並びに免疫して抗ペプチド抗
体を製造する間、キャリヤーとして働くより大きなポリペプチドに融合させるこ
とができる。
エピトープを有するペプチドはまた、化学合成の既知の方法を使用して合成す
ることもできる。例えば、Houghtenは、数多くのペプチドを合成するための簡単
な方法を記載している。例えば、これらは4週間以内に調製され特徴付けられた
(ELISA型結合分析により)HA1ポリペプチドのセグメントの1個のアミ
ノ酸変異体である、10〜20mgの、異なった13残基の248個のペプチド
。Houghten,R.A.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 82:5131-5135(1985)。この“Sim
ultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)”法は、Houghtenら(1986)米国
特許第4,631,211号にさらに記載されている。この方法では、様々なペプ
チドの固相合成のための個々の樹脂が別の溶媒透過性のパケットに入れられてお
り、固相法に含まれる多くの同一の繰り返し工程の最適な使用を可能にしている
。完全なマニュアル法は、500〜1000またはそれ以上の合成を同時に行う
ことが可能である。Houghtenら,前掲5134。
本発明のエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは,当業者によく知
られた方法にしたがって抗体を誘導するために使用する。例えばSutcliffeら,
前掲、Wilsonら,前掲、Chow,M.ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 82:910-914;
およびBittle,F.J.ら,J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)参照。一般に、動
物を遊離のペプチドで免疫する;但し、抗ペプチド抗体力価は、ペプチドをキー
ホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)または破傷風トキソイドのような
巨大分子担体にカップリングすることによりブーストすることができる。例えば
、ペプチドが含んでいるシステインをm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル(MBS)のようなリンカーを用いて担体にカップリ
ングすることができるが、他のペプチドをグルタルアルデヒドのようなより一般
的な連結剤を用いて担体にカップリングすることができる。ウサギ、ラットおよ
びマウスなどの動物は、遊離または担体とカップリングしたペプチド、例えば約
100μgのペプチドまたは担体タンパク質およびフロイントアジュバントを含
むエマルジョンの腹腔内および/または皮内注射によって免疫する。例えば固体
表面に吸着させた遊離のペプチドを用いるELISA分析によって検出し得る抗
ペプチド抗体の有効な力価を得るために、例えば約2週間おきで、数回のブース
ター注射をすることが必要かもしれない。免疫された動物に由来する血清中の抗
ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択、例えば、当分野でよく知られた
方法に従う固体の担持体への吸着と選択された抗体の溶出によって、増加させる
ことができる。
本発明の免疫原エピトープを有するペプチド、即ちタンパク質全体が免疫原で
ある場合に抗体応答を引き起こすタンパク質の一部は、当分野で知られた方法に
したがって同定する。例えば、前掲のGeysenら,1984は、酵素結合免疫吸着アッ
セイにおいて反応するに十分な純度の数百個のペプチドの、固体担持体上での迅
速な同時合成(rapid concurrent synthesis)のための方法を開示している。次
いで、抗体と合成されたペプチドの相互作用を、担持体から脱離することなく容
易に検出する。この方法では、所望のタンパク質の免疫原エピトープを有するペ
プチドは、当業者によって常套的に同定することができる。例えば、***ウイ
ルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、Geysenらに
よって所在が決定され、そのタンパク質の213アミノ酸の全アミノ酸配列をカ
バーしている全部で208個の可能性のあるヘキサペプチドのオーバーラップし
ている組を合成することによって、7つのアミノ酸であると結論づけられた。次
いで、20のアミノ酸すべてがそのエピトープ内のすべての位置で代わる代わる
置換されている、ペプチドの完全な置換のセットを合成し、抗体との反応の特異
性を与えている特定のアミノ酸を決定した。このように、本発明のエピトープを
有するペプチドのペプチドアナログをこの方法により常套的に作ることができる
。Geysen(1987)の米国特許第4,708,781号は、さらに所望のタンパク質
の免疫原エピトープを有するペプチドを同定する方法を記載している。
さらに、Geysen(1990)の米国特許第5,194,392号にも、目的の抗体の
特定のパラトープ(抗原結合部位)に相補的なエピトープ(即ち「ミモトープ」
)のトポロジー的な等価物であるモノマー(アミノ酸または他の化合物)の配列
を検出または決定する一般的な方法が開示されている。より一般的には、Geysen
(1989)の米国特許第4,433,092号は、目的の特定のレセプターのリガン
ド結合部位に相補的なリガンドのトポロジー的な等価物であるモノマーの配列を
検出または決定する方法を記載している。同様に、プレアルキル化オリゴペプチ
ド混合物に関するHougthen,R.A.ら(1996)の米国特許第5,480,971号は
、直鎖状C1−C7アルキルのプレアルキル化されたオリゴペプチドおよびそのよ
うなペプチドのセットおよびライブラリー、並びに目的のアクセプター分子に優
先的に結合するプレアルキル化されたオリゴペプチドの配列を決定するためのそ
のようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを用いる方法を開示している
。このように、本発明のエピトープを有しているペプチドの非ペプチドアナログ
もまた、これらの方法によって常套的に製造することができる。
本願発明者は、CD33様タンパク質が3つの主要な構造領域を示している5
51残基のタンパク質であることを発見した。第1に、細胞外領域(リガンド結
合領域を含む)は、第1図(配列番号2)の約16〜422番の残基において同
定された。成熟細胞外領域は、発明者によって長さが約407アミノ酸で分子量
が約45kDaであると推定された。第2に、膜貫通領域は、第1図(配列番号
2)の約423〜464番の残基において同定された。第3に、細胞内領域は、
第1図(配列番号2)の約465〜551番の残基において同定された。このよ
うに、本発明はさらに、以下から選択されるポリペプチドを含む好ましいCD3
3様タンパク質断片を提供する:成熟CD33様タンパク質;CD33様タンパ
ク質細胞外領域;CD33様タンパク質膜貫通領域;CD33様タンパク質細胞
内領域;または膜貫通領域の一部または全部が削除されているCD33様タンパ
ク質細胞外領域と細胞内領域。このようなCD33様タンパク質断片を製造する
ための方法は上に記載されている。
レセプターの細胞外領域を、免疫グロブリン(IgG)の定常領域の一部と合
し、キメラポリペプチドを得ることができる。これらの融合タンパク質はしばし
ばin vivoで半減期の増加を示す。このことは、例えば、ヒトのCD4ポリペプ
チドの最初の2つの領域と哺乳類の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域
の様々な領域とからなるキメラタンパク質について証明されている(欧州特許出
願公開第394,827号;Trauneckerら,Nature 331:84-86(1988))。IgG
部分のために、ジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質は、モ
ノマーの細胞外領域単独と比較して、リガンドの結合と中和においてより効果的
であり得る(Fountoulakisら,J.Biochem.270:3958-3964(1995))。
以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドおよびその断片は、以下
に記載するようなCD33様タンパク質発現を検出するための診断的分析におい
て、またはCD33様タンパク質の機能を増強または阻害することができるアゴ
ニストおよびアンタゴニストとして有用であるポリクローナルおよびモノクロー
ナル抗体を惹起するために使用し得る。さらに、このようなポリペプチドを酵母
2ハイブリッド系において使用し、本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト候
補でもあるCD33様タンパク質結合タンパクを「捕捉」することができる。酵
母2ハイブリッド系は、FieldsおよびSong,Nature 340:245-246(1989)に記載さ
れている。
この「CD33様ポリペプチドおよび断片」の節において引用した各文献の開
示全体は、参考のため本明細書の一部を構成する。
腫瘍性および炎症性疾患の診断と予後
腫瘍性または炎症性疾患に冒された哺乳類のある種の組織は、対応する「標準
の」哺乳類、即ち腫瘍性または炎症性疾患に冒されていない同じ種の哺乳類と比
較して、有意に増加したCD33様タンパク質遺伝子のコピー数を含み、有意に
増加したレベルのCD33様タンパク質とCD33様タンパク質をコードするm
RNAを発現すると考えられている。CD33様タンパク質の増加したレベルは
、腫瘍性または炎症性疾患に冒されていない同じ種の哺乳類から得られた血清と
比較したとき、腫瘍性または炎症性疾患に冒された哺乳類から得られたある種の
体液(例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液)において検出されるであろう
。このように、本発明は、腫瘍性または炎症性疾患の診断において有用な方法を
提供し、その方法は、哺乳類細胞または体液におけるCD33様タンパク質をコ
ードする遺伝子の発現レベルまたは遺伝子コピー数を分析すること、およびその
遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数を標準のCD33様タンパク質遺伝子発
現レベルまたは遺伝子コピー数と比較することを含み、それによって標準に対す
る遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数の増加が、ある種の腫瘍性または炎症
性疾患の指標になる。
腫瘍性または炎症性疾患の診断が慣用的な方法にしたがって既に行われている
場合、本発明は予後の指標として有用である。例えば、骨髄または末梢血の試料
を、あらかじめ白血病と診断された患者から採取し、抗CD33様タンパク質モ
ノクローナル抗体を用いてCD33様タンパク質発現に関する試験のための白血
病芽球を得ることができる。正常な骨髄細胞の分化のレベルを、発現したCD3
3様タンパク質抗原の濃度が反映すると考えられるので、試料をCD33−ブラ
イト(未成熟)対CD33−ダル(成熟)として分類し得る。その白血病芽球が
、未成熟の骨髄細胞に関連した量でCD33様タンパク質抗原を示している患者
は、より成熟した細胞に関連した表現型(即ち、比較的低いCD33様タンパク
質発現レベル)を発現している白血病芽球を有する患者よりも悪い臨床的結果を
経験するであろう。
「CD33様タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを分析すること」と
は、第1の生物学的試料におけるCD33様タンパク質のレベルまたはCD33
様タンパク質をコードするmRNAのレベルを、直接的(例えば、絶対的なタン
パク質レベルまたはmRNAレベルを決定または推定すること)または相対的(
例えば、第2の生物学的試料におけるCD33様タンパク質レベルまたはmRN
Aレベルと比較すること)に、質的または量的に測定または推定することを意図
する。「CD33様タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を分析すること」
とは、第1の生物学的試料における遺伝子コピー数を、直接的(例えば、絶対的
な遺伝子コピー数を決定または推定すること)または相対的(第2の生物学的試
料におけるCD33様タンパク質遺伝子コピー数と比較すること)に、質的また
は量的に測定または推定することを意図する。
好ましくは、CD33様タンパク質レベル、mRNAレベル、または第1の生
物学的試料における遺伝子コピー数を測定または推定し、標準のCD33様タン
パク質レベル、mRNAレベル、または遺伝子コピー数と比較する。標準は、腫
瘍性または炎症性疾患でない人から得られた第2の生物学的試料から採取された
ものである。あるいは、予後の指標としてその方法を使用する場合は、第1およ
び第2の生物学的試料は両方とも、腫瘍性または炎症性疾患を有する人から採取
することができ、相対的な発現レベルまたはコピー数を予後を決定するために測
定する。当分野において認識されるように、標準のCD33様タンパク質レベル
、mRNAレベル、または遺伝子コピー数が分かれば、それを比較のための標準
として反復的に使用することができる。
「生物学的な試料」とは、個人、細胞系、培養組織、またはCD33様タンパ
ク質またはmRNAを含む他の供給源から得られるいずれかの生物学的試料を意
図する。生物学的試料には、選択された成熟CD33様タンパク質またはその可
溶性細胞外領域を含む哺乳類の体液(血清、血漿、尿、滑液および髄液など)、
好酸球、脾臓組織、単球、好中球、扁桃および骨髄が含まれる。哺乳類から組織
生検および体液を得るための方法は当分野においてよく知られている。生物学的
試料がmRNAを含む場合、組織生検は好ましい供給源である。
本発明は、哺乳類における腫瘍性または炎症性疾患を検出するのに有用である
。特に本発明は、哺乳類における以下のタイプの腫瘍性または炎症性疾患の診断
または予後において有用である:転移性腫瘍、白血病、リンパ腫、関節炎、およ
びアレルギー性疾患。好ましい哺乳類には、モンキー、エープ、ネコ、イヌ、ウ
シ、
ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが含まれる。好ましいのはヒトである。
細胞の総RNAは、ChomoczynskiおよびSacchi,Anal.Biochem.162:156-159
(1987)に記載されている1段階のグアニジウム−チオシアネート−フェノールク
ロロホルム法などのいずれかの適当な技術を用いて生物学的な試料から単離し得
る。次いで、CD33様タンパク質をコードするmRNAのレベルを、いずれか
の適当な方法を用いて分析する。これらには、ノーザンブッロティング分析、S
1ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリメラーゼ連
鎖反応と組合わせた逆転写(RT−PCR)、およびリガーゼ連鎖反応と組合わ
せた逆転写(RT−LCR)が含まれる。
ノーザンブロッティング分析は、Haradaら,Cell 63:303-312(1990)に記載さ
れているように行うことができる。簡潔に言えば、上記のように全RNAを生物
学的試料から調製する。ノーザンブロッティングに関しては、適当な緩衝液(グ
リオキサル/ジメチルスルホキシド/リン酸ナトリウム緩衝液)中でRNAを変
性させて、アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースフィルター上に移
す。UVリンカーによりRNAがフィルターに結合した後、フィルターをホルム
アミド、SSC、Denhardt's溶液、変性サケ***、SDS、およびリン酸ナトリ
ウム緩衝液を含む溶液中でプレハイブリッド形成させる。いずれかの適当な方法
(32P−多重プライム(multiprimed)DNA標識システム(Amersham))にし
たがって標識したCD33様タンパク質cDNAをプローブとして使用する。一
晩ハイブリッド形成させた後、フィルターを洗浄してX線フィルムに感光させる
。本発明にしたがってプローブとして使用するためのcDNAは、上の節に記載
されており、好ましくは少なくとも15bpの長さであろう。
S1マッピングは、Fujitaら,Cell 49:357-367(1987)に記載されているよう
に行うことができる。S1マッピングに使用するためのプローブDNAを調製す
るために、上記cDNAのセンス鎖をテンプレートとして使用して標識されたア
ンチセンスDNAを合成する。次いで、アンチセンスDNAを適当な制限エンド
ヌクレアーゼを用いて消化し、所望の長さの更なるDNAプローブを作成する。
このようなアンチセンスプローブは、標的mRNA(即ち、CD33様タンパク
質をコードするmRNA)に対応する保護されたバンドを視覚化するのに有用で
ある。ノーザンブロッティング分析は上記のとおりに行う。
好ましくは、CD33様タンパク質をコードするmRNAのレベルを、Makino
ら,Technique 2:295-301(1990)に記載されているRT−PCR法を用いて分析
する。この方法によれば、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン」
の放射能は、標的mRNAの始めの濃度と直線的に相関する。簡潔に言えば、こ
の方法は、生物学的試料から単離された全RNAを、RTプライマーと適当な緩
衝液を含む反応混合物に加えることを含む。プライマーのアニーリングのために
インキュベーションした後、混合物にRT緩衝液、dNTP、DTT、RNas
e阻害剤および逆転写酵素を加える。インキュベーションしてRNAの逆転写を
達成させた後、RT生成物を標識プライマーを用いるPCRに付す。あるいは、
プライマーを標識するよりはむしろ、標識したdNTPをPCR反応混合物に入
れる。PCR増幅は、慣用の技術にしたがってDNAサーマルサイクラーで行う
ことができる。適当な回数を行って増幅した後、PCR反応混合物をポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動する。ゲルを乾燥させた後、適当なバンド(CD33様
タンパク質をコードするmRNAに対応する)の放射能をイメージングアナライ
ザーを用いて定量する。RTおよびPCR反応成分と条件、試薬およびゲル濃度
、および標識法は当分野でよく知られている。RT−PCR法に対する変更は、
当業者には明らかであろう。
逆転写された標的mRNAを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーのいず
れかの組は、上の節で記載したように使用し設計することができる。
CD33様タンパク質遺伝子コピー数の分析は、例えば、組織試料と上記のc
DNAプローブとのin situハイブリット形成のようないずれかの既知の技術に
したがって行うことができる。
生物学的試料におけるCD33様タンパク質レベルの分析は、当分野で知られ
たいずれかの方法を用いて行うことができる。生物学的試料中のCD33様タン
パク質レベルの分析に好ましいのは、抗体に基づいた技術である。例えば、組織
におけるCD33様タンパク質発現を古典的な免疫組織学的方法で調べることが
できる。これら方法では、特異的な認識は一次抗体(ポリクローナルまたはモノ
クローナル)によってもたらされ、二次的な検出系は、蛍光、酵素または他のコ
ンジュゲート二次抗体を使用し得る。結果として、病理学的試験のための組織片
の免疫組織学的な染色が得られる。ウェスタンブロットまたはドット/スロット
アッセイのためのCD33様タンパク質の遊離のために、例えば尿素や中性洗剤
で組織を抽出することもできる(Jalkanen,M.ら,J Cell.Biol.101:976-985(
1985));Jalkanen,M.ら,J Cell.Biol.105:3087-3096(1987)。陽イオン性
の固相の使用に基づくこの技術では、単離されたCD33様タンパク質を標準と
して用い、CD33様タンパク質の定量を行うことができる。この技術はまた、
体液にも使用することができる。これらの試料に関して、CD33様タンパク質
のモル濃度が、血清、血漿、尿、滑液などの異なる体液についてのCD33様タ
ンパク質含量の標準値を設定する手助けどなるであろう。次いで、CD33様タ
ンパク質量の正常な様相は、健康な人から得られる数値を使用して設定すること
ができ、それを被検者から得られた値と比較することができる。
CD33様タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な抗体に基づく他の方
法には、酵素を結合した免疫吸着分析(ELISA)およびラジオイムノアッセ
イ(RIA)のようなイムノアッセイが含まれる。例えば、CD33様タンパク
質特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤および酵素標識されたプローブの両
方として使用し、CD33様タンパク質を検出および定量することができる。試
料中に存在するCD33様タンパク質の量は、回帰直線コンピュータアルゴリズ
ムを用いて標準の調製物に存在する量を参照して計算することができる。腫瘍抗
原を検出するためのこのようなELISAは、Iacobelliら,Breast Cancer Res
earch and Treatment 11:19-30(1988)に記載されている。別のELISA分析で
は、2つの別個の特定のモノクローナル抗体を使用して、体液中のCD33様タ
ンパク質を検出することができる。この分析では、1つの抗体を免疫吸着剤とし
て使用し、他方の抗体を酵素標識プローブとして使用する。
上記技術は、本質的に「一段階」または「二段階」の分析として行うことがで
きる。「一段階」の分析は、CD33様タンパク質を固定化された抗体に接触さ
せ、洗浄することなくその混合物を標識抗体と接触させることを含む。「二段階
」の分析は、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の慣用
的な方法も適当に使用することができる。分析系の1つの成分を担持体に固定化
することが通常望ましく、それによって分析系の他の成分がその成分と接触して
試料から容易に脱離することが可能になる。
適当な酵素標識には、例えば、基質と反応することによって過酸化水素の生成
を触媒するオキシダーゼ群の酵素が含まれる。グルコースオキシダーゼは、安定
性に優れ、その基質(グルコース)が容易に入手できるため特に好ましい。オキ
シダーゼの活性のレベルは、酵素標識された抗体と基質の反応によって形成した
過酸化水素の濃度を測定することによって分析することができる。酵素以外のほ
かに、他の適当な標識には、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、イオウ(35
S)、重水素(3H)、インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc
)などの放射性同位体、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識および
ビオチンが含まれる。
人から得られた生物学的試料中のCD33様タンパク質レベルの分析に加えて
、CD33様タンパク質は、造影によってin vivoで検出することもできる。C
D33様タンパク質のin vivo造影のための抗体標識またはマーカーには、X線
ラジオグラフィー、NMRまたはESRによって検出可能なものが含まれる。例
えば、X線ラジオグラフィーについては、適当な標識には、検出可能な放射線を
放射するが患者に対しては際立って有害ではない、バリウムまたはセシウムのよ
うな放射性同位元素が含まれる。NMRおよびESRのための適当なマーカーに
は、重水素のような検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれ、それらは
、関連するハイブリドーマのための栄養素を標識することによって抗体中に組み
込むことができる。
適当な検出可能な造影用部分、例えば放射性同位元素(例えば、131I、112I
n、99mTc)、放射能不伝導性(radio-opaque)の物質、または核磁気共鳴に
よって検出可能な物質などで標識されたCD33様タンパク質特異的な抗体また
は抗体断片を、腫瘍を検査する哺乳類に投与する(例えば、非経口、皮下または
腹腔内投与)。患者の大きさおよび使用する造影系によって診断用画像を作成す
るに必要な造影用部分の量が決まるであろうということは当分野において理解さ
れよう。放射性同位元素部分の場合、ヒトの患者に関し、注射される放射能の量
は普通約5〜20マイクロキュリーの範囲の99mTcである。標識された抗体
または抗体断片は、CD33様タンパク質を含む細胞の場所に選択的に蓄積され
るであろう。in vivo腫瘍造影は、S.W.Burchielら,“Immunopharmacokinetics
of Radiolabelled Antibodies and Their Fragments”(Tumor imagingの第1
3章:The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.BurchielおよびB.A.Rho
des編,Masson Publising Inc.(1982))に記載されている。
本発明において使用するためのCD33様タンパク質に特異的な抗体は完全な
CD33様タンパク質またはその抗原性ポリペプチド断片に対して惹起し得る。
それらは、アルブミンなどの担体タンパク質と一緒に動物系(ウサギまたはマウ
スなど)に提示してもよく、または十分に長い(少なくとも約25アミノ酸)場
合は担体なしで提示してもよい。
本明細書に使用される「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Ma
b)は、CD33様タンパク質に特異的に結合することができる完全な分子並び
に抗体断片(例えばFabおよびF(ab')2断片)を意味し包含する。Fabお
よびF(ab')2断片は、完全な抗体のFc断片を欠いており、循環からより迅速に
除去され、完全な抗体の非特異的な組織の結合がより少ないであろう(Wahlら,
J Nucl.Med.24:316-325(1983))。このように、これらの断片は好ましい。
本発明の抗体は、様々な方法のいずれかによって製造することができる。例え
ば、CD33様タンパク質またはその抗原性断片を発現している細胞を、ポリク
ローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与することができる。
好ましい方法では、CD33様タンパク質の調製物を調製し、精製してその調製
物が実質的に天然の不純物を含まないようにする。次いで、そのような調製物を
より高い比活性のポリクローナル抗血清を産生させるために動物に投与する。
最も好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である(またはそ
のCD33様タンパク質結合断片)。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブ
リドーマ技術を用いて製造することができる(Kohlerら,Nature 266:495(1975)
;Kohlerら,Eur.J.Immunol.6:511(1976);Kohlerら,Eur.J.Immunol.6:2
92(1976);Hammerlingら,In:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybriomas,E
lsevier,N.Y.,pp.563-681(1981))。一般に、そのような方法は、動
物(好ましくはマウス)をCD33様タンパク質抗原、またはより好ましくはC
D33様タンパク質発現細胞で免疫する。適当な細胞は、抗CD33様タンパク
質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。そのような細胞は、いず
れかの適当な組織培地で培養できる。しかし、10%ウシ胎児血清(約56℃で
不活性化した)、および約10μg/Lの非必須アミノ酸、約1000U/mLのペ
ニシリン、および約100μg/mLのストレプトマイシンを添加したEagleの改
変Eagle培地で細胞を培養するのが好ましい。,そのようなマウスの脾細胞を抽
出し、適当な骨髄腫細胞系と融合する。いずれかの骨髄腫細胞系が本発明に従っ
て使用できる。しかし、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル
、メリーランドから入手可能なペアレント骨髄腫細胞系(SP2O)を使用する
ことが好ましい。融合した後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地で選択
的に維持され、次いでWandsら,(Gastroenterology 80:225-232(1981))に記載さ
れているように限界希釈によりクローニングする。そのような選択によって得ら
れたハイブリドーマ細胞を分析してCD33様タンパク質抗原に結合することが
できる抗体を分泌するクローンを同定する。
あるいは、CD33様タンパク質抗原に結合することが可能な更なる抗体を、
抗イディオタイプの抗体を使用する2段階の方法で製造することができる。その
ような方法は、抗体がそれ自身抗原であるという事実を用いるものであり、従っ
て第2の抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法によれば、CD
33様タンパク質特異的抗体を使用して動物、好ましくはマウスを免疫する。次
いで、そのような動物の脾細胞を使用してハイブリドーマ細胞を調製し、そのハ
イブリドーマ細胞をスクリーニングし、CD33様タンパク質特異的抗体と結合
するその抗体の能力が、CD33様タンパク質抗原によってブロックされ得る抗
体を産生しているクローンを同定する。そのような抗体は、CD33様タンパク
質特異的抗体に対する抗イディオタイプの抗体を含み、動物の免疫に使用して更
なるCD33様タンパク質特異的抗体の形成を誘導することができる。
FabおよびF(ab’)2および本発明の抗体の他の断片は、本明細書に記載
の方法に従って使用することができる。そのような断片は、パパイン(Fab断
片を生成する)またはペプシン(F(ab’)2断片を生成する)のような酵素を
用いてタンパク質加水分解的開裂によって典型的に製造する。あるいは、CD3
3様タンパク質結合断片を、組換えDNA技術を適用することによりまたは化学
的に合成することにより製造することができる。
in vivo造影を、ヒトにおける腫瘍診断のため、CD33様タンパク質の増加
したレベルを検出するために使用する場合は、「ヒト化した」キメラモノクロー
ナル抗体を使用するのが好ましいであろう。このような抗体は、上記モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られる遺伝的構築物を使用して製
造し得る。キメラ抗体を製造する方法は、当分野で知られている。例えば、Morr
ison,Science 229:1202(1985);Oiら,BioTechniques 4:214(1986);Cabillyら
,米国特許第4,816,567号;Tanigutiら,EP171496;Morrisonら
,EP173494;Neubergerら,WO8601533;Robinsonら,WO8
702671;Boulianneら,Nature 312:643(1984);Neubergerら,Nature 314
:268(1985)を参照。
本発明のCD33様タンパク質特異的抗体のための更なる適当な標識を以下に
記載する。適当な酵素標識の例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコ
ッカスヌクレアーゼ、Δ5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロ
ゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル
コースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、
カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、お
よびアセチルコリンエステラーゼ。
適当な放射性同位元素標識の例には、3H、111In、125I、131I、32P、35
S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu
、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pdなどが含まれる。111Inは、
肝臓による125Iまたは131I標識されたモノクローナル抗体の脱ハロゲン化の問
題を回避するので、in vivo造影を使用する場合、好ましい放射性同位体である
。さらに、この放射性ヌクレオチドは、造影にとってより好ましいガンマ線放射
エネルギーを有する(Perkinsら,Eur.J.Nucl.Med.10:296-301(1085);Cara
squilloら,J.Nucl.Med.28:281-287(1987))。例えば、1−
(P−イソチオシアナトベンジル)−DPTAによってモノクローナル抗体にカ
ップリングした111Inは、非腫瘍性組織、特に肝臓にはほとんど取り込まれな
いことが示されており、従って腫瘍の所在に対する特異性が高まる(Estebanら
,J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。
適当な非放射性同元素標識の例には、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、お
よび56Feが含まれる。
適当な蛍光標識の例には、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシア
ネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、ア
ロフィコシアニン標識、o−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識
が含まれる。
適当なトキシン標識の例には、ジフテリアトキシン、リシン、およびコレラト
キシンが含まれる。
化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリ
ジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エ
ステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識が含まれ
る。
核磁気共鳴造影剤の例には、Gd、Mnおよび鉄などの重金属核が含まれる。
上記の標識を抗体に結合するための典型的な技術は、Kennedyら,(Clin.Chi
m.Acta 70:1-31(1976))、およびSchursら,(Clin.Chim.Acta 81:1-40(1977
))に記載されている。後者で述べられているカップリング技術は、グルタルア
ルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、m−マレイミドベンジル−N−
ヒドロキシ−サクシンイミドエステル法であり、それら方法はすべて参考のため
に本明細書の一部を構成する。
治療法
CD33は、急性骨髄性白血病(AML)患者の約90%に由来するクローン
産生性の白血病細胞により発現する。AMLを患っている成人の約60〜70%
は、化学療法後に完全寛解を経験するがとはいえ、これら患者の大多数は白血病
の再発により結局死亡する(Robertsonら,Blood 79:2229-2236(1992))。C
D33と同様、本発明のCD33様タンパク質も、AMLの患者の大多数に由来
するクローン産生性の白血病細胞により発現すると考えられる。
患者が同種骨髄移植により処置される場合は、寛解後の治療がよりうまくいく
。しかし、この治療様式はしばしば、患者の年齢のために、または適当なドナー
がいないために、人によってはできない。それに代わる処置は、患者が寛解にあ
る間に採取した自己の骨髄を使用するものである。しかし、白血病細胞が残存し
ていると、そのような同種移植はその患者に再発を招着得るであろう。従って、
進行したAML患者の自己移植組織から白血病細胞を除去する方法に対する必要
性がある。そのような方法は、腫瘍細胞を選択的に除きまたは除去するが生着に
必要な造血幹細胞は許容することが可能な細胞毒性物質の使用を理想的には含む
。研究により、白血球細胞の大部分は持続的な複製ができないことが証明されて
いる。しかし、これらの細胞は、他の細胞とは異なった表面抗原表現型を有する
と思われる、即ち、本発明のCD33様タンパク質抗原を欠損していると考えら
れる、少数の白血病性の「幹細胞」によって生じる。
本発明によって、白血病性の造血細胞をAML患者の自己移植組織から除去す
るための方法が提供される。この方法は、AML患者から、例えば後部腸骨骨稜
からの経皮吸引によって骨髄(BM)を得、Ficollhypaque密度勾配遠心法によ
りBM単核細胞を単離し、抗CD33様タンパク質モノクローナル抗体(MoA
B)と、例えば3〜5回、15〜30分間、4〜6℃でインキュベーションした
後、ウサギ補体と約37℃で30分間インキュベーションすることを含む(至適
の特異的な細胞毒性について試験したウサギ補体は、Royら,Leuk.Res 14:407
(1990)に記載されているように得ることができる)。次いで患者を、Robertson
ら,Blood 79(9):2229(1992)に記載されているように骨髄除去化学療法(myeloa
blative chemotherapy)に付した後、処置した自己のBMを標準的な技術に従っ
て再輸液する。本発明によれば、生着に必要な造血細胞が許容されると同時にク
ローン産生性の腫瘍細胞が骨髄から除かれる。
更なる態様では、本発明は、本発明のCD33様タンパク質抗原を発現してい
る腫瘍細胞を選択的に殺傷またはその増殖を阻害するためのin vivoの方法を提
供する。そのような腫瘍細胞には、転移性の腫瘍、白血病およびリンパ腫が含
まれる。その方法は、CD33様タンパク質レセプターのシグナル伝達経路を阻
害する有効量のアンタゴニストを患者に投与することを含む。本発明によれば、
患者へのそのようなCD33様タンパク質のアンタゴニストの投与はまた、関節
炎および大腸炎を含む炎症性の疾患を処置するのに有用である。
本発明において使用するアンタゴニストには、CD33様ポリペプチドまたは
その断片に対して惹起されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれ
る。CD33様ポリペプチドに対して惹起されるそのようなアンタゴニスト抗体
は、Caronら,Cancer Research 52:6761(1992);Juricら,Cancer Research(Su
ppl.)55:5908s-5910s(1995);Robertsonら,Blood 79:2229-2236(1992)に記
載されているように製造することができる。
その他の可能性のあるアンタゴニストには、アンチセンス分子が含まれる。ア
ンチセンス技術を使用して、アンチセンスDNAまたはRNAによってまたは三
重らせんの形成によって遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技術
は、例えば、Okano,J.,Neurochem.156:560(1990);Oligodeoxynucleotidesas
Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988
)に記載されている。三重らせん形成は、例えば、Leeら,Nucleic Acids Reserc
h 6:3073(1979);Conneyら,Science 241:456(1988);Dervanら,Science 251:1
360(1991)に記載されている。その方法は、ポリヌクレオチドの相補的DNAま
たはRNAへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟タンパク質をコード
するボリヌクレオチドの5'コード部分を使用して、約10〜40塩基対の長さ
のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計することができる。DNAオリ
ゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計し、
それにより転写とレセプターの産生を阻止する。アンチセンスRNAオリゴヌク
レオチドは、in vivoでmRNAとハイブリダイズし、mRNA分子のレセプタ
ーポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、ア
ンチセンスRNAまたはDNAがin vivoで発現してレセプターの産生を阻害し
得るように細胞へ送達することができる。
本発明の更なるアンタゴニストには、CD33様タンパク質の可溶性の形態、
即ち、完全長のレセプターの細胞外領域を含むCD33様タンパク質断片が含ま
れる。レセプターのそのような可溶性の形態は、天然のものでも合成されたもの
でもよく、CD33レセプターリガンドに対する結合に関して細胞表面のCD3
3様タンパク質と競合することにより、シグナル伝達を媒介するCD33様タン
パク質を拮抗する。
示すとおり、本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体アンタゴニス
トは、WO93/20848および米国特許第5,239,062号に記載されて
いる方法に従って惹起することができる。本明細書中で使用される「抗体」(A
b)または「モノクローナル抗体」(mAb)なる語は、抗原と結合することが
できる完全な分子並びにその断片(例えば、FabおよびF(ab')2断片など)
を含むことを意味する。FabおよびF(ab')2断片は、完全な抗体のFc断片
を欠いており、より迅速に循環から除かれ、完全な抗体の非特異的な組織結合を
少なくできる(Wahlら,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。
本発明の抗体は、本発明のCD33様タンパク質免疫原を使用して様々な方法
のいずれかによって製造することができる。示すように、そのようなCD33様
タンパク質免疫原には、完全長のCD33様タンパク質ポリペプチド(リーダー
配列を含んでいてもいなくてもよい)および細胞外領域、膜貫通領域、および細
胞内領域などのCD33様タンパク質ポリペプチド断片が含まれる。
好ましい方法では、本発明の抗体はMoAbである。そのようなMoAbは、
上記のハイブリドーマ技術を用いて製造することができる(KohlerおよびMilstei
n,Nature 256:495-497(1975)および米国特許第4,376,110号;Harlowら
,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,C
old Spring Harbor,NY,1988;Monoclonal Antibodies and Hybridomas:A New D
imension in Biological Analyses,Plenum Press,New York,NY,1980;Campb
ell,“Monoclonal Antibody Technology,”In:Laboratory Techniques in Bioc
hemistry and Molecular Biology,Volume 13(Burdonら編),Elsevier,Amsterd
am(1984))。
さらに本発明の範囲内であると意図されるのは、上記のmAbを産生するハイ
ブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用して製造されるヒト化されたキメ
ラ抗体である。キメラ抗体の製造方法は当分野において知られている。Morrison
ら,Science 229:1202-1207(1985);Oiら,BioTechniques 4:214(1986)を参照;
さらにCabillyら,米国特許第4,816,567号(3/28/89);Taniguchiら,EP
O特許公開EP171496号(2/19/86);Morrisonら,EPO特許公開EP17
3494号(3/5/86);Neubergerら,PCT公開WO8601533号(3/13/86)
;Robinsonら,PCT公開WO8702671号(5/7/87);Boulianneら,Nature
312:643-646(1984);Neubergerら,Nature 314:268-270(1985)を参照。
抗CD33様タンパク質ヒト化MoAbを製造するための特に好ましい方法は
、Caronら,Cancer Res 52:6761(1992)に記載されている。
CD33様タンパク質領域に結合するタンパク質およびその他の化合物も、本
発明のアンタゴニスト候補である。そのような結合化合物は、酵母2ハイブリッ
ドシステムを使用して「捕捉」することができる(FieldsおよびSong,Nature 3
40:245-246(1989))。酵母2ハイブリッドシステムの改良法は、Roger Brentお
よび彼の同僚(Gyuris,J.ら,Cell 75:791-803(1993);Zervos,A.S.ら,Cell 7
2:223-232(1993))によって記載されている。簡潔に言えば、CD33様ポリペプ
チドの領域を、結合化合物のおとり(bait)として使用する。次いで、陽性のも
のを、過去に非常に詳細に記載されたとおりに(Gyuris,J.ら,Cell 75:791-803
(1993))、ロイシンを欠くプレート上で生育する能力により選択した後、X−ga
lを添加したプレート上で青く変色する能力についてさらに試験する。好ましく
は、酵母2ハイブリッドシステムを本発明に従って使用し、CD33様細胞外リ
ガンド結合領域またはCD33様タンパク質細胞内領域のいずれかに結合する化
合物を捕捉する。そのような化合物は、本発明のアンタゴニストの優秀な候補で
ある。このシステムは、p55およびp75TNFレセプターの細胞内領域に結
合するタンパク質を単離するために以前使用された(95/31544)。
本発明はさらに、腫瘍細胞の選択的な殺傷のためのビークルとして上記のCD
33様タンパク質結合化合物を使用する方法を提供する。
CD33様タンパク質に対する結合化合物の特異性は、それらの親和性によっ
て決定し得る。その部分の解離定数(KD=1/K、ここでKは親和性定数)が
<1μM、好ましくは<100nM、最も好ましくは<1nMであれば、そのよ
うな特異性が存在する。抗体分子は、典型的に低い範囲のKDを有するであろう
。KD=[R−L]/[R][L](ここで[R]、[L]および[R−L]は、各々、レ
セプターまたはCD33様タンパク質(R)、リガンド、抗体またはペプチド(
L)、およびレセプター−リガンド複合体(R−L)の、平衡における濃度であ
る)。典型的には、リガンドまたはペプチドとレセプターまたは抗体との間の結
合の相互作用には、静電気相互作用、ファンデルワールス力、および水素結合な
どの可逆性の非共有結合が含まれる。
その他の分析形式には、Receptor-Effector Coupring-A Practical Approach
,Hulme編,IRL Press,Oxford(1990)に記載されているような、下方調節(down
modulation)、インターナリゼーション(internalization)、またはリン酸化の増
加などの相互作用から生じる様々な生理学的または化学的変化の存在または不在
の検出を含み得る。
ゲロニンは、Gelonium multiforumの種子から精製された糖タンパク質である
(分子量約29〜30,000Kd)。ゲロニンは、強力なリボソーム不活性化
植物毒素のクラスに属する。リボーム不活性化植物毒素のこのクラスのその他の
構成員はアブリン、リシンおよびモデクシン(modeccin)の鎖である。ゲロニン
は、アブリンおよびリシンと同様、哺乳類リボソームの60Sサブユニットに損
傷を与えることにより、タンパク質合成を阻害する。ゲロニンは、化学的および
物理的な処理に対して安定であるようである。さらに、ゲロニン自身は細胞に結
合しないために非毒性であり(高濃度である場合を除いて)、実験室で扱うには
安全である。リボソームの不活性化は、不可逆で、コファクターは関与していな
いようであり、ゲロニンが酵素的に作用していることを示唆する効率で生じる。
タンパク質の重量に基づけば、ゲロニンおよびリシンは、タンパク質合成を阻
害する最も活性な毒素の1つである。ゲロニンは、タンパク質合成の阻害におい
て、リシンA鎖に比べて10〜1000倍も活性である。ペプチド様のリシンお
よびアブリンは2つの鎖から構成されており、A鎖は毒性単位であり、B鎖は細
胞へ結合することによって作用する。リシンおよびアブリンと異なり、ゲロニン
は、1つの鎖から構成されており、細胞へ結合するためのB鎖を欠いているため
に、それ自身は無傷の細胞に対しては比較的毒性がない。
哺乳類細胞は、明らかに天然のゲロニン分子に結合および/またはインターナ
ライズする能力を欠いている。本発明のCD33様タンパク質結合化合物とゲロ
ニンの複合体は、ゲロニンを細胞へ結合するための特定の方法とゲロニン−結合
化合物複合体のインターナリゼーションのための経路の両方を提供する。
CD33様タンパク質結合化合物がMoAbである場合、イムノトキシンの細
胞傷害性部分は、細胞傷害剤、または細菌または植物由来の酵素的に活性な毒素
、またはそのような毒素の酵素的に活性な断片(「A鎖」)であってよい。酵素
的に活性な毒素およびその断片が好ましく、以下のものが例示される:ゲロニン
、ジフテリアA鎖、ジフテリアトキシンの非結合性の活性断片、エキソトキシン
A鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン
A鎖、αサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phyt
ojacca americanaタンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP−S)、mo
mordica charantiaインヒビター、クルシン、クロチン、サポナリア、officinal
isインヒビター、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノ
マイシン。最も好ましいのはゲロニンとの複合体である。
抗CD33様タンパク質MoAbとカップリングしてイムノトキシンを形成し
得る生物学的応答修飾因子には、IL−1、IL−2、インターフェロン(α、
βまたはγ)、TNF、LT、TGF−βおよびIL−6などのリンホカインお
よびサイトカインが含まれるがこれらに限られない。これらの生物学的応答修飾
因子は、腫瘍細胞に対して様々な作用を有する。それらの作用には、直接的作用
による腫瘍細胞殺傷の増大、並びに増大した宿主防御媒介過程による腫瘍細胞殺
傷の増大がある。これら生物学的応答修飾因子へのMoAbの複合体形成は、腫
瘍内での選択的な局在を可能にし、よって改良された抗増殖作用を可能にし、一
方非標的細胞に対する毒性に導く非特異的作用を抑制する。
本発明において有用な細胞傷害剤(およびその誘導体)には、アドリアマイシ
ン、cis-プラチニン複合体、ブレオマイシン、およびメトトレキセートが含まれ
るがこれらに限られない。これらの細胞傷害剤は、再発性の腫瘍の臨床的管理に
有用であるが、その使用は重い副作用と非標的細胞に起こる損傷を伴う。MoA
bは、腫瘍への送達と腫瘍細胞自身への侵入の増強両方の効果的手段をもたらす
、そのような薬剤の有用な担体として働く。さらに、腫瘍への細胞傷害剤の抗体
送達は、化学療法剤の有害な作用からの、CD33様タンパク質を発現しない肝
臓や骨髄幹細胞などのような感受性の部位の保護をもたらすであろう。すべての
薬剤部分が、腫瘍または白血病内部に集中する抗体にコンジュゲートされるので
、送達システムとしての担体抗体にコンジュゲートした薬剤の使用は、その薬剤
自身の用量を少なくすることができる。
モノクローナル抗体の複合体は、様々な二機能タンパク質カップリング剤を使
用して製造することができる。そのような試薬の例は、SPDP、イミノチオラ
ンテ(IT)、ジメチルアジピミデートなどのイミドエステルの二機能誘導体、
HCl、スベリン酸ジサクシンイミジルなどの活性エステル、グルタルアルデヒ
ドなどのアルデヒド、bib(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなどのbis
-アジド化合物、bi-(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミンなどのbi
s-ジアゾニウム誘導体、トリエン2,6−ジイソシアネートなどのジイソシアネ
ート、および1,5−ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなどのbis−活性フッ
素化合物である。
治療のためにin vivoで使用する場合、イムノトキシンをヒトまたは動物の患
者に治療上有効な量、即ち腫瘍部分を除去または減少させる量で、または化学療
法または放射線治療による早期の処置の後に残存した疾患を取り除く量で投与す
る。通常、非経口、好ましくは静脈投与する。用量、用法は、その白血病の性質
およびその規模、個々のイムノトキシンの特性、例えば、その治療上の指標、患
者、および患者の既往歴に依存するであろう。投与するイムノトキシンの量は、
典型的には約0.01〜約1.0mg/kg(患者の体重)の範囲であろう。
非経口投与については、イムノトキシンを薬学的に許容し得る非経口用ビーク
ルと一緒に注射可能な(溶液、懸濁液、エマルジョン)単位投与剤型に製剤化す
る。そのようなビークルは、本質的には非毒性で非治療的なものである。そのよ
うなビークルの例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストラン溶液、お
よび5%ヒト血清アルブミンである。固形油脂およびオレイン酸エチルなどの非
水性のビークルも使用できる。リボソームは担体として使用できる。ビークルは
、
同種毒性と化学的安定性を高める物質、例えば緩衝剤や保存剤などのような少量
の添加剤を含むことができる。イムノトキシンは、このようなビークル中約0.
1mg/mL〜10mg/mLの濃度で典型的に製剤化する。
本発明のイムノトキシンは、骨髄中の腫瘍細胞を殺傷する方法において使用す
ることもできる。この方法では、最初に、白血病などの腫瘍性疾患を有する人か
ら骨髄を取り出す。次いで、その骨髄を細胞破壊に効果的な用量の本発明のイム
ノトキシンで処理する。
本発明を一般的に記載したが、本発明は、説明として記載されるものであって
限定を意図するものではない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に
理解されるであろう。
実施例
実施例1:E.coliにおける発現
寄託されたポリヌクレオチドにおけるCD33様タンパク質をコードするDN
A配列を、CD33様タンパク質のアミノ酸のカルボキシ末端の配列およびその
遺伝子に対する3'のベクター配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。クローニングを助長するための制限部位を含む更なる
ヌクレオチドを5'および3'配列にそれぞれ加える。
5'オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列
5'CGCCCATGGAGAAGCCAGTGTACGAG 3'
(配列番号4)を有し、NcoI部位内で開始点のAUGをコードしている下線部
のNcoI制限部位、その後に、第1図(配列番号1)のヌクレオチド第85〜1
02番で示されるヌクレオチド配列を有するCD33様タンパク質cDNAの1
8ヌクレオチドを含んでいる。
3'プライマーは、以下の配列
5'CGCAAGCTTTCAAGAGCCGCTCTGGGACCC 3'
(配列番号5)の配列を有し、下線部のBamlHI制限部位、第1図(配列番号1
)のヌクレオチド第1285〜1302番で示されるヌクレオチド配列に相補的
なヌクレオチド配列を有するCD33様タンパク質cDNAの18ヌクレオチド
を含んでいる。
制限部位は、これら実施例において細菌での発現に使用する細菌発現ベクター
pQE−60における制限酵素部位に便利である。(Quiagen,Inc.9259 Eton
Avenue,Chatsworth,CA,91311)pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性(
「Ampr」)をコードし、細菌複製起点(「ori」)、IPTG誘導可能な
プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、6−Hisタグおよび制限
酵素部位を含んでいる。
増幅されたDNAおよびベクターpQE60を、いずれもNcoIおよびHindIII
で消化した後、互いをライゲーションする。CD33様タンパク質をコードする
増幅したcDNAをpQE60へ挿入して、そのコード領域を、ベクターのIP
TG誘導可能プロモーターの下流に、作動可能なように連結されるように、そし
てCD33様タンパク質の翻訳のために適当に位置した開始AUGとインフレー
ムに配置する。
ライゲーション混合物を、標準的な方法を用いてコンピテントE.coli細胞へ
形質転換した。そのような方法は、Sambrookら,Molecular Clonjng:A Laborato
ry Mannual,第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harb
or,N.Y.(1989)に記載されている。lacリプレッサーを発現しカナマイシン
耐性(「kanr」)を付与する、プラスミドpREP4の多重コピーを含むE
.coli M15/rep4株を、ここに記載する実施例の実施において使用する。こ
の株は、CD33様タンパク質を発現するのに適当な多くの株うちの単なる1つ
に過ぎないが、Qiagenから商業的に入手し得る。
形質転換体は、アンピシリンの存在下でLBプレートで生育する能力によって
同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、クローニングしたDN
Aのアイデンティティーを制限分析によって確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン(100μg/mL)とカナマ
イシン(25μg/mL)の両方を添加したLB培地の液体培地中で一晩(「O
/N」)培養する。
O/N培養細胞を、約1:100〜1:250に希釈して大規模培養の接種に
使用する。600nmでの光学密度(「OD600」)が0.4〜0.6になる
まで細胞を培養する。次いで、イソプロピル−B−D−チオガラクトピラノシド
(「IPTG」)を最終濃度1mMになるように加え、lacIリプレッサーを
不活性化することにより、lacリプレッサー感受性プロモーターから転写を誘
導する。次いで、細胞をさらに3〜4時間インキュベーションする。標準的な方
法により、細胞を遠心によって集め、破砕する。インクルージョンボディーを、
常套的な収集技術を用いて破砕した細胞から精製し、8M尿素中でインクルージ
ョンボディーからタンパク質を可溶化する。可溶化したタンパク質を含む8M尿
素溶液を、2×リン酸緩衝化生理食塩水(「PBS」)中、PD−10カラムに
通し、それにより尿素を除き、緩衝液を交換してタンパク質をリフォールディン
グする。発現したタンパク質を更なるクロマトグラフィー工程によって精製し、
外毒素を除く。次いで、これを滅菌ろ過する。滅菌ろ過されたタンパク質調製物
は、2×PBS中95mg/mLの濃度で保存する。
実施例2:哺乳類細胞(CHO、COSおよびその他)における発現
哺乳類細胞におけるCD33様タンパク質をコードするcDNAの一過性発現
に用いるベクターの大部分は、SV40複製起点を有する。このことにより、ウ
イルスのDNA合成の開始に必要なT抗原を発現する細胞(例えばCOS細胞)
において高いコピー数でベクターの複製が可能になる。他のいずれの哺乳類細胞
系もこの目的に使用できる。
典型的な哺乳類の発現ベクターは、mRNAの転写の開始に関与するプロモー
ターエレメント、タンパク質のコード配列、および転写の終止およびその転写物
のポリアデニル化に必要なシグナルを含んでいる。更なるエレメントには、エン
ハンサー、コザック配列、およびRNAスプライシングのための供与および受容
部位が両端にある介在配列を含んでいる。効率性の高い転写は、SV40由来の
初期および後期プロモーター、例えばRSV、HTLVI、HIVIなどのレト
ロウイルス由来の長い末端反復(LTR)、サイトメガロウイルス(CMV)の
初期プロモーターにより達成できる。しかし、細胞のシグナル(例えば、ヒトア
クチン、プロモーター)も使用できる。本発明の実践において使用するための適
当な発現ベクターには、例えば、pSVLおよびpMSG(Pharmacia,Uppsala
,
Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37
146)およびpBC12MI(ATCC67109)が含まれる。使用できる
哺乳類宿主細胞には、ヒトHela、283、H9、およびJurkart細胞、マウ
スNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1アフリカ
ミドリザル細胞、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハム
スター卵巣細胞が含まれる。
別法として、その遺伝子が染色体に組み込まれた安定な細胞系において遺伝子
を発現させることができる。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン、
などの選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは、トランスフェクトさ
れた細胞の同定と単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子を増幅して大量のコードされたタンパク質を発
現させることもできる。DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)は、目的の遺伝
子の数百さらには数千ものコピーを有する細胞系を開発するための有用なマーカ
ーである。他の有用な選択マーカーは、グルタミンシンターゼ(GS)酵素であ
る(Murphyら,Biochem J.227:277-275(1991),Bebbingtonら,Bio/Technology
10:163-175(1992))。これらのマーカーを使用して、哺乳類細胞を選択培地で
培養し、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系は、染色体に組
み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細
胞はタンパク質の製造にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー(LTR)(Cullenら,Molecular and Cellular Biology,438-4470(198
5年3月)とCMV−エンハンサーの断片(Boshartら,Cell 41:521-530(1985))
を含んでいる。例えば制限酵素開裂部位BamHI、XbalおよびAsp718の多
重クローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを助長する。ベクターはさ
らに、3'イントロン、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化およ
び終止シグナルを含む。
実施例2A:COS細胞におけるCD33様タンパク質の細胞外可溶性領域の発
現
CD33様タンパク質をコードするcDNAを発現ベクターpcDNAI/A
mp(Invitrogen,Inc.より入手できる)へクローニングすることにより発現プ
ラスミドを製造する。
発現ベクターpcDNAI/Ampは、以下のものを含んでいる:(1)E.c
oliおよび他の原核細胞における増殖に有効なE.coli複製起点;(2)プラスミ
ドを含む原核細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子;(3)真核細胞にお
ける増殖のためのSV40複製起点;(4)ポリリンカーにおける制限部位によ
って、cDNAが、CMVプロモーターの発現調節下に便利なように置かれ、S
V40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されるように
配置された、CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン、および
ポリアデニル化シグナル。
CD33様タンパク質細胞外可溶性領域をコードするDNA断片とその3'末
端へインフレームで融合されたHAタグを、ベクターのポリリンカー領域に、組
換えタンパク質発現がCMVプロモーターによって指揮されるようにクローニン
グする。HAタグは、Wilsonら,Cell 37:767(1984)に記載されたインフルエン
ザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する。HAタグの標的
タンパク質への融合は、HAエピトープを認識する抗体による組換えタンパク質
の容易な検出を可能にする。
プラスミド構築法は、以下のとおりである。多くは、E.coljにおけるCD3
3様タンパク質の発現に関して上に記載したように、寄託されたクローンのCD
33様タンパク質cDNAを便利な制限部位を含むプライマーを用いて増幅する
。発現したCD33様タンパク質の検出、精製および特徴付けを助長するため、
プライマーのうち1つは、上記のヘマグルチニンタグ(「HAタグ」)を含んで
いる。
適当なプライマーには以下のものが含まれ、この実施例において使用される:
5'プライマーCGCGGATCCGCCATCATGCTGCCCCTGCT
GCTG3'(配列番号6)は、下線部のBamHI部位と、第1図(配列番号
1)のヌクレオチド第37〜54番に示されるヌクレオチド配列を有するCD3
3様タンパク質cDNAのコード領域の最初の18個のヌクレオチドを含む。
3'プライマーは、下線部のXbaI部位、終止コドン、ヘマグルチニンタグを含
んでおり、第1図(配列番号1)に示される膜貫通領域(bps1285〜130
2)の前の、最後の18bpのヌクレオチド配列に相補的であり、以下の配列を有
している:5'CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGT
CGTATGGGTAAGAGCCGCTCTGGGACCC3'(配列番号7
)。
PCR増幅されたDNA断片およびベクター、pcDNAI/AmpをBamHI
およびXbaIで消化した後、ライゲーションする。ライゲーション混合物をE.co
li SURE株(Stratagene Cloning Systems,11099 North Torrey Pines Road
,La Jolla,CA 92037より入手可能)へ形質転換した後、形質転換した培養細胞
をアンピシリン培地プレート上に蒔き、それをインキュベーションしてアンピシ
リン耐性コロニーを生育させる。耐性コロニーからプラスミドDNAを単離し、
制限分析とゲル分画によってCD33様タンパク質をコードする断片の存在につ
いて試験する。
組換えCD33様タンパク質の発現のために、例えばSambrookら,Molecular
Clonjng:A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,Cold Spring H
arbor,New York(1989)に記載されているDEAE−DEXTRANを用いて上
記のようにCOS細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。ベクターによる
CD33様タンパク質の発現条件下で細胞をインキュベーションする。CD33
様タンパク質/HA融合タンパク質の発現は、例えばHarlowら,Antibodies :A
Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spr
ing Harbor,New York(1988)に記載されている方法を用いて放射能標識および免
疫沈降によって検出する。この目的のため、トランスフェクションの2日後に、
細胞を、35S−システインを含む培地中で8時間インキュベーションすることに
よって標識する。細胞および培地を集め、細胞を洗浄し、上で引用したWilsonら
に記載されているように、界面活性剤を含むPIPA緩衝液:150mM NaCl
、1%NP−40、0.1%SDS、1%NP−40、0.5%DOC、50m
M TRIS(pH7.5)により溶解する。HA特異的モノクローナル抗体を
使用して細胞リゼートおよび培地からタンパク質を沈殿させる。次い
で、沈殿したタンパク質をSDS−PAGEゲルおよびオートラジオグラフィー
により分析する。期待されるサイズの発現生成物は細胞リゼートにおいてみられ
、陰性対照にはみられなかった。
実施例2B:CHO発現系を使用するヒトCD33様タンパク質の発現と精製
寄託されたヌクレオチドにおけるCD33様タンパク質をコードするDNA配
列を、CD33様タンパク質のカルボキシ末端配列およびその遺伝子に対する3
'のベクター配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増
幅する。クローニングを助長するための制限部位を含む更なるヌクレオチドを5
'および3'配列にそれぞれ加える。
完全長の遺伝子および細胞外可溶性領域をコードするヌクレオチド配列の両方
のための5'プライマーは、5'CGCGGATCCGCCATCATGCTGC
CCCTGCTGCTG 3'(配列番号09)の配列を有し、下線部のBam
HI制限部位および第1図(配列番号1)のヌクレオチド第37〜54番で示さ
れるヌクレオチド配列を有する、CD33様タンパク質cDNAのコード領域の
最初の18個のヌクレオチドを含んでいる。完全長の遺伝子のための3'プライ
マーは、CGCGGTACCTCAGTGGCTCCTCCAGCCAGG3'
(配列番号8)の配列を有し、下線部のAsp718制限部位および第1図(配列
番号1)のヌクレオチド第1713〜1730番で示されるヌクレオチド配列に
相補的な配列を有するCD33様タンパク質cDNAのヌクレオチドを含んでい
る。細胞外領域のための3'プライマーは、5'CGCGGTACCTCAAGA
GCCGCTCTGGGACCC3'(配列番号10)の配列を有し、下線部のA
sp718制限部位および第1図(配列番号1)のヌクレオチド第1285〜13
02番で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するCD3
3様タンパク質cDNAの18個のヌクレオチドを含んでいる。制限部位は、C
HO発現ベクターPC4における制限酵素部位に便利である。
増幅したCD33様タンパク質DNAおよびベクターPC4を両方ともBamHI
で消化し、消化されたDNAを互いにライゲーションする。CD33様タンパク
質DNAをBamHI制限したベクターに挿入して、そのCD33様タンパク質
コード領域を、ベクターのプロモーターの下流で作動可能なように連結されるよ
うに配置する。ライゲーション混合物を、標準的な方法を用いてコンピテントE
.coli細胞へ形質転換した。そのような方法は、Sambrookら,Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載されている。
実施例3:バキュロウイルス発現系におけるCD33様タンパク質のクローニン
グおよび発現
寄託されたクローンにおける、可溶性細胞外領域または完全長CD33様タン
パク質レセプターのいずれかをコードするcDNA配列を、その遺伝子の5'お
よび3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅す
る。
細胞外領域または完全長タンパク質のいずれかの発現ための5'プライマーは
、5'CGCGGATCCGCCATCATGCTGCCCCTGCTGCTG
3'(配列番号09)であり、下線部のBamHI制限部位および第1図(配列番
号1)のヌクレオチド第37〜54番で示されるヌクレオチド配列を有する、C
D33様タンパク質cDNAのコード領域の最初の18個のヌクレオチドを含ん
でいる。以下に記載するように、発現ベクターに挿入すると、CD33様タンパ
ク質をコードする増幅された断片の5'末端は有効なシグナルペプチドを与える
。真核細胞における翻訳の開始のための有効なシグナルは、Kozak,M.,J.Mol
.Biol.196:947-950(1987)に記載されているようにその構築物のベクター部分
に適切に配置されている。
完全長の遺伝子のための3'プライマーは、完全長配列CGCGGTACCT
CAGTGGCTCCTCCAGCCAGG(配列番号8)を有し、下線部のAs
p718制限部位および第1図(配列番号1)のヌクレオチド第1713〜17
30番で示されるヌクレオチド配列に相補的な配列を有するCD33様タンパク
質cDNAのヌクレオチドを含んでいる。細胞外領域のための3'プライマーは
、5'CGCGGTACCTCAAGAGCCGCTCTGGGACCC3'(配
列番号10)であり、下線部のAsp718制限部位および第1図(配列番号1)
の
ヌクレオチド第1285〜1302番で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列を有するCD33様タンパク質cDNAの18個のヌクレオチド
を含んでいる。
増幅した断片を商業的に入手可能なキット(「Geneclean」BIO 101Inc.
,La Jolla,Ca)を用いて1%アガロースゲルから単離する。次いで、断片をBa
mHIおよびAsp718で消化し、再び1%アガロースゲルで精製する。この断片
をここではF2と称する。
Summersら,A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No
.1555(1987)に記載されている方法のような標準的な方法を用いて、ベクター
pA2を使用し、バキュロウイルス発現系においてCD33様タンパク質を発現
させる。発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcM
NPV)の強力なポリヘドリンプロモーターそしてその後に便利な制限部位を含
んでいる。組換えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿入し、その後にポリ
ヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入する。細胞が媒介する、野生型
ウイルスDNAとの相同的組換えのために、ポリヘドリン配列をウイルスの配列
の両側につなぎ、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生育可能なウ
イルスを製造する。
他の多くのバキュロウイルスベクター、例えばpAc373、pVL941お
よびpAcIMIがpA2の代わりに使用できる。但し、当業者が容易に認識す
るように、構築物はインフレームAUGおよびシグナルペプチドなどの、転写、
翻訳、転送などのための適切に配置されたシグナルを必要に応じて提供する。そ
のようなベクターは、特にLuckowら,Virology 170:31-39に記載されている。
当分野で知られている常套的な方法を用いて、プラスミドをBamHIおよびAsp
718制限酵素で消化した後、仔ウシ腸内ホスファターゼを用いて脱リン酸化す
る。次いで、商業的に入手可能なキット(「Geneclean」BIO 101Inc.,La
Jolla,Ca)を用いて、DNAを1%アガロースゲルから単離する。このDNA
をここではV2と称する。
F2断片と脱リン酸化したV2断片を、T4DNAリガーゼにより、お互いに
ライゲーションする。E.coli HB101細胞をライゲーションミックスで形質
転換し、培養プレート上に広げる。BamHIおよびAsp718を用いて個々の
コロニー由来のDNAを消化した後、その消化産物をゲル電気泳動により分析す
ることによって、ヒトCD33様タンパク質遺伝子を有するプラスミドを含む細
菌を同定する。クローニングされた断片の配列を、DNA配列決定により確認す
る。このプラスミドをここではpBac/CD33様タンパク質と称する。
5μgのpBac/CD33様タンパク質と1.0μgの商業的に入手可能な線
状化されたバキュロウイルスDNA(「BaculoGoldTMバキュロウイルスDNA」
,Pharminigen,San Diego,CA)を、Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:7413-7417(1987)に記載されたリポフェクション法を用いて共トランスフェク
トする。1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAと5μgのプラスミドpBac/C
D33様タンパク質を、50μLの血清不含Grace's培地(Life Technolo
gies Inc.,Gaithersburg,MD)を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル
中で混合する。その後、リポフェクチン10μLおよびGrace's培地90
μLを加え、混合し、15分間室温でインキュベーションする。次いで、トラン
スフェクション混合物を、1mLの血清不含Grace's培地を含む35mm組
織培養プレートに蒔いたSf9昆虫細胞(ATC CCRL1711)に滴加す
る。プレートを前後に振盪させて新たに加えた溶液を混合させる。次いで、プレ
ートを27℃で5時間インキュベーションする。5時間後、トランスフェクショ
ン溶液をプレートから除き、10%ウシ胎児血清を添加した1mLのGrace
's昆虫培地を加える。プレートをインキュベーターに戻し、27℃で4日間培
養を続ける。
4日後、上で引用したSummersおよびSmithに記載されたように、上清を集め、
プラークアッセイを行う。「Blue Gal」(Life Technologies Inc.,Gai
thersburg)を添加したアガロースゲルを使用して、galを発現しているクロ
ーンの同定と単離を容易にする。そのクローンは青く染色されたプラークを形成
する。(この種の「プラークアッセイ」の詳細な記載は、Life Technologies In
c.,Gaithersburg,p9-10によって配布される昆虫培養細胞およびバキュロウイ
ルス学についての使用説明書においてもみることもできる)。
連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加える。適当なインキュベーションの後
、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで取る。次いで、
組換えウイルスを含む寒天を、200μLのGrace's培地を入れたエッペ
ンドルフチューブ内で再懸濁する。寒天を手短かな遠心により除き、組換えバキ
ュロウイルスを含む上清を用いて、35mmディッシュに蒔いたSf9細胞を感
染させる。4日後、これら培養細胞ディッシュの上清を集め、次いでそれを4℃
で保存する。適切に挿入されたCD33様タンパク質レセプターを含むクローン
を、制限マッピングおよび配列決定を含むDNA解析によって同定する。これを
ここではV−CD33様タンパク質と称する。
Sf9細胞を、10%熱不活性化FBSを添加したGrace's培地で培養
する。細胞を、約2(約1〜3)の多重感染度(「MOI」)にて組換えバキュ
ロウイルスV−CD33様タンパク質により感染させる。6時間後に培地を除き
、メチオニンおよびシステインを欠くSF900II培地(Life Technologies
Inc.,Gaithersburg)と交換する。42時間後、5μCiの35S−メチオニンと35
S−システイン(Amershamより入手可能)を加える。細胞をさらに16時間イ
ンキュベーションした後、遠心によりそれらを集め、溶菌し、SDS−PAGE
およびオートラジオグラフィーにより、標識したタンパク質を視覚化する。
実施例4:CD33様タンパク質mRNA発現の組織分布
特に、上で引用したSambrookらに記載された方法を用いて、ノーザンブロット
解析を行い、ヒトの組織におけるCD33様タンパク質をコードする遺伝子の発
現レベルを調べた。本発明のCD33様タンパク質の全長ヌクレオチド配列(配
列番号1)を含むcDNAプローブを、rediprimeTMDNA標識システム(Amers
ham Life Science)を用いて製造者の使用説明書に従い32Pで標識した。標識し
た後、プローブを、CHAROMA SPIN−100TMカラム(Clontech Labo
ratories,Inc.)を用い、製造者のプロトコル番号PT1200−1にしたがっ
て精製した。次いで、精製された標識ブローブを使用して、CD33様タンパク
質をコードする遺伝子の発現について様々なヒト組織を調べた。
様々なヒト組織(H)またはヒト免疫系組織(IM)を含む多重組織ノーザン
(MTN)ブロットをClontechから得、製造者のプロトコルPT1190−1に
したがってExpressHybTMハイブリダイゼーション溶液(Clontech)を使用して標
識プローブにより調べた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットを
固定し、−70℃で一晩フィルムに感光させ、標準的な方法にしたがってフィル
ムを現像した。
第3図に示すように、本発明のCD33様タンパク質をコードする遺伝子の発
現は、骨髄、末梢血白血球、および脾臓を含む造血組織において最も高かった(
第3図、各々レーン10,11,15)が、リンパ節、虫垂、肺および胎盤(第
3図、各々レーン14、12、5および6)などの他の組織においても検出でき
る。
上の説明および実施例で特別に記載した以外にも本発明を実施し得ることは明
らかである。
上記の教示に照らして、本発明の非常に多くの修飾と変更が可能であり、よっ
てそれらは添付した請求の範囲の範囲内である。
本明細書において引用した特許、特許出願、および刊行物の開示はすべて、本
明細書の一部を構成する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Nucleotide sequence encoding CD33-like protein
Background of the Invention
Field of the invention
The present invention relates to novel CD33-like proteins. In particular, CD33-like protein
Provided is an isolated nucleic acid molecule encoding a protein. In addition, recombinant CD33-like poly
Also provided are peptides and recombinant vectors and host cells. The invention further relates to tumors
Method useful for diagnosis or prognosis of ulcer or inflammatory disease and CD33-like polype
Therapeutic treatment targeting cells expressing the peptide is provided.
Background information
CD33 is a 67 kD glycoprotein whose expression is restricted to hematopoietic cells.
A series of monoclonal antibodies (MoAbs) that recognize
For the first time (Peiper S.C. et al., In Knapp W, Dorken B, Gilks WR, Riebe
r EP, Schmidt RE, Stein H, von dem Borne AEG (eds.): Leucocyte Typing IV. Wh
ite Cell Differentiation Antigens. Oxford, UK, Oxford University 1989, p
814; Pierelli L. Et al., Br J Haematol 84:24 (1993); Andrews R.G. et al., Blood 62: 1.
24, (1983); Griffin J.D. et al., Leuk Res 8: 521 (1984)). CD33 is a hematopoietic stem cell
But not detected in a subpopulation of mixed colony forming cells for the first time.
(Pierelli L. et al., Br J Haematol 84:24 (1993); Griffin J.D. et al., Leuk
Res 8: 521 (1984)). Thereafter, expression is down-regulated in granulocytes, but monocytes and tissue
Expression follows the bone marrow monocyte pathway until maintained by the lophage (Pi
erelli L. Et al., Br J Haematol 84:24 (1993); Bernstein I.D. et al. Cljn. Inv
est 79: 1153 (1987)). The expression pattern of CD33 in the hematopoietic system
Shows a potential role in regulation. However, even if its identification was ten years ago,
Regardless (Andrews R.G. et al., Blood 62: 124, (1983)), the function of CD33 is linked.
The composite properties are not yet known.
CD33MoAb is derived from myeloid leukemia cells (acute myeloid leukemia [AML]
Classification (French-American-British classification) MI-7)
Very important in immunodiagnosis of acute leukemia that can be distinguished from normal CD33 negative cells
is important. (Griffin J.D. et al., Leuk Res 8: 521 (1984); Matutes E. et al., Haemat.
ol Oncol 3: 179 (1985); Bain B.J., Immunological cytogenetic and other mark
ers, in Bain BJ (ed.); Lulaemia Diagnosis: A Guide to FAB Classification.
London, UK, Gower Medical, 1990, p6l). This is because accurate classification is a prognostic prediction and
Insufficient morphological criteria, although essential for treatment and treatment choice
Of particular value for the younger forms of AML. CD33MoAb also
Especially before transplantation or in the case of diseases that are resistant to chemotherapy, the bones of AML patients are mainly
It has been used in preliminary trial treatments to remove the marrow. (Robertson M.J.
Et al., Blood 79: 2229 (1992); Applibaum F.R. et al., Transplantation 54: 829 (1992); C.
aron P.C. et al., Cancer 73: 1049 (1994)). Thus, because of the importance of CD33
, A nucleic acid encoding an additional polypeptide having CD33-like protein activity
There is a clear need to identify and isolate offspring.
Summary of the Invention
The present invention relates to a CD33-like protein whose amino acid sequence is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
Isolation comprising a nucleic acid sequence encoding a protein or a fragment of a polypeptide thereof
Provided nucleic acid molecules. The CD33-like protein gene has its start codon
It is present at positions 37-39 of the nucleotide sequence shown in FIG.
It has a leader sequence of 15 amino acid residues and an estimated molecular weight of about 60 kDa.
Includes an open reading frame encoding a 551 amino acid residue protein.
In another aspect, the invention relates to ATCC Accession No. 9752 on April 25, 1996.
The amino acid sequence encoded by the cDNA of the clone deposited as No. 1.
An isolated nucleic acid molecule encoding a CD33-like polypeptide is provided. Like
Alternatively, the nucleic acid molecule is a mature polynucleotide encoded by the deposited cDNA described above.
Encodes a repeptide.
Preferred nucleic acid fragments of the invention include isolated nucleic acid molecules that encode:
Included: extracellular region of the CD33-like protein (about 16 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2))
A CD33-like protein;
Transmembrane region (amino acid residues from about 423 to about 464 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2))
A CD33-like protein intracellular region (FIG. 1 (SEQ ID NO:
No. 2) (amino acid residues from about 465 to about 551);
Extracellular and intracellular regions where all or part of the transmembrane region has been deleted
A polypeptide comprising
In a further aspect, the present invention provides a nucleic acid molecule comprising at least any of the nucleic acid molecules described herein.
90% identical, and more preferably at least 95%, 97%, 98% or 9
An isolated nucleic acid molecule having a nucleotide sequence that is 9% identical is included.
The present invention further provides a vector comprising the isolated DNA molecule of the present invention,
Host cells that have been genetically engineered with recombinant vectors, and
Of a CD33-like polypeptide or a fragment thereof.
The polypeptide of the present invention includes a polypeptide encoded by the deposited cDNA.
Peptides, polypeptides of SEQ ID NO: 2 (especially mature polypeptides), and deposited
Polypeptide encoded by the cDNA or the polypeptide of SEQ ID NO: 2
At least 90% similar, more preferably at least 95% similar to the amino acid sequence of
Polypeptides having the following amino acid sequences: Further, the polypep of the present invention
The peptide may include the polypeptide or sequence number encoded by the deposited cDNA.
At least 80% identical to the amino acid sequence of the polypeptide of No. 2, more preferably
Polypeptides having an amino acid sequence that is at least 90% or 95% identical.
I will.
Preferred polypeptide fragments of the present invention include polypeptides comprising:
Include: CD33-like protein extracellular region; CD33-like protein transmembrane
Region; a CD33-like protein intracellular region; or a transmembrane region has been deleted,
CD33-like protein extracellular and intracellular regions.
The invention further provides methods useful in diagnosing neoplastic or inflammatory diseases.
The method comprises determining the expression level of the gene encoding the CD33-like protein or
Analyzing the gene copy number in cell-like or body fluids and expressing the gene
Present
Levels or copy numbers can be determined using standard CD33-like protein gene expression levels or
Comparison with the gene copy number, and thereby the gene expression level relative to the standard.
Increased bell or gene copy number may be an indicator of certain neoplastic or inflammatory diseases.
Become. According to the present invention, the above method is also useful as a prognostic indicator.
In another embodiment, the method comprises removing leukemic hematopoietic cells from a transplant of a leukemia patient.
An in vitro method is provided. This method uses anti-CD33-like protein monochrome
Hematopoietic cells containing CD33-like antigens are treated with null antibody (MoAb) and complement
Removing from bone marrow obtained from.
In a further aspect, the present invention provides a tumor cell expressing a CD33-like antigen of the present invention.
An in vivo method for selectively killing or inhibiting the growth of
An amount of an effective to block the D33-like protein receptor signaling pathway
There is provided a method comprising administering a gonist to a patient. According to the present invention,
Administration of such antagonists of a CD33-like protein to a patient may be an inflammatory disease.
It is also useful for treating the disease.
In a further aspect, an immunospecific cell specific for a CD33-like protein is expressed.
A toxin is provided to selectively kill tumor cells. Immunoto the present invention
The xin can further be treated in vitro according to the method described above in leukemia hematopoietic CD33.+Fine
Useful for vesicle removal.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 shows the nucleotide (SEQ ID NO: 1) of the CD33-like protein and the putative DNA.
2 shows the amino acid (SEQ ID NO: 2) sequence. About amino acids 1 to 15 are signal peptides
(The first underlined sequence), and amino acids from about 16 to about 422 represent the extracellular region.
Shown (sequence between first and second underline), amino acid sequence from about 423 to about 464
Indicates the transmembrane region (second underlined sequence), and
The amino acid sequence indicates an intracellular region (remaining sequence).
FIG. 2 shows the CD33-like protein of the present invention (SEQ ID NO: 2) and the human differentiation antigen CD
33 (SEQ ID NO: 3)
It is a comparison.
FIG. 3 shows the tissue distribution of human CD33-like protein mRNA expression in Northern
It is a blot.
Detailed description
The present invention is based on FIG. 1 determined by sequencing the cloned cDNA.
Encodes a CD33-like protein having the amino acid sequence shown in (SEQ ID NO: 2)
An isolated nucleic acid molecule comprising the polynucleotide. C of the present invention
The D33-like protein is sequenced with respect to the human differentiation antigen (CD33) (FIG. 2).
Share homology. The nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
Lican Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockvil
le, Maryland 20852, on April 25, 1996, access number 9
7521, obtained by sequencing the HMQCD14 clone.
It is.
Nucleic acid molecule
Unless otherwise specified, the DNA molecules herein are determined by sequencing.
All of the nucleotide sequences generated were converted to an automated DNA sequencer (Applied Bi
osystems, Inc., model 373), and
The amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA molecule
Estimated by translation of the DNA sequence determined as described. Therefore, this self
Known in the art for DNA sequences determined by automated methods.
As such, any of the nucleotide sequences herein may contain some errors.
May be. The nucleotide sequence determined by automation is
The actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule, typically at least about
90% identical, more typically at least about 95% to at least 99.9% identical
is there. Actual sequences include manual DNA sequencing methods well known in the art.
More precise determinations can be made by other methods. As known in the art
, One insertion or one in the determined nucleotide sequence compared to the actual sequence
Causes a frameshift in the translation of the nucleotide sequence,
Yo
Encoded by the determined nucleotide sequence, starting from the insertion or deletion
The predicted amino acid sequence is actually encoded by the sequenced DNA molecule.
The amino acid sequence will be completely different.
Unless otherwise specified, each of the "nucleotide sequences" described herein is a deoxy
Expressed as a sequence of siribonucleotides (abbreviated as A, G, C and T). However
The "nucleotide sequence" of a nucleic acid molecule or polynucleotide is a DNA molecule or
Denote the sequence of deoxyribonucleotides for polynucleotides;
For the A molecule or polynucleotide, the specific deoxynucleotide sequence
Each thymidine deoxynucleotide (T) is a ribonucleotide uridine (U
), Corresponding sequences of ribonucleotides (A, G, C and U)
Intended. For example, sequences described using abbreviations for deoxyribonucleotides
Reference to an RNA molecule having SEQ ID NO: 1 refers to the respective deoxynucleotide of SEQ ID NO: 1.
Otide A, G or C is replaced by the corresponding ribonucleotide A, G or C
And each deoxynucleotide T is replaced by a ribonucleotide U
It is intended to indicate an RNA molecule having the sequence of interest.
Thus, in one aspect, an isolated CD33-like protein encoding
A nucleic acid molecule is provided. An “isolated” nucleic acid molecule is one that is removed from its natural environment.
The intended nucleic acid molecule is DNA, RNA or RNA. For example, included in the vector
Is considered to be isolated for the purposes of the present invention.
You. Further examples of isolated DNA molecules include those maintained in heterologous host cells.
In a recombinant DNA molecule or a (partially or substantially) purified solution
DNA molecules are included. The isolated RNA molecule includes the in v of the DNA molecule of the present invention.
Itro RNA transcript is included. The isolated nucleic acid molecules of the present invention may further comprise synthetic
Included are such molecules produced by
As described herein, such as a nucleotide sequence as shown in FIG.
Using the information obtained, a nucleic acid molecule of the invention encoding a CD33-like protein
As a method for cloning cDNA using NA as starting material
It can be obtained using standard cloning and screening methods. Departure
By way of illustration, the nucleic acid molecules described in FIG. 1 are derived from human activated monocytes.
Found in a cDNA library. Further, the gene has the following Thailand
Also found in a cDNA library derived from human cells:
Spheres, spleen, chronic lymphocytic leukemia, human activated neutrophils and human tonsils.
The initiation codon of the CD33-like protein gene is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
No. 37-39 of the nucleotide sequence to be deduced, and the predicted leader sequence is about 1
About 551 amino acids that are 5 amino acid residues and whose estimated molecular weight is about 60 kD
Contains open reading frame encoding full-length protein of residues
You. The amino acid sequence of the putative mature CD33-like protein is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
At amino acid residues 16-551. Mature CD33-like protein
Has three main structural areas. These include the ligand binding region,
It is presumed to correspond to amino acid residues No. 16 to No. 422 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
Extracellular region is included. The mature extracellular region has a molecular weight of about 45 kD,
It is estimated to be about 407 amino acids. Another area is shown in FIG. 1 (sequence number
No. 2) is a transmembrane region presumed to correspond to residues 423 to 464.
You. Yet another region is from about position 465 to about 551 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
This is an intracellular region that is presumed to correspond to the amino acid residue at position 1. FIG. 1 (SEQ ID NO:
The CD33-like protein shown in 2) has the accession number M23197 under GenB
about 53% identical to the human differentiation antigen CD33 which has access to
% Are similar. As will be appreciated by those skilled in the art, the sequencing errors described above
Possibility and variability in leader cleavage sites in different known proteins
Because of the actual full-length CD33 encoded by the deposited cDNA
-Like protein (including the leader) contains about 551 amino acids, but 545-560
Can be any of a range of amino acids and the actual leader sequence of this protein
Is about 15 amino acids but in any of the range of about 12 to about 18 amino acids.
Can get. Those skilled in the art will appreciate that, depending on the criteria used,
Opinions may be different regarding the exact "address" of the region. But
Thus, for example, extracellular and intracellular CD33-like proteins of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
The exact location of the transmembrane region is determined by the criteria used to define that region.
(For example, the exact “position” may be
Shown
About 1 to 5 residues compared to the position of the amino acid).
As indicated, the nucleic acid molecules of the invention can be RNA, such as mRNA, or
CDNA and cDNA obtained by cloning or produced synthetically
It may be in the form of DNA, including nome DNA. DNA is double-stranded or single-stranded
May be. Single-stranded DNA may be the coding strand, also known as the sense strand.
Or the non-coding strand, also known as the antisense strand.
The isolated nucleic acid molecule of the present invention has its initiation codon shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
Open reading frame at positions 37-39 of the nucleotide sequence to be
ORF), and all or part of the ORF is substantially
Comprising different sequences, but due to the degeneracy of the genetic code CD33-like proteins or
Still encodes the fragment, the start codon is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
DNA molecules at positions 37-39 of the nucleotide sequence. Of course, heredity
Codes are well known in the art. Therefore, the above degenerate mutants
This will be routine to those skilled in the art.
In another aspect, the invention relates to ATCC Accession No. 9752 on April 25, 1996.
The amino acid sequence encoded by the cDNA of the clone deposited as No. 1.
An isolated nucleic acid molecule encoding a CD33-like polypeptide is provided. Like
Alternatively, the nucleic acid molecule comprises the mature poly- gen encoded by the deposited cDNA described above.
Encodes a peptide.
The present invention further relates to the nucleotide sequence shown in FIG.
Nucleotides of the CD33-like protein gene contained in the deposited cDNA
An isolated nucleic acid molecule having a sequence, or having a sequence complementary to one of the above sequences
Nucleic acid molecules are provided. Such an isolated molecule, especially a DNA molecule, is a chromosome.
Gene mapping by in situ hybridization with
Analysis of CD33-like protein gene expression in human tissues
It is useful as a probe for As described in detail below, some organizations
Detection of increased CD33-like protein gene expression is an indicator of neoplasia
is there.
The invention further relates to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein.
The nucleotide sequence of the deposited cDNA or the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
A fragment of an isolated nucleic acid molecule having a nucleotide sequence has at least about 15 nt,
And more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least
About 30 nt, and even more preferably at least about 40 nt in length;
Fragments useful as diagnostic probes and primers described herein
Figure. Of course, larger fragments of 50-1500 nt in length were also deposited c
Not all of the DNA or nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
As well as most corresponding fragments are useful in the present invention. For example, at least
The approximately 20 nt long fragment is also the nucleotide sequence of the deposited cDNA or the first nucleotide.
20 or more derived from the nucleotide sequence shown in the Figure (SEQ ID NO: 1)
Fragments containing adjacent bases are contemplated. The gene has been deposited and is shown in FIG.
Since the nucleotide sequence shown in No. 1) is provided, such a DNA
Creating fragments will be routine to those skilled in the art. For example, the restriction endonucleus
Fragments of various sizes can be easily used by shearing or sonication shearing.
Could be created. Alternatively, such fragments may be made synthetically.
I can do it.
Preferred nucleic acid fragments of the present invention include nucleic acid molecules that encode:
: Polypeptide comprising an extracellular region of CD33-like protein (FIG. 1 (SEQ ID NO:
No. 1) amino acid residues No. 16 to No. 422); CD33-like protein transmembrane domain
Polypeptide comprising the region (amino acid residue about position 423 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2))
To about 464); a polypeptide comprising a CD33-like protein intracellular region (
FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) at about amino acid residues 465 to 551);
Extracellular and intracellular regions of CD33-like protein, wholly or partially deleted
A polypeptide comprising
In another aspect, the invention is directed to stringent hybridization conditions.
In the above, a part of the polynucleotide of the nucleic acid molecule of the present invention, for example, ATCC accession number
No. 97521, a polypeptide that hybridizes with the cDNA clone contained in
An isolated nucleic acid molecule is provided. "A stringent hybrid
"Conditionation conditions" are 50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl
,
15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6),
5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / mL denature
After overnight incubation at 42 ° C. in a solution containing chopped salmon sperm DNA,
It is intended to wash the filter in 0.1 × SSC at about 65 ° C. Polynuk
A polynucleotide that hybridizes to a “portion” of a reotide is a polynucleotide that
At least 15 nucleotides (nt) of nucleotides, and more preferably
At least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, even more preferably
Or at least about 30 to 70 nt of the polynucleotide (D
NA or RNA). These are described in more detail above and below.
Useful as diagnostic probes and primers.
Of course, the polynucleotides referred to (eg, deposited cDNA clones)
A larger part, for example, a part having a length of 50 to 750 nt of the referred polynucleotide.
Or even a polynucleotide that hybridizes to a length comparable to the full length.
The nucleotide sequence of the deposited cDNA or shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
Polynucleotides that correspond to most, if not all, of the nucleotide sequence
Like the peptide, it is useful as the probe of the present invention. "At least 20 nt long
"A portion of the polynucleotide is, for example, a nucleoside of the referenced polynucleotide.
The nucleotide sequence (eg, the deposited cDNA or shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1))
20 or more adjacent nucleotides derived from
Figure. As indicated, such portions are fully disclosed, for example, for reference.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambr
ook, J., French, E. F. and Maniatis, T. Ed. (1989), Cold Spring Harbor Lab
conventional DNA hybridization as described in the oratory Press
Target as a probe according to the technology or by the polymerase chain reaction (PCR)
It is diagnostically useful as a primer for sequence amplification.
Of course, the poly A sequence (3 of the CD33-like cDNA shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2))
'Like a terminal poly A sequence) or to a complementary contiguous sequence of T (or U) residues.
The polynucleotide that hybridizes only with the poly A continuous sequence or its complementary strand (
(Eg, virtually any double-stranded cDNA clone)
Can also hybridize with the nucleic acid of the present invention.
It is not included in the polynucleotide of the present invention used in the above.
As shown, a nucleic acid molecule of the invention encoding a CD33-like polypeptide comprises the following:
Including but not limited to: the coding sequence of the mature polypeptide itself
A coding sequence for the mature polypeptide and a leader or secretory sequence of about 15 amino acids.
Additional sequences, such as coding sequences, e.g., pre- or pro- or pre-pro-
Protein sequence; with or without the additional coding sequence described above,
A coding sequence for a mature polypeptide having a coding sequence, the sequence comprising
And, eg, transcription, mRNA processing (eg, splicing and
Denylation signal), ribosome binding and mRNA stability
Contains non-coding 5 'and 3' sequences, such as
But not limited to; additional amino acids that do not provide additional function and encode additional amino acids
Code sequence. Thus, for example, a sequence encoding a polypeptide may
The peptide is fused to a marker sequence, such as a peptide-encoding sequence.
Purification of the combined polypeptide can be facilitated. In this aspect of the invention
In one preferred embodiment, the marker sequence comprises, inter alia, a pQE vector (Quigen
Hex-histidine peptide such as the tag given in
Among them, many are commercially available. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86: 821-824 (1989), for example, hexahistidine
Provides for convenient purification of the fusion protein. HA tag is influenza
Useful for purification corresponding to epitopes obtained from hemagglutinin protein
One peptide is described in, for example, Wilson et al., Cell 37: 767 (1984).
I have.
The invention further provides for encoding a fragment, homolog or derivative of a CD33-like protein.
To a variant of the nucleic acid molecule of the present invention. Mutants are naturally occurring like allelic variants
May exist. An "allelic variant" is a defined locus on the chromosome of an organism.
Intends one of several alternative forms of the gene occupying
. Non-naturally occurring variants may be produced using mutagenesis techniques known in the art.
Can be.
Such variants include those resulting from nucleotide substitutions, deletions or additions.
Is included. Substitutions, deletions or additions involve one or more nucleotides.
Can give. Variants may have altered coding or non-coding regions, or both.
It may be. Changes in the coding region may result in conservative or non-conservative amino acids.
Acid substitutions, deletions or additions can occur.
Particularly preferred among these are the properties of the CD33-like protein or a part thereof.
And silent substitutions, additions and deletions that do not alter activity. Also,
Particularly preferred are conservative substitutions.
Further aspects of the invention include at least 90% identical to:
More preferably, a nucleic acid that is at least 95%, 97%, 98% or 99% identical
An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a leotide sequence
: (A) as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or at ATCC accession number 97521
Complete amino acid sequence as encoded by the included cDNA clone
Encoding a full-length CD33-like polypeptide having a defined leader sequence
Nucleotide sequence; (b) shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or ATCC depository
Amino acid as encoded by the cDNA clone contained in
Mature CD33 polypeptide having an acid sequence (full-length polypeptide with the leader sequence removed)
(C) shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
Or the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97521
A CD33-like protein extracellular region having an amino acid sequence as encoded
(D) the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or AT
As encoded by the cDNA clone contained in CC Accession No. 97521
Encoding a CD33-like protein intracellular region having a unique amino acid sequence
(E) shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 2) or ATCC accession number 97
The amino acid sequence as encoded by the cDNA clone contained in 521
A nucleotide sequence encoding a transmembrane region of a CD33-like protein; (f)
Shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 2) or included in ATCC Accession No. 97521
CD33-like having an amino acid sequence as encoded by a cDNA clone
Protein extracellular and intracellular regions (all or part of the transmembrane region
Or (g) the nucleotide sequence of (a) to (f).
A nucleotide sequence complementary to any of the otide sequences.
In the referenced nucleotide sequence encoding a CD33-like polypeptide, for example,
Polynucleotides having a nucleotide sequence that is at least 95% identical are polynucleotides.
The nucleotide sequence of the nucleotide refers to a CD33-like polypeptide.
Up to 5 mutations per 100 nucleotides of the nucleotide sequence
Identical to the referenced sequence except that the nucleotide sequence may include
Intended to be. In other words, at least 9
To obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence that is 5% identical,
Up to 5% of the nucleotides of the referenced sequence have been deleted or replaced with another nucleotide
Up to 5% of the total number of nucleotides of the referenced sequence
May be inserted into the referenced sequence. This in the array to mention
These mutations may be at the 5 'or 3' end of the referenced nucleotide sequence or
Somewhere between these terminal positions, either individually in the referenced sequence or
May be dispersed as one or more contiguous groups in the referenced sequence
You.
As a practical matter, any particular nucleic acid molecule may be, for example, the nucleic acid shown in FIG.
Less nucleotide sequence or nucleotide sequence of the deposited cDNA clone
Nucleotide sequences that are 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to each other
The best fit program (Wisconsin Sequence Analysis P
ackage, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research
Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).
It can be determined routinely using a program. Bestfit is Smith and Waterm
an (Advances in Applied MathematicsTwo: 482-489 (1981))
Use rhythm to find the best segment of homology between the two sequences. specific
Is, for example, at least 95% identical to the sequence referred to in the invention
Bestfit or any other sequence alignment program to determine
When using a system, of course, the identity may vary over the entire length of the nucleotide sequence referred to.
Calculate the percentage and homology up to 5% of the total number of nucleotides of the referenced sequence
Set parameters to allow for differences.
The present application provides a method for encoding a polypeptide having CD33-like protein activity.
Or at least 90%, 95%, 97%, 98% or
Refers to nucleic acid molecules that are 99% identical. This is because a specific nucleic acid molecule is a CD33-like tag.
Even if they do not encode a polypeptide having protein activity,
For example, a hybridization probe or polymerase chain reaction (PCR) probe
Because you will know how to use the nucleic acid molecule as a primer
It is. The present invention does not encode a polypeptide having CD33-like protein activity
Uses of the nucleic acid molecules of the invention include, among others: (1) CD33-like
Gene encoding the protein or its allelic variant from a cDNA library
Isolation of offspring; (2) Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques
, Pergamon Press, New York (1988).
Metaphase chromosome spread to obtain the exact location on the chromosome
in situ hybridization (FISH); and (3) specific tissue
Northern blot analysis to detect CD33-like mRNA expression
.
However, it actually encodes a polypeptide with CD33-like protein activity
At least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to the above nucleic acid sequence
Certain nucleic acid molecules are preferred. "Polypeptide having CD33-like protein activity"
Is a CD33-like polypeptide of the invention as measured by a particular biological assay.
A polypeptide exhibiting an activity similar to, but not necessarily identical to, that of
You.
For example, in a solid phase binding assay, the CD33-like protein of the present invention comprises CD33-like protein
And sialic acid-dependent sialic acid-dependent erythrocytes (RBC)
May mediate sticking. (This assay is based on Fr, the content of which is part of the present specification.
eeman, S.D. Et al., Blood 85 (8): 2005-2012 (1995)). Special
In addition, human erythrocytes (RBC) are modified with enzymes and possess sialic acid through a unique bond.
(Paulson JC. Et al., Methods Enzymol. 138: 162 (1987)). This
It provides a useful experimental method to characterize the specificity of sialic acid-dependent adhesion molecules
You. Briefly, this assay converts the Fc-CD33-like protein to the C
By polymerase chain reaction amplification of extracellular part of D33-like protein cDNA
And cloned into the Fc expression vector pIG (Simmons DL: Cloning cells
urface molecules by transient expression in mammalian cells, in Hartley
DA (eds.): Cellular Interactions in Development-A Practical Approach. Oxf
ord, UK, IRL, 1993, p93), followed by Freeman, S.D., et al., 85 (8): 2005-2012 (1995).
And expression in COS-1 cells as described in US Pat. COS
Cell supernatants were collected about 6 days after transfection and were described as described in Simmons DL, supra.
First, the Fc-CD33-like protein is purified using protein A sepharose.
Solid phase binding assays are described in Kelm, S. et al., Curr Biol 4: 965 (1994).
As described above, an enzyme-linked immunosorbent assay plate was prepared using an Fc-CD33-like protein.
Coating, and Freemn, S.D., et al., Blood 85 (8): 2005-2012 (
Sialic acid residues in one or more structures as described in
Add the radioactively labeled RBC at an appropriate concentration (eg, 4 × 106
Cells / mL). After 30 minutes, wash non-adherent and weakly adherent cells.
Excluded by purification. The percentage of cells bound in each well is:
Calculate: (cpm binding / cpm addition amount) × 100. CD33-like polypeptide of the invention
The peptide will bind to RBC in a sialic acid-dependent manner.
As described above, according to the present invention, “polypeptide having CD33-like protein activity”
"Include polypeptides that also bind to RBCs in the above assays. Saying
So, in a side-by-side comparison, use the CD33-like protein
The percentage of RBC binding of the "polypeptide having CD33-like protein activity"
Similar to the percentage obtained using the candidate (i.e., no more than 50%, preferably
Will not differ by more than 25%).
In another aspect, the above binding assay measures the potential for CD33-like protein activity.
Useful for screening certain antagonists and agonists. This
The method of (1) uses agonists or antagonist candidates (anti-CD33-like protein
Sialic acid-dependent binding of the CD33-like protein to RBCs
RB at standard binding levels, ie, in the absence of candidate agonist or antagonist
C
Enhances or inhibits compared to the degree of CD33-like protein binding to
Or determining whether
Of course, due to the degeneracy of the genetic code, those skilled in the art
Have nucleotide sequences that are 0%, 95%, 97%, 98% or 99% identical
Many nucleic acid molecules have polypeptides that "have CD33-like protein activity"
You will instantly recognize that it can be loaded. In fact, all degenerate mutations
Since the body encodes the same polypeptide, it can be done without performing the comparison assay described above.
This will be apparent to those skilled in the art. For nucleic acid molecules that are not degenerate variants
Any number may also encode a polypeptide having CD33-like protein activity.
It will be further recognized in the art. Because those skilled in the art
Amino acid substitutions that have little or no significant effect on protein function (
For example, substituting one aliphatic amino acid for another)
Because he knows.
For example, how to make silent amino acid substitutions for phenotypes
Bowie, J. U. Et al., “Deciphering the Message in Protein Sequences
: Tolerance to Amino Acid Substitutions, ”Science 247: 1306-1310 (1990)
In which the authors examine the tolerance of the amino acid sequence for changes.
It shows that there are two main methods. The first method depends on the process of evolution
Where the mutant is allowed or excluded by natural selection
It is. The second method uses a specific location of a gene cloned using genetic engineering.
Introduce amino acid changes to the position and maintain the function by selection or screening.
Identify the column. As the author states, these studies have led to protein
It was found to be surprisingly resistant to amino acid substitution. What's the author more
Whether such amino acid changes are likely to be tolerated at certain positions in the protein.
Is shown. For example, most embedded amino acid residues are nonpolar
, But a few features of the surface side chains are generally conserved. other
Such phenotypically silent substitutions can be found in Bowie, supra, cited for reference.
, J. U. Are described.
Vectors and host cells
The present invention also provides a vector comprising the isolated DNA molecule of the present invention, a recombinant vector thereof.
Host cells that have been genetically engineered by a
It relates to the production of 3-like polypeptides or fragments thereof.
Infection, transduction, transfection, transvection and transformation
The recombinant construct can be introduced into host cells using well-known techniques such as
You. Vectors can be, for example, plasmids, plasmids, viruses or retroviruses.
May be a vector. Retroviral vectors can replicate even if they have the ability to replicate.
It may be a manufacturing defect. In the latter case, retroviral propagation is generally complementary (
complementing) occurs only in host cells.
The polypeptide comprises a vector comprising a selectable marker for propagation in a host.
Can be linked to Generally, the plasmid vector is calcium phosphate
Introduced in a precipitate, such as a precipitate, or in a complex with a charged lipid
I do. If the vector is a virus, use an appropriate packaging cell line
Can be transfected into host cells after packaging in vitro
You.
Preferably, a vector containing a cis-acting control region in the polynucleotide of interest.
You. Appropriate trans-acting factors may be supplied by the host or in a complementary vector.
Or when introduced into a host cell, from the vector itself.
It is.
In certain preferred embodiments in this regard, the vector is transducible and / or
Or a specific expression that is specific to the cell type. Especially preferred among them
Acceptable vectors depend on environmental factors that are easy to handle, such as temperature and additional nutrients.
This is a vector capable of inducing the expression of the protein.
Expression vectors useful in the present invention include those derived from chromosomes, episomes and viruses.
Vectors such as bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast
Chromosomal elements, viruses such as baculovirus, papovavirus, vaccinia
Senior virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus and
Vectors derived from Torovirus and vectors derived from combinations thereof
Plasmids such as cosmids and phagemids and bacteriophage
And vectors obtained from such elements.
The DNA insertion is carried out by a suitable promoter, for example, phage ram
Da PL promoter, E.C. coli lac, trp and tac promoters, SV40 early
And promoters such as the late promoter and the retroviral LTR promoter
Operably connected to the motor. Other suitable promoters will be familiar to those skilled in the art.
Are known. Expression constructs include sites for transcription initiation, termination, and transcribed regions.
Contains a ribosome binding region for translation. Mature transcript expressed by the construct
The coding portion of contains a translation initiation AUG at the beginning and an appropriately located stop codon.
Located at the end of the translated polypeptide.
As indicated, the expression vectors preferably include a selectable marker. That
Such markers include dihydrofolate reductase or the like for eukaryotic cell culture.
Or neomycin resistance and E. coli. for culturing in E. coli or other bacteria
Includes tracycline or ampicillin resistance. Representative examples of suitable hosts include
E. bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium;
Fungal cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9; CH
Animal cells such as O, COS and Bose melanoma; and plant cells
You. Suitable media and conditions for the above-described host cells are known in the art.
PQE70, pQE60 and pQE-9 available from Quiagen; pB
S vector, Phagescript vector, Bluescript vector, obtained from Stratagene
Possible pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; and Pharma
ptrc99a, pKK233-3, pKK233-3, p
DR540, pRIT5 is a preferred vector for use in bacteria.
Among the preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, p available from Stratagene.
SV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG; and obtained from Pharmacia
Possible pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL. Other suitable vector
The parameters will be apparent to those skilled in the art.
Among the known bacterial promoters for use in the present invention are E. coli. col
i lacI and lacZ promoters, T3 and T7 promoters, gpt promoter
Promoter, lambda PR, PL promoter and trp promoter.
Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter
HSV thymidine kinase promoter, early and late SV40 promoter
Retrovirus LT, such as the promoter of Rous sarcoma virus ("RSV")
R promoter and meta such as the mouse metallothionein-I promoter
A rothionein promoter is included.
Introduction of the construct into host cells can be performed by calcium phosphate precipitation transfection,
DEAE dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection
Sfection, electroporation, transduction, infection or other
The method can be performed by the following method. Such methods are described, for example, in Davis et al., Basic.
Many standard laboratory manuals such as Methods in Molecular Biology (1986)
Has been described.
Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be
It can be enhanced by inserting a Hanser sequence into the vector. En
Hansers are typically promoters of about 10 to 300 bp in a given host cell type.
Is a cis-acting element of DNA that acts to increase the transcriptional activity of
. Examples of enhancers include SV located behind the origin of replication at bp 100-270.
40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, replication
Contains the polyoma enhancer behind the origin and the adenovirus enhancer
I will.
Secretion of translated protein into the endoplasmic reticulum tube, periplasmic space, or extracellular environment
Therefore, an appropriate secretion signal can be incorporated into the expressed polypeptide.
The signal may be endogenous to the polypeptide or may be heterologous.
Other signals.
The polypeptide can be expressed in a modified form, such as a fusion protein.
May contain additional heterologous functional regions in addition to secretory signals.
it can. That is, for example, regions of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be
In addition to the N-terminus of the peptide, the host details during purification or during subsequent processing and storage.
It can improve stability and persistence in the vesicle. In addition, the peptide
It can be added to a peptide to facilitate purification.
CD33-like protein is subjected to ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction,
Anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography
Raffy, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography
、, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography
Can be recovered and purified from recombinant cultured cells by well-known methods, including
Can be. Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC")
Used for purification.
The polypeptides of the present invention include natural purified products, products of chemical synthesis and
Prokaryotic or eukaryotic, including, for example, bacteria, yeast, higher plants, insects and mammalian cells.
Includes products produced by recombinant techniques from nuclear hosts. Used in recombinant manufacturing
Depending on the host used, the polypeptide of the present invention may be glycosylated.
And may not be glycosylated. Further, the polypeptide of the present invention
The first modified methionine, in some cases as a result of a process involving the host
It may contain residues.
CD33-like polypeptides and fragments
The present invention further provides an amino acid sequence encoded by the deposited cDNA or
Is an isolated CD33-like having the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
A polypeptide, or a peptide or polypeptide comprising a portion of said polypeptide
Provide a peptide. The terms “peptide” and “oligopeptide” are (usually
Are recognized as synonyms) and each word is
Used interchangeably if necessary, at least two linked by a peptidyl bond
A chain of two amino acids can be shown. As used herein, the term "polypeptide"
Used for chains containing 10 or more amino acid residues. All of the items in this specification
The formula or sequence of the rigopeptide and polypeptide, from left to right,
In the direction of the carboxy terminus.
An "isolated" polypeptide or protein has been removed from its natural environment.
A polypeptide or protein is intended. For example, a recombinant expressed in a host
The polypeptides and proteins produced by any of the suitable techniques,
For example, the one-step purification method described in Smith and Johnson, Cene 67: 31-110 (1988).
Thus, similar to substantially purified natural or recombinant polypeptides,
Therefore, it is considered to be isolated.
One of skill in the art will recognize that some amino acid sequences of CD33-like polypeptides
Recognize that it can be changed without significant effect on the structure or function of the
Will do. Given such sequence differences, determine protein activity
Don't forget that there will be definitive areas of action. That
Such regions may include residues that make up the extracellular region. Form tertiary structure
It is generally possible, however, to perform a similar function.
Use the residue In other instances, the change occurs in a non-critical region of the protein.
In this case, the type of residue will not be at all important.
Accordingly, the present invention further provides that the invention exhibits substantially CD33-like polypeptide activity.
Or regions of a CD33-like protein such as the protein fragments described below.
And variants of the CD33-like polypeptide. Such mutants include deletions,
Insertions, inversions, repeats, and types of substitutions (e.g., replacing one hydrophilic residue with another
Generally, a strong hydrophobic residue is replaced with a strong hydrophilic residue.
Not included). Minor changes or "neutral" amino acid substitutions are generally
Will have little effect on activity.
Typically seen as conservative substitutions are the aliphatic amino acids Ala, Val, L
replacing one of eu and Ile with another;
Interchange between residues Ser and Thr, exchange of acidic residues Asp and Glu, amide
Substitution of residues Asn and Gln, exchange of basic residues Leu and Arg and aromatic residues
Substitution within Phe, Tyr.
As indicated above, which amino acid changes are phenotypically silent (ie,
Is unlikely to have a significant detrimental effect).
Pull by Bowie, J. U. Et al., “Deciphering the Message in Protein Sequences: To
lerance to Amino Acid Substitutions, "Science 247: 1306-1310 (1990)
It is.
The polypeptides of the present invention are encoded by the deposited cDNA containing a leader.
Polypeptide, the leader encoded by the deposited cDNA has been deleted.
FIG. 1 containing the sequence of the mature polypeptide (ie, mature protein) and leader
No. 2), leader-free polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO. 2)
And at least 90% similar, more preferably, to the polypeptides described herein.
Or at least 95% similar, even more preferably at least 97%, 98%
Or polypeptides that are 99% similar. Further polypeptides of the invention
Is at least 80% identical, more preferably less than, the polypeptides described herein.
At least 90% or 95% identical, even more preferably at least 97%, 9
A polypeptide that is 8% or 98% identical, and further comprises at least 30 amino acids.
Such polypeptides having at least 50 amino acids, more preferably no acids
Including a part of.
“% Similarity” for two polypeptides refers to the Bestfit program (Wisconsin
Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group
, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) and
Use the default setting to determine similarity
The similarity determined by comparing the amino acid sequences of the two polypeptides
Gender scores are intended. Bestfit is based on Smith and Waterman (Advances in Applied Mat
hematics 2: 482-489 (1981)).
The homology between finds the best segment.
At least for the referred amino acid sequence of the CD33-like polypeptide, for example
A polypeptide having an amino acid sequence that is 95% "identical"
For each 100 amino acids referred to by the CD33-like polypeptide
Except that it may have up to five amino acid changes.
It is intended that the acid sequence is identical to the sequence referred to. In other words, mention
Having an amino acid sequence at least 95% identical to the amino acid sequence
To obtain a tide, up to 5% of the amino acid residues of the referenced sequence may be deleted or otherwise deleted.
May be replaced by a nucleotide of the amino acid of the referenced sequence
Amino acids of up to 5% of the total number of residues may be inserted into the referenced sequence. Word
These alterations in the sequence of the amino acid
At the xy-terminal position or somewhere between these terminal positions, the reference
One or more of the residues in the sequence, either individually or in the referenced sequence.
They may be dispersed as adjacent groups.
As a practical matter, any particular polypeptide may be identified, for example, in FIG.
No. 2) or the deposited cDNA clone.
At least 90%, 95%, 97%, and at least 90%,
Whether 98% or 99% identical is determined by the Bestfit program (Wisconsin Seq
uence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, Uni
versity Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).
It can be determined routinely using known computer programs. Bestfi
t or any other sequence alignment program
Determine whether the sequence is, for example, at least 95% identical to the sequence referred to in the invention.
When defining, of course, the percent identity over the entire length of the amino acid sequence referred to
Calculated and allowed homology differences of up to 5% of the total number of amino acids in the referred sequence
Set the parameters as follows.
In another aspect, the present invention provides an epitope-bearing portion of a polypeptide of the present invention.
A peptide or polypeptide is provided. Epitope of this polypeptide part
A polypeptide is an immunogenic or antigenic epitope of a polypeptide of the invention. "Immunity
A `` genic epitope '' is one that elicits an antibody response when the entire protein is an immunogen.
It is defined as being part of the scrap protein. These immunogenic epitopes
It is thought to be limited to a few positions on the molecule. On the other hand, the antibody
The region of the resulting protein molecule is defined as an "antigenic epitope." Protein
Immunogenic epitopes are generally less than the number of antigenic epitopes. For example, Ge
ysen, H. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984).
A region of a protein molecule that has an antigenic epitope (ie,
Part of the protein sequence for selection of peptides or polypeptides
A relatively short synthetic peptide that mimics reacts with its partially mimicked protein
It is well known in the art that it is routinely possible to induce
Are known. For example, Sutcliffe, J. G. See Science 219: 660-666 (1984).
Peptides that can induce protein-reactive serum are
It is often displayed in a Mary sequence and is characterized by a set of simple chemical rules.
And the immunodominant region of the complete protein (ie, the immunogenic epitope
) Or amino or carboxy termini. Remarkably hydrophobic pepti
Peptides with 6 or less residues usually bind to mimetic proteins
Not effective in inducing antibodies; longer, soluble peptides, especially proline residues
Peptides containing groups are generally effective. Sutcliffe et al., Supra at 661. For example,
75% of the sequence of the influenza virus hemagglutinin HA1 polypeptide chain
Designed according to these guidelines, including the barring 8-39 residues
Eighteen of the twenty peptides are HA1 protein or complete virus
Induces antibodies that react with proteins; of 12 of the peptides derived from MuLV polymerase
12 and 18 out of 18 from the rabies virus glycoprotein
Antibodies that precipitate proteins were induced.
Accordingly, peptides and polypeptides having the antigenic epitope of the present invention
Are antibodies including monoclonal antibodies that specifically bind to a polypeptide of the invention.
Useful for raising. For example, immunized with a peptide having an antigenic epitope
Hybridomas obtained by fusion of spleen cells from donors
Secretes antibodies that react with proteins. Sutcliffe et al., Supra at 663. Antigenic epitome
Antibodies elicited by a peptide or polypeptide having a loop
Useful for detecting proteins, antibodies to different peptides
Used to track the fate of various regions of the processed protein precursor
Can be The peptides and anti-peptide antibodies relate to mimetic proteins
Can be used in various qualitative or quantitative analyses, such as competition assays
Wear. Because even short peptides (ie, about 9 amino acids) can be used for immunoprecipitation analysis.
Has been shown to bind and replace larger peptides
It is. For example, Wilson, I. A. See Cell 37: 767-778 p777 (1984). The present invention
Peptide antibodies can also be used to purify mimetic proteins, for example, as is well known in the art.
It is useful for purification by adsorption chromatography using the method described above.
Peptides of the invention having an antigenic epitope designed according to the above guidelines
The peptides and polypeptides are preferably at least 7, more preferably at least 7,
9 and most preferably from about 15 to about 30 amino acids.
Contained within the amino acid sequence of the peptide. However, about 30 to about 50 amino
The length and total length of either the acid or the entire amino acid sequence of the polypeptide of the invention.
The polypeptide of the present invention including the amino acid sequence contains a larger portion of the amino acid sequence.
Also produce antibodies that react with the mimetic protein.
Useful for Preferably, the amino acid sequence of the peptide having the epitope is
Can be selected to achieve substantial solubility in aqueous solvents (ie, if the sequence is relatively
Sequences containing hydrophilic residues and highly hydrophobic sequences are preferably avoided);
Sequences comprising are particularly preferred.
Peptides and polypeptides having an epitope of the present invention may be a nucleic acid component of the present invention.
To produce peptides or polypeptides, including recombinant methods using offspring
It can be manufactured by any of the conventional methods. For example, having an epitope
Short amino acid sequences are used during recombinant production and purification as well as for immunization with anti-peptide
During manufacture of the body, it can be fused to a larger polypeptide that acts as a carrier.
Can be.
Epitope-bearing peptides may also be synthesized using known methods of chemical synthesis.
You can also. For example, Houghten describes a simple method for synthesizing numerous peptides.
Method is described. For example, they were prepared and characterized within four weeks
One amino acid of a segment of the HA1 polypeptide (by ELISA-type binding analysis)
10 to 20 mg of 248 peptides of 13 different residues, which are no acid variants
. Houghten, R. A. , Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 5131-5135 (1985). This “Sim
ultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS) "method was developed by Houghten et al. (1986) in the United States.
It is further described in Patent No. 4,631,211. In this way, various pep
Individual resins for the solid-phase synthesis of tides are packaged in separate solvent-permeable packets.
Enables optimal use of many of the same repetitive steps involved in solid-phase methods
. Complete manual methods perform 500-1000 or more syntheses simultaneously
It is possible. Houghten et al., Supra, 5134.
Peptides and polypeptides having an epitope of the present invention are well known to those of skill in the art.
Used to elicit antibodies according to the methods provided. For example, Sutcliffe et al.
Supra, Wilson et al., Supra, Chow, M. Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 910-914;
And Bittle, F. J. J. et al. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985). In general, dynamic
Is immunized with free peptide; however, anti-peptide antibody titers are
Like whole limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid
It can be boosted by coupling to a macromolecular carrier. For example
The cysteine contained in the peptide is m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy
Coupling to the carrier using a linker such as cis-succinimide ester (MBS)
Other peptides such as glutaraldehyde
It can be coupled to a carrier using a suitable linking agent. Rabbit, rat and
And animals such as mice, free or coupled to a carrier, e.g., about
Contains 100 μg of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant
Immunization is performed by intraperitoneal and / or intradermal injection of the emulsion. For example solid
Antibodies detectable by ELISA analysis using free peptide adsorbed on the surface
Several booths, for example, about every two weeks, to obtain effective titers of peptide antibodies
It may be necessary to give a syringe injection. Antibody in serum from immunized animals
The titer of the peptide antibody can be determined by selecting an anti-peptide antibody, for example, as is well known in the art.
Increased by adsorption of the solid onto the support and elution of the selected antibody according to the method
be able to.
The peptide having the immunogen epitope of the present invention, that is, the whole protein is an immunogen.
Some of the proteins that elicit an antibody response in some cases can be obtained by methods known in the art.
Therefore, it is identified. For example, Geysen et al., 1984, cited above, provide an enzyme-linked immunosorbent assay.
Hundreds of peptides of sufficient purity to react in the assay on a solid support
A method for rapid concurrent synthesis is disclosed. Next
The interaction between the antibody and the synthesized peptide can be
Detect easily. In this method, a marker having an immunogenic epitope of a desired protein is used.
Peptides can be routinely identified by those skilled in the art. For example, foot-and-mouth disease
An immunologically important epitope on the Rus coat protein was reported by Geysen et al.
Thus, the location was determined, and the entire 213 amino acid sequence of the protein was encoded.
Overlap of a total of 208 possible hexapeptide bars
By synthesizing one set, it was concluded that there were seven amino acids. Next
All 20 amino acids alternate at every position within the epitope
Synthesize a complete set of substituted peptide substitutions and identify the specificity of the reaction with the antibody
The specific amino acid conferring sex was determined. Thus, the epitope of the present invention
Peptide analogs of the peptide can be routinely made by this method
. Geysen (1987) U.S. Pat. No. 4,708,781 further discloses the desired protein
A method for identifying a peptide having an immunogenic epitope is described.
Further, Geysen (1990) U.S. Pat. No. 5,194,392 also discloses the antibody of interest.
An epitope complementary to a particular paratope (antigen binding site) (ie, "mimotope")
Sequence of monomers (amino acids or other compounds) that are topological equivalents of
A general method for detecting or determining is disclosed. More generally, Geysen
(1989) U.S. Pat. No. 4,433,092 discloses a specific receptor ligand of interest.
Sequence of the monomer, which is the topological equivalent of the ligand complementary to the
A method for detecting or determining is described. Similarly, pre-alkylated oligopeptides
Hougthen, R. A. U.S. Patent No. 5,480,971 to (1996)
, Linear C1-C7Alkyl-prealkylated oligopeptides and the like
Peptide sets and libraries, as well as target acceptor molecules
To determine the sequence of pre-alkylated oligopeptides that bind
Using oligopeptide sets and libraries such as
. Thus, non-peptide analogs of a peptide having an epitope of the invention
Can also be produced conventionally by these methods.
We have shown that the CD33-like protein represents three major structural regions.
It was found to be a 51 residue protein. First, the extracellular region (ligand binding)
1 (SEQ ID NO: 2) at about residues 16-422.
Was decided. The mature extracellular region is approximately 407 amino acids long and has a molecular weight of
Was estimated to be about 45 kDa. Second, the transmembrane region is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO:
2) at about residues 423-464. Third, the intracellular area
It was identified at about residues 465-551 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). This
Thus, the present invention further provides a preferred CD3 comprising a polypeptide selected from:
Provide 3-like protein fragments: mature CD33-like protein; CD33-like protein
Extracellular region of the cytoplasm; CD33-like protein transmembrane region; CD33-like protein cell
Inner region; or a CD33-like tamper in which part or all of the transmembrane region has been deleted
The cytoplasmic extracellular and intracellular regions. Producing such a CD33-like protein fragment
The method for this is described above.
Combining the extracellular region of the receptor with a portion of the immunoglobulin (IgG) constant region
Thus, a chimeric polypeptide can be obtained. These fusion proteins are often
It shows an increased half-life in vivo. This means, for example, that human CD4 polypep
The first two regions of the tide and the heavy or light chain constant regions of a mammalian immunoglobulin
Has been demonstrated for a chimeric protein consisting of various regions of
Application Publication No. 394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). IgG
Due to the moieties, fusion proteins with disulfide-bonded dimeric structures
More effective in binding and neutralizing ligands than the extracellular region of the nomer alone
(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)).
As described in detail below, the polypeptides of the present invention and fragments thereof comprise
Diagnostic analysis for detecting CD33-like protein expression as described in
Or a jaw capable of enhancing or inhibiting the function of a CD33-like protein
Polyclonal and monochrome useful as nysts and antagonists
Can be used to raise null antibodies. Furthermore, such polypeptides can be transformed into yeast
Agonists and antagonists of the invention for use in a two-hybrid system
The CD33-like protein binding protein, which is also a complement, can be "captured". Yeast
The mother two hybrid system is described in Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989).
Have been.
The bibliography of each of the references cited in this section "CD33-like polypeptides and fragments"
The entire specification forms part of the present specification for reference.
Diagnosis and prognosis of neoplastic and inflammatory diseases
Certain tissues of mammals affected by a neoplastic or inflammatory disease may have the corresponding "standard"
Of mammals, that is, mammals of the same species not affected by a neoplastic or inflammatory disease
In comparison, the number of copies of the CD33-like protein gene was significantly increased,
Increased levels of CD33-like protein and m encoding CD33-like protein
It is thought to express RNA. Increased levels of CD33-like protein
Sera from mammals of the same species not affected by a neoplastic or inflammatory disease
When compared, certain types of mammals affected by neoplastic or inflammatory diseases
Will be detected in body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid, and cerebrospinal fluid)
. Thus, the present invention provides methods useful in diagnosing neoplastic or inflammatory diseases.
Provided, the method comprises co-expressing a CD33-like protein in a mammalian cell or body fluid.
Analyzing the expression level or gene copy number of the gene to be loaded; and
Gene expression level or gene copy number can be determined using standard CD33-like protein gene
Including comparing to the current level or gene copy number, thereby
Increased gene expression levels or gene copy number may be associated with certain neoplastic or inflammatory
It is an indicator of sexual disease.
Diagnosis of neoplastic or inflammatory diseases is already done according to conventional methods
In this case, the present invention is useful as a prognostic indicator. For example, bone marrow or peripheral blood samples
Was collected from patients previously diagnosed with leukemia, and anti-CD33-like protein
Leukemia for testing for CD33-like protein expression using noclonal antibodies
Disease blasts can be obtained. The level of differentiation of normal bone marrow cells was expressed by CD3
Since the concentration of the 3-like protein antigen is considered to be reflected, the sample was used for CD33-Bra.
(Mature) versus CD33-dal (mature). The leukemia blasts
Showing CD33-like protein antigen in an amount associated with immature bone marrow cells
Is a phenotype associated with more mature cells (ie, a relatively low CD33-like protein).
Worse than patients with leukemic blasts expressing
Will experience.
"To analyze the expression level of the gene encoding the CD33-like protein"
Is the level of CD33-like protein or CD33 in the first biological sample.
The level of mRNA encoding the like protein is directly (eg, absolute
Determining or estimating protein or mRNA levels) or relative (
For example, the CD33-like protein level or mRN in a second biological sample
A level), or to measure or estimate qualitatively or quantitatively
I do. "To analyze the copy number of the gene encoding the CD33-like protein"
Means that the gene copy number in the first biological sample is directly (eg, absolute)
Determining or estimating the appropriate gene copy number) or relative (second biological test).
Compared to the CD33-like protein gene copy number in
Is intended to be measured or estimated quantitatively.
Preferably, the CD33-like protein level, mRNA level, or first live
The gene copy number in a physical sample is measured or estimated and a standard CD33-like protein
Compare to protein level, mRNA level, or gene copy number. Standard is tumor
Taken from a second biological sample obtained from a person without an ulcerative or inflammatory disease
Things. Alternatively, if the method is used as a prognostic indicator,
And the second biological sample are both taken from a person with a neoplastic or inflammatory disease
Relative expression levels or copy numbers can be measured to determine prognosis.
Set. As recognized in the art, standard CD33-like protein levels
Once the mRNA, mRNA level, or gene copy number is known, it can be used as a standard for comparison.
Can be used repeatedly.
A "biological sample" is an individual, cell line, cultured tissue, or CD33-like protein.
Any biological sample obtained from proteins or other sources containing mRNA.
Figure. The biological sample may include a selected mature CD33-like protein or
Mammalian body fluids including the soluble extracellular region (such as serum, plasma, urine, synovial fluid and cerebrospinal fluid);
Includes eosinophils, spleen tissue, monocytes, neutrophils, tonsils and bone marrow. Tissues from mammals
Methods for obtaining biopsies and body fluids are well known in the art. biological
If the sample contains mRNA, a tissue biopsy is a preferred source.
The invention is useful for detecting neoplastic or inflammatory diseases in mammals
. In particular, the invention relates to the diagnosis of the following types of neoplastic or inflammatory diseases in mammals:
Or useful in prognosis: metastatic tumors, leukemias, lymphomas, arthritis, and
And allergic diseases. Preferred mammals include monkeys, apes, cats, dogs, cormorants
Si,
Pigs, horses, rabbits and humans are included. Preferred is a human.
Total cellular RNA was obtained from Chomoczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159
(1987) one-stage guanidium-thiocyanate-phenol
Can be isolated from a biological sample using any suitable technique, such as the loroform method.
You. The level of mRNA encoding the CD33-like protein was then determined
Analyze using the appropriate method. These include Northern blotting analysis, S
1 nuclease mapping, polymerase chain reaction (PCR), polymerase chain
Reverse transcription (RT-PCR) combined with strand reaction, and ligase chain reaction
Reverse transcription (RT-LCR).
Northern blot analysis is described in Harada et al., Cell 63: 303-312 (1990).
Can be done as is. Briefly, as described above, total RNA is
Prepared from biological samples. For Northern blotting, use the appropriate buffer
RNA in lioxal / dimethylsulfoxide / sodium phosphate buffer)
And subjected to agarose gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter.
You. After the RNA has been bound to the filter by the UV linker, form the filter.
Amide, SSC, Denhardt's solution, denatured salmon sperm, SDS, and sodium phosphate
Prehybridization in a solution containing buffer solution. Any suitable method
(32P-multiprimed DNA labeling system (Amersham)
The labeled CD33-like protein cDNA is used as a probe. one
After overnight hybridization, wash the filter and expose to X-ray film
. CDNAs for use as probes according to the invention are described in the section above.
And preferably will be at least 15 bp in length.
The S1 mapping is as described in Fujita et al., Cell 49: 357-367 (1987).
Can be done. Prepare probe DNA for use in S1 mapping
For this purpose, the labeled strand is labeled using the sense strand of the above cDNA as a template.
Synthesize antisense DNA. The antisense DNA is then ligated to the appropriate restriction end.
Digest with nuclease to create additional DNA probes of desired length.
Such an antisense probe can target the target mRNA (ie, the CD33-like protein).
Useful for visualizing the protected band corresponding to the quality-encoding mRNA).
is there. Northern blot analysis is performed as described above.
Preferably, the level of mRNA encoding the CD33-like protein is
Et al., Using the RT-PCR method described in Technique 2: 295-301 (1990).
I do. According to this method, the “amplicon” in the polyacrylamide gel band
Is linearly correlated with the initial concentration of target mRNA. In short, this
Is to combine total RNA isolated from a biological sample with an RT primer and an appropriate buffer.
Adding to the reaction mixture containing the impingement liquid. For primer annealing
After incubation, the mixture was added to RT buffer, dNTP, DTT, RNas.
e Add inhibitor and reverse transcriptase. Incubate for reverse transcription of RNA
Once achieved, the RT product is subjected to PCR using labeled primers. Or,
Rather than label the primers, the labeled dNTPs are added to the PCR reaction mixture.
It is. PCR amplification is performed in a DNA thermal cycler according to conventional techniques
be able to. After the appropriate number of amplifications, the PCR reaction mixture is
Perform electrophoresis on a luamide gel. After drying the gel, the appropriate band (CD33-like
Imaging activity (corresponding to mRNA encoding protein)
Quantify using a laser. RT and PCR reaction components and conditions, reagent and gel concentrations
, And labeling methods are well known in the art. Changes to the RT-PCR method include:
It will be clear to those skilled in the art.
Any oligonucleotide primer capable of amplifying reverse transcribed target mRNA
These sets can be used and designed as described in the section above.
Analysis of the CD33-like protein gene copy number can be performed by, for example,
Any known technique, such as in situ hybridization with DNA probes
Therefore can be done.
Analysis of CD33-like protein levels in biological samples is known in the art.
It can be performed using any of the above methods. CD33-like tan in biological samples
Preferred for protein level analysis are antibody-based techniques. For example, an organization
Of CD33-like protein expression in mice by classical immunohistological methods
it can. In these methods, specific recognition is based on the primary antibody (polyclonal or monoclonal).
Clonal), the secondary detection system can be fluorescent, enzyme or other
A conjugated secondary antibody may be used. As a result, tissue fragments for pathological examination
Immunohistological staining is obtained. Western blot or dot / slot
For release of CD33-like proteins for assays, eg urea or neutral detergents
Can also be used to extract tissue (Jalkanen, M. et al., J Cell. Biol. 101: 976-985 (
1985)); Jalkanen, M. et al., J Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987). Cationic
This technique, which is based on the use of a solid phase of
To quantify the CD33-like protein. This technology also
It can also be used for bodily fluids. For these samples, the CD33-like protein
CD33-like data for different body fluids such as serum, plasma, urine, and synovial fluid
It will help set a standard value for protein content. Next, CD33
The normal aspect of the protein mass should be set using values obtained from healthy people
Can be compared to values obtained from the subject.
Others based on antibodies useful for detecting CD33-like protein gene expression
Methods include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay.
Immunoassays such as A (RIA) are included. For example, CD33-like protein
Quality-specific monoclonal antibodies are used for both immunosorbents and enzyme-labeled probes.
Used to detect and quantify CD33-like proteins. Trial
The amount of CD33-like protein present in the sample was determined by a regression linear computer algorithm.
It can be calculated with reference to the amount present in the standard preparation using the system. Antitumor
Such an ELISA for detecting protogenesis is described in Iacobelli et al., Breast Cancer Res.
earch and Treatment 11: 19-30 (1988). In another ELISA analysis
Uses two distinct specific monoclonal antibodies to detect CD33-like proteins in bodily fluids.
Protein can be detected. In this analysis, one antibody was used as the immunosorbent.
And the other antibody is used as an enzyme-labeled probe.
The above techniques can be performed essentially as a “one-step” or “two-step” analysis.
Wear. “One-step” analysis involves contacting the CD33-like protein with the immobilized antibody.
Contacting the mixture with the labeled antibody without washing. "Two steps
Involves washing the mixture before contacting it with the labeled antibody. Other idiomatic
Conventional methods can also be used appropriately. Immobilize one component of the analysis system on a carrier
Is usually desirable so that other components of the analytical system come into contact with the component.
It can be easily detached from the sample.
Suitable enzyme labels include, for example, the production of hydrogen peroxide by reacting with a substrate.
And enzymes of the oxidase group that catalyze. Glucose oxidase is stable
It is particularly preferable because it has excellent properties and its substrate (glucose) can be easily obtained. Oki
The level of sidase activity was formed by the reaction of the enzyme-labeled antibody with the substrate
It can be analyzed by measuring the concentration of hydrogen peroxide. Other than enzymes
Crab and other suitable labels include iodine (125I,121I), carbon (14C), sulfur (35
S), deuterium (ThreeH), indium (112In) and technetium (99mTc
), Fluorescent labels such as fluorescein and rhodamine and
Contains biotin.
In addition to analyzing CD33-like protein levels in biological samples obtained from humans
, CD33-like proteins can also be detected in vivo by imaging. C
Antibody labels or markers for in vivo imaging of D33-like proteins include X-rays
Includes those that can be detected by radiography, NMR or ESR. An example
For example, for X-ray radiography, appropriate labels include detectable radiation.
Barium or cesium, which emits but is not significantly harmful to the patient
Such radioisotopes. Suitable marker for NMR and ESR
Include those with detectable characteristic spins, such as deuterium, which
Assembled into antibodies by labeling nutrients for the relevant hybridoma
Can be included.
Suitable detectable imaging moieties, such as radioisotopes (eg,131I,112I
n,99mTc), radio-opaque substances, or nuclear magnetic resonance
Thus, an antibody specific to a CD33-like protein labeled with a detectable substance or the like
Administers the antibody fragment to the mammal being examined for tumor (eg, parenterally, subcutaneously or
Intraperitoneal administration). Create diagnostic images based on patient size and contrast system used
It is understood in the art that the amount of
Let's go. In the case of a radioisotope moiety, for a human patient, the amount of radioactivity injected
Is usually in the range of about 5-20 microcuries99mTc. Labeled antibody
Alternatively, antibody fragments are selectively accumulated at locations of cells containing the CD33-like protein.
Will be. In vivo tumor imaging is described in SW. Burchiel et al., “Immunopharmacokinetics
of Radiolabelled Antibodies and Their Fragments ”
Chapter 3: The Radiochemical Detection of Cancer, SW. Burchiel and B.A. Rho
des, Masson Publising Inc. (1982)).
Antibodies specific to CD33-like proteins for use in the present invention
It can be raised against a CD33-like protein or an antigenic polypeptide fragment thereof.
They can be used in animal systems (rabbit or mouse) together with carrier proteins such as albumin.
Or a sufficiently long (at least about 25 amino acids)
If present, they may be presented without a carrier.
As used herein, "antibody" (Ab) or "monoclonal antibody" (Ma
b) is a complete sequence of molecules that can specifically bind to CD33-like proteins
Antibody fragments (eg, Fab and F (ab '))TwoFragment). Fab
And F (ab ')TwoFragments lack the Fc fragment of the whole antibody and are more rapidly circulated
Will be removed and intact antibody will have less nonspecific tissue binding (Wahl et al.,
J Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Thus, these fragments are preferred.
The antibodies of the present invention can be produced by any of a variety of methods. example
For example, cells expressing a CD33-like protein or an antigenic fragment thereof
It can be administered to an animal to induce the production of serum containing a nal antibody.
In a preferred method, a preparation of a CD33-like protein is prepared, purified and
The object is substantially free of natural impurities. Then, such a preparation is
Animals are administered to produce higher specific activity polyclonal antisera.
In the most preferred method, the antibodies of the present invention are monoclonal antibodies (or
CD33-like protein binding fragment). Such monoclonal antibodies are
It can be manufactured using lidoma technology (Kohler et al., Nature 266: 495 (1975)).
Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 2
92 (1976); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybriomas, E
lsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). Generally, such methods are dynamic.
(Preferably mouse) with a CD33-like protein antigen, or more preferably C3
Immunize with cells expressing D33-like protein. Suitable cells are anti-CD33-like proteins
Can be recognized by their ability to bind quality antibodies. Such cells
These can be cultured in an appropriate tissue culture medium. However, 10% fetal bovine serum (at about 56 ° C)
Inactivated), and about 10 μg / L of non-essential amino acids, about 1000 U / mL
Eagle's modification with the addition of nicillin and about 100 μg / mL streptomycin.
Preferably, the cells are cultured in a modified Eagle's medium. , Extract splenocytes of such mice
And fused with a suitable myeloma cell line. Any myeloma cell line according to the invention
Can be used. But American Type Culture Collection, Rockville
Parental myeloma cell line (SP) available from MarylandTwoUse O)
Is preferred. After fusion, the resulting hybridoma cells are selected in HAT medium
And then described in Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)).
Clone by limiting dilution as described. Gained by such a choice
Analyzed hybridoma cells bind to CD33-like protein antigen
Identify clones that secrete the resulting antibodies.
Alternatively, an additional antibody capable of binding to a CD33-like protein antigen is
It can be produced in a two-step method using anti-idiotype antibodies. That
Such methods use the fact that antibodies are themselves antigens, and
To obtain an antibody that binds to the second antibody. According to this method, the CD
An animal, preferably a mouse, is immunized using a 33-like protein specific antibody. Next
Then, hybridoma cells are prepared using spleen cells of such an animal, and the
Screens hybridoma cells and binds to CD33-like protein specific antibody
That the ability of the antibody to bind to
Identify clones producing the body. Such an antibody is a CD33-like protein
Anti-idiotypic antibodies to quality-specific antibodies and used to immunize animals
The formation of specific CD33-like protein-specific antibodies.
Fab and F (ab ')TwoAnd other fragments of the antibodies of the invention are described herein.
It can be used according to the method of. Such a fragment was prepared by papain (Fab cleavage).
Fragments) or pepsin (F (ab ')TwoEnzymes that produce fragments)
And is typically prepared by proteolytic cleavage. Or CD3
The 3-like protein binding fragment can be prepared by applying recombinant DNA technology or chemically.
It can be produced by synthetic synthesis.
In vivo imaging increases CD33-like protein for tumor diagnosis in humans
"Humanized" chimeric monochrome when used to detect
It may be preferable to use a null antibody. Such an antibody is
Manufactured using genetic constructs derived from hybridoma cells producing null antibodies.
Can be built. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For example, Morr
ison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabilly et al.
U.S. Pat. No. 4,816,567; Taniguti et al., EP 171496; Morrison et al.
Neuberger et al., WO8601533; Robinson et al., WO8.
702671; Bouulianne et al., Nature 312: 643 (1984); Neuberger et al., Nature 314.
: 268 (1985).
Further suitable labels for the CD33-like protein specific antibodies of the invention are described below.
Describe. Examples of suitable enzyme labels include malate dehydrogenase, staphyloco
Cass nuclease, Δ5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydro
Genase, α-glycerol phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomer
Rase, peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glue
Course oxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease,
Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and
And acetylcholinesterase.
Examples of suitable radioisotope labels include:ThreeH,111In,125I,131I,32P,35
S,14C,51Cr,57To,58Co,59Fe,75Se,152Eu,90Y,67Cu
,217Ci,211At,212Pb,47Sc,109Pd and the like.111In is
By the liver125I or131Question on dehalogenation of I-labeled monoclonal antibody
Is the preferred radioisotope when using in vivo imaging because it avoids the
. In addition, the radionucleotides provide more favorable gamma radiation for imaging.
With energy (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 10: 296-301 (1085); Cara
squillo et al. Nucl. Med. 28: 281-287 (1987)). For example, 1-
(P-isothiocyanatobenzyl) -DPTA catalyzes monoclonal antibodies
Pulled up111In is hardly taken up by non-neoplastic tissues, especially liver
And thus increased specificity for the location of the tumor (Esteban et al.)
, J. et al. Nucl. Med. 28: 861-870 (1987)).
Examples of suitable non-radioactive isotopic labels include:157Gd,55Mn,162Dy,52Tr, you
And56Fe is included.
Examples of suitable fluorescent labels include:152Eu label, fluorescein label, isothiocyan
Nate label, rhodamine label, phycoerythrin label, phycocyanin label,
Rophycocyanin label, o-phthalaldehyde label, and fluorescamine label
Is included.
Examples of suitable toxin labels include diphtheria toxin, lysine, and cholerato
Contains xin.
Examples of chemiluminescent labels include luminal labels, isoluminal labels, and aromatic acrylics.
Dinium ester label, imidazole label, acridinium salt label, oxalate
Includes stele label, luciferin label, luciferase label and aequorin label
You.
Examples of nuclear magnetic resonance contrast agents include heavy metal nuclei such as Gd, Mn and iron.
Typical techniques for coupling the above labels to antibodies are described in Kennedy et al., (Clin. Chi.
m. Acta 70: 1-31 (1976)), and Schurs et al., (Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977)).
))It is described in. The coupling technique mentioned in the latter is
Aldehyde method, periodate method, dimaleimide method, m-maleimidobenzyl-N-
The hydroxy-succinimide ester method, all of which are for reference only.
Constitutes a part of the present specification.
Treatment
CD33 is a clone from about 90% of acute myeloid leukemia (AML) patients
Expressed by productive leukemia cells. About 60-70% of adults with AML
Although they experience complete remission after chemotherapy, the majority of these patients have leukemia
Death eventually results from relapse (Robertson et al., Blood 79: 2229-2236 (1992)). C
Like D33, the CD33-like protein of the present invention is derived from the majority of AML patients.
Is thought to be expressed by clonal leukemia cells.
Post-remission therapy is better if the patient is treated with an allogeneic bone marrow transplant
. However, this mode of treatment is often dependent on the age of the patient or the appropriate donor.
Because there is no, some people can not. An alternative is to treat the patient in remission.
It uses the bone marrow collected during the period. However, leukemia cells remain
As such, such an allograft could lead to relapse in the patient. Therefore,
Need for a method to remove leukemia cells from autograft tissue in advanced AML patients
There is. Such methods selectively remove or remove tumor cells but do not
Necessary hematopoietic stem cells ideally include the use of acceptable cytotoxic agents
. Studies have shown that most white blood cells cannot replicate continuously
I have. However, these cells have a different surface antigen phenotype than other cells
Supposedly lacking the CD33-like protein antigen of the present invention.
Caused by a small number of leukemic "stem cells".
The present invention removes leukemic hematopoietic cells from autologous tissues of AML patients
A method is provided for: This method can be used, for example, in posterior iliac crests from AML patients.
Bone marrow (BM) is obtained by percutaneous aspiration from
BM mononuclear cells were isolated and an anti-CD33-like protein monoclonal antibody (MoA
B), for example, 3-5 times, incubation at 4-6 ° C. for 15-30 minutes
Followed by incubation with rabbit complement at about 37 ° C. for 30 minutes (optimal
Rabbit complement tested for specific cytotoxicity of Roy et al., Leuk. Res 14: 407
(1990)). The patient is then
Et al., Blood 79 (9): 2229 (1992), as described in myeloablative chemotherapy (myeloa
After being subjected to blative chemotherapy), the treated BM is treated according to standard techniques.
And reinfusion. According to the present invention, hematopoietic cells required for engraftment are tolerated and simultaneously
Loan-producing tumor cells are removed from the bone marrow.
In a further aspect, the invention relates to the expression of a CD33-like protein antigen of the invention.
In vivo methods to selectively kill or inhibit the growth of tumor cells
Offer. Such tumor cells include metastatic tumors, leukemias and lymphomas.
I will. The method blocks the signaling pathway of the CD33-like protein receptor.
Administering to the patient an effective amount of the harmful antagonist. According to the present invention,
Administration of such a CD33-like protein antagonist to a patient also
Useful for treating inflammatory diseases, including inflammation and colitis.
The antagonist used in the present invention may be a CD33-like polypeptide or
Polyclonal and monoclonal antibodies raised against the fragment
You. Such antagonist antibodies raised against CD33-like polypeptides
See Caron et al., Cancer Research 52: 6761 (1992); Juric et al., Cancer Research (Su
ppl.) 55: 5908s-5910s (1995); Robertson et al., Blood 79: 2229-2236 (1992).
Can be manufactured as listed.
Other potential antagonists include antisense molecules. A
Using antisense DNA or RNA, or using antisense technology.
Gene expression can be controlled by the formation of heavy helices. Antisense technology
Are described, for example, in Okano, J., Neurochem. 156: 560 (1990); Oligodeoxynucleotidesas
Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988
)It is described in. Triple helix formation is described, for example, by Lee et al., Nucleic Acids Reserc.
h 6: 3073 (1979); Conney et al., Science 241: 456 (1988); Dervan et al., Science 251: 1.
360 (1991). The method involves complementary DNA to the polynucleotide.
Or binding to RNA. For example, encoding the mature protein of the invention
Using the 5 'coding portion of a polynucleotide, it is about 10-40 base pairs in length.
Antisense RNA oligonucleotides can be designed. DNA ori
Gonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription,
It blocks transcription and receptor production. Antisense RNA oligonucleotide
Leotide hybridizes to mRNA in vivo and is a receptor for mRNA molecules.
-Block translation into polypeptides. The above oligonucleotides also
Antisense RNA or DNA is expressed in vivo to inhibit receptor production
Can be delivered to the cells.
Further antagonists of the invention include soluble forms of the CD33-like protein,
That is, a CD33-like protein fragment containing the extracellular region of the full-length receptor is included.
It is. Such soluble forms of the receptor may be natural or synthetic
Cell surface CD3 for binding to the CD33 receptor ligand.
CD33-like proteins that mediate signaling by competing with 3-like proteins
Antagonizes protein.
As shown, the polyclonal and monoclonal antibodies of the present invention antagonis
Are described in WO 93/20848 and US Pat. No. 5,239,062.
Can be triggered according to the method used. As used herein, "antibody" (A
The term b) or "monoclonal antibody" (mAb) can bind to an antigen.
Possible complete molecules and fragments thereof (eg, Fab and F (ab '))TwoFragments)
Is included. Fab and F (ab ')TwoThe fragment is an Fc fragment of a complete antibody
And removes it more quickly from the circulation, reducing nonspecific tissue binding of intact antibodies.
(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
Antibodies of the invention can be used in a variety of methods using the CD33-like protein immunogens of the invention.
Can be manufactured. As shown, such a CD33-like
Protein immunogens include full-length CD33-like protein polypeptides (leader
(With or without sequences) and extracellular, transmembrane, and
Included are CD33-like protein polypeptide fragments, such as intravesicular regions.
In a preferred method, the antibodies of the invention are MoAbs. Such MoAbs are:
It can be manufactured using the hybridoma technology described above (Kohler and Milstei
n, Nature 256: 495-497 (1975) and U.S. Patent No. 4,376,110; Harlow et al.
, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, NY, 1988; Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New D
imension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, NY, 1980; Campb
ell, “Monoclonal Antibody Technology,” In: Laboratory Techniques in Bioc
hemistry and Molecular Biology, Volume 13 (ed. by Burdon et al.), Elsevier, Amsterd
am (1984)).
It is further contemplated that within the scope of the present invention is a hybrid that produces the mAb described above.
Humanized textures produced using genetic constructs derived from bridoma cells
La antibody. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. Morrison
Et al., Science 229: 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986);
Further, Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567 (3/28/89); Taniguchi et al., EP
O Patent Publication EP171496 (2/19/86); Morrison et al., EPO Patent Publication EP17.
3494 (3/5/86); Neuberger et al., PCT Publication No. WO8601533 (3/13/86).
Robinson et al., PCT Publication No. WO8702671 (5/7/87); Bouulianne et al., Nature
312: 643-646 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985).
A particularly preferred method for producing an anti-CD33-like protein humanized MoAb is
Caron et al., Cancer Res 52: 6761 (1992).
Proteins and other compounds that bind to the CD33-like protein region are also described in this article.
It is a candidate antagonist of the invention. Such a binding compound is a yeast 2 hybrid
Can be "captured" using a field system (Fields and Song, Nature 3
40: 245-246 (1989)). An improved method for the yeast two-hybrid system is described in Roger Brent and
And his colleagues (Gyuris, J. et al., Cell 75: 791-803 (1993); Zervos, A.S. et al., Cell 7.
2: 223-232 (1993)). Briefly, CD33-like polypep
The region of the tide is used as a bait for the binding compound. Then the positive one
As described in great detail in the past (Gyuris, J. et al., Cell 75: 791-803).
(1993)), X-ga after selection by its ability to grow on plates lacking leucine.
Further test for the ability to turn blue on the plate with l. Preferably
Use the yeast two-hybrid system in accordance with the present invention to provide CD33-like extracellular
Binding to either the gand binding region or the intracellular region of the CD33-like protein
Capture the compound. Such compounds are excellent candidates for antagonists of the present invention.
is there. This system binds to the intracellular region of the p55 and p75 TNF receptors.
Previously used to isolate matching proteins (95/31544).
The present invention further provides a CD as described above as a vehicle for the selective killing of tumor cells.
Methods for using a 33-like protein binding compound are provided.
The specificity of binding compounds for CD33-like proteins depends on their affinity.
Can be determined. The dissociation constant (KD= 1 / K, where K is the affinity constant)
<1 μM, preferably <100 nM, most preferably <1 nM,
Such specificity exists. Antibody molecules typically have a low range of KDWill have
. KD= [RL] / [R] [L] (where [R], [L] and [RL] are
Sceptor or CD33-like protein (R), ligand, antibody or peptide (
L) and the receptor-ligand complex (RL) at equilibrium.
). Typically, the binding between the ligand or peptide and the receptor or antibody
Interactions include electrostatic interactions, van der Waals forces, and hydrogen bonding.
Which includes reversible non-covalent bonds.
Other analysis formats include the Receptor-Effector Coupring-A Practical Approach
, Hulme, IRL Press, Oxford (1990).
modulation), internalization, or increased phosphorylation
Presence or absence of various physiological or chemical changes resulting from interactions such as addition
May be detected.
Gelonin is a glycoprotein purified from the seeds of Gelonium multiforum
(Molecular weight about 29-30,000 Kd). Gelonin is a potent ribosome inactivator
Belongs to the class of plant toxins. Others of this class of ribome-inactivating phytotoxins
Members are chains of abrin, lysine and modeccin. Gelonin
Damages the 60S subunit of mammalian ribosomes, like abrin and lysine
Scars inhibit protein synthesis. Gelonin is chemically and
Seems to be stable to physical processing. In addition, gelonin itself binds to cells.
Non-toxic (except at high concentrations) because they do not
It is safe. Ribosome inactivation is irreversible and does not involve cofactors.
And occurs with an efficiency that suggests that gelonin is acting enzymatically.
Based on protein weight, gelonin and lysine inhibit protein synthesis.
It is one of the most active toxins to harm. Gelonin is an inhibitor of protein synthesis
Thus, it is 10 to 1000 times more active than the ricin A chain. Peptide-like lysine
And abulin are composed of two chains, the A chain is a toxic unit, and the B chain is a fine chain.
It works by binding to vesicles. Unlike lysine and abrin, gelonin
Is composed of one chain and lacks the B chain for binding to cells
In addition, itself is relatively non-toxic to intact cells.
Mammalian cells apparently bind and / or bind to native gelonin molecules.
Lack the ability to rise. CD33-like protein binding compound of the present invention and gero
The complex of nin is a specific method for binding gelonin to cells and gelonin-binding
It provides both a route for internalization of the compound conjugate.
When the CD33-like protein binding compound is MoAb, immunotoxin specific
The cytotoxic moiety is a cytotoxic agent or an enzymatically active toxin of bacterial or plant origin.
Or an enzymatically active fragment of such a toxin ("A-chain"). enzyme
Active toxins and fragments thereof are preferred, including the following: Gelonin
, Diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin
A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modexin
A chain, α-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phyt
ojacca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S), mo
mordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponaria, officinal
is inhibitors, mitgeline, restrictocin, phenomycin, and eno
Mycin. Most preferred is a complex with gelonin.
Coupling with anti-CD33-like protein MoAb to form immunotoxin
The resulting biological response modifiers include IL-1, IL-2, interferon (α,
β or γ), lymphokines such as TNF, LT, TGF-β and IL-6 and
And cytokines. Modification of these biological responses
Factors have various effects on tumor cells. Their actions include direct effects
Increases tumor cell killing, as well as tumor cell killing by increased host defense-mediated processes
There is an increase in wounds. Complexation of MoAbs with these biological response modifiers is
Allowing for selective localization within the tumor and thus improved antiproliferative effects,
It suppresses non-specific effects that lead to toxicity to non-target cells.
Cytotoxic agents (and derivatives thereof) useful in the present invention include Adriamycin
Cis-platinin complex, bleomycin, and methotrexate
But not limited to these. These cytotoxic agents are useful in the clinical management of recurrent tumors.
Although useful, its use is associated with severe side effects and damage to non-target cells. MoA
b provides an effective means of both delivering to the tumor and enhancing entry into the tumor cells themselves
Serve as a useful carrier for such drugs. In addition, cytotoxic drug antibodies to tumors
Delivery is due to the adverse effects of chemotherapeutic drugs, livers that do not express CD33-like protein
It will provide protection for sensitive sites such as the kidney and bone marrow stem cells. All
Because the drug moiety is conjugated to antibodies that are concentrated inside the tumor or leukemia
The use of a drug conjugated to a carrier antibody as a delivery system,
You can lower your own dose.
Monoclonal antibody conjugates use various bifunctional protein coupling agents.
Can be manufactured using Examples of such reagents are SPDP, iminothiola
Bifunctional derivatives of imide esters such as dimethyl (IT), dimethyl adipimidate,
HCl, active esters such as disuccinimidyl suberate, glutaraldehyde
Aldehydes such as aldehydes and bis such as bib (p-azidobenzoyl) hexanediamine
-Azide compounds, bi- (p-diazoniumbenzoyl) ethylenediamine and other bi
diisocyanes such as s-diazonium derivatives and triene 2,6-diisocyanate
Bis-activated fluorocarbons such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene
Element compound.
When used in vivo for therapy, immunotoxins can be used in human or animal
In a therapeutically effective amount, i.e., an amount that removes or reduces the tumor area, or
Given in an amount that removes residual disease after early treatment with
You. Usually, it is administered parenterally, preferably intravenously. Dosage, usage depends on the nature of the leukemia
And its size, characteristics of individual immunotoxins, such as their therapeutic indicators,
And the patient's medical history. The amount of immunotoxin to administer is
Typically, it will range from about 0.01 to about 1.0 mg / kg (patient weight).
For parenteral administration, administer the immunotoxin in a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle.
Into unit dosage forms (solutions, suspensions, emulsions) that are injectable with the drug.
You. Such vehicles are essentially non-toxic and non-therapeutic. That's it
Examples of such vehicles are water, saline, Ringer's solution, dextran solution,
And 5% human serum albumin. Non-oils such as solid fats and ethyl oleate
Aqueous vehicles can also be used. Ribosomes can be used as carriers. Vehicle
,
Small amounts of substances that increase homotoxicity and chemical stability, such as buffers and preservatives
May be included. Immunotoxin is present in such vehicles at about 0.
It is typically formulated at a concentration of 1 mg / mL to 10 mg / mL.
The immunotoxin of the present invention is used in a method for killing tumor cells in bone marrow.
You can also. In this method, a person with a neoplastic disease, such as leukemia,
And remove the bone marrow. The bone marrow can then be used to kill cells of the
Treat with notoxin.
Having generally described the invention, the invention has been described by way of illustration only.
More easily by reference to the following examples, which are not intended to be limiting
Will be appreciated.
Example
Example 1 Expression in E. coli
DN encoding a CD33-like protein in a deposited polynucleotide
A sequence is a carboxy-terminal sequence of amino acids of CD33-like protein and
PCR oligonucleotide ply specific for 3 'vector sequence to gene
Amplify using a marker. Further including restriction sites to facilitate cloning
Nucleotides are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.
The 5 'oligonucleotide primer has the following sequence
5 'CGCCCATGGAGAAGCCAGTGTACGAG 3 '
(SEQ ID NO: 4) and underlined coding for the AUG of the start point within the NcoI site
NcoI restriction site, followed by nucleotides 85-1 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
CD33-like protein cDNA having a nucleotide sequence represented by No. 02
Contains 8 nucleotides.
The 3 'primer has the following sequence
5 'CGCAAGCTTTCAAGAGCCGCTCTGGGACCC 3 '
(SEQ ID NO: 5), the underlined BamlHI restriction site, FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
) Is complementary to the nucleotide sequence represented by nucleotides 1285 to 1302
Nucleotides of CD33-like protein cDNA having a unique nucleotide sequence
Contains.
The restriction site is a bacterial expression vector used for bacterial expression in these examples.
Convenient for restriction enzyme sites in pQE-60. (Quiagen, Inc. 9259 Eton
Avenue, Chatsworth, CA, 91111) pQE60 is an ampicillin antibiotic resistant (
"Ampr"), encodes a bacterial origin of replication ("ori"), and is IPTG-inducible
Promoter, ribosome binding site ("RBS"), 6-His tag and restriction
Contains enzyme sites.
Both the amplified DNA and the vector pQE60 were ligated with NcoI and HindIII.
After digestion with, ligate each other. Encodes a CD33-like protein
The amplified cDNA is inserted into pQE60, and its coding region is inserted into the IP of the vector.
So that it is operably linked downstream of the TG inducible promoter;
AUG and inflation appropriately located for translation of CD33-like protein
Place it on the
The ligation mixture was subjected to competent E. coli using standard methods. coli cells
Transformation. Such a method is described in Sambrook et al., Molecular Clonjng: A Laborato.
ry Mannual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb
or, N.Y. (1989). Lac repressor expresses kanamycin
E containing multiple copies of plasmid pREP4 conferring resistance ("kanr")
. E. coli strain M15 / rep4 is used in the practice of the examples described herein. This
Is just one of many strains suitable for expressing CD33-like proteins.
But commercially available from Qiagen.
Transformants are based on their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin.
Identify. Plasmid DNA was isolated from resistant colonies and cloned DN
A's identity is confirmed by restriction analysis.
Clones containing the desired constructs were isolated with ampicillin (100 μg / mL)
In a liquid medium of LB medium supplemented with both isine (25 μg / mL) overnight (“O
/ N ").
O / N cultured cells are diluted about 1: 100-1: 250 to inoculate large scale cultures.
use. Optical density at 600 nm ("OD600") is 0.4-0.6
Culture the cells until Then, isopropyl-BD-thiogalactopyranoside
("IPTG") to a final concentration of 1 mM and add the lacI repressor.
Inactivation induces transcription from lac repressor-sensitive promoter
Lead. The cells are then incubated for an additional 3-4 hours. Standard one
According to the method, cells are collected by centrifugation and disrupted. Inclusion body,
Purified from disrupted cells using conventional harvesting techniques and included in 8M urea
Solubilize protein from the body. 8M urine containing solubilized protein
The undiluted solution was loaded onto a PD-10 column in 2 × phosphate buffered saline (“PBS”).
To remove the urea and exchange the buffer to refold the protein.
To The expressed protein is purified by a further chromatography step,
Excluding exotoxins. This is then sterile filtered. Sterile filtered protein preparation
Are stored at a concentration of 95 mg / mL in 2 × PBS.
Example 2: Expression in mammalian cells (CHO, COS and others)
Transient expression of cDNA encoding CD33-like protein in mammalian cells
Most of the vectors used for have an SV40 origin of replication. As a result,
Cells (eg, COS cells) that express the T antigen required to initiate DNA synthesis of ils
Enables the replication of the vector with a high copy number. Any other mammalian cell
Systems can also be used for this purpose.
Typical mammalian expression vectors contain promoters involved in the initiation of mRNA transcription.
Element, protein coding sequence, and termination of transcription and its transcript
Contains the signals necessary for polyadenylation of Additional elements include en
Donors and acceptors for Hansers, Kozak sequences, and RNA splicing
The site contains intervening sequences at both ends. Highly efficient transcription is derived from SV40
Early and late promoters such as RSV, HTLVI, HIVI, etc.
Long terminal repeats (LTRs) derived from cytomegalovirus (CMV)
This can be achieved with an early promoter. However, cell signals (eg, human
Cutin, promoter). Suitable for use in the practice of the present invention.
Such expression vectors include, for example, pSVL and pMSG (Pharmacia, Uppsala).
,
Sweden), pRSVcat (ATCC37152), pSV2dhfr (ATCC37
146) and pBC12MI (ATCC 67109). Can be used
Mammalian host cells include human Hela, 283, H9, and Jurkart cells, mouse
NIH3T3 and C127 cells, Cos1, Cos7 and CV1 Africa
Green monkey cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells and Chinese ham
Star ovary cells are included.
Alternatively, the gene may be placed in a stable cell line with the gene integrated into a chromosome.
Can be expressed. dhfr, gpt, neomycin, hygromycin,
Co-transfection with a selectable marker such as
Enables the identification and isolation of isolated cells.
Amplify transfected genes to produce large amounts of encoded protein
It can also be manifested. DHFR (dihydrofolate reductase)
Useful markers for developing cell lines with hundreds or even thousands of offspring
It is. Another useful selectable marker is the glutamine synthase (GS) enzyme.
(Murphy et al., Biochem J. 227: 277-275 (1991), Bebbington et al., Bio / Technology).
10: 163-175 (1992)). Use these markers to transform mammalian cells in selective media
Culture and select cells with the highest resistance. These cell lines are organized into chromosomes.
Includes the amplified gene incorporated. Chinese hamster ovary (CHO) fine
Vesicles are often used for the production of proteins.
Expression vectors pC1 and pC4 are strong promoters of Rous sarcoma virus
-(LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-4470 (198).
March 2005) and a fragment of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)).
Contains. For example, many of the restriction enzyme cleavage sites BamHI, Xbal and Asp718
The double cloning site facilitates cloning of the gene of interest. Vector isa
In addition, the 3 'intron, polyadenylation of the rat preproinsulin gene and
And a stop signal.
Example 2A: Generation of extracellular soluble region of CD33-like protein in COS cells
Present
A cDNA encoding a CD33-like protein is transformed into an expression vector pcDNAI / A
mp (available from Invitrogen, Inc.).
Produce rasmid.
The expression vector pcDNAI / Amp contains the following: c
oli and other prokaryotic cells that are effective for growth in E. coli. coli origin of replication; (2) Plasmi
Ampicillin resistance gene for the selection of prokaryotic cells containing
SV40 origin of replication for growth in (4) restriction sites in the polylinker
Thus, the cDNA is conveniently placed under the control of CMV promoter expression,
To be operably linked to a V40 intron and a polyadenylation signal.
The CMV promoter, polylinker, SV40 intron, and
Polyadenylation signal.
DNA fragment encoding extracellular soluble region of CD33-like protein and its 3 'end
The HA tag fused in-frame to the end was inserted into the polylinker region of the vector.
Clonin so that recombinant protein expression is driven by the CMV promoter
To The HA tag is an influenza tag described in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984).
Corresponds to an epitope derived from the Zahemagglutinin protein. HA tag targets
The fusion to the protein is performed by a recombinant protein using an antibody that recognizes the HA epitope.
Enables easy detection of
The plasmid construction method is as follows. Many have CD3 in colj
CD of the deposited clone as described above for expression of the 3-like protein
Amplify 33-like protein cDNA using primers containing convenient restriction sites
. To facilitate the detection, purification and characterization of the expressed CD33-like protein,
One of the primers includes a hemagglutinin tag ("HA tag") as described above.
I have.
Suitable primers include the following and are used in this example:
5 'primer CGCGGATCCGCCATCATGCTGCCCCTGCT
GCTG3 ′ (SEQ ID NO: 6) is composed of the underlined BamHI site and FIG. 1 (SEQ ID NO:
CD3 having the nucleotide sequence represented by nucleotides 37 to 54 of 1)
Contains the first 18 nucleotides of the coding region of the 3-like protein cDNA.
The 3 'primer contains an underlined XbaI site, a stop codon, and a hemagglutinin tag.
And the transmembrane region (bps 1285 to 130) shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
It is complementary to the last 18 bp nucleotide sequence before 2) and has the following sequence:
Yes: 5 'CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGT
CGTATGGGGTAAGAGCCGCTCTGGGACCC 3 ′ (SEQ ID NO: 7
).
PCR amplified DNA fragment and vector, pcDNAI / Amp
Ligation after digestion with XbaI. The ligation mixture was added to E. coli. co
li SURE strain (Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road
, La Jolla, CA 92037) and transformed cells
Plate on an ampicillin medium plate and incubate it
Grow phosphorus-resistant colonies. Isolating plasmid DNA from resistant colonies,
The presence of the fragment encoding the CD33-like protein was determined by restriction analysis and gel fractionation.
And test.
For expression of recombinant CD33-like proteins, see, eg, Sambrook et al., Molecular
Clonjng: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, using the DEAE-DEXTRAN described in New York (1989).
The COS cells are transfected with the expression vector as described. By vector
The cells are incubated under conditions for expression of the CD33-like protein. CD33
Expression of the HA-like protein / HA fusion protein is described, for example, in Harlow et al., Antibodies:
Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr
radiolabeling and immunization using the method described in Ining Harbor, New York (1988).
Detected by sedimentation. For this purpose, two days after transfection,
Cells35Incubating for 8 hours in a medium containing S-cysteine
Therefore, label. Collect cells and media, wash cells, and use Wilson et al., Cited above.
PIPA buffer with detergent: 150 mM NaCl as described in
1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50m
Dissolve by M TRIS (pH 7.5). HA specific monoclonal antibody
Used to precipitate proteins from cell lysates and media. Next
In SDS-PAGE gel and autoradiography
Analyze by Expected size expression product is found in cell lysates
, Not found in the negative control.
Example 2B: Expression and purification of human CD33-like protein using CHO expression system
DNA sequence encoding CD33-like protein at the deposited nucleotide
The column contains the carboxy-terminal sequence of the CD33-like protein and 3
'Using vector specific PCR oligonucleotide primers
Width. 5 additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning
'And 3' sequences respectively.
Both the full-length gene and the nucleotide sequence encoding the extracellular soluble region
5 'primer for 5' CGCGGATCCGCCATCATGCTGC
It has the sequence of CCCTGCTGCTG 3 ′ (SEQ ID NO: 09), and the underlined Bam
Shown at the HI restriction site and nucleotides 37-54 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
The coding region of the CD33-like protein cDNA having the nucleotide sequence
Contains the first 18 nucleotides. 3 'ply for full length gene
Ma, CGCGGTACCTCAGTGGCTCCTCCAGCCAGG3 '
(SEQ ID NO: 8), the underlined Asp718 restriction site and FIG.
No. 1) to the nucleotide sequence represented by nucleotides 1713 to 1730
Contains nucleotides of the cDNA of a CD33-like protein having a complementary sequence
You. The 3 'primer for the extracellular region is 5' CGCGGTACCTCAAGA
It has the sequence of GCCGCTCTGGGACCC3 '(SEQ ID NO: 10), and the underlined A
sp718 restriction site and nucleotides 1285-13 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
CD3 having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by No. 02
Contains 18 nucleotides of the 3-like protein cDNA. The restriction site is C
This is convenient for restriction enzyme sites in the HO expression vector PC4.
Both the amplified CD33-like protein DNA and the vector PC4 were converted to BamHI
And ligate the digested DNA to each other. CD33-like protein
Quality DNA is inserted into a BamHI restricted vector and its CD33-like protein
The coding region is operably linked downstream of the vector promoter.
So that The ligation mixture is transferred to competent E using standard methods.
. coli cells. Such a method is described in Sambrook et al., Molecular Clonin.
g: A Laboratory Manual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y. (1989).
Example 3: Clonin of CD33-like protein in baculovirus expression system
And expression
Soluble extracellular region or full-length CD33-like tan in the deposited clone
The cDNA sequence encoding any of the protein receptors is replaced with the 5 'and 5'
And using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 3 'sequence
You.
The 5 'primer for expression of either the extracellular region or the full length protein is
, 5 'CGCGGATCCGCCATCATGCTGCCCCTGCTGCTG
3 ′ (SEQ ID NO: 09), the underlined BamHI restriction site and FIG. 1 (SEQ ID NO:
C) having a nucleotide sequence represented by nucleotides 37 to 54 of No. 1);
Contains the first 18 nucleotides of the coding region of the D33-like protein cDNA
In. As described below, when inserted into an expression vector, a CD33-like protein
The 5 'end of the amplified fragment encoding the protein provides an effective signal peptide
. Effective signals for initiation of translation in eukaryotic cells are described in Kozak, M., J .; Mol
. Biol. 196: 947-950 (1987), the vector portion of the construct
Properly placed.
The 3 'primer for the full-length gene is a full-length sequence CGCGGTACCT
It has CAGTGGCTCCTCCCAGCCAGG (SEQ ID NO: 8), and has an underlined As
p718 restriction site and nucleotides 1713-17 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
CD33-like protein having a sequence complementary to the nucleotide sequence represented by No. 30
Contains the nucleotides of the quality cDNA. The 3 'primer for the extracellular region is
, 5 'CGCGGTACCTCAAGAGCCGCTCTGGGACCC3 '(distribution
Column 10), the underlined Asp718 restriction site and FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
of
A nucleotide complementary to the nucleotide sequence represented by nucleotides 1285 to 1302
18 nucleotides of a CD33-like protein cDNA having a nucleotide sequence
Contains.
The amplified fragment was prepared using a commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc.
, La Jolla, Ca) using a 1% agarose gel. The fragment is then
Digest with mHI and Asp718 and purify again on a 1% agarose gel. This fragment
Is referred to herein as F2.
Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No
. Using standard methods, such as those described in 1555 (1987), the vector
Expression of CD33-like protein in baculovirus expression system using pA2
Let it. The expression vector is Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcM
NPV) containing the strong polyhedrin promoter followed by convenient restriction sites.
It is. For easy selection of recombinant viruses, E. coli. β-galact from E. coli
Insert the sidase gene in the same direction as the polyhedrin promoter, followed by
Insert the polyadenylation signal of the hedrin gene. Cell-mediated, wild-type
For homologous recombination with viral DNA, the polyhedrin sequence is replaced with the viral sequence.
Viable cells that express the cloned polynucleotide
Manufacture Irus.
Many other baculovirus vectors, such as pAc373, pVL941 and
And pAcIMI can be used instead of pA2. However, those skilled in the art will easily recognize
As such, the construct is transcribed, such as an in-frame AUG and a signal peptide.
Provide appropriately arranged signals for translation, transfer, etc. as needed. So
Such vectors are described, inter alia, in Luckow et al., Virology 170: 31-39.
Plasmids were transformed with BamHI and Asp using routine methods known in the art.
After digestion with 718 restriction enzyme, it is dephosphorylated using calf intestinal phosphatase.
You. The commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La.
DNA is isolated from a 1% agarose gel using Jolla, Ca). This DNA
Is herein referred to as V2.
The F2 fragment and the dephosphorylated V2 fragment were combined with each other by T4 DNA ligase.
Ligation. E. Transform E. coli HB101 cells with the ligation mix
Convert and spread on culture plate. Individually using BamHI and Asp718
After digestion of the colony-derived DNA, the digestion product is analyzed by gel electrophoresis.
By doing so, the cells containing the plasmid having the human CD33-like protein gene
Identify the fungus. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing.
You. This plasmid is referred to herein as pBac / CD33-like protein.
5 μg of pBac / CD33-like protein and 1.0 μg of commercially available line
Baculovirus DNA ("BaculoGoldTMBaculovirus DNA "
, Pharminigen, San Diego, CA) as described in Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84: 7413-7417 (1987) using the lipofection method.
To 1μg BaculoGoldTMViral DNA and 5 μg of plasmid pBac / C
D33-like protein was added to 50 μL of serum-free Grace's medium (Life Technolo
gies Inc., Gaithersburg, MD) containing microtiter plates
Mix in. Then, 10 μL of lipofectin and Grace's medium 90
Add μL, mix and incubate for 15 minutes at room temperature. Next,
A 35 mm set containing 1 mL of serum-free Grace's medium without serum
Drop to Sf9 insect cells (ATC CCRL1711) seeded on a woven culture plate
You. The plate is shaken back and forth to mix the newly added solution. Next,
The plate is incubated at 27 ° C. for 5 hours. 5 hours later, transfection
The solution was removed from the plate and 1 mL of Grace supplemented with 10% fetal bovine serum was added.
Add 's insect medium. Return the plate to the incubator and incubate at 27 ° C for 4 days.
Keep feeding.
Four days later, the supernatant was collected as described in Summers and Smith, cited above,
Perform plaque assay. "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gai
agarose gel with the addition of thersburg), and
Facilitates the identification and isolation of proteins. The clone forms a blue-stained plaque
I do. (A detailed description of this type of "plaque assay" can be found at Life Technologies In
c., Cultured insect cells and baculois distributed by Gaithersburg, p9-10
It can also be found in the instruction book on Luthology).
Four days after serial dilution, the virus is added to the cells. After a suitable incubation
The blue-stained plaque is picked up with the tip of an Eppendorf pipette. Then
The agar containing the recombinant virus was added to an eppe containing 200 μL of Grace's medium.
Resuspend in an Ndorf tube. Remove the agar by brief centrifugation and
Using the supernatant containing the urovirus, Sf9 cells seeded on a 35 mm dish were sensitized.
Dye. Four days later, the supernatants of these cultured cell dishes were collected and then placed at 4 ° C.
To save. Clones containing a properly inserted CD33-like protein receptor
Are identified by DNA analysis, including restriction mapping and sequencing. this
Here, it is referred to as V-CD33-like protein.
Sf9 cells are cultured in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS
I do. Cells were recombinantly vaccinated at a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 (about 1-3).
Infected with rovirus V-CD33-like protein. After 6 hours, remove the medium
Medium lacking, methionine and cysteine (Life Technologies
Inc., Gaithersburg). 42 hours later, 5 μCi35With S-methionine35
Add S-cysteine (available from Amersham). Incubate the cells for another 16 hours.
After incubation, they were collected by centrifugation, lysed, and SDS-PAGE.
And visualize the labeled protein by autoradiography.
Example 4: Tissue distribution of CD33-like protein mRNA expression
In particular, Northern blots were performed using the method described in Sambrook et al., Cited above.
Analysis of the gene encoding the CD33-like protein in human tissues
I checked the current level. The full-length nucleotide sequence of the CD33-like protein of the present invention (the sequence
The cDNA probe containing column number 1) was replaced with rediprimeTMDNA labeling system (Amers
ham Life Science) according to the manufacturer's instructions32Labeled with P. Sign
After that, the probe was changed to CHAROMA SPIN-100.TMColumn (Clontech Labo
ratories, Inc.) and according to the manufacturer's protocol number PT1200-1.
And purified. The CD33-like protein is then purified using the purified labeled probe.
Various human tissues were examined for expression of the quality-encoding gene.
Multiple tissue Northern containing various human tissues (H) or human immune system tissues (IM)
(MTN) blots were obtained from Clontech and according to the manufacturer's protocol PT1190-1.
Therefore ExpressHybTMUsing hybridization solution (Clontech)
Inspection was carried out using a probe. After hybridization and washing, blots are
Fix, expose to film overnight at -70 ° C, and fill according to standard methods.
Developed.
As shown in FIG. 3, the gene encoding the CD33-like protein of the present invention was expressed.
It is currently highest in hematopoietic tissues, including bone marrow, peripheral blood leukocytes, and spleen (
FIG. 3, lanes 10, 11, and 15 respectively show lymph nodes, appendix, lung and placenta (Fig.
3, can be detected in other tissues such as lanes 14, 12, 5, and 6) respectively.
You.
It is apparent that the present invention may be practiced other than as specifically described in the above description and examples.
It is easy.
Numerous modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings,
And they are within the scope of the appended claims.
All disclosures of patents, patent applications, and publications cited in this specification are
Form a part of the specification.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 19/02 A61P 19/02
29/00 29/00
35/00 35/00
35/02 35/02
C07K 14/47 C07K 14/47
16/18 16/18
C12N 1/21 C12N 1/21
5/10 C12P 21/02 C
C12P 21/02 C12N 5/00 B
//(C12N 1/21
C12R 1:19)
(C12P 21/02
C12R 1:19)
(C12P 21/02
C12R 1:91)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AM,AU
,BG,BR,BY,CA,CN,CZ,EE,FI,
GE,HU,IL,JP,KG,KP,KR,KZ,L
T,LV,MD,MN,MX,NO,NZ,PL,RO
,RU,SG,SI,SK,TJ,TM,TR,UA,
US,UZ,VN
(72)発明者 ジェンツ,ライナー・エル
アメリカ合衆国20904メリーランド州 シ
ルバー・スプリング、フェアランド・パー
ク・ドライブ13404番
(72)発明者 ローゼン,クレイグ・エイ
アメリカ合衆国20882メリーランド州 レ
イトンズビル、ローリング・ヒル・ロード
22400番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 19/02 A61P 19/02 29/00 29/00 35/00 35/00 35/02 35/02 C07K 14/47 C07K 14/47 16/18 16/18 C12N 1/21 C12N 1/21 5/10 C12P 21/02 C C12P 21/02 C12N 5/00 B // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT , LU, MC, NL, PT, SE), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AM, AU, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IL, J , KG, KP, KR, KZ, LT, LV, MD, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, UA, US, UZ, VN ( 72) Inventor Gents, Rainer El. United States 20904 Fairland Park Drive, No. 13404, Silver Spring, Maryland Rosen, Craig A United States 20882 Rolling Hill, Raytonsville, MD 20882 Road 22400