JP2001502331A - Cytokine-enhanced immunotherapy for brain tumors - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 全身投与用の薬学的に受容可能なキャリア中のサイトカインと局所投与用の薬学的に受容可能なキャリア中のサイトカインとの組み合わせを利用する、ガン患者の処置のための治療が記載される。最も好ましい実施態様では、脳腫瘍は、全身投与されたGM-CSFのようなサイトカイン（最も好ましくは、複製不能腫瘍細胞のような腫瘍抗原と組み合わせて）、および、局所投与されたIL-2またはIL-4のようなサイトカイン（最も好ましくは、形質導入された細胞、また最も好ましくは複製不能腫瘍細胞のような、ある期間にわたって放出を提供するビヒクル中で、あるいは、ポリマーミクロスフェアのような微小粒子化ビヒクル中に組み込まれて）で処置される。   (57) [Summary] A therapy for the treatment of a cancer patient utilizing a combination of a cytokine in a pharmaceutically acceptable carrier for systemic administration and a cytokine in a pharmaceutically acceptable carrier for local administration is described. In a most preferred embodiment, the brain tumor comprises systemically administered cytokines such as GM-CSF (most preferably in combination with a tumor antigen such as non-replicable tumor cells) and locally administered IL-2 or IL-2 Cytokines such as -4 (most preferably in transduced cells, and most preferably in vehicles that provide release over a period of time, such as non-replicable tumor cells, or microparticles such as polymeric microspheres (Incorporated in a cosmetic vehicle).

Description

【発明の詳細な説明】 脳腫瘍に対するサイトカインで増強した免疫療法 発明の分野 本発明は、サイトカインを使用して全身的および局所的免疫療法の組み合わせ を投与することによってガンを処置することの分野にある。 連邦政府の権利 台衆国政府は、米国国立衛生研究所，Bethesda，Marylandの国立ガン研究所の National Cooperative Drug Discovery Group UOI-CA52857による助成金によっ て、本発明に特定の権利を有する。 発明の背景 合衆国単独内のすべての個体の３分の１はガンを発生する。５年生存率は、早 期診断および治療の進歩の結果としてほぼ50パーセントまで劇的に上昇したが、 ガンはなお、合衆国における死亡原因として心臓病に次いで第２位のままである 。アメリカ人の20パーセントはガンで死亡し、その半分は肺ガン、乳ガン、およ び結直腸ガンによる。 ガンの患者に対する効果的な処置を設計することは、主要なチャレンジを意味 している。外科手術的切除、外部ビーム照射治療、および／または全身的化学療 法の現在の治療法は、悪性腫瘍のいくつかの種類で部分的に成功しているが、他 では満足な結果を生じていない。脳悪性腫瘍のような、いくつかの悪性腫瘍では 、この治療法は、１年未満の生存中央値を生じる。例えば、再切除された悪性グ リオーマの90％が、１年以内に元の腫瘍部位の２センチメートル内に再発する。 全身的化学療法の使用は、ガンのいくつかの種類で効果的であるが、結腸-直 腸、食道、肝臓、膵臓、および腎臓のガンの処置で少し成功していた。これらの タイプのガンの処置のための全身的化学療法での主な問題は、腫瘍増殖の制御を 達成するために必要とされる全身用量が、許容されない全身毒性を頻繁に生じる ことである。腫瘍部位への化学療法剤の送達を改良するための努力は、例えば、 連続的全身注入によるような、器官特異的化学療法の進歩を生じた。しかし、抗 ガン薬物の連続的注入は、一般的に、パルスまたは短期注入よりも明確な有用性 を示していない。自己シールしたシリコーン横隔膜を有する移植可能なエラスト マーアクセスポートもまた、連続的注入のために試用されているが、溢血が問題 のままである。携帯型注入ポンプは、現在送達デバイスとして利用可能であり、 そして有効性について評価されている。（一般的総説については、Harrlson's P rinciples of Internal Mediclne ，431-446頁，Braunwald，E.ら編，McGraw-Hil l Book Co．(1987)を参照のこと）。徐放性生体適合性ポリマーが、局所的薬物 送達にうまく使用されており、そして避妊、インスリン治療、処置治療、喘息治 療、歯科関連疾患の予防、およびあるタイプのガンの化学療法に利用されている 。（Langer，R.およびWise，D.編，Medical Applications of Controlled Relea se ，IおよびII巻，Boca Raton，CRC Press(1986)）。 脳において、中枢神経系の悪性新生物を有する患者の処置のために有効な抗腫 瘍剤の設計および開発は、２つの主要な要因によって影響を受けている：1)血液 -脳関門は、これらの腫瘍への薬物のアクセスを限定する解剖学的閉塞症を与え る；および2)高い全身レベルで投与される薬物は、一般的に細胞傷害性である。 脳における腫瘍床への薬物送達を改良するための努力には、血液脳関門の一過性 浸透破壊、脳脊髄液灌流、およびカテーテルを使用する脳腫瘍への直接注入が含 まれている。各技術は、顕著な制限を有している。血液脳関門の破壊は、正常な 脳への親水性物質の取り込みを増加させたが、腫瘍への物質の輸送を顕著に増加 させなかった。脳脊髄液に投与される薬剤の小さな画分のみが、実際に、脳実質 へ浸潤した。注入によって腫瘍を処置するために使用されている薬物は不適切で あり、注入の部位から適切な距離に拡散せず、すなわち持続拡散勾配を可能にす るために十分な濃度で維持され得なかった。カテーテルの使用は、詰まりのため に、感染、障害、および機能不全の高い割合によって複雑化されている。Tomlta ，T.，「lnterstltial chemotherapy for brain tumors:revlew」，J．Neuro-On cology，10:57-74（1991）を参照のこと。 免疫系の理解の近年の進歩および腫瘍細胞に対するＴ細胞抗原を定義すること の進歩は、免疫療法で腫瘍を処置することの有望な結果を示している。これらの 新しいアプローチのいくつかは、腫瘍抗原に対する弱い宿主免疫応答を増大させ ることを目的とし、そして抗体、細胞性免疫療法、およびサイトカインの使用を 含む。抗体の使用は、抗体の特異性が非腫瘍細胞に著しく結合しないものである ことを必要とするので、困難である。抗体に基づく免疫療法アプローチが設計さ れる場合、選択するための真の腫瘍特異的抗原はほとんどない。細胞性免疫療法 は、腫瘍を有する宿主内へ抗腫瘍反応性を有する培養された免疫細胞の導入を包 含する。自己リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞での養子治療は、サイトカ インまたは化学療法薬物の存在下でのみ印象的な結果を得た。免疫応答を増強す るために細胞に直接投与されたサイトカインの使用もまた、成功したことが示さ れている。Abbasら，「Immunityto to Tumors」，372頁，Cellular and Molecul ar Immunology ，第2版，W.B．Saunders Company（1994）を参照のこと。しかし 、高用量の全身投与が毒性であり得そして局所投与によって連続的放出を提供す ることが問題であり得る点で、サイトカインの効果的な投与は、化学療法剤の投 与に関して上記と同じ障害に苫しむ。 それゆえ、本発明の目的は、腫瘍、特に脳腫瘍に対する増強された免疫応答を 提供し、治療効率を改善し、そして潜在的毒性を減少させる、組成物およびその 使用方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、腫瘍、特に脳腫瘍の処置のための組成物および使用 方法を提供することであり、これは、複数のその後の腫瘍チャレンジに対して強 力な抗腫瘍応答を生じ得る長期記憶を確立する。 発明の要旨 全身投与用の薬学的に受容可能なキャリア中のサイトカインと、局所投与用の 薬学的に受容可能なキャリア中のサイトカインとの組み合わせを利用する、がん の患者の処置のための治療が記載される。最も好ましい実施態様では、脳腫瘍は 、最も好ましくは、複製不能腫瘍細胞のような腫瘍抗原と組み合わせて、全身投 与される顆粒球マクロファージーコロニー刺激因子（GM-CSF）のようなサイトカ インで、そして最も好ましくは形質導入された細胞、さらに最も好ましくは複製 不能腫瘍細胞のようなある期間にわたる放出を提供するビヒクル中でか、または ポ リマーミクロスフェアのような微小粒子ビヒクルに組み込まれた、局所投与され るインターロイキン-2（IL-2）またはIL-4のようなサイトカインで処置される。 実施例は、GM-CSFで形質導入された腫瘍細胞またはマイクロカプセル化された GM-CSFでの全身投与（ワクチン接種）が、頭蓋内黒色腫の増殖に対して防御する ことを示す。実施例はまた、IL-2で形質導入した腫瘍細胞またはマイクロカプセ ル化されたIL-2の局所的頭蓋内送達が、中枢神経系内の即時抗腫瘍応答、ならび に中枢神経系外のチャレンジを含む、複数のその後の腫瘍チャレンジに対する強 力な抗腫瘍応答を生じ得る長期記憶を生じることを示す。実施例はさらに、GM-C SF形質導入体での全身ワクチン接種およびIL-2形質導入体の局所的頭蓋内投与を 使用する組み合わせ免疫療法が、いずれかの処置単独での処置と比較して著しく 増強される抗腫瘍効果を生じることを示す。 図面の簡単な説明 図１は、100,000（白丸）、10,000（白四角）、1,000（白三角）、および100 （黒四角）の用量で野生型B16-F10黒色肺細胞の定位的頭蓋内注入、ならびに細 胞を含まない生理食塩水（黒丸）を投与されている頭蓋内黒色腫の実験動物モデ ルの、時間経過（日）での生存のパーセントを示すグラフである。 図２は、GM-CSFを分泌するための遺伝子導入によって操作された10⁶の照射さ れたB16-F10細胞（黒四角）、培地（白丸）、または10⁶の照射されたB16-F10野 生型非サイトカイン産生細胞（白四角）の単回皮下注射での全身ワクチン接種後 、脳における10²の非照射野生型B16-F10黒色腫細胞の注射を14日後にチャレンジ されたマウスの、時間経過（日）での生存のパーセントを示すグラフである（p ＜0.001）。 図３は、IL-2を分泌するための遺伝子導入によって操作された10⁵の照射され たB16-F10細胞（黒四角）、培地（白丸）、または10⁵の照射されたB16-F10野生 型非サイトカイン産生細胞（白四角）の単回頭蓋内注入で処置され、10²の非照 射野生型B16-F10細胞の定位性頭蓋内同時注入で同時にチャレンジされたマウス の、時間経過（日）での生存のパーセントを示すグラフである（p＜0.001）。 図４は、10⁶の照射されたGM-CSF産生B16-F10黒色腫細胞の皮下注射でワクチン 接種され、次いで２週後に５×10⁴の照射された住-2分泌B16-F10細胞を頭蓋 内投与され、そして同時に10²の非照射野生型B16-F10細胞（黒四角）の頭蓋内同 時注射でチャレンジされた動物の、時間経過（日）での生存のパーセントを示す グラフである。コントロール動物は、GM-CSFワクチン単独、続いて野生型B16-F1 0細胞での頭蓋内腫瘍チャレンジ（×マーク）を受け、または培地単独でのワク チン接種、続いて頭蓋内IL-2治療および腫瘍チャレンジ（白丸）を受けた。追加 のコントロールは、培地でのワクチン接種、続いて培地での頭蓋内治療および頭 蓋内腫瘍チャレンジ（白四角）を受けた。 発明の詳細な説明 腫瘍の処置のための治療が開発されており、これは、免疫系の最初の全身的「 プライミング」の組み合わせ、最も好ましくは、腫瘍細胞に対する免疫応答を増 強するIL-2のようなサイトカインの腫瘍部位（または腫瘍除去後の切除の部位） での局所的放出とともに、GM-CSFのようなサイトカインと複製不能腫瘍細胞のよ うな腿瘍抗原との投与の組み合わせを介しての組み合わせに頼る。局所放出は、 いくつかの手段のいずれかを使用して得られ得るが、好ましい方法は、少なくと も数日の期間にわたりサイトカインを放出するための微小粒子、または形質導入 された細胞、最も好ましくは放出されるべきサイトカインをコードする遺伝子で 形質導入される複製不能腫瘍細胞を使用することである。後者は、移植後少なく とも５日間放出することが示される。微小粒子は、数時間と数週間の間、または 必要ならば数カ月間でさえ放出されるように設計され得る。 実施例は、全身投与されたGM-CSF、ならびに頭蓋内に投与されたIL-2およびIL -4を使用する、脳腫瘍のインビボ処置を示す。しかし、種々のサイトカインが使 用され得る。同様の結果が、他の腫瘍タイプの処置について期待される。 Ｉ．治療組成物 ａ．サイトカイン ｉ．顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子。顆粒球-マクロファージコロ ニー刺激因子（GM-CSF）は、活性化Ｔ細胞によって、ならびに活性化単核食細胞 、血管内皮細胞、および線維芽細胞によって作成された22kDの糖タンパク質であ る。GM-CSFは、骨髄由来抗原提示細胞の刺激による全身性免疫応答をプライムす るこ とが示されている。Inaba，K.ら，J．Exp．Med.，175:1157-67(1992)；Inaba，K .ら，J．Exp．Med.，176:1693−702(1992)；Steinman，R.，Annual Rev．Immuno logy，9:271-81(1991)を参照のこと。GM-CSFを形質導入した腫瘍細胞でのインビ ボ研究は、このサイトカインの局所放出が、CD4+およびCD8+腫瘍特異的Ｔリンパ 球の生成、ならびに腫瘍チャレンジからの全身的防御を生じることが明らかにす る：Dranoff，G.ら，Proc．Natl．Acad．Scj．U.S.A.，90:3539-43(1993)。 ii．インターロイキン-2。インターロイキン-2（IL-2）は、CD4+ Ｔ細胞に よって産生され、そしてCD8+ Ｔ細胞によってより少量産生される。分泌されたI L-2は、ヒトの第４染色体上の単一の遺伝子によってコードされる14〜17kDの糖 タンパク質である。IL-2は、それを産生する同じ細胞に作用し、すなわち、これ は自己分泌増殖因子として機能する。IL-2はまた、CD4+およびCD8+の両方の細胞 を含む、他のＴリンパ球に作用する。IL-2は、Ｔ細胞のヘルパーおよび細胞傷害 性の両方のサブセットの活性化を導く局所炎症応答を誘導する。IL-2はまた、ナ チュラルキラー細胞の増殖を刺激し、そしてその細胞溶解機能を増強する。IL-2 分泌腫瘍細胞を用いたインビボ研究は、強力な局所的および全身的抗腫瘍免疫応 答が生じ、それによって脇腹における形質導入された腫瘍の破壊を導くことを示 す。Fearon，E.R.ら，Cell，60:397-403(1990)；Gansbacher，B.ら，J．Exp．Me d.，172:1217-24(1990)。 iii．腫瘍壊死因子。腫瘍壊死因子（TNF）は、もともとは、エンドトキシン のような細菌性リポ多糖（LPS）に曝露された動物の血清中に存在する腫瘍壊死 のメディエーターとして同定された。TNFの主な内因性供給源は、LPS活性化単核 食細胞であるが、抗原刺激されたＴ細胞、活性化されたナチュラルキラー細胞、 および活性化されたマスト細胞もまたこのタンパク質を分泌し得る。単核食細胞 では、TNFは、最初は、約25kDの非グリコシル化膜貫通タンパク質として合成さ れる。TNFは、インビトロで強力な抗腫瘍作用を有するが、進行したガン患者に おけるTNFの臨床試験は、毒性のため中断している。TNF-αは、インターロイキ ン-6、インターロイキン-8、GM-CSF、および顆粒球-コロニー刺激因子のような 多くのサイトカインの発現を誘導すること、ならびに樹立された腫瘍における出 血性壊死を引き起こすことを包含する、異なる範囲の生物学的特性を有する。TN Fは、腫瘍細胞を標的化したTNF-α遺伝子導入の後に腫瘍抑制を生じることが報 告されている。Blankenstein，T．ら，J．Exp．Med.，173:1047-52(1991)。 iv．インターロイキン-4。インターロイキン-4（IL-4）は、抗Ig抗体（抗原 のアナログ）の存在下でマウスＢ細胞の増殖を刺激し、そして休止Ｂ細胞の拡大 ならびにクラスII MHC分子の発現の増加を引き起こす、約20kDのヘルパーＴ細胞 由来サイトカインである。IL-4の主な内因性供給源は、CD4+ Ｔリンパ球からで ある。活性化したマスト細胞および好塩基球、ならびにいくつかのCD8+Ｔ細胞は また、IL-4を産生し得る。頭蓋内に送達されたIL-4は、IL-4で形質導入した腫瘍 の末梢投与後の観察に類似の抗腫瘍活性を提示する。Golumbek，P.T.ら，Scienc e，254:713−6(1991)；Yu，J.S.ら，Cancer Res.，53:3125−8(1993)。 ｖ．ガンマインターフェロン。ガンマインターフェロン（IFN-γ）は、約21 〜24kDサブユニットを含むホモダイマー糖タンパク質である。IFN-γは、いくつ かのCD4+ヘルパーＴ細胞およびほぼすべてのCD8+ Ｔ細胞によって産生される。 転写は、抗原活性化の結果として直接開始され、そしてIL-2およびインターロイ キン-12によって増強される。IFN-γはまた、ナチュラルキラー細胞によって産 生される。IFN-γは、単核食細胞の強力なアクチベーターとして作用し、その分 化を促進するためにＴおよびＢリンパ球に直接作用し、そしてナチュラルキラー 細胞の細胞溶解活性を刺激するために作用する。IFN-γで形質導入した非免疫原 性肉腫は、野生型腫瘍細胞に対するCD8+ Ｔ細胞を誘起することが報告されてい る。Restlfo，N.ら，J．Exp．Med.，175:1423-28(1992)。 vi．インターロイキン-3。インターロイキン-3（IL-3）は、多系列コロニー 刺激因子としても公知であり、これはほとんどの未成熟骨髄前駆体に作用し、そ してすべての公知の成熟細胞タイプに分化する細胞の拡大を促進する、CD4+ Ｔ 細胞の20〜26kD産物である。IL-3は、CD4依存的メカニズムによって腫瘍反応性 細胞障害性Ｔ細胞の発生を増強することが報告されている。Pulaskl，B.A.ら，C ancer Res.，53:2112-57(1993)。 vii．インターロイキン-6。インターロイキン-6（IL-6）は、IL-1およびよ り低い程度でTNFに応じて、単核食細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、および他 の細胞によって合成される約26kDのサイトカインである。これは、いくつかの活 性化されたＴ細胞によって作製される。Lewis肺ガン腫瘍細胞にトランスフェク トされたIL-6は、悪性表現型を抑制することおよび親転移細胞に対する免疫療法 的能力を与えることが報告されている。Porgador，A.，CancerRes.，52:3679-87 (1992)。 viii．インターロイキン-7。インターロイキン-7（IL-7）は、Ｂリンパ球系 統に委ねられた（committed）造血細胞前駆体に作用する骨髄間質細胞によって 分泌されるサイトカインである。IL-7は、CD42+ Ｔ細胞依存性腫瘍拒絶を誘導す ることが報告されている。Hock，H.ら，J．Exp．Med.，174:1291-99(1991)。 ix．顆粒球-コロニー刺激因子。顆粒球-コロニー刺激激因子（G-CSF）は、G M-CSFを作製する同じ細胞によって作製される。分泌されたポリペプチドは、約l 9kDである。G-CSF遺伝子導入は、マウス腺ガンの腫瘍形成能を抑制することが報 告されている。Colombo，M.ら，CancerRes.，52:4853-57(1991)。 ｘ．他のサイトカイン。他のサイトカインは、抗腫瘍効果を有することが当 該分野で公知であり、そして本明細書中に記載の薬学的組成物に使用され得る。 さらに、サイトカインは、他のサイトカインに対する効果を有することが公知で あるので、上記のサイトカインの１つを誘起するサイトカインを投与し得るか、 または誘起されるサイトカインの１つを直接投与し得る。追加のサイトカインは 、当業者に公知であり、そしてAbbasら，「Cytoklnes」，第12章，239-61頁，Ce llular and Molecular Immunology ，第２版，W.B．Saunders Company(1994)に記 載される。 ｂ．他の生物学的に活性な化合物との組み合わせ サイトカインはまた、他のサイトカイン、抗体、抗腫瘍反応性を有する培養さ れた免疫細胞（LAK細胞を含む）、または化学療法剤（照射治療を含む）と組み 合わせて投与され得る。活性化合物は、投与のためのサイトカインと同じビヒク ル中に組み込まれ得るか、または別々のビヒクルで投与され得る。 ｉ．化学療法剤。 サイトカインは、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて使用され得る 。化学療法剤の例としては、パクリタキセル、カンプトテシン、テルノソラミド 、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素（BCNU）、アドリアマイシンのよ う な細胞傷害性薬剤、シスプラチンのようなプラチナ薬物、酪酸誘導体のような分 化薬剤、因子α-Pseudomonasエキソトキシン融合タンパク質のようなトランスフ ォーミング増殖因子、およびモノクローナル抗体81C6のような腫瘍抗原、特にグ リオーマ抗原に対する抗体が挙げられる。これらの薬剤は、サイトカインととも に送達のためにポリマーマトリクス中に組み込まれ得る。例えば、Dombら，Poly m．Prepr.，32(2):219-220(1991)を参照のこと、これは、水溶性化学療法剤カル ボプラチン（シスプラチンのアナログ）、および4-ヒドロパーオキシシクロホス ファミドを、腫瘍を処置するために生分解性ポリマーマトリクスに組み込むこと 、ならびに有望な結果を得ることを報告した。 ii．他の薬学的に活性な化合物。 これらの実施態様の変更において、腫脹を減少させるために使用されるステロ イド抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、または抗血管新生化合物のような、他 の薬学的に活性な化合物を含むことが所望され得る。例えば、脳浮腫を制御する ために全身に使用される合成副腎皮質ステロイドであるデキサメタゾンは、非生 分解性ポリマーマトリクスに組み込まれ、そして脳浮腫を逆にすることの効率に ついてインビトロおよびインビボでラット脳で試験されている。含まれ得る他の 化合物は、保存剤、抗酸化剤、および充填剤、ポリマー放出速度を変化するため にも利用され得るコーティングまたは増量剤である。 ｃ．サイトカイン処方物 サイトカインは、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、サイトカインをコー ドする遺伝子で形質導入した細胞、微小粒子、または他の従来のビヒクルのよう な薬学的に受容可能なキャリア中で投与され得る。 ｉ．ポリマー処方物 サイトカインは、固形腫瘍の処置における使用のために、生体適合性ポリマー マトリクス（最も好ましくは生分解性）にカプセル化され得る。サイトカインは 、好ましくは、治療に有効な時間、通常は８時間〜５年、好ましくは１週間〜１ 年にわたって拡散および／または分解によって放出される。本明細書で使用され る場合、マイクロカプセル化とは、ミクロスフェア、微小粒子、またはマイクロ カプセルの上にまたは中にまたはこれらに組み込まれることを包含する。マイク ロ カプセルは、ミクロスフェアおよび微小粒子と交換可能に使用されるが、カプセ ル化の分野の当業者には、処方方法、放出の特徴、およびこれらの種々の様式間 の組成の差を認識することが理解される。ミクロスフェアは、生理食塩水のよう な生理学的に適合可能な溶液中で、直接移植または送達され得る。 生体適合性ポリマーは、生分解性および非生分解性として分類され得る。生分 解性ポリマーは、化学組成、製造方法、および移植構築物の関数としてインビボ で分解する。合成ポリマーおよび天然ポリマーが使用され得るが、合成ポリマー は、より均一で、ならびに再生可能な分解および他の物理学的特性のため好まし いかもしれない。合成ポリマーの例には、ポリ無水物、ポリヒドロキシル酸（例 えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマー）、ポリエステ ル、ポリアミド、ポリオルトエステル、ならびにいくつかのポリホスファゼンが 挙げられる。天然に存在するポリマーの例には、コラーゲン、ヒアルロン酸、ア ルブミン、およびゼラチンのような、タンパク質および多糖が挙げられる。理想 的なポリマーはまた、強力であり、さらに、使用中に砕けるまたは断片にならな いように十分に可撓性でなければならない。 サイトカイン、および必要に応じて他の薬物または添加物は、移植物の内部、 全体、および／または表面上にカプセル化され得る。サイトカインは、ポリマー 、またはその組み合わせの拡散、分解によって放出される。生分解性ポリマーの ２つの一般的クラスがある：バルク腐食によって分解するポリマーおよび表面腐 食によって分解するポリマー。後者のポリマーは、より直線的な放出が必要とさ れる場合に好ましい。放出の時間は、化学組成を変化させることによって；例え ば、セバシン酸（SA）のようなモノマーとコポリマー形成されるp-カルボキシフ ェノキシプロパン（CPP）のような芳香族のモノマーの量を増加させることによ って、操作され得る。特に好ましいポリマーは、CPP-SA（20:80）である。制御 された送達デバイスにおけるポリ無水物の使用は、Leongら，J．Med．Bjomed．M ater．Res.，19:941(1985)；J．Med．Bjomed．Mater．Res.，20:51(1986)；およ びRosenら，Biomaterials，4:131(1983)によって報告されている。物質の制御さ れた送達についてのポリ無水物の使用を記載する米国特許には、DombおよびLang erに対する米国特許第4,857,311号、Langerらに対する米国特許第4,888,176号、 お よびDombおよびLangerに対する米国特許第4,789,724号が挙げられる。ポリ乳酸 、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーのような他のポリマーは、多く の年にわたり縫合糸物質として市販されており、そして薬物送達のためのデバイ スに容易に形成され得る。 非生分解性ポリマーは、長時間（年）にわたってインビボで完全なままである 。非生分解性ポリマーマトリクスにロードされた薬剤は、持続されおよび予測可 能な様式でポリマーの微孔格子を通る拡散によって放出され、これは、サイトカ インのローディングのパーセント、マトリクスの孔性、および移植物構造を変化 させることによって、速いまたはより遅い放出速度を提供するために適合され得 る。エチレン-酢酸ビニルコポリマー（EVAc）は、タンパク質および他の巨大分 子についての局所送達システムとして使用されている非生分解性ポリマーの一例 であり、Langer，R.およびFolkman，J.，Nature(London)，263:797-799(1976)に 報告される。他には、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、およびいくつかの ポリホスファゼンが挙げられる。 好ましい実施態様では、単一のポリマーおよび放出されるべきサイトカインは 、送達デバイスに組み込まれるが、他の生体適合性、好ましくは生分解性または 代謝性物質が処理する目的で、および追加の治療剤が含まれ得る。 緩衝剤、酸、および塩基は、組成物のpHを調節するために使用される。移植さ れたポリマーから放出される薬剤の拡散距離を増加させるための薬剤も、含まれ 得る。 充填剤は、バルクを添加するために処方物に組み込まれる水溶性または不溶性 物質である。充填剤のタイプには、糖、スターチ、およびセルロースが含まれる 。処方物中の充填剤の量は、代表的には、約１と約90重量％との間の範囲である 。 スフェロ化(spheronization)エンハンサーは、球状移植物の産生を容易にする 。ゼイン、微結晶性セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム と同時加工された微結晶性セルロースのような物質は、処方物ならびに移植物の 強度および完全性に可塑性を与える。スフェロ化の間、剛性であるが可塑性でな い押出物(extrudate)は、ダンベル成形された移植物の形成および／または微粒 子の高い割合を生じる。可塑性であるが剛性ではない押出物は、塊になり、そし て 過剰に大きい移植物を形成する傾向がある。剛性と可塑性との間のバランスは、 維持されなければならない。処方物中のスフェロ化エンハンサーのパーセントは 、他の賦形剤特性に依存し、そして代表的には10〜90％(w/w)の範囲にある。 分解化剤は、液体の存在下、移植物の破壊を促進する物質である。分解化剤の 機能は、処方物に使用される任意の結合物質の効果を相殺または中和することで ある。分解のメカニズムは、大部分は、水分吸着、および不溶性物質による湿潤 が含まれる。分解化剤の例には、クロスマルメロースナトリウムおよびクロスポ ビドンが挙げられ、これらは、代表的には、総移植物重量の１〜20％の範囲で移 植物に組み込まれる。多くの場合、糖（マンニトールおよびラクトース）のよう な可溶性充填剤はまた、移植物の分解を容易にするために添加され得る。 界面活性剤は、可溶性の乏しいまたは疎水性物質の湿潤性を増強するために移 植処方物に必要であり得る。ポリソルベートまたはラウリル硫酸ナトリウムのよ うな界面活性剤は、必要であれば、低い濃度で、一般的には５％未満で使用され る。 結合剤は、粉末を結合しそして移植物統合性を維持するために、移植処方物に 組み込まれる接着性物質である。結合剤は、乾燥粉末としてまたは溶液として添 加され得る。糖ならびに天然および合成ポリマーは、結合剤として作用し得る。 結合剤として特異的に添加される物質は、一般的に、移植処方物の約0.5〜15％w /wの範囲に含まれる。微結晶性セルロースのようなある物質はまた、スフェロ化 エンハンサーとして使用され、追加の結合特性も有する。 種々のコーティングが、移植物の特性を改変するために適用され得る。コーテ ィングの３つのタイプは、封入、光沢、および腸溶である。封入コートは、水性 ベースの腸溶コーティングの適用中の移植物による過剰の水分取り込みを抑制す る。光沢コーティングは、最終産物の取り扱いを改善する。ヒドロキシプロピル セルロースのような水溶性物質は、封入コートおよび光沢コート移植物に使用さ れ得る。封入コートおよび光沢コートは、一般的に、約0.5％と約５％との間、 好ましくは封入コートについては約１％および光沢コートについては約３％の重 量増加が得られるまで、移植物上にスプレーされる。 腸溶コーティングは、胃の低いpH（3.0未満）で不溶性であるポリマーからな リマーが使用され得、そして水溶液または懸濁液から移植物上への薄膜として層 にされる。腸溶コートは、一般的に、約１〜約30％、好ましくは約10〜約15％の 重量増加までスプレーされ、そして可塑剤、界面活性剤、コーティング中の移植 物の厚さを減少させる分離剤、およびコーティング透過性調節剤のようなコーテ ィングアジュバントを含み得る。種々の溶解または腐食特性を有する他のタイプ のコーティングは、移植物行動をさらに改変するために使用され得る。このよう なコーティングは、当業者に容易に公知である。 制御放出デバイスは、代表的には、いくつかの方法のうちの１つで調製される 。例えば、ポリマーは、融解され、送達されるべき物質を混合され、次いで冷却 によって固化され得る。このような融解された製作プロセスは、送達されるべき 物質およびポリマーが分解しまたは反応性になる温度以下である融点を有するポ リマーを必要とする。あるいは、デバイスは、溶媒キャスティングによって調製 され得、ここでポリマーは、溶媒に溶解され、そして送達されるべき物質はポリ マー溶液に溶解または分散される。次いで、溶媒は、エバポレートされ、ポリマ ーマトリクス中に物質を残す。溶媒キャスティングは、ポリマーが有機溶媒に可 溶性でありそしてカプｔル化される薬剤が溶媒に可溶性または分散性であること を必要とする。同様のデバイスは、相分離または乳化あるいはさらにスプレー乾 燥技法によって製造され得る。さらに他の方法では、ポリマーの粉末が、サイト カインと混合され、次いで移植物を形成するために圧縮される。 移植物を製造する方法はまた、顆粒形成、押出、およびスフェロ化を包含する 。所望の賦形剤およびミクロスフェアを含む乾燥粉末ブレンドが製造される。乾 燥粉末は、水、あるいは油のようなミクロスフェア用の他の非溶媒とともに顆粒 化され、そして押出機スクリーンを通過するような湿った塊になった物質の「ス トリング」または「ファイバー」を形成する押出機を通過する。押出物ストリン グは、ストリングの破壊、および粒子と、スフェロ化機壁と、回転スフェロ化機 ベースプレートとの間の反復した接触によって、球状粒子を形成するスフェロ化 機中に配置される。移植物は乾燥され、そして凝集物および微細粉を除去するた め にスクリーニングされる。これらの方法は、微小移植物（放出されるべきサイト カインをカプセル化する微小粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセル） 、スラブまたはシート、フィルム、チューブ、および他の構造物を製造するため に使用され得る。 ii．サイトカインを分泌する遺伝子操作した細胞 サイトカイン分泌細胞は、全身または局所的にサイトカインを送達するために 、当該技術分野で公知の方法によって遺伝子操作され得る。細胞は、細菌または ウイルスDNAベクターで、それぞれ形質転換または形質導入のいずれかが行われ 得る。好ましい実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。複製を抑制しそしてサイ トカイン産生を保存するために、形質導入された細胞は、インビボ注入の前に照 射され得る。腫瘍細胞の有利点は、患者が、サイトカインに対する免疫応答を刺 激するサイトカインと組み合わせて、抗原に曝露されることである。IL-4を分泌 するように操作された腫瘍細胞の調製の例は、Golumbek，P.T．ら，Scjence，25 4:713-6(1991)およびYu，J.S.ら，Cancer Res．53:3125-8(1993)に記載される。 腫瘍細胞へのIL-2遺伝子輸送は、Gansbacher，B.ら，J．Exp．Med.，172:1217-2 4(1990)に記載される。ＧＭ−ＣＳＦを分泌するように操作された腫瘍細胞は、D ranoff，G.ら，Proc．Natl．Acad．Scj．U.S.A.，90:3539-43(1993)に記載され る。TNF遺伝子輸送は、Blankenstein，T.ら，J．Exp．Med.，73:1047-52(1991) に記載される。肺ガン腫瘍細胞へのIL-6トランスフェクションは、Progador，A. ら，CancerRes.，52:3679-87(1992)に記載される。非免疫原性肉腫へ形質導入さ れたγIFN cDNAは、Restlfo，N.，J．Exp．Med.，175:1423-28(1992)に記載され る。G-CSF遺伝子輸送は、Colombo，M.ら，CancerRes.，52:4853-57(1991)に記載 される。IL-3およびIL-7を含む他のサイトカインは、上記のサイトカインについ て使用される方法を適用することによって、あるいはKarp，S.E.ら，Ｊ．Immuno l.，150:896-908(1993)およびJaffee，E.ら，J．Immunotherapy，印刷中(1995) に記載される非免疫原性のマウス線維肉腫を遺伝的に改変するための一般的手順 によって、細胞から分泌され得る。上記の刊行物は、サイトカインを分泌するた めに細胞を遺伝子操作する方法を記載する。さらに、２つの異なるサイトカイン をコードする遺伝子を含む操作されたベクターから、または連続組換え レトロウイルス媒介遺伝子形質導入によって、２つ以上のサイトカインを発現す るガンワクチンが、調製され得る。適切な薬学的ビヒクルは、当業者に公知であ る。 インデューサーはまた、サイトカインを分泌する細胞を産生するために使用さ れ得る。インデューサーは、いくつかの場合は単独で、あるいはトランスフォー ミング薬剤と組み合わせて使用され得、そして腫瘍壊死因子（TNF）、エンドト キシン、および当業者に公知の他の薬剤を含む。一般に、培養された細胞は、サ イトカイン発現、免疫グロブリン分泌、および／または細胞表面の特性もしくは マーカーの増殖もしくは変化のような他の指標によって決定されるような、細胞 を活性化するために有効な量に曝露される。いくつかの場合、細胞は、最初に、 細胞を「プライム」するために少量に、次いで細胞のより大きな活性化を誘起す るためにその後の用量に曝露される。 細胞は、培地中で投与されるか、または生理食塩水中で洗浄および投与され得 る。あるいは、細胞は、ポリマーマトリクスにカプセル化されそして投与され得 る。 II．患者への投与 本明細書に記載のサイトカインまたはその機能的等価な誘導体は、他の化学療 法または照射治療または手術を使用する処置の前、同時に、もしくは処置に続い てのいずれかで、単独でまたは組み合わせて投与され得る。好ましい実施態様は 、本明細書に記載のように決定した投与量を使用して、GM-CSFのような第１のサ イトカインの、最も好ましくは、複製不能腫瘍細胞の形態の腫瘍抗原と組み合わ せての全身投与であり、その後、手術中の局所投与、または選択されたサイトカ インもしくはサイトカイン分泌細胞のいずれかとともにロードされた生体適合性 ポリマーマトリクスの注射が続く。局所投与は、除去されるべき腫瘍に隣接する 部位、または腫瘍中、または腫瘍が除去された場所であり得る。機能的に等価な 誘導体の投与量は、インビボデータから推定され得る。有効量は、より長い生存 時間または腫瘍サイズの減少のいずれかによって測定される場合に抗腫瘍効果を 誘導するために十分な量である。 局所投与はまた、例えば、インスリンまたは化学療法剤を特定の器官または腫 瘍に送達するために使用されるタイプの、注入ポンプを使用することによって達 成され得る。 投与の好ましい方法では、ポリマー移植物またはサイトカイン分泌細胞は、例 えば、離れた部位での皮下注射によって、ポリマー移植物またはサイトカイン分 泌細胞の全身投与の２週後に、腫瘍の部位に移植される。生分解性ポリマーが使 用されるならば、好ましくは、これらは、約100〜200ミクロン未満の直径であり 、そしてカテーテルまたはシリンジによって注入される；免疫療法剤の放出後に 移植物を除去する必要はない。 サイトカインはまた、放射線療法、全身または局所に投与される化学療法剤、 および他の免疫療法を含む、他の治療様式と組み合わされ得る。 サイトカインは、好ましくは、脳ガン患者に投与される。しかし、サイトカイ ン組み合わせ治療はまた、乳ガン、肺ガン、および結腸ガンを有する患者を含む 、すべてのガン患者に適用され得る。処置は、局所投与の部位で即時応答を提供 し、ならびに局所投与の部位でおよび局所投与の部位から離れた部位でガンに対 する長期記憶防御を提供する。したがって、本明細書に記載の免疫療法は、転移 を予防または処置することに有用である。 III．実施例。 本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解され る。 実施例１：GM-CSFを形質導入した腫瘍細胞での全身ワクチン接種 腫瘍細胞株および動物。B16-F10黒色腫細胞を、10％ウシ胎児血清およびペニ シリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で維 持した。すべての実験に使用した動物は、Harlan(Indianapolls，IN)から得られ た６〜12週齢のC57BL/6雌性マウスであった。B16-F10黒色腫細胞を、Dranoff，G .ら，Proc．Nall．Acad．Sci．U.S.A.，90:3539-43(1993)に既述のように、複製 欠損MFGレトロウイルスベクターを使用することによって、マウスGM-CSF遺 伝子で形質導入した。形質転換された腫瘍細胞によって産生されたサイトカイン の量を、標準的ELISA技術（Endogen，Cambridge，MA）によって日常的に定量し た。培養した腫瘍単層を、トリプシンを用いて採取し、そして注入前にDMEMに再 懸濁した。腫瘍細胞を、複製不能にするために、注入の直前に、１分当たり1378 ラドを放出する¹³⁷セシウム源（Gammacell Model #62照射器，Nordin Internati onal，Inc.，Kanata，Ontarlo，Canada）からの5000ラドに曝露した。 頭蓋内細胞注入のための技術。マウスに、0.9％NaCl溶液で1:3に希釈された、 塩酸ケタミン25mg/ml、キシラジン2.5mg/ml、および14.25％エチルアルコールを 含むストック溶液の0.1mlの腹腔内注射で麻酔をかけた。腫瘍細胞の定位頭蓋内 注入のために、外科手術部位を剃り、そして70％エチルアルコールおよびプレポ ダイン溶液で調製した。正中線切開後、冠状縫合の2mm後方および矢状縫合の2mm 側方に、1mmのバーホール中心を作製した。次いで、動物を定位フレームに置き 、そして細胞を、３分間にわたって3mmの深さまで26ゲージの針によって送達し た。注入した細胞の総容量は、10μｌであった。針を取り出し、この部位を、滅 菌0.9％NaCl溶液で洗浄し、そして皮膚を、4.0ビクリル(vicryl)で縫合して閉じ た。 C57BL/6マウヌにおける頭蓋内B16-F10黒色腫モデルの開発。B16-F10黒色腫の 頭蓋内増殖特徴を評価するために、動物を、少なくとも８匹の動物の５つの群に 分け、そして上記の方法によって左の頭頂領域に10²、10³、10⁴、または10⁵のい ずれかの野生型B16-F10黒色肺細胞の定位頭蓋内注入を受けさせた。コントロー ル動物に、0.9％NaCl溶液の同様の頭蓋内注入を受けさせた。動物を、生存にに ついて毎日評価した。組織学的分析については、脳を死亡時に取り出し、そして 少なくとも５日間10％ホルマリンで固定し、切片にし、パラフィンに包埋し、そ してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 最高用量のB16-F10（10⁵細胞）を受けたすべての動物は、処置の15日以内に死 亡し、12日の生存中央値であった。結果を図１に示す。10³および10⁴細胞の用量 では、生存中央値は、それぞれ20および16日であった。10²細胞の頭蓋内用量は 、一様に致死的であった（生存中央値は20日、16〜21日の範囲）。これらのカイ ネティクスは、B16-F10の高い腫瘍発生性で乏しい免疫原性の特徴を強調する。 すべてのコントロール動物(0.9％NaClの定位注入で処置した)は、120日目 に生存していた。 脳の組織学的分析は、頭蓋内野生型B16-F10で処置したすべての動物が、頭頂 領域における注入で大きな固形腫瘍塊を発達させたことを明らかにした。腫瘍の 転移沈着物を、注入部位から離れた脳実質で、特に大きな腫瘍接種物を受けた動 物で、ときどき観察した。腫瘍沈着物はまた、脊髄の周囲のクモ膜下腔で観察さ れた。このことは、細胞移動が脳脊髄液経路に沿って起こることを示唆した。頭 蓋脊髄の外に腫瘍は現れなかった。この新規なモデルは、信頼性および再現性が 高いことが証明された。10²腫瘍細胞の頭蓋内用量で、動物は、注入の20日以内 の３〜４日の期間にわたり堅実に死亡した。 ワクチン接種研究。サイトカインを分泌するB16-F10黒色腫細胞を、ワクチン 接種特性、および野生型B16-F10黒色腫での頭蓋内チャレンジに対して防御する 能力について評価した。これらの研究については、動物を、27ゲージ針を付けた ツベルクリンシリンジを使用して、10⁶個の照射GM-CSF分泌性B16-F10細胞の単回 皮下側腹部注射で処置した。注入前にインビトロでの形質導入された細胞によっ て分泌されたGM-CSFの総量は、１日当たり10⁶細胞当たり50ngと60ngとの間であ った。複製を防止しそしてサイトカイン産生を保つために、形質導入された細胞 を、インビボ注入の前に照射した。これまでの研究は、5000ラドに曝露されたB1 6-F10黒色腫細胞が、複製不能になるが、その代謝能力を維持しそして５日まで の間インビボでサイトカインを分泌し続けることを示した。Jaffee，E.ら，「Us e of murine models of cytokine-secreting tumor vaccines to study feasibi lity and toxicity issues critical to designing clinical trials」，J．Imm unotherapy，印刷中(1995)。実験を、２つのコントロール群で行った：一方の群 は、10⁵個の照射した野生型（非サイトカイン産生)B16細胞の側腹部注射を受け 、そして他方は、細胞増殖培地または0.9％NaClのいずれかの皮下注射で処置さ れた。すべての実験について、１群当たり少なくとも10匹の動物が存在した。２ 週後、すべての動物を、上記に概説した方法によって10²個の非照射野生型B16-F 10黒色腫細胞の定位頭蓋内注入でチャレンジした。動物を、生存について評価し た。 統計学的分祈。すべての効力研究について、生存を、Kaplan-Meier生存分析を 使用してプロットし、そして統計学的有意性を、Zar，J.編，Biostatistical An alysis ，Englewood Cliffs，New Jersey，Prentice-Hall，Inc.，140-50頁(1984 )に記載のようなKruskal-Wallis非母数分散分析によって決定した。長期生存動 物の百分率を、２つの比の比較によって分析した。 結果 図２は、GM-CSFを分泌するように遺伝子移入によって操作された10⁶個の照射B 16-FI10細胞の単回皮下注射を受けた動物において行った全身ワクチン接種研究 の結果を示す。この様式で投与されたGM-CSF分泌細胞は、野生型腫瘍での頭蓋内 チャレンジに対して防御されることが見い出された。GM-CSFワクチンで処置し、 次いで２週後に脳に野生型B16をチャレンジした動物についての生存中央値は、 照射野生型細胞（GM-CSFを分泌しなかった）のワクチンまたは培地で処置したコ ントロール動物についての、それぞれ、19日および17日と比較して、27日であっ た（p＜0.0001）。これらの結果は、４回複製されており、それぞれ類似しそし て統計学的に有意な結果であった。 実施例２：マイクロカプセル化したGM-CSFでの全身ワクチン接種 32匹のC57BL/6マウスを、８匹の４つの群に分け、そして以下のいずれかを側 腹部にワクチン接種した：1)生理食塩水、2)2500ngのボーラスGM-CSFおよび１× 10⁶個の照射B16黒色腫細胞、3)2500ngのGM-CSFミクロスフェアおよび１×10⁶個 の照射黒色腫細胞、または4)GM-CSFを産生するように形質導入された１×10⁶個 の照射黒色腫細胞。14日後、すべての動物は、左前頭葉にB16黒色腫のチャレン ジを受けた。 結果 GM-CSFミクロスフェア群および形質導入したGM-CSF分泌群の生存中央値は、そ れぞれ27.5日であった。これらの生存期間は、16.5日生存した、生理食塩水を受 けたコントロール動物と比較して有意に延長される（p＜0.001）。GM-CSFボーラ ス群は15.5日生存し、したがって、生存において効果がなかった。GM-CSF処置し た動物は、ワクチン接種からの毒性の徴候をなんら示さなかった。 この研究は、有意な抗腫瘍免疫応答が、GM-CSFミクロスフェアでの全身ワクチ ン接種を使用して生じることを証明する。この応答は、GM-CSFを形質導入した腫 瘍細胞によって生じた応答に匹敵し、そしてGM-CSF免疫療法を用いる処置でGM-C SFを送達する実際の方法を示す。 実施例３：IL-2を形質導入した腫瘍細胞の局所頭蓋内送達 動物は、10³、10⁴、10⁵、または10⁶のいずれかの照射されたサイトカイン産生 B16-F10黒色腫細胞の頭蓋内定位同時注入を受けた。これは、ELISAで決定される 場合、24時間毎に10⁶細胞当たり80ngのIL-2を産生する。コントロール動物は、1 0³、10⁴、10⁵、または10⁶の細胞の等価の用量で、照射非IL-2産生野生型B16-F10 の同時注入を受けた。同時に、すべての動物を、10²の生存非照射B16-F10黒色肺 細胞の定位頭蓋内注入でチャレンジした。これらの実験については、１群当たり 少なくとも10匹の動物が存在した。 結果 IL-2を形質導入された細胞が、脳に直接送達した場合に、頭蓋内腫瘍を処置す ることに非常に有効であることを見い出した。最初の研究は、IL-2効果が用量依 存的であることを示した。結果を図３に示す。IL-2の１日当たり0.08ngの用量（ 10³個のIL-2産生細胞）は、コントロールと比較して増強された生存を示さなか ったが、１日当たり0.8ngの用量（10⁴個のIL-2産生細胞）は、統計学的有意に達 しない延長した生存の傾向を示した。１日当たり8.0ng用量（10⁵個のIL-2産生細 胞）でテストした場合、生存の有意な延長が見られた。未処置のコントロール動 物は22日目までに頭蓋内腫瘍で死亡したが（生存中央値、20日）、IL-2群につい ての生存中央値は31日であり、マウスの33％は80日より長く生存した（p＜0.001 ）。興味深いことに、IL-2処置群で死亡した数匹の動物は、脳で腫瘍を有さない ことが見い出された；むしろ、腫瘍を脊髄の周囲で観察された。このことは、IL -2の防御効果がサイトカイン送達の部位に局在することを示唆する。IL-2のより 高用量（１日当たり80.0ng）では、運動失調および死亡を含む、IL-2毒性の徴候 が観察された。これらの動物は、コントロールより前に死亡した（生存中央値、 12日）。これらの研究は、IL-2形質導入体の同様の用量で７回複製した。各実験 では、コントロールと比較して、頭蓋内IL-2形質導入体で処置した動物で、 生存の有意な延長があった。 死亡時の組織学的実験において、炎症は、処置した動物の脳実質に明らかに存 在しなかった。しかし、IL-2処置した動物の脳脊髄液腔で、リンパ球を観察した 。 実施例４：マイクロカプセル化したインターロイキン-2の頭蓋内送達は、 長期記憶を生じ、そして再チャレンジに対して防御する IL-2を、４μｍの平均直径を有する生分解性持続放出ミクロスフェアに組み込 んだ。これらのミクロスフェアを、マウスの脳に定位で注入して、７日間にわた って100ngのIL-2を送達した。安全性テストは、120日の期間にわたって、この用 量からの臨床的または組織学的毒性の証拠を全く示さなかった。一次処置として の効力を評価するために、B16黒色腫の致死的なチャレンジを、生理食塩水、空 のミクロスフェア、またはIL-2含有ミクロスフェアのいずれかで25匹のマウスの 左頭頂葉に定位で同時注入した。同様の実験において、9Lグリオーマ細胞を、ラ ットの左頭頂葉に同時注入した。 この治療の可能性のある脳ワクチン効果を評価するために、非腫瘍保有マウス の群に、IL-2ミクロスフェアおよび複製を防止するために照射された黒色腫細胞 を頭蓋内に同時注入した。30日後、これらの動物およびこれまで処置を受けてい ないコントロールマウスの群に、追加のIL-2治療なしで生存黒色腫の致死用量を 頭蓋内にチャレンジした。 結果 IL-2処置マウスの75パーセント（８匹のうち６匹）は、最初の処置の90日後に 腫瘍の徴候なしに生存したが、未処置コントロールの生存中央値は18日であった 。21日を超えて生存した動物はいなかった。空のミクロスフェアは、生存に効果 を有さなかった。同様のマウス黒色腫実験では、腫瘍部位へのIL-2のボーラス注 入かまたは全身IL-2投与のいずれかからの生存への影響は観察されなかった。グ リオーマ実験では、IL-2のミクロスフェア送達は、コントロールについての25日 と比較して、ラットにおける生存中央値を55日まで延長した。 これまでのIL-2ワクチン接種は、生存中央値を45パーセントまで延ばし、23日 までに死亡したすべてのコントロールでの腫瘍チャレンジの160日後に２〜５匹 の動物が生存した。 これらの結果は、ミクロスフェアによって送達されるIL-2での脳間質免疫治療 が、脳転移に対して効果的および安全な処置であり、そして腫瘍の再発を阻害す ることを示す。追加の有効性の結果およびミクロスフェアからのIL-2の放出動力 学は、それぞれ、Sills，A.K.,Jr.，ら，Proceed．Intern．Symp．Control．Rel ．Biomater.，23(1996年７月)、およびKalyanasundaram，S.ら，Proceed．Inter n．Symp.Control．Rel．Biomater.，23(1996年７月）に報告される。 実施例５：IL-2形質導入された細胞の頭蓋内送達は長期的記憶を生じ そして再チャレンジに対して防御する 11匹のC57BL/6マウスの一群を、最初に頭蓋内IL-2で処置し、そしてコントロ ール動物で一律に致死であるB16黒色腫の用量で同時注入した。コントロールと は異なり、頭蓋内IL-2投与された11匹の動物すべては、脳における最初の腫瘍チ ャレンジで生存し、そして70日目に同じ部位に再チャレンジした。11匹のうちの ６匹に、野生型黒色腫細胞を再チャレンジした。他の５匹は、培地単独の注入を 受けた。これまで未処置であった12匹の追加のマウスに、脳においてB16黒色腫 で同様にチャレンジした。 結果 黒色腫チャレンジは、これまで未処置であったマウスすべてに致死的であり、 生存中央値は17日であった。反対に、最初にIL-2で処置しそして70日目に腫瘍で 再チャレンジしたマウスは、有意に延長した生存を有し、ここで生存中央値は36 日であり、６匹のうちの３匹は70日生存した（p＝0.01対陽性コントロール、Man n-Whitney Test）。予測されるように、培地で再チャレンジされたマウスはすべ てさらに70日生存した。 これらの結果は、切除後の転移腫瘍再発を抑制すること、またはIL-2形質導入 した細胞の送達によって同時の転移の増殖を阻害することにおいて有用な、頭蓋 内黒色腫に対する免疫応答において長期記憶を証明する。 実施例６：IL-2形質導入した細胞の局所頭蓋内送達は中枢神経系の外の チャレンジに対して防御する 24匹のC57B16マウスに、照射したIL-2分泌B16-F10黒色腫細胞を頭蓋内に注入 し、そして12匹のC57B16マウスに、コントロールとして培地を注入した。すべて の動物に、同時に、未処理のマウスに一様に致死的である野生型B16-F10の同時 注入をした。24匹のIL-2処置したマウスのうち９匹が、75日生存した。コントロ ールは、20日より長く生存しなかった。75日目に、９匹の生存動物および８匹の 新しいコントロール動物に、10,000の野生型B16-F10黒色腫細胞を脇腹にチャレ ンジした。 結果 ９匹の長期生存動物のうち１匹のみが、脇腹腫瘍を発生した；逆に、８匹のコ ントロールマウスのうち６匹が脇腹腫瘍を発生した（p=0.024）。最初に脇腹に チャレンジを受けた（９匹のうち）８匹の長期生存動物に、８匹の新しいコント ロール動物とともに、最初のチャレンジの126日後、50,000の野生型B16-F10黒色 肺細胞のより大きなボーラスを脇腹に２回目のチャレンジをした。17日後、８匹 中８匹のコントロールマウスが腫瘍を発生したが、８匹の長期生存動物のうち２ 匹のみが脇腹腫瘍を発現した（p＝0.01）。 この研究は、頭蓋内に送達された局在化IL-2免疫治療が、中枢神経系内に即時 抗腫瘍応答を生じるだけでなく、中枢神経系外の複数回の後の腫瘍チャレンジに 対する強力な抗腫瘍応答を生じ得る長期記憶も確立することを証明する。 実施例７：IL-4形質導入した腫瘍細胞の局所頭蓋内送達 免疫原性の乏しいB16-F10黒色腫細胞を、中枢神経系における腫瘍部位でIL-4 を送達するためにIL-4遺伝子でトランスフェクトした。トランスフェクトしたB1 6-F10細胞に照射して複製を抑制し、そして非照射のトランスフェクトされてい ないB16-F10（野生型）黒色腫細胞とともに、８匹のC57BL/6マウスで頭蓋内に注 入した。B16-F10黒色腫細胞におけるIL-4レセプターの発現を、蛍光活性化細胞 選別（FACS）の手段によって検査した。 結果 IL-4で処置した動物は31日の生存中央値を有したが、野生型細胞のみを投与さ れたコントロール動物は、18日の生存中央値を有した（15〜20日の範囲；p＝0.0 02）。 B16-F10細胞のFACS分析は、IL-4レセプターの存在を示さず、これは、IL-4が 、細胞障害性効果を及ぼすために腫瘍細胞上のレセプターと相互作用しないこと を示唆した。これらの実験から得られた結果は、局所的に発現された高レベルの IL-4が、中枢神経系腫瘍のあるマウスにおける生存の有意な延長を導く強力な免 疫学的抗腫瘍応答を刺激することを示す。 実施例８：組み合わせ治療：GM-CSF形質導入体での全身ワクチン接種および IL-2形質導入体の局所的頭蓋内投与 組み合わせ実験については、すべての動物に脇腹皮下にワクチン接種し、そし て特定の頭蓋内処置で同時注入した10²野生型黒色腫細胞の標準的頭蓋内用量で 、２週後にチャレンジした。脇腹ワクチン接種は、10⁶の照射したGM-CSF産生細 胞の単回皮下注射であり、そして２週後の頭蓋内処置は、脳へ注入した５×10⁴ を照射したIL-2産生細胞であった。IL-2の１日当たりの8.0ngの用量（10⁵細胞） が、33パーセントの長期生存率を得、そして毒性が観察される用量に接近した場 合、IL-2の１日当たり4.0ngのより低い用量（５×10⁴細胞）を選択した。コント ロール動物に、皮下GM-CSFワクチンおよび培地での頭蓋内処置か、または培地で の皮下ワクチン接種および５×10⁴IL-2産生細胞での頭蓋内処置のいずれかを与 えた。追加のコントロールに、培地単独のワクチン接種、次いで頭蓋内腫瘍チャ レンジと一緒の培地での頭蓋内処置を行った。 結果 動物を、頭蓋内IL-2産生細胞と組み合わせてGM-CSF分泌細胞ワクチンで処置し た場合、非常に増強された応答が達成された。結果を図４に示す。生存中央値は 、まだ100日に達せず、58％のマウスは、さらに組み合わせ治療後に生存した。 これは、GM-CSF産生細胞単独での脇腹ワクチン接種に対して（生存中央値、27日 、p＝0.018）、IL-2産生細胞単独の局所的頭蓋内投与に対して（生存中央値、35 日、p＝0.01）、およびコントロールに対して（生存中央値、17.5日、ｐ＜0.001 ）、有意な利点を示す。組み合わせ群において100日より長く生存する長期生存 動物 の58％の割合は、GM-CSF脇腹ワクチン群における割合（16％、p＝0.08）、頭蓋 内IL-2形質導入体群における割合（8.3％、p＝0.03）、または２つの合計を越え 、非常に増強された応答を提供する。GM-CSFワクチン単独を投与されたマウスお よび頭蓋内IL-2分泌細胞単独で処置されたマウスの両方とも、コントロールと比 較して生存の延長を示し（IL-2、p＝0.0006；GM-CSF、p＜0.001）、このモデル における単回サイトカイン治療の有効性を確認した。 これらの結果は、GM-CSFワクチンが、腫瘍抗原に特異的なCD4+およびCD8+ Ｔ 細胞の一群を生じ、細胞の活性が腫瘍部位でのその後の局所的IL-2治療によって 増強されることを示す。結果は、血液-脳関門が、脳への化学療法剤の送達への 障害を有するが、免疫学的に活性な細胞については中枢神経系への侵入の手段と して機能するという理論に一致する。Wekerly，H.ら，TINS，27:1-7(1986)。 これらのサイトカインで処置した動物の脳実質における炎症性浸潤の程度は、 送達の様式に関係なく、小さかった。これらの所見は、脇腹モデルで行われるサ イトカインで増強した抗腫瘍免疫応答の研究とは逆に、顕著な局所的炎症性浸潤 が明らかであった。これらの結果は、ミクログリアのような脳内の固有の免疫応 答がまた、防御的免疫応答に関連し得ることを示す。 実施例９：GM-CSF形質導入体での全身ワクチン接種およびIL-2形質導入体の 局所的頭蓋内投与は再チャレンジに対する長期記憶防御を生じる 遺伝子操作した非複製B16-F10黒色腫細胞を、GM-CSFの全身送達またはIL-2の 頭蓋内送達に使用した。49匹のC57B16マウスに、GM-CSF産生B16-F10細胞で、あ るいは２週後のIL-2または培地の頭蓋内送達後の培地でのいずれかで、脇腹にワ クチン接種した。あらゆる動物は、未処置動物に対して一律に致死的な用量で野 生型黒色腫の頭蓋内同時注入を受けた。最初の生存動物および新しいコントロー ル群に、最初のチャレンジの134日後に野生型B16-F10黒色腫の２回目の頭蓋内用 量を再チャレンジした。 結果 脇腹のGM-CSFおよび頭蓋内IL-2の両方を受けた動物は、最も長く生存し、生存 中央値はまだ130日に達していなかった（13匹中７匹生存）。これは、脇腹GM-CS F単独（生存中央値27日、p＝0.018）、頭蓋内IL-2単独（32日、p＝0.01）、また はコントロール（17.5日、p＜0.001）のいずれよりも有意な改良がある。GM-CSF 単独およびIL-2単独は、コントロールよりも有意に効果的であった（p＜0.006） 。 GM-CSFとIL-2との組み合わせ治療を受けた７匹の動物は、130日より長く生存 した。再チャレンジした７匹のマウスのうち５匹は28日後に生存していた。８匹 のコントロール動物はすべて21日目までに死亡した（p＝0.018）。さらに、抗腫 瘍効果は４カ月より長く持続した。これらの結果は、サイトカインの使用が脳に おける免疫学的記憶を導き得ることを証明する。 実施例10：IL-2の脳への間質送達 方法 腫瘍を樹立するための一次処置およびその後の再発に対するワクチンの両方と して、インターロイキン-2（IL-2）の間質送達での局所的免疫治療を使用するこ とによる、転移性脳腫瘍の制御のための代替アプローチが記載される。IL-2を、 生分解性持続放出ミクロスフェア（平均直径４μｍ）に組込み、これを、マウス の脳に立体走性で注入して、７日間にわたり100ngのIL-2を送達した。安全性テ ストは、120日間にわたるこの用量からの臨床的または組織学的毒性の証拠を示 さなかった。一次処置としての有効性を評価するために、B16黒色腫の致死的チ ャレンジを、以下のいずれかで25匹のマウスの左頭頂葉に立体走性で同時注入し た：生理食塩水（コントロール）、空（IL-2なし）のミクロスフェア、またはIL -2含有ミクロスフェア。 結果 IL-2処置動物の75％（6/8）は、最初の処置後90日に腫瘍の徴候なく生存した が、未処置コントロールの生存中央値は18日であり、21日より長く生存した動物 はなかった。空のミクロスフェアは、生存への影響がなかった。同様のマウス黒 色腫テストでは、腫瘍部位へのIL-2のボーラス注入または全身IL-2投与のいずれ かの、生存への強い影響は見られず、これは、ミクロスフェアによって提供され る脳におけるIL-2の持続した局所的送達が、腫瘍床へ誘引された免疫細胞の連続 した刺激に重要であることを示唆した。 実施例11：脳へのIL-2の頭蓋内注入 方法 この治療の可能性のある脳ワクチン効果を評価するために、腫瘍のないマウス の群に、IL-2ミクロスフェアおよび複製を抑制するために照射されている黒色腫 細胞（実施例10を参照のこと）を頭蓋内に同時注入した。30日後、これらの動物 およびコントロールマウス（これまで処置なし）の群に、追加のIL-2治療なしに 生きている黒色腫の致死的用量を頭蓋内にチャレンジした。 結果 既存のIL-2ワクチン接種は、生存中央値を45％拡張し、そして腫瘍チャレンジ 後160日目で５匹中２匹の動物が生存し、すべてのコントロールは23日目までに 死亡した。これらの結果は、ミクロスフェアによって送達されたIL-2での脳間質 免疫治療が、脳転移に対して効果的かつ安全な処置であり、そして腫瘍再発を抑 制し得ることを示唆する。 実施例12：局所的に送達されたIL-2および化学療法剤との組み合わせ治療 方法 IL-2を産生する非複製の遺伝子操作した腫瘍細胞を使用する免疫治療、および 化学療法の局所的送達からなる組み合わせ治療をテストして、成分治療が、マウ ス脳腫瘍モデルにおける頭蓋内腫瘍チャレンジに対して相乗的に作用するかどう かを決定した。B16-F10黒色腫細胞を、複製防御的MFGレトロウイルスベクターを 使用して、マウスIL-2で形質導入した。化学療法剤のBCNUおよびカルボプラチン を、制御放出ポリマー中に組込んだ。C57/B16マウスに、非複製IL-2産生腫瘍細 胞とともにおよびなしで、野生型腫瘍の頭蓋内チャレンジを投与した。５日目に 、動物に、4.0％BCNU、１％カルボプラチンを含むポリマー移植物またはプラセ ボを投与した。 結果 IL-2および１％カルボプラチンを投与した動物（n＝10、生存中央値100日より 長い、p＜0.01）は、IL-2(n＝10、生存中央値38日）または１％カルボプラチン 単独（n=、生存中央値23日）を投与した動物よりも有意に改善された生存であっ た。IL-2および4.0％BCNUを投与した動物（n＝10、生存中央値44日）は、4.0％ BCNU（n＝10、生存中央値24日）またはIL-2単独(n＝10、生存中央値38日)を投与 した動物よりも改善された生存であった。コントロール群（n＝10）についての 生存中央値は19日であった。この実施例は、IL-2と化学療法剤の局所的送達との 組み合わせ頭蓋内免疫治療が、いずれかの抗腫瘍治療単独よりも生存を改善する ことを証明する。この効果を、低用量の化学療法（１％カルボプラチンおよび4. 0％ BCNU）を利用した場合でさえも得た。 実施例13：肝臓黒色腫転移のマウスモデルにおけるIL-2阻害された腫瘍増殖 方法 有用な免疫治療方策は、独特の免疫学的特性を有する器官およびヒトにおける 転移の普通の部位である、肝臓内の腫瘍における成功を証明しなければならない 。局所またはパラ分泌IL-2送達の抗腫瘍効果を、C57B1/6マウスの肝臓に移植さ れた非免疫原性B16-F10黒色腫を使用して評価した。IL-2遺伝子でトランスフェ クトした照射された自家腫瘍細胞を、IL-2の供給源として使用した。これらの細 胞の種々の数（５×10⁵〜２×10⁶）を、１×10⁴野生型B16-F10黒色腫細胞と混合 し、そして肝臓内に注入し、そして細胞単独、非トランスフェクト細胞と同時注 入された細胞、または遠位部位（脇腹）で注入されたIL-2細胞と同時注入された 細胞を比較した（n＝7/群）。肝臓内の腫瘍の存在または不在および腫瘍容量を 、21日目に測定した。 結果 すべての用量で局所的に送達されたIL-2を投与されたマウスで、腫瘍増殖の阻 害が見られた。全く腫瘍のないマウスの数は、最高のIL-2用量を投与されたマウ スで有意に低く（p＜0.05）、そして腫瘍が存在する肝臓では、平均腫瘍容量は 有意に減少した（２mm³対884mm³、p＜0.05）。この効果は、IL-2が遠位に投与さ れた場合も、または照射された野生型コントロールを投与したマウスにおいても 見られなかった。効果は用量依存的であり、最大阻害は最高IL-2用量で見られた 。組織学的検査は、リンパ球およびKupffer細胞の両方から構成される、IL-2 分泌細胞を有する肝臓内の部位で、顕書な浸潤を示した。要約すると、これらの 結果は、IL-2の局所的送達が、肝臓黒色腫転移のこのマウスモデルにおいて腫瘍 増殖を阻害したことを証明する。この方策は、肝臓腫瘍の免疫治療の開発のため に可能性のある適用を有する。 当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を 認識し得るかあるいはわずかに日常の実験を使用して確認し得る。このような等 価物は、以下の請求の範囲に包含されると意図される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION               Cytokine-enhanced immunotherapy for brain tumors                                Field of the invention   The present invention relates to the combination of systemic and local immunotherapy using cytokines. Are in the field of treating cancer by administering                              Federal rights   The Government of the United States has established the National Institutes of Health, the Bethesda, and the National Cancer Institute in Maryland. Granted by National Cooperative Drug Discovery Group UOI-CA52857 Thus, the present invention has certain rights.                                Background of the Invention   One third of all individuals in the United States alone develop cancer. 5 year survival rate is early Up dramatically to almost 50 percent as a result of advancements in diagnostics and treatment, Cancer Still Remains Second Only to Heart Disease as Cause of Death in the United States . Twenty percent of Americans die from cancer, half of which is lung, breast, and cancer. And colorectal cancer.   Designing effective treatments for cancer patients represents a major challenge are doing. Surgical resection, external beam radiation therapy, and / or systemic chemotherapy The current treatment of the law has been partially successful in some types of malignant tumors, while others have Did not produce satisfactory results. Some malignancies, such as brain malignancies, This treatment results in a median survival of less than one year. For example, re-excised malignant tumors Ninety percent of liomas recur within two years within two centimeters of the original tumor site.   The use of systemic chemotherapy is effective for some types of cancer, but Treatment of cancers of the gut, esophagus, liver, pancreas, and kidney has been somewhat successful. these A major problem with systemic chemotherapy for the treatment of types of cancer is controlling tumor growth. Systemic dose required to achieve frequently results in unacceptable systemic toxicity That is. Efforts to improve delivery of chemotherapeutic agents to the tumor site include, for example, Progress has been made in organ-specific chemotherapy, such as by continuous systemic infusion. But anti Continuous infusion of cancer drugs is generally more pronounced than pulse or short-term infusion Does not show. Implantable elast with self-sealing silicone diaphragm Mer Access Port is also being trialed for continuous infusion, but has problems with bleeding Remains. Portable infusion pumps are currently available as delivery devices, It has been evaluated for effectiveness. (For a general review,Harrlson's P rinciples of Internal Mediclne Ed., Braunwald, E. et al., McGraw-Hil. l Book Co. (1987)). Controlled release biocompatible polymer Used successfully for delivery and contraception, insulin therapy, treatment therapy, asthma cure In the treatment, prevention of dental-related diseases, and chemotherapy for some types of cancer . (Langer, R. and Wise, D.,Medical Applications of Controlled Relea se , I and II, Boca Raton, CRC Press (1986)).   Effective antitumor in the brain for treatment of patients with malignant neoplasms of the central nervous system The design and development of ulcers is affected by two main factors: 1) blood -Brain barrier gives anatomical obstruction limiting drug access to these tumors And 2) drugs administered at high systemic levels are generally cytotoxic. Efforts to improve drug delivery to the tumor bed in the brain involve a transient blood-brain barrier Includes osmotic disruption, cerebrospinal fluid perfusion, and direct injection into brain tumors using catheters It is rare. Each technique has significant limitations. Destruction of the blood-brain barrier is normal Increased uptake of hydrophilic substances into the brain, but significantly increased transport of substances to the tumor I didn't let it. Only a small fraction of the drug administered to the cerebrospinal fluid is actually Infiltrated into Drugs used to treat tumors by injection are inappropriate Yes, does not diffuse to the proper distance from the site of injection, i.e. allows for a sustained diffusion gradient Could not be maintained at a concentration sufficient to Catheter use due to clogging In addition, it is complicated by a high rate of infection, disability, and dysfunction. Tomlta , T., "lnterstltial chemotherapy for brain tumors: revlew", J. Amer. Neuro-On cology, 10: 57-74 (1991).   Recent advances in understanding the immune system and defining T cell antigens against tumor cells Advances have shown promising results of treating tumors with immunotherapy. these Some of the new approaches increase the weak host immune response to tumor antigens And the use of antibodies, cellular immunotherapy, and cytokines Including. Use of antibodies is one where the specificity of the antibody does not significantly bind to non-tumor cells It is difficult because it requires. Antibody-based immunotherapy approach designed If so, there are few true tumor-specific antigens to select from. Cellular immunotherapy Involves the introduction of cultured immune cells with anti-tumor reactivity into a tumor-bearing host. Include. Adoptive treatment with autologous lymphokine-activated killer (LAK) cells Impressive results were obtained only in the presence of ind or chemotherapeutic drugs. Boosts the immune response The use of cytokines administered directly to cells has also been shown to be successful. Have been. Abbas et al., "Immunityto to Tumors", p. 372,Cellular and Molecul ar Immunology , Second Edition, W.B. See Saunders Company (1994). However High dose systemic administration can be toxic and provide continuous release by local administration Effective administration of cytokines may be a problem in that The same obstacles as mentioned above are given to Yo.   Therefore, it is an object of the present invention to provide an enhanced immune response against tumors, especially brain tumors. Compositions, which improve the efficiency of treatment and reduce potential toxicity. The purpose is to provide usage.   A further object of the invention is a composition and use for the treatment of tumors, especially brain tumors To provide a method that is robust against multiple subsequent tumor challenges. Establish long-term memory that can produce a strong anti-tumor response.                                Summary of the Invention   A cytokine in a pharmaceutically acceptable carrier for systemic administration and a cytokine for local administration Cancer, using a combination with cytokines in a pharmaceutically acceptable carrier A therapy for the treatment of a patient is described. In a most preferred embodiment, the brain tumor is Most preferably, systemic administration in combination with a tumor antigen, such as a non-replicable tumor cell. Cytokines such as granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) In, and most preferably, transduced cells, and most preferably, replication. In a vehicle that provides release over a period of time, such as incapable tumor cells, or Po Topically administered, incorporated in a microparticulate vehicle such as limmer microspheres Treated with cytokines such as interleukin-2 (IL-2) or IL-4.   Examples include tumor cells transduced with GM-CSF or microencapsulated Systemic administration (vaccination) with GM-CSF protects against intracranial melanoma growth Indicates that Examples also include IL-2 transduced tumor cells or microcapsules. Localized intracranial delivery of activated IL-2 results in an immediate antitumor response in the central nervous system and Strength against multiple subsequent tumor challenges, including challenges outside the central nervous system FIG. 9 shows that long-term memory can result in a strong antitumor response. The examples further include GM-C Systemic vaccination with SF transductants and local intracranial administration of IL-2 transductants The combination immunotherapy used is significantly less than either treatment alone 2 shows that it produces an enhanced antitumor effect.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Figure 1 shows 100,000 (open circles), 10,000 (open squares), 1,000 (open triangles), and 100 (Black squares) at a dose of stereotactic intracranial injection of wild-type B16-F10 Experimental animal model of intracranial melanoma receiving vesicle-free saline (filled circles) 7 is a graph showing percent survival over time in days.   FIG. 2 shows that 10 engineered by gene transfer to secrete GM-CSF.⁶Irradiated B16-F10 cells (closed squares), medium (open circles), or 10⁶B16-F10 field irradiated After systemic vaccination with a single subcutaneous injection of live non-cytokine producing cells (open squares) , 10 in the brain^Two14 days after injection of non-irradiated wild-type B16-F10 melanoma cells FIG. 4 is a graph showing the percentage of surviving mice over time (days) (p <0.001).   FIG. 3 shows that 10 engineered by gene transfer to secrete IL-2.^FiveIs irradiated B16-F10 cells (closed squares), medium (open circles), or 10^FiveIrradiated B16-F10 wild Treated with a single intracranial injection of non-cytokine producing cells (open squares)^TwoNo illumination Mice challenged simultaneously with stereotactic intracranial co-injection of wild-type B16-F10 cells 5 is a graph showing the percentage of survival over time (days) (p <0.001).   FIG.⁶Vaccine by subcutaneous injection of irradiated GM-CSF producing B16-F10 melanoma cells Inoculated, then 5 × 10 2 weeks later^FourCranialized irradiated S-2 secreted B16-F10 cells Administered internally and at the same time 10^TwoOf non-irradiated wild-type B16-F10 cells (solid squares) Shows the percent survival over time (days) of animals challenged with time injection It is a graph. Control animals were GM-CSF vaccine alone, followed by wild-type B16-F1 0 intracellular tumor challenge with cells (x mark) or media alone They received a tin inoculation followed by intracranial IL-2 treatment and a tumor challenge (open circles). add to Controls include vaccination with medium, followed by intracranial treatment with medium and head Received intralid tumor challenge (open squares).                             Detailed description of the invention   Therapies for the treatment of tumors have been developed, which are the first systemic " Priming, most preferably to boost the immune response against tumor cells Tumor site (or site of excision after tumor removal) of a cytokine such as IL-2 that enhances Cytokines such as GM-CSF and non-replicatable tumor cells Relying on combinations via administration combinations with eel thigh ulcer antigens. Local release is Although obtainable using any of several means, the preferred method is at least Microparticles to release cytokines over a period of even days, or transduction Cells, most preferably genes encoding cytokines to be released The use of non-replicable tumor cells to be transduced. The latter is less after transplantation Both are shown to release for 5 days. Microparticles can last for hours and weeks, or It can be designed to be released even for months if needed.   Examples are GM-CSF administered systemically, and IL-2 and IL administered intracranially. 4 shows in vivo treatment of brain tumors using -4. However, various cytokines are used. Can be used. Similar results are expected for treatment of other tumor types. I. Therapeutic composition   a. Cytokine     i. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Granulocyte-macrophage colo Knee stimulating factor (GM-CSF) is activated by activated T cells as well as activated mononuclear phagocytes 22kD glycoprotein produced by vascular endothelial cells and fibroblasts You. GM-CSF primes a systemic immune response by stimulating bone marrow-derived antigen-presenting cells Ruko Are shown. Inaba, K. et al. Exp. Med., 175: 1157-67 (1992); Inaba, K Et al. Exp. Med., 176: 1693-702 (1992); Steinman, R., Annual Rev. Immuno logy, 9: 271-81 (1991). In vivo in tumor cells transduced with GM-CSF Studies have shown that local release of this cytokine can be linked to CD4 + and CD8 + tumor-specific T lymphocytes. Sphere generation, as well as systemic protection from tumor challenge revealed Dranoff, G. et al., Proc. Natl. Acad. Scj. U.S.A., 90: 3539-43 (1993).     ii. Interleukin-2. Interleukin-2 (IL-2) activates CD4 + T cells Thus, it is produced and is produced in smaller amounts by CD8 + T cells. Secreted I L-2 is a 14-17 kD sugar encoded by a single gene on human chromosome 4. It is a protein. IL-2 acts on the same cells that produce it, Functions as an autocrine growth factor. IL-2 also stimulates both CD4 + and CD8 + cells Acts on other T lymphocytes, including IL-2 is a T cell helper and cytotoxic Induces a local inflammatory response that leads to activation of both subsets of sex. IL-2 also Stimulates the growth of natural killer cells and enhances their cytolytic function. IL-2 In vivo studies with secretory tumor cells have shown strong local and systemic anti-tumor immune responses. Response, which leads to the destruction of the transduced tumor in the flank. You. Fearon, E.R. et al., Cell, 60: 397-403 (1990); Gansbacher, B. et al. Exp. Me d., 172: 1217-24 (1990).     iii. Tumor necrosis factor. Tumor necrosis factor (TNF) is originally an endotoxin Tumor necrosis in serum of animals exposed to bacterial lipopolysaccharide (LPS) such as Was identified as a mediator. The major endogenous source of TNF is LPS-activated mononuclear Phagocytic but antigen-stimulated T cells, activated natural killer cells, And activated mast cells can also secrete this protein. Mononuclear phagocytes In TNF, TNF was initially synthesized as a non-glycosylated transmembrane protein of approximately 25 kD. It is. TNF has potent antitumor effects in vitro, but is useful in advanced cancer patients Clinical trials of TNF have been discontinued due to toxicity. TNF-α is interleukin Such as insulin-6, interleukin-8, GM-CSF, and granulocyte-colony stimulating factor Inducing the expression of many cytokines, as well as the expression in established tumors It has a different range of biological properties, including causing blood necrosis. TN F reports tumor suppression following TNF-α gene transfer targeting tumor cells It has been tell. Blankenstein, T .; J. et al. Exp. Med., 173: 1047-52 (1991).     iv. Interleukin-4. Interleukin-4 (IL-4) is an anti-Ig antibody (antigen Stimulates the proliferation of mouse B cells and expands resting B cells in the presence of And about 20 kD helper T cells that cause increased expression of class II MHC molecules Derived cytokine. The major endogenous source of IL-4 is from CD4 + T lymphocytes is there. Activated mast cells and basophils, and some CD8 + T cells It can also produce IL-4. IL-4 delivered intracranial is a tumor transduced with IL-4 Exhibits similar antitumor activity to the observations following peripheral administration. Golumbek, P.T., et al., Scienc e, 254: 713-6 (1991); Yu, J.S. et al., Cancer Res., 53: 3125-8 (1993).     v. Gamma interferon. Gamma interferon (IFN-γ) is about 21 Homodimeric glycoprotein containing を 24 kD subunit. How many IFN-γ It is produced by such CD4 + helper T cells and almost all CD8 + T cells. Transcription is initiated directly as a result of antigen activation, and IL-2 and interleukin Augmented by Kin-12. IFN-γ is also produced by natural killer cells. Be born. IFN-γ acts as a potent activator of mononuclear phagocytes, Acts directly on T and B lymphocytes to promote the activation of natural killers Acts to stimulate the cytolytic activity of the cell. Non-immunogen transduced with IFN-γ Sarcoma has been reported to induce CD8 + T cells against wild-type tumor cells You. Restlfo, N. et al. Exp. Med., 175: 1423-28 (1992).     vi. Interleukin-3. Interleukin-3 (IL-3) is a multilineage colony Also known as stimulators, which act on most immature bone marrow precursors, Promotes expansion of cells that differentiate into all known mature cell types This is the 20-26 kD product of the cell. IL-3 is tumor responsive by a CD4-dependent mechanism It has been reported to enhance the development of cytotoxic T cells. Pulaskl, B.A. et al., C ancer Res., 53: 2112-57 (1993).     vii. Interleukin-6. Interleukin-6 (IL-6) is IL-1 and Mononuclear phagocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, and others, depending on TNF to a lesser extent Is a cytokine of about 26 kD that is synthesized by the cells. This is some activity Produced by sexualized T cells. Transfects Lewis lung cancer tumor cells IL-6 suppresses malignant phenotype and immunotherapy against parental metastatic cells It has been reported that it can provide Porgador, A., CancerRes., 52: 3679-87 (1992).     viii. Interleukin-7. Interleukin-7 (IL-7) is a B lymphocyte Bone marrow stromal cells acting on committed hematopoietic cell precursors It is a secreted cytokine. IL-7 induces CD42 + T cell-dependent tumor rejection Has been reported. Hock, H. et al. Exp. Med., 174: 1291-99 (1991).     ix. Granulocyte-colony stimulating factor. Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) Produced by the same cells that produce M-CSF. The secreted polypeptide is about l 9 kD. G-CSF gene transfer suppresses mouse adenocarcinoma tumorigenicity It has been tell. Colombo, M. et al., Cancer Res., 52: 4853-57 (1991).     x. Other cytokines. Other cytokines may have antitumor effects. It is known in the art and can be used in the pharmaceutical compositions described herein. Furthermore, cytokines are known to have effects on other cytokines. Is it possible to administer a cytokine that induces one of the above cytokines, Alternatively, one of the induced cytokines can be administered directly. Additional cytokines Abbas et al., "Cytoklnes", Chapter 12, pages 239-61,Ce llular and Molecular Immunology , Second Edition, W.B. Written in Saunders Company (1994) Will be posted.   b. Combination with other biologically active compounds   Cytokines can also be used in cultures with other cytokines, antibodies, anti-tumor reactivity. Combined with immune cells (including LAK cells) or chemotherapeutic agents (including irradiation) They can be administered together. The active compound is the same vehicle as the cytokine for administration. Or it can be administered in a separate vehicle.     i. Chemotherapy.   Cytokines can be used alone or in combination with other chemotherapeutic agents . Examples of chemotherapeutic agents include paclitaxel, camptothecin, ternosolamide 1,3-bis (2-chloroethyl) -1-nitrosourea (BCNU) and adriamycin U Cytotoxic drugs, platinum drugs such as cisplatin, and compounds such as butyric acid derivatives. Drugs, such as factor α-Pseudomonas exotoxin fusion proteins Growth factors, and tumor antigens such as monoclonal antibody 81C6, especially Antibodies to the glioma antigen may be mentioned. These drugs, along with cytokines Can be incorporated into a polymer matrix for delivery to For example, Domb et al., Poly m. Prepr., 32 (2): 219-220 (1991), which is a water-soluble chemotherapeutic Boplatin (an analog of cisplatin), and 4-hydroperoxycyclophos Incorporating famide into a biodegradable polymer matrix to treat tumors , As well as promising results.     ii. Other pharmaceutically active compounds.   In a variation of these embodiments, the sterols used to reduce swelling Others, such as id anti-inflammatory drugs, antibiotics, antivirals, or anti-angiogenic compounds It may be desirable to include a pharmaceutically active compound. For example, control brain edema Dexamethasone, a synthetic corticosteroid used systemically for Built into a degradable polymer matrix and increases the efficiency of reversing brain edema Have been tested in rat brain in vitro and in vivo. Others that may be included The compounds are preservatives, antioxidants, and fillers, to alter the rate of polymer release Coatings or extenders that can also be used.   c. Cytokine formulation   Cytokines include saline, phosphate buffered saline, and cytokines. Like cells, microparticles, or other conventional vehicles transduced with the gene to be May be administered in any pharmaceutically acceptable carrier.     i. Polymer formulation   Cytokines are biocompatible polymers for use in the treatment of solid tumors. It can be encapsulated in a matrix, most preferably biodegradable. Cytokines , Preferably a therapeutically effective time, usually 8 hours to 5 years, preferably 1 week to 1 Released by diffusion and / or degradation over the years. As used herein Microencapsulation refers to microspheres, microparticles, or microspheres. Included on or in or in capsules. Microphone B Capsules are used interchangeably with microspheres and microparticles, Those skilled in the art of rubbing will know how to formulate, release characteristics, and these various modes. It is understood that the difference in the composition of Microspheres are like saline It can be implanted or delivered directly in any physiologically compatible solution.   Biocompatible polymers can be classified as biodegradable and non-biodegradable. Livestock Degradable polymers can be used in vivo as a function of chemical composition, manufacturing method, and implantation construct. Decompose with. Synthetic and natural polymers can be used, Is preferred because of its more uniform and renewable decomposition and other physical properties Maybe. Examples of synthetic polymers include polyanhydrides, polyhydroxy acids (eg, For example, polylactic acid, polyglycolic acid, and copolymers thereof), polyester , Polyamides, polyorthoesters, and some polyphosphazenes No. Examples of naturally occurring polymers include collagen, hyaluronic acid, Proteins and polysaccharides, such as albumin, and gelatin. ideal Typical polymers are also powerful and, in addition, do not crumble or fragment during use. It must be flexible enough to   Cytokines, and other drugs or additives as needed, can be found inside the implant, It can be encapsulated in whole and / or on a surface. Cytokines are polymers Or a combination thereof, is released by diffusion and decomposition. Biodegradable polymer There are two general classes: polymers degraded by bulk corrosion and surface decay A polymer that degrades when eaten. The latter polymer requires a more linear release Is preferred. The time of release is by changing the chemical composition; For example, p-carboxyphenyl which is copolymerized with a monomer such as sebacic acid (SA) By increasing the amount of aromatic monomers such as enoxypropane (CPP) Can be operated. A particularly preferred polymer is CPP-SA (20:80). control The use of polyanhydrides in modified delivery devices is described in Leong et al. Med. Bjomed. M ater. Res., 19: 941 (1985); Med. Bjomed. Mater. Res., 20:51 (1986); And Rosen et al., Biomaterials, 4: 131 (1983). Substance control United States patents describing the use of polyanhydrides for controlled delivery include Domb and Lang U.S. Pat.No. 4,857,311 to Langer et al., U.S. Pat. You And U.S. Patent No. 4,789,724 to Domb and Langer. Polylactic acid Other polymers, such as, polyglycolic acid, and their copolymers, Has been marketed as a suture material for over Can be easily formed.   Non-biodegradable polymers remain in vivo in prolonged periods (years) . Drugs loaded on non-biodegradable polymer matrices are sustained and predictable Is released by diffusion through the microporous lattice of the polymer in an efficient manner, Changes in percent loading, matrix porosity, and implant structure Can be adapted to provide a faster or slower release rate. You. Ethylene-vinyl acetate copolymer (EVAc) is a protein, An example of a non-biodegradable polymer used as a local delivery system for offspring And Langer, R. and Folkman, J., Nature (London), 263: 797-799 (1976). Will be reported. Others include polyurethane, polyacrylonitrile, and some And polyphosphazenes.   In a preferred embodiment, the single polymer and the cytokine to be released are Embedded in the delivery device, but other biocompatible, preferably biodegradable or Metabolites may be included for processing purposes and additional therapeutic agents.   Buffers, acids, and bases are used to adjust the pH of the composition. Transplanted Drugs to increase the diffusion distance of the drug released from the deposited polymer are also included. obtain.   Fillers can be water soluble or insoluble incorporated into the formulation to add bulk Substance. Filler types include sugar, starch, and cellulose . The amount of filler in the formulation typically ranges between about 1 and about 90% by weight .   Spheronization enhancers facilitate the production of spherical implants . Zein, microcrystalline cellulose, or sodium carboxymethylcellulose Materials such as microcrystalline cellulose co-processed with formulations and implants Provides plasticity to strength and integrity. During sphering, it is rigid but not plastic. Extrudates are used to form dumbbell-shaped implants and / or granules. Produces a high percentage of offspring. An extrudate that is plastic but not rigid will agglomerate and hand There is a tendency to form excessively large implants. The balance between rigidity and plasticity is Must be maintained. The percentage of sphering enhancer in the formulation is , Depending on other excipient properties, and is typically in the range of 10-90% (w / w).   Degradants are substances that promote the destruction of an implant in the presence of a liquid. Decomposing agent Its function is to offset or neutralize the effects of any binding substances used in the formulation is there. The mechanism of decomposition is largely due to moisture adsorption and wetting by insoluble substances Is included. Examples of degrading agents include crosmalmellose sodium and crospo Bidon, which are typically transferred in the range of 1-20% of the total implant weight. Incorporated in plants. Often like sugars (mannitol and lactose) A soluble filler can also be added to facilitate the degradation of the implant.   Surfactants may be transferred to enhance the wettability of poorly soluble or hydrophobic substances. May be necessary for plant formulations. Polysorbate or sodium lauryl sulfate Such surfactants are used, if necessary, at low concentrations, generally less than 5%. You.   Binders are used in implant formulations to bind the powder and maintain implant integrity. Adhesive substance to be incorporated. The binder is added as a dry powder or as a solution. Can be added. Sugars and natural and synthetic polymers can act as binders. Substances specifically added as binders generally comprise about 0.5 to 15% w of the implant formulation. Included in the / w range. Certain substances, such as microcrystalline cellulose, are also Used as an enhancer, it also has additional binding properties.   Various coatings can be applied to modify the properties of the implant. Coat The three types of wings are encapsulation, gloss, and enteric coating. Enclosure coat is aqueous Inhibits excessive moisture uptake by implants during application of base-based enteric coatings You. Gloss coatings improve the handling of the end product. Hydroxypropyl Water soluble materials such as cellulose are used in encapsulation and gloss coat implants. Can be Encapsulation and gloss coats are generally between about 0.5% and about 5%, Preferably about 1% weight for the encapsulation coat and about 3% weight for the gloss coat Spray onto the implant until a volume increase is obtained.   Enteric coatings consist of polymers that are insoluble at low gastric pH (<3.0). Limers can be used and layered from aqueous solutions or suspensions as thin films on implants To be. Enteric coats generally contain from about 1 to about 30%, preferably from about 10 to about 15%. Sprayed to weight gain and implanted in plasticizer, surfactant, coating Coating agents such as separating agents to reduce the thickness of the material and coating permeability modifiers May include a living adjuvant. Other types with different dissolution or corrosion properties Can be used to further modify implant behavior. like this Suitable coatings are readily known to those skilled in the art.   Controlled release devices are typically prepared in one of several ways. . For example, the polymer is melted, mixed with the substance to be delivered, and then cooled. Can be solidified. Such a melted fabrication process should be delivered PO with a melting point below the temperature at which substances and polymers decompose or become reactive Need rimmers. Alternatively, devices are prepared by solvent casting Wherein the polymer is dissolved in a solvent and the substance to be delivered is a poly Dissolved or dispersed in the mer solution. The solvent is then evaporated and the polymer -Leave the substance in the matrix. Solvent casting allows the polymer to be dissolved in organic solvents. The drug being soluble and encapsulated is soluble or dispersible in the solvent Need. Similar devices can be phase separated or emulsified or even spray dried. It can be manufactured by a drying technique. In still other methods, the polymer powder is It is mixed with Cain and then compressed to form an implant.   Methods for making implants also include granulation, extrusion, and sphering . A dry powder blend containing the desired excipients and microspheres is produced. Dry The dry powder is granulated with water or other non-solvents for microspheres such as oil. Of the material that has been wetted and agglomerated as it passes through the extruder screen It passes through an extruder that forms a "tring" or "fiber". Extrudate string Crushed strings, and particles, spheromizer walls, and rotating spheromerizers Spheration to form spherical particles by repeated contact with the base plate Placed on board. The implant is dried and removed to remove aggregates and fines. Me Will be screened. These methods involve the use of micrografts (sites to be released) Microparticles, microspheres, and microcapsules that encapsulate Caine) For manufacturing slabs or sheets, films, tubes, and other structures Can be used for     ii. Genetically modified cells that secrete cytokines   Cytokine-secreting cells are used to deliver cytokines systemically or locally. Can be genetically manipulated by methods known in the art. Cells are bacteria or The viral DNA vector is either transformed or transduced, respectively. obtain. In a preferred embodiment, the cells are tumor cells. Suppress replication and To conserve tokine production, transduced cells were irradiated prior to in vivo injection. Can be fired. The advantage of tumor cells is that patients can stimulate an immune response to cytokines. Exposure to an antigen in combination with a vigorous cytokine. Secretes IL-4 Examples of the preparation of engineered tumor cells are described in Golumbek, P.T. Et al., Scjence, 25 4: 713-6 (1991) and Yu, J.S. et al., Cancer Res. 53: 3125-8 (1993). IL-2 gene delivery to tumor cells has been described by Gansbacher, B. et al. Exp. Med., 172: 1217-2 4 (1990). Tumor cells engineered to secrete GM-CSF contain D ranoff, G. et al., Proc. Natl. Acad. Scj. U.S.A., 90: 3539-43 (1993) You. TNF gene transfer has been described by Blankenstein, T. et al. Exp. Med., 73: 1047-52 (1991) It is described in. IL-6 transfection into lung cancer tumor cells was performed as described by Progador, A. et al. Et al., Cancer Res., 52: 3679-87 (1992). Transduced into non-immunogenic sarcoma The obtained γIFN cDNA is available from Restlfo, N., Exp. Med., 175: 1423-28 (1992). You. G-CSF gene transfer is described in Colombo, M. et al., Cancer Res., 52: 4853-57 (1991). Is done. Other cytokines, including IL-3 and IL-7, By applying the method used by Karp, S.E. et al. Immuno l., 150: 896-908 (1993) and Jaffee, E. et al. Immunotherapy, printing (1995) General Procedure for Genetically Modifying Non-Immunogenic Murine Fibrosarcomas Described in Can be secreted from the cell. The publications cited above only secrete cytokines. A method for genetically engineering cells is described. In addition, two different cytokines From an engineered vector containing a gene encoding Express two or more cytokines by retrovirus-mediated gene transduction Cancer vaccines can be prepared. Suitable pharmaceutical vehicles are known to those skilled in the art. You.   Inducers are also used to produce cells that secrete cytokines. Can be In some cases, the inducer may work alone or Tumor necrosis factor (TNF), endotoxin Includes xins, and other agents known to those of skill in the art. Generally, cultured cells are Itokine expression, immunoglobulin secretion, and / or cell surface properties or Cells, as determined by other indicators such as proliferation or change in the marker Is exposed to an amount effective to activate. In some cases, the cells first Inducing small amounts to "prime" the cells, then inducing greater activation of the cells Exposure to subsequent doses.   Cells can be administered in medium or washed and administered in saline You. Alternatively, cells can be encapsulated and administered in a polymer matrix You. II. Administration to patients   The cytokines or functionally equivalent derivatives thereof described herein may be used in other chemotherapy. Before, at the same time as, or following a procedure using a method or radiation therapy or surgery May be administered alone or in combination. A preferred embodiment is Using a dose determined as described herein, a first support such as GM-CSF. Combining itokain with a tumor antigen, most preferably in the form of non-replicable tumor cells Systemic administration, followed by local administration during surgery or selected Biocompatible loaded with either in- or cytokine-secreting cells Injection of the polymer matrix follows. Topical administration is adjacent to the tumor to be removed It can be a site, or in a tumor, or where a tumor has been removed. Functionally equivalent The dosage of the derivative can be extrapolated from in vivo data. Effective dose is longer survival Antitumor effect as measured by either time or tumor size reduction Sufficient to induce.   Topical administration can also include, for example, insulin or chemotherapeutic agents in certain organs or tumors. Achieved by using an infusion pump, of the type used to deliver to the ulcer Can be achieved.   In a preferred method of administration, the polymer implant or cytokine secreting cell is For example, subcutaneous injection at a distant site may result in a polymer implant or cytokine Two weeks after systemic administration of the secretory cells, they are implanted at the site of the tumor. Biodegradable polymer used If used, preferably they are less than about 100-200 microns in diameter And injected by catheter or syringe; after release of immunotherapeutic agent There is no need to remove the implant.   Cytokines also include radiation therapy, systemic or local chemotherapeutic agents, And other modalities, including and other immunotherapy.   The cytokine is preferably administered to a brain cancer patient. But Cytokai Combination therapy also includes patients with breast, lung, and colon cancer , Can be applied to all cancer patients. Treatment provides immediate response at the site of local administration And treat cancer at the site of local administration and at a distance from the site of local administration. To provide long term memory protection. Thus, the immunotherapy described herein is useful for metastatic Is useful for preventing or treating. III. Example.   The invention will be further understood by reference to the following non-limiting examples. You. Example 1: Systemic vaccination with GM-CSF transduced tumor cells   Tumor cell lines and animals. B16-F10 melanoma cells were harvested with 10% fetal bovine serum and In Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing sylin / streptomycin, I carried it. Animals used for all experiments were obtained from Harlan (Indianapolls, IN). 6-12 week old C57BL / 6 female mice. B16-F10 melanoma cells were transferred from Dranoff, G Et al., Proc. Nall. Acad. Sci. Reproduction as described in U.S.A., 90: 3539-43 (1993) By using a defective MFG retroviral vector, mouse GM-CSF It was transduced with the gene. Cytokines produced by transformed tumor cells Is routinely quantified by standard ELISA techniques (Endogen, Cambridge, Mass.). Was. Cultured tumor monolayers are harvested using trypsin and reconstituted in DMEM prior to injection. Suspended. Immediately prior to injection, 1378 / min to render tumor cells incapable of replicating Release rad¹³⁷Cesium source (Gammacell Model # 62 irradiator, Nordin Internati onal, Inc., Kanata, Ontarlo, Canada).   Technique for intracranial cell injection. Mice were diluted 1: 3 with 0.9% NaCl solution, Ketamine hydrochloride 25 mg / ml, xylazine 2.5 mg / ml, and 14.25% ethyl alcohol Anesthetized with 0.1 ml intraperitoneal injection of the containing stock solution. Stereotactic intracranial tumor cells For injection, the surgical site is shaved and 70% ethyl alcohol and prep Prepared with Dyne solution. After midline incision, 2 mm posterior to coronal suture and 2 mm sagittal suture A 1 mm bar hole center was made laterally. Then place the animal in a stereotaxic frame And deliver the cells via a 26 gauge needle to a depth of 3 mm for 3 minutes. Was. The total volume of injected cells was 10 μl. Remove the needle and remove this part Wash with 0.9% NaCl solution and close skin with suture with 4.0 vicryl Was.   Development of an intracranial B16-F10 melanoma model in the C57BL / 6 Maunu. B16-F10 melanoma Animals were divided into 5 groups of at least 8 animals to assess intracranial growth characteristics Divide, and add 10 to the left parietal area by the method described above.^Two,Ten^Three,Ten^FourOr 10^FiveNo Stereotactic intracranial injections of some wild-type B16-F10 black lung cells were received. control Animals received a similar intracranial injection of a 0.9% NaCl solution. For animals to survive Was evaluated daily. For histological analysis, remove the brain at death and Fix in 10% formalin for at least 5 days, section, embed in paraffin, and And stained with hematoxylin and eosin.   The highest dose of B16-F10 (10^FiveAll animals receiving cells) die within 15 days of treatment He died, with a median survival of 12 days. The results are shown in FIG. Ten^ThreeAnd 10^FourCell dose In, the median survival was 20 and 16 days, respectively. Ten^TwoThe intracranial dose of cells Were uniformly lethal (median survival ranged from 20 days, 16-21 days). These chi Netix emphasizes the high oncogenic and poor immunogenic character of B16-F10. All control animals (treated with a stereotactic injection of 0.9% NaCl) were treated on day 120 Was alive.   Histological analysis of the brain showed that all animals treated with intracranial wild-type B16-F10 It was revealed that injection in the area developed a large solid tumor mass. Tumorous Metastatic deposits can be transferred to the brain parenchyma distant from the site of injection, especially for those receiving large I sometimes observed things. Tumor deposits are also observed in the subarachnoid space around the spinal cord. Was. This suggested that cell migration occurred along the cerebrospinal fluid pathway. Head No tumor appeared outside the tibial spinal cord. This new model is reliable and repeatable Proven high. Ten^TwoWith an intracranial dose of tumor cells, animals are within 20 days of injection Died steadily over a period of 3-4 days.   Vaccination study. B16-F10 melanoma cells secreting cytokines Inoculation characteristics and protection against intracranial challenge in wild-type B16-F10 melanoma The ability was evaluated. For these studies, animals were fitted with a 27 gauge needle Using a tuberculin syringe, 10⁶Single irradiation of GM-CSF secreting B16-F10 cells Treated with subcutaneous flank injection. Prior to injection, transduced cells in vitro The total amount of secreted GM-CSF is 10⁶Between 50 and 60 ng per cell Was. Transduced cells to prevent replication and maintain cytokine production Was irradiated prior to in vivo injection. Previous studies have shown that B1 exposed to 5000 rads 6-F10 melanoma cells become replication incompetent but retain their metabolic capacity and up to 5 days It was shown to continue secreting cytokines in vivo during Jaffee, E. et al., “Us e of murine models of cytokine-secreting tumor vaccines to study feasibi lity and toxicity issues critical to designing clinical trials, " Imm unotherapy, printing (1995). The experiment was performed in two control groups: one group Is 10^FiveReceived flank injections of irradiated wild-type (non-cytokine-producing) B16 cells And the other was treated with a subcutaneous injection of either cell growth medium or 0.9% NaCl. Was. For all experiments, there were at least 10 animals per group. 2 After a week, all animals are removed by the method outlined above for 10 weeks.^TwoNon-irradiated wild-type B16-F Challenged with stereotactic intracranial injection of 10 melanoma cells. Animals are evaluated for survival Was.   Statistical minute prayer. Survival, Kaplan-Meier survival analysis for all efficacy studies And plotted statistical significance using Zar, J. Ed.Biostatistical An alysis Englewood Cliffs, New Jersey, Prentice-Hall, Inc., p. 140-50 (1984 ) Was determined by Kruskal-Wallis nonparametric analysis of variance as described in). Long-term survival The percentage of the product was analyzed by comparing the two ratios.   result   FIG. 2 shows that 10 engineered by gene transfer to secrete GM-CSF.⁶Irradiation B A systemic vaccination study performed in animals that received a single subcutaneous injection of 16-FI10 cells The result is shown. GM-CSF-secreting cells administered in this manner are not It was found to be protected against the challenge. Treated with GM-CSF vaccine, The median survival for animals whose brains were then challenged with wild-type B16 two weeks later was: Irradiated wild-type cells (which did not secrete GM-CSF) were treated with vaccine or medium. Control animals for 27 days compared to 19 and 17 days, respectively. (P <0.0001). These results were replicated four times and were similar and Results were statistically significant. Example 2: Systemic vaccination with microencapsulated GM-CSF   Thirty-two C57BL / 6 mice were divided into four groups of eight and either The abdomen was vaccinated: 1) saline, 2) 2500 ng bolus GM-CSF and 1 × Ten⁶Irradiated B16 melanoma cells, 3) 2500 ng of GM-CSF microspheres and 1 × 10⁶Pieces Irradiated melanoma cells, or 4) 1x10 transduced to produce GM-CSF⁶Pieces Irradiated melanoma cells. 14 days later, all animals had B16 melanoma challenge in the left frontal lobe Received   result   The median survival of the GM-CSF microsphere group and the transduced GM-CSF secretion group was Each lasted 27.5 days. These patients survived 16.5 days and received saline. It is significantly prolonged (p <0.001) compared to the control animals. GM-CSF Bora Group survived 15.5 days, and thus had no effect on survival. GM-CSF treatment The animals did not show any signs of toxicity from the vaccination.   This study showed that a significant anti-tumor immune response was detected in whole body vaccines with GM-CSF microspheres. Demonstrate what happens using inoculation. This response was due to tumors transduced with GM-CSF. GM-C comparable to the response produced by the tumor cells and treated with GM-CSF immunotherapy Shows the actual way to deliver SF. Example 3: Local intracranial delivery of IL-2 transduced tumor cells   Animals are 10^Three,Ten^Four,Ten^FiveOr 10⁶Irradiated cytokine production in any of Intracranial stereotactic co-injection of B16-F10 melanoma cells was received. It is determined by ELISA If 10 every 24 hours⁶It produces 80 ng of IL-2 per cell. Control animals are 1 0^Three,Ten^Four,Ten^FiveOr 10⁶Irradiated non-IL-2 producing wild-type B16-F10 at an equivalent dose of Received a co-injection. At the same time, all animals, 10^TwoSurvival of non-irradiated B16-F10 black lung Challenged with stereotactic intracranial injection of cells. For these experiments, There were at least 10 animals.   result   Treat intracranial tumors when cells transduced with IL-2 are delivered directly to the brain Found to be very effective in doing things. Initial studies showed that IL-2 effects were dose-dependent. Indeed. The results are shown in FIG. 0.02 ng daily dose of IL-2 ( Ten^ThreeIL-2 producing cells) show enhanced survival compared to controls However, the daily dose of 0.8 ng (10^FourIL-2 producing cells) reached statistical significance There was no prolonged survival tendency. 8.0 ng daily dose (10^FiveIL-2 producing cells Vesicles) showed a significant prolongation of survival. Untreated control action The animal died of an intracranial tumor by day 22 (median survival, day 20), but did not The median survival for all was 31 days, and 33% of the mice survived for more than 80 days (p <0.001 ). Interestingly, some animals that died in the IL-2-treated group have no brain tumors Was found; rather, tumors were observed around the spinal cord. This means that IL -2 suggests that the protective effect is localized at the site of cytokine delivery. Than IL-2 At high doses (80.0 ng / day), signs of IL-2 toxicity, including ataxia and death Was observed. These animals died before controls (median survival, 12th). These studies replicated seven times with similar doses of IL-2 transductants. Each experiment In animals treated with intracranial IL-2 transductants, compared to controls, There was a significant prolongation of survival.   In histological experiments at death, inflammation was apparently present in the brain parenchyma of the treated animals. Did not exist. However, lymphocytes were observed in the cerebrospinal fluid of animals treated with IL-2 . Example 4: Intracranial delivery of microencapsulated interleukin-2           Produces long-term memory and defends against re-challenge   Incorporating IL-2 into biodegradable sustained release microspheres with an average diameter of 4 μm I do. These microspheres were stereotactically injected into the brains of mice for 7 days. Delivered 100 ng of IL-2. A safety test is conducted for this over a period of 120 days. There was no evidence of clinical or histological toxicity from the dose. As primary treatment To assess the efficacy of B16 melanoma, lethal challenge with saline, empty Microspheres, or microspheres containing IL-2 The left parietal lobe was injected stereotaxically. In a similar experiment, 9L glioma cells were Were injected co-injected into the left parietal lobe.   To assess the potential brain vaccine efficacy of this treatment, non-tumor-bearing mice Group of IL-2 microspheres and melanoma cells irradiated to prevent replication Was co-injected intracranially. Thirty days later, these animals and any A group of control mice with no lethal dose of viable melanoma without additional IL-2 treatment Challenged intracranial.   result   Seventy-five percent (6 out of 8) of the IL-2 treated mice were 90 days after the first treatment Survived without signs of tumor, but median survival of untreated controls was 18 days . No animals survived beyond 21 days. Empty microspheres help survive Did not have. In a similar mouse melanoma experiment, a bolus injection of IL-2 was injected into the tumor site. No effect on survival was observed from either entry or systemic IL-2 administration. The In reoma experiments, microsphere delivery of IL-2 was 25 days for control The median survival in rats was extended to 55 days as compared to.   Previous IL-2 vaccinations have increased median survival to 45 percent and 2-5 animals 160 days after tumor challenge in all controls who died by Animals survived.   These results indicate that brain stromal immunotherapy with IL-2 delivered by microspheres Is an effective and safe treatment for brain metastases and inhibits tumor recurrence Indicates that Additional efficacy results and release kinetics of IL-2 from microspheres Science, Sills, A.K., Jr., et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel . Biomater., 23 (July 1996), and Kalyanasundaram, S. et al., Proceed. Inter n. Symp.Control. Rel. Biomater., 23 (July 1996). Example 5: Intracranial delivery of IL-2 transduced cells results in long-term memory           And defend against re-challenge   A group of 11 C57BL / 6 mice was first treated with intracranial IL-2 and Were co-injected with a dose of B16 melanoma, which was uniformly lethal in all animals. Control and In contrast, all 11 animals receiving intracranial IL-2 received the first tumor tumor in the brain. They survived the challenge and re-challenge the same site on day 70. Of 11 Six were re-challenged with wild-type melanoma cells. For the other 5 animals, injection of medium alone Received. Twelve additional mice, previously untreated, had B16 melanoma in the brain Challenged in the same way.   result   The melanoma challenge is lethal in all previously untreated mice, The median survival was 17 days. Conversely, treatment with IL-2 first and tumors on day 70 Re-challenged mice have significantly prolonged survival, with a median survival of 36 Days, 3 out of 6 survived 70 days (p = 0.01 vs. positive control, Man n-Whitney Test). As expected, all mice re-challenged with medium Survived another 70 days.   These results indicate that metastatic tumors do not recur after resection, or that IL-2 transduction Cranium useful in inhibiting the growth of simultaneous metastases by delivery of isolated cells Demonstrates long-term memory in the immune response to internal melanoma. Example 6: Local intracranial delivery of IL-2 transduced cells is outside the central nervous system           Defend against challenges   Intracranial injection of irradiated IL-2-secreting B16-F10 melanoma cells into 24 C57B16 mice And 12 C57B16 mice were injected with medium as a control. all Animals at the same time with wild-type B16-F10, which is uniformly lethal to untreated mice. An injection was made. Nine of the 24 IL-2 treated mice survived for 75 days. Control Did not survive for more than 20 days. On day 75, 9 surviving animals and 8 New control animals are challenged with 10,000 wild-type B16-F10 melanoma cells I did.   result   Only one out of nine long-term survivors developed flank tumors; conversely, eight Six of the control mice developed flank tumors (p = 0.024). First on the side Eight (out of nine) challenged long-term surviving animals received eight new controls. 126 days after the first challenge, 50,000 wild-type B16-F10 black with roll animals A second challenge was given to the flank with a larger bolus of lung cells. 17 days later, 8 animals Eight of the control mice developed tumors, but two out of eight long-term survivors Only animals developed flank tumors (p = 0.01).   This study shows that localized IL-2 immunotherapy delivered intracranially has immediate implications in the central nervous system. Not only generates an anti-tumor response, but also in multiple subsequent tumor challenges outside the central nervous system Demonstrates that it also establishes a long-term memory that can generate a strong anti-tumor response to it. Example 7: Local intracranial delivery of IL-4 transduced tumor cells   Poor immunogenicity of B16-F10 melanoma cells at IL-4 at tumor sites in the central nervous system Was transfected with the IL-4 gene. Transfected B1 Irradiate 6-F10 cells to suppress replication, and Intracranial injection in 8 C57BL / 6 mice with no B16-F10 (wild-type) melanoma cells Entered. Expression of IL-4 receptor in B16-F10 melanoma cells Inspection was performed by means of sorting (FACS).   result   Animals treated with IL-4 had a median survival of 31 days, but received only wild-type cells. Control animals had a median survival of 18 days (range 15-20 days; p = 0.0 02).   FACS analysis of B16-F10 cells did not show the presence of the IL-4 receptor, indicating that IL-4 Does not interact with receptors on tumor cells to exert cytotoxic effects Suggested. Results from these experiments show that high levels of locally expressed IL-4 is a potent immune system leading to a significant prolongation of survival in mice with central nervous system tumors It shows that it stimulates an epidemiological antitumor response. Example 8: Combination therapy: systemic vaccination with GM-CSF transductants and           Local intracranial administration of IL-2 transductants   For combination experiments, all animals are vaccinated subcutaneously on the flank and 10 co-injected with specific intracranial procedure^TwoWith a standard intracranial dose of wild-type melanoma cells I challenged two weeks later. 10 flank vaccinations⁶Irradiated GM-CSF production cells A single subcutaneous injection of the bleb and intracranial treatment 2 weeks later was performed with 5 x 10^Four Irradiated IL-2 producing cells. A daily dose of 8.0 ng of IL-2 (10^Fivecell) If you get a long-term survival of 33 percent and approach the dose at which toxicity is observed Lower dose of 4.0 ng / day of IL-2 (5 × 10^FourCells). Conte Roll animals are treated intracranially with subcutaneous GM-CSF vaccine and medium or with medium Vaccination and 5 × 10^FourProvide any of the intracranial treatments with IL-2-producing cells I got it. Additional controls include vaccination with medium alone, followed by intracranial tumor challenge. Intracranial treatment with media along with the range was performed.   result   Animals are treated with a GM-CSF secreting cell vaccine in combination with intracranial IL-2 producing cells. A very enhanced response was achieved. FIG. 4 shows the results. Median survival Not yet reached 100 days, 58% of the mice survived further combination treatment. This was compared to flank vaccination with GM-CSF producing cells alone (median survival, 27 days , P = 0.018) versus local intracranial administration of IL-2 producing cells alone (median survival, 35 Days, p = 0.01) and relative to controls (median survival, 17.5 days, p <0.001 ), Showing significant advantages. Long-term survival of more than 100 days in combination group animal Of the GM-CSF flank vaccine group (16%, p = 0.08), Of the total IL-2 transductants (8.3%, p = 0.03), or more than the sum of the two Provides a very enhanced response. Mice and GM-CSF vaccine alone In both mice treated with intracranial IL-2 secreting cells alone, Showed a prolonged survival (IL-2, p = 0.0006; GM-CSF, p <0.001), indicating that this model The efficacy of a single cytokine treatment in was confirmed.   These results indicate that the GM-CSF vaccine did not express CD4 + and CD8 + T Give rise to a population of cells, the activity of which is changed by subsequent local IL-2 treatment at the tumor site Indicates that it is enhanced. The result is that the blood-brain barrier is not able to deliver chemotherapeutic drugs to the brain. For impaired but immunologically active cells, means of entry into the central nervous system This is consistent with the theory that it works. Wekerly, H. et al., TINS, 27: 1-7 (1986).   The extent of inflammatory infiltration in the brain parenchyma of animals treated with these cytokines Small regardless of the mode of delivery. These findings are based on the flank model. Significant local inflammatory infiltration, contrary to studies of anti-tumor immune response enhanced with itokines Was evident. These results demonstrate the unique immune response in the brain, such as microglia. The answer also indicates that it may be associated with a protective immune response. Example 9: Systemic vaccination with GM-CSF transductants and IL-2 transductants           Topical intracranial administration results in long-term memory protection against rechallenge   Genetically engineered non-replicating B16-F10 melanoma cells can be used for systemic delivery of GM-CSF or IL-2 Used for intracranial delivery. Forty-nine C57B16 mice were treated with GM-CSF-producing B16-F10 cells. Flank, either with IL-2 or media after intracranial delivery of media 2 weeks later Inoculated with Kuching. All animals are given a uniform lethal dose to untreated animals. Received intracranial co-injection of live melanoma. First surviving animals and new controls Group receive a second intracranial injection of wild-type B16-F10 melanoma 134 days after the first challenge Re-challenge the amount.   result   Animals that received both flank GM-CSF and intracranial IL-2 survived the longest and survived The median has not yet reached 130 days (7/13 survivors). This is the flank GM-CS F alone (median survival 27 days, p = 0.018), intracranial IL-2 alone (32 days, p = 0.01) Has a significant improvement over any of the controls (17.5 days, p <0.001). GM-CSF Alone and IL-2 alone were significantly more effective than controls (p <0.006) .   7 animals treated with GM-CSF plus IL-2 survived for more than 130 days did. Five of the seven re-challenged mice survived after 28 days. Eight All control animals died by day 21 (p = 0.018). In addition, antitumor The ulcer effect lasted longer than 4 months. These results indicate that the use of cytokines Prove that it can lead to immunological memory in Example 10: Interstitial delivery of IL-2 to the brain   Method   With both primary treatment to establish tumors and a vaccine against subsequent recurrences To use local immunotherapy with interstitial delivery of interleukin-2 (IL-2) Describes an alternative approach for the control of metastatic brain tumors. IL-2, Incorporated into biodegradable sustained release microspheres (average diameter 4 μm), Were injected trigesally into the brains and delivered 100 ng of IL-2 over 7 days. Safety Strike shows evidence of clinical or histological toxicity from this dose over 120 days. I didn't. To evaluate the efficacy of B16 melanoma, Co-injected into the left parietal lobe of 25 mice in one of the following ways: : Saline (control), empty (no IL-2) microspheres, or IL -2 containing microspheres.   result   75% (6/8) of IL-2 treated animals survived 90 days after the first treatment without signs of tumor However, the median survival of untreated controls was 18 days and animals survived longer than 21 days There was no. Empty microspheres had no effect on survival. Similar mouse black In the chromoma test, either a bolus injection of IL-2 at the tumor site or systemic IL-2 administration However, there is no strong effect on survival, which is provided by microspheres. Sustained local delivery of IL-2 in the developing brain leads to a continuum of immune cells attracted to the tumor bed Suggested that it is important for stimulation. Example 11: Intracranial injection of IL-2 into the brain   Method   To assess the potential brain vaccine efficacy of this treatment, tumor-free mice Group with melanoma being irradiated to suppress IL-2 microspheres and replication Cells (see Example 10) were co-injected intracranial. 30 days later, these animals And group of control mice (previously no treatment) without additional IL-2 treatment A lethal dose of live melanoma was challenged intracranial.   result   Existing IL-2 vaccination extends median survival by 45%, and tumor challenge At 160 days later two out of five animals survived, and all controls were by day 23 Died. These results indicate that interstitial brain with IL-2 delivered by microspheres Immunotherapy is an effective and safe treatment for brain metastases and suppresses tumor recurrence Suggest that it can be controlled. Example 12: Combination treatment with locally delivered IL-2 and a chemotherapeutic agent   Method   Immunotherapy using non-replicating genetically engineered tumor cells that produce IL-2, and Testing a combination therapy consisting of local delivery of chemotherapy, Acting Synergistically on Intracranial Tumor Challenge in a Brain Tumor Model Decided. B16-F10 melanoma cells with replication-protective MFG retroviral vector Used to transduce with mouse IL-2. Chemotherapeutic drugs BCNU and carboplatin Was incorporated into the controlled release polymer. Non-replicating IL-2-producing tumor cells were injected into C57 / B16 mice. Intracranial challenge of wild-type tumors was administered with and without vesicles. On the fifth day , Animals were implanted with 4.0% BCNU, 1% carboplatin in polymer implants or Bo was administered.   result   Animals treated with IL-2 and 1% carboplatin (n = 10, median survival from 100 days) Long, p <0.01) was IL-2 (n = 10, median survival 38 days) or 1% carboplatin Survival was significantly improved compared to animals given alone (n = median survival 23 days). Was. Animals receiving IL-2 and 4.0% BCNU (n = 10, median survival 44 days) had 4.0% BCNU (n = 10, median survival 24 days) or IL-2 alone (n = 10, median survival 38 days) There was better survival than animals that did. About control group (n = 10) The median survival was 19 days. This example demonstrates the combination of IL-2 with local delivery of a chemotherapeutic agent. Combined intracranial immunotherapy improves survival over either anti-tumor treatment alone Prove that. This effect is due to the low dose of chemotherapy (1% carboplatin and 4. 0% BCNU). Example 13: IL-2 inhibited tumor growth in a mouse model of hepatic melanoma metastasis   Method   Useful immunotherapy strategies can be useful in organs with unique immunological properties and in humans. Must prove success in tumors in the liver, a common site of metastasis . The antitumor effect of local or paracrine IL-2 delivery was implanted into the liver of C57B1 / 6 mice Were evaluated using the obtained non-immunogenic B16-F10 melanoma. Transfer with IL-2 gene The irradiated autologous tumor cells were used as a source of IL-2. These details Various numbers of cells (5 × 10^Five~ 2 × 10⁶) Is 1 × 10^FourMixed with wild-type B16-F10 melanoma cells And injected into the liver and co-injected with cells alone, with untransfected cells Cells injected or co-injected with IL-2 cells injected at the distal site (flank) Cells were compared (n = 7 / group). Presence or absence of tumor in the liver and tumor volume , Measured on day 21.   result   Mice receiving IL-2 delivered locally at all doses inhibited tumor growth. Harm was seen. The number of mice without any tumors was determined by the mice receiving the highest IL-2 dose. Mean significantly lower (p <0.05) and in the liver where the tumor is present, the average tumor volume is Significantly reduced (2mm^Three884mm^Three, P <0.05). This effect is due to IL-2 being administered distally. Or in mice receiving irradiated wild-type controls I couldn't see it. Effect was dose-dependent, with maximal inhibition seen at highest IL-2 dose . Histological examination revealed that IL-2 was composed of both lymphocytes and Kupffer cells. Sites in the liver with secretory cells showed marked infiltration. In summary, these The results indicate that local delivery of IL-2 is Demonstrate that growth was inhibited. This strategy is for the development of immunotherapy for liver tumors. Has potential applications.   One skilled in the art will recognize many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. It can be recognized or slightly confirmed using routine experimentation. Such as Valuations are intended to be encompassed by the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 トンプソン，レイド シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94014, ダリー シティ，エステイト サークル 632 (72)発明者 ジャフィー，エリザベス エム. アメリカ合衆国 メリーランド 21093, ルーサービル，サマー フィールズ コー ト 20 (72)発明者 レオン，カム ダブリュー. アメリカ合衆国 メリーランド 21043, エリコット シティ，ブレコンシャー ロ ード 10242 (72)発明者 エウェンド，マシュー ジー. アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27514，チャペル ヒル，ハンティントン ドライブ 224──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 35/00 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AU, BA, BB, BG, BR, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KP, KR, LC, LK, LR, LT, LV, MG, M K, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, SL, TR, TT, UA, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Thompson, Raidsea. California, USA 94014, Darry City, Estate Circle 632 (72) Inventor Jaffy, Elizabeth M. Maryland, United States 21093, Lutherville, Summer Fields Court 20 (72) Inventor Leon, Cam W. Maryland, United States 21043, Ellicott City, Breconshire Row De 10242 (72) Inventor Ewend, Matthew G. United States North Carolina 27514, Chapel Hill, Huntington Drive 224

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．患者において腫瘍の増殖を阻害するための処方物であって、以下： 制御放出および持続放出するための薬学的に受容可能なキャリア中の抗原と組 み合わせた第１のサイトカイン、および 腫瘍の部位で制御放出および持続放出のための薬学的に受容可能なキャリア中 の第２のサイトカイン、 を含み、ここで、該サイトカインの組み合わせが、該患者において腫瘍の増殖を 阻害するために有効な投与量である、処方物。 ２．前記第１のサイトカインが、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子であ る、請求項１に記載の処方物。 ３．前記第２のサイトカインが、インターロイキン-2およびインターロイキン-4 からなる群より選択される、請求項１に記載の処方物。 ４．腫瘍抗原を前記サイトカインと別々に投与する工程をさらに包含する、請求 項１に記載の処方物。 ５．前記腫瘍抗原が、複製不能にした腫瘍細胞の形態で投与される、請求項４に 記載の処方物。 ６．サイトカインが、生体適合性制御放出ポリマーマトリクスにマイクロカプセ ル化される、請求項１に記載の処方物。 ７．前記サイトカインが、複製不能にしたサイトカイン分泌腫瘍細胞の形態で投 与される、請求項１に記載の処方物。 ８．前記第１のサイトカインがGM-CSFであり、そして前記第２のサイトカインが 形質導入された細胞または微小粒子から放出されるインターロイキン-2である、 請求項１に記載の処方物。 ９．患者において腫瘍増殖を阻害する方法であって、以下： 処置の必要な患者に抗原と組み合わせて第１のサイトカインを投与する工程で あって、ここで該組み合わせが、制御放出処方物および持続放出処方物において 投与される工程、および 制御放出処方物および持続放出処方物において第２のサイトカインを該患者に 投与する工程、 を包含し、ここで、該第１のサイトカインおよび第２のサイトカインの組み合わ せが、該患者において腫瘍増殖を阻害する、方法。 １０．前記第１のサイトカインが、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子で ある、請求項９に記載の方法。 １１．前記第２のサイトカインが、インターロイキン-2およびインターロイキン -4からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。 １２．前記患者に腫瘍抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項９に記載の 方法。 １３．前記腫瘍抗原が、複製不能にしたサイトカイン分泌腫瘍細胞の形熊である 、請求項１２に記載の方法。 １４．サイトカインがマイクロカプセル化される、請求項９に記載の方法。 １５．前記第２のサイトカインが、複製不能にしたサイトカイン分泌腫瘍細胞の 形態である、請求項９に記載の方法。 １６．前記第２のサイトカインが、制御放出処方物中にマイクロカプセル化され る、請求項１４に記載の方法。 １７．前記第１のサイトカインが顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子であ り、そして前記第２のサイトカインがインターロイキン-2である、請求項９に記 載の方法。 １８．前記患者が脳腫瘍を有し、そして前記第２のサイトカインが頭蓋内に投与 される、請求項９に記載の方法。 １９．前記第１のサイトカインが、腫瘍抗原と組み合わせたGM-CSFである、請求 項１８に記載の方法。 ２０．前記第２のサイトカインが、マイクロカプセル化されたインターロイキン である、請求項１９に記載の方法。[Claims] 1. A formulation for inhibiting tumor growth in a patient, comprising:   Antigens and pairs in pharmaceutically acceptable carriers for controlled and sustained release A combined first cytokine, and   In a pharmaceutically acceptable carrier for controlled and sustained release at the site of the tumor A second cytokine, Wherein the combination of cytokines increases tumor growth in the patient. A formulation that is an effective dose to inhibit. 2. The first cytokine is granulocyte-macrophage colony stimulating factor The formulation of claim 1, wherein 3. The second cytokine is interleukin-2 and interleukin-4 The formulation of claim 1, wherein the formulation is selected from the group consisting of: 4. Further comprising the step of administering a tumor antigen separately from said cytokine. Item 10. The formulation according to Item 1. 5. 5. The method according to claim 4, wherein the tumor antigen is administered in the form of tumor cells that have rendered replication incompetent. The described formulation. 6. Cytokines are microencapsulated into a biocompatible controlled release polymer matrix. The formulation of claim 1, wherein the formulation is 7. The cytokine is administered in the form of a cytokine-secreting tumor cell that has become replication incompetent. The formulation of claim 1, which is provided. 8. Wherein said first cytokine is GM-CSF and said second cytokine is Interleukin-2 released from the transduced cells or microparticles, A formulation according to claim 1. 9. A method of inhibiting tumor growth in a patient, comprising:   Administering the first cytokine in combination with the antigen to the patient in need of treatment And wherein the combination is in a controlled release formulation and a sustained release formulation Administered steps, and   Providing a second cytokine to the patient in a controlled release formulation and a sustained release formulation Administering, Wherein the combination of the first cytokine and the second cytokine A method of inhibiting tumor growth in said patient. 10. The first cytokine is granulocyte-macrophage colony stimulating factor The method of claim 9, wherein the method comprises: 11. The second cytokine is interleukin-2 and interleukin; 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of: -4. 12. 10. The method of claim 9, further comprising administering a tumor antigen to the patient. Method. 13. The tumor antigen is the form of cytokine-secreting tumor cells that have rendered replication incompetent The method of claim 12, wherein: 14． 10. The method of claim 9, wherein the cytokine is microencapsulated. 15. The second cytokine is a cytokine-secreting tumor cell that has rendered replication incompetent. 10. The method of claim 9, wherein the method is in a form. 16. The second cytokine is microencapsulated in a controlled release formulation The method of claim 14, wherein 17． The first cytokine is granulocyte-macrophage colony stimulating factor And the second cytokine is interleukin-2. The method described. 18. The patient has a brain tumor and the second cytokine is administered intracranial 10. The method of claim 9, wherein the method is performed. 19. Claims: The first cytokine is GM-CSF in combination with a tumor antigen. Item 19. The method according to Item 18. 20. The second cytokine is a microencapsulated interleukin 20. The method of claim 19, wherein