【発明の詳細な説明】
プラスミドDNAの迅速な単離のための組成物及び方法
連邦政府によって支援された研究又は開発に関する申し立て
本発明は、国立衛生研究所(NIH)に支給したグラント番号1R03RR08759-01及び1
R29A134278-01A2の政府からの補助金による成果である。政府は、本発明に一定
の権利を有する。
発明の背景
本発明は、細菌培養液からのプラスミドDNAの迅速な単離のための組成物及び
その使用方法に関する。特に、望ましい具体例として、本発明は、細胞破片、染
色体DNA、細胞RNA、及び蛋白質類を析出させることによって透明な溶解液を調製
するために使用することができ、次にその透明な溶解液からプラスミドDNAを特
異的に析出させるために使用することができる組成物に関する。別の望ましい具
体例として、本発明は細胞RNAを消化するための酵素、ヌクレアーゼ消化からプ
ラスミドDNAを保護するための安定剤、及びプラスミドDNAを析出させるための析
出剤から成る組成物に関する。この組成物を使用する方法は、細胞RNAを消化す
ること、ヌクレアーゼ消化からプラスミドDNAを保護すること、透明な細菌溶解
液からプラスミドDNAを析出させること、を同時に行うことから成る。
細菌培養液からのプラスミドDNAの単離は、分子生物学では日常的な操作であ
る。これまで、多くのプラスミドDNA単離操作が開発されてきた。例えば、(a)SD
S-NaOH溶解/フェノール・クロロホルム抽出/エタノール析出(H.C.Birnboim & J.
Doly,A Rapid Alkaline Extraction Procedure for Screening Recombinant pla
smid DNA,7 Nucl.Acids Res.1513-23(1979))、(b)煮沸溶解/エタノール析出(D.S
.Holmes & M.Quigley,A Rapid Boiling Method for the Preparation of Bacter
ial plasmid,114Anal.Biochem.193-97(1981))、(c)フェノール・クロロホルム溶
解及び抽出/エタノール析出(S.Anant & K.N.Subramanian,Isolation of Low Mol
ecular Weight DNA from Bacteria and Animal Cells,216 Meth.Enzymol．20-29
(1992))、(d)SDS-NaOH溶解/エタノール析出/ポリエチレングリコール(PEG)精製(
J.Sambrook et al.,
Purification of Plasmid DNA by Precipitation with Polyethylene Glycol,in
Sambrook et al.,Molecular Cloning 1.40-1.41(2d ed.,1989))、(e)SDS-NaOH
溶解/ガラス又はシリカ吸着(M.A.Marko et al.,A Procedure for the Large Sca
le Isolation of Highly Purified Plasmid DNA using Alkali Extraction and
Binding to Glass Powder,121 Anal.Biochem.382-87(1982))、及び(f)SDS-NaOH
溶解/CsCl勾配精製(J.Sambrook et al.,Pcurification of Closed Circular DNA
by Equilibrium Centrifugation in CsCl-EthBr Gradicnts,in J.Sambrook et
al.,Molecular Cloning 1.42-1.43(2d ed.,1989))。これらの方法の多くは、か
なり信頼でき、いくつかはDNA単離キットとして市販されている。しかし、これ
らには全て、一つ以上の欠点がある。例えば、時間がかかること、毒性化学物質
の使用を必要とすること、RNAで汚染されること、又は専用設備を必要とするこ
とである。プラスミドDNAの単離は、分子クローニングにおいて他の多くの段階
の前の段階であるので、簡単で迅速なプラスミドDNA単離方法が常に求められて
いる。従って、プラスミド単離操作を簡易化するために、多くの努力が、多くの
研究者によってなされてきたし、現在もなされている。
このような状況から判断して、細菌培養液からプラスミドDNAをRNAで汚染する
ことなく高収率で迅速に単離するための組成物及びその使用方法を提供すること
は重要なことであり、毒性化学物質も専用設備も必要としない方法は技術の重要
な前進となろう。
発明の概要
細菌培養液から非常に純粋なプラスミドDNAを迅速に単離するための組成物を
提供することが本発明の目的の一つである。
細菌培養液から非常に純粋なプラスミドDNAを迅速に単離する方法を提供する
ことも本発明の目的の一つである。
細菌培養液からプラスミドDNAを迅速に単離するための毒性化学物質も専用設
備も必要としない方法を提供することも本発明の目的の一つである。
細菌培養液からプラスミドDNAを単離するために、大規模標品、ミニ標品(mini
prep)、及び96穴マイクロタイタープレート形式に適用可能な方法を提供するこ
とも本発明の目的の一つである。
これらの目的等は、約3Ｍ以上のMgCl2と約10％(w/v)ポリエチレングリコール
の組成物を提供することによって達成することができる。ポリエチレングリコー
ル
の平均分子量は約6000〜約8000、MgCl2の濃度は約3Ｍであるのが望ましい。
細菌培養液からプラスミドDNAを単離する操作は以下の各段階から成る：
(a)細菌培養液中の細菌細胞を溶解して細菌溶解液を作り、
(b)細菌溶解液にMgCl2とポリエチレングリコールを添加し、MgCl2を約1Ｍ以上、
ポリエチレングリコールを約3.3％(w/v)含む第一の混合物を作ることにより、第
一の混合物中の細胞破片、染色体DNA、細胞RNA、及び蛋白質類を析出させ、
(c)第一の混合物から析出した細胞破片、染色体DNA、細胞RNA、及び蛋白質類を
分離し取り除き、透明な溶解液を作り、
(d)透明な溶解液に、MgCl2とポリエチレングリコールを添加してMgCl2を約1.5Ｍ
以上、ポリエチレングリコールを約5％(w/v)含む第二の混合物を作ることにより
、第二の混合物のプラスミドDNAを析出させ、そして
(e)第二の混合物から析出したプラスミドDNAを単離し、単離したプラスミドDNA
を得る。
細菌細胞はアルカリ溶解によって溶解するのが望ましい。また、MgCl2とポリ
エチレングリコールは、MgCl2が約3Ｍ以上、ポリエチレングリコールが約10％(w
/v)となるように加えるのが望ましい。組成物は約3ＭのMgCl2から成り、ポリエ
チレングリコールの平均分子量は約8000であるのが、より望ましい。
細菌培養液から透明な細菌溶解液を作る方法は以下の各段階から成る：
(a)細菌培養液の細菌細胞を溶解して細菌溶解液を作り、
(b)細菌溶解液にMgCl2とポリエチレングリコールを加えてMgCl2を約1Ｍ以上、ポ
リエチレングリコールを約3.3％(w/v)含む第一の混合物を作り、細胞破片、染色
体DNA、細胞RNA、及び蛋白質類を析出させ、そして
(c)第一の混合物から析出した細胞破片、染色体DNA、細胞RNA、及び蛋白質類を
分離し、透明な溶解液を作る。
発明の別の具体例では、細菌培養液からプラスミドDNAを単離するための組成
物は、細胞RNAを消化するために有効な量の酵素、ヌクレアーゼ分解からプラス
ミドDNAを保護するために有効な量の安定剤、及びプラスミドDNAを析出させるた
めに有効な量の析出剤から成る。酵素はリボヌクレアーゼを用い、酵素の有効な
量は約1〜100μｇ/mlであるのが望ましく、5〜50μｇ/mlの範囲であるのがより
望ましい。また、安定剤は二価の陽イオン・キレート化剤であるのが望ましく、
エ
チレンジアミン四酢酸(EDTA)またはその塩類であるのがより望ましく、有効な量
は約1〜100mMの範囲にあるのが望ましく、5〜50mMであるのがより望ましい。
さらに、析出剤はポリエチレングリコールであり、析出剤の有効な量は約5〜25
％(w/v)の範囲であるのが望ましい。ポリエチレングリコールの平均分子量は、
約6000〜8000であるのが望ましい。
細菌培養液からプラスミドDNAを単離する方法は以下の各段階から成る：
(a)細菌培養液から細菌細胞を濃縮してペレットにし、
(b)ペレット状の細菌細胞を所定の体積の水溶液に再懸濁し濃縮細胞懸濁液を得
、
(c)濃縮細胞懸濁液中の細菌細胞を溶解して溶解された細胞懸濁液を得、
(d)溶解された細胞懸濁液中の細胞破壊片を析出させ、溶解された細胞懸濁液か
ら、析出した細胞破壊片を分離して透明な細胞溶解液を得、
(e)透明な細胞溶解液を、細胞RNAを消化するために有効な量の酵素、ヌクレアー
ゼ分解からプラスミドDNAを保護するために有効な量の安定剤、及びプラスミドD
NAを析出させるために有効な量の析出剤から成る有効な量の組成物を添加して混
合物を得、混合物に含まれる細胞RNAを消化する酵素のため及び混合物に含まれ
るプラスミドDNAを析出させるために充分な温度で充分な時間、混合物をインキ
ュベートし、
(f)混合物から析出したプラスミドDNAを単離し、析出したプラスミドDNAを洗浄
溶液中で洗い、DNAペレットを得、そして
(g)DNAペレットを乾かし、次に、所定量の水系媒体中にDNAペレットを再懸濁し
て、単離プラスミドDNAを得る。
図面の簡単な説明
図1は、10％アガロースゲルでの分離及び臭化エチジウム染色による可視化の
後に同じ細胞溶菌から本発明(レーン1、3、5、及び7)により調製されるpUC19の1
:1階段希釈のミニ標品及びエタノール析出(レーン2、4、6、及び8)によるDNAを
示す。レーンＭ、BstEII/1の分子量ラダー(階段状の模様)。
図2は、32種類の制限酵素で消化され、0.6％アガロースゲル上で分離され、臭
化エチジウムで染色されたプラスミドpBKBH10S(11857bp)の制限エンドヌクレア
ーゼ断片を示す。0、非切断；1、BsaHI；2、NotI；3、SmaI；4、XbaI；5、BamHI
；6、BpmI；7、BspHI；8、ClaI；9、DrdI；10、NdeI；11、PstI；12、SacI；13S
alI；
14、SapI；15、XhoI；16、EcoRI；17、EcoRV；18、BsgI；19、HaeII；20、HindI
II；21、KpnI；22、XmnI；23、AlwNI；24、BsbI；25、BglII；26、SspI；27、Sc
aI；28、AccI；29、StyI；30、DraI；31、TaqI；及び32、HphI。
図3は、本発明によるマイクロタイタープレート操作で調製されるプラスミドD
NAを示す。カラム9〜12からのプラスミドDNAが0.8％アガロースゲル上で分離さ
れ、臭化エチジウムで染色された。カラム10と12には細菌を接種せず、プラスミ
ドDNAは非接種ウェル中には見出されなかった。
発明の詳細な説明
細菌培養液からプラスミドDNAを単離するための本組成物及び方法を説明し記
述する前に、本発明は、ここで説明する特定の構成、プロセス段階、及び材料に
は限定されず、そのような構成、プロセス段階、及び材料は幾分変わりうるもの
であることを理解されたい。本明細書で用いる用語は特定の具体例を記述する目
的のためだけに使用され、制限する意図はないこと、また、本発明の範囲は添付
された請求の範囲及びその均等物によってのみ制限されることも理解されたい。
本明細書及び添付された請求の範囲で使用する用語に“類”を付けなくても、
文脈から明らかに単数である場合以外は、複数形も含むことに注意されたい。
本発明を記述し、特許を請求する場合には、以下の用語は、以下の定義に従っ
て使用する。
本明細書では、“TE緩衝液”は10mMトリス、１mM EDTA、pH8.0から成る。
本明細書では、“アルカリ性溶解溶液”は0.2N NaOH中1％SDSから成る。
本明細書では、“有効な量”は所定の反応を、悪影響がなく達成できる量を意
味する。例えば、細胞RNAを消化するために有効な量の酵素は、所定の温度で所
定の時間内でそのような細胞RNAを消化するために充分な量である。安定剤の有
効な量はヌクレアーゼ分解から所定の温度で所定の時間、プラスミドDNAを保護
するために充分な量である。析出剤の有効な量は、所定の温度で所定の時間で、
所定のプラスミドを析出させるために充分な量である。本発明で提供する手引き
及び公知の技術を用いれば、技術に熟練した人は、過度の実験をしなくても、そ
のような有効な量を求めることができる。
本明細書で使用する“細胞RNAを消化するための酵素”及び同様の用語は、そ
のような細胞RNAを消化することのための核酸分解酵素を意味する。そのような
核酸分解酵素はリボヌクレアーゼＡであるのが望ましい。リボヌクレアーゼＡは
、請求する組成物に約1〜約100μＬ/mLの量含まれるのが望ましい。
本明細書で使用する“安定剤”という用語は、ヌクレアーゼ分解からプラスミ
ドDNAを保護するための薬剤を意味する。望ましい安定剤は、エチレンジアミン
四酢酸(EDTA)及びその塩類のような二価の陽イオン・キレート剤である。本請求
の組成中のEDTA又はその塩類のような安定剤の望ましい量は約1〜約100mMの範囲
である。
本明細書で使用する“析出剤”と言う用語は、溶液からプラスミドDNAを析出
させるためのポリエチレングリコール又はデキストランのような高分子を意味す
る。ポリエチレングリコールが特に望ましく、本発明の組成物には一般に、約5
〜50重量％の濃度で使用する。また、PEG6000又はPEG8000のような比較的低い平
均分子量を有するポリエチレングリコール(PEG)ポリマー類を使用するのが望ま
しい。
この組成物の具体例の一つは、約3Ｍ以上のMgCl2と約10％(w/v)のポリエチレ
ングリコール水溶液から成り、ポリエチレングリコールの平均分子量は約8000(P
EG8000)であるのが望ましい。PEG8000の濃度は、組成物の適切な機能にかなり重
要であるが、MgCl2の濃度は変わり得る。MgCl2の最適濃度は、約3Ｍであること
が求められた。MgCl2とポリエチレングリコールを細胞溶解液に添加することに
より、透明な溶解液を得ることができ、その透明な溶解液にさらにMgCl2とポリ
エチレングリコールを添加することによりプラスミドDNAを析出させることがで
きる。MgCl2とポリエチレングリコールは混合物として加えても別々の溶液を続
けて加えても構わないが、調製と使用の容易さのためには、MgCl2とポリエチレ
ングリコールの混合物を用いるのが望ましい。
細菌培養液からプラスミドDNAを特異的に析出させるためのこの組成物を使用
する具体的方法の一つは、細菌培養液中の細胞を、望ましくは公知のアルカリ性
溶解液で、溶解し、MgCl2/PEG8000組成物約0.5容を加えて混合し、細胞破片、RN
A、染色体DNA、及びタンパク質を析出させ、析出した細胞破片、RNA、染色体DNA
、及びタンパク質を取り除き、透明な溶解液を得、その透明な溶解液と前の段階
で使用したMgCl2/pEG8000組成物のほぼ同じ体積を混合し、プラスミドDNAを特異
的に析出させ、析出したプラスミドDNAを回収することである。析出
したプラスミドDNAは、公知の70％エタノール等の洗浄溶液で洗うのが望ましい
。得られるプラスミドDNAは、制限エンドヌクレアーゼでの消化や、ヌクレオチ
ド配列決定関連技術のために充分純粋である。
本組成物及び方法は、細胞溶解液からプラスミドDNAを精製するために、そし
て以下の応用のためにも使用することができる：(1)陰イオン交換や他のクロマ
ト的手法による超高純度プラスミドDNAを調製する予備精製段階として、(2)哺乳
動物細胞のような種々の細胞や組織からウイルスDNA類などの他のエピソームDNA
分子を単離し精製するために、そして(3)反応後のクリーンアップ段階として、
二本鎖DNAから他の分子、例えばRNA、一本鎖DNA、ヌクレオチド類、酵素類、等
を取り除く、又は回収するため。
本発明は、プラスミドDNAを単離して精製するのにPEGを使用する、東亜合成化
学工業(株)による操作(JP 61-4719pp.533-36(1986))及び同様の操作(M.Hattori
& Y.Sakaki,Dideoxy Sequencing Method Using Denatured Plasmid Templates,1
52,Anal.Biochem.232-38(1986);K.D.Cole,Purification of Plasmid and High M
olecular Mass DNA Using PEG-salt Two-phase Extraction，11 BioTechniques
18-24(1991))の改良法である。これらの方法では、細胞タンパク質を抽出するた
めに細胞溶解液をフェノール・クロロホルムで処理し、溶解液中のDNAとRNAをエ
タノールで析出させ、次にRNAをRNA分解酵素で37℃で30分間消化し、最終段階で
PEG析出によりプラスミドDNAを単離する。
“ミニ”プラスミド標品すなわち“ミニ標品”を多数調製する方法は生物工学
に重要な貢献をする。ヒト・ゲノム計画などの多くの遺伝子配列決定プロジェク
トでは、何百万個ものプラスミド・ミニ標品が毎年調製され、これらの研究では
手間がかかり律速段階となっている。96穴形式の自動化DNA塩基配列決定反応が
現在利用可能であるので、本発明により96穴マイクロタイタープレート中にプラ
スミド・ミニ標品を調製することによって、細胞培養過程からDNA塩基配列決定
までが能率化される。N.Avdalovic,Automation of DNA Sequencing Protocols U
sing Fluorescent primers and the Beckman Biomek 1000 Workstation,Beckman
Application Notes ROBAN-015,pp.1-14(1989)。
現在、96穴プレート・ミニ標品技術はプロメガ社からだけ入手可能である。D.
Romanin et al.，Use of a 96 Well Format for Wizard Miniprep DNA Isolatio
ns，49
Promega Notes 28-32(1994)。プロメガの方法はシリカ樹脂へのDNA結合に基づき
、一組のミニ・カラムへの細胞溶解液の移動、溶解液へのDNA付着樹脂の添加、
多岐管中での試料の洗浄、及びカラムから96穴プレートへのプラスミドDNAの溶
出から成る。本発明の方法は異なるDNA単離機構に基づくだけではなく、異なるD
NA単離操作も含む。プロメガの方法と異なり、本方法は専用設備も補助装置も必
要とせず、細胞培養からプラスミドDNAの単離までのすべての段階を96穴プレー
ト中で実行する。
実施例１
MgCl2とPEG8000を3Ｍ MgCl2と10％(w/v)PEG8000の濃度に脱イオン水で溶かす
ことによって、細菌培養液からプラスミドDNAを単離するための本発明による具
体的組成物を調製した。
実施例２
この実施例では、プラスミドDNAを単離するための実施例１による組成物を使
用するための操作を記述する：
1.一夜培養した細菌培養液1.5mlを12,000×gで約1〜60秒間遠心分離してペレッ
トにし、
2.培地を捨て、細胞ペレットに脱イオン水約100μＬを加え、攪拌して、細胞を
再懸濁し、
3.細胞懸濁液に1％SDSと0.2N NaOHから成るアルカリ性溶解溶液100μＬを加え、
チューブを逆にして混合し、細菌溶解液を得、
4.実施例１の溶液100μＬを加え、チューブを逆にして混合し、1,2000×gで1分
間遠心分離し、細胞破壊片、染色体DNA、細胞RNA、及びタンパク質をペレットに
し、透明な溶解液を得、
5.実施例１の溶液100μＬを入れたチューブにその透明溶解液を移し、攪拌し、1
2,000×gで10分間遠心分離し、プラスミドDNAをペレットにし、
6.上清を捨て、70％エタノールでプラスミドDNAのペレットをすすぎ、DNAペレッ
トを乾かし、次にTE衝液50μＬ中にそれを懸濁する。
実施例３
この操作では、実施例１による組成物を使用する中規模標品、すなわち“ミデ
ィ標品”操作を記述する：
1.一夜培養した細菌培養液50mLを12,000×gで60秒間遠心分離してペレットにし
、
2.脱イオン水1mLでピペット操作によってペレットを懸濁し、
3.1％SDS，0.2N NaOH 3mLを加え、チューブを逆にして混合し、細菌溶解液を得
、
4.実施例１の溶液2mLを加え、チューブを逆にして混合し、
5.チューブを12,000×gで5分間遠心分離して、細胞破壊片、染色体DNA、細胞RNA
、及びタンパク質をペレットにし、透明な溶解液を得、
6.新しいチューブにその透明溶解液を移し、
7.実施例１の溶液2mLを加え、攪拌し、37℃で5分間チューブと内容物をインキュ
ベートし、
8.12,000×gで10分間遠心分離して、プラスミドDNAをペレットにし、上清を捨て
、
9.70％エタノール5mL中に懸濁し、遠心分離してチューブの底にペレットにし、
次に上清を捨てることによって二度プラスミドDNAペレットを洗い、
10.プラスミドDNAペレットを乾かし、次にTE500μＬ中にそれを再懸濁する。
実施例４
この実施例では、96穴マイクロタイタープレートを使用する大規模なミニ標品
操作を記述する：
1.96穴の各ウェルに、プラスミドが有する抗生物質抵抗性マーカーに対応する適
当な抗生物質を含むLB培地1mLを入れ(J.Miller,Experiments in Molecular Gene
tics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1972)、本明細
書に援用)、
2.ウェルにプラスミドを含む細菌を接種し、アルミニウムでプレートを覆い、イ
ンキュベーションの間のウェルの通気のために針でふたに穴を開け、
3.ふたをしたプレートを37℃のシェーカーで一夜インキュベートし、
4.別の96穴マイクロタイタープレートに各ウェルから50μＬを移し、可能な今後
の使用のために保存し、
5.2500×gで5分間元のプレートを遠心分離し、細胞をペレットにし、上清を捨て
、
6.脱イオン水50μＬ中に攪拌することによって各細胞ペレットを懸濁し、0.2N N
aOH中1％SDS 50μＬを加え、振盪によって混合し、
7.実施例１の溶液50μＬを加え、振盪によって混合し、次にプレートを2500×g
で15分間遠心分離し、細胞破壊片、染色体DNA、細胞RNA、及びタンパク質をペレ
ットにし、透明な溶解液を得し、
8.新しい96穴プレートに透明溶解液を移し、実施例１の溶液50μＬを添加し、37
℃で5分間インキュベートし、
9.プレートを2500×gで15分間遠心分離し、プラスミドDNAをペレットにし、次に
上清を捨て、
10.プラスミドDNAペレットを70％エタノール1mL中に懸濁し、プレートを遠心分
離し、次に上清を捨てることで、二度洗い、
11.プラスミドDNAペレットを乾かし、TE50μＬ中に懸濁する。
pUT626のクローンを、この操作を用いて調製する。試料間のプラスミドDNAの
回収率は比較的安定であり、ウェル間の汚染は見られない。
実施例５
プラスミドpHHC(2768bp)のクローンを実施例２の操作により分離し、35S-α-d
ATPと“SEQUENASE”バージョン2を使用するジデオキシ法によって配列決定する
。F.Sanger et al.,DNA Sequencing with Chain-terminating Inhibitors,74 Pr
oc.Nat'l Acad.Sci.USA 5463(1977)、本明細書に援用。
本発明のもう一つの望ましい態様では、細菌培養液からプラスミドDNAの迅速
な分離を成功させるDNA単離溶液が開発された。その組成物は上記の細胞RNAを消
化するために有効な量の酵素、ヌクレアーゼ分解からプラスミドDNAを保護する
ために有効な量の安定剤、及びプラスミドDNAを析出させるために有効な量の析
出剤から成る。この溶液を使用する方法は簡単で、速く、便利で、費用効率がよ
い。この方法によれば細胞溶解液からプラスミドDNAの95％以上を回収すること
ができる。この方法によって得られるDNAはRNA汚染が無く、分子クローニング及
びDNA塩基配列決定のための種々の操作に適当である。この方法は、高効率ミニ
標品のための96穴マイクロタイタープレート形式に適合し、多数のクローンをス
クリーニングするために非常に役に立つ。
この方法は、プラスミド精製にPEGを使用する従来の方法より優れる少なくと
も二つの異なる改良点を含んでいる。第一に、プラスミド単離のために使用する
溶液へEDTAなどの二価の陽イオン・キレート化剤を添加することによって、最初
にエノール析出および有害で面倒なフェノール・クロロホルム抽出を行うことな
く、RNA分解酵素と37℃でのインキュベーションの間、細胞DNA分解酵素による分
解から、プラスミドDNAを保護することができる。第二に、PEG溶液への
EDTAとRNA分解酵素の添加によって次の三つの目的が同時に達成される:(1)プラ
スミドDNAを保護する、(2)RNAを消化する、そして(3)プラスミドDNAを析出させ
る。従来のPEG法では、これらの目的は三つ以上の別々の段階で達成されていた
。これらの改良と簡素化のために、本発明の方法は、より簡単でより速く、そし
て以下に記述するように、96穴マイクロタイタープレートを使用する大規模なミ
ニ標品操作に適合させることができる。
プラスミド単離溶液は非毒性成分で構成され、4℃で6カ月間以上安定である。
必要な他の試薬はTE緩衝液(10mMトリス及び1mM EDTA、pH8.0)、0.2N NaOH中1％S
DS、3Ｍ酢酸ナトリウム(pH5.0)、及び70％エタノールである。大規模なミニ標品
のためには、96穴(2mL/ウェル)マイクロタイタープレート(例えば、Beckman #14
0504)とアルミニウムのふた（例えば、Beckman #538619)を用いるのが望ましい
。
実施例６
この実施例では、脱イオン水中RNaseA 20μｇ/ml、20mM EDTA、及び20％PEG80
00から成る溶液を本発明による組成物とする。
実施例７
プラスミドDNAを単離する、この方法の態様の具体例は、次の各段階から成る:
(a)細菌細胞のアルカリ性溶解液を調製し、(b)等体積の溶解液と実施例６により
調製する組成物を混合する、(c)37℃で数分間混合物をインキュベートし、そし
て次に(d)インキュベートした混合物を遠心分離し、プラスミドDNAをペレットに
する。次に、残留している汚染物を取り除くためにプラスミド・ペレットを洗う
のが望ましい。洗ったプラスミドDNAを次に乾かし、適切な緩衝液又は水に懸濁
する。
実施例８
この実施例では、実施例６による組成物を使用するミニ標品操作を記述する：
1.一夜培養した細菌培養液1.5mLを12,00×gで20秒間遠心分離してペレットにし
、
2.TE緩衝液50μＬ中で激しく攪拌することによって細胞ペレットを懸濁し、
3.0.2N NaOH中1％SDS 80μＬを加え、チューブを逆にすることによって混合し、
4.3Ｍ酢酸ナトリウム80μＬを加え、逆にすることによって混合し、
5.12,000×gで2分間チューブを遠心分離して、細胞破壊片をペレットにし、
6.実施例６の溶液200μＬを入れたチューブに上清を移し、
7.攪拌によって混合し、チューブを37℃で2分間インキュベートし、
8.12,000×gで2分間遠心分離し、上清を捨て、
9.70％エタノール0.5mL中にそれを懸濁し、チューブの底に遠心分離し、上清を
捨てることよって二度ペレットを洗い、
10.DNAペレットを乾かし、次にTE50μＬ中にそれを懸濁する。
プラスミドpUC19のミニ標品を、プラスミドを含む大腸菌DH5αを一夜培養した
液1.5mLから、この操作によって調製した。また、プラスミドDNAを直接エタノー
ル析出によって同じ細胞溶解液の半分から調製した。本発明により調製したプラ
スミドDNAの純度をアガロースゲル電気泳動によって調べ、収率を直接エタノー
ル析出(図1)によって達成されるプラスミドDNAのパーセントとして求めた(98.6
％)。これらの結果は、本発明により調製したプラスミドDNAが高純度で、収率が
満足できるものであることを示す。
実施例９
この実施例では、実施例６による組成物を使用するミディ標品操作を記述する
：
1.一夜培養した液50mLを12,000×gで60秒間遠心分離し、ペレットにし、
2.TE緩衝液1mLでのピペット操作によってペレットを懸濁し、
3.0.2N NaOH中1％SDS 3mLを加え、チューブを逆にすることによって混合し、
4.3Ｍ酢酸ナトリウム3mLを加え、チューブを逆にすることによって混合し、
5.12,000×gで5分間チューブを遠心分離し、細胞破壊片をペレットにし、
6.実施例６の溶液7mLを入れたチューブに上清を移し、
7.攪拌によって混合し、チューブを37℃で５分間インキュベートし、
8.12,000×gで10分間遠心分離し、上清を捨て、
9.70％エタノール5mL中にそれを懸濁し、チューブの底にそれを遠心分離し、次
に上清を捨てることによって二度ペレットを洗い、
10.DNAペレットを乾かし、TE500μＬ中にそれを懸濁し、
11.TE懸濁液を12,000×gで1分間遠心分離して、新しいチューブにプラスミドを
含む透明な上清を移す。
この操作による精製プラスミドDNAが制限エンドヌクレアーゼでの消化に適当
であるかどうかを判定するために、細菌STBL2株を一夜培養した液50mLからプ
ラスミドpBKBH10S(11857)を調製した。プラスミドを、32種類の制限酵素で、各
々の至適温度で1時間消化した。消化DNAは次に、0.6％アガロースゲル上での電
気泳動によって分画した(図2)。その結果、実施例６の溶液で精製したプラスミ
ドDNAが試験した酵素によって完全に消化され、プラスミド・バンドの検出を妨
げるどんなRNAも存在しなかったことを示す。
実施例１０
この実施例では、実施例６による96穴マイクロタイタープレートと組成物を使
用する大規模なミニ標品操作を記述する：
1.反復ピペッターを使用して、96個の各ウェルに抗生物質を含むLB培地1mLを分
注し(J.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Labor
atory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1972)、本明細書に援用)、
2.ウェルに細菌の1コロニーを接種し、アルミニウムのふたでプレートを覆い、
インキュベーションの間のウェルの通気のために針でふたに穴を開け、
3.覆ったプレートを37℃のシェーカーで一夜インキュベートし、
4.多チャンネル・ピペッターで別の96穴プレートに一夜培養した液50μＬを移し
、可能な今後の使用のために保存し、
5.元のプレートを2500×gで5分間遠心分離し、細胞をペレットにし、次に上清を
捨て、
6.攪拌によってTE50μＬ中に細胞ペレットを懸濁し、次に0.2N NaOH中1％SDS 80
μＬを加え、振盪によって混合し、
7.3Ｍ酢酸ナトリウム80μＬを加え、振盪によって混合し、次に、2500×gで15分
間プレートを遠心分離し、細胞破壊片をペレットにし、
8.新しい96穴プレートに上清を移し、実施例６の溶液の1容を添加し、37℃で5分
間インキュベートし、
9.2500×gで15分間プレートを遠心分離し、DNAをペレットにし、次に上清を捨て
、
10.ペレットを70％エタノール1mL中に懸濁し、ウェルの底にペレットを遠心分離
し、次にデカンテーションによって上清を捨てることによって二度ペレットを洗
い、
11.DNAペレットを乾かし、TE50μＬ中にそれらを懸濁する。
プラスミドpUT626(3185bp)のクローンを、この大規模操作を用いて調製した。
図3に示すように、試料間でプラスミドの回収率は比較的安定しており、ウェル
間の汚染は操作の間起きず、細菌を接種しなかったウェルはプラスミドDNAを作
らなかった。
実施例１１
プラスミドpHHC(2768bp)のクローンを実施例８の操作に従って分離し、35S-α
-dATPと”SEQUENASEバージョン2”を用いるジデオキシ法によって配列決定した
。F.Sanger et al.,DNA Sequencing with Chain-terminating Inhibitors,74 Pr
oc.Nat'l Acad．Sci.USA 5463(1977)、本明細書に援用。この方法によって精製
されるプラスミドは、配列決定の応用のために適当であることが示された。
ここに記述する溶液とプラスミド単離操作には、他の従来の、市販の方法より
優た多くの利点がある。例えば、この方法は簡単である。望ましい態様では、溶
液1容を細菌細胞溶解液に加え、短いインキュベーション(2〜5分)の後に、プラ
スミドDNAを遠心によって得る。また、この操作は速い。プラスミド・ミニ標品
は20〜30分で完了することができる。大規模96穴ミニ標品操作では、約90分で96
個のミニ標品を得ることができる。また、この操作は安全である。溶液はどんな
有毒成分も含まず、またこの操作のどんな段階にも毒性の有機溶剤を必要としな
い。さらに、この操作は便利である。SDS-NaOH溶解操作は多くの実験室で既にル
ーチンである。ガラス又はシリカ樹脂、カラム、シリンジ、多岐管も必要ではな
い。その上、この操作は経済的である。溶液の試薬コストは、ミニ標品当たり約
5セントである。二つの微量遠心チューブと二三のピペット・チップがそれぞれ
の標準のミニ標品に必要なだけである。溶液は調製するのが簡単で、単一の溶液
製品である。それは他の専門的試薬も付属品も必要としない。得られるプラスミ
ドDNAは高純度で高収率である。検出可能なRNA汚染もなく、OD 260/280比は約1.
8である。細胞溶解液中のプラスミドDNAの95％以上を回収することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Compositions and Methods for Rapid Isolation of Plasmid DNA Claims for Research or Development Supported by the Federal Government The present invention relates to grant number 1R03RR08759-issued to the National Institutes of Health (NIH). 01 and 1 These are the results of government subsidies for R29A134278-01A2. The government has certain rights in the invention. BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to compositions for rapid isolation of plasmid DNA from bacterial cultures and methods of using the same. In particular, as a preferred embodiment, the present invention can be used to prepare a clear lysate by precipitating cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and proteins, which in turn can be used to prepare the clear lysate. The present invention relates to a composition that can be used for specifically precipitating plasmid DNA from E. coli. In another preferred embodiment, the present invention relates to a composition comprising an enzyme for digesting cellular RNA, a stabilizer for protecting plasmid DNA from nuclease digestion, and a precipitant for precipitating plasmid DNA. The method of using this composition consists of simultaneously digesting cellular RNA, protecting plasmid DNA from nuclease digestion, and precipitating plasmid DNA from clear bacterial lysate. Isolation of plasmid DNA from bacterial cultures is a routine operation in molecular biology. To date, a number of plasmid DNA isolation procedures have been developed. For example, (a) SD S-NaOH dissolution / phenol / chloroform extraction / ethanol precipitation (HC Birnboim & J. Doly, A Rapid Alkaline Extraction Procedure for Screening Recombinant plasmid DNA, 7 Nucl. Acids Res. 1513-23 (1979)) , (B) boiling dissolution / ethanol precipitation (DS Holmes & M. Quigley, A Rapid Boiling Method for the Preparation of Bacterial plasmid, 114 Anal.Biochem. 193-97 (1981)), (c) phenol / chloroform dissolution and Extraction / ethanol precipitation (S. Anant & KN Subramanian, Isolation of Low Molecular Weight DNA from Bacteria and Animal Cells, 216 Meth. Enzymol. 20-29 (1992)), (d) SDS-NaOH dissolution / ethanol precipitation / polyethylene glycol (PEG) purification (J. Sambrook et al., Purification of Plasmid DNA by Precipitation with Polyethylene Glycol, in Sambrook et al., Molecular Cloning 1.40-1.41 (2d ed., 1989)), (e) SDS-NaOH dissolution / Glass or silica adsorption (MAMarko et al., A Procedure for the Large Scale Isolation of Highly Purified Plasmid DNA using Alkali Extraction and Binding to Glass Powder, 121 Anal.Biochem. 382-87 (1982)), and (f) SDS-NaOH dissolution / CsCl gradient purification (J. Sambrook et al., Pcurification of Closed Circular DNA by Equilibrium Centrifugation in CsCl-EthBr) Gradicnts, in J. Sambrook et al., Molecular Cloning 1.42-1.43 (2d ed., 1989)). Many of these methods are fairly reliable and some are commercially available as DNA isolation kits. However, they all have one or more disadvantages. For example, it may be time consuming, require the use of toxic chemicals, be contaminated with RNA, or require specialized equipment. Since plasmid DNA isolation is a step before many other steps in molecular cloning, there is a constant need for simple and rapid methods for plasmid DNA isolation. Therefore, many efforts have been and are being made by many researchers to simplify the plasmid isolation procedure. Judging from such circumstances, it is important to provide a composition and a method for using the same for rapidly isolating plasmid DNA from a bacterial culture solution with high yield without contaminating with RNA, Methods that do not require toxic chemicals or specialized equipment would be a significant advance in technology. SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a composition for rapidly isolating very pure plasmid DNA from a bacterial culture. It is also an object of the present invention to provide a method for rapidly isolating very pure plasmid DNA from a bacterial culture. It is also an object of the present invention to provide a method for rapidly isolating plasmid DNA from bacterial cultures without the need for toxic chemicals or specialized equipment. It is also an object of the present invention to provide a method applicable to large scale preparations, mini preparations (mini prep), and 96-well microtiter plate format for isolating plasmid DNA from bacterial cultures. It is. The purpose of these is about 3M or more MgCl Two And about 10% (w / v) polyethylene glycol. The average molecular weight of polyethylene glycol is about 6000 to about 8000, MgCl Two Is preferably about 3M. The procedure for isolating plasmid DNA from a bacterial culture consists of the following steps: (a) lysing bacterial cells in the bacterial culture to form a bacterial lysate; Two And polyethylene glycol, MgCl Two By making a first mixture containing about 1 M or more and about 3.3% (w / v) of polyethylene glycol, thereby precipitating cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and proteins in the first mixture, ) Separating and removing cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and proteins precipitated from the first mixture to form a transparent lysate, (d) MgCl Two And polyethylene glycol with MgCl Two Of about 1.5 M or more and about 5% (w / v) of polyethylene glycol to form a second mixture of plasmid DNA, and (e) plasmid DNA precipitated from the second mixture. Isolate the DNA and obtain the isolated plasmid DNA. Bacterial cells are desirably lysed by alkaline lysis. Also, MgCl Two And polyethylene glycol, MgCl Two Is preferably about 3M or more, and polyethylene glycol is about 10% (w / v). The composition is about 3M MgCl Two More preferably, the average molecular weight of the polyethylene glycol is about 8000. The process of making a clear bacterial lysate from a bacterial culture consists of the following steps: (a) lysing the bacterial cells in the bacterial culture to form a bacterial lysate; Two And polyethylene glycol with MgCl Two A first mixture containing at least about 1M and about 3.3% (w / v) of polyethylene glycol to precipitate cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and proteins, and (c) precipitate from the first mixture. The separated cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and proteins are separated to form a clear lysate. In another embodiment of the invention, a composition for isolating plasmid DNA from a bacterial culture comprises an amount of an enzyme effective to digest cellular RNA, an amount effective to protect the plasmid DNA from nuclease degradation. And an effective amount of a precipitant for precipitating plasmid DNA. As the enzyme, ribonuclease is used, and the effective amount of the enzyme is preferably about 1-100 μg / ml, more preferably 5-50 μg / ml. Preferably, the stabilizer is a divalent cation chelating agent, more preferably, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or a salt thereof, and the effective amount is in the range of about 1-100 mM. Desirably, it is more preferably 5 to 50 mM. Further, the precipitant is polyethylene glycol, and the effective amount of the precipitant preferably ranges from about 5 to 25% (w / v). Preferably, the polyethylene glycol has an average molecular weight of about 6000-8000. The method of isolating plasmid DNA from a bacterial culture consists of the following steps: (a) concentrating bacterial cells from the bacterial culture into a pellet; (b) converting the bacterial cells in a pellet into a predetermined volume of aqueous solution. Resuspending to obtain a concentrated cell suspension; (c) lysing the bacterial cells in the concentrated cell suspension to obtain a lysed cell suspension; (d) cells in the lysed cell suspension Precipitate debris and separate the precipitated cell debris from the lysed cell suspension to obtain a clear cell lysate. (E) The clear cell lysate is effective for digesting cellular RNA A mixture comprising the addition of an effective amount of a composition comprising an effective amount of an enzyme, an effective amount of a stabilizer to protect the plasmid DNA from nuclease degradation, and an effective amount of a precipitant to precipitate plasmid DNA. For the enzyme that digests the cellular RNA contained in the mixture and for the plus contained in the mixture. Incubating the mixture at a temperature and for a sufficient time to precipitate the DNA, (f) isolating the plasmid DNA precipitated from the mixture, washing the precipitated plasmid DNA in a washing solution to obtain a DNA pellet, and (g) Dry the DNA pellet and then resuspend the DNA pellet in a predetermined amount of aqueous medium to obtain an isolated plasmid DNA. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows that pUC19 prepared according to the present invention (lanes 1, 3, 5, and 7) from the same cell lysate after separation on a 10% agarose gel and visualization by ethidium bromide staining: 1 shows DNA obtained by one-step dilution of a mini sample and ethanol precipitation (lanes 2, 4, 6, and 8). Lane M, molecular weight ladder of BstEII / 1 (stepped pattern). FIG. 2 shows a restriction endonuclease fragment of plasmid pBKBH10S (11857 bp) digested with 32 restriction enzymes, separated on a 0.6% agarose gel and stained with ethidium bromide. 0, uncut; 1, BsaHI; 2, NotI; 3, SmaI; 4, XbaI; 5, BamHI; 6, BpmI; 7, BspHI; 8, ClaI; 9, DrdI; 10, NdeI; 11, PstI; 14, SacI; 13, SapI; 15, XhoI; 16, EcoRI; 17, EcoRV; 18, BsgI; 19, HaeII; 20, HindII; 21, KpnI; 22, XmnI; 23, AlwNI; 25, BglII; 26, SspI; 27, ScaI; 28, AccI; 29, StyI; 30, DraI; 31, TaqI; and 32, HphI. FIG. 3 shows a plasmid DNA prepared by a microtiter plate operation according to the present invention. Plasmid DNA from columns 9-12 was separated on a 0.8% agarose gel and stained with ethidium bromide. Columns 10 and 12 were not inoculated with bacteria and no plasmid DNA was found in uninoculated wells. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Before describing and describing the present compositions and methods for isolating plasmid DNA from bacterial cultures, the present invention is limited to the specific configurations, process steps, and materials described herein. However, it should be understood that such configurations, process steps, and materials may be somewhat variable. The terms used in the specification are used for the purpose of describing particular embodiments only, and are not intended to be limiting, and the scope of the present invention is limited only by the appended claims and equivalents thereof. It should also be understood. It is noted that the use of the term "class" in the present specification and the appended claims also includes the plural unless the context clearly dictates otherwise. In describing and claiming the present invention, the following terminology will be used in accordance with the definitions below. As used herein, "TE buffer" consists of 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0. As used herein, "alkaline lysis solution" consists of 1% SDS in 0.2N NaOH. As used herein, "effective amount" means an amount that can achieve a given reaction without adverse effects. For example, an effective amount of an enzyme to digest cellular RNA is an amount sufficient to digest such cellular RNA at a given temperature and for a given time. An effective amount of a stabilizer is an amount sufficient to protect plasmid DNA from nuclease degradation at a predetermined temperature for a predetermined time. An effective amount of a precipitant is an amount sufficient to precipitate a given plasmid at a given temperature for a given time. Using the guidance and known techniques provided in the present invention, those skilled in the art can determine such effective amounts without undue experimentation. As used herein, "enzyme for digesting cellular RNA" and like terms means a nuclease for digesting such cellular RNA. Preferably, such a nuclease is ribonuclease A. Desirably, ribonuclease A is included in the claimed composition in an amount of about 1 to about 100 μL / mL. The term "stabilizer" as used herein refers to an agent for protecting plasmid DNA from nuclease degradation. Preferred stabilizers are divalent cation chelators such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its salts. Desirable amounts of stabilizers such as EDTA or salts thereof in the claimed compositions range from about 1 to about 100 mM. As used herein, the term "precipitating agent" refers to a macromolecule such as polyethylene glycol or dextran for precipitating plasmid DNA from a solution. Polyethylene glycol is particularly desirable and is generally used in compositions of the present invention at a concentration of about 5 to 50% by weight. It is also desirable to use polyethylene glycol (PEG) polymers having a relatively low average molecular weight, such as PEG6000 or PEG8000. One specific example of this composition is MgCl of about 3M or more. Two And about 10% (w / v) of an aqueous solution of polyethylene glycol, and the average molecular weight of polyethylene glycol is preferably about 8000 (PEG8000). The concentration of PEG8000 is quite important for the proper functioning of the composition, Two Can vary. MgCl Two Was determined to be about 3M. MgCl Two And a polyethylene glycol to the cell lysate to obtain a transparent lysate. Two And polyethylene glycol can be added to precipitate plasmid DNA. MgCl Two And polyethylene glycol may be added as a mixture or in separate solutions, but for ease of preparation and use MgCl Two It is desirable to use a mixture of and polyethylene glycol. One specific method of using this composition to specifically precipitate plasmid DNA from bacterial cultures is to lyse the cells in the bacterial culture, preferably with a known alkaline lysate, Two About 0.5 volume of / PEG8000 composition was added and mixed to precipitate cell debris, RNA, chromosomal DNA, and protein, and remove the precipitated cell debris, RNA, chromosomal DNA, and protein to obtain a clear lysate. The clear lysate and MgCl used in the previous step Two This is to mix approximately the same volume of the / pEG8000 composition, specifically precipitate the plasmid DNA, and collect the precipitated plasmid DNA. The precipitated plasmid DNA is desirably washed with a known washing solution such as 70% ethanol. The resulting plasmid DNA is sufficiently pure for digestion with restriction endonucleases and for techniques related to nucleotide sequencing. The compositions and methods can also be used to purify plasmid DNA from cell lysates and for the following applications: (1) Ultra-pure plasmids by anion exchange or other chromatographic techniques Preliminary purification steps to prepare DNA include (2) to isolate and purify other episomal DNA molecules such as viral DNAs from various cells and tissues, such as mammalian cells, and (3) clean after reaction As an up-step, to remove or recover other molecules, such as RNA, single-stranded DNA, nucleotides, enzymes, etc., from double-stranded DNA. The present invention relates to an operation by Toa Gosei Chemical Industry Co., Ltd. (JP 61-4719 pp. 533-36 (1986)) and a similar operation (M. Y. Sakaki, Dideoxy Sequencing Method Using Denatured Plasmid Templates, 152, Anal.Biochem. 232-38 (1986); KDCole, Purification of Plasmid and High Molecular Mass DNA Using PEG-salt Two-phase Extraction, 11 BioTechniques 18- 24 (1991)). In these methods, the cell lysate is treated with phenol / chloroform to extract cellular proteins, the DNA and RNA in the lysate are precipitated with ethanol, and the RNA is digested with RNase at 37 ° C for 30 minutes. In the final step, plasmid DNA is isolated by PEG precipitation. The method of preparing a large number of "mini" plasmid preparations or "mini preparations" makes a significant contribution to biotechnology. Many gene sequencing projects, such as the Human Genome Project, make millions of plasmid mini-preparations each year, making these studies laborious and rate-limiting. Because automated DNA sequencing reactions in a 96-well format are currently available, preparing plasmid mini-specimens in 96-well microtiter plates according to the present invention can streamline the process from cell culture to DNA sequencing. Be transformed into N. Avdalovic, Automation of DNA Sequencing Protocols Using Fluorescent primers and the Beckman Biomek 1000 Workstation, Beckman Application Notes ROBAN-015, pp. 1-14 (1989). Currently, 96-well plate mini-specimen technology is only available from Promega. D. Romanin et al., Use of a 96 Well Format for Wizard Miniprep DNA Isolations, 49 Promega Notes 28-32 (1994). Promega's method is based on the binding of DNA to silica resin, transferring cell lysate to a set of mini-columns, adding DNA-attached resin to the lysate, washing the sample in a manifold, and removing 96 Consists of elution of plasmid DNA into well plates. The method of the present invention is not only based on different DNA isolation mechanisms, but also includes different DNA isolation procedures. Unlike Promega's method, the method does not require specialized equipment or auxiliary equipment, and performs all steps from cell culture to plasmid DNA isolation in 96-well plates. Example 1 MgCl Two And PEG8000 with 3M MgCl Two A specific composition according to the present invention for isolating plasmid DNA from bacterial cultures was prepared by dissolving with deionized water to a concentration of 10% (w / v) PEG8000. Example 2 This example describes the procedure for using the composition according to Example 1 to isolate plasmid DNA: 1. 1.5 ml of an overnight bacterial culture at 12,000 xg for about 1 to 1 Centrifuge for 60 seconds to pellet, 2. Discard the medium, add about 100 μL of deionized water to the cell pellet, stir to resuspend the cells, 3. Add 1% SDS and 0.2N NaOH to the cell suspension. Add 100 μL of alkaline lysis solution consisting of: Invert the tube and mix to obtain a bacterial lysate. 4. Add 100 μL of the solution of Example 1, mix by inverting the tube and mix at 1,2000 × g for 1 minute. Centrifuge to pellet cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and protein to obtain a clear lysate. 5. Transfer the clear lysate to a tube containing 100 μL of the solution of Example 1, stir, 1 Centrifuge at 2,000 xg for 10 minutes to pellet plasmid DNA. 6. Discard supernatant and remove 70% Rinse the pellet of plasmid DNA with ethanol and dry the DNA pellet, then suspend it in 50 μL of TE buffer. Example 3 This operation describes a medium-sized preparation using the composition according to Example 1, ie the "midi preparation" operation: 1. Centrifugation of 50 ml of an overnight bacterial culture at 12,000 xg for 60 seconds. 2. Pellet was suspended by pipetting with 1 mL of deionized water, 3 mL of 3.1% SDS, 0.2 N NaOH was added, and the tube was inverted to mix to obtain a bacterial lysate. Add 2 mL of the solution, mix by inverting the tube, and centrifuge the tube at 12,000 xg for 5 minutes to pellet cell debris, chromosomal DNA, cellular RNA, and protein, and remove the clear lysate. 6. Transfer the clear lysate to a new tube, add 2 mL of the solution of Example 1, stir, incubate the tube and contents at 37 ° C. for 5 minutes, and centrifuge at 8.12,000 × g for 10 minutes Separate, pellet the plasmid DNA, discard the supernatant, and add 9.70% ethanol 5 Wash the plasmid DNA pellet twice by suspending in mL and centrifuging to pellet at the bottom of the tube, then discarding the supernatant. 10.Dry the plasmid DNA pellet and then resuspend it in 500 μL of TE. It becomes cloudy. Example 4 This example describes a large-scale mini-preparation procedure using a 96-well microtiter plate: 1. In each well of the 96-well, the appropriate antibiotic corresponding to the antibiotic resistance marker carried by the plasmid was added. Put 1 mL of LB medium containing (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972), incorporated herein by reference), 2.Inoculate wells with bacteria containing plasmid, Cover the plate with aluminum and puncture the lid with a needle to vent the wells during incubation. 3. Incubate the covered plate overnight on a 37 ° C shaker. 4. Transfer to another 96-well microtiter plate. Transfer 50 μL from each well, save for possible future use, centrifuge the original plate at 5.2500 × g for 5 minutes, pellet the cells, discard the supernatant, and place in 50 μL of deionized water. Stirring Each cell pellet by suspending, adding 50 μL of 1% SDS in 0.2 N NaOH and mixing by shaking. 7. Add 50 μL of the solution of Example 1, mix by shaking, then plate at 2500 × g. Centrifuge for 15 minutes to pellet cell debris, chromosomal DNA, cell RNA, and protein to obtain a clear lysate. 8. Transfer the clear lysate to a new 96-well plate and add 50 μL of the solution of Example 1 Add, incubate at 37 ° C for 5 minutes, 9. Centrifuge the plate at 2500 xg for 15 minutes, pellet the plasmid DNA, then discard the supernatant, and 10. Dissolve the plasmid DNA pellet in 1 mL of 70% ethanol. Suspend, wash the plate twice by centrifuging the plate and then discarding the supernatant. 11. Dry the plasmid DNA pellet and resuspend in 50 μL TE. A clone of pUT626 is prepared using this procedure. The recovery of plasmid DNA between samples is relatively stable and no contamination between wells is seen. Example 5 A clone of the plasmid pHHC (2768 bp) was separated by the procedure of Example 2, 35 Sequence by dideoxy method using S-α-d ATP and “SEQUENASE” version 2. F. Sanger et al., DNA Sequencing with Chain-terminating Inhibitors, 74 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 5463 (1977), incorporated herein. In another preferred embodiment of the present invention, a DNA isolation solution has been developed that achieves rapid isolation of plasmid DNA from bacterial cultures. The composition comprises an effective amount of an enzyme to digest the cellular RNA, an effective amount of a stabilizer to protect the plasmid DNA from nuclease degradation, and an effective amount of a precipitant to precipitate the plasmid DNA. Consists of The method of using this solution is simple, fast, convenient and cost-effective. According to this method, 95% or more of the plasmid DNA can be recovered from the cell lysate. The DNA obtained by this method is free of RNA contamination and is suitable for various operations for molecular cloning and DNA sequencing. This method fits into a 96-well microtiter plate format for high-efficiency mini standards and is very useful for screening large numbers of clones. This method includes at least two different improvements over conventional methods using PEG for plasmid purification. First, by adding a divalent cation chelating agent such as EDTA to the solution used for plasmid isolation, without first performing enol precipitation and harmful and cumbersome phenol-chloroform extraction. During incubation with RNase at 37 ° C., plasmid DNA can be protected from degradation by cellular DNase. Second, the addition of EDTA and RNase to the PEG solution simultaneously achieves three goals: (1) protects plasmid DNA, (2) digests RNA, and (3) plasmid DNA. Is precipitated. In the conventional PEG method, these objectives have been achieved in three or more separate steps. Because of these improvements and simplifications, the method of the present invention is simpler and faster, and can be adapted to large-scale mini-specimen operations using 96-well microtiter plates, as described below. it can. The plasmid isolation solution is composed of non-toxic components and is stable at 4 ° C for more than 6 months. Other reagents required are TE buffer (10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 8.0), 1% SDS in 0.2N NaOH, 3M sodium acetate (pH 5.0), and 70% ethanol. For large mini standards, it is desirable to use a 96-well (2 mL / well) microtiter plate (eg, Beckman # 14 0504) and an aluminum lid (eg, Beckman # 538619). Example 6 In this example, a solution consisting of 20 μg / ml RNaseA in deionized water, 20 mM EDTA, and 20% PEG8000 is a composition according to the invention. Example 7 A specific example of an embodiment of this method for isolating plasmid DNA comprises the following steps: (a) preparing an alkaline lysate of bacterial cells, Mix the composition prepared according to 6, (c) incubate the mixture for several minutes at 37 ° C., and then (d) centrifuge the incubated mixture to pellet the plasmid DNA. Next, it is desirable to wash the plasmid pellet to remove residual contaminants. The washed plasmid DNA is then dried and suspended in a suitable buffer or water. Example 8 This example describes a mini-preparation procedure using the composition according to Example 6: 1. Pellet 1.5 mL of bacterial culture grown overnight at 12,000 xg for 20 seconds to pellet. 2. Suspend the cell pellet by vigorous shaking in 50 μL of TE buffer, add 80 μL of 1% SDS in 3.0.2 N NaOH, mix by inverting the tube, add 80 μL of 4.3 M sodium acetate, Mix by inverting, centrifuge the tube at 5.12,000 × g for 2 minutes to pellet cell debris, 6. Transfer supernatant to tube containing 200 μL of Example 6 solution, 7. Mix by agitation, incubate the tube at 37 ° C for 2 minutes, centrifuge at 8.12,000 xg for 2 minutes, discard the supernatant, suspend it in 0.5 mL of 9.70% ethanol and centrifuge at the bottom of the tube Wash the pellet twice by discarding the supernatant. Dry the door, then suspended it in TE50myuL. A mini-preparation of plasmid pUC19 was prepared by this procedure from 1.5 mL of an overnight culture of Escherichia coli DH5α containing the plasmid. Plasmid DNA was also prepared from half of the same cell lysate by direct ethanol precipitation. The purity of the plasmid DNA prepared according to the invention was checked by agarose gel electrophoresis and the yield was determined as the percentage of plasmid DNA achieved by direct ethanol precipitation (FIG. 1) (98.6%). These results indicate that the plasmid DNA prepared according to the present invention has high purity and satisfactory yield. Example 9 This example describes the midi preparation procedure using the composition according to Example 6: 1. Centrifuge 50 mL of overnight culture at 12,000 xg for 60 seconds to pellet, 2. TE buffer Resuspend the pellet by pipetting with 1 mL of liquid, add 3 mL of 3.0.2 N 1% SDS in NaOH, mix by inverting the tube, add 3 mL of 4.3 M sodium acetate, mix by inverting the tube Then, centrifuge the tube at 5.12,000 × g for 5 minutes to pellet cell debris, transfer the supernatant to a tube containing 7 mL of the solution of Example 6, and mix by stirring. Incubate at 37 ° C for 5 minutes, centrifuge for 10 minutes at 8.12,000 xg, discard the supernatant, suspend it in 5 mL of 9.70% ethanol, centrifuge it to the bottom of the tube, then Wash the pellet twice by discarding the DNA pellet. However, suspended it in TE500μL, 11.TE suspension was centrifuged for 1 min at 12,000 × g and transfer the clear supernatant containing the plasmid into a new tube. In order to determine whether the purified plasmid DNA obtained by this operation was suitable for digestion with restriction endonuclease, plasmid pBKBH10S (11857) was prepared from 50 mL of an overnight culture of bacterial STBL2 strain. Plasmids were digested with 32 restriction enzymes for 1 hour at each optimal temperature. The digested DNA was then fractionated by electrophoresis on a 0.6% agarose gel (FIG. 2). The results show that the plasmid DNA purified in the solution of Example 6 was completely digested by the tested enzymes, indicating that no RNA was present that prevented detection of the plasmid band. Example 10 This example describes a large-scale mini-preparation using a 96-well microtiter plate and composition according to Example 6: 1. Using an iterative pipettor, add antibiotics to each of 96 wells. 1 mL of LB medium containing the substance was dispensed (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972), incorporated herein by reference). , Cover the plate with an aluminum lid, puncture the lid with a needle to vent the wells during the incubation, and incubate the covered plate overnight on a 37 ° C shaker. Transfer 50 μL of the overnight culture to another 96-well plate with a pipettor, save for possible future use, and 5. Centrifuge the original plate at 2500 xg for 5 minutes to pellet the cells, then Discard the supernatant. 6. TE50 by stirring Suspend the cell pellet in L, then add 80 μL of 1% SDS in 0.2 N NaOH, mix by shaking, add 80 μL of 7.3 M sodium acetate, mix by shaking, and then 2500 × g for 15 minutes The plate is centrifuged to pellet cell debris. 8. Transfer the supernatant to a new 96-well plate, add 1 volume of the solution of Example 6, incubate at 37 ° C for 5 minutes, 9.2500 xg for 15 minutes. Centrifuge the plate for 1 min, pellet the DNA, then discard the supernatant, suspend the pellet in 1 mL of 70% ethanol, centrifuge the pellet to the bottom of the well, then decant the supernatant. Wash the pellet twice by discarding, 11. Dry the DNA pellet and suspend them in 50 μL of TE. A clone of plasmid pUT626 (3185 bp) was prepared using this large scale operation. As shown in FIG. 3, plasmid recovery was relatively stable between samples, no contamination between wells occurred during the operation, and wells that were not inoculated with bacteria did not produce plasmid DNA. Example 11 A plasmid pHHC (2768 bp) clone was isolated according to the procedure of Example 8, 35 Sequenced by the dideoxy method using S-α-dATP and “SEQUENASE version 2”. F. Sanger et al., DNA Sequencing with Chain-terminating Inhibitors, 74 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 5463 (1977), incorporated herein. Plasmids purified by this method have been shown to be suitable for sequencing applications. The solution and plasmid isolation procedures described herein have a number of advantages over other conventional, commercial methods. For example, this method is simple. In a preferred embodiment, one volume of the solution is added to the bacterial cell lysate, and after a short incubation (2-5 minutes), the plasmid DNA is obtained by centrifugation. Also, this operation is fast. Plasmid mini preparations can be completed in 20-30 minutes. In large-scale 96-hole mini-specimen operation, 96 mini-specimens can be obtained in about 90 minutes. This operation is safe. The solution does not contain any toxic components and does not require toxic organic solvents at any stage of the operation. Furthermore, this operation is convenient. The SDS-NaOH dissolution procedure is already routine in many laboratories. No glass or silica resin, columns, syringes, manifolds are required. Moreover, this operation is economical. The reagent cost of the solution is about 5 cents per mini standard. Only two microcentrifuge tubes and a few pipette tips are needed for each standard mini-preparation. The solution is simple to prepare and is a single solution product. It requires no other specialized reagents or accessories. The resulting plasmid DNA has high purity and high yield. There is no detectable RNA contamination and the OD 260/280 ratio is about 1.8. 95% or more of the plasmid DNA in the cell lysate can be recovered.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
(72)発明者 ラッフナー，デュアン
アメリカ合衆国ユタ州84108，ソルト・レ
イク・シティ，ダウニントン・アベニュー
1966────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US
(72) Inventor Ruffner, Duane
Salt Re, 84108, Utah, United States
Ike City, Downington Ave
1966