【発明の詳細な説明】
ヒトＧＴＰ結合タンパク質γ−３他の出願との相互参照
本出願は、「新規なヒト下垂体細胞由来ポリヌクレオチド及びポリペプチド（
Novel Human Pituitary Cell-Derived Polynucleotides and Polypeptides）」
なる名称の１９９４年１０月５日に出願された米国特許出願第08/320,011号の一
部継続出願である、「ヒト下垂体由来ポリヌクレオチド（Polynucleotides deri
ved from Human Pituitary）」なる名称の１９９５年５月５日に出願された米国
特許出願第08/440,743号の一部継続出願である。この出願の明細書を本明細書と
一体に参照されたい。技術分野
本発明は、新規な疾病関連膜タンパク質（ＨＧＰＧ）の核酸及びアミノ酸配列
、及び疾病の診断、研究、予防、及び治療におけるこれらの配列の利用に関する
ものである。背景技術
ヘテロ三量体のＧタンパク質であるＧＴＰアーゼのファミリーは全ての細胞に
存在する。このタンパク質は、一連の細胞応答系列にホルモン、神経伝達物質及
び感覚のシグナルを伝達することによって種々の機能（代謝性、体液性、神経性
及び発生性の機能）を調節する。各Ｇタンパク質は、細胞表面の受容体によって
誘導されて、特定のエフェクタの活性を調節する。このエフェクタには、適切な
生化学的応答を開始させるイオンチャネルタンパク質、ホスホリパーゼＣ、及び
アデニル酸シクラーゼが含まれる。Ｇタンパク質は、厳密な細胞下の局在化を示
し得、エンドサイトーシスの小胞に含められ得る。
各Ｇタンパク質はα、β、及びγの各サブユニットからなり、各サブ
ユニットは会合して複合体を形成し不活性なＧＤＰ結合形態を形成する。ホルモ
ンが膜貫通受容体を活性化することにより、ＧＴＰアーゼの活性化及びＧＴＰに
よるＧＤＰの置換が生じる。活性化されると、このヘテロ三量体、αサブユニッ
ト、又はβ−γサブユニットが特定の活性を有し得る。一般に、Ｇタンパク質の
αサブユニットは、β及びγ複合体から解離し、受容体と相互作用し、且つメッ
セージをエフェクタに運ぶ。
少なくとも５０〜９５％のアミノ酸同一性を有する４つの主要なクラスのタン
パク質をコードするＧαサブユニットの遺伝子は、少なくとも２０個存在する。
刺激性のＧｓクラスは、受容体−Ｇタンパク質相互作用を脱共役する百日咳毒素
に対する感受性を有する。この脱共役により、イオンチャネルを調節しホスホリ
パーゼを活性化するｃＡＭＰの濃度を低下させる受容体へのシグナル伝達が阻害
される。抑制性のＧｉクラスも、ＧｉによるｃＡＭＰ濃度の低下を阻止する百日
咳毒素による修飾を受けやすい。百日咳毒素修飾に対して不応性の２つの新規な
クラスは、ホスホリパーゼＣを活性化するＧｑと、ショウジョウバエ遺伝子conc ertina
と相同な配列を有するＧ12であって、これらは胎児の発達の調節に寄与し
得る。Ｇαサブユニットは、分子量が３９乃至５２ｋＤａの範囲にわたり、いく
つかのスプライスバリアントを有する。同義遺伝子は、それぞれ分子量が３５乃
至３６ｋＤａ及び６乃至１０ｋＤａの範囲にわたる少なくとも４つのβ及び６つ
のγサブユニットもコードする（Watson S及びS Arkinstall(1994)The G protei n Linked Recepter Facts Book
,Academic Press，San Diego CA）。
β−γ二量体は、ＧＤＰ結合αサブユニットとリガンド結合受容体との会合を
促進する。この二量体は、会合の配向及び安定化の双方を行い、アゴニストが存
在しないときにシグナル伝達が発生しないようにする。Neer EJ（1995;Cell 80:
249-257）の報告によれば、β−γ二量体はア
デニリルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、カルモジュリン、βアドレナリン受容
体キナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスデューシン、ホスホイノシチド３キナー
ゼ、トランスデューシン等と相互作用する。更にこの二量体は、カリウムチャネ
ルの調節、ＭＡＰキナーゼ経路の媒介を行い、ホスホイノシチド加水分解の活性
化、つまり増加をなし得る。酵母菌では、この二量体はＧタンパク質依存性接合
応答を媒介する。５つのβサブユニットのアイソタイプは、互いに５３乃至９０
％のアミノ酸同一性を有しており、広範囲にわたって発現されるが、Clapman DE
及びEJ Neer（1993:Nature 365:403-6）の報告によれば、β−４は他の組織と比
較して脳及び肺により多く存在する。
ウシ、ラット、及びマウスの組織から得られた既知のγサブユニットは、一般
に、そのアミノ酸配列の概ね中央部に少なくとも１個のシステイン残基を有し、
これは二量体形成において重要である。即ちこのγサブユニットにおけるシステ
インはβサブユニットにおけるシステインとクロスリンクする。多くの配列は、
ｒａｓオンコジーン末端配列に類似した、翻訳後修飾のための部位であるＣ末端
コンセンサス配列CAAX(ここでＡは脂肪族残基を表し、Ｘは残基未指定を表す)を
示す。この修飾には、３’末端残基の切断や、それに続くカルボキシメチル化、
ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、又はイソプレニル化が含まれる。翻訳後
修飾により、サブユニットの多様性及び疎水性が高まり、この翻訳後修飾は膜会
合や機能活性について重要である。これとは異なり、末端部にCSFLを有するラッ
トのγ−５配列は広範に発現され、腎臓、心臓、肺、及び脳において高度に発現
された。
異なるＧタンパク質サブユニットは約６００の異なる組み合わせを形成し得る
が、全ての組み合わせが可能若しくは機能的であるわけではない。二量体の場合
、β１−γ１は唯一網膜において活性である。更に、
エフェクタ調節のパターンは高度に特異的であり得る。例えば、あるタイプのア
デニリルシクラーゼはＧαサブユニットによって活性化され、β−γサブユニッ
トの影響を受けないが、第２のタイプはαサブユニットにより活性化され、且つ
β−γサブユニットにより阻害される。下垂体由来ＧＨ３細胞系に関する別の例
では、ソマトスタチン受容体及びムスカリン受容体の双方がカルシウムチャネル
を調節するが、それぞれ、スプライスされた形態のαs/o及び異なるβ−γサブ
ユニットの何れかを利用する。最後の例は、特異性及び効率性についてのもので
ある。再構成された小胞において、βアドレナリン受容体はＧｉの３倍Ｇｓを活
性化し、何れかのヘテロ三量体からのβ−γサブユニットはカルシウムチャネル
を活性化するはずではあるが、アデニリルシクラーゼのみが活性化される。
Neer（前出）は、Ｇタンパク質調節が、ＡＴＰ加水分解の動態論、化学量論、
共有結合による修飾、補助タンパク質、及び区画化を含む要素群の組み合わせに
応じて決まり、Ｇタンパク質の数より受容体の数の方が多いことを示唆している
。Ｇｓに刺激されたアデニリルシクラーゼの分子及び機能的多様性については、
最近Iyengar Rの論文(1993;FASEB Jour 7:768-75)に記載されており、異なる組
織が、β−γ二量体及び他の分子により異なって調節された種々のアデニリルシ
クラーゼを発現することが示された。細胞シグナル伝達分子及びシグナル伝達経路に関係する疾病
細胞シグナル伝達カスケードの構成要素の発現パターンにおける変化や分子の
突然変異によって、成長や発達に影響を及ぼす白血球又はリンパ球の異常な活性
化、若しくは細胞の増殖を引き起こし得る。白血球やリンパ球が不適切に活性化
されると、慢性関節リウマチ、胆汁性肝硬変、溶血性貧血、全身性エリテマトー
デス、及び甲状腺炎のような自己免疫
疾患において見られる組織損傷や組織破壊が生じ得る。例えば、Aussel C等（19
88;J Immunol 140-215）の報告によれば、Ｔ細胞の活性化はαＧタンパク質で調
節されたプロセスである。ジャーカット細胞における百日咳毒素の作用によって
、Ｇタンパク質がＴ細胞受容体−ＣＤ３複合体を介したシグナルの伝達手段とし
ての役目を果たしていることが分かった。更に、フッ化物イオンがジアシルグリ
セロールの放出を刺激するが、イノシトール３リン酸は刺激しないという事実に
よって、Ｇタンパク質がホスホリパーゼＣの活性化を調節していることが示唆さ
れた。
細胞の異常増殖によって、子宮内膜症又は腫瘍、腺種、又は腺癌が発生し得る
。脳、甲状腺、副腎、及び生殖腺の増殖の環状ＡＭＰによる剌激は、Ｇタンパク
質によって調節される。実際に、成長ホルモンを産生する下垂体の腺種の約５０
％が、変異Ｇａsアレルを含み、類似の突然変異は、甲状腺癌やマックーン−オ
ルブライト症候群の新生物障害にも関連する。Ｇａ2i遺伝子における既知の変異
は、副腎皮質及び卵巣に由来する腫瘍組織においても見出される。持続性細胞外
刺激及びこれらのＧｑ及びホスホリパーゼＣに結合した受容体の発現によっても
腫瘍形成が生じ得る（Isselbacher KJ等(1994)Harrison's Principles of Inter
nal Medicine,McGraw-Hill,New York NY）。更に、多発性内分泌機能亢進症の原
因は、Ｇタンパク質−ｃＡＭＰ−プロテインキナーゼＡ依存性経路における欠損
であり得る。
ホスホイノシチド３キナーゼは、受容体刺激性有糸***誘発、好中球における
酸化的バースト、膜の波打ち、及びグリコース取り込みに関与する重要なシグナ
リング酵素である。Stephens L等（1994:Cell 77:83-93）の報告によれば、細胞
に由来する骨髄におけるホスホイノシチド３キナーゼの活性化は、ホスホチロシ
ンキナーゼ及びβ−γ二量体により調節される。更に、組織特異性はβ−γ二量
体分子の濃度に支配
され得、ホスホチロシンキナーゼによる調節の場合より活性化はより速く過渡的
であるようである。このことは提示されてはいないが、β又はγサブユニットの
何れかの発現を制御する能力は、細胞のシグナル伝達及び有糸***誘発の調節の
ための手段となると考えられる。
新たなＧサブユニットタンパク質、その機能の組み合わせ、及びそれらの受容
体との相互作用の発見は、異常な細胞過程における介入の機会を与えることによ
り、従来技術における必要性を満たし得る。Ｇタンパク質の活性化及びＧＴＰ加
水分解の速度を、サブユニット産生及び会合の調節によって変化させることがで
きる。二量体及びヘテロ三量体形成を阻止することにより、ＧＴＰに調節された
経路における細胞シグナル伝達を減少させて、セカンドメッセンジャーの活性化
を低下せしめ、腫瘍形成に関係する白血球及びリンパ球の活性化や細胞増殖を調
節することができる。発明の開示
本発明は、細胞増殖の調節に関与する４つの膜貫通タンパク質と同じ特徴を共
有する新規な疾病関連膜タンパク質（以下ＨＧＰＧと称する）を開示する。従っ
て、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列に示すような、実質的に精製された
ＨＧＰＧを提供する。
本発明のある実施例は、ＨＧＰＧをコードする単離され実質的に精製されたポ
リヌクレオチドを提供する。特定の実施例では、このポリヌクレオチドは配列番
号：２の核酸配列である。更に、本発明は、厳密な条件の下で、配列番号：２の
配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明は更に、ＨＧＰＧをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチ
ド核酸、その断片、一部分、又はアンチセンス分子に関するものである。本発明
はまた、部分的に、宿主細胞又は生物体を形質転換した
り、ＨＧＰＧをコードする核酸配列の、該タンパク質を産生するために用いられ
得る発現ベクターへの組み込みにも関連する。本発明は、免疫系の不適切な活性
化や癌細胞の増殖を防止するための、アンチセンス分子を発現する類似のベクタ
ーの利用方法を提供する。
本発明は、ＨＧＰＧ又はその断片の生成方法を提供する。癌又は炎症性の細胞
若しくは組織に、ＨＧＰＧのアンタゴニスト又はインヒビターを、単体で、若し
くは製薬学的に許容される賦形剤とともに送達させることも企図されている。ま
た本発明の範囲には、ＨＧＰＧに特異的に結合し、in vivoで該タンパク質の分
布（prevalence）を検出するために用いられ得る抗体もその範囲に含んでいる。図面の簡単な説明
第１Ａ図及び第１Ｂ図は、本発明の新規なＨＧＰＧのアミノ酸配列(配列番号
：１)及び核酸配列（配列番号：２）を示した図である。配列のアライメントは
、MacDNAsisソフトウエア（日立ソフトウエアエンジニアリング社、San Bruno C
A）を用いて作製した。
第２図は、ＨＧＰＧ（配列番号：１）と、マウスのＧタンパク質γ３サブユニ
ット（GI 1353498;Williams CJ等(1996)Mol Reprod Dev:in press）、ヒトのＧ
タンパク質γ４サブユニット（GI 995917;Ray K等(1995)J Biol Chem 270:21765
-71）、及びウシのＧタンパク質γ３サブユニット（GI 163084;Gautam N等(1990
)Proc Natl Acad Sci 87:7973-77）との間のアミノ酸配列アライメントを示した
図である。配列のアライメントは、DNAStarTMソフトウエア(DNAStar Inc,Madiso
n WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作製した。
第３図は、ＨＧＰＧ（配列番号：１）の疎水性プロット（MacDNAsisソフトウ
エアを用いて作製）を示した図であり、Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し、Ｙ軸は負
の方向に疎水性のレベルを表す。
第４図は、ＨＧＰＧ（配列番号：１）の等電点プロット（MacDNAsisソフトウ
エアを用いて作製）を示した図である。発明の実施の形態 定義
本明細書において「核酸配列」とは、一本鎖か二本鎖の、センス鎖、又はアン
チセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌクレ
オチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分を意味
する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、ペプチド若しくはタン
パク質配列を意味する。
本明細書において「コンセンサス」とは、（１）再度シークエンシングされて
不要な塩基が分離された核酸配列か、（２）XL-PCR（Perkin Elmer）を用いて５
’方向または３’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配列か、
（３）GCGフラグメントアセンブリシステム（GCG,Madison WI）を用いて２以上
のインサイト社クローン重複した配列を元に組み合わせて形成された核酸配列か
、若しくは（４）延長と組み合わせの双方によって形成された核酸配列の何れか
を意味する。
本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア
ミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺
伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な（鋳型の）鎖に結合することにより
転写物の伸張を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63
）。
本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ
ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定
義される。
本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＨＧＰＧと比較し
て、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残
基の加わるようなヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ
酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指
す。
本明細書で用いられるとき、ＨＧＰＧとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブ
タ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類に由来する、天然の、合成
の、半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＨＧＰＧのアミノ
酸配列を意味する。
ＨＧＰＧの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸の「置換」により異な
るものとなったアミノ酸配列を有し得るものである。この変異体は「保存的」変
化を含むものであり得、この保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシ
ンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性
を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変
化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、ア
ミノ酸の欠失、挿入、若しくはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウ
エアのような従来より周知のコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは
免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミノ酸及びそのアミ
ノ酸の数を決定することができる。
用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＨＧＰＧの構造的機能、調節機能、
又は生化学的機能を有するＨＧＰＧを意味する。同様に「免疫学的活性」とは、
天然の、組換えの、又は合成のＨＧＰＧ、若しくはその任意のオリゴペプチドが
適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力
として定義される。
本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＨＧＰＧをコ
ードする核酸、又はコードされたＨＧＰＧを意味する。このよ
うな修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換があ
る。核酸誘導体は、天然ＨＧＰＧの必須の生物学的特性を保持しているポリペプ
チドをコードする。
本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除
かれ、天然にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離又は
分離されて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは
少なくとも９０％遊離した核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)」は「
核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（Coombs J（1994）Diction ary of Biotechnology
,Stockton Press社,New York）を含む概念である。増幅と
は、核酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995)
,PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press社,New york）。
「厳密性」とは、典型的には、約Ｔｍ−５℃(プローブのＴｍより５℃下)から
Ｔｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には理解できるように、厳密
性のあるハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、つ
まり検出したり、或いは類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、
つまり検出するために用いることができる。好適実施例
本発明は、下垂体ライブラリー（PITUNOT01）のｃＤＮＡの中から同定された
新規なヒトＧタンパク質γ３サブユニット（ＨＧＰＧ）、及び疾病の研究、診断
、予防、及び治療におけるその核酸及びアミノ酸配列の利用に関するものである
。
ＨＧＰＧをコードする核酸配列（配列番号：２）は、初めに、BLAST（Basic L
ocal Alignment Search Tool;Altschul SF(1993)J Mol Evol 36:290-300;Altsch
ul SF等(1990)J Mol Biol 215:403-10）を用いてインサイト社クローンＮｏ．11
2808の中から同定され、ウシのＧタンパク質ｇ−３サブユニット（GI 163084）
に対する相同性を示した。
配列番号：２のコンセンサス配列は、インサイト社クローンＮｏ．90963（HYP
ONOB01）、112808（PITUNOT01）、489878、491492（HNT2AGT01）、658952、6608
06（BRAINOT03）、926890（BRAINOT04）、1229795（BRAITUT01）、1384744（BRA
ITUT08）、及び1480453（CORPNOT02）を用いて延長され、合成されたものである
。マウス、ヒト、及びウシのｇ−３サブユニットに対する相同性を第２図に示す
。有意な保存的アミノ酸残基には、C30、C45、及びC50及びウシのタンパク質に
も見られる３’末端コンセンサス配列CALLが含まれる。
ＨＧＰＧコーディング配列
ＨＧＰＧの延長され合成された核酸及び推定アミノ酸配列を第１Ａ図及び第１
Ｂ図に示す。本発明によれば、ＨＧＰＧをコードする任意の核酸配列を用いて、
ＨＧＰＧを発現する組換え体分子を作り出すことができる。ここに開示する特定
の実施例では、ＨＧＰＧをコードする部分的配列は、初めに下垂体ｃＤＮＡライ
ブラリー（PITUNOT01）からインサイト社クローンＮｏ．112808として単離され
た。
遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列に対
して最小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のＨＧＰＧコード化ヌ
クレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。本
発明は、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によりなされ得る全
ての可能な核酸配列の変化をその範
囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自然発生のＨＧＰＧのヌクレオチド配
列に当てはまる標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであ
り、このような全ての変異は、ここに具体的に示されたものと考えられたい。
ＨＧＰＧ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳
密性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な
ものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するＨＧＰＧ又はその変
異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン選
択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細胞の
、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるように選
択され得る。ＨＧＰＧ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を、コード
されるアミノ酸配列を変更することなく実質的に変更する理由は、例えば自然発
生配列から作り出される転写物よりより長い半減期のようなより望ましい特性を
有するＲＮＡ転写物の産生のためである。
現在では、ＨＧＰＧ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその一
部分を、完全に合成ケミストリにより作製して、その後、その合成遺伝子を任意
の入手可能なＤＮＡベクター及び細胞系に、この出願時点において周知の試薬を
用いて挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＨＧＰＧをコード
する配列又はその任意の部分に突然変異を誘発させることができる。
また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で、配列番
号：２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列があ
る。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel（1987,Guide to Molecu lar Cloning Techniques,Methods in Enzymology
,Vol 152,Academic Press,San
Diego CA）に記載されてい
るように、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づいており、定義
された「厳密性」で用いられる基準を与える。上記文献は本明細書と一体に引用
されたものである。
本発明において用いられ得るＨＧＰＧをコードする変異核酸配列は、異なるヌ
クレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的
に等価のＨＧＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである
。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに
置換を含み、結果的に機能的に等価なＨＧＰＧとなる。慎重なアミノ酸置換は、
ＨＧＰＧの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度
、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。
例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正
に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ荷電
していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、
グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニ
ルアラニン並びにチロシンが含まれる。
本発明の範囲に含まれるものとして、ＨＧＰＧのアレルがある。ここで用いる
「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＨＧＰＧの別形態である。アレルは変異
、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペ
プチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更
される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態が存
在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生
じる変異は一般に、アミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタ
イプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせて、与えられた配
列内の１又は２以上の位置で生じ得る。
ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Se
quenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical社,Cleveland OH）、
Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性Ｔ７ポリメラー
ゼ（Amersham社,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）Methods社
から市販されているELONGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルー
フリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。好
ましくは、この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Hamilton社,Reno NV)、Peltie
r Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社,Watertown MA）並びにABI377DNAシー
ケンサ（Perkin Elmer社）のような装置を用いて自動化される。
ポリヌクレオチド配列の延長
ＨＧＰＧをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と
、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には
周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;PCR Meth
ods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎
用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）法を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対し
て特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅され
る。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内
部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣ
Ｒの各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素
を用いて配列決定される。
逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増
幅、または延長を行うことができる(Triglia等（1988）Nucleic
Acids Res 16:8186)。プライマーは、OLIGO(登録商標)4.06(National Bioscienc
es社,Plymouth MN)或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２０
〜３０ヌクレオチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の
温度で標的配列にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺
伝子の既知領域の適当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分
子内ライゲーションにより環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。
キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic 1:111-19
）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤ
ＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行うための方法である。またキャプチャＰＣＲ
では、多重制限酵素消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の未
知の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必要がある。
未知の配列を検索するために用いることができる別の方法は、Parker JD等の
方法である（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）。更に、ＰＣＲ、ネスト化
プライマー並びにPromoterFinderのライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩
行させることができる（PromoterFinder（登録商標）、Clontech社（Palo Alto
CA））。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イン
トロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選
択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライ
ミングした（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含
むより多くの配列を含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライ
ブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、
特に有用である。またゲノ
ムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’まで延長するために有用である。
サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列
を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定
のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton CA
）並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離
のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素(各ヌク
レオチドに対して１つ)を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行
う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGenotyper
（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換さ
れ、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコ
ンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された
量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法により３
０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたこ
とが報告されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8）。
ヌクレオチド配列の発現
本発明により、ＨＧＰＧ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或いはそ
の機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＨ
ＧＰＧの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができる
。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列
をコードする他のＤＮＡ配列も、ＨＧＰＧのクローニングや発現のために用いる
ことができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＨＧＰ
Ｇコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定の原核細胞
或いは真
核細胞の宿主において好適なコドン(Murray E等(1989):Nucleic Acids Res 17:4
77-508)を選択して、例えば、ＨＧＰＧ発現率を増大させたり、或いは自然発生
配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特性を有する組換
えＲＮＡ転写産物を生成することができる。
本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＨＧＰＧをコードする配列を改変
するべく組換えられ得るが、このような改変には、限定はしないが遺伝子生成物
のクローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾する改変が含まれる。例え
ば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異を誘
発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、
コドン選好の変化等をもたらすことができる。
本発明の別の実施例では、天然ＨＧＰＧコーディング配列、修飾ＨＧＰＧコー
ディング配列或いは組換えＨＧＰＧコーディング配列を非相同の配列に結合して
、融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＨＧＰＧ活性のインヒビタ
ーを選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体
により認識される異なるペプチドを発現するキメラＨＧＰＧタンパク質をコード
化することが役立ち得る。融合タンパク質はＨＧＰＧ配列とヘテロのタンパク質
配列との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これによっ
てＨＧＰＧを切断して、ヘテロの部分から分けて実質的に精製することが可能と
なる。
本発明の別の実施例では、ＨＧＰＧコーディング配列は、当業者によく知られ
た化学的方法（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea,
Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahedron
Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）を用いて
、全体的に、或いは部分的
に合成することができる。別法では、ＨＧＰＧアミノ酸配列を、全体的に或いは
部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を生成することができる。
例えば、種々の固相技術(Roberge JY等(1995)Science 269:202-204)でペプチド
合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI431Aペプヂドシンセサイザ
（Perkin Elmer）をその使用説明書に従って用いることにより達成することがで
きる。
この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精
製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecu lar Principles
,WH Freeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの組
成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる（例え
ばthe Edman degradation procedure;Creighton，上述）。さらにＨＧＰＧのア
ミノ酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に改変したり、また
他の細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用
いて結合して、変異体ポリペプチドを生成することができる。
発現系
生物学的に活性のＨＧＰＧを発現するために、ＨＧＰＧコーディングヌクレオ
チド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコー
ド化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。
ＨＧＰＧコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを含む発現
ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には
、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え、即ち遺伝子組
換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Molecular Clonin g A Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel FM
等Current Protocol in Molecular Biology
,John Wilky&Sons,New Yorkに記載されている。
種々の発現ベクター／宿主系を、ＨＧＰＧコーディング配列を保持し、かつ発
現するために利用することができる。このようなものには、限定はされないが、
組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形
質転換した細菌、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベク
ター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクタ
ー（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）
をトランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばTi、或いはpB
R322プラスミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系が含まれる。
これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は
様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３’非翻訳領域
であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作
用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを
含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテ
リア系においてクローニングする際には、Bluescript（登録商標）ファージミド
（Stratagene社，LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモータ及びptrp-lacハイ
ブリッド並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘ
ドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱
ショック,RUBISCO及びストレージタンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物ウ
イルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）に由来するプロモー
タ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動物細胞では、哺乳
動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適である。ＨＧＰＧの
多数の複製を含む株
細胞を生成する必要がある場合には、SV40或いはEBVに基づくベクターを、適切
な選択マーカーと共に用いる。
細菌系では、ＨＧＰＧの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得
る。例えば抗体を誘発するために大量のＨＧＰＧが必要とされる場合は、容易に
精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベクターが望まれる。そのよう
なベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発現ベクタ
ーBluescript（Stratagene社）（このベクターでは、ＨＧＰＧコード化配列が、
アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備え
たフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成され
る）や、pINベクター（Van Heeke&Schuster（1989）J Biol Chem 264:5503-5509
）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage社、Madison WI）も、グルタチオ
ンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチ
ドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であ
り、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存在下
における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成さ
れたタンパク質はへパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にGST部分から
放出され得る。
酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを
含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及
びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。
植物発現ベクターを用いる場合には、ＨＧＰＧをコードする配列の発
現は、多数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロ
モータ（Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモー
タは、単独で、或いはTMV(Takamatsu等(1987)EMBO J 6:307-311)からのオメガ−
リーダー配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO（Coruzzi等（1984）EMBO J
3:1671-1680）、Broglie等（1984）Science 224:838-843）の小サブユニット、
或いは熱ショックプロモータ（Winter J及びSinibaldi RM(1991)Results Probl
Cell Differ 17:85-105）のような植物プロモータが用いられる。これらの構成
は直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内
に導入される。そのような技術を再検討する場合には、Hobbs S及びMurry LE、M
cGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY,pp19
1-196及びWeissbach and Weissbach（1988）Methods for Plant Molecular Biol ogy
,Academic Press NY,pp421-463を参照されたい。
ＨＧＰＧを発現させるために用いることができる別の発現系は昆虫系である。
そのような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV
）がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusia
の幼虫において外来遺伝子を発現する。ＨＧＰＧコード化配列は、ポリヘドリン
遺伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロ
モータの制御下に置かれる。ＨＧＰＧの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン
遺伝子が不活性にされ、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成さ
れる。次いで、この変異体ウイルスは、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの
幼虫への感染させるために用いられ、その中でＨＧＰＧが発現される（Smith等
（1983）J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994）Proc Nat Acad Sci 91:3224-
7）。
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現
ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＨＧＰＧのコード化配列
は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳物
複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により、感染し
た宿主細胞でＨＧＰＧを発現することができる生存可能なウイルスになる（Loga
n及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:365j5-3659）。さらにラウス肉腫ウ
イルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現を
増加させるために用いることができる。
また、ＨＧＰＧ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要で
ある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ＨＧ
ＰＧ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合
には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコード化配列、或い
はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シ
グナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは正しい読み枠内にあ
る必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写エ
レメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであ
り得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強化
される（Scharf等（1994）Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（1
987）Methods Enzymol 153:516-544）。
さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタ
ンパク質のプロセシングを行う能力で選択される。このようなポリペプチドの修
飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化
、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」
形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、
正しい挿入、折り畳み、並びにまた機能の発揮のために重要である。CHO,HeLa,M
DCK,293,WI38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定
の細胞機構及び特徴的な機構を有しており、導入される外来タンパク質の修飾や
プロセシングを確実に実行するべく選択される。
長期間にわたって高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定
した発現が望ましい。例えばＨＧＰＧを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由
来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベ
クターを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に
切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日間成長させられる。選択マーカーは
選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合する細胞を同
定できるようにする。安定的に形質転換された細胞の耐性凝集塊はその細胞型に
適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。
形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler
等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Lowy等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子を含み、それぞれtk-及びaprt-細胞に
おいて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の
基礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を
与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノグリコシッド剤、
ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え(Colberre-Garapin等（1981）J Mol
Biol 150:1)、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、フォスフィノ
トリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）
に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択
可能な遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）
を利用できるようにするhisDが記載されている（Hartman及びMulligan（1988）P
roc Nalt Acad Sci 85:8047）。最近になって、形質転換体を同定するためばか
りではなく、特定ベクター系による一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を
定量するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシ
フェリンのような標識による可視標識が非常によく用いられるようになった（Rh
odes CA等（1995）Methods Mol Biol 55:121-131）。
本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって、目的の遺伝子の存在も示唆され
るが、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばＨＧＰＧがマーカー遺
伝子配列内に挿入されるなら、ＨＧＰＧを含む組換え細胞がマーカー遺伝子の機
能の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一プロモータの制御
下でＨＧＰＧ配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じてのマ
ーカー遺伝子の発現は、通常さらにＨＧＰＧの発現をも示す。
この他、ＨＧＰＧのコーディング配列を含み、さらにＨＧＰＧを発現する宿主
細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定
はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び
、核酸及びタンパク質の検出や定量、若しくはその両方を行うための膜、溶液或
いは破片ベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを
含む。
ＨＧＰＧポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＧＰＧのプローブ、一部、或いは
フラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョン或いは、増幅により検出することができる。核酸増
幅に基づくアッセイでは、ＨＧＰＧ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリ
ゴマーを使用し、ＨＧＰＧのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。
本明細書において「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ
或いは、ＰＣＲで増幅されるセグメントであるアンプリマーとして用いることが
できる、少なくとも10ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には
１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指
す。このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のい
ずれかを用いてＨＧＰＧポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプ
ロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結
合免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光表示式細胞分取
器法（FACS）を含む。ＨＧＰＧポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープに対
して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノ
アッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）は好適ではあるが、競合
的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Hampto
n R等（1990,Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul M
N）及びMaddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211）等に記載されている。
さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ
ノ酸検査法において用いることができる。ＨＧＰＧに関連する配列を検出するた
めの標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための
手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識
化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ＨＧＰＧ配列、或い
はその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニング
される。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ７，
Ｔ３或い
はＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼの付
加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができる。
Pharmacia Biotech社（Piscataway NJ）、Promega社（Madison WI）並びにUS
Biochemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対す
る商用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわ
ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成
剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含ま
れる。そのような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817,
837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,2
75,149号並びに第4,336,241号がある。また、組換え免疫グロブリンの製造につ
いては米国特許第4,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書とと
もに参照されたい。
ＨＧＰＧの精製
ＨＧＰＧをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培
地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される
。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクタ
ーに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業者
には理解されるように、ＨＧＰＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベク
ターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＨＧＰＧの分泌を誘導するシ
グナル配列を含むように設計される。他の組換え体作製物では、ＨＧＰＧを、可
溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオ
チド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol 12:441-5
3、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照され
たい）。
またＨＧＰＧは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以
上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現され得
る。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上
での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレー
トペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グ
ロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長
／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle
WA）が含まれる。精製ドメイン及びＨＧＰＧ間に第ＸＡ因子或いはエンテロキ
ナーゼ（Invitrogen,San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を含める
のは精製を促進するのに役立つ。このような発現ベクターの１つは、ＨＧＰＧを
含む融合タンパク質の発現を提供し、かつ６個のヒスチジン残基、それに続くチ
オレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む。ヒスチジ
ン残基によりＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフイー
、Porathら（1992）Protein Expression and Purification 3:263-281に記載）
上での精製を促進すると共にエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から
の目的タンパク質の精製のための手段となる。
組換え体の産生に加えて、ＨＧＰＧのフラグメントは、固層技術を用いた直接
のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら（1969）Solid-Phase Pet ide synthesis
,WH Freeman Co,San Francisco;Merrifield J(1963)J Am Chem So
c 85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが
、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431A
ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer，Foster City CA）を製造者の指示に従っ
て用いて
行うことができる。ＨＧＰＧの種々のフラグメントを個別に化学的に合成し、化
学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出すことができる。
ＨＧＰＧ
ＨＧＰＧをコードする配列の診断及び治療的利用の原理は、この核酸及びアミ
ノ酸配列、マウスのＧタンパク質γ−３サブユニットに対するその相同性、主と
して脳に存在するが、骨髄、***、腎臓、及び胎盤にも存在するその組織分布、
及びヘテロ三量体及び二量体Ｇタンパク質の既知の細胞及び機能に基づいている
。
第１Ａ図及び第１Ｂ図に提示された核酸配列、その相補的配列、断片、又はオ
リゴマー、及び抗ＨＧＰＧ抗体を、細胞、組織、又はその抽出物のアッセイにお
ける診断用組成物として用いることができる。精製されたＨＧＰＧ又はそれをコ
ードする核酸を、ＨＧＰＧの過剰発現で特徴付けられる状態や疾病のタンパク質
又は核酸に基づくアッセイにおいて、ポジティブコントロールとして用いること
ができる。ＨＧＰＧに特異的に結合し得るアンチセンス分子、アンタゴニスト、
又はインヒビターを、ＨＧＰＧの発現によって特徴づけられる状態や疾病のため
の医薬品組成物として用いることができる。このような状態には、腫瘍形成に関
連する細胞増殖が含まれる。
γ−３サブユニット発現の調節、若しくは二量体形成及び活性の調節により、
細胞増殖に基づく状態への早期の介入のための機会が得られる。この場合には、
脳又は***の腫瘍の成長の特異的な阻害に主な用途がある。このような阻害のた
めに、配列番号：２のアンチセンス配列を含みそれを発現し得るベクター、ＨＧ
ＰＧのペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はインヒビターを、生検又は術後に導入する
ことができる。このような治療用分子のデリバリーは、医薬品組成物の項で説明
するが、組織／腫瘍特異的であることが必要であり、新生物又は腫瘍の診断、大
きさ、及び
状態によって決まってくる。
γ−３サブユニットの発現は、骨髄、腎臓、胎盤、及びアルツハイマー病の患
者の脳梁においても顕著であった。これらの組織では、γ−３サブユニットの発
現は、同様に白血球又はリンパ球の活性とも関連を有する。二量体形成及び活性
化を防止するインヒビターの供給によって、これらの組織における不当な破壊を
防止することができる。同様にアンチセンス分子を供給することにより発現を止
めることができる。
ＨＧＰＧの抗体
ＨＧＰＧ特異的抗体は、ＨＧＰＧの発現が関係する病気や疾病の診断のために
役立つ。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブ
ラリーにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわちＨＧＰＧ
ポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特に診断及び治療に好適である。
抗体誘発のためのＨＧＰＧは生物学的活性を有している必要はないが、そのタ
ンパク質断片、つまりオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体
を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましく
は少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらの配列は
、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一のものであり、小さい自然発生の
分子の全アミノ酸配列を含み得る。ＨＧＰＧアミノ酸の短いストレッチを、キー
ホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような
他のタンパク質の配列に融合することができる。ＨＧＰＧに対する抗体の生成の
ために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。
抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は
、免疫学的特性を保持するＨＧＰＧ或いはその任意の部分、フ
ラグメント或いはオリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。
宿主の種に応じて、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いら
れる。そのようなアジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバン
ト、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのよう
な表面活性物質アジュバント、プルロニックポリオールアジュバント、ポリアニ
オンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホール
リンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが
含まれる。ＢＣＧ（カルメット-ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム
（Corynebacterium parvum）は有用なヒトアジュバントである。
ＨＧＰＧに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞によって抗体分
子の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしない
が、Koehler及びMilstein(1975,Nature 256:495-497)に当初掲載されたハイブリ
ドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor等（1983）Immunol Today
4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-20:30）及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal.Antibodies and Cancer Therapy,Ala
n R Liss Inc,pp77-96）を含む。
さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ
抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた
めに開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81:
6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のための周知技術（米国特許第
4,946,778号）を、ＨＧＰＧ特異的一本鎖抗体を生成するために適用する。
また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導することによ
り、或いはOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter
G及びMilstein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え体
免疫グロブリンライブラリー、または高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリ
ーニングすることによっても生成することができる。
ＨＧＰＧに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ
る。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン
消化により生成することができるＦ（ａｂ’）2フラグメント及びＦ（ａｂ’）2
フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａ
ｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦ
ａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブ
ラリーを構築する（Huse WD等（1989)Science 256:1275-1281）。
確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のい
ずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプ
ロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般
に、ＨＧＰＧとその特異的抗体（或いは類似のＨＧＰＧ結合分子）との間の複合
体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＨＧＰＧタンパク質上の
２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部
位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用い
られる。これらの検査法はMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載され
ている。
ＨＧＰＧ特異的抗体を用いる診断検査法
特定のＨＧＰＧ抗体は、ＨＧＰＧの発現の誘発によって特性化される病気或い
は疾病の診断や、ＨＧＰＧで治療されている患者のモニタリン
グのためのアッセイにおいて役立つ。ＨＧＰＧについての診断アッセイは、ヒト
の体液、細胞或いは組織の抽出物において、ＨＧＰＧを検出するための抗体或い
は標識を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に
拘わらず用いることができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合
、或いは非共有結合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することによ
り標識される。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについて
は上記した。
それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー
ナル抗体を用いて、ＨＧＰＧポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが
当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある。ＨＧＰ
Ｇポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル
抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合
的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox DE
等（1983,I Exp Med 158:1211）に記載されている。
疾病の診断の基礎を得るために、ＨＧＰＧ発現についての通常の値、すなわち
標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件下で
、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは細胞
抽出物と、ＨＧＰＧに対する抗体とを結合することにより得ることができるが、
これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連のポ
ジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体の既
知の量が既知の濃度の精製ＨＧＰＧと結合される。その後正常サンプルから得ら
れた標準値を、ＨＧＰＧが関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプルか
ら得られた値と比較する。標準値と対象値との偏差によって疾病の存在
を確認できる。
薬物スクリーニング
ＨＧＰＧや、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチ
ドは、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニ
ングのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメ
ントは、溶液に遊離した形態か、固体支持体へ付着したものか、細胞表面へ付着
したものか、或いは細胞内に存在するものであり得る。ＨＧＰＧと試験される薬
剤との間の結合複合体形成が測定される。
薬物スクリーニングのための別の方法は、ＨＧＰＧポリペプチドへの安定的な
結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするもので
あり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第84/03564号（Guysen）に詳細
に記載されている。この文献を本明細書に一体に参照されたい。概要としては、
多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつかの他の
表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験用化合物をＨＧＰＧフ
ラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合ＨＧＰＧを当分野で周知の方法に
より検出する。また精製ＨＧＰＧを前述の薬物スクリーニング技術において使用
するために、プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、ペプ
チドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いる。
また本発明は、ＨＧＰＧに結合し得る中和抗体特性が、ＨＧＰＧとの結合につ
いて特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図
している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＨＧ
ＰＧと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
ＨＧＰＧをコードするポリヌクレオチド使用
ＨＧＰＧをコードするポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治
療目的で用いられる。診断目的の場合、本発明のＨＧＰＧは、ＨＧＰＧの発現が
関与する生検組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる
。診断試験は、ＨＧＰＧが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを
区別したり、治療的介入の際にＨＧＰＧ濃度の調節をモニタリングするのに役立
つ。本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮ
Ａ分子、及びＰＮＡが含まれる。
本発明の別の側面は、ＨＧＰＧまたは近縁な分子をコードするゲノム配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰ
ＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわち
非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチ
ド）か、低度に保存的な領域（例えば特に３’領域におけるシステイン残基の間
の領域）の何れに由来するのかということや、ハイブリダイゼーション或いは増
幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳密性によって、そのプローブが自然発
生ＨＧＰＧのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定
するものであるかが決まってくる。
プローブは近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いるこ
とができ、好ましくは、これらのＨＧＰＧの任意のものをコードする配列から得
られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイ
ゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、プロモータ、エン
ハンサエレメント及び自然発生ＨＧＰＧのイントロンを含むゲノムの配列に由来
するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分子に
より標識すること
ができ、この標識には、32Ｐや35Ｓのような放射性核種、アビジン／ビオチン結
合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素標識等が含
まれる。
ＨＧＰＧのＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブの生成のた
めの他の手段は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにＨＧＰＧやＨＧＰＧ誘導
体をコードする核酸配列をクローン化することである。このようなベクターは周
知であって市販されており、Ｔ７やＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適切な
ＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in
vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。診断的使用
ＨＧＰＧをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＧＰＧの発現が関与する病
気や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＨＧＰＧをコードするポ
リヌクレオチド配列を、ＨＧＰＧ発現を検出するための生検組織や体液の、ハイ
ブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる
。そのような定性的及び定量的方法の形態には、サザンブロット法或いはノーザ
ンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、ディップス
ティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術及びELISA技術が含まれる
。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販されている多
くの診断キットの基礎となっている。
ここに開示したＨＧＰＧをコードするヌクレオチド配列は、癌に関係する活性
化や誘導を検出するアッセイのための基礎を提供する。ＨＧＰＧヌクレオチド配
列は、既知の方法により標識され得、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適
した条件の下で、患者の体液や組織のサンプルに加えられる。インキュベーショ
ン時間の経過後、このサンプルを、
ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には所望に応じて色素（または他の展
開剤を要する標識）を含む適合性の液体で洗浄する。この適合性の液体をリンス
した後、色素を定量して標準値と比較する。生検サンプルや抽出サンプルにおけ
る色素の量が、比較用対照サンプルの色素量を著しく上回っている場合には、こ
のヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリッド形成しており
、サンプル内に著しく高い濃度のＨＧＰＧをコードするヌクレオチド配列が存在
していることは、関連する疾病が存在していることを示している。
このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するため、動物実験、
臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができる
。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＨＧＰＧ発現に対する正常な或い
は標準的なプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィールは
、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を
、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ＨＧＰＧ或いはその一
部と結合することにより確立される。標準的なハイブリッド形成は、正常被験者
に対して得られる値と、既知の実質的に精製されたＨＧＰＧの量が用いられる同
一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較するこ
とにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＨＧＰ
Ｇ発現に関連する障害或いは疾患を潜在的に患っている被験者からのサンプルか
ら得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在が確認さ
れる。
ひとたび疾患が確認されると、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファ
イルが作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パター
ンに向かって回復しているか否かを評価するために規則的に繰り返される。継続
的な治療プロファイルを用いて数日間或いは
数ヶ月の期間にわたる治療効果を示すことができる。
米国特許第4,683,195号、並びに第4,965,188号に記載のようなＰＣＲ法により
、ＨＧＰＧ配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の使用法が提供される。この
ようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用いて発生させたり
、或いは組換え体を起源として生成することもできる。一般にオリゴマーは、通
常特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な条件下で用いられる２つのヌ
クレオチド配列、即ちセンス方向(５’→３’)のヌクレオチド及びアンチセンス
方向(３’←５’)のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子オ
リゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列の検出や定量のためのより低い厳密性の条件下であっても用いることがで
きる。
さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel
ing）(Melby PC等1993 J Immunol Methods 159:235-44)或いはビオチン標識（Du
plaa C等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増幅
（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準的なグラ
フ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイ
を実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈溶
液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができ
る。このタイプの確定診断により、健康の専門家が患者の積極的治療を開始した
り、病状の悪化を防ぐことが可能となる。同様に、当業者に周知のアッセイを用
いて、患者の治療の際に、その病状の進行をモニタリングすることができる。ま
た、まだ開発されていない分子生物学的技術でも、その新技術が既知のヌクレオ
チド配列の性質、例えばトリプレット遺伝暗号、特異的塩基対形成等に基づくも
のであれば、ここに開示したヌク
レオチド配列をそれに利用することができる。治療的利用
EMAP-IIに対するその相同性、及びその発現プロファイルに基づき、ここに開
示するＨＧＰＧをコードするポリヌクレオチドは、免疫不全疾患の治療において
役立ち得る。
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来
する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の
器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当
業者によく知られた方法は、アンチＨＧＰＧを発現する組換えベクターを構築す
るために用いることができる。例えばManiatis等（上記）及びAusubel等（上記
）に記載された技術を参照されたい。
完全長ｃＤＮＡ配列や調節エレメント、若しくはその両方を含むポリヌクレオ
チドにより、研究者は遺伝子機能のセンス調節(Youssoufian H及びHF Lodish 19
9.3 Mol Cell Biol 13:98-104)、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）An
nu Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＨＧＰＧを用いることが
できる。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディン
グ領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。
所望のＨＧＰＧ断片を高度に発現する発現ベクターを細胞または組織にトラン
スフェクトすることにより、ＨＧＰＧをコードする遺伝子の機能を停止させるこ
とができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列
で細胞を満たすことができる。ＤＮＡへの組み込みがない場合ですら、このよう
なベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解されるまで、ＲＮ
Ａ分子を転写し続ける。こ
のような一過性の発現は、非複製ベクター（Mettler I,personal communication
）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には更
に長い期間継続し得る。
上述のように、ＨＧＰＧの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイ
ントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計するこ
とにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダー配
列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。また
アンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することによ
り、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重らせ
ん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対台は、二重らせん
が、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく十分に開かないよ
うにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JEら(Huber BE and
BI Carr(1994)Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co,M
t Kisco NY)により記載されている。
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で
ある。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の
配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる
切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＨＧＰＧの
エンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る、人工合成
のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。
任意の潜在性ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、配
列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分子
を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子
の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレ
オチドの間の短いＲＮＡ配列は、そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２
次構造の特徴について評価される。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌク
レアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形
成に対する接触性を試験することにより行われる。
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための
当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス
ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学合成オリゴヌクレオチ
ドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＨＧＰＧをコードするＤＮＡ配
列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ
配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有す
る多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセ
ンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織
内に導入される。
ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが
できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’
末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ
ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メ
チルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のも
のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア
ニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び
類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブト
シン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによ
って、これら全ての分子に拡張することができる。
細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方
法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して
も適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞に
ベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方
法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994号に記載さ
れている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる送達は、当分野
でよく知られているものである。
更に、ここに開示するＨＧＰＧのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定は
しないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特
性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開
発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。
近緑なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング
ＨＧＰＧの核酸配列は、自然発生のゲノム配列のマッピングのためのハイブリ
ダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よ
く知られた技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマ
ッピングすることができる。このような技術には、染色体を展着物（chromosoma
l spreads）についてのin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988）Human
Chromosomes:A Manual of Basic Technique，Pergamon Press，New York）、フ
ローソーティング（How-sorted）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（ＹＡ
Ｃｓ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice CM（19
93;Blood Rev 7:127-34）及びTrask BJ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概要
が示されている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれる
。
染色体展着物（chromosome spread）についての蛍光in situハイブリダイゼー
ションの技術は、“Verma等（1988）Human Chromosomes:A Manual of Basic Tec hnique
,Pergamon Press，New York”に記載されている。染色体調製物の蛍光in
situハイブリダイゼーション及び他の染色体マッピング技術は、迫加の遺伝子地
図データと関係を有する。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Sci
ence(265:1981f)に見ることができる。物理的染色体地図上でのＨＧＰＧの位置
と、特定の失敗（または特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある遺
伝病が関係するＤＮＡの領域を限界決定することができる。本発明のヌクレオチ
ド配列を、健常者と、キャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出するため
に用いることができる。
染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に
大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI
T Center for genomic Reserch（Hudson TJら(1995)Science 270:1945-1954）か
ら最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いはアームが未知
であっても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関
連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはそ
の一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これは位置クローニ
ング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情
報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症
候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜11q22-23（Gatti等（1988）Nature 33
6:577-580）への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域にマッピング
される任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子
を表すことができる。本
発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者との間の、転座、逆位
等による染色***置の違いを検出するために用いることもできる。
医薬品組成物
本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒ
ビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とと
もに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の
無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定
はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの
分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤
或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され
得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活
性なものである。医薬品組成物の投与
医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、
局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与
、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含
まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合
物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的
に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming
ton's Pharmaceutical Sciences”（Maack Publishing Co,Easton PA）の最新版
において見出すことができる。
経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担
体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、
薬品組成物は、治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤
、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の
剤形として処方される。
経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合する
ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加
した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤
核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトー
ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも
ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの
ようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラ
チン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポ
リビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはア
ルギン酸ナトリウムや、その塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。
糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ
アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ
コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混
合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量
を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。
経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ
チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ
トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで
んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク
或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混
合された活性処方組成物を含み得る。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安
定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリ
コールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。
非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、
本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理
緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。
水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール
或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性
成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒
或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド
或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応
じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるように
なる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。
局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透
剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管
本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍
結乾燥処理により製造される。
この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸
、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに
形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態
である水性或いはプロトニック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある
。他の場合には、好適な製剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２
％のショ糖、使用前に緩衝剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜
７％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末である。
製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調
製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため
にラベル付けされる。ＨＧＰＧの投与のため、このようなラベルには、投与の量
、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量
本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的
を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業
者の能力の範囲内で行うことができる。
任意の化合物について、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或い
は通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のア
ッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的
な投与量や投与経路を決定することができる。
治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アン
タゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療
有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体
群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための、
細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することがで
きる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５
０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい
。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒ
トへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような
化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃
度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並
びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。
投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す
るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患
者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感
受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４
日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて
２週間に１度投与してもよい。
通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関
するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,760号
、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチド
に対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであ
ろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状
態、位置等によって決まってくる。
例えば、ＨＧＰＧを、自己免疫疾患における炎症性細胞の悪影響を改善する治
療的分子のスクリーニングのために用いることができる。
以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本
発明をこの実施例に限定しようとするものではない。
産業上の応用
１ ｃＤＮＡライブラリーの作製
下垂体ライブラリーを、１６乃至７０歳の年齢の範囲の白人男性及び女性の脳
から得られた、全部で２１個の健常な脳下垂体のサンプルのプールから作製した
。ポリＡ＋ＲＮＡはClontech社(catalogue #6584-1及び#6584-2;Clontech Labor
atories InC.Palo Alto CA）から得て、Stratagene社（La Jolla CA）において
カスタムメイドでｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ｃＤＮＡ合成の初回刺激には、オリゴｄ（Ｔ）とランダム六量体の双方を利用
し、２つのｃＤＮＡ調製物を個別に処理した。合成アダプターオリゴヌクレオチ
ドをｃＤＮＡの末端にリゲートし、これによってStratagene Uni-ZAPTMベクター
系への挿入を可能にした。最後に、この２つのｃＤＮＡライブラリーを等しい数
のバクテリオファージを混合することにより１つのライブラリーにした。
下垂体ｃＤＮＡライブラリーを、ＤＮＡプローブか抗体プローブの何れかでス
クリーニングすることができた。pBluescript（登録商標）ファージミド（Strat
agene）はin vivoで速やかに切除することができる。このファージ粒子を、大腸
菌宿主菌株XL1-Blue（登録商標）（Stratagene）にトランスフェクトした。別の
一方向性ベクターには、限定はされないが、pcDNAI（Invitrogen，San Diego CA
）やpSHlox-l（Novagen.Madison WI）が含まれる。
２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定
ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンは、in vivo切除プロセスにより
得られた。このプロセスではライブラリーファージとf1ヘルパーファージの双方
を宿主細菌株に同時感染させる。ライブラリーを含むファージとヘルパーファー
ジの双方によって産生されたポリペプチド又は酵素が、ＤＮＡにニックを入れ、
標的ＤＮＡ上の決まった配列から新たなＤＮＡ合成を開始させ、ｃＤＮＡインサ
ート及びpBluescriptファー
ジミドのＤＮＡ配列の全てを含む小形の一本鎖の環状ファージミドＤＮＡ分子を
形成した。このファージミドＤＮＡは細胞から放出され、精製されて、新たな宿
主細胞（SOLR,Stratagene）に再度感染させるのに用いられ、感染した宿主細胞
はアンピシリン含有媒地上で選択された。
次にQIAWELL-8 Plasmid Purification System(QIAGENInc，Chatsworth CA）を
用いてファージミドＤＮＡを精製し、ＤＮＡ配列決定及び他の解析操作のために
調製した。
下垂体ライブラリーのランダムな単離で得られたｃＤＮＡインサートを部分的
に配列決定１した。ＤＮＡ配列決定の方法は当分野においてよく知られている。
従来の酵素法では、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントSEQUENASETM(US B
iochemical Corp,Clevel and OH）、若しくはTaqポリメラーゼを用いて、目的の
ＤＮＡ鋳型にアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を延長す
る。一本鎖及び二本鎖の双方を用いるための方法が開発されてきている。鎖集結
反応の生成物を尿素ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、蛍光分析によって
（蛍光標識された前駆体を）検出した。Applied Biosystems Catalyst 800、377
及び373ＤＮＡシーケンサを用いる方法のような、最近進歩しつつある機械化反
応調製、配列決定、及び解析においては、蛍光検出法を利用している。
３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索
Applied Biosysteras社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）67
0 Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBank
の配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（
TRW社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのよう
に行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセ
ット、及び誤差
許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配列に対して相
同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列には、初期値
とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域をドットマト
リクスホモロジーブロット法を用いて検定し相同な領域と偶然の一致とを区別し
た。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて表示した。
ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT（商標）670配列解析システ
ムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Spec
ification Language及びパラメータウインドウを用いて、タンパク質データベー
スから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付
けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同
性を有する領域と偶然の一致とを区別した。
BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)JMol Evol3
6:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10)の略称であり、これを用
いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸
配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメントの
局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際に特に有効
である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム出
力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair（HSP）である。
HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、
そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアラ
イメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足
、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列と
データベース配列との間のHSP
を見つけ出すものであり、見出された任意の一致の統計的有意性を評価し、その
ユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものである。パラ
メータＥはデータベース配列一致を知らせるための統計的に有意な閾値を確定す
るパラメータである。Ｅは全データベース検索の情況においてHSP（或いはHSPの
組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界として解釈される。その一致が
Ｅを満足する任意のデータベース配列がプログラム出力において報告される。
４ ノーザン法による解析
ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由
来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写
物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。
類似のコンピュータ技術で、BLAST（Altschul SF 1993 and 1990，上述）を用
いてGenBankまたはLIFESEQ（商標）データベース（Incyte，Palo Alto CA）のよ
うなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多
数の膜式ハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、
コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるか
の分類を決定することができる。
検索の基準値は、プロダクトスコアであり、これは以下の式で定義されるもの
である。
（配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００
このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致
の双方を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差
が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相
同な分子は、通常プロダクトスコアとして１
５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、スコアの低いものは近
縁関係にある分子として同定される。
検索の結果は、完全長配列、又はその部分が存在するライブラリー、配列の存
在量（abundance）、及びパーセント存在量（percent abundance）のリストとし
て報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映し、パーセント存
在量は、存在量をライブラリー内で検出された配列の総数で除したものである。
５ ＨＧＰＧをコードする配列の延長
配列番号：２の核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を完全長まで延長するた
め、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを設計するために用いることができる。一方のプライマーはアンチセンス
方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方のプライマーはセンス方
向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、
周知のＨＧＰＧ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレ
オチド配列を含むアンプリコンを生成できるようになった（１９９５年６月７日
出願の米国特許出願第08/487,112号を本明細書と一体に参照されたい）。初期プ
ライマーは、Oligo(登録商標)4.06(National Biosciences社、Plymouth MN)、或
いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５０％以
上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするよ
うに設計することができる。結果的にヘアピン構造及びプライマー−プライマー
二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延長はが回避される。
元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて、
配列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ
。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加の
プライマーの組が設計される。
XL-PCRキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混合物と
を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プラ
イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合
、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社、Watertown MA）を
用いて、以下のパラメータで実行される。
ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性）
ステップ２ ６５℃で１分間
ステップ３ ６８℃で６分間
ステップ４ ９４℃で１５秒間
ステップ５ ６５℃で１分間
ステップ６ ６８℃で７分間
ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復
ステップ８ ９４℃で１５秒間
ステップ９ ６５℃で１分間
ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間
ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復
ステップ１２ ７２℃で８分間
ステップ１３ ４℃（その温度を保持）
反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに
成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか
ら切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商標）（QIAGEN社）のような
市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌク
レオチドの延び出しを切
り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。
エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、
１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ
ンキュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある
）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地
（Sembrook J等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後
、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ）寒天（S
embrook J等、上記）上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから
無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々の
ウェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さ
らに後日、５μｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、
水で１：１０に希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。
ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件に従って行う。
ステップ１ ９４℃で６０秒間
ステップ２ ９４℃で２０秒間
ステップ３ ５５℃で３０秒間
ステップ４ ７２℃で９０秒間
ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復
ステップ６ ７２℃で１８０秒間
ステップ７ ４℃（そのまま保持）
ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ
ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。
６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、
ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０の
塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡ
フラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、５０ｐ
ｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの［γ-32Ｐ]アデノシン三リン酸（Amer
sham社，Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN（商標）
、Boston MA）とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチ
ドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製する。それ
ぞれ毎分１０7カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（Asel，Bgl
II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII;DuPont NEN（商標））の１つを用いて消
化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用
いる。
切断した各ＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（
Nytran Plus,Schleicher&Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーション
は４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロット
は、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムま
で段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMAT AR(登録商
標)フィルム（Kodak，Rochester NY）を、数時間かけてPhosphoimager cassette
（Molecular Dynamics，Sunnyvale CA）においてブロットに露光された後、ハイ
ブ
リダイゼーションパターンが視覚的に比較される。
７ アンチセンス分子
ＨＧＰＧをコードする配列或いはその任意の一部は、自然発生の配列のin viv
oまたはin vitro発現を抑制するために用られる。約２０塩基対からなるアンチ
センスオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラ
グメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。配列番号：２に示すよ
うなＨＧＰＧのコード化配列に基づく相補的なオリゴヌクレオチド用いて、自然
発生ＨＧＰＧの発現を抑制することができる。この相補的なオリゴヌクレオチド
を配列番号：２に示す最も独特な５’配列から設計し、これを用いてプロモータ
ーが結合するのを阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に
結合するのを阻害してＨＧＰＧ転写物の翻訳を抑制することができる。配列番号
：２のリーダー配列及び５’配列の適切な部分を用いることにより、効果的なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１図に示すヌクレオチドのなかの、ポリペ
プチドのシグナル配列または初めの方のコーディング配列に翻訳される領域全体
にわたる１５〜２０個のヌクレオチドを含むようになる。
８ ＨＧＰＧの発現
ＨＧＰＧの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、その
ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン
グ用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXL1-BlueMRF（商標）（Stratage
ne）においてＨＧＰＧを発現するのに用いる。クローニング部位の上流には、β
−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端メ
チオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら８つ
の残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの独特の
切
断部位を含むリンカーである。
単離されたＩＰＴＧトランスフェクト菌株を標準的な方法を用いて誘導するこ
とにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及
び完全長ＨＧＰＧからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は、後
の行う活性のアッセイにおいて直接用いることができる菌培地へのＨＧＰＧの分
泌を誘導する。
９ ＨＧＰＧの活性
好中球シグナル伝達経路におけるＣａ++の動員をモニタリングすることにより
、ＨＧＰＧをin vitroで容易にアッセイすることができる。好中球には精製され
たＨＧＰＧ、及びその発光特性がＣａ++の結合によつて変化するFURA-2又はBCEC
F（Universal Imaging Corp）のような蛍光染料を予め負荷する。次に、この細
胞にアロジェニック刺激を与えて、蛍光活性化セルソーターを用いてＣａ++の流
動を観察し定量する。Ｃａ++の流動の測定値を、通常状態の細胞とＨＧＰＧを予
め負荷した細胞との間で比較する。ＨＧＰＧ利用能が高いために起こる動員量の
上昇によって、発光が増加する。
１０ ＨＧＰＧ特異的抗体の産生
標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（Sambrook前出）を用いて実質的に精製されたＨＧＰＧを用いる。ＨＧ
ＰＧから翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて
解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には
周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用い
る。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切な
エピトープを選択するための解析法は、Ausubel FM等（上記）の論文に記載され
ており、第４図に示されている。
通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ
プチドシンセサイザーModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法ケミストリにより合成し、
Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ：
Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（
ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペ
プチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド
活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用い
てブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識され
たヤギ抗ＴクサギＩｇＧに反応させる。
１１ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＧＰＧの精製
自然発生ＨＧＰＧ或いは組換えＨＧＰＧは、ＨＧＰＧに対する特異的な抗体を
用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イ
ムノアフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）の
ような活性化クロマトグラフレジンとＨＧＰＧ抗体とを共有結合させることによ
り構成される。結合後、そのレジンを製造者の指示に従って、ブロックし洗浄す
る。
ＨＧＰＧを発現する細胞からの細胞分画を、周知の方法で調製する。別法では
、適当なシグナル配列を含む可溶性ＨＧＰＧを、細胞が増殖可能な培地に有用な
量だけ分泌させる
ＨＧＰＧを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨＧ
ＰＧを優先的に吸収できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオ
ン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＨＧＰＧ結合を切るような条
件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イ
オンのようなカオトロピックイオン）で溶離させ、ＨＧＰＧを回収する。
上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本
発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及
び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実
施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実
施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を
実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分
野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28
16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566
33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
33/566 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ
，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＵＳ
(72)発明者 マリー、リン・イー
アメリカ合衆国カリフォルニア州94028・
ポルトラバレー・ロストランコスロード
1124