JP2001346577A - Human lactoferrin expression plasmid and transformant cell of genus bacteroides having the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a human lactoferrin expression plasmid based on the fact that intake of a bacterium of the genus Bacteroides capable of producing lactoferrin as an anticarcinostatic substance controls carcinogenesis of the large intestine. SOLUTION: This plasmid is obtained by incorporating a human lactoferrin into a vector and is capable of expressing a human lactoferrin protein and/or a protein obtained by subjecting the protein to processing. The transformant cell of the genus Bacteroides has the plasmid. A composition for controlling carcinogenesis of the large intestine contains the cell as an active ingredient and is used, for example, in the state of a food and a beverage.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトラクトフェリ
ン発現プラスミド、これを保有するバクテロイデス属形
質転換体及びその用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a human lactoferrin expression plasmid, a Bacteroides transformant carrying the same and a use thereof.

【０００２】[0002]

【従来の技術】腸内フローラは、食品の消化吸収や薬
物、毒物の代謝に関与しており、腸管には胆汁や膵液中
の酵素も流入していて、腸内菌が主体の腸内容物は生体
にとって一種の「臓器」として重要な働きをしていると
考えることができる。また、該腸内フローラの変化は、
種々の疾病の発症や薬物による毒性発現に関与している
と考えられており（Nakayama, H., et al., Pharmacoge
netics, 7, 35-43 (1997)）、発癌との関係も注目され
つつある。2. Description of the Related Art Intestinal flora is involved in digestion and absorption of foods and metabolism of drugs and toxic substances. Bile and enzymes in pancreatic juice also flow into the intestinal tract. Plays an important role as a kind of “organ” for living organisms. The change in the intestinal flora is
It is thought to be involved in the development of various diseases and the development of toxicity by drugs (Nakayama, H., et al., Pharmacoge
netics, 7 , 35-43 (1997)), and its relationship with carcinogenesis is also attracting attention.

【０００３】近年、上記の如き腸内フローラに関する研
究の進展に伴って、一部の人々は、健康を維持するため
に宿主に有益に働く生菌添加物、例えば乳酸菌等を積極
的に摂取する健康法を推奨、実行している。かかる方法
は、プロバイオティクスと呼ばれている。これは腸内フ
ローラのバランスを改善することで免疫刺激、抗癌作
用、抗変異原作用、抗酸化作用、生理活性作用などを通
じて宿主の生体ホメオスタシス維持を計るものである
（森下芳行、腸内細菌学雑誌、13, 53-66 (2000)）。[0003] In recent years, with the progress of research on the intestinal flora as described above, some people actively ingest live bacteria additives, such as lactic acid bacteria, which are beneficial to the host to maintain health. Recommend and implement health laws. Such a method is called probiotics. This is to improve the balance of intestinal flora and to maintain host homeostasis through immune stimulation, anticancer action, antimutagenic action, antioxidant action, bioactive action, etc. (Yoshiyuki Morishita, Enterobacteriaceae Journal, 13 , 53-66 (2000)).

【０００４】一方、大腸癌による死亡率は年々増加する
傾向にあり（Tominaga, S., et al., Int. J. Cancer,
10(supplement), 2-6, (1997)）、該大腸癌に対して予
防効果を持つ物質のスクリーニングが行なわれ、現在ま
でに、食物構成成分、生体防御物質などから種々の化学
予防物質が見出されている（Suaeyun, R., et al., Car
cinogenesis, 18, 949-955 (1997); Chewonarin, T., e
t al., Food Chem. Toxicol., 37, 591-601 (1999); Yo
o, T-C, et al., Jpn. J. Cancer Res., 88, 184-190
(1997)）。これらの物質のいくつかについては、その生
合成に関する遺伝子の同定、クローニングに成功してい
る（例えば、Yoo, T-C, et al., Jpn. J. Cancer Res.,
88, 184-190 (1997)等参照）。On the other hand, the mortality rate from colorectal cancer tends to increase year by year (Tominaga, S., et al., Int. J. Cancer,
10 (supplement), 2-6, (1997)), screening for substances that have a preventive effect on the colorectal cancer has been carried out. (Suaeyun, R., et al., Car
cinogenesis, 18 , 949-955 (1997); Chewonarin, T., e.
t al., Food Chem. Toxicol., 37 , 591-601 (1999); Yo
o, TC, et al., Jpn. J. Cancer Res., 88 , 184-190
(1997)). For some of these substances, the genes related to their biosynthesis have been successfully identified and cloned (for example, Yoo, TC, et al., Jpn. J. Cancer Res.,
88 , 184-190 (1997), etc.).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らも、上記現
状より、プロバイオティクス応用の一環として、腸内菌
が本来生産しない抗発癌物質を産生し得る腸内菌を遺伝
子工学的手法によって製造することができれば、該菌の
摂取によって、腸内フローラを改善でき、かくして例え
ば大腸癌などの予防ないし治療が可能となるとの新しい
着想から、鋭意研究を重ねた。SUMMARY OF THE INVENTION The inventors of the present invention have also developed, as a part of the application of probiotics, intestinal bacteria capable of producing anti-carcinogens that are not originally produced by intestinal bacteria by genetic engineering techniques. Intensive research has been conducted from the new idea that the intestinal flora can be improved by ingestion of the bacterium if the bacterium can be produced, thereby preventing or treating colon cancer, for example.

【０００６】その過程において、上記抗発癌物質として
ラクトフェリンに着目した。該ラクトフェリンは、従
来、母乳、涙、唾液、胆汁、膵液、多核白血球などに含
まれる糖タンパク質として知られており、また、抗菌作
用、防黴作用、免疫活性化作用、抗腫瘍作用、腸内細菌
叢改善作用や、化学大腸発癌物質（アゾキシメタン、Ａ
ＯＭ）によって誘発される大腸前癌病変であるＡＣＦ
（aberrant crypt foci）の形成を抑制する作用等が知
られている（Yoo, T-C, et al., Jpn. J. Cancer Res.,
88, 184-190 (1997); Sekine,K., et al., Cancer Let
t., 121, 211-216 (1997)）。In the process, lactoferrin was focused on as the above-mentioned anti-carcinogen. The lactoferrin is conventionally known as a glycoprotein contained in breast milk, tears, saliva, bile, pancreatic juice, polynuclear leukocytes, and the like, and also has an antibacterial action, an antifungal action, an immune activating action, an antitumor action, Bacterial flora improving effect and chemical colon carcinogens (azoxymethane, A
ACF, a precancerous colorectal lesion induced by OM)
(Aberrant crypt foci) is known to be inhibited (Yoo, TC, et al., Jpn. J. Cancer Res.,
88 , 184-190 (1997); Sekine, K., et al., Cancer Let.
t., 121 , 211-216 (1997)).

【０００７】その結果、上記ラクトフェリンの産生能を
有する腸内優勢菌であるバクテロイデス属菌を得るに成
功すると共に、該菌を摂取させるときには、腸内にラク
トフェリンが産生されて、腸内フローラが変化し、かく
して大腸発癌が抑制されるという事実を見出した。本発
明はかかる知見を基礎として完成されたものである。As a result, Bacteroides sp., Which is a predominant intestinal bacterium capable of producing lactoferrin, is successfully obtained, and when the bacterium is ingested, lactoferrin is produced in the intestine and the intestinal flora is altered. Thus, they found that colon carcinogenesis was suppressed. The present invention has been completed based on such findings.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒトラ
クトフェリン遺伝子をベクターに組み込んでなり、バク
テロイデス属宿主細胞によってヒトラクトフェリンタン
パク質及び／又はそのプロセッシングされたタンパク質
を発現することができるプラスミド、特にベクターがｐ
ＶＡＬ−１である上記プラスミドが提供される。According to the present invention, a plasmid comprising a human lactoferrin gene incorporated into a vector and capable of expressing a human lactoferrin protein and / or a processed protein thereof by a Bacteroides host cell, in particular, Vector is p
Provided above is a plasmid which is VAL-1.

【０００９】また本発明によれば、上記プラスミドを保
有するバクテロイデス属形質転換細胞、特にバクテロイ
デス属宿主細胞がバクテロイデス・ユニフォルミス（Ba
cteroides uniformis）ＢＵ１００１株又はＫＹＵ２株
である上記形質転換細胞が提供される。Further, according to the present invention, a Bacteroides transformed cell, particularly a Bacteroides host cell, carrying the above plasmid is transformed into Bacteroides uniformis ( Ba).
cteroides uniformis ) The above-mentioned transformed cell which is BU1001 strain or KYU2 strain is provided.

【００１０】更に本発明によれば、上記バクテロイデス
属形質転換細胞を有効成分として含有することを特徴と
する組成物、特に大腸発癌抑制及び／又は大腸菌増殖抑
制用である該組成物、並びに飲食品形態である上記組成
物が提供される。Further, according to the present invention, a composition comprising the above-described Bacteroides transformed cell as an active ingredient, particularly the composition for suppressing colon carcinogenesis and / or the growth of Escherichia coli, and food and drink. The composition is provided in the form.

【００１１】本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩
基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵ
Ｂの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等
の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分
野における慣用記号に従うものとする。また、ヒトラク
トフェリンｃＤＮＡの塩基配列及び該配列における塩基
番号は、特許第２７０１９７６号公報に記載のそれに従
うものとする。In the present specification, abbreviations for amino acids, peptides, base sequences, nucleic acids and the like are used in IUPAC and IUPAC.
The rules of B, “Guidelines for the preparation of a specification containing a base sequence or an amino acid sequence” (edited by the Patent Office), and commonly used symbols in the art shall be followed. In addition, the nucleotide sequence of human lactoferrin cDNA and the nucleotide numbers in the sequence are based on those described in Japanese Patent No. 2701976.

【００１２】[0012]

【発明の実施の形態】以下、本発明に係わるヒトラクト
フェリン発現プラスミド及びこれを保有する形質転換体
につき詳述する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, a human lactoferrin expression plasmid and a transformant carrying the same according to the present invention will be described in detail.

【００１３】本発明プラスミドは、上述した通り、ヒト
ラクトフェリン遺伝子を適当なベクターに組み込んでな
ることを必須とする。As described above, the plasmid of the present invention requires that the human lactoferrin gene be incorporated into an appropriate vector.

【００１４】ここでヒトラクトフェリン遺伝子として
は、例えば代表的には特許第２７０１９７６号公報に記
載の完全なｃＤＮＡ配列を用いることができるが、特に
これに限定されることなく、ヒトラクトフェリンタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列、これを含むもの、その天
然アレル変異体等であることができる。それらの例は米
国特許第５５７１６９１号、米国特許第５８４９８８１
号、国際公開ＷＯ９２／２１７５２号、国際公開ＷＯ９
５／３０３３９号等に記載されるとおりである。Here, as the human lactoferrin gene, for example, the complete cDNA sequence described in Japanese Patent No. 2701976 can be used, but is not particularly limited thereto, and encodes a human lactoferrin protein. It can be a DNA sequence, one containing it, a natural allelic variant thereof, or the like. Examples thereof are US Pat. No. 5,571,691 and US Pat. No. 5,849,881.
No., International Publication WO92 / 21752, International Publication WO9
5/30339 and the like.

【００１５】尚、完全なヒトラクトフェリンタンパク質
のアミノ酸配列は、７０３個のアミノ酸からなると報告
されており［Metz−Boutigue, et al., Eur.J.Bioche
m.,145巻,pp659−676（1984）;Anderson, et al., 「Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,84巻,pp1769−1773（1987年４
月）］、該ヒトラクトフェリンタンパク質の４２８−７
０３アミノ酸のクローン化ｃＤＮＡプローブも既に単離
されている［Radoら、、Blood,79巻,No.4,pp989−993
（1987年10月）］。It has been reported that the amino acid sequence of the complete human lactoferrin protein consists of 703 amino acids [Metz-Boutigue, et al., Eur. J. Bioche.
m., 145, pp659-676 (1984); Anderson, et al., "Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, pp1769-1773 (Apr. 1987
Month)], 428-7 of the human lactoferrin protein
A cloned cDNA probe of 03 amino acids has also been isolated [Rado et al., Blood, Vol. 79, No. 4, pp 989-993.
(October 1987)].

【００１６】また、本発明遺伝子には、ヒトラクトフェ
リンタンパク質のアミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至ア
ミノ酸配列を置換、欠失、付加等により改変してなり、
同様の機能を有する同効物をコードするポリヌクレオチ
ド配列もまた包含される。之等の改変（変異）は、天然
に生じることもあり、また翻訳後の修飾によってこれを
行なうこともできる。天然遺伝子の改変（変異）方法と
しては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシ
ス〔Methods in Enzymology, 154, p350, 367-382 (198
7); 同 100, p468 (1983); Nucleic Acids Research, 1
2, p9441 (1984); 続生化学実験講座１「遺伝子研究法I
I」、日本生化学会編, p105 (1986)〕等の遺伝子工学的
方法や、リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法等
の化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, p4801 (196
7); 同91, p3350 (1969); Science, 150, p178 (1968);
Tetrahedron Lett., 22, p1859 (1981); 同24, p245
(1983)〕による変異ＤＮＡの合成法等を採用することが
できる。The gene of the present invention is obtained by modifying a part of the amino acid sequence of the human lactoferrin protein by substitution, deletion, addition, or the like.
Polynucleotide sequences encoding the same with similar functions are also included. Such alterations (mutations) can occur naturally or can be achieved by post-translational modifications. As a method for modifying (mutating) a natural gene, for example, cytospecific mutagenesis [Methods in Enzymology, 154 , p350, 367-382 (198
7); id. 100 , p468 (1983); Nucleic Acids Research, 1
2 , p9441 (1984); Lecture on Sequent Chemistry Experiment 1
I ", edited by the Japanese Biochemical Society, p105 (1986)], and chemical synthesis means such as the phosphate triester method and the phosphate amidite method [J. Am. Chem. Soc., 89 , p4801 ( 196
7); the 91, p3350 (1969); Science , 150, p178 (1968);
Tetrahedron Lett., 22 , p1859 (1981); ibid. 24 , p245
(1983)].

【００１７】本発明に利用するヒトラクトフェリン遺伝
子は、公知の該遺伝子についての配列情報に従って、一
般的遺伝子工学的手法により容易に製造することができ
る〔Molecular Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor L
aboratory Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研
究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編 (1986)等参照〕。The human lactoferrin gene used in the present invention can be easily produced by a general genetic engineering technique according to known sequence information on the gene [Molecular Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor L.
aboratory Press (1989); see Seismic Chemistry Laboratory Course "Gene Research Methods I, II and III", edited by The Biochemical Society of Japan (1986), etc.).

【００１８】これは具体的には例えばヒトｃＤＮＡライ
ブラリー（所望遺伝子を保有する適当な起源細胞より常
法に従い調製されたもの）より、該遺伝子に特有の適当
なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択すること
により実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78,
6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)等〕。Specifically, for example, a desired cDNA is prepared from a human cDNA library (prepared from a suitable source cell having the desired gene by an ordinary method) using an appropriate probe or antibody specific to the gene. Natl. Acad. Sci. USA., 78 ,
6613 (1981); Science, 222 , 778 (1983), etc.].

【００１９】上記において、起源細胞としては、目的の
遺伝子を発現する各種の細胞、組織や之等に由来する培
養細胞等が例示され、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍ
ＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変換（合成）とその
クローニング等はいずれも常法に従い実施できる。ま
た、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明
においてはそれら市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等を
用いることもできる。In the above, examples of the source cell include various cells expressing the target gene, cultured cells derived from tissues and the like, and the separation of total RNA therefrom,
Isolation and purification of RNA, conversion to cDNA (synthesis), cloning thereof, and the like can all be carried out according to conventional methods. In addition, cDNA libraries are commercially available, and various commercially available cDNA libraries can be used in the present invention.

【００２０】ｃＤＮＡライブラリーからの所望遺伝子の
スクリーニングは、前記通常の方法に従い実施すること
ができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃＤ
ＮＡの産生するタンパク質に対して、該タンパク質特異
抗体を使用した免疫的スクリーニングにより、対応する
ｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に
選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダ
イゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等や之
等の組合せを例示できる。ここで用いられるプローブと
しては、所望遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報をもとに
して化学合成されたＤＮＡ配列等を用いるのが一般的で
あり、勿論既に確立された該遺伝子やその断片もかかる
プローブとして利用できる。Screening of the desired gene from the cDNA library can be carried out according to the above-mentioned usual method. The screening method includes, for example, cD
A method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using a protein-specific antibody for a protein produced by NA, plaque hybridization using a probe that selectively binds to a target DNA sequence, colony hybridization Hybridization and the like and combinations thereof can be exemplified. As the probe used here, it is common to use a DNA sequence or the like chemically synthesized based on information on the DNA sequence of the desired gene. Of course, the already established gene or a fragment thereof is also used as such a probe. Available.

【００２１】また、本発明に利用するヒトラクトフェリ
ン遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230,
1350-1354 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適
に利用できる。殊にライブラリーから全長のｃＤＮＡが
得られ難いような場合に、レース法（ＲＡＣＥ：Rapid
amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35-38
(1994)）、殊に５′−レース（５′−ＲＡＣＥ）法〔F
rohman,M.A., et al.,Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 8,
8998-9002 (1988)〕の採用が好適である。かかるＰＣＲ
法の採用に際して使用されるプライマーは、既知のヒト
ラクトフェリン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定す
ることができ、これは常法に従い合成することができ
る。In addition, when obtaining the human lactoferrin gene used in the present invention, the PCR method [Science, 230 ,
1350-1354 (1985)]. Particularly, when it is difficult to obtain a full-length cDNA from the library, the lace method (RACE: Rapid
amplification of cDNA ends; Experimental Medicine, 12 (6), 35-38
(1994)), especially the 5'-RACE method [F.
rohman, MA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8 ,
8998-9002 (1988)]. Such PCR
Primers to be used when the method is employed can be appropriately set based on sequence information of a known human lactoferrin gene, and can be synthesized according to a conventional method.

【００２２】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は、前記の通り常法、例えばゲル電気泳動法等に従
うことができ、また得られる所望遺伝子或は各種ＤＮＡ
断片等の塩基配列の決定も、常法、例えばジデオキシ法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (197
7)〕やマキサム−ギルバート法〔Method in Enzymolog
y, 65, 499 (1980)〕等に従うことができる。塩基配列
の決定は、また市販のシークエンスキット等を用いても
容易に行ない得る。The isolated DNA / RNA fragment can be isolated and purified by a conventional method such as gel electrophoresis as described above.
The nucleotide sequence of a fragment or the like can be determined by a conventional method, for example, the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74 , 5463-5467 (197
7)) and the Maxam-Gilbert method [Method in Enzymolog
y, 65 , 499 (1980)]. The determination of the nucleotide sequence can also be easily performed using a commercially available sequence kit or the like.

【００２３】本発明プラスミドは、上記ヒトラクトフェ
リン遺伝子を適当なベクターに組み込むことにより調製
できる。ここで、ベクターとしては、大腸菌とバクテロ
イデス属菌との間で機能し得るシャトルベクターを好適
に利用することができる。その例としては、ｐＥ５−２
（J. Bacteriology, 162, 626 (1980)）等を例示するこ
とができる。The plasmid of the present invention can be prepared by incorporating the above human lactoferrin gene into an appropriate vector. Here, as the vector, a shuttle vector that can function between Escherichia coli and Bacteroides bacteria can be suitably used. For example, pE5-2
(J. Bacteriology, 162 , 626 (1980)) and the like.

【００２４】特に好ましいベクターとしては、大腸菌と
バクテロイデス ユニフォルミス（Bacteroides unifor
mis）との間で使用できるシャトルベクターであるｐＶ
ＡＬ−１（J. Bacteriology, 170 (3), 1319 (1988)）
を例示することができる。[0024] Particularly preferred vectors, E. coli and Bacteroides Yuniforumisu (Bacteroides unifor
mis )) is a shuttle vector that can be used with pV
AL-1 (J. Bacteriology, 170 (3), 1319 (1988))
Can be exemplified.

【００２５】之等のベクターは、いずれも所望遺伝子を
発現させるための、プロモーター、ＳＤ（シヤイン・ア
ンド・ダルガーノ）配列、タンパク合成開始に必要な開
始コドン（例えばＡＴＧ）等を有している。特に必要で
はないが、利用するベクターには、かかるプロモーター
等の公知の各種の発現制御因子等を更に付与することも
できる。上記プロモーターとしては、例えばトリプトフ
ァン（trp） プロモーター、lpp プロモーター、lac プ
ロモーター、PL/PR プロモーター等を使用できる。Each of these vectors has a promoter for expressing a desired gene, an SD (Shine and Dalgarno) sequence, an initiation codon (eg, ATG) necessary for initiation of protein synthesis, and the like. Although not particularly required, various known expression control factors such as a promoter can be further added to the vector to be used. As the above promoter, for example, tryptophan (trp) promoter, lpp promoter, lac promoter, PL / PR promoter and the like can be used.

【００２６】また本発明プラスミドは、これをバクテロ
イデス属宿主細胞に組み込むことによって、所望のヒト
ラクトフェリン発現形質転換細胞を誘導することができ
る。The plasmid of the present invention can be used to induce a desired human lactoferrin-expressing transformed cell by incorporating it into a Bacteroides host cell.

【００２７】上記本発明プラスミド及び形質転換細胞の
調製は、基本的には、通常の遺伝子組換え技術〔例え
ば、Science, 224, p1431 (1984); Biochem. Biophys.
Res. Comm., 130, p692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA., 80, p5990 (1983)〕に従うことができる。The preparation of the plasmid of the present invention and the transformed cells is basically carried out by a conventional gene recombination technique [for example, Science, 224 , p1431 (1984); Biochem. Biophys.
Res. Comm., 130 , p692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA., 80 , p5990 (1983)].

【００２８】ここで宿主細胞としてのバクテロイデス属
菌としては、特にバクテロイデス・ユニフォルミスが好
ましい。該菌は大腸における常在菌であり、大腸に定着
する能力を有し且つヒトに対する病原性が極めて低いも
のである。これには、例えばＢＵ００６１株、ＢＵ１０
０１株、ＢＵ１００４株、ＢＵ１１００株、ＫＹＵ１
株、ＫＹＵ２株、ＡＴＣＣ８４９２株等が含まれる。
尚、上記ＢＵを付した株はイリノイ大学保存株であり、
ＫＹＵを付した株は杏林大学保健学部臨床分離株で、徳
島大学医学部細菌学教室にて保存されているものであ
り、また、ＡＴＣＣ８４９２株はアメリカンタイプカル
チャーコレクション保存株である。Here, as the Bacteroides bacterium as a host cell, Bacteroides uniformis is particularly preferred. The bacterium is a resident bacterium in the large intestine, has the ability to colonize the large intestine, and has extremely low pathogenicity to humans. This includes, for example, the BU0061 strain, BU10
01, BU1004, BU1100, KYU1
Strain, KYU2 strain, ATCC 8492 strain and the like.
The strain with the BU is a University of Illinois stock,
The strain with KYU is a clinical isolate from Kyorin University School of Health, which is stored in the Department of Bacteriology, School of Medicine, Tokushima University, and the ATCC 8492 strain is an American Type Culture Collection stock.

【００２９】特に好ましい宿主細胞としては、ＢＵ１０
０１株（J. Bacteriology, 162, 626 (1985)）及びＫＹ
Ｕ２株を挙げることができる。A particularly preferred host cell is BU10
01 (J. Bacteriology, 162, 626 (1985)) and KY
U2 strain can be mentioned.

【００３０】かくして、所望の本発明形質転換細胞を得
ることかできる。該形質転換細胞は、勿論、これを常法
に従い宿主細胞に応じて慣用される適当な培地中で培養
することによって、目的の組換えヒトラクトフェリンタ
ンパク質を、形質転換細胞の細胞内、細胞外乃至は細胞
膜上に発現、生産、蓄積乃至分泌できる。Thus, a desired transformed cell of the present invention can be obtained. The transformed cells are, of course, cultured in a suitable medium commonly used depending on the host cells according to a conventional method, whereby the recombinant human lactoferrin protein of interest can be intracellularly, extracellularly or intracellularly transformed cells. Can be expressed, produced, accumulated or secreted on the cell membrane.

【００３１】特に本発明によれば、上記形質転換細胞
は、腸内優勢菌であることから、該形質転換体をヒトに
摂取させることによって、これを摂取したヒトの腸内に
おいて、上記組換えヒトラクトフェリンタンパク質を発
現、産生し得、かくして、腸内フローラを改善して、そ
の特有の、例えば大腸発癌抑制作用を発揮し得る。In particular, according to the present invention, since the above transformed cell is a predominant intestinal bacterium, by ingesting the transformant into a human, the above recombinant cell is introduced into the intestine of a human who has taken the transformant. The human lactoferrin protein can be expressed and produced, thus improving intestinal flora and exerting its unique, eg, colon carcinogenesis inhibitory action.

【００３２】しかるに、ヒトラクトフェリンは、これを
母乳等からの抽出によって大量に得ることは非常に困難
であり、また近年の遺伝子工学的手法による大量生産は
可能であるが、かくして得られるヒトラクトフェリンと
いえども、その経口投与によれば、これが体内で消化、
分解されて、殆ど腸に到達しない不利がある。本発明
は、かかる欠点を悉く解消し得たものであり、その価値
は絶大である。However, it is very difficult to obtain human lactoferrin in large quantities by extracting it from breast milk or the like, and mass production by genetic engineering techniques in recent years is possible. However, according to its oral administration, this is digested in the body,
There is a disadvantage that it is decomposed and hardly reaches the intestine. The present invention has solved all such disadvantages, and its value is enormous.

【００３３】本発明は本発明形質転換細胞を有効成分と
して含有する組成物、特に大腸発癌抑制組成物及び大腸
菌増殖抑制組成物をも提供するものである。該組成物
は、本発明形質転換体を必須成分として含有し、摂取に
適した各種の形態、特に飲食品形態に調製され得る。か
かる形態としては、例えば飲料の他、ジェル、ペースト
状等の半固形食品、凍結乾燥粉末製剤等を例示できる。
かかる形態への調製は、慣用される各種の賦形剤、希釈
剤等の担体を用いて常法に従い実施することができる。
上記担体としては、可食性であれば特に限定されず、従
来よりよく知られている各種の食品原料をいずれも使用
することかできる。その例としては、例えばデンプン、
糖類等の炭水化物や、油脂、タンパク質等を挙げること
かできる。希釈剤の代表例は、水（飲料）であるが、こ
れに限定されることなく、従来より知られている各種飲
料に利用される種々の食品素材、例えば果汁、肉エキス
等を利用することもできる。The present invention also provides a composition containing the transformed cell of the present invention as an active ingredient, in particular, a composition for suppressing colon carcinogenesis and a composition for suppressing E. coli growth. The composition contains the transformant of the present invention as an essential component and can be prepared in various forms suitable for ingestion, particularly in the form of food and drink. Examples of such forms include beverages, semi-solid foods such as gels and pastes, and freeze-dried powder preparations.
Preparation into such a form can be carried out according to a conventional method using commonly used carriers such as excipients and diluents.
The carrier is not particularly limited as long as it is edible, and any of various conventionally known food materials can be used. Examples include starch,
Examples include carbohydrates such as sugars, fats and oils, and proteins. A typical example of the diluent is water (drink), but is not limited thereto, and various food materials used in various drinks known in the art, such as fruit juice and meat extract, may be used. Can also.

【００３４】本発明組成物の摂取は、該組成物の形態、
有効成分の配合量等や、所望の腸内フローラの改善効果
乃至大腸発癌抑制効果を考慮して適宜決定でき、特に制
限はない。通常１日成人１人当たり、有効成分としての
形質転換細胞が、１×１０¹²細胞前後摂取される量を目
安とすることができる。Ingestion of the composition of the present invention may be carried out in the form of the composition,
It can be appropriately determined in consideration of the compounding amount of the active ingredient, the desired effect of improving the intestinal flora or the effect of suppressing colon carcinogenesis, and is not particularly limited. Usually, the amount can be used as a guideline for the amount of transformed cells as an active ingredient ingested around 1 × 10 ¹² cells per adult per day.

【００３５】[0035]

【発明の効果】本発明によれば、新規なヒトラクトフェ
リン発現プラスミド、これを保有するバクテロイデス属
形質転換細胞及び該形質転換体を含む例えば大腸発癌抑
制組成物が提供され、該組成物の摂取によれば腸内フロ
ーラを改善して大腸癌の発症の予防乃至治療が可能とな
る。Industrial Applicability According to the present invention, there is provided a novel human lactoferrin expression plasmid, a Bacteroides transformed cell harboring the same, and a composition for suppressing colon carcinogenesis, for example, containing the transformant. According to this, the intestinal flora can be improved to prevent or treat colorectal cancer.

【００３６】[0036]

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。The present invention will now be described in further detail with reference to examples.

【００３７】[0037]

【実施例１】 (1) ヒトラクトフェリン発現プラスミドの調製 本プラスミドの調製の概略及びその制限酵素地図は、図
１に示すとおりであり、図１中の各略号は次のことを示
す。 Ａｐ及びＡｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子 Ｃｃ：クリンダマイシン(clindamycin)耐性遺伝子 Ｅｍ：エリスロマイシン(erythromycin)耐性遺伝子 Ｔｃ：テトラサイクリン(tetracyclin)耐性遺伝子 ｈＬＦ：ヒトラクトフェリンｃＤＮＡ ｌａｃＩ：lacリプレッサー遺伝子 ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子 ＯＲＩ：ColE1複製起点 ヒトラクトフェリンｃＤＮＡをpBluescript SK(-)(Stra
tagene社)にクローニングしたプラスミドｐＳＫＬＦ（D
eal-Yeul Yu博士；Research Institute of Bioscience
and Technology, Kribb Taejon, 韓国；より恵与、２１
３６ｂｐのヒトラクトフェリンｃＤＮＡを含有する）
を、制限酵素Bam HIとXho Iとで切断して、ヒトラクト
フェリンｃＤＮＡを含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を分
離した。Example 1 (1) Preparation of Human Lactoferrin Expression Plasmid The outline of the preparation of this plasmid and its restriction enzyme map are as shown in FIG. 1, and the abbreviations in FIG. 1 indicate the following. Ap and Amp: Ampicillin resistance gene Cc: Clindamycin resistance gene Em: Erythromycin resistance gene Tc: Tetracyclin resistance gene hLF: Human lactoferrin cDNA lacI: lac repressor gene lacZ: β-galactosidase gene ORI: ColE1 origin of replication Human lactoferrin cDNA was converted to pBluescript SK (-) (Stra
plasmid pSKLF (D
Dr. eal-Yeul Yu; Research Institute of Bioscience
and Technology, Kribb Taejon, South Korea;
Contains 36 bp human lactoferrin cDNA)
Was digested with restriction enzymes Bam HI and Xho I to isolate a DNA fragment of about 2.5 kb containing human lactoferrin cDNA.

【００３８】次に、シャトルベクターｐＶＡＬ−１（J.
Bacteriology, 170(3), 1319 (1988)）のBam HI-Sal I
部位に、上記ＤＮＡ断片をサブクローニングして、目的
の組換えベクターｐＶＬＦＫを得た。 (2) バクテロイデス・ユニフォルミスの形質転換 上記(1)で調製したプラスミドｐＶＬＦＫを用いて、先
ずヘルパープラスミドＲ７５１を有する大腸菌ＨＢ１０
１株を形質転換した。Next, the shuttle vector pVAL-1 (J.
Bacteriology, 170 (3), Bam HI- Sal I of 1319 (1988))
The above DNA fragment was subcloned into the site to obtain the target recombinant vector pVLFK. (2) Transformation of Bacteroides uniformis First, using the plasmid pVLFK prepared in the above (1), E. coli HB10 harboring the helper plasmid R751 was first used.
One strain was transformed.

【００３９】次に、得られた形質転換株をLuria-Bertan
i培地（日水製薬社）で、３７℃にて対数増殖前期まで
培養した。Next, the obtained transformant was transformed into Luria-Bertan
The cells were cultured at 37 ° C. in an i-medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) until the exponential growth phase.

【００４０】また、バクテロイデス・ユニフォルミスＢ
Ｕ１００１株（Bacteroides uniformis BU1001, VPI100
1株；J. Bacteriology, 162, 626 (1985)）をＧＡＭ培
地（日水製薬社）で、３７℃にて対数増殖前期まで培養
した。Also, Bacteroides Uniformis B
U1001 strain ( Bacteroides uniformis BU1001, VPI100
One strain; J. Bacteriology, 162 , 626 (1985)) was cultured in a GAM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 ° C until the exponential growth phase.

【００４１】続いて、それぞれの培養液を０．５ｍｌず
つ取り出して混合し、遠心（１２０００rpm、１分、室
温）した後、沈殿を０．１ｍｌのＧＡＭ培地中に懸濁し
た。この懸濁液をメンブランフィルター（０．４５μ
ｍ；ザルトリウス社製）上にスポットし、３７℃で一晩
好気的に培養した。フィルター表面上の菌を３ｍｌのＧ
ＡＭ培地を用いて洗い出し、この菌液を１０μｇ／ｍｌ
のエリスロマイシンを含むＧＡＭ寒天培地に塗沫し、３
７℃で４８時間嫌気培養して、本発明の形質転換細胞で
あるｐＶＬＦＫが伝達されたバクテロイデス・ユニフォ
ルミスＢＵ１００１株（ＴＣＴＫ１０１）を選択した。 (3) プラスミドの確認 上記（２）で調製した形質転換細胞ＴＣＴＫ１０１を、
アルカリ−ＳＤＳ法（Molecular Cloning: A Laborator
y Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaborator
y (1989)）で処理してプラスミドを抽出し、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動を行なったところ、ｐＶＬＦＫと
同サイズのバンドが検出された。Subsequently, 0.5 ml of each culture was taken out, mixed, centrifuged (12000 rpm, 1 minute, room temperature), and the precipitate was suspended in 0.1 ml of GAM medium. This suspension is passed through a membrane filter (0.45 μm).
m; Sartorius) and aerobically cultured at 37 ° C. overnight. 3 ml of G on the filter surface
Wash out using AM medium, and add 10 μg / ml
And spread on GAM agar medium containing erythromycin.
The cells were anaerobically cultured at 7 ° C. for 48 hours to select the Bacteroides uniformis BU1001 strain (TCTK101) to which the transformed cell of the present invention, pVLFK, was transmitted. (3) Confirmation of plasmid The transformed cell TCTK101 prepared in the above (2) was
Alkali-SDS method (Molecular Cloning: A Laborator
y Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laborator
y (1989)), the plasmid was extracted, and subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis. As a result, a band having the same size as pVLFK was detected.

【００４２】また、抽出したプラスミドについて、キッ
ト（Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React
ion Kit; パーキンエルマー社製)及びアナライザー(Gen
eticAnalyzer ABI PRISM 310; パーキンエルマー社製)
を用いて塩基配列を調べた結果、ｐＶＬＦＫと同じ塩基
配列であることが確認された。 (4) ヒトラクトフェリン遺伝子発現の確認 上記（２）で得た形質転換細胞ＴＣＴＫ１０１並びにｐ
ＶＡＬ−１で形質転換したＢＵ１００１株の対数増殖中
期の菌体より、全ＲＮＡを抽出し、それぞれ５μｌを１
％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった後、Hybo
nd N＋nyron membrane(アマーシャム社製)に転写した。In addition, a kit (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React
ion Kit; PerkinElmer) and analyzer (Gen
(eticAnalyzer ABI PRISM 310; manufactured by PerkinElmer)
As a result of examining the nucleotide sequence using, it was confirmed that the nucleotide sequence was the same as that of pVLFK. (4) Confirmation of human lactoferrin gene expression The transformed cells TCTK101 and p
Total RNA was extracted from the cells in the mid-logarithmic growth phase of the BU1001 strain transformed with VAL-1, and 5 μl of each was extracted with 1 μl of each.
% On agarose gel, and
Transferred to nd N + nyron membrane (Amersham).

【００４３】ヒトラクトフェリン遺伝子の５’末端領域
（１−８１４位）のＰＣＲ産物をキット(DIG DNA Label
ing and Detection Kit; ベーリンガー社製)を用いてデ
ィゴキシゲニンでラベルし、バッファー(Rapid hybridi
zation buffer; アマーシャム社製中で２時間、５５℃
でハイブリダイズさせた。A PCR product of the 5 ′ terminal region (positions 1 to 814) of the human lactoferrin gene was prepared using a kit (DIG DNA Label).
ing and Detection Kit; Boehringer) and label with digoxigenin, buffer (Rapid hybridi
zation buffer; 55 hours at 55 ° C in Amersham
And hybridized.

【００４４】アルカリホスファターゼ結合抗ディゴキシ
ゲニン抗体と発色基質であるＣＳＰＤ（リン酸二水素
３−（５’−クロロ−４−メトキシスピロ［１，２−ジ
オキセタン−３，２’−トリシクロ［３，３，１，１
３，７］デカン］−４−イル）フェニル 二ナトリウム
塩；ベーリンガー社製）を用いてシグナルを検出した。
その結果、ＴＣＴＫ１００１株においては、予想される
サイズ（２．２ｋｂ）のバンドが観測されたが、ｐＶＡ
Ｌ−１で形質転換したＢＵ１００１株では当該バンドは
観測されなかった。よって、ＴＣＴＫ１０１株におい
て、ヒトラクトフェリン遺伝子が発現していることが確
認された。 (5) ヒトラクトフェリン産生の確認 (2)で調製した形質転換細胞ＴＣＫＴ１０１及び比較の
ためｐＶＡＬ−１で形質転換したＢＵ１００１株のそれ
ぞれの対数増殖中期の菌体を超音波破砕し、９００００
ｇで２０分間遠心して、その上清を１０％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルで電気泳動を行なった後（タンパク量
５ｍｇ相当）、エレクトロブロッティング法によりＰＶ
ＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜；BioRad社製）に転写
した。An alkaline phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody and a chromogenic substrate, CSPD (dihydrogen phosphate)
3- (5'-chloro-4-methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo [3,3,1,1
3,7] decane] -4-yl) phenyl disodium salt (Boehringer).
As a result, in the TCTK1001 strain, a band of the expected size (2.2 kb) was observed, but pVA
The band was not observed in the BU1001 strain transformed with L-1. Therefore, it was confirmed that the human lactoferrin gene was expressed in the TCTK101 strain. (5) Confirmation of human lactoferrin production The cells of the transformed cell TCKT101 prepared in (2) and the BU1001 strain transformed with pVAL-1 for comparison were subjected to ultrasonic disruption of the cells in the mid-logarithmic growth phase, respectively, for 90000.
After centrifugation at 20 g for 20 minutes, the supernatant was subjected to electrophoresis on a 10% SDS polyacrylamide gel (corresponding to a protein amount of 5 mg).
The image was transferred to a DF film (polyvinylidene fluoride film; manufactured by BioRad).

【００４５】このＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクでブロ
ッキングし、ウサギ抗ヒトラクトフェリン抗体とインキ
ュベートした後、結合した抗体を、アルカリホスファタ
ーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体とＣＳＰＤを用いて検
出した。その結果、ＴＣＴＫ１０１株の上清のみ、ヒト
ラクトフェリンと同じサイズのバンドが確認された。After blocking the PVDF membrane with 5% skim milk and incubating with a rabbit anti-human lactoferrin antibody, the bound antibody was detected using an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody and CSPD. As a result, a band having the same size as human lactoferrin was confirmed only in the supernatant of the TCTK101 strain.

【００４６】[0046]

【実施例２】実施例１において、バクテロイデス・ユニ
フォルミスＢＵ１００１株（Bacteroides uniformis BU
1001, VPI1001株；J. Bacteriology, 162, 626 (198
5)）に代えてバクテロイデス・ユニフォルミスＫＹＵ２
株を用いて、同様にして形質転換細胞ＴＣＴＫ１０２株
を調製した。Example 2 In Example 1, Bacteroides uniformis BU1001 strain ( Bacteroides uniformis BU100) was used.
1001, VPI1001 strain; J. Bacteriology, 162 , 626 (198
5)) Instead of Bacteroides Uniformis KYU2
Using the strain, a transformed cell TCTK102 was prepared in the same manner.

【００４７】[0047]

【実施例３】(1) 本発明形質転換細胞の大腸菌の前癌病
変形成抑制効果 実施例１で調製した本発明形質転換細胞ＴＣＴＫ１０１
株及び比較のためｐＶＡＬ−１で形質転換したＢＵ１０
０１株を、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＧ
ＡＭ培地で２３時間培養した。Example 3 (1) Effect of the transformed cells of the present invention on the formation of precancerous lesions in Escherichia coli TCTK101 transformed cells of the present invention prepared in Example 1
Strain and BU10 transformed with pVAL-1 for comparison
01 strain with G containing 10 μg / ml erythromycin.
The cells were cultured in an AM medium for 23 hours.

【００４８】５週齢の雄性Ｆ３４４ラットを本発明群、
比較群及びコントロール群の３群（各群５匹）に分け、
本発明群及び比較群には上記各形質転換細胞の培養液の
それぞれを飲料水として自由摂取させた。また、コント
ロール群には培養液の代わりに水を与えた。尚、培養液
は毎日調製し、新しいものと交換した。A 5-week-old male F344 rat was treated with the group of the present invention.
Divided into three groups (five animals in each group) of a comparative group and a control group,
In the present invention group and the comparative group, each of the culture solutions of the above transformed cells was freely taken as drinking water. The control group was given water instead of the culture solution. The culture was prepared daily and replaced with a new one.

【００４９】各群ラットに、実験開始１週目及び２週目
に、アゾキシメタンを１５ｍｇ／ｋｇとなるように皮下
投与し、５週間後にラットを屠殺して大腸を摘出した。Azoxymethane was subcutaneously administered to each group of rats at 15 mg / kg on the first and second weeks of the experiment, and after 5 weeks, the rats were sacrificed and the large intestine was removed.

【００５０】摘出大腸を１０％ホルマリンで２４時間固
定した後、０．２％メチレンブルーで染色して、光学顕
微鏡で大腸癌の前癌病変と考えられる異常腺窩病巣(abe
rrant crypt focus,ACF)の数を測定した。結果を平均値
として下記表１に示す。The isolated colon was fixed with 10% formalin for 24 hours, stained with 0.2% methylene blue, and observed under an optical microscope with an abnormal crypt foci (abe) which is considered to be a precancerous lesion of colon cancer.
rrant crypt focus (ACF) was measured. The results are shown in Table 1 below as average values.

【００５１】[0051]

【表１】 [Table 1]

【００５２】表１より、本発明群では比較群と比べてＡ
ＣＦの形成が有意に抑制されていることが明らかであ
る。From Table 1, it can be seen that the group of the present invention has a higher A than the comparative group.
It is clear that the formation of CF is significantly suppressed.

【００５３】また、実施例１で調製した本発明形質転換
細胞ＴＣＴＫ１０１株に代えて、実施例２で調製した本
発明形質転換細胞ＴＣＴＫ１０２株を用いて、上記と同
様の試験を行なった結果を下記表２に示す。尚、ＴＣＴ
Ｋ１０２株を用いた試験では、培養液ではなく、２３時
間培養後の菌体を生理食塩水に懸濁させて摂取させた。
また、コントロール群では生理食塩水を用いた。The same test as described above was carried out using the transformant TCTK102 of the present invention prepared in Example 2 in place of the transformant TCTK101 of the present invention prepared in Example 1 and the following results were obtained. It is shown in Table 2. In addition, TCT
In the test using the K102 strain, not the culture solution but the cells after culturing for 23 hours were suspended in physiological saline and ingested.
In the control group, physiological saline was used.

【００５４】[0054]

【表２】 [Table 2]

【００５５】この表２からも、本発明群では比較群と比
べてＡＣＦの形成が抑制される傾向にあることが明らか
である。 (2) 本発明形質転換細胞の大腸菌増殖抑制効果 ５×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌を、本発明形質転換細
胞ＴＣＴＫ１０１株（表中、「本発明群」という）又は
ｐＶＡＬ−１で形質転換したＢＵ１００１株（表中、
「比較群」という）と共存させて、３７℃に保温し、３
時間及び６時間後の大腸菌数を測定した。結果を下記表
３に示す。It is also apparent from Table 2 that the group of the present invention tends to suppress the formation of ACF as compared with the comparative group. (2) Escherichia coli growth inhibitory effect of the transformed cells of the present invention 5 × 10 ⁷ CFU / ml Escherichia coli was transformed with the transformed cells of the present invention, TCTK101 strain (referred to as “the present invention group” in the table) or pVAL-1. BU1001 strain (in the table,
(Referred to as “comparison group”) and incubated at 37 ° C.
The time and the number of E. coli after 6 hours were measured. The results are shown in Table 3 below.

【００５６】[0056]

【表３】 [Table 3]

【００５７】表３より、本発明群では比較群と比べて大
腸菌の増殖が抑制されていることが明らかである。従っ
て、本発明細胞が腸内フローラを良好に維持できること
が判る。From Table 3, it is apparent that the growth of Escherichia coli is suppressed in the group of the present invention as compared with the comparative group. Therefore, it is understood that the cells of the present invention can maintain the intestinal flora satisfactorily.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明プラスミドの調製の概略及び制限酵素地
図を示す。FIG. 1 shows an outline of preparation of a plasmid of the present invention and a restriction enzyme map.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８７ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B018 MD85 ME08 ME09 4B024 AA05 BA80 CA04 DA05 EA04 GA11 GA19 HA13 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA10 4B065 AA01X AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD15 CA24 CA41 4C084 AA06 AA13 CA53 MA52 NA05 ZB261 4C087 AA01 AA02 BC53 MA52 NA14 ZB26 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/02 (C12N 1/21 4C087 // A61K 38/00 C12R 1:01) (C12N 1/21 ( C12P 21/02 C C12R 1:01) C12R 1:01) (C12P 21/02 C12N 15/00 A C12R 1:01) A61K 37/02 F term (reference) 4B018 MD85 ME08 ME09 4B024 AA05 BA80 CA04 DA05 EA04 GA11 GA19 HA13 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA10 4B065 AA01X AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD15 CA24 CA41 4C084 AA06 AA13 CA53 MA52 NA05 ZB261 4C087 AA01 AA02 BC53 MA52 NA14 ZB26

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ヒトラクトフェリン遺伝子をベクターに組
み込んでなり、バクテロイデス属宿主細胞によってヒト
ラクトフェリンタンパク質及び／又はそのプロセッシン
グされたタンパク質を発現することができるプラスミ
ド。A plasmid comprising a human lactoferrin gene incorporated into a vector and capable of expressing a human lactoferrin protein and / or a processed protein thereof by Bacteroides host cells. 【請求項２】ベクターがｐＶＡＬ−１である請求項１に
記載のプラスミド。2. The plasmid according to claim 1, wherein the vector is pVAL-1. 【請求項３】請求項１又は２に記載のプラスミドを保有
するバクテロイデス属形質転換細胞。[3] A Bacteroides transformed cell having the plasmid according to [1] or [2]. 【請求項４】バクテロイデス属宿主細胞がバクテロイデ
ス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）ＢＵ１
００１株又はＫＹＵ２株である請求項３に記載の形質転
換細胞。4. Bacteroides host cell Bacteroides Yuniforumisu (Bacteroides uniformis) BU1
The transformed cell according to claim 3, which is a 001 strain or a KYU2 strain. 【請求項５】請求項３又は４に記載のバクテロイデス属
形質転換細胞を有効成分として含有することを特徴とす
る組成物。5. A composition comprising the Bacteroides transformed cell according to claim 3 as an active ingredient. 【請求項６】大腸発癌抑制及び／又は大腸菌増殖抑制用
である請求項５に記載の組成物。6. The composition according to claim 5, which is used for inhibiting colon carcinogenesis and / or inhibiting the growth of Escherichia coli. 【請求項７】飲食品形態である請求項５又は６に記載の
組成物。7. The composition according to claim 5, which is in the form of a food or drink.