JP2001340074A - セルラーゼ - Google Patents
セルラーゼInfo
- Publication number
- JP2001340074A JP2001340074A JP2001043663A JP2001043663A JP2001340074A JP 2001340074 A JP2001340074 A JP 2001340074A JP 2001043663 A JP2001043663 A JP 2001043663A JP 2001043663 A JP2001043663 A JP 2001043663A JP 2001340074 A JP2001340074 A JP 2001340074A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellulase
- cellobiose
- enzyme
- buffer
- bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
ーゼ、その製造法及び該セルラーゼを含有する洗浄剤組
成物。 【効果】 最適反応pHをpH10付近に有し、反応産
物の一つであるセロビオースに阻害されず、界面活性
剤、キレート剤耐性の新規酵素であり衣料用等の洗浄剤
用、バイオマス用、繊維処理用酵素として有用である。
Description
て有用なセルラーゼに関する。
り、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマ
スの代表的存在である。セルロースの構造はグルコース
が直鎖状にβ−1,4結合した巨大分子であるため、分
解によって燃料物質やより高付加価値の代謝物質へと変
換が可能である。そのためセルロースを分解する酵素と
してセルラーゼに関する研究並びにその反応産物の有効
利用が、世界中の研究機関において多岐にわたり行われ
ている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般的
に中酸性に最適反応pHを有し、結晶性セルロースを良
好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心と
なっている。
ルラーゼを生産することが見出されて(特公昭50−2
8515号公報)以来、セルラーゼの衣料用重質洗剤へ
の応用が可能となりアルカリセルラーゼ(特公昭60−
23158号公報、特公平6−30578号公報等)が
衣料用洗剤へ配合され、セルラーゼはプロテアーゼ、リ
パーゼ、アミラーゼと並ぶ洗剤用酵素としての地位を確
立してきた。
セルラーゼの最適反応pHは8〜9付近のものが多く、
衣料用重質洗剤のpHであるpH10以上では有効に作
用しない場合が多く見受けられる。また、反応生成物の
一つであるセロビオースによって酵素活性が阻害される
ということもセルラーゼの一般的な特徴の一つである
(例えば、Creuzetら、Biochimie,65, 149-156(198
3))。セルラーゼ活性が、その反応生成物であるセロビ
オースによって阻害されるため、セルロースをバイオマ
スとして有効に利用するためのオリゴ糖にまでの完全分
解には至らず有効利用が阻害されたり、繊維の精練に時
間がかかる等の課題が生じている。
って酵素活性が阻害されることがなく、さらに高アルカ
リ性領域に最適反応pHを有するセルラーゼを見出すこ
とにある。
らセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、
セロビオースによって酵素活性が阻害されることがな
く、且つ高アルカリ性領域に最適反応pHを有するセル
ラーゼを生産する微生物を見出した。
て阻害を受けないセルラーゼ及びその製造法を提供する
ものである。本発明のセルラーゼとしてはpH10にお
いてセロビオースによって阻害されず、むしろpH10
においてセロビオースにより活性化されるセルラーゼ、
特にアルカリ領域で最適反応pHを有するアルカリ性セ
ルラーゼが好ましい。また本発明のセルラーゼの加水分
解のタイプとしては、セルロースの非結晶領域にランダ
ムに作用し種々のオリゴ糖を生成するエンド型が好まし
い。
リセルラーゼが好ましい。 1.作用:カルボキシメチルセルロースを液化型で分解
する。反応生成物であるセロビオースによって阻害され
ず、pH10においてセロビオースにより活性化され
る。 2.基質特異性:カルボキシメチルセルロース、リケナ
ン、結晶性セルロース、セロトリオース以上のセロオリ
ゴ糖を分解し、還元糖を生成する。 3.最適反応pH:pH10付近(グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液)
質を有するアルカリセルラーゼが特に好ましい。 4.最適反応温度:55℃付近(pH10、グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液) 5.安定pH範囲:pH6〜11.5(30℃、60分
間) 6.耐熱性:55℃付近まで安定(pH7.5トリス−
塩酸緩衝液、15分間) 7.分子量:約50kDa(SDS電気泳動法) 8.等電点:約pH4.2(等電点電気泳動法) 9.アミノ末端配列:Asp−Asn−Ser−Val
−Val−Gly−Gln−Asn−Gly−Gln−
Leu−Ser−Ile
を培養し、その培養物から採取することにより製造され
る。かかるセルラーゼ生産菌としては、バチルス属に属
する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス
エスピー KSM−N252株が挙げられる。
株の菌学的性質) A 形態学的性質 (a)細胞の形及び大きさ:桿菌(0.4〜0.6×
3.2〜9.6μm) (b)多形性:無し (c)運動性:有り (d)胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無:楕円形、
0.6〜1.0×0.8〜1.4μm、準端位、膨潤有
り (e)グラム染色:不定、但し炭酸ナトリウム0.1重
量%(以下、単に%と記載する)を含むクリスタルバイ
オレット(CVT)寒天培地には生育しない。 (f)抗酸性:陰性
育せず (b)一般細菌用液体培地(pH6.8、培地1):生
育せず (c)一般細菌用寒天培地(pH6.5、培地2):生
育せず (d)一般細菌用寒天培地(pH8.5、培地2):生
育する なお、培地1はニュートリエントブロス(ディフコ)培
地2はニュートリエントアガー(ディフコ)で、指示量
添加し、培地1は希塩酸及び培地2は炭酸ナトリウムで
所定pHに調整した。
る。 (o)グルコースからのガス産生:陰性 (p)塩化ナトリウム耐性:7%塩化ナトリウム存在下
で生育する。 (q)馬尿酸の加水分解:陰性 (r)4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロ
ニド(MUG)の加水分解:陰性 (s)糖の利用性:グルコース、アラビノース、キシロ
ース、マンニトール、ガラクトース、シュークロース、
マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース、
フラクトース、メリビオース、リボース、サリシン等を
炭素源として生育が認められる。グリセロール、ラムノ
ース、イノシトール、ソルビトールを炭素源として利用
できない。
52株は中性培地に生育しない好アルカリ性細菌であ
り、且つカタラーゼ陽性の有胞子桿菌であることから好
アルカリ性バチルス属細菌であると判断された。そこで
本菌株の形態学、生理学的性質についてNielsenらが新
たに分類した好アルカリ性バチルス属細菌の記載(Micr
obiology、141、1745-1761、1995)に準じ比較検討した
結果、本菌株はバチルスシュウドアルカロフィルスに近
縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知
のバチルス シュウドアルカロフィルスとは完全には一
致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないた
め、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生
命工学研究所へバチルス エスピー KSM−N252
(FERMP−17474)として寄託した。
等のセルラーゼ生産菌を用いて本発明のセルラーゼを生
産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の
必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あ
るいは通気攪拌培養すれば良い。なお、培地のpHは、
本発明のセルラーゼ生産に適したpHに炭酸ナトリウム
等を用いて調整すれば良い。
ゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことがで
きる。すなわち、培養物から遠心分離又は濾過すること
で菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、例え
ば塩析法、溶剤沈殿法、限外濃縮等により目的酵素を濃
縮することができる。塩析法の例として硫酸アンモニウ
ム(30〜90%飽和画分)、溶剤沈殿の例として冷ア
セトン(50%以上)等の条件下において酵素を沈殿さ
せた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧
乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、
セファデックスG−10等を用いるゲル濾過、限外濾過
等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾
燥粉末はそのまま用いることもできるがさらに公知の方
法により結晶化や造粒化することができる。
エスピー KSM−N252株由来のアルカリセルラ
ーゼは、以下のような性質を有する。尚、酵素活性の測
定は以下のように行った。
0.5Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH1
0.0)、0.4mLの2.5%(w/v)カルボキシメ
チルセルロース(A01MC;日本製紙)、0.4mLの
脱イオン水、0.1mLの適当に希釈した酵素液(希釈は
10mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5で行った)を加え
20分間反応させた後、1mLのジニトロサリチル酸試薬
(0.5%ジニトロサリチル酸、30%ロッシェル塩、
1.6%水酸化ナトリウム水溶液)を添加し、沸水浴中
で5分間還元糖の発色を行った。氷水浴中で急冷し、4
mLの脱イオン水を加え535nmにおける吸光度を測定し
還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加え
ずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた
後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意し
た。酵素1単位(1U)は、上記反応条件下において1
分間に1μmolのグルコース相当の還元糖を生成する量
とした。
2.5%アクリルアミドゲルを用いSDS電気泳動を行
った。標準タンパク質としてホスホリラーゼb(97.
4kDa)、血清アルブミン(67kDa)、卵白アルブミン
(45kDa)、カルボニックアンヒドロラーゼ(31kD
a)、トリプシンインヒビター(21.5kDa)、α−ラ
クトアルブミン(14.4kDa)を用い、それぞれの移
動度と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求
めたところ約50kDaと推定された。
いpH3.5〜9.5のPAGプレート(ファルマシ
ア)上で本酵素の等電点電気泳動を行った。泳動したゲ
ルをクマーシブリリアントブルーG−250により染色
した後、標準タンパク質の等電点と移動度から得た検量
線より本酵素の等電点を求めたところ、pH4.2付近
であると決定された。
インシークエンサー(476A;アプライドバイオシス
テム)によりアミノ末端から13番目までのアミノ酸配
列を調べた結果、Asp−Asn−Ser−Val−V
al−Gly−Gln−Asn−Gly−Gln−Le
u−Ser−Ileであった。
8)、トリス−塩酸緩衝液(pH7〜9)、グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液(pH8〜11)、炭酸緩衝液
(pH9〜11)、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH11〜12.5)の各緩衝液(50mM)を用いて
最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH10のグリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示
した。また、pH8から11の間で最大活性の80%以
上の活性を有していた(図1)。
中、30℃〜80℃の各温度で酵素反応を行い、最適反
応温度を調べた。その結果、本酵素は55℃付近に最適
反応温度を示し、それ以上の温度では失活した(図
2)。
8)、リン酸緩衝液(pH6〜8)、トリス−塩酸緩衝
液(pH7〜9)、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH8〜11)、炭酸緩衝液(pH9〜11)、ホウ
酸緩衝液(pH9〜11)、リン酸−水酸化ナトリウム
緩衝液(pH11〜12.5)の各緩衝液(50mM)中
に酵素を加え、30℃、30分間恒温した後、残存活性
を測定した。その結果、本酵素は処理前の活性を100
%とした場合、pH6〜11.5の範囲で極めて安定で
あった(図3)。
加し、30℃〜70℃の各温度で15分間恒温した後の
残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において5
5℃まで安定であった(図4)。
する分解速度を100%とした場合、リケナンに対して
368%と高い分解速度を示し、リン酸膨潤アビセルに
対し91%、キシランに対し20%の分解速度であっ
た。しかし、カードラン、ラミナリンについては全く分
解しなかった。パラニトロフェニル基誘導体のグルコシ
ドからセロテトラオシドについての分解反応は50mMグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.0)中にお
いて行った。その結果、本酵素はパラニトロフェニルセ
ロビオシド以上の基質を分解することができ、パラニト
ロフェニルセロビオシドでは44%、パラニトロフェニ
ルセロトリオシドでは117%、パラニトロフェニルテ
トラオシドでは110%の相対速度(pH8.0におけ
るカルボキシメチルセルロースに対する分解速度を10
0%とした場合)で分解した。また、不溶性セルロース
であるシグマセル101(シグマ)又はアビセルSF
(フナコシ)を基質とし、50mMリン酸緩衝液(pH
6.0)中で1時間分解させた結果、2%及び0.58
%の相対速度で分解した(pH6.0におけるカルボキ
シメチルセルロースに対する分解速度を100%とした
場合)。
0)、1.0%カルボキシメチルセルロース(A10M
C;日本製紙)から成る反応液をオストワルド粘度計
(No.3;柴田科学工業)に入れ、30℃で10分間
恒温した後、酵素を添加し全量を10mLとした。5から
30分後に粘度を測定し、また各時間で反応液を抜き取
り還元糖の生成量をジニトロサリチル酸法により調べ切
断量を算出した。その結果、図5に示したように本酵素
はカルボキシメチルセルロースをエンド形式で分解し
た。次にセロオリゴ糖(G1−G6)を基質として50
mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.0)中
で30℃、2時間分解反応を行った。その後、一定量を
薄層クロマトプレートにスポットし、ブタノール/エタ
ノール/脱イオン水=5/3/1(v/v)の溶媒系に
て展開を行った。糖スポットの検出にはアニスアルデヒ
ド−硫酸溶液を用いた。その結果、セロトリオース(G
3)からわずかであるがG2のスポットが、セロテトラ
オシド(G4)からG3、G2及びG1のスポットが、
セロペンタオシド(G5)からG3とG2のスポット
が、セロヘキサオキドからG5、G4、G3、G2及び
G1のスポットがそれぞれ検出された。従って、本酵素
はG3以上のセロオリゴ糖を分解しうることが判った。
0)、1.0%カルボキシメチルセルロース(A10M
C;日本製紙)、50〜100mMセロビオースから成る
反応液をオストワルド粘度計(No.3)に入れ、30
℃で10分間恒温した後、本酵素を添加し全量を10mL
とした。5から30分後に粘度を測定した結果、図6に
示したように本酵素は高濃度のセロビオース存在下にお
いて全く阻害されることなく、むしろ酵素活性が促進さ
れていた。一方、50mMグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液(pH9)、1.0%カルボキシメチルセルロー
ス、100mMセロビオースを添加した反応液に市販セル
ラーゼA、Bを添加した場合は、両セルラーゼ共に酵素
活性は阻害された(図7)。
加した反応系において、酵素の活性を測定した。その結
果、それぞれの界面活性剤の存在下において本酵素は極
めて安定に活性を発現しうることが判った(表1)。
リンを含む50mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で
30℃、30分間恒温した後、10倍に希釈し残存活性
を測定した。その後、標準活性測定法により残存活性を
調べた。その結果、本酵素はいずれのキレート剤に対し
ても極めて安定であった。
応を行った。その結果、本酵素は塩化コバルト及び塩化
第二鉄により10%程度活性化されることが判った。ま
た塩化水銀により約20%、塩化銅及び塩化カドミウム
により約10%阻害された。その他のマンガン、マグネ
シウム、亜鉛、ニッケル、アルミニウム、銅、ストロン
チウム、バリウム、鉛、バリウム、ベリリウム、パラジ
ウム等の金属イオンでは殆ど影響を示さなかった。
は、反応物の一つであるセロビオースに阻害されず、最
適反応pHを10付近に有し、界面活性剤、キレート剤
耐性の新規酵素であり、衣料用等の洗浄剤用、バイオマ
ス用、繊維処理用酵素として有用である。
の配合量はセルラーゼが活性を示す量であれば特に制限
されないが、洗浄剤組成物1kg当たり10〜100万
Uが配合できるが、経済性等を考慮し、10万U以下が
好ましく、さらに好ましくは1万U以下である。
有する洗浄剤組成物は、後記実施例2に示すように優れ
た洗浄力を有している。
物に用いる場合は、熱による失活あるいは分解を防ぐた
め特開昭62−257990号公報に記載の方法に基づ
き製造した顆粒を洗剤粒子製造後に混合することが好ま
しい。
ゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、
加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラー
ゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ
等である。このうち、プロテアーゼ、本発明以外のセル
ラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ア
ミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マ
ンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等
が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラー
ゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販の
アルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ
(以上、ノボザイム社)、プロペラーゼ、プラフェクト
(ジェネンコア社)、またKAP(花王)、等が挙げられ
る。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム(以
上、ノボザイム社)、またKAC(花王)、特開平10-3138
59号公報記載のバチルス・エスピーKSM-S237株が生産す
るアルカリセルラーゼ(花王)等が挙げられる。アミラ
ーゼとしてはターマミル、デュラミル(以上、ノボザイ
ム社)、プラスター(ジェネンコア社)、またKAM(花
王)、等が挙げられる。これらの酵素は0.001〜1
0%、好ましくは0.03〜5%配合される。
分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分として
は、例えば次のものが挙げられる。
に%で示す)配合され、特に粉末状洗剤組成物について
は10〜45%、液体洗剤組成物については20〜50%配
合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物が漂
白洗剤又は自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性
剤は一般に1〜10%、好ましくは1〜5%配合され
る。
性剤としては、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性
剤、両性界面活性剤、カチオン界面活性剤の1種または
組み合わせを挙げることができるが、好ましくはアニオ
ン界面活性剤、非イオン界面活性剤である。
18のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数8〜20のアル
コールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキル
ベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−
オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−ス
ルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好まし
い。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が10〜14の、
より好ましくは12〜14の直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩や
アミン類が好ましく、特にナトリウム及び/又はカリウ
ム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ま
しい。
アルキレンアルキル(炭素数8〜20)エーテル、アルキ
ルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル(炭
素数8〜20)フェニルエーテル、ポリオキシアルキレン
ソルビタン脂肪酸(炭素数8〜22)エステル、ポリオキ
シアルキレングリコール脂肪酸(炭素数8〜22)エステ
ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック
ポリマーが好ましい。特に、非イオン界面活性剤として
は、炭素数10〜18のアルコールにエチレンオキシドやプ
ロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを4〜20モル
付加した〔HLB値(グリフィン法で算出)が10.5〜15.
0、好ましくは11.0〜14.5であるような〕ポリオキシア
ルキレンアルキルエーテルが好ましい。
5〜40%配合される。本発明の洗浄剤組成物に用いら
れる二価金属イオン補足剤としては、トリポリリン酸
塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸
塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶
性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢
酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカ
ルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノ
ケイ酸塩(合成ゼオライト)が特に好ましく、A型、X
型、P型ゼオライトのうち、A型が特に好ましい。合成
ゼオライトは、平均一次粒径0.1〜10μm、特に
0.1〜5μmのものが好適に使用される。
配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称さ
れる炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びに
JIS1号、2号、3号などの非晶質のアルカリ金属珪
酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾
燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的
硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら
以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水
素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩な
どのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。ま
た、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記ア
ルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又は
トリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の
対イオンとしても使用できる
%配合される。本発明の洗浄剤組成物に用いられる再汚
染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸
系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマー
は再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体
粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。
カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イ
タコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、
コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合
したものが好適であり、分子量が数千〜10万のものが
好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリ
シジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロー
スなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸
などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉
剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テト
ラアセチルエチレンジアミン(TAED)や特開平6−
316700号公報記載などの漂白活性化剤(アクチベ
ーター)を0.01〜10%配合することができる。
ェニル型蛍光剤(例えばチノパールCBS−Xなど)や
スチルベン型蛍光剤(例えばDM型蛍光染料など)が挙
げられる。蛍光剤は0.001〜2%配合するのが好ま
しい。
ビルダー、柔軟化剤、還元剤(亜硫酸塩など)、抑泡剤
(シリコーンなど)、香料、その他の添加剤を含有させ
ることができる。
れたセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて
常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に
応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒な
どにすることができる。かくして得られる本洗浄剤組成
物は、衣料洗剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤など
として使用することができる。
合、以下のような洗浄剤組成物であることが特に好まし
い。界面活性剤を10〜50重量%(好ましくは15〜
45重量%)、水溶性無機物を10〜50重量%(好ま
しくは20〜40重量%)、及び水不溶性無機物5〜5
0重量%(好ましくは10〜40重量%)を含有する粒
子であって、水溶性無機物と水不溶性無機物の合計が4
0〜70重量%(好ましくは45〜65重量%)である
ような粒子を含む洗浄剤組成物。またこの粒子が水に溶
解する過程において粒子径の1/10以上の径の気泡を
粒子内部から放出し得る粒子であるような洗浄剤組成
物。
は(1)に記述したような様々な界面活性剤を用いるこ
とができる。また水溶性無機物としては、炭酸塩、炭酸
水素塩、硫酸塩、亜硫酸塩、硫酸水素塩、塩酸塩、又は
リン酸塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、又はア
ミン塩等の水溶性無機塩類や、クエン酸塩やフマル酸塩
等の低分子量の水溶性有機酸塩が挙げられる。水不溶性
無機物としては、1次粒子の平均粒径が0.1〜20μmの
ものが好ましく、例えば、結晶性もしくは非晶質のアミ
ノ珪酸塩や、二酸化珪素、水和珪酸化合物、パーライ
ト、ベントナイト等の粘土化合物等があるが、結晶性も
しくは非晶質のアルミノ珪酸塩や、二酸化珪素、水和珪
酸化合物が好適であり、中でも金属イオン封鎖能及び界
面活性剤の担持能の点で結晶性アルミノ珪酸塩が好まし
い。
リマーを0.5〜20重量%含有することが好ましく、
1〜15重量%がより好ましく、3〜10重量%が更に
好ましい。水溶性ポリマーとしては、ポリアルキレング
リコール、カルボン酸系ポリマー、カルボキシメチルセ
ルロース、可溶性澱粉、糖類等が挙げられるが、中でも
金属イオン封鎖能、固体汚れ・粒子汚れの分散能及び再
汚染防止能の点で分子量が数千〜10万のカルボン酸系
ポリマー及びポリエチレングリコールが好ましい。特
に、アクリル酸−マレイン酸コポリマーの塩、ポリアク
リル酸塩及びポリエチレングリコールが好ましい。ここ
で、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウ
ム塩が挙げられる。
で、表面被覆剤により表面改質を行うことが好ましい。
表面被覆剤は本粒子中1〜30重量%が好ましく、2〜
25重量%がより好ましく、5〜25重量%が更に好ま
しい。表面被覆剤としては、例えば、アルミノケイ酸
塩、ケイ酸カルシウム、二酸化ケイ素、ベントナイト、
タルク、クレイ、非晶質シリカ誘導体、結晶性シリケー
ト化合物等のシリケート化合物、金属石鹸、粉末の界面
活性剤等の微粉体、カルボキシメチルセルロース、ポリ
エチレングリコール、ポリアクリル酸ソーダ、アクリル
酸とマレイン酸のコポリマー又はその塩等のポリカルボ
ン酸塩等の水溶性ポリマー、脂肪酸が挙げられる。中で
も水不溶性無機物が好ましく、特に結晶性アルミノケイ
酸塩、非晶質アルミノケイ酸塩、結晶性シリケート化合
物が好ましい。
程において好ましくは粒子径の1/10以上、より好ま
しくは1/5以上、更に好ましくは1/4以上、特に好
ましくは1/3以上の径の気泡を放出する。気泡の放出
は、水に静置した状態にて溶解させた場合、120秒以
内に所定の大きさの気泡が発生することが好ましく、6
0秒以内がより好ましく、45秒以内が更に好ましい。
また、気泡の放出には、所定の大きさの気泡を放出可能
な気孔(単数個でも複数個でもよい)を有していればよ
く、特に粒子の形態、構造には限定されない。
解性の点で、水溶性無機物、水不溶性無機物及び要すれ
ば水溶性ポリマーを含有するスラリーを噴霧乾燥するこ
とによって得られたベース顆粒100重量部に、界面活
性剤5〜80重量部を担持させ、次いで表面被覆剤によ
り表面改質する製法が好ましい。
JIS K 3362により規定された方法で測定する
嵩密度は600g/L以上が好ましく、700g/L以
上がより好ましく、800g/L以上が更に好ましい。
また、溶解性の点で、嵩密度は1600g/L以下が好
ましく、1300g/L以下がより好ましく、1000
g/L以下が更に好ましい。
801の標準篩を用いて5分間振動させた後、篩目のサ
イズによる重量分率から求める平均粒径は150〜70
0μmが好ましく、より好ましくは150〜600μ
m、更に好ましくは180〜400μmである。また、
溶解性の点で177〜350μmの粒子が粒子中40重
量%以上が好ましく、より好ましくは50重量%以上で
ある。
50〜99.5重量%が好ましく、50〜98重量%が
より好ましく、60〜96重量%が更に好ましく、70
〜94重量%が特に好ましい。
分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布
した[カルボキシメチルセルロース(A10MC;日本
製紙)2.0%、肉エキス(オキソイド)1.0%、バ
クトペプトン(ディフコ)1.0%、塩化ナトリウム
1.0%、リン酸2水素カリウム0.1%、炭酸ナトリ
ウム0.5%(別滅菌)、トリパンブルー0.005%
(別滅菌)]。30℃の培養器で3日間静置培養し、生
育した菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に
伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングル
コロニー化を繰り返した。これらの菌株をポリペプトン
S(日本製薬)2.0%、魚肉エキス(和光純薬)1.
0%、リン酸1水素カリウム0.15%、酵母エキス
(ディフコ)0.1%、硫酸マグネシウム7水塩0.0
7%、カルボキシメチルセルロース0.1%、炭酸ナト
リウム0.5%(別滅菌)から成る液体培地を用いて3
0℃、3日間振盪培養を行った。セルラーゼを生産して
いる菌株を選択し、とりわけ高アルカリ性域で強力な活
性を示したセルラーゼ生産菌としてバチルス エスピー
KSM−N252株を取得した。
52株によるセルラーゼの生産 上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピ
ー KSM−N252株の培養は、500mL容坂口フラ
スコに100mLの培地[ポリペプトンS1.0%、魚肉
エキス0.5%、酵素エキス0.1%、リン酸1水素カ
リウム0.15%、硫酸マグネシウム7水塩0.07
%、グルタミン酸ナトリウム1.0%、ラクトース2.
0%、炭酸ナトリウム0.5%(別滅菌)]を加え、3
0℃、4日間好気的に行った。培地組成は、上記と同様
とした。その結果、約1200U/Lの生産性を得た。
心分離(8000×g、15分間、4℃)し上清液(2
L)を得た。これをモジュール(AIP−1300;旭
化成)により115mLまで濃縮した。濃縮液を予め10
mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)にて平衡化してお
いたDEAEトヨパール650Mカラム(5.5×18
cm;東ソー)に添着した。約1.5Lの平衡化緩衝液を
用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた後、0〜0.
4M塩化ナトリウムの濃度勾配法により吸着タンパク質
を溶出させた。0.1Mの塩化ナトリウム濃度付近に溶
出されたセルラーゼ活性を示す画分を集め(325m
L)、限外濾過(PM10メンブレン;アミコン)によ
り濃縮を行い25mLとした。次いで10mMリン酸緩衝液
(pH6.0)にて平衡化しておいたDEAE−Bio
−GelAカラム(2.5×24cm;バイオラッド)へ
添着し、約350mLの同緩衝液にて洗浄溶出を行った。
さらに0〜0.125M塩化カリウムを含む緩衝液(5
00mLずつ)を用い、濃度勾配法により吸着タンパク質
の溶出を行った。その結果、0.1〜0.125Mの塩
化カリウム濃度付近でアルカリセルラーゼが溶出され
た。この画分を集め限外濾過(PM10メンブレン)に
より濃縮を行った(25mL)。これを予め10mMトリス
−塩酸緩衝液(pH9.5)にて平衡化しておいたDE
AE−Bio−GelAカラム(2.5×11cm)に添
着し、0〜0.125M塩化カリウムを含む緩衝液(2
50mLずつ)を用い、濃度勾配法により吸着タンパク質
の溶出を行い、さらに0.125〜0.25M塩化カリ
ウムを含む緩衝液(250mLずつ)にて吸着タンパク質
の溶出を行った。その結果、0.18Mの塩化カリウム
濃度付近でセルラーゼが溶出され、この画分を集め限外
濾過(PM10メンブレン)により濃縮を行った(1.
5mL)。得られた濃縮液を0.1M塩化カリウムを含む
10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)により平衡化し
たBio−GelA05mカラム(1.5×75cm;バ
イオラッド)に掛けゲル濾過クロマトグラフィーを行っ
た。セルラーゼ活性を示す画分を集め(35mL)、予め
10mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて平衡化しておい
たハイドロキシアパタイトカラム(1.5×8cm)へ添
着した。セルラーゼはカラムに吸着することなく通過し
たがこの画分を濃縮しSDS電気泳動を行ったところ、
分子量約50kDaの均一なタンパク質バンドが検出され
た。以上の精製操作により本酵素は約1000倍に精製
され、活性収率は6%であった。ここで得られた精製セ
ルラーゼは、前述の酵素学的性質を示すアルカリ性セル
ラーゼであった。
用いて洗浄力試験を行った。即ち撹拌翼を有した1m3
の混合槽に水465kgを加え、水温が55℃に達した
後に、50%(w/v)ドデシルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム水溶液48kg、40%(w/v)ポリアクリ
ル酸ナトリウム水溶液135kgを添加した。15分間
撹拌した後に、炭酸ナトリウム120kg、硫酸ナトリ
ウム60kg、亜硫酸ナトリウム9kg、蛍光染料3k
gを添加した。更に15分間撹拌した後に、ゼオライト
300kgを添加し、30分間撹拌して均質なスラリー
を得た(スラリー中の水分は50重量%)。このスラリ
ーを噴霧乾燥塔の塔頂付近に設置した圧力噴霧ノズルか
ら噴霧することでベース顆粒を得た(噴霧乾燥塔に供給
する高温ガスは塔下部より温度が225℃で供給し、塔
頂より105℃で排出)。
重量%のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液
15重量部とポリエチレングリコール1重量部を70℃
になるように加熱混合し、混合液を作製した。レディゲ
ミキサー(松坂技研(株)製、容量20L、ジャケット
付)に上記ベース顆粒100重量部を投入し、主軸(1
50rpm)とチョッパー(4000rpm)の撹拌を
開始した。なお、ジャケットに75℃の温水を10L/
分で流し、そこに上記混合液を3分間で投入し、その後
5分間撹拌を行った。更にこの洗剤粒子群の粒子表面を
結晶性アルミノ珪酸塩10重量部で表面被膜を行い、最
終粒状洗剤を得た。
レックスF65(花王(株)製) 非イオン界面活性剤:エチレンオキサイド平均付加モル
数が8.5のエマルゲン108KM(花王(株)製) ポリアクリル酸ナトリウム水溶液:平均分子量1000
0(特公平2−24283号公報に実施例に記載の方法
に従って製造した) 炭酸ナトリウム:デンス灰(セントラル硝子(株)製) ゼオライト:平均粒径が3.5μmのゼオライト4A型
(東ソー(株)製) ポリエチレングリコール:K−PEG6000(平均分
子量8500,花王(株)製) 蛍光染料:チノパールCBS−X(チバガイギー社製)
いた。
90号公報記載の方法に基づき調製した(600U/
g)。
667%洗剤水溶液1Lを調製する。人工油脂汚染布5
枚(6×6cm)を洗剤水溶液に添加し、30℃、1時
間放置後、洗剤溶液と人工汚染布をそのまま、ターゴト
メーター用ステンレスビーカーに移し、ターゴトメータ
ーにて100rpm、30℃、10分間撹拌洗浄する。
人工汚染布を流水下で濯いだ後、アイロンプレスし反射
率測定に供した。洗浄率の算出は下式に従った。原布及
び洗浄前後の汚染布の550nmにおける反射率を自記
色彩系(島津製作所製)にて測定し、次式によって洗浄
率を算出した。 洗浄率=(洗浄後の反射率−洗浄前の反射率)/(原布
の反射率−洗浄前の反射率)×100
上記酵素を添加して洗浄力試験を行った。結果を表2に
示す。本発明洗浄剤組成物が優れた洗浄力を有している
ことが判る。
であるセロビオースに阻害されず、最適反応pHをpH
10付近に有し、界面活性剤、キレート剤耐性の新規酵
素であり衣料用等の洗浄剤用、バイオマス用、繊維処理
用酵素として有用である。
示す図である。
示す図である。
を示す図である。
を示す図である。
ルロース分解に伴う粘度低下と還元末端の生成量の関係
を示す図である。
ース存在下でのカルボキシメチルセルロース分解に伴う
粘度低下を示す図である。
ース存在下でのカルボキシメチルセルロース分解に伴う
粘度低下を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項1】 セロビオースによって阻害されないセル
ラーゼ。 - 【請求項2】 pH10において、セロビオースにより
活性化されるセルラーゼ。 - 【請求項3】 以下の酵素学的性質を有するセルラー
ゼ。 1.作用:カルボキシメチルセルロースを液化型で分解
する。反応生成物であるセロビオースによって阻害され
ず、pH10においてセロビオースにより活性化され
る。 2.基質特異性:カルボキシメチルセルロース、リケナ
ン、結晶性セルロース、セロトリオース以上のセロオリ
ゴ糖を分解し、還元糖を生成する。 3.最適反応pH:pH10付近(グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液) 4.最適反応温度:55℃付近(pH10、グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液) 5.安定pH範囲:pH6〜11.5(30℃、60分
間) 6.耐熱性:55℃付近まで安定(pH7.5トリス−
塩酸緩衝液、15分間) 7.分子量:約50kDa(SDS電気泳動法) 8.等電点:約pH4.2(等電点電気泳動法) 9.アミノ末端配列:Asp−Asn−Ser−Val
−Val−Gly−Gln−Asn−Gly−Gln−
Leu−Ser−Ile - 【請求項4】 請求項1〜3いずれか1項記載のセルラ
ーゼを生産する細菌を培養し、当該セルラーゼを採取す
るセルラーゼの製造法。 - 【請求項5】 セルラーゼを生産する細菌がバチルス属
細菌である請求項4記載のセルラーゼの製造法。 - 【請求項6】 バチルス属細菌が、バチルス エスピー
KSM−N252(FERM P−17474)であ
る請求項5記載のセルラーゼの製造法。 - 【請求項7】 請求項1〜3のいずれか1項記載のセル
ラーゼを含有する洗浄剤組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001043663A JP4402309B2 (ja) | 2000-02-25 | 2001-02-20 | セルラーゼ |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000050112 | 2000-02-25 | ||
JP2000-50112 | 2000-02-25 | ||
JP2001043663A JP4402309B2 (ja) | 2000-02-25 | 2001-02-20 | セルラーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001340074A true JP2001340074A (ja) | 2001-12-11 |
JP4402309B2 JP4402309B2 (ja) | 2010-01-20 |
Family
ID=26586152
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001043663A Expired - Fee Related JP4402309B2 (ja) | 2000-02-25 | 2001-02-20 | セルラーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4402309B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009189293A (ja) * | 2008-02-14 | 2009-08-27 | Asahi Kasei Chemicals Corp | セルラーゼ及びセロオリゴ糖の製造方法 |
WO2013133354A1 (ja) | 2012-03-08 | 2013-09-12 | 独立行政法人海洋研究開発機構 | 新規なセルラーゼ |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11503902A (ja) * | 1995-04-28 | 1999-04-06 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | アルカリセルラーゼおよびその製造方法 |
-
2001
- 2001-02-20 JP JP2001043663A patent/JP4402309B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11503902A (ja) * | 1995-04-28 | 1999-04-06 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | アルカリセルラーゼおよびその製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. BACTERIOL., 1986, 168(2), P.479-485, JPN6009038943, ISSN: 0001449956 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009189293A (ja) * | 2008-02-14 | 2009-08-27 | Asahi Kasei Chemicals Corp | セルラーゼ及びセロオリゴ糖の製造方法 |
WO2013133354A1 (ja) | 2012-03-08 | 2013-09-12 | 独立行政法人海洋研究開発機構 | 新規なセルラーゼ |
US9340811B2 (en) | 2012-03-08 | 2016-05-17 | Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | Cellulase |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4402309B2 (ja) | 2010-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4897186B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
JP4851093B2 (ja) | 洗剤組成物 | |
JP3112937B2 (ja) | アルカリ性バチルスーリパーゼ、これをコード化するdna配列およびこのリパーゼを生産するバチルス | |
JPH07504564A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
US7473544B2 (en) | Alkaline protease | |
US7429642B2 (en) | Alkaline protease | |
JPH06504199A (ja) | pH範囲にわたり分子荷電が低度に異なる突然変異体酵素 | |
CN102421893B (zh) | 碱性蛋白酶变体 | |
US5385837A (en) | Alkaline proteases derived from Bacillus proteolyticus | |
US5316691A (en) | Detergent composition containing an alkaline pullulanase from bacillus ferm BP-3048 | |
WO2011111836A1 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
US7405271B2 (en) | Alkaline protease | |
WO2022014428A1 (ja) | アミラーゼ配合洗浄剤組成物 | |
JP3534607B2 (ja) | 洗浄剤組成物 | |
CN100494364C (zh) | 碱性蛋白酶 | |
JP2001520043A (ja) | アミラーゼ酵素の産生方法 | |
JP3095786B2 (ja) | 悪臭除去のためのα―アミラーゼ類の組み合わせを含む洗剤組成物 | |
EP1764411B1 (en) | Alkaline xylanase | |
JP4382994B2 (ja) | 新規アルカリセルラーゼ | |
JP4402309B2 (ja) | セルラーゼ | |
JP4836701B2 (ja) | アルカリキシラナーゼ | |
CA2212456C (en) | Bacillus proteases | |
JP5202716B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
JP5698460B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
JP2651577B2 (ja) | アルカリセルラーゼe−▲iii▼ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070731 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20070731 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090804 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091005 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091027 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091029 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121106 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121106 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131106 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |