JP2001321193A - Method for roughly purifying human growth hormone - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for roughly but efficiently purifying a human growth hormone from the liquid extracted from microbial biomass containing the human growth hormone. SOLUTION: This method comprises the steps of adding low-molecular chitosan to the liquid extracted from microbial biomass capable of producing the human growth hormone to form aggregates to separate them, adding a salt of a transition metal to the obtained solution to form an insoluble complex in the solution, and collecting the complex.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト成長ホルモン
（以下、ｈＧＨという）を生産する微生物の菌体の抽出
液より、簡便にかつ効率よくｈＧＨを粗精製する方法に
関するものである。ｈＧＨは、下垂体不全性低身長症の
治療薬等として使用される有用な物質である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for simply and efficiently purifying hGH from an extract of cells of a microorganism that produces human growth hormone (hGH). hGH is a useful substance used as a therapeutic agent for pituitary insufficiency short stature and the like.

【０００２】[0002]

【従来の技術】成長ホルモンは、脳下垂体前葉から分泌
される代表的なペプチドホルモンであり、分子量約２２
０００のものおよび約２００００のものの、二種の存在
が知られている。この成長ホルモンは種々の生物がも
ち、生物毎に構造が違っていて生物的な種特異性が高
い。また成長ホルモンは幅広い生理作用をもつが、なか
でも成長ホルモン受容体と結合して成長促進活性を示す
作用のあることはよく知られている。2. Description of the Related Art Growth hormone is a typical peptide hormone secreted from the anterior pituitary gland and has a molecular weight of about 22%.
Two types are known, one of 000 and about 20,000. This growth hormone has various organisms, has a different structure for each organism, and has high biological species specificity. Although growth hormone has a wide range of physiological actions, it is well known that it has an action of binding to a growth hormone receptor and exhibiting a growth promoting activity.

【０００３】また一方、近年では組換えＤＮＡ技術の進
歩に伴い、ヒトの生体内に存在する生理活性物質や有用
タンパクの遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて形質
転換した微生物を大量培養することにより、有用物質を
生産することが可能になっている。そしてｈＧＨの場合
においても、ｈＧＨのＤＮＡ配列を適当なプロモーター
に接続し、この配列を発現ベクターに組み込んで宿主微
生物を形質転換して得られた組換え微生物を適当な培地
で培養し、微生物の菌体内、あるいは外膜と内膜の間の
ペリプラズム空間にｈＧＨを生産させることが可能にな
っている。On the other hand, in recent years, with the advance of recombinant DNA technology, a large amount of microorganisms transformed by using a plasmid into which a gene of a physiologically active substance or a useful protein existing in a living body is incorporated has been developed. It has become possible to produce useful substances. In the case of hGH, a recombinant microorganism obtained by connecting the DNA sequence of hGH to an appropriate promoter, incorporating this sequence into an expression vector and transforming a host microorganism is cultured in an appropriate medium, It has become possible to produce hGH in the cells or in the periplasmic space between the outer and inner membranes.

【０００４】このような組換え微生物からｈＧＨを精製
するには、一般に次のような方法が採用される。すなわ
ちまず、ｈＧＨを生産する組換え微生物を大量培養し、
該培養液から遠心分離等の方法で菌体を集め、これを凍
結融解する方法や、超音波破砕法、浸透圧ショック法等
の方法により、該微生物の細胞壁または細胞膜を破壊
し、ｈＧＨと共に微生物由来の種々のタンパクを多量に
含有する抽出液を得る。さらに、この抽出液から遠心分
離または膜分離等により菌体残さを除去し、次いで種々
の分離モード、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲ
ルろ過クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフ
ィ、疎水クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ等の
カラムクロマトグラフィの組合せにより、目的物質のｈ
ＧＨを精製する方法である。In order to purify hGH from such a recombinant microorganism, the following method is generally employed. That is, first, a large amount of a recombinant microorganism producing hGH is cultured,
The cells are collected from the culture by centrifugation or the like, and the cells are collected by freeze-thawing, ultrasonic crushing, osmotic shock, or the like, to destroy the cell wall or cell membrane of the microorganisms, and the microorganisms together with hGH are disrupted. An extract containing a large amount of various proteins derived from the extract is obtained. Further, cell residues are removed from the extract by centrifugation or membrane separation, and then various separation modes such as a combination of column chromatography such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and reverse phase chromatography. As a result, the target substance h
This is a method for purifying GH.

【０００５】上記カラムクロマトグラフィを組合せた方
法によりｈＧＨを精製する上では、ｈＧＨ以外の不純タ
ンパクを効率よく除去することが必要である。しかしな
がら、通常ｈＧＨを含む微生物菌体の抽出液には、多種
類の微生物菌体由来のタンパクが多量に含まれており、
これらは目的ｈＧＨ以外の不純タンパクである。これら
の不純タンパクの多くはクロマト担体に吸着する。この
クロマト担体の吸着容量は決まっているので、吸着する
不純タンパクが多いと、相対的にｈＧＨの吸着容量が低
下するため、結果として必要となるクロマト担体量は必
然的に多くなり、カラムサイズも大きくなってしまうこ
とになる。In purifying hGH by a method combining column chromatography, it is necessary to efficiently remove impurity proteins other than hGH. However, the extract of microbial cells containing hGH usually contains a large amount of proteins derived from various types of microbial cells.
These are impure proteins other than the target hGH. Many of these impurity proteins adsorb to the chromatographic carrier. Since the adsorption capacity of the chromatographic carrier is fixed, if the amount of impurity protein adsorbed is large, the adsorbing capacity of hGH is relatively reduced, and as a result, the amount of the chromatographic carrier required is inevitably increased, and the column size is also increased. It will be bigger.

【０００６】一般に、カラムクロマトグラフィに用いる
種々の緩衝液、カラム洗浄あるいはカラム再生用の水、
エタノール、アルカリ溶液、および塩溶液等は、クロマ
ト担体の容量に比例した量が使用される。したがって、
カラムサイズが大きくなる場合は、前記溶液類の使用量
も必然的に多くなり、その結果、原料費が増大し、ｈＧ
Ｈの製造コストが大きくなってしまうことになる。ま
た、使用する緩衝液等の量が多くなれば、当然ながら、
緩衝液等を調製する機器、および調製した緩衝液等を保
存する容器の体積も大きくなり、付随する設備に要する
金額も増大してしまうことが避けられない。In general, various buffers used for column chromatography, water for column washing or column regeneration,
Ethanol, alkali solution, salt solution and the like are used in an amount proportional to the volume of the chromatographic carrier. Therefore,
When the column size becomes large, the amount of the solution used inevitably increases, and as a result, the raw material cost increases and hG
The manufacturing cost of H will increase. Also, if the amount of buffer solution etc. to be used increases, naturally,
It is inevitable that the volume of the equipment for preparing the buffer solution and the like and the container for storing the prepared buffer solution and the like also increase, and the amount of money required for the associated equipment also increases.

【０００７】このような問題を解決する手段としては、
最初のカラムクロマトグラフィの前工程として、まずｈ
ＧＨの粗精製を行うことにより、ｈＧＨの純度をさらに
向上させるということが考えられ、このようにすれば、
その後の精製工程の簡略化が可能となる。すなわちこの
粗精製を行うことにより、カラムクロマトグラフィの数
が少なくできれば、製造コストが低減するので、非常に
有効な手段となるからである。ただ、この粗精製におけ
るｈＧＨの回収率が低い場合は、やはりｈＧＨの製造コ
ストが大きくなるため、なるべく不純物を除去してｈＧ
Ｈの純度を上げ、なおかつ収率よくｈＧＨを回収すると
いう、２つの条件を満足する方法が望まれる。Means for solving such a problem include:
Before the first column chromatography, h
It is conceivable that the purity of hGH is further improved by performing the crude purification of GH.
The subsequent purification step can be simplified. That is, if the number of column chromatography can be reduced by performing the crude purification, the production cost is reduced, which is a very effective means. However, when the recovery rate of hGH in the crude purification is low, the production cost of hGH also increases.
A method that satisfies the two conditions of increasing the purity of H and recovering hGH with high yield is desired.

【０００８】一般に、タンパクを粗精製する上では、タ
ンパクの溶解度差を利用する塩析や、有機溶媒による分
別沈殿の用いられることが多い。しかしながら、これら
一般的な方法を、上記したような、微生物の菌体の抽出
液よりｈＧＨを粗精製するのに適用した場合は、高純度
のものを得ようとすれば回収率が低下し、また、回収率
に重点をおく場合は取得ｈＧＨの純度が下がるという欠
点があることから、上記方法を工業的なｈＧＨの製造法
として採用する上では問題がある。現在のところ、この
ような問題を根本的に解決し得る粗精製の方法は知られ
ていない。In general, in crude purification of a protein, salting out utilizing a difference in solubility of the protein and fractional precipitation using an organic solvent are often used. However, when these general methods are applied to roughly purify hGH from an extract of the cells of a microorganism as described above, the recovery rate decreases if high purity is to be obtained, In addition, when the recovery rate is emphasized, there is a disadvantage that the purity of the obtained hGH is reduced. Therefore, there is a problem in employing the above method as an industrial method for producing hGH. At present, there is no known crude purification method that can fundamentally solve such a problem.

【０００９】また一方、この分野における類似技術とし
て、特開昭６３−２１６８９８号公報には、ソマトトロ
ピン（分子量約２２０００の成長ホルモン）を含む希薄
水溶液中より、該ソマトトロピンを回収する方法が開示
されている。これに開示されているのは粗精製方法では
なく、すでに精製されたソマトトロピンのみを含む希薄
水溶液から、該ソマトトロピンを回収する方法に関する
ものである。On the other hand, as a similar technique in this field, Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-216898 discloses a method for recovering somatotropin from a dilute aqueous solution containing somatotropin (growth hormone having a molecular weight of about 22,000). I have. The disclosure relates not to a crude purification method but to a method for recovering somatotropin from a dilute aqueous solution containing only purified somatotropin.

【００１０】つまり、上記特開昭６３−２１６８９８号
公報に開示されているのは、脳下垂体ホモジネートまた
は発酵培養液からソマトトロピンを精製した結果得られ
たソマトトロピンのみを含む希薄水溶液に、遷移金属の
塩を添加し、生成したソマトトロピンと遷移金属の不溶
性錯体を分離することにより、ソマトトロピンを回収す
る方法であって、前記したような、種々の不純タンパク
を含む微生物菌体抽出液からソマトトロピンを回収する
方法ではない。That is, Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 63-216898 discloses that a dilute aqueous solution containing only somatotropin obtained as a result of purifying somatotropin from a pituitary homogenate or a fermentation broth is prepared. A method for recovering somatotropin by adding a salt and separating the generated insoluble complex of somatotropin and a transition metal, and recovering somatotropin from a microbial cell extract containing various impurity proteins as described above. Not a way.

【００１１】しかしながら、上記公報記載の方法は、種
々の不純タンパクを含む微生物菌体の抽出液からｈＧＨ
を回収する方法としても有効である可能性が考えられた
ため、本発明者らは、ｈＧＨを含有する微生物菌体の抽
出液を対象として、上記特開昭６３−２１６８９８号公
報記載の方法を試みた。すなわち、ｈＧＨを含有する微
生物菌体の抽出液に遷移金属の塩を添加し、これにより
ｈＧＨの粗精製ができるか否かを試みた。しかしなが
ら、後述の実施例、特にその比較例１でも示すように、
この方法を、ｈＧＨを含有する微生物菌体の抽出液に対
して行う場合は、ｈＧＨの純度はほとんど向上せず、ま
たその回収率においても７０％未満の結果となり、到底
満足の得られるものではないことがわかった。[0011] However, the method disclosed in the above-mentioned publication discloses a method for extracting hGH from microbial cell extracts containing various impure proteins.
The present inventors have considered that the method may be effective as a method for recovering the microorganisms. Therefore, the present inventors have attempted the method described in JP-A-63-216898 for an extract of the microbial cells containing hGH. Was. That is, a transition metal salt was added to an extract of microbial cells containing hGH, and it was attempted whether or not hGH could be roughly purified. However, as shown in Examples described later, particularly Comparative Example 1,
When this method is performed on an extract of microbial cells containing hGH, the purity of hGH is hardly improved, and the recovery rate is less than 70%. I knew it wasn't.

【００１２】[0012]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｈＧＨを含
む微生物の菌体の抽出液より、ｈＧＨを効率よく粗精製
できる方法、すなわち、十分な収率をもって純度のよい
ｈＧＨを回収できる方法を提供することを目的とするも
のである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a method for efficiently purifying hGH from an extract of cells of a microorganism containing hGH, that is, a method for recovering high-purity hGH with a sufficient yield. It is intended to provide.

【００１３】[0013]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の目
的を達成するために鋭意検討した結果、まずｈＧＨを含
む微生物菌体の抽出液を低分子キトサン処理し、生じた
凝集物を分離した後、次いでこの溶液に遷移金属塩を加
える場合は、ｈＧＨが極めて効率よく回収でき、しかも
その純度も飛躍的に向上するものであることを見出し、
本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the above-mentioned object. As a result, first, an extract of microbial cells containing hGH was treated with low-molecular-weight chitosan, and the resulting aggregates were removed. When a transition metal salt is subsequently added to this solution after separation, it has been found that hGH can be recovered extremely efficiently, and that its purity is dramatically improved.
The present invention has been completed.

【００１４】すなわち、本発明は、 ｈＧＨを生産する微生物の菌体の抽出液に低分子キト
サンを添加し、凝集物を形成させてこれを分離した後、
得られた溶液に遷移金属塩を添加して液中に不溶性錯体
を形成させ、該錯体を回収することからなる、ｈＧＨの
粗精製方法でありまた、 微生物が組換え大腸菌である上記に記載の粗精製方
法であり、また、 遷移金属塩が、亜鉛塩または銅塩である上記または
に記載の粗精製方法である。That is, according to the present invention, a low molecular weight chitosan is added to an extract of cells of a microorganism producing hGH to form an aggregate, which is then separated.
A method for crude purification of hGH, comprising: adding a transition metal salt to the obtained solution to form an insoluble complex in the solution; and recovering the complex. It is a method for rough purification, wherein the transition metal salt is a zinc salt or a copper salt.

【００１５】[0015]

【発明の実施の形態】本発明でいうｈＧＨとは、組換え
微生物により生産されるｈＧＨであり、分子量約２００
００、または約２２０００のｈＧＨのものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The hGH referred to in the present invention is hGH produced by a recombinant microorganism and has a molecular weight of about 200.
00, or about 22,000 hGH.

【００１６】本発明における微生物としては、ｈＧＨを
生産する組換え微生物が用いられる。このような組換え
微生物は、一般に、ｈＧＨのＤＮＡ配列を適当なプロモ
ーター配列に接続し、この配列を発現ベクターに組み込
んで、宿主微生物を形質転換することにより得ることが
できる。宿主微生物としては、特に限定されないが、一
般には大腸菌、枯草菌等が用いられる。[0016] As the microorganism in the present invention, a recombinant microorganism producing hGH is used. Such a recombinant microorganism can be generally obtained by connecting the hGH DNA sequence to an appropriate promoter sequence, incorporating this sequence into an expression vector, and transforming a host microorganism. The host microorganism is not particularly limited, but Escherichia coli, Bacillus subtilis and the like are generally used.

【００１７】本発明において、ｈＧＨを生産する微生物
の菌体の抽出液とは、ｈＧＨを生産する組換え微生物を
培養し、次いでその菌体を遠心分離や膜分離等の方法に
より集めた後、次いでこれを凍結融解や超音波破砕、あ
るいは浸透圧ショック法等により、微生物の細胞壁また
は細胞膜を破壊し、得られる液をいう。In the present invention, the extract of the cells of the microorganisms that produce hGH refers to a culture of a recombinant microorganism that produces hGH, and then collecting the cells by a method such as centrifugation or membrane separation. Next, it refers to a liquid obtained by destroying the cell wall or cell membrane of a microorganism by freeze-thawing, sonication, or osmotic shock.

【００１８】また、本発明で用いられる低分子キトサン
は、天然のキチンから得られるキトサンの低分子のもの
であり、固有粘度０．０１〜５（ｄｌ／ｇ）、好ましく
は０．０３〜２（ｄｌ／ｇ）のものであって、例えば特
公平６−４１４７９号公報に記載のものである。また、
このような低分子キトサンは例えばクリムーバーＩ（商
品名、栗田工業（株）製）として市販されており、本発
明に有用である。The low molecular weight chitosan used in the present invention is a low molecular weight chitosan obtained from natural chitin, and has an intrinsic viscosity of 0.01 to 5 (dl / g), preferably 0.03 to 2 (dl / g). (Dl / g), for example, those described in Japanese Patent Publication No. 6-41479. Also,
Such a low-molecular-weight chitosan is commercially available, for example, as Cream Remover I (trade name, manufactured by Kurita Industry Co., Ltd.), and is useful in the present invention.

【００１９】本発明において、低分子キトサンはそのも
のの粉末状の形態で添加してもよいが、通常は、１〜１
０％（ｗ／ｖ）の水溶液として添加する方が好ましい。In the present invention, the low-molecular-weight chitosan may be added in the form of a powder as it is.
It is preferable to add as a 0% (w / v) aqueous solution.

【００２０】上記低分子キトサンの水溶液は、一般には
次のような方法で調製される。すなわちまず、低分子キ
トサンの必要量を水に懸濁し、よく攪拌しながら塩酸、
酢酸等の水溶液を添加することで低分子キトサンを溶解
させる。次いで水を添加し、最終容量を合わせること
で、目的とする濃度の低分子キトサン溶液を調製する。
最終容量を合わせる前に、水酸化ナトリウムや炭酸ナト
リウム等のアルカリ水溶液を添加することにより、低分
子キトサン溶液のｐＨを４〜６に調整しておいた方が好
ましい。The above aqueous solution of low molecular weight chitosan is generally prepared by the following method. That is, first, the required amount of low molecular weight chitosan is suspended in water, and hydrochloric acid,
The low molecular weight chitosan is dissolved by adding an aqueous solution such as acetic acid. Then, water is added and the final volume is adjusted to prepare a low-molecular-weight chitosan solution having a desired concentration.
Before adjusting the final volume, it is preferable to adjust the pH of the low molecular weight chitosan solution to 4 to 6 by adding an aqueous alkali solution such as sodium hydroxide or sodium carbonate.

【００２１】本発明において、上記のようにして調製さ
れた低分子キトサン溶液は、ｈＧＨを含む微生物菌体の
抽出液を適当なｐＨ、好ましくはｐＨ６〜８に調製した
後、少量ずつ添加する。In the present invention, the low molecular weight chitosan solution prepared as described above is added little by little after adjusting the extract of the microbial cells containing hGH to an appropriate pH, preferably pH 6 to 8.

【００２２】低分子キトサンは、通常０．０２％（Ｗ／
Ｖ）以上の濃度となるように添加する。低分子キトサン
の添加量は、菌体抽出液に含まれる菌体残さ、核酸、エ
ンドトキシン等の量に比例する。これらの含量は、組換
えｈＧＨ生産微生物の種類により異なる。また、低分子
キトサンを過剰量添加した場合には、ｐＨの低下等に伴
い、ｈＧＨの回収率が低下する場合がある。従って、低
分子キトサンの添加量が必要最小限となるように、予め
添加量を求めておくことが望ましい。例えば以下のよう
な方法で適正な添加量を求める。すなわち、少量の菌体
抽出液を分取し、適当なｐＨに調整した後、キトサンを
段階的な種々の添加量で添加する。次いで、遠心分離等
の方法で凝集物を除去してキトサン処理抽出液を得る。
このキトサン処理抽出液の濁度、または２６０ｎｍ（核
酸の吸収が最大となる波長）における吸光度が最低レベ
ルになる最小の添加量を求める。この点が、菌体抽出液
に含まれる菌体残さ、核酸、エンドトキシン等を除去可
能な必要最小限な低分子キトサンの添加量となる。次い
でこれをもとに、大容量の抽出液を必要最小限の低分子
キトサンを添加して処理するようにすればよい。The low molecular weight chitosan is usually 0.02% (W /
V) It is added so as to have a concentration of not less than. The amount of the low molecular weight chitosan added is proportional to the amount of cell residue, nucleic acid, endotoxin, etc. contained in the cell extract. These contents vary depending on the type of the recombinant hGH producing microorganism. When an excessive amount of low-molecular-weight chitosan is added, the recovery rate of hGH may decrease with a decrease in pH or the like. Therefore, it is desirable to determine the amount of the low molecular weight chitosan in advance so that the amount of the low molecular weight chitosan is minimized. For example, an appropriate addition amount is determined by the following method. That is, after a small amount of the cell extract is collected and adjusted to an appropriate pH, chitosan is added in various stepwise amounts. Next, aggregates are removed by a method such as centrifugation to obtain a chitosan-treated extract.
The turbidity of this chitosan-treated extract or the minimum amount of addition at which the absorbance at 260 nm (the wavelength at which the absorption of nucleic acids is maximum) is at a minimum level is determined. This point is the minimum necessary amount of low-molecular-weight chitosan that can remove cell residue, nucleic acid, endotoxin, etc. contained in the cell extract. Next, based on this, a large-volume extract may be treated by adding a necessary minimum amount of low-molecular-weight chitosan.

【００２３】本発明では、低分子キトサンを添加する
と、微生物菌体の抽出液を遠心分離等の方法で除去しき
れなかった菌体残さや核酸、およびエンドトキシン等が
低分子キトサンと結合し、不溶性の凝集物を形成して沈
殿し始める。このようにして形成した凝集物は、遠心分
離や精密ろ過膜による分離等の方法により、比較的容易
に除去することができる。In the present invention, when low-molecular-weight chitosan is added, cell residues, nucleic acids, endotoxin, etc., which cannot be completely removed by a method such as centrifugation, of the microbial cell extract, bind to the low-molecular-weight chitosan and become insoluble. Agglomerates form and begin to precipitate. Aggregates formed in this manner can be relatively easily removed by a method such as centrifugation or separation using a microfiltration membrane.

【００２４】次いで、本発明では、上記のようにして得
られる溶液を撹拌しつつ、これに遷移金属の塩を加え
る。遷移金属塩を添加することで、溶液中にｈＧＨの不
溶性錯体を含む沈殿を生じさせることができる。Next, in the present invention, a salt of a transition metal is added to the solution obtained as described above while stirring the solution. By adding a transition metal salt, a precipitate containing an insoluble complex of hGH can be generated in the solution.

【００２５】本発明において、上記遷移金属として好ま
しいものは亜鉛または銅である。またこれらの塩の形態
については特に制限はなく、具体的には硫酸塩、酢酸
塩、硝酸塩、塩酸塩等を挙げることができる。これらの
遷移金属の塩は粉末のままの形態で添加することもでき
るが、好ましくは水溶液として、少量ずつ添加すること
が望ましい。In the present invention, zinc or copper is preferred as the transition metal. The form of these salts is not particularly limited, and specific examples thereof include sulfates, acetates, nitrates, and hydrochlorides. These transition metal salts can be added in the form of a powder, but are preferably added little by little as an aqueous solution.

【００２６】遷移金属塩は通常、０．５ｍＭ以上の濃度
となるように添加する。しかしながら、必要な添加量
は、キトサン処理抽出液中のｈＧＨの含量、不純タンパ
クの種類や量によって影響される。添加量があまりにも
少ない場合はｈＧＨの回収率が低下する。また、添加量
が過剰な場合にはｈＧＨ以外の不純タンパクが多く沈殿
することになり、純度が低下する。従って、予備的に、
キトサン処理抽出液に段階的な種々の添加量で遷移金属
の塩を添加して粗精製し、得られる粗精製液の回収率と
純度を調べ、粗精製の後に実施するカラムクロマトグラ
フィ工程の精製効率を考慮して、適当な添加量の範囲を
決定しておくのが望ましい。The transition metal salt is usually added to a concentration of 0.5 mM or more. However, the required amount of addition is affected by the content of hGH in the chitosan-treated extract and the type and amount of the impure protein. If the addition amount is too small, the recovery rate of hGH will decrease. On the other hand, if the amount of addition is excessive, a large amount of impurity proteins other than hGH will precipitate, and the purity will decrease. Therefore, preliminary
The transition metal salt is added to the chitosan-treated extract in various stepwise amounts and the mixture is roughly purified. In consideration of the above, it is desirable to determine an appropriate range of the addition amount.

【００２７】本発明では、上記のようにして形成された
ｈＧＨを含む不溶性錯体は、しばらく静置すれば、その
不溶性錯体のほぼ全量が沈降するが、遠心分離、精密ろ
過膜による分離、あるいはろ過等の方法で、この不溶性
錯体の全量を容易に回収することができる。In the present invention, when the insoluble complex containing hGH formed as described above is allowed to stand for a while, almost all of the insoluble complex sediments. However, centrifugation, separation using a microfiltration membrane, or filtration. And the like, the entire amount of the insoluble complex can be easily recovered.

【００２８】上記のようにして回収したｈＧＨを含む沈
殿物は、回収してすぐにでも、あるいは−１０℃以下に
凍結保存しておいた後に、酸性またはアルカリ性の緩衝
液、またはエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を添
加することで、容易に再溶解することができる。The precipitate containing hGH recovered as described above may be recovered immediately after recovery or frozen and stored at -10 ° C. or lower, and then subjected to an acidic or alkaline buffer, ethylenediaminetetraacetic acid or the like. By adding a chelating agent of the formula (1), it can be easily redissolved.

【００２９】[0029]

【実施例】以下、本発明を具体的に説明するが、本発明
はこの例により何ら限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited by these examples.

【００３０】比較例１ 特開平８−３２２５８６号公報に記載のある、分子量約
２００００のｈＧＨを生産する組換え大腸菌（工業技術
院生命工学工業技術研究所寄託番号 ＦＥＲＭＢＰ−５
０２０）をペプトン、酵母エキス、グリセロール、コハ
ク酸、テトラサイクリンからなる培地で培養した。培養
した菌体を遠心分離により集め、浸透圧ショック法によ
り、抽出液を調製した。Comparative Example 1 Recombinant Escherichia coli producing hGH having a molecular weight of about 20,000 described in JP-A-8-322586 (Deposited number: FERMBP-5, Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)
020) was cultured in a medium consisting of peptone, yeast extract, glycerol, succinic acid and tetracycline. The cultured cells were collected by centrifugation, and an extract was prepared by an osmotic shock method.

【００３１】この菌体抽出液９０ｍｌに対し、２００ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を９ｍｌ添加し、抽
出液を３Ｎ苛性ソーダでｐＨ７．５に調整した。このｐ
Ｈ調整した抽出液のうち、２０ｍｌをマグネチックスタ
ーラーで攪拌しながら５００ｍＭのＺｎＳＯ₄の２ｍｌ
を一滴ずつ加え、沈殿を形成させた。液を４℃に１時間
静置した後、遠心分離して沈殿を集めた。For 90 ml of this cell extract, 200 m
9 ml of M Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added, and the extract was adjusted to pH 7.5 with 3N sodium hydroxide. This p
20 ml of the H-adjusted extract was stirred with a magnetic stirrer while stirring 2 ml of 500 mM ZnSO ₄ .
Was added dropwise to form a precipitate. After the solution was allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour, the precipitate was collected by centrifugation.

【００３２】得られた沈殿物に、１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８）を２０ｍｌと１００ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸（ｐＨ８）を２ｍｌ添加し、沈殿を溶解させ、
粗精製液を得た。To the obtained precipitate, 20 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) and 2 ml of 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid (pH 8) were added to dissolve the precipitate.
A crude liquid was obtained.

【００３３】抽出液と粗精製液のｈＧＨ濃度を酵素免疫
測定法により測定した。また、総タンパク量を表す指標
として２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果
を表１に示す。The hGH concentration of the extract and the crude solution was measured by an enzyme immunoassay. Further, the absorbance at 280 nm was measured as an index indicating the total protein amount. Table 1 shows the results.

【００３４】[0034]

【表１】 [Table 1]

【００３５】実施例１ 比較例１に記載と同様の方法により、特開平８−３２２
５８６号公報に記載の分子量約２００００のｈＧＨを生
産する組換え大腸菌（工業技術院生命工学工業技術研究
所寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０）の抽出液を調
製した。Example 1 By the same method as described in Comparative Example 1,
No. 586, an extract of recombinant Escherichia coli producing hGH having a molecular weight of about 20,000 (Deposit No. FERM BP-5020, National Institute of Bioscience and Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) was prepared.

【００３６】この菌体抽出液１００ｍｌに対し、２００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ添加
し、３Ｎ苛性ソーダでｐＨ７．５に調整した。ｐＨ調整
した抽出液をマグネチックスターラーで攪拌しながら、
５％低分子キトサン（栗田工業（株）製、商品名クリム
ーバーＩ）水溶液（ｐＨ４）を５．５ｍｌ滴下し、凝集
物を生成させ、そのまま１０分間攪拌を継続した。次い
で遠心分離して凝集物を除去し、キトサン処理抽出液を
得た。For 100 ml of the cell extract, 200
10 ml of mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added, and the pH was adjusted to 7.5 with 3N sodium hydroxide. While stirring the pH-adjusted extract with a magnetic stirrer,
5.5 ml of an aqueous solution (pH 4) of 5% low-molecular-weight chitosan (manufactured by Kurita Kogyo Co., Ltd., trade name: pH 4) was added dropwise to form aggregates, and stirring was continued for 10 minutes. Then, the aggregate was removed by centrifugation to obtain a chitosan-treated extract.

【００３７】このキトサン処理抽出液の２０ｍｌが量ら
れたものを４ケ用意し、これら各々をマグネチックスタ
ーラーで攪拌しながら、５００ｍＭのＺｎＳＯ₄、Ｚｎ
（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂、Ｚｎ（ＮＯ₃）₂、ＣｕＳＯ₄のいず
れか２ｍｌを一滴ずつ加え、沈殿を形成させた。各々の
液を４℃に１時間静置した後、遠心分離して沈殿を集め
た。Four 20 ml of this chitosan-treated extract were weighed, and each of them was stirred with a magnetic stirrer to obtain 500 mM ZnSO ₄ , ZnO ₄ .
Any 2 ml of (CH ₃ COO) ₂ , Zn (NO ₃ ) ₂ , or CuSO ₄ was added dropwise to form a precipitate. After leaving each liquid at 4 ° C. for 1 hour, the precipitate was collected by centrifugation.

【００３８】得られた沈殿物に、１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８）を２０ｍｌと１００ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸（ｐＨ８）を０．５ｍｌ添加し、沈殿を溶解さ
せ、粗精製液を得た。To the resulting precipitate, 20 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) and 0.5 ml of 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid (pH 8) were added, and the precipitate was dissolved to obtain a crude purified solution.

【００３９】抽出液と粗精製液のｈＧＨ濃度を酵素免疫
測定法により測定した。また、総タンパク量を表す指標
として、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結
果を表２に示す。The hGH concentrations of the extract and the crude solution were measured by an enzyme immunoassay. In addition, the absorbance at 280 nm was measured as an index indicating the total protein amount. Table 2 shows the results.

【００４０】表２に示す結果から、本発明の方法を用
い、ｈＧＨを生産する微生物の菌体の抽出液よりｈＧＨ
を粗精製する場合は、ｈＧＨの回収率および純度とも
に、前記比較例１に比し大きく向上することがわかる。From the results shown in Table 2, the extract of hGH-producing microorganism cells was extracted from the extract of hGH using the method of the present invention.
It can be seen that in the case of crude purification, both the recovery rate and purity of hGH are greatly improved as compared with Comparative Example 1.

【００４１】[0041]

【表２】 [Table 2]

【００４２】実施例２ 特願平１１−１９４５１０号に記載の、分子量約２００
００のｈＧＨを生産する組換え大腸菌（工業技術院生命
工学工業技術研究所寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９
０）をペプトン、酵母エキス、グリセロール、コハク
酸、テトラサイクリンから成る培地で培養した。培養し
た菌体を遠心分離により集め、浸透圧ショック法によ
り、抽出液を調製した。Example 2 A molecular weight of about 200 described in Japanese Patent Application No. 11-194510.
00 hGH-producing recombinant Escherichia coli (Deposit No. FERM BP-629, National Institute of Biotechnology and Industrial Technology)
0) was cultured in a medium consisting of peptone, yeast extract, glycerol, succinic acid and tetracycline. The cultured cells were collected by centrifugation, and an extract was prepared by an osmotic shock method.

【００４３】この菌体抽出液１００ｍｌに対し、２００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ添加
し、３Ｎ苛性ソーダでｐＨ７．５に調整した。ｐＨ調整
した抽出液をマグネチックスターラーで攪拌しながら、
５％低分子キトサン（栗田工業（株）製、商品名クリム
ーバーＩ）水溶液（ｐＨ４）を２．６４ｍｌ滴下し、凝
集物を生成させ、そのまま１０分間攪拌を継続した。次
いで遠心分離して凝集物を除去し、キトサン処理抽出液
を得た。For 100 ml of this cell extract, 200
10 ml of mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added, and the pH was adjusted to 7.5 with 3N sodium hydroxide. While stirring the pH-adjusted extract with a magnetic stirrer,
2.64 ml of an aqueous solution (pH 4) of 5% low-molecular-weight chitosan (manufactured by Kurita Kogyo Co., Ltd., trade name: pH4) was added dropwise to form aggregates, and stirring was continued for 10 minutes. Then, the aggregate was removed by centrifugation to obtain a chitosan-treated extract.

【００４４】このキトサン処理抽出液の２０ｍｌをマグ
ネチックスターラーで攪拌しながら、これに５００ｍＭ
のＺｎＳＯ₄の１ｍｌを一滴ずつ加え、沈殿を形成させ
た。液を４℃に２時間静置した後、遠心分離して沈殿を
集め、−２０℃に保存した。While stirring 20 ml of this chitosan-treated extract with a magnetic stirrer, add 500 mM
Of ZnSO ₄ was added dropwise to form a precipitate. After the solution was allowed to stand at 4 ° C for 2 hours, the precipitate was collected by centrifugation and stored at -20 ° C.

【００４５】上記より２日経過後、−２０℃に保存した
沈殿を取り出し、これに２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ
９）を１９ｍｌと１００ｍエチレンジアミン四酢酸（ｐ
Ｈ９）を２ｍｌ添加し、沈殿を溶解させ、粗精製液を得
た。Two days after the above, the precipitate stored at -20 ° C was taken out and added to a 20 mM borate buffer (pH
9) in 19 ml and 100 m ethylenediaminetetraacetic acid (p
H9) was added in an amount of 2 ml to dissolve the precipitate to obtain a crudely purified liquid.

【００４６】抽出液と粗精製液のｈＧＨ濃度を酵素免疫
測定法により測定した。また、総タンパク量を表す指標
として、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結
果を表３に示す。表３に示す結果から、本発明の方法を
用い、ｈＧＨを生産する微生物の菌体の抽出液よりｈＧ
Ｈを粗精製する場合は、ｈＧＨの回収率および純度とも
に、前記比較例１に比し大きく向上することがわかる。The hGH concentrations of the extract and the partially purified solution were measured by an enzyme immunoassay. In addition, the absorbance at 280 nm was measured as an index indicating the total protein amount. Table 3 shows the results. From the results shown in Table 3, using the method of the present invention, the extract of hGH-producing microorganism
When H is roughly purified, it can be seen that both the recovery rate and purity of hGH are greatly improved as compared with Comparative Example 1.

【００４７】[0047]

【表３】 [Table 3]

【００４８】[0048]

【発明の効果】以上のように、本発明の方法を採用する
場合は、ｈＧＨを生産する微生物の菌体の抽出液より、
非常に収率よくかつ高純度でｈＧＨを沈殿させることが
可能であり、従って、ｈＧＨを粗精製するのに極めて有
効な方法である。As described above, when the method of the present invention is employed, the extract of the cells of the microorganism that produces hGH
It is possible to precipitate hGH with very good yield and high purity, and therefore it is a very effective method for roughly purifying hGH.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒト成長ホルモンを生産する微生物の菌
体の抽出液に低分子キトサンを添加し、凝集物を形成さ
せてこれを分離した後、得られた溶液に遷移金属塩を添
加して液中に不溶性錯体を形成させ、該錯体を回収する
ことからなる、ヒト成長ホルモンの粗精製方法。1. A low molecular weight chitosan is added to an extract of a cell of a microorganism that produces human growth hormone to form an aggregate, which is separated, and then a transition metal salt is added to the obtained solution. A crude purification method of human growth hormone, comprising forming an insoluble complex in a liquid and recovering the complex. 【請求項２】 微生物が組換え大腸菌である請求項１に
記載の粗精製方法。2. The method according to claim 1, wherein the microorganism is a recombinant Escherichia coli. 【請求項３】 遷移金属塩が、亜鉛塩または銅塩である
請求項１または２に記載の粗精製方法。3. The method according to claim 1, wherein the transition metal salt is a zinc salt or a copper salt.