JP2001292792A - Method for recovering n-acetylglucosamine - Google Patents
Method for recovering n-acetylglucosamineInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、グルコースを含有
するＮ-アセチルグルコサミン溶液からＮ-アセチルグル
コサミンを回収する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for recovering N-acetylglucosamine from an N-acetylglucosamine solution containing glucose.
【０００２】[0002]
【従来の技術】N-アセチルグルコサミンは、動植物や微
生物の複合糖質、特にキチン、グリコサミノグリカン、
糖タンパク質、糖脂質等の構成成分として広く分布して
いる。2. Description of the Related Art N-acetylglucosamine is a complex carbohydrate of animals and plants and microorganisms, particularly chitin, glycosaminoglycan,
It is widely distributed as a constituent component of glycoproteins and glycolipids.
【０００３】N-アセチルグルコサミンはN-アセチルラク
トサミンの合成原料として用いられている。Ｎ-アセチ
ルラクトサミンは、人乳オリゴ糖やリポ多糖、各種糖タ
ンパク質及び糖脂質の糖鎖中に存在する生化学的に非常
に重要な二糖であり、腸内細菌の一種であるビフィズス
菌の増殖活性を有しており、優れた整腸作用を示すこと
から、育児用調製粉乳のような高度栄養食品への利用が
注目されている。さらに近年、N-アセチルラクトサミン
を含む複合糖質糖鎖の生理活性にも注目が集まってお
り、例えば、細胞接着阻害活性を有するシアリルLeX糖
鎖などの合成原料として注目されている。[0003] N-acetylglucosamine is used as a raw material for synthesizing N-acetyllactosamine. N-acetyllactosamine is a biochemically important disaccharide present in the sugar chains of human milk oligosaccharides, lipopolysaccharides, various glycoproteins and glycolipids, and is a kind of intestinal bacterium, Bifidobacterium Because of its proliferative activity and excellent intestinal regulation, its use in highly nutritional foods such as infant formula has attracted attention. Furthermore, in recent years, the physiological activity of complex carbohydrate sugar chains containing N-acetyllactosamine has also attracted attention. For example, it has been drawing attention as a raw material for synthesizing sialyl Le X sugar chains having cell adhesion inhibitory activity.
【０００４】このN-アセチルラクトサミンを合成する方
法としては、化学合成法と酵素合成法が知られている
が、一段階の反応で目的物質が得られることから、工業
規模での合成法としては専らβ-ガラクトシダーゼ又は
ガラクトシルトランスフェラーゼを使用する酵素合成法
の研究が広くなされている。このうち、β-ガラクトシ
ダーゼを使用する酵素合成法の多くは、反応原料として
Ｎ-アセチルグルコサミンとラクトースを含有する基質
を用いている方法である。この基質を用いた酵素反応終
了後の反応液中には、生成したＮ-アセチルラクトサミ
ンと共に未反応のＮ-アセチルグルコサミンや未反応の
ラクトース、それにグルコース等の反応副生成物が存在
している。この反応液からＮ-アセチルグルコサミンを
効率よく回収し、反応原料として再利用することは、環
境対策や工業規模でのＮ-アセチルラクトサミン製造の
コスト削減のために望まれている。As a method for synthesizing this N-acetyllactosamine, a chemical synthesis method and an enzyme synthesis method are known. However, since the target substance can be obtained by a one-step reaction, the synthesis method on an industrial scale is required. There has been extensive research on enzyme synthesis methods using exclusively β-galactosidase or galactosyltransferase. Among them, most of the enzyme synthesis methods using β-galactosidase are methods using a substrate containing N-acetylglucosamine and lactose as reaction raw materials. In the reaction solution after completion of the enzymatic reaction using this substrate, unreacted N-acetylglucosamine, unreacted lactose, and reaction by-products such as glucose are present together with the generated N-acetyllactosamine. . It is desired to efficiently recover N-acetylglucosamine from this reaction solution and reuse it as a reaction raw material for environmental measures and cost reduction of N-acetyllactosamine production on an industrial scale.
【０００５】また、グルコースはβ-ガラクトシダーゼ
のガラクトース転移活性を阻害する作用を示すことが知
られており、回収したＮ-アセチルグルコサミンをＮ-ア
セチルラクトサミン製造に再利用するには、可能な限り
グルコース含有率の低い、高純度なＮ-アセチルグルコ
サミンを得る必要がある。[0005] Further, glucose is known to have an action of inhibiting the galactose transfer activity of β-galactosidase, so that the recovered N-acetylglucosamine can be reused for N-acetyllactosamine production as much as possible. It is necessary to obtain high-purity N-acetylglucosamine having a low glucose content.
【０００６】しかしながら、従来用いられている活性炭
・セライトカラム等の工業的規模で利用可能なクロマト
グラフィーでは、単糖同士であるＮ-アセチルグルコサ
ミンとグルコースを分離することは困難であり、実際
に、上記Ｎ-アセチルラクトサミン製造により得られた
反応液から活性炭・セライトカラムにより分画したＮ-
アセチルグルコサミン画分には、約２０％のグルコース
が含まれている。このグルコースをさらに除去し、上記
Ｎ-アセチルラクトサミンの酵素合成等に再利用可能な
程度にグルコース含有率の低いＮ-アセチルグルコサミ
ンを得るためには、より煩雑な精製操作や高価な精製材
料を必要とする。[0006] However, it is difficult to separate N-acetylglucosamine and glucose, which are monosaccharides, from each other by chromatography that can be used on an industrial scale such as an activated carbon / celite column which is conventionally used. N-fractionated from the reaction solution obtained by the production of N-acetyllactosamine using an activated carbon / celite column
The acetylglucosamine fraction contains about 20% glucose. In order to further remove this glucose and obtain N-acetylglucosamine having a low glucose content such that it can be reused in the above-mentioned enzyme synthesis of N-acetyllactosamine, more complicated purification operations and expensive purification materials are required. I need.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、グル
コースを含有するＮ-アセチルグルコサミン溶液からＮ-
アセチルグルコサミンを回収する方法であって、Ｎ-ア
セチルグルコサミンを原料として用いる工業規模での物
質合成に使用可能なグルコース含有率の低いＮ-アセチ
ルグルコサミンを、簡便に、かつ低いコストで回収で
き、しかも環境に対し有益な方法を提供することを目的
とする。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, the present invention provides an N-acetylglucosamine solution containing glucose.
A method for recovering acetylglucosamine, wherein N-acetylglucosamine having a low glucose content, which can be used for substance synthesis on an industrial scale using N-acetylglucosamine as a raw material, can be recovered simply and at low cost, and The aim is to provide a beneficial way to the environment.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、グルコースを
含有するＮ-アセチルグルコサミン溶液に、グルコース
オキシダーゼを作用させ選択的にグルコースをグルコン
酸に変換すると、通常用いられる分離方法を用いて、簡
単に高純度なＮ-アセチルグルコサミンが得られること
を見出し、本発明を完成するに到った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, glucose oxidase is allowed to act on glucose-containing N-acetylglucosamine solution to selectively produce glucose. It has been found that high-purity N-acetylglucosamine can be easily obtained by conversion to gluconic acid using a commonly used separation method, and the present invention has been completed.
【０００９】従って本発明は、グルコースを含有するＮ
-アセチルグルコサミン溶液からグルコースを除去して
Ｎ-アセチルグルコサミンを回収する方法であって、前
記溶液をグルコースオキシダーゼで処理して、このよう
に処理したものからグルコースオキシダーゼ反応生成物
を分離除去することを特徴とする方法を提供する。[0009] Accordingly, the present invention relates to N-containing glucose-containing compounds.
A method for recovering N-acetylglucosamine by removing glucose from a -acetylglucosamine solution, comprising treating the solution with glucose oxidase and separating and removing a glucose oxidase reaction product from the treated product. A method of characterizing is provided.
【００１０】上記本発明の方法に用いられるグルコース
を含有するＮ-アセチルグルコサミン溶液としては、ラ
クトース及びＮ-アセチルグルコサミンを基質として用
いるＮ-アセチルラクトサミンの酵素合成において得ら
れた反応混合物を好ましく用いることができる。As the N-acetylglucosamine solution containing glucose used in the method of the present invention, a reaction mixture obtained in the enzyme synthesis of N-acetyllactosamine using lactose and N-acetylglucosamine as substrates is preferably used. be able to.
【００１１】上記Ｎ-アセチルラクトサミンの酵素合成
において得られた反応混合物からＮ-アセチルグルコサ
ミンを回収する場合、該反応混合物は、酵素合成反応
後、少なくともＮ-アセチルラクトサミンが分離除去さ
れていることが好ましく、酵素合成反応後に分取した単
糖類からなる画分であることが最も好ましい。When N-acetylglucosamine is recovered from the reaction mixture obtained in the enzyme synthesis of N-acetyllactosamine, at least N-acetyllactosamine is separated and removed from the reaction mixture after the enzyme synthesis reaction. It is preferable that the fraction be a fraction composed of monosaccharides collected after the enzyme synthesis reaction.
【００１２】上記本発明の方法に用いられるグルコース
オキシダーゼとしては、Aspergillus属又はPenicillium
属に属する微生物由来のグルコースオキシダーゼを好ま
しく使用することができ、特にAspergillus nigerに由
来するグルコースオキシダーゼを好ましく使用すること
ができる。[0012] Glucose oxidase used in the method of the present invention includes Aspergillus or Penicillium.
Glucose oxidase derived from a microorganism belonging to the genus can be preferably used, and glucose oxidase derived from Aspergillus niger can be particularly preferably used.
【００１３】上記本発明方法においては、前記溶液をグ
ルコースオキシダーゼ処理することによりグルコースを
グルコン酸に変換し、陰イオン交換樹脂処理により該処
理溶液からグルコン酸を分離除去してＮ-アセチルグル
コサミンを回収することが好ましい。In the method of the present invention, glucose is converted into gluconic acid by treating the solution with glucose oxidase, and gluconic acid is separated and removed from the treated solution by anion exchange resin treatment to recover N-acetylglucosamine. Is preferred.
【００１４】上記グルコースをグルコン酸に変換し、陰
イオン交換樹脂処理により溶液からグルコン酸を分離除
去してＮ-アセチルグルコサミンを回収する本発明方法
においては、純度が９０％以上のＮ-アセチルグルコサ
ミンを得ることができる。In the method of the present invention for converting glucose into gluconic acid and separating and removing gluconic acid from the solution by anion exchange resin treatment to recover N-acetylglucosamine, the method according to the present invention has a purity of 90% or more. Can be obtained.
【００１５】また本発明の別の形態として、上記本発明
方法により得られたＮ-アセチルグルコサミンとラクト
ースとをβ-ガラクトシダーゼ存在下において反応させ
ることを特徴とするＮ-アセチルラクトサミンの製造方
法が提供される。According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing N-acetyllactosamine, comprising reacting N-acetylglucosamine obtained by the method of the present invention with lactose in the presence of β-galactosidase. Provided.
【００１６】さらに、N-アセチルグルコサミンとラクト
ースとを、ラクトースからガラクトース残基をN-アセチ
ルグルコサミンに転移してN-アセチルラクトサミンを生
成する作用を有する酵素の存在下において反応させて、
該反応混合物を活性炭処理することによりN-アセチルグ
ルコサミン及びグルコースを含有する単糖画分を得、該
画分をグルコースオキシダーゼ処理し、生成したグルコ
ン酸を分離除去してN-アセチルグルコサミンを得る方法
が提供でき、これにより得られたN-アセチルグルコサミ
ンを含む溶液にラクトースを添加して上記N-アセチルラ
クトサミン合成反応に供することを特徴とするN-アセチ
ルラクトサミンの製造法が提供される。Further, N-acetylglucosamine and lactose are reacted in the presence of an enzyme capable of transferring a galactose residue from lactose to N-acetylglucosamine to produce N-acetyllactosamine,
A method of obtaining a monosaccharide fraction containing N-acetylglucosamine and glucose by treating the reaction mixture with activated carbon, treating the fraction with glucose oxidase, and separating and removing the produced gluconic acid to obtain N-acetylglucosamine. And a method for producing N-acetyllactosamine characterized by adding lactose to a solution containing N-acetylglucosamine obtained thereby and subjecting the solution to the above-mentioned N-acetyllactosamine synthesis reaction.
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】以下に本発明をさらに詳細に説明
する。本発明の方法に使用されるグルコースを含有する
Ｎ-アセチルグルコサミン溶液は、少なくとも両者を含
有する溶液であればよく、溶液の製造方法や由来は特に
限定されない。このような溶液は、Ｎ-アセチルグルコ
サミンをグルコースより多く含む溶液であることが好ま
しい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The glucose-containing N-acetylglucosamine solution used in the method of the present invention may be a solution containing at least both, and the method for producing the solution and the origin are not particularly limited. Such a solution is preferably a solution containing more N-acetylglucosamine than glucose.
【００１８】このような溶液としては、例えば、ラクト
ースとＮ-アセチルグルコサミンを基質とする酵素合成
によるＮ-アセチルラクトサミンの製造において得られ
る反応混合物を挙げることができる。この反応混合物と
は、該酵素合成によるN-アセチルラクトサミンの製造に
おいて得られるのであれば限定されない。通常、溶液だ
が、溶液から溶媒を除去した固体状のものでも良い。こ
の酵素合成によるＮ-アセチルラクトサミンの製造にお
いては、具体的には、ラクトースとＮ-アセチルグルコ
サミンを含有する基質溶液に、ラクトースからガラクト
ース残基をN-アセチルグルコサミンに転移する作用を有
する酵素を作用させ、Ｎ-アセチルラクトサミンを合成
する。反応終了後、通常、イオンクロマトグラフィー法
やゲル濾過分離法等により、N-アセチルラクトサミンを
分別除去した溶液を得たり、単糖画分のみを分取するこ
とにより、Ｎ-アセチルグルコサミンとグルコースを含
有する溶液を得ることができる。このような単糖画分は
通常７０〜９０モル％程度のＮ-アセチルグルコサミン
と１０〜３０モル％程度のグルコースを含んでいる。Examples of such a solution include a reaction mixture obtained in the production of N-acetyllactosamine by enzyme synthesis using lactose and N-acetylglucosamine as substrates. The reaction mixture is not limited as long as it is obtained in the production of N-acetyllactosamine by the enzyme synthesis. It is usually a solution, but may be a solid in which the solvent is removed from the solution. In the production of N-acetyllactosamine by this enzyme synthesis, specifically, an enzyme having an action of transferring a galactose residue from lactose to N-acetylglucosamine is added to a substrate solution containing lactose and N-acetylglucosamine. To synthesize N-acetyllactosamine. After completion of the reaction, N-acetylglucosamine and glucose are usually collected by obtaining a solution from which N-acetyllactosamine has been separated and removed by ion chromatography or gel filtration, or by collecting only the monosaccharide fraction. Can be obtained. Such a monosaccharide fraction usually contains about 70 to 90 mol% of N-acetylglucosamine and about 10 to 30 mol% of glucose.
【００１９】上記Ｎ-アセチルラクトサミンの酵素合成
において用いる、ラクトースからガラクトース残基をN-
アセチルグルコサミンに転移する作用を有する酵素とし
ては、そのような触媒作用を有するものであれば、その
存在形態や由来は限定されるものではなく、例えば精製
酵素、部分精製酵素等のいわゆる酵素そのものだけでは
なく、該酵素を含有する静止菌体、乾燥菌体、菌体破砕
物なども本発明における酵素の範疇である。このような
酵素として具体的には、Bacillus circulans等のBacill
us属微生物、Rhodotorula minutaやRhodotorula lactos
a等のRhodotorula属微生物、Sterigmatomyces elviae等
のSterigmatomyces属微生物に由来するβ-ガラクトシダ
ーゼの精製酵素もしくは部分精製酵素又は酵素調製物が
挙げられるが、特に、Bacillus circulans由来のβ-1,4
グリコシド結合に対する特異性の高いβ-ガラクトシダ
ーゼが好ましい。A galactose residue is converted from lactose to N-acetyl used in the enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine.
The enzyme having an action of transferring to acetylglucosamine is not limited in its form and origin as long as it has such a catalytic action.For example, only a so-called enzyme itself such as a purified enzyme or a partially purified enzyme is used. Rather, quiescent cells, dried cells, crushed cells and the like containing the enzyme are also included in the category of the enzyme in the present invention. Specific examples of such enzymes include Bacillus circulans and the like.
Us microorganisms, Rhodotorula minuta and Rhodotorula lactos
Rhodotorula microorganisms such as a, a purified enzyme or partially purified enzyme or enzyme preparation of β-galactosidase derived from a microorganism belonging to the genus Sterigmatomyces such as Sterigmatomyces elviae, and in particular, β-1,4 derived from Bacillus circulans.
Β-galactosidase with high specificity for glycosidic bonds is preferred.
【００２０】前記酵素は、前記酵素生産能を有する微生
物等の天然物から抽出・精製されたものであってもよ
く、あるいは前記酵素をコードする遺伝子ＤＮＡを導入
した組換え細胞等を生育させ、抽出、精製するなどの遺
伝子工学的手法により製造したものであってもよい。さ
らに、前記酵素は、ガラクトース転移反応を有する酵素
の活性部位を含むポリペプチドであってもよく、このよ
うなポリペプチドは遺伝子工学的手法により製造でき
る。The enzyme may be extracted and purified from a natural product such as a microorganism capable of producing the enzyme, or a recombinant cell or the like into which a gene DNA encoding the enzyme has been introduced; It may be produced by genetic engineering techniques such as extraction and purification. Further, the enzyme may be a polypeptide containing an active site of an enzyme having a galactosyltransfer reaction, and such a polypeptide can be produced by a genetic engineering technique.
【００２１】上記酵素合成反応の条件は特に限定される
ことはなく、用いる合成酵素の反応条件として公知の条
件に従って行うことができ、当業者が適宜選択すること
ができるが、用いる酵素の至適pH及び至適温度条件下で
反応を行うことが好ましい。基質を含有する溶液等の基
質混合物に関しても、用いる酵素による反応に影響を与
えない限り限定されないが、緩衝液中の混合物であるこ
とが好ましい。The conditions for the above enzyme synthesis reaction are not particularly limited, and the reaction can be carried out according to known conditions for the reaction of the synthetic enzyme to be used, and can be appropriately selected by those skilled in the art. It is preferable to carry out the reaction under conditions of pH and optimum temperature. The substrate mixture such as a solution containing the substrate is not limited as long as it does not affect the reaction by the enzyme to be used, but is preferably a mixture in a buffer solution.
【００２２】反応形態としては、酵素反応の常套的手段
が採用でき、酵素反応が進行する状態で基質と酵素を作
用させればよい。例えば、基質溶液に酵素を接触させて
もよく、またその逆でもよく、用いるこのような酵素を
適当な担体に固定して、基質溶液を接触させる方法も採
用し得る。より具体的には、例えば、用いる酵素をビー
ズ状の担体に固定化してカラムに充填し、ラクトースと
Ｎ-アセチルグルコサミンの混合物を通しながら連続し
て合成を行うことも可能である。また、基質溶液に固定
化酵素を添加し、攪拌等により両者を十分に接触反応さ
せ、反応後に固定化酵素を分離する等のバッチ法も採用
できる。As the reaction mode, conventional means of enzymatic reaction can be adopted, and the substrate and the enzyme may be allowed to act while the enzymatic reaction proceeds. For example, the enzyme may be brought into contact with the substrate solution, or vice versa. A method in which such an enzyme to be used is immobilized on an appropriate carrier and the substrate solution is brought into contact with the substrate solution may be employed. More specifically, for example, it is also possible to immobilize the enzyme to be used on a bead-like carrier, fill the column, and continuously perform synthesis while passing a mixture of lactose and N-acetylglucosamine. Alternatively, a batch method in which the immobilized enzyme is added to the substrate solution, and the two are sufficiently contacted and reacted by stirring or the like, and the immobilized enzyme is separated after the reaction, may be employed.
【００２３】このようにして得られた反応混合物には、
前記酵素による反応の目的物質であるＮ-アセチルラク
トサミンの他、未反応の基質であるＮ-アセチルグルコ
サミン、ラクトース、副生成物であるグルコース、ガラ
クトシル-Ｎ-アセチルラクトサミン等が含まれている。The reaction mixture thus obtained contains:
In addition to N-acetyllactosamine which is the target substance of the reaction by the enzyme, unreacted substrates such as N-acetylglucosamine and lactose, glucose which is a by-product and galactosyl-N-acetyllactosamine are contained. .
【００２４】この反応混合物から単糖画分を分取する方
法は、単糖画分を分取できる方法であれば特に限定され
ない。例えば、必要に応じて粉炭やイオン交換樹脂によ
る脱色・脱塩処理などの予備精製を反応混合物に施し、
成分の濃度が低い場合には、さらに減圧下で濃縮する等
の処理をしてから、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるク
ロマトグラフィーによる分離法、ゲル濾過分離法、分子
ふるい法、活性炭・セライト（商品名）カラム等の吸着
剤を用いる吸着クロマトグラフィー法等の公知の方法に
よって単糖画分を容易に分取することができる。The method for fractionating the monosaccharide fraction from the reaction mixture is not particularly limited as long as the method is capable of fractionating the monosaccharide fraction. For example, if necessary, the reaction mixture is subjected to preliminary purification such as decolorization / desalting treatment with pulverized coal or an ion exchange resin,
If the concentration of the component is low, it is further concentrated under reduced pressure, etc., and then separated by chromatography using a strongly acidic cation exchange resin, gel filtration separation, molecular sieving, activated carbon / celite ( The monosaccharide fraction can be easily collected by a known method such as adsorption chromatography using an adsorbent such as a trade name column.
【００２５】一例として、活性炭・セライトカラムによ
る分取方法をさらに詳細に説明する。カラム容量の２〜
６％（W/V）の前記合成反応混合物をカラムに供給し、
流速６０〜２００ ml/時間で溶出液を流し、糖類を溶出
させる。Ｎ-アセチルグルコサミンやグルコースを含有
する単糖画分は、水により溶出される。カラムに供給す
る合成反応終了混合物の糖濃度は、20〜65％（w/w）程
度が適当で、これよりも濃度が高いと分離パターンに乱
れを生じる。また、上記方法において、１４〜２０％メ
タノールによりN-アセチルラクトサミンが溶出するの
で、N-アセチルラクトサミンを分離することも可能であ
る。As an example, the method of fractionation using an activated carbon / celite column will be described in more detail. Column capacity of 2
Feeding 6% (W / V) of the synthesis reaction mixture to a column,
The eluate is flowed at a flow rate of 60 to 200 ml / hour to elute saccharides. The monosaccharide fraction containing N-acetylglucosamine and glucose is eluted with water. The sugar concentration of the synthesis reaction end mixture to be supplied to the column is suitably about 20 to 65% (w / w). If the sugar concentration is higher than this, the separation pattern is disturbed. In the above method, N-acetyllactosamine is eluted with 14 to 20% methanol, so that N-acetyllactosamine can be separated.
【００２６】グルコースを含有するＮ-アセチルグルコ
サミン溶液からグルコースを除去しＮ-アセチルグルコ
サミンを回収するために用いるグルコースオキシダーゼ
としては、グルコースをグルコン酸に変換する作用を有
すると共に、Ｎ-アセチルグルコサミンに実質的に影響
を及ぼさない酵素（ここで酵素とは、精製酵素、部分精
製酵素等の酵素そのものほか、該酵素を含有する静止菌
体、乾燥菌体、菌体破砕物なども含む概念である）であ
れば、その由来は特に限定されない。例えば、Aspergil
lus niger等のAspergillus属由来のものや、Penicilliu
m notatum等のPenicillium属由来のものが挙げられる。
特にAspergillus niger由来のものが好ましい。Glucose oxidase used for removing glucose from a glucose-containing N-acetylglucosamine solution and recovering N-acetylglucosamine has an action of converting glucose to gluconic acid and is substantially converted to N-acetylglucosamine. Enzymes that do not have any effect (here, the term "enzyme" is a concept that includes not only enzymes such as purified enzymes and partially purified enzymes, but also static cells, dried cells, and crushed cells containing the enzymes) If so, its origin is not particularly limited. For example, Aspergil
lus niger and other Aspergillus genus, Penicilliu
and those derived from the genus Penicillium such as m notatum.
In particular, those derived from Aspergillus niger are preferred.
【００２７】この酵素は、グルコースをグルコン酸に変
換する作用を有する酵素の生産能を有する微生物等の天
然物から抽出・精製されたものであってもよく、このよ
うな酵素をコードする遺伝子ＤＮＡを導入した組換え細
胞等を生育させ、抽出・精製するなどの遺伝子工学的手
法により製造されたものであってもよい。さらに、グル
コースをグルコン酸に変換する作用を有し、Ｎ-アセチ
ルグルコサミンに実質的に影響を及ぼさないものであれ
ば、グルコースオキシダーゼの活性部位を含むポリペプ
チドでもよく、このようなポリペプチドは遺伝子工学的
手法により製造できる。The enzyme may be extracted and purified from a natural product such as a microorganism having an ability to produce an enzyme capable of converting glucose to gluconic acid. Gene DNA encoding such an enzyme may be used. It may be produced by genetic engineering techniques such as growing, extracting and purifying a recombinant cell or the like into which is introduced. Furthermore, a polypeptide containing an active site of glucose oxidase may be used as long as it has an action of converting glucose to gluconic acid and does not substantially affect N-acetylglucosamine. It can be manufactured by engineering techniques.
【００２８】グルコースオキシダーゼ処理を行う条件
は、グルコースをグルコン酸に変換する反応を妨げない
と共に、Ｎ-アセチルグルコサミンに実質的に影響を及
ぼさない限り限定されず、当業者が適宜選択することが
できるが、用いるグルコースオキシダーゼの至適pH及び
至適温度条件下で反応させることが好ましい。Aspergil
lus niger由来のグルコースオキシダーゼを用いる場合
は、p H 5.7〜6.2、30℃程度で反応を行うことが好まし
い。The conditions for performing the glucose oxidase treatment are not limited as long as they do not hinder the reaction of converting glucose to gluconic acid and do not substantially affect N-acetylglucosamine, and can be appropriately selected by those skilled in the art. However, it is preferable that the reaction is carried out under the optimum pH and optimum temperature conditions of the glucose oxidase to be used. Aspergil
When using lus niger-derived glucose oxidase, the reaction is preferably carried out at a pH of 5.7 to 6.2 and about 30 ° C.
【００２９】グルコースオキシダーゼによる処理後、こ
の処理物を酵素法によるN-アセチルラクトサミンの生成
反応における基質であるN-アセチルグルコサミンの供給
源として使用することができる。通常、このN-アセチル
グルコサミンを含有する該処理物からグルコースオキシ
ダーゼによる反応生成物であるグルコン酸を公知慣用の
方法によって分離除去する。After the treatment with glucose oxidase, the treated product can be used as a source of N-acetylglucosamine as a substrate in a reaction for producing N-acetyllactosamine by an enzymatic method. Usually, gluconic acid, which is a reaction product of glucose oxidase, is separated and removed from the treated product containing N-acetylglucosamine by a known and commonly used method.
【００３０】尚、一般にグルコン酸は、水溶液中ではグ
ルコノ-1,4-ラクトン、グルコノ-1,5-ラクトン及び遊離
のグルコン酸の平衡混合物として存在することが知られ
ており、本発明においても、グルコースオキシダーゼに
より生成したグルコン酸は水溶液中でグルコノ-1,4-ラ
クトン、グルコノ-1,5-ラクトン及び遊離のグルコン酸
の平衡混合物として存在している。従って、本発明にお
いては、「グルコン酸」とは、グルコン酸そのもの以外
に、この様なグルコノラクトンも包含する用語として使
用するものとし、前記の分離・除去法はグルコノラクト
ンも除去可能な方法であることが好ましい。In general, gluconic acid is known to exist as an equilibrium mixture of glucono-1,4-lactone, glucono-1,5-lactone and free gluconic acid in an aqueous solution. Gluconic acid produced by glucose oxidase is present in aqueous solution as an equilibrium mixture of glucono-1,4-lactone, glucono-1,5-lactone and free gluconic acid. Therefore, in the present invention, "gluconic acid" is used as a term including such gluconolactone in addition to gluconic acid itself, and the above separation / removal method can also remove gluconolactone. Preferably, it is a method.
【００３１】グルコースオキシダーゼ処理後の溶液か
ら、グルコン酸（グルコノラクトン）を分離除去し、Ｎ
-アセチルグルコサミンを分取する方法は、Ｎ-アセチル
グルコサミンが得られる方法であれば特に限定されな
い。例えば、ムロマックCl−型（室町化学工業、4級ア
ンモニウム基を有するスチレン系強塩基性樹脂）や、ダ
イヤイオンＳＡ１０Ａもしくは１１Ａ等のＳＡシリーズ
又はＰＡシリーズ（三菱化学、4級アンモニウム基を有
するスチレン系強塩基性樹脂）のような陰イオン交換樹
脂を用いたクロマトグラフィーや、電気透析法がある
が、特に陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー
によりグルコン酸を吸着除去し、非吸着画分であるＮ-
アセチルグルコサミンを得る方法が簡便で好ましい。Gluconic acid (gluconolactone) is separated and removed from the solution after the glucose oxidase treatment,
The method for fractionating -acetylglucosamine is not particularly limited as long as N-acetylglucosamine can be obtained. For example, Muromakku Cl - type (Muromachi Kagaku Kogyo, styrenic strongly basic resins having a quaternary ammonium group), or Diaion SA10A or 11A or the like of the SA series or PA series (Mitsubishi Chemical, styrene having a quaternary ammonium group There are chromatography using an anion exchange resin such as a strong basic resin) and electrodialysis. In particular, gluconic acid is adsorbed and removed by chromatography using an anion exchange resin, and it is a non-adsorbed fraction. N-
A method for obtaining acetylglucosamine is simple and preferred.
【００３２】本発明方法により、純度９０％以上、好ま
しくは９５％以上のＮ-アセチルグルコサミンが得られ
る。本発明方法を上記Ｎ-アセチルラクトサミンの製造
と組合せて行う場合、上記活性炭・セライトカラムによ
る分取においては、14〜20％メタノールによりＮ-アセ
チルラクトサミンが溶出され、これによりＮ-アセチル
ラクトサミンが回収できる。そして本発明方法により回
収されたＮ-アセチルグルコサミンはＮ-アセチルラクト
サミンの酵素合成の原料として再び利用できるので非常
に有益であり、このようなＮ-アセチルラクトサミンの
製造方法は本発明の1つの形態を構成する。According to the method of the present invention, N-acetylglucosamine having a purity of 90% or more, preferably 95% or more is obtained. When the method of the present invention is carried out in combination with the production of N-acetyllactosamine, N-acetyllactosamine is eluted with 14 to 20% methanol in the fractionation using the activated carbon / celite column. Samin can be recovered. The N-acetylglucosamine recovered by the method of the present invention is very useful because it can be reused as a raw material for the enzyme synthesis of N-acetyllactosamine. Make up one form.
【００３３】なお、本発明方法を上記Ｎ-アセチルラク
トサミンの製造と組合せて行う場合には、例えば、先ず
N-アセチルラクトサミンの酵素合成反応を行い、反応混
合物を強酸性陽イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ
ィーや、ゲル濾過法、活性炭・セライトカラム等によ
り、Ｎ-アセチルラクトサミンの画分、N-アセチルグル
コサミン及びグルコースを含む単糖画分をそれぞれ分取
し、該単糖画分にグルコースオキシダーゼを作用させ、
生成したグルコン酸を除去し、N-アセチルグルコサミン
を回収することができる。但し本発明はこれに限定され
るものではなく、例えば、酵素合成反応終了液から目的
物質であるＮ-アセチルラクトサミンを分離除去し、こ
の分離後の混合物に本発明方法を適用してもよいし、酵
素反応後の未分画の溶液に本発明方法を適用してもよ
い。When the method of the present invention is carried out in combination with the production of N-acetyllactosamine, for example,
Perform an enzyme synthesis reaction of N-acetyllactosamine and subject the reaction mixture to chromatography using a strongly acidic cation exchange resin, gel filtration, activated carbon / celite column, etc. Monosaccharide fractions containing glucosamine and glucose are each fractionated, and glucose oxidase is allowed to act on the monosaccharide fraction,
The produced gluconic acid can be removed and N-acetylglucosamine can be recovered. However, the present invention is not limited to this. For example, N-acetyllactosamine, which is the target substance, may be separated and removed from the enzyme synthesis reaction end solution, and the method of the present invention may be applied to the separated mixture. Then, the method of the present invention may be applied to an unfractionated solution after the enzymatic reaction.
【００３４】[0034]
【実施例】本発明を実施例によりさらに具体的に説明す
るが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
【００３５】参考例１ Ｎ-アセチルグルコサミンの測定方法 後述の実施例中、Ｎ-アセチルグルコサミンの純度測定
は、高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCという）
を用い、下記の条件で行った。 カラム：Asahipak NH2P-50カラム（旭化成製、4.6 x 250 nm） 移動相：70%アセトニトリル水溶液 流速：0.7 ml/分 温度：37℃ 検出：UV210 nm （Ｎ-アセチル基の吸収） 示差屈折（糖類） 試料：5 ml 尚、本HPLC分析法によるＮ-アセチルグルコサミンのリ
テンションタイムは、7.8分であった。[0035]Reference Example 1 Method for measuring N-acetylglucosamine In the examples described later, the purity of N-acetylglucosamine was measured.
Stands for High Performance Liquid Chromatography (hereinafter referred to as HPLC)
And under the following conditions. Column: Asahipak NH2P-50 column (Asahi Kasei, 4.6 x 250 nm) Mobile phase: 70% acetonitrile aqueous solution Flow rate: 0.7 ml / min Temperature: 37 ° C Detection: UV210 nm (absorption of N-acetyl group) Differential refraction (saccharides) Sample: 5 ml Recover N-acetylglucosamine by this HPLC analysis method
The tension time was 7.8 minutes.
【００３６】参考例２ 酵素源のスクリーニング ラクトース資化性を有する酵母であるLipomyces lipofe
r（IFO 0673）、Rhodotorula minuta（IFO 0928）、Rho
dotorula lactosa(IFO 1423)、Sterigmatomyces elviae
(IFO 1843)（以上、理化学研究所微生物系統保存施設よ
り購入）をマルツエキス寒天スラント培地で２８℃にお
いて６日間培養し、保存カルチャーを作製した。[0036]Reference example 2 Screening of enzyme sources Lipomyces lipofe, a yeast capable of lactose utilization
r (IFO 0673), Rhodotorula minuta (IFO 0928), Rho
dotorula lactosa (IFO 1423), Sterigmatomyces elviae
(IFO 1843) (The above is from RIKEN Microbial Strain Preservation Facility.
To 28 ° C on a Malt's extract agar slant medium.
And cultured for 6 days to prepare a preservation culture.
【００３７】ラクトースを唯一の炭素源とする培地（ラ
クトース；2%、ペプトン；1%、酵母エキス；1%、(NH4)2
SO4；0.5%、K2HPO4；0.3%、KH2PO4；0.1%、MgSO4・7H
2O；0.05%、pH 7.0）を５００ mlの坂口フラスコに５０
ml入れ、121℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。こ
れに上記各保存カルチャーを１白金耳接種し、２８℃で
４日間培養した。培養終了後、遠心分離法により菌体を
集め、培養液と同量の生理食塩水で２回洗浄した後菌体
を集め、−２０℃で凍結保存した。Medium containing lactose as the sole carbon source (lactose; 2%, peptone; 1%, yeast extract; 1%, (NH 4 ) 2
SO 4; 0.5%, K 2 HPO 4; 0.3%, KH 2 PO 4; 0.1%, MgSO 4 · 7H
2 O; 0.05%, pH 7.0) into a 500 ml Sakaguchi flask.
ml, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. One platinum loop was inoculated with each of the above preservation cultures and cultured at 28 ° C. for 4 days. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, washed twice with the same amount of physiological saline as the culture solution, and then collected and stored frozen at -20 ° C.
【００３８】上記方法にて調製した洗浄菌体を、終濃度
が500 mg/mlになるように、100 mM酢酸ナトリウム緩衝
溶液（pH 6.0）にラクトース（和光純薬工業（株）製）
とＮ-アセチルグルコサミン（ナカライテスク製）をそ
れぞれ０.５Ｍと１Ｍになるように溶解した基質溶液に
懸濁し、６０℃で１７時間反応させた。その後遠心分離
法によって得られた反応上澄液を煮沸浴中（５分間）で
加熱して酵素を失活させた後、蒸留水で1/10に希釈し、
HPLCで反応生成物の分析を行った。結果を表１に示す。
碓氷らの方法（特開平３−４９６９２号公報）で合成し
た結果も併せて記載した。Lactose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a 100 mM sodium acetate buffer solution (pH 6.0) so that the washed cells prepared by the above method had a final concentration of 500 mg / ml.
And N-acetylglucosamine (manufactured by Nacalai Tesque) were suspended in a substrate solution in which the concentrations were 0.5 M and 1 M, respectively, and reacted at 60 ° C. for 17 hours. Thereafter, the reaction supernatant obtained by centrifugation was heated in a boiling bath (5 minutes) to inactivate the enzyme, and then diluted 1/10 with distilled water.
The reaction products were analyzed by HPLC. Table 1 shows the results.
The results synthesized by the method of Usui et al. (JP-A-3-49692) are also described.
【００３９】[0039]
【表１】 [Table 1]
【００４０】Rhodotorula属や、Sterigmatomyces属の酵
母を用いた洗浄菌体もＮ-アセチルラクトサミンを生産
し、特にRhodotorula属の酵母を用いた場合、Bacillus
circulans由来β-ガラクトシダーゼを用いた酵素合成と
同等のＮ-アセチルラクトサミン生産性が得られた。よ
って以下の実験にはRhodotorula minutaの洗浄菌体を使
用した。Washed cells using yeasts of the genus Rhodotorula or Sterigmatomyces also produce N-acetyllactosamine, and particularly when the yeasts of the genus Rhodotorula are used, Bacillus
N-acetyllactosamine productivity equivalent to that of enzyme synthesis using β-galactosidase from circulans was obtained. Therefore, washed cells of Rhodotorula minuta were used in the following experiments.
【００４１】実施例１ 固定化酵母菌体法を用いたＮ-アセチルラクトサミンの
連続生産法におけるＮ-アセチルグルコサミンの回収方
法[0041]Example 1 Of N-acetyllactosamine using the immobilized yeast cell method
Recovery of N-acetylglucosamine in continuous production method
Law
【００４２】（１）酵素合成（固定化酵母菌体法） 参考例２に従い調製したRhodotorura minuta菌体を常法
（日本生物工学会編、生物化学工学実験書、初版第２
刷、316（1993）、培風館）に従ってアルギン酸カルシ
ウムで固定化した。具体的には、あらかじめ冷却した2.
8%アルギン酸ナトリウム水溶液に菌体濃度が500 mg/ml
になるように懸濁し、これを冷却した0.5%塩化カルシウ
ム水溶液中にパスツールピペットを用いて滴下し、冷暗
所に一昼夜保管した。(1) Enzyme Synthesis (Immobilized Yeast Cell Method) Rhodotorura minuta cells prepared according to Reference Example 2 were prepared by a conventional method (Japanese Society for Biotechnology, edited by Biochemical Engineering, First Edition, Second Edition).
Imprint, 316 (1993), Baifukan) and immobilized with calcium alginate. Specifically, it was cooled in advance 2.
Cell concentration of 500 mg / ml in 8% sodium alginate aqueous solution
The suspension was dropped into a cooled 0.5% aqueous calcium chloride solution using a Pasteur pipette, and stored in a cool and dark place for 24 hours.
【００４３】予備実験として、固定化菌体（固定化菌体
濃度0.44 ml/ml）を用いたバッチ法（基質：ラクトース
0.5M、N-アセチルグルコサミン1.0Ｍ、反応条件：pH 6.
0、60℃）によるＮ-アセチルラクトサミンの合成反応を
行ったところ、60 mMのＮ-アセチルラクトサミンが反応
液中に得られることを確認した。As a preliminary experiment, a batch method using immobilized cells (immobilized cell concentration 0.44 ml / ml) (substrate: lactose
0.5 M, N-acetylglucosamine 1.0 M, reaction conditions: pH 6.
(0, 60 ° C.), it was confirmed that 60 mM N-acetyllactosamine was obtained in the reaction solution.
【００４４】固定化菌体をガラスカラム（1.6 x 10 c
m）に充填し、固定化菌体カラムとした。100 mM酢酸ナ
トリウム緩衝液（pH 6.0）にラクトースとＮ-アセチル
グルコサミンをそれぞれ0.5Mと1Mになるように溶解した
基質溶液を60℃に加温し、前記カラムに流速2 ml/時間
で供給し、連続的にＮ-アセチルラクトサミン合成反応
を行った。The immobilized cells were placed in a glass column (1.6 × 10 c
m) to give an immobilized cell column. A substrate solution obtained by dissolving lactose and N-acetylglucosamine in 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) to 0.5 M and 1 M, respectively, was heated to 60 ° C., and supplied to the column at a flow rate of 2 ml / hour. N-acetyllactosamine synthesis reaction was continuously performed.
【００４５】上記固定化菌体カラムを通過した反応液
（40 ml）を活性炭-セライト（1:1、和光純薬）カラム
（8 x 13 cm）にかけ、カラムの３倍量の水でカラムを
洗浄し、水（3000 ml）と40%メタノール（3000 ml）を
用いたメタノール濃度の直線的増加グラディエント法に
より、流速；0.82 ml/分、分画液量；20 mlで溶出し
た。The reaction solution (40 ml) passed through the immobilized bacterial cell column was applied to an activated carbon-celite (1: 1, Wako Pure Chemical Industries) column (8 × 13 cm), and the column was washed with water three times the amount of the column. The extract was washed, and eluted at a flow rate of 0.82 ml / min and a fraction volume of 20 ml by a gradient method of linearly increasing the methanol concentration using water (3000 ml) and 40% methanol (3000 ml).
【００４６】溶出画分は、210 nm（アセチル基の吸収）
におけるUV吸収を測定することにより決定した。結果を
図1に示す。ピーク１を単糖画分（グルコース、Ｎ-アセ
チルグルコサミン）、ピーク２を二糖画分（Ｎ-アセチ
ルラクトサミン、N-アセチルアロラクトサミン）、ピー
ク３(図示しない)を三糖画分（ガラクトシル-Ｎ-アセチ
ルラクトサミン）とした。ピーク１に関して、210 nmに
おける吸光度が０．８以上あるフラクションをプール
し、グルコースを含むＮ-アセチルグルコサミン画分を
得た。The eluted fraction was 210 nm (acetyl group absorption)
Determined by measuring UV absorption at The results are shown in Figure 1. Peak 1 is a monosaccharide fraction (glucose, N-acetylglucosamine), peak 2 is a disaccharide fraction (N-acetyllactosamine, N-acetylallolactosamine), and peak 3 (not shown) is a trisaccharide fraction ( Galactosyl-N-acetyllactosamine). Fractions having an absorbance of at least 0.8 at 210 nm with respect to peak 1 were pooled to obtain an N-acetylglucosamine fraction containing glucose.
【００４７】得られたＮ-アセチルグルコサミン画分を
凍結乾燥し、８.３gの純白粉末を得た。HPLCによる純度
検定によりこの粉末は純度78％のＮ-アセチルグルコサ
ミンであることが判った。尚、ここで得たグルコースを
含むN-アセチルグルコサミン画分中のグルコース含有量
は、約22％であった。The obtained N-acetylglucosamine fraction was freeze-dried to obtain 8.3 g of pure white powder. Purity assay by HPLC showed that the powder was 78% pure N-acetylglucosamine. The glucose content in the N-acetylglucosamine fraction containing glucose obtained here was about 22%.
【００４８】（２）Aspergillus niger由来グルコース
オキシダーゼ処理による精製 （１）で得られた粗Ｎ-アセチルグルコサミンを100 mM
酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）に溶解し、100 mg/ml
粗Ｎ-アセチルグルコサミン水溶液を10 ml調製した。こ
れにAspergillus niger由来グルコースオキシダーゼ
（クラボウ製、比活性156ユニット/mg）を終濃度５ U/m
lになるように添加した後、反応液のpHを１５％アンモ
ニア水でpH 5.7〜6.2に制御しながら、30℃で２４時間
酵素反応を行い、グルコースをグルコン酸に変換した。
得られた反応液を陰イオン交換樹脂（ムロマック1×4
（Cl―型、20 ml、室町化学工業））を用いたクロマト
グラフィーに供し、グルコン酸を該樹脂に吸着させ、非
吸着画分を凍結乾燥し、700 mgの純白の粉末を得た。HP
LCによる分析の結果、この粉末は純度９５％のＮ-アセ
チルグルコサミンであった。(2) Purification by treatment with glucose oxidase derived from Aspergillus niger The crude N-acetylglucosamine obtained in (1) was treated with 100 mM
Dissolve in sodium acetate buffer (pH 6.0) and add 100 mg / ml
10 ml of a crude N-acetylglucosamine aqueous solution was prepared. Glucose oxidase derived from Aspergillus niger (Kurabo Industries, specific activity 156 units / mg) was added thereto to a final concentration of 5 U / m.
After the addition, the enzyme reaction was carried out at 30 ° C. for 24 hours while controlling the pH of the reaction solution to pH 5.7 to 6.2 with 15% aqueous ammonia to convert glucose to gluconic acid.
The obtained reaction solution is applied to an anion exchange resin (Muromac 1 × 4
Chromatographed using - (Cl type, 20 ml, Muromachi Kagaku Kogyo) was), gluconic acid is adsorbed to the resin, the non-adsorbed fraction was lyophilized to give a pure white powder 700 mg. HP
As a result of analysis by LC, this powder was N-acetylglucosamine having a purity of 95%.
【００４９】実施例２ 回収されたＮ-アセチルグルコサミンを使用したＮ-アセ
チルラクトサミンの合成参考例２で調製したRhodotorur
a minuta洗浄菌体（終濃度500 mg/ml）と、100mM酢酸ナ
トリウム緩衝溶液（pH6.0）にラクトースを０.５Ｍ、及
び実施例１（１）で得たグルコースを含有するＮ-アセ
チルグルコサミン画分、実施例１（２）にて得た精製さ
れたＮ-アセチルグルコサミン画分、又は対照として市
販のＮ-アセチルグルコサミン（ナカライテスク製）い
ずれかをＮ-アセチルグルコサミンとして１Ｍとなるよ
うに溶解した基質を用い、反応温度６０℃、反応時間１
７時間の条件でバッチ法によりＮ-アセチルラクトサミ
ンの酵素合成を行った。結果を表２に示す。[0049]Example 2 N-acetate using recovered N-acetylglucosamine
Synthesis of tyllactosamine Rhodotorur prepared in Reference Example 2
a minuta washing cells (final concentration 500 mg / ml) and 100 mM sodium acetate
0.5M lactose in thorium buffer solution (pH 6.0)
And N-acetone containing glucose obtained in Example 1 (1)
Til glucosamine fraction, purified from Example 1 (2)
N-acetylglucosamine fraction, or as a control
N-acetylglucosamine (made by Nacalai Tesque) sold
It will be 1M as N-acetylglucosamine
Reaction temperature 60 ° C, reaction time 1
N-acetyllactosami by batch method under the condition of 7 hours
Enzyme synthesis. Table 2 shows the results.
【００５０】[0050]
【表２】 [Table 2]
【００５１】実施例１（２）で回収したＮ-アセチルグ
ルコサミン画分を用いたときのＮ-アセチルラクトサミ
ン生産量は、市販のＮ-アセチルグルコサミンを用いた
場合とほぼ同等であった。しかし、グルコースオキシダ
ーゼ処理をせずに回収した実施例１（１）のＮ-アセチ
ルグルコサミン画分を用いたときのＮ-アセチルラクト
サミン生産量は、市販のＮ-アセチルグルコサミンを用
いた場合に比べると半減し、さらに副反応物質であるN-
アセチルアロラクトサミンが生産される割合が増加し
た。The amount of N-acetyllactosamine produced when the N-acetylglucosamine fraction recovered in Example 1 (2) was used was almost the same as that when commercially available N-acetylglucosamine was used. However, the amount of N-acetyllactosamine produced when the N-acetylglucosamine fraction of Example 1 (1) collected without performing the glucose oxidase treatment was compared with the case where commercially available N-acetylglucosamine was used. N-
The rate of acetyl allolactosamine production increased.
【００５２】[0052]
【発明の効果】本発明により、グルコースが混在するＮ
-アセチルグルコサミンからグルコース含有率の低い高
純度のＮ-アセチルグルコサミンを、簡便に、かつ低い
コストで回収できる。特にＮ-アセチルラクトサミンの
酵素合成による製造において、本発明方法を適用するこ
とにより、反応終了液に残存しているＮ-アセチルグル
コサミンを基質として再利用することが可能となり、高
価な原料であるＮ-アセチルグルコサミンを無駄なく使
用でき、製造コストの削減を図ることができる。グルコ
ースオキシダーゼ処理により生成したグルコン酸は、医
薬品製造原料として利用することもできる。According to the present invention, N containing glucose is mixed.
-High-purity N-acetylglucosamine having a low glucose content can be easily and at low cost recovered from -acetylglucosamine. In particular, in the production of N-acetyllactosamine by enzymatic synthesis, application of the method of the present invention makes it possible to reuse N-acetylglucosamine remaining in the reaction-finished solution as a substrate, which is an expensive raw material. N-acetylglucosamine can be used without waste, and production costs can be reduced. Gluconic acid produced by the glucose oxidase treatment can also be used as a raw material for producing pharmaceuticals.
【図１】 固定化菌体法によるＮ-アセチルラクトサミ
ンの連続的製造において得られる混合物についての活性
炭クロマトグラフィーにおける糖の溶出パターンを示す
図である。BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a view showing a sugar elution pattern in activated carbon chromatography of a mixture obtained in a continuous production of N-acetyllactosamine by an immobilized cell method.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:685） Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｐ 19/26 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:80） Ｃ１２Ｒ 1:80） Ｆターム(参考） 4B064 AE01 AF03 CA05 CA06 CA21 CA36 CB11 CB30 CE09 CE10 CE20 DA16 4D017 AA07 BA04 CA13 CA17 DA03 EB03 4G066 AC14B AD06B AE10B CA56 DA07 EA01 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) C12R 1: 685) C12R 1: 685) (C12P 19/26 (C12P 19/26 C12R 1:80) C12R 1 : 80) F term (reference) 4B064 AE01 AF03 CA05 CA06 CA21 CA36 CB11 CB30 CE09 CE10 CE20 DA16 4D017 AA07 BA04 CA13 CA17 DA03 EB03 4G066 AC14B AD06B AE10B CA56 DA07 EA01
Claims (10)
コサミン溶液からグルコースを除去してＮ-アセチルグ
ルコサミンを回収する方法であって、前記溶液をグルコ
ースオキシダーゼで処理し、このように処理したものか
らグルコースオキシダーゼ反応生成物を分離除去するこ
とを特徴とする方法。1. A method for recovering N-acetylglucosamine by removing glucose from an N-acetylglucosamine solution containing glucose, wherein the solution is treated with glucose oxidase, and glucose oxidase is recovered from the thus treated solution. A method comprising separating and removing a reaction product.
ルグルコサミンを基質として用いるＮ-アセチルラクト
サミンの酵素合成において得られた反応混合物である請
求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the solution is a reaction mixture obtained in the enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine using lactose and N-acetylglucosamine as substrates.
おいて得られた反応混合物が、酵素合成反応後、少なく
ともＮ-アセチルラクトサミンを分離除去した混合物で
ある請求項２に記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein the reaction mixture obtained in the enzyme synthesis of N-acetyllactosamine is a mixture obtained by separating and removing at least N-acetyllactosamine after the enzyme synthesis reaction.
の酵素合成において得られた反応混合物より得られた単
糖画分である請求項２に記載の方法。4. The method according to claim 2, wherein the solution is a monosaccharide fraction obtained from a reaction mixture obtained in the enzymatic synthesis of N-acetyllactosamine.
s属又はPenicillium属に属する微生物由来のグルコース
オキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の方
法。5. The method according to claim 5, wherein the glucose oxidase is Aspergillus.
The method according to any one of claims 1 to 4, which is a glucose oxidase derived from a microorganism belonging to the genus s or Penicillium.
nigerに由来する請求項１〜４のいずれかに記載の方
法。6. Glucose oxidase is Aspergillus
The method according to any of claims 1 to 4, which is derived from niger.
することによりグルコースをグルコン酸に変換し、陰イ
オン交換樹脂処理により該処理溶液からグルコン酸を分
離除去してＮ-アセチルグルコサミンを回収することを
特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein glucose is converted to gluconic acid by treating the solution with glucose oxidase, and gluconic acid is separated and removed from the treated solution by anion exchange resin treatment to recover N-acetylglucosamine. The method according to any one of claims 1 to 6.
を基質として用いるＮ-アセチルラクトサミンの酵素合
成反応後、反応混合物を活性炭処理し、得られたＮ-ア
セチルグルコサミン及びグルコースを含む単糖画分に対
しグルコースオキシダーゼ処理することによりグルコー
スをグルコン酸に変換し、さらに陰イオン交換樹脂処理
により溶液からグルコン酸を分離除去してＮ-アセチル
グルコサミンを回収する方法。8. After the enzymatic synthesis reaction of N-acetyllactosamine using lactose and N-acetylglucosamine as substrates, the reaction mixture is treated with activated charcoal, and the resulting monosaccharide fraction containing N-acetylglucosamine and glucose is treated. A method of converting glucose into gluconic acid by treating with glucose oxidase, and separating and removing gluconic acid from the solution by treating with an anion exchange resin to recover N-acetylglucosamine.
度が９０％以上である請求項１〜８のいずれかに記載の
方法。9. The method according to claim 1, wherein the purity of the obtained N-acetylglucosamine is 90% or more.
方法によって得られたＮ-アセチルグルコサミンとラク
トースとを、ラクトースからガラクトース残基をＮ-ア
セチルグルコサミンに転移してN-アセチルラクトサミン
を生成する作用を有する酵素の存在下において反応させ
ることを特徴とするＮ-アセチルラクトサミンの製造方
法。10. An N-acetyllactosamine obtained by transferring N-acetylglucosamine and lactose obtained by the method according to claim 1 from lactose to a galactose residue to N-acetylglucosamine. A method for producing N-acetyllactosamine, characterized in that the reaction is carried out in the presence of an enzyme having the action of producing acetyl.
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2000
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