JP2001258560A - ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制
御する活性を有する遺伝子を提供する。 【解決手段】 dtsR1遺伝子プロモーターにレポーター遺
伝子を連結した融合遺伝子を作製し、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライブラリー
から前記融合遺伝子産物の発現を制御する遺伝子をスク
リーニングし、下記タンパク質をコードするＤＮＡを取
得する。 （Ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 （Ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌
のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタン
パク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ｄｔｓＲ１遺伝子
の発現を制御する遺伝子に関する。本遺伝子は、Ｌ−グ
ルタミン酸生産菌の育種、遺伝子の発現制御系の構築な
ど、発酵工業において利用され得る。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸
は、これらのアミノ酸生産能を有するブレビバクテリウ
ム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用
いて発酵法により工業生産されている。この方法では、
コリネ型細菌は生育にビオチンを要求する一方、培地中
に過剰量のビオチンが存在すると、Ｌ−グルタミン酸が
蓄積しないことが知られている。従って、従来のＬ−グ
ルタミン酸の製造法においては、ビオチン濃度を制限し
た培地で培養するか、あるいはビオチンを充分量含有す
る培地を用いる場合には、培養の初発または途上でビオ
チン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗
生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかの方法
が採用されている。しかしながら、特に培地の炭素源と
して廃糖蜜等の安価ではあるが過剰量のビオチンを含有
する原料を使用する場合、培地に添加することが必要な
ビオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となってい
た。

【０００３】これに対し、本発明者らは、コリネバクテ
リウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐
性を付与する蛋白質（DTSR蛋白）をコードする遺伝子
（dtsR遺伝子）の存在を突き止め、この遺伝子が破壊さ
れたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、野生株がほと
んどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在
する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成する
こと、及び、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型Ｌ−グ
ルタミン酸生産菌は、dtsR遺伝子を増幅すると著量のＬ
−リジンを生産する能力が付与されることを見出してい
る（WO95/23224号国際公開パンフレット）。

【０００４】また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタ
ミン酸生産菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感
受性を付与することにより、ビオチン存在下でも安定し
てＬ−グルタミン酸を発酵生産することができること、
及び、このようなビオチン作用抑制物質に対する温度感
受性株にＬ−リジン生産性を付与することにより、ビオ
チン存在下でも、安定してＬ−リジンとＬ−グルタミン
酸を同時に発酵生産することができることを見出してい
る（WO96/06180号国際公開パンフレット）。

【０００５】さらに、dtsR遺伝子に類似する遺伝子とし
て、dtsR2遺伝子が取得されている（特開平10-234371号
公報）。dtsR遺伝子は、dtsR2遺伝子との対比から、現
在ではdtsR1遺伝子と呼ばれている。

【０００６】

【発明の概要】上記のように、ビオチン濃度とコリネ型
細菌のＬ−グルタミン酸生産量とは負の相関があること
が知られている。また、本発明者らは、DTSRタンパク質
とＬ−グルタミン酸生産との間にも負の相関があること
を見出している。そこで、dtsR遺伝子の制御因子の存在
を予想し、dtsR1遺伝子のプロモーターにレポーター遺
伝子を連結した融合遺伝子をマルチコピーでコリネ型細
菌に導入し、形質転換株のＬ−グルタミン酸生産のタイ
ムコースを調べたところ、同融合遺伝子が導入されてい
ない株に比べてＬ−グルタミン酸の生産が遅れることを
知見した。このことから、本発明者は、形質転換株の細
胞中のdtsR1遺伝子のプロモーターのコピー数が増加し
たため、制御因子が希釈され、dtsR1遺伝子の発現量が
増加したと考えた。そして、前記融合遺伝子が導入され
た株を用いて、同融合遺伝子産物の発現を制御する遺伝
子のスクリーニングを行った結果、本発明の遺伝子を取
得することに成功した。

【０００７】すなわち本発明の要旨は以下のとおりであ
る。 （１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ。 （Ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 （Ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌
のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタン
パク質。 （２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）
のＤＮＡ。 （ａ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１
１１８〜１７１４で表される配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１
１１８〜１７１４で表される塩基配列又は同塩基配列か
ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、コリネ型細菌のｄｔｓＲ１遺伝
子の発現を制御する活性を有するタンパク質。 （３）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び
０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行わ
れる条件である（２）のＤＮＡ。

【０００８】（４）ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する
活性が増強され、かつ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有す
るコリネ型細菌。 （５）ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性の増強
が、前記細菌細胞内のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御す
る活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のコピー
数を高めること、又は前記細菌細胞内の同遺伝子の発現
を増強するように発現調節配列を改変することによるも
のである（４）のコリネ型細菌。 （６）前記ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子が、（１）〜（３）
のいずれかのＤＮＡである（５）のコリネ型細菌。

【０００９】（７）（４）〜（６）のいずれかに記載の
コリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン
酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを
特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。

【００１０】以下、本発明のdtsR1遺伝子の発現を制御
する活性を有するＤＮＡを、dtsR1制御遺伝子というこ
とがある。また、本発明において、「dtsR1遺伝子の発
現を制御する活性」とは、本発明のＤＮＡ又はその発現
産物がdtsR1遺伝子の発現を制御する活性、例えばdtsR1
遺伝子の発現を抑制する活性をいい、「dtsR1発現制御
活性」ともいう。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】＜１＞本発明の遺伝子 本発明の遺伝子は、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの染色体ＤＮＡライブラリーから、dtsR1遺伝
子プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子（la
cZ）との融合遺伝子の発現を抑制する活性を有するＤＮ
Ａ断片として単離された。以下に、上記融合遺伝子を利
用して本発明の遺伝子を取得する方法を説明する。

【００１３】プロモーター活性又はそれを制御する活性
を簡便に測定するためには、レポーター遺伝子を用いて
間接的にプロモーター活性を測定する方法が考えられ
る。レポーター遺伝子として望まれる性質として、活性
測定が簡単であること、レポーター遺伝子産物のＮ末端
側にある程度のアミノ酸が付加されても活性が著しく低
下しないこと、バックグランドの反応がないこと、遺伝
子操作をする上で適当な制限酵素切断部位があることが
挙げられる。

【００１４】エシェリヒア・コリのβ−ガラクトシダー
ゼ（LacZ）をコードする遺伝子（lacZ）は、広くレポー
ター遺伝子として用いられており、またコリネ型細菌に
はラクトース資化能がないことから（J. Gen. Appl. Mi
crobiol., 18, 399-416 (1972)）、レポーター遺伝子と
してlacZを用いるのが好適であると考えられる。

【００１５】dtsR1遺伝子プロモーターとlacZとの融合
遺伝子を保持する細菌、例えばエシェリヒア・コリは、
同プロモーターが機能すると、β−ガラクトシダーゼ活
性が上昇する。β−ガラクトシダーゼ活性は、これを産
生する細菌をX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-
β-D-チオガラクトシド）を含む培地で生育させると、
培地が青く呈色することによって検出することができ
る。したがって、前記融合遺伝子を保持する細菌、例え
ばエシェリヒア・コリを宿主に用い、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムの染色体遺伝子ライブラリー
から、コロニーの色を指標として、本発明の遺伝子を選
択することができる。

【００１６】dtsR1遺伝子プロモーターは、同遺伝子配
列は公知であるので（WO95/23224号国際公開パンフレッ
ト）、この配列に基づいて作製したプライマー、例え
ば、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマ
ーを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムの染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって取得するこ
とができる。一方、lacZは、これを保持するプラスミ
ド、例えばpMC1871（ファルマシアバイオテク）、pRS55
2（R.W.Simons et al., Gene, 53, 85-96 (1987)）等か
ら取得することができる。これらのdtsR1遺伝子プロモ
ーターとlacZを連結することにより、プロモーター活性
測定用の融合遺伝子が得られる。

【００１７】上記のような融合遺伝子をエシェリヒア・
コリに保持させるには、例えば、該融合遺伝子を含むプ
ラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換すればよい。
尚、この融合遺伝子は、染色体遺伝子ライブラリーの構
築に用いるプラスミドと和合性であるプラスミドを用い
てエシェリヒア・コリに導入するか、あるいは、エシェ
リヒア・コリ染色体に組み込む必要がある。エシェリヒ
ア・コリとしては、β−ガラクトシダーゼを欠損した
株、例えばJM109株等を用いる。

【００１８】染色体遺伝子ライブラリーは、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムから、例えば斎藤らの
方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 7
2, 619 (1963)）に従い染色体ＤＮＡを調製し、得られ
た染色体ＤＮＡを制限酵素を用いて切断し、コリネ型細
菌で機能するベクターに連結することによって取得する
ことができる。

【００１９】プロモーター活性測定用の融合遺伝子を含
むプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、得ら
れた形質転換体を染色体遺伝子ライブラリープラスミド
で形質転換し、X-galを含む培地上でコロニーの色が白
〜薄い青色を呈する株を選択することによって、dtsR1
発現制御遺伝子を保持する候補株が得られる。得られた
株をX-galを含む培地に植え継ぎ、白〜薄い青色を維持
するコロニーを選択することによって、候補株を絞るこ
とができる。さらに、候補株からプラスミドを調製し、
再度エシェリヒア・コリを形質転換し、上記と同様の操
作を繰り返すことによって、本発明の遺伝子を取得する
ことができる。

【００２０】本発明の遺伝子は、塩基配列及びコードさ
れるアミノ酸配列が明らかとなったので、その配列に基
づいてオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いたＰＣ
Ｒ（polymerase chain reaction）法又はハイブリダイ
ゼーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムの染色体ＤＮＡ又は染色体遺伝子ライブラリ
ーから取得することもできる。

【００２１】本発明のＤＮＡは、コードされるタンパク
質のdtsR1発現制御活性が損なわれない限り、１若しく
は複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むdtsR1発現制御活性を
有するタンパク質をコードするものであってもよい。こ
こで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体
構造における位置や種類によっても異なるが、前記タン
パク質を構成する１９９アミノ酸残基全体に対し、３０
〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上の相同性を
有し、dtsR1発現制御活性を有するものであってもよ
い。

【００２２】上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むタンパク質をコードするＤＮ
Ａは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位の
アミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含
むように塩基配列を改変することによって得られる。ま
た、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られてい
る変異処理によっても取得され得る。ＤＮＡの変異処理
としては、ＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ
処理する方法、及びＤＮＡを保持する微生物、例えばエ
シェリヒア・コリを、紫外線照射またはN−メチル−N'
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝
酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処
理する方法が挙げられる。

【００２３】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムの個体差、種の違いに基づく場合など
の天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれ
る。

【００２４】上記のような変異を有するＤＮＡを適当な
細胞で発現させ、発現産物のdtsR1発現制御活性を調べ
ることにより、配列番号９のアミノ酸配列を有するタン
パク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ
が得られる。また、変異を有するＤＮＡまたはこれを保
持する細胞から、例えば配列番号８に記載の塩基配列の
うち、塩基番号1118〜1714からなる塩基配列を有するＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
かつ、dtsR1発現制御活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡを単離してもよい。ここでいう「ストリンジ
ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう。この条件を明確に数値化することは困難である
が、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５
０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。

【００２５】プローブとして、配列番号８の塩基番号11
18〜1714からなる塩基配列の一部の配列を用いることも
できる。そのようなプローブは、同塩基配列に基づいて
作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基
配列を有するＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ反応によっ
て作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ
程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダ
イゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳが挙げられる。

【００２６】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、発現ベクターにつなぎdtsR1発現制御
活性を調べることによって容易に取り除くことができ
る。本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性は、前記のdts
R1遺伝子プロモーターとlacZとの融合遺伝子を用いるこ
とにより、評価することができる。

【００２７】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されてい
る。

【００２８】＜２＞本発明の遺伝子の利用 本発明の遺伝子は、dtsR1遺伝子の発現を制御する活性
を有するので、本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性を
弱化もしくは欠損又は増強することにより、dtsR1遺伝
子自体を弱化もしくは欠損、又は増強するのと同様の効
果が期待できる。また、本発明の遺伝子を温度感受性に
することにより、dtsR1遺伝子を温度感受性にするのと
同様の効果が得られる。

【００２９】例えば、コリネ型Ｌ−グルタミン酸菌にお
いてdtsR1発現制御活性を増強することにより、dtsR1遺
伝子の発現が抑制され、過剰量のビオチンを含む培地で
あっても、ビオチン作用抑制物質を添加せずにＬ−グル
タミン酸を生産させることができる。

【００３０】また、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型
細菌において本発明の遺伝子を破壊することによって、
dtsR1遺伝子の発現を増強させると、Ｌ−リジンを生産
能が向上すると考えられる。

【００３１】さらに、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸
生産能を有するコリネ型細菌において、本発明の遺伝子
のdtsR1発現制御活性を制御することによって、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生
産させることができると考えられる（WO96/06180号参
照）。

【００３２】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用
いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示
すものが挙げられる。

【００３３】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【００３４】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４ dtsR1発現制御活性を増強するには、本発明の遺伝子と
コリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えＤＮ
Ａを調製し、同組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換
すればよい。

【００３５】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。

【００３６】

【００３７】本発明の遺伝子をコリネ型細菌に導入する
には、これまでに報告されている形質転換法に従って行
えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２につ
いて報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and
Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バ
チルス・ズブチリスについて報告されているような、増
殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを
導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.
E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチル
ス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られてい
るような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易
に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状
態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法
（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen. Genet., 168,
111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nat
ure, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,
G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）
も応用できる。また、電気パルス法（特開平２−２０７
７９１号公報参照）も有効である。

【００３８】dtsR1発現制御活性の増強は、本発明の遺
伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させる
ことによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生
物の染色体ＤＮＡ上に本発明の遺伝子を多コピーで導入
するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標
的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮ
Ａ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピ
ートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５
号公報に開示されているように、本発明の遺伝子をトラ
ンスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上
に多コピー導入することも可能である。いずれの方法に
よっても形質転換株内の本発明の遺伝子のコピー数が上
昇する結果、dtsR1発現制御活性が増強される。

【００３９】dtsR1発現制御活性の増強は、上記の遺伝
子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上
の本発明の遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強
力なものに置換することによっても達成される。たとえ
ば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃ
プロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージの
ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等が強力なプロモ
ーターとして知られている。これらのプロモーターへの
置換により、本発明の遺伝子の発現が強化されることに
よってdtsR1発現制御活性が増強される。

【００４０】一方、本発明の遺伝子の破壊は、相同組換
えを利用した遺伝子置換によって行うことができる。同
遺伝子の内部を欠失し、dtsR1発現制御が正常に機能し
ないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）を含むＤＮ
Ａでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体
上の正常遺伝子との間で組換えを起こさせることによ
り、染色体上の遺伝子を破壊することができる。このよ
うな相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、
直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製開始点を含む
プラスミドを用いる方法などがあるが、温度感受性複製
開始点を含むプラスミドを用いる方法が好ましい。

【００４１】上記のようにして本発明の遺伝子のdtsR1
発現制御活性が増強又は抑制されたコリネ型細菌は、Ｌ
−グルタミン酸又はＬ−リジン等のアミノ酸の製造に利
用することができる。このようなコリネ型細菌の培養及
び培地に蓄積されたアミノ酸の採取は、通常と同様にし
て行うことができる。

【００４２】例えば、Ｌ−グルタミン酸の生産に使用す
る培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じ
その他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトー
ス、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノ
ールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることが
できる。

【００４３】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００４４】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ₁など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。

【００４５】培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施
するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐ
Ｈは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。

【００４６】また、dtsR1発現制御活性が増強されたコ
リネ型細菌に、界面活性剤やペニシリンを添加したり、
ビオチンを制限したりすることによりグルタミン酸収率
を更に向上させることができる場合がある。

【００４７】発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は通
常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み
合わせることにより実施できる。

【００４８】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４９】

【実施例１】dtsR1制御遺伝子の取得 ＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染
色体ＤＮＡライブラリーの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体Ｄ
ＮＡライブラリーを調製した（WO95/23224号国際公開パ
ンフレット参照）。ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869から、斎藤、三浦の方法（Biochem.
Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡ
を得た。この染色体ＤＮＡをSau3AIで部分分解した。一
方、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内
で自律複製可能なプラスミドベクターpSAC4をBamHIで切
断し、前記染色体ＤＮＡのSau3AI断片と連結し、連結反
応液でエシェリヒア・コリDH5を形質転換した。pSAC4
は、以下のようにして得た。pHM1519由来の複製制御領
域を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号）をBamHI及
びKpnIで消化して、複製制御領域を含むＤＮＡ断片を取
得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造
(株)、Blunting kit）を用いて平滑末端化した後、SalI
リンカー（宝酒造(株)）を結合し、これをpHSG399（宝
酒造(株)）のSalIサイトに挿入した。

【００５０】＜２＞dtsR1制御遺伝子のスクリーニング
系の構築 上記のＤＮＡライブラリーから、dtsR1制御遺伝子を取
得するために、スクリーニング系の構築を行った。

【００５１】（１）プロモーター活性測定用プラスミド
の構築 lacZをレポーター遺伝子として、プロモーターを搭載す
るためのプラスミドの構築を行なった。以下、その過程
を詳細に説明する（図１）。

【００５２】ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子（nptII）を保持するエシェリヒア・コリME8459（M
E8459は、日本の国立遺伝学研究所から入手できる）か
ら調製した染色体ＤＮＡを調製した。一方、nptIIをPCR
により増幅するためのプライマーとして、配列番号１、
配列番号２に示す合成DNAを合成した。これらのプライ
マーを用いて、前記染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行
なった。PCRは、Pyrobestpolymerase（宝酒造(株)）を
用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、
72℃ 3分を、30サイクル行った。

【００５３】得られたPCR産物は、SmaI、BamHIで完全分
解した後、SmaI、BamHIで切断したpGEM ベクター（Pro
mega）に挿入し、pGEMnpIIを得た。次に、pGEMnpIIをSm
aI、BamHIで切断してnptII遺伝子断片を切り出した。ク
ララムフェニコール耐性マーカーを保持するプラスミド
pKF3（宝酒造(株)）をHindIIIで分解した後、平滑末端
化し、前記nptII遺伝子断片と連結した。連結反応液で
エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造
(株)）を形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むＬ培
地に塗布した。一晩培養した後、出現したコロニーを釣
り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転
換株からプラスミドを調製し、pKF3nptIIとした。

【００５４】一方、コリネ型細菌とエシェリヒア・コリ
とのシャトルベクターを作製した。既に取得されている
コリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミド
pHM1519（特開昭58-77895号参照）由来の複製制御領域
を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号）を、制限酵素
BamHI及びKpnIで消化して、複製制御領域を含むＤＮＡ
断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット
（宝酒造(株)、Blunting kit）を用いて平滑末端化した
後、SalIリンカー（宝酒造(株)）を結合した。これをpH
SG299（宝酒造(株)）のSalIサイトに挿入し、プラスミ
ドpSAK4を得た。

【００５５】pSAK4をSmaI、SalIで完全分解し、複製制
御領域を含むＤＮＡ断片を、SalIで切断したpKF3nptII
と連結し、コリネ型細菌内で自律複製可能なシャトルベ
クターpNEOを構築した。このプラスミドは宿主にクロラ
ムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性を付与す
る。

【００５６】さらにpNEOをSmaI、Sse8387Iで完全分解し
た。これを、pMC1871（ファルマシアバイオテク）をPst
I、SmaIで完全分解したものと連結し、pNEOLを構築し
た。pNEOLは、pMC1871由来のレポーター遺伝子として、
Ｎ末端側の８アミノ酸を欠失したLacZをコードするlacZ
を保持し、コリネ型細菌内で自律複製可能なシャトルベ
クターである。pNEOLの適当な部位、例えばSmaI部位に
プロモーター活性を有する配列を挿入し、プロモーター
活性を発現させると、LacZを産生させることができる。
したがって、同プラスミドを保持する細菌をX-gal（5-
ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-チオガラクトシ
ド）を含む培地で生育させ、LacZを発現させると、培地
が青く呈色する。

【００５７】（２）プロモーター活性制御遺伝子スクリ
ーニング用プラスミドの構築 （ｉ）dtsR1プロモーター領域の取得 配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを
用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム13
869株の染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRを行い、dtsR1遺
伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を取得した。
前記プライマーは、WO95/23224号の配列番号１に記載さ
れているdtsR1遺伝子の塩基配列の塩基番号1〜24、及
び、398〜421に相当する。これらの配列は、dtsR1遺伝
子の開始コドンから数えて-358〜-335bp、及び、Ｎ末端
から数えて１４番目のアミノ酸（Pro）〜２１番目のア
ミノ酸（Gly）に相当する。前記プライマーは、5'側に
制限酵素NaeIサイトが付加されている。PCRは、Pyrobes
t polymerase（宝酒造(株)）を用い、94℃で1分処理し
た後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、72℃ 1分を、30サイク
ル行った。

【００５８】（ii）dtsR1プロモーターとpNEOとの連結 前記のようにして得られた421bpの増幅断片をNaeIで切
断し、SmaIで切断したpNEOと連結した。得られたプラス
ミドをpNEOLDR1と命名した（図２）。本プラスミドが導
入されたエシェリヒア・コリJM109株及びブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムは、dtsR1プロモーター
が機能すると、50μg/lカナマイシン（ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムの場合は25μg/l）及び45m
g/l X-gal添加LB寒天培地（ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムの場合はCM-2B培地(ポリペプトン10g/
L、酵母エキス 10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン 10μg/
L)）で青く呈色する。

【００５９】（２）pNEOLDR1のpACYC177ベクターへの繋
ぎ変え 前記染色体ＤＮＡライブラリーの構築に用いたプラスミ
ドpSAC4は、エシェリヒア・コリの複製制御領域としてp
UC系のプラスミドpHSG399を用いており、プロモーター
活性制御遺伝子スクリーニング用プラスミドpNEOLDR1
も、エシェリヒア・コリの複製制御領域として、同じく
pUC系のプラスミドpHSG299を用いている。これらのプラ
スミドはエシェリヒア・コリ細胞中で不和合性を示すの
で、pNEOLDR1のdtsR1プロモーターからレポーター遺伝
子（lacZ）までの断片を、pACYC177に移し変えた。pACY
C177は、p15A由来の複製制御領域を持ち、pUC系プラス
ミドと和合性を示す。

【００６０】まず、pNEOLDR1を鋳型にし、配列番号５、
６に示したプライマーを用いPCR法により、dtsR1プロモ
ーター及びレポーター遺伝子（lacZ）を含む断片の取得
を行った。これらのプライマーの5'側には、HindIIIサ
イトが付加されている。PCRは、Pyrobest polymerase
（宝酒造(株)）を用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10
秒、55℃ 30sec、72℃ 4分を、30サイクル行った。

【００６１】上記PCRにより得られたプロモーターからl
acZ構造遺伝子部分を含む約3.5kbの断片をHindIII処理
した後、pACYC177のHindIIIサイトに連結した。このよ
うにして作製したプラスミドをpACYCLDR1と命名した。
以上、pACYCDR1プラスミドの作製手順は図３に示す。

【００６２】＜３＞dtsR1制御遺伝子の取得 （１）dtsR1遺伝子制御遺伝子のスクリーニング 上記のようにして構築されたスクリーニング系を用い
て、＜１＞で得られたＤＮＡライブラリーから、dtsR1
制御遺伝子をスクリーニングした。

【００６３】pACYCDR1プラスミドを保持しているエシェ
リヒア・コリJM109に、エレクトロポレーション法によ
ってライブラリープラスミドを導入し、形質転換体をア
ンピシリン100μg/L、カナマイシン50μg/L、X-gal 45m
g/lを含むLB寒天培地にて生育させた。約５万コロニー
の中から、白及び薄い青を呈色したコロニーを200個選
択した。これらの株を、前記と同様の培地に塗りつけ、
白及び薄い青を呈色したコロニーを選択することにより
２次スクリーニングを行い、140株に絞った。その中か
ら白く呈色した８株と薄い青を示した20株、計28株から
プラスミドを抽出した。その結果、プラスミドのパター
ンが大きく６つに分かれた。白く呈色する原因には、宿
主そのものの変異も考えられたことから、これら６種類
のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109を再
び形質転換し、コロニーの色を調べたところ、白もしく
は薄い青を再度示したプラスミドが３個に絞られた。こ
れらプラスミドのうち、白を呈したコロニーをpSAC86、
薄い青を呈したコロニーをpSAC72及びpSAC113を命名し
た。

【００６４】（２）候補遺伝子の解析 pSAC72、pSAC86及びpSAC113の挿入断片のシークエンス
解析を行った。それぞれ挿入断片は5668bp、2984bp、44
44bpの長さであった。それぞれの塩基配列を、配列番号
７、８、１０に示す。pSAC86の挿入断片にはオープン・
リーディング・フレーム（ORF）が見出された（塩基番
号1118〜1714）。このORFがコードし得るアミノ酸配列
を配列番号９に示す。

【００６５】

【実施例２】dtsR1制御遺伝子のコリネ型細菌への導
入、及びＬ−グルタミン酸生産の誘導 pSAC72、pSAC86、pSAC113を、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869にエレクトロポレーショ
ン法により導入し、ATCC13869/pSAC72、ATCC13869/pSAC
86、ATCC13869/pSAC113を得た。

【００６６】ATCC13869/pSAC86、及びpSAC4を保持するA
TCC13869株を、下記に示す培地にて、31.5℃で22時間培
養した。培養終了後、培地の620nmにおける吸光度（51
倍希釈）、及び培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン
酸の量を測定した。結果を表１に示す。ATCC13869/pSAC
4は、過剰量のビオチンを含む培地でＬ−グルタミン酸
をほとんど蓄積しなかったが、ATCC13869/pSAC86はＬ−
グルタミン酸を蓄積した。 〔培地組成〕 グルコース 80g KH₂PO₄ 1g MgSO₄ 0.4g (NH₄)₂SO₄ 30g FeSO₄ 7H₂O 0.01g MnSO₄ 7H₂O 0.01g 大豆加水分解液 15ml サイアミン塩酸塩 200μg ビオチン 300μg CaCO₃ 50g

【００６７】

【表１】 表１ ──────────────────────────── OD0₆₂₀ Ｌ−グルタミン酸(g/l) ──────────────────────────── ATCC13869/pSAC4 1.807 0.02 ATCC13869/pSAC86 1.618 0.99 ────────────────────────────

【００６８】

【発明の効果】本発明により、dtsR1遺伝子の発現を制
御する遺伝子が得られる。本遺伝子は、遺伝子の発現制
御、あるいはＬ−グルタミン酸生産菌の育種等に利用す
ることができる。

【００６９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社 <120> ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する遺伝子 <130> P-7170 <140> <141> 2000-03-17 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００７０】 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying nptII <400> 1 gggatcccgg atgaatgtca 20

【００７１】 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying nptII <400> 2 gcccggggtg ggcgaagaac tcc 23

【００７２】 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR for amplifying dtsR1 promoter region <400> 3 gggccggcga tcttggaact cgacagtttt ca 32

【００７３】 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR for amplifying dtsR1 promoter region <400> 4 gggccggcag tggtgttgat gtctgg 26

【００７４】 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying dtsR1 promoter and lacZ <400> 5 gcaagcttcc cggcgatctt ggaactcgac ag 32

【００７５】 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR for amplifying dtsR1 promoter and lacZ

【００７６】 <400> 6 gcaagcttcc tgcaggtcga cggatccccc ct 32

【００７７】 <210> 7 <211> 5669 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 7 gatcatgctg cctgtggtgg cggcgctcaa tggcattggt ttggtgatga tttatcgcct 60 tgatgaggcc acgggctaca gcacggtcaa tagccaattg atgtggacgg ttgttggcgt 120 cacgctgatg gtggctgtgt tgttgctgtt gcgtgattac aagtcgctct cgcgttattc 180 ctacctcctc ggtgtggtgg gcatcgtgct gctggcgctg cctctcgtgt ggccgcagcc 240 agacggcgtg gaagcccgca tctggatttg gcttggacct ttctccatcc agccaggtga 300 gttctccaag attttgctgc tgctgttctt tgctcagctg ctagccacca agcgtgcttt 360 gtttactgtt gcgggctacc gtttcctcgg catggatttc cctcgtttgc gtgacctcgc 420 gccgattctt gtggtgtggg cattggctat tttgatcatg gctggcgcca acgacttcgg 480 tcctgcactg ctgcttttca ctaccgtttt ggccatggtg tacctggcta ccggccgtgg 540 ttcctggctg ttgattggtg ctgtgttggt ggctgtcggc gcgttcgcgg tgtaccaagt 600 ttcaagcaag attcaggaac gcgtgcaaaa cttcgtggat cccgtggccc actacgacac 660 caccggttac cagctgtccc agtccttgtt tggcatgagt tggggcggaa tcaccggcac 720 cggcattggt cagggttacc ccaacatgat ccctgtcgtg cactcggact tcattctcgc 780 agccattggt 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gcattgcgtt gcgcaaggat ccgggtcgcc gtttccctga tggaaatgaa 3360 atggcgctag ctgtttctgc tgtgcgcctt ggcaagcgcc cgcctcaacc gcgcacgagc 3420 gcgatgatgg cgcaggcgga ggcgccgtcg ccaagcgaat caacggcgat gctgggcagg 3480 gtggcccggc ctgcaacaat cacccaagaa gcggccccga aacgcggttc cggcattggc 3540 attggtctgt tcatcgcagc tttgctggcc gtgattattg gcacgggatc tatgcgggca 3600 ccaccggaat tttgttcaac gacactccgg aagaaaccac cacacctgaa accattacgg 3660 aaacctacac cccaaccgtg gaggaaacca cctctcagtg ggtaccgcca acgcctccaa 3720 ctcggtcaac attcaccgaa cctgaaacaa cttcacaccg tccgacgaca agtgaagaga 3780 gcacatccga ggaaccaacc acggaagctc caacaagtag ccgaactgtg cctcaaatcc 3840 ctacctctac acctaggacg agtgctagcg ttccagttga gactaatgca ccggctgatg 3900 atttaatcga cgccgtaaat ggcctattgg atgtaggagg agcgcagtga ccttcgtgat 3960 cgctgatcgc tatgaactgg gtgccgtcat cggctccggt ggcatgagcg aggtgttcgc 4020 ggccaccgac acgctcattg gtcgggaggt cgcggtaaag atgctgcgca tcgaccttgc 4080 caaagatccc aatttccggg aacgtttccg cagggaagcc caaaactccg gaaggttgag 4140 ccactcttca atcgtcgctg tttttgacac cggcgaagta gacaaagacg gcacctctgt 4200 tccttatatc gtgatggaac gtgtgcgggc cgaaacctgc gcgaagttgt caccgaagac 4260 ggcgtattca ccccagttga ggcagccaac atcctcatcc ctgtgtgtga agcgctgcag 4320 gcatcccatg acgccggcat tattcaccgc gatgtgaaac ccgccaacat catgatcacc 4380 aacaccggtg gcgtgaaagt catggacttt ggcatcgccc gcgcggtcaa cgattccacc 4440 tccgccatga ctcaaacctc cgcagtcatc ggcaccgccc agtacctctc ccctgagcag 4500 gcccgcggca aacccgccga tgcgcgttcc gatatttacg ccaccggctg cgtcatgtac 4560 gaattggtca ccggcaagcc accttttgaa ggcgagtccc ctttcgccgt ggcctaccaa 4620 cacgtccagg aagaccccac ccctccttcg gatttcatcg cggacctcac cccgacctct 4680 gctgtcaacg tggatgccgt ggtactcacc gccatggcaa aacaccccgc cgaccgctac 4740 caaacagcct ccgaaatggc cgctgacctg ggccggctat cccgcaatgc agtctcccat 4800 gcggcacgcg cacatgtaga aacagaagaa gagccagaaa ctcgcttctc gacgcgcacc 4860 tccacccaag tggcccccgc cgcaggcgtg gctgcggcag gagctgggtc agggtctgga 4920 tctgggtctg attcgcgcaa acgtggctcc aggggcctca ccgccctggc catcgtgtta 4980 tccctaggtg tcgtcggcgt tgccggtgcc ttcacctacg actactttgc caacagctcc 5040 tccaccgcaa ccagcgcaat ccccaacgtt gaaggcctcc cgcagcaaga agctctggca 5100 gaacttcaag ccgcaggatt tgtggtcagc atcgtcgaag aagccagcgc cgacgtcgcc 5160 gaaggccttg tcatccgagc aaacccaagc gttggatccg aaatccgcca aggtgccacc 5220 gtcaccatca ccgtgtccac cggccgagaa atgatcaaca tcccagacgt ctccggcatg 5280 acactcgagg acgcggcccg aactctcgaa gaggcgggcc tcgtgctcaa ccaaaacgtt 5340 cgggaagaaa actccgacga cgtcgaatcc ggcctcgtca ttgaccaaaa ccccgaagcc 5400 ggacaagaag tagtcgtggg ctcctcagtg tccctgacca tgtcctcagg tgccgaaagc 5460 atccgagtac ccaacctcac cggcatgaac tggtcacagg cagaacaaaa cctcatctcc 5520 atgggattca atcccaccgc caccttcgta gacagccaac aactagaagg cgaagtactt 5580 tcagtttcaa gccaaggaac tgagcttctc aagggttcat ccatcaccgt ggaagtctcc 5640 aatggcatgc tcatcgaagc ccctgatcc 5669

【００７８】 <210> 8 <211> 2984 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1118)..(1714) <400> 8 gatcttcttc atcagtgagc ttcaggcgac gcaccaacct gccaaagtgt gtatccaccg 60 tgattcccgg aacaccgaaa gcatttccca gcaccacgtt ggcggttttc cgcccgaccc 120 ccggcagctc aactagctgc tcaagggtac cggggacctg gccgtcgtga agcgaaatta 180 gtgcctcacc caggccgatt aaagaagcgg ccttgttgcg gtaaaagcct gtcggacgga 240 tgaactcttc caattccgtg cgatcggcgt tggcgtaatc tgcggccgtc ggatagcgct 300 tgaacaacgc gggcgtcacc tggttcacgc gaacgtccgt gcactgggcg gacaaaatgg 360 tggcgaccgt gagttctagc ggattggtga aatctaattc gcagtgcgca tccggatatg 420 ccacggtgag tgtgcgattg atgcgtcgag ctcggcgttt tcgcccgata tcagtctctt 480 gacccttgtt cgcgatgtga gaccccacgc gaggccgctt ctgcggagta atggaaccca 540 tacccttaag ttagcgtgaa tttgattcat cactagaatg actcccatga caggtttgct 600 tgtggtgatc atcccgctct tactgatgct ttttgcattt gcgatggagc ggatcgagtc 660 ttctttcctg cactccaacg ctccgcagaa cactgaggta aagttagcaa aggacgctgt 720 cggtgcagaa aacttaaatg aagacgacgt gcaggaagca tcagctgcct aaacaagagt 780 taatttgaaa gatttattca aaataaactt tggctgctag caatctgtga atattgaaat 840 tacggttttt aaagtgtgac attttagcca aatgcactaa tatggtgacc aattgcatag 900 tagagtggtc tttgccacat taatagatgc ctccagttag gtgtcatccg gattttatct 960 caaaccctaa caccccaggt gttgccactc atccggactc aaacaagatg tgtgcagatg 1020 aaggagaaaa gcagtggaag gtgtacagga catcctgtcg cgcgccggaa tttttcaagg 1080 cgttgaccca acggcagtca ataacctcat ccaggat atg gag acc gtt cgc ttc 1135 Met Glu Thr Val Arg Phe 1 5 cca cgc gga gca acc atc ttc gac gag ggc gag cca ggt gac cgc ctt 1183 Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp Arg Leu 10 15 20 tac atc atc acc tcc ggc aaa gtg aag ctt gcg cgc cac gca ccg gac 1231 Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala Pro Asp 25 30 35 ggc cgc gaa aac ctg ctg acc atc atg ggt cct tcc gac atg ttc ggt 1279 Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met Phe Gly 40 45 50 gag ctc tcc atc ttc gac cca ggc cca cgc acc tcc tct gca gtg tgt 1327 Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala Val Cys 55 60 65 70 gtc acc gaa gtt cat gcg gca acc atg aac tcc gac atg ctg cgc aac 1375 Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu Arg Asn 75 80 85 tgg gta gct gac cac cca gcg atc gct gag cag ctc ctg cgc gtg ctg 1423 Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg Val Leu 90 95 100 gct cgt cgt ctg cgt cgc acc aac gct tcc ctg gct gac ctc atc ttc 1471 Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu Ile Phe 105 110 115 acc gac gtc cca ggc cgc gtt gct aag acc ctc ctg cag ctg gct aac 1519 Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu Ala Asn 120 125 130 cgc ttc ggc acc caa gaa gct ggc gcg ctg cgc gtc aac cac gac ctc 1567 Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His Asp Leu 135 140 145 150 acc cag gaa gaa atc gca cag ctc gtc ggt gct tcc cgt gaa acc gtg 1615 Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu Thr Val 155 160 165 aac aag gct ctt gca acg ttc gcc cac cgt ggc tgg atc cgc ctc gag 1663 Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg Leu Glu 170 175 180 ggc aag tcc gtc ctc att gtg gac acc gag cat ttg gca cgt cgc gct 1711 Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg Arg Ala 185 190 195 cga taatcaccaa agcgctaaaa agcgcctgat cagtttcata ctgattaggc 1764 Arg gctttctttg ttgtttagtt aaaagtgttt agtttgaggc ggaagcttcc tgagcctgca 1824 ggtaacgaat agccacatga gtggactgct cggctgcacc acgcagaact ggatcaacat 1884 catcgtagat ggcgtcgatg agatccttca tggacacgtc acggccacga gtctcccata 1944 cctcacggat ctggttcaga cgcagctcac gacgctcaat gtacttacga gcaaacgagg 2004 caacgtcctg tccatctgga ccatgtcctg gaagcagcgg aatatccttg ccgcgctcct 2064 ccaaaatggc caaagaattc aggtactcac ccaaatcgcc gtcggtctct gaaatcatcg 2124 tggtgtgacg acccgcaatg gtgtcgccag aaacgatgcc ctccaaagtg gactcatgag 2184 ggactccact ccagataaaa taagacacag aatcacgagt atgaccaggt gtggccacca 2244 cctcaatctg tggggtgaca ccgtcgatcg tgatgatctc accatcatga atctcctccg 2304 caccagcaca gtacgaaggg tcctacgcac gcacaggtgc attggtcagc tgacggaaac 2364 gctgtgcgcc gtcagcatga tcatggtgac ggtgggtcag aagaatcaaa cccacctcct 2424 cagccttgga atgcaagacg ttaaggtggc cctcatcttc aggacctgga tcgatgacaa 2484 tgctccgggg gtcttctggt gcccggataa cccaagaatt agtgccttcc agcgagctgt 2544 aaccgggatt agggcacaaa acaacagatg cggacggggt aaccggccgc aattggctgt 2604 aagcaggatg ctccatgcgc tcaagcttag tcacaataag tcatttcgta gaactgggga 2664 gaaaaatagc agcgcacccc taacattgaa gggatgcgcc ggatgggttt ttgcgtcgag 2724 aagcaagctt ttaagcgtag aagcgggtga gaaaggtggc tacgacggcc gggcgctcct 2784 gcccttcgat ctcaatggtg ccatcggcga ccaggtgcag gccattgccc ttcacctcag 2844 agatctcacg gaccacagcg cccatgcgga tgcgggaacc gaccttgacg ggagaggtga 2904 aacgcacctt atccaggcca tagttcacct tggtggtcac gccggtgaca tcgagaagct 2964 cgccccagaa cggaatgatc 2984

【００７９】 <210> 9 <211> 199 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 9 Met Glu Thr Val Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Gly Asp Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu 20 25 30 Ala Arg His Ala Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly 35 40 45 Pro Ser Asp Met Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg 50 55 60 Thr Ser Ser Ala Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn 65 70 75 80 Ser Asp Met Leu Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu 85 90 95 Gln Leu Leu Arg Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser 100 105 110 Leu Ala Asp Leu Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr 115 120 125 Leu Leu Gln Leu Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu 130 135 140 Arg Val Asn His Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly 145 150 155 160 Ala Ser Arg Glu Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg 165 170 175 Gly Trp Ile Arg Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu 180 185 190 His Leu Ala Arg Arg Ala Arg 195

【００８０】 <210> 10 <211> 4445 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 10 gatcgtttga agaaggctgg cgtccctgtc attggtacct ccccagaggc aatcgacatg 60 gctgaggacc gtggcgagtt cggtgcactg ctgaaccgcg agcagcttcc tgctccagca 120 ttcggcaccg caacctcttt cgaagaggct cgcacagtag ccgatgagat cagctaccca 180 gtgctggttc gcccttccta cgtcttgggt ggccgtggca tggagattgt ctacgatgag 240 gcttccctcg aggattacat caaccgcgca actgagttgt cttctgacca cccagtgctg 300 gttgaccgct tcctggacaa cgctattgag atcgacgtcg acgcactgtg cgacggcgac 360 gaagtctacc tggcgggcgt catggaacac atcgaggaag ccggcattca ctccggtgac 420 tccgcatgtg cacttcctcc aatgactttg ggcgcacagg acatcgagaa ggtccgcgaa 480 gcaaccaaga agctggctct gggcatcggc gtacagggcc tgatgaacgt ccagtacgca 540 ctcaaggacg acatcctcta cgtcatcgag gcaaacccac gtgcatcccg caccgtgccg 600 ttcgtctcca aggcaacggg cgtcaacctg gccaaggcag catcccgtat cgcagtgggc 660 gccaccatca aggatctcca agatgagggc atgattccta ccgagtacga cggcggctcc 720 ttgccactgg acgctccaat cgctgtgaag gaagcagtgt tgccgttcaa ccgcttccgt 780 cgcccagatg gaaagaccct ggacaccctg ctttccccag agatgaagtc cactggcgag 840 gtcatgggct tggccaacaa cttcggcgct gcatatgcaa aggctgaagc tggcgcgttt 900 ggtgcattgc caaccgaagg caccgtcttc gtgaccgtgg ctaaccgcga caagcgcacc 960 ctgatcctgc caatccagcg cctggcgtcg atgggctaca agatcctcgc caccgaaggc 1020 accgcaggca tgctgcgccg caacggcatt gattgtgaag ttgtgctcaa ggcttccgac 1080 atccgcgaag gtgtagaggg caagtccatc gtggatcgta tccgcgaagg cgaagttgac 1140 ctcatcctca acaccccagc tggttctgct ggcgctcgcc acgatggcta cgatatccgc 1200 gcagcagcag tgaccgtggg tgttccactg atcaccactg tccagggtgt caccgcagct 1260 gtccagggca ttgaggccct gcgtgagggc gttgtcagcg tccgcgcgct gcaggaactc 1320 gaccacgcag tcaaggctta agccctatga cattcggcga gaagcttctg aacgccgcct 1380 ccacccgtgg caggctatgt gtgggcattg atccccacga aagcctgctg acgtcctggg 1440 ggctgccggt aaacgtagac ggacttgcgg agttctcccg cgcctgcgtg gaggctttcg 1500 ccgacaccgt ggcattggtg aagcctcagg tggcgttcta tgagcgtttc ggttccgctg 1560 gctttgccat cttggaagaa accattcaga cgctgcgtga gcgtggctgt ttggtggtct 1620 ctgacgccaa acgcggcgat attggctcca ccatggctgg ctatgcctca gcgtggttag 1680 atccagcgtc accgctgtct agcgacgctg tgacggtctc tccctacctt ggttttcatt 1740 ccttggaccc agtgttcgaa cttgccgagc aacacggcag gggagtgttt gtcttggccg 1800 cgacctcaaa ccctgaggcc cgcgaactcc aggaccagca aaacgctgac ggcgtgagca 1860 tttcccagca gatcgtggat caggcagcgg cgcttaacgc gccttatatg gcccagggca 1920 aggctggcaa cattggcgtc gtcatcggcg ccaccttgtc caaaccacca cgcttatcga 1980 cgctcggggg cgccattttg atgcccggcg tcggcgccca gggcggcacg gcaagcgacg 2040 ttgatgagat tgcgggagac atggctcatc ttgcgttccc aaatgtctct agaagtattt 2100 tggcgacagg cccagatatc gctgaaatga agaattctgt ggcaaaaact gctgcagact 2160 ttcctggttt ccccaggtca tagtcgcgga aacggccctt gattgcaagc ctgtgacctg 2220 caggtttagc ttttaggggt tctgccacct ttgtgtttgt gaaagtagtg ctagactatt 2280 cgaaaatcgc aggctgacat ccttggtatt aaccaggtgt accctcgatt tctggatact 2340 ttggtattca ttttgtcact aaaaaccaca cgataacgga ggaaccccgt ggcccttcca 2400 cagttgactg atgagcagcg caaggcagct cttgctaagg cagcagaggc acgcaaggca 2460 cgcgcagagc tcaaagagaa cctgaagcgc ggcaacacta acctcaggga agttctggac 2520 aaggctgagt ctgacgagat catcggcaag accaaggtct ccgctctcct cgaggctctc 2580 cctaaggttg gcaaggtcaa ggcaaaggag attatggacg agctgggcat tgctcagacc 2640 cgtcgtcttc gtggactggg tgaccgtcag cgtcgcgcac ttctcgagcg tttcggcttc 2700 gaggattaat tcttcagtgt cgggcgataa tcaactagga cggctcgtaa ttcttgcggg 2760 cccctcagcg gtcggtaaat cgactgtggt tgatcgcctc cgcaatgacg ttccaaacct 2820 gtatttcagt gtgtcgatga ccaccagggc acctcgtcct ggtgaagtcg atggacgtga 2880 ctacttctat gtcactgcac aggaatttca ggacaaaatc gactgtggag agatgcttga 2940 atgggcagat atccacggcg gtttgcagcg ttcaggcact ccagcaggtc ccgtcaatga 3000 ggctcgccaa aatggtcggc cagtattggt tgaggttgat cttgcaggag cccgaaacat 3060 cgctagctta attccagatg cagaaaccat cttccttgct ccaccttcat gggaagtttt 3120 ggttgaacgc ctcactggac gtggcaccga aagcgaagac gttattgctc gcaggctcga 3180 gaccgcacgc gaagaattgg ctgctcagag cgaatttaag cacgtcatta tcaatgatga 3240 tgtggataca gccgtcaagg ctattgagga tgttctcctc ggcgcttagc caaaacatag 3300 agcggtaggg tatgcttttc cgattgagca acctttcccg ctcttaacac tactgtccat 3360 atacttttga aaaggtgtca gtgaccaacg tgagcaacga gaccaacgcc accaaggccg 3420 tcttcgatcc gccagtgggc attaccgctc ctccgatcga tgaactgctg gataaggtca 3480 cttccaagta cgccctcgtg atcttcgcag ccaagcgtgc gcgccagatc aacagcttct 3540 accatcaggc agatgaggga gtattcgagt tcatcggacc attggttact ccgcagccag 3600 gcgaaaagcc actttctatt gctctgcgtg agatcaatgc aggtctgttg gaccacgagg 3660 aaggttaaaa gaccttataa cttcacacag ttgtaaaaat cacctaccgc gagttatcac 3720 ttgcggtggg tgttttgcat ttttggcggc aggtttgtcc gtgtgtacat aagacaacaa 3780 gatttcggca aaaaggtggc caaaatcagg aaatcttgct gccctatgca cagcggaggt 3840 cgagggagag tgtggggtgg cgtcgaaaag catcttgtag agtgtgtggg aacccagcca 3900 gcctcttact ttgaaggatt gttgtgccca tgactcatgt ttcaagcccc tccgcacccc 3960 gcaacgtggt tgttggtgtt gcccggcgga atcgcagcgt acaaggcgtg tcacatcgtg 4020 cgcgcgttta aagaagcggg cgataatgtg cgggtggttc ctacggaatc cgcgttgaag 4080 tttgtgggga aggcgacgtt tgaagcgttg tctggcaatc cggtgtccac aacggtgttt 4140 gatgcggtgg attcggtgca gcatgtgaaa gttggccagg aagctgattt gatcgtgatt 4200 gcgccggcga cagccgattt gatggcgcgt gtggtggcag gtcgcggtga cgatctgttg 4260 gcggcgacgc tgctggtggc aacgtgcccc gtggttattg cgccggcgat gcatacggag 4320 atgtggttta atccggctac cgtagccaat gtggcaacgc tgaggcagcg ggggattacc 4380 gtgattgagc ctgcgcatgg tcgactcacc ggtaaagata cgggccctgg ccggctgccg 4440 gatcc 4445

【図面の簡単な説明】

【図１】 lacZを持つプラスミドpNEOLの構築過程を示
す図。

【図２】 dtsR1遺伝子制御下にレポーター遺伝子とし
てlacZが連結された融合遺伝子を持つプラスミドpNEOLD
R1の構築過程を示す図。

【図３】 pNEOLDR1中の融合遺伝子をpACYC177に移し変
えることによって得たプラスミドpACYCLDR1の構築過程
を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｎ 1/20 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 杉本 愼一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA74 CA02 CA03 DA06 EA04 FA02 FA04 FA13 FA15 GA14 GA16 HA01 HA14 4B063 QA01 QA05 QQ42 QQ52 QR15 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX01 4B064 AE20 AG01 BA02 BA14 CA02 CA19 CC24 DA10 4B065 AA22X AA22Y AA24X AA32X AB01 AC14 AC20 BA03 BA25 BB13 BB37 CA17 CA41 4H045 AA10 BA10 CA11 FA73 FA74 HA05

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
   ク質。 （Ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、１若
   しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は
   逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌
   のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタン
   パク質。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１
   １１８〜１７１４で表される配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１
   １１８〜１７１４で表される塩基配列又は同塩基配列か
   ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
   イブリダイズし、かつ、コリネ型細菌のｄｔｓＲ１遺伝
   子の発現を制御する活性を有するタンパク質。
3. 【請求項３】 前記ストリンジェントな条件が、１×Ｓ
   ＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗
   浄が行われる条件である請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性
   が増強され、かつ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコ
   リネ型細菌。
5. 【請求項５】 ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性
   の増強が、前記細菌細胞内のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を
   制御する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の
   コピー数を高めること、又は前記細菌細胞内の同遺伝子
   の発現を増強するように発現調節配列を改変することに
   よるものである請求項４記載のコリネ型細菌。
6. 【請求項６】 前記ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する
   活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、請求項
   １〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡである請求項５記
   載のコリネ型細菌。
7. 【請求項７】 請求項４〜６のいずれか一項に記載のコ
   リネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸
   を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特
   徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。