JP2001252095A - Method for assaying trace component and composition used therefor - Google Patents

Method for assaying trace component and composition used therefor

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JP2001252095A
JP2001252095A JP2000070847A JP2000070847A JP2001252095A JP 2001252095 A JP2001252095 A JP 2001252095A JP 2000070847 A JP2000070847 A JP 2000070847A JP 2000070847 A JP2000070847 A JP 2000070847A JP 2001252095 A JP2001252095 A JP 2001252095A
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atp
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Fumihiko Yamaguchi
文彦 山口
Mamoru Takahashi
守 高橋
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for rapidly and readily assaying ATP, AMP, ADP, cyclic AMP, ammonia and ammonium ion with low blank value, in good reproducibility in high sensitivity, and further to provide a composition used for the assay. SOLUTION: This method for determining a trace component such as the ATP and/or the AMP, the ADP, the cyclic AMP, the ammonia and the ammonium ion is characterized in that a reaction represented by reaction formula (I) (wherein, E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2 is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reactant with E1; P1 is a product of the reaction of S1 with E1; S2 is a reactant with E2; P2 is a product of the reaction of S2 with E2) is carried out by using a NAD synthetic enzyme and an enzyme (E1) using the AMP as the substrate, and the component consumed or formed by the reaction is determined. The composition used for the assaying method is also provided.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰ、
ＡＤＰ、サイクリックＡＭＰ、アンモニアおよびアンモ
ニウムイオン等の微量成分を測定する新規な測定法及び
その測定に用いる組成物に関するものである。さらに詳
しくは、ＡＴＰを基質とする酵素とＡＭＰを基質とする
酵素を用いて反応をせしめ、その反応により消費する反
応物及び／またはその反応による生成物を定量すること
で、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、サイクリックＡＭＰ、ア
ンモニアおよびアンモニウムイオン等の微量成分を測定
する事が出来る測定法及びそのために用いる組成物に関
するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to ATP, AMP,
The present invention relates to a novel method for measuring trace components such as ADP, cyclic AMP, ammonia and ammonium ions, and a composition used for the measurement. More specifically, a reaction is performed using an enzyme using ATP as a substrate and an enzyme using AMP as a substrate, and a reaction product consumed by the reaction and / or a product resulting from the reaction are quantified, whereby ATP, AMP, and ADP are determined. The present invention relates to a method for measuring trace components such as AMP, cyclic AMP, ammonia and ammonium ions, and a composition used therefor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ＡＴＰは、すべての生物の細胞内に含ま
れているヌクレオチドであり、生物の代謝に大きく関与
している。ＡＴＰの測定は、各種工業分野において広く
行われており、特に、食料衛生、バイオ、臨床検査、医
学の分野では試料中の微生物の有無の判定や微生物細胞
数の計測を目的として、細胞内ＡＴＰの測定が行われて
いる。最近では、細胞内ＡＴＰの測定について、血球・
***などの細胞組織の活性測定への応用、薬物等のスト
レスの影響度測定への応用も報告されている。2. Description of the Related Art ATP is a nucleotide contained in the cells of all living organisms and is greatly involved in the metabolism of living organisms. The measurement of ATP is widely performed in various industrial fields. In particular, in the fields of food hygiene, biotechnology, clinical testing, and medicine, intracellular ATP is used for the purpose of determining the presence or absence of microorganisms in a sample and measuring the number of microbial cells. Has been measured. Recently, about the measurement of intracellular ATP,
The application to the measurement of the activity of cell tissues such as sperm and the application to the measurement of the influence of stress such as drugs have also been reported.

【０００３】従来、ＡＴＰの測定方法として、ピルビン
酸カイネス（Ｅ Ｃ．２．７．１．４０）やアデニル酸
カイネス（ＥＣ．２．７．４．３）等のカイネスを用い
てＡＤＰをＡＴＰに変換し、さらにヘキソカイネス（Ｅ
Ｃ．２．７． １．１）を用いてＡＴＰをＡＤＰに変換
する事でサイクリング反応を起こし、生成されたグルコ
ース−６−リン酸とＮＡＤをグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４９）で反応させ
る事で、ＮＡＤＨに変換させ、得られたＮＡＤＨ量を分
光光度計で測定する方法が知られている（ジャーナル・
オブ・バイオテクノロジー、３１、３６９−３８０（１
９９３））。[0003] Conventionally, as a method for measuring ATP, ADP is converted to ATP using chines such as chines pyruvate (EC 2.7. 1.40) and chines adenylate (EC 2.7.4.3). Into Hexokines (E)
C. 2.7. The cycling reaction is caused by converting ATP to ADP using 1.1), and the generated glucose-6-phosphate and NAD are converted to glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.1.49). A method is known in which the reaction is carried out in a manner such that the amount of NADH is converted into NADH and the obtained amount of NADH is measured with a spectrophotometer (Journal
Of Biotechnology, 31, 369-380 (1
993)).

【０００４】また、ＡＴＰの測定方法として、ＮＡＤ合
成酵素の酵素反応によって生成された酸化型ＮＡＤをデ
ヒロゲナーゼ及びジアホラーゼ、テトラゾリウム塩と反
応させてできるホルマザンを測定する方法が知られてい
る（特公平２−３４５９９）。しかしながら、微量のＡ
ＴＰを測定する場合、これら方法では感度が低いという
問題があった。As a method for measuring ATP, there is known a method for measuring formazan produced by reacting oxidized NAD produced by an enzymatic reaction of NAD synthase with dehydrogenase, diaphorase, and tetrazolium salt (Japanese Patent Publication No. Hei 2 (1994)). -34599). However, a small amount of A
When measuring TP, there was a problem that these methods had low sensitivity.

【０００５】さらに、ＡＴＰを測定方法としてはＡＴＰ
にルシフェリンを加えルシフェラーゼ（ＥＣ．１．１
３．１２．７）を作用させ、得られた発光量を測定する
方法がある。（センサーズアンドアクチュエターズ、Ｂ
１（１９９０）５８０−５８４や特開平７−９５８９
８） しかしながら、この方法では発光測定であるために携帯
測定装置への小型軽量化が困難であると言う問題があっ
た。その上、酵素が非常に高価であるといった問題や試
料の濁りや着色の影響を受けやすいと言う問題もある。[0005] Further, ATP can be measured by ATP.
Luciferin was added to luciferase (EC 1.1).
3.12.7) is applied to measure the amount of luminescence obtained. (Sensors and Actuators, B
1 (1990) 580-584 and JP-A-7-9589.
8) However, this method has a problem that it is difficult to reduce the size and weight of a portable measurement device because the measurement is based on light emission. In addition, there are problems that the enzyme is very expensive and that the sample is susceptible to turbidity and coloring of the sample.

【０００６】アンモニアおよび／またはアンモニウムイ
オンは生体内でタンパク代謝の過程で生成され、肝臓に
おいては他の窒素化合物の生合成に用いられる。余分な
アンモニアおよび／またはアンモニウムイオンは尿素に
合成された後に尿***されるが、肝臓に障害がある場合
にはアンモニア代謝に異常をきたし、血液中のアンモニ
アおよび／またはアンモニウムイオン濃度が高まること
が知られ、血中のアンモニアおよび／またはアンモニウ
ムイオンの測定は肝臓障害の指標となる。[0006] Ammonia and / or ammonium ions are produced in vivo during the process of protein metabolism, and are used in the liver for the biosynthesis of other nitrogen compounds. Excess ammonia and / or ammonium ions are excreted in urine after being synthesized into urea, but if the liver is impaired, abnormalities in ammonia metabolism can occur, leading to increased ammonia and / or ammonium ion concentrations in the blood. Known, measurement of ammonia and / or ammonium ions in the blood is indicative of liver damage.

【０００７】従来、アンモニアおよび／またはアンモニ
ウムイオンの測定方法として、ＮＡＤ合成酵素（ＥＣ
６．３．１．５およびＥＣ６．３．５．１）の酵素反応
によって生成された酸化型ＮＡＤを酸化還元酵素および
その基質を用いて還元型ＮＡＤとして直接測定する方法
（反応式（ＩＶ））や、アンモニアと還元型ＮＡＤをグ
ルタミン酸デヒロゲナーゼによって反応させ、消費され
た還元型ＮＡＤを直接測定する方法（反応式（Ｖ））が
知られている。Conventionally, as a method for measuring ammonia and / or ammonium ions, NAD synthase (EC
Method for directly measuring oxidized NAD produced by the enzyme reaction of 6.3.1.5 and EC 6.3.5.1) as reduced NAD using oxidoreductase and its substrate (reaction formula (IV)) ) And a method of reacting ammonia and reduced NAD with glutamate dehydrogenase to directly measure consumed reduced NAD (reaction formula (V)).

【０００８】[0008]

【化４】 （ただし、式中Ｅ３は、酸化型ＮＡＤおよびＳ３を基質
として消費して、還元型ＮＡＤおよびＰ３を生成する反
応を触媒するデヒドロゲナーゼを示す。）Embedded image (Where E3 is a dehydrogenase that catalyzes a reaction that consumes oxidized NAD and S3 as a substrate to produce reduced NAD and P3.)

【０００９】[0009]

【化５】 しかしながら、微量のアンモニアおよび／またはアンモ
ニウムイオンを測定する場合、この方法では感度が低い
という問題があった。Embedded image However, when measuring trace amounts of ammonia and / or ammonium ions, this method has a problem that the sensitivity is low.

【００１０】また、アンモニアおよび／またはアンモニ
ウムイオン高感度測定方法として、ＮＡＤ合成酵素の酵
素反応によって生成された酸化型ＮＡＤをデヒロゲナー
ゼ及びジアホラーゼ、テトラゾリウム塩と反応させてで
きるホルマザンを測定する方法、あるいは、オキシダー
ゼ系と組み合わせ、生成される過酸化水素を発色させて
測定する方法等の下記反応式（ＶＩ）および（ＶＩＩ）
の方法が知られている。（特開昭５９−１９８９９５号
公報、ＵＳ特許第４７６７７１２号明細書、ＵＳ特許第
５２０６１４６号明細書、特開昭６３ー１８５３７８号
公報、ＵＳ特許第４９２１７８６号明細書、特公平２−
３４５９９）As a method for measuring ammonia and / or ammonium ions with high sensitivity, a method for reacting oxidized NAD produced by an enzymatic reaction of NAD synthase with dehydrogenase, diaphorase and tetrazolium salt to measure formazan, or The following reaction formulas (VI) and (VII), such as a method of measuring the color of hydrogen peroxide generated by combining with an oxidase system
The method is known. (JP-A-59-198995, US Pat. No. 4,767,712, US Pat. No. 5,206,146, JP-A-63-185378, US Pat. No. 4,921,786, Japanese Patent Publication No.
34599)

【００１１】[0011]

【化６】 （ただし、Ｅ４は、酸化型ＮＡＤおよびＳ４を基質とし
て消費して、還元型ＮＡＤおよびＰ４を生成する反応を
触媒するデヒドロゲナーゼ；Ｅ５は、還元型ＮＡＤおよ
びＳ５を消費して、酸化型ＮＡＤおよびＰ５を生成する
反応を触媒する作用物質；Ｓ４は、Ｅ４の還元型反応
物；Ｓ５は、Ｅ５の酸化型反応物；Ｐ４は、Ｓ４の酸化
型生成物；Ｐ５は、Ｓ５の還元型生成物をそれぞれ示
す。）Embedded image (However, E4 consumes oxidized NAD and S4 as a substrate to catalyze a reaction to produce reduced NAD and P4; E5 consumes reduced NAD and S5 to oxidize NAD and P5 S4 is a reduced form of E4; S5 is an oxidized form of E5; P4 is an oxidized form of S4; P5 is a reduced form of S5. Shown respectively.)

【００１２】[0012]

【化７】 （ただし、Ｅ６は、酸化型ＮＡＤを補酵素としＳ６を基
質として消費して、還型ＮＡＤおよびＰ６を生成する反
応を触媒するデヒドロゲナーゼ；Ｅ７は、還元型ＮＡＤ
を補酵素としＳ７を基質として消費して、酸化型ＮＡＤ
およびＰ７を生成する反応を触媒する作用物質；Ｅ８
は、Ｐ７を酸素を用いて酸化し、Ｓ７と過酸化水素を生
成する反応を触媒するオキシダーゼ；Ｓ６は、Ｅ６の還
元型反応物；Ｓ７は、Ｅ７の酸化型反応物；Ｐ６は、Ｓ
６の酸化型生成物；Ｐ７は、Ｓ７の還元型生成物をそれ
ぞれ示す。）Embedded image (However, E6 is a dehydrogenase that catalyzes the reaction of oxidizing NAD as a coenzyme and consuming S6 as a substrate to generate reduced NAD and P6; E7 is reduced NAD
Is consumed as a coenzyme and S7 is used as a substrate to produce oxidized NAD
And an agent which catalyzes the reaction producing P7; E8
Is an oxidase that catalyzes the reaction of oxidizing P7 with oxygen to generate S7 and hydrogen peroxide; S6 is a reduced reactant of E6; S7 is an oxidized reactant of E7;
6 is an oxidized product; and P7 is a reduced product of S7. )

【００１３】しかしながら、これらの方法でも、酵素や
反応試薬中のアンモニアや空気中からとけ込む検体以外
のアンモニアによる影響によって、ブランク（空試験）
値が高くなるために、再現性の低下を引き起こすという
問題があった。[0013] However, even in these methods, blanks (blank test) are caused by the effects of ammonia in enzymes and reagents and ammonia other than those dissolved in air.
There was a problem that the reproducibility was reduced due to the high value.

【００１４】[0014]

【発明が解決しようとする課題】ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤ
Ｐ、およびサイクリックＡＭＰ測定においては、高感度
で、汎用機器でも利用できる、または、携帯可能な機器
に利用できる測定法及び組成法を見いだす必要がある。
また、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオン測
定においては、低ブランクで、再現性の良い、高感度な
測定法及び組成物を見いだす必要がある。本発明の目的
は、これらの課題が解決されたＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤ
Ｐ、サイクリックＡＭＰ、アンモニアおよびアンモニウ
ムイオンの新規な測定法及びそれに用いる組成物を提供
する事にある。SUMMARY OF THE INVENTION ATP, AMP, AD
In the measurement of P and cyclic AMP, it is necessary to find a measurement method and a composition method which are highly sensitive and can be used in general-purpose devices or can be used in portable devices.
In the measurement of ammonia and / or ammonium ions, it is necessary to find a low blank, reproducible, highly sensitive measurement method and composition. It is an object of the present invention to provide an ATP, AMP, AD
An object of the present invention is to provide a novel method for measuring P, cyclic AMP, ammonia and ammonium ions, and a composition used therefor.

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段】前記の課題を解決するた
めに鋭意研究を重ねた結果、ＡＴＰを基質とする酵素と
ＡＭＰを基質とする酵素を用いて反応させ、その反応物
及び／または生成物を比色法、発光法、電極法で測定す
る事で低ブランクで、再現性良く、迅速簡便に、且つ、
高感度に測定する事ができるＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、
サイクリックＡＭＰ、アンモニアおよびアンモニウムイ
オンの測定法及びその測定のために用いる組成物を見出
し、本発明に到達した。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, an enzyme using ATP as a substrate and an enzyme using AMP as a substrate are reacted, and the reaction product and / or the product thereof are produced. Low blank, good reproducibility, quick and simple by measuring the product by colorimetric method, luminescent method and electrode method, and
ATP, AMP, ADP, which can measure with high sensitivity
The inventors have found a method for measuring cyclic AMP, ammonia and ammonium ions and a composition used for the measurement, and have reached the present invention.

【００１６】すなわち、本発明は、ＡＴＰを基質とする
酵素（ＥＩ）とＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）を用い
て、反応式（Ｉ）に記載の反応を行わせ、その反応によ
り消費された反応物および／または反応による生成物を
定量することを特徴とするＡＴＰおよび／またはＡＭ
Ｐ、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオン等の
微量成分の測定法である。That is, the present invention uses the enzyme (EI) using ATP as a substrate and the enzyme (E2) using AMP as a substrate to carry out the reaction described in the reaction formula (I), and is consumed by the reaction. ATP and / or AM characterized by quantifying the reacted product and / or the product of the reaction
This is a method for measuring trace components such as P, ammonia and / or ammonium ions.

【００１７】[0017]

【化１】 （ただし、式中Ｅ１は、ＡＴＰを基質とする酵素；Ｅ２
は、ＡＭＰを基質とする酵素；Ｓ１は、Ｅ１の反応物；
Ｐ１は、Ｓ１とＥ１の反応からの生成物；Ｓ２は、Ｅ２
の反応物；Ｐ２は、Ｓ２とＥ２の反応からの生成物をそ
れぞれ示す。）Embedded image (Where E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2
Is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reaction product of E1;
P1 is the product from the reaction of S1 with E1; S2 is E2
P2 represents the product from the reaction of S2 and E2, respectively. )

【００１８】また、ＡＴＰを基質とする酵素（ＥＩ）、
ＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）及びピルビン酸カイネ
スを用いて反応式（ＩＩ）の反応をさせ、その反応によ
り消費された反応物および／または反応による生成物を
定量することを特徴とするＡＴＰ、ＡＭＰ、およびＡＤ
Ｐ等の微量成分の測定法である。Also, an enzyme (EI) using ATP as a substrate,
ATP characterized by reacting the reaction formula (II) using an enzyme (E2) using AMP as a substrate and chines pyruvate, and quantifying a reaction product consumed by the reaction and / or a product by the reaction. , AMP, and AD
This is a method for measuring trace components such as P.

【００１９】[0019]

【化２】 （ただし、式中Ｅ１は、ＡＴＰを基質とする酵素；Ｅ２
は、ＡＭＰを基質とする酵素；Ｓ１は、Ｅ１の反応物；
Ｐ１は、Ｓ１とＥ１の反応からの生成物；Ｓ２は、Ｅ２
の反応物；Ｐ２は、Ｓ２とＥ２の反応からの生成物をそ
れぞれ示す。）Embedded image (Where E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2
Is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reaction product of E1;
P1 is the product from the reaction of S1 with E1; S2 is E2
P2 represents the product from the reaction of S2 and E2, respectively. )

【００２０】また、ＡＴＰを基質とする酵素（ＥＩ）、
ＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）及びサイクリック
３’、５’−ヌクレオチドホスホジエステラーゼを用い
て反応式（ＩＩＩ）の反応をさせ、その反応により消費
された反応物および／または反応による生成物を定量す
ることを特徴とするＡＴＰ、ＡＭＰ、およびサイクリッ
クＡＭＰ等の微量成分の測定法である。An enzyme (EI) using ATP as a substrate,
The reaction of the reaction formula (III) is carried out using an enzyme (E2) using AMP as a substrate and cyclic 3 ′, 5′-nucleotide phosphodiesterase, and a reaction product consumed by the reaction and / or a product by the reaction are quantified. This is a method for measuring trace components such as ATP, AMP, and cyclic AMP.

【００２１】[0021]

【化３】 （ただし、式中Ｅ１は、ＡＴＰを基質とする酵素；Ｅ２
は、ＡＭＰを基質とする酵素；Ｓ１は、Ｅ１の反応物；
Ｐ１は、Ｓ１とＥ１の反応からの生成物；Ｓ２は、Ｅ２
の反応物；Ｐ２は、Ｓ２とＥ２の反応からの生成物をそ
れぞれ示す。）Embedded image (Where E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2
Is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reaction product of E1;
P1 is the product from the reaction of S1 with E1; S2 is E2
P2 represents the product from the reaction of S2 and E2, respectively. )

【００２２】また、ＡＴＰを基質とする酵素（ＥＩ）と
ＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）と過剰量の基質とを含
有する微量成分測定用組成物である。The present invention also provides a composition for measuring a minor component, comprising an enzyme (EI) using ATP as a substrate, an enzyme (E2) using AMP as a substrate, and an excess amount of a substrate.

【００２３】以下、本発明に係わる微量成分の測定法及
びその組成物について具体的に説明する。Hereinafter, a method for measuring a trace component and a composition thereof according to the present invention will be described in detail.

【００２４】［ＡＴＰを基質とする酵素］本発明に係わ
るＡＴＰを基質とする酵素（Ｅ１）を以下に示すが、こ
れにより何ら本発明が限定されるものではない。 ＜１＞ＮＡＤシンセターゼ（ＮＡＤ ｓｙｎｔｈｅｔａ
ｓｅ：ＥＣ ６．３．１．５およびＥＣ ６．３．５．
１） ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋アンモニア⇒ ＡＭＰ＋Ｎ
ＡＤ＋ピロリン酸イオン ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋Ｌ−グルタミン＋Ｈ２Ｏ⇒
ＡＭＰ＋ＮＡＤ＋グルタミン酸＋ピロリン酸イオン[Enzyme Using ATP as Substrate] The enzyme (E1) using ATP as a substrate according to the present invention is shown below, but the present invention is not limited thereto. <1> NAD synthetase (NAD syntheta)
se: EC 6.3.1.5 and EC 6.3.5.
1) ATP + deamide-NAD + ammonia⇒AMP + N
AD + pyrophosphate ion ATP + deamide-NAD + L-glutamine + H2O ⇒
AMP + NAD + glutamate + pyrophosphate ion

【００２５】＜２＞ リボースホスフェイトピロホスホ
カイネス（Ｒｉｂｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｙｒｏ
ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ：ＥＣ ２．７．６．１） ＡＴＰ＋Ｄ−リボース−５−ホスフェイト⇒ ＡＭＰ＋
５−ホスホ−α−Ｄ−リボシルピロホスフェイト<2> Ribose phosphate pyrophosphate
phosphokinase: EC 2.7.6.1) ATP + D-ribose-5-phosphate⇒AMP +
5-phospho-α-D-ribosyl pyrophosphate

【００２６】＜３＞ チアミンピロホスホカイネス（Ｔ
ｈｉａｍｉｎ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ：
ＥＣ ２．７．６．２） ＡＴＰ＋チアミン ⇒ ＡＭＰ＋チアミンピロホスフェ
イト<3> Thiamine pyrophosphokines (T
hiamin pyrophosphokinase:
EC 2.7.6.2) ATP + thiamine ⇒ AMP + thiamine pyrophosphate

【００２７】＜４＞ ２−アミノ−４−ヒドロキシ−６
−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホカイ
ネス（２−Ａｍｉｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｈｙ
ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｐｔｅｒｉｄｉ
ｎｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ：ＥＣ
２．７．６．３） ＡＴＰ＋２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシ
メチル−７，８−ジヒドロプテリジン ⇒ ＡＭＰ＋２
−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−
７，８−ジヒドロプテリジン−６−ジフォスフェイト<4> 2-amino-4-hydroxy-6
-Hydroxymethyldihydropteridine pyrophosphokines (2-Amino-4-hydroxy-6-hy
hydroxymethyldihydroterteridi
ne pyrophosphokinase: EC
2.7.6.3) ATP + 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine ⇒ AMP + 2
-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-
7,8-dihydropteridine-6-diphosphate

【００２８】＜５＞ ヌクレオチドピロホスホカイネス
（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｋｉ
ｎａｓｅ：ＥＣ ２．７．６．４） ＡＴＰ＋グアノシン三リン酸⇒ ＡＭＰ＋グアノシン
５’−トリホスフェイト ３’−ジフォスフェイト<5> Nucleotide pyrophosphokines
case: EC 2.7.6.4) ATP + guanosine triphosphate → AMP + guanosine
5'-triphosphate 3'-diphosphate

【００２９】＜６＞ アピラーゼ（Ａｐｙｒａｓｅ：Ｅ
Ｃ ３．６．１．５） ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏ ⇒ ＡＤＰ＋リン酸イオン ＡＤＰ＋Ｈ２Ｏ ⇒ ＡＭＰ＋リン酸イオン<6> Apyrase (Epyrase: E)
C 3.6.1.5) ATP + H2O ⇒ ADP + phosphate ADP + H2O ⇒ AMP + phosphate

【００３０】＜７＞ ＡＴＰピロホスファターゼ（ＡＴ
Ｐ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＥＣ ３．６．
１．８） ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏ ⇒ ＡＭＰ＋ピロリン酸イオン<7> ATP pyrophosphatase (AT
P pyrophosphatase: EC 3.6.
1.8) ATP + H2O ⇒ AMP + pyrophosphate ion

【００３１】＜８＞ コロイル−ＣｏＡ シンセターゼ
（Ｃｈｏｌｏｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：Ｅ
Ｃ ６．２．１．７） ＡＴＰ＋コール酸＋ＣｏＡＳＨ⇒ ＡＭＰ＋コロイル−
ＣｏＡ＋ピロリン酸イオン<8> Choroyl-CoA synthetase (E)
C 6.2.1.7) ATP + Cholic acid + CoASH⇒AMP + Coloil-
CoA + pyrophosphate ion

【００３２】＜９＞ パントテネイト シンセターゼ
（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：
ＥＣ ６．３．２．１） ＡＴＰ＋パントイン酸＋β−アラニン⇒ ＡＭＰ＋パン
トテン酸＋ピロリン酸<9> Pantothenate synthetase:
EC 6.3.2.1) ATP + pantoic acid + β-alanine → AMP + pantothenic acid + pyrophosphate

【００３３】＜１０＞ ２，３−ジヒドロキシベンゾイ
ルセリンシンセターゼ（２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂ
ｅｎｚｏｙｌｓｅｒｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：Ｅ
Ｃ ６．３．２．１４） ＡＴＰ＋２，３−ジヒドロキシ安息香酸＋Ｌ−セリン⇒
ＡＭＰ＋２，３−ジヒドロキシベンゾイル−Ｌ−セリ
ン＋ピロリン酸イオン<10> 2,3-dihydroxybenzoylserine synthetase (2,3-dihydroxyb)
Enzoylserine synthase: E
C 6.3.2.14) ATP + 2,3-dihydroxybenzoic acid + L-serine
AMP + 2,3-dihydroxybenzoyl-L-serine + pyrophosphate ion

【００３４】＜１１＞ ビオチン−［メチルマロニル−
ＣｏＡ−カルボキシトランスフェラーゼ］シンセターゼ
（Ｂｉｏｔｉｎ−［ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−Ｃｏ
Ａ−ｃａｒｂｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ］ ｓｙｎ
ｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．３．４．９） ＡＴＰ＋アポトランスカルボキシラーゼ＋ビオチン⇒
ＡＭＰ＋ホロトランスカルボキシラーゼ＋ピロリン酸イ
オン<11> Biotin- [methylmalonyl-
CoA-carboxytransferase] synthetase (Biotin- [methylmalonyl-Co
A-carboxytransferase] syn
thetase: EC 6.3.4.9) ATP + apotranscarboxylase + biotin⇒
AMP + holotranscarboxylase + pyrophosphate ion

【００３５】＜１２＞ ビオチン−［プロピオニル−Ｃ
ｏＡ−カルボキシトランスフェラーゼ（ＡＴＰ−ハイド
ロリジング）］シンセターゼ（Ｂｉｏｔｉｎ−［ｐｒｏ
ｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＡＴ
Ｐ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ）］ ｓｙｎｔｈｅｔａｓ
ｅ：ＥＣ ６．３．４．１０） ＡＴＰ＋プロピオニル−ＣｏＡアポカルボキシラーゼ＋
ビオチン ⇒ＡＭＰ＋プロピオニル−ＣｏＡホロトラン
スカルボキシラーゼ＋ピロリン酸イオン<12> Biotin- [propionyl-C
oA-carboxytransferase (ATP-hydroriding)] synthetase (Biotin- [pro
pionyl-CoA-carboxylase (AT
P-hydrolyzing)] synthetas
e: EC 6.3.4.10) ATP + propionyl-CoA apocarboxylase +
Biotin ⇒ AMP + propionyl-CoA holotranscarboxylase + pyrophosphate ion

【００３６】＜１３＞ ビオチン−［メチルクロトノイ
ル−ＣｏＡ−カルボキシトランスフェラーゼ］シンセタ
ーゼ（Ｂｉｏｔｉｎ−［ｍｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｏｙ
ｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ］
ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ６．３．４．１１） ＡＴＰ＋メチルクロトノイル−ＣｏＡアポカルボキシラ
ーゼ＋ビオチン ⇒ ＡＭＰ＋メチルクロトノイル−Ｃ
ｏＡホロトランスカルボキシラーゼ＋ピロリン酸イオン<13> Biotin- [methylcrotonoyl-CoA-carboxytransferase] synthetase (Biotin- [methylcrotonoy)
l-CoA-carboxytransferase]
synthase: EC 6.3.4.11) ATP + Methylcrotonoyl-CoA apocarboxylase + Biotin ⇒ AMP + Methylcrotonoyl-C
oA holotranscarboxylase + pyrophosphate ion

【００３７】ＮＡＤ合成酵素（ＥＣ ６．３．１．５お
よびＥＣ ６．３．５．１）は特に限定されるものでは
ないが、例えば特開昭６３−１８５３７８号公報、米国
特許第４９２１７８６号明細書に示されたＮＡＤ合成酵
素（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ Ｈ−８０４由来：ＦＥＲＭ ＢＰ−１４０８
およびＦＥＲＭ ＢＰ−５３８１）が特異性、及び、安
定性の点で好ましい。ＮＡＤ合成酵素の濃度は例えば
０．０１ｕ／ｍＬ〜５００ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１
ｕ／ｍＬ〜１００ｕ／ｍＬ、最適には０．２ｕ／ｍＬ〜
２０ｕ／ｍＬの濃度範囲で用いられる。NAD synthases (EC 6.3.1.5 and EC 6.3.5.1) are not particularly limited, but are described in, for example, JP-A-63-185378 and US Pat. No. 4,921,786. The NAD synthase (Bacillus stearothermoph) shown in the specification
From ilus H-804: FERM BP-1408
And FERM BP-5381) are preferred in terms of specificity and stability. The concentration of NAD synthase is, for example, 0.01 u / mL to 500 u / mL, preferably 0.1 u / mL.
u / mL ~ 100u / mL, optimally 0.2u / mL ~
Used in a concentration range of 20 u / mL.

【００３８】［ＡＭＰを基質とする酵素］本発明に係わ
るＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）を以下に示すが、こ
れにより何ら本発明が限定されるものではない。[Enzyme Using AMP as Substrate] The enzyme (E2) using AMP according to the present invention as a substrate is shown below, but the present invention is not limited thereto.

【００３９】＜１＞ ピルビベイト オルソホスフェイ
ト ジカイネス（Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｏｒｔｈｏｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ：ＥＣ ２．７．９．
１） ＡＭＰ＋ホスホエノールピルビン酸＋ピロリン酸イオン
⇔ＡＴＰ＋ピルビン酸＋リン酸イオン<1> Pyruvate, orthophosphate dicines (Pyruvate, orthophophos)
sphate kinase: EC 2.7.9.
1) AMP + phosphoenolpyruvate + pyrophosphate ion ATP + pyruvate + phosphate ion

【００４０】＜２＞ ピルビベイト ウォーター ジカ
イネス（Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｗａｔｅｒ ｄｉｋｉｎａ
ｓｅ：ＥＣ ２．７．９．２） ＡＭＰ＋ホスホエノールピルビン酸＋リン酸イオン⇔Ａ
ＴＰ＋ピルビン酸＋Ｈ２Ｏ<2> Pyruvate, water dicina
se: EC 2.7.9.2) AMP + phosphoenolpyruvate + phosphate リ ン 酸 A
TP + pyruvic acid + H2O

【００４１】＜３＞ フェニルアラニンラセマーゼ（Ｐ
ｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｒａｃｅｍａｓｅ：ＥＣ
５．１．１．１１） ＡＭＰ＋Ｄ−フェニルアラニン＋ピロリン酸イオン⇔Ａ
ＴＰ＋Ｌ−フェニルアラニン＋Ｈ２Ｏ<3> Phenylalanine racemase (P
henylalanineracemase: EC
5.1.1.11) AMP + D-phenylalanine + pyrophosphate ion ΔA
TP + L-phenylalanine + H2O

【００４２】＜４＞チロシル−ｔＲＮＡ シンセターゼ
（Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：
ＥＣ ６．１．１．１） ＡＭＰ＋Ｌ−チロシル−ｔＲＮＡ＋ピロリン酸イオン⇔
ＡＴＰ＋Ｌ−チロシン＋ｔＲＮＡ<4> Tyrosyl-tRNA synthetase:
EC 6.1.1.1) AMP + L-tyrosyl-tRNA + pyrophosphate⇔
ATP + L-tyrosine + tRNA

【００４３】＜５＞トリプトファニル−ｔＲＮＡ シン
セターゼ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙ
ｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．１．１．２） ＡＭＰ＋Ｌ−トリプトファニル−ｔＲＮＡ＋ピロリン酸
イオン⇔ＡＴＰ＋Ｌ−トリプトファン＋ｔＲＮＡ<5> Tryptophanyl-tRNA synthetase (Tryptophanyl-tRNA sy
netase: EC 6.1.1.2) AMP + L-tryptophanyl-tRNA + pyrophosphate⇔ATP + L-tryptophan + tRNA

【００４４】＜６＞アセチル−ＣｏＡ シンセターゼ
（Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ
６．２．１．１） ＡＭＰ＋アセチルＣｏＡ＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ＋
アセチル酸＋ＣｏＡＳＨ<6> Acetyl-CoA synthetase (EC
6.2.1.1) AMP + acetyl-CoA + pyrophosphate @ ATP +
Acetyl acid + CoASH

【００４５】＜７＞ブチリル−ＣｏＡ シンセターゼ
（Ｂｕｔｙｒｙｌ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．
２．１．２） ＡＭＰ＋ブチリルＣｏＡ＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ＋
ブチリル酸＋ＣｏＡＳＨ<7> Butyryl-CoA synthetase (EC)
2.1.2) AMP + butyryl-CoA + pyrophosphate ion @ ATP +
Butyric acid + CoASH

【００４６】＜８＞アシル−ＣｏＡ シンセターゼ（Ａ
ｃｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．
２．１．３） ＡＭＰ＋アシルＣｏＡ＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ＋ア
シル酸＋ＣｏＡＳＨ<8> Acyl-CoA synthetase (A
5. cyl-CoA synthase: EC
2.1.3) AMP + acyl CoA + pyrophosphate ion ATP + acyl acid + CoASH

【００４７】＜９＞オキサリル−ＣｏＡ シンセターゼ
（Ｏｘａｌｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ
６．２．１．８） ＡＭＰ＋オキサリル−ＣｏＡ＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴ
Ｐ＋オキサリル酸＋ＣｏＡ<9> Oxalyl-CoA synthetase (EC)
6.2.1.8) AMP + oxalyl-CoA + pyrophosphate ion @AT
P + oxalic acid + CoA

【００４８】＜１０＞ビオチニル−ＣｏＡ シンセター
ゼ（Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓ
ｅ：ＥＣ ６．２．１．１１） ＡＭＰ＋ｄ−ビオチニル−ＣｏＡ＋ピロリン酸イオン⇔
ＡＴＰ＋ｄ−ビオチン＋ＣｏＡ<10> Biotinyl-CoA synthetase (Biotinyl-CoA synthetas)
e: EC 6.2.1.11) AMP + d-biotinyl-CoA + pyrophosphate ion⇔
ATP + d-biotin + CoA

【００４９】＜１１＞４−クマロイル−ＣｏＡ シンセ
ターゼ（４−Ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈ
ｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．２．１．１２） ＡＭＰ＋４−クマロイル−ＣｏＡ＋ピロリン酸イオン⇔
ＡＴＰ＋クマリン酸＋ＣｏＡ<11> 4-Coumaroyl-CoA synthetase (4-Coumaroyl-CoA synth)
etase: EC 6.2.1.12) AMP + 4-coumaroyl-CoA + pyrophosphate ion⇔
ATP + coumaric acid + CoA

【００５０】＜１２＞アスパラギン シンセターゼ（Ａ
ｓｐａｒａｇｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ
６．３．１．１及びＥＣ ６．３．５．４） ＡＭＰ＋Ｌ−アスパラギン＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ
＋Ｌ−アスパラギン酸＋アンモニウムイオン ＡＭＰ＋Ｌ−アスパラギン＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ
＋Ｌ−アスパラギン酸＋グルタミン<12> Asparagine synthetase (A
spargine synthase: EC
6.3.1.1 and EC 6.3.5.4) AMP + L-asparagine + pyrophosphate ion @ ATP
+ L-aspartic acid + ammonium ion AMP + L-asparagine + pyrophosphate ion ATP
+ L-aspartic acid + glutamine

【００５１】＜１３＞カルノシン シンセターゼ（Ｃａ
ｒｎｏｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．
３．２．１１） ＡＭＰ＋カルノシン＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ＋Ｌ−
ヒスチジン＋β−アラニン<13> Carnosine synthetase (Ca
rnosine synthase: EC
3.2.11) AMP + carnosine + pyrophosphate ion ATP + L-
Histidine + β-alanine

【００５２】＜１４＞アルギノコハク酸 シンセターゼ
（Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅ
ｔａｓｅ：ＥＣ ６．３．４．５） ＡＭＰ＋アルギノコハク酸＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ
＋シトルリン＋アスパラギン酸<14> Arginosuccinate synthase (Argininosuccinate synthese)
case: EC 6.3.4.5) AMP + arginosuccinic acid + pyrophosphate ion @ ATP
+ Citrulline + aspartic acid

【００５３】＜１５＞ビオチン−［アセチル−ＣｏＡ−
カルボキシトランスフェラーゼ］ シンセターゼ（Ｂｉ
ｏｔｉｎ−［Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ］ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ
６．３．４．１５） ＡＭＰ＋［アセチル−ＣｏＡ：カルボン−ジオキサイド
リガーゼ］＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴＰ＋アポ−［ア
セチル−ＣｏＡ：カルボン−ジオキサイド リガーゼ］
＋ビオチン<15> Biotin- [acetyl-CoA-
Carboxytransferase] Synthetase (Bi
otin- [Acetyl-CoA-carboxyt
[transferase] synthase: EC
6.3.4.15) AMP + [acetyl-CoA: carboxyl-dioxide ligase] + pyrophosphate ion ATP + apo- [acetyl-CoA: carboxyl-dioxide ligase]
+ Biotin

【００５４】＜１６＞ポリデオキシリボヌクレオチド
シンセターゼ（Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＥＣ ６．５．
１．１及びＥＣ ６．５．１．２） ＡＭＰ＋（ｄＮＭＰ）ｍ＋ｎ＋ピロリン酸イオン⇔ＡＴ
Ｐ＋（ｄＮＭＰ）ｍ＋（ｄＮＭＰ）ｎ ＡＭＰ＋（ｄＮＭＰ）ｍ＋ｎ＋ＮＭＮ⇔ＡＴＰ＋（ｄＮ
ＭＰ）ｍ＋（ｄＮＭＰ）ｎ<16> Polydeoxyribonucleotide
Synthetase (Polydeoxyribonucle)
oide synthase: EC 6.5.
1.1 and EC 6.5.1.2) AMP + (dNMP) m + n + pyrophosphate @ AT
P + (dNMP) m + (dNMP) n AMP + (dNMP) m + n + NMN⇔ATP + (dNMP
MP) m + (dNMP) n

【００５５】ピルビン酸リン酸化酵素としては上記のＰ
ＰＤＫ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ：ＥＣ ２．７．９．１）とＰ
ＷＤＫ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｗａｔｅｒ ｄｉｋｉｎａ
ｓｅ：ＥＣ ２．７．９．２）が挙げられ、ＰＰＤＫは
アセトバクター・キシリヌム、プロピオニバクター・シ
ェルマニー、バクテロイデス・シンビオサスおよびトウ
モロコシ葉などに、ＰＷＤＫはエッシェリヒア・コリ、
サルモネラ・チフィムリウム（酵素ハンドブック、１９
８７年）およびピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６
３８菌株（１９９８年度、日本農芸化学会大会講演要旨
集、２１３、大島ら）などにその存在が知られている。As the pyruvate kinase, the above-mentioned P
PDK (Pyruvate, orthophospha)
te kinase: EC 2.7.9.1) and P
WDK (Pyruvate, water dikina)
se: EC 2.7.9.2), PPDK is used for Acetobacter xylinum, Propionibacter shelmani, Bacteroides symbiosus and corn leaf, and PWDK is used for Escherichia coli,
Salmonella typhimurium (Enzyme Handbook, 19
1987) and Pyrococcus furiosas DSM36
Its existence is known in 38 strains (1998, Abstracts of Japanese Society of Agricultural Chemistry, 213, Oshima et al.).

【００５６】これらは上記菌株の培養物あるいは植物か
ら取得すれば良く、例えばＰＷＤＫの生産菌の培養方法
は後述の培地を用いて、培養温度は菌の生育する温度範
囲で行えばよく、１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０
℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最高力価
となる培養時間、例えば１〜３日で目的とする酵素を採
取すればよい。These may be obtained from cultures or plants of the above-mentioned strains. For example, the method for culturing PWDK-producing bacteria may be carried out using a medium described below and at a culturing temperature within a temperature range in which the bacteria grow. 45 ° C, preferably 25-40
° C. The culture time may be the culture time at which the target enzyme has the highest titer, for example, 1 to 3 days.

【００５７】ＰＷＤＫは主としてその菌体内に含有、蓄
積されており、その菌体内から抽出すればよい。その抽
出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分離などによっ
て分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など
の緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビ
ーズなどによって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗
酵素液として回収する。PWDK is mainly contained and accumulated in the cells, and may be extracted from the cells. To illustrate the extraction method, cells are separated from the culture by centrifugation, suspended in a buffer such as phosphate buffer, Tris-HCl buffer, lysozyme, ultrasonic, glass beads, etc. And centrifuged, and the soluble fraction is recovered as a crude enzyme solution.

【００５８】このようにして得られた粗製のＰＷＤＫ含
有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処
理することにより、精製されたＰＷＤＫを得る事ができ
る。例えば、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオ
ン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法
などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精
製ＰＷＤＫを得る事ができ、適宜安定化剤例えばショ
糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補
酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて、凍結、ある
いは凍結乾燥させても良い。ＰＷＤＫの濃度は例えば
０．０１ｕ／ｍＬ〜５００ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１
ｕ／ｍＬ〜２００ｕ／ｍＬ、最適には０．２ｕ／ｍＬ〜
５０ｕ／ｍＬの濃度範囲で用いられる。The thus-obtained crude PWDK-containing solution is treated with known protein and enzyme isolation and purification means, whereby purified PWDK can be obtained. For example, it is possible to obtain a purified PWDK by appropriately selecting and combining common enzyme purification methods such as a salting out method using ammonium sulfate, an ion exchange chromatography method, a hydrophobic chromatography method, an affinity chromatography method, and a gel filtration method, An appropriate stabilizer such as sucrose or glycerol may be added in an amount of about 5 to 50%, and an amino acid or coenzyme may be added in an amount of about 0.01 to 0.1%. The concentration of PWDK is, for example, 0.01 u / mL to 500 u / mL, preferably 0.1 u / mL.
u / mL ~ 200u / mL, optimally 0.2u / mL ~
Used in a concentration range of 50 u / mL.

【００５９】［測定対象である微量成分］本発明で測定
される微量成分としては、ＡＴＰ、ＡＭＰ、アンモニ
ア、アンモニウムイオン、デアミド−ＮＡＤ、ホスホエ
ノールピルビン酸、ピロリン酸イオン、リン酸イオン、
Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシル−ｔＲＮＡ、Ｌ−
トリプトファニル−ｔＲＮＡ、アセチルＣｏＡ、ブチリ
ルＣｏＡ、アシルＣｏＡ、オキサリル−ＣｏＡ、ｄ−ビ
オチニル−ＣｏＡ、４−クマロイル−ＣｏＡ、Ｌ−アス
パラギン、カルノシン、アルギノコハク酸、［アセチル
−ＣｏＡ：カルボン−ジオキサイド リガーゼ］、ｄＮ
ＭＰ（ヌクレオチド）、Ｄ−リボース−５−ホスフェイ
ト、チアミン、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒド
ロキシメチル−７，８−ジヒドロプテリジン、グアノシ
ン三リン酸、コール酸、ＣｏＡＳＨ、パントイン酸、β
−アラニン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、Ｌ−セリ
ン、アポトランスカルボキシラーゼ、ビオチン、プロピ
オニル−ＣｏＡアポカルボキシラーゼ、メチルクロトノ
イル−ＣｏＡアポカルボキシラーゼ等が挙げられる。[A trace component to be measured] The trace components measured in the present invention include ATP, AMP, ammonia, ammonium ion, deamide-NAD, phosphoenolpyruvate, pyrophosphate ion, phosphate ion,
D-phenylalanine, L-tyrosyl-tRNA, L-
Tryptophanyl-tRNA, acetyl-CoA, butyryl-CoA, acyl-CoA, oxalyl-CoA, d-biotinyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA, L-asparagine, carnosine, alginosuccinic acid, [acetyl-CoA: carboxyl-dioxide ligase], dN
MP (nucleotide), D-ribose-5-phosphate, thiamine, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, guanosine triphosphate, cholic acid, CoASH, pantoic acid, β
-Alanine, 2,3-dihydroxybenzoic acid, L-serine, apotranscarboxylase, biotin, propionyl-CoA apocarboxylase, methylcrotonoyl-CoA apocarboxylase and the like.

【００６０】［基質］本発明の測定法あるいは組成物で
用いる基質としては、ＡＴＰ、ＡＭＰ、アンモニア、ア
ンモニウムイオン、デアミド−ＮＡＤ、ホスホエノール
ピルビン酸、ピロリン酸化合物、リン酸化合物、Ｄ−フ
ェニルアラニン、Ｌ−チロシル−ｔＲＮＡ、Ｌ−トリプ
トファニル−ｔＲＮＡ、アセチルＣｏＡ、ブチリルＣｏ
Ａ、アシルＣｏＡ、オキサリル−ＣｏＡ、ｄ−ビオチニ
ル−ＣｏＡ、４−クマロイル−ＣｏＡ、Ｌ−アスパラギ
ン、カルノシン、アルギノコハク酸、［アセチル−Ｃｏ
Ａ：カルボン−ジオキサイド リガーゼ］、ｄＮＭＰ
（ヌクレオチド）、Ｄ−リボース−５−ホスフェイト、
チアミン、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキ
シメチル−７，８−ジヒドロプテリジン、グアノシン三
リン酸、コール酸、ＣｏＡＳＨ、パントイン酸、β−ア
ラニン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、Ｌ−セリン、
アポトランスカルボキシラーゼ、ビオチン、プロピオニ
ル−ＣｏＡアポカルボキシラーゼ、メチルクロトノイル
−ＣｏＡアポカルボキシラーゼ等が挙げられる。[Substrate] ATP, AMP, ammonia, ammonium ion, deamide-NAD, phosphoenolpyruvate, pyrophosphate compound, phosphate compound, D-phenylalanine, ATP, AMP, ammonia, ammonium ion, deamide-NAD, L-tyrosyl-tRNA, L-tryptophanyl-tRNA, acetyl CoA, butyryl Co
A, acyl CoA, oxalyl-CoA, d-biotinyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA, L-asparagine, carnosine, alginosuccinic acid, [acetyl-Co
A: carboxyl-dioxide ligase], dNMP
(Nucleotide), D-ribose-5-phosphate,
Thiamine, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine, guanosine triphosphate, cholic acid, CoASH, pantoic acid, β-alanine, 2,3-dihydroxybenzoic acid, L-serine ,
Examples include apotranscarboxylase, biotin, propionyl-CoA apocarboxylase, and methylcrotonoyl-CoA apocarboxylase.

【００６１】本発明の過剰量とは、反応速度が最大を示
す濃度以上の濃度のことであり、本発明の測定法あるい
は組成物においては、基質を過剰量で使用する。例えば
デアミド−ＮＡＤの使用量は、特に限定されるものでは
ないが、０．００５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは０．
０５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で用いられる。The excess amount in the present invention means a concentration higher than the concentration at which the reaction rate shows the maximum, and in the assay method or composition of the present invention, the substrate is used in an excessive amount. For example, the amount of deamide-NAD used is not particularly limited, but is 0.005 mM to 500 mM, preferably 0.1 mM.
Used in a concentration range of 05 mM to 50 mM.

【００６２】また、アンモニウムイオンの使用量は、特
に限定されるものではないが、例えば塩化アンモニウム
として、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは０．
１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲である。The amount of ammonium ion to be used is not particularly limited, but is, for example, 0.01 mM to 1000 mM, preferably 0.1 mM as ammonium chloride.
The concentration ranges from 1 mM to 100 mM.

【００６３】また、ＡＴＰの使用量は、特に限定される
ものではないが、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好まし
くは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲である。また、
ＡＭＰの使用量は、反応速度が最大を示すような濃度以
上であればよく、特に限定されるものではないが、０．
０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１０
０ｍＭの濃度範囲である。 また、ホスホエノールピル
ビン酸の使用量は、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ま
しくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲である。The amount of ATP used is not particularly limited, but is in the range of 0.01 mM to 1000 mM, preferably 0.1 mM to 100 mM. Also,
The amount of AMP used is not particularly limited as long as it is equal to or higher than the concentration at which the reaction rate shows the maximum.
01 mM to 1000 mM, preferably 0.1 mM to 10
The concentration range is 0 mM. The amount of phosphoenolpyruvate used is in a concentration range of 0.01 mM to 1000 mM, preferably 0.1 mM to 100 mM.

【００６４】また、リン酸化合物の使用量は、０．０１
ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍ
Ｍの濃度範囲である。リン酸化合物としては、リン酸、
リン酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン
酸二水素アンモニウム、リン酸水素アンモニウムナトリ
ウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸
二水素カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナト
リウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カルシウム、
リン酸一水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、リ
ン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、リン酸水
素マグネシウムアンモニウム、リン酸バリウム、リン酸
水素バリウム、リン酸二水素バリウム、リン酸二水素リ
チウム、リン酸二水素マンガン（ＩＩ）等が挙げられ
る。The amount of the phosphoric acid compound used is 0.01
mM to 1000 mM, preferably 0.1 mM to 100 m
M is the concentration range. Phosphoric acid compounds include phosphoric acid,
Ammonium phosphate, diammonium hydrogen phosphate, ammonium dihydrogen phosphate, ammonium sodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, sodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, phosphoric acid Sodium dihydrogen, calcium phosphate,
Calcium monohydrogen phosphate, calcium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium ammonium hydrogen phosphate, barium phosphate, barium hydrogen phosphate, barium dihydrogen phosphate, lithium dihydrogen phosphate, phosphoric acid Manganese dihydrogen (II) and the like can be mentioned.

【００６５】また、ピロリン酸化合物の使用量は、０．
０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１０
０ｍＭの濃度範囲である。ピロリン酸化合物としては、
ピロリン酸、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸カルシウ
ム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸マグネシウム、
ピロリン酸二水素二ナトリウム等が挙げられる。The amount of the pyrophosphate compound used is 0.1
01 mM to 1000 mM, preferably 0.1 mM to 10
The concentration range is 0 mM. As pyrophosphate compounds,
Pyrophosphate, potassium pyrophosphate, calcium pyrophosphate, sodium pyrophosphate, magnesium pyrophosphate,
And disodium dihydrogen pyrophosphate.

【００６６】また、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシ
ル−ｔＲＮＡ、Ｌ−トリプトファニル−ｔＲＮＡ、アセ
チルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、アシルＣｏＡ、オキサリ
ル−ＣｏＡ、ｄ−ビオチニル−ＣｏＡ、４−クマロイル
−ＣｏＡ、Ｌ−アスパラギン、カルノシン、アルギノコ
ハク酸、［アセチル−ＣｏＡ：カルボン−ジオキサイド
リガーゼ］、ｄＮＭＰ（ヌクレオチド）、Ｄ−リボー
ス−５−ホスフェイト、チアミン、２−アミノ−４−ヒ
ドロキシ−６−ヒドロキシメチル−７，８−ジヒドロプ
テリジン、グアノシン三リン酸、コール酸、ＣｏＡＳ
Ｈ、パントイン酸、β−アラニン、２，３−ジヒドロキ
シ安息香酸、Ｌ−セリン、アポトランスカルボキシラー
ゼ、ビオチン、プロピオニル−ＣｏＡアポカルボキシラ
ーゼメチルクロトノイル−ＣｏＡアポカルボキシラーゼ
の使用量は、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは
０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲である。Also, D-phenylalanine, L-tyrosyl-tRNA, L-tryptophanyl-tRNA, acetyl-CoA, butyryl-CoA, acyl-CoA, oxalyl-CoA, d-biotinyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA, L-asparagine, Carnosine, alginosuccinic acid, [acetyl-CoA: carboxyl-dioxide ligase], dNMP (nucleotide), D-ribose-5-phosphate, thiamine, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydro Pteridine, guanosine triphosphate, cholic acid, CoAS
H, pantoic acid, β-alanine, 2,3-dihydroxybenzoic acid, L-serine, apotranscarboxylase, biotin, propionyl-CoA apocarboxylase methylcrotonoyl-CoA apocarboxylase is used in an amount of 0.01 mM to 1000 mM, Preferably, the concentration ranges from 0.1 mM to 100 mM.

【００６７】ＮＡＤ合成酵素は活性化にマグネシウムイ
オンまたはマンガンイオンを必要とし、またカリウムイ
オンでさらに活性化される。活性化に用いられるマグネ
シウムイオンまたはマンガンイオンの使用量は、反応速
度が最大を示すような濃度以上であればよく、例えば塩
化マグネシウムまたは塩化マンガンとして０．０５ｍＭ
〜５００ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１００ｍＭ程度
である。 また必要であれば塩化カリウム、ＢＳＡ等も
適宜添加される。また、ＮＡＤ合成酵素は活性化にマグ
ネシウムイオンまたはマンガンイオンを必要とし、また
カリウムイオンでさらに活性化されることから、その活
性化率を測定することでマグネシウムイオンまたはマン
ガンイオン、およびカリウムイオンの濃度を測定するこ
とが出来る。またこれらの他に適宜界面活性剤、防腐
剤、活性化剤、安定化剤、緩衝剤等を加えることができ
る。NAD synthase requires magnesium or manganese ions for activation and is further activated by potassium ions. The amount of the magnesium ion or manganese ion used for the activation may be a concentration that is higher than the concentration at which the reaction rate shows the maximum, for example, 0.05 mM as magnesium chloride or manganese chloride.
It is about 500 mM, preferably about 0.5 mM to 100 mM. If necessary, potassium chloride, BSA and the like are added as appropriate. NAD synthase requires magnesium ion or manganese ion for activation and is further activated by potassium ion. Therefore, by measuring the activation rate, the concentration of magnesium ion or manganese ion and potassium ion can be determined. Can be measured. In addition to these, a surfactant, a preservative, an activator, a stabilizer, a buffer, and the like can be appropriately added.

【００６８】［測定法］本発明では、反応式（Ｉ）、
（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の反応で消費される反応物また
はこれらの反応で生成される生成物を測定して、間接的
にＡＴＰおよび／またはＡＭＰ、ＡＤＰ、サイクリック
ＡＭＰ、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオン
アンモニア等の微量成分を測定している。反応で消費さ
れる反応物または反応で生成される生成物としてはＮＡ
Ｄ、ピルビン酸、ピロリン酸、５−ホスホ−α−Ｄ−リ
ボシルピロホスフェイト、チアミンピロホスフェイト、
２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−
７，８−ジヒドロプテリジン−６−ジホスフェイト、コ
ロイル−ＣｏＡ、パントテン酸、Ｄ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−チロシン、アセチルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、
アシルＣｏＡ、オキサリル−ＣｏＡ、ｄ−ビオチニル−
ＣｏＡ、４−クマロイル−ＣｏＡ、アルギノコハク酸が
挙げられる。[Measurement Method] In the present invention, the reaction formula (I)
ATP and / or AMP, ADP, cyclic AMP, ammonia and / or ammonium are measured indirectly by measuring the reactants consumed in the reactions (II) and (III) or the products formed in these reactions. Trace components such as ion ammonia are measured. The reactant consumed in the reaction or the product generated in the reaction is NA
D, pyruvic acid, pyrophosphate, 5-phospho-α-D-ribosyl pyrophosphate, thiamine pyrophosphate,
2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-
7,8-dihydropteridine-6-diphosphate, coloyl-CoA, pantothenic acid, D-phenylalanine, L-tyrosine, acetyl-CoA, butyryl-CoA,
Acyl CoA, oxalyl-CoA, d-biotinyl-
CoA, 4-coumaroyl-CoA, and alginosuccinic acid.

【００６９】ＮＡＤの測定法としては、その還元型補酵
素である還元型ＮＡＤをその極大吸収波長域である３４
０ｎｍ付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を
用い直接定量するか、若しくは生じた還元型補酵素を各
種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート
（以下ＰＭＳと略す。）、メトキシＰＭＳ、ジメチルア
ミノベンゾフェノキサジニウムクロライド（メルドラブ
ルー）等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、
ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上同人化学研究所社製）に
代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を
用い間接的に定量しても良く、またこれ以外の公知の方
法により直接、間接的に測定してもよい。As a method for measuring NAD, reduced NAD, which is a reduced coenzyme, was measured for its maximum absorption wavelength range of 34.
It is directly quantified using a known technique such as measurement with a colorimeter at a wavelength around 0 nm, or the resulting reduced coenzyme is various diaphorase, phenazine methosulfate (hereinafter abbreviated as PMS), methoxy PMS, dimethyl Electron carriers such as aminobenzophenoxazinium chloride (Meldra Blue) and nitrotetrazolium,
Indirect quantification may be performed using a reducing color developing reagent such as various tetrazolium salts represented by WST-1 and WST-8 (all manufactured by Dojindo Chemical Laboratories), or directly by other known methods. It may be measured indirectly.

【００７０】さらに、特公平２−３４５９９に記載され
ているような酸化型反応系デヒドロゲナーゼを用いた酸
化型ＮＡＤを補酵素とする酸化型反応系と還元型反応系
デヒドロゲナーゼを用いた還元型ＮＡＤを補酵素とする
還元型反応系による補酵素サイクリング反応によって直
接発色させて測定しても良いし、サイクリング反応の反
応物や生成物を間接的に測定しても良い。Furthermore, an oxidized reaction system using oxidized NAD using an oxidized reaction type dehydrogenase as a coenzyme and a reduced NAD using a reduced reaction system dehydrogenase as described in Japanese Patent Publication No. The measurement may be carried out by directly developing a color by a coenzyme cycling reaction using a reduced reaction system as a coenzyme, or indirectly measuring a reaction product or a product of the cycling reaction.

【００７１】酸化型ＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生
成するデヒドロゲナーゼとしては、少なくとも酸化型Ｎ
ＡＤを補酵素とし、還元型基質に作用して還元型ＮＡＤ
を生成すればいかなる起源の酵素であってもよい。例え
ば、 アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．１）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
１．１．６）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ １．１．１．８、ＥＣ １．１．１．９
４）、イノシトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．１８）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．２７）、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ １．１．１．３０）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．１．１．３７）、イソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ １．１．１．４１）、グルコースデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）、ガラクトース
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４８）、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．４９）、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ １．１．１．５０）、７α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１５
９）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．１．１．１７６）、β−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．５１）、カ
ルニチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１０
８）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．１４）、ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．１４０）、マンニトールデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．６７）、ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１）、ギ酸
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２）、グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
２．１．１２）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．２．１．３７）、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．４．１．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．４．１．２、ＥＣ １．４．１．３）、Ｌ
−アミノ酸デヒロドゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
５）、セリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
７）、バリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
８）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
９）およびグリシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．
１．１０）などが挙げられる。The dehydrogenase that consumes oxidized NAD to produce reduced NAD includes at least oxidized NAD.
Using AD as a coenzyme and acting on a reduced substrate, reduced NAD
The enzyme may be of any origin as long as it is produced. For example, alcohol dehydrogenase (EC 1.1.
1.1), glycerol dehydrogenase (EC 1.
1.1.6), glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.8, EC 1.1.1.9)
4), inositol dehydrogenase (EC 1.1.
1.18), lactate dehydrogenase (EC 1.1.
1.27), 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (E
C 1.1.1.30), malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37), isocitrate dehydrogenase (EC 1.1.1.141), glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.147) , Galactose dehydrogenase (EC 1.1.1.148), glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.
1.49), 3α-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.150), 7α-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.15)
9), 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.176), β-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.15), carnitine dehydrogenase (EC 1.1.1.10)
8), sorbitol dehydrogenase (EC 1.1.
1.14), sorbitol-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.140), mannitol dehydrogenase (EC 1.1.1.67), formaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.1), formic acid Dehydrogenase (EC 1.2.1.2), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.2).
2.1.12), xanthine dehydrogenase (EC
1.2.1.37), alanine dehydrogenase (EC
1.4.1.1), glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3), L
-Amino acid dehydrogenase (EC 1.4.1.
5), serine dehydrogenase (EC 1.4.1.
7), valine dehydrogenase (EC 1.4.1.
8), leucine dehydrogenase (EC 1.4.1.
9) and glycine dehydrogenase (EC 1.4.
1.10).

【００７２】還元型ＮＡＤを消費して酸化型ＮＡＤを生
成するデヒドロゲナーゼとしては、少なくとも還元型Ｎ
ＡＤを補酵素とし、酸化型基質に作用して酸化型ＮＡＤ
および還元生成物を生成するデヒドロゲナーゼであれば
いかなる起源の酵素であってもよい。例えば、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、グリセ
ロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．６）、グ
リセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
１．１．８、ＥＣ １．１．１．９４）、イノシトール
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１８）、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７）、３−ヒドロ
キシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３
０）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
３７）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
１．１．４１）、ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．４８）、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）、３α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
５０）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．１７６）、β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．５１）、カ
ルニチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１０
８）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．１４）、ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．１４０）、マンニトールデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．６７）、ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１）、グリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．２．１．１２）、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．４．１．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．４．１．２、ＥＣ １．４．１．３）、Ｌ
−アミノ酸デヒロドゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
５）、セリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
７）、バリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．
８）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．
９）およびグリシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．
１．１０）が挙げられる。The dehydrogenase that consumes reduced NAD to produce oxidized NAD includes at least reduced NAD.
Using AD as a coenzyme and acting on oxidized substrate, oxidized NAD
Any enzyme may be used as long as it is a dehydrogenase that produces a reduction product. For example, alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1), glycerol dehydrogenase (EC 1.1.1.6), glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.6).
1.1.8, EC 1.1.1.194), inositol dehydrogenase (EC 1.1.1.18), lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27), 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.14). 1.1.3
0), malate dehydrogenase (EC 1.1.1.
37), isocitrate dehydrogenase (EC 1.
1.1.41), galactose dehydrogenase (EC
1.1.1.148), glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49), 3α-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.1.
50), 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.176), β-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.15), carnitine dehydrogenase (EC 1.1.1.10)
8), sorbitol dehydrogenase (EC 1.1.
1.14), sorbitol-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.140), mannitol dehydrogenase (EC 1.1.1.16), formaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.1), glycine Cellaldehyde-3-phosphate dehydrogenase (EC
1.2.1.12), alanine dehydrogenase (EC
1.4.1.1), glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3), L
-Amino acid dehydrogenase (EC 1.4.1.
5), serine dehydrogenase (EC 1.4.1.
7), valine dehydrogenase (EC 1.4.1.
8), leucine dehydrogenase (EC 1.4.1.
9) and glycine dehydrogenase (EC 1.4.
1.10).

【００７３】また、本反応に用いられる酵素としては、
少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、チトクローム、
ジスルフィド化合物、キノンおよびその類縁体等を受容
体とする還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素であっても
よく、その起源も限定されることはない。これらの酵素
およびその基質または受容体としては、還元型ＮＡＤ：
受容体酸化還元酵素としてチトクロームｂ５レダクター
ゼ（ＥＣ．１．６．２．２）、ジアホラーゼ（ＥＣ．
１．６．４．３）等が挙げられ、受容体としてはメチレ
ンブルー、フラビン類、キノン類２，６−ジクロロフェ
ノールインドフェノールなどが挙げられる。The enzymes used in this reaction include:
At least reduced NAD as a coenzyme, cytochrome,
Reduced NAD using a disulfide compound, quinone and its analogs as receptors may be a receptor oxidoreductase, and its origin is not limited. These enzymes and their substrates or receptors include reduced NAD:
As acceptor oxidoreductases, cytochrome b5 reductase (EC. 1.6.2.2), diaphorase (EC.
1.6.4.3) and the like, and examples of the receptor include methylene blue, flavins, quinones 2,6-dichlorophenolindophenol and the like.

【００７４】還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素および
受容体の組み合わせは、還元型ＮＡＤを補酵素としてな
る酵素および電子受容体となり得るものであれば特に限
定されない。好ましい組み合わせとしてはジアホラーゼ
（ＥＣ．１．６．４．３）およびテトラゾリウム塩およ
びメチレンブルー、ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．
１．６．９９．３）およびチトクロームＣ等が挙げられ
る。Reduced NAD: The combination of the receptor oxidoreductase and the receptor is not particularly limited as long as it can be an enzyme using reduced NAD as a coenzyme and an electron acceptor. Preferred combinations include diaphorase (EC. 1.6.4.3) and tetrazolium salt and methylene blue, NAD dehydrogenase (EC.
1.6.99.3) and cytochrome C.

【００７５】還元型ＮＡＤを基質とする反応系で一般的
なものとしては色原体と水素受容体、例えばニトロテト
ラゾリウムブルー等の存在化にジアホラーゼ等の酵素に
より色素、例えばホルマザン色素を生成させ、このホル
マザン色素の量を、その極大吸収波長、例えば５３０ｎ
ｍにて吸収増加量として測定するホルマザン発色反応が
広く用いられる。この場合酵素の使用濃度は例えば０．
０１ｕ／ｍＬ〜５００ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１ｕ／
ｍＬ〜５０ｕ／ｍＬで用いられる。テトラゾリウム塩の
使用濃度は、テトラゾリウム塩および形成されるホルマ
ザンの双方の水溶性によって限定されるが、例えば１μ
ｇから１０００μｇ好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１００
μｇ／ｍＬで使用する。As a general reaction system using reduced NAD as a substrate, a dye such as a formazan dye is formed by the presence of a chromogen and a hydrogen acceptor such as nitrotetrazolium blue by an enzyme such as diaphorase. The amount of this formazan dye is determined by its maximum absorption wavelength, for example, 530 n.
The formazan color reaction, which is measured as the absorption increase in m, is widely used. In this case, the concentration of the enzyme used is, for example, 0.1.
01u / mL to 500u / mL, preferably 0.1u / mL
Used at mL to 50 u / mL. The working concentration of the tetrazolium salt is limited by the water solubility of both the tetrazolium salt and the formazan formed;
g to 1000 μg, preferably 10 μg / mL to 100
Use at μg / mL.

【００７６】電子伝達物質としては、還元型ＮＡＤを酸
化型ＮＡＤに酸化する能力を有し、しかも補酵素サイク
リング反応を妨げないような物質、例えばフェナシンメ
タルサルフェート、メルドーラ・ブルー、ピロシアニン
などが挙げられる。使用濃度は感度に応じて設定すれば
よいが、例えば０．５μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ、好ま
しくは５μｇ〜５００μｇで使用する。Examples of the electron mediator include substances that have the ability to oxidize reduced NAD to oxidized NAD and do not hinder the coenzyme cycling reaction, such as phenacine metal sulfate, Meldola blue, and pyrocyanine. Can be The concentration to be used may be set according to the sensitivity, for example, 0.5 μg / mL to 1000 μg, preferably 5 μg to 500 μg.

【００７７】これらの酸化還元サイクリング反応に使用
する酵素量、酵素力価、基質の種類、感度によって異な
るが、例えば０．０１／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ま
しくは０．１Ｕ／ｍＬ〜２５０Ｕ／ｍＬで使用する。ま
た、これらの酸化還元サイクリング反応に使用する基質
量は、その酸化還元酵素の反応速度が最大を示す濃度以
上であればよく、例えば０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭ、
好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度で使用す
る。Although it varies depending on the amount of enzyme, enzyme titer, type of substrate and sensitivity used in these redox cycling reactions, for example, 0.01 / mL to 1000 U / mL, preferably 0.1 U / mL to 250 U / mL. Used in. Further, the base mass used in these redox cycling reactions may be a concentration at which the reaction rate of the oxidoreductase shows a maximum or more, for example, 0.01 mM to 1000 mM,
Preferably, it is used at a concentration of about 0.1 mM to 100 mM.

【００７８】サイクリング反応の反応物や生成物を間接
的に測定する方法として、例えば、グリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼを用いてジヒドロキシアセトン
リン酸と還元型ＮＡＤを反応させてグリセロール−３−
リン酸を生成させ、それをグリセロリン酸オキシダーゼ
で過酸化水素にし、それを測定する方法や乳酸酸デヒド
ロゲナーゼを用いてピルビン酸と還元型ＮＡＤを反応さ
せて乳酸を生成させ、それを乳酸オキシダーゼで生成さ
れる過酸化水素を測定する方法等が挙げられる。As a method for indirectly measuring a reaction product or product of the cycling reaction, for example, glycerol-3-
Reaction of dihydroxyacetone phosphate with reduced NAD using phosphate dehydrogenase to give glycerol-3-
Generating phosphoric acid, converting it to hydrogen peroxide with glycerophosphate oxidase, measuring it or reacting pyruvate with reduced NAD using lactate dehydrogenase to produce lactic acid, which is then produced with lactate oxidase For example, a method of measuring hydrogen peroxide to be performed.

【００７９】上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシ
ダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等
により定量しても良く、また、カタラーゼ等を用いてア
ルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデ
ヒドの量を定量しても良く、さらに、電気化学的手法に
よって定量しても良い。The amount of the hydrogen peroxide may be determined by, for example, producing a dye or the like using peroxidase or the like and quantifying it by color development, luminescence, fluorescence or the like, or by producing an aldehyde from an alcohol using catalase or the like. Then, the amount of the generated aldehyde may be quantified, or may be further quantified by an electrochemical method.

【００８０】過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼ
を用いた公知の方法で行えば良く、例えば、パーオキシ
ダーゼの存在下で４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）
若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾ
ン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体
との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パ
ーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型
試薬等を用いることが出来る。The color development system of hydrogen peroxide may be carried out by a known method using peroxidase. For example, 4-aminoantipyrine (4-AA) is used in the presence of peroxidase.
Alternatively, a leuco which directly oxidizes and develops a color in the presence of a peroxidase, a Trinder reagent which produces a dye by oxidative condensation between a coupler such as 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) and a chromogen such as phenol. A template reagent or the like can be used.

【００８１】トリンダー型試薬の色原体としては、フェ
ノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が
使用可能であり、具体例としてＮ，Ｎジメチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、２，４−ジクロロフェ
ノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５ジメチ
ルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニ
リン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジ
ン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニ
リン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
３、５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホ
プロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（Ｈ
ＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＨＡＬＰ
Ｓ）（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。As the chromogen of the Trinder type reagent, phenol derivatives, aniline derivatives, toluidine derivatives and the like can be used, and specific examples are N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, 2,4-dichlorophenol. , N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAO
S), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline (MAPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N- Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOO
S), N-ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidine (ADPS), N-ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-
3,5-dimethoxyaniline (DAPS), N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (HDAP
S), N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine (TOPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-
3-sulfopropyl) -m-anisidine (ADOS),
N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N- (2-hydroxy-3
-Sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (H
DAOS), N-sulfopropyl-aniline (HALP)
S) (both manufactured by Doujin Chemical Laboratories).

【００８２】またロイコ型試薬の具体例としては、ｏ−
ジアニシジン、ｏ−トリジン、３，３ジアミノベンジジ
ン、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン；以上同
人化学研究所社製、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカル
ボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニル
アミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノ
カルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノ
チアジン（ＤＡ６７）；以上和光純薬社製等が挙げられ
る。Specific examples of the leuco-type reagent include o-
Dianisidine, o-tolidine, 3,3 diaminobenzidine, 3,3,5,5-tetramethylbenzidine; N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4-bis (dimethylamino) manufactured by Dojindo Chemical Laboratories Biphenylamine (DA64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine (DA67);

【００８３】さらに蛍光法には、酸化によって蛍光を発
する化合物、例えばホモバニリン酸、４−ヒドロキシフ
ェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフ
ルオレスシン誘導体等を、化学発光法には、触媒として
ルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロー
ル等を用いることが出来る。Further, in the fluorescence method, a compound emitting fluorescence upon oxidation, for example, homovanillic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, tyramine, paracresol, diacetylfluorescin derivative or the like is used. In the chemiluminescence method, luminol, lucigenin is used as a catalyst. , Isoluminol, pyrogallol and the like can be used.

【００８４】カタラーゼ等を用いてアルコールからアル
デヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドを定量する方
法としては、ハンチ反応を用いる方法や、ＭＢＴＨとの
縮合反応により発色させる方法、若しくはアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼを用いる方法等が挙げられる。Examples of a method for producing aldehyde from alcohol using catalase or the like and quantifying the generated aldehyde include a method using a Huntch reaction, a method of coloring by a condensation reaction with MBTH, a method of using aldehyde dehydrogenase, and the like. Is mentioned.

【００８５】さらに、過酸化水素を電極を用いて測定す
る事もできる。電極には、過酸化水素との間で電子を授
受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、
例えば白金、金、銀、カーボンペースト、若しくは、グ
ラッシーカーボン等が挙げられ、好ましくはカーボン電
極が良い。用いる酵素類は緩衝液中に溶解させても良い
し、電極表面に固定化しても良いが、好ましくは固定化
した方が効率よく分析できる。固定化にはグルタルアル
デヒドの様な架橋性試薬を用いて直接行っても良いし、
アミノ酸を有する合成ポリマーやアルブミンの様なタン
パク質を介して行っても良い。酵素以外の反応に必要な
成分（緩衝液、反応基質、界面活性剤等）は電極に酵素
類を固定化する時に同時に含浸させる事もできる。Further, hydrogen peroxide can be measured using an electrode. The electrode is not particularly limited as long as it is a material that can exchange electrons with hydrogen peroxide,
For example, platinum, gold, silver, carbon paste, glassy carbon, or the like can be used, and a carbon electrode is preferable. The enzymes to be used may be dissolved in a buffer solution or may be immobilized on the electrode surface, but preferably immobilization allows more efficient analysis. Immobilization may be performed directly using a crosslinking reagent such as glutaraldehyde,
It may be carried out via a protein such as a synthetic polymer having an amino acid or albumin. Components required for the reaction other than the enzyme (buffer, reaction substrate, surfactant, etc.) can be impregnated at the same time when the enzymes are immobilized on the electrode.

【００８６】電極測定方法としてはアンペロメトリー、
ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を
用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電
極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸
化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。The electrode measurement method includes amperometry,
Known methods such as potentiometry and coulometry can be used, and furthermore, the reaction between the oxidase or the substrate and the electrode may be made to intervene with an electron carrier, and the resulting oxidation, reduction current or the amount of electricity may be measured. .

【００８７】電子伝達体としては電子伝達機能を有する
任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導
体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダ
ーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝
達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気
量を測定しても良い。As the electron carrier, any substance having an electron transfer function can be used, and examples thereof include substances such as ferrocene derivatives and quinone derivatives. Further, an oxidation or reduction current or an amount of electricity obtained by interposing an electron carrier between hydrogen peroxide generated by the oxidase reaction and the electrode may be measured.

【００８８】この方法によって携帯可能な測定機材の開
発が可能となる。さらに、酸化ＮＡＤを電極を用いて測
定する事もできる。電極には、酸化型ＮＡＤとの間で電
子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されな
いが、例えば白金、金、銀、カーボンペースト、若しく
は、グラッシーカーボン等が挙げられ、好ましくはカー
ボン電極が良い。用いる酵素類は緩衝液中に溶解させて
も良いし、電極表面に固定化しても良いが、好ましくは
固定化した方が効率よく分析できる。固定化にはグルタ
ルアルデヒドの様な架橋性試薬を用いて直接行っても良
いし、アミノ酸を有する合成ポリマーやアルブミンの様
なタンパク質を介して行っても良い。酵素以外の反応に
必要な成分（緩衝液、反応基質、界面活性剤等）は電極
に酵素類を固定化する時に同時に含浸させる事もでき
る。電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンシ
ョメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いるこ
とが出来る。With this method, portable measuring equipment can be developed. Furthermore, oxidized NAD can be measured using an electrode. The electrode is not particularly limited as long as it is a material capable of transmitting and receiving electrons to and from the oxidized NAD, but examples thereof include platinum, gold, silver, carbon paste, and glassy carbon. Is good. The enzymes to be used may be dissolved in a buffer solution or may be immobilized on the electrode surface, but preferably immobilization allows more efficient analysis. Immobilization may be carried out directly using a cross-linking reagent such as glutaraldehyde, or may be carried out via a protein such as a synthetic polymer having amino acids or albumin. Components required for the reaction other than the enzyme (buffer, reaction substrate, surfactant, etc.) can be impregnated at the same time when the enzymes are immobilized on the electrode. Known methods such as amperometry, potentiometry, and coulometry can be used as the electrode measuring method.

【００８９】ピルビン酸を測定する方法として、例え
ば、オキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量また
は反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成
物として、例えばピルビン酸オキシダーゼを用いた場合
には反応により過酸化水素が生成し、それを公知の方法
により直接、間接的に測定する事が出来る。過酸化水素
の測定方法は前記と同様の方法で測定する事ができる。As a method for measuring pyruvate, for example, when oxidase is used, it is preferable to measure the amount of consumed oxygen or the amount of reaction products. When, for example, pyruvate oxidase is used as a reaction product, hydrogen peroxide is generated by the reaction, and it can be measured directly or indirectly by a known method. Hydrogen peroxide can be measured by the same method as described above.

【００９０】ピロリン酸を測定する方法として、公知の
化学測定法や酵素測定法によって測定する事ができる。
化学測定法として、例えば、アナリティカル バイオケ
ミストリー、３３、１１４−１１９（１９７０）やジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、２１
１、７９１−７９６（１９５４）の様に、ピロリン酸と
モリブデン化合物との複合体生成させ、その吸光度で測
定する方法が挙げられる。また、酵素測定法として、例
えば、アナリティカル バイオケミストリー、２６、１
３７−１４５（１９６８）の様に、ピロリン酸をＵＤＰ
−グルコース ピロホスホリラーゼ、ホスホグルコムタ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによっ
てＮＡＤＰＨを生成させ、その吸光度を測定する方法が
挙げられる。As a method for measuring pyrophosphoric acid, it can be measured by a known chemical measuring method or enzyme measuring method.
As a chemical measurement method, for example, Analytical Biochemistry, 33, 114-119 (1970), Journal of Biological Chemistry, 21
1, 791-796 (1954), a method of forming a complex of pyrophosphoric acid and a molybdenum compound and measuring the absorbance of the complex. As an enzyme measurement method, for example, Analytical Biochemistry, 26, 1
37-145 (1968).
-Glucose pyrophosphorylase, phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase to generate NADPH and measure the absorbance.

【００９１】本発明のアンモニア及び／またはアンモニ
ウムイオンの測定は、ブランクを十分に下げる事ができ
るが、さらにアンモニアを正確に測定するには、以下の
方法で反応液に含まれるアンモニアを消去した方が良い
場合もある。また、尿素等の体液（サンプル）中に含ま
れる成分の定量の多くは、その成分を加水分解により生
成されるアンモニア量を測定する方法が用いられるの
で、体液中の内因性のアンモニアの影響も以下の方法で
消去した方が良い場合もある。In the measurement of ammonia and / or ammonium ion of the present invention, the blank can be sufficiently lowered. However, in order to measure ammonia more accurately, it is necessary to eliminate ammonia contained in the reaction solution by the following method. May be better. In addition, most of the quantification of components contained in body fluids (samples) such as urea uses a method of measuring the amount of ammonia generated by hydrolysis of the components. In some cases, it is better to delete data by the following method.

【００９２】アンモニアの消去法としてはグルタミン酸
デヒドロゲナーゼを用いた方法（特公平０２−１８０７
５、特公平０６−７５５１５、特開平０５−１０３６９
７等）、アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いた方法（特公
昭５７−２１１９５、ＵＳ０５７８４２）、グルタミン
合成酵素を用いた方法（Ｃｈｅｍｉｓｔｙ ｌｅｔｔｅ
ｒｓ Ｎｏ．２ １９９−２０２１９８４）等が挙げら
れる。As a method for eliminating ammonia, a method using glutamate dehydrogenase (Japanese Patent Publication No. 02-1807)
5, JP-B-06-75515, JP-A-05-10369
7), a method using amino acid dehydrogenase (Japanese Patent Publication No. 57-21195, US057842), a method using glutamine synthase (Chemistry lette).
rs No. 2 199-2021984).

【００９３】本発明に最も適したアンモニアの消去法
は、グルタミン合成酵素（ＥＣ６．３．１．２）を用い
た方法であり、グルタミン合成酵素はユニチカ株式会
社、キッコーマン株式会社等から市販されているものを
使用すればよいが、多くの微生物がグルタミン合成酵素
を生産することが知られているので、その培養菌体から
精製することも可能である。またアンモニアの消去を行
った後にグルタミン合成酵素活性を阻害剤を用いて停止
し、検体のアンモニアあるいは生成されるアンモニアを
測定する。グルタミン合成酵素の阻害剤としてはメチオ
ニンスルフォキシミン、カルバミルリン酸、ＡＭＰ等が
挙げられるがグルタミン合成酵素活性を阻害し、ＮＡＤ
合成酵素に影響を及ぼさない物質であるならば限定され
るものではない。The most suitable method for eliminating ammonia in the present invention is a method using glutamine synthase (EC 6.3.1.2). Glutamine synthase is commercially available from Unitika KK, Kikkoman KK, or the like. However, since it is known that many microorganisms produce glutamine synthase, it is also possible to purify glutamine synthase from cultured cells. After the elimination of ammonia, the glutamine synthetase activity is stopped using an inhibitor, and the ammonia of the sample or the generated ammonia is measured. Examples of glutamine synthetase inhibitors include methionine sulfoximine, carbamyl phosphate, AMP, etc.
The substance is not limited as long as the substance does not affect the synthase.

【００９４】本発明の反応の温度は好ましくは２０〜５
０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の温度範囲で行
う。また、本発明の反応のｐＨは、緩衝液によって反応
組成中の酵素の至適ｐＨ付近に調製されているのが望ま
しい。使用する緩衝液としては、酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液お
よびＧＯＯＤ緩衝液が好ましいが何ら限定されるもので
はない。The temperature of the reaction according to the invention is preferably between 20 and 5
The reaction is performed at a temperature of 0 ° C, more preferably 25 to 40 ° C. Further, the pH of the reaction of the present invention is desirably adjusted to around the optimum pH of the enzyme in the reaction composition by a buffer solution. The buffer used is preferably an acetate buffer, a citrate buffer, a Tris buffer, a phosphate buffer, a borate buffer and a GOOD buffer, but is not limited at all.

【００９５】上記の成分の測定においてはレイトアッセ
イ、エンドポイントアッセイあるいはその組み合わせの
いずれを選択しても良く、反応は１段階の反応であって
も２段階以上の反応であっても適宜組み立てることがで
き、試薬も１試薬系あるいは２試薬系以上の複数の組成
物に分けた試薬系であっても適宜選択できる。In the measurement of the above components, any of a late assay, an endpoint assay or a combination thereof may be selected, and the reaction may be a one-step reaction or a two- or more-step reaction. The reagent can be appropriately selected even if it is a reagent system divided into a plurality of compositions of one reagent system or two or more reagent systems.

【００９６】[0096]

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例に基づきよ
り詳細に説明するが、本発明の方法は何らこれらに限定
されるものではない。 ＜ＰＷＤＫの酵素活性測定方法＞ 測定試薬 １００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） １ｍＭ ＰＥＰ １ｍＭ ＡＭＰ ５Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ ０．２ｍＭ 還元型ＮＡＤ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the method of the present invention is not limited thereto. <Method for measuring enzyme activity of PWDK> Measurement reagent 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) 1 mM PEP 1 mM AMP 5 U / ml LDH 0.2 mM reduced NAD 5 mM MgCl 2

【００９７】試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温後、
０．０５ｍｌの酵素液を添加して反応を開始させる。反
応開始後２分後および３分後の吸光度を層長１．０ｃｍ
のセルを用いて、波長３４０ｎｍに於ける吸光度を測定
し、１分間あたりの吸光度を求める（Ａｓ）。また、盲
検として酵素液のかわりに蒸留水０．０５ｍｌを用いて
同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵
素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光
度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１
単位は３７℃で１分間に１μモルのＡＭＰをＡＴＰに変
換させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×３．３３×酵
素の希釈倍率After preliminarily heating 1 ml of the reagent at 37 ° C. for 1 minute,
The reaction is started by adding 0.05 ml of enzyme solution. The absorbance at 2 minutes and 3 minutes after the start of the reaction was determined by measuring the layer length to 1.0 cm.
The absorbance at a wavelength of 340 nm is measured using the cell (1), and the absorbance per minute is determined (As). As a blind test, the same operation is performed using 0.05 ml of distilled water instead of the enzyme solution, and the absorbance is measured (Ab). The enzyme activity is determined from the difference in absorbance (As-Ab) between the absorbance (As) using the enzyme and the absorbance (Ab) in a blind test. Enzyme activity 1
The unit is the amount of enzyme that converts 1 μmol of AMP to ATP per minute at 37 ° C., and the calculation formula is as follows. Enzyme activity (U / ml) = (As-Ab) x 3.33 x enzyme dilution

【００９８】＜ＰＷＤＫの取得方法＞ エシェリヒア・コリ・Ｗ３１１０菌株の培養 培地組成 １．５％ ソルビトール １．５％ グリセロール １．５％ 酵母エキス １．５％ ペプトン<Method for Obtaining PWDK> Culture of Escherichia coli W3110 Strain Medium Composition 1.5% Sorbitol 1.5% Glycerol 1.5% Yeast Extract 1.5% Peptone

【００９９】上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５
００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に分注し、
１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリ
ヒア・コリ・Ｗ３１１０菌株の菌体懸濁液１０ｍｌを移
植し、攪拌させながら、３７℃で２０時間培養し、種培
養液とした。上記培地成分を含む液体培地２０ｌ／３０
ｌジャーを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させな
がら、３０℃で２４時間培養し、０．６５Ｕ／ｍｌの培
養液２０ｌを得た。Liquid medium (pH 7) containing the above medium components 5
Dispense 00 ml into 10 500 ml Erlenmeyer flasks,
After heat sterilization at 120 ° C. for 20 minutes, 10 ml of a cell suspension of Escherichia coli W3110 was transplanted into this, and cultured at 37 ° C. for 20 hours with stirring to obtain a seed culture solution. 20 l / 30 liquid medium containing the above medium components
After sterilizing the jar, the seed culture was transplanted and cultured at 30 ° C. for 24 hours with stirring to obtain 20 liters of a 0.65 U / ml culture.

【０１００】＜ＰＷＤＫの精製方法＞得られた培養液２
０ｌを遠心分離して、得られた菌体を４０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ６．６）で１回洗浄した。洗浄菌体を１０
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁して１．８ｌ
に調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴ
ＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理し
て、菌体破砕液を得た。<Method of Purifying PWDK> Culture Solution 2 Obtained
0 l was centrifuged, and the obtained cells were washed once with 40 mM phosphate buffer (pH 6.6). Wash 10 cells
1.8 l suspended in mM phosphate buffer (pH 6.6)
And the ultrasonic crusher manufactured by Kubota (INSONAT)
OR 201M) at 180 W for 30 minutes to obtain a disrupted cell suspension.

【０１０１】この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠
心分離し、１．８ｌ（酵素活性９０００Ｕ）の上清を得
た。この可溶化上清を４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．６）で緩衝化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
（ファルマシア社製）２ｌのカラムに通し、４０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）１０ｌで洗浄を行い、０．
３ＭのＮａＣｌを含む４０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＨ
６．６）５ｌで溶出を行った。その結果、８１００Ｕが
溶出された。この得られた酵素液５ｌを限外ろ過（Ｕ
Ｆ）モジュールＡＣＰ−１０１０（旭化成工業社製）を
用いて５００ｍｌまで濃縮した後、１０ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ６．６）８ｌに５℃、一夜透析した。更に、
この得られた酵素液を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．６）で緩衝化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ
（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）
のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジ
エントで溶出を行った。その結果、０．０５〜０．０８
モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（６５００Ｕ）が溶出さ
れた。この酵素液を凍結乾燥して９０ｍｇの酵素粉末
（７２Ｕ／ｍｇ）を得た。This crushed liquid was centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes to obtain 1.8 l (enzyme activity: 9000 U) of a supernatant. The solubilized supernatant was added to a 40 mM phosphate buffer (pH
Q-Sepharose FF buffered in 6.6)
(Pharmacia), passed through a 2 l column, washed with 10 l of a 40 mM phosphate buffer (pH 6.6),
40 mM phosphate buffer containing 3 M NaCl (PH
6.6) Elution was performed with 5 l. As a result, 8100 U was eluted. 5 L of the obtained enzyme solution was subjected to ultrafiltration (U
F) After concentrating to 500 ml using module ACP-1010 (manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), the solution was dialyzed overnight at 5 ° C. against 8 l of 10 mM phosphate buffer (pH 6.6). Furthermore,
The obtained enzyme solution was added to a 10 mM phosphate buffer (pH
Q-Sepharose HP buffered in 6.6)
(Pharmacia) 200ml (2.6 × 38cm)
And elution was performed with a linear gradient of 0 to 1 mol of NaCl. As a result, 0.05 to 0.08
The active fraction (6500 U) eluted at a molar NaCl concentration. This enzyme solution was freeze-dried to obtain 90 mg of enzyme powder (72 U / mg).

【０１０２】＜ＰＷＤＫの理化学的性質＞ （１）酵素作用［ＮＡＤ合成酵素］ 本発明に用いられるＮＡＤ合成酵素（ＥＣ ６．３．
１．５およびＥＣ ６．３．５．１）は特に限定される
ものではないが、例えば特開昭６３−１８５３７８号公
報、米国特許第４９２１７８６号明細書に示されたＮＡ
Ｄ合成酵素（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｈ−８０４由来：ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４０８およびＦＥＲＭ ＢＰ−５３８１）が特異性、
及び、安定性の点で好ましい。ＮＡＤ合成酵素の濃度は
例えば０．０１ｕ／ｍＬ〜５００ｕ／ｍＬ、好ましくは
０．１ｕ／ｍＬ〜１００ｕ／ｍＬ、最適には０．２ｕ／
ｍＬ〜２０ｕ／ｍＬの濃度範囲で用いられる。基質とし
てホスホエノールピルビン酸を用いた酵素作用を以下に
示す。 ＡＭＰ＋ホスホエノールピルビン酸＋リン酸イオン⇒Ａ
ＴＰ＋ピルビン酸＋Ｈ2Ｏ （２）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
したＰＷＤＫの分子量は６８，０００±２，０００であ
った。 （３）ＰＷＤＫのホスホエノールピルビン酸に対するＫ
ｍ値は０．１３ｍＭ、ＡＭＰに対するＫｍ値は０．１５
ｍＭであった。 （４）至適ｐＨはｐＨ６．５〜７．０（リン酸緩衝液）
であった。 （５）熱安定性は５０℃まで安定であった。<Physicochemical properties of PWDK> (1) Enzymatic action [NAD synthase] The NAD synthase (EC 6.3.
1.5 and EC 6.3.5.1) are not particularly limited, but for example, NAs described in JP-A-63-185378 and U.S. Pat. No. 4,921,786.
D synthase (Bacillus stearother)
mofilus H-804 origin: FERM BP-
1408 and FERM BP-5381) are specific,
And it is preferable in terms of stability. The concentration of NAD synthase is, for example, 0.01 u / mL to 500 u / mL, preferably 0.1 u / mL to 100 u / mL, and most preferably 0.2 u / mL.
Used in the concentration range of mL to 20 u / mL. The enzymatic action using phosphoenolpyruvate as a substrate is shown below. AMP + phosphoenolpyruvate + phosphate ion ⇒ A
TP + pyruvic acid + H 2 O (2) Molecular weight The molecular weight of PWDK measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was 68,000 ± 2,000. (3) K for PWDK against phosphoenolpyruvate
The m value is 0.13 mM and the Km value for AMP is 0.15
mM. (4) The optimum pH is pH 6.5 to 7.0 (phosphate buffer)
Met. (5) The thermal stability was stable up to 50 ° C.

【０１０３】[0103]

【実施例１】０．９０ｍｌの反応液１を３７℃で５分間
予備加温した後、０、０．００１、０．０１、０．１、
１ｎｍｏｌ／ｌのＡＴＰを０．１０ｍｌ添加して反応を
開始し、開始後２分から７分の５分間、分光光度計（島
津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長５３０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ＡＴＰ濃度と各ＡＴＰ濃度で得
られた吸光度からブランク（ＡＴＰ濃度が０ｎｍｏｌ／
ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度との関係を図１に示
す。この反応は、反応式（Ｉ）及び反応式（Ｉ）で生成
された酸化型ＮＡＤと還元型ＮＡＤのサイクリング反応
からなるダブルサイクリング反応である。Example 1 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 1 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 0.001, 0.01, 0.1,
The reaction was started by adding 0.10 ml of 1 nmol / l ATP, and the absorbance at a wavelength of 530 nm was measured using a spectrophotometer (Shimadzu: UV2100) for 5 minutes from 2 minutes to 7 minutes after the start. From the ATP concentration and the absorbance obtained at each ATP concentration, a blank (ATP concentration of 0 nmol /
FIG. 1 shows the relationship with the absorbance obtained by subtracting the absorbance of 1). This reaction is a double cycling reaction comprising the cycling reaction of the oxidized NAD and reduced NAD generated in Reaction Formula (I) and Reaction Formula (I).

【０１０４】 反応液１ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ５ｍＭ（終濃度） ホスホエノールピルビン酸 １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム １０ｍＭ（終濃度） コール酸ナトリウム ０．３５ｗｔ％（終濃度） ニトロテトラゾリウムブルー １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＰＷＤＫ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） １２α−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ジアホラーゼ（旭化成工業製）Reaction solution 1 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 5 mM (final concentration) Phosphoenolpyruvate 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Chloride Magnesium 10 mM (final concentration) Sodium cholate 0.35 wt% (final concentration) Nitrotetrazolium blue 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (manufactured by Asahi Kasei Kogyo) 10 U / ml (final concentration) PWDK 5 U / ml (final concentration) 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (Asahi Kasei Kogyo) 5 U / ml (final concentration) Diaphorase (Asahi Kasei Kogyo)

【０１０５】[0105]

【比較例１】０．９０ｍｌの反応液２を３７℃で５分間
予備加温した後、０、０．００１，０．０１、０．１、
１、１０、１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＴＰを０．１０ｍｌ
添加して反応を開始し、開始後２分から７分の５分間、
分光光度計（島津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長
５３０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＴＰ濃度と各
ＡＴＰ濃度で得られた吸光度からブランク（ＡＴＰ濃度
が０ｎｍｏｌ／ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度との関
係を図１に示す。この反応は、酸化型ＮＡＤと還元型Ｎ
ＡＤのサイクリング反応（ＶＩ）である。Comparative Example 1 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 2 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 0.001, 0.01, 0.1,
0.10 ml of 1, 10, 100 nmol / l ATP
Addition to start the reaction, 2 minutes to 7 minutes after the start,
The absorbance at a wavelength of 530 nm was measured using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV2100). FIG. 1 shows the relationship between the ATP concentration and the absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank (ATP concentration is 0 nmol / l) from the absorbance obtained at each ATP concentration. This reaction involves the oxidation of NAD and reduced N
AD cycling reaction (VI).

【０１０６】 反応液２ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム １０ｍＭ（終濃度） コール酸ナトリウム ０．３５ｗｔ％（終濃度） ニトロテトラゾリウムブルー １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） １２α−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ジアホラーゼ（旭化成工業製） 以上の通り、吸光度はＡＴＰ濃度に依存し、しかも既存
のＡＴＰの発色測定法より、低濃度のＡＴＰを定量する
事ができた。Reaction Solution 2 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Magnesium chloride 10 mM (final concentration) Sodium cholate 0.35 wt% (final concentration) Nitrotetrazolium blue 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (Asahi Kasei Kogyo) 5 U / ml (final concentration) 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (Asahi Kasei Kogyo) 5 U / ml (final concentration) Diaphorase (manufactured by Asahi Kasei Kogyo) As described above, the absorbance depends on the ATP concentration, and a low-concentration ATP could be quantified by an existing ATP color measurement method.

【０１０７】[0107]

【実施例２】ＡＴＰをＡＭＰに変えた以外は実施例１と
同様の方法で行った。その結果を図２に示す。Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that ATP was changed to AMP. The result is shown in FIG.

【０１０８】[0108]

【比較例２】ＡＴＰをＡＭＰに変えた以外は比較例１と
同様の方法で行った。その結果を図２に示す。以上の通
り、吸光度はＡＭＰ濃度に依存し、しかも既存のＡＭＰ
の発色測定法より、低濃度のＡＭＰを定量する事ができ
た。Comparative Example 2 The same procedure as in Comparative Example 1 was carried out except that ATP was changed to AMP. The result is shown in FIG. As described above, the absorbance depends on the AMP concentration, and the existing AMP
It was possible to quantify low-concentration AMP by the color measurement method described above.

【０１０９】[0109]

【実施例３】０．９０ｍｌの反応液３を３７℃で５分間
予備加温した後、０、０．００１、０．０１、０．１、
１ｎｍｏｌ／ｌのＡＴＰを０．１０ｍｌ添加して反応を
開始し、開始後２分から７分の５分間、分光光度計（島
津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長５５５ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ＡＴＰ濃度と各ＡＴＰ濃度で得
られた吸光度からブランク（ＡＴＰ濃度が０ｎｍｏｌ／
ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度との関係を図３に示
す。この反応は、反応式（Ｉ）及び反応式（Ｉ）で生成
された酸化型ＮＡＤと還元型ＮＡＤのサイクリング反応
からなるダブルサイクリング反応である。Example 3 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 3 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 0.001, 0.01, 0.1,
The reaction was started by adding 0.10 ml of 1 nmol / l ATP, and the absorbance at a wavelength of 555 nm was measured using a spectrophotometer (Shimadzu: UV2100) for 5 minutes from 2 minutes to 7 minutes after the start. From the ATP concentration and the absorbance obtained at each ATP concentration, a blank (ATP concentration of 0 nmol /
FIG. 3 shows the relationship with the absorbance obtained by subtracting the absorbance of 1). This reaction is a double cycling reaction comprising a cycling reaction of the oxidized NAD and reduced NAD generated in Reaction Formula (I) and Reaction Formula (I).

【０１１０】 反応液３ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ５ｍＭ（終濃度） ホスホエノールピルビン酸 １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム ５ｍＭ（終濃度） コール酸ナトリウム ５０ｍＭ（終濃度） ジヒドロキシアセトンリン酸 ０．０３ｗｔ％（終濃度） ４−アミノアンチピリン ０．０３ｗｔ％（終濃度） ＴＯＯＳ（同人化学製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） １５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＰＷＤＫ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） １２α−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） グリセロール−３−リン酸デヒロゲナ ーゼ（ＳＩＧＭＡ） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ （旭化成工業製） ３Ｕ／ｍｌ（終濃度） パーオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ）Reaction solution 3 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 5 mM (final concentration) Phosphoenolpyruvate 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Chloride Magnesium 5 mM (final concentration) Sodium cholate 50 mM (final concentration) Dihydroxyacetone phosphate 0.03 wt% (final concentration) 4-aminoantipyrine 0.03 wt% (final concentration) TOOS (manufactured by Dojin Chemical) 10 U / ml (final concentration) ) NAD synthase (Asahi Kasei Kogyo) 15 U / ml (final concentration) PWDK 5 U / ml (final concentration) 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (Asahi Kasei Kogyo) 5 U / ml (final concentration) Glycerol-3-phosphate dehirogener Ze (SIGMA) 5U / ml (final concentration) L-α-glyceroline Oxidase (manufactured by Asahi Kasei) 3U / ml (final concentration) peroxidase (SIGMA)

【０１１１】[0111]

【比較例３】０．９０ｍｌの反応液４を３７℃で５分間
予備加温した後、０、０．００１、０．０１、０．１、
１、１０、１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＴＰを０．１０ｍｌ
添加して反応を開始し、開始後２分から７分の５分間、
分光光度計（島津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長
５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＴＰ濃度と各
ＡＴＰ濃度で得られた吸光度からブランク（ＡＴＰ濃度
が０ｎｍｏｌ／ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度との関
係を図３に示す。この反応は、酸化型ＮＡＤと還元型Ｎ
ＡＤのサイクリング反応（ＶＩ）である。Comparative Example 3 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 4 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 0.001, 0.01, 0.1,
0.10 ml of 1, 10, 100 nmol / l ATP
Addition to start the reaction, 2 minutes to 7 minutes after the start,
The absorbance at a wavelength of 555 nm was measured using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV2100). FIG. 3 shows the relationship between the ATP concentration and the absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank (ATP concentration is 0 nmol / l) from the absorbance obtained at each ATP concentration. This reaction involves the oxidation of NAD and reduced N
AD cycling reaction (VI).

【０１１２】 反応液４ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム ５ｍＭ（終濃度） コール酸ナトリウム ５０ｍＭ（終濃度） ジヒドロキシアセトンリン酸 ０．０３ｗｔ％（終濃度） ４−アミノアンチピリン ０．０３ｗｔ％（終濃度） ＴＯＯＳ（同人化学製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） １２α−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） グリセロール−３−リン酸デヒロゲナ ーゼ（ＳＩＧＭＡ） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ （旭化成工業製） ３Ｕ／ｍｌ（終濃度） パーオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ） 以上の通り、吸光度はＡＴＰ濃度に依存し、しかも既存
のＡＴＰの発色測定法より、低濃度のＡＴＰを定量する
事ができた。Reaction solution 4 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Magnesium chloride 5 mM (final concentration) Sodium cholate 50 mM (final concentration) 0.03 wt% of dihydroxyacetone phosphate (final concentration) 0.03 wt% of 4-aminoantipyrine (final concentration) TOOS (manufactured by Dojindo Chemical) 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (manufactured by Asahi Chemical Industry) 5 U / ml (final concentration) 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (manufactured by Asahi Kasei Kogyo) 5 U / ml (final concentration) Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (SIGMA) 5 U / ml (final concentration) L-α-glycerophosphate Oxidase (Asahi Kasei Kogyo) 3U / ml (final concentration) Peroxidase (SI GMA) As described above, the absorbance depends on the ATP concentration, and a low concentration of ATP could be quantified by the existing ATP color measurement method.

【０１１３】[0113]

【実施例４】ＡＴＰをＡＭＰに変えた以外は実施例１と
同様の方法で行った。その結果を図４に示す。Example 4 The same procedure as in Example 1 was performed except that ATP was changed to AMP. FIG. 4 shows the results.

【０１１４】[0114]

【比較例４】ＡＴＰをＡＭＰに変えた以外は比較例１と
同様の方法で行った。その結果を図４に示す。以上の通
り、吸光度はＡＭＰ濃度に依存し、しかも既存のＡＭＰ
の発色測定法より、低濃度のＡＭＰを定量する事ができ
た。Comparative Example 4 The same procedure as in Comparative Example 1 was carried out except that ATP was changed to AMP. FIG. 4 shows the results. As described above, the absorbance depends on the AMP concentration, and the existing AMP
It was possible to quantify low-concentration AMP by the color measurement method described above.

【０１１５】[0115]

【実施例５】０．９０ｍｌの反応液５を３７℃で５分間
予備加温した後、０、０．００１、０．０１、０．１、
１ｎｍｏｌ／ｌのＡＤＰを０．１０ｍｌ添加して反応を
開始し、開始後２分から７分の５分間、分光光度計（島
津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長５３０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ＡＤＰ濃度と各ＡＤＰ濃度で得
られた吸光度からブランク（ＡＤＰ濃度が０ｎｍｏｌ／
ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度との関係を図５に示
す。この反応は、反応式（ＶＩＩＩ）の反応である。Example 5 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 5 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 0.001, 0.01, 0.1,
The reaction was started by adding 0.10 ml of 1 nmol / l ADP, and the absorbance at a wavelength of 530 nm was measured using a spectrophotometer (Shimadzu: UV2100) for 5 minutes from 2 minutes to 7 minutes after the start. From the ADP concentration and the absorbance obtained at each ADP concentration, a blank (ADP concentration of 0 nmol /
FIG. 5 shows the relationship with the absorbance obtained by subtracting the absorbance of 1). This reaction is a reaction of the reaction formula (VIII).

【０１１６】[0116]

【化８】 Embedded image

【０１１７】 反応液５ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ５ｍＭ（終濃度） ホスホエノールピルビン酸 １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム １０ｍＭ（終濃度） コール酸ナトリウム ０．３５ｗｔ％（終濃度） ニトロテトラゾリウムブルー ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ピルビン酸カイネス（ＳＩＧＭＡ製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＰＷＤＫ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） １２α−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ジアホラーゼ（旭化成工業製）Reaction solution 5 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 5 mM (final concentration) Phosphoenolpyruvate 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Chloride Magnesium 10 mM (final concentration) Sodium cholate 0.35 wt% (final concentration) Nitrotetrazolium blue 5 U / ml (final concentration) Chines pyruvate (manufactured by SIGMA) 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (manufactured by Asahi Chemical Industry) 10 U / Ml (final concentration) PWDK 5U / ml (final concentration) 12α-hydroxysteroid dehydrogenase (Asahi Kasei Kogyo) 5U / ml (final concentration) Diaphorase (Asahi Kasei Kogyo)

【０１１８】[0118]

【比較例５】０．９０ｍｌの反応液６を３７℃で５分間
予備加温した後、０、０．００１、０．０１、０．１、
１、１０、１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＤＰを０．１０ｍｌ
添加して反応を開始し、開始後２分から７分の５分間、
分光光度計（島津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長
５３０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＤＰ濃度と各
ＡＤＰ濃度で得られた吸光度からブランク（ＡＤＰ濃度
が０ｎｍｏｌ／ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度との関
係を図５に示す。この反応は、反応式（ＩＸ）の反応で
ある。Comparative Example 5 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 6 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 0.001, 0.01, 0.1,
0.10 ml of 1, 10, 100 nmol / l ADP
Addition to start the reaction, 2 minutes to 7 minutes after the start,
The absorbance at a wavelength of 530 nm was measured using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV2100). FIG. 5 shows the relationship between the ADP concentration and the absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank (ADP concentration is 0 nmol / l) from the absorbance obtained at each ADP concentration. This reaction is a reaction of the reaction formula (IX).

【０１１９】[0119]

【化９】 Embedded image

【０１２０】 反応液６ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム １０ｍＭ（終濃度） コール酸ナトリウム ０．３５ｗｔ％（終濃度） ニトロテトラゾリウムブルー ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ピルビン酸カイネス（ＳＩＧＭＡ製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） １２α−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ（旭化成工業製） ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ジアホラーゼ（旭化成工業製） 以上の通り、吸光度はＡＤＰ濃度に依存し、しかも既存
のＡＤＰの発色測定法より、低濃度のＡＤＰを定量する
事ができた。Reaction solution 6 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Magnesium chloride 10 mM (final concentration) Sodium cholate 0.35 wt% (final concentration) Nitrotetrazolium blue 5 U / ml (final concentration) Chines pyruvate (SIGMA) 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (Asahi Kasei Kogyo) 5 U / ml (final concentration) 12α-hydroxy Steroid dehydrogenase (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) 5 U / ml (final concentration) Diaphorase (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) As described above, the absorbance depends on the ADP concentration, and a low-concentration ADP is quantified by the existing ADP color measurement method. I was able to do things.

【０１２１】[0121]

【実施例６】０．９０ｍｌの反応液７を３７℃で５分間
予備加温した後、０、１、１０、１００、１０００ｎｍ
ｏｌ／ｌのサイクリックＡＭＰを０．１０ｍｌ添加して
反応を開始し、開始後２分から７分の５分間、分光光度
計（島津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長５５５ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。サイクリックＡＭＰ濃度
と各サイクリックＡＭＰ濃度で得られた吸光度からブラ
ンク（サイクリックＡＭＰ濃度が０ｎｍｏｌ／ｌ）の吸
光度を差し引いた吸光度との関係を図６に示す。この反
応は、反応式（Ｘ）の反応である。Example 6 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 7 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 1, 10, 100, and 1000 nm
The reaction was started by adding 0.10 ml of cyclic AMP at ol / l, and for 5 minutes from 2 minutes to 7 minutes after the start, the wavelength was 555 n using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV2100).
The absorbance at m was measured. FIG. 6 shows the relationship between the cyclic AMP concentration and the absorbance obtained by subtracting the absorbance of a blank (cyclic AMP concentration of 0 nmol / l) from the absorbance obtained at each cyclic AMP concentration. This reaction is a reaction of the reaction formula (X).

【０１２２】[0122]

【化１０】 Embedded image

【０１２３】 反応液７ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ（終濃度） ホスホエノールピルビン酸 １ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ ５０ｍＭ（終濃度） 塩化アンモニウム ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム ０．５ｍＭ（終濃度） チアミンピロリン酸 ２ｍＭ（終濃度） ４−アミノアンチピリン ０．０１ｍＭ（終濃度） フラビンアデニンジヌクレオチド・２Ｎａ １５ｍＭ（終濃度） ＴＯＯＳ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） サイクリック３’、５’−ヌクレオチドホスホ ジエステラーゼ（ＳＩＧＭＡ製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＰＷＤＫ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ製） １５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ピルベイトオキシダーゼ（旭化成工業製） Reaction solution 7 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 10 mM (final concentration) Phosphoenolpyruvate 1 mM (final concentration) Deamide-NAD 50 mM (final concentration) Ammonium chloride 5 mM (final concentration) Chloride Magnesium 0.5 mM (final concentration) Thiamine pyrophosphate 2 mM (final concentration) 4-aminoantipyrine 0.01 mM (final concentration) Flavin adenine dinucleotide 2Na 15 mM (final concentration) TOOS 5 U / ml (final concentration) Cyclic 3 ' 5'-nucleotide phosphodiesterase (manufactured by SIGMA) 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (manufactured by Asahi Kasei Corporation) 10 U / ml (final concentration) PUDK 5 U / ml (final concentration) Peroxidase (manufactured by SIGMA) 15 U / ml (Final concentration) pyruvate oxidase (Asahi Kasei Corporation) Ltd.)

【０１２４】[0124]

【比較例６】０．９０ｍｌの反応液８を３７℃で５分間
予備加温した後、０、１、１０、１００、１０００、１
００００、１０００００ｎｍｏｌ／ｌのサイクリックＡ
ＭＰを０．１０ｍｌ添加して反応を開始し、開始後２分
から７分の５分間、分光光度計（島津製作所：ＵＶ２１
００）を用いて波長５５５ｎｍにおける吸光度を測定し
た。サイクリックＡＭＰ濃度と各サイクリックＡＭＰ濃
度で得られた吸光度からブランク（サイクリックＡＭＰ
濃度が０ｎｍｏｌ／ｌ）の吸光度を差し引いた吸光度と
の関係を図６に示す。この反応は、反応式（ＸＩ）の反
応である。Comparative Example 6 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 8 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 1, 10, 100, 1000, 1
0000, 100000 nmol / l cyclic A
The reaction was started by adding 0.10 ml of MP, and a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV21) was used for 2 minutes to 7 minutes 5 minutes after the start.
00) was used to measure the absorbance at a wavelength of 555 nm. From the cyclic AMP concentration and the absorbance obtained at each cyclic AMP concentration, a blank (cyclic AMP)
FIG. 6 shows the relationship with the absorbance obtained by subtracting the absorbance at a concentration of 0 nmol / l. This reaction is a reaction of the reaction formula (XI).

【０１２５】[0125]

【化１１】 Embedded image

【０１２６】 反応液８ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ（終濃度） ホスホエノールピルビン酸 ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム ０．５ｍＭ（終濃度） チアミンピロリン酸 ２ｍＭ（終濃度） ４−アミノアンチピリン ０．０１ｍＭ（終濃度） フラビンアデニンジヌクレオチド・２Ｎａ １５ｍＭ（終濃度） ＴＯＯＳ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） サイクリック３’、５’−ヌクレオチドホスホ ジエステラーゼ（ＳＩＧＭＡ製） １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＰＷＤＫ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ製） １５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ピルベイトオキシダーゼ（旭化成工業製） 以上の通り、吸光度はサイクリックＡＭＰ及びサイクリ
ックＡＭＰ濃度に依存し、しかも低濃度のサイクリック
ＡＭＰを定量する事ができた。Reaction solution 8 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 10 mM (final concentration) Phosphoenolpyruvate 5 mM (final concentration) Magnesium chloride 0.5 mM (final concentration) Thiamine pyrophosphate 2 mM (final concentration) 4-aminoantipyrine 0.01 mM (final concentration) Flavin adenine dinucleotide.2Na 15 mM (final concentration) TOOS 5 U / ml (final concentration) Cyclic 3 ', 5'-nucleotide phosphodiesterase (manufactured by SIGMA) 10 U / ml (Final concentration) PWDK 5 U / ml (final concentration) Peroxidase (manufactured by SIGMA) 15 U / ml (final concentration) Pyruvate oxidase (manufactured by Asahi Kasei Kogyo) As described above, the absorbance depends on the cyclic AMP and the cyclic AMP concentration, In addition, quantitative determination of low-concentration cyclic AMP It could be.

【０１２７】[0127]

【実施例７】０．９０ｍｌの反応液９を３７℃で５分間
予備加温した後、１５ｍＭのＴＯＯＳ（同仁化学製）を
０．０５ｍｌと０、１０、２０、４０、１００、２００
μｍｏｌ／ｌの塩化アンモニウムを０．０５ｍｌ添加し
て反応を開始し、開始後０分から５分の５分間、分光光
度計（島津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長５５５
ｎｍにおける吸光度を同条件で５回測定した。各塩化ア
ンモウム濃度における５分の吸光度から０分の吸光度を
引いた吸光度差の平均値とその標準偏差を吸光度差の平
均値で除したＣＶ（％）を表１、図７に示す。この反応
は、反応式（Ｉ）及び反応式（Ｉ）から生成されたピル
ビン酸をピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼに
よって発色させた反応である。Example 7 After preliminarily heating 0.90 ml of the reaction solution 9 at 37 ° C. for 5 minutes, 0.05 ml of 15 mM TOOS (manufactured by Dojindo) and 0, 10, 20, 40, 100, 200
The reaction was started by adding 0.05 ml of μmol / l ammonium chloride, and a wavelength of 555 was measured using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV2100) for 5 minutes from 0 minute to 5 minutes after the start.
The absorbance at nm was measured 5 times under the same conditions. Table 1 and FIG. 7 show the average value of the absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at 0 minutes from the absorbance at 5 minutes at each concentration of ammonium chloride and the CV (%) obtained by dividing the standard deviation thereof by the average value of the absorbance difference. This reaction is a reaction in which pyruvate produced from the reaction formula (I) and the reaction formula (I) is colored with pyruvate oxidase and peroxidase.

【０１２８】 反応液９ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １ｍＭ（終濃度） ＡＴＰ １０ｍＭ（終濃度） デアミド−ＮＡＤ １０ｍＭ（終濃度） ホスホエノールピルビン酸 ５ｍＭ（終濃度） 塩化マグネシウム ０．５ｍＭ（終濃度） チアミンピロリン酸 ２ｍＭ（終濃度） ４−アミノアンチピリン ０．０１ｍＭ（終濃度） フラビンアデニンジヌクレオチド・２Ｎａ １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＮＡＤ合成酵素（旭化成工業製） １５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ＰＷＤＫ ５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ製） １５Ｕ／ｍｌ（終濃度） ピルベイトオキシダーゼ（旭化成工業製）Reaction solution 9 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 1 mM (final concentration) ATP 10 mM (final concentration) Deamide-NAD 10 mM (final concentration) Phosphoenolpyruvate 5 mM (final concentration) Magnesium chloride 0.5 mM (final concentration) Thiamine pyrophosphate 2 mM (final concentration) 4-aminoantipyrine 0.01 mM (final concentration) Flavin adenine dinucleotide 2Na 10 U / ml (final concentration) NAD synthase (Asahi Kasei Kogyo) 15 U / ml (Final concentration) PWDK 5U / ml (final concentration) Peroxidase (manufactured by SIGMA) 15U / ml (final concentration) Pyruvate oxidase (manufactured by Asahi Chemical Industry)

【０１２９】[0129]

【比較例７】０．９５ｍｌの反応液１０を３７℃で５分
間予備加温した後、０、１０．２０、４０、１００、２
００μｍｏｌ／ｌの塩化アンモニウムを０．０５ｍｌ添
加して反応を開始し、開始後０分から５分の５分間、分
光光度計（島津製作所：ＵＶ２１００）を用いて波長３
４０ｎｍにおける吸光度を同条件で５回測定した。各塩
化アンモウム濃度における５分の吸光度から０分の吸光
度を引いた吸光度差の平均値とその標準偏差を吸光度差
の平均値で除したＣＶ（％）を表１、図７に示す。この
反応は、反応式（Ｖ）の反応である。Comparative Example 7 After preliminarily heating 0.95 ml of the reaction solution 10 at 37 ° C. for 5 minutes, 0, 10.20, 40, 100, 2
The reaction was initiated by adding 0.05 ml of 00 μmol / l ammonium chloride, and a wavelength of 3 using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation: UV2100) for 5 minutes from 0 to 5 minutes after the initiation.
The absorbance at 40 nm was measured five times under the same conditions. Table 1 and FIG. 7 show the average value of the absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at 0 minutes from the absorbance at 5 minutes at each concentration of ammonium chloride and the CV (%) obtained by dividing the standard deviation thereof by the average value of the absorbance difference. This reaction is a reaction of the reaction formula (V).

【０１３０】 反応液１０ ５０ｍＭ（終濃度） リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ（終濃度） ２−オキソグルタル酸 ５ｍＭ（終濃度） 還元型ＮＡＤ １０Ｕ／ｍｌ（終濃度） グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 以上の通り、平均吸光度はアンモニア濃度に依存し、し
かも既存のアンモニアの測定法より、再現良く、低濃度
のアンモニアを定量する事ができた。Reaction solution 10 50 mM (final concentration) Phosphate buffer (pH 7.0) 10 mM (final concentration) 2-oxoglutarate 5 mM (final concentration) Reduced NAD 10 U / ml (final concentration) Glutamate dehydrogenase The average absorbance was dependent on the ammonia concentration, and it was possible to quantify low-concentration ammonia with good reproducibility compared to the existing method for measuring ammonia.

【０１３１】[0131]

【発明の効果】低ブランクで、再現性良く、迅速簡便
に、且つ、高感度にＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、サイクリ
ックＡＭＰ、アンモニアおよびアンモニウムイオンを測
定する事が出来る。According to the present invention, ATP, AMP, ADP, cyclic AMP, ammonia and ammonium ions can be measured with low blank, good reproducibility, quick and simple, and high sensitivity.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】ＡＴＰ濃度と各ＡＴＰ濃度で得られた吸光度か
らブランクの吸光度を引いた吸光度差との関係を示す。
縦軸は吸光度差（ｍＡＢＳ）、横軸はＡＴＰ濃度（ｎｍ
ｏｌ／ｌ）を示す。FIG. 1 shows the relationship between the ATP concentration and the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance of a blank from the absorbance obtained at each ATP concentration.
The vertical axis represents the absorbance difference (mABS), and the horizontal axis represents the ATP concentration (nm).
ol / l).

【図２】ＡＭＰ濃度と各ＡＭＰ濃度で得られた吸光度か
らブランクの吸光度を引いた吸光度差との関係を示す。
縦軸は吸光度差（ｍＡＢＳ）、横軸はＡＭＰ濃度（ｎｍ
ｏｌ／ｌ）を示す。FIG. 2 shows the relationship between the AMP concentration and the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance of a blank from the absorbance obtained at each AMP concentration.
The vertical axis represents the absorbance difference (mABS), and the horizontal axis represents the AMP concentration (nm).
ol / l).

【図３】ＡＴＰ濃度と各ＡＴＰ濃度で得られた吸光度か
らブランクの吸光度を引いた吸光度差との関係を示す。
縦軸は吸光度差（ｍＡＢＳ）、横軸はＡＴＰ濃度（ｎｍ
ｏｌ／ｌ）を示す。FIG. 3 shows the relationship between the ATP concentration and the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank from the absorbance obtained at each ATP concentration.
The vertical axis represents the absorbance difference (mABS), and the horizontal axis represents the ATP concentration (nm).
ol / l).

【図４】ＡＭＰ濃度と各ＡＭＰ濃度で得られた吸光度か
らブランクの吸光度を引いた吸光度差との関係を示す。
縦軸は吸光度差（ｍＡＢＳ）、横軸はＡＭＰ濃度（ｎｍ
ｏｌ／ｌ）を示す。FIG. 4 shows the relationship between the AMP concentration and the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank from the absorbance obtained at each AMP concentration.
The vertical axis represents the absorbance difference (mABS), and the horizontal axis represents the AMP concentration (nm).
ol / l).

【図５】ＡＤＰ濃度と各ＡＤＰ濃度で得られた吸光度か
らブランクの吸光度を引いた吸光度差との関係を示す。
縦軸は吸光度（ｍＡＢＳ）、横軸はＡＤＰ濃度（ｎｍｏ
ｌ／ｌ）を示す。FIG. 5 shows the relationship between the ADP concentration and the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank from the absorbance obtained at each ADP concentration.
The vertical axis is absorbance (mABS), and the horizontal axis is ADP concentration (nmo).
1 / l).

【図６】サイクリックＡＭＰ濃度と各サイクリックＡＭ
Ｐ濃度で得られた吸光度からブランクの吸光度を引いた
吸光度差との関係を示す。縦軸は吸光度差（ｍＡＢ
Ｓ）、横軸はサイクリックＡＭＰ濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）
を示す。FIG. 6 shows cyclic AMP concentration and each cyclic AM.
The relationship between the absorbance obtained by subtracting the absorbance of the blank from the absorbance obtained at the P concentration is shown. The vertical axis represents the absorbance difference (mAB
S), the horizontal axis is the cyclic AMP concentration (nmol / l)
Is shown.

【図７】アンモニア濃度と各塩化アンモウム濃度におけ
る５分の吸光度から０分の吸光度を引いた吸光度差の平
均値との関係を示す。縦軸は吸光度差（ｍＡＢＳ）、横
軸はアンモニア濃度（μｍｏｌ／ｌ）を示す。FIG. 7 shows the relationship between the ammonia concentration and the average absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at 0 minutes from the absorbance at 5 minutes at each concentration of ammonium chloride. The vertical axis indicates the absorbance difference (mABS), and the horizontal axis indicates the ammonia concentration (μmol / l).

フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ Ｆターム(参考） 2G045 AA28 CB21 DA15 DB06 FB01 4B050 CC07 DD02 KK06 KK13 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ03 QQ16 QQ63 QQ90 QR02 QR03 QR04 QR07 QR12 QR20 QR42 QR57 QX02 Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat II (reference) C12N 9/16 C12N 9/16 C F term (reference) 2G045 AA28 CB21 DA15 DB06 FB01 4B050 CC07 DD02 KK06 KK13 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ03 QQ16 QQ63 QQ90 QR02 QR03 QR04 QR07 QR12 QR20 QR42 QR57 QX02

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）
を基質とする酵素（Ｅ１）とアデノシンモノホスフェー
ト（ＡＭＰ）を基質とする酵素（Ｅ２）を用いて、反応
式（I）に記載の反応を行わせ、その反応により消費さ
れた反応物および／または反応による生成物を定量する
ことを特徴とする微量成分の測定法。 【化１】 （ただし、式中Ｅ１は、ＡＴＰを基質とする酵素；Ｅ２
は、ＡＭＰを基質とする酵素；Ｓ１は、Ｅ１の反応物；
Ｐ１は、Ｓ１とＥ１の反応からの生成物；Ｓ２は、Ｅ２
の反応物；Ｐ２は、Ｓ２とＥ２の反応からの生成物をそ
れぞれ示す。）1. Adenosine triphosphate (ATP)
Is reacted using an enzyme (E1) using as a substrate and an enzyme (E2) using adenosine monophosphate (AMP) as a substrate, and reactants consumed by the reaction and / or Alternatively, a method for measuring a trace component, which comprises quantifying a reaction product. Embedded image (Where E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2
Is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reaction product of E1;
P1 is the product from the reaction of S1 with E1; S2 is E2
P2 represents the product from the reaction of S2 and E2, respectively. ) 【請求項２】 微量成分がＡＴＰおよび／またはＡＭＰ
である請求項１記載の測定法。2. The method according to claim 1, wherein the trace component is ATP and / or AMP.
The method according to claim 1, wherein 【請求項３】 微量成分がアンモニアおよび／またはア
ンモニウムイオンである請求項１記載の測定法。3. The method according to claim 1, wherein the trace component is ammonia and / or ammonium ion. 【請求項４】 ＡＴＰを基質とする酵素（Ｅ１）とＡＭ
Ｐを基質とする酵素（Ｅ２）及びピルベイトカイネス
（ＥＣ２．７．１．４０）を用いて反応式（ＩＩ）に記
載の反応を行わせ、その反応により消費された反応物お
よび／または反応による生成物を定量することを特徴と
する微量成分の測定法。 【化２】 （ただし、式中Ｅ１は、ＡＴＰを基質とする酵素；Ｅ２
は、ＡＭＰを基質とする酵素；Ｓ１は、Ｅ１の反応物；
Ｐ１は、Ｓ１とＥ１の反応からの生成物；Ｓ２は、Ｅ２
の反応物；Ｐ２は、Ｓ２とＥ２の反応からの生成物をそ
れぞれ示す。）4. An enzyme (A1) using ATP as a substrate and AM
The reaction described in the reaction formula (II) is carried out using the enzyme (E2) using P as a substrate and pyruvate kines (EC 2.7.1.40), and the reactants consumed by the reaction and / or A method for measuring trace components, characterized by quantifying the product of the reaction. Embedded image (Where E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2
Is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reaction product of E1;
P1 is the product from the reaction of S1 with E1; S2 is E2
P2 represents the product from the reaction of S2 and E2, respectively. ) 【請求項５】 微量成分がＡＴＰ、ＡＭＰおよびアデノ
シンジホスフェート（ＡＤＰ）の一種以上である請求項
４記載の測定法。5. The method according to claim 4, wherein the trace component is one or more of ATP, AMP and adenosine diphosphate (ADP). 【請求項６】 ＡＴＰを基質とする酵素（Ｅ１）とＡＭ
Ｐを基質とする酵素（Ｅ２）及びサイクリック３’、
５’−ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＥＣ３．
１．４．１７）を用いて反応式（ＩＩＩ）に記載の反応
を行わせ、その反応により消費された反応物および／ま
たは反応による生成物を定量することを特徴とする微量
成分の測定法。 【化３】 （ただし、式中Ｅ１は、ＡＴＰを基質とする酵素；Ｅ２
は、ＡＭＰを基質とする酵素；Ｓ１は、Ｅ１の反応物；
Ｐ１は、Ｓ１とＥ１の反応からの生成物；Ｓ２は、Ｅ２
の反応物；Ｐ２は、Ｓ２とＥ２の反応からの生成物をそ
れぞれ示す。）6. An enzyme (E1) using ATP as a substrate and AM
An enzyme using P as a substrate (E2) and cyclic 3 ′,
5'-nucleotide phosphodiesterase (EC3.
The reaction described in Reaction Formula (III) is carried out using 1.4.17), and the amount of the reactant consumed by the reaction and / or the product of the reaction is quantified. . Embedded image (Where E1 is an enzyme using ATP as a substrate; E2
Is an enzyme using AMP as a substrate; S1 is a reaction product of E1;
P1 is the product from the reaction of S1 with E1; S2 is E2
P2 represents the product from the reaction of S2 and E2, respectively. ) 【請求項７】 微量成分がＡＴＰ、ＡＭＰおよびサイク
リックＡＭＰの一種以上である請求項６記載の測定法。7. The method according to claim 6, wherein the trace component is one or more of ATP, AMP and cyclic AMP. 【請求項８】 ＡＴＰを基質とする酵素（Ｅ１）がＮＡ
Ｄ合成酵素である請求項１〜７のいずれかに記載の測定
法。8. The enzyme (E1) using ATP as a substrate is NA
The method according to any one of claims 1 to 7, which is a D synthase. 【請求項９】 ＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）がピル
ビン酸リン酸化酵素である請求項１〜８のいずれかに記
載の測定法。9. The method according to claim 1, wherein the enzyme (E2) using AMP as a substrate is pyruvate kinase. 【請求項１０】 ＡＴＰを基質とする酵素（Ｅ１）とＡ
ＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）と過剰量の基質を含有す
ることを特徴とする微量成分測定用組成物。10. An enzyme (E1) using ATP as a substrate and A
A composition for measuring a minor component, comprising an enzyme (E2) using MP as a substrate and an excess amount of a substrate. 【請求項１１】 ＡＴＰを基質とする酵素（Ｅ１）がＮ
ＡＤ合成酵素である請求項１０に記載の微量成分測定用
組成物。11. An enzyme using ATP as a substrate (E1) is N
The composition for measuring a trace component according to claim 10, which is an AD synthase. 【請求項１２】 ＡＭＰを基質とする酵素（Ｅ２）がピ
ルビン酸リン酸化酵素である請求項１０または１１に記
載の微量成分測定用組成物。12. The composition for measuring a minor component according to claim 10, wherein the enzyme (E2) using AMP as a substrate is a pyruvate kinase.
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