JP2001231403A - Nonhuman animal retaining varied alien chromosome or its fragment - Google Patents
Nonhuman animal retaining varied alien chromosome or its fragmentInfo
- Publication number
- JP2001231403A JP2001231403A JP2000042074A JP2000042074A JP2001231403A JP 2001231403 A JP2001231403 A JP 2001231403A JP 2000042074 A JP2000042074 A JP 2000042074A JP 2000042074 A JP2000042074 A JP 2000042074A JP 2001231403 A JP2001231403 A JP 2001231403A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chromosome
- human
- cells
- fragment
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 262
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 232
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 146
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 32
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims description 140
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 133
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims description 62
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims description 62
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims description 62
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 61
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 39
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 claims description 31
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 30
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 312
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 140
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 87
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 64
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 61
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 61
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 56
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 30
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 26
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 26
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 22
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 22
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 19
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 13
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 12
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 12
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 12
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 11
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101150002896 RNR2 gene Proteins 0.000 description 11
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 11
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 11
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 10
- 101001082432 Homo sapiens Heparin cofactor 2 Proteins 0.000 description 10
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 101100302211 Arabidopsis thaliana RNR2A gene Proteins 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 8
- 102100030500 Heparin cofactor 2 Human genes 0.000 description 7
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 7
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 7
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 101100384866 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COT1 gene Proteins 0.000 description 6
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 5
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 5
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 3
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101150087313 Cd8a gene Proteins 0.000 description 2
- 208000031639 Chromosome Deletion Diseases 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010004020 Immunoglobulin lambda-Chains Proteins 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101710200251 Recombinase cre Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001182 human Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000010543 22q11.2 deletion syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000014392 Cat-eye syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004328 Cytochrome P-450 CYP3A Human genes 0.000 description 1
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000398 DiGeorge Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001635598 Enicostema Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100438956 Homo sapiens CD8A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101100450562 Homo sapiens SERPIND1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010027626 Milia Diseases 0.000 description 1
- 101100001347 Mus musculus Akt1s1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100058506 Mus musculus Bloc1s5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100384865 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cot-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100202463 Schizophyllum commune SC14 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081400 Subtelomere Proteins 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032099 V(D)J recombination activating protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100029591 V(D)J recombination-activating protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000004703 blastocyst inner cell mass Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009319 interchromosomal translocation Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は改変された外来染色
体あるいはその断片を保持する非ヒト動物に関する。[0001] The present invention relates to a non-human animal having a modified foreign chromosome or a fragment thereof.
【０００２】[0002]
【従来の技術】染色体断片を含むミクロセルと分化多能
性を有する細胞との融合により得られるハイブリッド細
胞からキメラ動物を作製する技術（WO97/07671）の開発
により,従来不可能であった長大な外来遺伝子を保持す
る非ヒト動物の作製が可能になった。2. Description of the Related Art The development of a technique (WO97 / 07671) for producing chimeric animals from hybrid cells obtained by fusing a microcell containing a chromosome fragment with cells having pluripotency has made it impossible to achieve a large size. It has become possible to create non-human animals that carry foreign genes.
【０００３】非ヒト動物に導入される染色体断片を改変
することにより、（１）不要な遺伝子の除去、（２）所
望の遺伝子の付加、（３）染色体断片の安定化等を行い
得ることは有用である。WO98/37757には、ニワトリ由来
のDT-40細胞に保持されたヒト染色体にテロメア配列を
ターゲティングし、高効率で所望の欠失染色体を取得で
きたことが記載されている。また、マウスＥＳ細胞及び
マウス個体において安定に保持され、かつ子孫伝達可能
なヒト染色体断片について記載されている。By modifying chromosome fragments introduced into non-human animals, it is possible to (1) remove unnecessary genes, (2) add desired genes, and (3) stabilize chromosome fragments. Useful. WO98 / 37757 describes that a desired deletion chromosome could be obtained with high efficiency by targeting a telomere sequence to a human chromosome retained in chicken-derived DT-40 cells. In addition, a human chromosome fragment stably maintained in mouse ES cells and mouse individuals and capable of transmitting progeny is described.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は改変された外
来染色体あるいはその断片を保持する非ヒト動物を提供
することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a non-human animal having a modified foreign chromosome or a fragment thereof.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】発明者らは前記課題を解
決するために鋭意研究を行った結果、ヒト１４番染色体
断片及び２２番染色体断片からなる１本の人工染色体を
構築し、これを保持するキメラマウスを作出することに
成功した。該キメラマウスはヒト１４番染色体上のヒト
抗体重鎖遺伝子、２２番染色体上のヒト抗体軽鎖λ遺伝
子の発現産物である完全ヒト抗体を産生することが確認
された。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, constructed one artificial chromosome comprising a human chromosome 14 fragment and a chromosome 22 fragment, and We succeeded in creating chimeric mice to retain. The chimeric mouse was confirmed to produce a fully human antibody which is an expression product of the human antibody heavy chain gene on human chromosome 14 and the human antibody light chain λ gene on chromosome 22.
【０００６】本発明の要旨は以下の通りである。 1. 改変された外来染色体あるいはその断片を保持する
細胞の作製方法であって、下記の工程： （a）外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを
作製し、該ミクロセルとの融合により相同組換え効率の
高い細胞へ前記外来染色体あるいはその断片を移入させ
る工程、（b）前記相同組換え効率の高い細胞におい
て、前記外来染色体あるいはその断片の所望の部位、及
び／又は前記相同組換え効率の高い細胞に由来する染色
体の所望の部位に相同組換えによりターゲティングベク
ターを挿入することにより、前記所望の部位にマーキン
グを施す工程、および（c）前記相同組換え効率の高い
細胞において、前記外来染色体あるいはその断片のマー
キングを施した部位における欠失および／または転座を
生ぜしめる工程を含む前記方法。The gist of the present invention is as follows. 1. A method for preparing a cell having a modified foreign chromosome or a fragment thereof, comprising the following steps: (a) preparing a microcell containing the foreign chromosome or a fragment thereof, and performing homologous recombination efficiency by fusion with the microcell; Transferring the foreign chromosome or a fragment thereof to a cell having a high homologous recombination efficiency, (b) in the cell having a high homologous recombination efficiency, a desired site of the foreign chromosome or a fragment thereof, and / or a cell having a high homologous recombination efficiency (C) marking the desired site by inserting a targeting vector into the desired site of the chromosome derived from by homologous recombination, and (c) in the cell having a high homologous recombination efficiency, The method comprising the step of causing a deletion and / or translocation at the site where the fragment was marked.
【０００７】２. 工程（ａ）および（ｂ）を経た複数の
相同組換え効率の高い細胞を全細胞融合した後、工程
（ｃ）を行う上記１記載の方法。 ３. 複数の相同組換え効率の高い細胞が、異なる外来染
色体あるいはその断片を保持するものである上記２記載
の方法。 ４．改変された外来染色体あるいはその断片を保持する
細胞が動物細胞である上記１記載の方法。 ５. 動物細胞が哺乳動物細胞である上記４記載の方法。[0007] 2. The method according to the above item 1, wherein the step (c) is carried out after all the cells having a high homologous recombination efficiency having undergone the steps (a) and (b) are subjected to whole cell fusion. 3. The method according to the above 2, wherein the plurality of cells having high homologous recombination efficiency have different foreign chromosomes or fragments thereof. 4. 2. The method according to the above 1, wherein the cell holding the modified foreign chromosome or a fragment thereof is an animal cell. 5. The method according to the above 4, wherein the animal cell is a mammalian cell.
【０００８】６． 動物細胞がヒト以外の動物の細胞で
ある上記４記載の方法。 ７. ターゲティングベクターがテロメア配列を含み、該
ターゲティングベクターの挿入により前記テロメア配列
が所望の部位に導入される上記１記載の方法。 ８. テロメア配列の導入された部位に欠失を生ぜしめる
上記2記載の方法。 ９. ターゲティングベクターが部位特異的組換え酵素の
認識配列を含み、該ターゲティングベクターの挿入によ
り前記部位特異的組換え酵素の認識配列が所望の部位に
導入される上記１記載の方法。[0008] 6. 5. The method according to the above 4, wherein the animal cell is a cell of a non-human animal. 7. The method according to the above 1, wherein the targeting vector contains a telomere sequence, and the telomere sequence is introduced into a desired site by inserting the targeting vector. 8. The method according to the above 2, wherein a deletion is caused at the site where the telomere sequence is introduced. 9. The method according to the above 1, wherein the targeting vector contains a site-specific recombinase recognition sequence, and the site-specific recombinase recognition sequence is introduced into a desired site by inserting the targeting vector.
【０００９】10. 部位特異的組換え酵素の認識配列を含
むターゲティングベクターの挿入と同時にあるいは挿入
後に、部位特異的組換え酵素を発現できるベクターを相
同組換え効率の高い細胞に導入し、前記部位特異的組換
え酵素活性を発現せしめることにより、部位特異的組換
え酵素の認識配列が導入された部位において外来染色体
あるいはその断片の欠失および／または転座を生ぜしめ
る上記９記載の方法。 11. 転座が、複数の外来染色体あるいはその断片の間で
行われるものである上記10記載の方法。 12. 複数の外来染色体が、同種の生物由来である上記11
記載の方法。 13. 同種の生物がヒトである上記12記載の方法。 14. 複数の外来染色体が、異種の生物由来である上記11
記載の方法。 15. 異種の生物がヒトおよびマウスである上記14記載の
方法。[0009] 10. A vector capable of expressing a site-specific recombinase is introduced into cells having high homologous recombination efficiency simultaneously with or after the insertion of a targeting vector containing a recognition sequence for the site-specific recombinase. 10. The method according to the above item 9, wherein the exogenous chromosome or its fragment is deleted and / or translocated at the site where the site-specific recombinase recognition sequence is introduced by expressing the specific recombinase activity. 11. The method according to the above 10, wherein the translocation is performed between a plurality of foreign chromosomes or fragments thereof. 12. The above-mentioned 11 in which the plurality of foreign chromosomes are derived from the same species of organism.
The described method. 13. The method according to the above 12, wherein the same kind of organism is human. 14. The above-mentioned 11 wherein the plurality of foreign chromosomes are derived from heterologous organisms
The described method. 15. The method according to the above 14, wherein the heterologous organism is a human and a mouse.
【００１０】16. 転座が、外来染色体あるいはその断片
と相同組換え効率の高い細胞に由来する染色体の間で行
われるものである上記10記載の方法。 17. 部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である上記９記
載の方法。 18. 部位特異的組換え酵素の認識配列がＬｏｘＰ配列で
ある上記９記載の方法。 19. 相同組換え効率の高い細胞が胚性幹細胞（ES細胞）
である上記１記載の方法。 20. 相同組換え効率の高い細胞がニワトリDT-40細胞で
ある上記１記載の方法。16. The method according to the above item 10, wherein the translocation is performed between a foreign chromosome or a fragment thereof and a chromosome derived from a cell having a high homologous recombination efficiency. 17. The method according to the above 9, wherein the site-specific recombinant enzyme is a Cre enzyme. 18. The method according to the above 9, wherein the recognition sequence of the site-specific recombinase is a LoxP sequence. 19. Cells with high homologous recombination efficiency are embryonic stem cells (ES cells)
2. The method according to the above 1, wherein 20. The method according to the above 1, wherein the cells having high homologous recombination efficiency are chicken DT-40 cells.
【００１１】21. 欠失および／または転座を生じた外来
染色体あるいはその断片を含む細胞を選抜する工程をさ
らに含む上記１記載の方法。 22. 欠失および／または転座を生じた外来染色体あるい
はその断片を含む細胞の選抜が、マーカー遺伝子の発現
に基づくものである上記21記載の方法。 23. マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である上記22記載
の方法。 24. マーカー遺伝子がオワンクラゲ由来の緑色蛍光タン
パク質（green fluorescent protein）遺伝子あるいは
その改変体遺伝子である上記22記載の方法。 25. 外来染色体あるいはその断片がヒト由来である上記
１記載の方法。21. The method according to the above 1, further comprising a step of selecting cells containing the foreign chromosome or a fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred. 22. The method according to 21 above, wherein the selection of cells containing the foreign chromosome or the fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred is based on the expression of the marker gene. 23. The method according to the above 22, wherein the marker gene is a drug resistance gene. 24. The method according to the above 22, wherein the marker gene is a green fluorescent protein gene derived from O jellyfish or a modified gene thereof. 25. The method according to 1 above, wherein the foreign chromosome or a fragment thereof is derived from human.
【００１２】26. 改変された外来染色体あるいはその断
片を保持するキメラ非ヒト動物の作製方法であって、下
記の工程； （a）外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを
作製し、該ミクロセルとの融合により相同組換え効率の
高い細胞へ前記外来染色体あるいはその断片を移入させ
る工程、（b）前記相同組換え効率の高い細胞におい
て、前記外来染色体あるいはその断片の所望の部位、及
び／又は前記相同組換え効率の高い細胞に由来する染色
体の所望の部位に相同組換えによりベクターを挿入する
ことにより、前記所望の部位にマーキングを施す工程、
（c）前記相同組換え効率の高い細胞において、前記外
来染色体あるいはその断片のマーキングを施した部位に
おける欠失および／または転座を生ぜしめる工程、およ
び（d）前記の欠失または転座を生じた外来染色体ある
いはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセル
との融合により、前記の欠失または転座を生じた外来染
色体あるいはその断片を分化多能性を保持する非ヒト動
物細胞に移入させる工程を含む前記方法。26. A method for producing a chimeric non-human animal having a modified foreign chromosome or a fragment thereof, comprising the following steps: (a) preparing a microcell containing the foreign chromosome or a fragment thereof, Transferring the foreign chromosome or a fragment thereof to a cell having a high homologous recombination efficiency by fusion; (b) in the cell having a high homologous recombination efficiency, a desired site of the foreign chromosome or a fragment thereof; A step of marking the desired site by inserting a vector by homologous recombination at a desired site of a chromosome derived from a cell having a high recombination efficiency,
(C) a step of causing a deletion and / or translocation at the site where the foreign chromosome or a fragment thereof is marked in the cell having a high homologous recombination efficiency; and (d) performing the deletion or translocation. Producing a microcell containing the resulting foreign chromosome or a fragment thereof, and transferring the foreign chromosome or the fragment thereof having the deletion or translocation to a non-human animal cell having pluripotency by fusion with the microcell. The above method comprising the step of:
【００１３】27. 工程（ａ）および（ｂ）を経た複数の
相同組換え効率の高い細胞を全細胞融合した後、工程
（ｃ）を行う上記26記載の方法。 28. 複数の相同組換え効率の高い細胞が、異なる外来染
色体あるいはその断片を保持するものである上記27記載
の方法。 29. ターゲティングベクターがテロメア配列を含み、該
ターゲティングベクターの挿入により前記テロメア配列
が所望の部位に導入される上記26記載の方法。 30. テロメア配列の導入された部位に欠失を生ぜしめる
上記29記載の方法。27. The method according to the above item 26, wherein the step (c) is carried out after all cells having a high homologous recombination efficiency having undergone the steps (a) and (b) are subjected to whole cell fusion. 28. The method according to 27 above, wherein the plurality of cells having high homologous recombination efficiency have different foreign chromosomes or fragments thereof. 29. The method according to the above 26, wherein the targeting vector contains a telomere sequence, and the telomere sequence is introduced into a desired site by inserting the targeting vector. 30. The method according to the above 29, wherein a deletion is caused at the site where the telomere sequence is introduced.
【００１４】31. ターゲティングベクターが部位特異的
組換え酵素の認識配列を含み、該ターゲティングベクタ
ーの挿入により前記部位特異的組換え酵素の認識配列が
所望の部位に導入される上記26記載の方法。 32. 部位特異的組換え酵素の認識配列を含むターゲティ
ングベクターの挿入と同時にあるいは挿入後に、部位特
異的組換え酵素を発現できるベクターを相同組換え効率
の高い細胞に導入し、前記部位特異的組換え酵素活性を
発現せしめることにより、部位特異的組換え酵素の認識
配列が導入された部位において外来染色体あるいはその
断片の欠失および／または転座を生ぜしめる上記31記載
の方法。31. The method according to the above item 26, wherein the targeting vector comprises a site-specific recombinase recognition sequence, and the site-specific recombinase recognition sequence is introduced into a desired site by inserting the targeting vector. 32. Simultaneously with or after the insertion of the targeting vector containing the recognition sequence of the site-specific recombinase, a vector capable of expressing the site-specific recombinase is introduced into cells having high homologous recombination efficiency, 32. The method according to the above item 31, wherein the exogenous chromosome or a fragment thereof is deleted and / or translocated at the site where the site-specific recombinase recognition sequence is introduced by expressing the recombinase activity.
【００１５】33. 転座が、複数の外来染色体あるいはそ
の断片の間で行われるものである上記32記載の方法。 34. 転座が、外来染色体あるいはその断片と相同組換え
効率の高い細胞に由来する染色体の間で行われるもので
ある上記32記載の方法。 35. 部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である上記31記
載の方法。 36. 部位特異的組換え酵素の認識配列がＬｏｘＰ配列で
ある上記31記載の方法。33. The method according to 32, wherein the translocation is performed between a plurality of foreign chromosomes or fragments thereof. 34. The method according to 32 above, wherein the translocation is performed between the foreign chromosome or a fragment thereof and a chromosome derived from a cell having a high homologous recombination efficiency. 35. The method according to the above 31, wherein the site-specific recombinant enzyme is a Cre enzyme. 36. The method according to 31 above, wherein the recognition sequence of the site-specific recombinase is a LoxP sequence.
【００１６】37. 相同組換え効率の高い細胞が胚性幹細
胞（ES細胞）である上記26記載の方法。 38. 相同組換え効率の高い細胞がニワトリDT-40細胞で
ある上記26記載の方法。 39. 欠失および／または転座を生じた外来染色体あるい
はその断片を含む細胞を選抜する工程をさらに含む上記
26記載の方法。37. The method according to the above 26, wherein the cells having high homologous recombination efficiency are embryonic stem cells (ES cells). 38. The method according to the above 26, wherein the cells having a high homologous recombination efficiency are chicken DT-40 cells. 39. The above-mentioned method, further comprising a step of selecting cells containing a foreign chromosome or a fragment thereof in which a deletion and / or translocation has occurred.
26. The method of claim 26.
【００１７】40. 欠失および／または転座を生じた外来
染色体あるいはその断片を含む細胞の選抜が、マーカー
遺伝子の発現に基づくものである上記39記載の方法。 41. マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である上記40記載
の方法。 42. マーカー遺伝子がオワンクラゲ由来の緑色蛍光タン
パク質（green fluorescent protein）遺伝子あるいは
その改変体遺伝子である上記40記載の方法。40. The method according to the above item 39, wherein the selection of cells containing the foreign chromosome or the fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred is based on the expression of the marker gene. 41. The method according to the above 40, wherein the marker gene is a drug resistance gene. 42. The method according to 40 above, wherein the marker gene is a green fluorescent protein gene derived from O jellyfish or a modified gene thereof.
【００１８】43. 工程（d）において、相同組換え効率
の高い細胞からミクロセルを作製し、該ミクロセルとの
融合により、前記欠失および／または転座を生じた外来
染色体あるいはその断片をCHO細胞に移入し、次いで、
該CHO細胞からミクロセルを作製し、該ミクロセルとの
融合により、前記欠失および／または転座を生じた外来
染色体あるいはその断片を分化多能性を保持する細胞に
移入させる上記26記載の方法。 44. 分化多能性を有する細胞が胚性幹細胞（ES細胞）で
ある上記26記載の方法。 45. 外来染色体あるいはその断片がヒト由来である上記
26記載の方法。43. In the step (d), a microcell is prepared from a cell having a high homologous recombination efficiency, and the foreign chromosome or its fragment, which has been deleted and / or translocated by fusion with the microcell, is transformed into a CHO cell. And then
27. The method according to the above 26, wherein a microcell is prepared from the CHO cell, and the foreign chromosome or the fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred is transferred to a cell having pluripotency by fusion with the microcell. 44. The method according to the above 26, wherein the cells having pluripotency are embryonic stem cells (ES cells). 45. The above, wherein the foreign chromosome or fragment thereof is of human origin
26. The method of claim 26.
【００１９】46. 改変された外来染色体あるいはその断
片を保持する非ヒト動物の作製方法であって、下記の工
程； （a）外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを
作製し、該ミクロセルとの融合により相同組換え効率の
高い細胞へ前記外来染色体あるいはその断片を移入させ
る工程、（b）前記相同組換え効率の高い細胞におい
て、前記外来染色体あるいはその断片の所望の部位、及
び／又は前記相同組換え効率の高い細胞に由来する染色
体の所望の部位に相同組換えによりベクターを挿入する
ことにより、前記所望の部位にマーキングを施す工程、
（c）前記相同組換え効率の高い細胞において、前記外
来染色体あるいはその断片のマーキングを施した部位に
おける欠失および／または転座を生ぜしめる工程、
（d）前記の欠失および／または転座を生じた外来染色
体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミク
ロセルとの融合により、前記の欠失または転座を生じた
外来染色体あるいはその断片を非ヒト動物由来の細胞に
移入させる工程、および（e）前記非ヒト動物由来の細
胞の核を、同種の非ヒト動物の除核した未受精卵に移植
する工程を含む前記方法。46. A method for producing a non-human animal having a modified foreign chromosome or a fragment thereof, comprising the following steps: (a) preparing a microcell containing the foreign chromosome or a fragment thereof, and fusing with the microcell Transferring the foreign chromosome or a fragment thereof to a cell having a high homologous recombination efficiency, (b) in the cell having a high homologous recombination efficiency, a desired site of the foreign chromosome or a fragment thereof, and / or the homologous set. By inserting a vector by homologous recombination into a desired site of a chromosome derived from a cell with high recombination efficiency, a step of marking the desired site,
(C) causing a deletion and / or translocation at a site where the foreign chromosome or a fragment thereof is marked in the cell having a high homologous recombination efficiency;
(D) preparing a microcell containing the foreign chromosome or a fragment thereof in which the above-described deletion and / or translocation has occurred, and transferring the foreign chromosome or the fragment thereof in which the above-described deletion or translocation has occurred by fusion with the microcell. The above method comprising the steps of: transferring to non-human animal-derived cells; and (e) transplanting the nuclei of the non-human animal-derived cells to enucleated unfertilized eggs of the same type of non-human animal.
【００２０】47. 工程（ａ）および（ｂ）を経た複数の
相同組換え効率の高い細胞を全細胞融合した後、工程
（ｃ）を行う上記46記載の方法。 48. 複数の相同組換え効率の高い細胞が、異なる外来染
色体あるいはその断片を保持するものである上記47記載
の方法。 49. ターゲティングベクターがテロメア配列を含み、該
ターゲティングベクターの挿入により前記テロメア配列
が所望の部位に導入される上記46記載の方法。 50. テロメア配列の導入された部位に欠失を生ぜしめる
上記49記載の方法。47. The method according to the above item 46, wherein the step (c) is carried out after all the cells having a high homologous recombination efficiency having undergone the steps (a) and (b) are subjected to whole cell fusion. 48. The method according to 47 above, wherein the plurality of cells having high homologous recombination efficiency have different foreign chromosomes or fragments thereof. 49. The method according to the above 46, wherein the targeting vector contains a telomere sequence, and the telomere sequence is introduced into a desired site by inserting the targeting vector. 50. The method according to the above 49, wherein a deletion is caused at the site where the telomere sequence is introduced.
【００２１】51. ターゲティングベクターが部位特異的
組換え酵素の認識配列を含み、該ターゲティングベクタ
ーの挿入により前記部位特異的組換え酵素の認識配列が
所望の部位に導入される上記46記載の方法。 52. 部位特異的組換え酵素の認識配列を含むターゲティ
ングベクターの挿入と同時にあるいは挿入後に、部位特
異的組換え酵素を発現できるベクターを相同組換え効率
の高い細胞に導入し、前記部位特異的組換え酵素活性を
発現せしめることにより、部位特異的組換え酵素の認識
配列が導入された部位において外来染色体あるいはその
断片の欠失および／または転座を生ぜしめる上記51記載
の方法。51. The method according to the above item 46, wherein the targeting vector comprises a recognition sequence for a site-specific recombinase, and the insertion of the targeting vector introduces the recognition sequence for the site-specific recombinase into a desired site. 52. Simultaneously with or after insertion of a targeting vector containing a site-specific recombinase recognition sequence, a vector capable of expressing a site-specific recombinase is introduced into cells having high homologous recombination efficiency, 52. The method according to the above item 51, wherein the exogenous chromosome or a fragment thereof is deleted and / or translocated at the site where the recognition sequence of the site-specific recombinase is introduced by expressing the recombinase activity.
【００２２】53. 転座が、複数の外来染色体あるいはそ
の断片の間で行われるものである上記52記載の方法。 54. 転座が、外来染色体あるいはその断片と相同組換え
効率の高い細胞に由来する染色体の間で行われるもので
ある上記52記載の方法。 55. 部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である上記51記
載の方法。 56. 部位特異的組換え酵素の認識配列がＬｏｘＰ配列で
ある上記51記載の方法。 57. 相同組換え効率の高い細胞が胚性幹細胞（ES細胞）
である上記46記載の方法。53. The method according to 52 above, wherein the translocation is performed between a plurality of foreign chromosomes or fragments thereof. 54. The method according to 52 above, wherein the translocation is performed between a foreign chromosome or a fragment thereof and a chromosome derived from a cell having high homologous recombination efficiency. 55. The method according to 51 above, wherein the site-specific recombinant enzyme is a Cre enzyme. 56. The method according to 51 above, wherein the recognition sequence of the site-specific recombinase is a LoxP sequence. 57. Cells with high homologous recombination efficiency are embryonic stem cells (ES cells)
47. The method of claim 46, wherein
【００２３】58. 相同組換え効率の高い細胞がニワトリ
DT-40細胞である上記46記載の方法。 59. 欠失および／または転座を生じた外来染色体あるい
はその断片を含む細胞を選抜する工程をさらに含む上記
46記載の方法。 60. 欠失および／または転座を生じた外来染色体あるい
はその断片を含む細胞の選抜が、マーカー遺伝子の発現
に基づくものである上記59記載の方法。 61. マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である上記60記載
の方法。 62. マーカー遺伝子がオワンクラゲ由来の緑色蛍光タン
パク質（green fluorescent protein）遺伝子あるいは
その改変体遺伝子である上記60記載の方法。58. Cells with high homologous recombination efficiency
47. The method according to 46 above, which is a DT-40 cell. 59. The above-mentioned method, further comprising a step of selecting cells containing a foreign chromosome or a fragment thereof in which a deletion and / or translocation has occurred.
46. The method of claim 46. 60. The method according to above 59, wherein the selection of cells containing the foreign chromosome or the fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred is based on the expression of the marker gene. 61. The method according to the above 60, wherein the marker gene is a drug resistance gene. 62. The method according to the above 60, wherein the marker gene is a green fluorescent protein gene derived from Oan jellyfish or a modified gene thereof.
【００２４】63. 工程（d）において、相同組換え効率
の高い細胞からミクロセルを作製し、該ミクロセルとの
融合により、前記欠失および／または転座を生じた外来
染色体あるいはその断片をCHO細胞に移入し、次いで、
該CHO細胞からミクロセルを作製し、該ミクロセルとの
融合により、前記欠失および／または転座を生じた外来
染色体あるいはその断片を非ヒト動物由来の細胞に移入
させる上記46記載の方法。 64. 非ヒト動物由来の細胞が、胚または胚盤胞由来の培
養細胞である上記46記載の方法。63. In the step (d), a microcell is prepared from a cell having a high homologous recombination efficiency, and the foreign chromosome or the fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred by fusion with the microcell is transferred to a CHO cell. And then
47. The method according to the above 46, wherein a microcell is prepared from the CHO cell, and the foreign chromosome or the fragment thereof in which the deletion and / or translocation has occurred is transferred to a cell derived from a non-human animal by fusion with the microcell. 64. The method according to the above 46, wherein the cell derived from a non-human animal is a cultured cell derived from an embryo or a blastocyst.
【００２５】65. 非ヒト動物由来の細胞が、胎児または
成体由来の培養細胞である上記46記載の方法。 66. 非ヒト動物由来の細胞が、胎児由来の繊維芽細胞で
ある上記46記載の方法。 67. 外来染色体あるいはその断片がヒト由来である上記
46記載の方法。 68. 外来染色体あるいはその断片の欠失により生じた染
色体断片を保持する非ヒト動物。65. The method according to 46 above, wherein the cell derived from a non-human animal is a cultured cell derived from a fetus or an adult. 66. The method according to the above 46, wherein the cell derived from a non-human animal is a fibroblast derived from a fetus. 67. The above, wherein the foreign chromosome or a fragment thereof is of human origin
46. The method of claim 46. 68. A non-human animal carrying a chromosome fragment resulting from deletion of a foreign chromosome or a fragment thereof.
【００２６】69. 欠失により生じた染色体断片が、
（ｉ）マーカー遺伝子およびテロメア配列、および／ま
たは（ｉｉ）部位特異的組換え酵素の認識配列を有する
ものである上記68記載の非ヒト動物。 70. 複数の外来染色体あるいはその断片の間の転座によ
り生じた組換え外来染色体を保持する非ヒト動物。 71. 組換え外来染色体が、（ｉ）マーカー遺伝子および
テロメア配列、および／または（ｉｉ）部位特異的組換
え酵素の認識配列を有するものである上記70記載の非ヒ
ト動物。69. The chromosome fragment resulting from the deletion
69. The non-human animal according to the above item 68, which has (i) a marker gene and a telomere sequence, and / or (ii) a recognition sequence for a site-specific recombinase. 70. A non-human animal that carries a recombinant foreign chromosome resulting from translocation between multiple foreign chromosomes or fragments thereof. 71. The non-human animal according to the above 70, wherein the recombinant foreign chromosome has (i) a marker gene and a telomere sequence, and / or (ii) a recognition sequence for a site-specific recombinase.
【００２７】72. 組換え外来染色体の保持が、非ヒト動
物細胞の核内において独立したものである上記70記載の
非ヒト動物。 73. 組換え外来染色体がヒト由来である上記70記載の非
ヒト動物。 74. 組換え外来染色体がヒト１４番染色体とヒト２番染
色体由来である上記70記載の非ヒト動物。 75. 組換え外来染色体がヒト１４番染色体とヒト２２番
染色体由来である上記70記載の非ヒト動物。72. The non-human animal according to the above 70, wherein the retention of the recombinant foreign chromosome is independent in the nucleus of the non-human animal cell. 73. The non-human animal according to the above 70, wherein the recombinant foreign chromosome is derived from a human. 74. The non-human animal according to the above 70, wherein the recombinant foreign chromosome is derived from human chromosome 14 and human chromosome 2. 75. The non-human animal according to the above 70, wherein the recombinant foreign chromosome is derived from human chromosome 14 and human chromosome 22.
【００２８】76. 組換え外来染色体がヒト抗体重鎖遺伝
子と軽鎖λ遺伝子を含む上記70記載の非ヒト動物。 77. 組換え外来染色体がヒト抗体重鎖遺伝子と軽鎖κ遺
伝子を含む上記70記載の非ヒト動物。 78. マウスである上記70記載の非ヒト動物。76. The non-human animal according to 70 above, wherein the recombinant foreign chromosome contains a human antibody heavy chain gene and a light chain λ gene. 77. The non-human animal according to the above 70, wherein the recombinant foreign chromosome contains a human antibody heavy chain gene and a light chain κ gene. 78. The non-human animal according to 70 above, which is a mouse.
【００２９】79. 有蹄類である上記70記載の非ヒト動
物。 80. ウシである上記70記載の非ヒト動物。 81. ヒツジである上記70記載の非ヒト動物。 82. 鳥類である上記70記載の非ヒト動物。 83. ニワトリである上記70記載の非ヒト動物。79. The non-human animal according to the above 70, which is an ungulate. 80. The non-human animal according to the above 70, which is a cow. 81. The non-human animal according to the above 70, which is a sheep. 82. The non-human animal according to 70 above, which is a bird. 83. The non-human animal according to the above 70, which is a chicken.
【００３０】84． 染色体あるいはその断片の欠失およ
び／または転座により生じた組換え染色体あるいは染色
体断片であって、(i)マーカー遺伝子およびテロメア配
列、および／または(ii)部位特異的組換え酵素の認識配
列が導入され、かつ、ヒト染色体の少なくとも一部の領
域を含む前記組換え染色体あるいは染色体断片を保持す
る細胞。84. A recombinant chromosome or chromosome fragment resulting from deletion and / or translocation of a chromosome or a fragment thereof, wherein (i) a marker gene and a telomere sequence, and / or (ii) a site-specific recombinase recognition sequence. A cell having the recombinant chromosome or the chromosome fragment, which has been introduced and contains at least a part of a human chromosome.
【００３１】85． 細胞中で外来染色体あるいはその断
片を改変する方法であって、下記の工程： （a）外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを
作製し、該ミクロセルとの融合により相同組換え効率の
高い細胞へ前記外来染色体あるいはその断片を移入させ
る工程、（b）前記相同組換え効率の高い細胞におい
て、前記外来染色体あるいはその断片の所望の部位、及
び／又は前記相同組換え効率の高い細胞に由来する染色
体の所望の部位に相同組換えによりターゲティングベク
ターを挿入することにより、前記所望の部位にマーキン
グを施す工程、および（c）前記相同組換え効率の高い
細胞において、前記外来染色体あるいはその断片のマー
キングを施した部位における欠失または転座を生ぜしめ
る工程を含む前記方法。85. A method for modifying a foreign chromosome or a fragment thereof in a cell, comprising the steps of: (a) preparing a microcell containing the foreign chromosome or a fragment thereof and fusing the microcell with the microcell to transform the cell into a cell having high homologous recombination efficiency; Transferring a foreign chromosome or a fragment thereof, (b) in the cell having a high homologous recombination efficiency, a desired site of the foreign chromosome or a fragment thereof, and / or a chromosome derived from the cell having a high homologous recombination efficiency. Inserting a targeting vector into a desired site by homologous recombination to mark the desired site; and (c) marking the foreign chromosome or a fragment thereof in the cell having a high homologous recombination efficiency. Said method comprising the step of causing a deletion or translocation at said site.
【００３２】86. ヒト１４番あるいは２１番染色体由来
のセントロメア配列および部位特異的組換え酵素の認識
配列を含む人工染色体ベクター。 87. 部位特異的組換え酵素の認識配列がLoxP配列である
上記86記載の人工染色体ベクター。 88. 染色体あるいはその断片の欠失および／または転座
により生じた組換え染色体あるいは染色体断片であっ
て、(i)マーカー遺伝子およびテロメア配列、および／
または(ii)部位特異的組換え酵素の認識配列が導入さ
れ、かつ、ヒト染色体の少なくとも一部の領域を含む前
記組換え染色体あるいは染色体断片。86. An artificial chromosome vector containing a centromere sequence derived from human chromosome 14 or 21 and a site-specific recombinase recognition sequence. 87. The artificial chromosome vector according to 86, wherein the recognition sequence for the site-specific recombinase is a LoxP sequence. 88. A recombinant chromosome or chromosome fragment resulting from deletion and / or translocation of a chromosome or a fragment thereof, wherein (i) a marker gene and a telomere sequence;
Or (ii) the recombinant chromosome or chromosome fragment into which a recognition sequence for a site-specific recombinase has been introduced and which comprises at least a part of a human chromosome.
【００３３】89. ヒト１４番染色体断片およびヒト２２
番染色体断片を含む上記88に記載の組換え染色体あるい
は染色体断片。 90. ヒト１４番染色体断片およびヒト２番染色体断片を
含む上記88記載の組換え染色体あるいは染色体断片。 91. ヒト抗体重鎖遺伝子およびヒト抗体軽鎖λ遺伝子を
含む上記88記載の組換え染色体あるいは染色体断片。 92. ヒト抗体重鎖遺伝子およびヒト抗体軽鎖κ遺伝子を
含む上記88記載の組換え染色体あるいは染色体断片。89. Fragment of human chromosome 14 and human 22
88. The recombinant chromosome or chromosome fragment according to 88 above, comprising a chromosome fragment. 90. The recombinant chromosome or chromosome fragment of 88 above, comprising a human chromosome 14 fragment and a human chromosome 2 fragment. 91. The recombinant chromosome or chromosome fragment described in 88 above, comprising the human antibody heavy chain gene and the human antibody light chain λ gene. 92. The recombinant chromosome or chromosome fragment according to 88 above, comprising the human antibody heavy chain gene and the human antibody light chain κ gene.
【００３４】[0034]
【発明の実施の形態】１．外来染色体の改変 分化多能性を有する細胞（例えばマウスＥＳ細胞）に導
入される外来染色体（例えばヒト染色体）への欠失、転
座、置換等の改変は、具体的には以下１）〜３）の方法
で達成される。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Modification of foreign chromosome Modifications such as deletion, translocation, and substitution of a foreign chromosome (for example, human chromosome) to be introduced into a cell having pluripotency (for example, mouse ES cell) are specifically described in 1) to below. This is achieved by the method of 3).
【００３５】１）ＷＯ９７／０７６７１に記載されたヒ
ト染色体断片導入マウスの作製過程における、マウスＡ
９細胞とヒト雑種細胞の作製、前記マウス‐ヒト雑種細
胞からのミクロセル誘導、該ミクロセルとマウスＡ９細
胞の再融合、該再融合細胞からのミクロセル誘導、該ミ
クロセルとマウスＥＳ細胞の融合の各過程において、ヒ
ト染色体の欠失、転座が起こる場合がある。これらの変
異染色体を保持する細胞を、染色体の顕微鏡観察、ＰＣ
Ｒ、サザン解析等により適宜選抜する。種々のヒト染色
体を保持するマウスＡ９細胞ライブラリから所望の変異
染色体を保持するクローンを選抜することも可能であ
り、特定のヒト染色体を保持するマウスＡ９細胞からミ
クロセルを誘導し、Ａ９細胞あるいはＥＳ細胞に融合し
たもののなかから所望の変異染色体を保持するクローン
を選抜することも可能である。また、染色体の断片化は
ガンマ線照射によりその発生頻度をあげることができる
（Koiら、Science, 260:361, 1993）。1) Mouse A in the process of producing a human chromosome fragment-introduced mouse described in WO 97/07671
Preparation of 9 cells and human hybrid cells, induction of microcells from the mouse-human hybrid cells, refusion of the microcells with mouse A9 cells, induction of microcells from the refused cells, and fusion of the microcells and mouse ES cells In some cases, human chromosome deletion and translocation may occur. Cells containing these mutant chromosomes were identified by microscopic observation of chromosomes, PC
Select appropriately by R, Southern analysis, etc. It is also possible to select a clone holding a desired mutant chromosome from a mouse A9 cell library holding various human chromosomes, and to induce microcells from a mouse A9 cell holding a specific human chromosome, It is also possible to select a clone retaining a desired mutant chromosome from those fused with the above. The frequency of chromosome fragmentation can be increased by gamma irradiation (Koi et al., Science, 260: 361, 1993).
【００３６】２）ヒト染色体を保持する細胞において、
Ｃｒｅ酵素の認識配列であるｌｏｘｐ配列を保持するタ
ーゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色
体上の所望の位置にｌｏｘｐ配列の挿入されたクローン
を取得の後、Ｃｒｅ酵素を細胞内で発現させることによ
り、部位特異的組換えにより染色体の欠失・転座等の変
異体を得る。 WO97/49804およびSmithら、Nature Genet
ics, 9:376, 1995を参照のこと。また、ターゲティング
ベクターの導入に際しての宿主細胞として、ニワトリＤ
Ｔ−４０細胞（理研セルバンク:RCB1464、ATCC：CRL-21
11）のような相同組換え頻度の高い細胞を用いることも
できる。2) In a cell holding a human chromosome,
After constructing a targeting vector retaining the loxp sequence, which is a recognition sequence of the Cre enzyme, obtaining a clone having the loxp sequence inserted at a desired position on the chromosome by homologous recombination, and then expressing the Cre enzyme in a cell As a result, mutants such as chromosome deletion and translocation are obtained by site-specific recombination. WO97 / 49804 and Smith et al., Nature Genet
ics, 9: 376, 1995. As a host cell for introducing the targeting vector, chicken D
T-40 cells (RIKEN cell bank: RCB1464, ATCC: CRL-21
Cells having a high homologous recombination frequency as in 11) can also be used.
【００３７】３）ヒト染色体を保持する細胞において、
ヒトテロメア配列を保持するターゲティングベクターを
構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置にテロ
メア配列の挿入されたクローンを取得の後、テロメア・
トランケーションによる欠失変異体を得る。Itzhaki
ら、Nature Genet.,２, 283-287, 1992;及びBrownら、
P. N. A. S., 93:7125, 1996を参照のこと。また、ター
ゲティングベクターの導入に際しての宿主細胞として、
ニワトリＤＴ−４０細胞（ Diekenら、前記）のような
相同組換え頻度の高い細胞を用いることもできる。前記
Brownらの開示はベクターの挿入が染色体上のリピート
配列に対するものであり、特定の位置をターゲットでき
るものではない。Itzhakiらの開示によれば、ヒトテロ
メア配列を導入した腫瘍細胞の一種であるＨＴ１０８０
細胞株を１２０００株に渡って解析した結果８個の相同
組換え体を取得し、そのうちわずか１株においてテロメ
ア配列による欠失を見出したに過ぎない。また、細胞に
よってはテロメア配列が挿入されてもトランケーション
体が全く得られないという結果も報告されているが（Ba
rnettら、Nucleic Acids Res., 21:27, 1993）、発明者
らはトランケーション体を得るためにはともかくも相同
組換え体の絶対数を増やすことが必要と考え、ニワトリ
ＤＴ−４０細胞を宿主としたテロメア・トランケーショ
ンを試みた。その結果、予想外のことに取得された８個
の相同組換え体のすべてにおいて、トランケーションが
起こっていることを見出した（Kuroiwaら、Nucleic Aci
ds Res., 26:3447, 1998）。3) In a cell holding a human chromosome,
After constructing a targeting vector retaining the human telomere sequence and obtaining a clone having the telomere sequence inserted at a desired position on the chromosome by homologous recombination,
Obtain truncation deletion mutants. Itzhaki
Et al., Nature Genet., 2, 283-287, 1992; and Brown et al.
See PNAS, 93: 7125, 1996. In addition, as a host cell when introducing the targeting vector,
Cells having a high homologous recombination frequency such as chicken DT-40 cells (Dieken et al., Supra) can also be used. Said
The disclosure of Brown et al. Is for insertion of a vector into a repeat sequence on a chromosome and cannot target a particular location. According to the disclosure of Itzhaki et al., HT1080, a type of tumor cell into which a human telomeric sequence has been introduced
As a result of analyzing 12,000 cell lines, eight homologous recombinants were obtained, and only one of them found a deletion due to the telomere sequence. It has also been reported that truncated forms cannot be obtained at all even if a telomere sequence is inserted in some cells (Ba
rnett et al., Nucleic Acids Res., 21:27, 1993), thought that it is necessary to increase the absolute number of homologous recombinants anyway in order to obtain truncated forms, and used chicken DT-40 cells as a host. And tried telomere truncation. As a result, it was found that truncation occurred in all of the eight homologous recombinants obtained unexpectedly (Kuroiwa et al., Nucleic Aci.
ds Res., 26: 3447, 1998).
【００３８】以上に開示された導入染色体の改変によ
り、ヒト染色体導入マウスにおいて発現させたくない遺
伝子を排除することができる。また、導入される染色体
のサイズの縮小化により、導入される染色体断片をヒト
染色体導入マウスの子孫に伝達することが可能となる。
さらに、染色体の転座、置換により、複数の染色体由来
の遺伝子を同一の染色体断片上において発現させるこ
と、染色体断片上の複数の遺伝子の一部を異なる遺伝子
に置き換えること、すなわち、外来染色体断片をマウス
個体及びマウス細胞への遺伝子導入用のベクターとして
用いることが可能となる。By the above-described modification of the introduced chromosome, a gene that is not desired to be expressed in a mouse into which a human chromosome has been introduced can be excluded. In addition, by reducing the size of the introduced chromosome, the introduced chromosome fragment can be transmitted to the progeny of a human chromosome-introduced mouse.
Furthermore, by translocation of chromosomes, by replacing genes from multiple chromosomes on the same chromosome fragment, replacing a part of the multiple genes on the chromosome fragment with different genes, that is, exogenous chromosome fragments It can be used as a vector for gene transfer into mouse individuals and mouse cells.
【００３９】ヒト染色体の人為的改変の方法については
以下にさらに詳細に述べる。ヒト染色体を安定に保持す
るマウスなどの非ヒト動物の作製は、ヒトゲノムの構造
・機能を生体において染色体レベルで解析することを可
能にする。従来は、偶発的に断片化したヒト染色体断片
やヒト染色体全長そのものがマウスへの導入に使われて
きた（Tomizukaら, Nature Genet., 16:133, 1997）。
この場合、導入されるヒト染色体によっては、マウス中
で不安定であったり、あるいは、導入染色体上のヒト遺
伝子がマウスの発生に影響を及ぼし、ヒト染色体導入マ
ウス自体が生まれてこないといった問題に直面する可能
性がある。例えば、富塚ら（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 97:722, 2000）の報告にあるように、ヒト14番染色
体断片SC20は、マウスES細胞中で非常に安定であり、そ
の結果マウス生体においても安定に保持されているのに
対して、2番染色体断片W23は不安定であった。また、ヒ
トやマウスにおいては異常染色体の存在は減数***を阻
害すると考えられており、導入ヒト染色体が子孫に伝達
できないことが想像される（Tomizukaら,Nature Gene
t., 16:133, 1997）。実際、富塚ら (Nature Genet., 1
6:133, 1997）の報告においてはヒト14番染色体(約100M
b)の半分程度の領域を含む断片を保持する雄キメラマウ
スは不妊となり、当該断片は子孫伝達しなかった。一
方、富塚らの報告 (Nature Genet., 16:133, 1997）に
ある2番染色体断片W23(5〜20Mbと考えられる；Rastan,
Nature Genet., 16:113, 1997)や本願実施例中にある14
番染色体断片SC20(W23より幾分大きい)のような小さな
染色体断片は子孫伝達可能であった。すなわち、より小
さな染色体断片の利用が子孫伝達の可能性を高めると考
えられる。このように、ヒト染色体導入非ヒト動物の作
製効率は、どのようなヒト染色体を導入するかに大きく
依存し，あらゆるヒト染色体（多くの場合は、その断
片）を安定に保持する効率的な非ヒト動物の作製法は知
られていない。The method for artificially modifying the human chromosome will be described in more detail below. The production of non-human animals such as mice stably retaining human chromosomes enables the structure and function of the human genome to be analyzed at the chromosome level in living organisms. Hitherto, accidentally fragmented human chromosome fragments and the entire human chromosome itself have been used for introduction into mice (Tomizuka et al., Nature Genet., 16: 133, 1997).
In this case, depending on the human chromosome to be introduced, it may be unstable in the mouse, or the human gene on the introduced chromosome may affect the development of the mouse, and the human chromosome-introduced mouse itself may not be born. there's a possibility that. For example, Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 97: 722, 2000), whereas the human chromosome 14 fragment SC20 is extremely stable in mouse ES cells, and as a result, is stably retained in the mouse organism. Chromosome 2 fragment W23 was unstable. In humans and mice, the presence of abnormal chromosomes is thought to inhibit meiosis, suggesting that the introduced human chromosomes cannot be transmitted to progeny (Tomizuka et al., Nature Gene
t., 16: 133, 1997). In fact, Tomizuka et al. (Nature Genet., 1
6: 133, 1997) reported that human chromosome 14 (about 100M
Male chimeric mice carrying a fragment containing about half the region of b) became infertile, and the fragment did not transmit offspring. On the other hand, the chromosome 2 fragment W23 (probably 5-20 Mb) reported by Tomizuka et al. (Nature Genet., 16: 133, 1997);
Nature Genet., 16: 113, 1997) and 14
Small chromosomal fragments such as chromosome fragment SC20 (somewhat larger than W23) were able to transmit progeny. In other words, the use of smaller chromosomal fragments may increase the likelihood of progeny transmission. Thus, the efficiency of producing a non-human chromosome-introduced non-human animal greatly depends on the type of human chromosome to be introduced, and an efficient non-human chromosome capable of stably retaining all human chromosomes (in many cases, fragments thereof). There is no known method for producing a human animal.
【００４０】望みのヒト染色体領域を含み、それを安定
保持し、子孫伝達するような非ヒト動物を作製するため
には、偶発的に生じた染色体断片ではなく、ヒト染色体
を所望の部位で切断したり、所望の染色体断片のみを別
の安定な染色体につなげるなどといった染色体を自在に
加工する技術が望まれる。このような技術は、染色体工
学と呼ばれ、これまで主にマウスES細胞中で内在性マウ
ス染色体を部位特異的に切断したり（WO 98/54348）、
相同染色体間で組換え（転座）を起こさせることで特定
の遺伝子領域を欠失・逆位・倍加させ、そのような改変
染色体を有する変異マウスが作製されてきた（R.Ramire
z-Solisら、Nature 378:720, 1995）。人工的改変を施
されたヒト染色体断片を保持するマウスなどの非ヒト動
物の作製については、Shenら（Curr. Biol.、10：31, 2
000）によるミニ染色体ST1を保持するキメラマウス作製
とその子孫伝達の例があるが、以下の（１）、（２）の
点において、ST1は本願で示す人工染色体とは大きく異
なるものである。ミニ染色体ST1はヒトY染色体由来断片
とマウスセントロメア配列から構成され、マウスES細胞
中で安定である（Shenら、Hum. Mol. Genet., 6:1375,
1997）。このミニ染色体はテロメア配列により断片化さ
れたY染色体断片がマウスESに移入された際に、組換え
によりマウスセントロメア配列を獲得して生成したと考
えられている（Shenら、Hum. Mol. Genet., 6:1375, 19
97）。（１）前述した通り、テロメア配列による断片化
がY染色体中のリピート配列をターゲットとして行われ
ており、特定の位置をターゲットしたものではない（Br
ownら、P. N. A. S., 93:7125,1996）。（２）上記Y染
色体断片はマウスES細胞への移入の過程でマウスセント
ロメア配列を獲得して安定化したが、この安定化は偶然
起こったものであった。すなわち、本願で示されるよう
な染色体上の所望とする特定の位置においてテロメアに
よる断片化、あるいはloxP配列を介した転座等の改変が
行われた人工染色体を保持する非ヒト動物の作製につい
てはこれまで報告がない。また最近、哺乳動物細胞中で
安定に保持されるべき人工染色体（Mammalian Artifici
al Chromosome, MAC）ベクターの開発が報告されている
（例えば，W. Millsら、Human Molecular Genetics 8:7
51, 1999）が、実際に外来DNAインサートをクローニン
グした人工染色体の報告はない。特に、ヒトゲノムを染
色体レベルで解析するためにはYACベクターのクローニ
ングサイズを越えるゲノム領域（染色体断片）のクロー
ニングが必要だが、そのような人工染色体作製法の報告
もない。In order to produce a non-human animal containing the desired human chromosome region, stably retaining it, and transmitting the progeny, the human chromosome is cut at a desired site, not an accidentally generated chromosome fragment. There is a demand for a technique for freely processing chromosomes, such as connecting a desired chromosome fragment to another stable chromosome. Such a technique is called chromosome engineering, and in the past, the endogenous mouse chromosome was site-specifically cut in mouse ES cells (WO 98/54348),
By causing recombination (translocation) between homologous chromosomes, specific gene regions are deleted, inverted, and doubled, and mutant mice having such modified chromosomes have been produced (R. Ramire).
z-Solis et al., Nature 378: 720, 1995). For the production of non-human animals such as mice carrying artificially modified human chromosome fragments, see Shen et al. (Curr. Biol., 10:31, 2
000), there is an example of production of a chimeric mouse carrying the minichromosome ST1 and transmission of its progeny. However, in the following points (1) and (2), ST1 is significantly different from the artificial chromosome described in the present application. The minichromosome ST1 is composed of a fragment derived from the human Y chromosome and a mouse centromere sequence and is stable in mouse ES cells (Shen et al., Hum. Mol. Genet., 6: 1375,
1997). It is believed that this minichromosome was generated by obtaining a mouse centromere sequence by recombination when the Y chromosome fragment fragmented by the telomere sequence was transferred to mouse ES (Shen et al., Hum. Mol. Genet. ., 6: 1375, 19
97). (1) As described above, fragmentation by the telomere sequence is performed targeting the repeat sequence in the Y chromosome, and is not targeted to a specific position (Br
own et al., PNAS, 93: 7125, 1996). (2) The Y chromosome fragment acquired and stabilized the mouse centromere sequence during the process of transfer to mouse ES cells, but this stabilization occurred by accident. That is, regarding the production of a non-human animal holding an artificial chromosome that has been subjected to fragmentation by telomere at a desired specific position on the chromosome as shown in the present application or modification such as translocation through the loxP sequence, etc. There is no report so far. Recently, artificial chromosomes that must be stably maintained in mammalian cells (Mammalian Artifici
al Chromosome, MAC) vectors have been reported (eg, W. Mills et al., Human Molecular Genetics 8: 7).
51, 1999), but there is no report on artificial chromosomes that actually cloned foreign DNA inserts. In particular, in order to analyze the human genome at the chromosome level, it is necessary to clone a genomic region (chromosome fragment) exceeding the cloning size of the YAC vector, but there is no report on such an artificial chromosome preparation method.
【００４１】そこで、本発明において、ヒト抗体遺伝子
クラスター周辺領域をクローニングしたヒト人工染色体
（Human Artificial Chromosome, HAC）の作製を実施例
に挙げ、あらゆる染色体断片のクローニングを可能にす
る普遍的なヒト人工染色体作製システムを開示する。以
下A〜Dにおいて、ヒト抗体λ軽鎖、κ軽鎖遺伝子クラス
ター周辺をクローニングしたヒト人工染色体λ, κ-HAC
の作製について述べる。さらには、作製されたHACのマ
ウス個体への導入、HACに含まれるヒト抗体遺伝子のマ
ウス個体における発現、HACのキメラマウスから子孫へ
の伝達について述べる。Therefore, in the present invention, the preparation of a human artificial chromosome (Human Artificial Chromosome, HAC) in which the region around the human antibody gene cluster has been cloned is described in the Examples, and a universal human chromosome capable of cloning any chromosome fragment is provided. A chromosome preparation system is disclosed. In the following AD, human artificial chromosomes λ, κ-HAC cloned around the human antibody λ light chain and κ light chain gene clusters
Will be described. Furthermore, the introduction of the produced HAC into a mouse individual, the expression of a human antibody gene contained in HAC in the mouse individual, and the transfer of HAC from a chimeric mouse to progeny are described.
【００４２】A．ヒト２２番染色体の改変 ヒト抗体λ軽鎖遺伝子クラスターは２２番染色体上の22
q11.2に存在する（例えば，J.E.Collinsら、Nature 37
7:367, 1995）。この染色体領域周辺のみを人工染色体
作製に用いるために、まず、λ軽鎖遺伝子クラスターの
テロメア側に位置するLIF遺伝子座にヒトテロメア配列
を相同組換えにより挿入しテロメアトランケーション
（例えば、黒岩ら、Nucleic Acid Research, 26:3447,
1998）することで染色体を切断する。次に、λ軽鎖遺伝
子クラスターの極セントロメア側に位置するHCF2遺伝子
座に組換え酵素Creの認識配列であるloxP配列を相同組
換えにより挿入し、HCF2-Igλ-LIF断片（10-20Mb）のみ
を人工染色体作製のためのインサートとして用いること
とする。この２２番染色体断片のみをクローニングする
ことにより、マウスの発生に影響を及ぼす可能性がある
２２番染色体上のCatEye 症候群（例えば，Johnson.A
ら、Genomics 57:306, 1999）やDigeorge 症候群（例え
ば，H.Yamagishiら、SCIENCE 283:1158, 1999）の原因
遺伝子領域（HCF2よりもセントロメア側に存在）を排除
することができる。A. Modification of human chromosome 22 Human antibody λ light chain gene cluster
q11.2 (eg, JECollins et al., Nature 37
7: 367, 1995). To use only the periphery of this chromosome region for artificial chromosome production, first, a human telomere sequence is inserted by homologous recombination into the LIF locus located on the telomere side of the λ light chain gene cluster, and telomere truncation (for example, Kuroiwa et al., Nucleic Acid Research, 26: 3447,
1998) to cut the chromosome. Next, the loxP sequence, which is a recognition sequence of the recombinase Cre, was inserted into the HCF2 locus located on the extreme centromere side of the λ light chain gene cluster by homologous recombination, and only the HCF2-Igλ-LIF fragment (10-20 Mb) was inserted. Is used as an insert for preparing an artificial chromosome. By cloning only this chromosome 22 fragment, CatEye syndrome on chromosome 22 (eg, Johnson. A
Et al., Genomics 57: 306, 1999) and the causative gene region (located on the centromere side of HCF2) of Digeorge syndrome (eg, H. Yamagishi et al., SCIENCE 283: 1158, 1999).
【００４３】B．ヒト２番染色体の改変 ヒト抗体κ軽鎖遺伝子クラスターは２番染色体上の2p1
1.2-12に存在する（例えば，Gottfried M. ら、Genomic
s 16:512, 1993）。この染色体領域周辺のみを人工染色
体作製に用いるために、まず、κ軽鎖遺伝子クラスター
よりも2 Mb程テロメア側に位置するCD8A遺伝子座（例え
ば，Gottfried M. ら、Genomics 16:512, 1993）にヒト
テロメア配列を相同組換えにより挿入しテロメアトラン
ケーションすることで染色体を切断する。次に、κ軽鎖
遺伝子クラスターの極セントロメア側に位置するyWHZ30
-4ゲノム領域（J.B.-Kupersら，Gene 191:173, 1997）
に組換え酵素Creの認識配列であるloxP配列を相同組換
えにより挿入し、yWHZ30-Igκ-CD8A断片(5 Mb前後)のみ
を人工染色体作製のためのインサートとして用いること
とする。B. Modification of human chromosome 2 Human antibody kappa light chain gene cluster is 2p1 on chromosome 2
1.2-12 (eg, Gottfried M. et al., Genomic
s 16: 512, 1993). In order to use only the periphery of this chromosomal region for artificial chromosome production, first, the CD8A locus located about 2 Mb telomere side from the kappa light chain gene cluster (eg, Gottfried M. et al., Genomics 16: 512, 1993) The chromosome is cut by inserting a human telomere sequence by homologous recombination and telomere truncation. Next, yWHZ30 located on the extreme centromere side of the kappa light chain gene cluster
-4 genomic region (JB-Kupers et al., Gene 191: 173, 1997)
And the loxP sequence, which is a recognition sequence of the recombinase Cre, is inserted by homologous recombination, and only the yWHZ30-Igκ-CD8A fragment (about 5 Mb) is used as an insert for producing an artificial chromosome.
【００４４】C．ヒト１４番染色体断片SC20の改変 ヒト１４番染色体断片SC20はES細胞及びマウス中におい
て、ほぼ100%保持され、かつ子孫伝達することが示され
ている（Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 97:
722, 2000）。そこで、本発明において、このSC20をヒ
トミニ染色体ベクターとして用いることを考える。つま
り、上記Ａ、Ｂで記したHCF2-Igλ-LIFヒト２２番染色
体断片やyWHZ30-Igκ-CD8Aヒト２番染色体断片をSC20へ
転座させることでヒト２２番、２番染色体断片をクロー
ニングしたヒト人工染色体λ, κ-HACを構築することと
する。１４番染色体上14p12に位置するRNR2遺伝子座にl
oxP配列を相同組換えにより挿入し、Cre-loxPシステム
（例えば，R.Ramirez-Solisら、Nature 378:720, 199
5）を用いることで、HCF2-Igλ-LIFヒト２２番染色体断
片やyWHZ30-Igκ-CD8Aヒト２番染色体断片をSC20上 RNR
2遺伝子座に転座させることでクローニングする。C. Modification of human chromosome 14 fragment SC20 It has been shown that human chromosome 14 fragment SC20 is retained in ES cells and mice in almost 100% and is transmitted to progeny (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:
722, 2000). Thus, in the present invention, use of this SC20 as a human minichromosome vector is considered. In other words, the HCF2-Igλ-LIF human chromosome 22 fragment and the yWHZ30-Igκ-CD8A human chromosome 2 fragment described in A and B above were translocated to SC20 to clone the human chromosome 22 and chromosome 2 fragments. An artificial chromosome λ, κ-HAC is to be constructed. L at the RNR2 locus located at 14p12 on chromosome 14.
The oxP sequence is inserted by homologous recombination and the Cre-loxP system (eg, R. Ramirez-Solis et al., Nature 378: 720, 199).
By using 5), HCF2-Igλ-LIF human chromosome 22 fragment and yWHZ30-Igκ-CD8A human chromosome 2
Cloning by translocation to 2 loci.
【００４５】上記Ａ、Ｂ、Ｃで記したテロメアトランケ
ーションや相同組換えを効率良く行うためのホスト細胞
としてニワトリDT-40細胞を利用することができる（例
えば、黒岩ら、Nucleic Acid Research 26:3447, 1998
とDiekenら、Nature Genet.,12:174, 1996）。Chicken DT-40 cells can be used as host cells for efficiently performing telomere truncation and homologous recombination described in A, B, and C above (for example, Kuroiwa et al., Nucleic Acid Research 26: 3447). , 1998
And Dieken et al., Nature Genet., 12: 174, 1996).
【００４６】D．Cre-loxPシステムによるHCF2-Igλ-LIF
ヒト22番染色体断片とyWHZ30-Igκ-CD8Aヒト２番染色体
断片のSC20上 への転座 上記Ａ、Ｂ、Ｃで示したように、テロメアトランケーシ
ョンやloxP挿入により改変したヒト22番、2番染色体断
片あるいは、SC20のいずれか1本を保持するニワトリDT-
40細胞を作製する。次に、Cre-loxPシステムを用いてHC
F2-Igλ-LIFヒト22番染色体断片あるいはyWHZ30-Igκ-C
D8Aヒト2番染色体断片をSC20上 へ転座させるために、
いずれかの改変ヒト染色体断片を１本保持するニワトリ
DT-40細胞同志を融合させることによって、2本の改変ヒ
ト染色体断片を保持するニワトリDT-40細胞ハイブリッ
ドを作製する。これで、転座のための材料が揃ったこと
になる。次に、Cre組換え酵素をこのニワトリDT-40細胞
ハイブリッド中で発現させて転座させるわけだが、２本
の非相同染色体間での組換え（転座）頻度は非常に低い
ことが報告されており（例えば、A.J.Smithら、Nature
Genet., 9:376, 1995）、さらに本発明の場合は、内在
性染色体間ではなく、外来性のヒト染色体間での転座で
あり、さらに組換え効率が低くなる可能性も考えられ
る。そこで、期待通りloxP間で組換えが起こった細胞を
選択できるポジティブセレクション系を考えなくてはな
らない。D. HCF2-Igλ-LIF by Cre-loxP system
Translocation of human chromosome 22 fragment and yWHZ30-Igκ-CD8A human chromosome 2 fragment onto SC20 As shown in A, B and C above, human chromosomes 22 and 2 modified by telomere truncation or loxP insertion Chicken DT-, which holds one of the fragments or SC20
Make 40 cells. Next, using the Cre-loxP system,
F2-Igλ-LIF human chromosome 22 fragment or yWHZ30-Igκ-C
To translocate the D8A human chromosome 2 fragment onto SC20,
Chicken holding one modified human chromosome fragment
By fusing DT-40 cells together, a chicken DT-40 cell hybrid holding two modified human chromosome fragments is produced. Now the material for translocation is complete. Next, Cre recombinase is expressed and translocated in this chicken DT-40 cell hybrid. It is reported that the frequency of recombination (translocation) between two heterologous chromosomes is extremely low. (Eg, AJSmith et al., Nature
Genet., 9: 376, 1995), and in the case of the present invention, translocation between exogenous human chromosomes, not between endogenous chromosomes, and the recombination efficiency may be further reduced. Therefore, it is necessary to consider a positive selection system that can select cells in which recombination has occurred between loxPs as expected.
【００４７】近年、A. J. H. Smithら（Nature Genet.,
9:376, 1995）はマウスES細胞中で、マウス12番染色体
と15番染色体とをCre-loxPシステムを用いて相互に転座
させることに成功した。彼らはHprt（ヒポキサンチン・
グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ）遺伝
子欠損ES細胞に対して、Hprt遺伝子の5'側部分（loxPを
含む）と3'側部分（loxPを含む）とをそれぞれ12番、15
番染色体の特定領域に相同組換えにより挿入した。そし
て、Creを一過性発現させ、loxP間で組換えが起こった
ときのみにHprt遺伝子が再構成され、そのES細胞はヒポ
キサンチンを含まない培地（HAT培地）でも増殖できる
ようになる。この選択法は、Hprt遺伝子欠損細胞に対し
てのみに用いることができ、いかなる細胞に対しても利
用できるわけではない。また、Qin, M.ら（PNAS 91:170
6, 1994）が報告しているように、Hprt遺伝子の代わり
に適当な薬剤耐性遺伝子が転座の結果再構成され、その
薬剤を含む培地中で目的の細胞が増殖してくるというセ
レクション法もあるが、細胞は常に薬剤選択という圧力
のかかった環境での増殖を強いられ、コロニー形成率が
低い細胞のクローニングは困難かもしれない。そこで、
本発明においては、いかなる細胞に対しても利用でき、
かつ迅速に目的細胞を濃縮できる以下のようなシステム
を考えた。Recently, AJH Smith et al. (Nature Genet.,
9: 376, 1995) successfully translocated mouse chromosomes 12 and 15 to each other using the Cre-loxP system in mouse ES cells. They are Hprt (hypoxanthine
For guanine phosphoribosyl transferase) gene-deficient ES cells, the 5 'side (including loxP) and the 3' side (including loxP) of the Hprt gene were numbered 12 and 15, respectively.
It was inserted into a specific region of chromosome number by homologous recombination. Then, Cre is transiently expressed, the Hprt gene is reconstituted only when recombination occurs between loxPs, and the ES cells can be grown in a hypoxanthine-free medium (HAT medium). This selection method can be used only for Hprt gene-deficient cells, and not for all cells. See also Qin, M. et al. (PNAS 91: 170
6, 1994), there is also a selection method in which an appropriate drug resistance gene is rearranged as a result of translocation instead of the Hprt gene, and the target cells grow in a medium containing the drug. Nevertheless, cells are always forced to grow in a stressed environment of drug selection, and cloning cells with low colony formation rates may be difficult. Therefore,
In the present invention, it can be used for any cells,
The following system that can rapidly and rapidly enrich target cells was considered.
【００４８】近年、動物細胞への遺伝子導入におけるレ
ポータ遺伝子としてオワンクラゲ由来のGFP（Green Flu
orescent Protein）遺伝子が開発された（例えば、Pras
her,D. Cら，Gene, 111:229, 1992）。GFPの発光には基
質は必要なく、蛍光で検出することが可能であるので、
生細胞のまま、しかも短時間でモニターすることができ
る。さらに、GFPの発現量がたとえ低くてもタンパク質
自体が安定であるため徐々に細胞内に蓄積され、検出が
可能になると思われる。また、FACSを用いることによっ
て、非常に微弱な蛍光でも検出できるであろう。以上の
点から、本発明においては、loxP組換え体のポジティブ
セレクションマーカーとして、GFP遺伝子を用いること
とした。具体的には、プロモーターを含まないGFP遺伝
子をSC20上 RNR2遺伝子座にloxPと共に挿入し、GFPの発
現に必要なプロモーターをヒト２２番染色体上のHCF2遺
伝子座あるいは，２番染色体上のyWHZ30-4ゲノム領域に
loxPと共に挿入する。CreによるloxP配列間での組換え
が起こると、プロモーターとGFP遺伝子とが連結され、G
FPが発現するようになる。この組換え細胞は蛍光を発光
するので、FACSによるソーティングが可能となる。前述
したように，GFPの発現は短時間で検出可能なので，FAC
Sソーティングを繰り返すことによって，薬剤セレクシ
ョンと比較して、より迅速にGFP陽性細胞を濃縮するこ
とが可能と考えられる。さらに、組換え頻度を上げるた
めに、Cre組換え酵素を一過性ではなく、安定発現させ
ることを考える。２本の染色体間での転座は相互的に起
こるので、Cre組換え酵素を安定発現させると、せっか
く転座を起こした染色体が、頻度こそは低いが、再び組
換え（転座）を起こして元に戻ってしまう可能性があ
る。そこで、通常このような実験においてはCre組換え
酵素を一過性に発現させたり、Cre組換え酵素の発現を
厳密にコントロールしたりする必要性がある。しかし、
本発明においては、DT-40ハイブリッド中で転座させた
直後に目的の転座したヒト人工染色体をミクロセル法に
よりチャイニーズハムスターCHO細胞へ移入させるた
め、移入先であるCHO細胞中においては、Cre組換え酵素
の影響を受けずに済む。そこで、厳密な発現コントロー
ルは必要なく，単純にCre組換え酵素を安定発現させる
ことが可能となる。後述するが、非ヒト細胞（本発明で
は、ニワトリDT-40細胞）において、２本の非相同ヒト
染色体間で転座が成功したのは本発明が初めてである。In recent years, as a reporter gene for gene transfer into animal cells, GFP (Green Flu
orescent Protein) genes have been developed (eg, Pras
her, DC et al., Gene, 111: 229, 1992). No substrate is required for GFP emission, and it can be detected by fluorescence.
Live cells can be monitored as they are in a short time. Furthermore, even if the expression level of GFP is low, the protein itself is stable, so that it is likely to be gradually accumulated in the cells and detectable. Also, by using FACS, even very weak fluorescence could be detected. In view of the above, in the present invention, the GFP gene was used as a positive selection marker for the loxP recombinant. Specifically, the promoter-free GFP gene was inserted together with loxP into the RNR2 locus on SC20 together with loxP, and the promoter required for GFP expression was changed to the HCF2 locus on human chromosome 22 or the yWHZ30-4 gene on chromosome 2. Genome region
Insert with loxP. When recombination between loxP sequences by Cre occurs, the promoter and the GFP gene are linked, and G
FP becomes expressed. Since the recombinant cells emit fluorescence, sorting by FACS is possible. As mentioned above, since GFP expression can be detected in a short time, FAC
Repeating S-sorting would allow more rapid enrichment of GFP-positive cells than drug selection. Furthermore, in order to increase the recombination frequency, it is considered that Cre recombinase is stably expressed, not transiently. Translocations between two chromosomes occur reciprocally, so when Cre recombinase is stably expressed, the translocated chromosomes, although less frequently, undergo recombination (translocation) again. May return to the original. Thus, in such experiments, it is usually necessary to transiently express Cre recombinase or to strictly control the expression of Cre recombinase. But,
In the present invention, in order to transfer the desired translocated human artificial chromosome to Chinese hamster CHO cells by the microcell method immediately after translocation in the DT-40 hybrid, the Cre group It does not need to be affected by the replacement enzyme. Therefore, strict expression control is not required, and the Cre recombinant enzyme can simply be stably expressed. As will be described later, the present invention is the first successful translocation between two non-homologous human chromosomes in a non-human cell (chicken DT-40 cell in the present invention).
【００４９】上記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄで開示したように、ニ
ワトリDT-40細胞中での一連のテロメアトランケーショ
ンとCre-loxPシステムによる染色体間転座を併用するこ
とによって、如何なるサイズのあらゆるヒト染色体断片
（YACベクターのクローニングサイズを越える）をも安
定なSC20染色体ベクター上のloxP部位（14p12）にクロ
ーニングすることが可能であり、ここにヒト人工染色体
構築システムを提案できる。ここに開示したヒト人工染
色体構築システムをニワトリDT-40細胞で行うことが好
ましい。なぜなら、通常の培養動物細胞では相同組換え
の頻度が非常に低いからである。一方、ニワトリDT-40
細胞以外で相同組換え頻度の高い動物細胞としてはマウ
スES細胞が知られている（相沢慎一, バイオマニュア
ルシリーズ8, ジーンターゲティング, 羊土社, 199
5）。すなわち、本願に示されるヒト人工染色体構築は
マウスES細胞において行うことも可能である。しかしな
がら、マウスES細胞は多様な組織への分化能を有してお
り、未分化な状態を保ちつつ培養するためには煩雑な操
作（例えば、栄養細胞の培養）と熟練が必要とされる
（相沢慎一, 前記）。また、導入染色体の種類によっ
ては、分化してしまう恐れもある（Mullerら、 Nature,
311:438, 1984）。すなわち、マウスES細胞には以上の
問題点があるため、人工染色体構築の場として通常はニ
ワトリDT-40細胞を利用することが望ましい。As disclosed in A, B, C, and D above, the combination of a series of telomere truncations in chicken DT-40 cells with interchromosomal translocation by the Cre-loxP system allows any human of any size to be used. Chromosome fragments (exceeding the cloning size of the YAC vector) can also be cloned into the loxP site (14p12) on the stable SC20 chromosome vector, and a human artificial chromosome construction system can be proposed here. The human artificial chromosome construction system disclosed herein is preferably performed in chicken DT-40 cells. This is because the frequency of homologous recombination is extremely low in normal cultured animal cells. Meanwhile, chicken DT-40
Mouse ES cells are known as an animal cell having a high homologous recombination frequency other than cells (Shinichi Aizawa, Bio Manual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 199
Five). That is, the construction of the human artificial chromosome described in the present application can also be performed in mouse ES cells. However, mouse ES cells have the ability to differentiate into various tissues, and culturing them while maintaining their undifferentiated state requires complicated operations (for example, culture of vegetative cells) and skill ( Shinichi Aizawa, supra). In addition, depending on the type of transchromosome, differentiation may occur (Muller et al., Nature,
311: 438, 1984). That is, since mouse ES cells have the above-mentioned problems, it is usually desirable to use chicken DT-40 cells as a site for constructing artificial chromosomes.
【００５０】一方、実施例に示したヒト染色体同士の組
換えだけでなく、ヒト染色体の所望の領域（断片）をマ
ウスES細胞に由来するマウス染色体に転座させることも
可能である。これは例えば、以下の(１）〜（４）の手
順で可能である。 （１）マウスES細胞自身の染色体上に相同組換えにより
部位特異的組換え酵素の認識配列、例えばloxP配列を挿
入する。loxP配列を含むターゲティングベクターには例
えば下記GFP等のマーカーを発現させるためのプロモー
ター配列が含まれる。loxP配列の挿入部位は、マウス自
身の遺伝子に対する影響を避けるために、例えばマウス
染色体のサブテロメア領域が望ましい。On the other hand, in addition to the recombination between human chromosomes shown in Examples, a desired region (fragment) of a human chromosome can be translocated to a mouse chromosome derived from a mouse ES cell. This can be performed, for example, by the following procedures (1) to (4). (1) Insert a site-specific recombinase recognition sequence, for example, a loxP sequence, into the chromosome of the mouse ES cell itself by homologous recombination. The targeting vector containing the loxP sequence contains, for example, a promoter sequence for expressing a marker such as the following GFP. The loxP sequence insertion site is preferably, for example, a subtelomeric region of a mouse chromosome in order to avoid an effect on the mouse's own gene.
【００５１】（２）所望の領域を含むヒト染色体を保持
するニワトリDT-40細胞において以下の操作Ａ、Ｂを行
う。 （２）−Ａ ヒト染色体上の所望の領域のテロメア側に
テロメア配列を挿入し、当該染色体を短縮化する。前記
所望の領域が前記ヒト染色体の本来のテロメアの近傍に
ある場合にはこの操作は不要な場合がある。 （２）−Ｂ ヒト染色体上の所望の領域のセントロメア
側に部位特異的組換え酵素の認識配列、例えばloxP配列
を挿入する。loxP配列を含むターゲティングベクターに
は例えばGFP遺伝子が含まれる。(2) The following operations A and B are performed on chicken DT-40 cells holding a human chromosome containing a desired region. (2) -A Insert a telomere sequence on the telomere side of a desired region on a human chromosome to shorten the chromosome. This operation may not be necessary if the desired region is near the original telomere of the human chromosome. (2) -B A site-specific recombinase recognition sequence, for example, a loxP sequence, is inserted into the desired region of the human chromosome at the centromere side. The targeting vector containing the loxP sequence includes, for example, the GFP gene.
【００５２】（３）上記（２）において作製されたヒト
染色体（断片）をCHO細胞にミクロセル移入し、さらに
当該ヒト染色体断片をCHO細胞から上記（１）で作製さ
れたマウスES細胞に移入する。 （４）上記（３）で作製されたヒト染色体(断片)を保持
するマウスES細胞において部位特異的組換え酵素を発現
させる。loxP配列において部位特異的組換えを起こした
細胞においては前記プロモーター配列とGFP遺伝子が連
結し、GFPが発現し、当該細胞を選択することができ
る。以上の工程により、自身の染色体に所望のヒト染色
体領域（断片）が転座したマウスES細胞を得ることがで
きる。当該マウスES細胞からは、当該ヒト染色体領域
（断片）を安定に保持するキメラマウスあるいはその子
孫を作製することが出来る。(3) The human chromosome (fragment) prepared in the above (2) is transferred into a CHO cell by microcell, and the human chromosome fragment is further transferred from the CHO cell to the mouse ES cell prepared in the above (1). . (4) The site-specific recombinase is expressed in the mouse ES cells holding the human chromosome (fragment) prepared in (3) above. In a cell in which site-specific recombination has occurred in the loxP sequence, the promoter sequence and the GFP gene are linked, GFP is expressed, and the cell can be selected. Through the above steps, a mouse ES cell in which a desired human chromosome region (fragment) has been translocated to its own chromosome can be obtained. From the mouse ES cells, chimeric mice or their progeny that stably retain the human chromosome region (fragment) can be produced.
【００５３】作製したヒト人工染色体を非ヒト動物に導
入する一つの手段として、ミクロセル法（清水ら、細胞
工学ハンドブック、羊土社、1992）によりマウスES細胞
に導入してキメラマウスを作製することが挙げられる。
Diekenら（Nature Genet., 12:174, 1996）は、改変ヒ
ト染色体をニワトリDT-40細胞からマウスMEL細胞（ガン
細胞の一種）へ移入したが、大部分が断片化された状態
で移入された。発明者らもニワトリDT-40細胞からマウ
スA9細胞などへヒト染色体の移入を試みたが、全てヒト
染色体の断片化が観察され、無傷の状態で移入されるこ
とはなかった。しかしながら、チャイニーズハムスター
CHO細胞へ移入した際に、無傷の状態でヒト染色体を移
入し得ることを発明者らは初めて見出した。そこで、本
ヒト人工染色体構築システムにより作製されたヒト人工
染色体は一度CHO細胞へ移入することとした。ハムスタ
ー細胞は異種細胞との融合による雑種細胞作製に適して
おり、様々な融合実験で用いられている（Kwokら、Nuc
l. Acids Res., 26:3562, 1998）。本発明では、前記ニ
ワトリDT-40細胞からの人工染色体の移入先として、CHO
細胞に限らずBHK細胞他、ハムスター及びその近縁種由
来の細胞を使用し得る。特にCHO細胞はマウスA9細胞と
同様に効率良くミクロセルを形成することが知られてお
り（例えば，M.Koiら、Science 260:361, 1993）、これ
により、我々はヒト人工染色体をCHO細胞からマウスES
細胞へ移入し，ヒト人工染色体保持キメラマウスを作製
することに初めて成功した。このように、キメラマウス
作製に至るまで、ヒト人工染色体は幾つかの異種細胞
（ニワトリDT-40細胞、チャイニーズハムスターCHO細
胞、マウスES細胞）を経由しなければならない。このた
めには、ヒト人工染色体が各々の細胞で構造的・機能的
に安定である必要がある。現在までに、幾つかのヒト染
色体（断片）が様々な細胞へ導入されてきたが、その安
定性は細胞間によって異なるようである。特に、ES細胞
では不安定であることが報告されている（Shenら、Hum.
Mol. Genet., 6, 1375-1382, 1997）。実施例にて後述
するが、我々の作製したヒト人工染色体は少なくともニ
ワトリDT-40細胞、チャイニーズハムスターCHO細胞、マ
ウスES細胞、そして生体であるマウス中でも安定である
ことを示した。本発明にて開示したシステムにより作製
されたヒト人工染色体は、種を越えて様々な細胞へ安定
導入可能なシャトルベクターとして利用できると考えら
れる。As one means for introducing the prepared human artificial chromosome into a non-human animal, a chimeric mouse is prepared by introducing it into mouse ES cells by the microcell method (Shimizu et al., Cell Engineering Handbook, Yodosha, 1992). Is mentioned.
Dieken et al. (Nature Genet., 12: 174, 1996) transferred modified human chromosomes from chicken DT-40 cells to mouse MEL cells (a type of cancer cell), but most of them were transferred in a fragmented state. Was. The inventors have also attempted to transfer human chromosomes from chicken DT-40 cells to mouse A9 cells and the like, but fragmentation of all human chromosomes was observed, and the transfer was not intact. However, Chinese hamsters
The inventors have found for the first time that human chromosomes can be transferred intact when transferred to CHO cells. Therefore, the human artificial chromosome produced by the present human artificial chromosome construction system was once transferred to CHO cells. Hamster cells are suitable for producing hybrid cells by fusion with heterologous cells and have been used in various fusion experiments (Kwok et al., Nuc
l. Acids Res., 26: 3562, 1998). In the present invention, as a transfer destination of the artificial chromosome from the chicken DT-40 cells, CHO
Not only cells but also BHK cells and cells derived from hamsters and their relatives can be used. In particular, CHO cells are known to form microcells as efficiently as mouse A9 cells (eg, M. Koi et al., Science 260: 361, 1993), which allows us to transfer human artificial chromosomes from CHO cells. Mouse ES
We succeeded in producing chimeric mice with human artificial chromosomes carrying them for the first time. Thus, human artificial chromosomes must pass through several heterologous cells (chicken DT-40 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse ES cells) until chimeric mouse production. For this, the human artificial chromosome needs to be structurally and functionally stable in each cell. To date, several human chromosomes (fragments) have been introduced into various cells, but their stability appears to vary from cell to cell. In particular, it has been reported that ES cells are unstable (Shen et al., Hum.
Mol. Genet., 6, 1375-1382, 1997). As will be described later in the examples, it has been shown that the human artificial chromosome we have produced is stable at least in chicken DT-40 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse ES cells, and living mice. The human artificial chromosome produced by the system disclosed in the present invention is considered to be usable as a shuttle vector that can be stably introduced into various cells across species.
【００５４】特に、マウスES細胞中での安定性は特筆す
べきである。現在までに、幾つかのヒト染色体（断片）
がES細胞へ導入されているが、安定に保持されたという
報告は前述のSC20断片とヒトY染色体由来断片（Shen
ら、Hum. Mol. Genet., 6, 1375-1382, 1997）のみであ
る。前者は偶発的に生じた断片であり、後者は偶発的に
マウスのセントロメア配列を獲得したものであり、人工
染色体という意味ではES細胞中で安定なものは例がな
い。発明者らはこのSC20断片をヒトミニ染色体ベクター
として用い、元来は不安定であるヒト２番、あるいは２
２番染色体断片をSC20へクローニングすることにより安
定化させることに成功した。不安定な染色体断片を安定
化できる初めての方法である。SC20はアクロセントリッ
クな染色体であり、その短腕に外来染色体断片が転座す
ることによって劇的な染色体構造の変化が起こり、元来
の安定性がある程度落ちることが予想された。しかし、
実施例に示すように、λ-HACは元のSC20とほぼ同等の安
定性を示し、このことはSC20が外来染色体断片のクロー
ニングベクターとして利用できることを示唆している。
すなわち、如何なる染色体断片でもSC20染色体ベクター
に転座クローニングすることでマウスなどの非ヒト動物
中で安定に保持できる可能性を意味している。また、ヒ
ト21番染色体及びその断片もマウス個体中で安定に保持
されることが示されており（篠原ら，EMBO workshops 1
999, The molecular biology of chromosome 21 and Do
wn syndrome, Sea of Galilee, Israel, 6-11 June, 19
99)、SC20断片同様に染色体ベクターとして利用するこ
とが可能である。応用例として以下が挙げられる。In particular, the stability in mouse ES cells is notable. To date, several human chromosomes (fragments)
Was introduced into ES cells, but was reported to be stably retained, according to the aforementioned SC20 fragment and a fragment derived from human Y chromosome (Shen
Hum. Mol. Genet., 6, 1375-1382, 1997). The former is an accidentally generated fragment, and the latter is an accidentally acquired mouse centromere sequence. There is no example of an artificial chromosome that is stable in ES cells. The present inventors used this SC20 fragment as a human minichromosome vector and used the originally unstable human No. 2 or 2
The chromosome 2 fragment was successfully stabilized by cloning into SC20. This is the first method that can stabilize unstable chromosomal fragments. SC20 is an acrocentric chromosome, and it is expected that translocation of a foreign chromosome fragment to the short arm thereof will cause a dramatic change in chromosome structure, thereby reducing the original stability to some extent. But,
As shown in the Examples, λ-HAC shows almost the same stability as the original SC20, suggesting that SC20 can be used as a cloning vector for foreign chromosomal fragments.
That is, it means that translocation cloning of any chromosome fragment into the SC20 chromosome vector can be stably maintained in a non-human animal such as a mouse. It has also been shown that human chromosome 21 and fragments thereof are stably retained in mouse individuals (Shinohara et al., EMBO workshops 1
999, The molecular biology of chromosome 21 and Do
wn syndrome, Sea of Galilee, Israel, 6-11 June, 19
99), similarly to the SC20 fragment, it can be used as a chromosome vector. The following are examples of application.
【００５５】薬物代謝はヒトと動物間では種差があり、
医薬品開発の一つの障害になっている。これは主に薬物
代謝酵素であるP450分子に種差があることに起因してい
ると考えられており、例えば、ヒトで主要なP450分子を
コードしているCYP3A遺伝子クラスターが存在するヒト
７番染色体断片をSC20へクローニングし、本発明のよう
にキメラマウスを作製することでヒト型代謝モデルマウ
スを作出できる。また、本システムによるヒト人工染色
体は、文字通り、基本的には全てヒト由来のゲノム配列
から成っており、YACベースのものやウイルス由来配列
を含むものと比較して安全性に優れていると考えられ
る。このため、安全なヒト遺伝子治療用ベクターとして
用いることも可能であろう。Drug metabolism has species differences between humans and animals.
It is an obstacle to drug development. This is thought to be mainly due to species differences in P450 molecules, which are drug metabolizing enzymes. For example, human chromosome 7 in which the CYP3A gene cluster encoding a major P450 molecule in humans is present A human metabolic model mouse can be produced by cloning the fragment into SC20 and producing a chimeric mouse as in the present invention. In addition, human artificial chromosomes according to this system are, as the name suggests, basically all composed of human-derived genomic sequences, and are considered to be superior in safety compared to YAC-based and those containing virus-derived sequences. Can be Therefore, it could be used as a safe vector for human gene therapy.
【００５６】さらに、SC20断片自身は既に子孫伝達する
ことが分かっており，この染色体断片をベクターとして
用いている本システムにより作製されたヒト人工染色体
（λ, κ-HAC）も子孫伝達することが期待できる。すな
わち、キメラ動物のみならず、いわゆるトランスクロモ
ソミック動物（富塚ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
97:722, 2000）の作製も可能と考えられる。Furthermore, it has been known that the SC20 fragment itself transmits offspring, and the human artificial chromosome (λ, κ-HAC) produced by the present system using this chromosome fragment as a vector can also transmit offspring. Can be expected. That is, not only chimeric animals but also so-called transchromosomic animals (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
97: 722, 2000).
【００５７】前記富塚らの報告（Tomizukaら, Nature G
enet., 16:133, 1997）においてマウスに導入されたヒ
ト染色体はヒト繊維芽細胞に由来し、その後マウスA9細
胞を経由し、最終的にマウスES細胞に導入された後、キ
メラマウス及びその子孫において機能した。導入染色体
上のヒト遺伝子の転写レベルさらにはタンパク質レベル
の発現は、例えばヒト抗体遺伝子について確認された(T
omizukaら, Nature Genet., 16:133, 1997)。一方、ヒ
ト染色体が哺乳動物とは進化的に離れた鳥類の細胞を経
由した場合にマウス中で機能する能力を保持しているか
どうかについてはこれまでよく分かっていなかった。ニ
ワトリDT-40細胞（理研セルバンク:RCB1464、ATCC：CRL
-2111）はトリ白血病ウイルス（ALV）の感染により誘導
されるBリンパ腫から樹立された（Babaら、Virology, 1
44:139, 1985）細胞株であるが、トリ由来であるという
以外にも、相同組換えの効率が非常に高い(Takedaら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:023, 1992)という特徴
を持っている。例えば導入したヒト染色体上のヒト遺伝
子がトリ染色体上の相同なトリ遺伝子との間で遺伝子変
換を起こし、不活化されてしまう恐れも想像された。こ
の問題についての唯一の研究はDiekenら（Nature Gene
t., 12:174, 1996）がニワトリDT-40細胞を経由したヒ
ト11番染色体をマウスMEL細胞に移入したところヒトベ
ータグロビン遺伝子の転写産物が検出されたという報告
であるが、ヒト遺伝子のタンパク質レベルでの発現、及
び発現したヒトタンパク質の機能に関しては未だ報告が
無い。本願においてはニワトリDT-40細胞を経由したヒ
ト染色体上のヒト遺伝子及び当該遺伝子にコードされる
タンパク質がマウス個体において機能的であることを示
す。ニワトリDT-40細胞において作製されたヒト人工染
色体l-HAC（ヒト免疫グロブリン重鎖とλ軽鎖遺伝子を
含む）を保持するキメラマウスの血清中には、ヒト免疫
グロブリン重鎖とλ軽鎖の両タンパク質が検出された。
同様にκ-HACを保持するキメラマウスにおいても、ヒト
免疫グロブリン重鎖とκ軽鎖の両タンパク質が検出でき
ることが期待される。l-HACキメラマウスにおいては、
週齢の増加と共にヒトm鎖からg鎖へのクラススイッチも
観察された。さらに、抗原を免疫して抗原特異的ヒト抗
体の抗体価の上昇が確認され、発現したヒト免疫グロブ
リンタンパク質は機能的な抗体分子の構成成分として存
在していることを示した。The report by Tomizuka et al. (Tomizuka et al., Nature G)
enet., 16: 133, 1997), the human chromosome was derived from human fibroblasts, then passed through mouse A9 cells, and finally introduced into mouse ES cells. Worked in offspring. Transcriptional and even protein level expression of human genes on the transchromosome was confirmed, for example, for human antibody genes (T
omizuka et al., Nature Genet., 16: 133, 1997). On the other hand, it has not been well known whether the human chromosome retains the ability to function in mice when passed through cells of birds that are evolutionarily separated from mammals. Chicken DT-40 cells (RIKEN cell bank: RCB1464, ATCC: CRL
-2111) was established from B lymphoma induced by avian leukemia virus (ALV) infection (Baba et al., Virology, 1
44: 139, 1985) Although it is a cell line, besides being derived from birds, the efficiency of homologous recombination is very high (Takeda et al., P.
Roc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 023, 1992). For example, it was imagined that a human gene on the introduced human chromosome may undergo gene conversion between a homologous avian gene on the avian chromosome and be inactivated. The only study on this issue is Dieken et al.
t., 12: 174, 1996) reported that a transcript of the human beta-globin gene was detected when human chromosome 11 was transferred to mouse MEL cells via chicken DT-40 cells. There is no report on the expression at the protein level and the function of the expressed human protein. In the present application, it is shown that a human gene on a human chromosome via chicken DT-40 cells and a protein encoded by the gene are functional in a mouse individual. The serum of chimeric mice harboring human artificial chromosome l-HAC (including human immunoglobulin heavy chain and λ light chain gene) produced in chicken DT-40 cells contains human immunoglobulin heavy chain and λ light chain. Both proteins were detected.
Similarly, it is expected that both human immunoglobulin heavy chain and κ light chain proteins can be detected in chimeric mice retaining κ-HAC. In l-HAC chimeric mice,
A class switch from human m-chain to g-chain was observed with increasing age. Furthermore, an increase in the antibody titer of an antigen-specific human antibody was confirmed by immunization with the antigen, indicating that the expressed human immunoglobulin protein was present as a component of a functional antibody molecule.
【００５８】染色体断片の安定性に関する議論（前記）
で触れた人工染色体における劇的な構造変化は、遺伝子
発現にも影響を与える可能性がある。例えば、SC20の染
色体断片転座部位は14番染色体短腕に含まれるが、この
領域にはRNAポリメラーゼIによって転写されるrRNA遺伝
子が数百コピー存在するものの、RNAポリメラーゼIIに
よってmRNAに転写される通常の遺伝子はほとんど含まれ
ていない。このような領域に免疫グロブリンλ鎖を含む
22番染色体断片を転座させた場合、その断片上の遺伝子
（RNAポリメラーゼIIによって転写されるもの）が正常
に発現するかどうかはこれまで不明であった。このよう
な問題が実際にあるとすれば、λ‐HACを保持するキメ
ラマウスにおいては、HACの安定化にもかかわらず、2本
の染色体断片を別々に導入した場合と比較して血清中免
疫グロブリンλ鎖発現が改善されないことが想像され
た。しかしながら、実際にキメラマウスで観察されたλ
鎖発現は2本の断片保持の場合と比較して高かった。特
に全軽鎖中の95%をヒトλ鎖が占めていたが、これは正
常マウスにおけるκ鎖の構成比と同等であり、λ‐HAC
に含まれる免疫グロブリンλ鎖遺伝子が効率良く発現し
ていることが示された。すなわち、本願においては上記
のような困難が想像されたにもかかわらず、SC20をベー
スとしたヒト人工染色体構築システムが望みの染色体領
域の遺伝子発現を目的とした実験に有用であることが示
された。Discussion on chromosome fragment stability (supra)
Dramatic structural changes in the artificial chromosomes mentioned in (1) may also affect gene expression. For example, the translocation site of the chromosome fragment of SC20 is contained in the short arm of chromosome 14, where there are several hundred copies of the rRNA gene transcribed by RNA polymerase I, but transcribed to mRNA by RNA polymerase II. Almost no normal genes are included. Such regions include immunoglobulin lambda chains
If the chromosome 22 fragment was translocated, it was not known whether the gene on that fragment (transcribed by RNA polymerase II) was normally expressed. If such a problem actually exists, the serum immunity of chimeric mice carrying λ-HAC, compared to the case where two chromosomal fragments are separately introduced, is notable despite the stabilization of HAC. It was assumed that globulin λ chain expression was not improved. However, the λ actually observed in chimeric mice
Strand expression was higher compared to the case with two fragments retained. In particular, 95% of the total light chain was occupied by human λ chains, which is equivalent to the proportion of κ chains in normal mice, indicating that λ-HAC
It was shown that the immunoglobulin λ chain gene contained in E. coli was efficiently expressed. That is, despite the above-mentioned difficulties being imagined in the present application, it was shown that a human artificial chromosome construction system based on SC20 is useful for experiments aimed at gene expression of a desired chromosomal region. Was.
【００５９】ヒト人工染色体λ-HAC, κ-HACを保持する
マウスは主にヒトモノクローナル抗体医薬の開発に用い
ることができる。しかし、感染症などの治療用抗体医薬
としてはモノクローナル抗体よりもポリクローナル抗体
の方が治療効果は大きいと考えられる。例えば本願に記
載されたヒト人工染色体をウシ胎児由来繊維芽細胞へ導
入し、この細胞核を、除核したウシ未受精卵へ核移植
し、発生させる（Cibelliら、Science, 280, 1256-125
8, 1998）ことにより、ヒト人工染色体を保持するウシ
の作出が可能になると考えられる。このウシに抗原を免
疫することにより、大量のヒトポリクローナル抗体を精
製することができる。Mice carrying human artificial chromosomes λ-HAC and κ-HAC can be used mainly for the development of human monoclonal antibody drugs. However, polyclonal antibodies are considered to have a greater therapeutic effect than monoclonal antibodies as therapeutic antibody drugs for infectious diseases. For example, the human artificial chromosome described in the present application is introduced into a bovine fetal fibroblast, and the cell nucleus is nuclear-transplanted into an enucleated unfertilized bovine egg and developed (Cibelli et al., Science, 280, 1256-125).
8, 1998), it will be possible to create cattle that carry human artificial chromosomes. By immunizing the bovine with an antigen, a large amount of human polyclonal antibody can be purified.
【００６０】２．分化多能性を保持するマウス細胞への
ヒト人工染色体の移入 これまでに、種々の系統のマウス由来の胚性癌腫細胞
（EC細胞、Hanaokaら, Differentiation, 48:83, 1991
）、胚性幹細胞（ES細胞、Evansら, Nature, 292:154,
1981 ）、胚性生殖細胞（EG細胞、Matsuiら, Cell, 7
0:841, 1992）がマウス初期胚に注入あるいは共培養す
ることによりその正常体細胞に寄与する、すなわちキメ
ラマウス作製可能であることが報告されている。ES、EG
細胞はその能力が特に高く、多くの場合生殖細胞にも寄
与し、その細胞由来の子孫を作ることができる。EC細胞
は主に生殖細胞癌から、ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊か
ら、EG細胞は発生初期に出現する始原生殖細胞から得ら
れる。本発明におけるヒト人工染色体移入の受容細胞と
してはこれらの細胞株及びその変異株、さらにはマウス
個体において全て、あるいは一部の正常体細胞に分化可
能なあらゆる未分化細胞を用いることができる。これら
の受容細胞は、キメラマウス、キメラマウス由来の組織
あるいは細胞において、導入されるヒト遺伝子の発現を
好適なものとするため、導入されるヒト遺伝子に相同な
マウス遺伝子等の、単一あるいは複数の遺伝子を標的遺
伝子相同組換え法（Joynerら, Gene Targeting, 1993,
IRL PRESS)等の方法を用いて破壊することも可能であ
る。2. Transfer of Human Artificial Chromosome into Mouse Cells Retaining Pluripotency So far, various types of mouse-derived embryonic carcinoma cells (EC cells, Hanaoka et al., Differentiation, 48:83, 1991)
), Embryonic stem cells (ES cells, Evans et al., Nature, 292: 154,
1981), embryonic germ cells (EG cells, Matsui et al., Cell, 7
0: 841, 1992) have been reported to contribute to normal somatic cells by injection or co-culture into early mouse embryos, ie, chimeric mice can be produced. ES, EG
Cells are particularly capable, often contributing also to germ cells, and can produce progeny derived from the cells. EC cells are obtained mainly from germ cell carcinomas, ES cells are obtained from the inner cell mass of blastocysts, and EG cells are obtained from primordial germ cells that appear early in development. As the recipient cells for human artificial chromosome transfer in the present invention, these cell lines and mutants thereof, and all undifferentiated cells that can be differentiated into all or some normal somatic cells in a mouse individual can be used. These recipient cells may be used alone or in combination with a mouse gene or the like homologous to the introduced human gene in order to optimize the expression of the introduced human gene in chimeric mice, tissues or cells derived from the chimeric mouse. Homologous recombination method (Joyner et al., Gene Targeting, 1993,
It is also possible to destroy using a method such as IRL PRESS).
【００６１】受容細胞へのヒト人工染色体移入の材料と
してはヒト人工染色体を保持する供与細胞から調製され
るミクロセルあるいはガンマ線照射したミクロセルを用
いることができる。受容細胞への移入は<清水素行, 細
胞工学ハンドブック, 羊土社,1992>等に記された方法で
受容細胞とミクロセルを融合することにより行なう。ミ
クロセル供与細胞においてはあるヒト人工染色体または
その断片が受容細胞において選別可能なマーカーを保持
している。この中から、PCR、サザンブロット解析、FIS
H解析等により、導入を目的とする遺伝子あるいは染色
体あるいはその断片を保持する株を選択すれば、あらゆ
るヒト人工染色体、あるいはその断片を導入することが
可能である。また、異なる選択マーカーを保持する複数
の染色体、あるいはその断片を逐次導入することによ
り、これらを同時に保持する受容細胞を得ることもでき
る。さらに、すでにあるヒト人工染色体を導入した細胞
株の中から、導入染色体数が増加したものを選抜するこ
とも可能である。これは通常、培養液中に添加する選択
薬剤の濃度を高めることにより達成される。As a material for transferring a human artificial chromosome to a recipient cell, a microcell prepared from a donor cell having a human artificial chromosome or a microcell irradiated with gamma rays can be used. Transfection into recipient cells is performed by fusing recipient cells and microcells by the method described in, for example, Seiki Higashi, Cell Engineering Handbook, Yodosha, 1992. In microcell donor cells, certain human artificial chromosomes or fragments thereof carry selectable markers in recipient cells. Among them, PCR, Southern blot analysis, FIS
Any human artificial chromosome or a fragment thereof can be introduced by selecting a strain retaining the gene or chromosome or a fragment thereof to be introduced by H analysis or the like. Further, by sequentially introducing a plurality of chromosomes holding different selectable markers or fragments thereof, a recipient cell holding these at the same time can also be obtained. Furthermore, it is also possible to select, from existing cell lines into which human artificial chromosomes have been introduced, those having an increased number of introduced chromosomes. This is usually achieved by increasing the concentration of the selective agent added to the culture.
【００６２】ヒト人工染色体上のマーカー（G418耐性
等）により選抜された受容細胞が、供与細胞の保持して
いたヒト人工染色体の全部あるいは一部を保持している
ことは、以下のようにして確認される。選抜された受容
細胞から抽出したゲノムDNAを用い、プローブとしてヒ
ト特異的繰り返し配列（L1、 Alu等、Korenbergら, Cel
l, 53:391, 1988）、ヒト遺伝子等を用いたサザン解析
により検出される。また、ヒト遺伝子特異的プライマー
によるPCR法、及びヒト人工染色体特異的プローブ（Lic
hterら, Human Genetics, 80:224, 1988）を用いたフル
オレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション
（FISH）等の染色体解析により確認することができる。The fact that a recipient cell selected by a marker (such as G418 resistance) on a human artificial chromosome retains all or a part of a human artificial chromosome retained by a donor cell as follows. It is confirmed. Using genomic DNA extracted from the selected recipient cells, a human-specific repetitive sequence (L1, Alu et al., Korenberg et al., Cel.
1, 53: 391, 1988), and is detected by Southern analysis using human genes and the like. In addition, a PCR method using human gene-specific primers and a human artificial chromosome-specific probe (Lic
hter et al., Human Genetics, 80: 224, 1988) by chromosome analysis such as fluorescence in situ hybridization (FISH).
【００６３】ヒト人工染色体を保持するES細胞株からの
キメラマウス作製は、< 相沢慎一,バイオマニュアルシ
リーズ 8 ジーンターゲティング, 羊土社, 1995>等に記
された方法で行なう。効率的なキメラマウス作製を行な
うための宿主胚の発生時期、系統等の選択については、
それぞれのES細胞株についてすでに検討された条件を用
いることが望ましい。例えば、CBA×C57BL/6 F1 由来の
TT２細胞（野生色、Yagiら, Analytical Biochemistry,
214:70, 1993）についてはBalb/c （白色、日本クレア
社）あるいはICR（白色、日本クレア社）由来の８細胞
期胚を宿主胚として用いるのが望ましい。The production of chimeric mice from ES cell lines having human artificial chromosomes is performed by the method described in Shinichi Aizawa, Bio Manual Series 8 Gene Targeting, Yodosha, 1995> and the like. Regarding the stage of development of host embryos and the selection of strains for efficient chimeric mouse production,
It is desirable to use the conditions already examined for each ES cell line. For example, CBA × C57BL / 6 F1 derived
TT2 cells (wild color, Yagi et al., Analytical Biochemistry,
214: 70, 1993), it is desirable to use an 8-cell stage embryo derived from Balb / c (white, CLEA Japan) or ICR (white, CLEA Japan) as a host embryo.
【００６４】キメラマウスにおけるヒト人工染色体の保
持及びヒト遺伝子発現以下の通り確認される。ES細胞株
を注入した胚から誕生したマウスにおけるES細胞の貢献
率は、その毛色によりおおまかに判定することができ
る。但し、毛色に全く貢献が見られないからといって他
の組織で貢献がないとは断定できない。より詳細な、キ
メラマウス各組織におけるヒト人工染色体の保持は各組
織より抽出されたゲノムDNAを用いたサザン解析、PCR等
によって確認することができる。Retention of human artificial chromosome and expression of human gene in chimeric mice are confirmed as follows. The contribution of ES cells to mice born from embryos injected with ES cell lines can be roughly determined by their coat color. However, just because there is no contribution to hair color cannot be concluded that there is no contribution in other organizations. More detailed retention of the human artificial chromosome in each tissue of the chimeric mouse can be confirmed by Southern analysis, PCR or the like using genomic DNA extracted from each tissue.
【００６５】導入ヒト人工染色体上の遺伝子発現は以下
のようにして確認される。ヒト人工染色体由来mRNAの発
現は各組織由来RNAを用いたRT-PCR法（Kawasakiら, P.
N.A.S., 85:5698, 1988）、ノーザンブロット法（Ausub
elら, 前記）により検出される。蛋白質レベルの発現
は、マウスの相同蛋白質との交差反応性を最小にした抗
ヒト蛋白質抗体による酵素免疫測定法（ELISA、富山・
安東, 単クローン抗体実験マニュアル, 講談社サイエン
ティフィク, 1987; 石川, 超高感度酵素免疫測定法, 学
会出版センター, 1993）、ウエスタンブロット法（Ausu
belら, 前記）あるいは、電気泳動度の違いを利用した
アイソザイム分析（Koi ら，Jpn. J. Cancer Res., 80:
413, 1989)等により検出される。さらに、キメラマウス
細胞中でのヒト人工染色体の保持及び該染色体上の遺伝
子の発現が、キメラマウス由来初代培養細胞での薬剤耐
性マーカー遺伝子発現による耐性細胞の出現より確認で
きる。The gene expression on the introduced human artificial chromosome is confirmed as follows. Expression of mRNA from human artificial chromosomes was determined by RT-PCR using RNA from each tissue (Kawasaki et al.,
NAS, 85: 5698, 1988), Northern blotting (Ausub
el et al., supra). Expression at the protein level was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, Toyama) using an anti-human protein antibody that minimized cross-reactivity with mouse homologous proteins.
Ando, Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific, 1987;
bel et al., supra) or isozyme analysis using differences in electrophoretic mobility (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res., 80:
413, 1989). Furthermore, the retention of the human artificial chromosome and the expression of the gene on the chromosome in the chimeric mouse cells can be confirmed by the appearance of resistant cells due to the expression of the drug resistance marker gene in the primary culture cells derived from the chimeric mouse.
【００６６】例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖の存在す
るヒト14番染色体断片及び、免疫グロブリンλ軽鎖の存
在する22番染色体断片を含むヒト人工染色体を保持する
ES細胞から作製されたキメラマウスについて、キメラマ
ウス血清中のヒトIgM、IgG、IgA、Igl等をマウス抗体と
の交差反応性を最小にした抗ヒトIg抗体による酵素免疫
測定法により検出することができる。また、このキメラ
マウスをヒト由来抗原（例えばヒト血清アルブミン）に
より免疫し、その脾臓細胞とマウスミエローマを融合す
ることにより得られる、ハイブリドーマ（安東・千葉,
単クローン抗体実験操作入門, 講談社サイエンティフィ
ク, 1991）をELISAによりスクリーニングすることによ
り、ヒト免疫グロブリン重鎖及びλ軽鎖からなる完全な
ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができ
る。For example, a human artificial chromosome containing a human chromosome 14 fragment having a human immunoglobulin heavy chain and a chromosome 22 fragment having an immunoglobulin λ light chain is retained.
For chimeric mice produced from ES cells, human IgM, IgG, IgA, Igl, etc. in chimeric mouse serum can be detected by enzyme immunoassay using an anti-human Ig antibody that minimizes cross-reactivity with mouse antibodies. it can. The chimera mouse is immunized with a human-derived antigen (for example, human serum albumin), and hybridomas (Ando and Chiba, obtained by fusing their spleen cells and mouse myeloma) are obtained.
Screening of monoclonal antibody experimental procedure introduction, Kodansha Scientific, 1991) by ELISA can obtain a hybridoma producing a complete human antibody composed of a human immunoglobulin heavy chain and a λ light chain.
【００６７】以上、マウスを例にとり、ヒト人工染色体
またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の
遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物の作製法を説明した
が、本発明において、キメラ非ヒト動物へ移入される人
工染色体またはその断片は、ヒト由来のものに限られ
ず、広く外来染色体またはその断片を移入し、該染色体
またはその断片上の遺伝子を発現させることが可能であ
る。ここで、「外来染色体」とは、分化多能性を保持す
る細胞へ移入され、キメラ非ヒト動物において、該染色
体またはその断片上の遺伝子が発現することを特徴とす
るものであり、その由来とする生物種は特に限定される
ものではない。また、本発明の方法により、キメラマウ
スのみならず、他のキメラ動物、例えば、ラット、ブタ
等の哺乳類その他のキメラ動物も作製することができ
る。マウス以外の動物種におけるES細胞あるいはES様細
胞の樹立はラット（Iannacconeら, Dev. Biol., 163, 2
88-, 1994）、ブタ（Wheeler ら, Reprod. Fertil. De
v., 6, 563-, 1994）、ウシ（Simsら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 91, 6143-6147, 1994）において報告さ
れ、さらにメダカ、ニワトリ等でも試みられている（ト
ランスジェニック動物, 蛋白質核酸酵素, 1995年10月号
増刊, 共立出版）。また、ヒツジにおいてはES様細胞
（ED細胞）さらにはそれを10代以上継代して得られる上
皮様細胞由来の核を移植された未受精卵が正常に発生す
ることが知られている（Campbellら, Nature,380, 64-,
1996）。これらESあるいはES様細胞を受容細胞とした
外来染色体移入によってマウスの場合と同様に外来染色
体あるいはその断片を保持し、該染色体またはその断片
上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物が作製可能であ
る。The method of producing a chimeric non-human animal that retains a human artificial chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof has been described above using a mouse as an example. The artificial chromosome or a fragment thereof to be transferred into an animal is not limited to a human-derived chromosome, and it is possible to transfer a foreign chromosome or a fragment thereof and express a gene on the chromosome or a fragment thereof. Here, the “foreign chromosome” is transferred to a cell that retains pluripotency and is characterized in that the gene on the chromosome or a fragment thereof is expressed in a chimeric non-human animal, and its origin is The species to be used is not particularly limited. Further, according to the method of the present invention, not only chimeric mice but also other chimeric animals such as mammals such as rats and pigs and other chimeric animals can be produced. Establishment of ES cells or ES-like cells in animal species other than mice has been described in rats (Iannaccone et al., Dev. Biol., 163, 2).
88-, 1994), pigs (Wheeler et al., Reprod. Fertil. De)
v., 6, 563-, 1994), cattle (Sims et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 91, 6143-6147, 1994), and has also been tried in medaka, chicken, and the like (transgenic animals, protein nucleic acid enzymes, October 1995 extra edition, Kyoritsu Shuppan). In addition, it has been known that unfertilized eggs in which sheep are transplanted with ES-like cells (ED cells) and nuclei derived from epithelial-like cells obtained by passage of the cells for 10 or more generations are normal ( Campbell et al., Nature, 380, 64-,
1996). By transferring a foreign chromosome using these ES or ES-like cells as recipient cells, a chimeric non-human animal that retains a foreign chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof can be produced as in the case of a mouse. .
【００６８】さらに近年の核移植技術の急速な進展によ
り、上記ESあるいはES様細胞よりもさらに分化した胎児
や成体の体細胞も核移植のドナーとして利用できるよう
になった。これまでにヒツジ成体の乳腺細胞(Wilmutら,
Nature, 385:810, 1997)、ウシ胎児の繊維芽細胞(Schn
iekeら, Science, 278:2130, 1997)、マウス成体の卵丘
細胞(Wakayamaら, Nature, 394:369, 1998)をドナーと
した未受精卵への核移植により生存可能な産仔が得られ
たとの報告がある。加えて、クローン化された外来DNA
を導入した体細胞(胎児由来繊維芽細胞)をドナーとして
用いることにより、トランスジェニックヒツジ(Schniek
eら,前記)及びウシ(Cibelliら, Science 280:1256, 199
8)の作製も可能である。Further, with the rapid progress of nuclear transfer technology in recent years, fetal or adult somatic cells that have further differentiated from the above-mentioned ES or ES-like cells can be used as donors for nuclear transfer. So far, adult sheep mammary gland cells (Wilmut et al.,
Nature, 385: 810, 1997), fetal bovine fibroblasts (Schn
ieke et al., Science, 278: 2130, 1997), and viable offspring can be obtained by nuclear transfer to unfertilized eggs using adult mouse cumulus cells (Wakayama et al., Nature, 394: 369, 1998) as donors. There is a report. In addition, cloned foreign DNA
By using somatic cells (fetal-derived fibroblasts) transfected as donors, transgenic sheep (Schniek
e et al., supra) and cattle (Cibelli et al., Science 280: 1256, 199).
8) is also possible.
【００６９】すなわち、外来染色体あるいは外来組換え
染色体を移入した体細胞をドナーとした核移植により、
当該外来染色体あるいは外来組換え染色体を保持し、発
現する動物個体の作製が可能であると考えられる。これ
は例えば、以下の手順（１）〜（５）により可能であ
る。That is, by nuclear transfer using a somatic cell into which a foreign chromosome or a foreign recombinant chromosome has been transferred as a donor,
It is thought that it is possible to produce an animal individual that retains and expresses the foreign chromosome or the foreign recombinant chromosome. This can be performed, for example, by the following procedures (1) to (5).
【００７０】（１）Igλ領域を含むヒト22染色体を保持
するニワトリDT-40細胞において以下の操作Ａ、Ｂを行
う。 （１）−Ａ ヒト22染色体上のIgλ領域のテロメア側に
テロメア配列を挿入し、当該染色体を短縮化する。 （１）−Ｂ ヒト22染色体上のIgλ領域のセントロメア
側（例えばHCF遺伝子座）に部位特異的組換え酵素の認
識配列、例えばloxP配列を挿入する。loxP配列を含むタ
ーゲティングベクターには例えば下記GFP等のマーカー
を発現させるためのプロモーター配列が含まれる。(1) The following operations A and B are performed on chicken DT-40 cells carrying 22 human chromosomes including an Igλ region. (1) -A Insert a telomere sequence on the telomere side of the Igλ region on human 22 chromosome to shorten the chromosome. (1) -B Insert a site-specific recombinase recognition sequence, for example, a loxP sequence, into the centromere side (for example, the HCF locus) of the Igλ region on human 22 chromosome. The targeting vector containing the loxP sequence contains, for example, a promoter sequence for expressing a marker such as the following GFP.
【００７１】（２）RNR2遺伝子座にloxP配列及びGFP遺
伝子が挿入されたヒト14番染色体断片SC20を保持するニ
ワトリDT-40細胞と上記（１）において作製されたニワ
トリDT-40細胞を全細胞融合し、2種のヒト染色体断片を
同時に保持するニワトリDT-40細胞を得る。 （３）上記（２）で作製されたヒト染色体(断片)を保持
するニワトリDT-40細胞において部位特異的組換え酵素
を発現させる。loxP配列において部位特異的組換えを起
こした細胞においては前記プロモーター配列とGFP遺伝
子が連結し、GFPが発現する。すなわち転座による組換
えヒト染色体を含むニワトリDT-40細胞を選択すること
ができる。(2) Chicken DT-40 cells carrying the human chromosome 14 fragment SC20 having the loxP sequence and the GFP gene inserted at the RNR2 locus and the chicken DT-40 cells prepared in (1) above were all cells After fusion, chicken DT-40 cells that simultaneously retain two types of human chromosome fragments are obtained. (3) Expression of site-specific recombinase in chicken DT-40 cells holding the human chromosome (fragment) prepared in (2) above. In cells in which site-specific recombination has occurred in the loxP sequence, the promoter sequence and the GFP gene are linked, and GFP is expressed. That is, chicken DT-40 cells containing recombinant human chromosomes by translocation can be selected.
【００７２】（４）上記（３）において作製された組換
えヒト染色体（断片）をCHO細胞にミクロセル移入す
る。さらに、得られた組換えヒト染色体（断片）を保持
するCHO細胞よりミクロセルを誘導し、そのミクロセル
を例えばウシ胎児由来繊維芽細胞と融合する。当該組換
えヒト染色体断片を保持するウシ胎児由来繊維芽細胞は
例えば組換えヒト染色体上に存在する薬剤耐性マーカー
の発現により選択できる。 （５）上記（４）で得られた当該組換えヒト染色体断片
を保持するウシ胎児由来繊維芽細胞をドナー、ウシ未受
精卵をレシピエントとした核移植により、当該組換えヒ
ト染色体断片を保持し、発現するウシ個体及びその子孫
が作製される(Cibelliら, Science 280:1256, 1998)。(4) The recombinant human chromosome (fragment) prepared in the above (3) is transferred to a CHO cell by a microcell. Further, microcells are derived from the obtained CHO cells holding the recombinant human chromosome (fragment), and the microcells are fused with, for example, fetal bovine-derived fibroblasts. Fetal bovine fetal cells carrying the recombinant human chromosome fragment can be selected, for example, by expressing a drug resistance marker present on the recombinant human chromosome. (5) The recombinant human chromosome fragment is retained by nuclear transfer using the fetal bovine fibroblasts retaining the recombinant human chromosome fragment obtained in (4) above as a donor and a bovine unfertilized egg as a recipient. Expressing bovine individuals and their progeny are produced (Cibelli et al., Science 280: 1256, 1998).
【００７３】また、本発明において、外来染色体あるい
はその断片が移入される、分化多能性を保持する細胞
は、前述のＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞に限られるも
のではない。例えば、骨髄幹細胞に外来染色体あるいは
その断片を移入することが可能であり、該骨髄幹細胞の
生体への移植により、遺伝病等の治療を行うことが可能
である。In the present invention, the cells retaining the pluripotency into which a foreign chromosome or a fragment thereof has been transferred are not limited to the aforementioned ES cells, EC cells, and EG cells. For example, a foreign chromosome or a fragment thereof can be transferred to bone marrow stem cells, and treatment of a genetic disease or the like can be performed by transplanting the bone marrow stem cells into a living body.
【００７４】キメラ非ヒト動物において、外来染色体を
保持するES細胞がその生殖細胞に分化した場合、生殖に
より得られる子孫にも導入染色体または断片が認めら
れ、その子孫は導入された染色体または断片上の遺伝子
を発現する。上記のようにして得られるキメラ非ヒト動
物またはその子孫を利用して、外来染色体またはその断
片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することによ
り、生物学的に活性な物質を製造することができる。具
体的には、キメラ非ヒト動物またはその子孫の個体を外
来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下
で飼育し、その後発現産物を動物の血液、腹水などから
回収することができる。In a chimeric non-human animal, when ES cells having a foreign chromosome are differentiated into their germ cells, transgenic chromosomes or fragments are also observed in progeny obtained by reproduction, and the progeny are located on the introduced chromosome or fragment. Of the gene. Using the chimeric non-human animal or its progeny obtained as described above, expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and recovering the product to produce a biologically active substance Can be. Specifically, a chimeric non-human animal or its progeny can be bred under conditions capable of expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and then the expression product can be recovered from the animal's blood, ascites, and the like.
【００７５】あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはそ
の子孫の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの（例
えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブ
リドーマ）などを外来染色体またはその断片上の遺伝子
を発現しうる条件下で培養し、その後発現産物を培養物
から回収することができる。さらには、これらキメラ非
ヒト動物またはその子孫の組織、細胞、あるいはそれを
不死化したものから抽出した外来染色体あるいはその断
片、または外来染色体またはその断片を構成するＤＮ
Ａ、さらにはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫の
組織、細胞、あるいはそれを不死化したものに保持され
た外来染色体あるいはその断片に由来するｃＤＮＡを動
物細胞あるいは昆虫細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ
細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、ＳＦ９細胞等）に
導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子
を発現しうる条件下で培養し、その後発現産物（例え
ば、特定の抗原特異的な抗体蛋白質等）を培養物から回
収することができる。発現産物は遠心分離などの公知の
方法に従って回収することができ、さらに、硫安分画、
分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフ
ィーなどの公知の方法に従って精製することができる。
生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされて
いるあらゆる物質を含み、例えば、抗体、特にヒト抗体
などを挙げることができる。例えば、得られたキメラ動
物の脾細胞あるいはそのハイブリドーマなどの不死化細
胞から該染色体上のヒト抗体遺伝子をクローニングし、
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）やミエロー
マ細胞に導入してヒト抗体を生産することができる（Ly
netteら, Biotechnology, 10, 1121-, 1992; Bebbingto
nら, Biotechnology, 10, 169-, 1992)。Alternatively, the expression of a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof may be carried out using a chimeric non-human animal or its progeny tissue, cells or immortalized tissue (eg, a hybridoma immortalized by fusion with myeloma cells). The culture can be cultured under possible conditions, after which the expression product can be recovered from the culture. Furthermore, foreign chromosomes or fragments thereof extracted from tissues or cells of these chimeric non-human animals or their progeny, or immortalized tissues thereof, or DNs constituting the foreign chromosomes or fragments thereof
A, or a cDNA derived from a foreign chromosome or a fragment thereof retained in a tissue, cell, or immortalized tissue or cell of a chimeric non-human animal or its progeny, can be used for animal cells or insect cells (for example, CHO cells, BHK
Cells, liver cancer cells, myeloma cells, SF9 cells, etc.), and culturing the cells under conditions capable of expressing the gene on the foreign chromosome or a fragment thereof, and then expressing the product (for example, specific antigen-specific Antibody protein, etc.) can be recovered from the culture. The expression product can be recovered according to a known method such as centrifugation, and further, ammonium sulfate fractionation,
Purification can be performed according to a known method such as partition chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, or preparative thin-layer chromatography.
Biologically active substances include any substance encoded on a foreign chromosome, and include, for example, antibodies, particularly human antibodies. For example, cloning the human antibody gene on the chromosome from immortalized cells such as spleen cells of the obtained chimeric animal or its hybridoma,
Can be introduced into Chinese hamster ovary cells (CHO) or myeloma cells to produce human antibodies (Ly
nette et al., Biotechnology, 10, 1121-, 1992; Bebbingto
n et al., Biotechnology, 10, 169-, 1992).
【００７６】ハイブリドーマの選抜により所望の抗体産
生細胞を選抜するという従来の方法に加えて、近年開発
されたファージディスプレー法により、所望の抗体を選
抜することも可能である（Winterら、 Annu. Rev. Immu
nol., 12:433, 1994）。様々な特異性を持つヒト抗体を
その表面に発現するファージライブラリーを得るために
は、抗原未感作あるいは、特定の抗原を感作した本発明
のキメラ非ヒト動物またはその子孫の脾臓やリンパ組織
由来のヒト免疫グロブリン遺伝子重鎖及び軽鎖可変領域
cDNAを用いることができる。In addition to the conventional method of selecting desired antibody-producing cells by selecting hybridomas, it is also possible to select desired antibodies by a recently developed phage display method (Winter et al., Annu. Rev.). . Immu
nol., 12: 433, 1994). In order to obtain a phage library that expresses human antibodies having various specificities on its surface, it is necessary to use antigen-unsensitized or spleen or lymph of a chimeric non-human animal of the present invention or a progeny thereof sensitized with a specific antigen. Tissue-derived human immunoglobulin gene heavy and light chain variable regions.
cDNA can be used.
【００７７】本発明により得られるλ-HAC及びκ-HACを
保持するキメラマウス及びその子孫は、λ-HACの場合、
ヒト抗体重鎖（14番染色体上）＋軽鎖λ（22番染色体
上）、κ-HACの場合、ヒト抗体重鎖（14番染色体上）＋
軽鎖κ（２番染色体上）、それぞれの遺伝子の機能的配
列の大部分を保持し得る。すなわち、酵母人工染色体等
を用いてヒト抗体遺伝子の一部を導入した既知のトラン
スジェニックマウス（Greenら, Nature Genetics,７, 1
3-, 1994, Lonbergら, Nature, 368, 856-, 1994等）と
比較して、ヒトにおいて観察されるものにより近い、非
常に多様なヒト抗体レパートリーを発現することが可能
である。また、上記キメラマウス及びその子孫は、重
鎖、軽鎖の両者がヒト由来である完全なヒト抗体を産生
することが可能である。これらのマウスはヒト由来抗原
に対してそれを異物とみなして免疫反応を起こし、抗原
特異的ヒト抗体を産生することができる。この性質は治
療用のヒトモノクローナル抗体、あるいはヒトポリクロ
ーナル抗体を得るために非常に有用である（Greenら、
前記、Lonbergら、前記）。一方、特定の抗原に対して
親和性の高いヒト抗体を得る効率を上げるためには、マ
ウス抗体を産生せず、ヒト抗体のみを産生するマウスを
作成することが望まれる（Greenら、前記、Lonbergら、
前記）。本発明において、これは典型的には以下の方法
Aあるいは Bにより達成される。 方法A：マウス抗体欠損ES細胞およびマウス抗体欠損キ
メラ宿主胚を用いる方法。 方法B：ヒト人工染色体導入キメラマウスよりヒト人工
染色体を保持する子孫を得てマウス抗体遺伝子を欠損す
るマウス系統との交配を行う方法。The chimeric mouse having λ-HAC and κ-HAC obtained according to the present invention and the progeny thereof, when λ-HAC,
Human antibody heavy chain (on chromosome 14) + light chain λ (on chromosome 22), in the case of κ-HAC, human antibody heavy chain (on chromosome 14) +
Light chain kappa (on chromosome 2), which can retain most of the functional sequence of each gene. That is, a known transgenic mouse in which a part of a human antibody gene is introduced using a yeast artificial chromosome or the like (Green et al., Nature Genetics, 7, 1).
3-, 1994, Lonberg et al., Nature, 368, 856-, 1994, etc.) and are able to express a very diverse human antibody repertoire closer to that observed in humans. In addition, the chimeric mouse and its progeny can produce fully human antibodies in which both the heavy and light chains are derived from humans. These mice are capable of producing an antigen-specific human antibody against human-derived antigens by treating them as foreign substances. This property is very useful for obtaining therapeutic human monoclonal or polyclonal antibodies (Green et al.,
Lonberg et al., Supra). On the other hand, in order to increase the efficiency of obtaining a human antibody having a high affinity for a specific antigen, it is desired to produce a mouse that does not produce a mouse antibody but produces only a human antibody (Green et al., Supra. Lonberg et al.
Above). In the present invention, this typically involves the following method
Achieved by A or B. Method A: Method using mouse antibody-deficient ES cells and mouse antibody-deficient chimeric host embryo. Method B: A method in which progeny retaining the human artificial chromosome are obtained from the human artificial chromosome-introduced chimeric mouse and crossed with a mouse strain lacking the mouse antibody gene.
【００７８】以下にA, Bそれぞれの方法の典型的な例に
ついて以下に具体的に記す。 方法Aの具体的手順 １．マウスES細胞に２コピー存在するマウス抗体重鎖遺
伝子の片側のアレルを標的遺伝子相同組み換え法（Joyn
erら, Gene Targeting, 1993, IRL PRESS）を用いて破
壊する。遺伝子破壊箇所には後に部位特異的組換えによ
り除去可能な配列、例えばloxP配列（Creレコンビナー
ゼにより組み換え、Sauerら、前記、他にFLPレコンビナ
ーゼ-FRT配列を用いたO'Gormanら, Science, 251, 1351
-, 1991の例がある）にはさまれたG418耐性遺伝子等の
マーカー遺伝子を挿入する。A typical example of each of the methods A and B will be specifically described below. Specific Procedure of Method A The target gene homologous recombination method (Joyn)
er et al., Gene Targeting, 1993, IRL PRESS). Sequences that can be subsequently removed by site-specific recombination, such as loxP sequences (recombined with Cre recombinase, Sauer et al., Supra, as well as O'Gorman et al. 1351
-, 1991) insert a marker gene such as the G418 resistance gene.
【００７９】２．抗体重鎖遺伝子の片側のアレルが破壊
された上記薬剤耐性マウスES細胞を高濃度の薬剤存在下
で培養し、高濃度薬剤耐性となった株を選抜する。これ
らの株をスクリーニングすることにより抗体重鎖遺伝子
の両側のアレルが破壊された株が得られる（相沢慎一、
前記）。あるいは、抗体重鎖遺伝子の片側のアレルが破
壊された上記薬剤耐性マウスES細胞のもう一方の側のア
レルの標的遺伝子も相同組み換え法を用いて破壊する。
予め挿入されたマーカー遺伝子とは別のマーカー遺伝子
を使用することによって、同様な操作を繰り返すことが
できる。例えば、G418耐性遺伝子を用いて相同組み換え
を行った後、ピューロマイシン耐性遺伝子を用いて相同
組み換えを行い、両側のアレルとも抗体重鎖遺伝子が破
壊された株を得る。予め挿入されたマーカー遺伝子と同
じマーカー遺伝子を使用する場合には、１．で薬剤耐性
遺伝子の両側に挿入した組み換え配列の間で、部位特異
的組み換え反応を起こす酵素遺伝子を一時的に導入し、
標的遺伝子に挿入されていた薬剤耐性遺伝子を除去され
た薬剤感受性株を選抜する。その後、再度標的遺伝子相
同組み換え法によって、マーカー遺伝子を挿入し、両側
のアレルとも標的遺伝子が破壊された株を得る（高津聖
志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、p.255-、19
95、羊土社) 。2. The above-mentioned drug-resistant mouse ES cells in which the allele on one side of the antibody heavy chain gene has been disrupted are cultured in the presence of a high concentration of a drug, and a strain that has become highly drug-resistant is selected. Screening these strains yields strains in which alleles on both sides of the antibody heavy chain gene have been disrupted (Shinichi Aizawa,
Above). Alternatively, the target gene of the allele on the other side of the drug-resistant mouse ES cell in which the allele on one side of the antibody heavy chain gene has been disrupted is also destroyed by homologous recombination.
The same operation can be repeated by using a marker gene different from the previously inserted marker gene. For example, after performing homologous recombination using the G418 resistance gene, homologous recombination is performed using the puromycin resistance gene to obtain a strain in which the antibody heavy chain gene has been disrupted in both alleles. When using the same marker gene as the previously inserted marker gene, 1. Temporarily introduce an enzyme gene that causes a site-specific recombination reaction between the recombination sequences inserted on both sides of the drug resistance gene,
A drug-sensitive strain from which the drug resistance gene inserted into the target gene has been removed is selected. Then, the marker gene is inserted again by the target gene homologous recombination method to obtain a strain in which the target gene has been disrupted in both alleles.
95, Yodosha).
【００８０】３．２．で得られた抗体重鎖遺伝子の両側
のアレルが破壊されたマウスES細胞に１．で薬剤耐性遺
伝子の両側に挿入した組換え配列の間で部位特異的組み
換え反応を起こす酵素遺伝子、例えばCreレコンビナー
ゼ遺伝子（Sauerら、前記）を一時的に導入し、loxP配
列の間で組み換え反応が起こって両方の抗体重鎖遺伝子
に挿入された薬剤耐性遺伝子が除去された薬剤感受性株
を選抜する（高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基
礎技術、p255-、1995、羊土社）。 ４．マウス抗体軽鎖κ遺伝子について上記１〜３の過程
を繰り返し、最終的に抗体重鎖及びκ鎖を完全に欠損し
た薬剤感受性株を取得する。3.2. In mouse ES cells in which alleles on both sides of the antibody heavy chain gene obtained in 1) were disrupted, In this method, an enzyme gene causing a site-specific recombination reaction between the recombination sequences inserted on both sides of the drug resistance gene, for example, the Cre recombinase gene (Sauer et al., Supra) is temporarily introduced, and the recombination reaction between the loxP sequences A drug-sensitive strain in which the drug resistance gene inserted into both antibody heavy chain genes has been removed is selected (Satoshi Takatsu et al., Experimental Medicine Supplement, Basic Techniques for Immunological Research, p255-, 1995, Yodosha). 4. The above steps 1 to 3 are repeated for the mouse antibody light chain κ gene to finally obtain a drug-sensitive strain completely deficient in the antibody heavy chain and κ chain.
【００８１】５．４の株（抗体重鎖、κ鎖欠損マウスES
細胞）を受容細胞としたミクロセル融合により、薬剤耐
性マーカー（例えばG418耐性遺伝子）でマーキングされ
たヒト人工染色体（λ-HAC、κ-HAC）を導入する。 ６．自らの抗体を産生することができないマウス系統
（例えばRAG-2ノックアウトマウス、Shinkaiら, Cell,
68, 855-, 1992、膜型μ鎖ノックアウトマウス、Kitamu
raら, Nature, 350, 423-,1991）から得た胚を宿主胚と
して５で得られたES細胞とのキメラマウスを作成する。5.4 strains (antibody heavy chain, κ chain deficient mouse ES
A human artificial chromosome (λ-HAC, κ-HAC) marked with a drug resistance marker (eg, a G418 resistance gene) is introduced by microcell fusion using the cell as a recipient cell. 6. Mouse strains that cannot produce their own antibodies (eg, RAG-2 knockout mice, Shinkai et al., Cell,
68, 855-, 1992, membrane μ chain knockout mouse, Kitamu
Ra et al., Nature, 350, 423-, 1991) are used as host embryos to create chimeric mice with the ES cells obtained in 5 above.
【００８２】７．得られるキメラマウスにおいてほとん
どの機能的なBリンパ球はES細胞に由来する（高津聖志
ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、p234-、羊土
社、1995）。このBリンパ球においてはマウス重鎖、κ
鎖が欠損しているため、主として導入染色体上の機能的
なヒト抗体遺伝子よりヒトの抗体のみが産生される。 方法Bの具体的手順 １．ヒト人工染色体（λ-HAC、κ-HAC）を保持するキメ
ラマウスからそれらを安定に保持する継代可能な子孫を
得る。 ２．１．で得られたヒト抗体重鎖および軽鎖の両者を発
現するマウス系統と自らの抗体遺伝子が欠損しているマ
ウス系統（例えば膜型μ鎖ノックアウトマウス、前記、
軽鎖κノックアウトマウス、Chenら, EMBO J., 3, 821
-, 1993）との交配により、マウス抗体重鎖、及び軽鎖
κの欠損についてホモ接合体であり、なおかつヒト人工
染色体（λ-HAC、κ-HAC）を保持するマウス系統を得
る。このマウス系統においてはマウス抗体重鎖、軽鎖κ
遺伝子が欠損しているため、主として導入染色体上の機
能的なヒト抗体遺伝子よりヒトの抗体のみが産生され
る。なお、上記のＡおよびＢの方法は、ヒト抗体のみな
らず、外来染色体上に存在するあらゆる遺伝子の産物を
効率的に得るために、用いることができる。7. Most functional B lymphocytes in the obtained chimeric mice are derived from ES cells (Seiji Takatsu et al., Experimental Medicine Supplement, Basic Techniques for Immunological Research, p234-, Yodosha, 1995). In this B lymphocyte, the mouse heavy chain, κ
Because of the missing chains, only human antibodies are produced primarily from functional human antibody genes on the transchromosome. Specific Procedure of Method B From a chimeric mouse carrying human artificial chromosomes (λ-HAC, κ-HAC), passable progeny that stably retain them are obtained. 2.1. A mouse strain expressing both the human antibody heavy chain and light chain obtained in and a mouse strain deficient in its own antibody gene (for example, membrane-type μ chain knockout mouse,
Light chain kappa knockout mouse, Chen et al., EMBO J., 3, 821
-, 1993) to obtain a mouse strain that is homozygous for the deletion of the mouse antibody heavy and light chains κ and that retains human artificial chromosomes (λ-HAC, κ-HAC). In this mouse strain, the mouse antibody heavy chain, light chain κ
Due to the gene deletion, only human antibodies are produced mainly from functional human antibody genes on the transchromosome. The methods A and B described above can be used to efficiently obtain not only human antibodies but also products of all genes present on foreign chromosomes.
【００８３】[0083]
【実施例】以下に実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 （実施例1）カセットベクターploxPHyg, ploxPbsrの作
製 以下（実施例1）〜（実施例17）において、ヒト抗体λ
軽鎖、κ軽鎖遺伝子クラスターをクローニングしたヒト
人工染色体λ-HAC, κ-HACの作製について述べる。さら
には、作製された各HACのマウス個体への導入、HACに含
まれるヒト抗体遺伝子のマウス個体における発現、HAC
のキメラマウス子孫への伝達について述べる。ここに開
示されるHAC導入マウス作製システムの概略を図1、図2
に図示した。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. (Example 1) Preparation of cassette vectors ploxPHyg and ploxPbsr In the following (Example 1) to (Example 17), the human antibody λ
Production of human artificial chromosomes λ-HAC and κ-HAC cloned from the light chain and κ light chain gene clusters is described. Furthermore, introduction of each produced HAC into a mouse individual, expression of a human antibody gene contained in HAC in the mouse individual, HAC
Is described to the offspring of chimeric mice. The outline of the HAC-introduced mouse production system disclosed herein is shown in FIGS. 1 and 2
Illustrated in FIG.
【００８４】ヒト染色体上にCre組換え酵素の認識配列
であるloxP配列を挿入するためのカセットベクターplox
PHyg, ploxPbsrを以下のようにして作製した。また、前
述したように、期待通りの転座が起った細胞をポジティ
ブセレクションできるように、前者のカセットベクター
にはPGKプロモータが、後者にはこのPGKプロモータによ
って転写されるべきGFP遺伝子が含まれるように構築し
た。まず、ploxPHygの作製について述べる。プラスミド
pBluescript II SK(-)（東洋紡）を制限酵素EcoRV（ベ
ーリンガー）で切断し、脱リン酸化酵素CIAP（仔牛小腸
由来アルカリ脱リン酸化酵素、宝酒造）を用いて、50℃
で30分間反応し、切断末端を脱リン酸化した。これに、
プラスミドpBS302（ギブコ）から制限酵素SpeIとHindII
I（ベーリンガー）で切り出してDNA Blunting kit（宝
酒造）で平滑末端化したDNA断片を、DNA Ligation kit
（宝酒造）を用いてライゲーションし、コンピテントセ
ルDH5（東洋紡）を形質転換した（プラスミドpBS302H
S）。平滑末端化、ライゲーション及び形質転換は、各
キットに添付のプロトコールに従って行った。次に,こ
のプラスミドを制限酵素SalI（ベーリンガー）で切断、
脱リン酸化し、プラスミドpGKPuro（WHITEHEAD INSTITU
TE, Dr. Peter W. Lairdから分与、例えば，M.Tanigich
iら、Nucleic Acid Res., 26:679, 1998）から制限酵素
SalIとXhoI（ベーリンガー）で切り出したPGKプロモー
タ断片をクローニングし、プラスミドpBSPGK302HSを得
た。このプラスミドを制限酵素EcoRIとNotI（ベーリン
ガー）で切断し、平滑化脱リン酸化後、NotIリンカー
（宝酒造）をライゲーションした（プラスミドpBSPGK30
2HSN）。一方、プラスミド#1-133（京都大学医学部 武
田俊一教授より分与、例えば，D. X. Yinら、Cancer Re
s., 55:4922, 1995）を制限酵素BamHI（ベーリンガー）
で切断することによってハイグロマイシンB耐性遺伝子
カセットを切り出し，末端を平滑化した。プラスミドpB
SPGK302HSN を制限酵素SalI（ベーリンガー）で切断し
平滑末端後、ハイグロマイシンB耐性遺伝子カセットを
クローニングした（プラスミドploxPHyg）。次に、plox
Pbsrの作製について述べる。まず最初に、プラスミドpB
luescript IISK(-)（東洋紡）のSacI部位に上記のよう
にしてSfiIリンカーを挿入した。SfiIリンカーは、以下
の配列のオリゴDNAを合成し、5'末端をリン酸化した
（合成はグライナーに委託）。 （SfiIリンカー） 5'-GGCCGC [A/T]GCGGCC-3'（配列番号１） このプラスミドを制限酵素BamHI（ベーリンガー）で切
断、脱リン酸化し、プラスミドpBS302（ギブコ）から制
限酵素BamHI（ベーリンガー）で切り出したDNA断片をク
ローニングした（pBSSfK302B）。プラスミドpGREEN LAN
TERN-1（ギブコ）のClaI部位に上記のようにSpeIリンカ
ー（宝酒造）を挿入し、制限酵素SpeI（ベーリンガー）
で切り出したGFP遺伝子カセット断片を、SpeIで切断
後、脱リン酸化したプラスミドpBSSfK302Bにクローニン
グした（pBSSfK302BGFP）。このプラスミドを制限酵素X
baI（ベーリンガー）で切断・平滑末端後、プラスミド#
1-134（京都大学医学部 武田俊一教授より分与、例え
ば，K. Kobayashiら、 Agric.Biol. Chem., 55:3155,
1991）から制限酵素BamHI（ベーリンガー）で切り出し
平滑末端化したDNA断片（ブラストサイジンS耐性遺伝子
カセット）をクローニングした（ploxPbsr）。カセット
ベクターploxPHyg, ploxPbsrの構造を図3に示した。A cassette vector plox for inserting a loxP sequence, which is a recognition sequence of Cre recombinase, on a human chromosome.
PHyg and ploxPbsr were prepared as follows. Also, as described above, the former cassette vector contains the PGK promoter, and the latter contains the GFP gene to be transcribed by this PGK promoter, so that cells that have undergone translocation as expected can be positively selected. Was built as follows. First, preparation of ploxPHyg will be described. Plasmid
Cleavage pBluescript II SK (-) (Toyobo) with restriction enzyme EcoRV (Boehringer) and use phosphatase CIAP (calf intestine-derived alkaline phosphatase, Takara Shuzo) at 50 ° C.
For 30 minutes to dephosphorylate the cleaved ends. to this,
Restriction enzymes SpeI and HindII from plasmid pBS302 (Gibco)
The DNA fragment cut out with I (Boehringer) and blunt-ended with DNA Blunting kit (Takara Shuzo) is
(Takara Shuzo) and transformed competent cell DH5 (Toyobo) (plasmid pBS302H
S). Blunting, ligation and transformation were performed according to the protocol attached to each kit. Next, this plasmid was cut with the restriction enzyme SalI (Boehringer),
Dephosphorylate the plasmid pGKPuro (WHITEHEAD INSTITU
Dispensed from TE, Dr. Peter W. Laird, for example, M. Tanigich
i et al., Nucleic Acid Res., 26: 679, 1998)
The PGK promoter fragment cut out with SalI and XhoI (Boehringer) was cloned to obtain plasmid pBSPGK302HS. This plasmid was digested with restriction enzymes EcoRI and NotI (Boehringer), blunted and dephosphorylated, and ligated with a NotI linker (Takara Shuzo) (plasmid pBSPGK30
2HSN). On the other hand, plasmid # 1-133 (distributed by Professor Shunichi Takeda, School of Medicine, Kyoto University, for example, DX Yin et al., Cancer Re
s., 55: 4922, 1995) with the restriction enzyme BamHI (Boehringer).
The hygromycin B resistance gene cassette was cut out by cutting with, and the end was blunted. Plasmid pB
SPGK302HSN was digested with restriction enzyme SalI (Boehringer), blunt-ended, and the hygromycin B resistance gene cassette was cloned (plasmid ploxPHyg). Next, plox
The preparation of Pbsr will be described. First, the plasmid pB
The SfiI linker was inserted into the SacI site of luescript IISK (-) (Toyobo) as described above. The SfiI linker synthesized oligo DNA having the following sequence and phosphorylated the 5 ′ end (consigned to Greiner). (SfiI linker) 5′-GGCCGC [A / T] GCGGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 1) This plasmid was cleaved and dephosphorylated with a restriction enzyme BamHI (Boehringer), and the restriction enzyme BamHI (Boehringer) was converted from plasmid pBS302 (Gibco). ) Was cloned (pBSSfK302B). Plasmid pGREEN LAN
Insert the SpeI linker (Takara Shuzo) into the ClaI site of TERN-1 (Gibco) as described above, and restrict the enzyme SpeI (Boehringer)
The GFP gene cassette fragment excised in the above was cut with SpeI and cloned into a dephosphorylated plasmid pBSSfK302B (pBSSfK302BGFP). This plasmid is called restriction enzyme X
After digestion with blunt-ended with baI (Boehringer), plasmid #
1-134 (Distributed by Professor Shunichi Takeda, School of Medicine, Kyoto University, for example, K. Kobayashi et al., Agric. Biol. Chem., 55: 3155,
1991) and a blunt-ended DNA fragment (blasticidin S resistance gene cassette) cut out with restriction enzyme BamHI (Boehringer) was cloned (ploxPbsr). FIG. 3 shows the structures of the cassette vectors ploxPHyg and ploxPbsr.
【００８５】（実施例2）ターゲティングベクターpHCF2
loxPHyg(F), (R)の作製 ヒト２２番染色体上のHCF2遺伝子座（Igλ領域の極セン
トロメア側）にloxP配列を挿入するためのターゲティン
グベクターpHCF2loxPHyg(F), (R)を以下のようにして作
製した。HCF2遺伝子の転写方向がセントロメア→テロメ
アか、テロメア→セントロメアかが不明のため、 (F),
(R)の２方向のターゲティングベクターを作製した。ま
ず、ヒトHCF2遺伝子座のゲノム領域を以下のプライマー
を用いてPCRにより増幅した。 HCF2-F2K; 5'-TCGAGGTACCGTGAGAACAAGACAGAGAATGAGGGAG
G-3'（配列番号２） HCF2-R2K; 5'-TCGAGGTACCTAATGCAGAGGCTCTTTGGTGTACTTG
G-3'（配列番号３） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、68℃15分を35サ
イクル行った。PCR産物をプロテネースK（ギブコ）処理
した後，CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）でゲル
濾過した。その後,制限酵素KpnI（ベーリンガー）で切
断しCHROMA SPIN-TE1000（クローンテック）でゲル濾過
した。このPCR断片をプラスミドpBluescriptIIのKpnI部
位にクローニングした（pHCF2）。次に，カセットベク
ターploxPHygから制限酵素KpnIとNotI（ベーリンガー）
でloxPを含むDNA断片を切り出し平滑末端化後，プラス
ミドpHCF2のSnaBI部位にクローニングした。LoxP配列の
方向がクローニングしたHCF2遺伝子断片と同方向のもの
を(F)、逆方向のものを(R)とした[pHCF2loxPHyg(F),
(R)、図4、5]。(Example 2) Targeting vector pHCF2
Preparation of loxPHyg (F), (R) The targeting vector pHCF2loxPHyg (F), (R) for inserting the loxP sequence into the HCF2 locus (the extreme centromere side of the Igλ region) on human chromosome 22 was prepared as follows. Produced. Since it is unknown whether the transcription direction of the HCF2 gene is centromere → telomere or telomere → centromere, (F),
(R) bidirectional targeting vector was prepared. First, the genomic region of the human HCF2 locus was amplified by PCR using the following primers. HCF2-F2K; 5'-TCGAGGTACCGTGAGAACAAGACAGAGAATGAGGGAG
G-3 '(SEQ ID NO: 2) HCF2-R2K; 5'-TCGAGGTACCTAATGCAGAGGCTCTTTGGTGTACTTG
G-3 '(SEQ ID NO: 3) PCR was a thermal cycler manufactured by Perkin-Elmer G
eneAmp9600 was used, Taq polymerase used was LA Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, then 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 15 minutes. After the PCR product was treated with proteinase K (Gibco), it was subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE400 (Clontech). Thereafter, the cells were cut with a restriction enzyme KpnI (Boehringer) and subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE1000 (Clontech). This PCR fragment was cloned into the KpnI site of plasmid pBluescriptII (pHCF2). Next, the restriction enzymes KpnI and NotI (Boehringer) from the cassette vector ploxPHyg
The DNA fragment containing loxP was cut out and blunt-ended, and then cloned into the SnaBI site of plasmid pHCF2. The direction of the LoxP sequence was the same as that of the cloned HCF2 gene fragment (F), and the reverse direction was (R) (pHCF2loxPHyg (F),
(R), FIGS. 4, 5].
【００８６】（実施例3）ターゲティングベクターpRNR2
loxPbsrの作製 ヒト１４番染色体上のRNR2遺伝子座にloxP配列を挿入す
るためのターゲティングベクターpRNR2loxPbsrを以下の
ようにして作製した。まず、ヒトRNR2遺伝子座のゲノム
領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。 RNR2-F10E; 5'-TCGAGAATTCAGTAGCTGGCACTATCTTTTTGGCCA
TC-3'（配列番号４） RNR2-R10E; 5'-TCGAGAATTCGGAGAAAGAACACACAAGGACTCGGT
C-3'（配列番号５） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、68℃15分を35サ
イクル行った。PCR産物をプロテネースK（ギブコ）処理
した後，CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）でゲル
濾過した。その後,制限酵素EcoRI（ベーリンガー）で切
断しCHROMA SPIN-TE1000（クローンテック）でゲル濾過
した。一方，プラスミドpBluescriptIIのKpnI部位を制
限酵素KpnI（ベーリンガー）で切断後、平滑化・セルフ
ライゲーションすることにより欠失し、さらにNotI部位
にSrfIリンカーを挿入したプラスミドベクター[pBS(K)S
r]を作製した。尚，SrfIリンカーには以下の配列のオリ
ゴDNAを用いた。 SrfIリンカー; 5'-GCCCGGGC-3'（配列番号６） プラスミド[pBS(K)Sr]のEcoRI部位に上記のRNR2遺伝子P
CR断片をクローニングすることでプラスミドpRNR2を作
製した。一方，カセットベクターploxPbsrのSfiI部位に
KpnIリンカー（宝酒造）を挿入し，制限酵素KpnI（ベー
リンガー）でloxP配列を含むDNA断片を切り出し，プラ
スミドpRNR2のKpnI部位にクローニングした。RNR2遺伝
子はテロメア→セントロメア方向に転写される（R.G.Wo
rtonら、SCIENCE, 239:64-68, 1988）ことが報告されて
いるので，クローニングしたRNR2遺伝子PCR断片の方向
とloxP配列の方向とが逆向きのものをターゲティングベ
クターとして用いた（pRNR2loxPbsr、図6）。Example 3 Targeting Vector pRNR2
Preparation of loxPbsr A targeting vector pRNR2loxPbsr for inserting a loxP sequence into the RNR2 locus on human chromosome 14 was prepared as follows. First, the genomic region of the human RNR2 locus was amplified by PCR using the following primers. RNR2-F10E; 5'-TCGAGAATTCAGTAGCTGGCACTATCTTTTTGGCCA
TC-3 '(SEQ ID NO: 4) RNR2-R10E; 5'-TCGAGAATTCGGAGAAAGAACACACAAGGACTCGGT
C-3 ′ (SEQ ID NO: 5) PCR was performed by using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600 was used, Taq polymerase used was LA Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, then 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 15 minutes. After the PCR product was treated with proteinase K (Gibco), it was subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE400 (Clontech). Then, it was cut with restriction enzyme EcoRI (Boehringer) and gel-filtered with CHROMA SPIN-TE1000 (Clontech). On the other hand, after cutting the KpnI site of the plasmid pBluescriptII with the restriction enzyme KpnI (Boehringer), the plasmid vector was deleted by blunting and self-ligation, and further a SrfI linker was inserted into the NotI site.
r] was prepared. The oligo DNA having the following sequence was used for the SrfI linker. SrfI linker; 5′-GCCCGGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 6) The above-mentioned RNR2 gene P was inserted into the EcoRI site of plasmid [pBS (K) Sr].
Plasmid pRNR2 was prepared by cloning the CR fragment. On the other hand, in the SfiI site of the cassette vector ploxPbsr
A KpnI linker (Takara Shuzo) was inserted, a DNA fragment containing the loxP sequence was cut out with a restriction enzyme KpnI (Boehringer), and cloned into the KpnI site of plasmid pRNR2. RNR2 gene is transcribed from telomere to centromere (RGWo
rton et al., SCIENCE, 239: 64-68, 1988), so that the direction of the cloned RNR2 gene PCR fragment and the direction of the loxP sequence were used as the targeting vector (pRNR2loxPbsr, FIG. 6).
【００８７】（実施例4）ターゲティングベクターpYHZl
oxPHygの作製 ヒト２番染色体上のyWHZ30-4（J.B.-Kupersら，Gene 19
1:173, 1997）ゲノム領域（Igλ領域の極セントロメア
側に位置）にloxP配列を挿入するためのターゲティング
ベクターpYHZloxPHygを以下のようにして作製した。ま
ず、ヒトyWHZ30-4ゲノム領域を以下のプライマーを用い
てPCRにより増幅した。 YHZ-F2B; 5'-TCGAGGATCCGATAGAGAGATTGTCTTAAATGGGTGGG
-3'（配列番号７） YHZ-R2B; 5'-TCGAGGATCCAACAGCTGGAACTCATAAAAGCATAGC-
3'（配列番号８） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、68℃15分を35サ
イクル行った。PCR産物をプロテネースK（ギブコ）処理
した後，CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）でゲル
濾過した。その後,制限酵素BamHI（ベーリンガー）で切
断しCHROMA SPIN-TE1000（クローンテック）でゲル濾過
した。一方，プラスミドpBluescriptIIのNotI部位を制
限酵素NotI（ベーリンガー）で切断後、平滑化・セルフ
ライゲーションすることにより欠失し、さらにSacII部
位にSrfIリンカーを挿入したプラスミドベクター[pBS
(N)Sr]を作製した。プラスミド[pBS(N)Sr]のBamHI部位
に上記のyWHZ30-4ゲノム領域PCR断片をクローニングす
ることでプラスミドpYHZを作製した。このプラスミドを
制限酵素Tth111I（宝酒造）で切断・平滑後、NotIリン
カー（宝酒造）を挿入した（pYHZN）。一方，カセット
ベクターploxPHygのKpnI部位にNotIリンカー（宝酒造）
を挿入し，制限酵素NotI（ベーリンガー）でloxP配列を
含むDNA断片を切り出し，プラスミドpYHZNのNotI部位に
クローニングした。yWHZ30-4のシークエンスの方向はテ
ロメア→セントロメア方向であることが判明しているの
で（J.B.-Kupersら，Gene 191:173, 1997），クローニ
ングしたyWHZ30-4ゲノムPCR断片の方向とloxP配列の方
向とが逆向きのものをターゲティングベクターとして用
いた（pYHZloxPHyg、図7）。Example 4 Targeting Vector pYHZl
Preparation of oxPHyg yWHZ30-4 on human chromosome 2 (JB-Kupers et al., Gene 19
1: 173, 1997) A targeting vector pYHZloxPHyg for inserting the loxP sequence into the genomic region (located on the extreme centromere side of the Igλ region) was prepared as follows. First, the human yWHZ30-4 genomic region was amplified by PCR using the following primers. YHZ-F2B; 5'-TCGAGGATCCGATAGAGAGATTGTCTTAAATGGGTGGG
-3 '(SEQ ID NO: 7) YHZ-R2B; 5'-TCGAGGATCCAACAGCTGGAACTCATAAAAGCATAGC-
3 ′ (SEQ ID NO: 8) PCR was performed using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600 was used, Taq polymerase used was LA Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, then 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 15 minutes. After the PCR product was treated with proteinase K (Gibco), it was subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE400 (Clontech). Thereafter, the cells were cut with a restriction enzyme BamHI (Boehringer) and subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE1000 (Clontech). On the other hand, after cutting the NotI site of the plasmid pBluescriptII with the restriction enzyme NotI (Boehringer), the plasmid was deleted by blunting and self ligation, and a plasmid vector [pBS
(N) Sr]. Plasmid pYHZ was prepared by cloning the above-described yWHZ30-4 genomic region PCR fragment into the BamHI site of plasmid [pBS (N) Sr]. This plasmid was digested with restriction enzyme Tth111I (Takara Shuzo) and blunted, and then a NotI linker (Takara Shuzo) was inserted (pYHZN). On the other hand, a NotI linker (Takara Shuzo) at the KpnI site of the cassette vector ploxPHyg
And a DNA fragment containing the loxP sequence was cut out with a restriction enzyme NotI (Boehringer) and cloned into the NotI site of plasmid pYHZN. Since the sequence direction of yWHZ30-4 has been found to be the telomere → centromere direction (JB-Kupers et al., Gene 191: 173, 1997), the direction of the cloned yWHZ30-4 genomic PCR fragment and the direction of the loxP sequence Were used as targeting vectors (pYHZloxPHyg, FIG. 7).
【００８８】（実施例5）カセットベクターpTELPuroの
作製 ヒト染色体上にヒトテロメア配列を挿入するためのカセ
ットベクターpTELPuroを以下のようにして作製した。ヒ
トテロメア配列は、J.J.Harringtonら（NatureGnet., 1
5, 345-355, 1997）にならってPCRにより合成し、プラ
スミドpBluescript II SK(-)（東洋紡）のEcoRV部位に
クローニングした（pTEL）。次にプラスミドpGKPuro（W
HITEHEAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Lairdから分与、例
えば，M.Tanigichiら、Nucleic Acid Res., 26:679, 19
98）のEcoRI部位をNotI部位に変え，制限酵素NotI（ベ
ーリンガー）で切り出したDNA断片（ピューロマイシン
耐性遺伝子カセット）をプラスミドpTELのNotI部位にク
ローニングした（pTELPuro、図8）。Example 5 Preparation of Cassette Vector pTELPuro A cassette vector pTELPuro for inserting a human telomere sequence on a human chromosome was prepared as follows. The human telomere sequence is described in JJ Harrington et al. (NatureGnet., 1
5, 345-355, 1997) and cloned into the EcoRV site of plasmid pBluescript II SK (-) (Toyobo) (pTEL). Next, plasmid pGKPuro (W
Dispensed from HITEHEAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Laird, for example, M. Tanigichi et al., Nucleic Acid Res., 26: 679, 19
98) was replaced with a NotI site, and a DNA fragment (puromycin resistance gene cassette) cut out with a restriction enzyme NotI (Boehringer) was cloned into the NotI site of plasmid pTEL (pTELPuro, FIG. 8).
【００８９】（実施例6）ターゲティングベクターpTELP
uroCD8A(F),(R)の作製 ヒト２番染色体上のCD8A遺伝子座（Igλ領域の極テロメ
ア側に位置）にヒトテロメア配列を挿入するためのター
ゲティングベクターpTELPuroCD8A(F),(R)を以下のよう
にして作製した。CD8A遺伝子の転写方向がセントロメア
→テロメアか、テロメア→セントロメアかが不明のた
め、 (F), (R)の２方向のターゲティングベクターを作
製した。まず、ヒトCD8A遺伝子座のゲノム領域を以下の
プライマーを用いてPCRにより増幅した。Example 6 Targeting Vector pTELP
Preparation of uroCD8A (F), (R) A targeting vector pTELPuroCD8A (F), (R) for inserting a human telomere sequence into the CD8A locus on human chromosome 2 (located on the extreme telomere side of the Igλ region) It was produced as described above. Since it is unknown whether the transcription direction of the CD8A gene is centromere → telomere or telomere → centromere, two-way targeting vectors (F) and (R) were prepared. First, the genomic region of the human CD8A locus was amplified by PCR using the following primers.
【００９０】CD8A-F; 5'-TCGAGGATCCCTTTAGTGAAGGCAAAG
GAAGGGACACTC-3'（配列番号９） CD8A-R; 5'-TCGAGGATCCTGTAAAGGGGTAGCCTGTCCTCTTTCATG
-3'（配列番号１０） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、65℃10分を35サ
イクル行った。PCR産物をプロテネースK（ギブコ）処理
した後，CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）でゲル
濾過した。その後,制限酵素BamHI（ベーリンガー）で切
断しCHROMA SPIN-TE1000（クローンテック）でゲル濾過
した。このPCR断片をプラスミドpTELPuroのBamHI部位に
クローニングした。クローニングされたCD8Aゲノム断片
がヒトテロメア配列と同方向のものを(F)、逆方向のも
のを(R)とした[pTELPuroCD8A(F),(R)、図9，10]。CD8A-F; 5'-TCGAGGATCCCTTTAGTGAAGGCAAAG
GAAGGGACACTC-3 '(SEQ ID NO: 9) CD8A-R; 5'-TCGAGGATCCTGTAAAGGGGTAGCCTGTCCTCTTTCATG
-3 '(SEQ ID NO: 10) PCR was performed by using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600 was used, Taq polymerase used was LA Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, then 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 65 ° C. for 10 minutes. After the PCR product was treated with proteinase K (Gibco), it was subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE400 (Clontech). Thereafter, the cells were cut with a restriction enzyme BamHI (Boehringer) and subjected to gel filtration with CHROMA SPIN-TE1000 (Clontech). This PCR fragment was cloned into the BamHI site of plasmid pTELPuro. The cloned CD8A genomic fragment was designated as (F) in the same direction as the human telomere sequence and (R) in the opposite direction [pTELPuroCD8A (F), (R), FIGS. 9, 10].
【００９１】（実施例7）ニワトリDT-40細胞中でのloxP
Hygカセットのヒト２２番染色体上への部位特異的挿入 LIF遺伝子座でテロメアトランケーションしたヒト２２
番染色体断片を保持するニワトリDT-40細胞（黒岩ら、N
ucleic Acid Research, 26:3447-3448, 1998）に上記
（実施例2）で作製したターゲティングベクターpHCF2lo
xPHyg(F), (R)をトランスフェクションし、HCF2遺伝子
座にloxPHygカセットを挿入することを試みた。(Example 7) loxP in chicken DT-40 cells
Site-specific insertion of the Hyg cassette on human chromosome 22 Human 22 telomerized at the LIF locus
Chicken DT-40 cells harboring a chromosome fragment (Kuroiwa et al., N
ucleic Acid Research, 26: 3447-3448, 1998) in the targeting vector pHCF2lo prepared in the above (Example 2).
We transfected xPHyg (F), (R) and tried to insert the loxPHyg cassette into the HCF2 locus.
【００９２】ニワトリDT-40細胞の培養は10%ウシ胎児血
清（ギブコ、以下FBSで記す）、1%ニワトリ血清（ギブ
コ）、10-4M 2-メルカプトエタノール（シグマ）を添加
したRPMI1640培地（ギブコ）中で行った。約107個の細
胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し，0.5 mlの無添加
RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotI（ベーリンガー）
で線状化したターゲティングベクターpHCF2loxPHyg(F),
(R)を25-30 μg加え，エレクトロポレーション用のキ
ュベット（バイオラッド）に移し，室温で10分間静置し
た。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセ
ットし、550V, 25 μFの条件で電圧印加した。室温で10
分間静置後，24時間培養した。24時間後、ハイグロマイ
シンB（1 mg/ml）を含む培地に交換し，96穴培養プレー
ト５枚に分注して約２週間の選択培養を行った。ハイグ
ロマイシンB耐性クローンからPuregene DNA Isolation
Kit（Gentra System社）を用いてゲノムDNAを抽出し
た。ゲノムDNAを制限酵素HpaIとXhoI（ベーリンガー）
で切断し，0.8%アガロースゲル中で電気泳動し、ニトロ
セルロースフィルター（DuPont社）へアルカリブロッテ
ィングした。このフィルターに対してHCF2プローブを用
いてサザンハイブリダイゼーションを行い，相同組換え
体の同定を行った。HCF2プローブの作製は以下のプライ
マーを用いてヒトゲノムを鋳型としてPCRを行い，そのP
CR産物を鋳型にしてランダムプライミングによる32P標
識DNAプローブを作製した（アマシャム、添付のプロト
コールに従った）。The culture of chicken DT-40 cells was performed using an RPMI1640 medium (supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco, hereinafter referred to as FBS), 1% chicken serum (Gibco) and 10 -4 M 2-mercaptoethanol (Sigma)). Gibco) went inside. Wash approximately 10 7 cells once with RPMI1640 medium without supplements
Suspended in RPMI1640 medium, restriction enzyme NotI (Boehringer)
Targeting vector pHCF2loxPHyg (F),
(R) was added in an amount of 25 to 30 μg, transferred to a cuvette (Bio-Rad) for electroporation, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The cuvette was set in a Gene Pulser (Bio-Rad), and a voltage was applied at 550 V and 25 μF. 10 at room temperature
After standing for minutes, the cells were cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was replaced with a medium containing hygromycin B (1 mg / ml), dispensed into five 96-well culture plates, and subjected to selective culture for about 2 weeks. Puregene DNA Isolation from hygromycin B resistant clones
Genomic DNA was extracted using Kit (Gentra System). Genomic DNA with restriction enzymes HpaI and XhoI (Boehringer)
And electrophoresed in a 0.8% agarose gel, followed by alkali blotting on a nitrocellulose filter (DuPont). Southern hybridization was performed on this filter using the HCF2 probe to identify homologous recombinants. The HCF2 probe was prepared by PCR using the following primers and the human genome as a template.
Using the CR product as a template, a 32 P-labeled DNA probe was prepared by random priming (Amersham, according to the attached protocol).
【００９３】HCF2-F4; 5'-CACATGACAAGAGCTCAGCG-3'
（配列番号１１） HCF2-R4; 5'-TCTGACTTCCTCATGAGAGCC-3'（配列番号１
２） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、65℃30秒、72℃
1分を35サイクル行った。ターゲティングベクターpHCF2
loxPHyg(F)の場合，非相同組換え体では>20 kb、相同組
換え体では8.7 kbのバンドが検出される。ターゲティン
グベクターpHCF2loxPHyg (R)の場合，非相同組換え体で
は>20 kb、相同組換え体では9.5 kbのバンドが検出され
る（図4，5）。サザンハイブリダイゼーションの結果，
ターゲティングベクターpHCF2loxPHyg(F)においては52
クローン中41クローン, (R)においては60クローン中28
クローンが目的の相同組換え体であった（それぞれHF,
HRクローンと呼ぶ）。HCF2-F4; 5'-CACATGACAAGAGCTCAGCG-3 '
(SEQ ID NO: 11) HCF2-R4; 5′-TCTGACTTCCTCATGAGAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 1
2) PCR was performed using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600, Taq polymerase used was Ex Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. Temperature and cycle conditions are as follows: heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C
One minute was performed for 35 cycles. Targeting vector pHCF2
In the case of loxPHyg (F), a band of> 20 kb is detected in the heterologous recombinant, and a band of 8.7 kb is detected in the homologous recombinant. In the case of the targeting vector pHCF2loxPHyg (R), a band of> 20 kb is detected in the heterologous recombinant and a band of 9.5 kb is detected in the homologous recombinant (FIGS. 4 and 5). As a result of Southern hybridization,
52 in the targeting vector pHCF2loxPHyg (F)
41 out of clones, 28 out of 60 clones in (R)
Clones were homologous recombinants of interest (HF,
HR clone).
【００９４】（実施例8）ニワトリDT-40細胞中でのloxP
bsrカセットのヒト14番染色体上への部位特異的挿入 WO98/37757に記載された方法で作製されたヒト１４番染
色体断片SC20を保持するニワトリDT-40細胞に上記（実
施例3）で作製したターゲティングベクターpRNR2loxPbs
rをトランスフェクションし、RNR2遺伝子座にloxPbsrカ
セットを挿入することを試みた。Example 8 loxP in chicken DT-40 cells
Site-Specific Insertion of the bsr Cassette on Human Chromosome 14 The above-described (Example 3) was prepared in chicken DT-40 cells carrying the human chromosome 14 fragment SC20 prepared by the method described in WO98 / 37757. Targeting vector pRNR2loxPbs
r, and attempted to insert the loxPbsr cassette into the RNR2 locus.
【００９５】上記と同様にして、制限酵素SrfI（東洋
紡）で線状化したターゲティングベクターpRNR2loxPbsr
をトランスフェクションし、ブラストサイジンS（10 μ
g/ml）存在下で約２週間選択培養した。耐性クローンか
らゲノムDNAを抽出して以下のプライマーを用いてPCRに
より相同組換え体の同定を行った（図6）。 RNR2-1; 5'-TGGATGTATCCTGTCAAGAGACC-3'（配列番号１
３） STOP-3; 5'-CAGACACTCTATGCCTGTGTGG-3'（配列番号１
４） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、65℃5分を35サ
イクル行った。この結果，60クローン中8クローンにお
いて予想通りの約2.5 kbのPCR産物が増幅され，相同組
換え体が得られた（Rクローンと呼ぶ）。In the same manner as described above, the targeting vector pRNR2loxPbsr linearized with the restriction enzyme SrfI (Toyobo)
Transfected and blasticidin S (10 μl
g / ml) for about 2 weeks. Genomic DNA was extracted from the resistant clones, and homologous recombinants were identified by PCR using the following primers (FIG. 6). RNR2-1; 5'-TGGATGTATCCTGTCAAGAGACC-3 '(SEQ ID NO: 1
3) STOP-3; 5'-CAGACACTCTATGCCTGTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 1)
4) PCR was performed by using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600 was used, Taq polymerase used was LA Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: 35 cycles of heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds and 65 ° C for 5 minutes As a result, a PCR product of about 2.5 kb was amplified as expected in 8 of the 60 clones, and a homologous recombinant was obtained (referred to as R clone).
【００９６】（実施例9）ニワトリDT-40細胞中でのヒト
２番染色体の部位特異的切断 WO98/37757に記載された方法で作製されたヒト２番染色
体全長を保持するニワトリDT-40細胞に上記（実施例6）
で作製したターゲティングベクターpTELPuroCD8A(F),
(R)をトランスフェクションし、CD8A遺伝子座にヒトテ
ロメア配列を挿入することによって、その挿入部位で２
番染色体を切断することを試みた。Example 9 Site-Specific Cleavage of Human Chromosome 2 in Chicken DT-40 Cells Chicken DT-40 cells having the full length human chromosome 2 prepared by the method described in WO98 / 37757 Above (Example 6)
The targeting vector pTELPuroCD8A (F), prepared in
(R) and the insertion of the human telomere sequence at the CD8A locus
Tried to cut chromosome 7.
【００９７】上記と同様にして、制限酵素SrfI（東洋
紡）で線状化したターゲティングベクターpTELPuroCD8A
(F), (R)をトランスフェクションし、ピューロマイシ
（0.3 μg/ml）存在下で約２週間選択培養した。耐性ク
ローンからゲノムDNAを抽出して以下のプライマーを用
いてPCRにより相同組換え体の同定を行った（図9、1
0）。 ターゲティングベクターpTELPuroCD8A(F)用 CD8A-3; 5'-GCCCTCATGGAAATCTCCTGGG-3'（配列番号１
５） CDPuro-1; 5'-GCAGCAACAGATGGAAGGCCTC-3'（配列番号１
６） ターゲティングベクターpTELPuroCD8A (R)用 CD8A-2; 5'-GAACAGAAAGCCACTCTTGCTTTCCAT-3'（配列番
号１７） CDPuro-2; 5'-ACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCAC-3'（配列番
号１８） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、68℃10分を35サ
イクル行った。この結果，(F)においては95クローン中
２クローン、 (R)においては160クローン中２クローン
で予想通りのPCR産物が増幅され，相同組換え体が得ら
れた（それぞれCD, CRクローンと呼ぶ）。In the same manner as described above, the targeting vector pTELPuroCD8A linearized with the restriction enzyme SrfI (Toyobo)
(F) and (R) were transfected and selectively cultured for about 2 weeks in the presence of puromyci (0.3 μg / ml). Genomic DNA was extracted from the resistant clones, and homologous recombinants were identified by PCR using the following primers (FIGS. 9, 1).
0). CD8A-3 for targeting vector pTELPuroCD8A (F); 5'-GCCCTCATGGAAATCTCCTGGG-3 '(SEQ ID NO: 1
5) CDPuro-1; 5'-GCAGCAACAGATGGAAGGCCTC-3 '(SEQ ID NO: 1)
6) CD8A-2 for targeting vector pTELPuroCD8A (R); 5'-GAACAGAAAGCCACTCTTGCTTTCCAT-3 '(SEQ ID NO: 17) CDPuro-2; 5'-ACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCAC-3' (SEQ ID NO: 18) PCR is a Perkin-Elmer as a thermal cycler. Company G
eneAmp9600 was used, Taq polymerase used was LA Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation was performed at 94 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 10 minutes. As a result, the expected PCR products were amplified in 2 out of 95 clones in (F) and 2 out of 160 clones in (R), and homologous recombinants were obtained (referred to as CD and CR clones, respectively). ).
【００９８】次に，相同組換え体CD, CRクローンにおい
て、CD8A遺伝子座で２番染色体の切断が起こっているか
否かをPCR及びFISH解析によって調べた。 （１）PCR解析 ２番染色体上の遺伝子及び多型マーカの存在（図11）を
以下のプライマーを用いてPCRにより検出した。D2S373,
D2S113, D2S388, D2S1331, D2S134, D2S171, TPO検出
用のプライマーはBIOS社のものを用いた。 Vκ3検出用プライマー Vκ3-F; 5'-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA-3'（配列番号１９） Vκ3-R; 5'-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC-3'（配列番号２
０） Cκ検出用プライマー Cκ-F; 5'-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3'（配列番号２１） Cκ-R; 5'-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3'（配列番号２
２） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、56-60℃30秒、7
2℃30秒を35サイクル行った。結果を図11に示した。ヒ
ト２番染色体全長を保持するDT-40細胞クローン521D4に
おいては、全てのマーカが検出されているのに対して、
相同組換え体CDクローン（CD10）においては、CD8Aより
もテロメア側に位置するマーカは全て消失していた。一
方，相同組換え体CRクローンにおいては、全てのマーカ
が検出された。Next, in the homologous recombinant CD and CR clones, whether or not chromosome 2 was cut at the CD8A locus was examined by PCR and FISH analysis. (1) PCR analysis The presence of the gene and polymorphic marker on chromosome 2 (FIG. 11) was detected by PCR using the following primers. D2S373,
Primers for detection of D2S113, D2S388, D2S1331, D2S134, D2S171, and TPO used were BIOS's. Vκ3 detection primer Vκ3-F; 5′-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 19) Vκ3-R; 5′-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
0) Cκ detection primer Cκ-F; 5′-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 21) Cκ-R; 5′-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
2) PCR was performed using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600, Taq polymerase used was Ex Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds, 56-60 ° C for 30 seconds,
35 cycles of 30 seconds at 2 ° C were performed. The results are shown in FIG. In DT-40 cell clone 521D4, which retains the full length of human chromosome 2, all markers are detected,
In the homologous recombinant CD clone (CD10), all markers located on the telomere side from CD8A had disappeared. On the other hand, all markers were detected in the homologous recombinant CR clone.
【００９９】（２）FISH解析 ヒト２番染色体がCD8A遺伝子座で切断されていることを
視覚的に判断するためにターゲティングベクター中のピ
ューロマイシン耐性遺伝子を検出できるpGKPuroプロー
ブを用いたFISHを行った(図12)。方法は黒岩ら（Nuclei
c Acid Research, 26:3447-3448, 1998）に従った。COT
1染色（ローダミン標識、赤色）により、521D4と比較し
てCDクローン（CD10）では、２番染色体が断片化してい
ることが分かる。さらに、pGKPuroプローブ由来のシグ
ナル（FITC標識、黄色）がテロメア一端に検出された。
このことはターゲティングベクターが挿入されたCD8A遺
伝子座が２番染色体断片のテロメア一端になっているこ
とを示している。また、CRクローンにおいては、pGKPur
oプローブ由来のシグナルが2p12に認められ，全く断片
化が起こっていないことが判明した。(2) FISH Analysis In order to visually determine that human chromosome 2 was cleaved at the CD8A locus, FISH using a pGKPuro probe capable of detecting a puromycin resistance gene in a targeting vector was performed. (FIG. 12). The method is Kuroiwa et al. (Nuclei
c Acid Research, 26: 3447-3448, 1998). COT
One staining (rhodamine label, red) shows that chromosome 2 is fragmented in the CD clone (CD10) as compared to 521D4. Furthermore, a signal (FITC label, yellow) derived from the pGKPuro probe was detected at one end of the telomere.
This indicates that the CD8A locus into which the targeting vector was inserted is at the telomere end of the chromosome 2 fragment. In the CR clone, pGKPur
o A signal derived from the probe was observed at 2p12, indicating that no fragmentation had occurred.
【０１００】以上の結果から、相同組換え体CDクローン
において、ヒト２番染色体がCD8A遺伝子座で切断されて
いると結論できた。また、CRクローンでは切断化が起こ
らなかったことからCD8A遺伝子の転写方向はセントロメ
ア→テロメアであると考えられる。このように、転写方
向の不明な遺伝子座において、今回のように両方向でテ
ロメアトランケーションをすることで転写方向を決定す
ることにも応用できる。From the above results, it was concluded that the human chromosome 2 was cut at the CD8A locus in the homologous recombinant CD clone. Further, since no cleavage occurred in the CR clone, the transcription direction of the CD8A gene is considered to be centromere → telomere. Thus, at a locus whose transcription direction is unknown, the present invention can be applied to determining the transcription direction by performing telomere truncation in both directions as in the present case.
【０１０１】（実施例10）ニワトリDT-40細胞中でのlox
PHygカセットのヒト２番染色体上への部位特異的挿入 上記（実施例）で得られたCD8A遺伝子座でテロメアトラ
ンケーションしたヒト２番染色体断片を保持するニワト
リDT-40細胞CDクローンに上記（実施例）で作製したタ
ーゲティングベクターpYHZloxPHygをトランスフェクシ
ョンし、yWHZ30-4ゲノム領域にloxPHygカセットを挿入
することを試みた。(Example 10) Lox in chicken DT-40 cells
Site-specific insertion of the PHyg cassette on human chromosome 2 The chicken DT-40 cell CD clone carrying the human chromosome 2 fragment obtained by telomere truncation at the CD8A locus obtained in the above (Example) was prepared as described above (Example ) Was transfected with the targeting vector pYHZloxPHyg, and insertion of the loxPHyg cassette into the yWHZ30-4 genomic region was attempted.
【０１０２】上記と同様にして、制限酵素SrfI（東洋
紡）で線状化したターゲティングベクターpYHZloxPHyg
をトランスフェクションし、ハイグロマイシンB（1 mg/
ml）存在下で約２週間選択培養した。耐性クローンから
Puregene DNA Isolation Kit（Gentra System社）を用
いてゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAを制限酵素Sph I
（ベーリンガー）で切断し，0.8%アガロースゲル中で電
気泳動し、ナイロンメンブレンフィルター（DuPont社）
へアルカリブロッティングした。このフィルターに対し
てYHZプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション
を行い，相同組換え体の同定を行った。YHZプローブの
作製は以下のプライマーを用いてヒトゲノムを鋳型とし
てPCRを行い，そのPCR産物を鋳型にしてランダムプライ
ミングによる 32P標識DNAプローブを作製した（アマシャ
ム、添付のプロトコールに従った）。 YHZ-FP; 5'-GTCTGGGGTTTGGAGATCTG-3'（配列番号２３） YHZ-RP; 5'-ATCCCATTCATAAGGGCTCG-3'（配列番号２４） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、57℃30秒、72℃
1分を35サイクル行った。非相同組換え体では11.5 kb、
相同組換え体では7.9 kbのバンドが検出される(図7)。
サザンハイブリダイゼーションの結果， 95クローン中1
クローンが目的の相同組換え体であった（Yクローンと
呼ぶ）。In the same manner as described above, the restriction enzyme SrfI (Toyo
Targeting vector pYHZloxPHyg linearized by
And transfected with hygromycin B (1 mg /
ml) for about 2 weeks. From resistant clones
Use Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System)
And extracted genomic DNA. Genomic DNA with restriction enzyme Sph I
(Boehringer) and run in 0.8% agarose gel.
Electrophoresis, nylon membrane filter (DuPont)
Alkaline blotting was performed. For this filter
Hybridization using YHZ probe
And homologous recombinants were identified. YHZ probe
Using the following primers and the human genome as a template,
PCR, and use the PCR product as a template for random priming.
By mining 32P-labeled DNA probe was prepared (Amasha
According to the attached protocol). YHZ-FP; 5'-GTCTGGGGTTTGGAGATCTG-3 '(SEQ ID NO: 23) YHZ-RP; 5'-ATCCCATTCATAAGGGCTCG-3' (SEQ ID NO: 24) PCR is a thermal cycler G
eneAmp9600, Taq polymerase Ex Taq (Takara Shuzo)
Buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
The attached one was used according to the recommended conditions. Temperature, cycle
The conditions are heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds, 57 ° C for 30 seconds, 72 ° C.
One minute was performed for 35 cycles. 11.5 kb for heterologous recombinants,
In the homologous recombinant, a band of 7.9 kb is detected (FIG. 7).
As a result of Southern hybridization, 1 out of 95 clones
The clone was the homologous recombinant of interest (Y clone and
Call).
【０１０３】（実施例11）ヒト抗体重鎖遺伝子クラスタ
ーとλ軽鎖遺伝子クラスターの両方を有するヒト人工染
色体λ-HACの構築 一般記載で記したように，マウス中でより安定にかつ効
率良く完全なヒト抗体を発現させるために、HCF2-Igλ-
LIFから成るヒト２２番染色体断片を、ヒトIgHを含む１
４番染色体断片SC20上のRNR2遺伝子座に転座させること
によって、ヒト抗体重鎖遺伝子クラスターとλ軽鎖遺伝
子クラスターの両方を有するヒト人工染色体λ-HACを構
築することを試みた。Example 11 Construction of Human Artificial Chromosome λ-HAC Having Both Human Antibody Heavy Chain Gene Cluster and λ Light Chain Gene Cluster As described in the general description, more stably and efficiently in mice. HCF2-Igλ-
The human chromosome 22 fragment consisting of LIF was
An attempt was made to construct a human artificial chromosome λ-HAC having both a human antibody heavy chain gene cluster and a λ light chain gene cluster by translocation to the RNR2 locus on chromosome 4 fragment SC20.
【０１０４】まず、最初に上記（実施例）で得られた相
同組換え体HF, HRクローンを相同組換え体Rクローンと
細胞融合することによって、ヒト２２番染色体断片と１
４番染色体断片SC20断片の両者を保持するDT-40ハイブ
リッドを作製した。 （１）ヒト２２番染色体断片と１４番染色体断片SC20断
片の両者を保持するDT-40ハイブリッドの作製 RクローンはブラストサイジンS（10 μg/ml）含有RPMI1
640培地で、HFクローンはハイグロマイシンB（1 mg/m
l）含有RPMI1640培地で培養した。1-2 x 107個の両クロ
ーンを混合し遠心後，無血清RPMI1640培地で２回洗浄し
た。残量培地を完全に取り除いた後に，予め37℃で保温
しておいた50% PEG 1500（ベーリンガー）0.5 mlを静か
に加え，約２分間ピペットで激しく混合した。その後，
無血清RPMI1640培地1 mlを１分間かけてゆっくり加え，
続いて無血清RPMI1640培地9 mlを約３分間かけて加え、
37℃で１０分間静置した。その後，1,200 rpmで５分間
遠心し、血清を含むRPMI1640培地で24-48時間培養し
た。その後，ブラストサイジンS（10μg/ml）・ハイグ
ロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地に交換し，24
穴培養プレート５枚に分注し、3-4週間培養した。同様
にして，HRクローンとRクローンも細胞融合した。HFク
ローンとRクローンとの細胞融合から得られたハイブリ
ッド（RHFクローンと呼ぶ）、HRクローンとRクローンと
の細胞融合から得られたハイブリッド（RHRクローンと
呼ぶ）からゲノムDNAを抽出して、以下のプライマーを
用いてPCRを行い，ヒト１４番、２２番染色体の２本が
保持されていることを確認した。First, the homologous recombinant HF, HR clone obtained in the above (Example) was cell-fused with the homologous recombinant R clone, whereby the human chromosome 22 fragment was
A DT-40 hybrid carrying both the chromosome 4 fragment and the SC20 fragment was prepared. (1) Preparation of DT-40 hybrid holding both human chromosome 22 fragment and SC14 fragment SC20 fragment The R clone was RPMI1 containing blasticidin S (10 μg / ml).
In 640 medium, the HF clone was hygromycin B (1 mg / m
l) The cells were cultured in the containing RPMI1640 medium. After 1-2 × 10 7 clones were mixed and centrifuged, they were washed twice with serum-free RPMI1640 medium. After the residual medium was completely removed, 0.5 ml of 50% PEG 1500 (Boehringer) pre-warmed at 37 ° C. was gently added, and mixed vigorously with a pipette for about 2 minutes. afterwards,
Add 1 ml of serum-free RPMI1640 medium slowly over 1 minute,
Subsequently, 9 ml of serum-free RPMI1640 medium was added over about 3 minutes,
The mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. Then, the mixture was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and cultured in RPMI1640 medium containing serum for 24-48 hours. Then, the medium was replaced with RPMI1640 medium containing blasticidin S (10 μg / ml) and hygromycin B (1 mg / ml).
The mixture was dispensed into five well culture plates and cultured for 3-4 weeks. Similarly, the HR and R clones were also fused. Genomic DNA was extracted from the hybrid obtained from the cell fusion of the HF clone and the R clone (referred to as RHF clone) and the hybrid obtained from the cell fusion of the HR clone and the R clone (referred to as the RHR clone). PCR was performed using the above primers to confirm that two human chromosomes 14 and 22 were retained.
【０１０５】ヒト１４番染色体検出用プライマー VH3-F; 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3'（配列番号２５） VH3-R; 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3'（配列番号２６） ヒト２２番染色体検出用プライマー Igλ-F; 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3'（配列番号２
７） Igλ-R; 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3'（配列番号２
８） PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のG
eneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を
用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は
添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル
条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、56℃30秒、72℃
30秒を35サイクル行った。PCRの結果，RHFクローンは６
クローン、RHRクローンは２クローンがVH3とIgλの両方
に陽性であった。さらに、ヒトCOT1 DNAをプローブに用
いてFISHを行った結果，これらのクローンは全て２本の
ヒト染色体を独立した状態で保持していることが明らか
となった。以上の結果から、RHF, RHRハイブリッドクロ
ーンはヒト１４番、２２番染色体の２本を保持している
と判断できた。Primer for detecting human chromosome 14 VH3-F; 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3 '(SEQ ID NO: 25) VH3-R; 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3' (SEQ ID NO: 26) Primer for detecting human chromosome 22 Igλ -F; 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3 '(SEQ ID NO: 2
7) Igλ-R; 5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 2
8) PCR was performed using Perkin-Elmer G as a thermal cycler.
eneAmp9600, Taq polymerase used was Ex Taq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions are as follows: heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C
35 cycles of 30 seconds were performed. As a result of PCR, RHF clone was 6
Two clones, RHR clones, were positive for both VH3 and Igλ. Furthermore, as a result of performing FISH using human COT1 DNA as a probe, it was revealed that all of these clones maintained two human chromosomes in an independent state. From the above results, it was determined that the RHF and RHR hybrid clones retained two human chromosomes 14 and 22.
【０１０６】（２）RHF, RHRハイブリッドクローンにお
けるヒト２２番染色体断片の１４番染色体断片SC20への
部位特異的転座 (2)-1 Cre組換え酵素安定発現ベクターpBS185hisDの構
築 一般記載で記したように，ヒト染色体の部位特異的転座
はCre-loxPシステムを用いることによって行う。このシ
ステムにおいても、今回のように非相同染色体間での組
換え効率は非常に低いことが予想されるため、Cre酵素
を一過性ではなく安定発現させることを考え，以下のよ
うな発現ベクターを構築した。(2) Site-specific translocation of human chromosome 22 fragment to chromosome 14 SC20 in RHF, RHR hybrid clones (2) -1 Construction of -1 Cre recombinase stable expression vector pBS185hisD Thus, site-specific translocation of the human chromosome is performed by using the Cre-loxP system. Even in this system, the recombination efficiency between heterologous chromosomes is expected to be very low as in this case. Therefore, considering the stable and not transient expression of the Cre enzyme, the following expression vector Was built.
【０１０７】Cre組換え酵素発現ベクターpBS185（ギブ
コ）を制限酵素EcoRI（ベーリンガー）で切断し，BglII
リンカーを挿入した（pBS185Bg）。一方，ヒスチヂノー
ル耐性遺伝子カセットを含むプラスミド#1-132（京都大
学医学部 武田俊一教授より分与、例えば，M. A. Clar
kら、Mol. Biol. Evol., 16:1586, 1999）から制限酵素
BamHI（ベーリンガー）でヒスチヂノール耐性遺伝子カ
セットを切り出し，pBS185BgのBglII部位にクローニン
グした（pBS185hisD，図13）。The Cre recombinase expression vector pBS185 (Gibco) was digested with the restriction enzyme EcoRI (Boehringer) and BglII
A linker was inserted (pBS185Bg). On the other hand, plasmid # 1-132 containing the histidinol resistance gene cassette (distributed by Professor Shunichi Takeda, School of Medicine, Kyoto University, for example, MA Clar
k et al., Mol. Biol. Evol., 16: 1586, 1999).
The histinol resistance gene cassette was cut out with BamHI (Boehringer) and cloned into the BglII site of pBS185Bg (pBS185hisD, FIG. 13).
【０１０８】(2)-2 Cre-loxPシステムを用いたRHF, R
HRハイブリッドクローンにおけるヒト２２番染色体断片
の１４番染色体断片SC20への部位特異的転座 上記と同様にして、制限酵素KpnI（ベーリンガー）で線
状化したCre組換え酵素安定発現ベクターpBS185hisDをR
HF, RHRハイブリッドクローンにそれぞれトランスフェ
クションし、ヒスチヂノール（0.5 mg/ml）存在下で約
２週間選択培養した。その後，６穴培養プレート４枚に
耐性細胞集団を分注し（２４プール）、任意に２プール
を選んで約107個になるまで培養した。細胞プールを5%
FBSと1μg/mlのプロピディアムアイオダイド（PI）を添
加したPBS（リン酸緩衝溶液） 4mlに懸濁し、FACSVanta
ge（ベクトン・ディッキンソン）により解析した。前述
したように、loxP間での組換え転座が起こるとGFP遺伝
子が再構築され発現するので転座を起こした細胞をFACS
で検出できる。GFP陽性と思われる細胞画分のソーティ
ングを４回繰り返した。毎回のソーティング後の培養は
ハイグロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地で行っ
た（後述するように、アセントリック染色体を保持する
細胞を除くため）。その結果，RHFクローンからはGFP陽
性細胞を98-99%の純度で濃縮することができたが、RHR
クローンからは全く濃縮できなかった。このことは、図
14に示したようにRHFクローンにおいては２つのloxPの
方向がセントロメア→テロメアという方向で一致してお
り、転座後も正常な染色体構造になるのに対して、RHR
では２つのloxPの方向が一致していないために転座後の
染色体がセントロメアを２つ持つ染色体（dicentricchr
omosome）とセントロメアを持たない染色体（acentric
chromosome）になるため、例えば，ハイグロマイシンB
存在下では増殖できず、濃縮されないと考えられる。こ
のことから、本システムにおける転座実験の特異性を示
すことができる。因みに，このことからHCF2遺伝子はセ
ントロメア→テロメアの方向に転写されると推察でき
る。(2) -2 RHF, R using Cre-loxP system
Site-specific translocation of the human chromosome 22 fragment to the chromosome 14 fragment SC20 in the HR hybrid clone In the same manner as described above, the Cre recombinant enzyme stable expression vector pBS185hisD linearized with the restriction enzyme KpnI (Boehringer) was replaced with R
Each of the HF and RHR hybrid clones was transfected, and selectively cultured in the presence of histinol (0.5 mg / ml) for about 2 weeks. Thereafter, resistant cell population dispensed (24 pools) in four 6-well culture plates and cultured to about 10 7 to choose any two pools. 5% cell pool
The suspension was suspended in 4 ml of PBS (phosphate buffer solution) supplemented with FBS and 1 μg / ml of propidium iodide (PI).
Analyzed by ge (Becton Dickinson). As described above, when recombination translocation between loxP occurs, the GFP gene is reconstructed and expressed, so cells that have translocated
Can be detected. Sorting of the cell fractions considered to be GFP positive was repeated four times. The culture after each sort was performed in RPMI1640 medium containing hygromycin B (1 mg / ml) (to remove cells holding the acentric chromosomes, as described below). As a result, GFP-positive cells could be enriched at 98-99% purity from the RHF clone.
No enrichment was possible from the clones. This is illustrated
As shown in Fig. 14, in the RHF clone, the directions of the two loxPs were the same in the direction of centromere-> telomere.
Chromosome after translocation has two centromeres (dicentricchr
omosome) and chromosome without centromere (acentric
chromosome), for example, hygromycin B
It cannot grow in the presence and is not considered to be concentrated. From this, the specificity of the translocation experiment in the present system can be shown. Incidentally, this suggests that the HCF2 gene is transcribed in the direction of centromere to telomere.
【０１０９】次に，FACSでクローニングされたRHF由来
の２クローン（SF2-21とSF2-23と呼ぶ）において、期待
通りloxP間で組換えが起こっていることをPCRによって
確認した。SF2-21とSF2-23からゲノムDNAを抽出して以
下のプライマーを用いてPCRを行った。 PGK-1; 5'-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3'（配列番号２９） GFP-1; 5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3'（配列番号３０）Next, it was confirmed by PCR that recombination between loxP occurred in the two RHF-derived clones (referred to as SF2-21 and SF2-23) cloned by FACS as expected. Genomic DNA was extracted from SF2-21 and SF2-23, and PCR was performed using the following primers. PGK-1; 5'-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3 '(SEQ ID NO: 29) GFP-1; 5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3' (SEQ ID NO: 30)
【０１１０】PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-
Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq
（宝酒造）を用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGT
P, dTTP）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温
度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、61
℃30秒、72℃1分を35サイクル行った。図15に示すよう
に、このプライマーで約600 bpのPCR産物が得られれ
ば、loxP間で組換えが起こっていることが示唆される。
結果を図16に示した。Cre組換え酵素安定発現ベクター
をトランスフェクションしていないRHFクローンではPCR
産物が得られなかったのに対して，SF2-21とSF2-23にお
いては、約600 bpのPCR産物が得られた。さらに、SF2-2
1とSF2-23に対して，ヒト14q ter特異的プローブ（ヒト
１４番染色体長腕テロメア領域を検出、FITC標識）とpG
KPuroプローブ（ヒト２２番染色体断片の長腕テロメア
領域を検出、ローダミン標識）を用いたFISHを行った結
果，同一染色体上の両末端テロメア領域にFITCシグナル
とローダミンシグナルが検出された(図17)。また、ヒト
１４番染色体特異的プローブ（ローダミンラベル）とヒ
ト２２番染色体特異的プローブ（FITCラベル）でFISHを
行った際にも同一染色体上に両方のプローブ由来のシグ
ナルが観察された（図17）。以上の結果から，SF2-21と
SF2-23において期待通りの転座が起こり，同一染色体上
にヒト重鎖遺伝子クラスターとλ軽鎖遺伝子クラスター
の両方が含まれるヒト人工染色体λ-HACが構築されたと
結論できた。The PCR was performed using Perkin- as a thermal cycler.
Elmer GeneAmp9600, Taq polymerase is Ex Taq
(Takara Shuzo) using buffer and dNTP (dATP, dCTP, dGT
(P, dTTP) was used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds, 61
35 cycles of 30 seconds at 72 ° C and 1 minute at 72 ° C were performed. As shown in FIG. 15, when a PCR product of about 600 bp is obtained with this primer, recombination between loxP is suggested.
The results are shown in FIG. PCR for RHF clones not transfected with Cre recombinase stable expression vector
While no product was obtained, a PCR product of about 600 bp was obtained for SF2-21 and SF2-23. In addition, SF2-2
Human 14qter-specific probe (detects human chromosome 14 long arm telomere region, FITC labeling) and pG for 1 and SF2-23
As a result of performing FISH using a KPuro probe (detecting the long-arm telomere region of human chromosome 22 fragment and rhodamine labeling), a FITC signal and a rhodamine signal were detected in both terminal telomere regions on the same chromosome (FIG. 17). . Also, when FISH was performed with a human chromosome 14-specific probe (rhodamine label) and a human chromosome 22-specific probe (FITC label), signals derived from both probes were observed on the same chromosome (FIG. 17). ). From the above results, SF2-21 and
It was concluded that the translocation as expected occurred in SF2-23, and that a human artificial chromosome λ-HAC containing both the human heavy chain gene cluster and the λ light chain gene cluster was constructed on the same chromosome.
【０１１１】（実施例12）ヒト抗体重鎖遺伝子クラスタ
ーとκ軽鎖遺伝子クラスターの両方を有するヒト人工染
色体κ-HACの構築 λ-HAC構築の実施例と全く同様にして、yWHZ30-Igκ-CD
8Aから成るヒト２番染色体断片をヒトIgHを含む１４番
染色体断片SC20上のRNR2遺伝子座に転座させることによ
って、ヒト抗体重鎖遺伝子クラスターとκ軽鎖遺伝子ク
ラスターの両方を有するヒト人工染色体κ-HACを構築す
ることを試みた。Example 12 Construction of Human Artificial Chromosome κ-HAC Having Both Human Antibody Heavy Chain Gene Cluster and κ Light Chain Gene Cluster yWHZ30-Igκ-CD was prepared in exactly the same manner as in the λ-HAC construction example.
By translocating the human chromosome 2 fragment consisting of 8A to the RNR2 locus on chromosome 14 fragment SC20 containing human IgH, a human artificial chromosome κ having both a human antibody heavy chain gene cluster and a κ light chain gene cluster was transposed. -Tried to build HAC.
【０１１２】まず、最初に上記（実施例）で得られた相
同組換えYクローンを相同組換え体Rクローンと細胞融合
することによって、ヒト２番染色体断片と１４番染色体
断片SC20断片の両者を保持するDT-40ハイブリッドを作
製した。 （１）ヒト２番染色体断片と１４番染色体断片SC20断片
の両者を保持するDT-40ハイブリッッドの作製 RクローンはブラストサイジンS（10μg/ml）含有RPMI16
40培地で、YクローンはハイグロマイシンB（1 mg/ml）
含有RPMI1640培地で培養した。1-2 x 107個の両クロー
ンを混合し遠心後，無血清RPMI1640培地で２回洗浄す
る。残量培地を完全に取り除いた後に，予め37℃で保温
しておいた50% PEG 1500（ベーリンガー）0.5 mlを静か
に加え，約２分間ピペットで激しく混合した。その後，
無血清RPMI1640培地1 mlを１分間かけてゆっくり加え，
続いて無血清RPMI1640培地9 mlを約３分間かけて加え、
37℃で１０分間静置した。その後，1,200 rpmで５分間
遠心し、血清を含むRPMI1640培地で24-48時間培養し
た。その後，ブラストサイジンS（10μg/ml）・ハイグ
ロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地に交換し，24
穴培養プレート５枚に分注し、3-4週間培養した。得ら
れたハイブリッド（YRクローンと呼ぶ）からゲノムDNA
を抽出して、以下のプライマーを用いてPCRを行い，ヒ
ト１４番、２番染色体の２本が保持されていることを確
認した。First, both the human chromosome 2 fragment and the chromosome 14 SC20 fragment were fused by cell fusion of the homologous recombination Y clone obtained above (Example) with a homologous recombinant R clone. A retained DT-40 hybrid was produced. (1) Preparation of DT-40 hybrid holding both human chromosome 2 fragment and SC20 fragment SC20 fragment The R clone was RPMI16 containing blasticidin S (10 μg / ml).
In 40 medium, Y clone is hygromycin B (1 mg / ml)
The cells were cultured in the containing RPMI1640 medium. Mix and centrifuge 1-2 x 10 7 clones and wash twice with serum-free RPMI1640 medium. After the residual medium was completely removed, 0.5 ml of 50% PEG 1500 (Boehringer) pre-warmed at 37 ° C. was gently added, and mixed vigorously with a pipette for about 2 minutes. afterwards,
Add 1 ml of serum-free RPMI1640 medium slowly over 1 minute,
Subsequently, 9 ml of serum-free RPMI1640 medium was added over about 3 minutes,
The mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. Then, the mixture was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and cultured in RPMI1640 medium containing serum for 24-48 hours. Then, the medium was replaced with RPMI1640 medium containing blasticidin S (10 μg / ml) and hygromycin B (1 mg / ml).
The mixture was dispensed into five well culture plates and cultured for 3-4 weeks. Genomic DNA from the obtained hybrid (called YR clone)
Was extracted and subjected to PCR using the following primers, and it was confirmed that two human chromosomes 14 and 2 were retained.
【０１１３】ヒト１４番染色体検出用プライマー VH3-F; 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3'（配列番号２５） VH3-R; 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3'（配列番号２６） ヒト２番染色体検出用プライマー Cκ-F; 5'-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3'（配列番号２１） Cκ-R; 5'-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3'（配列番号２
２）Primer for detecting human chromosome 14 VH3-F; 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3 '(SEQ ID NO: 25) VH3-R; 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3' (SEQ ID NO: 26) Primer for detecting human chromosome 2 Cκ -F; 5'-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3 '(SEQ ID NO: 21) Cκ-R; 5'-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3' (SEQ ID NO: 2)
2)
【０１１４】PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-
Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq
（宝酒造）を用い，バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGT
P, dTTP）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温
度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後，98℃10秒、56
-60℃30秒、72℃30秒を35サイクル行った。さらに、ヒ
トCOT1 DNAをプローブに用いてFISHを行い，２本のヒト
染色体を独立した状態で存在していることを確認した。
以上の実験から、YRハイブリッドクローンがヒト１４
番、２番染色体の２本を保持していることを確認した。The PCR was carried out using Perkin-
Elmer GeneAmp9600, Taq polymerase is Ex Taq
(Takara Shuzo) using buffer and dNTP (dATP, dCTP, dGT
(P, dTTP) was used according to the recommended conditions. The temperature and cycle conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 10 seconds, 56
35 cycles of −60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds were performed. Furthermore, FISH was performed using human COT1 DNA as a probe, and it was confirmed that two human chromosomes exist independently.
From the above experiments, it was confirmed that the YR hybrid clone
No. 2 and 2 were confirmed to be retained.
【０１１５】（２）YRハイブリッドクローンにおけるヒ
ト２番染色体断片の１４番染色体断片SC20への部位特異
的転座 上記と同様にして、制限酵素KpnI（ベーリンガー）で線
状化したCre組換え酵素安定発現ベクターpBS185hisDをR
Yハイブリッドクローンにトランスフェクションし、ヒ
スチヂノール（0.5 mg/ml）存在下で約２週間選択培養
した。その後，６穴培養プレート４枚に耐性細胞集団を
分注し（２４プール）、任意にプールを選んで約107個
になるまで培養した。細胞プールを5% FBSと1μg/mlの
プロピディアムアイオダイド（PI）を添加したPBS（リ
ン酸緩衝溶液） 4mlに懸濁し、FACSVantage（ベクトン
・ディッキンソン）により解析し、GFP陽性と思われる
細胞画分のソーティングを４回繰り返した（クローンκ
56-6, 10）。次に，FACSでクローニングされるYR由来ク
ローンにおいて、期待通りloxP間で組換えが起こってい
ることを同様にPGK-1プライマーとGFP-1プライマーとを
用いたPCRによって確認した。さらに、ヒト１４番染色
体特異的プローブとヒト２番染色体特異的プローブを用
いるFISHを行うことにより、同一染色体上にヒト重鎖遺
伝子クラスターとκ軽鎖遺伝子クラスターの両方が含ま
れる人工染色体κ-HACが構築されたことを確認する。(2) Site-specific translocation of human chromosome 2 fragment to chromosome 14 SC20 in the YR hybrid clone In the same manner as described above, Cre recombinant enzyme stabilized by linearization with the restriction enzyme KpnI (Boehringer) was used. Expression vector pBS185hisD to R
Y hybrid clones were transfected and selectively cultured in the presence of histidinol (0.5 mg / ml) for about 2 weeks. Thereafter, resistant cell population dispensed (24 pools) in four 6-well culture plates and cultured to about 10 7 to choose any pool. The cell pool was suspended in 4 ml of PBS (phosphate buffer solution) supplemented with 5% FBS and 1 μg / ml of propidium iodide (PI), and analyzed by FACSVantage (Becton Dickinson). Was repeated four times (clone κ
56-6, 10). Next, in the YR-derived clone cloned by FACS, recombination between loxP was confirmed as expected by PCR using PGK-1 primer and GFP-1 primer. Furthermore, by performing FISH using a human chromosome 14 specific probe and a human chromosome 2 specific probe, an artificial chromosome κ-HAC containing both a human heavy chain gene cluster and a κ light chain gene cluster on the same chromosome. Make sure that is built.
【０１１６】（実施例13）DT-40ハイブリッド細胞から
のヒト人工染色体λ,κ-HACのチャイニーズハムスターC
HO細胞への移入 マウスES細胞へλ,κ-HACを導入するために，前述した
ようにまず、CHO細胞へミクロセル法により導入した。(Example 13) Chinese hamster C of human artificial chromosome λ, κ-HAC from DT-40 hybrid cells
Transfer into HO cells In order to introduce λ, κ-HAC into mouse ES cells, they were first introduced into CHO cells by the microcell method as described above.
【０１１７】SF2-21とSF2-23 DT-40ハイブリッドをそれ
ぞれ直径150 mmシャーレ８枚で培養し，コンフルエント
になった時点で20% FBS, 1% ニワトリ血清、10-4M 2-メ
ルカプトエタノール、0.05μg/mlコルセミドを添加した
RPMI1640培地に交換し，さらに３６時間培養してミクロ
セルを形成させた。細胞を24 mlの血清RPMI1640培地に
懸濁し、予め100μg/mlのポリL-リジンでコートした遠
心用25 cm2フラスコ１２本（コーニング）に2 mlずつ分
注し、37℃で１時間培養し，細胞をフラスコの底に付着
させた。培養液を除去し，予め37℃で保温したサイトカ
ラシンB（10κg/ml, シグマ）溶液を遠心用フラスコに
満たし，34℃, 8000 rpm, 1時間の遠心を行った。ミク
ロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm, 5μm フィル
ターにて精製した。精製後，1700 rpm, 10分間遠心し、
無血清DMEM培地5 mlに懸濁した。一方，約107個のCHO細
胞をトリプシン処理によりはがし、無血清DMEM培地で２
回洗浄し，無血清DMEM培地5 mlに懸濁した。再度，ミク
ロセルを1700 rpm,10分間遠心し、上清を除かずに先のC
HO懸濁液5 mlを静かに重層した。遠心後，培養液を除去
し，1:1.4 PEG溶液 [5 g PEG1000（和光純薬）、DMSO
（シグマ）1mlをDMEM 6mlに溶解] 0.5 mlを加え，約２
分間ピペットで激しく攪拌した。その後，無血清DMEM培
地10 mlを約３分間かけてゆっくり加え，37度で10分間
静置した。遠心後，10% FBS添加F12培地（ギブコ）に細
胞を懸濁し、24穴培養プレート10枚に分注し、37℃で24
時間培養した。その後，G418 800μg/ml含有F12培地に
交換し，3-4週間選択培養した。The SF2-21 and SF2-23 DT-40 hybrids were cultured in eight 150 mm-diameter Petri dishes, and when confluent, 20% FBS, 1% chicken serum, 10 -4 M 2-mercaptoethanol, 0.05 μg / ml colcemide was added
The medium was replaced with RPMI1640 medium, and the cells were further cultured for 36 hours to form microcells. The cells were suspended in 24 ml of serum RPMI 1640 medium, dispensed in 2 ml portions into 12 25 cm 2 flasks for centrifugation (Corning) previously coated with 100 μg / ml of poly L-lysine, and cultured at 37 ° C. for 1 hour. Cells were allowed to attach to the bottom of the flask. The culture solution was removed, a cytochalasin B (10 kg / ml, Sigma) solution that had been kept at 37 ° C in advance was filled in a centrifugation flask, and centrifuged at 8,000 rpm for 1 hour at 34 ° C. The microcell was suspended in a serum-free DMEM medium and purified with an 8 μm or 5 μm filter. After purification, centrifuge at 1700 rpm for 10 minutes.
The cells were suspended in 5 ml of serum-free DMEM medium. On the other hand, about 10 7 CHO cells were detached by trypsin treatment, and 2 cells were removed in serum-free DMEM medium.
Washed twice and suspended in 5 ml of serum-free DMEM medium. Centrifuge the microcell again at 1700 rpm for 10 minutes, and remove the supernatant without removing the supernatant.
5 ml of the HO suspension was gently overlaid. After centrifugation, remove the culture solution and use a 1: 1.4 PEG solution [5 g PEG1000 (Wako Pure Chemical Industries), DMSO
(Sigma) 1 ml dissolved in 6 ml DMEM]
Stir vigorously with a pipette for minutes. Thereafter, 10 ml of serum-free DMEM medium was slowly added over about 3 minutes, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. After centrifugation, the cells were suspended in F12 medium (Gibco) supplemented with 10% FBS, dispensed into 10 24-well culture plates, and incubated at 37 ° C for 24 hours.
Cultured for hours. Thereafter, the medium was replaced with an F12 medium containing 800 μg / ml of G418, and selective culture was performed for 3 to 4 weeks.
【０１１８】G418耐性クローンからゲノムDNAを抽出し
てIgλとVH3検出用プライマー及びPGK-1, GFP-1プライ
マーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、λ-HAC
を保持するCHOクローンを同定した。さらに、上記PCRで
陽性だったクローンに対して、ヒト１４番染色体、２２
番染色体特異的プローブを用いてFISHを行い、視覚的に
λ-HACの存在を確認した。これらの結果から，λ-HACを
保持するCHO細胞クローンが得られたと結論できた。全
く同様にしてκ-HACを保持するCHO細胞をクローニング
できる。Genomic DNA was extracted from the G418-resistant clone and subjected to PCR under the same conditions as above using Igλ and VH3 detection primers and PGK-1 and GFP-1 primers.
Was identified. Furthermore, human clones 14 and 22
FISH was performed using a chromosome number-specific probe to visually confirm the presence of λ-HAC. From these results, it was concluded that a CHO cell clone retaining λ-HAC was obtained. CHO cells retaining κ-HAC can be cloned in exactly the same way.
【０１１９】（実施例14）CHO細胞からのλ,κ-HACのマ
ウスES細胞への移入 λ,κ-HACを保持するキメラマウスを作製するために、
（実施例13）で得られたλ-HACを保持するCHO細胞から
マウスES細胞（野性型TT2F）及び内因性抗体重鎖、軽鎖
遺伝子の両アレルをそれぞれ破壊したES細胞株（HKD2）
（WO98/37757）へミクロセル法により導入した。Example 14 Transfer of λ, κ-HAC from CHO Cells to Mouse ES Cells In order to prepare a chimeric mouse having λ, κ-HAC,
Mouse ES cells (wild-type TT2F) and ES cell lines (HKD2) in which both alleles of the endogenous antibody heavy chain and light chain genes have been disrupted from the CHO cells retaining λ-HAC obtained in (Example 13)
(WO98 / 37757) by the microcell method.
【０１２０】富塚ら（Nature Genet. 16:133, 1997）の
方法に従い、約108個のλ-HACを保持するCHO細胞からミ
クロセルを精製し、DMEM 5 mlに懸濁した。約107個のマ
ウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで
３回洗浄後DMEM 5 mlに懸濁し、遠心したミクロセルに
加え、1250 rpmで１０分間遠心し、上清を完全に取り除
いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4 PEG
溶液 [5g PEG 1000(和光純薬)、1 ml DMSO（シグマ）を
DMEM 6 mlに溶解] 0.5 mlを加え、約１分３０秒間、十
分攪拌した。その後、DMEM 10mlをゆっくり加え、1250
rpmで１０分間遠心し、30 mlのES培地に懸濁し、予めフ
ィーダー細胞をまいた直径100 mmシャーレ（コーニン
グ）３枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG
418を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その
結果、HKD2を染色体受容細胞とした実験より8クローン
（HKD2/λ-HAC）、野性型TT2Fを受容細胞とした実験よ
り25クローン（TT2F/λ-HAC）の薬剤耐性株を得た。こ
れらのクローンからゲノムDNAを抽出してIgλとVH3検出
用プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行っ
た。両プライマー共に陽性であったの8クローン中3クロ
ーン（HKD2）、25クローン中9クローン（野性型TT2F）
であった。さらに、ヒトCOT1 DNAプローブを用いてFISH
解析（Tomizukaら、Nature Genet. 16:133, 1997)を行
った結果、COT1プローブにより特異的に検出されるλ-H
ACの存在が確認された。同様にして、κ-HACを保持する
ES細胞クローンが得られる。[0120] Tomizuka et al. (Nature Genet 16:. 133, 1997) according to the method of purifying the microcell from CHO cell retaining about 10 8 lambda-HAC, and suspended in DMEM 5 ml. Approximately 10 7 mouse ES cells TT2F were detached by trypsin treatment, washed three times with DMEM, suspended in 5 ml of DMEM, added to the centrifuged microcell, centrifuged at 1250 rpm for 10 minutes, and the supernatant was completely removed. The precipitate is sufficiently loosened by tapping, and 1: 1.4 PEG
Solution [5 g PEG 1000 (Wako Pure Chemical Industries), 1 ml DMSO (Sigma)
Dissolved in 6 ml of DMEM], and added 0.5 ml, and stirred well for about 1 minute and 30 seconds. Then, slowly add 10 ml of DMEM and add 1250
The mixture was centrifuged at rpm for 10 minutes, suspended in 30 ml of ES medium, and distributed into three 100 mm diameter Petri dishes (Corning) in which feeder cells had been seeded in advance and cultured. 24 hours later, 300 μg / ml G
The medium was replaced with a medium containing 418, and selective culture was performed for about one week. As a result, 8 clones (HKD2 / λ-HAC) were obtained from experiments using HKD2 as chromosome recipient cells, and 25 clones (TT2F / λ-HAC) were obtained from experiments using wild-type TT2F as recipient cells. Genomic DNA was extracted from these clones and subjected to PCR under the same conditions as above using Igλ and primers for VH3 detection. 3 clones out of 8 clones (HKD2), 9 clones out of 25 clones (wild type TT2F), both primers were positive
Met. Furthermore, FISH using human COT1 DNA probe
Analysis (Tomizuka et al., Nature Genet. 16: 133, 1997) showed that λ-H specifically detected by the COT1 probe.
The presence of AC was confirmed. Similarly, retain κ-HAC
An ES cell clone is obtained.
【０１２１】（実施例15）ヒト人工染色体λ,κ-HACの
マウスES細胞中での安定性 ヒト人工染色体λ-HACを保持するHKD2細胞株（クローン
#1、実施例14で取得）について、富塚らの報告（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 97:722, 2000）に記載された方
法で非選択培養条件下での導入染色体安定性を検討し
た。対照として、SC20断片を保持するTT2F細胞株、及び
LIF遺伝子座でテロメア配列により断片化されたヒト22
番染色体（黒岩ら、Nucleic Acid Research, 26:3447-3
448, 1998）、を保持するHKD2細胞株についても同様の
実験を行った。その結果を図18に示す。断片化22番染色
体(hCF22)が非選択培養開始後15日目（2日で3***）で
消失してしまうのに対し、λ-HACは45日目においても、
SC20（Tomizuka ら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97:
722, 2000）と同程度保持されていることが示された。
κ-HACがマウスES細胞中で安定に保持されることも同様
にして示される。Example 15 Stability of Human Artificial Chromosome λ, κ-HAC in Mouse ES Cells HKD2 Cell Line Carrying Human Artificial Chromosome λ-HAC (Clone
# 1, obtained in Example 14), reported by Tomizuka et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722, 2000) to examine the stability of the introduced chromosome under non-selective culture conditions. As controls, a TT2F cell line carrying the SC20 fragment, and
Human 22 fragmented by telomere sequences at the LIF locus
Chromosome No. (Kuroiwa et al., Nucleic Acid Research, 26: 3447-3
448, 1998). FIG. 18 shows the result. Fragmented chromosome 22 (hCF22) disappears 15 days after the start of non-selective culture (3 divisions in 2 days), whereas λ-HAC
SC20 (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:
722, 2000).
It is similarly shown that κ-HAC is stably retained in mouse ES cells.
【０１２２】（実施例16）ヒト人工染色体λ,κ-HACを
保持するキメラマウスの作製 上記（実施例14）で得られたES細胞クローンを用いて富
塚らの方法（Nature Genet., 16:133, 1997）でキメラ
マウスを作製した。宿主としてはICR、MCH（日本クレ
ア）、あるいは抗体重鎖ノックアウトマウスの雌雄交配
により得られる８細胞期胚（WO98/37757）を用いた。注
入胚を仮親に移植した結果生まれる子マウスは毛色によ
りキメラであるかどうかを判定できる。HKD2/λ-HACク
ローン（A3、実施例14）を注入した216個の胚を仮親に
移植した結果、46匹のキメラマウスが誕生し、そのうち
11匹が毛色に濃茶色の部分の認められるキメラマウスで
あった。また野性型TT2F/λ-HAC（B10）を注入した240
個の胚を移植した仮親からは46匹のマウスが誕生し、そ
のうち13匹がキメラマウスであった。すなわち、ヒト人
工染色体λ-HACを保持するES細胞株はキメラ形成能を保
持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する
能力を保持していることが示された。同様にして、ヒト
人工染色体κ-HACを保持するES細胞株からキメラマウス
の作製を行い、キメラマウスを得る。Example 16 Preparation of Chimeric Mouse Carrying Human Artificial Chromosome λ, κ-HAC Using the ES cell clone obtained in the above (Example 14), the method of Tomizuka et al. (Nature Genet., 16: 133, 1997). The host used was ICR, MCH (CLEA Japan), or an 8-cell stage embryo (WO98 / 37757) obtained by mating male and female antibody heavy chain knockout mice. The offspring born as a result of implanting the injected embryo into the foster mother can be judged to be chimeric based on coat color. Implantation of 216 embryos injected with the HKD2 / λ-HAC clone (A3, Example 14) into foster mothers resulted in 46 chimeric mice.
Eleven were chimeric mice with a dark brown portion in coat color. The wild type TT2F / λ-HAC (B10) was injected 240
46 mice were born from the foster mother to which the embryos were implanted, 13 of which were chimeric mice. That is, it was shown that the ES cell line retaining the human artificial chromosome λ-HAC retained the ability to form chimeras, that is, the ability to differentiate into normal tissues of mouse individuals. Similarly, a chimeric mouse is prepared from an ES cell line carrying a human artificial chromosome κ-HAC to obtain a chimeric mouse.
【０１２３】（実施例17）ヒト人工染色体λ,κ-HACを
保持するES細胞より作製されたキメラマウス体細胞にお
ける人工染色体の保持 （実施例16）でTT2F/λ-HACクローン（B10）あるいはHK
D2/λ-HACクローン(A3)より作製されたキメラマウスの
尻尾から富塚らの報告（Nature Genet., 16:133, 199
7）に記された方法で繊維芽細胞を調製した。2週間培養
後の繊維芽細胞より、中期染色体サンプルを調製し、ヒ
トCOT1 DNAプローブを用いてFISH解析を行った（Tomizu
kaら、Nature Genet. 16:133, 1997)。その結果、COT1
プローブにより特異的に検出されるλ-HACの存在が確認
された。同様に、κ-HACを保持するES細胞クローン由来
のキメラマウス体細胞においてκ-HACが保持されている
ことが確認される。Example 17 Retention of Artificial Chromosome in Chimeric Mouse Somatic Cells Prepared from ES Cells Retaining Human Artificial Chromosome λ, κ-HAC The TT2F / λ-HAC clone (B10) or HK
From the tail of a chimeric mouse generated from the D2 / λ-HAC clone (A3), reported by Tomizuka et al. (Nature Genet., 16: 133, 199).
Fibroblasts were prepared by the method described in 7). A metaphase chromosome sample was prepared from fibroblasts cultured for two weeks, and subjected to FISH analysis using a human COT1 DNA probe (Tomizu
ka et al., Nature Genet. 16: 133, 1997). As a result, COT1
The presence of λ-HAC specifically detected by the probe was confirmed. Similarly, it is confirmed that κ-HAC is retained in chimeric mouse somatic cells derived from ES cell clones retaining κ-HAC.
【０１２４】（実施例18）ヒト人工染色体λ-HAC、κ-H
ACを保持するキメラマウスにおけるヒト抗体の発現 λ-HACを保持するキメラマウスにおけるヒトIgλ鎖及び
ヒトIg重鎖の発現を（WO98/37757）に記載された方法で
検討した。HKD2/λ-HACクローン（#1）を内因性重鎖遺
伝子欠損マウス8細胞期胚に注入して作製されたキメラ
マウスより採血し、ELISA法によりヒトμ鎖、γ鎖、λ
鎖、マウスλ鎖濃度の測定を行った。対照としてSC20と
断片化22番染色体（黒岩ら、Nucleic Acid Research, 2
6:3447-3448, 1998）を同時に保持するHKD2細胞株から
もキメラマウスを作製し、同様の解析を行った。その結
果を図１９に示す。λ-HACを保持するキメラマウス血清
中のヒトλ鎖濃度は2本の断片を保持する場合と比較し
て高かった。また全軽鎖中のヒトλ鎖濃度の割合は、λ
‐HACを保持するキメラマウス血清中で94%（正常マウス
におけるκ鎖の構成比と同等）、2本の断片保持の場合
が55%であった。すなわち、λ‐HACの利用によりヒトλ
鎖のより効率的な発現が可能になった。λ‐HACを保持
するキメラマウスにおいてはマウスμ鎖、κ鎖は発現し
ない（WO98/37757）ので、血清中の抗体分子うち94%が
ヒト重鎖（μ鎖あるいはγ鎖）とヒトλ鎖より構成され
る完全なヒト抗体分子であると考えられる。同様にκ-H
ACを保持するキメラマウスにおけるヒトIgκ鎖、ヒトIg
重鎖分子の発現も（WO98/37757）に記載された方法で確
認される。(Example 18) Human artificial chromosome λ-HAC, κ-H
Expression of Human Antibody in Chimeric Mice Carrying AC The expression of human Igλ chain and human Ig heavy chain in chimeric mice carrying λ-HAC was examined by the method described in (WO98 / 37757). Blood was collected from a chimeric mouse prepared by injecting the HKD2 / λ-HAC clone (# 1) into an 8-cell embryo of a mouse lacking the endogenous heavy chain gene, and human μ chain, γ chain, λ
Chain and mouse λ chain concentrations were measured. As controls, SC20 and fragmented chromosome 22 (Kuroiwa et al., Nucleic Acid Research, 2
6: 3447-3448, 1998), and a chimeric mouse was prepared from the HKD2 cell line simultaneously carrying out the same analysis. The result is shown in FIG. The concentration of the human λ chain in the serum of the chimeric mouse retaining λ-HAC was higher than that in the case of retaining the two fragments. The ratio of human λ chain concentration in all light chains is λ
94% (equivalent to the ratio of the kappa chain in normal mice) in the serum of chimeric mice carrying -HAC, and 55% carrying two fragments. In other words, the use of λ-HAC
More efficient expression of the chains became possible. Chimeric mice carrying λ-HAC do not express the mouse μ and κ chains (WO98 / 37757), so 94% of the antibody molecules in serum are human heavy (μ or γ) and human λ It is believed to be a fully composed human antibody molecule. Similarly κ-H
Human Igκ chain and human Ig in chimeric mice that retain AC
The expression of the heavy chain molecule is also confirmed by the method described in (WO98 / 37757).
【０１２５】（実施例19）ヒト人工染色体λ-HAC、κ-H
ACを保持するキメラマウスにおけるヒト抗体の発現から
の抗原特異的ヒト抗体産生ハイブリドーマ取得 （WO98/37757）の方法に準じた方法でヒト抗体を生産す
るハイブリドーマを作製する。（実施例18）の生後3ヶ
月齢のλ-HACキメラマウス（C44、キメラ率40%）に対し
てヒトG-CSFを免疫した。0.5mg/ml となるようPBSに溶
解したG-CSFと同量のアジュバント（Titer Max Gold、C
tRx）とを混合し、0.05mg/headで約10日間隔で5回免疫
した。免疫開始後27日目、38日目と48日目に採血し、血
清中の抗G-CSF抗体をELISA法で検出した。G-CSFを炭酸
緩衝液（シグマ、C3041）に溶解し0.5μg/ml溶液とし
た。96well plate（NUNC、442404）の各wellに50μlづ
つ分注しG-CSFを固定化した。希釈した血清を添加し、
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（シグマ、A0170）
もしくは抗ヒトラムダ鎖抗体（Southern Biotechnology
ssosiates,2070-05）で検出した。結果を図20に示す。G
-CSFに特異的なヒト抗体γ鎖およびヒト抗体λ鎖の濃度
が上昇していることが示されている。HAC上の抗体遺伝
子が機能しており、抗原に対して免疫応答できることが
確認された。(Example 19) Human artificial chromosome λ-HAC, κ-H
A hybridoma producing a human antibody is produced by a method according to the method of obtaining an antigen-specific human antibody-producing hybridoma from expression of a human antibody in a chimeric mouse carrying AC (WO98 / 37757). A 3-month-old λ-HAC chimeric mouse (C44, chimera rate 40%) of Example 18 was immunized with human G-CSF. The same amount of G-CSF adjuvant dissolved in PBS to 0.5 mg / ml (Titer Max Gold, C
tRx) and immunized 5 times at 0.05 mg / head at approximately 10 day intervals. Blood was collected on days 27, 38 and 48 after the start of immunization, and anti-G-CSF antibody in the serum was detected by ELISA. G-CSF was dissolved in a carbonate buffer (Sigma, C3041) to give a 0.5 μg / ml solution. G-CSF was immobilized by dispensing 50 μl into each well of a 96-well plate (NUNC, 442404). Add diluted serum,
Peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (Sigma, A0170)
Alternatively, an anti-human lambda chain antibody (Southern Biotechnology
ssosiates, 2070-05). The results are shown in FIG. G
It is shown that the concentrations of human antibody γ-chain and human antibody λ-chain specific to -CSF are increased. It was confirmed that the antibody gene on HAC was functioning and capable of immune response to the antigen.
【０１２６】PBSに溶解したG-CSFをキメラマウス腹腔、
静脈あるいは脾臓に注入し最終免疫を行う。3日後に脾
臓を取り出し（実施例24）に従いPEGにて細胞融合し、
ハイブリドーマを作製する。融合後の細胞を、ひ細胞が
100万個/ml程度となるようHAT（Gibco、31062-037）、1
0%Hibrydoma Cloning Factor（IGEN ,50-0615）と2%牛
胎児血清とを添加した培地（エス・クローニングメデュ
ームCM-B、三光純薬、SS8800）に懸濁し、96穴あるいは
384穴プレート各wellに分注し培養する。培養開始約1週
間後にELISA法によって抗G-CSFヒト抗体生産ハイブリド
ーマのスクリーニングを行う。G-CSFに対するヒトIgγ
とIgλとが陽性となったwellの細胞を限外希釈法にてク
ローニングし、抗G-CSFヒト抗体生産クローンを得る。W
ell中の抗体生産細胞の割合が低くクローニングが困難
な場合には、抗ヒトIgG抗体を固定化した磁気ビーズを
用いて抗体生産細胞を濃縮した後クローニングする。あ
るいはwellの細胞にISOGEN-LS（和光純薬、311-0262）
を加えた後ｍRNAを調製し、RT-PCRによって抗体遺伝子
を取得することもできる。G-CSF dissolved in PBS was added to the peritoneal cavity of a chimeric mouse,
Inject into vein or spleen for final immunization. Three days later, the spleen was removed and cell fusion was performed with PEG according to (Example 24).
Create a hybridoma. After fusion, the spleen cells
HAT (Gibco, 31062-037), 1 so that it is about 1 million / ml
Suspension in a medium (S Cloning Medium CM-B, Sanko Junyaku, SS8800) supplemented with 0% Hibrydoma Cloning Factor (IGEN, 50-0615) and 2% fetal bovine serum, and
Dispense into each well of a 384-well plate and culture. Approximately one week after the start of culture, screening of anti-G-CSF human antibody-producing hybridomas is performed by ELISA. Human Igγ for G-CSF
The cells of the wells that have become positive for IgG and Igλ are cloned by the ultradilution method to obtain an anti-G-CSF human antibody-producing clone. W
When the ratio of antibody-producing cells in ell is low and cloning is difficult, the antibody-producing cells are concentrated using magnetic beads on which an anti-human IgG antibody is immobilized, and then cloned. Alternatively, add ISOGEN-LS (Wako Pure Chemical Industries, 311-0262) to well cells
After the addition, mRNA may be prepared, and the antibody gene may be obtained by RT-PCR.
【０１２７】（実施例20）ヒト人工染色体λ-HAC、κ-H
ACを保持するキメラマウスからのλ-HAC、κ-HACの子孫
伝達 キメラマウスからのλ-HAC及びκ-HACの子孫伝達をVH
3、Igλ、Ck（実施例11、12）等のマーカーを用いたPCR
解析、COT-1 DNAプローブを用いたFISH解析等により検
討する。その結果、λ-HACあるいはκ-HACをそれぞれ保
持し、子孫伝達するマウス系統が確立される。また、λ
-HACあるいはκ-HACを保持し、子孫伝達するマウス系統
におけるヒトIg軽鎖（κあるいはλ）、ヒトIg重鎖及び
ヒトIg軽鎖（κあるいはλ）/重鎖からなる完全なヒト
抗体分子の発現は産生された血清中のヒト抗体をELISA
法によって検出することで確認される。さらに、λ-HAC
あるいはκ-HACを保持し子孫伝達するマウス系統を内在
性抗体重鎖、軽鎖κ遺伝子を欠損しているマウス系統と
繰り返し交配し、各HACを保持しかつ内在性抗体重鎖及
びκ鎖遺伝子欠損についてホモであるマウス系統を得る
ことができる。これらの系統においては主として完全な
ヒト抗体が産生される。Example 20 Human Artificial Chromosome λ-HAC, κ-H
Progeny transmission of λ-HAC and κ-HAC from chimeric mice retaining AC VH transmission of λ-HAC and κ-HAC from chimeric mice
3, PCR using markers such as Igλ, Ck (Examples 11 and 12)
It will be examined by analysis and FISH analysis using COT-1 DNA probe. As a result, a mouse strain that retains λ-HAC or κ-HAC and transmits offspring is established. Also, λ
Fully human antibody molecule consisting of human Ig light chain (κ or λ), human Ig heavy chain and human Ig light chain (κ or λ) / heavy chain in a mouse strain that carries -HAC or κ-HAC and transmits progeny Expression of human antibodies in serum produced by ELISA
Confirmed by detection by the method. Furthermore, λ-HAC
Alternatively, a mouse strain that retains κ-HAC and transmits progeny is repeatedly crossed with a mouse strain deficient in the endogenous antibody heavy chain and light chain κ genes, and retains each HAC and has an endogenous antibody heavy chain and κ chain gene. Mouse strains homozygous for the defect can be obtained. These lines produce primarily fully human antibodies.
【０１２８】[0128]
【発明の効果】本発明により、改変された外来染色体あ
るいはその断片を保持する非ヒト動物が提供された。According to the present invention, a non-human animal having a modified foreign chromosome or a fragment thereof is provided.
【０１２９】[0129]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> Method for Modifying Chromosomes or Fragments thereof <130> P99-0719 <140> <141> <160> 30 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SfiI linker <400> 1 ggccgcwgcg gcc 13 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 2 tcgaggtacc gtgagaacaa gacagagaat gagggagg 38 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 3 tcgaggtacc taatgcagag gctctttggt gtacttgg 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 4 tcgagaattc agtagctggc actatctttt tggccatc 38 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 5 tcgagaattc ggagaaagaa cacacaagga ctcggtc 37 <210> 6 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SrfI linker <400> 6 gcccgggc 8 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 7 tcgaggatcc gatagagaga ttgtcttaaa tgggtggg 38 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 8 tcgaggatcc aacagctgga actcataaaa gcatagc 37 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 9 tcgaggatcc ctttagtgaa ggcaaaggaa gggacactc 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 10 tcgaggatcc tgtaaagggg tagcctgtcc tctttcatg 39 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 11 cacatgacaa gagctcagcg 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 12 tctgacttcc tcatgagagc c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 13 tggatgtatc ctgtcaagag acc 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 14 cagacactct atgcctgtgt gg 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 gccctcatgg aaatctcctg gg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 gcagcaacag atggaaggcc tc 22 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 gaacagaaag ccactcttgc tttccat 27 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 accgagctgc aagaactctt cctcac 26 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 19 ctctcctgca gggccagtca 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 tgctgatggt gagagtgaac tc 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 21 tggaaggtgg ataacgccct 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 tcattctcct ccaacattag ca 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 23 gtctggggtt tggagatctg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 atcccattca taagggctcg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 25 agtgagataa gcagtggatg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 26 gttgtgctac tcccatcact 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 27 gagagttgca gaaggggtga ct 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 ggagaccacc aaaccctcca aa 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 29 atagcagctt tgctccttcg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 30 ttctctcctg cacatagccc 20 [Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> Method for Modifying Chromosomes or Fragments there <130> P99-0719 <140> <141> <160> 30 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SfiI linker <400> 1 ggccgcwgcg gcc 13 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 2 tcgaggtacc gtgagaacaa gacagagaat gagggagg 38 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 3 tcgaggtacc taatgcagag gctctttggt gtacttgg 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 4 tcgagaattc agtagctggc actatctttt tggccatc 38 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 5 tcgagaattc ggagaaagaa cacacaagga ctcggtc 37 <210> 6 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SrfI linker <400> 6 gcccgggc 8 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 7 tcgaggatcc gatagagaga ttgtcttaaa tgggtggg 38 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 8 tcgaggatcc aacagctgga actcataaaa gcatagc 37 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 9 tcgaggatcc ctttagtgaa ggcaaaggaa gggacactc 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 10 tcgaggatcc tgtaaagggg tagcctgtcc tctttcatg 39 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 11 cacatgacaa gagctcagcg 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer < 400> 12 tctgacttcc tcatgagagc c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 13 tggatgtatc ctgtcaagag acc 23 <210> 14 <211 > 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 14 cagacactct atgcctgtgt gg 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 gccctcatgg aaatctcctg gg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 gcagcaacag atggaaggcc tc 22 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 gaacagaaag ccactcttgc tttccat 27 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 accgagctgc aagaactctt cctcac 26 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> < 223> Description o f Artificial Sequence: Primer <400> 19 ctctcctgca gggccagtca 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 tgctgatggt gagagtgaac tc 22 < 210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 21 tggaaggtgg ataacgccct 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 tcattctcct ccaacattag ca 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 23 gtctggggtt tggagatctg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 atcccattca taagggctcg 20 <210> 25 <211 > 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 25 agtgagataa gcagtggatg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Descri ption of Artificial Sequence: Primer <400> 26 gttgtgctac tcccatcact 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 27 gagagttgca gaaggggtga ct 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 ggagaccacc aaaccctcca aa 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 29 atagcagctt tgctccttcg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 30 ttctctcctg cacatagccc 20
【０１３０】[0130]
【配列表フリーテキスト】配列番号１は、SfiIリンカー
の塩基配列を示す。配列番号２〜５は、プライマーの塩
基配列を示す。配列番号６は、SrfIリンカーの塩基配列
を示す。配列番号７〜３０は、プライマーの塩基配列を
示す。[Sequence List Free Text] SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of SfiI linker. SEQ ID NOs: 2 to 5 show the nucleotide sequences of the primers. SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of SrfI linker. SEQ ID NOs: 7 to 30 show the nucleotide sequences of the primers.
【図１】ヒト人工染色体λ-HAC, κ-HAC作製の概略を示
す。FIG. 1 shows an outline of production of human artificial chromosomes λ-HAC and κ-HAC.
【図２】ヒト人工染色体λ-HAC, κ-HAC導入マウス作製
の概略を示す。FIG. 2 shows an outline of preparation of a mouse into which human artificial chromosomes λ-HAC and κ-HAC have been introduced.
【図３】カセットベクターploxPHygとploxPbsrの構造を
示す。FIG. 3 shows the structures of cassette vectors ploxPHyg and ploxPbsr.
【図４】ターゲティングベクターpHCF2loxPHyg(F)の構
造と相同組換え体の同定法を示す。FIG. 4 shows the structure of a targeting vector pHCF2loxPHyg (F) and a method for identifying a homologous recombinant.
【図５】ターゲティングベクターpHCF2loxPHyg(R)の構
造と相同組換え体の同定法を示す。FIG. 5 shows the structure of a targeting vector pHCF2loxPHyg (R) and a method for identifying a homologous recombinant.
【図６】ターゲティングベクターpRNR2loxPbsrの構造と
相同組換え体の同定法を示す。FIG. 6 shows the structure of a targeting vector pRNR2loxPbsr and a method for identifying a homologous recombinant.
【図７】ターゲティングベクターpYHZloxPHyg(F)の構造
と相同組換え体の同定法を示す。FIG. 7 shows the structure of a targeting vector pYHZloxPHyg (F) and a method for identifying a homologous recombinant.
【図８】カセットベクターpTELPuroの構造を示す。FIG. 8 shows the structure of the cassette vector pTELPuro.
【図９】ターゲティングベクターpTELPuroCD8A(F)の構
造と相同組換え体の同定法を示す。FIG. 9 shows the structure of a targeting vector pTELPuroCD8A (F) and a method for identifying a homologous recombinant.
【図１０】ターゲティングベクターpTELPuroCD8A(R)の
構造と相同組換え体の同定法を示す。FIG. 10 shows the structure of a targeting vector pTELPuroCD8A (R) and a method for identifying a homologous recombinant.
【図１１】ヒト２番染色体上の遺伝子マーカーの存在と
CD8A遺伝子座でテロメアトランケートしたクローンCD10
におけるヒト２番染色体上の遺伝子マーカーの存在を示
す。FIG. 11. Presence of genetic markers on human chromosome 2
Clone CD10 Telomerized at CD8A Locus
2 shows the presence of a genetic marker on human chromosome 2 in FIG.
【図１２】クローンCD10におけるpGKPuroプローブを用
いたFISHの結果を示す。FIG. 12 shows the results of FISH using the pGKPuro probe on clone CD10.
【図１３】Cre組換え酵素安定発現ベクターpBS185hisD
の構造を示す。FIG. 13: Cre recombinase stable expression vector pBS185hisD
The structure of is shown.
【図１４】RHFクローンとRHRクローンにおけるloxP間転
座後の人工染色体の構造を示す。FIG. 14 shows the structure of an artificial chromosome after translocation between loxP in RHF clone and RHR clone.
【図１５】RHFクローンにおけるloxP間転座後のゲノム
領域の構造と転座確認のためのPCR同定法を示す。FIG. 15 shows the structure of the genomic region after loxP translocation in the RHF clone and the PCR identification method for confirming the translocation.
【図１６】転座確認のためのPCRの結果を示す。FIG. 16 shows the results of PCR for confirming translocation.
【図１７】RHFクローンにおけるpGKPuroプローブと14qt
er特異的プローブを用いたFISH及び２２番染色体特異的
プローブと１４番染色体プローブを用いたFISHの結果を
示す。FIG. 17. pGKPuro probe and 14qt in RHF clone
The results of FISH using an er-specific probe and FISH using a chromosome 22-specific probe and a chromosome 14 probe are shown.
【図１８】ヒト染色体断片（λ-HAC、hCF22およびSC2
0）のマウスES細胞中での安定性を示す。FIG. 18. Human chromosome fragments (λ-HAC, hCF22 and SC2
0) shows stability in mouse ES cells.
【図１９】ヒト人工染色体λ-HACを保持するキメラマウ
ス、SC20およびhCF22を同時に保持するマウスにおける
ヒト抗体の発現量を示す。FIG. 19 shows the expression levels of human antibodies in chimeric mice holding human artificial chromosome λ-HAC and mice holding SC20 and hCF22 simultaneously.
【図２０】λ-HACを保持するキメラマウス血清中のG-CS
Fに対する免疫応答が示されている。FIG. 20 shows G-CS in the serum of chimeric mice retaining λ-HAC.
The immune response to F is shown.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 石田 功 群馬県高崎市宮原町３番地 麒麟麦酒株式 会社医薬探索研究所内 (72)発明者 黒岩 義巳 群馬県高崎市宮原町３番地 麒麟麦酒株式 会社医薬探索研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA31 BA41 CA03 DA02 EA04 FA10 GA11 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat 参考 (Reference) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) C12R 1:91) (72) Inventor Isao Ishida Takasaki City, Gunma Prefecture 3 Miyahara-cho Kirin Brewery Co., Ltd. Pharmaceutical Research Laboratories (72) Inventor Yoshimi Kuroiwa 3rd Miyahara-cho, Takasaki City, Gunma Prefecture Kirin Brewery Co., Ltd. Pharmaceutical Research Laboratories F-term (reference) AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44
Claims (16)
り生じた染色体断片を保持する非ヒト動物。1. A non-human animal having a chromosome fragment generated by deletion of a foreign chromosome or a fragment thereof.
マーカー遺伝子およびテロメア配列、および／または
（ｉｉ）部位特異的組換え酵素の認識配列を有するもの
である請求項１記載の非ヒト動物。2. The method according to claim 1, wherein the chromosome fragment generated by the deletion comprises:
The non-human animal according to claim 1, which has a marker gene and a telomere sequence, and / or (ii) a recognition sequence for a site-specific recombinase.
の転座により生じた組換え外来染色体を保持する非ヒト
動物。3. A non-human animal having a recombinant foreign chromosome generated by translocation between a plurality of foreign chromosomes or fragments thereof.
伝子およびテロメア配列、および／または（ｉｉ）部位
特異的組換え酵素の認識配列を有するものである請求項
３記載の非ヒト動物。4. The non-human animal according to claim 3, wherein the recombinant foreign chromosome has (i) a marker gene and a telomere sequence, and / or (ii) a recognition sequence for a site-specific recombinase.
細胞の核内において独立したものである請求項３記載の
非ヒト動物。5. The non-human animal according to claim 3, wherein the retention of the recombinant foreign chromosome is independent in the nucleus of the non-human animal cell.
項３記載の非ヒト動物。6. The non-human animal according to claim 3, wherein the recombinant foreign chromosome is derived from a human.
ヒト２番染色体由来である請求項３記載の非ヒト動物。7. The non-human animal according to claim 3, wherein the recombinant foreign chromosome is derived from human chromosome 14 and human chromosome 2.
ヒト２２番染色体由来である請求項３記載の非ヒト動
物。8. The non-human animal according to claim 3, wherein the recombinant foreign chromosome is derived from human chromosome 14 and human chromosome 22.
と軽鎖λ遺伝子を含む請求項３記載の非ヒト動物。9. The non-human animal according to claim 3, wherein the recombinant foreign chromosome contains a human antibody heavy chain gene and a light chain λ gene.
子と軽鎖κ遺伝子を含む請求項３記載の非ヒト動物。10. The non-human animal according to claim 3, wherein the recombinant foreign chromosome contains a human antibody heavy chain gene and a light chain κ gene.
物。11. The non-human animal according to claim 3, which is a mouse.
物。12. The non-human animal according to claim 3, which is an ungulate.
物。13. The non-human animal according to claim 3, which is a cow.
物。14. The non-human animal according to claim 3, which is a sheep.
物。15. The non-human animal according to claim 3, which is a bird.
動物。16. The non-human animal according to claim 3, which is a chicken.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000042074A JP2001231403A (en) | 2000-02-18 | 2000-02-18 | Nonhuman animal retaining varied alien chromosome or its fragment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000042074A JP2001231403A (en) | 2000-02-18 | 2000-02-18 | Nonhuman animal retaining varied alien chromosome or its fragment |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001231403A true JP2001231403A (en) | 2001-08-28 |
Family
ID=18565194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000042074A Pending JP2001231403A (en) | 2000-02-18 | 2000-02-18 | Nonhuman animal retaining varied alien chromosome or its fragment |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001231403A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002092812A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | ARTIFICIAL HUMAN CHROMOSOME CONTAINING HUMAN ANTIBODY μ LIGHT CHAIN GENE |
| WO2013042426A1 (en) | 2011-09-21 | 2013-03-28 | 富士レビオ株式会社 | Antibody against affinity complex |
| US8835712B2 (en) | 2000-11-30 | 2014-09-16 | Medarex, L.L.C. | Transgenic trasnchromosomal rodents for making human antibodies |
-
2000
- 2000-02-18 JP JP2000042074A patent/JP2001231403A/en active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8835712B2 (en) | 2000-11-30 | 2014-09-16 | Medarex, L.L.C. | Transgenic trasnchromosomal rodents for making human antibodies |
| US9426970B2 (en) | 2000-11-30 | 2016-08-30 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies |
| US10076103B2 (en) | 2000-11-30 | 2018-09-18 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies |
| WO2002092812A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | ARTIFICIAL HUMAN CHROMOSOME CONTAINING HUMAN ANTIBODY μ LIGHT CHAIN GENE |
| EP1632571A1 (en) | 2001-05-11 | 2006-03-08 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Human artificial chromosome containing human antibody Lambda light chain and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission |
| US7402729B2 (en) | 2001-05-11 | 2008-07-22 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | Human artificial chromosome containing human antibody λ light chain gene and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission |
| US7476536B2 (en) | 2001-05-11 | 2009-01-13 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | Artificial human chromosome containing human antibody a light chain gene |
| US9499838B2 (en) | 2001-05-11 | 2016-11-22 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Human artificial chromosome containing human antibody λ light chain gene and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission |
| US10448622B2 (en) | 2001-05-11 | 2019-10-22 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Human artificial chromosome containing human antibody lambda light chain gene and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission |
| WO2013042426A1 (en) | 2011-09-21 | 2013-03-28 | 富士レビオ株式会社 | Antibody against affinity complex |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4192162B2 (en) | Human artificial chromosome containing human antibody λ light chain gene, and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of offspring transmission | |
| JP3732407B2 (en) | Chromosome modification method | |
| JP4318736B2 (en) | Non-human animals expressing human antibody genes and their use | |
| KR100882030B1 (en) | Expression of Xenogenous (Human) Immunoglobulins in Cloned, Transgenic Ungulates | |
| US7491867B2 (en) | Expression of xenogenous (human) immunoglobulins in cloned, transgenic ungulates | |
| US8110671B2 (en) | Isolated human chromosome 14 fragment encoding immunoglobulin genes | |
| JP4082740B2 (en) | Pluripotent retaining cells with disrupted endogenous genes | |
| JP2005504507A5 (en) | ||
| AU2001297523A1 (en) | Expression of xenogenous (human) immunoglobulins in cloned, transgenic ungulates | |
| JP6868250B2 (en) | Human antibody-producing non-human animals and human antibody production methods using them | |
| JP2006094849A (en) | Pluripotent cell with improved homologous recombination efficiency and use thereof | |
| JP2001231403A (en) | Nonhuman animal retaining varied alien chromosome or its fragment | |
| JP3030092B2 (en) | Chimeric animal and method for producing the same | |
| JP2007312792A (en) | Chimeric animals and method for producing the same | |
| JPH11313576A (en) | Chimera animal and its preparation |