JP2001224360A - アルカン類を分解する新規微生物、アルカン類を分解する方法 - Google Patents
アルカン類を分解する新規微生物、アルカン類を分解する方法Info
- Publication number
- JP2001224360A JP2001224360A JP2000034638A JP2000034638A JP2001224360A JP 2001224360 A JP2001224360 A JP 2001224360A JP 2000034638 A JP2000034638 A JP 2000034638A JP 2000034638 A JP2000034638 A JP 2000034638A JP 2001224360 A JP2001224360 A JP 2001224360A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- alkanes
- decomposing
- bacillus
- strains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Production Of Liquid Hydrocarbon Mixture For Refining Petroleum (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 原油に含まれる環境汚染物質である、高分子
量の炭化水素類を、高温で効率的に分解するための方法
を開発する。 【解決手段】 本発明により、バチルス・サーモレオボ
ランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒ
ａｎｓ）に属し、高温有機溶媒条件下で生育し、かつア
ルカン類を分解する事が可能な新規微生物である、バチ
ルス・サーモレオボランスＢ２３株及びバチルス・サー
モレオボランスＨ４１株が与えられた。本発明の菌株
は、有害物質である高分子量の炭化水素類の処理に有効
である。
量の炭化水素類を、高温で効率的に分解するための方法
を開発する。 【解決手段】 本発明により、バチルス・サーモレオボ
ランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒ
ａｎｓ）に属し、高温有機溶媒条件下で生育し、かつア
ルカン類を分解する事が可能な新規微生物である、バチ
ルス・サーモレオボランスＢ２３株及びバチルス・サー
モレオボランスＨ４１株が与えられた。本発明の菌株
は、有害物質である高分子量の炭化水素類の処理に有効
である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バチルス・サーモ
レオボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏ
ｖｏｒａｎｓ）に属し、高温有機溶媒条件下で生育し、
かつアルカン類を分解する事が可能な新規微生物であ
る、バチルス・サーモレオボランスＢ２３株及びバチル
ス・サーモレオボランスＨ４１株に関する。更に本発明
は、上記微生物を用いて原油あるいは廃油に含有される
アルカンを高温で分解する方法に関する。
レオボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏ
ｖｏｒａｎｓ）に属し、高温有機溶媒条件下で生育し、
かつアルカン類を分解する事が可能な新規微生物であ
る、バチルス・サーモレオボランスＢ２３株及びバチル
ス・サーモレオボランスＨ４１株に関する。更に本発明
は、上記微生物を用いて原油あるいは廃油に含有される
アルカンを高温で分解する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、原油等に含まれる炭化水素類によ
る環境汚染が社会的に問題となっており、それらの物質
を迅速に処理する技術が求められている。原油の主成分
である分子量の大きな炭化水素類は、低温では粘性が高
いために微生物の分解を受けにくく、そのために分解の
難しい環境汚染物質の一つとされている。一方、７０℃
程の高温下では炭化水素類の粘性は低下するものの、従
来の炭化水素分解微生物の多くは死滅してしまうという
問題があった。
る環境汚染が社会的に問題となっており、それらの物質
を迅速に処理する技術が求められている。原油の主成分
である分子量の大きな炭化水素類は、低温では粘性が高
いために微生物の分解を受けにくく、そのために分解の
難しい環境汚染物質の一つとされている。一方、７０℃
程の高温下では炭化水素類の粘性は低下するものの、従
来の炭化水素分解微生物の多くは死滅してしまうという
問題があった。
【０００３】原油を分解する活性を有する微生物、流出
原油など環境汚染物質を５〜４０℃前後の比較的低温に
おいて分解する技術は数多く特許化されているが、工場
から排出される高温の廃油などに対して直接有効なもの
はない。
原油など環境汚染物質を５〜４０℃前後の比較的低温に
おいて分解する技術は数多く特許化されているが、工場
から排出される高温の廃油などに対して直接有効なもの
はない。
【０００４】耐熱性酵素、高い反応特異性および環境に
対して低負荷であるという視点から、酵素等の生体触媒
は化学産業で広く注目されている。しかしながら、酵素
は安定性に乏しく、また水溶媒系でのみ機能するものが
ほとんどであるため、その用途は限られている。そこで
従来型の熱安定性の低い酵素の問題点を解決するため
に、耐熱性の高い酵素がいくつか特許化されている。し
かしながら、更に広く化学産業で利用されるためには、
熱安定性に加えて有機溶媒中でも機能するものが求めら
れている。
対して低負荷であるという視点から、酵素等の生体触媒
は化学産業で広く注目されている。しかしながら、酵素
は安定性に乏しく、また水溶媒系でのみ機能するものが
ほとんどであるため、その用途は限られている。そこで
従来型の熱安定性の低い酵素の問題点を解決するため
に、耐熱性の高い酵素がいくつか特許化されている。し
かしながら、更に広く化学産業で利用されるためには、
熱安定性に加えて有機溶媒中でも機能するものが求めら
れている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、炭化水素類の
粘性が低下する高温において生育し、有機溶媒に耐性を
有し、かつ炭化水素類を分解する活性を有する微生物を
提供する事が、本発明の課題である。その様な微生物よ
り得られた酵素群は高温有機溶媒に対して高い耐性を有
し、種々の化学反応に利用できる事が期待される。
粘性が低下する高温において生育し、有機溶媒に耐性を
有し、かつ炭化水素類を分解する活性を有する微生物を
提供する事が、本発明の課題である。その様な微生物よ
り得られた酵素群は高温有機溶媒に対して高い耐性を有
し、種々の化学反応に利用できる事が期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは油
田環境に注目し、油田に存在する微生物の単離、同定を
行った。即ち、油田の地下１５００〜２０００メートル
の、約１００℃の深度油田から新規の微生物を探索し
た。鋭意探索した結果、南阿賀油田（新潟）の地下より
バチルス・サーモレオボランスＢ２３株を得た。更に、
八橋油田（秋田）の地下よりバチルス・サーモレオボラ
ンスＨ４１株を得た。
田環境に注目し、油田に存在する微生物の単離、同定を
行った。即ち、油田の地下１５００〜２０００メートル
の、約１００℃の深度油田から新規の微生物を探索し
た。鋭意探索した結果、南阿賀油田（新潟）の地下より
バチルス・サーモレオボランスＢ２３株を得た。更に、
八橋油田（秋田）の地下よりバチルス・サーモレオボラ
ンスＨ４１株を得た。
【０００７】その様にして得られたバチルス・サーモレ
オボランスＢ２３株及びバチルス・サーモレオボランス
Ｈ４１株は、８０℃付近の高温において生育することが
可能であった。また、原油中に含まれるｎ−アルカン類
を、６０％以上という高い効率で分解する事が判明し
た。
オボランスＢ２３株及びバチルス・サーモレオボランス
Ｈ４１株は、８０℃付近の高温において生育することが
可能であった。また、原油中に含まれるｎ−アルカン類
を、６０％以上という高い効率で分解する事が判明し
た。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、新規微生物に関する。
即ち、本発明は、新規微生物であるバチルス・サーモレ
オボランスＢ２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌ
ｅｏｖｏｒａｎｓ Ｂ２３）株に関する。更に、本発明
は、新規微生物であるバチルス・サーモレオボランスＨ
４１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａ
ｎｓＨ４１）株に関する。尚、本願出願日前に、バチル
ス・サーモレオボランスＢ２３株はＦＥＲＭ Ｐ−１７
６９６として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。また、バチルス・サーモレオボランスＨ
４１株はＦＥＲＭ Ｐ−１７７１５として、本願出願前
に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。バチルス・サーモレオボランスＢ２３株は平成１２
年２月２日に、バチルス・サーモレオボランスＨ４１株
は平成１２年２月７日に寄託されている。更に本発明
は、上記の微生物を用いて、石油に含有されるアルカン
類を、高温条件下において分解する方法である。
即ち、本発明は、新規微生物であるバチルス・サーモレ
オボランスＢ２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌ
ｅｏｖｏｒａｎｓ Ｂ２３）株に関する。更に、本発明
は、新規微生物であるバチルス・サーモレオボランスＨ
４１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａ
ｎｓＨ４１）株に関する。尚、本願出願日前に、バチル
ス・サーモレオボランスＢ２３株はＦＥＲＭ Ｐ−１７
６９６として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。また、バチルス・サーモレオボランスＨ
４１株はＦＥＲＭ Ｐ−１７７１５として、本願出願前
に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。バチルス・サーモレオボランスＢ２３株は平成１２
年２月２日に、バチルス・サーモレオボランスＨ４１株
は平成１２年２月７日に寄託されている。更に本発明
は、上記の微生物を用いて、石油に含有されるアルカン
類を、高温条件下において分解する方法である。
【０００９】本発明の新規微生物であるＢ２３株及びＨ
４１株は、高温有機溶媒条件下で生育し、かつアルカン
を分解するという特徴を有する。下記にも示す様に、Ｂ
２３株とＨ４１株は共に、４５℃から８０℃で生育す
る。なお、Ｂ２３株の至適生育温度は７０℃、Ｈ４１株
の至適生育温度は６５℃である。尚、本明細書中におい
て、高温とは通常の菌株は生育できない温度、具体的に
は６０℃以上の温度を意味する。
４１株は、高温有機溶媒条件下で生育し、かつアルカン
を分解するという特徴を有する。下記にも示す様に、Ｂ
２３株とＨ４１株は共に、４５℃から８０℃で生育す
る。なお、Ｂ２３株の至適生育温度は７０℃、Ｈ４１株
の至適生育温度は６５℃である。尚、本明細書中におい
て、高温とは通常の菌株は生育できない温度、具体的に
は６０℃以上の温度を意味する。
【００１０】また、本発明の微生物を用いて、原油ある
いは廃油に含有されるアルカン類を、高温条件下におい
て分解する方法も、本発明の範囲内である。本発明のＢ
２３株は、炭素鎖が１２以上のｎ−アルカンを効率的
（６０％以上）に分解した。また、Ｈ４１菌株は１５以
上のｎ−アルカンを、効率的（６０％以上）に分解し
た。微生物は通常、炭素鎖の長さが１０から１８の範囲
のｎ−アルカンを最も良く分解して、生育のエネルギー
源とする。よって、本発明のＢ２３株とＨ４１株を用い
て、環境汚染物質である炭素数が多いｎ−アルカンを処
理することができる。炭素数２０以上のアルカンを分解
できる微生物はほとんどないことを考えると、原油中に
主として含まれる炭素数が多いｎ−アルカンを、本発明
の菌株が分解できるという効果は顕著である。
いは廃油に含有されるアルカン類を、高温条件下におい
て分解する方法も、本発明の範囲内である。本発明のＢ
２３株は、炭素鎖が１２以上のｎ−アルカンを効率的
（６０％以上）に分解した。また、Ｈ４１菌株は１５以
上のｎ−アルカンを、効率的（６０％以上）に分解し
た。微生物は通常、炭素鎖の長さが１０から１８の範囲
のｎ−アルカンを最も良く分解して、生育のエネルギー
源とする。よって、本発明のＢ２３株とＨ４１株を用い
て、環境汚染物質である炭素数が多いｎ−アルカンを処
理することができる。炭素数２０以上のアルカンを分解
できる微生物はほとんどないことを考えると、原油中に
主として含まれる炭素数が多いｎ−アルカンを、本発明
の菌株が分解できるという効果は顕著である。
【００１１】本発明の微生物の菌学的性質を下記に示
す。 （生育条件） 温度：Ｂ２３株、Ｈ４１株は共に４５℃から８０℃で生
育する。至適生育温度はＢ２３株は７０℃、Ｈ４１株は
６５℃である。Ｂ２３株とＨ４１株の生育速度に対する
温度の影響を、図１に示す。図１において、○はＢ２３
株を、□はＨ４１株を示す。 ｐＨ：Ｂ２３株はｐＨ５−８で、Ｈ４１株はｐＨ５．５
−８で生育する。両菌株共に、至適ｐＨは６．５であ
る。Ｂ２３株とＨ４１株の生育速度に対するｐＨの影響
を、図２に示す。図２において、○はＢ２３株を、□は
Ｈ４１株を示す。 酸素要求性：絶対好気性である。 培地：Ｂ２３株、Ｈ４１株に共に肉エキス、酵母エキス
中で良く生育し、平板栄養培地中で白色コロニーを形成
する。表面は、比較的滑らかである。約２４時間でＯＤ
６６０ｎｍが０．３〜０．５のフルグロースに達する。
す。 （生育条件） 温度：Ｂ２３株、Ｈ４１株は共に４５℃から８０℃で生
育する。至適生育温度はＢ２３株は７０℃、Ｈ４１株は
６５℃である。Ｂ２３株とＨ４１株の生育速度に対する
温度の影響を、図１に示す。図１において、○はＢ２３
株を、□はＨ４１株を示す。 ｐＨ：Ｂ２３株はｐＨ５−８で、Ｈ４１株はｐＨ５．５
−８で生育する。両菌株共に、至適ｐＨは６．５であ
る。Ｂ２３株とＨ４１株の生育速度に対するｐＨの影響
を、図２に示す。図２において、○はＢ２３株を、□は
Ｈ４１株を示す。 酸素要求性：絶対好気性である。 培地：Ｂ２３株、Ｈ４１株に共に肉エキス、酵母エキス
中で良く生育し、平板栄養培地中で白色コロニーを形成
する。表面は、比較的滑らかである。約２４時間でＯＤ
６６０ｎｍが０．３〜０．５のフルグロースに達する。
【００１２】（形態観察） 運動性：Ｂ２３株とＨ４１株に共にない。 細胞の形：Ｂ２３株、Ｈ４１株共に桿菌である。Ｂ２３
株の走査型顕微鏡写真を図３に、Ｈ４１株の走査型顕微
鏡写真を図４に、それぞれ示す。 細胞の大きさ：Ｂ２３株とＨ４１株に共に、０．３〜
０．５μｍ×２．５μｍである。
株の走査型顕微鏡写真を図３に、Ｈ４１株の走査型顕微
鏡写真を図４に、それぞれ示す。 細胞の大きさ：Ｂ２３株とＨ４１株に共に、０．３〜
０．５μｍ×２．５μｍである。
【００１３】（生理学的特性）アビ２０ＮＥキットを用
いて、Ｂ２３株とＨ４１株の生理学的を比較した。尚、
炭化水素分解性好熱細菌の中では解析が最も進んでい
る、バシルスサーモレオボランスＬＥＨ−１株を標準と
して用いた。結果を以下に示す。 基質（反応又は酵素） B23 H41 LEH-1 硝酸カリウム（硝酸から亜硝酸への還元） ＋ ＋ ＋ Ｌ−トリプトファン（インドールの生成） − − − グルコース（酸化） − − − 塩酸Ｌ−アルギニン（アルギニンジヒドロラーゼ） − − ＋ 尿素（ウレアーゼ） − − ＋ エスキュリン（加水分解：β−グルクロニダーゼ） ＋ ＋ ＋ ゼラチン（加水分解：プロテアーゼ） ＋ ＋ ＋ ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノサイド ＋ ＋ ＋ （β−ガラクトシダーゼ） グルコース（同化） ＋ ＋ ＋ Ｌ−アラビノース（同化） ＋ − − Ｄ−マンノース（同化） ＋ − ＋ Ｄ−マンニトール（同化） − ＋ ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（同化） − − ＋ マルトース（同化） ＋ ＋ ＋ グルコン酸カリウム（同化） ＋ − ＋ ｎ−カプリン酸（同化） − − − アジピン酸（同化） ＋ − − リンゴ酸（同化） ＋ ＋ ＋ クエン酸ナトリウム（同化） − − − フェニル酢酸（同化） − − ＋ テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン ＋ ＋ − （チトクロームオキシダーゼ）
いて、Ｂ２３株とＨ４１株の生理学的を比較した。尚、
炭化水素分解性好熱細菌の中では解析が最も進んでい
る、バシルスサーモレオボランスＬＥＨ−１株を標準と
して用いた。結果を以下に示す。 基質（反応又は酵素） B23 H41 LEH-1 硝酸カリウム（硝酸から亜硝酸への還元） ＋ ＋ ＋ Ｌ−トリプトファン（インドールの生成） − − − グルコース（酸化） − − − 塩酸Ｌ−アルギニン（アルギニンジヒドロラーゼ） − − ＋ 尿素（ウレアーゼ） − − ＋ エスキュリン（加水分解：β−グルクロニダーゼ） ＋ ＋ ＋ ゼラチン（加水分解：プロテアーゼ） ＋ ＋ ＋ ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノサイド ＋ ＋ ＋ （β−ガラクトシダーゼ） グルコース（同化） ＋ ＋ ＋ Ｌ−アラビノース（同化） ＋ − − Ｄ−マンノース（同化） ＋ − ＋ Ｄ−マンニトール（同化） − ＋ ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（同化） − − ＋ マルトース（同化） ＋ ＋ ＋ グルコン酸カリウム（同化） ＋ − ＋ ｎ−カプリン酸（同化） − − − アジピン酸（同化） ＋ − − リンゴ酸（同化） ＋ ＋ ＋ クエン酸ナトリウム（同化） − − − フェニル酢酸（同化） − − ＋ テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン ＋ ＋ − （チトクロームオキシダーゼ）
【００１４】（株の同定）近年、菌株の同定においては
１６S rRNA遺伝子の比較に基づいてなされるのが主流と
なっている。そこで本発明の菌株につき、１６S rRNA遺
伝子の核酸配列を決定した。１６S rRNA遺伝子のＰＣＲ
増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００を用
いて行い、ＰＣＲにはＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラ
ーゼを用いた。ＰＣＲ増幅プライマーとして、１６Ｓ−
７（５’−ＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣ−
３’）及び１６Ｓ−１５１０（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧ
ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧ−５’）を用いた。鋳型とし
て用いた染色体ＤＮＡは、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔ
ｒｉｘ（バイオラッド、ＵＳＡ）を用いて、Ｂ２３株及
びＨ４１株より調製した。
１６S rRNA遺伝子の比較に基づいてなされるのが主流と
なっている。そこで本発明の菌株につき、１６S rRNA遺
伝子の核酸配列を決定した。１６S rRNA遺伝子のＰＣＲ
増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００を用
いて行い、ＰＣＲにはＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラ
ーゼを用いた。ＰＣＲ増幅プライマーとして、１６Ｓ−
７（５’−ＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣ−
３’）及び１６Ｓ−１５１０（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧ
ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧ−５’）を用いた。鋳型とし
て用いた染色体ＤＮＡは、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔ
ｒｉｘ（バイオラッド、ＵＳＡ）を用いて、Ｂ２３株及
びＨ４１株より調製した。
【００１５】ＤＮＡ断片の解析のために、標準的な条件
下で、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲ
ルからＤＮＡ断片を回収する目的でＧｅｎｅＣｌｅａｎ
キット（Ｂｉｏ１０１、ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲで増
幅した１．５ｋｂｐ断片を、ＴＡクローニングキット
（インビトローゲン社）を用いてクローニングベクター
ｐＣＲ２．１へとクローニングし、大腸菌ＤＨ５αの形
質転換に用いた。遺伝子の核酸配列は、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭ３１０遺伝子解析機を用いて検討した。ホモロジー
検索には、ＢＬＡＳＴＮソフトウェア（ＮＣＢＩ、ＵＳ
Ａ）を用いた。
下で、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲ
ルからＤＮＡ断片を回収する目的でＧｅｎｅＣｌｅａｎ
キット（Ｂｉｏ１０１、ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲで増
幅した１．５ｋｂｐ断片を、ＴＡクローニングキット
（インビトローゲン社）を用いてクローニングベクター
ｐＣＲ２．１へとクローニングし、大腸菌ＤＨ５αの形
質転換に用いた。遺伝子の核酸配列は、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭ３１０遺伝子解析機を用いて検討した。ホモロジー
検索には、ＢＬＡＳＴＮソフトウェア（ＮＣＢＩ、ＵＳ
Ａ）を用いた。
【００１６】本発明者らは１．５ｋｂｐの１６S rRNA遺
伝子断片をクローニングした。Ｂ２３株とＨ４１株由来
の１６S rRNA遺伝子は、Ｂ・サーモレオボランスＤＳＭ
５３６６由来の遺伝子と、Ｂ２３株は９９．５％、Ｈ４
１株は９９．６％の相同性を示した。表１に、関連する
好熱性バチルス属細菌の１６S rRNA遺伝子との相同性を
示す。Ｂ２３株とＨ４１株由来の遺伝子の相同性は９
９．６％であった。これらの結果は、両者の菌株はＢ・
サーモレオボランスに属することを示している。以下に
本発明の実施例を述べるが、本発明はこれらの実施例に
より限定を受けるものではない。
伝子断片をクローニングした。Ｂ２３株とＨ４１株由来
の１６S rRNA遺伝子は、Ｂ・サーモレオボランスＤＳＭ
５３６６由来の遺伝子と、Ｂ２３株は９９．５％、Ｈ４
１株は９９．６％の相同性を示した。表１に、関連する
好熱性バチルス属細菌の１６S rRNA遺伝子との相同性を
示す。Ｂ２３株とＨ４１株由来の遺伝子の相同性は９
９．６％であった。これらの結果は、両者の菌株はＢ・
サーモレオボランスに属することを示している。以下に
本発明の実施例を述べるが、本発明はこれらの実施例に
より限定を受けるものではない。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【実施例】（アルカンの分解性）Ｂ２３株とＨ４１株の
アルカン分解能を７０℃において検討し、ＬＥＨ−１株
と比較した（図５）。０．１％の標準ガスオイル（ｎ−
アルカン混合油）を添加したＬＢＭ培地中で培養した
後、ｎ−アルカンをヘキサンで抽出し、ＧＣ／ＦＩＤで
定量した。７０℃という条件は、ＬＥＨ−１株とＨ４１
株にとっては至適ではないが、温度により基質の粘度が
変化するために、温度を７０℃に統一した。尚、図５に
おいて●はＢ２３株を、■はＨ４１株を、▲はＬＥＨ−
１株を示す。ｎ−アルカンの量は、ＬＥＨ−１株または
Ｈ４１株により１２日間で初期量の４０％にまで減少
し、Ｂ２３株により２０日間で初期量の４０％にまで減
少した。図５に示される様に、ＬＥＨ−１株はインキュ
ベーションが始まってすぐにアルカンを分解した。対照
的に、Ｂ２３株とＨ４１株は、アルカンの分解において
７日間の遅れがあった。
アルカン分解能を７０℃において検討し、ＬＥＨ−１株
と比較した（図５）。０．１％の標準ガスオイル（ｎ−
アルカン混合油）を添加したＬＢＭ培地中で培養した
後、ｎ−アルカンをヘキサンで抽出し、ＧＣ／ＦＩＤで
定量した。７０℃という条件は、ＬＥＨ−１株とＨ４１
株にとっては至適ではないが、温度により基質の粘度が
変化するために、温度を７０℃に統一した。尚、図５に
おいて●はＢ２３株を、■はＨ４１株を、▲はＬＥＨ−
１株を示す。ｎ−アルカンの量は、ＬＥＨ−１株または
Ｈ４１株により１２日間で初期量の４０％にまで減少
し、Ｂ２３株により２０日間で初期量の４０％にまで減
少した。図５に示される様に、ＬＥＨ−１株はインキュ
ベーションが始まってすぐにアルカンを分解した。対照
的に、Ｂ２３株とＨ４１株は、アルカンの分解において
７日間の遅れがあった。
【００１９】更に、１３日間標準ガスオイル存在下で前
培養を行った細胞について、分解能を検討した。図５に
おいて、○は前培養後のＢ２３株によるアルカン分解
を、□は前培養後のＨ４１株によるアルカン分解を検討
した結果を示す。図５より、前培養を行った場合には、
Ｂ２３株とＨ４１株のアルカンの分解には、前述した様
な分解の遅れは観察されず、９０％以上のアルカンが分
解された。この結果は、いくつかのアルカン分解経路の
酵素が誘導されている事を示している。
培養を行った細胞について、分解能を検討した。図５に
おいて、○は前培養後のＢ２３株によるアルカン分解
を、□は前培養後のＨ４１株によるアルカン分解を検討
した結果を示す。図５より、前培養を行った場合には、
Ｂ２３株とＨ４１株のアルカンの分解には、前述した様
な分解の遅れは観察されず、９０％以上のアルカンが分
解された。この結果は、いくつかのアルカン分解経路の
酵素が誘導されている事を示している。
【００２０】（菌株の基質特異性の比較）ガスオイル中
で減少した個々のアルカンの量を定量することにより、
各菌株の基質特異性を解析した。即ち、Ｂ２３株とＨ４
１株の、種々の炭素数のｎ−アルカンの分解能を検討
し、ＬＥＨ−１株と比較した（図６）。図６において、
斜線のカラムはＢ２３株を、黒のカラムはＨ４１株を、
白のカラムはＬＥＨ−１株を、それぞれ示す。０．１％
の標準ガスオイルを添加したＬＢＭ培地中で、各菌株を
２０日間培養した後、残存したｎ−アルカンをヘキサン
で抽出し、ＧＣ／ＭＳにより定量した。Ｂ２３株は、炭
素鎖が１２以上のｎ−アルカンを、効率的（６０％以
上）に分解した。また、Ｈ４１株は、炭素鎖がより多い
１５以上のｎ−アルカンを、効率的（６０％以上）に分
解した。Ｂ２３株は炭素数１３から２３の基質を、殆ど
同じ効率で分解したが、Ｈ４１菌株はエイコサン（炭素
数２０）及びヘネイコサン（炭素数２１）を最も効率的
に分解した。図には示されていないが、両菌株はヘキサ
コサン（炭素数２６）及びトリアコンタン（炭素数３
０）も分解した。一方、ＬＥＨ−１株は炭素数１８以下
のｎ−アルカンを、とりわけウンデカン（炭素数１１）
を効率的に分解した。
で減少した個々のアルカンの量を定量することにより、
各菌株の基質特異性を解析した。即ち、Ｂ２３株とＨ４
１株の、種々の炭素数のｎ−アルカンの分解能を検討
し、ＬＥＨ−１株と比較した（図６）。図６において、
斜線のカラムはＢ２３株を、黒のカラムはＨ４１株を、
白のカラムはＬＥＨ−１株を、それぞれ示す。０．１％
の標準ガスオイルを添加したＬＢＭ培地中で、各菌株を
２０日間培養した後、残存したｎ−アルカンをヘキサン
で抽出し、ＧＣ／ＭＳにより定量した。Ｂ２３株は、炭
素鎖が１２以上のｎ−アルカンを、効率的（６０％以
上）に分解した。また、Ｈ４１株は、炭素鎖がより多い
１５以上のｎ−アルカンを、効率的（６０％以上）に分
解した。Ｂ２３株は炭素数１３から２３の基質を、殆ど
同じ効率で分解したが、Ｈ４１菌株はエイコサン（炭素
数２０）及びヘネイコサン（炭素数２１）を最も効率的
に分解した。図には示されていないが、両菌株はヘキサ
コサン（炭素数２６）及びトリアコンタン（炭素数３
０）も分解した。一方、ＬＥＨ−１株は炭素数１８以下
のｎ−アルカンを、とりわけウンデカン（炭素数１１）
を効率的に分解した。
【００２１】嫌気的条件下、又は空気を過度に導入した
振盪条件下では、これらの菌株はｎ−アルカンを分解し
なかった。Ｂ・サーモレオボランス株は、酸素が存在す
る静止条件下でのみ、効率的にアルカンを分解する。こ
の条件は、これらの菌株が単離された、深い地面下の状
態を模倣していると予想される。Ｂ２３株とＨ４１株
は、カテコールの様な芳香族炭化水素を分解することは
できなかった。
振盪条件下では、これらの菌株はｎ−アルカンを分解し
なかった。Ｂ・サーモレオボランス株は、酸素が存在す
る静止条件下でのみ、効率的にアルカンを分解する。こ
の条件は、これらの菌株が単離された、深い地面下の状
態を模倣していると予想される。Ｂ２３株とＨ４１株
は、カテコールの様な芳香族炭化水素を分解することは
できなかった。
【００２２】（Ｂ２３株とＨ４１株のｎ−アルカン分解
経路）ｎ−アルカン類の分解経路を解析する目的で、ヘ
キサデカン（炭素数１６）又はヘプタデカン（炭素数１
７）を添加したＢ２３株とＨ４１株を、ＬＢＭ中で２０
日間培養した。これらの細胞から疎水性画分を抽出し
た。抽出した画分をサポニン化し、メチル化してＧＣ／
ＦＤＩにより比較を行った。その様にして細胞内に蓄積
した脂肪酸を解析した結果が図７である。図７におい
て、使用した菌株と基質はそれぞれ、（ａ）Ｂ２３株、
ヘキサデカン （ｂ）Ｂ２３株、ヘプタデカン （ｃ）
Ｈ４１株、ヘキサデカン （ｄ）Ｈ４１株、ヘプタデカ
ンである。
経路）ｎ−アルカン類の分解経路を解析する目的で、ヘ
キサデカン（炭素数１６）又はヘプタデカン（炭素数１
７）を添加したＢ２３株とＨ４１株を、ＬＢＭ中で２０
日間培養した。これらの細胞から疎水性画分を抽出し
た。抽出した画分をサポニン化し、メチル化してＧＣ／
ＦＤＩにより比較を行った。その様にして細胞内に蓄積
した脂肪酸を解析した結果が図７である。図７におい
て、使用した菌株と基質はそれぞれ、（ａ）Ｂ２３株、
ヘキサデカン （ｂ）Ｂ２３株、ヘプタデカン （ｃ）
Ｈ４１株、ヘキサデカン （ｄ）Ｈ４１株、ヘプタデカ
ンである。
【００２３】図７より、特徴的に認められるピークが、
ヘキサデカン酸メチルエステル、ペンタデカン酸メチル
エステル、ヘプタデカン酸メチルエステルに由来するこ
とが判った。即ち、唯一の炭素源として添加したアルカ
ンと等しい炭素数の脂肪酸が菌体内より検出され、又ヘ
プタデカンを添加した場合には炭素数が二つ少ないペン
タデカン酸メチルエステルも検出された。これらの結果
により、Ｂ２３株とＨ４１株は、シュードモナス属の細
菌などと同様の分解経路によりアルカンを分解している
ことが示唆された。即ち、アルカンの末端をアルコー
ル、アルデヒド、脂肪酸へと順次酸化していき、アシル
ＣｏＡから最終的にβ酸化によりアセチルＣｏＡとして
利用するというターミナル酸化系によってアルカンを分
解していることが示された。データは示さないが、細胞
が本経路に関係するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性及び
スーパーオキシドジスムターゼ活性を有することは別途
確認済である。なお、ヘキサデカンよりも炭素数の二つ
少ない脂肪酸メチルエステルについては、ヘキサデカン
のピークと重なったため、確認できなかった。
ヘキサデカン酸メチルエステル、ペンタデカン酸メチル
エステル、ヘプタデカン酸メチルエステルに由来するこ
とが判った。即ち、唯一の炭素源として添加したアルカ
ンと等しい炭素数の脂肪酸が菌体内より検出され、又ヘ
プタデカンを添加した場合には炭素数が二つ少ないペン
タデカン酸メチルエステルも検出された。これらの結果
により、Ｂ２３株とＨ４１株は、シュードモナス属の細
菌などと同様の分解経路によりアルカンを分解している
ことが示唆された。即ち、アルカンの末端をアルコー
ル、アルデヒド、脂肪酸へと順次酸化していき、アシル
ＣｏＡから最終的にβ酸化によりアセチルＣｏＡとして
利用するというターミナル酸化系によってアルカンを分
解していることが示された。データは示さないが、細胞
が本経路に関係するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性及び
スーパーオキシドジスムターゼ活性を有することは別途
確認済である。なお、ヘキサデカンよりも炭素数の二つ
少ない脂肪酸メチルエステルについては、ヘキサデカン
のピークと重なったため、確認できなかった。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、バチルス・サーモレオボ
ランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒ
ａｎｓ）に属し、高温有機溶媒条件下で生育し、かつア
ルカン類を分解する事が可能な新規微生物である、バチ
ルス・サーモレオボランスＢ２３株及びバチルス・サー
モレオボランスＨ４１株が与えられた。更に本発明によ
り、上記微生物を用いて石油に含有されるアルカンを分
解する方法が与えられた。
ランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒ
ａｎｓ）に属し、高温有機溶媒条件下で生育し、かつア
ルカン類を分解する事が可能な新規微生物である、バチ
ルス・サーモレオボランスＢ２３株及びバチルス・サー
モレオボランスＨ４１株が与えられた。更に本発明によ
り、上記微生物を用いて石油に含有されるアルカンを分
解する方法が与えられた。
【図１】 図１は、Ｂ２３株とＨ４１株の生育の温度依
存性を示すグラフである。
存性を示すグラフである。
【図２】 図２は、Ｂ２３株とＨ４１株の生育のｐＨ依
存性を示すグラフである。
存性を示すグラフである。
【図３】 図３は、Ｂ２３株の走査型電子顕微鏡写真で
ある。
ある。
【図４】 図４は、Ｈ４１株の走査型電子顕微鏡写真で
ある。
ある。
【図５】 図５は、Ｂ２３株とＨ４１株及びＬＥＨ−１
株によるｎ−アルカン分解の、経時変化を示す図であ
る。
株によるｎ−アルカン分解の、経時変化を示す図であ
る。
【図６】 図６は、Ｂ２３株とＨ４１株及びＬＥＨ−１
株によるｎ−アルカン分解の、炭素鎖長による基質特異
性を示す図である。
株によるｎ−アルカン分解の、炭素鎖長による基質特異
性を示す図である。
【図７】 図７は、Ｂ２３株とＨ４１株による、ｎ−ア
ルカン分解時の代謝産物をガスクロマトグラフィーで解
析した結果である。
ルカン分解時の代謝産物をガスクロマトグラフィーで解
析した結果である。
Claims (5)
- 【請求項１】 アルカンを分解する作用を有する、バチ
ルス・サーモレオボランス ＦＥＲＭ Ｐ−１７６９
６。 - 【請求項２】 アルカンを分解する作用を有する、バチ
ルス・サーモレオボランス ＦＥＲＭ Ｐ−１７７１
５。 - 【請求項３】 バチルス・サーモレオボランス ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７６９６とバチルス・サーモレオボランス
ＦＥＲＭ Ｐ−１７７１５との少なくとも一方を用い
て、アルカン類を分解する方法。 - 【請求項４】 原油あるいは廃油に含有される高分子ア
ルカン類を分解する、請求項３記載のアルカン類を分解
する方法。 - 【請求項５】 ６０℃以上の高温でアルカン類を分解す
る、請求項３又は４記載のアルカン類を分解する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000034638A JP3120114B1 (ja) | 2000-02-14 | 2000-02-14 | アルカン類を分解する新規微生物、アルカン類を分解する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000034638A JP3120114B1 (ja) | 2000-02-14 | 2000-02-14 | アルカン類を分解する新規微生物、アルカン類を分解する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3120114B1 JP3120114B1 (ja) | 2000-12-25 |
| JP2001224360A true JP2001224360A (ja) | 2001-08-21 |
Family
ID=18558941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000034638A Expired - Fee Related JP3120114B1 (ja) | 2000-02-14 | 2000-02-14 | アルカン類を分解する新規微生物、アルカン類を分解する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3120114B1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100500398B1 (ko) * | 2002-05-23 | 2005-07-12 | 바이오세인트(주) | 신규의 고온성 미생물 및 이를 이용한 고온 폐가스의 생물학적 정화방법 |
| WO2006053469A1 (fr) * | 2004-11-17 | 2006-05-26 | Nankai University | Geobacillus thermodenitrificans, procede de criblage et utilisations |
| WO2020009097A1 (ja) * | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Ｉｇａバイオリサーチ株式会社 | 石油関連物質により汚染された環境の除染方法および使用する資材 |
-
2000
- 2000-02-14 JP JP2000034638A patent/JP3120114B1/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100500398B1 (ko) * | 2002-05-23 | 2005-07-12 | 바이오세인트(주) | 신규의 고온성 미생물 및 이를 이용한 고온 폐가스의 생물학적 정화방법 |
| WO2006053469A1 (fr) * | 2004-11-17 | 2006-05-26 | Nankai University | Geobacillus thermodenitrificans, procede de criblage et utilisations |
| WO2020009097A1 (ja) * | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Ｉｇａバイオリサーチ株式会社 | 石油関連物質により汚染された環境の除染方法および使用する資材 |
| CN113195122A (zh) * | 2018-07-06 | 2021-07-30 | Iga生物研究股份有限公司 | 遭石油相关物质污染的环境的净化方法和所使用的材料 |
| JPWO2020009097A1 (ja) * | 2018-07-06 | 2021-08-26 | Ｉｇａバイオリサーチ株式会社 | 石油関連物質により汚染された環境の除染方法および使用する資材 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3120114B1 (ja) | 2000-12-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gao et al. | Shewanella loihica sp. nov., isolated from iron-rich microbial mats in the Pacific Ocean | |
| Sawabe et al. | Vibrio halioticoli sp. nov., a non-motile alginolytic marine bacterium isolated from the gut of the abalone Haliotis discus hannai | |
| Liu et al. | Hydrogenispora ethanolica gen. nov., sp. nov., an anaerobic carbohydrate-fermenting bacterium from anaerobic sludge | |
| Rahman et al. | Geobacillus zalihae sp. nov., a thermophilic lipolytic bacterium isolated from palm oil mill effluent in Malaysia | |
| Holmes et al. | Prolixibacter bellariivorans gen. nov., sp. nov., a sugar-fermenting, psychrotolerant anaerobe of the phylum Bacteroidetes, isolated from a marine-sediment fuel cell | |
| Kevbrin et al. | Anoxybacillus kamchatkensis sp. nov., a novel thermophilic facultative aerobic bacterium with a broad pH optimum from the Geyser valley, Kamchatka | |
| Fu et al. | Flavobacterium beibuense sp. nov., isolated from marine sediment | |
| Kim et al. | Shewanella arctica sp. nov., an iron-reducing bacterium isolated from Arctic marine sediment | |
| Romano et al. | Thermoanaerobacterium thermostercus sp. nov., a new anaerobic thermophilic hydrogen-producing bacterium from buffalo-dung | |
| Martínez-Murcia et al. | Aeromonas lusitana sp. nov., isolated from untreated water and vegetables | |
| Najar et al. | A systematic review of the genera Geobacillus and Parageobacillus: their evolution, current taxonomic status and major applications | |
| Wang et al. | Tumebacillus flagellatus sp. nov., an α-amylase/pullulanase-producing bacterium isolated from cassava wastewater | |
| Lai et al. | Marispirillum indicum gen. nov., sp. nov., isolated from a deep-sea environment | |
| Liu et al. | Marinobacter antarcticus sp. nov., a halotolerant bacterium isolated from Antarctic intertidal sandy sediment | |
| Bing et al. | Caldicellulosiruptor changbaiensis sp. nov., a cellulolytic and hydrogen-producing bacterium from a hot spring | |
| Varel et al. | Clostridium herbivorans sp. nov., a cellulolytic anaerobe from the pig intestine | |
| Shang et al. | Themoanaerobacterium calidifontis sp. nov., a novel anaerobic, thermophilic, ethanol-producing bacterium from hot springs in China | |
| Yoon et al. | Shewanella marisflavi sp. nov. and Shewanella aquimarina sp. nov., slightly halophilic organisms isolated from sea water of the Yellow Sea in Korea | |
| Watanabe et al. | Proposal of Effusibacillus lacus gen. nov., sp. nov., and reclassification of Alicyclobacillus pohliae as Effusibacillus pohliae comb. nov. and Alicyclobacillus consociatus as Effusibacillus consociatus comb. nov. | |
| Xue et al. | Caldalkalibacillus thermarum gen. nov., sp. nov., a novel alkalithermophilic bacterium from a hot spring in China | |
| Yang et al. | Alcanivorax mobilis sp. nov., a new hydrocarbon-degrading bacterium isolated from deep-sea sediment | |
| Fukuda et al. | Rhodoligotrophos appendicifer gen. nov., sp. nov., an appendaged bacterium isolated from a freshwater Antarctic lake | |
| Jiang et al. | Defluviimonas indica sp. nov., a marine bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent environment | |
| Zhou et al. | Aquimarina agarivorans sp. nov., a genome-sequenced member of the class Flavobacteriia isolated from Gelidium amansii | |
| Baek et al. | Brevibacillus ginsengisoli sp. nov., a denitrifying bacterium isolated from soil of a ginseng field |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |