JP2001218587A - Baculovirus containing minimal cmv promoter - Google Patents
Baculovirus containing minimal cmv promoterInfo
- Publication number
- JP2001218587A JP2001218587A JP2000035693A JP2000035693A JP2001218587A JP 2001218587 A JP2001218587 A JP 2001218587A JP 2000035693 A JP2000035693 A JP 2000035693A JP 2000035693 A JP2000035693 A JP 2000035693A JP 2001218587 A JP2001218587 A JP 2001218587A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- baculovirus
- promoter
- protein
- sequence
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【従来の技術】バキュロウイルスは鱗翅目（レピドプテ
ラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ））の昆虫に主に感染する
ＤＮＡウイルスのファミリーであるバキュロウイルスゲ
ノムは一般に約８０〜２３０kbの長さの二本鎖ＤＮＡ分
子である。バキュロウイルスは、両方ともウイルス生活
環の後期段階の間、強力に活性である内因性ポリヒドリ
ン及びｐ１０プロモーターにより駆動される大量の非バ
キュロウイルスタンパク質を発現することができる。BACKGROUND OF THE INVENTION Baculovirus is a family of DNA viruses that mainly infect insects of the order Lepidoptera Baculovirus genomes are generally double-stranded DNA molecules of about 80-230 kb in length. Baculovirus, both during the later stages of the viral life cycle, it is possible to express large amounts of non-baculovirus protein that is driven by the endogenous polyhedrin and p 10 promoter which is strongly active.
【０００２】[0002]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特定の
タンパク質のためには、バキュロウイルス生活環の早期
の発現が適当で好まれる場合がある。例えば、ウイルス
生活環の後期では翻訳後グリコシル化が少くともいくら
かは害されるので、ウイルス生活環の早期のグリコプロ
テインの発現を駆動することが要求され得る。However, for certain proteins, early expression of the baculovirus life cycle may be appropriate and preferred. For example, late in the viral life cycle at least some of the post-translational glycosylation may be impaired, so it may be necessary to drive the expression of glycoproteins early in the viral life cycle.
【０００３】[0003]
【課題を解決するための手段】本発明は、最小のサイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）即時−早期プロモーターがバ
キュロウイルスベクターの遺伝子の発現を効率よく駆動
することができるという発見に基づく。ＣＭＶプロモー
ターはウイルス生活環を通じて制御されないので、この
発見は、ウイルス生活環の早期及び後期においてＲＮＡ
又はタンパク質を高レベルで発現することができるバキ
ュロウイルスベクターの作製を許容する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on the discovery that a minimal cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter can efficiently drive the expression of a baculovirus vector gene. Since the CMV promoter is not regulated throughout the viral life cycle, this finding suggests that RNA may be expressed early and late in the viral life cycle.
Alternatively, it allows the production of baculovirus vectors that can express proteins at high levels.
【０００４】従って、本発明は、ＣＭＶプロモーター配
列及びＲＮＡ（例えば非バキュロウイルスＲＮＡ）をコ
ードする配列を含むゲノムを有するバキュロウイルスを
特徴とする。ＲＮＡ（例えば非バキュロウイルスタンパ
ク質をコードするｍＲＮＡ）の発現は最小ＣＭＶプロモ
ーター配列（例えば配列番号：１）により駆動される。
最小ＣＭＶプロモーター配列の例には、全長のＣＭＶプ
ロモーター配列内にしばしば含まれるが最小ＣＭＶプロ
モーター配列には存在しない上流配列である配列番号：
２の配列を含まないものがある。これらの配列を以下に
示す。[0004] Accordingly, the invention features a baculovirus having a genome that includes a CMV promoter sequence and a sequence encoding RNA (eg, non-baculovirus RNA). Expression of RNA (eg, mRNA encoding non-baculovirus proteins) is driven by a minimal CMV promoter sequence (eg, SEQ ID NO: 1).
Examples of minimal CMV promoter sequences include SEQ ID NO: an upstream sequence often included within the full length CMV promoter sequence but not present in the minimal CMV promoter sequence.
Some do not include the 2 sequence. These sequences are shown below.
【０００５】ＣＭＶ最小プロモーター配列：[0005] CMV minimal promoter sequence:
【０００６】[0006]
【化１】 Embedded image
【０００７】全長ＣＭＶプロモーターから削除される配
列：Sequences deleted from the full length CMV promoter:
【０００８】[0008]
【化２】 Embedded image
【０００９】天然のＣＭＶゲノムにおいて、ＣＭＶ最小
プロモーター配列（配列番号：１）は全長ＣＭＶプロモ
ーター配列から削除された配列（配列番号：２）のすぐ
下流にある。ＣＭＶプロモーター配列が配列番号：２の
配列を含まないと言う場合、それは、プロモーター配列
が配列番号：２の完全なヌクレオチド配列を含まないこ
とを意味する。これにより、プロモーター配列は配列番
号：２の配列のフラグメントを含んでもよく、なお配列
番号：２の配列を含まないと考えることができる。典型
的には、本発明のバキュロウイルスにおける適切なＣＭ
Ｖプロモーター配列は配列番号：２内に実質的な欠失を
有する（例えば、少くとも２５，５０，１００又は２０
０ヌクレオチドの欠失削除）。適切なＣＭＶプロモータ
ーは、配列番号：２の配列の１つのヌクレオチドの欠失
さえ含んでもよく、なお配列番号：２の配列を含まない
と考えることができる。[0009] In the native CMV genome, the CMV minimal promoter sequence (SEQ ID NO: 1) is immediately downstream of a sequence deleted from the full length CMV promoter sequence (SEQ ID NO: 2). If the CMV promoter sequence does not include the sequence of SEQ ID NO: 2, it means that the promoter sequence does not include the complete nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. Thus, it can be considered that the promoter sequence may include a fragment of the sequence of SEQ ID NO: 2, and may not include the sequence of SEQ ID NO: 2. Typically, a suitable CM in the baculovirus of the invention
The V promoter sequence has a substantial deletion in SEQ ID NO: 2 (eg, at least 25, 50, 100 or 20
Deletion of 0 nucleotides). A suitable CMV promoter may even include a deletion of one nucleotide of the sequence of SEQ ID NO: 2 and still be considered to not include the sequence of SEQ ID NO: 2.
【００１０】ＣＭＶプロモーター配列は、必ずしもこれ
と同一である必要はないが、バキュロウイルスゲノムの
関係でＲＮＡ転写を駆動することができる天然のサイト
メガロウイルス由来のいずれかの配列である。非バキュ
ロウイルスＲＮＡ又はタンパク質は、天然のバキュロウ
イルスのゲノムによりコードされないいずれかのＲＮＡ
又はタンパク質である。但し、非バキュロウイルスＲＮ
Ａ又はタンパク質の一部はバキュロウイルス配列を含み
得る。例えば、非バキュロウイルスタンパク質は、バキ
ュロウイルスタンパク質及びヒトタンパク質から形成さ
れる融合タンパク質であり得る。非バキュロウイルスタ
ンパク質は、検出可能なタンパク質、例えばルシフェラ
ーゼであっても、生きている生物殺有害生物剤としての
バキュロウイルスの使用を増大させ得る昆虫毒素であっ
てもよい。検出可能なタンパク質は、酵素、放射能、色
原、蛍光、又はルミネセンス特性を示し得る。[0010] The CMV promoter sequence is not necessarily identical, but is any sequence derived from a natural cytomegalovirus that is capable of driving RNA transcription in the context of the baculovirus genome. Non-baculovirus RNA or protein is any RNA not encoded by the native baculovirus genome.
Or a protein. However, non-baculovirus RN
A or a portion of the protein may include a baculovirus sequence. For example, the non-baculovirus protein can be a fusion protein formed from a baculovirus protein and a human protein. The non-baculovirus protein can be a detectable protein, such as luciferase, or an insect toxin that can enhance the use of the baculovirus as a living biopesticide. A detectable protein may exhibit enzymatic, radioactive, chromogenic, fluorescent, or luminescent properties.
【００１１】本発明は、昆虫細胞に本発明のバキュロウ
イルスを感染させることにより昆虫細胞において非バキ
ュロウイルスＲＮＡ又はタンパク質を発現する方法も含
む。本発明のバキュロウイルス及び方法は、（最小ＣＭ
Ｖプロモーターにより駆動される組換えバキュロウイル
スＲＮＡ又はタンパク質を含む）外来ＲＮＡ及びタンパ
ク質の生活環と独立した高レベルの発現を供する。例え
ば、生物殺有害生物剤をコードするＲＮＡは、組換えバ
キュロウイルス内の配列によりコードされ得る。次にこ
のバキュロウイルスは、自然の感染により昆虫害虫集団
を抑制するのに用いることができる。The present invention also includes a method for expressing non-baculovirus RNA or protein in insect cells by infecting insect cells with the baculovirus of the present invention. The baculoviruses and methods of the present invention include:
Provides high levels of life cycle independent expression of foreign RNAs and proteins (including recombinant baculovirus RNAs or proteins driven by the V promoter). For example, RNA encoding a biopesticide can be encoded by a sequence in a recombinant baculovirus. This baculovirus can then be used to control insect pest populations by natural infection.
【００１２】更に、本発明は、配列番号：２の配列を含
まないＣＭＶプロモーター配列を含むプラスミドを含
む。好ましくは、そのＣＭＶプロモーターは配列番号：
１の配列を含む。更に、本発明は、細胞内でタンパク質
を発現させる方法であって、その細胞を、配列番号：２
の配列を含まないプラスミドで形質転換することを含む
方法も含む。好ましくは、本発明の方法は、その細胞を
配列番号：１の配列を含むプラスミドで形質転換するこ
とを含む。Further, the present invention includes a plasmid containing a CMV promoter sequence that does not include the sequence of SEQ ID NO: 2. Preferably, the CMV promoter is SEQ ID NO:
1 sequence. Further, the present invention relates to a method for expressing a protein in a cell, the method comprising:
And transforming with a plasmid that does not contain the sequence of Preferably, the method of the invention comprises transforming the cell with a plasmid comprising the sequence of SEQ ID NO: 1.
【００１３】本発明の他の特徴又は利点は、以下の説明
を記載から及び特許請求の範囲からも明らかになるであ
ろう。[0013] Other features or advantages of the invention will be apparent from the following description, and from the claims.
【００１４】[0014]
【発明の実施の形態】本発明は、ＲＮＡ又はタンパク質
の発現を駆動する最小ＣＭＶプロモーター配列を含む新
規バキュロウイルスに関する。最小ＣＭＶプロモーター
配列は、全長ＣＭＶ即時早期プロモーター配列から欠失
した配列である配列番号：２（上述）がない機能的ＣＭ
Ｖプロモーターである。最小プロモーター配列の例は配
列番号：１である（上述）。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to novel baculoviruses that contain a minimal CMV promoter sequence that drives RNA or protein expression. The minimal CMV promoter sequence is a functional CM lacking SEQ ID NO: 2 (described above), which is a sequence deleted from the full length CMV immediate early promoter sequence.
V promoter. An example of a minimal promoter sequence is SEQ ID NO: 1 (described above).
【００１５】種々の外来遺伝子要素を有するバキュロウ
イルスをクローニングするための標準的な方法は公知で
ある。組換えバキュロウイルスを昆虫又はその細胞導入
するための方法も公知である。例えば、 Pfeiferら、Ge
ne 188 : 183〜190, 1999 ;及びClemら、J. Virol. 68:
6759〜6762, 1994を参照のこと。更に詳述しないが、
当業者は、先の開示及び以下の記載に基づいて、本発明
をその最も十分な程度まで利用すると信じられる。以下
の例は当業者がいかに本発明を実施するかを単に実例で
示すものとして解釈すべきであり、いずれにしても、本
開示を限定するものではない。本開示に言及されるいず
れの出版物も引用により本明細書に組み込まれる。Standard methods for cloning baculoviruses having various foreign genetic elements are known. Methods for introducing recombinant baculovirus into insects or their cells are also known. For example, Pfeifer et al., Ge
ne 188: 183-190, 1999; and Clem et al., J. Virol. 68:
See 6759-6762, 1994. Without further elaboration,
It is believed that one skilled in the art, based on the preceding disclosure and the description below, will utilize the invention to its fullest extent. The following examples should be construed as merely illustrative of how those skilled in the art can practice the present invention, and are not intended to limit the disclosure in any way. Any publications mentioned in this disclosure are incorporated herein by reference.
【００１６】以下の記載に用いる実験手順並びに組換え
プラスミド及びウイルスは最初に議論される。組換えオ
ートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多重核多角体ウイルス（Ａｃ
ＭＮＰＶｓ）を作るために、ホタルルシフェラーゼをコ
ードするＤＮＡ及び種々のプロモーターを、完全なポリ
ヒドリン遺伝子及び外来遺伝子発現のためのｐ１０プロ
モーターを含む転移ベクターｐＡｃＵＷ２１（Ｐｈａｇ
ｒＭｉｎｇｅｎ）にクローン化した（Roelvinkら、J. G
en. Virol 73: 1481〜1489, 1992; Vlakら、Virology 1
79 : 312〜320, 1990 ;及び Weyerら、J. Gen. Virol 7
1: 1525〜1534, 1990）。最小ＣＭＶ（ＣＭＶｍｉｎ）
プロモーター及びＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターは
Gossenら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5547〜555
1, 1992に記載される。ＣＭＶｍｉｎプロモーターはＣ
ＭＶプロモーターの＋７５〜−３５の間の配列を含む。
ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターは、ＣＭＶｍｉｎプ
ロモーターに配合したＴｎ１０のオペレーター０２由来
の４２−bp Ｔｅｔ０配列の７つのコピーを含む（Goss
enら、前掲）。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写開始
部位の＋３０から終止コドンまでを含むルシフェラーゼ
遺伝子のコーディング領域(Wetら、Mol. Cell biol.7:
725〜737, 1989)をＣＭＶｍｉｎプロモーターによって
駆動させた。ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターをプラ
スミドｐＴＲＥ−Ｌｕｃ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）から得て
ｐＡｃＵＷ２１に別個に挿入し、このプラスミドのもと
にあったｐ１０プロモーターを置換した。生じたプラス
ミドを各々ｐＡＰｃｍＬ及びｐＡＰｃｍＬと名づけた。
プラスミドｐＡＰｃｍＬを に受託
番号としてブタペスト条約下でChina Center For Type
Culture Collection (CCTCC)に寄託した。ｐＴＲＥ−Ｌ
ｕｃプラスミドからのルシフェラーゼコーディング配列
（位置５０７〜２１８７bpからのもの、ＣｌｏｎＴｅｃ
ｈ）もプラスミドｐＡｃＵＷ２１内のＡｃＭＮＰＶのｐ
１０プロモーターの制御下にｐＡｃＵＷ２１にクローン
化し、生じたプラスミドをｐＡＰ１０Ｌと名づけた。ｐ
Ｔｅｔ−Ｏｆｆから得た全長ＣＭＶプロモーター（位置
６８〜６７３bpから、ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を、ｐＴＲＥ
−Ｌｕｃから得たルシフェラーゼコーディング領域（位
置５０７〜２１８６bpから、ＣｌｏｎＴｅｃｈ）と一緒
に、ｐ１０プロモーターのかわりにｐＡｃＵＷ２１に挿
入し、生じたプラスミドをｐＡＰｃＬと名づけた。The experimental procedures and recombinant plasmids and viruses used in the following description are first discussed. Recombinant Autographa californica ( Autographa
californica multinucleopolyhedrovirus (Ac)
To make MNPVs), the transfer vector comprising the p 10 promoter for the DNA and various promoters encoding firefly luciferase, complete polyhedrin gene and foreign gene expression pAcUW21 (Phag
rMingen) (Roelvink et al., J. G.
en.Virol 73: 1481-1489, 1992; Vlak et al., Virology 1.
79: 312-320, 1990; and Weyer et al., J. Gen. Virol 7
1: 1525-1534, 1990). Minimum CMV (CMVmin)
Promoter and TRE-CMVmin promoter
Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-555.
1, 1992. CMVmin promoter is C
Includes sequences between +75 and -35 of the MV promoter.
The TRE-CMVmin promoter contains seven copies of the 42-bp Tet0 sequence from operator 02 of Tn10 combined with the CMVmin promoter (Goss
en et al., supra). The coding region of the luciferase gene, which includes from +30 to the termination codon of the transcription start site of the firefly luciferase gene (Wet et al., Mol. Cell biol. 7:
725-737, 1989) was driven by the CMVmin promoter. The TRE-CMVmin promoter separately inserted into pAcUW21 obtained from plasmid pTRE-Luc (ClonTech), to replace the p 10 promoter was in the original plasmid. The resulting plasmids were named pAPcmL and pAPcmL, respectively.
Plasmid pAPcmL as accession number under China Center For Type under the Budapest Treaty
Deposited with Culture Collection (CCTCC). pTRE-L
luciferase coding sequence from the uc plasmid (from positions 507-2187 bp, ClonTec
h) also the pM of AcMNPV in plasmid pAcUW21.
It was cloned into pAcUW21 under the control of 10 promoter and the resulting plasmid was named pAP10L. p
The full-length CMV promoter from Tet-Off (from positions 68-673 bp, ClonTech) was added to pTRE
(From the position 507~2186bp, ClonTech) luciferase coding region was obtained from -Luc with and inserted into pAcUW21 instead of p 10 promoter, resulting plasmid was named PAPcL.
【００１７】プラスミドｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（ＣｌｏｎＴ
ｅｃｈ）からのトランスアクティベータータンパク質ｔ
ＴＡのコーディング領域をｐ１０プロモーターの制御下
でｐＡｃＵＷ２１にクローン化し、生じたプラスミドを
ｐＡＰ１０Ｔと名づけた。ｐＥＧＦＰ−１プラスミド
（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）からの増強される緑色蛍光タンパ
ク質（ＥＧＦＰ）のコーディング配列をｐＡｃＵＷ２１
にクローン化し、ｐ１０プロモーターの制御下におき、
生じたプラスミドをｐＡＰ１０Ｅと名づけた。ｐＡＰｔ
ｃｍＬプラスミド中のルシフェラーゼコーディング配列
をＥＧＦＰコーディング配列で置換し、そのＥＧＦＰコ
ーディング領域がＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターの
制御下にある生じた構成物をｐＡＰｔｃｍＥと名づけ
た。The plasmid pTet-Off (ClonT
ech) transactivator protein t
The TA coding region of cloned into pAcUW21 under the control of the p 10 promoter, resulting plasmid was named PAP10T. The coding sequence of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) from the pEGFP-1 plasmid (ClonTech) was changed to pAcUW21
To cloned, placed under the control of the p 10 promoter,
The resulting plasmid was named pAP10E. pAPt
The luciferase coding sequence in the cmL plasmid was replaced with the EGFP coding sequence, and the resulting construct whose EGFP coding region was under the control of the TRE-CMVmin promoter was named pAPtcmE.
【００１８】プラスミドｐＡＰｃＬ，ｐＡＰ１０Ｌ，ｐ
ＡＰｃｍＬ、及びｐＡＰｔｃｍＬにｖＡｃＲＰ２３．Ｌ
ａｃＺ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を同時トランスフェク
トし、ＡｃＭＮＰＶの直鎖ゲノムＤＮＡをＬｉｐｏｆｅ
ｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用
いてＳｆ２１細胞に移入した。生じた組換えウイルス
は、全長ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｍｉｎプロモータ
ー、ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーター、及びｐ１０プ
ロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含んだ。
これらのウイルスの各々をｖＡＰｃＬ，ｖＡＰｃｍＬ，
ｖＡＰｔｃｍＬ、及びｖＡＰ１０Ｌと名づけた。ｐＡＰ
ｔｃｍＥ及びｐＡＰ１０ＥプラスミドにｖＡｃＲＰ２
３．ＬａｃＺを同時トランスフェクトした。ＴＲＥ−Ｃ
ＭＶｍｉｎプロモーター及びｐ１０プロモーターの制御
下にＥＧＦＰ遺伝子を含む生じた組換えウイルスを各々
ｖＡＰｔｃｍＥ及びｖＡＰ１０Ｅと名づけた。ｐＡＰ１
０ＴにｖＡｃＲＰ２３．ＬａｃＺを同時トランスフェク
トし、ｐ１０プロモーターの制御下にｔＴＡ遺伝子を含
む生じた組換えウイルスをｖＡＰ１０Ｔと名づけた。こ
れらの組換えウイルス全てを３回の終点希釈により精製
し、閉塞及びルシフェラーゼの存在、ＥＧＦＰ、又はｔ
ＴＡ発現により同定した。The plasmids pAPcL, pAP10L, p
VAcRP23.APcmL and pAPtcmL. L
acZ (PharMingen) was co-transfected, and the linear genomic DNA of AcMNPV was Lipofe.
The cells were transferred to Sf21 cells using ctin (Life-Technologies). The resulting recombinant viruses contained the full-length CMV promoter, CMVmin promoter, TRE-CMVmin promoter, and the luciferase gene under the control of the p 10 promoter.
Each of these viruses was designated vAPcL, vAPcmL,
They were named vAPtcmL and vAP10L. pAP
vAcRP2 in the tcmE and pAP10E plasmids
3. LacZ was co-transfected. TRE-C
Each recombinant virus produced containing EGFP gene under the control of MVmin promoter and p 10 promoter was named vAPtcmE and VAP10E. pAP1
VAcRP23. Cotransfected LacZ, the recombinant virus produced containing tTA gene under the control of the p 10 promoter was named VAP10T. All of these recombinant viruses were purified by three end-point dilutions, and the presence of occlusion and luciferase, EGFP or t
Identified by TA expression.
【００１９】Ｓｆ２１細胞（２×１０5 ）をＰＢＳで２
回、洗い、示される時間、１００mMリン酸カリウム（pH
７．８）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び２
mMβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液（３００μ
ｌ）中に溶解した。その細胞ライゼート（５０μｌ）
を、２５mMリン酸緩衝液（pH７．８）、４mM ＥＧＴ
Ａ、１５mM ＭｇＳＯ4 、１mMジチオトレイトール、及
び０．２mM ＡＴＰを含む反応緩衝液（１８０μｌ）と
共にインキュベートした。その後、５０μｌの０．２mM
ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を自動注入し、相
対的光単位（ＲＬＶ／１０秒）を、ルミノメーター（Ｂ
ｅｒｔｈｏｌｄ．Ｌｕｎａｔ ＬＢ９５０１）を用いて
測定した。結果を、３回の独立した実験の３回重複アッ
セイからの、平均ルシフェラーゼ活性対感染の時間とし
てプロットした。Sf21 cells (2 × 10 5 ) were treated with PBS for 2 hours.
Times, wash, 100 mM potassium phosphate (pH
7.8), 0.2% Triton X-100, and 2
Buffer containing mM β-mercaptoethanol (300 μl
1). Cell lysate (50 μl)
With 25 mM phosphate buffer (pH 7.8), 4 mM EGT
A, incubated with 180 μl of reaction buffer containing 15 mM MgSO 4 , 1 mM dithiothreitol, and 0.2 mM ATP. Then, 50 μl of 0.2 mM
The luciferin (Promega) solution was automatically injected, and the relative light units (RLV / 10 seconds) were measured using a luminometer (B
erthold. (Lunat LB9501). Results were plotted as mean luciferase activity versus time of infection from triplicate assays in three independent experiments.
【００２０】Ｃｙｔｏ Ｆｌｕｏｒ ２３００／２３５
０蛍光測定システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて可
溶性ＥＧＦＰ蛍光を定量した。Ｓｆ２１細胞（２×１０
5 ）をＰＢＳ緩衝液で２回、洗い、示される時間、１０
０mMリン酸カリウム（pH７．８）、０．２％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、及び２mM β−メルカプトエタノー
ルを含む緩衝液（３００μｌ）中に溶解した。細胞ライ
ビート（５０μｌ）を、４８５／２０nm励起フィルター
及び５３０／２５nm放射フィルターを備えたＣｙｔｏ
Ｆｌｕｏｒプレートソーダーを用いてＥＧＦＰ蛍光検出
前に９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。Ｃ
ｙｔｏ Ｆｌｕｏｒ ２３００／２３５０蛍光測定シス
テムは、０．１〜１００μｇ／mlの範囲にわたって直線
的に、ＥＧＦＰ蛍光を定量することができた。結果を、
３回の独立した実験の３回重複アッセイから、平均ＥＧ
ＦＰ蛍光対感染後の時間としてプロットした。Cyto Fluor 2300/235
Soluble EGFP fluorescence was quantified using a 0 fluorescence measurement system (Millipore). Sf21 cells (2 × 10
5 ) was washed twice with PBS buffer, for the indicated time, 10
0 mM potassium phosphate (pH 7.8), 0.2% Trit
on X-100 and 2 mM β-mercaptoethanol in a buffer (300 μl). Cell lysate (50 μl) was applied to a Cyto equipped with a 485/20 nm excitation filter and a 530/25 nm emission filter.
The cells were transferred to a 96-well plate (Falcon) using a Fluor plate soda before EGFP fluorescence detection. C
The yto Fluor 2300/2350 fluorescence measurement system was able to quantify EGFP fluorescence linearly over the range of 0.1-100 μg / ml. The result
From triplicate assays of three independent experiments, the average EG
Plotted as FP fluorescence versus time after infection.
【００２１】イムノブロッティング分析のために、タン
パク質を１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分画し、次にＨ
ｙｐｅｒｂｏｎｄ Ｃ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し
た。その膜を、１時間、室温で、３％非ダイリークリー
マーを含むＴｒｉｓ緩衝塩類溶液（ＴＴＢＳ；１００mM
Ｔｒｉｓ（pH７．４）、１００mM ＮａＣｌ、及び
０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックした。次にそ
の膜を４℃で一晩、ＴＴＢＳ中で一次抗体（抗ルシフェ
ラーゼ抗体（（Ｃｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ）又は抗
ＥＧＦＰ抗体（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のいずれか）と共に
インキュベートした。次に二次抗体とコンジュゲートさ
せたセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をその
膜に加え、次に室温で１時間、インキュベートした。Ｈ
ＲＰを、製造元により供されるプロトコルに従って、増
強化化学発光キット（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）によ
り検出した。For immunoblotting analysis, proteins were fractionated by 12% SDS / PAGE and then
transferred to a hyperbond C membrane (Amersham). The membrane was washed for 1 hour at room temperature with Tris-buffered saline containing 3% non-daily creamer (TTBS; 100 mM
Blocked with Tris (pH 7.4), 100 mM NaCl, and 0.2% Tween-20). The membrane was then incubated with a primary antibody (either anti-luciferase antibody (either (Cortex Biochem) or anti-EGFP antibody (ClonTech)) in TTBS overnight at 4 ° C. Then conjugated to a secondary antibody. Horseradish peroxidase (HRP) was added to the membrane and then incubated for 1 hour at room temperature.
RP was detected with an enhanced chemiluminescence kit (ECL; Amersham) according to the protocol provided by the manufacturer.
【００２２】上述の手順を利用する実験結果は次の通り
であった。ＴＲＥＳの２つの調節構成物のうちの１つで
あるｐＴＲＥ−Ｌｕｃ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を、単独で
又はｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）と組み合わ
せてＳｆ２１細胞にトランスフェクトした。ｐＴＲＥ−
Ｌｕｃは、ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターにより駆
動されるルシフェラーゼコーディング領域を含み、ｐＴ
ｅｔ−Ｏｆｆは、全長ＣＭＶプロモーターにより駆動さ
れるｔＴＡコーディング領域を含む。両方の構成物の同
時トランスフェクションは、ｐＴＲＥ−Ｌｕｃ単独のト
ランスフェクションに比べてわずかな活性の増強を示し
たが刺激のレベルは低かった。直前のプラスミドを用い
る各々の実験におけるルシフェラーゼ活性は極めて弱か
った。これらの結果は、全長ＣＭＶプロモーターのプロ
モーター活性はＳｆ２１細胞内でｔＴＡを作り出すため
に極めて弱い。Experimental results utilizing the above procedure were as follows. One of the two regulatory components of TRES, pTRE-Luc (ClonTech), was transfected into Sf21 cells alone or in combination with pTet-Off (ClonTech). pTRE-
Luc contains a luciferase coding region driven by the TRE-CMVmin promoter, pT
et-Off contains a tTA coding region driven by a full-length CMV promoter. Co-transfection of both constructs showed a slight increase in activity compared to transfection of pTRE-Luc alone, but at a lower level of stimulation. Luciferase activity in each experiment with the immediately preceding plasmid was very weak. These results indicate that the promoter activity of the full-length CMV promoter is very weak to create tTA in Sf21 cells.
【００２３】Ｓｆ２１細胞においてリポーティング遺伝
子機能を測定することにおいてＴＲＥＳを利用するため
に、新しいプラスミドｐＡＰ１０Ｔを上述の通り作製し
てｐＴｅｔ−Ｏｆｆに置換した。全長ＣＭＶプロモータ
ーのかわりに、ｐ１０プロモーター（Vlakら、Virology
179 : 312〜320, 1990 ; 及び Weyerら、J. Gen Virol
71 : 1525〜2534, 1990）を用いてｔＴＡを駆動した。To utilize TRES in measuring reporting gene function in Sf21 cells, a new plasmid pAP10T was constructed as described above and replaced with pTet-Off. Instead of the full-length CMV promoter, p 10 promoter (Vlak et al., Virology
179: 312-320, 1990; and Weyer et al., J. Gen Virol.
71: 1525-2534, 1990).
【００２４】増加量のｐＴＲＥ−Ｌｕｃ ＤＮＡのみを
細胞にトランスフェクトした場合、ルシフェラーゼ活性
はかろうじて検出できた。しかしながら、種々の濃度の
ｐＡＰ１０Ｔを増加濃度のｐＴＲＥ−Ｌｕｃと共にトラ
ンスフェクトした場合、ルシフェラーゼ活性はかなり増
強された。ｐＡＰ１０Ｔ及びｐＴＲＥ−Ｌｕｃの同時ト
ランスフェクションで、ルシフェラーゼ活性の刺激はｐ
ＴＲＥ−Ｌｕｃトランスフェクションのみと比べて１６
０倍も高かった。When cells were transfected with increasing amounts of pTRE-Luc DNA alone, luciferase activity was barely detectable. However, when various concentrations of pAP10T were transfected with increasing concentrations of pTRE-Luc, luciferase activity was significantly enhanced. Upon co-transfection of pAP10T and pTRE-Luc, stimulation of luciferase activity
16 compared to TRE-Luc transfection alone
It was 0 times higher.
【００２５】昆虫細胞内のｔＴＡによりトランスアクテ
ィベートされたルシフェラーゼはテトラサイクリンの添
加により抑制され得る。テトラサイクリン感学性は０．
００１μｇ／mlで明らかになった。これらの実験は、Ｔ
ＲＥＳの刺激及び抑制はＳｆ２１細胞において極めて調
節可能である。２つのＴＲＥＳ構成物がＡｃＭＮＰＶの
ゲノム内で機能することができるか否かを決定するため
に、ｐＡＰ１０Ｔを最初に、上述の通り、ＡｃＭＮＰＶ
に挿入した。組換えウイルスｖＡＰ１０Ｔを次に作っ
た。ルシフェラーゼ活性を、ｔＴＡ発現性ウイルスｖＡ
Ｐ１０ＴでのｐＴＲＥ−Ｌｕｃの同時感染によって刺激
した。最も大きな刺激は、ｖＡＰ１０Ｔを０．１のｍ．
ｏ．ｉ．で感染させた時に観察された。より低い（ｍ．
ｏ．ｉ．＝０．０１）又はより高い（ｍ．ｏ．ｉ．＝
１）ウイルス濃度で現れるルシフェラーゼ活性の減少
は、感染した細胞の少なさ（低いｍ．ｏ．ｉ．）又は迅
速さウイルス誘導化細胞死（高いｍ．ｏ．ｉ．）の結果
のようであった。Luciferase transactivated by tTA in insect cells can be suppressed by the addition of tetracycline. The tetracycline sensitivity is 0.
Revealed at 001 μg / ml. These experiments are based on T
RES stimulation and suppression is highly regulatable in Sf21 cells. To determine whether the two TRES constructs can function in the genome of AcMNPV, pAP10T was first used as described above for AcMNPV.
Was inserted. The recombinant virus vAP10T was then made. The luciferase activity was determined using the tTA expressing virus vA.
Stimulated by co-infection of pTRE-Luc with P10T. The largest stimuli were vAP10T with a 0.1 m.
o. i. Was observed when infected. Lower (m.
o. i. = 0.01) or higher (moi =
1) The decrease in luciferase activity manifested at the virus concentration appears to be the result of fewer (low moi) or rapid virus-induced cell death (high moi) of infected cells. Was.
【００２６】最も優れた活性化比、９１倍刺激が、０．
２μｇ／ウェルの濃度でｐＴＲＥ−Ｌｕｃを用いること
によって観察された。ｐＴＲＥ−Ｌｕｃのトランスフェ
クション及び次のｖＡＰ１０Ｔの感染により与えられる
ルシフェラーゼ発現の刺激は、テトラサイクリンの添加
によって阻害された。この阻害は、２つの対応するプラ
スミド構成物による同時トランスフェクションによって
与えられる抑制に似た抑制速度を阻害した。The best activation ratio, 91-fold stimulus, is equivalent to 0.1.
This was observed by using pTRE-Luc at a concentration of 2 μg / well. The stimulation of luciferase expression conferred by pTRE-Luc transfection and subsequent vAP10T infection was inhibited by the addition of tetracycline. This inhibition inhibited the rate of suppression similar to that provided by co-transfection with the two corresponding plasmid constructs.
【００２７】合成ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターを
上述の通りバキュロウイルス転移ベクターｐＡｃＵＭ２
１に挿入してｐＡＰｔｃｍＬ及び組換えウイルスｖＡＰ
ｔｃｍＬを作り出し、生じた。予期せぬことに、ウイル
スに挿入した後、ルシフェラーゼは、ｖＡＰ１０Ｔでの
同じ感染あり又はなしで高度に発現された。テトラサイ
クリンでの更なる処理はルシフェラーゼ発現を抑制せ
ず、このことは、ｖＡＰｔｃｍＬからのルシフェラーゼ
の発現は、テトラサイクリン応答性発現メカニズムによ
って活性化されないことを示唆する。The synthetic TRE-CMVmin promoter was replaced with the baculovirus transfer vector pAcUM2 as described above.
PAPtcmL and recombinant virus vAP
tcmL was created and produced. Unexpectedly, after insertion into the virus, luciferase was highly expressed with or without the same infection with vAP10T. Further treatment with tetracycline did not suppress luciferase expression, suggesting that luciferase expression from vAPtcmL is not activated by the tetracycline-responsive expression mechanism.
【００２８】ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーター含有ウ
イルス中での強力なルシフェラーゼ発現のメカニズムを
検査するために、いくつかのプロモーターを作製してそ
れらがｔＴＡ刺激なしでルシフェラーゼ遺伝子を活性化
する能力を決定した。これらのプロモーターは全長ＣＭ
Ｖプロモーター（ｐＡＰｃＬ内）、ＡｃＭＮＰＶのｐ１
０プロモーター（ｐＡＰ１０Ｌ内）、ＣＭＶｍｉｎプロ
モーター（ｐＡＰｔｃｍＬ内）であった。全てのプロモ
ーターを、ＡｃＭＮＰＶのポリヒドリン遺伝子に隣接す
る側面フラグメントを含むプラスミドであるｐＡｃＵＷ
２１に挿入した。これら４つの構成物に加えて、ｐＴＲ
Ｅ−Ｌｕｃ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を対照として用いた。To examine the mechanism of strong luciferase expression in TRE-CMVmin promoter-containing viruses, several promoters were created to determine their ability to activate the luciferase gene without tTA stimulation. These promoters are full length CM
V promoter (in pAPcL), p 1 of AcMNPV
0 promoter (in pAP10L) and CMVmin promoter (in pAPtcmL). All promoters were replaced by pAcUW, a plasmid containing a side fragment flanking the polyhydrin gene of AcMNPV.
21. In addition to these four components, pTR
E-Luc (ClonTech) was used as a control.
【００２９】ｐＡＰｃＬはトランスフェクションのみ又
は活性型ＡｃＭＮＰＶの同時感染のいずれかによりプロ
モーター活性を示さなかった。第２の構成物であるｐＡ
Ｐ１０Ｌも、いずれの条件下でもプロモーター活性を示
さなかった。これは、ｐ１０プロモーターは他のウイル
ス産物の発現を要求する強力な後期プロモーターである
からである。第３及び第４の構成物であるｐＡＰｃｍＬ
及びｐＡＰｔｃｍＬは、単独でトランスフェクトした時
に極めて低いプロモーター活性しか示さなかったが、対
応する組換えウイルスを同時感染に用いた時に強力に刺
激された。これらの結果は、ＣＭＶｍｉｎプロモーター
は、ＴＲＥ要素あり又はなしでウイルス因子により強力
に刺激されることを示唆する。しかしながら、全長ＣＭ
Ｖプロモーターは用いるいずれの条件下でも昆虫細胞内
で発現されなかった。PAPcL showed no promoter activity either by transfection alone or by co-infection with activated AcMNPV. The second component, pA
P10L also showed no promoter activity under any conditions. This, p 10 promoter is because a strong late promoter which requests the expression of other viral products. PAPcmL, the third and fourth components
And pAPtcmL showed very low promoter activity when transfected alone, but were strongly stimulated when the corresponding recombinant virus was used for co-infection. These results suggest that the CMVmin promoter is strongly stimulated by viral factors with or without the TRE element. However, full length CM
The V promoter was not expressed in insect cells under any of the conditions used.
【００３０】全長ＣＭＶ，ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎ，ＣＭ
Ｖｍｉｎ、及びｐ１０プロモーターを含む転移ベクター
プラスミドを用いて組換えＡｃＭＮＰＶ：ｖＡＰｃＬ，
ｖＡＰｔｃｍＬ，ｖＡＰｃｍＬ、及びｖＡＰ１０Ｌを各
々作製した。異なるプロモーターを含む独立して単離さ
れた組換えウイルス株のいくつかのグループの活性を、
１０のｍ．ｏ．ｉ．で感染後７２時間にテストした。全
部で３つのｖＡＰｃＬｓのルシフェラーゼ活性は低く、
１．６〜２．０×１０4 ＲＬＶ／μｇタンパク質の範囲
であったが、他のプロモーターを含む他の組換えバキュ
ロウイルスの活性は高かった。全部で３つの組換えｖＡ
ＰｔｃｍＬのルシフェラーゼ活性は３．５〜３．７×１
０6 ＲＬＶ／μｇタンパク質の範囲であった。全部で４
つの組換えｖＡＰ１０Ｔは、６．５〜７．７×１０6 Ｒ
ＬＶ／μｇタンパク質の範囲であった。これらの結果
は、全長ＣＭＶプロモーターの活性は、ＣＭＶｍｉｎプ
ロモーター含有ウイルスのそれより約２００倍低いこと
を示した。Full length CMV, TRE-CMVmin, CM
Vmin, and using the transfer vector plasmid containing the p 10 promoter recombinant AcMNPV: vAPcL,
vAPtcmL, vAPcmL, and vAP10L were each produced. The activity of several groups of independently isolated recombinant virus strains containing different promoters,
10 m. o. i. And tested 72 hours after infection. Luciferase activity of all three vAPcLs was low,
The activity of other recombinant baculoviruses containing other promoters, although in the range of 1.6-2.0 × 10 4 RLV / μg protein, was high. All three recombinant vA
The luciferase activity of PtcmL is 3.5-3.7 × 1
It was in the range of 0 6 RLV / μg protein. 4 in total
One recombinant vAP10T has 6.5-7.7 × 10 6 R
LV / μg protein range. These results indicated that the activity of the full-length CMV promoter was about 200 times lower than that of the virus containing the CMVmin promoter.
【００３１】ＣＭＶｍｉｎプロモーター含有ウイルス
は、ルシフェラーゼ活性を、ｐ１０プロモーターにより
発現されるものに近いレベルまで誘導した。更に、これ
らの結果は、ＣＭＶｍｉｎプロモーターが示す高いプロ
モーター活性がＣＭＶｍｉｎプロモーター含有組換えウ
イルス単離物のいくつかに限られないことを示唆する。
従って、各々のプロモーター構成物中の１つの組換えウ
イルスを選択し、プロモーター発現の時間経過研究を行
った。[0031] CMVmin promoter-containing viruses, the luciferase activity was induced to a level close to that expressed by the p 10 promoter. Furthermore, these results suggest that the high promoter activity exhibited by the CMVmin promoter is not limited to some of the CMVmin promoter-containing recombinant virus isolates.
Therefore, one recombinant virus in each promoter construct was selected and a time course study of promoter expression was performed.
【００３２】異なるプロモーターを有する組換えウイル
スにおけるプロモーター発現の時間経過を、２つの検出
可能なタンパク質：ルシフェラーゼ及びＥＧＦＰの発現
を検査することにより研究した。両タンパク質の活性
を、ＣＭＶｍｉｎプロモーターを含む組換えウイルスの
感染後４時間に、最初に検出した（ルシフェラーゼのた
めにｖＡＰｔｃｍＬ及びｖＡＰｃｍＬ、並びにＥＧＦＰ
のためにｖＡＰｃｍＥ）。これらのウイルスのルシフェ
ラーゼ及びＥＧＦＰ活性は、後に顕著に増加し、各々感
染後４８時間及び３６時間に安定水準に達した。全長Ｃ
ＭＶプロモーターを含むウイルスｖＡＰｃＬはｖＡＰｔ
ｃｍＬ及びｖＡＰｃｍＬウイルスより約２００倍少くル
シフェラーゼを発現し、このことは、全長ＣＭＶプロモ
ーターはＡｃＭＮＰＶのゲノム内で弱い機能しか有さな
いことを示唆する。The time course of promoter expression in recombinant viruses with different promoters was studied by examining the expression of two detectable proteins: luciferase and EGFP. The activity of both proteins was first detected 4 hours after infection with the recombinant virus containing the CMVmin promoter (vAPtcmL and vAPcmL for luciferase, and EGFP
For vAPcmE). The luciferase and EGFP activities of these viruses increased significantly later and reached steady levels at 48 and 36 hours post infection, respectively. Overall length C
The virus vAPcL containing the MV promoter is vAPt
It expresses luciferase approximately 200 times less than the cmL and vAP cmL viruses, suggesting that the full-length CMV promoter has only a weak function in the AcMNPV genome.
【００３３】ｐ１０プロモーターを含む組換えウイルス
ｖＡＰ１０Ｌは、直前に記載したウイルスと異なる挙動
をした。ｐ１０プロモーターを介して発現されたルシフ
ェラーゼ及びＥＧＦＰの活性を感染後８時間に検出し、
それは感染後４８時間又はその後に安定状態に達した。
ｐ１０プロモーター含有ウイルスにより発現される最大
ルシフェラーゼ及びＥＧＦＰ活性はＣＭＶｍｉｎプロモ
ーター含有ウイルスにより発現されるより約２倍（ルシ
フェラーゼ）及び１６倍（ＥＧＦＰ）高かった。後者
は、ルシフェラーゼ又はＥＧＦＰを感染後より早期に発
現した。[0033] The recombinant virus vAP10L including the p 10 promoter, was a different behavior with the virus just described. The activity of the expressed luciferase and EGFP through the p 10 promoter was detected 8 hours after infection,
It reached a stable state for 48 hours or after infection.
maximum luciferase and EGFP activity expressed by p 10 promoter-containing viruses was higher about twice than that expressed (luciferase) and 16 times (EGFP) by CMVmin promoter-containing viruses. The latter expressed luciferase or EGFP earlier after infection.
【００３４】ＣＭＶｍｉｎプロモーター含有ウイルスに
より発現されるルシフェラーゼは、感染後最初の３６時
間の間、ｖＡＰ１０Ｌのものより大きかった。この期間
の間、ＣＭＶｍｉｎ−駆動発現がｐ１０駆動発現より１
２時間、早くおこったことを除いて、ＣＭＶｍｉｎプロ
モーター含有ウイルスはｐ１０プロモーター含有ウイル
スによって発現された。Luciferase expressed by the virus containing the CMVmin promoter was greater than that of vAP10L during the first 36 hours after infection. During this period, CMVmin- drive expression from p 10 driven expression 1
2 hours, except that occurred earlier, CMVmin promoter-containing viruses expressed by p 10 promoter-containing viruses.
【００３５】ウエスタン・ブロット分析は、ＣＭＶｍｉ
ｎプロモーター駆動ウイルスｖＡＰｃｍＬ及びｖＡＰｔ
ｃｍＥから発現されたルシフェラーゼ及びＥＧＦＰのた
めの最初の検出時間は、感染後１２時間に観察されるこ
とを示した。対照的に、ｐ１０プロモーター駆動ウイル
スｖＡＰ１０Ｌ及びｖＡＰ１０Ｅからの発現は、感染後
２４時間に観察された。感染後３６時間に、ｐ１０及び
ＣＭＶｍｉｎプロモーター駆動ウイルスは同様の量のそ
れらの各々の検出可能なタンパク質を発現し始めた。感
染後７２時間に、ＣＭＶｍｉｎ駆動の発現のｐ１０駆動
発現に対する比率はルシフェラーゼについて１：１．９
及びＥＧＦＰについて１：３であった。Western blot analysis was performed using CMVmi
n promoter driven viruses vAPcmL and vAPt
Initial detection times for luciferase expressed from cmE and EGFP were shown to be observed 12 hours after infection. In contrast, expression from p 10 promoter-driven viruses vAP10L and vAP10E was observed 24 hours after infection. 36 hours post-infection, p 10 and CMVmin promoter-driven virus began to express their respective detectable protein of similar amounts. 72 hours post infection, the ratio of p 10 drive expression of the expression of CMVmin drive for luciferase 1: 1.9
And EGFP for 1: 3.
【００３６】これらの実験結果は、まとめて、全長のＣ
ＭＶプロモーターは昆虫細胞内又はバキュロウイルスの
ゲノム内で機能的でないことを示した。しかしながら、
驚くことに、ＣＭＶｍｉｎプロモーターはウイルス同時
感染により送り出されるなら、昆虫細胞内で強力に機能
する。These experimental results are summarized as follows:
The MV promoter has been shown to be non-functional in insect cells or the baculovirus genome. However,
Surprisingly, the CMVmin promoter functions strongly in insect cells if delivered by viral co-infection.
【００３７】[0037]
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ ＜１１０＞ Academia Sinica ＜１２０＞ Baculovirus containing minimal CMV promotor ＜１３０＞ Ａ９９６４００ ＜１４０＞ ＪＰ ２０００−０３５６９３ ＜１４１＞ ２０００−２−８ ＜１６０＞ ２ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ １１１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＜４００＞ １ taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcac 60 tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca g 111 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＜４００＞ ２ tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcgg 684[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> Baculovirus containing minimal CMV promotor <130> A996400 <140> JP 2000-035693 <141> 2000-2-8 <160> 2 <210> 1 <211> 111 <212> DNA <213> cytomegalovirus <400> 1 taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcac 60 tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca g 111 <210> 2 <211> <212> DNA <213> cytomegalovirus <400> 2 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttac gg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcgg 684
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１２年４月２６日（２０００．４．２
６）[Submission date] April 26, 2000 (200.4.2
6)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００１６[Correction target item name] 0016
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００１６】以下の記載に用いる実験手順並びに組換え
プラスミド及びウイルスは最初に議論される。組換えオ
ートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多重核多角体ウイルス（Ａｃ
ＭＮＰＶｓ）を作るために、ホタルルシフェラーゼをコ
ードするＤＮＡ及び種々のプロモーターを、完全なポリ
ヒドリン遺伝子及び外来遺伝子発現のためのｐ１０プロ
モーターを含む転移ベクターｐＡｃＵＷ２１（Ｐｈａｇ
ｒＭｉｎｇｅｎ）にクローン化した（Roelvinkら、J. G
en. Virol 73: 1481〜1489, 1992; Vlakら、Virology 1
79 : 312〜320, 1990 ;及び Weyerら、J. Gen. Virol 7
1: 1525〜1534, 1990）。最小ＣＭＶ（ＣＭＶｍｉｎ）
プロモーター及びＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターは
Gossenら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5547〜555
1, 1992に記載される。ＣＭＶｍｉｎプロモーターはＣ
ＭＶプロモーターの＋７５〜−３５の間の配列を含む。
ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターは、ＣＭＶｍｉｎプ
ロモーターに配合したＴｎ１０のオペレーター０２由来
の４２−bp Ｔｅｔ０配列の７つのコピーを含む（Goss
enら、前掲）。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写開始
部位の＋３０から終止コドンまでを含むルシフェラーゼ
遺伝子のコーディング領域(Wetら、Mol. Cell biol.7:
725〜737, 1989)をＣＭＶｍｉｎプロモーターによって
駆動させた。ＴＲＥ−ＣＭＶｍｉｎプロモーターをプラ
スミドｐＴＲＥ−Ｌｕｃ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）から得て
ｐＡｃＵＷ２１に別個に挿入し、このプラスミドのもと
にあったｐ１０プロモーターを置換した。生じたプラス
ミドを各々ｐＡＰｃｍＬ及びｐＡＰｃｍＬと名づけた。
プラスミドｐＡＰｃｍＬを２０００年１月２１日に受託
番号CCTCC200003 としてブタペスト条約下でChina Cent
er For Type Culture Collection(CCTCC)に寄託した。
ｐＴＲＥ−Ｌｕｃプラスミドからのルシフェラーゼコー
ディング配列（位置５０７〜２１８７bpからのもの、Ｃ
ｌｏｎＴｅｃｈ）もプラスミドｐＡｃＵＷ２１内のＡｃ
ＭＮＰＶのｐ１０プロモーターの制御下にｐＡｃＵＷ２
１にクローン化し、生じたプラスミドをｐＡＰ１０Ｌと
名づけた。ｐＴｅｔ−Ｏｆｆから得た全長ＣＭＶプロモ
ーター（位置６８〜６７３bpから、ＣｌｏｎＴｅｃｈ）
を、ｐＴＲＥ−Ｌｕｃから得たルシフェラーゼコーディ
ング領域（位置５０７〜２１８６bpから、ＣｌｏｎＴｅ
ｃｈ）と一緒に、ｐ１０プロモーターのかわりにｐＡｃ
ＵＷ２１に挿入し、生じたプラスミドをｐＡＰｃＬと名
づけた。The experimental procedures and recombinant plasmids and viruses used in the following description are first discussed. Recombinant Autographa californica ( Autographa
californica multinucleopolyhedrovirus (Ac)
To make MNPVs), the transfer vector comprising the p 10 promoter for the DNA and various promoters encoding firefly luciferase, complete polyhedrin gene and foreign gene expression pAcUW21 (Phag
rMingen) (Roelvink et al., J. G.
en.Virol 73: 1481-1489, 1992; Vlak et al., Virology 1.
79: 312-320, 1990; and Weyer et al., J. Gen. Virol 7
1: 1525-1534, 1990). Minimum CMV (CMVmin)
Promoter and TRE-CMVmin promoter
Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-555.
1, 1992. CMVmin promoter is C
Includes sequences between +75 and -35 of the MV promoter.
The TRE-CMVmin promoter contains seven copies of the 42-bp Tet0 sequence from operator 02 of Tn10 combined with the CMVmin promoter (Goss
en et al., supra). The coding region of the luciferase gene, including the transcription start site from +30 to the stop codon of the firefly luciferase gene (Wet et al., Mol. Cell biol. 7:
725-737, 1989) was driven by the CMVmin promoter. The TRE-CMVmin promoter separately inserted into pAcUW21 obtained from plasmid pTRE-Luc (ClonTech), to replace the p 10 promoter was in the original plasmid. The resulting plasmids were named pAPcmL and pAPcmL, respectively.
Plasmid pAPcmL was deposited on January 21, 2000 under accession number CCTCC200003 under China Budapest Treaty.
er For Type Culture Collection (CCTCC).
Luciferase coding sequence from the pTRE-Luc plasmid (from positions 507-2187 bp, C
lonTech) is also the Ac in plasmid pAcUW21.
Under the control of the p 10 promoter of MNPV pAcUW2
1 and the resulting plasmid was named pAP10L. Full length CMV promoter obtained from pTet-Off (from position 68-673 bp, ClonTech)
From the luciferase coding region from pTRE-Luc (from positions 507-2186 bp, ClonTe
along with the ch), pAc in place of the p 10 promoter
It was inserted into UW21 and the resulting plasmid was named pAPcL.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:92） 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/00 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:91） 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA08 CA11 CA12 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL03 LL10 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA28 CA46 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) C12R 1:92) 1:91) (C12N 1/00 (C12N 9/02 C12R 1:92) C12R 1:91) (C12N 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:91) 5/00 B (C12N 9/02 C12R 1:92) C12R 1:91) 1 : 91) F term (reference) 4B024 AA20 BA08 CA11 CA12 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL03 LL10 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA28 CA46
Claims (28)
ードする配列と、を含むゲノムＤＮＡ分子を含むバキュ
ロウイルスであって、該ＲＮＡの発現は、ＣＭＶプロモ
ーター配列により駆動され、ここで該ＣＭＶプロモータ
ー配列は配列番号：１又はその機能的等価物を含むこと
を特徴とするバキュロウイルス。1. A baculovirus comprising a genomic DNA molecule comprising a CMV promoter sequence and a sequence encoding RNA, wherein the expression of the RNA is driven by a CMV promoter sequence, wherein the CMV promoter sequence is A baculovirus comprising SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof.
号：１の配列であることを特徴とする請求項１に記載の
バキュロウイルス。2. The baculovirus according to claim 1, wherein the CMV promoter sequence is a sequence of SEQ ID NO: 1.
であることを特徴とする請求項２に記載のバキュロウイ
ルス。3. The method according to claim 2, wherein the RNA is a non-baculovirus RNA.
The baculovirus according to claim 2, wherein
ク質をコードするｍＲＮＡであることを特徴とする請求
項３に記載のバキュロウイルス。4. The baculovirus according to claim 3, wherein the RNA is an mRNA encoding a non-baculovirus protein.
特徴とする請求項４に記載のバキュロウイルス。5. The baculovirus according to claim 4, wherein the protein is detectable.
ことを特徴とする請求項５に記載のバキュロウイルス。6. The baculovirus according to claim 5, wherein the protein is luciferase.
であることを特徴とする請求項１に記載のバキュロウイ
ルス。7. The method according to claim 7, wherein the RNA is a non-baculovirus RNA.
The baculovirus according to claim 1, wherein
ク質をコードするｍＲＮＡであることを特徴とする請求
項７に記載のバキュロウイルス。8. The baculovirus according to claim 7, wherein the RNA is an mRNA encoding a non-baculovirus protein.
特徴とする請求項８に記載のバキュロウイルス。9. The baculovirus according to claim 8, wherein the protein is detectable.
ることを特徴とする請求項９に記載のバキュロウイル
ス。10. The baculovirus according to claim 9, wherein the protein is luciferase.
パク質をコードするｍＲＮＡであることを特徴とする請
求項１に記載のバキュロウイルス。11. The baculovirus according to claim 1, wherein the RNA is an mRNA encoding a non-baculovirus protein.
を特徴とする請求項１１に記載のバキュロウイルス。12. The baculovirus according to claim 11, wherein said protein is detectable.
ることを特徴とする請求項１２に記載のバキュロウイル
ス。13. The baculovirus according to claim 12, wherein the protein is luciferase.
方法であって、該昆虫細胞に請求項１に記載のバキュロ
ウイルスを感染させることを含む方法。14. A method for expressing RNA in insect cells, comprising infecting the insect cells with the baculovirus according to claim 1.
タンパク質を発現させる方法であって、該昆虫細胞に請
求項２に記載のバキュロウイルスを感染させることを含
む方法。15. A method for expressing a non-baculovirus protein in an insect cell, comprising infecting the insect cell with the baculovirus according to claim 2.
方法であって、該昆虫細胞に請求項３に記載のバキュロ
ウイルスを感染させることを含む方法。16. A method for expressing RNA in insect cells, comprising infecting the insect cells with the baculovirus according to claim 3.
タンパク質を発現させる方法であって、該昆虫細胞に請
求項４に記載のバキュロウイルスを感染させることを含
む方法。17. A method for expressing a non-baculovirus protein in an insect cell, comprising infecting the insect cell with the baculovirus according to claim 4.
方法であって、該昆虫細胞に請求項６に記載のバキュロ
ウイルスを感染させることを含む方法。18. A method for expressing RNA in insect cells, comprising infecting the insect cells with the baculovirus according to claim 6.
タンパク質を発現させる方法であって、該昆虫細胞に請
求項７に記載のバキュロウイルスを感染させることを含
む方法。19. A method for expressing a non-baculovirus protein in an insect cell, comprising infecting the insect cell with the baculovirus according to claim 7.
方法であって、該昆虫細胞に請求項１１に記載のバキュ
ロウイルスを感染させることを含む方法。20. A method for expressing RNA in insect cells, comprising infecting the insect cells with the baculovirus according to claim 11.
的等価物を含むＣＭＶプロモーター配列を含むプラスミ
ド。21. A plasmid comprising a CMV promoter sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof.
号：１記載の配列であることを特徴とする請求項２１に
記載のプラスミド。22. The plasmid according to claim 21, wherein the CMV promoter sequence is a sequence represented by SEQ ID NO: 1.
該配列の発現が前記ＣＭＶプロモーターによって増強す
ることができる配列を更に含む請求項２１に記載のプラ
スミド。23. The plasmid of claim 21, further comprising a sequence encoding a protein, the expression of which can be enhanced by said CMV promoter.
ることを特徴とする請求項２１に記載のプラスミド。24. The plasmid according to claim 21, wherein the protein is luciferase.
であって、該細胞を、請求項２１に記載のプラスミドで
形質転換することを含む方法。25. A method for expressing a protein in a cell, comprising transforming the cell with the plasmid of claim 21.
であって、該細胞を、請求項２２に記載のプラスミドで
形質転換することを含む方法。26. A method for expressing a protein in a cell, comprising transforming the cell with the plasmid of claim 22.
とする請求項２５又は２６に記載の方法。27. The method according to claim 25, wherein the cell is an insect cell.
ることを特徴とする請求項２５又は２６に記載の方法。28. The method according to claim 25, wherein the protein is luciferase.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000035693A JP2001218587A (en) | 2000-02-08 | 2000-02-08 | Baculovirus containing minimal cmv promoter |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000035693A JP2001218587A (en) | 2000-02-08 | 2000-02-08 | Baculovirus containing minimal cmv promoter |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001218587A true JP2001218587A (en) | 2001-08-14 |
Family
ID=18559859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000035693A Pending JP2001218587A (en) | 2000-02-08 | 2000-02-08 | Baculovirus containing minimal cmv promoter |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001218587A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7723104B2 (en) | 2004-04-02 | 2010-05-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer specific promoters |
-
2000
- 2000-02-08 JP JP2000035693A patent/JP2001218587A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7723104B2 (en) | 2004-04-02 | 2010-05-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer specific promoters |
| US7816131B2 (en) | 2004-04-02 | 2010-10-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer specific promoters |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6368825B1 (en) | Baculovirus containing minimal CMV promoter | |
| CN110616198B (en) | Novel coronavirus vaccine based on chimpanzee adenovirus type 68 and MERS-CoV full-length membrane protein | |
| CN110546257B (en) | Compositions and methods for enhancing gene expression | |
| KR101180139B1 (en) | Expression vectors comprising the mcmv ie2 promoter | |
| US20230331826A1 (en) | Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof | |
| US5939285A (en) | Method for regulating the expression of a gene in a baculovirus using a retinoic acid receptor binding site and vector therefor | |
| Lukac et al. | Transcriptional activation by the human cytomegalovirus immediate-early proteins: requirements for simple promoter structures and interactions with multiple components of the transcription complex | |
| KR102240180B1 (en) | Multiple vector systems and their uses | |
| US6790657B1 (en) | Lentivirus vector system | |
| KR20200051011A (en) | Modified closed-terminated DNA (CEDNA) | |
| Liu et al. | Rice black-streaked dwarf virus minor core protein P8 is a nuclear dimeric protein and represses transcription in tobacco protoplasts | |
| CN115103710A (en) | Adeno-associated virus (AAV) system for the treatment of hereditary hearing loss | |
| CN110283794A (en) | Recombination oncolytic virus and preparation method, application and drug | |
| Li et al. | The functional oligomeric state of tegument protein GP41 is essential for baculovirus budded virion and occlusion-derived virion assembly | |
| JP2001218587A (en) | Baculovirus containing minimal cmv promoter | |
| CN106459999A (en) | Novel promoters for high level expression | |
| AU2017233055A1 (en) | Compositions and methods for treatment of type VII collagen deficiencies | |
| CN110650624A (en) | Riboswitch regulated gene therapy for retinal diseases | |
| Kadison et al. | Role of protein kinase A in tax transactivation of the human T-cell leukemia virus type I long terminal repeat | |
| RU2761879C1 (en) | VACCINE BASED ON AAV5 FOR THE INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY TO THE SARS-CoV-2 VIRUS AND/OR THE PREVENTION OF CORONAVIRUS INFECTION CAUSED BY SARS-CoV-2 | |
| EP4185323A1 (en) | Aav5-based vaccine against sars-cov-2 | |
| CN108977413B (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus expressing double-copy gD gene | |
| RU2795230C1 (en) | Recombinant oncolytic virus, method for its production, its application and the drug on its basis | |
| US20230063208A1 (en) | Baculovirus expression system | |
| Li et al. | Cytomegalovirus immediate-early promoter efficiently drives heterogeneous gene expression in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040629 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040928 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041022 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041216 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20041216 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050215 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050513 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050524 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050812 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051004 |