JP2001201691A - 走査型顕微鏡法における使用者手引きのための方法およびシステム - Google Patents

走査型顕微鏡法における使用者手引きのための方法およびシステム

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JP2001201691A JP2000380302A JP2000380302A JP2001201691A JP 2001201691 A JP2001201691 A JP 2001201691A JP 2000380302 A JP2000380302 A JP 2000380302A JP 2000380302 A JP2000380302 A JP 2000380302A JP 2001201691 A JP2001201691 A JP 2001201691A
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ヨハン、エンゲルハルト
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Abstract

(57)【要約】 【課題】走査型顕微鏡で利用されるシステムおよび使用
者手引きを提供するための方法を提供する。 【解決手段】使用者手引きを提供するためのシステム
は、光ビームLを発生するための照射源2および光ビーム
Lを形成し、誘導するための光学装置を含む。走査装置6
は、標本10を横切って光ビームLを走査する。少なくと
も1つの検出器12が、標本10からの蛍光または反射光を
検知するために使用される。標本10の上で光ビームの位
置信号Pも検知される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は主に、走査型顕微鏡
法の分野における使用者手引きのための方法およびシス
テムに関する。さらに詳細には、本発明は、経験の浅い
使用者が走査型顕微鏡を首尾よく操作することができる
ような使用者手引きシステムおよび方法に関する。
【0002】
【従来の技術】共焦点顕微鏡法において、標本は集光さ
れたレーザビームを用いて走査される。レーザビームの
焦点は、2つの走査ミラーをそれぞれの軸を中心にして
傾けることによって、標本の断面に移動させる。走査ミ
ラーの軸は、互いに直交する。たとえば、一方の走査ミ
ラーは、x方向にレーザ光を方向変換し、他方の走査ミ
ラーは、y方向にレーザ光を方向変換する。反射光また
は蛍光の強度は、各走査点に関して測定される。各測定
強度値は標本のx、y、z位置に関連するため、使用者
に標本の3次元画像を提供する。
【0003】Victoria Centozoneお
よびJames Pawleyによる「Tutoria
l on Practical Confocal M
icroscopy and Use of the
Confocal TestSpecimen」(共焦
点顕微鏡法ハンドブック、James B.Pawle
y編、Plenum Press,New York,
1995,pp.549−569)には、共焦点顕微鏡
法における画像取込みの処理に影響を及ぼす変数の概観
が含まれている。共焦点顕微鏡を適正に利用するため
に、使用者は、共焦点顕微鏡の基本概念および作動原理
に精通する必要がある。画質に影響を及ぼすさまざまな
変数および共焦点顕微鏡の適正な設定は、高画質を得る
ために不可欠であり、使用者によって設定されなければ
ならない。現在、使用者に最適な変数設定を提供する共
焦点顕微鏡の自動変数設定を備えたシステムは、存在し
ない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、経験の浅い使用者が走査型顕微鏡を効率的に使
用することができるような使用者手引きシステムを備え
た走査型顕微鏡を提供することにある。使用者手引きシ
ステムによって、使用者は短時間で最適な画質の画像を
見ることができる。本発明の目的は、走査型顕微鏡にお
いて、使用者手引きのためのシステムによって実現され
る。このシステムは、走査信号のオンラインディジタル
データを提供するためのディジタル化手段を備えた制御
処理装置を含む。信号は、標本からの蛍光または反射光
によって形成される。さらに、標本を走査する光ビーム
は、位置信号を生成する。制御処理手段は、使用者に表
示するための関連する画質変数を作成する。システムは
また、画像処理のためのコンピュータ手段および使用者
に対して関連する画質変数についての情報を表示するた
めの表示装置を含む。
【0005】また、本発明の目的は、経験の浅い使用者
が、短時間で走査型顕微鏡を効率的に使用することがで
きるようにするための使用者手引きシステムを備えた走
査型顕微鏡を提供することにある。本発明の目的は、光
ビームを発生する照射源および照射源の光の形状を整形
し、誘導する光学手段を具備する使用者手引きシステム
を備えた走査型顕微鏡によって実現される。また、標本
を横切って光ビームを走査するための走査装置および標
本からの蛍光および/または反射光を表示するための少
なくとも1つの検出器も設けられる。このシステムはま
た、標本の面における光ビームの位置信号を決定するた
めの表示手段および走査データのオンラインディジタル
信号を生成するためのディジタル化手段を備えた制御処
理装置を含む。信号は、標本からの蛍光または反射光に
よって生成され、標本の面において光ビームの位置信号
を含む信号である。本発明の制御処理手段はオンライン
関連画質変数を提供し、コンピュータ手段はデータ処理
を行い、表示装置は複数の関連画質変数に関する視覚化
された情報を表示する。
【0006】本発明のさらなる目的は、顕微鏡の設定を
調整することなく、経験の浅い使用者が、共焦点顕微鏡
において高画質の画像を得ることができる使用者手引き
方法を提供することにある。本目的は、標本の第1およ
び第2の画像の連続画像信号を記録することを含み、画
像信号は標本からの蛍光または反射光に対応する。関連
する画素位置信号は、標本の面における走査ビームの位
置に対応する。本方法は、連続的に表示された画像信号
のオンラインディジタル化、画像の構造および位置と無
関係な受信データの統計的な処理、複数の関連画質変数
の算出および連続画像表示のために算出された画質変数
の利用をさらに含む。
【0007】走査型顕微鏡法において、標本は、適切に
集光されたレーザビームを用いて走査される。標本から
伝搬する反射光または蛍光は、適切な検出器によって検
知される。特に、共焦点走査型顕微鏡法において、生じ
る画像の画質に影響を及ぼす変数が多くあるため、最適
な画像結果を受信するためにこのような変数を制御する
方法があることが望ましい。このような変数の例として
は、標本の褪色率、標本色素の褪色率、背景雑音、オー
バサンプリングおよびアンダサンプリング、検出器のあ
ふれおよび下位桁あふれ、飽和度、走査速度、標本の走
査される部分の寸法がある。走査型顕微鏡において完全
な画像を得ることは、経験の浅い顕微鏡使用者のみなら
ず、このような顕微鏡の操作経験の豊富な使用者にとっ
ても、困難な作業であることがよくある。蛍光標本を分
析する際、使用者は、照射されるときの標本を白っぽく
する蛍光色素を考慮に入れなければならない。さらに、
使用者は、標本が高い強度の光ビームで照射される場合
に生じる飽和効果を防止しなければならない。
【0008】
【課題を解決するための装置】本発明は、主な画質変数
を表示するため、経験の浅い使用者および経験の豊富な
使用者に、最適な顕微鏡設定をインタラクティブに調整
する助けとなる。このような顕微鏡設定は、画像におけ
る雑音の程度、実際の褪色率および飽和の程度のほか、
走査速度の実際の設定、走査率、標本の走査される部分
のサイズ、オーバサンプリングまたはアンダサンプリン
グを含んでもよい。本発明は、重要な画像量および画質
変数を決定するために、2枚の連続して取込まれた画像
の強度を利用する。たとえば、このような決定の1つの
可能性としては、2つの強度グラフH(I),H(I
)の中心のずれを検出し、分析することによって、褪
色率を測定することである。
【0009】褪色率を決定するための別の方法は、2枚
の異なる画像の対応する位置に関して、強度をグラフに
表すことである。褪色していない標本の強度の組
(I,I )は、45°の傾きのある直線の状態にな
る。褪色している標本の強度の組は45°の傾きの直線
より高い傾斜を有する直線の状態になる。直線は、雑音
による影響を受けない理想的な場合を示している。実際
には、強度の組のデータ(I ,I)は、理想的な線
の周囲に分散される。理想的な線に垂直である断面にお
ける強度の組のデータ(I,I)の分布によって、
雑音の実際の程度を決定することができる。大部分の場
合には、この分布は、ガウス分布またはポアソン分布で
ある。
【0010】標本色素の飽和作用を決定するために、照
射強度の設定は、第1の画像を獲得した後に変更されな
ければならない。2つの異なる画像に対応する強度の比
が同じままであれば、飽和していないことを意味する。
強度比が変化する場合には、飽和していることを意味
し、強度の比の変化から飽和度を算出することができ
る。
【0011】選択された設定からオーバサンプリングお
よびアンダサンプリングを算出することができる。
【0012】本発明の一実施態様において、算出された
設定は、自動的に保存され、連続画像を作成するために
使用される。本発明の別の実施態様において、さまざま
な画質変数が使用者に対して表示されるため、使用者
は、顕微鏡設定を調整するために表示された変数を利用
することができる。表示された変数は、たとえば、スク
ロールバーなどの図形表示インジケータの形状で使用者
に視覚的表示されることが好ましい。
【0013】本発明の使用者手引きの方法およびシステ
ムは、プログラム可能なディジタル論理回路(たとえ
ば、現場でプログラム可能な論理ゲートアレイFPG
A)によって、データの処理を促進するために、できる
限り標本および検出器から受信された信号のディジタル
化を行う方法を利用する。FPGAエレクトロニクスの
利点は、実時間においてナノセカンドまでの精度でデー
タを処理することができることである。
【0014】
【発明の実施の形態】図1は、変数設定および画質調整
の困難さを軽減し、複雑な顕微鏡の使用者マニュアルを
頻繁に使用する必要を排除する共焦点顕微鏡システムの
概略図を示している。照射システム2は、光ビームLを
発生する。ビームスプリッタ4は、入射光ビームLを第
1の経路Lおよび第2の経路Lに分割する。照射シ
ステムからの光は、第1の経路Lに沿って走査装置6
に向けられる。走査装置6は、第1の経路Lに沿って
伝搬する光が標本10を横切って走査されるように移動
することができる走査ミラーシステム7を含む。第1の
経路Lに沿って伝搬する光が、標本10に達する前に
光学系8を通過する。標本から反射された光は、第1の
経路Lに沿ってビームスプリッタ4へ戻り、次に標本
10から反射された光を受光するように配置された第1
の検出器12へ進む。第1の検出器12はその光を第1
の電気信号Iに変換し、第1の信号Iは標本から反射さ
れた光の強度に比例する。走査装置6によって発生され
る位置信号Pは、電気結線17を介して第2の入力ポー
ト16に送られる。図1に示される実施態様は、制御
処理装置16に送られる2つの異なるアナログ信号I,
Pを示している。このような歪み乱された入力アナログ
信号I,Pは、制御処理装置16において補正ディジタ
ル信号に変換される。次に、ディジタル信号は、画像処
理および表示装置20で画像表示を行うためにコンピュ
ータ18に送信される。表示装置20は、使用者にたと
えば、標本10の褪色率、飽和挙動、オーバサンプリン
グ、アンダサンプリング、ピンホールサイズなどの関連
画質変数の同時視覚的表示を提供する。制御処理装置1
6は、複数のFPGA装置(現場でプログラム可能なゲ
ートアレイ)を用いて実現される。走査信号のオンライ
ン処理を実現するために、アナログ信号I,Pは、でき
る限りディジタル化され、結果として生じるディジタル
データは、プログラム可能なディジタル論理回路によっ
て処理され、ナノセカンドの精度の実時間処理を行うこ
とができる。
【0015】制御処理装置16において実現される処理
の実施態様が、図2に概略的に示されている。2枚の連
続して取込まれた画像の画素強度は、ヒストグラムとし
て表示される。第1の画像B(t)は時間tで取込
まれ、第2の画像B(t)は時間tで取込まれる。
画像に対応する信号は、制御処理装置16およびコンピ
ュータ18に送られる。第1および第2の画像B
(t),B(t)の測定された画素強度は、ヒスト
グラム22としてグラフに表される。各データ点の横座
標は強度Iを表し、縦座標は強度H(I)の周波数を表
す。測定された画素データ(強度H(I))は、必要な
計算を実行するために、制御処理装置16およびコンピ
ュータ18に送られる。強度ヒストグラムをグラフに表
す処理は、ヒストグラムデータから褪色率を算出するた
めに使用される。第1のヒストグラムH(I)は第1
の画像B(t)の画素強度から得られ、第2のヒスト
グラムH(I)は第2の画像B(t)の画素強度か
ら得られる。第1および第2のヒストグラムH
(I),H(I)のそれぞれに関して、すべての画
像B(t),B(t)の平均画素強度を表す重心が
算出される。したがって、既存の走査変数を考慮に入れ
なければならない。たとえば、あふれ領域付近または表
示限界付近で、検出器12を作動してもよい。(このよ
うな事実が考慮され、使用者に表示される。)ヒストグ
ラムの重心Iは、式(1)によって算出される:
【数1】 第1の画像B(t)の第1のヒストグラムH(I
の重心Iは、第2の画像B(t)の第2のヒストグ
ラムH(I)の重心Iと比較されるため、異なる位
置であってもよい。褪色係数Bは、式(2)による重心
のずれから算出されることができる:
【数2】 走査の光強度がある走査とその次の走査が異なる場合に
は、ヒストグラムの重心のずれによって、標本色素の飽
和度を算出することができる。標本色素の飽和度を算出
するために、前に算出された褪色率を考慮してもよい。
【0016】褪色率および画像雑音を決定するための別
の方法が、図3に概略的に示されている。この方法は、
連続して取込まれた第1の画像B(t)および第2の
画像B(t)の画素強度周波数を比較する。この方法
によれば、時間tで取込まれた第1の画像B(t
の画素強度Iおよび、時間tで取込まれた第2の画
像B(t)の画素強度Iが決定され、対応する画像
信号が制御処理装置16およびコンピュータ18に送ら
れる。第1および第2の画像B(t),B(t)に
対応する画素強度は、グラフ24として示されている。
このグラフの横座標は、第2の画像B(t)の画素強
度Iを示し、縦座標は同一の画素における第1の画像
B(t)の画素強度Iを示す。褪色していない標本
に対応するグラフは、横座標に対して45°の傾きのあ
る直線30(実線)である。一方、褪色している標本
は、横座標に対して45°以上の傾きのある直線32
(点線)を形成する。もちろん、実際には、画素強度測
定は影響を受けるのに対して、線30,32は、完全な
測定の場合に限って作成されることができることに留意
しなければならない。
【0017】画像の背景雑音を決定するための方法が、
図4に概略的に示されている。直線40は、雑音のない
理想的な場合に対応する。実際には、2枚の画像B(t
),B(t)の画素強度I,Iに対応する強度
の組のデータ(I,I)は、直線40の周囲に分散
される。直線40に垂直である断面において、強度の組
のデータ(I,I)の分布42は、実際の雑音の程
度に関連されうる。大部分の場合において、分布42
は、ガウス分布またはポアソン分布44である。標準偏
差は、使用者に表示される平均画素雑音を示す。本発明
の別の実施態様において、図4に示された図は、ディス
プレイ20上で使用者に表示される。すでに述べた方法
によれば、使用者は、分布42の幅から既存の雑音を決
定することができ、さらに、分布42の傾きから褪色率
を直接決定することができる。
【0018】本発明の一実施態様において、図5に示さ
れるようなディスプレイ20上の画質変数に対応するも
のを見ながら、顕微鏡の走査変数を調整することができ
る。変数は、ディスプレイ上の任意の位置にある任意の
サイズの図形表示ウィンドウ50として表示されること
ができる。
【0019】図形表示ウィンドウ50のさらなる詳細図
が、図6に示されている。図形表示ウィンドウ50は、
個別の区画61,62,63,64にさまざまな変数の
実際の値および複数のクリックボタン65,66,6
7,68を表示する。標本の雑音は、第1の区画61に
おけるグラフ70として表示される。ノイズバー71の
高さは、測定された画素強度の0%〜100%の範囲の
中の雑音の程度に対応する。標本の褪色度は、第2の区
画62に表示される。褪色度は、ブリーチングバー74
の高さが標本を横切る走査ビームの1走査当り0パーミ
ル〜10パーミルの範囲の褪色の程度に対応するような
グラフ73として表示される。標本の飽和度は、百分率
で飽和度を示す数字によって第3の区画63に表示され
る。クリックボタン67も、図形表示ウィンドウ50の
第3の区画63に表示される。クリックボタン67は、
付加的なウィンドウ69を開く「最適」ラベルを含む。
付加的なウィンドウ69は、使用者に変数を低いレベル
の飽和度に調整する方法に関する説明及びヒントを提供
する。図6に示される特定の実施態様において、説明に
は、「有用な照射強度は、色素によって制限される。こ
れにより、解像度が減少する。」と表示され、ヒントに
は、「さらに低い飽和度を得るために低出力のレーザを
使用する。」と表示されている。標本のサンプリング設
定は、第4の区画64で監視され、表示される。現在の
サンプリング設定は、最も明るく点灯したボタン64a
として表示される。サンプリング設定は、3つの可能な
標本抽出率:オーバサンプリング、正常、アンダサンプ
リングに反映される。第1の区画61の下には、雑音/
信号比を最適化するために顕微鏡設定を調整するための
第1のクリックボタン65がある。第2の区画62の下
には、1つの走査から別の走査へ標本の最適な褪色度を
設定し、維持するための第2のクリックボタン66があ
る。第4の区画64の下には、高画質の標本画像を取込
むために必要な変数のすべてを自動的に調整するための
第4のクリックボタン68がある。
【0020】図7は、2つの検出チャネルの間のクロス
トークを示している。横座標は第1のスペクトル検出チ
ャネルによって発生された信号の強度I(Ch)を示
し、縦座標は第2の検出チャネルによって発生された信
号の強度I(Ch)を示す。2つのチャネルの間にク
ロストークがない場合には、第1の線81を規定する第
1の分布80および第2の線83を規定する第2の分布
82が観測される。たとえば、第2のチャネルから第1
のチャネルへのクロストークは、図7において矢印によ
って示されているように、第1のスペクトル検出チャネ
ルが横座標から離れて回転する。図7のグラフは、使用
者に可能なクロストークを表示することができるように
するために、ディスプレイ20上で使用者に示されても
よい。
【図面の簡単な説明】
【図1】 共焦点顕微鏡および3次元標本画像を得るた
めのシステムの概略図である。
【図2】 ヒストグラムにおいて連続画像の画素強度を
表示するための計算方法の概略図である。
【図3】 連続画像の画素強度の周波数を比較する計算
方法の概略図である。
【図4】 画像の雑音を決定するための方法の概略図で
ある。
【図5】 視覚的なユーザインターフェイスの実施態様
の概略図である。
【図6】 さらに詳細な視覚的なユーザインターフェイ
スの実施態様の概略図である。
【図7】 2つの検知チャネルの間のクロストークを示
したグラフである。
【符号の説明】
2 照射システム、 4 ビームスプリッタ、 6 走
査装置、 7 走査ミラーシステム、 8 光学系、
10 標本、 12 第1の検出器、 16 制御処理
装置、 16 入力ポート、 16 入力ポート、
17 電気結線、 18 コンピュータ、 20 表
示装置、 22 ヒストグラム、 24グラフ、 30
褪色していない標本に対応するグラフ、 32 褪色
している標本に対応するグラフ、 40 雑音のない理
想的な場合、 42 強度の組のデータ(I,I
の分布 44 ガウス分布またはポアソン分布、 50
図形表示ウィンドウ、 61 第1の区画 、62 第
2の区画、 63 第3の区画、 64a 現在のサン
プリング設定、 65 第1のクリックボタン、66
第2のクリックボタン、 67 第3のクリックボタ
ン、 68 第4のクリックボタン、 69 付加的な
ウィンドウ、 70 雑音のグラフ、71ノイズバー、
73 褪色度を表すグラフ、 74 ブリーチングバ
ー、 80 第1の分布、 81 第1の線、 82
第2の分布、 83 第2の線、L 光ビーム、
、第1の経路、 L 第2の経路、I 第1の電
気信号、 P 位置信号、 B(t) 第1の画像、
B(t) 第2の画像、H(I) 第1のヒスト
グラム、 H(I) 第2のヒストグラム、 I
第1のヒストグラムH(I)の重心、 I 第2の
ヒストグラムH(I )の重心、 I(Ch) 第1
のスペクトル検出チャネルによって発生された信号の強
度、 I(Ch) 第2の検出チャネルによって発生
された信号の強度、

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 走査型顕微鏡の使用者に手引きをするた
    めのシステムであって、 標本から反射された光に対応する第1の信号および標本
    上の走査ビームの位置に対応する位置信号と、 前記第1の信号および前記位置信号を受信し、前記第1
    の信号および前記位置信号に対応するディジタルデータ
    を生成し、前記ディジタルデータが画質変数を示してい
    る制御処理装置と、 前記ディジタルデータを処理するコンピュータ手段と、 前記画質変数に関する視覚的情報を提供する表示装置と
    を含むシステム。
  2. 【請求項2】 前記画質変数が、複数のクリックボタン
    を使用者に提供する図形表示ウィンドウに表示され、選
    択された画質変数を最適化するようになっている請求項
    (1)に記載のシステム。
  3. 【請求項3】 使用者手引きを提供するための走査型顕
    微鏡システムであって、 光ビームを発生する照射源と、 前記光ビームを標本に誘導するための光学手段と、 前記標本を横切って前記光ビームを走査するための走査
    装置と、 前記標本からの光を検出して第1の信号を生成する、少
    なくとも1つの検出器および前記標本の面で前記光ビー
    ムの位置に対応する位置信号を発生するための手段と、 前記第1の信号および前記位置信号を受信し、前記第1
    の信号および前記位置信号に対応するディジタルデータ
    を生成し、前記ディジタルデータが画質変数を示してい
    る制御処理装置と、 前記ディジタルデータを処理するコンピュータ手段と、 前記画質変数に関する視覚的情報を提供する表示装置と
    を含むシステム。
  4. 【請求項4】 走査型顕微鏡において、使用者に手引き
    をするための方法であって、 標本の第1の画像および第2の画像に対応するデータで
    あって、前記標本を走査するビームにより、蛍光または
    反射光によって生成されたデータを連続収集すること
    と、 前記データをディジタル化することと、 複数の画質変数を算出するために、前記データを統計処
    理することと、 さらなる画像取込みのために、前記複数の画質変数を利
    用することとを含む方法。
  5. 【請求項5】 前記蛍光または反射光が、マルチバンド
    検出器によって検知される請求項(4)に記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記画質変数が、標本の褪色率、標本色
    素の褪色率、画像雑音、オーバサンプリング、アンダサ
    ンプリング、検出器のあふれおよび下位桁あふれ、飽和
    度、走査速度、標本の走査される領域のサイズからなる
    群から選択される請求項(4)に記載の方法。
  7. 【請求項7】 第1の線における前記第1の画像の画素
    強度信号をグラフに表すことと、第2の線における前記
    第2の画像の画素強度信号をグラフに表すこととをさら
    に含む請求項(4)に記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記第1および第2の線の傾きから標本
    色素の褪色率を決定することをさらに含む請求項(7)
    に記載の方法。
  9. 【請求項9】 前記第1の画像を取込んだ後、照射強度
    を変更することと、前記第1の線および前記第2の線の
    傾きから前記標本色素の飽和度を決定することと、をさ
    らに含む請求項(7)に記載の方法。
  10. 【請求項10】 使用者によって前記複数の画質変数の
    設定からオーバサンプリングおよびアンダサンプリング
    を決定することをさらに含む請求項(7)に記載の方
    法。
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