JP2001194303A - Device for analyzing diffusion motion of fluorescent molecule - Google Patents
Device for analyzing diffusion motion of fluorescent moleculeInfo
- Publication number
- JP2001194303A JP2001194303A JP2000004695A JP2000004695A JP2001194303A JP 2001194303 A JP2001194303 A JP 2001194303A JP 2000004695 A JP2000004695 A JP 2000004695A JP 2000004695 A JP2000004695 A JP 2000004695A JP 2001194303 A JP2001194303 A JP 2001194303A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- excitation light
- sample
- fluorescence
- fluorescent
- diffusion motion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、視野内の被測定試
料中の蛍光分子の拡散運動を解析する蛍光分子拡散運動
解析装置に関するものである。[0001] 1. Field of the Invention [0002] The present invention relates to a fluorescent molecule diffusion motion analyzer for analyzing the diffusion motion of fluorescent molecules in a sample to be measured in a visual field.
【０００２】[0002]
【従来の技術】溶液中における極微小な粒子と粒子との
結合、分子と分子との結合、抗原抗体反応など、２つの
物質の間の相互作用すなわち解離会合反応の解析は、２
つの物質の間の動的理解を深める上で、或いは静的結合
学を知る上で、不可欠な課題である。例えば、抗原抗体
反応は抗原とその抗体との間で特異的な反応であり、あ
る種の抗原に対して産生された抗体は、特別な例外を除
き、その抗原とのみ結合する。このような免疫反応を利
用したいわゆる免疫測定法は、測定対象物を複雑な組成
の混合物の中から特異的に選別できるので、物質の分離
や検出に広く用いられており、測定系を最適化するため
には、抗体と抗原との反応様式を測定することが必要で
ある。2. Description of the Related Art The analysis of the interaction between two substances, that is, the dissociation-association reaction, such as the binding between extremely small particles in a solution, the binding between molecules, the antigen-antibody reaction, etc.
It is an indispensable task to deepen the dynamic understanding between two substances or to understand static coupling. For example, an antigen-antibody reaction is a specific reaction between an antigen and its antibody, and antibodies produced against a certain antigen bind only with that antigen, with special exceptions. The so-called immunoassay using such an immune reaction can be used to specifically select the analyte from a mixture of complex compositions, and is widely used for the separation and detection of substances. To do so, it is necessary to measure the mode of reaction between the antibody and the antigen.
【０００３】従来より、２つの物質の間の相互作用を測
定する方法が多数提案されている。例えば、平均透析
法、連続平衡透析法、超遠心法、ゲル濾過法、限外濾過
法、硫安沈殿法、ポリエチレングリコール法、二次抗体
法、固相ＲＩＡ法、吸収スペクトル法および蛍光法等が
知られている。これらのうち、分光学的な性質を利用す
る蛍光法は、少量の試料で測定が可能である。従来の蛍
光法は、２つの物質の間の相互作用によって形成される
複合体の形成量に比例するシグナルの測定が蛍光の消光
や増強に基づくものである。[0003] Conventionally, many methods have been proposed for measuring the interaction between two substances. For example, average dialysis method, continuous equilibrium dialysis method, ultracentrifugation method, gel filtration method, ultrafiltration method, ammonium sulfate precipitation method, polyethylene glycol method, secondary antibody method, solid phase RIA method, absorption spectrum method, fluorescence method, etc. Are known. Among these, the fluorescence method utilizing spectroscopic properties can measure with a small amount of sample. In the conventional fluorescence method, measurement of a signal proportional to the amount of a complex formed by the interaction between two substances is based on quenching or enhancement of fluorescence.
【０００４】また、近年においては、自己相関蛍光法に
より複合体の形成量を測定することが行われるようにな
り、統計学的な手段により、蛍光強度のゆらぎと分子の
並進拡散運動との関係を密接に求めることにより、分子
の相互作用の解析が行われている。In recent years, the amount of complex formed has been measured by the autocorrelation fluorescence method, and the relationship between the fluctuation of the fluorescence intensity and the translational diffusion movement of molecules has been determined by statistical means. By closely determining the, the interaction of molecules is analyzed.
【０００５】また、自己相関蛍光法とは異なり、蛍光分
子１個の運動を直接的に測定する手法も存在する。例え
ば、溶液中に浮遊している蛍光分子は、溶液の温度およ
び粘性度ならびに蛍光分子自身の大きさをパラメータと
した並進拡散運動により、常に所在する位置が変動して
いる。その蛍光分子の並進拡散速度は、 rhodamin6Gで
は３×１０-6ｃｍ2／ｓ程度であり、B-phicoerythrin
では６×１０-7ｃｍ2／ｓ程度であり、１μｍ3の観測領
域が顕微鏡下に仮想的に作られたとき、rhodamin6G で
は１．７ｍｓｅｃの平均時間で、B-phicoerythrin では
８．３ｍｓｅｃの平均時間で、観測領域内にあるそれぞ
れの蛍光分子が隣接する次の領域へと３次元的にランダ
ムに移動する。[0005] Unlike the autocorrelation fluorescence method, there is also a method for directly measuring the movement of one fluorescent molecule. For example, the location of a fluorescent molecule floating in a solution is constantly changing due to translational diffusion motion using the temperature and viscosity of the solution and the size of the fluorescent molecule itself as parameters. The translational diffusion rate of the fluorescent molecule is about 3 × 10 -6 cm 2 / s for rhodamin6G, and the B-phicoerythrin
Is about 6 × 10 −7 cm 2 / s, and when an observation area of 1 μm 3 is virtually created under a microscope, the average time of 1.7 msec for rhodamin6G and 8.3 msec for B-phicoerythrin At time, each fluorescent molecule in the observation area moves randomly three-dimensionally to the next adjacent area.
【０００６】この現象に着目し、顕微鏡下において蛍光
分子からの発光を検出し、この並進拡散運動を解析しよ
うとする試みが始まっており、“Xiao-Hong Xu, Edward
S.Yeung, Science, 1997, 275, 1106”の文献では、エ
バネッセント照明法とＩＣＣＤカメラ（イメージインテ
ンシファイドＣＣＤ）の組み合わせで、3.25msecの露光
時間とＣＣＤ高速読み出し法とにより、顕微鏡下におい
て溶液中の rhodamin6G の並進拡散運動の検出を行なっ
ている。これは、単一蛍光分子検出技術を背景に、エバ
ネッセント照明法による低バックグラウンドな環境の構
築、および、数ミリ秒の高速フレームレート・ビデオカ
メラの採用により、蛍光分子１個の拡散運動を直接的に
計測するものである。Attention has been paid to this phenomenon, and attempts have been made to detect light emission from fluorescent molecules under a microscope and to analyze this translational diffusion motion. “Xiao-Hong Xu, Edward
In the literature of S. Yeung, Science, 1997, 275, 1106 ”, a combination of an evanescent illumination method and an ICCD camera (image-intensified CCD), an exposure time of 3.25 msec and a CCD high-speed readout method are used to obtain a solution under a microscope. Detection of translational diffusion motion of rhodamin6G in the environment, based on single fluorescent molecule detection technology, construction of low background environment by evanescent illumination method, and fast frame rate video of several milliseconds The adoption of a camera directly measures the diffusion movement of one fluorescent molecule.
【０００７】顕微鏡下において、溶液中を３次元的に運
動する蛍光分子を計測するという方法は、その運動特性
の違いにより、分子を識別する能力を有し、しかも自然
状態に近い液相の状態において微量の試料を簡便に、２
種の物質の間の解離反応および会合反応を測定すること
ができる。したがって、抗原抗体反応を用いたイムノア
ッセイ法や細胞の動的計測に関連して細胞レセプタ数の
計測や細胞表面の特異抗原の測定等にも応用されようと
している。The method of measuring a fluorescent molecule moving three-dimensionally in a solution under a microscope has the ability to identify the molecule due to the difference in its movement characteristics, and furthermore, has a liquid phase state close to a natural state. A small amount of sample can be easily stored in
Dissociation and association reactions between species can be measured. Therefore, in connection with the immunoassay method using the antigen-antibody reaction and the dynamic measurement of cells, it is going to be applied to the measurement of the number of cell receptors, the measurement of specific antigens on the cell surface, and the like.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、蛍光物
質の並進拡散運動の解析によりその物質を識別しようと
する場合、特に２種の物質の間の解離反応および会合反
応を測定しようとする場合、以下の問題点がある。However, when an attempt is made to identify a fluorescent substance by analyzing the translational diffusion motion of the fluorescent substance, and particularly to measure a dissociation reaction and an association reaction between two kinds of substances, the following method is required. There is a problem.
【０００９】自己相関蛍光法においては、共焦点光学系
により顕微鏡下に極微小な測定領域を形成し、その測定
領域中に観測される蛍光物質の平均個数、蛍光物質の並
進拡散定数を求めることを目的としているが、測定領域
中に存在する蛍光物質の数が少ない場合、例えば平均個
数が０．１とか０．０１では、蛍光を検出する効率が悪
くなるため、Ｓ／Ｎ比が低下し、これを解消するため
に、長時間の測定時間を要する等の問題が生じる。これ
は、極微小な測定領域からの蛍光を検出するという手法
から、余儀なくされる事象であり、極低濃度な試料を測
定する際の問題点となっている。In the autocorrelation fluorescence method, a very small measurement area is formed under a microscope by a confocal optical system, and the average number of fluorescent substances observed in the measurement area and the translational diffusion constant of the fluorescent substance are determined. However, when the number of fluorescent substances present in the measurement area is small, for example, when the average number is 0.1 or 0.01, the efficiency of detecting the fluorescence is deteriorated, so that the S / N ratio decreases. In order to solve this problem, a long measurement time is required. This is an event that is inevitable from the technique of detecting fluorescence from an extremely small measurement region, and is a problem when measuring an extremely low concentration sample.
【００１０】また、極低濃度な試料を測定する手法が上
記のXiao-Hong Xuの文献に記載されている。これは、顕
微鏡視野内に存在する各蛍光分子を、エバネッセント照
明法を用いて同時に測定し、そのフラクチュエーション
（空間的にランダムに運動している状態）を解析し、rh
odamin6G (R6G)と３０塩基のＤＮＡ鎖にラベルしたrhod
amin6G (DNA-R6G)との違いを示唆しており、自己相関蛍
光法に比べ、短時間にて計測が行える利点を有してい
る。しかし、エバネッセント照明法を用いた場合、顕微
鏡下で測定できる領域は、励起光が全反射している近傍
のみとなり、すなわち、基盤と溶媒の界面付近に存在す
る蛍光分子しか測れない。またThin-layermodeなる照明
法を用いた場合、エバネッセント照明法の問題点は解消
されるが、屈折率の関係により、液浸系の高開口数の対
物レンズを用いることができないといった欠点を有す
る。[0010] A technique for measuring an extremely low concentration sample is described in the above-mentioned Xiao-Hong Xu document. This means that each fluorescent molecule present in the field of view of the microscope is measured simultaneously using the evanescent illumination method, and its fractionation (in a state of moving randomly in space) is analyzed.
rhod labeled with odamin6G (R6G) and 30 bases DNA strand
It suggests a difference from amin6G (DNA-R6G), and has the advantage that measurement can be performed in a shorter time than the autocorrelation fluorescence method. However, when the evanescent illumination method is used, the area that can be measured under a microscope is only in the vicinity where excitation light is totally reflected, that is, only fluorescent molecules existing near the interface between the substrate and the solvent can be measured. When the thin-layer mode illumination method is used, the problem of the evanescent illumination method is solved, but there is a disadvantage that an immersion type high numerical aperture objective lens cannot be used due to the relationship of the refractive index.
【００１１】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、視野内に離散的に存在する蛍光分子の
並進拡散運動を、高感度、高解像度、高時間分解能で解
析することができる蛍光分子拡散運動解析装置を提供す
ることを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and it is an object of the present invention to analyze translational diffusion motion of fluorescent molecules discretely present in a visual field with high sensitivity, high resolution, and high time resolution. It is an object of the present invention to provide a fluorescent molecule diffusion motion analyzing device capable of performing the above-mentioned.
【００１２】[0012]
【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光分子拡
散運動解析装置は、視野内の被測定試料中の蛍光分子の
拡散運動を解析する蛍光分子拡散運動解析装置であっ
て、(1) 視野内においてライン状の励起光を当該ライン
方向と直交する方向に走査しながら被測定試料に照射す
る励起光照射光学系と、(2) 励起光照射光学系により照
射された被測定試料中の蛍光分子から発生した蛍光を結
像する蛍光結像光学系と、(3) 蛍光結像光学系により結
像された蛍光の像面位置に撮像面を有する２次元光検出
器と、(4)２次元光検出器の撮像面に結像された蛍光の
像のうち、励起光照射光学系により励起光が照射された
被測定試料のライン状位置に対応する各画素における蛍
光強度を各走査位置で求め、この求められた各画素にお
ける蛍光強度に基づいて被測定試料中の蛍光分子の拡散
運動を解析する解析部と、を備えることを特徴とする。According to the present invention, there is provided a fluorescent molecule diffusion motion analyzer for analyzing a diffusion motion of a fluorescent molecule in a sample to be measured in a visual field, wherein (1) An excitation light irradiation optical system for irradiating the sample to be measured while scanning the line-shaped excitation light in a direction orthogonal to the line direction in the visual field; and A fluorescence imaging optical system for imaging fluorescence generated from fluorescent molecules, (3) a two-dimensional photodetector having an imaging surface at an image plane position of the fluorescence imaged by the fluorescence imaging optical system, (4) In the fluorescence image formed on the imaging surface of the two-dimensional photodetector, the fluorescence intensity at each pixel corresponding to the linear position of the sample to be measured irradiated with the excitation light by the excitation light irradiation optical system is calculated at each scanning position. And based on the obtained fluorescence intensity at each pixel, Characterized in that it comprises an analysis unit for analyzing the diffusion motion of fluorescent molecules fixed in a sample, the.
【００１３】この蛍光分子拡散運動解析装置は、視野内
の被測定試料で離散的に存在している蛍光分子の動きを
計測し、その蛍光分子の並進拡散運動の速度を解析する
装置である。この蛍光分子拡散運動解析装置によれば、
励起光照射光学系により、視野内においてライン状の励
起光が、このライン方向と直交する方向に走査されなが
ら被測定試料に照射される。励起光照射光学系により励
起光が照射された被測定試料中の蛍光分子から蛍光が発
生すると、この蛍光は、蛍光結像光学系により２次元光
検出器の撮像面上に結像される。この蛍光の像は、励起
光照射光学系により被測定試料へ照射されるライン状の
励起光の形状に応じたものとなる。解析部により、２次
元光検出器の撮像面に結像された蛍光の像のうち、励起
光照射光学系により照射された被測定試料のライン状位
置に対応する各画素における蛍光強度が各走査位置で求
められ、この求められた各画素における蛍光強度に基づ
いて被測定試料中の蛍光分子の拡散運動が解析される。This fluorescent molecule diffusion motion analyzer is a device that measures the motion of a fluorescent molecule that is discretely present in a sample to be measured in a visual field and analyzes the speed of the translational diffusion motion of the fluorescent molecule. According to this fluorescent molecule diffusion motion analyzer,
The excitation light irradiating optical system irradiates the sample to be measured with linear excitation light in the visual field while scanning in a direction orthogonal to the line direction. When fluorescence is generated from the fluorescent molecules in the sample to be measured irradiated with the excitation light by the excitation light irradiation optical system, the fluorescence is imaged on the imaging surface of the two-dimensional photodetector by the fluorescence imaging optical system. The image of the fluorescence corresponds to the shape of the linear excitation light irradiated on the sample to be measured by the excitation light irradiation optical system. In the fluorescence image formed on the imaging surface of the two-dimensional photodetector, the fluorescence intensity at each pixel corresponding to the linear position of the sample to be measured irradiated by the excitation light irradiation optical system is analyzed by the analysis unit. The diffusion motion of the fluorescent molecules in the sample to be measured is analyzed based on the position, and based on the obtained fluorescence intensity at each pixel.
【００１４】より具体的には、励起光源から出力されシ
リンドリカルレンズによりライン状のビームスポット
（スリット照明と等価）とされた励起光は、対物レンズ
よりＹ軸方向に伸びたラインで照射される。さらに、光
走査手段（例えばガルバノメータスキャナー）により、
そのライン状のビームスポットは、ライン状の方向に対
して垂直方向すなわちＸ軸方向に走査される。この励起
光照射光学系により、顕微鏡下における撮像領域全体を
励起することが可能となる。この時、光走査手段による
励起光の走査周波数により、この蛍光分子拡散運動解析
装置の時間分解能が決定される。More specifically, the excitation light output from the excitation light source and converted into a linear beam spot (equivalent to slit illumination) by a cylindrical lens is emitted from the objective lens in a line extending in the Y-axis direction. Further, by optical scanning means (for example, a galvanometer scanner)
The linear beam spot is scanned in a direction perpendicular to the linear direction, that is, in the X-axis direction. With this excitation light irradiation optical system, it is possible to excite the entire imaging area under the microscope. At this time, the time resolution of the fluorescent molecule diffusion motion analyzer is determined by the scanning frequency of the excitation light by the optical scanning means.
【００１５】また、この走査照明に合わせ、２次元光検
出器（例えば、イメージインテンシファイア付きＣＣＤ
カメラ：ＩＣＣＤカメラ）が動作することにより、励起
された蛍光分子からの発光を検出することができ、ＣＣ
Ｄに、インターライン型ＣＣＤやフレームトランスファ
ー型ＣＣＤ（光検出領域とデータ転送領域を持つもの）
を用いることにより、Ｘ軸方向への走査照明が終わりし
だい、光検出領域のデータは、データ転送用のＣＣＤエ
リアに転送し、さらに、走査照明中に順次にデータ転送
用ＣＣＤのデータを読み込むことにより、走査信号と同
期させ、これを繰り返し行うことにより、高速なフレー
ムレートにて画像取得が可能となる。Further, in accordance with the scanning illumination, a two-dimensional photodetector (for example, a CCD with an image intensifier) is used.
Camera: ICCD camera) can detect the light emission from the excited fluorescent molecules,
D: Interline type CCD or frame transfer type CCD (with light detection area and data transfer area)
As soon as the scanning illumination in the X-axis direction is completed, the data in the light detection area is transferred to the CCD area for data transfer, and the data in the CCD for data transfer is sequentially read during the scanning illumination. Thus, by synchronizing with the scanning signal and repeating this, it is possible to obtain an image at a high frame rate.
【００１６】また、２次元光検出器として光子計数型２
次元位置検出器を用いることができ、走査速度を向上さ
せるのに有用な方法となる。この場合、光子計数型の２
次元位置検出器は、励起された蛍光分子からの発光に対
し、その２次元的な位置と光強度とを高時間分解能で検
出することができるものであり、この２次元位置検出器
から出力される光子の位置検出信号およびその信号の発
生タイミングは、走査周波数によって、蛍光分子の位置
情報および時間情報を持つため、走査周波数によって決
められたフレームレートの撮像が可能となる。すなわ
ち、光走査手段による励起光の走査時間を基にしたフレ
ームレート時間、２次元位置検出器からの時系列に出力
されるＸ、Ｙ信号および光強度の情報より、画像構築が
可能となり、そのフレームレート時間に対応した時間分
解能で画像を得ることができる。A photon counting type 2 is used as a two-dimensional photodetector.
A dimensional position detector can be used, which is a useful method to increase the scanning speed. In this case, the photon counting type 2
The two-dimensional position detector is capable of detecting the two-dimensional position and light intensity of the emitted light from the excited fluorescent molecules with high time resolution, and outputs the two-dimensional position detector. Since the position detection signal of the photon and the generation timing of the signal have the position information and the time information of the fluorescent molecule depending on the scanning frequency, the imaging at the frame rate determined by the scanning frequency becomes possible. That is, it is possible to construct an image from the frame rate time based on the scanning time of the excitation light by the optical scanning means, and the information of the X, Y signals and light intensity output in time series from the two-dimensional position detector. An image can be obtained with a time resolution corresponding to the frame rate time.
【００１７】どちらの２次元光検出器を用いた場合にお
いても、光走査手段による励起光の走査時間に応じたフ
レームレートによる画像取得が可能で、顕微鏡下の任意
の位置で蛍光分子を励起し、その分子からの発光を、２
次元光検出器が任意の位置または画素で検出したとき、
次の励起にいたるまでの時間内に、その蛍光分子が隣の
位置（撮像装置の解像度に依存）もしくは隣の画素に移
動したことを検出できれば、その発光から蛍光分子の並
進拡散運動の軌跡を追うことができる。With either two-dimensional photodetector, an image can be acquired at a frame rate corresponding to the scanning time of the excitation light by the optical scanning means, and the fluorescent molecules can be excited at any position under the microscope. , The emission from that molecule
When the three-dimensional photodetector detects at any position or pixel,
If it can be detected that the fluorescent molecule has moved to the next position (depending on the resolution of the imaging device) or to the next pixel within the time until the next excitation, the trajectory of the translational diffusion motion of the fluorescent molecule can be determined from the emission. I can follow.
【００１８】さらに、光走査手段と２次元光検出器とを
同期させることにより得られた２次元画像の解析法とし
ては、軌跡の大きさを評価する方法や、自己相関演算処
理による評価法がある。軌跡の大きさを評価する場合に
おいては、蛍光分子の移動度を光走査手段によって決ま
るフレームレート時間で規格化することにより簡単に行
える。また、Ｓ／Ｎ比が十分に取れていない画像に関し
ては、自己相関蛍光法の概念を取り入れ、自己相関演算
処理をそれぞれの画素毎にフレームレート時間に対して
求め、その平均値を一般的に行われている自己相関蛍光
法と同様の処理を行うことによって、分子の並進拡散運
動を求めることが可能となる。これら一連の処理を実行
することにより、顕微鏡下に離散する蛍光物質を、その
並進拡散運動の特性の相違より判定することが行える。Further, as a method of analyzing a two-dimensional image obtained by synchronizing the light scanning means and the two-dimensional photodetector, a method of evaluating the size of a trajectory and an evaluation method by autocorrelation calculation processing are available. is there. In the case of evaluating the size of the trajectory, it can be easily performed by normalizing the mobility of the fluorescent molecule with the frame rate time determined by the optical scanning means. For images where the S / N ratio is not sufficiently obtained, the concept of the autocorrelation fluorescence method is adopted, the autocorrelation calculation process is performed for the frame rate time for each pixel, and the average value is generally calculated. By performing the same processing as the autocorrelation fluorescence method being performed, it becomes possible to obtain the translational diffusion motion of the molecule. By executing these series of processes, the fluorescent substance dispersed under the microscope can be determined from the difference in the characteristics of the translational diffusion motion.
【００１９】また、このような照明法と２次元光検出器
とを組み合わせた場合、得られる光検出強度の信号に対
し、閾値を設定でき、２次元光検出器自身のノイズを最
小に抑えることが行える。When such an illumination method is combined with a two-dimensional photodetector, a threshold value can be set for the signal of the obtained photodetection intensity, and the noise of the two-dimensional photodetector itself can be minimized. Can be performed.
【００２０】さらに照明法として、２光子励起法も選択
でき、試料由来の背景光をさらに抑えることが可能とな
り、また、対物レンズの焦点深度を制限することが可能
となる。Further, a two-photon excitation method can be selected as the illumination method, so that background light originating from the sample can be further suppressed, and the depth of focus of the objective lens can be limited.
【００２１】[0021]
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明にお
いて同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を
省略する。Embodiments of the present invention will be described below in detail with reference to the accompanying drawings. In the description of the drawings, the same elements will be denoted by the same reference symbols, without redundant description.
【００２２】図１は、本実施形態に係る蛍光分子拡散運
動解析装置１の構成図である。この蛍光分子拡散運動解
析装置１は、被測定試料２に励起光を照射する励起光照
射光学系として、励起光源１１、音響光学変調素子１
２、ミラー１３、コリメータ光学系１４、シリンドリカ
ルレンズ１５、ガルバノメータミラー１６、ドライバ１
７、リレーレンズ１８，１９、ダイクロイックミラー２
１および対物レンズ２２を備えている。また、この蛍光
分子拡散運動解析装置１は、被測定試料２中の蛍光分子
から発生した蛍光を結像する蛍光結像光学系として、ダ
イクロイックミラー２１、対物レンズ２２、バンドパス
フィルタ２４および結像レンズ２５を備えている。ま
た、この蛍光分子拡散運動解析装置１は、２次元光検出
器３１、ドライバ３２および解析部４０を備えている。FIG. 1 is a configuration diagram of a fluorescent molecule diffusion motion analyzing apparatus 1 according to the present embodiment. The fluorescent molecule diffusion motion analyzer 1 includes an excitation light source 11 and an acousto-optic modulator 1 as an excitation light irradiation optical system for irradiating the sample 2 to be measured with excitation light.
2, mirror 13, collimator optical system 14, cylindrical lens 15, galvanometer mirror 16, driver 1
7, relay lenses 18, 19, dichroic mirror 2
1 and an objective lens 22. The fluorescent molecule diffusion motion analyzer 1 includes a dichroic mirror 21, an objective lens 22, a band-pass filter 24, and a fluorescent imaging optical system for imaging fluorescence generated from fluorescent molecules in the sample 2 to be measured. The lens 25 is provided. The fluorescent molecule diffusion motion analysis device 1 includes a two-dimensional photodetector 31, a driver 32, and an analysis unit 40.
【００２３】励起光源１１は、被測定試料２中の蛍光分
子を励起する励起光を出力するものであり、例えば、波
長５３２ｎｍで光強度５０ｍＷのレーザ光を励起光とし
て出力するＬＤ励起Ｎｄ：ＹＡＧレーザ光源が好適に用
いられる。音響光学変調素子１２は、励起光源１１から
出力された励起光を入力し、被測定試料２への励起光の
走査に同期して励起光を透過または遮断する。ミラー１
３は、音響光学変調素子１２を透過した励起光を反射さ
せコリメータ光学系１４へ入射させる。The excitation light source 11 outputs excitation light that excites fluorescent molecules in the sample 2 to be measured. For example, LD excitation Nd: YAG that outputs laser light having a wavelength of 532 nm and a light intensity of 50 mW as excitation light. A laser light source is preferably used. The acousto-optic modulator 12 receives the excitation light output from the excitation light source 11 and transmits or blocks the excitation light in synchronization with the scanning of the sample 2 to be measured with the excitation light. Mirror 1
Numeral 3 reflects the excitation light transmitted through the acousto-optic modulation element 12 and makes it incident on the collimator optical system 14.
【００２４】コリメータ光学系１４は、入力した励起光
の光束径を適正化して平行光束として出力する。このコ
リメータ光学系１４は、励起光が対物レンズ２２へ入射
する際の光束径を最適化するものであり、対物レンズ２
２が有する瞳径よりも入射する光束径が小さくなるよう
に励起光の光束径を最適化する。このような最適化は、
対物レンズ２２によって集光される励起光ビームの形状
をガウス分布とするための手法である。The collimator optical system 14 optimizes the light beam diameter of the input excitation light and outputs it as a parallel light beam. The collimator optical system 14 optimizes the light beam diameter when the excitation light is incident on the objective lens 22.
The luminous flux diameter of the excitation light is optimized such that the diameter of the incident luminous flux is smaller than the pupil diameter of 2. Such optimizations
This is a technique for making the shape of the excitation light beam focused by the objective lens 22 into a Gaussian distribution.
【００２５】シリンドリカルレンズ１５は、コリメータ
光学系１４により光束径が適正化されて出力された励起
光を入力し、ガルバノメータミラー１６の走査方向と直
交する軸に関して励起光を集光する。この集光された励
起光の形状は、ガルバノメータミラー１６の走査方向に
長いライン状のものである。また、この集光位置は、ガ
ルバノメータミラー１６の反射面またはその近傍であ
る。The cylindrical lens 15 receives the excitation light output from the collimator optical system 14 after the light beam diameter has been optimized, and collects the excitation light about an axis orthogonal to the scanning direction of the galvanometer mirror 16. The shape of the condensed excitation light is linear in the scanning direction of the galvanometer mirror 16. Further, the light condensing position is on the reflecting surface of the galvanometer mirror 16 or in the vicinity thereof.
【００２６】ガルバノメータミラー１６は、ドライバ１
７により駆動され、シリンドリカルレンズ１５による励
起光の集光方向に対して直交する方向に、励起光を走査
するように反射させる。ドライバー１７は、ガルバノメ
ータミラー１６を高精度に駆動するためのものであり、
走査位置検出装置を兼ね備え、外部からの走査信号に対
し走査位置をフィードバックループ制御し、且つ走査位
置を出力する機能を有している。The galvanometer mirror 16 is provided with the driver 1
7, the excitation light is reflected so as to scan in a direction orthogonal to the direction in which the excitation light is collected by the cylindrical lens 15. The driver 17 drives the galvanometer mirror 16 with high accuracy.
It also has a scanning position detecting device, and has a function of performing a feedback loop control of the scanning position with respect to an external scanning signal and outputting the scanning position.
【００２７】リレーレンズ１８および１９は、ガルバノ
メータミラー１６とともに、一般的なレーザ光走査顕微
鏡で用いられている場合と同様な配置をとる。すなわ
ち、対物レンズ２２の瞳位置がガルバノメータミラー１
６の反射面またはその近傍に伝送されるように、リレー
レンズ１８および１９は配置される。このような光学素
子の配置により、ガルバノメータミラー１６により走査
される方向の励起光は、対物レンズ２２を経て、被測定
試料２に集光され且つ走査されることになる。The relay lenses 18 and 19 are arranged together with the galvanometer mirror 16 in the same arrangement as that used in a general laser light scanning microscope. That is, the pupil position of the objective lens 22 is
The relay lenses 18 and 19 are arranged so as to be transmitted to or near the reflecting surface of No. 6. With such an arrangement of the optical elements, the excitation light in the direction scanned by the galvanometer mirror 16 passes through the objective lens 22 and is focused on the sample 2 to be measured and scanned.
【００２８】一方で、シリンドリカルレンズ１５により
集光された方向の励起光は、上記光学系の配置により、
被測定試料１に集光されない状態で照射されることにな
る。すなわち、この光学系の配置により、対物レンズ２
２の焦点面では、ライン状の励起光のビームスポットが
形成され、且つ、ライン方向とは垂直な方向に対しては
ガルバノメータミラー１６の走査が加わり、被測定試料
２の対物レンズ焦点面を２次元的に光照射することが可
能となる。On the other hand, the excitation light in the direction converged by the cylindrical lens 15 is
The sample 1 to be measured is irradiated without being focused. That is, due to the arrangement of the optical system, the objective lens 2
On the focal plane 2, a beam spot of a linear excitation light is formed, and the scanning of the galvanometer mirror 16 is applied in a direction perpendicular to the line direction, so that the objective lens focal plane of the sample 2 to be measured is moved to 2. It becomes possible to irradiate light three-dimensionally.
【００２９】蛍光顕微鏡２０は、ダイクロイックミラー
２１、対物レンズ２２、ステージ２３、バンドパスフィ
ルタ２４および結像レンズ２５を含んで構成されてい
る。ダイクロイックミラー２１は、リレーレンズ１９よ
り到達した励起光を対物レンズ２２へ向けて反射させる
とともに、対物レンズ２２より到達した蛍光をバンドパ
スフィルタ２４へ向けて透過させる。対物レンズ２２
は、無限遠補正系のものであり、ステージ２３上に載置
された被測定試料２に対してライン状の励起光を照射す
るとともに、励起光が照射されて被測定試料２の蛍光分
子から発生した蛍光を集光する。バンドパスフィルタ２
４は、対物レンズ２２から出力されダイクロイックミラ
ー２１を透過した光のうち、蛍光を透過させ、励起光の
散乱成分を遮断する。結像レンズ２５は、対物レンズ２
２の焦点面の像を２次元光検出器３１の撮像面に結像す
るように配置される。The fluorescence microscope 20 includes a dichroic mirror 21, an objective lens 22, a stage 23, a band-pass filter 24, and an imaging lens 25. The dichroic mirror 21 reflects the excitation light arriving from the relay lens 19 toward the objective lens 22 and transmits the fluorescence arriving from the objective lens 22 toward the bandpass filter 24. Objective lens 22
Is an infinity-correction system, which irradiates the sample 2 placed on the stage 23 with linear excitation light, and irradiates the excitation light so that the fluorescent molecules of the sample 2 The generated fluorescence is collected. Bandpass filter 2
Numeral 4 transmits fluorescent light out of the light output from the objective lens 22 and transmitted through the dichroic mirror 21, and blocks the scattered component of the excitation light. The imaging lens 25 includes the objective lens 2
The two focal plane images are arranged to form an image on the imaging surface of the two-dimensional photodetector 31.
【００３０】２次元光検出器３１は、結像レンズ２５に
より結像された蛍光の像を撮像面上に受光する。この２
次元光検出器３１の撮像面上の蛍光像は、励起光照射光
学系により被測定試料２へ照射されるライン状の励起光
の形状に応じたものとなる。２次元光検出器３１は、例
えば、光電面冷却機能を有したイメージインテンシファ
イアとインターライン型ＣＣＤとを組み合わせた構成を
持っているのが好適である。また、この場合には、イメ
ージインテンシファイアの光電面はＧａＡｓ光電面を有
し、また、蛍光面には５００μ秒以下の蛍光寿命を持つ
材料を用い、シングルフォトンが検出できるようゲイン
が１０4以上であって、高量子効率、低ノイズ、高速応
答、高感度の機能を持っているのが好適である。さら
に、ＣＣＤについては、特定範囲の読み出しとビニング
機能とにより、高速で画素の読み出しが可能なものを使
用し、極微弱な蛍光像を高速フレームレートで撮像する
ことが可能なものであるのが好適である。ドライバ３２
は、解析部４０からの指示により２次元光検出器３１を
駆動し、また、２次元光検出器３１により撮像された画
像データを解析部４０へ送る。The two-dimensional photodetector 31 receives the fluorescent light image formed by the image forming lens 25 on the imaging surface. This 2
The fluorescence image on the imaging surface of the three-dimensional photodetector 31 corresponds to the shape of the linear excitation light irradiated on the sample 2 to be measured by the excitation light irradiation optical system. The two-dimensional photodetector 31 preferably has, for example, a configuration in which an image intensifier having a photocathode cooling function and an interline CCD are combined. In this case, the image intensifier photocathode has a GaAs photocathode. The phosphor screen is made of a material having a fluorescence lifetime of 500 μsec or less, and has a gain of 10 4 so that single photons can be detected. As described above, it is preferable to have functions of high quantum efficiency, low noise, high-speed response, and high sensitivity. Furthermore, a CCD capable of reading out pixels at high speed by reading out a specific range and a binning function is used, and a very weak fluorescent image can be captured at a high frame rate. It is suitable. Driver 32
Drives the two-dimensional photodetector 31 in accordance with an instruction from the analysis unit 40 and sends image data captured by the two-dimensional photodetector 31 to the analysis unit 40.
【００３１】解析部４０は、ガルバノメータミラー１６
を駆動するためのドライバ１７を制御する信号を発生
し、ガルバノメータミラー１６による走査の位置に関す
る情報をドライバ１７より受け取る。また、解析部４０
は、ガルバノメータミラー１６による励起光の走査に同
期させて、音響光学変調素子１２による励起光の透過／
遮断を制御する。さらに、解析部４０は、光検出器３１
を外部同期させて駆動させるためドライバ３２を制御す
る信号を発生し、光検出器３１からの光検出信号をドラ
イバ３２を介して受け取って記録し、その光検出信号を
解析する。解析部４０は、例えばパーソナルコンピュー
タで構成される。The analysis unit 40 includes a galvanometer mirror 16
A signal for controlling the driver 17 for driving the device is generated, and information on the scanning position by the galvanometer mirror 16 is received from the driver 17. The analysis unit 40
Is synchronized with the scanning of the excitation light by the galvanometer mirror 16 so that the transmission of the excitation light by the acousto-optic
Control the interruption. Further, the analysis unit 40 includes the light detector 31
, A signal for controlling the driver 32 is generated to externally synchronize and drive, and a light detection signal from the photodetector 31 is received and recorded via the driver 32, and the light detection signal is analyzed. The analysis unit 40 is configured by, for example, a personal computer.
【００３２】高速フレームレートで蛍光像を取得するた
めの手段は以下のとおりである。画像のフレームレート
は、ガルバノメータミラー１６による励起光の走査の周
波数で決まり、２５０Ｈｚ程度まで走査速度を上げるこ
とができる。この場合、励起光照射光学系により、対物
レンズ２２の焦点面にライン状の励起光のビームスポッ
トが形成され、そのビームスポットが当該ラインに垂直
な方向に走査される。１回の走査により、視野内の被測
定試料２の２次元平面への励起光照射が完了する。した
がって、ガルバノメータミラー１６用のドライバ１７に
外部から任意の振幅およびオフセットを持った鋸歯状波
を印加することにより光走査が行える。The means for acquiring a fluorescent image at a high frame rate is as follows. The frame rate of the image is determined by the frequency of the scanning of the excitation light by the galvanometer mirror 16, and the scanning speed can be increased to about 250 Hz. In this case, the excitation light irradiation optical system forms a linear excitation light beam spot on the focal plane of the objective lens 22, and the beam spot is scanned in a direction perpendicular to the line. By one scan, the excitation light irradiation on the two-dimensional plane of the sample 2 to be measured in the field of view is completed. Therefore, optical scanning can be performed by externally applying a sawtooth wave having an arbitrary amplitude and offset to the driver 17 for the galvanometer mirror 16.
【００３３】すなわち、図２に示すように、対物レンズ
２２の視野Ａ内の被測定試料２は、励起光のライン状ビ
ームスポットＢの長軸方向（図中の矢印Ｃの方向）に関
しては常に同一時間に励起光が照射され、また、この長
軸方向と直交する走査方向（図中の矢印Ｄの方向）に関
しては走査時間毎に励起光が照射され最速で４ミリ秒の
フレームレートを得る。このとき、被測定試料２が照射
される範囲は、ガルバノメータミラー１６の振れ角およ
びシリンドリカルレンズ１５の焦点距離で決定される。
この振れ角とシリンドリカルレンズの集光した際の立体
角とがほぼ等しい場合、照射範囲は正方形となる。しか
しながら、シリンドリカルレンズ１５で集光する方向に
関しては、励起光の強度分布を反映することから、その
影響を取り除くために、集光角はガルバノメータミラー
１６の振れ角よりも大きくとる方が望ましい。That is, as shown in FIG. 2, the measured sample 2 in the field of view A of the objective lens 22 always moves in the major axis direction (direction of arrow C in the figure) of the linear beam spot B of the excitation light. Excitation light is irradiated at the same time, and in a scanning direction (direction of arrow D in the figure) orthogonal to the long axis direction, excitation light is irradiated at every scanning time to obtain a frame rate of 4 ms at the fastest. . At this time, the irradiation range of the sample 2 to be measured is determined by the deflection angle of the galvanometer mirror 16 and the focal length of the cylindrical lens 15.
When the deflection angle is substantially equal to the solid angle when the cylindrical lens converges, the irradiation range is a square. However, since the direction in which light is condensed by the cylindrical lens 15 reflects the intensity distribution of the excitation light, it is preferable that the light condensing angle be larger than the deflection angle of the galvanometer mirror 16 in order to remove the influence.
【００３４】実質的な照射範囲は、２次元光検出器３１
の撮像範囲に合わせられる。例えば、１／２インチ角の
ＣＣＤを有する２次元光検出器３１および倍率６０倍の
対物レンズ２２を用いた場合、被測定試料２面上で０．
１１ｍｍ×０．８ｍｍ程度の範囲を照射できるようにガ
ルバノメータミラー１６の振れ角を決めればよい。ま
た、ライン状のビームスポットの短軸方向の幅は、対物
レンズ２２の瞳径と、そこに入射する励起光のビーム径
との関係で決まる。ガウスビーム形状の強度分布を必要
とする場合、走査軸方向の励起光のビーム径は、瞳径よ
りも小さくしておく必要があり、６０倍の対物レンズ２
２を用いた場合には１μｍ程度となるような設定が望ま
しい。The substantial irradiation range is the two-dimensional photodetector 31
Of the image pickup range. For example, when a two-dimensional photodetector 31 having a 1/2 inch square CCD and an objective lens 22 with a magnification of 60 times are used, the two-dimensional photodetector 31 has a diameter of 0.2 mm on the two surfaces of the sample to be measured.
The deflection angle of the galvanometer mirror 16 may be determined so that a range of about 11 mm × 0.8 mm can be irradiated. Further, the width of the linear beam spot in the minor axis direction is determined by the relationship between the pupil diameter of the objective lens 22 and the beam diameter of the excitation light incident thereon. When a Gaussian beam-shaped intensity distribution is required, the beam diameter of the excitation light in the scanning axis direction needs to be smaller than the pupil diameter, and the objective lens 2 having a magnification of 60 times is used.
When 2 is used, it is desirable that the setting be about 1 μm.
【００３５】上記励起光照射光学系を用いて蛍光色素を
励起した場合、２次元光検出器３１の撮像面には常にラ
イン状の光スポットの走査に対応した蛍光像が現われ、
２次元光検出器３１は、この光走査に同期して蛍光像を
撮像する。２次元光検出器３１が高速応答可能なイメー
ジインテンシファイアとインターライン型ＣＣＤとから
なる場合には、ＣＣＤが高速で画素読み出しを行って
も、残像現象が起こらない。これは、イメージインテン
シファイアの蛍光面の蛍光寿命が走査速度よりも速く設
定していることに起因する。このような２次元光検出器
３１において、ＣＣＤのＸ軸方向を光走査方向、Ｙ軸を
ライン状のビームスポットの長軸方向とした場合、光走
査で照射された直後のＹ軸方向の画素を、光走査と同期
して読み出すことにより、最低限の読み出し速度で、Ｃ
ＣＤからデータ転送を行うことが可能となる。When a fluorescent dye is excited using the above-mentioned excitation light irradiation optical system, a fluorescent image corresponding to scanning of a linear light spot always appears on the imaging surface of the two-dimensional photodetector 31,
The two-dimensional photodetector 31 captures a fluorescent image in synchronization with the optical scanning. When the two-dimensional photodetector 31 is composed of an image intensifier and an interline CCD capable of responding at high speed, the afterimage phenomenon does not occur even if the CCD reads out pixels at high speed. This is because the fluorescence lifetime of the fluorescent screen of the image intensifier is set to be faster than the scanning speed. In such a two-dimensional photodetector 31, when the X-axis direction of the CCD is the light scanning direction and the Y-axis is the long axis direction of the linear beam spot, the pixels in the Y-axis direction immediately after being irradiated by the light scanning. Is read out in synchronization with the optical scanning, so that C
Data can be transferred from the CD.
【００３６】図３は、２次元光検出器３１に含まれるＣ
ＣＤにおける読み出しタイミングを示す図である。図３
（ａ）は、ドライバ１７より解析部４０へ送られる走査
位置信号であり、ガルバノメータミラー１６による励起
光の走査の位置を表すものである、図３（ｂ）は、解析
部４０よりドライバ３２へ送られるトリガ信号であり、
２次元光検出器３１に含まれるＣＣＤにおいてデータ転
送を開始するタイミングを示すものである。インタライ
ン型ＣＣＤの場合、このトリガ信号に従い、１クロック
にてデータ転送用ＣＣＤにデータが転送される。そし
て、図３（ｃ）に示すように、データが転送された後の
次の光走査時間内で、データ転送用ＣＣＤのデータが外
部に読み出される。FIG. 3 shows the C included in the two-dimensional photodetector 31.
FIG. 3 is a diagram showing read timings in a CD. FIG.
FIG. 3A shows a scanning position signal sent from the driver 17 to the analyzing unit 40, and represents a position of scanning of the excitation light by the galvanometer mirror 16. FIG. Trigger signal to be sent,
This shows the timing at which data transfer is started in the CCD included in the two-dimensional photodetector 31. In the case of an interline CCD, data is transferred to the data transfer CCD in one clock in accordance with the trigger signal. Then, as shown in FIG. 3C, the data of the data transfer CCD is read out within the next optical scanning time after the data is transferred.
【００３７】また、フレームトランスファ型ＣＣＤを用
いる場合においては、データ量が多く、転送に時間がか
かる。そこで、光検出領域とデータ転送領域とで構成さ
れているＣＣＤを用いる必要がある。これは、一般的に
フレームトランスファ型ＣＣＤ全領域に対し、半分の領
域がアルミコートされているような素子を用い、Ｙ軸方
向の転送を終了させるだけで、次のフレームの露光を可
能にするものである。この場合、図３（ｄ）に示すよう
にトリガ信号に対して光検出領域からデータ転送領域へ
とデータを転送し、その後、図３（ｅ）に示すようにデ
ータ転送領域のデータを外部に読み出すことにより、光
走査と同期を取ることが可能となる。ただし、光検出領
域からデータ転送領域へのＣＣＤデータ転送時間は、光
走査の戻り時間内に行われる必要がある。読み出された
データは、順次Ａ／Ｄコンバータによりデジタルデータ
に変換され、解析部４０内のメモリにストアされる。When a frame transfer type CCD is used, the amount of data is large and the transfer takes time. Therefore, it is necessary to use a CCD composed of a light detection area and a data transfer area. This generally uses an element in which half the area is coated with aluminum for the entire area of the frame transfer type CCD, and enables the exposure of the next frame only by terminating the transfer in the Y-axis direction. Things. In this case, the data is transferred from the light detection area to the data transfer area in response to the trigger signal as shown in FIG. 3D, and then the data in the data transfer area is sent to the outside as shown in FIG. By reading, it becomes possible to synchronize with optical scanning. However, the CCD data transfer time from the light detection area to the data transfer area needs to be performed within the return time of light scanning. The read data is sequentially converted into digital data by an A / D converter and stored in a memory in the analysis unit 40.
【００３８】また、ＣＣＤデータ転送速度およびＡ／Ｄ
コンバータの変換速度それぞれに関しては限界がある。
例えば１ＭＨｚのサンプリングが行えるＡ／Ｄコンバー
タを１個用い、光走査周波数２５０Ｈｚで駆動した場
合、読み出せるデータ数は、およそ２８００画素とな
り、一般的なＣＣＤ画素数である６５６×４９４の画素
データを読み出すことは不可能となる。この場合、特定
範囲を限定して読み出すか、ビニング動作させることに
より、すなわち画素数の減少を図ることにより、読み出
しが可能となる。例えば、４１×３１画素を読み出す場
合、またはビニング動作としては１６×１６のエリア積
算をし、４１×３１画素の読み出しをする場合において
は、データ転送が可能となる。また、ＣＣＤデータ転送
におけるＳ／Ｎ比が十分に確保できる場合においては、
複数個のＡ／Ｄコンバータを用い、ＣＣＤ転送速度を増
やすことも可能となる。Further, the CCD data transfer speed and A / D
There is a limit for each conversion speed of the converter.
For example, when one A / D converter capable of sampling at 1 MHz is used and driven at an optical scanning frequency of 250 Hz, the number of data that can be read out is about 2800 pixels, and pixel data of 656 × 494, which is a general CCD pixel number, is used. Reading becomes impossible. In this case, reading can be performed by limiting a specific range or by performing a binning operation, that is, by reducing the number of pixels. For example, when 41 × 31 pixels are read, or when 16 × 16 area integration is performed as a binning operation and 41 × 31 pixels are read, data transfer becomes possible. When the S / N ratio in CCD data transfer can be sufficiently secured,
By using a plurality of A / D converters, the CCD transfer rate can be increased.
【００３９】以上の方法により、高速フレームレートで
蛍光像を撮像することが行える。なお、光走査において
ビームスポットが戻る期間にも被測定試料２を励起する
のは好ましくないので、音響光学変調素子１２を励起光
源１１とコリメータ光学系１４の間に設置することで、
ビームスポットが戻る期間のみ、励起光を遮断し又は強
度を減光することができる。音響光学変調素子１２の好
適な利用法として、０次光を励起光として用い、減光す
る際は１次光に回折させ０次光の強度を下げるようにす
れば良い。この方法では、消光比は取れないが、励起光
のビーム形状を損なうことはない。With the above method, a fluorescent image can be captured at a high frame rate. In addition, since it is not preferable to excite the sample 2 to be measured even during the period when the beam spot returns in the optical scanning, the acousto-optic modulation element 12 is provided between the excitation light source 11 and the collimator optical system 14 by setting the acousto-optic modulator 12.
Only during the period when the beam spot returns, the excitation light can be blocked or the intensity can be reduced. As a preferable use of the acousto-optic modulation element 12, the zero-order light may be used as the excitation light, and when the light is reduced, it may be diffracted into the first-order light to reduce the intensity of the zero-order light. In this method, the extinction ratio cannot be obtained, but the beam shape of the excitation light is not impaired.
【００４０】次に、本実施形態に係る蛍光分子拡散運動
解析装置１の動作について説明するとともに、被測定試
料２として具体的なものを用いて解析した実施例につい
て説明する。被測定試料２として、"Xiao-Hong Xu, Edw
ard S. Yeung, Science, 1997, 275, 1106”の文献に記
載されているような数十塩基のＤＮＡにローダミン系色
素がラベル化された試料（DNA-R6G）を用い、その濃度
を１０-10Ｍ程度とした。この被測定試料２の並進拡散
定数は、およそ６．２×１０-7ｃｍ2ｓ-1である。ま
た、対物レンズ２２として倍率６０倍（ＮＡ＝１．１
５）の水浸系レンズを用いた。この場合、そのＤＮＡ分
子は、２次元光検出器３１で撮像すると離散的な分布を
とり、且つ、その分子は並進拡散運動をし、常に位置が
３次元的に変動した状態になっている。本装置は、この
ような顕微鏡下で離散的に点在する蛍光分子でラベル化
された分子の挙動を計測するものであり、その分子の並
進拡散運動が走査時間と比較し遅い挙動を示す場合にお
いて、その運動特性を解析でき、また、２次元光検出器
３１自身のノイズを除去することができて、さらに速い
挙動を示す分子との識別を可能とするものである。Next, the operation of the fluorescent molecule diffusion motion analyzing apparatus 1 according to the present embodiment will be described, and an example in which a specific sample 2 to be measured is analyzed will be described. As the sample 2 to be measured, "Xiao-Hong Xu, Edw
ard S. Yeung, Science, 1997, 275, 1106 ”, using a sample (DNA-R6G) in which a rhodamine dye is labeled on a DNA of several tens of bases and having a concentration of 10 − was about 10 M. translational diffusion constant of the measured sample 2 is about 6.2 × 10 -7 cm 2 s -1 . Further, 60 magnifications as an objective lens 22 (NA = 1.1
The immersion lens of 5) was used. In this case, the DNA molecule has a discrete distribution when imaged by the two-dimensional photodetector 31, and the molecule performs a translational diffusion motion, and its position is always three-dimensionally changed. This device measures the behavior of molecules labeled with fluorescent molecules discretely scattered under such a microscope, and when the translational diffusion motion of the molecules shows a slow behavior compared to the scanning time , The motion characteristics thereof can be analyzed, the noise of the two-dimensional photodetector 31 itself can be removed, and it is possible to discriminate the molecule that shows a faster behavior.
【００４１】２次元光検出器３１でのＣＣＤの1画素の
大きさが１０μｍ×１０μｍであり、１６×１６のビニ
ング動作をした場合、ＣＣＤの１画素（１６×１６画
素）の大きさは、被測定試料２面上で２．７μｍ×２．
７μｍに相当する。このとき、DNA-R6Gが３次元的に並
進拡散運動を行い、DNA-R6Gが隣の画素へと移動する平
均時間はおよそ５９ミリ秒となる。この平均運動時間
は、任意の大きさの立方体の空間を考えたとき、この中
に分子が入り、また出ていくまでの平均時間を示してい
る。この場合、光走査の周波数を２５０Ｈｚとした場
合、任意画素を励起する間隔は、４ミリ秒となり、平均
移動時間の方が励起間隔よりも遅く、DNA-R6Gを検出す
ることが可能となる。この場合、２．７μｍ×２．７μ
ｍの範囲において、分子が１個もしくは０個存在するよ
うな濃度が適正な試料濃度となる。When the size of one CCD pixel in the two-dimensional photodetector 31 is 10 μm × 10 μm and a binning operation of 16 × 16 is performed, the size of one pixel (16 × 16 pixels) of the CCD becomes 2.7 μm × 2.
7 μm. At this time, the DNA-R6G performs a three-dimensional translational diffusion motion, and the average time for the DNA-R6G to move to the next pixel is about 59 milliseconds. This average exercise time indicates the average time required for a molecule to enter and exit a cubic space of an arbitrary size when considered. In this case, when the frequency of the optical scanning is 250 Hz, the interval for exciting any pixel is 4 milliseconds, and the average movement time is later than the excitation interval, so that DNA-R6G can be detected. In this case, 2.7 μm × 2.7 μ
In the range of m, the concentration at which one or zero molecules exist is the appropriate sample concentration.
【００４２】また、結像レンズ２５と２次元光検出器３
１との間に倍率２倍の中間変倍レンズを挿入し、撮像範
囲を１／２に変え、同時に光走査範囲も１／２に変更す
ることで、ＣＣＤの１画素は１．３μｍ2に相当し、DNA
-R6Gの平均移動時間は１５ミリ秒と速くなる。この場
合、被測定試料２を前記の場合に比べ濃くすることがで
きる利点があるが、同時に検出できない分子も生ずるこ
とになる。The imaging lens 25 and the two-dimensional photodetector 3
By inserting an intermediate magnification lens with a magnification of 2 between the two and changing the imaging range to 1/2 and the optical scanning range to 1/2 at the same time, one pixel of the CCD becomes 1.3 μm 2 . Equivalent, DNA
-The average travel time of the R6G is as fast as 15 milliseconds. In this case, there is an advantage that the measured sample 2 can be made denser than in the above case, but at the same time, some molecules cannot be detected.
【００４３】中間変倍レンズを設けない光学系の設定
で、且つ走査周波数を２５０Ｈｚとした場合、撮像され
る画像は、走査時間および分子位置に応じた、輝点だけ
の画像となる。励起光強度が試料面上で、６０ｋＷ／ｃ
ｍ2とした場合、蛍光色素の発光効率、光学系の光収集
効率および光検出器の量子効率を考慮すると、１回の光
走査でＣＣＤの1画素が検出する効率は、分子が存在す
る場合、およそ０．４光子となり、シングルフォトンが
検出できる超高感度カメラでのみ検出が可能となる。こ
の条件下で、平均的な移動時間５９ミリ秒のDNA-R6G分
子を撮像すると、４ミリ秒の間隔で蛍光色素の励起が行
われ、隣の画素に分子が移動する前に、分子が励起され
る確率が高く、分子が隣の画素に移動したことを撮像で
きる。When the optical system is not provided with an intermediate zoom lens and the scanning frequency is 250 Hz, the captured image is an image of only bright spots according to the scanning time and the molecular position. Excitation light intensity is 60 kW / c on the sample surface
If the m 2, luminous efficiency of the fluorescent dyes, in consideration of the quantum efficiency of the light collection efficiency and photodetector of the optical system, the efficiency of one pixel of CCD in one optical scanning is detected, if the molecule is present , Which is approximately 0.4 photons, and can be detected only by an ultra-sensitive camera that can detect single photons. Under these conditions, when imaging a DNA-R6G molecule with an average movement time of 59 ms, the fluorescent dye is excited at 4 ms intervals, and the molecule is excited before moving to the next pixel. Is high, and it can be imaged that the molecule has moved to the next pixel.
【００４４】撮像されたデータは、解析部４０におい
て、光子計数法で用いられる信号処理技術でソフトウェ
ア的に処理される。すなわち、フレーム毎に、信号強度
値の低いものは削除され（ディスクリミネート）、かつ
複数の画素にまたがって信号強度が得られるデータに関
しては重心演算により１画素データとして処理すること
により、フレーム毎の輝点の移動を測定していき、その
軌跡を解析し、分子の移動度が算出される。しかしなが
ら、これは２次元的な振る舞いの測定であり、実際の試
料となる分子の運動は３次元的なランダム運動をしてい
るので、求められる軌跡は上記平均移動時間よりも長い
特性を示す。これは、３次元的運動解析を行っていない
のが原因であること、さらに光軸方向の蛍光を検出でき
る領域が、ＣＣＤ１画素に相当する大きさよりも大きい
からである。The imaged data is processed in software by the signal processing technique used in the photon counting method in the analysis unit 40. That is, for each frame, a signal having a low signal intensity value is deleted (discriminated), and data for which signal intensity is obtained over a plurality of pixels is processed as one pixel data by a center of gravity calculation, so that each frame is processed. The movement of the luminescent spot is measured, and its locus is analyzed to calculate the mobility of the molecule. However, this is a measurement of the two-dimensional behavior, and since the movement of the molecule serving as the actual sample is a three-dimensional random movement, the required trajectory exhibits a characteristic longer than the average moving time. This is because three-dimensional motion analysis is not performed, and furthermore, a region where fluorescence in the optical axis direction can be detected is larger than a size corresponding to one CCD pixel.
【００４５】フレームを通して輝点の軌跡が描けない場
合においては、自己相関蛍光法における自己相関演算を
行うことにより、統計的で直接的に分子の運動特性を求
めることが行える。これは、任意画素のデータをフレー
ムを通してデータ化し、自己相関演算するものである。
この場合、一般的な自己相関蛍光法と異なる点は、任意
の画素は連続的に励起光照射して蛍光を発生させたデー
タではなく、４ミリ秒の間隔で瞬間的に励起光照射し蛍
光を発生させたデータである。得られる自己相関演算波
形に関しては、４ミリ秒の時間分解能となり、４ミリ秒
以下の速さで動く分子の運動を検出できないことを意味
する。さらに、任意画素毎に演算されたデータは、全画
素分の平均値を求めることにより、自己相関波形のＳ／
Ｎ比は改善される。When the locus of the bright spot cannot be drawn through the frame, the movement characteristics of the molecule can be statistically and directly obtained by performing the autocorrelation calculation in the autocorrelation fluorescence method. In this method, data of an arbitrary pixel is converted into data through a frame and an autocorrelation operation is performed.
In this case, the difference from the general autocorrelation fluorescence method is that any pixel is not data generated by continuously irradiating excitation light to generate fluorescence, but by irradiating excitation light instantaneously at 4 millisecond intervals. Is the data that generated The obtained autocorrelation calculation waveform has a time resolution of 4 milliseconds, which means that the motion of a molecule moving at a speed of 4 milliseconds or less cannot be detected. Further, the data calculated for each arbitrary pixel is obtained by calculating the average value of all pixels to obtain the S / S of the autocorrelation waveform.
The N ratio is improved.
【００４６】次に、２次元光検出器３１として光子計数
型の光位置検出器を（ポジションセンシティブデバイ
ス：ＰＳＤ）用いる場合について説明する。このとき
も、イメージインテンシファイアは上記と同一のものが
使える。また、ドライバ３２は、フレームメモリを有し
ており、さらに、２次元光検出器３１であるＰＳＤから
の信号（これは光子が飛来した位置Ｘ，Ｙと、光強度Ｉ
の３つの信号が含まれている）と、ガルバノメータミラ
ー１６を駆動するドライバ１７からの走査位置信号ＳＸ
とをを入力し、これらの４つの信号をディジタイズする
機能を有しており、これらの４つの信号を用いてフレー
ムメモリ上で画像構築を行う。これは、２次元光検出器
３１としてＰＳＤを用いた場合、フレームレートに依存
した画像を直接的に取得することができないため、ガル
バノメータミラー１６により励起光を走査する時間を基
に画像構築を行なうものである。Next, a case where a photon counting type optical position detector (position sensitive device: PSD) is used as the two-dimensional photodetector 31 will be described. At this time, the same image intensifier as described above can be used. The driver 32 has a frame memory, and further receives a signal from the PSD which is the two-dimensional photodetector 31 (this is a position X, Y at which a photon arrives, and a light intensity I).
And a scanning position signal SX from a driver 17 for driving the galvanometer mirror 16.
And a function of digitizing these four signals, and constructing an image on a frame memory using these four signals. This is because, when a PSD is used as the two-dimensional photodetector 31, an image depending on the frame rate cannot be directly obtained, and therefore, the image is constructed based on the time when the galvanometer mirror 16 scans the excitation light. Things.
【００４７】図４は、画像構築のためのフローチャート
を示す図である。ステップＳ１では、初期設定として、
画像の画素数ｎ×ｍを決め、それに対応するフレームメ
モリを割り当てる。さらに、フレームメモリアドレスと
ＰＳＤの位置信号Ｘ，Ｙおよび走査位置信号ＳＸとが１
対１の対応をするようあらかじめ準備し、また、光検出
器由来のノイズを取り除く必要があるため、閾値Ｉthを
設定しておく。FIG. 4 is a diagram showing a flowchart for constructing an image. In step S1, as an initial setting,
The number n × m of pixels of the image is determined, and a corresponding frame memory is allocated. Further, the frame memory address, the PSD position signals X and Y and the scanning position signal SX are 1
Prepared in advance to the corresponding pair 1, also, it is necessary to remove the noise from the optical detector, setting the threshold value I th.
【００４８】ステップＳ２では、励起光照射光学系によ
る１フレームの走査が終了しているか否かの判定を行
う。走査終了の判定法としては、解析部４０よりドライ
バ１７へ印加する走査信号を基準とする。終了している
場合、ステップＳ３で、ドライバ３２は、フレームメモ
リのデータを１フレームの画像として解析装部４０へ転
送し、測定が終了していない場合にはステップＳ４に進
む。１フレームの走査が終了していない場合、ステップ
Ｓ４で、ドライバ３２は、２次元光検出器３１であるＰ
ＳＤからのＸ，Ｙ，Ｉの信号を読む。In step S2, it is determined whether or not scanning of one frame by the excitation light irradiation optical system has been completed. The method of determining the end of scanning is based on a scanning signal applied from the analysis unit 40 to the driver 17. If the measurement has been completed, in step S3, the driver 32 transfers the data in the frame memory to the analysis device 40 as an image of one frame. If the measurement has not been completed, the process proceeds to step S4. If the scanning of one frame has not been completed, the driver 32 sets the P as the two-dimensional photodetector 31 in step S4.
Read X, Y, I signals from SD.
【００４９】ステップＳ５で、ＩとＩthとを比較する。
もし、Ｉ＜Ｉthであれば、ステップＳ２へ戻る。もし、
Ｉ≧Ｉthであれば、ステップＳ６で、ドライバ４２は、
走査位置信号ＳＸを読む。そして、ステップＳ７で、走
査位置信号ＳＸに対応するフレームメモリアドレスとＰ
ＳＤのＸ信号に対応するフレームアドレスとを比較す
る。両者が一致していない場合、ステップＳ２へ戻る。
両者が一致している場合、ステップＳ８で、ＰＳＤの
Ｘ，Ｙ，Ｉ信号を対応するフレームメモリ上のアドレス
に書き込んだ後、ステップＳ２へ戻る。[0049] In step S5, comparing the I and I th.
If, if I <I th, the flow returns to step S2. if,
If I ≧ I th , in step S6, the driver 42
Read the scanning position signal SX. Then, in step S7, the frame memory address corresponding to the scanning position signal SX and P
The frame address corresponding to the X signal of SD is compared. If they do not match, the process returns to step S2.
If they match, in step S8, the X, Y, and I signals of the PSD are written to the corresponding addresses on the frame memory, and the process returns to step S2.
【００５０】以上の処理を行うことにより、前に述べた
のと同様に蛍光画像を取得することができ、その後の解
析も同様にすることができる。なお、２次元光検出器３
１としてＰＳＤを用いる場合には、高速走査可能のガル
バノメータドライバ１６と組み合わせることにより、さ
らに高速なフレームレートで画像を取得できる利点があ
る。By performing the above processing, a fluorescence image can be obtained in the same manner as described above, and the subsequent analysis can be performed in the same manner. The two-dimensional photodetector 3
In the case where the PSD is used as 1, the combination with the galvanometer driver 16 capable of high-speed scanning has an advantage that an image can be acquired at a higher frame rate.
【００５１】以上のようにして、この蛍光分子拡散運動
解析装置１は、数ミリ秒の遅い並進拡散運動を検出する
特性を生かし、例えば、核酸のハイブリダイゼーション
の評価を行える。例えば１０塩基程度のＤＮＡ鎖を蛍光
ラベルしたものを蛍光プローブとして用いた場合、この
蛍光分子拡散運動解析装置１でこの蛍光プローブのみを
観察した際、その蛍光プローブの並進拡散運動は観測さ
れない。しかし、これとハイブリダイズする数百塩基以
上のＤＮＡやＲＮＡを混ぜ合わせた場合においては、ハ
イブリダイズすることにより、蛍光プローブの分子量が
増大するため、その並進拡散運動は遅くなり、蛍光分子
拡散運動解析装置１でその運動をモニタすることが可能
となる。したがって、従来の自己相関蛍光法では長時間
測定を余儀なくされていた極低濃度試料についても、短
時間で並進拡散運動特性を求めることができる。またエ
バネッセント波による照明法に頼ることなく試料を励起
できるため、どのような形態の試料についても計測が行
える。As described above, the fluorescent molecule diffusion motion analyzing apparatus 1 can evaluate, for example, nucleic acid hybridization by utilizing the characteristic of detecting a slow translational diffusion motion of several milliseconds. For example, when a fluorescently-labeled DNA strand of about 10 bases is used as a fluorescent probe, when only the fluorescent probe is observed with the fluorescent molecule diffusion motion analyzer 1, the translational movement of the fluorescent probe is not observed. However, when DNA and RNA of several hundred bases or more that hybridize to the mixture are mixed, the hybridization causes the molecular weight of the fluorescent probe to increase, so that the translational diffusion movement becomes slower and the fluorescent molecular diffusion movement becomes slower. The movement can be monitored by the analyzer 1. Therefore, it is possible to obtain the translational diffusion motion characteristics in a short time even for an extremely low-concentration sample, which had to be measured for a long time in the conventional autocorrelation fluorescence method. In addition, since the sample can be excited without relying on an illumination method using an evanescent wave, measurement can be performed on any type of sample.
【００５２】この蛍光分子拡散運動解析装置１は、励起
光を走査することにより、背景光の低減を図り、且つ蛍
光色素を確実に励起することができる。また、この蛍光
分子拡散運動解析装置１は、極微弱な蛍光を検出するた
めに２次元光検出器３１の特性を損なうことなく装置構
成を行っているため、例えば蛍光プローブの並進拡散運
動の特性を精度良く評価行える。The fluorescent molecule diffusion motion analyzing apparatus 1 can reduce the background light and reliably excite the fluorescent dye by scanning the excitation light. In addition, since the fluorescent molecule diffusion motion analysis device 1 is configured without deteriorating the characteristics of the two-dimensional photodetector 31 in order to detect the extremely weak fluorescence, for example, the characteristics of the translational diffusion motion of the fluorescent probe Can be accurately evaluated.
【００５３】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、さらに背景
光低減を図るため、または、対物レンズの焦点深度を制
限するために、二光子励起法も選択することができる。
これは、本実施例で、ライン状のビームスポットで試料
を励起することに因るものである。The present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications are possible. For example, a two-photon excitation method can also be selected to further reduce background light or to limit the depth of focus of the objective lens.
This is caused by exciting the sample with the linear beam spot in the present embodiment.
【００５４】[0054]
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
係る蛍光分子拡散運動解析装置は、視野内の被測定試料
で離散的に存在している蛍光分子の動きを計測し、その
分子の並進拡散運動の速度を解析する装置である。この
蛍光分子拡散運動解析装置によれば、励起光照射光学系
により、視野内においてライン状の励起光が、このライ
ン方向と直交する方向に走査されながら被測定試料に照
射される。励起光照射光学系により励起光が照射された
被測定試料中の蛍光分子から蛍光が発生すると、この蛍
光は、蛍光結像光学系により２次元光検出器の撮像面上
に結像される。この蛍光の像は、励起光照射光学系によ
り被測定試料へ照射されるライン状の励起光の形状に応
じたものとなる。解析部により、２次元光検出器の撮像
面に結像された蛍光の像のうち、励起光照射光学系によ
り照射された被測定試料のライン状位置に対応する各画
素における蛍光強度が各走査位置で求められ、この求め
られた各画素における蛍光強度に基づいて被測定試料中
の蛍光分子の拡散運動が解析される。As described above in detail, the apparatus for analyzing the diffusion motion of a fluorescent molecule according to the present invention measures the movement of a fluorescent molecule discretely existing in a sample to be measured in a visual field, and detects the movement of the molecule. This device analyzes the speed of translational diffusion motion. According to this fluorescent molecule diffusion motion analyzer, the excitation light irradiating optical system irradiates the sample to be measured with the linear excitation light in the field of view while scanning in a direction orthogonal to the line direction. When fluorescence is generated from the fluorescent molecules in the sample to be measured irradiated with the excitation light by the excitation light irradiation optical system, the fluorescence is imaged on the imaging surface of the two-dimensional photodetector by the fluorescence imaging optical system. The image of the fluorescence corresponds to the shape of the linear excitation light irradiated on the sample to be measured by the excitation light irradiation optical system. In the fluorescence image formed on the imaging surface of the two-dimensional photodetector, the fluorescence intensity at each pixel corresponding to the linear position of the sample to be measured irradiated by the excitation light irradiation optical system is analyzed by the analysis unit. The diffusion motion of the fluorescent molecules in the sample to be measured is analyzed based on the position, and based on the obtained fluorescence intensity at each pixel.
【００５５】したがって、この蛍光分子拡散運動解析装
置は、従来の自己相関蛍光法では長時間測定を余儀なく
されていた極低濃度試料についても、短時間で並進拡散
運動特性を求めることができる。またエバネッセント波
による照明法に頼ることなく試料を励起できるため、ど
のような形態の試料についても計測が行える。また、こ
の蛍光分子拡散運動解析装置は、励起光を走査すること
により、背景光の低減を図り、且つ蛍光色素を確実に励
起することができる。また、この蛍光分子拡散運動解析
装置は、極微弱な蛍光を検出するために２次元光検出器
の特性を損なうことなく装置構成を行っているため、例
えば蛍光プローブの並進拡散運動の特性を精度良く評価
できる。Therefore, this apparatus for analyzing the diffusion motion of a fluorescent molecule can obtain the translational diffusion motion characteristics in a short time even for an extremely low-concentration sample, which had to be measured for a long time by the conventional autocorrelation fluorescence method. In addition, since the sample can be excited without relying on an illumination method using an evanescent wave, measurement can be performed on any type of sample. In addition, the fluorescent molecule diffusion motion analyzer can reduce background light and reliably excite the fluorescent dye by scanning the excitation light. In addition, since this fluorescent molecule diffusion motion analysis device is configured to detect the weak fluorescence, without impairing the characteristics of the two-dimensional photodetector, for example, the characteristics of the translational diffusion motion of the fluorescent probe can be accurately determined. Can be evaluated well.
【００５６】本発明に係る蛍光分子拡散運動解析装置を
用いることにより、極微小な粒子と粒子の結合、分子と
分子の結合、さらに抗原抗体反応を評価する際に、単一
蛍光分子検出の条件を満たし、さらに、蛍光発光検出が
高時間分解能を有する２次元画像として取得できるた
め、同時にそれぞれの蛍光分子の運動解析が確実に行
え、その結果より、顕微鏡下に存在する蛍光分子の識別
が行える。その結果、抗原抗体反応を用いたイムノアッ
セイ法、抗原決定基（エピトープ）の計測、細胞のレセ
プター数の計測、細胞表面の特異抗原の測定など、微量
物質の計測の多様化において、蛍光プローブを用いて、
容易に試料評価を行える。By using the fluorescent molecule diffusion motion analyzer according to the present invention, the conditions for detecting a single fluorescent molecule can be evaluated when evaluating the binding between extremely small particles, the binding between molecules, and the antigen-antibody reaction. In addition, since fluorescence emission detection can be acquired as a two-dimensional image having high time resolution, the motion analysis of each fluorescent molecule can be reliably performed at the same time, and as a result, the fluorescent molecule existing under the microscope can be identified. . As a result, fluorescent probes are used in diversification of measurement of trace substances, such as immunoassays using antigen-antibody reactions, measurement of antigenic determinants (epitope), measurement of the number of cell receptors, and measurement of specific antigens on the cell surface. hand,
Sample evaluation can be performed easily.
【図１】本実施形態に係る蛍光分子拡散運動解析装置の
構成図である。FIG. 1 is a configuration diagram of a fluorescent molecule diffusion motion analyzer according to the present embodiment.
【図２】本実施形態に係る蛍光分子拡散運動解析装置の
対物レンズ視野内における励起光のライン状ビームスポ
ットの照射および走査を説明する図である。FIG. 2 is a diagram illustrating irradiation and scanning of a linear beam spot of excitation light in a field of view of an objective lens of the fluorescent molecule diffusion motion analyzer according to the present embodiment.
【図３】本実施形態に係る蛍光分子拡散運動解析装置の
２次元光検出器に含まれるＣＣＤにおける読み出しタイ
ミングを示す図である。FIG. 3 is a diagram showing readout timing of a CCD included in a two-dimensional photodetector of the fluorescent molecule diffusion motion analyzer according to the present embodiment.
【図４】本実施形態に係る蛍光分子拡散運動解析装置に
おける画像構築のためのフローチャートを示す図であ
る。FIG. 4 is a diagram showing a flowchart for constructing an image in the fluorescent molecule diffusion motion analyzing apparatus according to the present embodiment.
１…蛍光分子拡散運動解析装置、１１…励起光源、１２
…音響光学変調素子、１３…ミラー、１４…コリメータ
光学系、１５…シリンドリカルレンズ、１６…ガルバノ
メータミラー、１７…ガルバノメータミラードライバ、
１８，１９…リレーレンズ、２０…蛍光顕微鏡、２１…
ダイクロイックミラー、２２…対物レンズ、２３…ステ
ージ、２４…バンドパスフィルタ、２５…結像レンズ、
３１…２次元光検出器、３２…２次元光検出器用ドライ
バ、４０…解析部。DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Fluorescence molecular diffusion motion analyzer, 11 ... Excitation light source, 12
... acousto-optic modulator, 13 ... mirror, 14 ... collimator optical system, 15 ... cylindrical lens, 16 ... galvanometer mirror, 17 ... galvanometer mirror driver,
18, 19 ... relay lens, 20 ... fluorescence microscope, 21 ...
Dichroic mirror, 22: objective lens, 23: stage, 24: band-pass filter, 25: imaging lens,
31: two-dimensional photodetector, 32: driver for two-dimensional photodetector, 40: analysis unit.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 FA01 FA02 FA03 GA02 GA08 GB01 GB02 GB03 GB19 GB21 HA01 HA02 JA03 KA09 LA03 MA04 NA06 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 FA01 FA02 FA03 GA02 GA08 GB01 GB02 GB03 GB19 GB21 HA01 HA02 JA03 KA09 LA03 MA04 NA06
Claims (1)
運動を解析する蛍光分子拡散運動解析装置であって、 前記視野内においてライン状の励起光を当該ライン方向
と直交する方向に走査しながら前記被測定試料に照射す
る励起光照射光学系と、 前記励起光照射光学系により励起光が照射された前記被
測定試料中の蛍光分子から発生した蛍光を結像する蛍光
結像光学系と、 前記蛍光結像光学系により結像された蛍光の像面位置に
撮像面を有する２次元光検出器と、 前記２次元光検出器の前記撮像面に結像された蛍光の像
のうち、前記励起光照射光学系により励起光が照射され
た前記被測定試料のライン状位置に対応する各画素にお
ける蛍光強度を各走査位置で求め、この求められた各画
素における蛍光強度に基づいて前記被測定試料中の蛍光
分子の拡散運動を解析する解析部と、 を備えることを特徴とする蛍光分子拡散運動解析装置。1. A fluorescent molecule diffusion motion analyzer for analyzing the diffusion motion of a fluorescent molecule in a sample to be measured in a visual field, wherein a line-shaped excitation light is scanned in a direction orthogonal to the line direction in the visual field. An excitation light irradiating optical system for irradiating the sample to be measured while irradiating the sample with the excitation light, and a fluorescence imaging optical system for imaging fluorescence generated from fluorescent molecules in the sample to be measured irradiated with the excitation light by the excitation light irradiating optical system A two-dimensional photodetector having an imaging surface at an image plane position of the fluorescence imaged by the fluorescence imaging optical system; and a fluorescence image formed on the imaging surface of the two-dimensional photodetector. The fluorescence intensity at each scanning position corresponding to a linear position of the sample to be measured irradiated with excitation light by the excitation light irradiation optical system is determined at each scanning position, and based on the determined fluorescence intensity at each pixel, Fireflies in the sample to be measured Fluorescent molecules diffusing motion analysis device, characterized in that it comprises an analysis unit for analyzing the diffusion motion of the molecules, the.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000004695A JP2001194303A (en) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | Device for analyzing diffusion motion of fluorescent molecule |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000004695A JP2001194303A (en) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | Device for analyzing diffusion motion of fluorescent molecule |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001194303A true JP2001194303A (en) | 2001-07-19 |
Family
ID=18533454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000004695A Pending JP2001194303A (en) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | Device for analyzing diffusion motion of fluorescent molecule |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001194303A (en) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004072624A1 (en) * | 2003-02-13 | 2004-08-26 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescent correlated spectrometric analysis device |
| JP2005214924A (en) * | 2004-02-02 | 2005-08-11 | Olympus Corp | Measuring method and measuring instrument |
| JP2006113021A (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Univ Waseda | Raman spectroscopic device and spectroscopic device |
| JP2006275794A (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Toshiba Corp | Analyzer |
| JP2008051772A (en) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Hamamatsu Photonics Kk | Fluorescence image acquisition device and fluorescence image acquisition method |
| JP2008276191A (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Olympus Corp | Fluorescence microscope apparatus |
| JP2008541128A (en) * | 2005-05-18 | 2008-11-20 | アレクセーヴィチ クリモフ アンドレイ | Fluorescence nanoscopy method |
| WO2009110603A1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-11 | 日産化学工業株式会社 | Method for measuring diffusion coefficient of polymeric thin film by single fluorescent molecule detecting technique |
| JP2010517056A (en) * | 2007-01-30 | 2010-05-20 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | Time-resolved fluorescence imaging system |
| JP2011504594A (en) * | 2007-11-23 | 2011-02-10 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | Optical illumination apparatus and method |
| JP2011521269A (en) * | 2008-05-26 | 2011-07-21 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | Optical illumination apparatus and method |
| JP2011179912A (en) * | 2010-02-26 | 2011-09-15 | Olympus Corp | Sample evaluation method and sample evaluation device |
-
2000
- 2000-01-13 JP JP2000004695A patent/JP2001194303A/en active Pending
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4495083B2 (en) * | 2003-02-13 | 2010-06-30 | 浜松ホトニクス株式会社 | Fluorescence correlation spectroscopy analyzer |
| JPWO2004072624A1 (en) * | 2003-02-13 | 2006-06-01 | 浜松ホトニクス株式会社 | Fluorescence correlation spectroscopy analyzer |
| US7400396B2 (en) | 2003-02-13 | 2008-07-15 | Hamanatsu Photonics K.K. | Fluorescent correalated spectrometric analysis device |
| WO2004072624A1 (en) * | 2003-02-13 | 2004-08-26 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescent correlated spectrometric analysis device |
| US7737389B2 (en) | 2003-02-13 | 2010-06-15 | Hamamatsu Photonics K.K. | Image pickup device including photodetection surface and transfer control arrangement |
| JP2005214924A (en) * | 2004-02-02 | 2005-08-11 | Olympus Corp | Measuring method and measuring instrument |
| JP2006113021A (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Univ Waseda | Raman spectroscopic device and spectroscopic device |
| JP4565119B2 (en) * | 2004-10-18 | 2010-10-20 | 学校法人早稲田大学 | Raman spectrometer |
| JP2006275794A (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Toshiba Corp | Analyzer |
| JP4621524B2 (en) * | 2005-03-29 | 2011-01-26 | 株式会社東芝 | Analysis equipment |
| JP2008541128A (en) * | 2005-05-18 | 2008-11-20 | アレクセーヴィチ クリモフ アンドレイ | Fluorescence nanoscopy method |
| JP2008051772A (en) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Hamamatsu Photonics Kk | Fluorescence image acquisition device and fluorescence image acquisition method |
| JP2010517056A (en) * | 2007-01-30 | 2010-05-20 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | Time-resolved fluorescence imaging system |
| JP2008276191A (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Olympus Corp | Fluorescence microscope apparatus |
| JP2011504594A (en) * | 2007-11-23 | 2011-02-10 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | Optical illumination apparatus and method |
| WO2009110603A1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-11 | 日産化学工業株式会社 | Method for measuring diffusion coefficient of polymeric thin film by single fluorescent molecule detecting technique |
| JP5267824B2 (en) * | 2008-03-06 | 2013-08-21 | 日産化学工業株式会社 | Measurement method of diffusion coefficient in polymer thin film by single fluorescent molecule detection method |
| JP2011521269A (en) * | 2008-05-26 | 2011-07-21 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | Optical illumination apparatus and method |
| US8742384B2 (en) | 2008-05-26 | 2014-06-03 | Koninklijke Philips N.V. | Optical illumination apparatus and method having a reflective arrangement with moveable components for adjusting incident light |
| JP2011179912A (en) * | 2010-02-26 | 2011-09-15 | Olympus Corp | Sample evaluation method and sample evaluation device |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8063386B2 (en) | Time resolved fluorescent imaging system | |
| US6441379B1 (en) | Imaging system for an optical scanner | |
| US5308990A (en) | Method for measuring microparticles, quantitative measuring method therefor and instrument for measuring microparticles | |
| JP3290786B2 (en) | Particle analyzer | |
| JP3145487B2 (en) | Particle analyzer | |
| JP3551860B2 (en) | DNA testing method and DNA testing device | |
| CN101868752B (en) | Optical illumination apparatus for illuminating a sample with a line beam | |
| JP3824135B2 (en) | Biochip reader | |
| JP2002162351A (en) | Method and apparatus for reading fluorescence | |
| JP2004354348A (en) | Spectroscopic analyzer | |
| JP2001194303A (en) | Device for analyzing diffusion motion of fluorescent molecule | |
| JP4827335B2 (en) | Scanning laser microscope | |
| US7453567B2 (en) | Fluorescence lifetime distribution image measuring system and its measuring method | |
| JP2826449B2 (en) | Flow type particle image analysis method and flow type particle image analysis device | |
| EP1157268B1 (en) | Imaging system for an optical scanner | |
| WO2023135367A1 (en) | An apparatus and a method for fluorescence imaging | |
| US7545498B2 (en) | System and method for removing auto-fluorescence through the use of multiple detection channels | |
| JP3729043B2 (en) | Fluorescence image detection method, DNA inspection method and apparatus | |
| US8742384B2 (en) | Optical illumination apparatus and method having a reflective arrangement with moveable components for adjusting incident light | |
| WO2008010120A2 (en) | Employing beam scanning for optical detection | |
| JP3338626B2 (en) | Measurement device using surface plasmon resonance | |
| JP2004184379A (en) | Method of reading microarray | |
| JPH01270644A (en) | Particle analyser | |
| JP2003057557A (en) | Biochip reader | |
| JP2004354346A (en) | Measuring device |