JP2001178479A - ポリペプチドとその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規なポリペプチド、当該ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、当該ポリペプチドと免疫学的に反応す
る抗体、及びそれらの用途の提供。 【解決手段】 配列表におけるヒト由来の特定のアミノ
酸配列１、又は、当該アミノ酸配列と少なくとも７５％
の相同性を有し、その中間部分アミノ酸配列として配列
表におけるヒト由来の特定のアミノ酸配列２を含んでな
るアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表における
ヒト由来の特定の塩基配列３、当該塩基配列と少なくと
も７５％の相同性を有し、その５´末端側に配列表にお
けるヒト由来の特定の塩基配列４を含んでなる塩基配
列、又は、それら塩基配列に相補的な塩基配列からなる
ＤＮＡ、当該ポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、
及び当該ポリペプチドを検出する方法により前記課題を
解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なポリペプチ
ド、それをコードするＤＮＡ、及び、それらの製造方法
並びに用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン１（以下、「ＩＬ−
１」と言う。）は、有核細胞が産生するサイトカインで
あって、ほとんど全ての器官系或いは恒常性維持機構に
関与する生体にとって重要なポリペプチドである。ＩＬ
−１の生物学的活性を例示すると、ナチュラルキラー
（ＮＫ）細胞の活性化、好中球の活性化、血管内皮細胞
表面の性状の変化、骨及び軟骨の崩壊促進、造血促進、
前駆Ｂ細胞の成熟誘導、成熟Ｂ細胞の増殖誘導、Ｔ細胞
の活性化及びＩＬ−２産生誘導、サイトカイン産生誘
導、ある種の腫瘍細胞に対する細胞障害性／細胞制止性
作用、繊維芽細胞の***促進、及び軟寒天中での腫瘍細
胞の増殖促進作用等の活性を挙げることができる。これ
まで、ＩＬ−１には、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの二種類
のＩＬ−１が報告されている。これらＩＬ−１α及びＩ
Ｌ−１βは、何れも同じ細胞表面受容体に結合し、同等
の生物学的性質を持っているが、これらＩＬ−１αとＩ
Ｌ−１βの塩基配列の相同性は約４５％で、アミノ酸配
列の相同性は約２６％程度に過ぎないことが明らかにさ
れている。又、ＩＬ−１関連物質としては、ＩＬ−１受
容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）及びＩＬ−１受容
体β（ＩＬ−１Ｒａβ）の存在が明らかにされている。
斯かる状況下、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ
及びＩＬ−１Ｒａβなどの所謂、ＩＬ−１ファミリー以
外に、他のＩＬ−１類縁体が存在するのではないかとの
指摘が為されているが、未だそのような報告はない。そ
のようなＩＬ−１類縁体は、生体の免疫機構をより詳細
に解明し、また、新たな医薬品を開発する上で有用であ
り、斯界に於いては、斯かる類縁体のスクリーニングと
その確立が希求されていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の課題
は、従来公知のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ
及びＩＬ−１Ｒａβとは異なる、ＩＬ−１類縁体として
の新規なポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチ
ド」と言う。）を提供することにある。

【０００４】本発明の第二の課題は、本発明のポリペプ
チドと結合する受容体蛋白質を提供することにある。

【０００５】本発明の第三の課題は、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを提供することにある。

【０００６】本発明の第四の課題は、前記ＤＮＡと自律
複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮ
Ａを提供することにある。

【０００７】本発明の第五の課題は、前記組換えＤＮＡ
を適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することに
ある。

【０００８】本発明の第六の課題は、本発明のポリペプ
チドの製造方法を提供することにある。

【０００９】本発明の第七の課題は、本発明のポリペプ
チドと免疫学的に反応する抗体を提供することにある。

【００１０】本発明の第八の課題は、本発明のポリペプ
チドを有効成分とする医薬組成物を提供することにあ
る。

【００１１】本発明の第九の課題は、本発明のポリペプ
チドと免疫学的に反応する抗体を含んでなる医薬組成物
を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−
１ＲａのｃＤＮＡを用いて、培養株化された動物細胞由
来のｍＲＮＡを広く検索した。その結果、培養株化され
たヒトＴ細胞であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２４３０）から、配列表における配列番号５に示す
アミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを単離する
ことに成功した。本発明のポリペプチドは、前述したよ
うに、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ＲａのｃＤ
ＮＡに基づいて得られたものであるが、ＩＬ−１α、Ｉ
Ｌ−１β及びＩＬ−１Ｒａとのアミノ酸配列の相同性は
２０％未満に過ぎず、ＩＬ−１ファミリーに属するも、
従来公知のＩＬ−１ファミリーとは異なる新規ポリペプ
チドであることが判明した。本発明はこの知見に基づい
て為された発明である。

【００１３】すなわち、本発明の前記第一の課題は、培
養株化されたヒトＴ細胞であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２４３０）由来の新規ポリペプチドによ
り解決するものである。

【００１４】本発明の第二の課題は、本発明のポリペプ
チドと結合する受容体蛋白質により解決するものであ
る。

【００１５】本発明の第三の課題は、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡにより解決するものである。

【００１６】本発明の第四の課題は、当該ＤＮＡと自律
複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮ
Ａにより解決するものである。

【００１７】本発明の第五の課題は、当該組換えＤＮＡ
を適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するも
のである。

【００１８】本発明の第六の課題は、本発明のポリペプ
チドの製造方法により解決するものである。

【００１９】本発明の第七の課題は、本発明のポリペプ
チドと免疫学的に反応する抗体により解決するものであ
る。

【００２０】本発明の第八の課題は、本発明のポリペプ
チドを有効成分とする医薬組成物により解決するもので
ある。

【００２１】本発明の第九の課題は、本発明のポリペプ
チドと免疫学的に反応する抗体を含んでなる医薬組成物
により解決するものである。

【００２２】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、配列表
における配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、更には、配列表における配列番号５に示すアミ
ノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、中間部分
アミノ酸配列として配列表における配列番号７に示すア
ミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドを意味する。より詳細には、本発明のポリペプチド
は、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を有
するポリペプチド、更には、配列表における配列番号５
に於けるアミノ酸配列中の１箇所又は２箇所以上に於い
て、１個以上のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換し
たアミノ酸配列、即ち、配列表における配列番号５に於
けるアミノ酸配列中、１乃至５５個のアミノ酸が欠失、
付加及び／又は置換したアミノ酸配列からなるポリペプ
チドが、本発明のポリペプチドとして好適に使用でき
る。斯かる本発明のポリペプチドは、特徴的な生物学的
活性として、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性を抑制する
作用を有する。

【００２３】本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチ
ド産生能を有するヒト及びヒト以外の温血動物由来の細
胞から得ることができると共に、遺伝子工学的手法を用
いて得ることができる。好適には、本発明のポリペプチ
ド産生能を有する培養株化されたヒトＴ細胞、殊に、Ｈ
ＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−２４３０）を栄養
培地中で培養することにより得ることができる。又、本
発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト
細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖法として、ヒト以外の温血
動物の栄養分を含んだ体液（以下、「体液」と言う。）
の供給を受けながら増殖させ、その培養液及び／又は増
殖細胞から容易に得ることができる。前記ヒト以外の温
血動物を用いる増殖方法は、マウス、ヌードマウス、ラ
ット、ヌードラット、モルモット、ハムスターなどのげ
っ歯類の新生児を使用し、これら温血動物に、例えば、
ウサギ由来の抗胸腺抗体などを注射して免疫反応を減弱
させた後、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株
化されたヒト細胞を、動物１匹当たり約１×１０^５乃至
１×１０^８個皮下又は腹腔内に注射して移植するか、あ
るいは、これら温血動物の成長個体の体外又は体内に設
けられ、温血動物の体液が環流可能な拡散チャンバーな
どの容器内に本発明のポリペプチド産生能を有する培養
株化されたヒト細胞を収容し、その後、通常一般の方法
により動物を約２乃至１０週間飼育する。この飼育期
間、移植したヒト細胞は温血動物の体液を利用しながら
増殖させる。本発明のポリペプチドが増殖細胞中に含ま
れている場合、増殖細胞を細胞塊、腹水又は細胞浮遊液
として採取し、必要に応じて、これを適宜分散溶媒を用
いて分散・洗浄した後、増殖細胞を以下に述べる機械的
破壊又は化学的破壊処理して、得られる破壊物から目的
とする本発明のポリペプチドを採取する。ｉｎ ｖｉｖ
ｏ増殖法は、栄養培地を用いる生体外の増殖方法と比較
して、より低コストと低労力でより短時間に所望量の増
殖細胞の得られるとの利点がある。なお、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ増殖方法は、例えば、特公昭５６−５４１５８号公報
などに詳述されている。

【００２４】本発明のポリペプチドを前記細胞培養液か
ら採取するには、増殖細胞を除去した培養上清から採取
するか、又は、増殖細胞を分離又は分離せずに培養上清
と共に超音波を印加して破砕したり、ホモゲナイズ、凍
結融解、あるいは、低張媒体中に浸漬するなどして増殖
細胞を破砕した後、得られる破砕物又は破砕物と培養上
清との混合物から当該ポリペプチドを採取する。斯かる
破砕物又は混合物から本発明のポリペプチドを採取する
には、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動など、通
常、蛋白質を分離、精製するために斯界に於いて使用さ
れる１種以上の方法を採用することができる。使用目的
に応じて、採取した本発明のポリペプチド含有液を濃縮
し、凍結乾燥して、本発明のポリペプチドを含有する液
状又は固状物を得る。得られる本発明のポリペプチドの
純度は、前記手法を組み合わせることにより、そのアミ
ノ酸配列を正確に分析できる程度に、実質的に純粋なレ
ベルまで精製することができる。

【００２５】又、本発明のポリペプチドは、当該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡに通常の遺伝子工学的手法を
適用して得ることもできる。このようにして得られる組
換え型ポリペプチであっても、配列表における配列番号
５に示すアミノ酸配列、及び、当該アミノ酸配列と少な
くとも７５％の相同性を有し、Ｎ−末端側に、中間部分
アミノ酸配列として配列表における配列番号７に示すア
ミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドである限り、本発明のポリペプチドに包含される。
また、本発明のポリペプチド断片とは、前記した本発明
のポリペプチドを酵素、薬剤等により切断して得ること
のできるポリペプチド断片を意味し、斯かるポリペプチ
ド断片はポリペプチド合成することも可能である。

【００２６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配
列、当該塩基配列と少なくとも７５％の相同性を有し、
その５´末端側に配列表における配列番号８に示す塩基
配列からなる塩基配列を含んでなる塩基配列、又は、そ
れら塩基配列に相補的な塩基配列を含んでなるＤＮＡに
基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得
ることができる。いずれにしても、本発明によるＤＮＡ
は、一旦入手しさえすれば、ＰＣＲ法や、自律複製可能
なベクターを用いる方法などを適用することにより、所
望のレベルにまで容易に増幅させて得ることができる。
又、当該ＤＮＡを公知の方法により断片化して得られる
ＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａをスクリーニングする場合に有用であると共に、本発
明のポリペプチドに対する抗体を遺伝子組換え技術によ
り調製する場合に有用である。遺伝子工学的手法による
抗体を製造する手法自体は公知であり、この手法は大量
にヒト由来の抗体（ヒト化抗体）を得るのに有用な手法
である。

【００２７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、当該ＤＮＡが自律複製可能なベクターに挿入され
た、組換えＤＮＡとしての形態のものも包含する。斯か
る組換えＤＮＡは、上述のように一旦目的とするＤＮＡ
が入手できれば、通常一般の遺伝子工学的手法により比
較的容易に調製することができる。本発明で用いるベク
ターは、適宜の宿主内で自律複製できるものであればよ
く、具体例には、例えば、大腸菌を宿主として用いるｐ
ＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌
を宿主として用いる、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１
９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種以上の微生物
を宿主として用いるｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、
ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を挙げることができ
る。斯かるベクターに本発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用
いられる。具体的には、上述のようにして得られる本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能な
ベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断した
後、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片とベ
クター断片を連結する。ＤＮＡの切断に塩基配列に特異
的に作用する制限酵素、とりわけ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ
Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、Ｓｍ
ａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片とベクタ
ー断片を連結するのが容易となる。連結するには、必要
に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体
外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得ら
れる組換えＤＮＡは、適宜の宿主において無限に複製可
能である。

【００２８】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、更に、当該ＤＮＡが適宜の宿主に導入された、形質
転換体としての形態のものも包含する。斯かる形質転換
体は、通常、上述のようにして得られるＤＮＡ乃至は組
換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して形質転換することに
より容易に得ることができる。宿主としては、当該組換
えＤＮＡにおけるベクターに応じて選択される、斯界に
おいて慣用される微生物、植物、動物由来の種々の細胞
を用いることができる。宿主微生物としては、例えば、
大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめ
とする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などの何れも有利
に用いることができる。宿主微生物に本発明によるＤＮ
Ａを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法
やプロトプラスト法を適用すればよい。なお、本発明に
よる形質転換体において、当該ポリペプチドをコードす
るＤＮＡは、宿主の染色体から独立した状態にあって
も、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。
宿主の染色体に組み込まれた当該ＤＮＡは、宿主内で安
定して保持されるという特徴があり、組換え型の本発明
のポリペプチドの製造に有利な場合がある。又、培養物
自体を直接これらの菌体の破砕方法のいずれかを用いて
処理し、上述の分離手段のいずれかを適用し、本発明の
ポリペプチドを含む菌体抽出液として得ることも有利に
実施できる。このようにして得られる菌体抽出液から高
純度の本発明のポリペプチドを採取する手法としては、
公知の蛋白質の精製手段を適宜採用することにより達成
できる。殊に、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応
する、本発明の抗体を用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーによれば、高純度の本発明ポリペプチドを工業
的に容易に製造することができる。

【００２９】また、本発明のＤＮＡ断片とは、前記した
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを酵素、薬剤
等により切断して得ることのできるＤＮＡ断片を意味
し、斯かるＤＮＡ断片は、化学合成することも可能であ
る。

【００３０】本発明のポリペプチドと免疫学的に反応す
る抗体、殊に、モノクローナル抗体は、本発明のポリペ
プチド又はその抗原性フラグメントを抗原として用いる
ことにより得ることができる。具体的には、例えば、斯
かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗
体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とのハイ
ブリドーマを作製し、これより本発明のモノクローナル
抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、
これを生体内外で培養することにより得ることができ
る。斯かる抗原としては、配列表における配列番号５に
示すアミノ酸配列又はそれと相同的なアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを導入した形質転換体を培養することに
よって得ることができ、それらは、通常、完全精製又は
部分精製した状態で使用される。抗原性フラグメントを
得るには、これら完全精製品又は部分精製品を化学的又
は酵素的に分解するか、配列表における配列番号５に示
すアミノ酸配列に基づいてペプチド合成すればよい。ま
た、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体に
は、生体に本来的に存在し、生体から単離し、精製され
た、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する当該ポ
リペプチドの受容体蛋白質も包含される。

【００３１】免疫感作は慣用の方法によればよく、例え
ば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとと
もに、哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接
種し、一定期間飼育する。哺乳動物は特に限定されるこ
となく、所期の抗体産生細胞が得られる限り、その種
類、大きさ、雌雄は問わない。通常はラット、マウス、
ハムスターなどのげっ歯類が用いられ、後記無限増殖可
能な哺乳類由来の細胞との適合性も勘案しながら、最適
のものが選択される。用いる哺乳動物の種類や大きさに
も依るが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約５乃至
５００μｇ／匹とし、これを約１乃至２週間の間隔を置
いて２乃至５回に分けて接種する。そして、最終接種か
ら３乃至５日後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞
としての脾細胞を得る。尚、この際、哺乳動物の血液か
ら、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を
含む血清（抗血清）を採取することも可能である。

【００３２】斯くして得られた抗体産生細胞と無限増殖
可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて、目的のハイブ
リドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖可能な哺
乳類由来の細胞には、通常、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４
−１（ＮＳ−１）細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１８）、Ｐ３
Ｘ６３Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）及びＳｐ２／
０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）などの
マウス骨髄腫由来の細胞株又はその変異株が用いられ
る。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセ
ンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスに
よる慣用の方法が用いられる。一例を挙げると、融合促
進剤を含む融合培地に、抗体産生細胞と無限増殖可能な
哺乳類由来の細胞を、約１：１乃至１：１０の割合で浮
遊させ、この状態のまま、約３０乃至４０℃で約１乃至
５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、Ｍ
ＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコフ改変ダル
ベッコ培地を始めとする通常一般のものを用いることが
できるが、血清は除いておくのが望ましい。

【００３３】目的のハイブリドーマを選択するには、ま
ず、上記のようにして得た細胞融合産物をＨＡＴ培地な
どの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至
３週間培養して、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ
る。つぎに、ハイブリドーマを常法により培養し、培養
物中に分泌された抗体を本発明のポリペプチドとの反応
性を試験して検出する。試験には、エンザイムイムノア
ッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなど
の抗体を検出するための慣用の方法が用いられる。例え
ば、富山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュ
アル』、１９９２年、講談社サイエンティフィック社発
行、１０５乃至１５２頁には、そのための方法が種々詳
述されている。本発明のポリペプチドに特異的な抗体を
産生するハイブリドーマは、限界希釈法などによりクロ
ーニングして、単一クローンを得ることができる。

【００３４】本発明のモノクローナル抗体は、斯かるハ
イブリドーマを生体内外で培養することにより得ること
ができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するため
の慣用の方法が用いられ、例えば、生体外（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）の培養培地で培養するときには、その培養物か
ら、又、ヒト以外の温血動物に移植して生体内（ｉｎｖ
ｉｖｏ）で増殖させるときには、その腹水及び／又は血
液からモノクローナル抗体を採取する。培養物又は腹水
若しくは血液からモノクローナル抗体を採取するには、
抗体一般を精製するための斯界における慣用の方法が用
いられる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、
濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これ
らは必要に応じて組合せて適用される。精製したモノク
ローナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、用途に応じて
液状又は固状とする。

【００３５】本発明のモノクローナル抗体は、イムノア
フィニティークロマトグラフィーによる本発明のポリペ
プチドの精製に極めて有用である。即ち、本発明のモノ
クローナル抗体を、本発明のポリペプチドとそれ以外の
夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質との混合物に接触させ
て、当該モノクローナル抗体に本発明のポリペプチドの
みを吸着させる工程と、吸着した本発明のポリペプチド
を当該モノクローナル抗体から脱着させる工程を含んで
なる。これら両工程は、通常、水性媒体中で行なう。当
該モノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担体
に固定化した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒
状のカラムに充填し、これに、例えば、形質転換体の培
養液又はそれらの粗精製品を通液すると、実質的に本発
明のポリペプチドのみが水不溶性担体に固定化した当該
モノクローナル抗体に吸着する。吸着した本発明のポリ
ペプチドは、当該モノクローナル抗体周囲の水素イオン
濃度を変えることにより脱着させることができる。例え
ば、当該モノクローナル抗体がＩｇＧのクラスに属する
場合は、酸性側のｐＨ、通常、ｐＨ２乃至３で、又、Ｉ
ｇＭのクラスに属する場合は、アルカリ側のｐＨ、通
常、ｐＨ１０乃至１１で脱着・溶出させる。本発明のモ
ノクローナル抗体を用いる精製方法によるときには、本
発明のポリペプチドを最少限の労力と時間で高度に精製
できる。

【００３６】本発明のモノクローナル抗体は、本発明の
ポリペプチドの検出を必要とする諸分野にも広範な用途
を有する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体にラ
ジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光
イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用すると
きには、被検試料中の本発明のポリペプチドの検出及び
定量を迅速且つ正確に分析することができる。斯かる検
出及び分析において、本発明のモノクローナル抗体は、
例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標
識して用いられる。本発明のモノクローナル抗体は、本
発明のポリペプチドに特異的に反応し、免疫学的に反応
するので、斯かる免疫反応を前記標識物質を指標に検出
すれば、被検試料中の極微量の本発明のポリペプチドを
高精度で検出することができる。殊に、標識イムノアッ
セイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被
検試料を分析できる上、分析に要する時間と労力が低減
でき、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。
したがって、本発明による検出方法は、本発明のポリペ
プチドを製造する際の工程管理や、得られる製品の品質
管理に極めて有用である。なお、本発明はモノクローナ
ル抗体の標識や標識アッセイそのものに係わるものでは
ないので詳細な説明は省くが、例えば、ピー・ティッセ
ン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセイ』、１９
８９年、東京化学同人発行、１９６乃至３４８頁などに
は、モノクローナル抗体の標識や標識アッセイ方法につ
いて詳述されている。

【００３７】次に、本発明の医薬組成物について説明す
る。本発明のポリペプチドは、哺乳動物の免疫系に深く
関与しているＮＫ活性を抑制する作用を有していること
から、それ単独、又は、公知のＮＫ活性抑制剤、免疫調
節剤、生理活性物質等と併用して、更には、必要に応じ
て、医薬的に許容される担体と併用して、ＮＫ活性抑制
剤としての医薬組成物とすることができる。当該医薬組
成物に配合する本発明のポリペプチドの投与量は、通
常、ヒト成人１日当たり０．００１〜１００μｇ、好ま
しくは、０．０１〜１０μｇ、より好ましくは、０．１
〜１μｇの範囲から選択される。当該医薬組成物の剤形
としては、液剤、粉剤、錠剤、顆粒剤、ペースト剤等の
形態を例示でき、それらは、単位投与形態とするのが望
ましい。又、本発明の抗体を含んでなる医薬組成物と
は、当該抗体が本発明のポリペプチドと免疫学的に反応
する形態にある組成物全般を意味する。

【００３８】ところで、本発明ポリペプチドをコードす
るＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも適用するこ
とができる。すなわち、通常の遺伝子療法に於いて、本
発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクタ
ーに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポ
ソームなどのリポソームに包埋した状態で、ＮＫ活性を
抑制する必要性のある疾患に罹患した患者に直接注入す
るか、あるいは、前記患者からリンパ球を採取し、採取
したリンパ球に生体外で導入した後、その患者に自家移
植することができる。又、養子免疫遺伝子療法に於いて
は、効果細胞に本発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場
合と同様にして導入し、前記患者や免疫疾患等に罹患し
た患者を治療することも可能である。

【００３９】以下、本発明を実験に基づいてより詳細に
説明する。

【００４０】

【実験１】＜ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞由来ｍＲＮＡの取得＞
ヒトＴ細胞であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２４３０）を、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し
て湿重量で１．１ｇの細胞を採取した。これを５Ｍグア
ニジンイソチオシアネート、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、及び８％（ｗ／
ｖ）β−メルカプトエタノールからなる混液（ｐＨ７．
０）７．７ｍｌに浸し、ホモゲナイザーで細胞を破砕
し、４℃で１５時間静置した。次に、常法に従って、３
５ｍｌ容遠心チューブに、５．７Ｍ塩化セシウムを含む
１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を１ｍｌ注入し、
その液面に前記細胞破砕物を１０ｍｌ重層し、この状態
で２０℃、２５，０００ｒｐｍの条件で２０時間超遠心
分離してＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５
ｍｌ容遠心チューブにとり、等量のクロロホルム／イソ
ブタノール混液（体積比で４：１）を加え、５分間振盪
し、４℃、１５，０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分
離した後、水層部を採取し、これに２．５倍容のエタノ
ールを加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈殿
させた。この沈殿物を採取し、７５％（ｖ／ｖ）エタノ
ール水溶液で洗浄後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解して
全ＲＮＡを取得した。これをオリゴ結合ビーズ『Ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞』（日本合成ゴム
株式会社製）を用いて精製して得られたＨＰＢ−ＭＬＴ
細胞由来ｍＲＮＡを下記の実験に供した。

【００４１】

【実験２】＜ポリペプチドのｃＤＮＡの取得＞

【実験２−１】＜ポリペプチドの部分ｃＤＮＡの取得＞
上記で得たｍＲＮＡ１μｇを０．５ｍｌ容チューブに入
れ、サーマルサイクラー（商品名『ＤＮＡサーマルサイ
クラー４８０』、パーキンエルマー社製）を用いて、７
０℃で５分間加熱した後、４℃に急冷した。次に１０×
ＰＣＲ反応液を２μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを２
μｌ、１００ｍＭジチオトレイトールを２μｌ、２．５
ｍＭ ｄＮＴＰｓを１μｌ、０．２μｇ／μｌのランダ
ムヘキサマーを１μｌ、３５Ｕ／μｌのリボヌクレアー
ゼインヒビター（商品名『ＲＮａｓｉｎ』、プロメガ社
製）を０．５μｌ、２００Ｕ／μｌの逆転写酵素（商品
名『Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉ
ｒｕｓ（ＡＭＶ）由来逆転写酵素』、日本合成ゴム社
製）を１μｌ加え、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとし
た。この混合物を２５℃で１０分間、４２℃で３０分
間、９９℃で５分間インキュベートして逆転写酵素を反
応させ、第１ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。
次いで、ジェンバンク・データベースより、ヒトＩＬ−
１α（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０１１４６）、ヒ
トＩＬ−１β（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ００６１
９）およびヒトＩＬ−１Ｒａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎ
ｏ．Ｍ５５６４６）のｃＤＮＡ塩基配列を入手し、ホモ
ロジー検索をコンピュータソフト（ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍ
ＡＣ Ｖｅｒ．９．０）を用いて行ない、三者に比較的
保存された塩基配列領域について、センスプライマー１
（ｓ１；５′−（Ｃ／Ｇ）（Ｔ／Ａ）ＣＴＡＣＡＧ（Ｃ
／Ｔ）ＴＧ（Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ｃ）Ａ
−３′）とアンチセンスプライマー１（ａ１；５′−
（Ｇ／Ｔ）（Ｃ／Ｇ）ＧＧＣ（Ａ／Ｃ）ＧＡＣ（Ｔ／
Ｇ）Ｃ（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）−３′）を設計
し、ＰＣＲ増幅させた。ストラタジーン社製の１０×Ｐ
ｆｕ反応液５μｌ、２．５Ｕ／ｍｌのＰｆｕポリメラー
ゼ１μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ（１００ｎｇ／μｌ）
を４μｌ、ｓ１プライマーを１μｌ、及び１００ｎｇ／
μｌのａ１プライマー１μｌ加え、滅菌蒸留水で全量を
５０μｌとした。反応は、９４℃で４５秒間、４２℃で
４５秒間、７２℃で２１０秒間の一連の処理を３０サイ
クル行った。得られたＰＣＲ産物を２．０％アガロース
ゲルにて電気泳動したところ、約１００ｂｐ付近にバン
ドが検出された。この付近の増幅断片をゲルから切り出
し、抽出用キット（『ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘ
ｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて
精製を行った。即ち、１．５ｍｌ容チューブに目的のゲ
ル断片を入れた後、前記抽出用キットに付属されている
『ＱＸ１』溶液を３００μｌ加え、次いで前記抽出用キ
ットに付属されているＤＮＡ吸着用ゲル『ＱＩＡＥＸ
ＩＩ』を１０μｌ加え、５０℃にて１０分間インキュベ
ートした。１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した
後、上清を除去し、沈殿物にＱＸ１溶液を５００μｌ加
えて懸濁した後、１３，０００ｒｐｍの条件で３０秒間
遠心処理して沈殿を洗浄した。その後、得られた沈澱物
にＰＥ溶液を５００μｌ加え、同様の遠心処理条件で２
回洗浄した後、上清除去し、１５分間室温にて乾燥し
た。最後に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸
緩衝溶液（ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０）を２０μｌ加え、
室温で５分間静置してＤＮＡを抽出した後、１３，００
０ｒｐｍの条件で３０秒間遠心処理して、目的のＤＮＡ
断片を得た。

【００４２】次に、クローニングキット（商品名『ｐＣ
Ｒ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉ
ｔ』、ストラタジーン社製）を用いて、ＤＮＡ断片−１
のクローニングを行った。０．５ｍｌ容チューブに１０
ｎｇ／μｌのｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）クロー
ニングベクターを１μｌ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ １０
×反応溶液を１μｌ、１０ｍＭ ｒＡＴＰを０．５μ
ｌ、５Ｕ／μｌのＤＮＡ断片−１を４μｌ、５Ｕ／μｌ
のＳｒｆＩ制限酵素を１μｌ、４Ｕ／μｌのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを１μｌ加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量を
１０μｌとした。これを室温にて１時間反応させてライ
ゲーションを行った。次いで６５℃にて１０分間インキ
ュベートして反応を停止させた後、４℃に冷却した。そ
の後、常法に従い下記の方法で形質転換を行った。大腸
菌株（商品名『ＥｐｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ ＸＬ１−
Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′ Ｋａｎ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔ
ｅｎｔ ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）を予め氷
冷しておいたファルコン２０５９ポリプロピレンチュー
ブ（ファルコン社製）に４０μｌ入れ、１．４４Ｍβ−
メルカプトエタノールを０．７μｌ加え、１０分間氷中
にて冷却した。これに前記ライゲーション産物を２μｌ
加えて穏やかに撹拌した後、３０分間氷中に静置した。
次いで、４２℃にて４５秒間加熱後、ＳＯＣ培地を４５
０μｌ加え、３７℃で１時間振盪培養した。その後、発
色指示薬としてのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）０．
４ｍｇ、１００ｍＭイソプロピルチオガラクトシドを４
０μｌ含むＬＢ培地（１％塩化ナトリウム、１％トリプ
トン、０．５％酵母エキス、２％アガーを含む）にこの
培養産物を植菌し、３７℃にて１６時間培養した。ｓ
１、ａ１プライマーを用いたコロニーＰＣＲによって、
目的とする１００ｂｐのバンドが出されたコロニーを、
ＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間で振盪培養した。
得られた菌体培養液２ｍｌを用いて、常法に従って下記
の方法でプラスミドを調製した。即ち、菌体を３，００
０ｒｐｍの条件で５分間遠心分離して回収した後、１０
ｎｇ／μｌのリゾチウムを１００μｌ入れ、室温にて５
分間インキュベートし、０．２Ｍドデシル硫酸ナトリウ
ム２００μｌを加えて混合し、５分間氷中で冷却した
後、５Ｍ酢酸カリウムを１５０μｌ加え、５分間氷中に
て冷却した。１５，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心処
理した後、上清４００μｌを１．５ｍｌ容チューブに取
り、これに当量のフェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（体積比で２５：２４：１）を加え、５分
間激しく振盪した後、１５，０００ｒｐｍの条件で５分
間遠心分離し、タンパク質を除去した。次いで、水層２
８０μｌを回収し、常法に従ってエタノール沈殿を行っ
た。その後、ＲＮａｓｅ（４０ｍｇ／ｍｌ）／ＴＥを６
０μｌ加え、３７℃にて１時間３０分インキュベートし
た後、２０％ポリエチレングリコールを３０μｌ入れ、
１．５時間氷中にて静置した。次いで、１５，０００ｒ
ｐｍの条件で３０分間遠心分離し、上清を除去した後、
沈殿を７５％（ｖ／ｖ）冷エタノール水溶液２００μｌ
で洗浄し、減圧下で１０分間乾燥し、滅菌水に溶解させ
た。得られたプラスミドにつき、ジデオキシ法により、
ＤＮＡシーケンサー（商品名『ＤＮＡシーケンサー３７
３Ａ』、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩
基配列を解析した結果、配列表における配列番号１に示
す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡの部分塩基配列を暫
定的に決定した。その後、完全長の本発明のポリペプチ
ドのｃＤＮＡのクローニングを目的として、５′及び
３′末端のｃＤＮＡ塩基配列の取得をＲＡＣＥキット
（商品名『５′／３′ＲＡＣＥ Ｋｉｔ』、ロシュダイ
アグノスティックス社製）を用いて行った。

【００４３】

【実験２−２】＜５′ＲＡＣＥ法＞アンチセンスプライ
マー２（ａ２）として、配列表における配列番号１の塩
基配列に於ける第１０３〜８６番目に相当する５′−Ａ
ＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＣＣ−３′、アンチセ
ンスプライマー３（ａ３）として、配列表における配列
番号１の塩基配列の８３〜６５番目に相当する５′−Ａ
ＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧ−３′、アンチ
センスプライマー４（ａ４）として、配列表における配
列番号１の塩基配列の６１〜４２番目に相当する５′−
ＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧ−３′を作
出した。先ず、５×ｃＤＮＡ合成溶液（２５０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８．５）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、１
５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭジチオトレイトール）を
４μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓを２μｌ、ａ２プライマ
ー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、ヒトＨＰＢ−ＭＬＴ
細胞ｍＲＮＡを２４０ｎｇ、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙ
ｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）由来逆転写酵
素（２０Ｕ／μｌ）を１μｌ加え、ＤＥＰＣ処理水を入
れ全量を２０μｌとした。これを５５℃で１時間、６５
℃で１０分間反応させてｃＤＮＡを得た。これをスピン
カラムを用いて精製した。即ち、合成産物に１００μｌ
の反応溶液（３Ｍグアニジンチオシアネート、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ６．６）、５％エタノール）を加え、
スピンカラムに前記産物を入れ、１５，０００ｒｐｍで
３０秒間遠心処理した。次に洗浄溶液（２０ｍＭ塩化ナ
トリウム、２ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）／エタノー
ル）を５００μｌを加え、１５，０００ｒｐｍで３０秒
間遠心処理して洗浄し、再度同洗浄溶液２００μｌを加
えて同様の操作を繰り返した。次いで、洗浄処理して得
られた沈殿物に、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）及
び１ｍＭＥＤＴＡを含む抽出溶液を５０μｌを加え、１
５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離してｃＤＮＡ精製
物を得た。精製物１９μｌに、１００ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ塩化マグネシウム、及び５０
０ｍＭ塩化カリウムを含む１０×反応液を２．５μｌ、
２ｍＭｄＡＴＰを２．５μｌ加えて、全量を２４μｌと
した。これを９４℃で３分間加熱後、直ちに急冷し、タ
ーミナルトランスフェラーゼ（１０Ｕ／μｌ）を１μｌ
加え、３７℃で３０分間、７２℃で１０分間保温した。
次に合成産物５μｌ、３７．５μＭ オリゴｄＴ−アン
カープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧ
ＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ
−３′、ＶはＡ、Ｃ又はＧを示す）を１μｌ、ａ３プラ
イマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、２５ｍＭ ｄＮ
ＴＰｓを１μｌ、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｍ
ｌ）を１μｌ、１０×Ｐｆｕ反応液を５μｌ加えて滅菌
蒸留水で５０μｌとし、９４℃で４５秒間、５５℃で４
５秒間、７２℃で２分間処理する一連の処理を３５サイ
クル行って合成産物を増幅させた。更に増幅産物を１μ
ｌ採取し、同様の条件で増幅を行った（但し、再増幅時
には、１２．５μＭ ＰＣＲアンカープライマー（５′
−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−
３′）と９０ｎｇ／μｌのａ４プライマーを使用）。Ｐ
ＣＲ産物を１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動を
行ったところ、約５５０ｂｐのバンドが検出された。そ
の後、検出された断片を、前述と同様に抽出用キット
（商品名『ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて精製を行
い、クローニングキット（『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ（＋） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ』、ストラタジーン
社製）を用いてクローニングを行った。次いで、常法に
従い大腸菌株（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′ Ｋａｎｓｕｐｅｒｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）
を用いて形質転換を行った。得られた形質転換体を栄養
培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーＰＣＲ
により目的のバンドが検出されたコロニーを選択してＬ
Ｂ−液体培地に植菌し、３７℃で１６時間で振盪培養し
た。菌体培養液２ｍｌから、常法に従ってプラスミドを
調製し、得られたプラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−５』をジ
デオキシ法により、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配
列解析を行った結果、配列表における配列番号２に示す
５′末端側ｃＤＮＡ部分に約５７５ｂｐ相当の塩基配列
が得られた。

【００４４】

【実験２−３】＜３′ＲＡＣＥ法＞センスプライマー２
（ｓ２）として、配列表における配列番号１の塩基配列
の２４〜４２番目に相当する５′−ＣＴＧＡＴＧＡＡＧ
ＣＴＧＧＣＴＧＣＣ−３′を作出した。次いで、５×ｃ
ＤＮＡ合成溶液を４μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓを２
μｌ、３７．５μＭオリゴｄＴ−アンカープライマーを
１μｌ、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞ｍＲＮＡを５４０ｎｇ、２
０Ｕ／μｌのＡＭＶ由来逆転写酵素を１μｌ加え、ＤＥ
ＰＣ処理水で全量を２０μｌとし、サーマルサイクラー
を用いて５５℃で６０分間、６５℃で１０分間反応させ
てＤＮＡ産物を得、このＤＮＡ産物を１μｌ、１２．５
μＭ ＰＣＲアンカープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣ
ＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−３′）を１μｌ、
ｓ２プライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、２５ｍ
Ｍ ｄＮＴＰｓを１μｌ、２．５Ｕ／μｌのＰｆｕポリ
メラーゼを１μｌ、１０×Ｐｆｕ反応液５μｌに、滅菌
蒸留水を加えて全量を５０μｌとした。これを９４℃で
４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１２０秒間処理
する一連の処理を３５サイクル行って前記ＤＮＡ産物を
増幅させた。増幅産物を１．２％アガロースゲルを用い
て電気泳動したところ、約３２０ｂｐのバンドが検出さ
れた。その後、検出されたバンドを切除し、前述と同様
に、抽出用キット（『ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘ
ｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて
精製し、続いて常法に従って、大腸菌株（『Ｅｐｉｃｕ
ｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′ Ｋ
ａｎ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ』、
ストラタジーン社製）を用いて形質転換した。得られた
形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成さ
せ、コロニーＰＣＲによって、目的のバンドが検出され
たコロニーを選択してＬＢ−液体培地に植菌し、３７℃
で１６時間で振盪培養した。常法に従って得られたプラ
スミド『ｐＣＲＩＬＬ−３』を、ジデオキシ法により塩
基配列を解析した。その結果、本発明のポリペプチドの
３′末端側ｃＤＮＡ部分の塩基配列として、配列表にお
ける配列番号３に示す２４８ｂｐの塩基配列が得られ
た。

【００４５】

【実験２−４】＜ポリペプチドのｃＤＮＡの取得＞実験
２−２及び実験２−３で得られた塩基配列を基に、本発
明のポリペプチドｃＤＮＡの５′末端側のセンスプライ
マーｓ４（５′−ＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣ
ＡＧ−３′）及び３′末端側のアンチセンスプライマー
ａ５（５′−ＡＧＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴ
−３′）を作出し、本発明のポリペプチドの完全長塩基
配列についてＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅した。即ち、５×
ｃＤＮＡ合成溶液を４μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓを
２μｌ、３７．５μＭオリゴｄＴ−アンカープライマー
を１μｌ、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞ｍＲＮＡを５４０ｎｇ、
２０Ｕ／μｌのＡＭＶ由来逆転写酵素を１μｌ加えＤＥ
ＰＣ処理水で２０μｌとし、サーマルサイクラーを用い
て５５℃で６０分間、６５℃で１０分間反応させた。得
られたｃＤＮＡ１μｌに、１００ｎｇ／μｌの作出した
センスプライマーｓ４及びアンチセンスプライマーａ５
をそれぞれ１μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰｓを１μｌ、
２．５Ｕ／μｌのＰｆｕポリメラーゼを１μｌ、１０×
Ｐｆｕ反応液を５μｌ加え、更に、滅菌水を加えて５０
μｌとした。これを９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒
間、７２℃で１２０秒間処理する一連の処理を３５サイ
クル行って前記ｃＤＮＡを増幅させた。増幅産物を１．
２％アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、約８
５０ｂｐのバンドが検出された。次に、検出された断片
を、前述と同様に抽出用キット（商品名『ＱＩＡＥＸ
ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ』、キア
ゲン社製）を用いて精製し、クローニングキット（商品
名『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋） Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｋｉｔ』、ストラタジーン社製）を用いてクローニ
ングし、続いて常法に従って大腸菌株（商品名『Ｅｐｉ
ｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′
Ｋａｎｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ
ｓ』、ストラタジーン社製）を形質転換した。得られた
形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成さ
せ、コロニーＰＣＲによって、目的のバンドが検出され
たコロニーを選択してＬＢ−液体培地に植菌し、３７℃
で１６時間振盪培養した。菌体培養液２ｍｌから、常法
に従ってプラスミドを調製し、得られたプラスミドをプ
ラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−ｆｕｌｌ』と命名した。この
プラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−ｆｕｌｌ』の塩基配列をジ
デオキシ法により、ＤＮＡシーケンサーを用いて解析
し、配列表における配列番号４に示す本発明のポリペプ
チドｃＤＮＡを決定した。又、配列表における配列番号
４に対応する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を配
列表における配列番号５に示す。

【００４６】

【実験３】＜生物活性＞常法に従って、健常人から末梢
血を採取し、水溶性非イオン性ポリマー（商品名『ファ
イコール』、ファルマシア社製）を用いてＮＫ細胞を含
む末梢血リンパ球を採取した。採取したＮＫ細胞を含む
末梢血リンパ球を、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール及び１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地
を用いて２回洗浄し、５×１０^６個／ｍｌの細胞濃度と
なるように懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェルマイ
クロプレートに各ウェル当たり１００μｌずつ分注し、
各ウェルに、後述する実施例２で得た本発明のポリペプ
チド標品を所定濃度含有する溶液を５０μｌ及び上記培
地を５０μｌそれぞれ添加し、３７℃で１８時間インキ
ュベートした。培養後のＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球
を回収し、^５１Ｃｒ標識したＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２４３）と濃度比（ＮＫ細胞を含む末梢血リン
パ球（エフェクター細胞（Ｅ））／Ｋ−５６２細胞（タ
ーゲット細胞（Ｔ））（＝Ｅ／Ｔ比）＝６．２５及び２
５の割合で混合した後、３７℃で４時間培養した。培養
後、９６ウェルマイクロプレートを２，０００ｒｐｍの
条件で５分間遠心分離し、上清中の^５１Ｃｒのカウント
数を測定することにより、本発明のポリペプチドがＮＫ
活性に及ぼす影響を調べた。その結果を図１に示す。

【００４７】図１の結果から明らかなように、本発明の
ポリペプチドが添加されたＮＫ細胞を含む末梢血リンパ
球は、本発明のポリペプチド無添加のＮＫ細胞を含む末
梢血リンパ球と比べ、上清中の^５１Ｃｒのカウント数が
著しく低下し、このことは、本発明のポリペプチドが、
ＮＫ細胞活性を抑制することを示すものである。

【００４８】

【実施例１】＜組換えＤＮＡ及び形質転換体の調製＞本
発明のポリペプチドとして、配列表における配列番号５
に示す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡがコードするア
ミノ酸配列の５２番目のバリン残基からＣ−末端アミノ
酸残基であるアスパラギン酸残基までの１６７個のアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドを大腸菌を用いる系で発
現させる目的で、下記の組換えＤＮＡの調製した。即
ち、０．５ｍｌ容反応チューブに１０×Ｐｆｕ反応液
（ストラタジーン社製）を１０μｌ、Ｐｆｕポリメラー
ゼ（２．５Ｕ／ｍｌ）を１μｌに２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ
を１μｌ、上記で得られたプラスミドｐＣＲＩＬＬ−ｆ
ｕｌｌを１ｎｇ、５′−ＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡ
ＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＣＣＣＧ−３′（無作為な４塩基
に引き続き、ＮｄｅＩサイト及び配列表における配列番
号４に於ける２７４番目から２９１番目の塩基配列に相
当）及び５′−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴ
ＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（無作為な４塩基に引き続
き、ＢａｍＨＩサイトと終始コドン及び配列表における
配列番号４に於ける７７７番目から７６３番目の塩基配
列に相当）で表わされる塩基配列のセンスプライマー及
びアンチセンスプライマーをそれぞれ適量加え、滅菌蒸
留水で５０μｌとした。その後、常法により、得られた
混合物を９４℃で０．５分間、６０℃で１分間、７２℃
で１分間、この順序でインキュベートする一連の処理を
３０サイクル繰り返してＰＣＲ反応させた。得られたＰ
ＣＲ産物を、常法に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢ
ａｍＨＩにて３７℃で２時間消化後、７０℃で１５分間
熱処理し、両制限酵素を失活させた。一方、プラスミド
（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、ノバジェン社製）も同様に
制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて３７℃で２時間
消化後、７０℃で１５分間熱処理を行なった。制限酵素
消化後のベクター『ｐＥＴ−３ａ』１００ｎｇと同様の
制限酵素処理後のＰＣＲ産物２００ｎｇとをライゲーシ
ョンキット（商品名『ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ Ｖｅｒ．２』、宝酒造株式会社製）を用いてライゲ
ーション反応を行ない、発現用プラスミドｐＥＴＩＬＬ
−ＥＸを構築した。ｐＥＴＩＬＬ−ＥＸを常法に従っ
て、ノバジェン製大腸菌『ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ
Ｓ』を形質転換して形質転換体を得た。この形質転換体
を形質転換体『ＩＬＬ−ＥＸ−１』と命名した。尚、本
実験で用いた、配列表における配列番号５に示す本発明
のポリペプチドのｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列の
５２番目のバリン残基からＣ−末端アミノ酸残基である
アスパラギン酸残基までの１６７個のアミノ酸配列は、
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、及びＩＬ−１
Ｒａβとの相同性は図２に示すように２０％程度に過ぎ
なかった。図２中、アルファベットはアミノ酸の１文字
略記号を示す。

【００４９】

【実施例２】＜ポリペプチドの調製＞実施例１で得た形
質転換体『ＩＬＬ−ＥＸ−１』を、アンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ培地（ｐＨ７．２）５ｍｌに接種し、３７℃で１８
時間培養した後、培養物から菌体液１ｍｌを採取し、上
記２種類の抗生物質を含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し
た。その後、３７℃で４時間培養後、１００ｍＭ ＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）１
ｍｌを添加し、２時間培養した。培養後、１０，０００
ｒｐｍで１５分間遠心分離して大腸菌を回収した。この
ペースト状の大腸菌に、０．５Ｍ尿素、０．１％β−メ
ルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）１０ｍｌを添加し、室温で３時間攪拌した。攪
拌後、１０，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心し、菌
体を回収した。この菌体に、８Ｍ尿素、０．１％β−メ
ルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．８）１０ｍｌを添加し、室温で１８時間
攪拌した。攪拌後、１０，０００ｒｐｍの条件で２０分
間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を０．５
Ｍ尿素、０．１％β−メルカプトエタノールを含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１Ｌに対し
て４℃にて１８時間透析を行い、１０，０００ｒｐｍの
条件で２０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清
をクロマトグラフィー用ゲル（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅ
ｘ７５』、ファルマシア社製）を用いるゲル濾過した。
この際、０．１％β−メルカプトエタノールを含むＰＢ
Ｓを溶出液として用い、分子量約２０ｋＤａの画分を回
収することにより、精製した本発明のポリペプチド標品
を得た。

【００５０】

【実施例３】〈ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
の調製〉

【実施例３−１】〈ハイブリドーマの調製〉１０週齢Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に実施例２の方法により得た
精製した本発明のポリペプチドを完全フロイントアジュ
バントともに２０μｇ／匹の割合で注射により接種し
た。この接種を２週間おきに２回、４週間に亘ってマウ
スに接種し、最後の接種から１週間後に更に接種し、そ
の３日後に脾臓を摘出し、摘出した脾臓を生理食塩水中
に分散して懸濁状の脾細胞を得た。

【００５１】この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／
０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）を、３
７℃に予温しておいた血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培
地（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度３×１０^４個／ｍ
ｌ及び１×１０^４個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心
分離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，
５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコ
ールを含む血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ
７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分
間インキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血
清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々
加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡ
Ｔ培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに２０
０μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１週間インキュベ
ートしてハイブリドーマを選択した。

【００５２】各ウェルにおける培養上清中に分泌された
抗体につき、実施例２の方法により得た精製ポリペプチ
ドとの反応性をエンザイムイムノアッセイにより調べ、
前記精製ポリペプチドに反応性を示す抗体を産生するハ
イブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマ
に常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、本発明の
モノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマクロー
ンを得た。

【００５３】

【実施例３−２】〈モノクローナル抗体の調製〉実施例
３−１で得た本発明のモノクローナル抗体を産生し得る
ハイブリドーマクローンを栄養培地中で培養し、培養物
を精製したところ、ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹当たり、本
発明のポリペプチドと免疫学的に反応するモノクローナ
ル抗体約５ｍｇを得た。

【００５４】

【実施例４】＜エンザイムイムノアッセイによるポリペ
プチドの検出〉常法にしたがって、実施例２の方法によ
り得た本発明のポリペプチドでウサギを免疫感作した
後、血液を採取し、本発明のポリペプチドと免疫学的に
反応する抗体を精製し、単離した。当該抗体をＰＢＳに
２０μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウェルマイク
ロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注した。マイク
ロプレートを室温下で３時間インキュベートした後、当
該抗体溶液を除き、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
を含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ加え、４℃で一
晩静置した。

【００５５】マイクロプレートからＰＢＳを除き、０．
０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、
実施例２の方法により得た本発明のポリペプチドを０．
５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにより
適宜濃度に希釈して１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪
下、室温下で２時間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）
ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、予めビオチン標識
した本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を
１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪しながら室温下で２
時間反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含
むＰＢＳで洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼと
ストレプトアビジンとの複合体を１００μｌ／ウェルず
つ加え、振盪しながら室温下でさらに２時間反応させ
た。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで
洗浄後、精製ポリペプチドに結合した西洋ワサビパーオ
キシダーゼの活性をｏ−フェニレンジアミンを基質に波
長４９２ｎｍにおける吸光度として測定した。本検出方
法によれば、好感度で本発明のポリペプチドを精度良く
検出し得る。

【００５６】

【発明の効果】上記したように、本発明は、配列表にお
ける配列番号５、又は、当該アミノ酸配列と少なくとも
７５％の相同性を有し、その中間部分アミノ酸配列とし
て配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を含ん
でなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列
表における配列番号４に示す塩基配列、配列表における
配列番号４に示す塩基配列と少なくとも７５％の相同性
を有する塩基配列を有し、その５´末端側に配列表にお
ける配列番号８に示す塩基配列を含んでなる塩基配列、
又は、それら塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮ
Ａ、更には、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応す
る抗体、及び本発明のポリペプチドを検出する方法を提
供する発明である。本発明によれば、哺乳動物の免疫系
に関する研究、更には、ＮＫ活性抑制剤／調節剤として
の医薬品開発にも貢献し得る発明である。

【００５７】本発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮す
るものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のあ
る発明であると云える。

【００５８】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Kabushikikaisha Hayashibara Seibutsukagaku Kenkyujo <120> Polypeptide and uses thereof <130> 10082502 <160> 8 <210> 1 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA based on cDNA of IL-1α, IL-1β, IL-1 receptor antago nist (IL-Ra). <400> 1 cactacagct gaagaaggag aaactgatga agctggctgc ccaaaaggaa tcagcacgcc 60 ggcccttcat cttttatagg gctcaggtgg gctcctggaa catgctggag tcggccgc 118 <210> 2 <211> 575 <212> DNA <213> Microorganism <400> 2 gagaactgaa ggcaaacaga gctccaggag tccaagacag agccacagac cacgaggatc 60 cctggcccag gtcttggact tcattccatt ttctgttgag taataaactc aacgttgaaa 120 atgtcctttg tgggggagaa ctcaggagtg aaaatgggct ctgaggactg ggaaaaagat 180 gaaccccagt gctgcttaga agacccggct gtaagccccc tggaaccagg cccaagcctc 240 cccgccatga attttgttca cacaagtcca aaggtgaaga acttaaaccc gaagaaattc 300 agcattcatg accaggatca caaagtactg gtcctggact ctgggaatct catagcagtt 360 ccagataaaa actacatacg cccagagatc ttctttgcat tagcctcatc cttgagctca 420 gcctctgcgg agaaaggaag tccgattctc ctgggggtct ctaaagggga gttttgtctc 480 tactgtgaca aggataaagg acaaagtcat ccatcccttc agctgaagaa ggagaaactg 540 atgaagctgg ctgcccaaaa ggaatcagca cgccg 575 <210> 3 <211> 248 <212> DNA <213> Microorganism <400> 3 ggtgggctcc tggaacatgc tggagtcggc ggctcacccc ggatggttca tctgcacctc 60 ctgcaattgt aatgagcctg ttggggtgac agataaattt gagaacagga aacacattga 120 attttcattt caaccagttt gcaaagctga aatgagcccc agtgaggtca gcgattagga 180 aactgcccca ttgaacgcct tcctcgctaa tttgaactaa ttgtataaaa accccaaacc 240 tgctcact 248 <210> 4 <211> 847 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 4 gagaactgaa ggcaaacaga gctccaggag tccaagacag agccacagac cacgaggatc 60 cctggcccag gtcttggact tcattccatt ttctgttgag taataaactc aacgttgaaa 120 atgtcctttg tgggggagaa ctcaggagtg aaaatgggct ctgaggactg ggaaaaagat 180 gaaccccagt gctgcttaga agacccggct gtaagccccc tggaaccagg cccaagcctc 240 cccgccatga attttgttca cacaagtcca aaggtgaaga acttaaaccc gaagaaattc 300 agcattcatg accaggatca caaagtactg gtcctggact ctgggaatct catagcagtt 360 ccagataaaa actacatacg cccagagatc ttctttgcat tagcctcatc cttgagctca 420 gcctctgcgg agaaaggaag tccgattctc ctgggggtct ctaaagggga gttttgtctc 480 tactgtgaca aggataaagg acaaagtcat ccatcccttc agctgaagaa ggagaaactg 540 atgaagctgg ctgcccaaaa ggaatcagca cgccggccct tcatctttta tagggctcag 600 gtgggctcct ggaacatgct ggagtcggcg gctcaccccg gatggttcat ctgcacctcc 660 tgcaattgta atgagcctgt tggggtgaca gataaatttg agaacaggaa acacattgaa 720 ttttcatttc aaccagtttg caaagctgaa atgagcccca gtgaggtcag cgattaggaa 780 actgccccat tgaacgcctt cctcgctaat ttgaactaat tgtataaaaa ccccaaacct 840 gctcact 847 <210> 5 <211> 218 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 5 Met Ser Phe Val Gly Glu Asn Ser Gly Val Lys Met Gly Ser Glu Asp 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Val Ser 20 25 30 Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Ala Met Asn Phe Val His Thr 35 40 45 Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp 50 55 60 Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val 65 70 75 80 Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser 85 90 95 Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly 100 105 110 Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln 115 120 125 Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala 130 135 140 Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln 145 150 155 160 Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe 165 170 175 Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys 180 185 190 Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys 195 200 205 Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp 210 215 <210> 6 <211> 855 <212> DNA <213> Homosapiens <220> <221> CDS <222> (121)...(777) <400> 6 gagaactgaa ggcaaacaga gctccaggag tccaagacag agccacagac cacgaggatc 60 cctggcccag gtcttggact tcattccatt ttctgttgag taataaactc aacgttgaaa 120 atg tcc ttt gtg ggg gag aac tca gga gtg aaa atg ggc tct gag gac 168 Met Ser Phe Val Gly Glu Asn Ser Gly Val Lys Met Gly Ser Glu Asp 1 5 10 15 tgg gaa aaa gat gaa ccc cag tgc tgc tta gaa gac ccg gct gta agc 216 Trp Glu Lys Asp Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Val Ser 20 25 30 ccc ctg gaa cca ggc cca agc ctc ccc gcc atg aat ttt gtt cac aca 264 Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Ala Met Asn Phe Val His Thr 35 40 45 agt cca aag gtg aag aac tta aac ccg aag aaa ttc agc att cat gac 312 Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp 50 55 60 CAG GAT CAC AAA GTA CTG GTC CTG GAC TCT GGG AAT CTC ATA GCA GTT 360 Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val 65 70 75 80 cca gat aaa aac tac ata cgc cca gag atc ttc ttt gca tta gcc tca 408 Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser 85 90 95 tcc ttg agc tca gcc tct gcg gag aaa gga agt ccg att ctc ctg ggg 456 Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly 100 105 110 gtc tct aaa ggg gag ttt tgt ctc tac tgt gac aag gat aaa gga caa 504 Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln 115 120 125 agt cat cca tcc ctt cag ctg aag aag gag aaa ctg atg aag ctg gct 552 Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala 130 135 140 gcc caa aag gaa tca gca cgc cgg ccc ttc atc ttt tat agg gct cag 600 Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln 145 150 155 160 gtg ggc tcc tgg aac atg ctg gag tcg gcg gct cac ccc gga tgg ttc 648 Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe 165 170 175 atc tgc acc tcc tgc aat tgt aat gag cct gtt ggg gtg aca gat aaa 696 Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys 180 185 190 ttt gag aac agg aaa cac att gaa ttt tca ttt caa cca gtt tgc aaa 744 Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys 195 200 205 gct gaa atg agc ccc agt gag gtc agc gat taggaaactg ccccattgaa 794 Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp 210 215 cgccttcctc gctaatttga actaattgta taaaaacccc aaacctgctc actaaaaaaa 854 a 855 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 7 Val Lys Asn 1 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 8 gtg aag aac 9

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のポリペプチドがＮＫ活性に及ぼす影響
を示す図である。

【図２】本発明の実施例２のポリペプチド、ＩＬ−１
α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１Ｒａβとの
相同性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/545 16/24 14/715 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｋ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 栗本 雅司 岡山県岡山市下石井１丁目２番３号 株式 会社林原生物化学研究所内

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表における配列番号５に示すアミノ
   酸配列、又は、当該アミノ酸配列と少なくとも７５％の
   相同性を有し、その中間部分アミノ酸配列として配列表
   における配列番号７に示すアミノ酸配列を含んでなるア
   ミノ酸配列からなるポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドから得るこ
   とのできるポリペプチド断片。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドと結合する
   受容体蛋白質。
4. 【請求項４】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   る、配列表における配列番号４に示す塩基配列、当該塩
   基配列と少なくとも７５％の相同性を有し、その５´末
   端側に配列表における配列番号８に示す塩基配列を含ん
   でなる塩基配列、又は、それら塩基配列に相補的な塩基
   配列からなるＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡと自律複製可能な
   ベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項４記載のＤＮＡから得ることので
   きるＤＮＡ断片。
7. 【請求項７】 請求項５記載の組換えＤＮＡを適宜宿主
   に導入してなる形質転換体。
8. 【請求項８】 宿主が大腸菌である請求項７記載の形質
   転換体。
9. 【請求項９】 請求項１記載のポリペプチド産生能を有
   する培養株化されたヒト由来又はヒト以外の温血動物由
   来のＴ細胞を栄養培地中、又は、ヒトを除く温血動物の
   栄養分を含んだ体液を供給しながら増殖させて当該ポリ
   ペプチドを産生させ、これを採取することを特徴とする
   ポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】 培養株化されたヒトＴ細胞が、ＨＰＢ
    −ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−２４３０）である請求
    項９記載のポリペプチドの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項７又は８記載の形質転換体を栄
    養培地中で培養することにより請求項１記載のポリペプ
    チドを産生させ、これを培養物から採取することを特徴
    とするポリペプチドの製造方法。
12. 【請求項１２】 請求項１記載のポリペプチドと免疫学
    的に反応する抗体。
13. 【請求項１３】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項１２記載の抗体。
14. 【請求項１４】 抗体が抗血清である請求項１２又は１
    ３記載の抗体。
15. 【請求項１５】 抗体がヒト型抗体である請求項１２、
    １３又は１４記載の抗体。
16. 【請求項１６】 請求項１記載のポリペプチドを有効成
    分とする医薬組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１２乃至１５の何れかに記載の
    抗体を含んでなる医薬組成物。