JP2001163801A - Dried c-reactive protein composition - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a dried C-reactive protein(CRP) composition from which existing endotoxin is sufficiently removed in a dried composition of CRP having difficulty in purification due to liability to flocculation and precipitation in an aqueous solvent and tendency of dry denaturation. SOLUTION: This dried CRP composition which can prevent flocculation and precipitation of CRP by adding a saccharide and/or a surfactant and can be readily dissolved in the aqueous solvent while maintaining biological activity is prepared. The dried CRP composition may be further formulated with a stabilizer. The prepared CPR is sufficiently concentrated in an added state of the additive, the concentration of endotoxin is raised, endotoxin is adsorbed on an adsorbent and endotoxin present in CRP can be efficiently and substantially removed, to be concrete, up to <=2.5 endotoxin unit/mg CRP. Consequently the aqueous solvent readily soluble dried CRP composition substantially free from endotoxin is prepared.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、容易に水性溶媒に
溶解することができるようにした、乾燥C反応性タンパ
ク質（以下、「CRP」という。）組成物に関する。本発
明はまた、エンドトキシンを実質的に含まない、容易に
水性溶媒に溶解することができる乾燥CRP組成物に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a dry C-reactive protein (hereinafter, referred to as "CRP") composition which can be easily dissolved in an aqueous solvent. The present invention also relates to a dry CRP composition that is substantially free of endotoxin and can be readily dissolved in aqueous solvents.

【０００２】[0002]

【従来の技術】CRPは、肺炎双球菌の莢膜のC多糖体と反
応するタンパク質であり、血清中のβグロブリン分画に
存在し、分子量が約130kDaのペプチドの5量体からな
る。正常ヒト血中でのCRP濃度は約350 ng/ml未満である
が、感染、炎症、組織損傷などの急性相反応の間、血中
濃度が最大で0.1 mg/mlへと激増する、急性相タンパク
質の１種として知られている（Agrawal, A, Kilpartric
k, J.M., and Volanakis,J.E. (1994) in Acute Phase
Proteins- Molecular Biology, Biochemistry andClini
cal Applications- (Mackiewicz, A., Kushuner, I., a
nd Baumann, H.,Eds.), pp. 79-92, CRC Press, Londo
n）。2. Description of the Related Art CRP is a protein that reacts with the C polysaccharide in the capsulation of Streptococcus pneumoniae. It is present in the serum β-globulin fraction and consists of a pentamer of a peptide having a molecular weight of about 130 kDa. CRP levels in normal human blood are less than about 350 ng / ml, but during acute phase reactions such as infection, inflammation, and tissue damage, the blood levels increase sharply to a maximum of 0.1 mg / ml. Known as a kind of protein (Agrawal, A, Kilpartric
k, JM, and Volanakis, JE (1994) in Acute Phase
Proteins- Molecular Biology, Biochemistry and Clini
cal Applications- (Mackiewicz, A., Kushuner, I., a
nd Baumann, H., Eds.), pp. 79-92, CRC Press, Londo
n).

【０００３】CRPの生物学的役割については、未だ完全
には明らかになっていない。しかし近年、補体活性化
（Richards, R.L., et al., (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci.USA 74, 5672-5676; Richards, R.L., et al., (1
979) J. Immunol. 122, 1185-1189; Miyazawa, K., and
Inoue, K. (1990) J. Immunol. 145, 650-654; Jiang,
H., et al., (1991) J. Immunol. 146, 2324-2330; Wo
lbink, G.J., et al.,(1996) J. Immunol. 157, 473-47
9）およびリンパ球のオプソニン化（Mortensen, R.F.,
et al., (1976) J. Immunol. 117, 774; Edwards, W.
M., et al., (1982) J. Immunol. 128, 2498; Szalai,
A.J., et al., (1995) J. Immunol. 155,2557-2563）を
含む、さまざまな前炎症性の宿主防御活性を示すことが
わかってきた。こうした活性は、炎症反応の前免疫相中
の非特異的宿主防御に貢献していると考えられている。[0003] The biological role of CRP has not yet been fully elucidated. However, recently, complement activation (Richards, RL, et al., (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, 5672-5676; Richards, RL, et al., (1
979) J. Immunol. 122, 1185-1189; Miyazawa, K., and
Inoue, K. (1990) J. Immunol. 145, 650-654; Jiang,
H., et al., (1991) J. Immunol. 146, 2324-2330; Wo
lbink, GJ, et al., (1996) J. Immunol. 157, 473-47
9) and lymphocyte opsonization (Mortensen, RF,
et al., (1976) J. Immunol. 117, 774; Edwards, W.
M., et al., (1982) J. Immunol. 128, 2498; Szalai,
AJ, et al., (1995) J. Immunol. 155, 2557-2563) have been shown to exhibit a variety of proinflammatory host defense activities. These activities are thought to contribute to non-specific host defense during the pre-immune phase of the inflammatory response.

【０００４】このようなCRPの生物学的活性を示す例と
しては、例えば、in vitro研究で、CRPは肺炎連鎖球菌
（Streptococcus pneumoniae）のさまざまな血清型と結
合し、顆粒球による細菌食作用を増進した（De Beaufor
t, A.J., et al., (1997) Scand. J. Immunol. 46, 597
-600）例があり、この事実からCRPが抗細菌活性を有す
るということが示唆された。また、ヒトCRP遺伝子トラ
ンスジェニックマウスに対して実験的に、致死量のStre
ptococcus pneumoniaeを感染させると、対照の無処置マ
ウスより死亡率が低いという結果も報告されている（Sz
alai, A.J., et al., (1995) J. Immunol. 155(5), 255
7-2563）。[0004] Examples of such biological activities of CRP include, for example, in vitro studies, CRP binds to various serotypes of Streptococcus pneumoniae and inhibits bacterial phagocytosis by granulocytes. (De Beaufor
t, AJ, et al., (1997) Scand. J. Immunol. 46, 597
-600) In some cases, this fact suggested that CRP has antibacterial activity. In addition, a lethal dose of Stre was experimentally tested on human CRP gene transgenic mice.
Infection with ptococcus pneumoniae has also been reported to result in lower mortality than control untreated mice (Sz
alai, AJ, et al., (1995) J. Immunol. 155 (5), 255
7-2563).

【０００５】CRPを調製するために、例えばヒトCRP（hC
RP）の場合、従来はヒト血清中または癌患者の腹水か
ら、レシチン‐Ca²⁺沈殿法（Hokama, Y., et al., (197
4) Clin. Chem. Acta 50, 53-62）、C-多糖アフィニテ
ィークロマトグラフィー法（Pepys, M.B., et al., (19
97) Clin. Exp. Immunol. 30, 32-37）またはホスホリ
ルコリン（PC）アフィニティークロマトグラフィー法
（Volanakis, J.E., et al.,(1978) J. Immunol. Metho
ds 23, 285-295; Stults, N.L., et al., (1987) Anal.
Biochem., 161, 567-573）により、CRPを単離・精製す
ることができる。[0005] To prepare CRP, for example, human CRP (hC
In the case of RP), the lecithin-Ca ²⁺ precipitation method (Hokama, Y., et al., (197)
4) Clin. Chem. Acta 50, 53-62), C-polysaccharide affinity chromatography (Pepys, MB, et al., (19)
97) Clin. Exp. Immunol. 30, 32-37) or phosphorylcholine (PC) affinity chromatography (Volanakis, JE, et al., (1978) J. Immunol. Metho
ds 23, 285-295; Stults, NL, et al., (1987) Anal.
Biochem., 161, 567-573), CRP can be isolated and purified.

【０００６】一方、原料の入手が困難なこと、ウィルス
感染やプリオン病などの感染に対する防御が困難なこ
と、そして正常ヒト血清中のCRP濃度が約350 ng/ml未満
と非常に低いことなどの理由から、近年、より安全にか
つ効率よくCRPを調製する方法として、組換えCRPを遺伝
子工学的に大腸菌内で発現する方法も開発されている
（Tanaka, T., and Matsuo, Y. (1994) Rinsyo-Kagaku
(Japanese) 23(2), 107b-; Tanaka, T., et al., (199
6) Seibutsu-shiryobunseki (Japanese) 19(4), 217-22
6）。遺伝子工学的手法により組換えCRPを調製すること
により、生物材料からCRPを単離・精製する従来の方法
に比べ、CRPを高い収率で得ることができ、精製もはる
かに安全かつ容易に行うことができるようになった。On the other hand, it is difficult to obtain raw materials, it is difficult to protect against infections such as virus infection and prion disease, and the CRP concentration in normal human serum is very low, less than about 350 ng / ml. For this reason, in recent years, as a method for preparing CRP more safely and efficiently, a method for genetically engineering recombinant CRP in E. coli has also been developed (Tanaka, T., and Matsuo, Y. (1994). ) Rinsyo-Kagaku
(Japanese) 23 (2), 107b-; Tanaka, T., et al., (199
6) Seibutsu-shiryobunseki (Japanese) 19 (4), 217-22
6). By preparing recombinant CRP by genetic engineering techniques, CRP can be obtained at a higher yield than conventional methods for isolating and purifying CRP from biological materials, and purification is much safer and easier. Now you can do it.

【０００７】このように生物材料から単離・精製したCR
Pまたは遺伝子組換え技術により調製したCRPは、例えば
動物に注射することにより一過性の急性相を誘導するこ
となどの試験・研究的な用途のために、または肝臓疾患
治療薬として使用することなどの医学臨床的な用途のた
めに使用することも考えられている。[0007] The CR thus isolated and purified from the biological material
P or CRP prepared by genetic recombination techniques should be used for testing and research purposes, such as inducing a transient acute phase by injection into animals, or as a therapeutic agent for liver disease It is also considered to be used for medical and clinical applications such as.

【０００８】CRP調製品を試験・研究的にまたは医学臨
床的に使用する場合には、CRP調製品を水性溶媒に溶解
して使用することが望まれる。しかしながら、CRPは水
性溶媒中で凝集・沈澱を生じやすく、しかも一旦凝集・
沈澱を生じるとその後水性溶媒に再溶解しにくくなり、
仮に再溶解しても生物学的活性が著しく低下するという
欠点を有する。そのためCRPを生物材料から単離・精製
する過程およびCRP調製物を試薬または治療薬として製
品化する過程で、CRPの水性溶媒に対する溶解性をいか
にして維持するかが課題であった。特にCRPを乾燥組成
物として提供する場合に、使用時に水性溶媒に十分溶解
せず、沈澱を生じてしまうことは大きな問題であった。[0008] When the CRP preparation is used for testing / research or for medical and clinical use, it is desirable to use the CRP preparation dissolved in an aqueous solvent. However, CRP tends to aggregate and precipitate in aqueous solvents, and once aggregates
When precipitation occurs, it is difficult to redissolve in an aqueous solvent thereafter,
Even if it is redissolved, it has the disadvantage that the biological activity is significantly reduced. Therefore, in the process of isolating and purifying CRP from biological material and in the process of commercializing a CRP preparation as a reagent or a therapeutic agent, there was a problem how to maintain the solubility of CRP in an aqueous solvent. In particular, when CRP is provided as a dry composition, it is a serious problem that it does not dissolve sufficiently in an aqueous solvent at the time of use and precipitates.

【０００９】さらに、大腸菌で発現させた組換えタンパ
ク質にはもちろんのこと、生物材料から単離・精製され
たタンパク質中にも、大腸菌などのグラム陰性細菌由来
のエンドトキシン（リポ多糖（LPS））が混入する可能
性があるという問題が存在する。哺乳動物はエンドトキ
シンに対して非常に高い感受性を有しているため、投与
物中に微量のエンドトキシンが混入しているだけで、哺
乳動物は強い発熱反応やショック反応などの急性相反応
を引き起こし、死に至ることもある。[0009] Endotoxins (lipopolysaccharide (LPS)) derived from Gram-negative bacteria such as Escherichia coli are included in proteins isolated and purified from biological materials as well as recombinant proteins expressed in Escherichia coli. There is a problem of possible contamination. Since mammals have a very high sensitivity to endotoxin, even a minute amount of endotoxin in the administered substance causes an acute phase reaction such as a strong fever or shock response, It can be fatal.

【００１０】CRP調製品からエンドトキシンを除去する
ためには、吸着剤による方法が考えられるが、微量のエ
ンドトキシンの残存も問題であるため、除去操作を何回
か繰り返す必要がある。ところが、前述のようにCRPは
凝集および沈澱する傾向が強いため、実質的にエンドト
キシンを含まない状態のCRPを得ることは従来不可能で
あった。[0010] In order to remove endotoxin from the CRP preparation, a method using an adsorbent is conceivable. However, since a small amount of endotoxin remains a problem, it is necessary to repeat the removal operation several times. However, since CRP has a strong tendency to aggregate and precipitate as described above, it has been conventionally impossible to obtain CRP containing substantially no endotoxin.

【００１１】[0011]

【発明が解決しようとする課題】CRPは水性溶媒中で凝
集・沈澱を生じやすく、しかも一旦凝集・沈澱を生じる
とその後水性溶媒に再溶解しにくくなり、たとえ再溶解
できたとしても生物学的活性が著しく低下するという特
徴を有する。CRPはまた、水性溶媒から乾燥状態にする
ときにも変性する傾向があり、再び水性溶媒に溶解しよ
うとしても、沈澱を生じて十分に溶解しないという問題
がある。本発明の第一の課題は、水に容易に溶解する乾
燥CRP組成物を提供することである。乾燥CRP組成物を哺
乳動物に非経口投与するには、エンドトキシンを実質的
に含んではならない。したがってそのような目的のた
め、本発明の第二の課題は、実質的にエンドトキシンを
含まない、水に容易に溶解する乾燥CRP組成物を提供す
ることである。CRPは凝集・沈澱を生じやすいので、混
在するエンドトキシンを十分の除去することは非常に困
難であった。CRP is liable to aggregate and precipitate in an aqueous solvent, and once aggregated and precipitated, it is difficult to redissolve in an aqueous solvent thereafter. It has the characteristic that the activity is significantly reduced. CRP also tends to be denatured when it is dried from an aqueous solvent, and there is a problem that even if it tries to be dissolved again in an aqueous solvent, it precipitates and is not sufficiently dissolved. A first object of the present invention is to provide a dry CRP composition that is easily dissolved in water. Parenteral administration of the dried CRP composition to a mammal should be substantially free of endotoxin. Accordingly, for such purposes, a second object of the present invention is to provide a dry CRP composition that is substantially free of endotoxin and readily soluble in water. Since CRP easily causes aggregation and precipitation, it was very difficult to sufficiently remove mixed endotoxin.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、CRPが凝
集、沈澱することを防止することにより、生物学的に活
性な状態を維持したまま、上記課題を解決するために、
糖、界面活性剤および安定化剤から選択される少なくと
も一種の添加物を添加することにより、CRPの乾燥まで
の工程、例えばCRPの単離工程、精製工程、濃縮工程、
凍結・融解工程、凍結・乾燥工程などの適当な段階にお
いて、沈澱の発生を有意に防止できることを発見した。Means for Solving the Problems The present inventors have solved the above-mentioned problems by preventing CRP from aggregating and precipitating while maintaining a biologically active state.
By adding at least one additive selected from sugars, surfactants and stabilizers, steps up to drying of CRP, for example, CRP isolation step, purification step, concentration step,
It has been discovered that the precipitation can be significantly prevented at appropriate stages such as the freezing / thawing step and the freezing / drying step.

【００１３】本発明者らはさらに、CRP粗抽出溶液ある
いは組換えCRP溶液からエンドトキシンを実質的に除去
するためには、CRP調製物を十分に濃縮し、エンドトキ
シンの濃度を高めてから吸着剤に吸着させることによ
り、CRPに混在するエンドトキシンを効率よくかつ実質
的に除去できるのではないかと考えた。この過程におい
ては、CRP調製物を濃縮する工程が含まれるが、従来の
方法によれば、この過程においてCRPの濃度の上昇とと
もにCRPの凝集・沈澱が生じやすくなるという問題が存
在していた。In order to substantially remove endotoxin from the CRP crude extraction solution or the recombinant CRP solution, the present inventors further concentrate the CRP preparation sufficiently, increase the endotoxin concentration, and then add the endotoxin to the adsorbent. It was thought that endotoxin mixed in CRP could be efficiently and substantially removed by the adsorption. In this process, a step of concentrating the CRP preparation is included. However, according to the conventional method, there has been a problem that in this process, aggregation and precipitation of CRP tend to occur as the concentration of CRP increases.

【００１４】しかしながら、本発明の特徴の一つである
糖および界面活性剤などの添加剤の存在により、本発明
はCRPの濃縮工程におけるその凝集・沈澱も同時に防ぐ
ことができる。本発明によれば、濃縮されたCRP調製物
を吸着剤で処理してエンドトキシンを除去する前に、添
加した糖および界面活性剤を除去することも特徴であ
る。However, the present invention can simultaneously prevent the aggregation and precipitation of the CRP in the concentration step due to the presence of additives such as a sugar and a surfactant, which are one of the features of the present invention. According to the invention, it is also a feature that the added sugar and surfactant are removed before the concentrated CRP preparation is treated with the adsorbent to remove endotoxin.

【００１５】この濃縮工程および吸着剤による処理は少
なくとも１回行うが、好ましくは複数回繰り返すことに
よって、エンドトキシンを実質的に含まないCRP組成物
を調製することが可能になった。The concentration step and the treatment with the adsorbent are performed at least once, and preferably repeated a plurality of times, thereby making it possible to prepare a CRP composition substantially free of endotoxin.

【００１６】上記のようにして調製された、エンドトキ
シンを実質的に含まないCRP組成物は、適当な緩衝液等
に溶解してから乾燥させ、用時溶解して使用できるよう
にしておくことが好ましい。しかしながら、乾燥過程で
のCRPの変性のため、用時に水に十分溶解せず、沈澱が
生じることがわかった。本発明者らは、この課題解決に
も糖、界面活性剤および安定化剤の中から選択される少
なくとも一種の添加物を添加することが有効であること
を見出した。[0016] The CRP composition substantially free of endotoxin prepared as described above may be dissolved in an appropriate buffer or the like, dried, and dissolved before use so that it can be used. preferable. However, it was found that due to denaturation of CRP during the drying process, it was not sufficiently dissolved in water at the time of use, and a precipitate was formed. The present inventors have found that it is effective to add at least one additive selected from sugars, surfactants and stabilizers to solve this problem.

【００１７】以下に本発明を詳しく説明する。生物材料からのCRPの調製 生物材料からのCRPの調製は、例えば、Stultsらの論文
（Stults, N.L., et al., (1987) Anal. Biochem., 16
1, 567-573）に記載されているように行う。CRPを調製
するためには、ヒト、ネズミ、ウシ、ブタなどに由来す
る、血液、腹水、組織抽出液などの生物材料を使用する
ことができるが、これらに限定されるものではなく、CR
Pが存在することが知られている生物種の試料であれば
いずれを用いてもよい。Hereinafter, the present invention will be described in detail. Preparation of CRP from biological material Preparation of CRP from biological material is described, for example, in Stults et al. (Stults, NL, et al., (1987) Anal. Biochem., 16).
1, 567-573). To prepare CRP, biological materials such as blood, ascites, tissue extracts, etc., derived from humans, rats, cows, pigs, etc. can be used, but are not limited thereto.
Any sample may be used as long as it is a sample of a biological species in which P is known to be present.

【００１８】これらの生物材料から得られた試料中に
は、生物材料中に存在していた、またはコンタミネーシ
ョンにより混在したグラム陰性菌由来のエンドトキシン
が、500 〜5000 EU/mg CRP程度含まれる場合がある。CR
P組成物中に微量なエンドトキシンが存在していても、
生物によっては発熱反応などの急性相反応を生じる可能
性があることを考慮して、本発明においては、エンドト
キシンによる影響なく生物材料由来のCRPを生物に投与
できるようにするために、組換えタンパク質中のエンド
トキシンを実質的に含まれない状態にする。ここで、実
質的にエンドトキシンを含まないとは、投与を受けた生
物が発熱反応などの急性相反応を起こさない程度の濃度
をいい、具体的には、組成物中において、100 EU/mg CR
P以下、好ましくは10 EU/mg CRP以下、最も好ましくは
2.5 EU/mg CRP以下の濃度をいう。The samples obtained from these biological materials contain endotoxins derived from Gram-negative bacteria which were present in the biological materials or mixed due to contamination, in the case of about 500 to 5000 EU / mg CRP. There is. CR
Even if a trace amount of endotoxin is present in the P composition,
In consideration of the possibility that an acute phase reaction such as an exothermic reaction may occur in some organisms, the present invention provides a recombinant protein in order to allow administration of CRP derived from a biological material to an organism without being affected by endotoxin. To be substantially free of endotoxin. Here, the term "substantially free of endotoxin" refers to a concentration at which the administered organism does not cause an acute phase reaction such as a fever reaction, and specifically, 100 EU / mg CR in the composition.
P or less, preferably 10 EU / mg CRP or less, most preferably
2.5 EU / mg Concentration below CRP.

【００１９】組換えCRP 本発明で用いるCRPは、組換えCRPでもよい。組換えCRP
は、例えば、Tanakaらの論文（Tanaka, T., et al., (1
996) Seibutsu-shiryobunseki (Japanese) 19(3), 159-
167）に記載されているように、大腸菌を用いた菌体外
分泌発現により得ることができる。この方法では組換え
CRPタンパク質が大腸菌培養液中に分泌されるため、当
該大腸菌培養液から組換えCRPタンパク質を精製するこ
とができる（Tanaka, T., et al., (1996) Seibutsu-sh
iryobunseki (Japanese) 19(3),159-167）。 Recombinant CRP The CRP used in the present invention may be a recombinant CRP. Recombinant CRP
Is described, for example, in the paper by Tanaka et al. (Tanaka, T., et al., (1
996) Seibutsu-shiryobunseki (Japanese) 19 (3), 159-
As described in 167), it can be obtained by extracellular secretory expression using Escherichia coli. This method uses recombination
Since the CRP protein is secreted into the E. coli culture, the recombinant CRP protein can be purified from the E. coli culture (Tanaka, T., et al., (1996) Seibutsu-sh
iryobunseki (Japanese) 19 (3), 159-167).

【００２０】このようにして得られる組換えCRPタンパ
ク質には、典型的には1000〜1500 EU/mg CRPのLPSが含
まれている。本発明においては、エンドトキシンによる
影響なく組換えCRPを生物に投与できるようにするため
に、組換えタンパク質中のエンドトキシンを実質的に含
まれない状態にする。The recombinant CRP protein thus obtained typically contains 1000-1500 EU / mg CRP of LPS. In the present invention, the endogenous endotoxin in the recombinant protein is made substantially free so that the recombinant CRP can be administered to an organism without being affected by endotoxin.

【００２１】糖および界面活性剤 一般に、一回の精製により除去されるエンドトキシン量
は、後述するように溶液中のエンドトキシン濃度に比例
するため、溶液中のエンドトキシン濃度が低いと除去さ
れるエンドトキシン量も減少する。したがって、組換え
CRP溶液中から効率よくエンドトキシンを除去するため
には、できるだけ濃厚なCRP溶液からエンドトキシンを
除去することが好ましい。しかしながら、CRP溶液を濃
縮しすぎると、溶液中のCRPが凝集・沈澱する可能性も
高くなる。このような凝集・沈澱を防止するため、本発
明では糖および界面活性剤から選択される一種以上の添
加物を使用することが好ましい。[0021] sugar and surfactant generally, the amount of endotoxin that is removed by a single purification is proportional to concentration of endotoxin in the solution as will be described later, endotoxin amount endotoxin concentration is low and the removal of the solution also Decrease. Therefore, recombinant
In order to efficiently remove endotoxin from a CRP solution, it is preferable to remove endotoxin from a CRP solution as concentrated as possible. However, when the CRP solution is excessively concentrated, the possibility that the CRP in the solution aggregates and precipitates increases. In order to prevent such aggregation / precipitation, in the present invention, it is preferable to use one or more additives selected from sugars and surfactants.

【００２２】糖としては、トレハロースを使用すること
が好ましい。トレハロースは、不凍剤としての活性を有
することが知られている糖質であり、タンパク質の高次
構造を維持する役割を果たすことが知られている。CRP
が活性を維持するためには、トレハロースを添加してCR
Pの高次構造を維持することが好ましい。トレハロース
は分子量が小さく、透析により溶液中から除去すること
が可能である（Hjelmeland, L.M. (1980) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77(11), 6568-6570）。トレハロース
は、0.1〜10 mg/mg CRPの範囲の量で使用する。As the sugar, trehalose is preferably used. Trehalose is a carbohydrate known to have an activity as an antifreeze, and is known to play a role in maintaining a higher-order structure of a protein. CRP
To maintain the activity, add trehalose to CR
It is preferable to maintain the higher order structure of P. Trehalose has a low molecular weight and can be removed from solution by dialysis (Hjelmeland, LM (1980) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77 (11), 6568-6570). Trehalose is used in amounts ranging from 0.1 to 10 mg / mg CRP.

【００２３】界面活性剤は、CRP分子の粒子表面に吸着
され、粒子間に反発力を与えるため、CRP分子が水溶液
中で安定化するために役に立つと考えられる。本発明で
使用する界面活性剤は、臨界ミセル濃度が比較的高いも
のであることが好ましい。このような界面活性剤として
は、例えば、CHAPS、MEGA-9^TMなどがある。最も好まし
くは、CHAPSを使用する。CHAPSは、Tween系の界面活性
剤などと比較して、臨界ミセル濃度が7.4 mMと高い界面
活性剤である。たとえば、Tween系の界面活性剤は、臨
界ミセル濃度が1.2〜5.9×10^-2 mMと、CHAPSの約1/100
〜1/600である。したがって、CHAPSは、ミセルを形成し
にくいため、必要であれば、CRPの濃縮の後に透析、ゲ
ル濾過などにより比較的容易に除去することができる
（Hjelmeland, L.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 77(11), 6568-6570）。CHAPSは、0.1〜10 mg/mg CRP
の範囲の量で使用する。The surfactant is considered to be useful for stabilizing the CRP molecule in an aqueous solution because the surfactant is adsorbed on the particle surface of the CRP molecule and gives a repulsive force between the particles. The surfactant used in the present invention preferably has a relatively high critical micelle concentration. Such surfactants include, for example, CHAPS, MEGA-9 ^™ and the like. Most preferably, CHAPS is used. CHAPS is a surfactant having a critical micelle concentration as high as 7.4 mM as compared with Tween-based surfactants and the like. For example, a Tween-based surfactant has a critical micelle concentration of 1.2 to 5.9 × 10 ⁻² mM, which is about 1/100 of CHAPS.
~ 1/600. Therefore, since CHAPS is unlikely to form micelles, it can be relatively easily removed by dialysis, gel filtration, etc. after concentration of CRP, if necessary (Hjelmeland, LM (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 77 (11), 6568-6570). CHAPS is 0.1-10 mg / mg CRP
Use in amounts in the range.

【００２４】糖および界面活性剤から選択した少なくと
も一種の添加物を添加したCRP溶液は、好ましくは中性p
Hの適当な緩衝液、例えば、50 MのTris塩酸緩衝液中
で、限外濾過により濃縮する。糖および界面活性剤から
選択される添加物を添加することによりCRPの沈澱が防
止されるので、CRPの濃度を10 mg/ml程度まで濃縮する
ことができる。The CRP solution to which at least one additive selected from sugar and surfactant is added is preferably a neutral p-type solution.
Concentrate by ultrafiltration in a suitable buffer of H, eg, 50 M Tris-HCl buffer. Addition of an additive selected from sugar and a surfactant prevents precipitation of CRP, so that the concentration of CRP can be concentrated to about 10 mg / ml.

【００２５】エンドトキシンの吸着除去 エンドトキシンは、非常に安定な物質であり、オートク
レーブなどの極端な温度や極端なpH値（4未満または10
以上）にも安定であるため、一般にはクロマトグラフィ
ー等の吸着法によって除去されている。現在、エンドト
キシン除去のための媒体が数多く知られており、商業的
にも入手可能である。例えば陰イオン交換ポリマーマト
リックス（Hou, K.C., and Zaniewski, R. (1990) Biot
echnol.Appl. Biochem. 12, 315-324）、キトサンアフ
ィニティーゲル（（Ida, J., etal., (1991) Polym. Pr
eprints Jpn. 40(3), 1082; Adachi, T., et al., (199
1) Nippon Nougeikagaku Kaishi, Jan. 65(3), 174））
およびヒスチジン固定セファロース（Matsumae, H., et
al., (1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12,129-14
0）はエンドトキシンの有用な吸着手段である。本発明
においては、エンドトキシンを吸着することができる吸
着手段であればいずれを使用してもよい。また、現在利
用可能である上述したエンドトキシン吸着手段に限定さ
れるものではない。 Endotoxin adsorption and removal Endotoxin is a very stable substance, and is used in extreme temperatures and pH values (such as less than 4 or 10
As described above, since it is stable, it is generally removed by an adsorption method such as chromatography. At present, many media for removing endotoxin are known and commercially available. For example, an anion exchange polymer matrix (Hou, KC, and Zaniewski, R. (1990) Biot
echnol. Appl. Biochem. 12, 315-324), chitosan affinity gel ((Ida, J., etal., (1991) Polym. Pr.
eprints Jpn. 40 (3), 1082; Adachi, T., et al., (199
1) Nippon Nougeikagaku Kaishi, Jan. 65 (3), 174))
And histidine-fixed Sepharose (Matsumae, H., et.
al., (1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12,129-14
0) is a useful means of adsorbing endotoxin. In the present invention, any adsorption means capable of adsorbing endotoxin may be used. Further, the present invention is not limited to the above-mentioned endotoxin adsorbing means currently available.

【００２６】十分に濃縮された前述のCRP溶液を、例え
ばカラムクロマトグラフィーを用いて、吸着剤で処理し
て、エンドトキシンを吸着剤に吸着させることにより除
去する。吸着用の緩衝液成分は、使用する吸着剤に応じ
て選択するが、好ましい吸着剤としてキトサンゲルを用
いるときは、50 mM酢酸緩衝液（0.15 M NaCl、10 mMCaC
l₂、pH 5.9）を用いることが好ましい。The above-mentioned sufficiently concentrated CRP solution is treated with an adsorbent using, for example, column chromatography, and the endotoxin is removed by adsorption onto the adsorbent. The buffer component for adsorption is selected according to the adsorbent to be used. When chitosan gel is used as a preferable adsorbent, 50 mM acetate buffer (0.15 M NaCl, 10 mM CaC
l ₂ , pH 5.9) is preferred.

【００２７】濃縮したCRP溶液は、吸着剤で処理する前
に吸着用の緩衝液に対して透析し、糖および界面活性剤
を十分に除去することが望ましい。CRPが吸着剤に吸着
する場合、CRPを吸着剤から溶出する溶出液は吸着剤に
応じて適宜選択する。この場合、例えばCRP活性またはO
D280 nmでモニターしながら、CRP活性を有する画分を回
収する。一方、CRPが吸着剤に吸着しない場合には、流
出画分から回収される。この場合、CRPは、例えばCRP活
性またはOD280 nmでモニターしながら、流出画分から回
収する。活性測定法は後述する。回収したCRP画分につ
いて、エンドトキシンが減少していることを後述の方法
で確認する。It is desirable that the concentrated CRP solution be dialyzed against an adsorbent buffer before being treated with an adsorbent to sufficiently remove sugars and surfactants. When CRP is adsorbed on the adsorbent, the eluate that elutes CRP from the adsorbent is appropriately selected according to the adsorbent. In this case, for example, CRP activity or O
The fraction having CRP activity is collected while monitoring at D280 nm. On the other hand, when CRP does not adsorb to the adsorbent, it is recovered from the effluent fraction. In this case, CRP is recovered from the effluent fraction, monitoring for example CRP activity or OD 280 nm. The activity measurement method will be described later. The collected CRP fraction is confirmed to have a reduced endotoxin by the method described below.

【００２８】本発明の好ましい態様においては、エンド
トキシンはCRP調製物から実質的に除去する。実質的に
除去されているとは、例えば、エンドトキシン含量がCR
P 1mg当たり100 EU以下であることをいう。1回の吸着剤
処理では実質的なエンドトキシン除去が達せられないと
きは、再度CRP画分を糖、界面活性剤および安定化剤か
ら選択される添加物の存在下で濃縮し、吸着剤による処
理をエンドトキシンが十分除去されるまで繰り返すこと
ができる。In a preferred embodiment of the present invention, endotoxin is substantially removed from the CRP preparation. Substantially removed means that the endotoxin content is CR
P means 100 EU or less per mg. If substantial endotoxin removal cannot be achieved by one adsorbent treatment, the CRP fraction is again concentrated in the presence of additives selected from sugars, surfactants and stabilizers, and treated with the adsorbent. Can be repeated until the endotoxin is sufficiently removed.

【００２９】吸着剤処理を繰り返す場合、一度使用した
吸着剤を再生して使用することもできる。キトサンゲル
は物理化学的強度のために、吸着剤の再生が容易であ
る。再生は、例えば、0.5 N NaOH水溶液の4倍量をキト
サンゲルカラムに流した後、エンドトキシンを含まない
水および緩衝液で洗浄する方法で行う。When the adsorbent treatment is repeated, the adsorbent used once can be regenerated and used. Chitosan gel is easy to regenerate the adsorbent due to its physicochemical strength. The regeneration is performed by, for example, flowing a 4-fold amount of a 0.5 N NaOH aqueous solution through a chitosan gel column, and then washing with a water and buffer solution containing no endotoxin.

【００３０】精製後のエンドトキシンを実質的に含まな
いCRP組成物は、その後、水溶液の状態、または乾燥し
た状態のいずれで保存してもよい。水溶液は、そのまま
の濃度で使用してもよく、あるいは水溶液を限外濾過、
透析、ゲル濾過などの方法により溶液中のCRP濃度を濃
縮してもよい。さらに、そのような濃縮を行うか否かに
かかわらず、CRP溶液中のCRPが凝集し、沈澱することを
防止するため、糖、界面活性剤および安定化剤から選択
される少なくとも一つの添加剤を添加してもよい。糖お
よび／または界面活性剤はエンドトキシンの除去のため
の精製時に添加したものと同じであってもよく、必要に
応じて、その他の糖および／または界面活性剤に変更し
てもよい。[0030] The purified endotoxin-free CRP composition may then be stored either in the form of an aqueous solution or in a dried state. The aqueous solution may be used at the same concentration, or the aqueous solution may be subjected to ultrafiltration,
The CRP concentration in the solution may be concentrated by a method such as dialysis or gel filtration. Further, regardless of whether such concentration is performed or not, at least one additive selected from sugars, surfactants and stabilizers to prevent CRP in the CRP solution from aggregating and precipitating. May be added. The sugar and / or surfactant may be the same as that added during purification for removal of endotoxin, and may be changed to another sugar and / or surfactant as necessary.

【００３１】安定化剤は、CRP分子を水溶液中で安定化
するために役立つと考えられる。本発明で使用する安定
化剤は、本発明のCRP組成物を生体に投与する可能性を
考慮して、生物材料中に含まれるものであることが好ま
しい。このような安定化剤としては、血清成分があり、
例えば、血清アルブミン、ガンマグロブリンなどを使用
することができる。It is believed that the stabilizer serves to stabilize the CRP molecule in aqueous solution. The stabilizer used in the present invention is preferably contained in a biological material in consideration of the possibility of administering the CRP composition of the present invention to a living body. Such stabilizers include serum components,
For example, serum albumin, gamma globulin and the like can be used.

【００３２】エンドトキシンを実質的に除去したCRP
は、保存、取扱いなどの容易さの観点から、乾燥した状
態で提供することが好ましい。そのためには、凍結乾
燥、蒸発乾固、噴霧乾燥などの方法を使用することがで
きる。好ましくは凍結乾燥により粉末化する。粉末の状
態で提供されるCRPを使用する場合には、使用者が適当
な溶媒、たとえば水に溶解して使用する。本発明におい
ては、粉末の状態にしたとき水に溶解可能な状態を保つ
ため、糖、界面活性剤および安定化剤から選択される少
なくとも一種の添加物を使用することが特徴である。ト
レハロース、CHAPS及び血清アルブミンまたはガンマグ
ロブリンは生体に対する安全性が高いため、その点から
もCRPの添加に適している。これらはそれぞれ、0.1〜10
mg/mg CRP、0.1〜10 mg/mg CRPおよび0.1〜1000 mg/mg
CRPの量でCRPに添加される。CRP from which endotoxin has been substantially removed
Is preferably provided in a dry state from the viewpoint of easiness of storage and handling. For this purpose, methods such as freeze drying, evaporation to dryness, and spray drying can be used. Preferably, the powder is formed by freeze-drying. When using the CRP provided in the form of a powder, the user dissolves it in a suitable solvent, for example, water, and uses it. The present invention is characterized in that at least one kind of additive selected from sugar, surfactant and stabilizer is used in order to maintain a state of dissolving in water when powdered. Trehalose, CHAPS and serum albumin or gamma globulin are highly safe for living organisms and are therefore suitable for the addition of CRP. These are 0.1 to 10 respectively.
mg / mg CRP, 0.1-10 mg / mg CRP and 0.1-1000 mg / mg
Added to CRP in the amount of CRP.

【００３３】上記の精製作業は、エンドトキシンが外部
から混入することを防止するため、十分に洗浄された器
具、キトサンゲル、材料を用いて行われることは、当業
者に明らかであろう。好ましくは、すべての作業はタン
パク質の失活や微生物の繁殖をさけるために低温で行わ
れる。It will be apparent to those skilled in the art that the above-mentioned purification operation is performed using well-washed instruments, chitosan gels, and materials to prevent endotoxin from being contaminated from the outside. Preferably, all operations are performed at low temperatures to avoid protein inactivation and microbial growth.

【００３４】CRP活性の測定 精製後のCRP組成物がCRP活性を有するか否かを調べるた
め、CRPのホスホリルコリン（PC）結合アッセイを行
う。CRPはPCと特異的に結合することが知られている。
この特性を利用し、CRPが活性を維持しているか否かに
ついて調べる。CRPのPCに対する結合活性は、解離増感
ランタノイド蛍光イムノアッセイ（Dissociation-enhan
ced lanthanide fluorescent immunoassay, DELFIA）法
（Guzaeva, T.V., et al., (1993) Immunology Lett. 3
5, 285-290）により測定する。精製中にCRPのタンパク
質高次構造が崩れた場合には、PC結合活性は極端に減少
し、高次構造が維持されていれば、PC結合活性も維持さ
れる。 Measurement of CRP Activity In order to examine whether or not the purified CRP composition has CRP activity, a phosphorylcholine (PC) binding assay of CRP is performed. CRP is known to specifically bind to PC.
By utilizing this property, it is examined whether or not CRP maintains the activity. The binding activity of CRP to PC was determined by dissociation-sensitized lanthanoid fluorescence immunoassay (Dissociation-enhan
ced lanthanide fluorescent immunoassay, DELFIA) (Guzaeva, TV, et al., (1993) Immunology Lett. 3)
5, 285-290). When the protein higher-order structure of CRP is disrupted during purification, the PC-binding activity is extremely reduced, and if the higher-order structure is maintained, the PC-binding activity is also maintained.

【００３５】CRPのPC結合活性を測定するDELFIA法は、E
LISAプレート上にPC−BSAを固定化し、それに結合する
ことができるCRPをEu³⁺標識した抗CRP抗体（1 mol IgG
あたり9 mol Eu³⁺）により検出する測定方法により行
う。ここで、PC-BSAとは、BSAのアミノ基をPC基により
置換して結合させたタンパク質複合体をいう。BSA上に
結合するPCの数に従い、例えば7分子のPCが結合したBSA
はPC₇-BSAのように表記する。The DELFIA method for measuring the PC binding activity of CRP is based on E
PC-BSA was immobilized on a LISA plate, and a CRP capable of binding thereto was Eu ^{3 +} -labeled anti-CRP antibody (1 mol IgG
Per 9 mol Eu ³⁺ ). Here, PC-BSA refers to a protein complex in which the amino group of BSA is substituted with a PC group and bound. According to the number of PCs bound on BSA, for example, 7 molecules of PC-bound BSA
Is written as PC ₇ -BSA.

【００３６】エンドトキシン測定 ゲル凝集試験用に凍結乾燥したカブトガニ遊走細胞溶解
物（LAL）を二回蒸留水（double-distilled water）で
溶解し、10 x 75 mmガラス試験管中で、同体積（0.1 m
l）の試料溶液またはエンドトキシン標準溶液と混合す
る。それぞれのアッセイにはエンドトキシン標準の2倍
希釈系列、試験試料および二回蒸留水（陰性コントロー
ル)が含まれる。次いで内容物を穏やかに混合し、試験
管を37℃で正確に1時間インキュベーションした後、そ
れぞれの試験管でゲル化が起きているか調べる。この方
法によれば、陽性反応は、試験管を逆さにしたとき視覚
的に検出可能なゲルフィルムがあることにより示される
（Young, N.S., et al., (1972) J. Clin. Investig. 5
1, 1790-1797）。大腸菌由来のエンドトキシン1 ngから
の希釈列はFDAが定義する10 EUと等価であることを示し
ており、これを標準として用いる。 Endotoxin determination The lysate of a horseshoe crab migrating cell (LAL) lyophilized for a gel agglutination test was dissolved in double-distilled water, and the same volume (0.1 ml) was placed in a 10 x 75 mm glass test tube. m
Mix with l) sample solution or endotoxin standard solution. Each assay includes a two-fold dilution series of an endotoxin standard, test samples and double distilled water (negative control). The contents are then mixed gently and the tubes are incubated at 37 ° C. for exactly 1 hour before checking for gelation in each tube. According to this method, a positive reaction is indicated by the presence of a visually detectable gel film when the tube is inverted (Young, NS, et al., (1972) J. Clin. Investig. 5
1, 1790-1797). A dilution series from 1 ng of endotoxin from E. coli shows that it is equivalent to 10 EU defined by the FDA and uses this as a standard.

【００３７】[0037]

【効果】本発明の方法により得られた実質的にエンドト
キシンを含まない、水溶性の組換えCRP組成物を調製す
ることができる。本発明の方法により、発熱応答などを
起こすことなく生物に投与することができる水溶性の組
換えCRP組成物を調製することができる。EFFECTS A water-soluble recombinant CRP composition substantially free of endotoxin obtained by the method of the present invention can be prepared. According to the method of the present invention, a water-soluble recombinant CRP composition that can be administered to an organism without causing a fever response or the like can be prepared.

【００３８】[0038]

【実施例】以下、エンドトキシンを実質的に含まない組
換えCRP組成物についての本発明を、エンドトキシン吸
着手段としてキトサンゲルを使用した場合を例にして説
明する。EXAMPLES Hereinafter, the present invention for a recombinant CRP composition substantially free of endotoxin will be described using chitosan gel as an endotoxin adsorption means as an example.

【００３９】本発明において使用した材料は、次の通り
である。大腸菌で発現し、140 mM NaCl、2 mM CaCl₂お
よび0.05% NaN₃を含む20 mM Tris-HCl（pH 7.5）溶液中
に0.9 mg/ml含まれる溶液とした組換えC反応性タンパク
質（CRP）、および抗ヒトCRPポリクローナルウサギIgG
はオリエンタル酵母株式会社(日本)より入手した。The materials used in the present invention are as follows. Recombinant C-reactive protein (CRP) expressed in E. coli and contained as a 0.9 mg / ml solution in 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 140 mM NaCl, 2 mM CaCl ₂ and 0.05% NaN ₃ , And anti-human CRP polyclonal rabbit IgG
Was obtained from Oriental Yeast Co., Ltd. (Japan).

【００４０】架橋したキトサンアフィニティーゲル（Ku
remover II、Kurita Eng社）はフナコシ（日本）から入
手した。塩化ホスホリルコリン（PC）（カルシウム
塩）、トレハロース二水和物（Glcα1‐1αGlc）、3-
[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパ
ンスルホン酸塩（CHAPS）、ジメチルグルタル酸、フタ
ル酸水素カリウム、およびTriton X-100はSigma Chem.
社（St. Louis, MO）より入手した。Cross-linked chitosan affinity gel (Ku
remover II, Kurita Eng) was obtained from Funakoshi (Japan). Phosphorylcholine chloride (PC) (calcium salt), trehalose dihydrate (Glcα1-1αGlc), 3-
[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), dimethylglutaric acid, potassium hydrogen phthalate, and Triton X-100 are available from Sigma Chem.
(St. Louis, MO).

【００４１】N¹-(p-イソチオシアネートベンジル) -ジ
エチレントリアミン-N¹,N²,N³,N³-四酢酸（DETATA-IT
C）はWallac社（Gaithersburg, MD）より、96穴マイク
ロプレート（カタログ番号#21-377-204）はFisher Scie
ntific社（Springfield, NJ）より入手した。N ^1- (p-isothiocyanate benzyl) -diethylenetriamine-N ¹ , N ² , N ³ , N ³ -tetraacetic acid (DETATA-IT
C) from Wallac (Gaithersburg, MD), 96-well microplate (Cat. # 21-377-204) from Fisher Scie
Obtained from ntific (Springfield, NJ).

【００４２】硝酸ユーロピウム、1-(β-ナフトイル)-3,
3,3-トリフルオロアセトン（β-NTA）、トリオクチルホ
スフィンオキシド（TOPO）、ジエチレントリアミン-N¹,
N²,N ³-五酢酸（DTPA）およびその二無水物（DTPAa）はA
ldrich Chem.社（Milwaukee,WI）より入手した。Europium nitrate, 1- (β-naphthoyl) -3,
3,3-trifluoroacetone (β-NTA), trioctylpho
Sphine oxide (TOPO), diethylenetriamine-N¹,
N^Two, N ^Three-Pentaacetic acid (DTPA) and its dianhydride (DTPAa) are A
Obtained from ldrich Chem. (Milwaukee, WI).

【００４３】ポリビニルベンジルラクトノイルアミド
（PVLA）はKazukiyo Kobayashi博士（名古屋大学）より
寄贈された。大腸菌細胞壁エンドトキシンを含むカブト
ガニ（Limulus）遊走細胞溶解物（LAL）発熱物質ゲル凝
固試験キット（感度は0.06 EUエンドトキシン/ml）はBi
oWhittaker, Inc.（Walkersville, MD）より購入した。Polyvinylbenzyllactonoylamide (PVLA) was donated by Dr. Kazukiyo Kobayashi (Nagoya University). Limulus migrating cell lysate (LAL) pyrogen gel coagulation test kit (sensitivity 0.06 EU endotoxin / ml) containing E. coli cell wall endotoxin is Bi
o Purchased from Whitaker, Inc. (Walkersville, MD).

【００４４】実施例１：DELFIA法によるCRPの活性測定 解離増感溶液 解離増感溶液は、フタル酸水素カリウムでpH 3.2に調整
した0.1 M酢酸を15μMβ-NTA、50μM TOPOおよび0.1%
（w/v） Triton X-100になるように調製した（Hemmila,
I., et al., (1984) Anal. Biochem. 137, 335-34
3）。 Example 1 Measurement of CRP Activity by DELFIA Dissociation Sensitization Solution The dissociation sensitization solution was prepared by adding 0.1 M acetic acid adjusted to pH 3.2 with potassium hydrogen phthalate to 15 μM β-NTA, 50 μM TOPO and 0.1%
(W / v) Triton X-100 was prepared (Hemmila,
I., et al., (1984) Anal. Biochem. 137, 335-34
3).

【００４５】マイクロタイタープレート ウシ血清アルブミン（BSA）およびホスホリルコリン（P
C）の結合体であるPC_{5 8}-BSAは、記載された通りに調製
した（Stults, N., et al., (1987) Anal. Biochem. 16
1, 567-573）。マイクロタイタープレートを、上述の方
法により作成したPC-BSAによりコーティングした。PC-B
SAはそのままでは固相上への固定化が困難であったの
で、PVLA法（Suzuki, N., et al., (1997) Anal. Bioch
em. 247, 412-416）を用いてマイクロタイタープレート
のウェルに固定した。 Microtiter plate Bovine serum albumin (BSA) and phosphorylcholine (P
PC _{5 8-BSA} is a conjugate of C) were prepared as described (Stults, N., et al. , (1987) Anal. Biochem. 16
1, 567-573). Microtiter plates were coated with PC-BSA made by the method described above. PC-B
Since SA was difficult to immobilize on a solid phase as it was, the PVLA method (Suzuki, N., et al., (1997) Anal. Bioch
em. 247, 412-416) using microtiter plates.

【００４６】PVLA法を用いてPC-BSAを固定する場合、コ
ーティングレベルはPC-BSAの使用量が100 ng／ウェルに
なるまでは、使用量に応じて増加した。したがって、PV
LA法には常時、PC-BSA 100 ngを用いた。When PC-BSA was immobilized using the PVLA method, the coating level increased with the use of PC-BSA until the use of PC-BSA reached 100 ng / well. Therefore, PV
In the LA method, 100 ng of PC-BSA was always used.

【００４７】予備試験を行った後、バックグラウンドカ
ウントが最小になるように、Eu³⁺標識した抗CRP IgG（2
0 ng IgG、1 pmol Eu³⁺／ウェル）またはPC₃₅-BSA（20
ng BSA、1.8 pmol Eu³⁺／ウェル）レベルを選択した。After the preliminary test, the Eu ^{3 +} -labeled anti-CRP IgG (2
0 ng IgG, 1 pmol Eu ³⁺ / well or PC ₃₅ -BSA (20
ng BSA, 1.8 pmol Eu ³⁺ / well) level.

【００４８】DELFIA法によるCRP測定 CRPの活性が維持されていることを、CRPのホスホリルコ
リン（PC）結合アッセイにより調べた。CRPのPCに対す
る結合活性は、PC-BSAコーティングELISAプレート上
で、Eu³⁺標識した抗CRP抗体（1 mol IgGあたり9 mol Eu
³⁺）を用い、DELFIA法により測定した。 CRP Measurement by DELFIA Method The maintenance of CRP activity was examined by CRP phosphorylcholine (PC) binding assay. The binding activity of CRP to PC was determined by using an Eu ^{3 +} -labeled anti-CRP antibody (9 mol Eu / mol IgG) on a PC-BSA-coated ELISA plate.
³⁺ ) was measured by the DELFIA method.

【００４９】PC₅₈-BSAでコーティングし、その後バック
グラウンドを抑えるためBSAでコーティングしたマイク
ロタイターウェルを、0.15 M NaCl、10 mM CaCl₂を含む
50 mM Tris-HCl（pH 7.6）で洗浄し、100μlのCRP溶液
（0.15 M NaCl、10 mM CaCl₂および0.02% Tween 20を含
む50 mM Tris-Tween（pH 7.6）中、5 ng CRP）中で室温
で2時間インキュベーションした。CRP溶液を除いた後、
ウェルをTris-Tween緩衝液で6回洗浄した。20 ngのEu³⁺
標識した抗CRP抗体（1 mol IgGあたり9 mol Eu ³⁺）を含
む100μlのTris-Tween緩衝液をウェルに加え、プレート
を室温で2時間インキュベーションした。抗体溶液を除
いた後、ウェルをTris-Tween緩衝液で6回洗浄し、200μ
lの増感溶液を加え、混合物を室温で15分インキュベー
ションした後、Eu³⁺蛍光カウント（cps）を測定した。
この結果、5 ng CRP/ウェルまで測定できた。[0049] PC₅₈-Coated with BSA, then back
Microphone coated with BSA to reduce ground
Rotate wells with 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl_Twoincluding
After washing with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 μl of CRP solution
(0.15 M NaCl, 10 mM CaCl_TwoAnd 0.02% Tween 20
Room temperature in 50 mM Tris-Tween (pH 7.6), 5 ng CRP)
For 2 hours. After removing the CRP solution,
Wells were washed six times with Tris-Tween buffer. 20 ng Eu³⁺
Labeled anti-CRP antibody (9 mol Eu per 1 mol IgG) ³⁺)
Add 100 μl Tris-Tween buffer to the wells and plate
Was incubated at room temperature for 2 hours. Remove antibody solution
After washing, the wells were washed 6 times with Tris-Tween buffer, 200 μl
l of sensitizing solution and incubate the mixture at room temperature for 15 minutes.
And then Eu³⁺The fluorescence count (cps) was measured.
As a result, measurement was possible up to 5 ng CRP / well.

【００５０】実施例２：組換えCRPの活性測定 濃縮・凍結乾燥後のCRP活性 0.14 M NaCl、2 mM CaCl₂および0.002% NaN₃を含む20 m
M Tris-HCl（pH 7.5）中のCRP（0.9 mg/ml）を、遠心分
離（10,000 x 20分）し、沈殿を除き、上清を1.5%トレ
ハロースおよび0.1% CHAPSを含むよう調製した。CRP溶
液はトレハロースおよびCHAPSの存在下で、Amicon型攪
拌細胞限外ろ過装置で、体積がおよそ15分の１になるま
で濃縮した。さらにこの濃縮CRP溶液を凍結乾燥して粉
末にして、凍結乾燥前と同体積の水に溶解した。濃縮時
及び凍結融解した後のCRPのPC結合活性を、沈殿を遠心
分離で除いた後に測定した。5 ngのCRPをPC-BSA固定ウ
ェルに加え、20 ngのEu³⁺標識した抗CRP抗体を用いてPC
結合活性を測定した。その結果、タンパク質のうち総CR
Pタンパク質の5％未満であり、比活性は天然CRPと同じ
であった（図1）。 Example 2: Activity measurement of recombinant CRP CRP activity after concentration and lyophilization 20 ml containing 0.14 M NaCl, 2 mM CaCl ₂ and 0.002% NaN ₃
CRP (0.9 mg / ml) in M Tris-HCl (pH 7.5) was centrifuged (10,000 × 20 minutes) to remove the precipitate, and the supernatant was prepared to contain 1.5% trehalose and 0.1% CHAPS. The CRP solution was concentrated in the presence of trehalose and CHAPS with an Amicon-type stirred cell ultrafiltration device until the volume was reduced to about 1/15. The concentrated CRP solution was freeze-dried to a powder, and dissolved in the same volume of water as before freeze-drying. The PC binding activity of CRP at the time of concentration and after freeze-thawing was measured after removing the precipitate by centrifugation. Add 5 ng of CRP to PC-BSA fixed wells and add 20 ng of Eu ³⁺ labeled anti-CRP antibody to PC.
Binding activity was measured. As a result, the total CR
It was less than 5% of the P protein and the specific activity was the same as native CRP (FIG. 1).

【００５１】凍結・融解後のCRP活性 0.14 M NaCl、2 mM CaCl₂および0.002% NaN₃を含む20 m
M Tris-HCl（pH 7.5）中のCRP（0.9 mg/ml）を上述のよ
うに体積がおよそ10分の１になるまで濃縮し、遠心分離
（10,000 x 20分）して沈殿を除いた。1.5%(w/v)トレハ
ロースおよび1.5%(w/v) CHAPSを含むまたは含まない状
態で、濃縮CRP溶液を‐20℃で凍結し、凍結CRP溶液を室
温で融解した。凍結融解サイクルを繰り返した後、可溶
性タンパク質濃度およびPC結合活性を、それぞれBCA法
およびDELFIA法で測定した。-20℃での凍結及び室温で
の融解を20回繰り返すと、トレハロースおよびCHAPSを
含まない場合、タンパク質のうち総CRPタンパク質の9％
が沈澱した（表1）。可溶性CRPのPC結合活性は、凍結融
解サイクル前の天然CRPと同じであった（図2）。 CRP activity after freezing and thawing 20 ml containing 0.14 M NaCl, 2 mM CaCl ₂ and 0.002% NaN ₃
CRP (0.9 mg / ml) in M Tris-HCl (pH 7.5) was concentrated to approximately 1/10 volume as described above and centrifuged (10,000 x 20 minutes) to remove the precipitate. The concentrated CRP solution was frozen at -20 ° C with or without 1.5% (w / v) trehalose and 1.5% (w / v) CHAPS, and the frozen CRP solution was thawed at room temperature. After repeated freeze-thaw cycles, the soluble protein concentration and PC binding activity were measured by the BCA and DELFIA methods, respectively. Freezing at -20 ° C and thawing at room temperature 20 times gives 9% of the total CRP protein of the protein without trehalose and CHAPS.
Precipitated (Table 1). The PC binding activity of soluble CRP was the same as native CRP before the freeze-thaw cycle (FIG. 2).

【００５２】[0052]

【表１】 [Table 1]

【００５３】CRP活性に対するpHの影響 CRP（10μg/ml）を、0.15 M NaCl、10 mM CaCl₂および
0.02% Tween 20を含む50 mM酢酸ナトリウム（pH 3から6
の場合）または0.15 M NaCl、10 mM CaCl₂および0.02%
Tween 20を含む50 mM Tris-HCl（pH7から9の場合）に加
えた。緩衝液を望ましいpHに調整するには、pH 3から6
については酢酸ナトリウムを、pH 7から9についてはTri
s-HClを用いた。異なるpHのCRPを1晩室温でインキュベ
ーションした後、0.1 M Tris-HClおよび水でpH 7.6に調
整した。CRPの最終濃度は100 ng/mlであり、種々のpHで
のCRPのPC結合活性およびpH 7.6に調整した後のCRPのPC
結合活性を測定した。 Effect of pH on CRP Activity CRP (10 μg / ml) was tested with 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl ₂ and
50 mM sodium acetate containing 0.02% Tween 20 (pH 3-6
Or 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl ₂ and 0.02%
It was added to 50 mM Tris-HCl containing Tween 20 (for pH 7 to 9). To adjust the buffer to the desired pH, pH 3-6
For sodium acetate and for pH 7 to 9 Tri
s-HCl was used. Different pH CRPs were incubated overnight at room temperature and then adjusted to pH 7.6 with 0.1 M Tris-HCl and water. The final concentration of CRP was 100 ng / ml, the PC binding activity of CRP at various pHs and the PC of CRP after adjusting to pH 7.6.
Binding activity was measured.

【００５４】pH 5から9でインキュベーションしたCRPの
PC結合活性は安定していた（図3）。しかし、pH 3また
は4でのCRPの活性はpH 7.6の活性と比較して95%以上失
活した。pHを7.6に再調整した場合、pH 3または4に曝露
された試料は、pH 7.6に保ち続けた試料の活性に対し
て、それぞれ10%および30%の活性を示した。CRP incubated at pH 5 to 9
The PC binding activity was stable (FIG. 3). However, the activity of CRP at pH 3 or 4 was inactivated by more than 95% compared to the activity at pH 7.6. When the pH was readjusted to 7.6, the samples exposed to pH 3 or 4 showed 10% and 30% activity, respectively, relative to the activity of the sample kept at pH 7.6.

【００５５】高濃度の酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.9）
を添加して、CRP溶液（10 mg/ml）をpH 7.6からpH 5.9
に調整すると、CRPの30‐40％が沈殿した。これとは対
照的に、CRP溶液の緩衝液を透析を用いてpH 7.6からpH
5.9に交換すると、CRPの沈殿は5％未満に抑制すること
ができた。Highly concentrated sodium acetate buffer (pH 5.9)
To adjust the CRP solution (10 mg / ml) from pH 7.6 to pH 5.9.
Adjusted to 30-40% of the CRP precipitated. In contrast, the buffer of the CRP solution was adjusted to pH 7.6 using dialysis.
When replaced with 5.9, the precipitation of CRP could be suppressed to less than 5%.

【００５６】実施例３：沈澱中CRPの活性 本発明の工程中のいずれかで形成された沈殿CRPは、遠
心分離（10,000 g x 20分）により除いた。これらの不
溶性CRP（およそ400 mgタンパク質）は、8 M尿素を加え
た0.15 M NaClおよび10 mM CaCl₂を含む50 mM Tris-HCl
（pH 7.6）100 ml中で、室温で6時間穏やかに攪拌する
ことで完全に溶解した。溶解したCRPを50 mM Tris-HCl
（pH 7.6）で透析して尿素を除いた後、新たに形成され
た沈殿を遠心分離で除き、回収したタンパク質の濃度お
よびPC結合活性を測定した。溶液から透析により尿素を
除くことにより80%以上のCRPが再沈殿し、活性型CRP
は、一度沈澱したCRPを再溶解したもののうち12.5%（お
よそ50 mgタンパク質）しか回収されなかった。しか
し、回収された活性型CRPのPC結合活性は、非沈殿CRPと
同じ比活性を示した（図４）。 Example 3 Activity of CRP during Precipitation Precipitated CRP formed during any of the steps of the present invention was removed by centrifugation (10,000 g × 20 minutes). These insoluble CRPs (approximately 400 mg protein) consist of 50 mM Tris-HCl with 0.15 M NaCl and 10 mM CaCl ₂ plus 8 M urea.
It was completely dissolved in 100 ml of (pH 7.6) by gentle stirring at room temperature for 6 hours. Dissolve the dissolved CRP in 50 mM Tris-HCl
After dialysis (pH 7.6) to remove urea, the newly formed precipitate was removed by centrifugation, and the concentration of the recovered protein and the PC binding activity were measured. By removing urea from the solution by dialysis, more than 80% of CRP is reprecipitated and activated CRP
Recovered only 12.5% (approximately 50 mg protein) of the redissolved CRP once precipitated. However, the PC binding activity of the recovered activated CRP showed the same specific activity as that of the non-precipitated CRP (FIG. 4).

【００５７】実施例４：エンドトキシンを含まないCRP
組成物の調製 エンドトキシン吸着剤の選択 本発明者らは、上述した使用可能な吸着媒体のうち、物
理的堅牢性および再生処理のための耐化学性が優れてお
り吸着容量が比較的高いことからキトサンゲルを選択
し、使用した。本実施例では商業的に入手可能なキトサ
ンアフィニティーゲル（Ida, J., et al., (1991) Poly
m. Preprints Jpn. 40(3), 1082; Adachi,T., et al.,
(1991) Nippon Nougeikagaku Kaishi, Jan. 65(3), 17
4）を使用し、大腸菌で発現された組換えヒトCRPから、
低エンドトキシンCRPを得る方法を記載する。 Example 4: CRP without endotoxin
Preparation of the composition Selection of the endotoxin adsorbent The present inventors have found that among the usable adsorption media mentioned above, the physical robustness and the chemical resistance for regeneration treatment are excellent and the adsorption capacity is relatively high. Chitosan gel was selected and used. In this example, commercially available chitosan affinity gel (Ida, J., et al., (1991) Poly
m. Preprints Jpn. 40 (3), 1082; Adachi, T., et al.,
(1991) Nippon Nougeikagaku Kaishi, Jan. 65 (3), 17
4) From recombinant human CRP expressed in E. coli using
A method for obtaining low endotoxin CRP is described.

【００５８】キトサン（β(1-4)-ポリ-N-アセチル-グル
コサミン）ゲルは架橋され、2‐3 meqアミノ基/ml湿ゲ
ルを有し（Ida, J., et al., (1991) Polym. Preprints
Jpn.40(3), 1082）、同様の官能基を持つその他のゲ
ル、例えばヒスチジン固定多糖（Matsumae, H., et a
l., (1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12, 129-14
0）、陰イオン交換ポリマーマトリックス（Hou, K.C.,
and Zaniewski, R. (1990)Biotechnol. Appl. Biochem.
12, 315-324）、およびポリ(γ-メチルL-グルタミン
酸)球体粒子（Hirayama, C., et al., (1992) Chem. Ph
arm. Bull. 40(8), 2106-2109; Sakata, M., et al.,
(1996) Chem. Pharm. Bull. 44(2), 328-332）などより
も堅い吸着剤である。このため、より迅速な溶出が可能
となり、再生に必要な極端なpHといった厳しい条件に対
しても高い耐久性を示す。The chitosan (β (1-4) -poly-N-acetyl-glucosamine) gel is crosslinked and has 2-3 meq amino groups / ml wet gel (Ida, J., et al., (1991) ) Polym. Preprints
Jpn. 40 (3), 1082), other gels with similar functional groups, such as histidine immobilized polysaccharides (Matsumae, H., et a.
l., (1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12, 129-14
0), anion exchange polymer matrix (Hou, KC,
and Zaniewski, R. (1990) Biotechnol. Appl. Biochem.
12, 315-324), and poly (γ-methyl L-glutamic acid) spherical particles (Hirayama, C., et al., (1992) Chem. Ph.
arm. Bull. 40 (8), 2106-2109; Sakata, M., et al.,
(1996) Chem. Pharm. Bull. 44 (2), 328-332). For this reason, more rapid elution becomes possible, and high durability is exhibited even under severe conditions such as extreme pH required for regeneration.

【００５９】キトサンアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いたエンドトキシンの除去 界面活性剤として、本実施例においてはCHAPSを選択し
た。組換えCRP溶液（0.14 M NaClおよび2 mM CaCl₂を含
む20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中、0.9 mg/mlのCRP）を1.
5%トレハロースおよび0.15% CHAPSを含むように調製
し、CRPの最終濃度がおよそ10 mg/mlになるよう、限外
ろ過で濃縮した。濃縮CRPは0.15 M NaClおよび10 mM Ca
Cl₂を含む50 mM酢酸緩衝液（pH 5.9）に対して透析を行
い、30 mlの酢酸緩衝液中に300 mgの組換えCRPを含む溶
液を得た。これをキトサンゲルカラム（50 ml、2 x 15
cmのカラムに詰めたもの）にアプライし、次いで0.15 M
NaClおよび10 mM CaCl₂を含む50 mM酢酸緩衝液（pH 5.
9）を用いて溶出した。流速は10 ml/時間で、5 mlの分
画を回収した。タンパク質溶出プロフィールは、280 nm
の吸光度により測定した。溶出したCRP溶液についてキ
トサンゲルカラムでのエンドトキシン除去をさらに3回
繰り返したところ、エンドトキシン濃度は10 EU/mgタン
パク質未満になった。すなわち、エンドトキシンを実質
的に含まないCRPが得られた。 Chitosan affinity chromatography
CHAPS was selected as a surfactant in this example as a surfactant for removing endotoxin by using a surfactant. Recombinant CRP solution (0.9 mg / ml CRP in 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.14 M NaCl and 2 mM CaCl ₂ ) 1.
Prepared to contain 5% trehalose and 0.15% CHAPS and concentrated by ultrafiltration to a final CRP concentration of approximately 10 mg / ml. Concentrated CRP is 0.15 M NaCl and 10 mM Ca
Dialysis was performed against 50 mM acetate buffer (pH 5.9) containing Cl ₂ to obtain a solution containing 300 mg of recombinant CRP in 30 ml of acetate buffer. This is applied to a chitosan gel column (50 ml, 2 x 15
cm column) and then 0.15 M
50 mM acetate buffer containing NaCl and 10 mM CaCl ₂ (pH 5.
Eluted using 9). The flow rate was 10 ml / hour and 5 ml fractions were collected. 280 nm protein elution profile
Was measured by the absorbance. Endotoxin removal on the chitosan gel column was repeated three more times for the eluted CRP solution, and the endotoxin concentration was less than 10 EU / mg protein. That is, CRP substantially free of endotoxin was obtained.

【００６０】各除去工程ごとに、キトサンアフィニティ
ーゲルをそれぞれ総容積の2倍の0.5M NaOHおよび0.1 M
酢酸で洗浄し、続いて溶出液が中性になるまで水で洗浄
して再生した。カラムは0.15 M NaClおよび10 mM CaCl₂
を含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.9）で再平衡
化した。For each removal step, chitosan affinity gels were each twice the total volume of 0.5 M NaOH and 0.1 M
Washing with acetic acid was followed by regeneration by washing with water until the eluate was neutral. Columns are 0.15 M NaCl and 10 mM CaCl ₂
Was re-equilibrated with 50 mM sodium acetate buffer solution (pH 5.9).

【００６１】プールしたエンドトキシンを実質的に含ま
ないCRP分画は0.15 M NaClおよび2mM CaCl₂を含む20 mM
Tris-HCl（pH 7.6）に対して透析を行い、CRP量と同量
のトレハロースおよびCHAPSを加えた（CRP：トレハロー
ス：CHAPSのモル比、１：１：１）後、凍結乾燥した。The pooled endotoxin-free CRP fraction is 20 mM containing 0.15 M NaCl and 2 mM CaCl _2.
After dialysis against Tris-HCl (pH 7.6), the same amount of trehalose and CHAPS as the CRP amount was added (molar ratio of CRP: trehalose: CHAPS, 1: 1: 1), and then lyophilized.

【００６２】上記のキトサンアフィニティークロマトグ
ラフィーにより組換えCRPからエンドトキシンを除去し
た際の溶出プロフィールを、図5に示す。大腸菌で発現
された段階の組換えCRPは、約1,330 EU/mgタンパク質を
含んでいたが、pH 5.9、高イオン強度（0.15）の条件
下、カルシウムイオンの存在下において、キトサンカラ
ムにより4回の連続流出をすると、組換えCRP中のエンド
トキシン濃度は2.4 EU/mgタンパク質にまで減少した(表
２)。FIG. 5 shows an elution profile when endotoxin was removed from recombinant CRP by the above-described chitosan affinity chromatography. The recombinant CRP at the stage expressed in E. coli contained approximately 1,330 EU / mg protein, but was subjected to four times with a chitosan column in the presence of calcium ions under conditions of pH 5.9 and high ionic strength (0.15). With continuous efflux, the endotoxin concentration in the recombinant CRP was reduced to 2.4 EU / mg protein (Table 2).

【００６３】[0063]

【表２】 [Table 2]

【００６４】ここで1 EUとは、米国食品医薬品局（FD
A）により基準とされているエンドトキシンユニットを
いう。本実施例中でタンパク質濃度は、BSAを標準とし
て用い、Pierce（Rockford, IL）の二シンコニン酸（BC
A）検定キットにより測定した（Smith, P.K., et al.,
(1985) Anal. Biochem. 193, 76-85）。Here, 1 EU means the US Food and Drug Administration (FD
Refers to the endotoxin unit referenced by A). In this example, the protein concentration was determined by using BSA as a standard and disinconic acid (BC) of Pierce (Rockford, IL).
A) Measured with a test kit (Smith, PK, et al.,
(1985) Anal. Biochem. 193, 76-85).

【００６５】エンドトキシンを実質的に含まないCRPの
入手可能性により、CRPをin vivo動物モデル実験での補
体活性化剤としてだけでなく、急性相免疫系誘導薬とし
ても使用することができる。The availability of CRP that is substantially free of endotoxin allows CRP to be used not only as a complement activator in in vivo animal model experiments, but also as an acute phase immune system inducer.

【００６６】エンドトキシンを実質的に含まないCRP溶
液の緩衝液は、溶出液から0.15 M NaClおよび2 mM CaCl
₂を含む20 mM Tris-HCl（pH 7.6）透析によりに交換
し、PC結合活性をCRPからのエンドトキシン除去前後で
比較した。エンドトキシンを実質的に含まないCRPはPC
結合に関し、開始成分と同じ比活性を示した（図６）。The buffer of the CRP solution, which is substantially free of endotoxin, contains 0.15 M NaCl and 2 mM CaCl 2 from the eluate.
₂ was exchanged by dialysis with 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing ₂ , and the PC binding activity was compared before and after removing endotoxin from CRP. CRP substantially free of endotoxin is PC
For binding, it showed the same specific activity as the starting component (FIG. 6).

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図1は、天然CRP、濃縮したCRPおよび凍結融
解したCRPのPC結合活性を比較したグラフである。FIG. 1 is a graph comparing the PC binding activity of native CRP, concentrated CRP and freeze-thawed CRP.

【図２】 図2は、凍結融解のサイクルを繰り返した際
のCRPのPC結合活性を、CHAPSおよびトレハロースを含む
場合および含まない場合で比較したグラフである。FIG. 2 is a graph comparing the PC binding activity of CRP with and without CHAPS and trehalose when a freeze-thaw cycle is repeated.

【図３】 図3は、pHがCRPのPC結合活性に及ぼす影響を
示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the effect of pH on PC binding activity of CRP.

【図４】 図4は、沈澱から回収されたCRPのPC結合活性
を天然のCRPと比較したグラフである。FIG. 4 is a graph comparing the PC binding activity of CRP recovered from the precipitate with native CRP.

【図５】 図5は、キトサンアフィニティークロマトグ
ラフィーによりエンドトキシンを除去する際の、エンド
トキシン溶出プロフィールを示す。FIG. 5 shows the endotoxin elution profile when removing endotoxin by chitosan affinity chromatography.

【図６】 図6は、天然のCRPとエンドトキシンを除去し
た後のCRPのそれぞれのPC結合活性を比較したグラフで
ある。FIG. 6 is a graph comparing the PC binding activities of native CRP and CRP after removal of endotoxin.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 31/04 31/04 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 597126480 1824 Ｓａｖｏ Ｃｏｕｒｔ，Ｔｉｍｏｎ ｉｕｍ，Ｍａｒｙｌａｎｄ 21093，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒ ｉｃａ (72)発明者 田村 弘 埼玉県所沢市北原町1346−18 (72)発明者 川口 吉太郎 茨城県北相馬郡藤代町光風台３丁目10番１ 号 (72)発明者 ワイ・シー・リィー アメリカ合衆国メリーランド州21093，チ モニウム，サボー・コート 1824 (72)発明者 高河原 勇 茨城県つくば市東光台３−２−１ (72)発明者 斉藤 景子 アメリカ合衆国メリーランド州21210，バ ルチモア，ウエスト・39ストリート 110, アパートメント ナンバー912 (72)発明者 松尾 雄志 大阪府吹田市千里山西６丁目16番５号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 DA06 4C076 AA12 BB11 CC07 CC21 CC31 DD14E DD67E EE41Q FF15 FF67 4C084 AA02 AA03 AA06 AA13 AA17 BA03 BA44 CA04 CA18 DC50 MA05 MA17 NA02 NA03 NA07 ZA752 ZB052 ZB352 4H045 AA50 CA42 DA70 EA22 EA25 FA74 GA26 HA31 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 1/16 A61P 31/04 31/04 37/00 37/00 C07K 14/435 C07K 14/435 A61K 37 / 02 C12N 15/09 C12N 15/00 A (71) Applicant 597126480 1824 Savo Court, Timonium, Maryland 21093, United States of America (72) Inventor Hiroshi Tamura 1346-18 Kitaharacho, Tokorozawa-shi, Saitama 72) Inventor Yoshitaro Kawaguchi 3-10-1, Kofudai, Fujishiro-machi, Kitasoma-gun, Ibaraki Pref. (72) Inventor YC Lee 21093, Timonium, Sabo Court, Maryland, USA 1824 (72) Inventor Takagawara Isamu 3-2-1 Tokodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture (72) Inventor Keiko Saito a 21210, West 39th Street, Baltimore, Maryland, United States 110 110, Apartment number 912 (72) Inventor Yushi Matsuo 6-16-5 Senriyama Nishi, Suita-shi, Osaka F-term (reference) 4B024 AA01 BA80 DA06 4C076 AA12 BB11 CC07 CC21 CC31 DD14E DD67E EE41Q FF15 FF67 4C084 AA02 AA03 AA06 AA13 AA17 BA03 BA44 CA04 CA18 DC50 MA05 MA17 NA02 NA03 NA07 ZA752 ZB052 ZB352 4H045 AA50 CA42 DA70 EA22 EA25 FA74 GA26 HA31

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 糖、界面活性剤および安定化剤から選
択される少なくとも一種の添加物を含むことにより、容
易に水性溶媒に溶解することができるようにした、乾燥
C反応性タンパク質（CRP）組成物。Claims: 1. A drying agent which contains at least one additive selected from a sugar, a surfactant and a stabilizer so that it can be easily dissolved in an aqueous solvent.
C-reactive protein (CRP) composition. 【請求項２】 糖がトレハロース（Glcα1‐1αGlc）
である、請求項１に記載の乾燥CRP組成物。2. The sugar is trehalose (Glcα1-1αGlc).
The dry CRP composition of claim 1, wherein the composition is: 【請求項３】 界面活性剤が3-[(3-コラミドプロピ
ル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（CHAP
S）である、請求項１または２に記載の乾燥CRP組成物。3. The method according to claim 1, wherein the surfactant is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAP
The dry CRP composition according to claim 1 or 2, which is S). 【請求項４】 安定化剤が血液成分である、請求項１
〜３のいずれか１項に記載の乾燥CRP組成物。4. The method according to claim 1, wherein the stabilizer is a blood component.
The dry CRP composition according to any one of claims 3 to 3. 【請求項５】 血液成分が血清アルブミン、またはガ
ンマグロブリンである、請求項４に記載の乾燥CRP組成
物。5. The dry CRP composition according to claim 4, wherein the blood component is serum albumin or gamma globulin. 【請求項６】 遺伝子組換えにより作製された、請求
項１〜５のいずれか１項に記載の乾燥CRP組成物。6. The dry CRP composition according to claim 1, which is produced by genetic recombination. 【請求項７】 エンドトキシンを実質的に含まない、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の乾燥CRP組成物。7. An endotoxin-free substantially.
The dry CRP composition according to any one of claims 1 to 6. 【請求項８】 CRPタンパク質1 mg当たりのエンドト
キシン含量が10エンドトキシンユニット以下である、請
求項７に記載の乾燥CRP組成物。8. The dry CRP composition according to claim 7, wherein the endotoxin content per mg of CRP protein is 10 endotoxin units or less. 【請求項９】 薬学的に許容可能な担体または希釈剤
を添加物として含有する、請求項１〜８のいずれか１項
に記載の乾燥CRP組成物。9. The dry CRP composition according to claim 1, comprising a pharmaceutically acceptable carrier or diluent as an additive.