JP2001124778A

JP2001124778A - Method for measuring cancer specific protein and method for diagnosing cancer

Info

Publication number: JP2001124778A
Application number: JP2000127207A
Authority: JP
Inventors: Tomokazu Tachikawa; 智一立川; Masahiko Nakano; 昌彦中野; Masatoshi Yamazaki; 雅俊山崎; Tomoko Imaruoka; 智子伊丸岡; Masayo Gazan; 眞與莪山; Toraichi Tawara; 寅一田原
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2001-05-11

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply and effectively immunologically diagnosing a cancer. SOLUTION: A protein existing in a human cancer patient's urine and having angioendothel-cytostatic activity, a molecular weight measured by a polyacrylamide gel electrophoresis containing a sodium dodecyl sulfate under a reducing condition of 38,000, 42,000 or 45,000 and an amino group terminal amino acid sequence of Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- or Val-Tyr- Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- in the human urine is measured by using an antibody connected to the protein or the antibody fragment.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトガン患者尿中
に特異的に検出されるタンパク質の測定方法を提供する
ものである。さらにヒト生体内の該タンパク質の動態を
測定することによって、ガンの診断、病態把握、予後の
管理を行う方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention provides a method for measuring a protein specifically detected in urine of a human cancer patient. Further, the present invention relates to a method for diagnosing cancer, grasping a disease state, and managing prognosis by measuring the dynamics of the protein in a human body.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アンジオスタチンはM.S.O'Reillyらによ
って1994年に初めて報告された血管新生抑制因子である
（O'Reillyら、Cell、79：315 （1994））。彼らは、マ
ウス皮下にルイス肺ガン細胞を移植し、皮下の原発巣が
存在する間は肺転移巣は微小にとどまるが、原発巣を除
去した場合に肺転移巣が急激に増大することを観察し
た。そして、この現象は皮下のガン組織が血管新生抑制
因子を放出し、それが肺転移巣の血管新生を阻害して転
移巣を微小の状態に保っており、皮下ガン組織を切除す
ることによってこの因子の産生消失を介して血管新生抑
制効果が消失し転移巣が増大することを明らかにした。
そしてマウスから得られたこの因子を同定した結果、マ
ウスプラスミノーゲンの内部構造フラグメントと98％以
上一致するタンパクであり、非還元下SDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分子量38,000の単一の蛋白性
因子であることを見いだしアンジオスタチンと命名して
報告した。マウスアンジオスタチンはマウスプラスミノ
ーゲンのアミノ酸の一次構造において、アミノ酸番号98
番目からはじまるフラグメントで、そのアミノ基末端ア
ミノ酸一次構造は、Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Ｘ-Lys-Thr-G
ly- （Ｘは未決定）であり（O'Reillyら、Cell、79：31
5 （1994））、プラスミノーゲン中の５個のクリングル
構造（K1、K2、K3、K4、K5）のうちK1〜K4を含む領域と
考えられている。また、O'Reillyらはヒトプラスミノー
ゲンをエラスターゼで限定分解して得られるヒトプラス
ミノーゲンフラグメント、すなわち、ヒトプラスミノー
ゲンのアミノ酸一次構造においてアミノ酸番号97番目あ
るいは99番目からはじまるK1〜K3を含むプラスミノーゲ
ンフラグメントを坦ガンマウスに有効量投与したとこ
ろ、転移巣の成長が抑制されることを突き止めた（O'Re
illyら、Cell、79：315 （1994））。さらにこのフラグ
メントは、ヒトガン細胞の増殖を抑制することが報告さ
れた（O'Reilly M.S. ら、Nature med. 、2 ：689 （19
96))。BACKGROUND OF THE INVENTION Angiostatin is an angiogenesis inhibitor first reported by MSO'Reilly et al. In 1994 (O'Reilly et al., Cell, 79: 315 (1994)). They implanted Lewis lung cancer cells under the skin of mice and observed that while the primary tumor under the skin was present, the lung metastases remained small, but when the primary tumor was removed, the lung metastases rapidly increased. did. And this phenomenon is that subcutaneous cancer tissue releases angiogenesis inhibitory factor, which inhibits angiogenesis of lung metastatic lesions and keeps metastatic lesions in a small state, and by removing subcutaneous cancer tissue, It was clarified that the angiogenesis inhibitory effect disappeared through the disappearance of factor production and the metastatic foci increased.
As a result of the identification of this factor obtained from mice, it was found that the protein was more than 98% identical to the internal structural fragment of mouse plasminogen. It was found to be a factor and reported as angiostatin. Mouse angiostatin has the amino acid number 98 in the primary structure of the amino acid of mouse plasminogen.
The primary structure of the amino-terminal amino acid is Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-X-Lys-Thr-G.
ly- (X is undecided) (O'Reilly et al., Cell, 79:31).
5 (1994)), which is considered to be a region containing K1 to K4 among the five kringle structures (K1, K2, K3, K4, K5) in plasminogen. Further, O'Reilly et al. Obtained a human plasminogen fragment obtained by limited degradation of human plasminogen with elastase, that is, K1-K3 starting from amino acid number 97 or 99 in the amino acid primary structure of human plasminogen. Plasminogen fragment containing the plasminogen fragment was administered to cancer-bearing mice in an effective amount, and it was found that the growth of metastatic foci was suppressed (O'Re
illy et al., Cell, 79: 315 (1994)). Furthermore, this fragment has been reported to inhibit the growth of human cancer cells (O'Reilly MS et al., Nature med., 2: 689 (19
96)).

【０００３】その後、Cao Y.らによって、K1〜K4のフラ
グメントよりK1〜K3のフラグメントの方が血管新生抑制
活性が高いこと、K1、K2、K3はそれぞれ単独でも弱いな
がら血管新生抑制活性を持つがK4にはその活性がないこ
と、ジスルフィド結合（S-S）によりK2とK3の間が結合
しているK2〜K3フラグメントを投与した場合は血管新生
抑制活性は弱いものの、K2フラグメントとK3フラグメン
トとをそれぞれ同時投与した場合はそれぞれの相加的効
果を発揮することから、K2とK3の間のジスルフィド結合
の解離が血管新生抑制活性に重要な働きをしていること
が示された（Cao Y.ら、J.Biol.Chem.、271 ：29461
（1996））。さらに、K5も単独で強い血管内皮細胞増殖
抑制活性を有することも報告されている（Cao Y.ら、J.
Biol.Chem.、272 ：22924 （1997））。[0003] Then, according to Cao Y. et al., The K1-K3 fragment has a higher angiogenesis inhibitory activity than the K1-K4 fragment, and K1, K2 and K3 each have a weak angiogenesis inhibitory activity even when used alone. However, K4 does not have its activity. When a K2 to K3 fragment in which K2 and K3 are linked by a disulfide bond (SS) is administered, although the angiogenesis inhibitory activity is weak, the K2 fragment and the K3 fragment The co-administration of each of them exerts an additive effect of each, indicating that the dissociation of the disulfide bond between K2 and K3 plays an important role in angiogenesis inhibitory activity (Cao Y. J. Biol. Chem., 271: 29461.
(1996)). Furthermore, it has been reported that K5 alone has a strong vascular endothelial cell growth inhibitory activity (Cao Y. et al., J. Am.
Biol. Chem., 272: 22924 (1997)).

【０００４】これまでに、ヒトガン患者生体内にプラス
ミノーゲンフラグメントが存在することを示した報告と
して特開平9-178744がある。ここで検出されたヒト血液
中に存在するプラスミノーゲンフラグメントは分子量6
0,000〜75,000の４種類の蛋白であり、O'Reillyらによ
ってマウス尿中から検出されたアンジオスタチンとは異
なる分子量を有するものであった。このタンパク質を測
定するには、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンフラ
グメントが同一の抗原性を有することから直接的に血液
試料中のプラスミノーゲンとプラスミノーゲンフラグメ
ントを区別して測定することは困難とされている。この
ため特開平9-178744では、目的とするプラスミノーゲン
フラグメントを除く他の夾雑物質を除去した後に、目的
のプラスミノーゲンフラグメントを測定するという技術
的な特徴が記載されている。また、M.Sten-Linder ら
は、ヒトガン患者尿中に非還元下で分子量 39,000 、4
5,000、50,000のプラスミノーゲンフラグメントが存在
することを報告している（M.Sten-Linder ら Anticance
r Res.、19 : 3409 (1999)) 。[0004] Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-178744 discloses a report showing the presence of a plasminogen fragment in the body of a human cancer patient. The plasminogen fragment present in the human blood detected here has a molecular weight of 6
There were four types of proteins, from 0,000 to 75,000, which had different molecular weights from angiostatin detected in mouse urine by O'Reilly et al. In order to measure this protein, it is difficult to directly distinguish and measure plasminogen and plasminogen fragment in a blood sample because plasminogen and plasminogen fragment have the same antigenicity. ing. For this reason, Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-178744 describes the technical feature of measuring the target plasminogen fragment after removing other contaminants other than the target plasminogen fragment. In addition, M. Sten-Linder et al. Reported that the molecular weight of non-reduced
It has been reported that there are 5,000 and 50,000 plasminogen fragments (M. Sten-Linder et al. Anticance
r Res., 19: 3409 (1999)).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】このようにヒトガン患
者生体内に、アンジオスタチンあるいは同様の活性を有
する他のプラスミノーゲンフラグメントが存在するかど
うか、さらにこれらを予め前処理を施すことなく簡便に
測定する具体的方法はこれまでに明らかとなっていな
い。ヒトガン患者生体内でこのような物質が存在して実
際にガン細胞の増殖、転移に関与することが明らかとな
り、このタンパクの簡便な検出方法が確立されれば、基
礎医学、臨床医学において極めて重要な意味をもつ。Thus, whether or not angiostatin or another plasminogen fragment having a similar activity is present in the body of a human cancer patient is examined simply and without any pretreatment. The specific method of measuring has not been clarified so far. It is clear that such substances are present in human cancer patients in vivo and actually contribute to the growth and metastasis of cancer cells, and if a simple detection method for this protein is established, it is extremely important in basic medicine and clinical medicine. It has a meaning.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】このような問題点を鑑み
本願発明者は鋭意研究の結果、還元下SDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で測定される分子量が38,000、42,0
00および45,000でありプラスミノーゲンと免疫学的に区
別できないタンパク質が、ヒトガン患者の尿中に特異的
に存在することを発見した。即ちこれらのタンパク質は
健常者の尿中には存在しなかった。さらに、ヒト尿中に
はこれらのガン特異タンパク質以外の免疫学的にプラス
ミノーゲンに類似したタンパク質が存在しないことも見
いだした。これらの発見により、尿を試料とすることに
よって予め夾雑物質を除く処理を行うことなく前記のタ
ンパク質を直接的に測定することが可能となった。すな
わち、プラスミノーゲンと構造上極めて類似するタンパ
ク質の測定に際して、血液を試料とした免疫学的測定法
では予め前処理を行わなければならないものの、尿を試
料とすることによって、前処理の必要なく直接的にこれ
らの免疫学的測定が可能であることを見いだし本発明に
到達した。Means for Solving the Problems In view of such problems, the present inventors have conducted intensive studies and found that the molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reduction was 38,000, 42,0.
It was discovered that proteins 00 and 45,000, immunologically indistinguishable from plasminogen, were specifically present in the urine of human cancer patients. That is, these proteins were not present in urine of healthy subjects. In addition, they found that there were no immunologically similar proteins to plasminogen other than these cancer-specific proteins in human urine. These findings have made it possible to directly measure the protein by using urine as a sample without previously performing a treatment for removing contaminants. That is, when measuring a protein that is structurally very similar to plasminogen, pretreatment must be performed in advance in an immunoassay using blood as a sample, but by using urine as a sample, pretreatment is not required. The present inventors have found that these immunological measurements can be directly performed, and reached the present invention.

【０００７】ガン患者尿中から特異的に検出された分子
量38,000、42,000、45,000のタンパク質は、いずれも下
記式（１）と式（２）で示されるアミノ基末端アミノ酸
配列を有するものの混合物であり、計６種類のタンパク
質からなる。このタンパク質のうちのひとつはM.S.O'Re
illyらによって坦ガンマウス尿中から発見されたアンジ
オスタチンと同一の分子量、同一のアミノ基末端配列を
持つタンパク質ではあったが、他の５種類は明らかに新
規なタンパク質であった。 Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （１） Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （２）また、いずれの分子量のタンパク質も、式（１）で示さ
れるタンパク質の方が式（２）で示されるタンパク質よ
りも多量に含まれていた。またこれらのタンパク質は、
マウスから発見されたアンジオスタチン同様に、血管内
皮細胞増殖抑制活性を有しており、これら新規タンパク
質がヒトガン患者生体内で血管新生抑制活性を介して転
移巣の成長抑制を担う物質としてアンジオスタチン以上
に機能しているものと考えられた。[0007] Proteins having a molecular weight of 38,000, 42,000, and 45,000 specifically detected in the urine of cancer patients are mixtures of those having the amino-terminal amino acid sequences represented by the following formulas (1) and (2). , Consisting of a total of six proteins. One of these proteins is MSO'Re
Although it was a protein having the same molecular weight and the same amino-terminal sequence as angiostatin discovered in the urine of cancer-bearing mice by illy et al., the other five proteins were clearly novel proteins. Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (1) Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (2) As for the protein, the protein represented by the formula (1) was contained in a larger amount than the protein represented by the formula (2). These proteins also
Similar to angiostatin found in mice, it has vascular endothelial cell growth inhibitory activity, and these new proteins are more than angiostatin as substances that are responsible for suppressing the growth of metastatic foci via angiogenesis inhibitory activity in human cancer patients It was thought that it was functioning.

【０００８】これらのヒトガン患者生体内に存在する血
管内皮細胞増殖抑制活性を有し、還元条件下のドデシル
硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が38,000、42,000または45,000であ
り、アミノ基末端アミノ酸配列が式（１）または式
（２）で示されるタンパク質は、プラスミノーゲンと免
疫学的に区別することができなかった。このため、プラ
スミノーゲンが多量に含まれる血液を試料とした場合の
直接的測定は困難であった。しかし、ヒト尿中には免疫
学的にプラスミノーゲンと区別できないタンパク質は前
記の６種類のタンパク質以外には存在しなかった。した
がって、尿を試料とすることによりこのプラスミノーゲ
ンの影響を受けることなくこのガン特異タンパク質を予
め夾雑物質を除去する操作を行う必要なく直接的に測定
が可能であることを見出し本発明に至った。さらに、本
発明のガン特異タンパク質の測定用試料は尿には限定さ
れず、前記のガン特異タンパク質以外にプラスミノーゲ
ンと免疫学的に区別できないタンパク質を含まない試料
であれば測定可能であり、例えばある種の細胞培養上清
等を試料とすることもできる。These human cancer patients have a vascular endothelial cell proliferation inhibitory activity present in the living body, and have a molecular weight of 38,000, 42,000 or 45,000 as measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. The protein whose base terminal amino acid sequence is represented by formula (1) or formula (2) could not be distinguished immunologically from plasminogen. For this reason, direct measurement was difficult when blood containing a large amount of plasminogen was used as a sample. However, there were no proteins in human urine that could not be distinguished immunologically from plasminogen other than the above-mentioned six proteins. Therefore, the present inventors have found that the use of urine as a sample allows the cancer-specific protein to be directly measured without being affected by the plasminogen and without having to perform an operation for removing contaminants in advance. Was. Furthermore, the measurement sample of the cancer-specific protein of the present invention is not limited to urine, and can be measured as long as the sample does not contain a protein that cannot be immunologically distinguished from plasminogen other than the cancer-specific protein, For example, a certain kind of cell culture supernatant can be used as a sample.

【０００９】本発明は、これらのガン特異タンパク質に
結合する抗体を用いたガン特異タンパク質の測定方法に
関するものである。さらに、この測定法を用いて、ヒト
尿中に含まれるこのガン特異タンパク質を測定、検出す
ることによるガンの診断またはその予後を診断する方法
に関するものである。ここでいうガン特異タンパク質と
は、ヒトガン患者生体内に存在し、血管内皮細胞増殖抑
制活性を有し、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウムを
含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量
が38,000、42,000または45,000であり、アミノ基末端ア
ミノ酸配列が式（１）または式（２）で示されるタンパ
ク質の意である。The present invention relates to a method for measuring a cancer-specific protein using an antibody that binds to these cancer-specific proteins. Further, the present invention relates to a method for diagnosing cancer or prognosis thereof by measuring and detecting this cancer-specific protein contained in human urine using this measurement method. The cancer-specific protein referred to herein is present in a human cancer patient's living body, has vascular endothelial cell growth inhibitory activity, and has a molecular weight of 38,000, 42,000 or 48,000 as measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions 45,000, meaning a protein whose amino-terminal amino acid sequence is represented by formula (1) or formula (2).

【００１０】本発明に使用するヒトガン患者尿中に存在
し、血管内皮細胞増殖抑制活性を有し、還元条件下のド
デシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電
気泳動で測定される分子量が38,000、42,000または45,0
00であり、アミノ基末端アミノ酸配列が式（１）または
式（２）であるタンパク質に結合する抗体は、ヒトガン
患者尿中から得られる前記ガン特異タンパク質を抗原と
して用いる以外に、組織、細胞、体液などの生体試料よ
り精製した前記のガン特異タンパク質、あるいはそれを
含む構成物、あるいはその一部を含む組成物を抗原とし
て、以下に示した従来より行われている方法により得る
ことができることは言うまでもないが、このタンパク質
の構造の一部を持つペプチドあるいはそれを含む構成
物、あるいはその一部を含む組成物を抗原として同様に
得ることができる。たとえば、ヒトプラスミノーゲン、
ヒトプラスミン、ヒトプラスミノーゲンリジン結合部位
−１、あるいはその一部を含む組成物を抗原として得る
ことができる。この場合、調製された抗体について、ヒ
トプラスミノーゲン、ヒトプラスミノーゲンリジン結合
部位−１、ガン患者尿、健常者尿との反応性を確認し、
健常者尿中には反応物を持たない抗体を選択することに
よって本発明の測定方法に使用する抗体が選択できる。
このような抗体は、プラスミノーゲンやプラスミンに結
合する抗体、結合しない抗体いずれも使用することがで
きる。ここでいう抗体には、モノクローナル抗体やポリ
クローナル抗体が含まれる。[0010] The present invention has a molecular weight of 38,000, 42,000 or 48,000, which is present in the urine of a human cancer patient, has a vascular endothelial cell growth inhibitory activity, and is measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. 45,0
The antibody that binds to a protein having an amino-terminal amino acid sequence of formula (1) or formula (2) may be a tissue, cell, Using the above-mentioned cancer-specific protein purified from a biological sample such as a body fluid, or a composition containing the same, or a composition containing a part thereof as an antigen, it is possible to obtain the antigen-specific protein by a conventionally used method described below. Needless to say, a peptide having a part of the structure of the protein, a component containing the peptide, or a composition containing a part thereof can be similarly obtained as an antigen. For example, human plasminogen,
A composition containing human plasmin, human plasminogen lysine binding site-1, or a part thereof can be obtained as an antigen. In this case, the prepared antibody was confirmed to be reactive with human plasminogen, human plasminogen lysine binding site-1, cancer urine, and healthy human urine.
The antibody used in the measurement method of the present invention can be selected by selecting an antibody having no reactant in urine of a healthy subject.
As such an antibody, an antibody that binds to plasminogen or plasmin or an antibody that does not bind can be used. The antibodies mentioned here include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.

【００１１】抗原にペプチドを用いる場合は、化学合成
や遺伝子工学的手法によっても得られるが、その由来は
問わない。このペプチドをそれ自身抗原として用いる方
法、ポリビニルピロリドン、ラテックス、ポリメチルメ
タクリレートなどの大分子の物質に吸着させて免疫する
方法、キャリアー蛋白に結合して用いる方法等があるが
ペプチドをキャリヤー蛋白に結合して用いる方法が好ま
しく、結合方法は公知の方法が用いられる（「続医薬品
の開発、14：廣川書店、1991」）。When a peptide is used as an antigen, it can be obtained by chemical synthesis or genetic engineering techniques, but the origin is not limited. There is a method of using this peptide as an antigen itself, a method of immunizing by adsorbing to a large molecule substance such as polyvinylpyrrolidone, latex, polymethyl methacrylate, and a method of using it by binding to a carrier protein. A known method is used as a binding method ("Development of a medicinal product, 14: Hirokawa Shoten, 1991").

【００１２】抗原から抗体を得る方法は、本技術分野に
おいてそれ自体公知の方法によって得ることができる。
モノクローナル抗体を取得するためには、免疫に使用す
る動物としては各種の哺乳動物、例えばマウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等
を使用することができ、十分な量の抗原刺激を受けたリ
ンパ球が形成されるよう抗原を投与する。抗原は、アジ
ュバント等との懸濁液として数回投与し、最終免疫の数
日後に免疫した動物から抗原産生細胞、例えばリンパ
球、好ましくは脾臓細胞を取り出す。抗体産生細胞とミ
エローマ細胞の融合および融合細胞の選択的培養は、
「エンザイムイムノアッセイ、生化学実験法11：東京化
学同人、1989」等に記載された一般的な方法で行うこと
ができる。目的の抗体を産生するハイブリドーマを検索
及び単一クローン化した後、栄養培地中あるいは哺乳動
物の腹腔内で増殖させることにより抗体を産生させ、産
生した抗体は培養上清あるいはその哺乳動物の腹水また
は血清から精製することができる。抗体の精製は、遠心
分離、透析、硫酸アンモニウム等による塩析、DEAEカラ
ム等によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、
アフィニティクロマトグラフィーなどの一般的な単離、
精製方法を用いて行うことができる。A method for obtaining an antibody from an antigen can be obtained by a method known per se in the art.
In order to obtain a monoclonal antibody, animals used for immunization can be various mammals, for example, mice, rats, guinea pigs, rabbits, sheep, goats, cats, dogs, etc., and a sufficient amount of antigen can be used. The antigen is administered so that stimulated lymphocytes are formed. The antigen is administered several times as a suspension with an adjuvant or the like, and antigen-producing cells, for example, lymphocytes, preferably spleen cells are removed from the immunized animal several days after the final immunization. Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells and selective culture of fused cells
It can be performed by a general method described in “Enzyme immunoassay, biochemical experiment method 11: Tokyo Chemical Dojin, 1989” or the like. After searching and monocloning a hybridoma that produces the antibody of interest, the antibody is produced by growing it in a nutrient medium or in the peritoneal cavity of a mammal, and the produced antibody is cultured in the culture supernatant or ascites of the mammal or It can be purified from serum. Antibody purification includes centrifugation, dialysis, salting out using ammonium sulfate, ion exchange chromatography using a DEAE column, gel filtration,
General isolation such as affinity chromatography,
It can be performed using a purification method.

【００１３】ポリクローナル抗体は通常行われている方
法、例えば「日本生化学会編、新生化学実験講座12、東
京化学同人、1992」記載の方法によって得られる。免疫
動物としては、特に限定されるものではないが、馬、山
羊、羊、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどが
挙げられる。免疫動物としてウサギを用いる場合には、
抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、完全フロ
イントアジュバント、不完全フロイントアジュバントま
たは水酸化アルミニウムアジュバントなどの懸濁液と
し、10〜1000μg ／回・匹を注射し、さらに２〜４週間
後に追加免疫注射を１〜３回行い、抗血清を得る。注射
は多数箇所の皮下に行うのが好ましい。抗血清からポリ
クローナル抗体の調製は、上記モノクローナル抗体の精
製と同様の方法で行うことができる。The polyclonal antibody can be obtained by a commonly used method, for example, the method described in "The Japanese Society of Biochemistry, Shinsei Chemistry Laboratory Course 12, Tokyo Kagaku Dojin, 1992". Examples of the immunized animal include, but are not limited to, horses, goats, sheep, rabbits, guinea pigs, mice, chickens, and the like. When using rabbits as immunized animals,
The antigen is diluted to an appropriate concentration with physiological saline or the like to prepare a suspension such as complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, or aluminum hydroxide adjuvant. Thereafter, 1 to 3 booster injections are performed to obtain antiserum. Preferably, the injection is made subcutaneously at multiple sites. Preparation of a polyclonal antibody from antiserum can be performed in the same manner as in the purification of the monoclonal antibody.

【００１４】本発明に使用できるガン特異タンパク質に
結合する抗体フラグメントとは、このガン特異タンパク
質に結合する抗体と同程度にこのガン特異タンパク質に
結合活性を有する抗体の断片の意であり、そのような抗
体フラグメントとしては、例えばF(ab')₂、Fab'、Fab
などを挙げることができる。かかる抗体フラグメント
は、公知の方法（石川栄治著、酵素標識法、生物化学実
験法27、学会出版センター、（1991）など）によって調
製することができる。An antibody fragment that binds to a cancer-specific protein that can be used in the present invention means a fragment of an antibody that has the same binding activity to the cancer-specific protein as the antibody that binds to the cancer-specific protein. Antibody fragments include, for example, F (ab ′) ₂ , Fab ′, Fab
And the like. Such an antibody fragment can be prepared by a known method (Eiji Ishikawa, Enzyme labeling method, Biological Chemistry Experimental Method 27, Gakkai Shuppan Center, (1991), etc.).

【００１５】得られた抗体の反応物の検討は、免疫沈降
法やウェスタンブロット法として既に知られた方法によ
り行うことができる。本発明の前記ガン特異タンパク質
の測定方法に使用する抗体は、免疫沈降反応でガン特異
タンパク質と結合できるが、いったん変性処理を加えて
膜に転写された前記のガン特異タンパク質を用いたウェ
スタンブロット法においては、反応性を示さない抗体で
あった。The reaction product of the obtained antibody can be examined by a method known as immunoprecipitation or Western blotting. The antibody used in the method for measuring the cancer-specific protein of the present invention can bind to the cancer-specific protein in an immunoprecipitation reaction, but is subjected to a Western blotting method using the cancer-specific protein once subjected to a denaturation treatment and transferred to a membrane. Was an antibody showing no reactivity.

【００１６】本発明は、このようにして得られた抗体を
用いた前記のガン特異タンパク質を測定する方法、すな
わち免疫測定法に関するものである。免疫測定法として
は、前記のガン特異タンパク質に結合する抗体またはそ
の抗体フラグメントを用いるものであればどのような方
法によってもよいが、例えばイムノクロマト法、ラテッ
クス凝集法、免疫比濁法、化学発光免疫測定法（CLI
A）、電気化学発光免疫測定法（ECLIA ）、酵素免疫測
定法（EIA ）、蛍光免疫測定法（FIA ）、放射免疫測定
法（RIA ）、免疫放射定量法（IRMA）、ラテックス近赤
外比濁法（LPIA）等、またサンドイッチ法（一段法、二
段法）や競合法等の公知の方法を用いることができる。
例えば、酵素免疫測定法としては、「エンザイムイムノ
アッセイ」生化学実験法11（石川榮治監訳、東京化学同
人、1989年）等に記載されているそれ自体公知の方法を
用いることができる。The present invention relates to a method for measuring the above-mentioned cancer-specific protein using the antibody thus obtained, that is, an immunoassay method. As the immunoassay, any method may be used as long as it uses an antibody that binds to the aforementioned cancer-specific protein or an antibody fragment thereof. Examples thereof include immunochromatography, latex agglutination, immunoturbidimetry, and chemiluminescence immunoassay. Measurement method (CLI
A), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay (IRMA), latex near infrared ratio Known methods such as a turbidity method (LPIA), a sandwich method (one-step method, two-step method), and a competitive method can be used.
For example, as the enzyme immunoassay, a method known per se described in "Enzyme Immunoassay", Biochemical Experimental Method 11 (translated by Eiji Ishikawa, Tokyo Kagaku Dojin, 1989) and the like can be used.

【００１７】そして本願発明者らは、本測定法を用い
て、このガン特異タンパク質の存在を直接的に確認し、
特にガンの転移と大きく関与してガン患者の生体内、尿
中でこれらのタンパク質が出現していることを明らかに
した。すなわち、本測定法を用いて尿中に含まれる前記
タンパク質量を測定した場合、転移の認められないガン
患者では健常者とほぼ同程度の測定値を示すのに対し、
遠隔転移の認められるガン患者では全例が健常者より高
値を示し、尿中の前記ガン特異タンパク質量を測定する
ことによって転移を有するガン患者の判別が可能である
ことを見出した。ここでいう転移を有するガン患者と
は、ＴＮＭ分類でＭ１に分類されるいわゆる遠隔転移あ
りと診断されるものは全て含まれ、さらに、同時性転移
に限らず異時性転移を引き起こす症例においても、原発
巣切除術前にすでに高値を示し、肉眼的所見、画像診断
によって発見が困難な段階のものも検出が可能である。
また、原発巣や転移巣の部位には特定されない。例えば
大腸ガンの肝転移例、胃ガンの肝転移例、膵臓ガンの
肝、肺転移例、肺ガンの脳転移例などが挙げられる。こ
のように本発明の測定方法を用いることによって、生体
内でのガン組織の存在、なかでも転移巣の存在を知るこ
とができ極めて有用である。また、このガン特異タンパ
ク質を定量することによって、その量の多少から患者の
病態の把握をすることが可能となる。さらに、病巣摘出
後の患者病態の管理にも用いることができる。Then, the present inventors directly confirmed the presence of this cancer-specific protein using the present assay,
In particular, it has been clarified that these proteins have appeared in the body and urine of cancer patients in connection with the metastasis of cancer. That is, when the amount of the protein contained in urine is measured using the present measurement method, cancer patients without metastasis show almost the same measured values as healthy subjects,
All cancer patients with distant metastasis showed higher values than healthy subjects, and it was found that cancer patients with metastasis could be identified by measuring the amount of the cancer-specific protein in urine. The cancer patients having metastasis referred to here include all those diagnosed as having distant metastases classified as M1 in the TNM classification, and are not limited to synchronous metastases but also cases that cause metachronous metastasis. However, it is possible to detect those that show a high level before the primary resection and are difficult to detect by gross findings and image diagnosis.
In addition, it is not specified in the site of the primary or metastatic focus. Examples include liver metastasis cases of colorectal cancer, liver metastasis cases of stomach cancer, liver metastasis of pancreatic cancer, lung metastasis cases, and lung cancer brain metastasis cases. As described above, the use of the measurement method of the present invention makes it possible to know the presence of cancer tissue in a living body, particularly the presence of metastatic foci, and is extremely useful. Further, by quantifying the cancer-specific protein, it is possible to grasp the patient's condition from the amount of the amount. Furthermore, it can also be used for managing the patient's condition after excision of the lesion.

【００１８】本発明の測定方法を使用して、ガンの診断
および予後の診断を行うには、測定試料として尿を使用
することが重要である。これは血液中にこのガン特異タ
ンパク質と類似の構造を有するプラスミノーゲンなどが
多量に含まれているため、血液を試料とした場合にはこ
れらの夾雑物質を除去する操作が必要となるためであ
る。このように本発明者らは、尿を試料として、本発明
のガン特異タンパク質に結合する抗体またはその抗体フ
ラグメントを用いた測定方法を用いることによって、測
定用試料中から測定に影響を及ぼす夾雑物質を予め除く
処理を施す必要なく、このガン特異タンパク質の測定が
可能であることを見出し本発明に至った。以下、実施例
により本発明を詳述するが、それらは例示のためのもの
であって、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。In order to make a diagnosis and prognosis of cancer using the measurement method of the present invention, it is important to use urine as a measurement sample. This is because the blood contains a large amount of plasminogen and the like having a structure similar to that of this cancer-specific protein, and when blood is used as a sample, it is necessary to remove these contaminants. is there. As described above, the present inventors use urine as a sample, and use a measurement method using an antibody or an antibody fragment thereof that binds to the cancer-specific protein of the present invention, whereby contaminants that affect measurement from a measurement sample can be obtained. It has been found that this cancer-specific protein can be measured without the need for performing a treatment for removing the cancer in advance. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but these are for illustration only, and the present invention is not limited to these examples.

【００１９】[0019]

【実施例】実施例１抗ヒトプラスミノーゲンリジン結
合部位-1モノクローナル抗体の作製（１）免疫脾細胞の調製６週令の雄Balb/cマウス３匹の腹腔内にヒトプラスミノ
ーゲンリジン結合部位−１（以下「hLBS-1」と記す）
（シグマ社製）50μg を含む生理食塩液0.1ml と完全フ
ロイントアジュバント0.1ml とのエマルジョンを投与し
た。さらに３週間後に、抗原50μg を含む生理食塩水溶
液0.2ml を静脈に投与した。最終免疫の３日後にマウス
を屠殺し、脾臓を摘出し細胞融合に用いた。EXAMPLES Example 1 Anti-human plasminogen lysine binding
Preparation of combined site-1 monoclonal antibody (1) Preparation of immunized splenocytes Human plasminogen lysine binding site-1 (hereinafter referred to as "hLBS-1") was intraperitoneally in three 6-week-old male Balb / c mice.
An emulsion of 0.1 ml of physiological saline containing 50 μg (manufactured by Sigma) and 0.1 ml of complete Freund's adjuvant was administered. Three weeks later, 0.2 ml of a physiological saline solution containing 50 µg of the antigen was intravenously administered. Three days after the final immunization, the mice were sacrificed and the spleens were excised and used for cell fusion.

【００２０】（２）細胞融合脾臓をピンセットでほぐして得られた細胞を、GIT 培地
（日本製薬社製）に懸濁後、ナイロンメッシュを通過さ
せ単細胞浮遊液を得た。この単細胞浮遊液より遠心にて
集めた細胞を、0.83％塩化アンモニウム溶液（９容量
部）と0.17 Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
塩酸緩衝液、pH 7.6（１容量部）との混液２mlで４℃で
２分間処理し、赤血球を破壊し、遠心分離で取り除い
た。GIT 培地で培養した対数増殖期のマウスミエローマ
細胞SP-2/O-Ag14 をGIT 培地で２回洗浄した。マウス脾
臓細胞とミエローマ細胞の細胞数の比率が10:1になるよ
うに混合した後、遠心にて細胞を回収した。この細胞を
37℃に加温した後、37℃に加温した2ml の50％ポリエチ
レングリコール1500（ベーリンガー社製）を１分間かけ
て徐々に加えた。１分間放置後、10mlのGIT 培地を４〜
５分かけて滴下した。細胞を遠心して集めた後、GIT 培
地で５×10⁶細胞／mlになるように細胞を懸濁した。こ
れを細胞培養用96穴マイクロウェルプレート（コーニン
グ社製）の各ウェルに 100μl ずつ分注し、５％炭酸ガ
ス培養装置中で37℃で培養した。１日培養後、プレート
の各ウェルに１×10^-4M ヒポキサンチン、４×10^-7M ア
ミノプテリンおよび1.6 ×10^-5M チミジンを含有するGI
T 培地（以下「HAT 培地」と記す）を 100μl 添加し
た。さらに２日または４日ごとに半量の培地を新たな H
AT培地に交換し、培養を続けた。細胞融合10日後にハイ
ブリドーマ細胞の増殖が認められた。培養２〜３週間後
の培養上清を抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
に供した。(2) Cell fusion Cells obtained by loosening the spleen with tweezers were suspended in a GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and then passed through a nylon mesh to obtain a single cell suspension. The cells collected from the single cell suspension by centrifugation were mixed with 2 ml of a 0.83% ammonium chloride solution (9 vol.) And 0.17 M tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer, pH 7.6 (1 vol. C. for 2 minutes to destroy red blood cells and remove by centrifugation. Exponentially growing mouse myeloma cells SP-2 / O-Ag14 cultured in GIT medium were washed twice with GIT medium. After mixing such that the ratio of mouse spleen cells to myeloma cells was 10: 1, the cells were collected by centrifugation. This cell
After heating to 37 ° C., 2 ml of 50% polyethylene glycol 1500 (manufactured by Boehringer) heated to 37 ° C. was gradually added over 1 minute. After leaving for 1 minute, add 10ml of GIT medium to 4 ~
It was added dropwise over 5 minutes. After the cells were collected by centrifugation, the cells were suspended in GIT medium to 5 × 10 ⁶ cells / ml. This was dispensed at 100 μl per well of a 96-well microwell plate for cell culture (manufactured by Corning) and cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas culture device. After one day of culture, each well of the plate contains a GI containing 1 × 10 ⁻⁴ M hypoxanthine, 4 × 10 ⁻⁷ M aminopterin and 1.6 × 10 ⁻⁵ M thymidine.
100 μl of T medium (hereinafter referred to as “HAT medium”) was added. Every 2 or 4 days, add half of the medium to fresh H
The medium was replaced with AT medium, and the culture was continued. Ten days after cell fusion, proliferation of hybridoma cells was observed. The culture supernatant after 2 to 3 weeks of culture was subjected to screening for antibody-producing hybridomas.

【００２１】（３）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマのスクリーニング hLBS-1に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマのスクリーニングは、hLBS-1を固定したマイク
ロプレートを用いてEIA により行った。hLBS-1の固定
は、96穴イムノマイクロプレート（ナルジェ・ヌンク社
製）の各ウェルに0.2 μg/mlになるように0.15M NaCl含
有0.01M リン酸緩衝液（pH 7.4）（以下「PBS 」と記
す）に溶解したhLBS-1を 100μl 添加し、４℃で一晩放
置させ行った。このプレートを0.05％Tween 20を含むPB
S （以下「T-PBS 」と記す）で５回洗浄後、0.2 ％BSA
を含むT-PBS （以下「T-B-PBS 」と記す）を加え、室温
に１時間放置し蛋白の非特異的吸着が起こらぬように各
ウエルをブロッキングした。各ウェルに上記（２）のハ
イブリドーマ培養上清のT-B-PBS 希釈液を100 μl 添加
し、室温で１時間インキュベートした。ウエルに固定し
たhLBS-1に結合した抗体の検出は、ベクタステインABC
キット（ベクターラボラトリーズ社製）を用いて行っ
た。プレートの各ウエルをT-PBS で５回洗浄後、各ウエ
ルにビオチン化ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗血清の
T-B-PBS 溶液を 100μl 添加して１時間反応させた。さ
らにT-PBS で洗浄後、 100μl のアビジン化ペルオキシ
ダーゼのT-B-PBS 溶液を添加し、20分反応させた。各ウ
エルをT-PBS で５回洗浄後、各ウェルに0.015 ％H₂O₂、
0.5mg/mlオルトフェニレンジアミン二塩酸塩を含む100m
M クエン酸リン酸緩衝液（pH 5.0）を 100μl 加え室温
で３〜10分間インキュベートした。各ウェルに4N硫酸を
100μl加えて反応を停止させ、イムノリーダーNJ-2000
（インターメッド社製）を用いて発色液の490nm の吸光
度を測定した。融合細胞を撒いたウェル数が3072ウェ
ル、このうちハイブリドーマの増殖が認められたウェル
数は1873ウェルであった。そしてhLBS-1に結合する抗体
の産生が認められたウェル数は271 ウェルであった。(3) Screening of Hybridoma Producing Monoclonal Antibody Screening of a hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to hLBS-1 was performed by EIA using a microplate on which hLBS-1 was immobilized. hLBS-1 was immobilized in a well of a 96-well immunomicroplate (manufactured by Narge Nunc) at a concentration of 0.25 μg / ml in a 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.15 M NaCl (hereinafter referred to as “PBS”). 100 μl of hLBS-1 dissolved in the mixture was added and left at 4 ° C. overnight. PB containing 0.05% Tween 20
After washing 5 times with S (hereinafter referred to as “T-PBS”), 0.2% BSA
T-PBS (hereinafter, referred to as "TB-PBS") containing the mixture was added and left at room temperature for 1 hour to block each well so that non-specific adsorption of proteins did not occur. To each well was added 100 μl of the above-mentioned (2) diluted solution of the hybridoma culture supernatant in TB-PBS, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. Detection of antibodies bound to hLBS-1 immobilized on the wells was performed using VectorStain ABC.
The test was performed using a kit (manufactured by Vector Laboratories). After washing each well of the plate 5 times with T-PBS, each well was washed with biotinylated goat anti-mouse immunoglobulin antiserum.
100 μl of TB-PBS solution was added and reacted for 1 hour. After further washing with T-PBS, 100 μl of avidin-peroxidase in TB-PBS was added and reacted for 20 minutes. After washing each well 5 times with T-PBS, 0.015% H ₂ O ₂ ,
100m containing 0.5mg / ml orthophenylenediamine dihydrochloride
100 μl of M citrate phosphate buffer (pH 5.0) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 3 to 10 minutes. 4N sulfuric acid in each well
The reaction was stopped by adding 100 μl, and immunoreader NJ-2000
The absorbance at 490 nm of the color developing solution was measured using (manufactured by Intermed). The number of wells in which the fused cells were spread was 3072 wells, and the number of wells in which hybridoma growth was observed was 1873 wells. The number of wells in which the production of antibodies binding to hLBS-1 was recognized was 271 wells.

【００２２】（４）hLBS-1に結合するモノクロ−ナル抗
体産生ハイブリドーマのクローニング（３）でhLBS-1に結合する抗体産生の認められた 271ウ
ェルのうち、 120ウェルについて培養液を、５％ブライ
クローン（大日本製薬社製）を含むHAT 培地（以下「HA
T-HCF-GIT 」培地と記す）を入れた24穴平底マイクロプ
レート（コーニング社製）に移した。増殖してきたハイ
ブリドーマを、HAT-HCF-GIT 培地を入れた96穴マイクロ
プレートを用いて限界希釈法によりクローニングした。
クローニング操作を２回行い、合計75個のクローンを得
た。(4) Cloning of hybridoma producing monoclonal antibody that binds to hLBS-1 Among the 271 wells in which production of an antibody that binds to hLBS-1 was observed in (3), the culture solution was used for 120 wells and 5% HAT medium containing Briclones (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
T-HCF-GIT "medium") was transferred to a 24-well flat bottom microplate (manufactured by Corning). The growing hybridoma was cloned by a limiting dilution method using a 96-well microplate containing HAT-HCF-GIT medium.
The cloning operation was performed twice to obtain a total of 75 clones.

【００２３】（５）hLBS-1に結合するモノクロ−ナル抗
体の精製 10日前に各々0.5ml のプリスタン（2,6,10,14-テトラメ
チルペンタデカン）を腹腔内に投与された７〜８週令の
Balb/cマウスの腹腔内に前記（４）で得られたhLBS-1に
結合するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２
〜５×10⁶個を移植した。約１週間後、マウスの腹腔よ
り腹水を採取し、その腹水からモノクロ−ナル抗体を25
〜50％飽和硫酸アンモニウム溶液により塩析した粗抗体
を得た。この粗抗体を少量のPBS に溶解し、アフィゲル
プロテイン A-MAPS キット（バイオラッド社製）を用い
て分離し、さらに、抗体溶液をPBS に透析した後、４℃
で保存した。腹水1ml あたり1.5 〜10mgの精製抗体を得
た。(5) Purification of monoclonal antibody binding to hLBS-1 0.5 to 10 days before intraperitoneal administration of 0.5 ml each of pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) Ordinance
Monoclonal antibody-producing hybridoma cells 2 binding to hLBS-1 obtained in (4) above in the abdominal cavity of Balb / c mice 2
５5 × 10 ⁶ were transplanted. About one week later, ascites was collected from the abdominal cavity of the mouse, and 25% of monoclonal antibody was collected from the ascites.
A crude antibody salted out with a 5050% saturated ammonium sulfate solution was obtained. This crude antibody was dissolved in a small amount of PBS, separated using an Affigel Protein A-MAPS kit (manufactured by Bio-Rad), and the antibody solution was dialyzed against PBS.
Saved in. 1.5 to 10 mg of purified antibody was obtained per ml of ascites.

【００２４】実施例２ hLBS-1 に結合するモノクロー
ナル抗体の特性（モノクローナル抗体の免疫グロブリン
サブクラスの同定）精製した抗体の免疫グロブリンのサブクラスをマウスモ
ノクロ−ナル抗体アイソタイピングキット（アマシャム
ファルマシア社製）を用いて同定した。結果を表１に示
す。 Example 2 Monochrome binding to hLBS-1
Characteristics of null antibody (monoclonal antibody immunoglobulin
Identification of Subclass) The immunoglobulin subclass of the purified antibody was identified using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham Pharmacia). Table 1 shows the results.

【００２５】表１抗体 Igサブクラス抗体 Igサブクラス抗体 Igサブクラス KRImAb1 IgG1 KRImAb18 IgG2a KRImAb34 IgM KRImAb2 IgG1 KRImAb19 IgG2a KRImAb35 IgG1 KRImAb3 IgG2a KRImAb20 IgG2a KRImAb36 IgA KRImAb4 IgG1 KRImAb21 IgG2a KRImAb41 IgG1 KRImAb5 IgG1 KRImAb22 IgG1 KRImAb43 IgG2a KRImAb6 IgG1 KRImAb23 IgG1 KRImAb46 IgM KRImAb7 IgG3 KRImAb24 IgG2a KRImAb47 IgG1 KRImAb8 IgG3 KRImAb25 IgG2a KRImAb49 IgG2b KRImAb9 IgG1 KRImAb26 IgG1 KRImAb57 IgG1 KRImAb10 IgG2a KRImAb27 IgG2b KRImAb58 IgG2a KRImAb11 IgM KRImAb28 IgM KRImAb60 IgG2a KRImAb12 IgG1 KRImAb29 IgG2a KRImAb69 IgG1 KRImAb13 IgG2b KRImAb30 IgG1 KRImAb70 IgG1 KRImAb14 IgG2a KRImAb31 IgG1 KRImAb72 IgM KRImAb15 IgG2a KRImAb32 IgG1 KRImAb73 IgG1 KRImAb16 IgG1 KRImAb33 IgG1 KRImAb75 IgG1 [0025] Table 1 antibody Ig subclass antibody Ig subclass antibody Ig subclasses KRImAb1 IgG1 KRImAb18 IgG2a KRImAb34 IgM KRImAb2 IgG1 KRImAb19 IgG2a KRImAb35 IgG1 KRImAb3 IgG2a KRImAb20 IgG2a KRImAb36 IgA KRImAb4 IgG1 KRImAb21 IgG2a KRImAb41 IgG1 KRImAb5 IgG1 KRImAb22 IgG1 KRImAb43 IgG2a KRImAb6 IgG1 KRImAb23 IgG1 KRImAb46 IgM KRImAb7 IgG3 KRImAb24 IgG2a KRImAb47 IgG1 KRImAb8 IgG3 KRImAb25 IgG2a KRImAb49 IgG2b KRImAb9 IgG1 KRImAb26 IgG1 KRImAb57 IgG1 KRImAb10 IgG2a KRImAb27 IgG2b KRImAb58 IgG2a KRImAb11 IgM KRImAb28 IgM KRImAb60 IgG2a KRImAb12 IgG1 KRImAb29 IgG2a KRImAb69 IgG1 KRImAb13 IgG2b KRImAb30 IgG1 KRImAb70 IgG1 KRImAb14 IgG2a KRImAb31 IgG1 KRImAb72 IgM KRImAb15 IgG2a KRImAb32 IgG1 KRImAb73 IgG1 KRImAb16 IgG1 KRImAb33 IgG1 KRImAb75 IgG1

【００２６】実施例３ hLBS-1モノクローナル抗体結合
セファロースの作製抗hLBS-1モノクローナル抗体結合セファロースを作成す
るにあたっての坦体には CNBr-活性化セファロース4B
（アマシャムファルマシア社製）を用いた。４gの CNBr
-活性化セファロース4Bを氷冷下１mM塩酸中で膨潤さ
せ、G3グラスフィルター上で１mM塩酸で洗浄を繰り返し
た。実施例１（５）で精製したhLBS-1に結合するモノク
ロ−ナル抗体（KRImAb1 、12、14、15、32、35、37、4
1、47、70、75）を0.5M NaCl-0.1M NaHCO３（pH8.3 ）
（以下「カップリングバッファー」と記す）中に溶解し
（100mg/10ml）、そこに膨潤した CNBr-活性化セファロ
ース4Bゲル10mlを加えた。４℃で一晩良く混合後、ゲル
を0.2Mグリシン（pH8.0 ）中に移し、室温で３時間置い
た。カップリングバッファ−でゲルを洗浄後、0.5M NaC
l-0.1M酢酸緩衝液（pH4.0 ）でさらに洗浄し、最後に再
びカップリングバッファ−でゲルを良く洗浄した。カラ
ムへの抗体の結合量は、3.5 〜8.4mg/mlゲルであった。 Example 3 Binding of hLBS-1 monoclonal antibody
Preparation of Sepharose CNBr-activated Sepharose 4B was used as a carrier for preparing anti-hLBS-1 monoclonal antibody-bound Sepharose.
(Amersham Pharmacia) was used. 4g CNBr
-Activated Sepharose 4B was swollen in 1 mM hydrochloric acid under ice-cooling, and the washing with 1 mM hydrochloric acid was repeated on a G3 glass filter. Monoclonal antibodies (KRImAb1, 12, 14, 15, 32, 35, 37, 4) that bind to hLBS-1 purified in Example 1 (5)
1, 47, 70, 75) with 0.5M NaCl-0.1M NaHCO3 (pH 8.3)
(Hereinafter, referred to as "coupling buffer") (100 mg / 10 ml), and 10 ml of swollen CNBr-activated Sepharose 4B gel was added thereto. After mixing well at 4 ° C. overnight, the gel was transferred into 0.2 M glycine (pH 8.0) and left at room temperature for 3 hours. After washing the gel with coupling buffer, 0.5M NaC
The gel was further washed with l-0.1 M acetate buffer (pH 4.0), and finally the gel was thoroughly washed again with a coupling buffer. The amount of antibody bound to the column was 3.5-8.4 mg / ml gel.

【００２７】実施例４ hLBS-1モノクローナル抗体に結
合するヒトガン患者尿中蛋白の精製 hLBS-1モノクローナル抗体に結合するヒトガン患者尿中
蛋白の精製には、実施例３で作成した抗hLBS-1モノクロ
ーナル抗体結合セファロースを用いた。ヒト肺ガン患者
尿あるいは健常者尿 10Lを濾過後、実施例３で作成した
抗hLBS-1モノクローナル抗体結合セファロース50mlに添
加し、４℃で一晩穏やかに振盪した。セファロースを回
収し、PBS で良く洗浄した後、3Mチオシアン酸ナトリウ
ムを含むPBS 、または４％ジチオスレイトールを含む30
mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝液
（pH6.8 ）で抗体への結合物を遊離した。 Example 4 Conjugation to hLBS-1 monoclonal antibody
Purification of Human Cancer Patient Urine Protein Combined The anti-hLBS-1 monoclonal antibody-conjugated Sepharose prepared in Example 3 was used for purification of the human cancer patient urine protein that binds to the hLBS-1 monoclonal antibody. After filtering 10 L of urine from a human lung cancer patient or urine from a healthy subject, it was added to 50 ml of the anti-hLBS-1 monoclonal antibody-conjugated Sepharose prepared in Example 3 and gently shaken at 4 ° C. overnight. Collect Sepharose, wash well with PBS, then add PBS containing 3M sodium thiocyanate or 30% containing 4% dithiothreitol.
The bound substance to the antibody was released with mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer (pH 6.8).

【００２８】実施例５ hLBS-1モノクローナル抗体に結
合するヒトガン患者尿中タンパク質の分子量およびウェ
スタンブロット解析実施例４で調製したhLBS-1モノクローナル抗体（KRImAb
70）に結合するヒトガン患者および健常者尿中タンパク
質を、常法に従い還元条件下で10％ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動し、プレステインド分子量マーカー
（アマシャムファルマシア社製）をもとに分子量を測定
した。その結果、ヒトガン患者尿を材料として調製した
場合でのみ分子量38,000、42,000、45,000の３本のバン
ドが検出され、ヒト健常者尿を材料として調製した場合
ではこれらのバンドはいずれも検出されなかった。同様
に電気泳動を行った後、ゲル内のタンパク質をポリビニ
リデンジフルオライドメンブレン（PVDF膜）にトランス
ブロットし、常法に従い調製したウサギ抗人抗プラスミ
ノーゲンポリクローナル抗体（PLGpAb）、抗hLBS-1モノ
クローナル抗体を一次抗体、 HRP結合プロテインＡ（ア
マシャムファルマシア社）を二次抗体としてウェスタン
ブロッティングを行った。結合した二次抗体の検出は、
ECL ウェスタンブロット試薬（アマシャムファルマシア
社）を用いた。ガン患者尿を材料とした際に検出された
前記の３本のバンドはPLGpAbにより染色されたが、抗hL
BS-1モノクローナル抗体を用いた場合には染色されず、
ここで使用した抗hLBS-1モノクローナル抗体は免疫沈降
反応でガン特異タンパク質と結合できるが、いったん変
性処理を加えて膜に転写されたガン特異タンパク質に対
しては反応性を示さない抗体であった。この抗hLBS-1モ
ノクローナル抗体はhLBS-1に対しても同様の挙動を示
し、変性処理を加えて膜に転写されたhLBS-1に対しては
反応性を示さなくなっていた。 Example 5 Conjugation to hLBS-1 monoclonal antibody
Molecular weight and weight of urinary protein
Stun blot analysis hLBS-1 monoclonal antibody (KRImAb) prepared in Example 4
Proteins in human cancer patients and healthy subjects binding to 70) were subjected to 10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions according to a conventional method, and the molecular weight was measured based on a prestained molecular weight marker (manufactured by Amersham Pharmacia). . As a result, three bands with molecular weights of 38,000, 42,000, and 45,000 were detected only when the urine was prepared using human cancer patient urine, and none of these bands were detected when human normal human urine was prepared as a material. . After electrophoresis in the same manner, the proteins in the gel were transblotted onto a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF membrane), and rabbit anti-human anti-plasminogen polyclonal antibody (PLGpAb), anti-hLBS- (1) Western blotting was performed using a monoclonal antibody as a primary antibody and HRP-binding protein A (Amersham Pharmacia) as a secondary antibody. Detection of the bound secondary antibody
ECL Western blot reagent (Amersham Pharmacia) was used. The three bands detected when using urine from cancer patients as a material were stained with PLGpAb, but anti-hL
Not stained with BS-1 monoclonal antibody,
The anti-hLBS-1 monoclonal antibody used here was able to bind to cancer-specific proteins by immunoprecipitation, but was an antibody that did not show reactivity with cancer-specific proteins that had been once denatured and transferred to the membrane. . The anti-hLBS-1 monoclonal antibody showed the same behavior with respect to hLBS-1, and showed no reactivity with hLBS-1 transferred to the membrane after denaturation.

【００２９】実施例６ヒトガン特異タンパク質のアミ
ノ基末端アミノ酸配列の決定実施例５と同様にしてhLBS-1モノクローナル抗体に結合
するヒトガン患者尿中タンパク質を還元条件下で10％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、PVDF膜にトラ
ンスブロットした後、クマシーブリリアントブルーで染
色した。分子量38,000、42,000、45,000の各バンド部分
を切りだし、Ｎ末端アミノ酸配列分析装置HP G1005A Pr
otein Sequencing System （ヒューレットパッカード社
製）を用いてそれぞれのアミノ基末端アミノ酸残基を調
べた。試料は予めS-還元ピリジルエチル化処理を行っ
た。その結果、いずれのバンドもアミノ基末端にLys を
持つ式（１）で示されるタンパク質と、アミノ基末端に
Val を持つ式（２）で示されるタンパク質の混合物であ
ることが判明した。 Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （１） Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （２）各バンド中の式（１）、式（２）で示されるタンパク質
の比率は、いずれも1.4〜2.8 ：１の範囲内であった。
このタンパク質の混合物は次の６種類のタンパク質から
なっていた。分子量38,000でＮ末端アミノ酸配列とし
て式（１）の構造を有するタンパク質、分子量38,000
でＮ末端アミノ酸配列として式（２）の構造を有するタ
ンパク質、分子量42,000でＮ末端アミノ酸配列として
式（１）の構造を有するタンパク質、分子量42,000で
Ｎ末端アミノ酸配列として式（２）の構造を有するタン
パク質、分子量45,000でＮ末端アミノ酸配列として式
（１）の構造を有するタンパク質、および分子量45,0
00でＮ末端アミノ酸配列として式（２）の構造を有する
タンパク質。 Example 6 Amino Acid of Human Cancer Specific Protein
Determination of the amino acid sequence at the terminal end of the human cancer The urinary protein of a human cancer patient that binds to the hLBS-1 monoclonal antibody was reduced to 10% S under reducing conditions in the same manner as in Example 5.
After performing DS polyacrylamide gel electrophoresis and trans-blotting on a PVDF membrane, the cells were stained with Coomassie brilliant blue. Each band of molecular weight 38,000, 42,000, 45,000 was cut out, and N-terminal amino acid sequence analyzer HP G1005A Pr
Each amino group terminal amino acid residue was examined using otein Sequencing System (Hewlett-Packard). The sample was previously subjected to an S-reduced pyridylethylation treatment. As a result, each of the bands has a protein represented by the formula (1) having Lys at the amino terminal, and a band at the amino terminal.
It was found to be a mixture of proteins represented by the formula (2) having Val. Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (1) Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (2) Formula in each band ( The ratios of the proteins represented by 1) and (2) were all in the range of 1.4 to 2.8: 1.
This mixture of proteins consisted of the following six proteins. A protein having a molecular weight of 38,000 and having the structure of formula (1) as the N-terminal amino acid sequence, a molecular weight of 38,000
A protein having the structure of formula (2) as the N-terminal amino acid sequence, a protein having a molecular weight of 42,000 and a structure of formula (1) as the N-terminal amino acid sequence, and a molecular weight of 42,000 having the structure of formula (2) as the N-terminal amino acid sequence A protein having a molecular weight of 45,000 and having the structure of formula (1) as an N-terminal amino acid sequence;
A protein having the structure of Formula (2) as the N-terminal amino acid sequence at 00.

【００３０】実施例７ヒト血管内皮細胞増殖抑制活性
の測定ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（MP-HUV-EC-4 ）を用いて、
実施例４で得られた抗hLBS-1モノクローナル抗体に結合
するヒトガン患者尿中タンパク質の血管内皮細胞の増殖
に対する効果を以下に示す方法で測定した。すなわち10
％ウシ胎児血清（FBS ）、10ng/ml 塩基性線維芽細胞増
殖因子（bFGF）、50IU/ml ペニシリンG、50μg/mlスト
レプトマイシンを加えたCHL-MCDB131 培地（クロレラ工
業社製）で培養したMP-HUV-EC-4 を、コラーゲンコート
した培養用96穴マイクロプレートの各ウェルに２×10³
cells/wellになるように分注した。このとき、終濃度と
して０、２、５、10μg/mlになるように実施例４で得ら
れたhLBS-1モノクローナル抗体に結合するヒトガン患者
尿中タンパク質、hLBS-1あるいはヒトプラスミノーゲン
（テクノクローン社製）を加え、５％炭酸ガス雰囲気下
において37℃で４日間培養した。培地100 μl を新たな
培地に交換し、さらに同条件下で１時間培養後、Cell T
iter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
（プロメガ社製）を用いて、生細胞を吸光度で測定し
た。結果を表２に示した。 Example 7 Human Vascular Endothelial Cell Growth Inhibitory Activity
Measurement of human umbilical vein vascular endothelial cells (MP-HUV-EC-4)
The effect of human urine patient urinary protein binding to the anti-hLBS-1 monoclonal antibody obtained in Example 4 on proliferation of vascular endothelial cells was measured by the following method. Ie 10
MP-cultured in CHL-MCDB131 medium (Chlorella Industries) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 10 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 50 IU / ml penicillin G, and 50 μg / ml streptomycin. 2 × 10 ³ HUV-EC-4 was added to each well of a 96-well microplate for culture coated with collagen.
The cells were dispensed to become cells / well. At this time, the urinary protein of the human cancer patient, hLBS-1 or human plasminogen (Techno) which binds to the hLBS-1 monoclonal antibody obtained in Example 4 so that the final concentration becomes 0, 2, 5, 10 μg / ml. (Manufactured by Clone) was added and cultured at 37 ° C. for 4 days in a 5% carbon dioxide gas atmosphere. Replace 100 μl of the medium with a new medium, and culture for 1 hour under the same conditions.
iter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
Viable cells were measured by absorbance using (Promega). The results are shown in Table 2.

【００３１】表２吸光度被験物質濃度（μg/ml）０２５１０抗体結合タンパク質 0.401 0.347 0.263 0.210 hLBS-1 0.443 0.397 0.313 0.223 ヒトプラスミノーゲン 0.474 0.426 0.400 0.427 実施例４で精製された抗hLBS-1モノクローナル抗体に結
合するヒトガン患者尿中タンパク質は、hLBS-1同様に血
管内皮細胞増殖抑制活性を有していた。一方、ヒトプラ
スミノーゲンには血管内皮細胞増殖抑制活性は認められ
なかった。 Table 2 Absorbance Test substance concentration (μg / ml) 0 25 10 Antibody binding protein 0.401 0.347 0.263 0.210 hLBS-1 0.443 0.397 0.313 0.223 Human plasminogen 0.474 0.426 0.400 0.427 Anti-hLBS-purified in Example 4 (1) Urinary protein from human cancer patients that binds to the monoclonal antibody had vascular endothelial cell growth inhibitory activity, similar to hLBS-1. On the other hand, human plasminogen had no vascular endothelial cell growth inhibitory activity.

【００３２】実施例８抗プラスミノーゲンポリクロー
ナル抗体のガン患者尿および健常者尿中反応物の特定
（ウェスタンブロット解析）ヒト肺ガン患者尿75mlおよび健常者尿150ml を濾過後、
分子量10,000カットの限外濾過装置（セントリカットU-
10：クラボウ社製）にて 300μl になるまで濃縮した。
これに10mlの30mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン塩酸緩衝液（pH6.8 ）を加え、再び 300μl になる
まで濃縮した後、実施例５と同様にして、電気泳動およ
び抗プラスミノーゲンポリクローナル抗体を用いたウェ
スタンブロッティングを行った。結果を図３に示した。
ヒト肺ガン患者尿を試料とした場合、分子量38,000、4
2,000、45,000の３本のバンドが検出されたのに対し、
健常者尿を試料とした場合では反応物は認められなかっ
た。このことから、ヒト尿中にはこれらのガン特異タン
パク質以外の免疫学的にプラスミノーゲンに類似したタ
ンパク質が存在しないものと考えられた。 Example 8 Anti-plasminogen polycloth
Identification of reaction products of null antibody in urine of cancer patients and healthy subjects
(Western blot analysis) After filtering 75 ml of human lung cancer urine and 150 ml of healthy human urine,
Ultrafiltration device with a molecular weight of 10,000 cut (Centricut U-
10: manufactured by Kurabo Industries Co., Ltd.).
To this was added 10 ml of 30 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer (pH 6.8), and the mixture was concentrated again to 300 μl. Western blotting used was performed. The results are shown in FIG.
When using human lung cancer patient urine as sample, molecular weight 38,000, 4
While 2,000 and 45,000 bands were detected,
No reaction product was observed when using healthy human urine as a sample. From this, it was considered that there was no immunologically similar protein to plasminogen other than these cancer-specific proteins in human urine.

【００３３】実施例９ガン特異タンパク質に結合する
モノクローナル抗体を用いたEIA の構築（一段法）（１）HRP 標識Fab'の調製 KRImAb12を2mg/ml含むPBS 溶液50mlに1Mクエン酸緩衝液
（pH3.2 ）を添加して、pH4.1 に調整した。これに、1
2.5mgのブタ胃粘膜ペプシン（シグマ社製）を添加し、3
7℃で５時間インキュベートして抗体を消化させた。こ
れに3Mトリス塩酸緩衝液（pH8.6 ）を加えてpH7.0 と
し、2ml に濃縮した後、この濃縮液を10mMリン酸緩衝液
（pH7.0 ）で平衡化したスーパーローズ12HR16/50 カラ
ム（アマシャムファルマシア社製）に通し、F(ab')₂画
分を得た。回収されたF(ab')₂の量は26.5mgであった。
F(ab')₂画分を２mlに濃縮して、これに２−メルカプト
エチルアミンおよびEDTAをそれぞれ10mMおよび0.5mM と
なるように添加し、37℃で90分間インキュベートしてF
(ab')₂を還元した。これを5mM EDTAを含有する10mMリ
ン酸緩衝液（pH 6.0）で平衡化したスーパーローズ12HR
16/50カラムに通して、Fab'画分を得たところ、21.2mg
のFab'が回収された。HRP へのマレイミド基の導入は、
50mgのHRP を10mMリン酸緩衝液（pH7.0 ）に溶解した
後、これに10mgの N−（ε−マレイミドカプロイルオキ
シ）−スクシンイミド（ジーベンケミカル社製）を１ml
のN,N'−ジメチルホルムアミドに溶解した溶液 750μl
を添加して、30℃で60分間反応させることにより行っ
た。この反応生成液を10mMリン酸緩衝液（pH 6.0）で平
衡化してPD10カラム（アマシャムファルマシア社製）に
通して、マレイミド基を導入した HRP画分を得た。前記
によって調製された濃度9.2mg/mlのFab'溶液2.0mlに、
濃度が8.0mg/mlのマレイミド基を導入したHRP を2.0ml
加えて、４℃で16時間反応させた。この反応生成液を2m
l に濃縮した後、10mMリン酸緩衝液（pH7.4 ）で平衡化
したスーパーローズ12HR 16/50カラムに通して、10mlの
HRP 標識Fab'画分を得た。なお調製されたHRP 標識Fab'
においてHRP とFab'との結合モル比はほぼ１：１であっ
た。回収された標識抗体量はFab'の量として15mgであっ
た。 Example 9 Binding to a cancer-specific protein
Construction of EIA Using Monoclonal Antibody (Single-Step Method) (1) Preparation of HRP-Labeled Fab '1M citrate buffer (pH 3.2) was added to 50 ml of a PBS solution containing 2 mg / ml of KRImAb12 to adjust the pH to 4.1. It was adjusted. In addition, 1
2.5 mg of porcine gastric mucosal pepsin (Sigma) was added and 3
The antibody was digested by incubation at 7 ° C for 5 hours. To this was added 3M Tris-HCl buffer (pH 8.6) to pH 7.0, concentrated to 2 ml, and this concentrated solution was equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to a Super Rose 12HR16 / 50 column. (Amersham Pharmacia) to obtain F (ab ') ₂ fraction. The amount of F (ab ') ₂ recovered was 26.5 mg.
The F (ab ') ₂ fraction was concentrated to 2 ml, and 2-mercaptoethylamine and EDTA were added thereto at 10 mM and 0.5 mM, respectively.
(ab ') ₂ was reduced. This was superrose 12HR equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA.
When passed through a 16/50 column to obtain a Fab ′ fraction, 21.2 mg
Fab's were recovered. Introduction of a maleimide group into HRP
After dissolving 50 mg of HRP in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1 ml of 10 mg of N- (ε-maleimidocaproyloxy) -succinimide (manufactured by D-ben Chemical Co.) was added thereto.
750 μl of a solution dissolved in N, N′-dimethylformamide
And reacted at 30 ° C. for 60 minutes. The reaction product was equilibrated with a 10 mM phosphate buffer (pH 6.0) and passed through a PD10 column (Amersham Pharmacia) to obtain an HRP fraction into which a maleimide group was introduced. In 2.0 ml of the Fab 'solution having a concentration of 9.2 mg / ml prepared as described above,
2.0 ml of HRP with a concentration of 8.0 mg / ml maleimide group introduced
In addition, the reaction was carried out at 4 ° C. for 16 hours. 2m of this reaction product
After passing through a Superrose 12HR 16/50 column equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.4), 10 ml
An HRP-labeled Fab 'fraction was obtained. The prepared HRP-labeled Fab '
In the above, the binding molar ratio between HRP and Fab 'was approximately 1: 1. The amount of the labeled antibody recovered was 15 mg as the amount of Fab ′.

【００３４】（２）一段法EIA 抗原の同一部位に対し互いに競合しない２種類のモノク
ローナル抗体、KRImAb70およびKRImAb12を用いて検討し
た。96穴のイムノマイクロプレートMaxisorp（ナルジェ
・ヌンク社製）の各ウェルに50mM炭酸水素ナトリウム緩
衝液（pH 9.6）で希釈した10μg/mlのKRImAb70を 250μ
l 添加し４℃で一晩静置し、抗体を固相化した。次に、
プレートを 300μl のT-PBS で５回洗浄後、T-B-PBS を
各ウェルに 300μl ずつ添加し、室温で１時間ブロッキ
ングした。次にウェルに（１）で調製したKRImAb12の H
RP標識Fab'のT-B-PBS 溶液（200ng/ml）を 100μl 、次
いでT-B-PBS で希釈したガン特異タンパク質を 100μl
加え混合後、室温で90分間反応させた後、このプレート
を 300μl のT-PBS で５回洗浄した。次に、 200μl の
オルトフェニレンジアミン含有基質（0.5mg/mlオルトフ
ェニレンジアミン、0.015 ％過酸化水素）を加え室温で
30分間反応させた。このウェルに4N硫酸を100 μl 加え
て反応を停止させ、イムノリーダー NJ-2000（インター
メッド社製）を用いて、反応生成液の 490nmの吸光度を
測定した。結果を表３に示す。(2) One-step method The investigation was carried out using two kinds of monoclonal antibodies, KRImAb70 and KRImAb12, which do not compete with each other for the same site of the EIA antigen. 250 μl of 10 μg / ml KRImAb70 diluted with 50 mM sodium bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to each well of a 96-well immunomicroplate Maxisorp (Narge Nunc).
l was added and left at 4 ° C. overnight to immobilize the antibody. next,
After the plate was washed five times with 300 μl of T-PBS, 300 μl of TB-PBS was added to each well, and blocking was performed at room temperature for 1 hour. Next, the H of KRImAb12 prepared in (1) was added to the wells.
100 µl of RP-labeled Fab 'TB-PBS solution (200 ng / ml), then 100 µl of cancer-specific protein diluted with TB-PBS
After adding and mixing, the mixture was reacted at room temperature for 90 minutes, and then the plate was washed five times with 300 μl of T-PBS. Next, add 200 μl of orthophenylenediamine-containing substrate (0.5 mg / ml orthophenylenediamine, 0.015% hydrogen peroxide) and add at room temperature.
The reaction was performed for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μl of 4N sulfuric acid to the wells, and the absorbance at 490 nm of the reaction solution was measured using an immunoreader NJ-2000 (manufactured by Intermed). Table 3 shows the results.

【００３５】表３ガン特異タンパク質濃度波長490nm における吸光度 ng/ml ４ 1.504 ２ 0.926 １ 0.502 0.5 0.257 0.25 0.124 ０ 0.004 Table 3 Concentration of cancer-specific protein Absorbance at 490 nm ng / ml 4 1.504 2 0.926 1 0.502 0.5 0.257 0.25 0.124 0 0.004

【００３６】実施例10 ガン特異タンパク質に結合する
モノクローナル抗体を用いたEIAの構築（二段法） 96穴のイムノマイクロプレートMaxisorp（ナルジェ・ヌ
ンク社製）の各ウェルに50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液
（pH 9.6）で希釈した10μg/mLのKRImAb70を250 μl 添
加し４℃で一晩静置し、抗体を固相化した。次に、プレ
ートを300 μlのT-PBS で５回洗浄後、T-B-PBS を各ウ
ェルに300 μl ずつ添加し、室温で１時間ブロッキング
した。次にウェルにT-B-PBS で希釈したガン特異タンパ
ク質を200μl加え室温で60分間反応させた後、このプレ
ートを 300μl のT-PBS で５回洗浄した。次に、各ウェ
ルに、実施例９（１）で調製したKRImAb12のHRP 標識Fa
b'のT-B-PBS 溶液（200ng/ml）を 200μl 加え、60分間
反応させた。このプレートを 300μl のT-PBS で５回洗
浄した後、 200μl のオルトフェニレンジアミン含有基
質を加え室温で30分間反応させた。このウェルに4N硫酸
を100 μl 加えて反応を停止させ、イムノリーダー NJ-
2000（インターメッド社製）を用いて、反応生成液の49
0nm の吸光度を測定した。結果を表４に示す。 Example 10 Binding to a cancer-specific protein
Construction of EIA Using Monoclonal Antibody (Two-Step Method) 10 μg / mL KRImAb70 diluted with 50 mM sodium hydrogencarbonate buffer (pH 9.6) was added to each well of a 96-well immunomicroplate Maxisorp (manufactured by Narge Nunc). 250 μl was added and left at 4 ° C. overnight to immobilize the antibody. Next, the plate was washed 5 times with 300 μl of T-PBS, and then 300 μl of TB-PBS was added to each well, followed by blocking at room temperature for 1 hour. Next, 200 μl of the cancer-specific protein diluted with TB-PBS was added to the wells and reacted at room temperature for 60 minutes, and the plate was washed five times with 300 μl of T-PBS. Next, the HRP-labeled Fa of KRImAb12 prepared in Example 9 (1) was added to each well.
200 μl of a TB-PBS solution (200 ng / ml) of b ′ was added and reacted for 60 minutes. After the plate was washed 5 times with 300 μl of T-PBS, 200 μl of the substrate containing orthophenylenediamine was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μl of 4N sulfuric acid to this well, and the immunoreader NJ-
Using a 2000 (manufactured by Intermed), 49
The absorbance at 0 nm was measured. Table 4 shows the results.

【００３７】表４ガン特異タンパク質濃度波長490nm における吸光度 ng/ml ４ 2.097 ２ 1.281 １ 0.725 0.5 0.378 0.25 0.196 0 0.002 Table 4 Cancer-specific protein concentration Absorbance at 490 nm ng / ml 4 2.097 2 1.281 1 0.725 0.5 0.378 0.25 0.196 0 0.002

【００３８】実施例11 ガン患者血中および尿中ガン特
異タンパク質量の測定実施例９（２）に示した抗hLBS-1モノクローナル抗体を
用いた一段法EIA （測定法Ａ）により、遠隔転移を有す
る各種ガン患者（肺ガン、胃ガン、膀胱ガン、前立腺ガ
ン、大腸ガン）並びに健常者の血漿中および尿中のガン
特異タンパク質量を測定した。あわせて、実施例５の抗
プラスミノーゲンポリクローナル抗体を用いた一段法EI
A （測定法Ｂ）により、ガン患者並びに健常者の尿中の
ガン特異タンパク質量を測定した。結果を表５に示し
た。 Example 11 Cancer Patient Blood and Urine Cancer Features
Measurement of Different Protein Amounts of various cancer patients with distant metastasis (lung cancer, stomach cancer, bladder cancer, (Prostate cancer, colorectal cancer) and the plasma and urine levels of cancer-specific proteins in healthy subjects were measured. In addition, the one-step method EI using the anti-plasminogen polyclonal antibody of Example 5
A (measurement method B) was used to measure the amount of cancer-specific protein in the urine of cancer patients and healthy subjects. Table 5 shows the results.

【００３９】表５測定値（ng/ml ）対象者測定法Ａ測定法Ｂ血漿中尿中尿中健常者（ｎ＝１０） 10180±5916 4.4±3.0 20.3±10.0 ガン患者（ｎ＝７） 11853±2715 77.8±86.0 100.0±102.4 方法Ａ（抗hLBS-1モノクローナル抗体を用いた一段法EI
A ）を用いた場合は、血漿を試料とすると患者、健常者
の測定値の分布に差は認められず、ガン特異タンパク質
の測定はできなかったが、尿を試料とした場合では健常
者と患者の測定値の分布は乖離した。また方法Ｂ（抗PL
G ポリクローナル抗体を用いた一段法EIA ）を用い、尿
を試料とした場合でも、健常者と患者の一部に測定値の
重なりは生じたが、おおよそ健常者と患者の識別は可能
であった。 Table 5 Measured values (ng / ml) Subject's assay A Assay B Plasma urine Urinary healthy subjects (n = 10) 10180 ± 5916 4.4 ± 3.0 20.3 ± 10.0 Cancer patients (n = 7) 11853 ± 2715 77.8 ± 86.0 100.0 ± 102.4 Method A (one-step EI using anti-hLBS-1 monoclonal antibody)
A) When plasma was used as a sample, no difference was observed in the distribution of measured values between patients and healthy subjects, and cancer-specific protein could not be measured. The distribution of patient measurements has diverged. Method B (anti-PL
G Using a one-step method using polyclonal antibodies (EIA), even when urine was used as a sample, measurement values overlapped in some healthy patients and some patients, but it was possible to roughly distinguish healthy patients from patients .

【００４０】実施例12 転移の有無によるガン患者尿中
ガン特異タンパク質量の測定値実施例９（２）に示した抗hLBS-1モノクローナル抗体を
用いた一段法EIA （測定法Ａ）により、健常者、転移の
認められるガン患者及び転移の認められないガン患者尿
中のガン特異タンパク質量を測定した（いずれも術前に
採取した尿）。結果を表６に示した。表６対象尿中ガン特異タンパク質濃度 (ng/ml) 平均値±標準偏差値（最低値最高値）健常者（ｎ＝１０）４．４±３．０（０．６１０．７）大腸ガン患者転移あり（ｎ＝４）２９．７±１５．２（１８．６５２．２）転移なし（ｎ＝５）３．６±３．９（０．６９．３）肺ガン患者転移あり（ｎ＝５）２５．５±６．２（１７．６３２．０）転移なし（ｎ＝２）７．５±１．５（６．４８．５）胃ガン患者転移あり（ｎ＝２）８７．２±６８．２（３９．０１３５．４）転移なし（ｎ＝１）７．３転移なし（ｎ＝１）２６．８（異時性転移例） Example 12 Urine in Cancer Patients Based on Presence or Absence of Metastasis
Measured value of the amount of cancer-specific protein The one-step method EIA (measuring method A) using the anti-hLBS-1 monoclonal antibody shown in Example 9 (2) shows healthy subjects, cancer patients with metastasis, and no metastasis. The amount of cancer-specific protein in the urine of cancer patients was measured (all urine collected before surgery). The results are shown in Table 6. Table 6 Subjects Urinary cancer specific protein concentration (ng / ml) Mean ± standard deviation (lowest and highest) Healthy (n = 10) 4.4 ± 3.0 (0.6 10.7) Colorectal cancer Patient metastasized (n = 4) 29.7 ± 15.2 (18.6 52.2) No metastasis (n = 5) 3.6 ± 3.9 (0.6 9.3) Lung cancer patient Metastasized (N = 5) 25.5 ± 6.2 (17.6 32.0) No metastasis (n = 2) 7.5 ± 1.5 (6.4 8.5) Gastric cancer patient Metastasis (n = 2) 87.2 ± 68.2 (39.0 135.4) No metastasis (n = 1) 7.3 No metastasis (n = 1) 26.8 (Example of metachronous metastasis)

【００４１】大腸ガン、肺ガン、胃ガンいずれにおいて
も、転移の認められないガン患者では健常者とほぼ同程
度の測定値を示すのに対し、遠隔転移の認められるガン
患者では全例が健常者より高値を示した。また原発巣除
去施術時に転移は認められなかったものの、その後転移
の認められた異時性転移例でも、手術前に高値を示して
いた。In any of colon cancer, lung cancer, and stomach cancer, cancer patients without metastasis show almost the same measurement values as healthy subjects, whereas cancer patients with distant metastasis show healthy subjects in all cases. The value was higher than the average. No metastasis was observed during primary tumor removal, but metachronous metastases with metastases afterwards showed high values before surgery.

【００４２】[0042]

【発明の効果】本発明によれば、ヒトガン患者生体内に
存在するガン特異タンパク質の測定が可能となる。ま
た、尿を試料としてこの測定方法を用いることによっ
て、予め前処理を行うことなく直接的にガン特異タンパ
ク質の定量が可能となり、ガンおよびその予後の診断、
病態の把握、治療方法の決定等に有効に利用することが
できる。According to the present invention, it becomes possible to measure a cancer-specific protein present in the body of a human cancer patient. In addition, by using this measurement method with urine as a sample, it is possible to directly quantify cancer-specific proteins without performing pretreatment in advance, and to diagnose cancer and its prognosis,
It can be effectively used for grasping a disease state, determining a treatment method, and the like.

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【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１２年１１月２日（２０００．１１．
２）[Submission date] November 2, 2000 (200.11.
2)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【書類名】明細書[Document Name] Statement

【発明の名称】ガン特異タンパク質の測定方法および
ガンの診断方法Patent application title: Method for measuring cancer-specific protein and method for diagnosing cancer

【特許請求の範囲】[Claims]

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【０００２】[0002]

【０００５】[0005]

【０００６】[0006]

【０００７】ガン患者尿中から特異的に検出された分子
量38,000、42,000、45,000のタンパク質は、いずれも配
列番号１および配列番号２に記載のアミノ基末端アミノ
酸配列を有するものの混合物であり、計６種類のタンパ
ク質からなる。このタンパク質のうちのひとつはM.S.O'
Reillyらによって坦ガンマウス尿中から発見されたアン
ジオスタチンと同一の分子量、同一のアミノ基末端配列
を持つタンパク質ではあったが、他の５種類は明らかに
新規なタンパク質であった。また、いずれの分子量のタ
ンパク質も、配列番号１に記載のアミノ基末端アミノ酸
配列を有するタンパク質の方が配列番号２に記載のアミ
ノ基末端アミノ酸配列を有するタンパク質よりも多量に
含まれていた。またこれらのタンパク質は、マウスから
発見されたアンジオスタチン同様に、血管内皮細胞増殖
抑制活性を有しており、これら新規タンパク質がヒトガ
ン患者生体内で血管新生抑制活性を介して転移巣の成長
抑制を担う物質としてアンジオスタチン以上に機能して
いるものと考えられた。[0007] The proteins having a molecular weight of 38,000, 42,000, and 45,000 specifically detected from the urine of cancer patients are mixtures of those having the amino-terminal amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and a total of 6 Consists of different types of proteins. One of these proteins is MSO '
Although it was a protein having the same molecular weight and the same amino terminal sequence as angiostatin found in the urine of cancer-bearing mice by Reilly et al., The other five proteins were clearly novel proteins. In addition, the protein having the amino-terminal amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was contained in a larger amount than the protein having the amino-terminal amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in any of the molecular weight proteins. These proteins also have vascular endothelial cell growth inhibitory activity, similar to angiostatin found in mice, and these novel proteins inhibit the growth of metastatic foci via angiogenesis inhibitory activity in human cancer patients. It is thought that it functions more than angiostatin as a carrier.

【０００８】これらのヒトガン患者生体内に存在する血
管内皮細胞増殖抑制活性を有し、還元条件下のドデシル
硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が38,000、42,000または45,000であ
り、アミノ基末端アミノ酸配列が配列番号１または配列
番号２に記載のタンパク質は、プラスミノーゲンと免疫
学的に区別することができなかった。このため、プラス
ミノーゲンが多量に含まれる血液を試料とした場合の直
接的測定は困難であった。しかし、ヒト尿中には免疫学
的にプラスミノーゲンと区別できないタンパク質は前記
の６種類のタンパク質以外には存在しなかった。したが
って、尿を試料とすることによりこのプラスミノーゲン
の影響を受けることなくこのガン特異タンパク質を予め
夾雑物質を除去する操作を行う必要なく直接的に測定が
可能であることを見出し本発明に至った。さらに、本発
明のガン特異タンパク質の測定用試料は尿には限定され
ず、前記のガン特異タンパク質以外にプラスミノーゲン
と免疫学的に区別できないタンパク質を含まない試料で
あれば測定可能であり、例えばある種の細胞培養上清等
を試料とすることもできる。These human cancer patients have a vascular endothelial cell growth inhibitory activity present in the living body, and have a molecular weight of 38,000, 42,000 or 45,000 as measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions, The protein whose base amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 could not be distinguished immunologically from plasminogen. For this reason, direct measurement was difficult when blood containing a large amount of plasminogen was used as a sample. However, there were no proteins in human urine that could not be distinguished immunologically from plasminogen other than the above-mentioned six proteins. Therefore, the present inventors have found that the use of urine as a sample allows the cancer-specific protein to be directly measured without being affected by the plasminogen and without having to perform an operation for removing contaminants in advance. Was. Furthermore, the measurement sample of the cancer-specific protein of the present invention is not limited to urine, and can be measured as long as the sample does not contain a protein that cannot be immunologically distinguished from plasminogen other than the cancer-specific protein, For example, a certain kind of cell culture supernatant can be used as a sample.

【０００９】本発明は、これらのガン特異タンパク質に
結合する抗体を用いたガン特異タンパク質の測定方法に
関するものである。さらに、この測定法を用いて、ヒト
尿中に含まれるこのガン特異タンパク質を測定、検出す
ることによるガンの診断またはその予後を診断する方法
に関するものである。ここでいうガン特異タンパク質と
は、ヒトガン患者生体内に存在し、血管内皮細胞増殖抑
制活性を有し、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウムを
含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量
が38,000、42,000または45,000であり、アミノ基末端ア
ミノ酸配列が配列番号１または配列番号２に記載のタン
パク質の意である。The present invention relates to a method for measuring a cancer-specific protein using an antibody that binds to these cancer-specific proteins. Further, the present invention relates to a method for diagnosing cancer or prognosis thereof by measuring and detecting this cancer-specific protein contained in human urine using this measurement method. The cancer-specific protein referred to herein is present in a human cancer patient's living body, has vascular endothelial cell growth inhibitory activity, and has a molecular weight of 38,000, 42,000 or 48,000 as measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. 45,000, and the amino acid sequence at the amino group terminus means the protein described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

【００１０】本発明に使用するヒトガン患者尿中に存在
し、血管内皮細胞増殖抑制活性を有し、還元条件下のド
デシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電
気泳動で測定される分子量が38,000、42,000または45,0
00であり、アミノ基末端アミノ酸配列が配列番号１また
は配列番号２に記載のタンパク質に結合する抗体は、ヒ
トガン患者尿中から得られる前記ガン特異タンパク質を
抗原として用いる以外に、組織、細胞、体液などの生体
試料より精製した前記のガン特異タンパク質、あるいは
それを含む構成物、あるいはその一部を含む組成物を抗
原として、以下に示した従来より行われている方法によ
り得ることができることは言うまでもないが、このタン
パク質の構造の一部を持つペプチドあるいはそれを含む
構成物、あるいはその一部を含む組成物を抗原として同
様に得ることができる。たとえば、ヒトプラスミノーゲ
ン、ヒトプラスミン、ヒトプラスミノーゲンリジン結合
部位−１、あるいはその一部を含む組成物を抗原として
得ることができる。この場合、調製された抗体につい
て、ヒトプラスミノーゲン、ヒトプラスミノーゲンリジ
ン結合部位−１、ガン患者尿、健常者尿との反応性を確
認し、健常者尿中には反応物を持たない抗体を選択する
ことによって本発明の測定方法に使用する抗体が選択で
きる。このような抗体は、プラスミノーゲンやプラスミ
ンに結合する抗体、結合しない抗体いずれも使用するこ
とができる。ここでいう抗体には、モノクローナル抗体
やポリクローナル抗体が含まれる。[0010] The present invention has a molecular weight of 38,000, 42,000 or 48,000, which is present in the urine of a human cancer patient, has a vascular endothelial cell growth inhibitory activity, and is measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. 45,0
The antibody whose amino-terminal amino acid sequence binds to the protein described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is obtained by using the above-mentioned cancer-specific protein obtained from human cancer patient urine as an antigen, Needless to say, the above-mentioned cancer-specific protein purified from a biological sample, or a composition containing the same, or a composition containing a part thereof can be obtained as an antigen by a conventional method described below. However, a peptide having a part of the structure of the protein, a component containing the peptide, or a composition containing a part thereof can be similarly obtained as an antigen. For example, a composition containing human plasminogen, human plasmin, human plasminogen lysine binding site-1, or a part thereof can be obtained as an antigen. In this case, for the prepared antibody, the reactivity with human plasminogen, human plasminogen lysine binding site-1, cancer patient urine, and healthy subject urine was confirmed, and there was no reactant in healthy subject urine. By selecting an antibody, the antibody used in the measurement method of the present invention can be selected. As such an antibody, an antibody that binds to plasminogen or plasmin or an antibody that does not bind can be used. The antibodies mentioned here include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.

【００１９】[0019]

【００２９】実施例６ヒトガン特異タンパク質のアミ
ノ基末端アミノ酸配列の決定実施例５と同様にしてhLBS-1モノクローナル抗体に結合
するヒトガン患者尿中タンパク質を還元条件下で10％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、PVDF膜にトラ
ンスブロットした後、クマシーブリリアントブルーで染
色した。分子量38,000、42,000、45,000の各バンド部分
を切りだし、Ｎ末端アミノ酸配列分析装置HP G1005A Pr
otein Sequencing System （ヒューレットパッカード社
製）を用いてそれぞれのアミノ基末端アミノ酸残基を調
べた。試料は予めS-還元ピリジルエチル化処理を行っ
た。その結果、いずれのバンドもアミノ基末端にLys を
持ち配列番号１に記載の構造を有するタンパク質と、ア
ミノ基末端にVal を持ち配列番号２に記載の構造を有す
るタンパク質の混合物であることが判明した。各バンド
中の配列番号１に記載の構造を有するタンパク質と配列
番号２に記載の構造を有するタンパク質との比率は、い
ずれも1.4 〜2.8 ：１の範囲内であった。このタンパク
質の混合物は次の６種類のタンパク質からなっていた。
分子量38,000でＮ末端アミノ酸配列として配列番号１
に記載の構造を有するタンパク質、分子量38,000でＮ
末端アミノ酸配列として配列番号２に記載の構造を有す
るタンパク質、分子量42,000でＮ末端アミノ酸配列と
して配列番号１に記載の構造を有するタンパク質、分
子量42,000でＮ末端アミノ酸配列として配列番号２に記
載の構造を有するタンパク質、分子量45,000でＮ末端
アミノ酸配列として式配列番号１に記載の構造を有する
タンパク質、および分子量45,000でＮ末端アミノ酸配
列として配列番号２に記載の構造を有するタンパク質。 Example 6 Amino Acid of Human Cancer Specific Protein
Determination of the amino acid sequence at the terminal end of the human cancer The urinary protein of a human cancer patient that binds to the hLBS-1 monoclonal antibody was reduced to 10% S under reducing conditions in the same manner as in Example 5.
After performing DS polyacrylamide gel electrophoresis and trans-blotting on a PVDF membrane, the cells were stained with Coomassie brilliant blue. Each band of molecular weight 38,000, 42,000, 45,000 was cut out, and N-terminal amino acid sequence analyzer HP G1005A Pr
Each amino group terminal amino acid residue was examined using otein Sequencing System (Hewlett-Packard). The sample was previously subjected to an S-reduced pyridylethylation treatment. As a result, it was found that each band was a mixture of a protein having Lys at the amino terminal and having the structure of SEQ ID NO: 1 and a protein having Val at the amino terminal and having the structure of SEQ ID NO: 2. did. The ratio of the protein having the structure of SEQ ID NO: 1 to the protein having the structure of SEQ ID NO: 2 in each band was in the range of 1.4 to 2.8: 1. This mixture of proteins consisted of the following six proteins.
SEQ ID NO: 1 as N-terminal amino acid sequence with a molecular weight of 38,000
A protein having a molecular weight of 38,000 and N
A protein having the structure of SEQ ID NO: 2 as the terminal amino acid sequence, a protein having a molecular weight of 42,000 and having the structure of SEQ ID NO: 1 as the N-terminal amino acid sequence, and a 42,000 molecular weight having the structure of SEQ ID NO: 2 as the N-terminal amino acid sequence; A protein having a molecular weight of 45,000 and having the structure of SEQ ID NO: 1 as the N-terminal amino acid sequence; and a protein having a molecular weight of 45,000 and having the structure of SEQ ID NO: 2 as the N-terminal amino acid sequence.

【００３９】表５測定値（ng/ml ）対象者測定法Ａ測定法Ｂ血漿中尿中尿中健常者（ｎ＝１０） 10180±5916 4.4±3.0 20.3±10.0 ガン患者（ｎ＝７） 11853±2715 77.8±86.0 100.0±102.4 方法Ａ（抗hLBS-1モノクローナル抗体を用いた一段法EI
A ）を用いた場合は、血漿を試料とすると患者、健常者
の測定値の分布に差は認められず、ガン特異タンパク質
の測定はできなかったが、尿を試料とした場合では健常
者と患者の測定値の分布は乖離した。また方法Ｂ（抗PL
G ポリクローナル抗体を用いた一段法EIA ）を用い、尿
を試料とした場合でも、健常者と患者の一部に測定値の
重なりは生じたが、おおよそ健常者と患者の識別は可能
であった。[0039]Table 5 Measured value (ng / ml) Target personMeasurement method A Measurement method B Plasma urine urine Healthy (n = 10) 10180 ± 5916 4.4 ± 3.0 20.3 ± 10.0 Cancer patients (n = 7) 11853 ± 2715 77.8 ± 86.0 100.0 ± 102.4 Method A (one-step method EI using anti-hLBS-1 monoclonal antibody)
A) When plasma is used as a sample, patients and healthy subjects
No difference was observed in the distribution of measured values of
Could not be measured, but it was healthy when urine was used as a sample.
The distributions of the measurements of the subjects and the patients were diverged. Method B (anti-PL
G One-step method using polyclonal antibody EIA)
Even if a sample is used as a sample, the
Although overlapping occurred, it was possible to roughly distinguish healthy patients from patients
Met.

【００４１】[0041]

【００４２】[0042]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. <120> ガン特異タンパク質の測定方法およびガンの診断方法 <130> P2000-115 <140> JP P2000-127207 <141> 2000-4-27 <160> 2 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thy Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thy Gly 1 5[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. <120> Method for measuring cancer-specific protein and diagnostic method for cancer <130> P2000-115 <140> JP P2000-127207 <141> 2000-4- 27 <160> 2 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thy Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thy Gly 1 5

フロントページの続き (72)発明者伊丸岡智子新潟県新潟市太夫浜字新割182番地三菱瓦斯化学株式会社新潟研究所内 (72)発明者莪山眞與新潟県新潟市太夫浜字新割182番地三菱瓦斯化学株式会社新潟研究所内 (72)発明者田原寅一新潟県新潟市太夫浜字新割182番地三菱瓦斯化学株式会社新潟研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA44 GA01 4B064 AG27 CA20 DA14 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74 Continued on the front page (72) Inventor Tomoko Imaruoka 182 Niigata, Niigata Niigata City Niigata Research Laboratories Niigata Research Laboratory Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. Address: Niigata Research Laboratory, Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

【請求項１】ヒトガン患者尿中に存在し、血管内皮細
胞増殖抑制活性を有し、還元条件下のドデシル硫酸ナト
リウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定さ
れる分子量が38,000、42,000または45,000であり、アミ
ノ基末端アミノ酸配列が下記式（１）または式（２）で
あるタンパク質に結合する抗体または該抗体フラグメン
トを使用することを特徴とするガン特異タンパク質の測
定方法。 Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （１） Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （２）The present invention has a molecular weight of 38,000, 42,000 or 45,000, which is present in the urine of a human cancer patient, has vascular endothelial cell growth inhibitory activity, and is measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. A method for measuring a cancer-specific protein, comprising using an antibody or an antibody fragment thereof, which binds to a protein having an amino-terminal amino acid sequence represented by the following formula (1) or (2). Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (1) Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (2)

【請求項２】使用する抗体が、ヒトプラスミノーゲン
に結合可能な抗体である請求項１記載の測定方法。2. The method according to claim 1, wherein the antibody used is an antibody capable of binding to human plasminogen.

【請求項３】ヒトガン患者尿中に存在し、血管内皮細
胞増殖抑制活性を有し、還元条件下のドデシル硫酸ナト
リウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定さ
れる分子量が38,000、42,000または45,000であり、アミ
ノ基末端アミノ酸配列が下記式（１）または式（２）で
あるタンパク質に結合する抗体または該抗体フラグメン
トを使用してヒト尿中の該タンパク質を測定することを
特徴とするガンを診断する方法。 Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （１） Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- （２）3. It has a vascular endothelial cell growth inhibitory activity in the urine of a human cancer patient, and has a molecular weight of 38,000, 42,000 or 45,000 as measured by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. Diagnosing a cancer characterized by measuring the protein in human urine using an antibody or an antibody fragment that binds to a protein having an amino terminal amino acid sequence represented by the following formula (1) or (2): Method. Lys-Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (1) Val-Tyr-Leu-Ser-Glu-Cys-Lys-Thr-Gly- (2)

【請求項４】使用する抗体が、ヒトプラスミノーゲン
に結合可能な抗体である請求項３記載のガンを診断する
方法。4. The method for diagnosing cancer according to claim 3, wherein the antibody used is an antibody capable of binding to human plasminogen.

【請求項５】診断するガンが遠隔転移を有するガンで
ある請求項３記載のガンを診断する方法。5. The method according to claim 3, wherein the cancer to be diagnosed is a cancer having distant metastasis.