JP2001124750A - Measuring method for alkylphenols - Google Patents
Measuring method for alkylphenolsInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、環境ホルモンとし
て疑いが持たれている、環境中のアルキルフェノール類
（炭素数４〜１２のアルキル基を有するアルキルフェノ
ールやビスフェノールＡなど）を高感度で測定する方法
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for measuring highly sensitive alkylphenols (such as alkylphenols having an alkyl group having 4 to 12 carbon atoms and bisphenol A) which are suspected as environmental hormones. About.
【０００２】[0002]
【従来の技術】環境ホルモンとして疑いが持たれている
環境中のアルキルフェノール類（炭素数４〜１２のアル
キル基を有するアルキルフェノールやビスフェノールＡ
など）の測定は、水試料の場合、試料１Ｌ（リットル）
から対象物を抽出して抽出液を１０００倍濃縮した後
に、ＧＣ−ＭＳ法により行われていた。しかし、ＧＣ−
ＭＳ法での検出下限は１０〜１００ｐｐｂ程度であっ
た。また、測定に当たっては、大量の水試料を必要とす
る上に、抽出、濃縮等の煩雑な操作が必要であった。2. Description of the Related Art Alkylphenols in the environment suspected as environmental hormones (such as alkylphenols having an alkyl group having 4 to 12 carbon atoms and bisphenol A)
For example, in the case of a water sample, the sample is 1 L (liter)
, And the extract was concentrated 1000-fold, followed by the GC-MS method. However, GC-
The lower limit of detection by the MS method was about 10 to 100 ppb. In addition, the measurement requires a large amount of water sample and also requires complicated operations such as extraction and concentration.
【０００３】一方、２，４−ジメチルフェノール、３−
メチル−４−クロロフェノール等のアルキルフェノール
類を測定する方法として、該アルキルフェノール類を、
アルカリ条件下、相間移動触媒を存在させ、ボルテック
スミキサーで攪拌しながらダンシルクロライドと反応さ
せてダンシル化アルキルフェノール類を生成させ、未反
応ダンシルクロライドを除去した後、ダンシル化アルキ
ルフェノール類を逆相液体クロマトグラフィーにより分
離した後に化学発光検出する方法が知られている（Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５５３（１９９１）３４５−
３５６）。しかしながら、この方法では、環境ホルモン
として疑いが持たれている、ノニルフェノール等の炭素
数の多いアルキル基を有するアルキルフェノールやビス
フェノールＡなどはダンシル化の速度が遅いために定量
性に問題があり、高感度で測定することができなかっ
た。On the other hand, 2,4-dimethylphenol, 3-
As a method for measuring an alkylphenol such as methyl-4-chlorophenol, the alkylphenol is
Under alkaline conditions, in the presence of a phase transfer catalyst, react with dansyl chloride while stirring with a vortex mixer to produce dansylated alkylphenols, remove unreacted dansyl chloride, and then reverse-phase liquid chromatography the dansylated alkylphenols. A method for detecting chemiluminescence after separation by J.I.
Chromatogr. , 553 (1991) 345-.
356). However, in this method, alkylphenol having an alkyl group having a large number of carbon atoms, such as nonylphenol, and bisphenol A, which are suspected as environmental hormones, have a problem in quantitativeness due to the low rate of dansylation, resulting in high sensitivity. Could not be measured.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、環境ホルモ
ンとして疑いが持たれている環境中のアルキルフェノー
ル類（炭素数４〜１２のアルキル基を有するアルキルフ
ェノールやビスフェノールＡ）を高感度で測定できる方
法を提供することを課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for measuring alkylphenols (alkylphenols having an alkyl group having 4 to 12 carbon atoms or bisphenol A) in the environment suspected as environmental hormones with high sensitivity. The task is to provide
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明の課題は、（１）
アルカリ条件下で、かつ相間移動触媒の存在のもと、水
試料中のアルキルフェノール類を蛍光ラベル化剤と超音
波処理下で反応させて、蛍光ラベル化されたアルキルフ
ェノール類を生成させる工程と、（２）未反応の蛍光ラ
ベル化剤と前工程の副生成物とを除去する工程と、
（３）前記の蛍光ラベル化されたアルキルフェノール類
を逆相液体クロマトグラフィーにより分離した後に化学
発光検出する工程と、を備えたことを特徴とするアルキ
ルフェノール類の測定方法により解決される。The object of the present invention is to provide (1)
Reacting alkylphenols in a water sample with a fluorescent labeling agent under ultrasonic treatment under alkaline conditions and in the presence of a phase transfer catalyst to produce fluorescently labeled alkylphenols; ( 2) removing the unreacted fluorescent labeling agent and the by-product of the previous step;
And (3) a step of separating the above-mentioned fluorescently labeled alkylphenols by reversed-phase liquid chromatography and then detecting chemiluminescence.
【０００６】即ち、本発明は、（１）アルキルフェノー
ル類の水溶液にアルカリ水溶液（ＮａＯＨ水溶液等）を
加えてアルカリ性にした後、相関移動触媒（テトラブチ
ルアンモニウムブロマイド等）の水溶液及び蛍光ラベル
化剤（ダンシルクロライド等）の塩化メチレン溶液を加
え、室温で約１０分間超音波処理して誘導体化反応を行
って、（２）反応後、その塩化メチレン層をミニカラム
（シリカゲルミニカラムの下にＮＨ2ミニカラムを連結
したもの）に通し、過剰のダンシルクロライドや副生成
物のスルホン酸塩を除去し、（３）得られた反応生成物
（ダンシル誘導体）を逆相ＨＰＬＣで分離した後、これ
をオンライン下でＴＤＰＯ（過シュウ酸エステル）と過
酸化水素を予め混合した溶液と混合・反応させ、生じた
発光を検出する、アルキルフェノール類の測定方法に関
する。That is, according to the present invention, (1) an aqueous solution of an alkylphenol is made alkaline by adding an aqueous alkali solution (eg, an aqueous NaOH solution), and then an aqueous solution of a phase transfer catalyst (eg, tetrabutylammonium bromide) and a fluorescent labeling agent ( A methylene chloride solution of dansyl chloride or the like is added, and a derivatization reaction is carried out by sonication at room temperature for about 10 minutes. (2) After the reaction, the methylene chloride layer is placed on a mini column (an NH 2 mini column is placed under a silica gel mini column). Excess dansyl chloride and by-product sulfonate were removed, and (3) the resulting reaction product (dansyl derivative) was separated by reversed-phase HPLC. Mixing and reacting with a solution in which TDPO (peroxalate) and hydrogen peroxide are mixed in advance, and detecting the generated luminescence; Method for measuring Le kill phenols.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】本発明の方法により測定されるア
ルキルフェノール類としては、炭素数４〜１２（好まし
くは４〜９）のアルキル基を有するアルキルフェノール
及び／又はビスフェノールＡが挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Examples of the alkylphenols measured by the method of the present invention include alkylphenol having an alkyl group having 4 to 12 (preferably 4 to 9) carbon atoms and / or bisphenol A.
【０００８】前記の炭素数４〜１２のアルキル基として
は、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ
−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ノニ
ル基、ｎ−ドデシル基等が挙げられる。そして、炭素数
４〜１２のアルキル基を有するアルキルフェノールとし
ては、例えば、ｐ−ｎ−ブチルフェノール、ｐ−ｔ−ブ
チルフェノール、ｐ−ｎ−ペンチルフェノール、ｐ−ｎ
−ヘキシルフェノール、ｐ−ｎ−ヘプチルフェノール、
ｐ−ｎ−オクチルフェノール、ｐ−ノニルフェノール等
が具体的に挙げられる。The alkyl group having 4 to 12 carbon atoms includes n-butyl, t-butyl, n-pentyl and n-butyl.
-Hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group, nonyl group, n-dodecyl group and the like. Examples of the alkylphenol having an alkyl group having 4 to 12 carbon atoms include pn-butylphenol, pt-butylphenol, pn-pentylphenol, and pn
-Hexylphenol, pn-heptylphenol,
Specific examples include pn-octylphenol and p-nonylphenol.
【０００９】本発明の方法では、前記アルキルフェノー
ル類を含有する試料は水試料として測定に供されること
が好ましい。水試料は環境中から通常に採取できるもの
（河川水、湖沼水、海水、地下水、雨水等）でよい。ポ
リカーボネート、ポリスルホン等のポリマーからの溶出
分を対象とする場合は、熱水又はアルカリ水溶液等でポ
リマーからアルキルフェノール類を溶出させた水試料が
使用される。In the method of the present invention, it is preferable that the sample containing the alkylphenols is subjected to measurement as a water sample. The water sample may be one that can be normally collected from the environment (river water, lake water, seawater, groundwater, rainwater, etc.). When eluting from a polymer such as polycarbonate or polysulfone is targeted, a water sample in which an alkylphenol is eluted from the polymer with hot water or an aqueous alkaline solution is used.
【００１０】これら水試料は必要であれば濃縮又は希釈
しても差し支えないが、通常は１〜１０ｍｌの試料を濃
縮することなくそのまま測定に供することができる。本
発明の方法では、少量の試料で簡便に測定できるため、
例えば、水試料は１ｍｌであればよい。水試料中のアル
キルフェノール類の濃度は、水試料の濃縮又は希釈によ
り測定可能な濃度範囲とすることができれば特に制限さ
れるものではない。[0010] These water samples may be concentrated or diluted if necessary, but usually 1 to 10 ml of the sample can be directly used for measurement without concentration. In the method of the present invention, since measurement can be easily performed with a small amount of sample,
For example, the water sample may be 1 ml. The concentration of the alkylphenols in the water sample is not particularly limited as long as the concentration can be measured by concentration or dilution of the water sample.
【００１１】本発明の方法で使用される蛍光ラベル化剤
としては、ダンシルクロライド、バンシルクロライドな
どが挙げられるが、ダンシルクロライドが好ましい。ダ
ンシルクロライドを使用する場合、ダンシル化アルキル
フェノール類が蛍光ラベル化アルキルフェノール類とし
て生成し、スルホン酸塩、例えば、ダンシルヒドロキサ
イドのアルカリ塩（ダンシルヒドロキサイドのアルカリ
金属塩）などが副生成物として生成する。Examples of the fluorescent labeling agent used in the method of the present invention include dansyl chloride and bansyl chloride, and dansyl chloride is preferred. When dansyl chloride is used, dansylated alkylphenols are formed as fluorescently labeled alkylphenols, and sulfonates such as alkali salts of dansyl hydroxide (alkali metal salts of dansyl hydroxide) are formed as by-products. .
【００１２】本発明の測定方法の手順を以下に述べる。 （１）最初の工程では、アルカリ条件下で、かつ相間移
動触媒の存在のもと、前記水試料中のアルキルフェノー
ル類を蛍光ラベル化剤と超音波処理下で反応させて、蛍
光ラベル化されたアルキルフェノール類を生成させる操
作（アルキルフェノール類の蛍光ラベル化）が行われ
る。The procedure of the measuring method of the present invention will be described below. (1) In the first step, the alkyl phenols in the water sample were reacted with a fluorescent labeling agent under ultrasonic treatment under an alkaline condition and in the presence of a phase transfer catalyst to perform fluorescent labeling. An operation of generating alkylphenols (fluorescent labeling of alkylphenols) is performed.
【００１３】前記（１）の操作（蛍光ラベル化）におい
て、アルカリ条件下とする方法は、水試料のｐＨを１０
〜１２程度に調整できる方法であれば特に制限されな
い。即ち、アルカリ種、アルカリ濃度、アルカリ添加量
などは、ｐＨを前記範囲に維持でき、かつ操作を煩雑に
しなければ特に制限されない。通常はアルカリ金属水酸
化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）やアルカ
リ金属炭酸塩（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）の水
溶液が使用される。本発明の方法では、少量の試料で簡
便に測定するため、例えば、中性の水試料１ｍｌに０．
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２０μｌを添加すればよ
い。In the above operation (1) (fluorescence labeling), the method under alkaline conditions is to adjust the pH of the water sample to 10
The method is not particularly limited as long as it can be adjusted to about 12. That is, the alkali species, alkali concentration, alkali addition amount, and the like are not particularly limited as long as the pH can be maintained in the above range and the operation is not complicated. Usually, an aqueous solution of an alkali metal hydroxide (such as sodium hydroxide or potassium hydroxide) or an alkali metal carbonate (such as sodium carbonate or potassium carbonate) is used. In the method of the present invention, for simple measurement with a small amount of a sample, for example, 0.1% is added to 1 ml of a neutral water sample.
What is necessary is just to add 20 microliters of 1N sodium hydroxide aqueous solution.
【００１４】前記相間移動触媒としては、テトラアルキ
ルアンモニウムハライドが好適に使用される。このアル
キル基は、メチル基、エチル基、ブチル基、ヘキシル
基、オクチル基等の炭素数１〜８のアルキル基が好まし
く、ハライドとしては、クロライド、ブロマイド等が好
ましい。相間移動触媒として、具体的には。テトラブチ
ルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウム
ブロマイド、テトラヘキシルアンモニウムブロマイド等
が挙げられるが、中でもテトラブチルアンモニウムブロ
マイド、テトラヘキシルアンモニウムブロマイドが好ま
しい。As the phase transfer catalyst, a tetraalkylammonium halide is preferably used. The alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, a butyl group, a hexyl group, an octyl group, and the halide is preferably a chloride, a bromide or the like. Specifically, as a phase transfer catalyst. Examples thereof include tetrabutylammonium chloride, tetrabutylammonium bromide, and tetrahexylammonium bromide. Of these, tetrabutylammonium bromide and tetrahexylammonium bromide are preferable.
【００１５】相間移動触媒は水試料に対して０．０１〜
１重量％の割合で使用することが好ましい。本発明の方
法では、少量の試料で簡便に測定するため、例えば、水
試料１ｍｌに１重量％テトラブチルアンモニウムブロマ
イド水溶液１００μｌを添加すればよい。なお、相間移
動触媒は通常は水溶液（例えば、１重量％水溶液）で水
試料に添加される。[0015] The phase transfer catalyst is 0.01 to
It is preferred to use 1% by weight. In the method of the present invention, for example, 100 μl of a 1% by weight aqueous solution of tetrabutylammonium bromide may be added to 1 ml of a water sample in order to easily measure a small amount of the sample. The phase transfer catalyst is usually added to a water sample as an aqueous solution (for example, a 1% by weight aqueous solution).
【００１６】蛍光ラベル化剤は、水試料に対して０．０
０１〜０．０１重量％の割合で使用することが好まし
い。本発明の方法では、少量の試料で簡便に測定するた
め、例えば、水試料１ｍｌに蛍光ラベル化剤／塩化メチ
レン溶液（蛍光ラベル化剤濃度：２０ｐｐｍ）１ｍｌを
添加すればよい。なお、蛍光ラベル化は通常は有機溶媒
溶液（例えば、２０ｐｐｍ有機溶媒溶液）で水試料に添
加することが好ましい。この有機溶媒としては、脂肪族
ハロゲン化炭化水素などが好ましいが、中でも、塩化メ
チレン、クロロホルムが好ましい。The fluorescent labeling agent is used in an amount of 0.0
Preferably, it is used in a proportion of from 0.01 to 0.01% by weight. In the method of the present invention, for simple measurement with a small amount of sample, for example, 1 ml of a fluorescent labeling agent / methylene chloride solution (fluorescent labeling agent concentration: 20 ppm) may be added to 1 ml of a water sample. In addition, it is preferable that fluorescent labeling is usually added to a water sample in an organic solvent solution (for example, a 20 ppm organic solvent solution). As the organic solvent, aliphatic halogenated hydrocarbons and the like are preferable, and among them, methylene chloride and chloroform are preferable.
【００１７】本発明の方法では、アルキルフェノール類
の蛍光ラベル化は、前記アルカリ条件下で、相間移動触
媒のもと、アルキルフェノール類を蛍光ラベル化剤と超
音波処理下で反応させることにより行われる。このと
き、反応温度は室温（１５〜３０℃）であればよく、反
応時間は５〜２０分程度であればよい。本発明の方法で
は、少量の試料で簡便に測定するため、例えば、前記の
ように、アルカリ及び相間移動触媒を添加した水試料を
室温で約１０分間超音波処理すればよい。この超音波処
理により、蛍光ラベル化の収率を著しく向上させて、水
試料中のアルキルフェノール類を高感度で測定できるよ
うになる。In the method of the present invention, the fluorescent labeling of the alkylphenols is carried out by reacting the alkylphenols with a fluorescent labeling agent under the alkaline conditions under a phase transfer catalyst under ultrasonic treatment. At this time, the reaction temperature may be room temperature (15-30 ° C.), and the reaction time may be about 5-20 minutes. In the method of the present invention, in order to easily measure a small amount of a sample, for example, as described above, a water sample to which an alkali and a phase transfer catalyst have been added may be subjected to ultrasonic treatment at room temperature for about 10 minutes. By this ultrasonic treatment, the yield of the fluorescent labeling is significantly improved, and the alkylphenols in the water sample can be measured with high sensitivity.
【００１８】本発明の測定方法では、次の工程で、
（２）生成した蛍光ラベル化されたアルキルフェノール
類と共存する、未反応の蛍光ラベル化剤と、前工程の副
生成物、例えば、スルホン酸塩（ダンシルヒドロキサイ
ドとアルカリとの塩）とを除去する操作が行われ、そし
て、次の工程で、（３）蛍光ラベル化されたアルキルフ
ェノール類を逆相液体クロマトグラフィーにより分離し
た後に化学発光検出する操作が行われる。In the measuring method of the present invention, the following steps
(2) Removal of unreacted fluorescent labeling agent coexisting with the generated fluorescently labeled alkylphenol and by-products of the previous step, for example, sulfonate (salt of dansyl hydroxide and alkali) Then, in the next step, (3) an operation of separating the fluorescently labeled alkylphenols by reversed-phase liquid chromatography and then detecting chemiluminescence is performed.
【００１９】即ち、前記（２）及び（３）の操作は、
前記蛍光ラベル化の反応液（水相と有機相からなる）か
ら有機相（塩化メチレン相）を分離する、水相を塩化
メチレンで抽出する、この抽出液と前記有機相を合せ
て、未反応の蛍光ラベル化剤と前工程の副生成物とを除
去するミニカラム（順相ミニカラム）に供する、該ミ
ニカラムを通過した蛍光ラベル化されたアルキルフェノ
ール類含有画分を濃縮して塩化メチレンを除去する、
この残渣にアセトニトリル１ｍｌを正確に添加する、
このアセトニトリル溶液を用いて、蛍光ラベル化アルキ
ルフェノール類を逆相クロマトグラフィーにより分離し
た後に化学発光検出する、という一連の操作により行わ
れる。That is, the operations (2) and (3) are as follows:
Separate the organic phase (methylene chloride phase) from the fluorescent labeling reaction solution (consisting of an aqueous phase and an organic phase), extract the aqueous phase with methylene chloride. Subjecting to a mini-column (normal-phase mini-column) for removing the fluorescent labeling agent and by-products of the previous step, concentrating the fluorescently labeled alkylphenol-containing fraction passing through the mini column to remove methylene chloride,
Add exactly 1 ml of acetonitrile to this residue,
This acetonitrile solution is used to perform a series of operations in which fluorescent-labeled alkylphenols are separated by reverse phase chromatography and then chemiluminescence is detected.
【００２０】前記操作は通常の方法で行えばよいが、こ
のうち、の操作は、例えば、塩化メチレン１ｍｌで２
回行うことが好ましく、の操作は、例えば、シリカゲ
ルミニカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ シリカ（ウォーターズ
製）など）とＮＨ2ミニカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌ
ｕｓ ＮＨ2（ウォーターズ製）など）を順に連結した
ミニカラム（順相ミニカラム）を用いて行うことが好ま
しい。水試料１ｍｌを用いて各操作を前記スケールで行
って測定する場合、このミニカラムを５〜８ｍｌの塩化
メチレンで洗浄すれば、蛍光ラベル化されたアルキルフ
ェノール類含有画分はカラムを通過した画分として得る
ことができる。の操作は窒素気流下で行うことが好ま
しい。The above-mentioned operation may be carried out by a usual method.
The operation is preferably performed twice, for example, using a silica gel mini column (Sep-Pak silica (manufactured by Waters)) and an NH 2 mini column (Sep-Pak Pl).
us NH 2 (manufactured by Waters) is preferably connected using a mini-column (normal-phase mini-column). When performing each operation on the above scale using 1 ml of a water sample for measurement, if the mini-column is washed with 5 to 8 ml of methylene chloride, the fluorescent-labeled alkylphenol-containing fraction becomes the fraction that has passed through the column. Obtainable. Is preferably performed under a nitrogen stream.
【００２１】の操作は、通常の逆相クロマトグラフィ
ー（Ｃ18系、Ｃ8系カラムなど）及び化学発光検出（過
シュウ酸エステル（ＴＤＰＯ等）−過酸化水素系など）
により行われるが、例えば、逆相カラムと化学発光検出
器を備えた高速液体クロマトグラフィー装置（ＬＣ−９
００型；日本分光製）を用いてオンライン下で行うこと
が好ましい。この分析はその条件を後述の実施例に例示
する。また、この分析におけるサンプル量は特に制限さ
れないが、測定感度や注入再現性などを考慮すれば、前
記アセトニトリル溶液５〜１０μｌを用いて行うことが
好ましい。The operation is generally the reverse phase chromatography (C 18 type, such as C 8 based columns) and chemiluminescent detection (peroxyoxalate (tdpo etc.) - hydrogen peroxide, etc.)
For example, a high performance liquid chromatography apparatus (LC-9) equipped with a reversed-phase column and a chemiluminescence detector
It is preferable to carry out the measurement online using Model 00 (manufactured by JASCO Corporation). This analysis illustrates the conditions in the examples below. Although the sample amount in this analysis is not particularly limited, it is preferable to use 5 to 10 μl of the acetonitrile solution in consideration of measurement sensitivity and injection reproducibility.
【００２２】この分析に当たって、別途調製したアルキ
ルフェノール類の標準溶液（水試料）について前記の各
操作を行って測定値（反応収率）を求めたところ、試料
濃度０．５〜５ｐｐｂの範囲で平均８０％程度の測定値
（反応率）を得ることができ、反応性は充分に高いもの
であった。また、高速液体クロマトグラフィー分析にお
ける面積カウント数をアルキルフェノール類の濃度に対
してプロットしたところ、アルキルフェノール類の濃度
と面積カウント数の間には高い相関性（直線性）が認め
られ、検出下限はｐ−ノニルフェノールで０．０５ｐｐ
ｂであった。この直線から得られる回帰式は、環境中か
ら採取した水試料を分析する際の検量線として使用する
ことができる。In this analysis, when a standard solution (a water sample) of an alkylphenol compound prepared separately was subjected to each of the above operations to determine a measured value (reaction yield), the average value was obtained in a sample concentration range of 0.5 to 5 ppb. A measured value (reaction rate) of about 80% was obtained, and the reactivity was sufficiently high. Further, when the area count number in the high performance liquid chromatography analysis was plotted against the concentration of the alkylphenols, a high correlation (linearity) was observed between the concentration of the alkylphenols and the area count number, and the lower limit of detection was p. -0.05 pp with nonylphenol
b. The regression equation obtained from this straight line can be used as a calibration curve when analyzing a water sample collected from the environment.
【００２３】本発明の測定方法によれば、アルキルフェ
ノール類は、例えば、（１）アルカリ条件下で、かつ相
間移動触媒の存在のもと、水試料中のアルキルフェノー
ル類を蛍光ラベル化剤と超音波処理下で反応させて、蛍
光ラベル化されたアルキルフェノール類を生成させる反
応装置と、（２）未反応の蛍光ラベル化剤と前工程の副
生成物とを除去する除去装置と、（３）前記蛍光ラベル
化されたアルキルフェノール類を逆相液体クロマトグラ
フィーにより分離した後に化学発光検出する検出装置
と、を備えたことを特徴とするアルキルフェノール類の
測定装置により測定することができる。According to the measuring method of the present invention, alkylphenols can be obtained by, for example, (1) subjecting alkylphenols in a water sample to a fluorescent labeling agent and an ultrasonic wave under alkaline conditions and in the presence of a phase transfer catalyst. A reaction device for producing a fluorescently labeled alkylphenol by reacting under the treatment; (2) a removing device for removing unreacted fluorescent labeling agent and a by-product of the previous step; And a detection device for detecting chemiluminescence after separating the fluorescent-labeled alkylphenols by reversed-phase liquid chromatography.
【００２４】前記反応装置は、超音波処理下でアルキル
フェノール類を蛍光ラベル化できる装置であれば特に制
限されない。例えば、超音波洗浄装置とガラス製反応器
（アンプル管など）とを組合せた装置が挙げられる。前
記除去装置も蛍光ラベル化の未反応物や副生成物を除去
できる装置であれば特に制限されない。例えば、前記順
相カラムを備えた液体クロマトグラフィー装置が挙げら
れる。前記検出装置としては、例えば、前記の逆相カラ
ムと化学発光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィ
ー装置（ＬＣ−９００型；日本分光製）などが好適に挙
げられる。この概念図を図１に示す。The reaction apparatus is not particularly limited as long as it can fluorescently label alkylphenols under ultrasonic treatment. For example, there is an apparatus in which an ultrasonic cleaning apparatus is combined with a glass reactor (such as an ampule tube). The removal device is not particularly limited as long as it can remove unreacted substances and by-products of fluorescent labeling. For example, there is a liquid chromatography apparatus provided with the normal phase column. As the detection device, for example, a high-performance liquid chromatography device (type LC-900; manufactured by JASCO Corporation) equipped with the above-described reversed-phase column and a chemiluminescence detector is preferably exemplified. This conceptual diagram is shown in FIG.
【００２５】[0025]
【実施例】次に、実施例及び比較例を挙げて本発明を具
体的に説明する。 実施例１ アルキルフェノール類としてｐ−ノニルフェノールを純
水に添加して調製した水試料（ｐ−ノニルフェノール濃
度：１．０ｐｐｂ）１ｍｌを１０ｍｌ容アンプル管に入
れ、これに、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２０μ
ｌ、１重量％テトラブチルアンモニウムブロマイド水溶
液１００μｌ、ダンシルクロライド／塩化メチレン溶液
（ダンシルクロライド濃度：２０ｐｐｍ）１ｍｌを添加
し、室温下、超音波洗浄装置中で１０分間処理してダン
シル化を行った。Next, the present invention will be described specifically with reference to examples and comparative examples. Example 1 1 ml of a water sample (p-nonylphenol concentration: 1.0 ppb) prepared by adding p-nonylphenol as an alkylphenol to pure water was put into a 10 ml ampoule tube, and 20 μl of a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution was added thereto.
1, 100% of a 1% by weight aqueous solution of tetrabutylammonium bromide and 1 ml of a solution of dansyl chloride / methylene chloride (concentration of dansyl chloride: 20 ppm) were added, and the mixture was subjected to dansylation by treatment in an ultrasonic cleaning device at room temperature for 10 minutes.
【００２６】処理終了後、塩化メチレン相を分離し、水
相は更に塩化メチレン１ｍｌで２回抽出した。前記塩化
メチレン相と抽出液を合せて、シリカゲルミニカラム
（Ｓｅｐ−Ｐａｋ シリカ；ウォーターズ製）とＮＨ2
ミニカラム（Ｓｅｐ−ＰａｋＰｌｕｓ ＮＨ2；ウォー
ターズ製）を連結した順相ミニカラムに供し、塩化メチ
レン６ｍｌで洗浄して、順相ミニカラムを通過したダン
シル化アルキルフェノール類含有画分を得た。After the treatment, the methylene chloride phase was separated, and the aqueous phase was further extracted twice with 1 ml of methylene chloride. The methylene chloride phase and the extract were combined, and a silica gel mini column (Sep-Pak silica; manufactured by Waters) was added to NH 2.
Mini column (Sep-PakPlus NH 2; Waters) was subjected to normal phase mini column linked and washed with methylene chloride 6 ml, to give the dansyl alkylphenols containing fraction that passes through the normal phase mini-column.
【００２７】次いで、この画分を窒素気流下で濃縮して
塩化メチレンを除去した後、その残渣にアセトニトリル
１ｍｌを正確に加えて混合し、その５μｌを逆相カラム
及び化学発光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィ
ー装置（ＬＣ−９００型；日本分光製）を用いて分析し
た。この装置の概念図を図１に示す。その結果、測定値
（反応収率）は供試ｐ−ノニルフェノールの７６．９％
に相当する値であった。このクロマトグラムを標準溶液
（ｐ−ノニルフェノール濃度：１．０ｐｐｂ）のクロマ
トグラムと共に図２に示す。Next, this fraction was concentrated under a stream of nitrogen to remove methylene chloride, 1 ml of acetonitrile was accurately added to the residue and mixed, and 5 μl of the residue was equipped with a reverse phase column and a chemiluminescence detector. The analysis was performed using a high performance liquid chromatography apparatus (LC-900; manufactured by JASCO Corporation). FIG. 1 shows a conceptual diagram of this device. As a result, the measured value (reaction yield) was 76.9% of the test p-nonylphenol.
Was a value corresponding to This chromatogram is shown in FIG. 2 together with the chromatogram of the standard solution (p-nonylphenol concentration: 1.0 ppb).
【００２８】高速液体クロマトグラフィーの条件は下記
の通りである。 カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ−Ｈ８０（φ４．６
ｍｍ×１５０ｍｍ） 移動相：アセトニトリル／５０ｍＭイミダゾール水溶液
（９０／１０（v/v）；硝酸でｐＨ７．０に調整） カラム温度：４０℃ 検出：化学発光検出 反応液：酢酸エチル／アセトニトリル（５０／５０（v/
v）；ＴＤＰＯを０．２５ｍＭで、過酸化水素を１２．
５ｍＭで含有する） 反応液流量：１．４ｍｌ／ｍｉｎ 反応温度：４０℃ 注入量：５μｌThe conditions for high performance liquid chromatography are as follows. Column: J'sphere ODS-H80 (φ4.6
mobile phase: acetonitrile / 50 mM imidazole aqueous solution (90/10 (v / v); adjusted to pH 7.0 with nitric acid) Column temperature: 40 ° C. Detection: chemiluminescence detection Reaction solution: ethyl acetate / acetonitrile (50 / 50 (v /
v); TDPO at 0.25 mM and hydrogen peroxide at 12.
Reaction solution flow rate: 1.4 ml / min Reaction temperature: 40 ° C. Injection volume: 5 μl
【００２９】実施例２ ｐ−ノニルフェノールの濃度を０．１ｐｐｂ、０．５ｐ
ｐｂ、５．０ｐｐｂに変えた試料各１ｍｌについて、実
施例１と同様にして分析した。その結果を実施例１の結
果と併せて表１に示す。Example 2 The concentrations of p-nonylphenol were 0.1 ppb and 0.5 ppb.
1 ml of each of the samples changed to pb and 5.0 ppb was analyzed in the same manner as in Example 1. Table 1 shows the results together with the results of Example 1.
【００３０】[0030]
【表１】 [Table 1]
【００３１】また、実施例１及び２の結果を分析時の面
積カウント数に対してプロットすると図３に示す直線が
得られた。この結果、本発明の方法によれば、ｐ−ノニ
ルフェノールの検出下限は０．０５ｐｐｂであり、非常
に高感度でｐ−ノニルフェノールを測定できることがわ
かった。When the results of Examples 1 and 2 were plotted against the area counts at the time of analysis, a straight line shown in FIG. 3 was obtained. As a result, according to the method of the present invention, the lower limit of detection of p-nonylphenol was 0.05 ppb, indicating that p-nonylphenol can be measured with extremely high sensitivity.
【００３２】比較例１ 超音波洗浄装置に代えてボルテックスミキサーで１０分
間処理したほかは、実施例１と同様にして分析した。そ
の結果、測定値は供試ｐ−ノニルフェノールの２０〜５
０％に相当する値を示す程度であり、再現性も得られな
かった。Comparative Example 1 The analysis was carried out in the same manner as in Example 1 except that treatment was performed with a vortex mixer for 10 minutes instead of the ultrasonic cleaning apparatus. As a result, the measured value was 20 to 5 for the test p-nonylphenol.
The value was a value corresponding to 0%, and reproducibility was not obtained.
【００３３】実施例３ アルキルフェノール類として、ｐ−ｎ−ブチルフェノー
ル、ｐ−ｎ−ペンチルフェノール、ｐ−ｎ−ヘキシルフ
ェノール、ｐ−ｎ−ヘプチルフェノール、ｐ−ｎ−オク
チルフェノール、ｐ−ノニルフェノール（混合物）、ビ
スフェノールＡをそれぞれ５ｐｐｂ含有する水試料１ｍ
ｌについて、実施例１と同様にして分析した。図４にそ
のクロマトグラムを示す。その結果、測定値は実施例１
と同様の供試濃度相当値であった。ビスフェノールＡの
検出下限は０．０３ｐｐｂであり、ビスフェノールＡも
同様に高感度で測定できることがわかった。Example 3 As alkylphenols, pn-butylphenol, pn-pentylphenol, pn-hexylphenol, pn-heptylphenol, pn-octylphenol, p-nonylphenol (mixture), 1 m water sample containing 5 ppb of bisphenol A
1 was analyzed in the same manner as in Example 1. FIG. 4 shows the chromatogram. As a result, the measured values were obtained in Example 1.
It was the same value as the test concentration. The lower limit of detection of bisphenol A was 0.03 ppb, indicating that bisphenol A can be measured with high sensitivity as well.
【００３４】[0034]
【発明の効果】本発明の測定方法により、環境ホルモン
として疑いが持たれている環境中のアルキルフェノール
類（炭素数４〜１２のアルキル基を有するアルキルフェ
ノールやビスフェノールＡ）を０．０５ｐｐｂ程度〜５
ｐｐｂの高感度で測定することができる。例えば、ノニ
ルフェノールについて測定した場合、試料濃度０．５〜
５ｐｐｂの範囲で平均８０％程度の測定値（反応率）を
得ることができ、反応性は充分に高いものであった。検
出下限はノニルフェノール換算で５０ｎｇ／Ｌ（０．０
５ｐｐｂ）程度であり、ＧＣ／ＭＳ（ＳＩＭ）法におけ
る目標検出下限値１００ｎｇ／Ｌ（０．１ｐｐｂ）と同
等以上の感度であった。また、試料濃度１ｐｐｂの反応
液を用いて室温及び冷蔵条件下での安定性を検討したと
ころ、いずれも１週間後においても変化は認められなか
った。なお、本発明の方法では、これらアルキルフェノ
ール類を含有する水試料を濃縮する必要がないため、少
量の水試料でも充分に高感度で測定できる。更に、例え
ば、水試料を１０００倍濃縮すれば、０．０５ｐｐｔ程
度〜５ｐｐｔの高感度で測定することも可能である。According to the measurement method of the present invention, alkylphenols (alkylphenols having alkyl groups having 4 to 12 carbon atoms or bisphenol A) in the environment which are suspected as environmental hormones are reduced to about 0.05 ppb to 5 ppb.
It can be measured with a high sensitivity of ppb. For example, when measuring nonylphenol, the sample concentration is 0.5 to
A measured value (reaction rate) of about 80% on average could be obtained in the range of 5 ppb, and the reactivity was sufficiently high. The lower limit of detection is 50 ng / L (0.0
5 ppb), which is equivalent to or higher than the target detection lower limit of 100 ng / L (0.1 ppb) in the GC / MS (SIM) method. In addition, when the stability under room temperature and refrigeration conditions was examined using a reaction solution having a sample concentration of 1 ppb, no change was observed even after one week. In the method of the present invention, it is not necessary to concentrate the water sample containing these alkylphenols, so that even a small amount of water sample can be measured with sufficiently high sensitivity. Furthermore, for example, if the water sample is concentrated 1000 times, it is possible to measure with a high sensitivity of about 0.05 to 5 ppt.
【図１】図１は、逆相カラム及び化学発光検出器を備え
た高速液体クロマトグラフィー装置（一例）を示す概念
図である。図中、Ｐ１，Ｐ２はポンプを示し、ＴＤＰＯ
は、ビス［２−（３，６，９−トリオキサデカニルオキ
シガルボニル）−４−ニトロフェニル］オキサレートを
示す。FIG. 1 is a conceptual diagram showing a high-performance liquid chromatography apparatus (one example) equipped with a reversed-phase column and a chemiluminescence detector. In the figure, P1 and P2 indicate pumps, and TDPO
Represents bis [2- (3,6,9-trioxadecanyloxygalbonyl) -4-nitrophenyl] oxalate.
【図２】図２は、実施例１の結果と標準溶液の分析結果
を示すクロマトグラムである。FIG. 2 is a chromatogram showing a result of Example 1 and an analysis result of a standard solution.
【図３】図３は、実施例１及び２の結果を分析時の面積
カウント数に対してプロットした図である。FIG. 3 is a diagram in which the results of Examples 1 and 2 are plotted against the area count number at the time of analysis.
【図４】図４は、実施例３の結果を示すクロマトグラム
である。図中、ｔ−Ｃ４、ｎ−Ｃ８等はアルキルフェノ
ールのアルキル基の炭素数を表し、Ｂｉｓ−Ａはビスフ
ェノールＡを表す。FIG. 4 is a chromatogram showing the results of Example 3. In the figure, t-C4, n-C8 and the like represent the carbon number of the alkyl group of the alkylphenol, and Bis-A represents bisphenol A.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｌ 30/74 30/74 Ａ 30/88 30/88 Ｃ (72)発明者 村中 隆 山口県宇部市大字小串1978番地の５ 株式 会社ユービーイー科学分析センター内 Ｆターム(参考） 4D017 AA01 BA04 DA03 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 30/48 G01N 30/48 L 30/74 30/74 A 30/88 30/88 C (72) Invention Person Takashi Muranaka 5F, 1978 Kogushi, Obe, Ube City, Yamaguchi Prefecture F-term in UBI Scientific Analysis Center Co., Ltd. 4D017 AA01 BA04 DA03
Claims (6)
触媒の存在のもと、水試料中のアルキルフェノール類を
蛍光ラベル化剤と超音波処理下で反応させて、蛍光ラベ
ル化されたアルキルフェノール類を生成させる工程と、
（２）未反応の蛍光ラベル化剤と前工程の副生成物とを
除去する工程と、（３）前記の蛍光ラベル化されたアル
キルフェノール類を逆相液体クロマトグラフィーにより
分離した後に化学発光検出する工程と、を備えたことを
特徴とするアルキルフェノール類の測定方法。(1) A fluorescently labeled alkylphenol is obtained by reacting an alkylphenol in a water sample with a fluorescent labeling agent under ultrasonic treatment under alkaline conditions and in the presence of a phase transfer catalyst. Generating a class,
(2) a step of removing unreacted fluorescent labeling agent and a by-product of the preceding step; and (3) chemiluminescence detection after separating the fluorescently labeled alkylphenols by reverse phase liquid chromatography. And a method for measuring alkylphenols.
２のアルキル基を有するアルキルフェノール及び／又は
ビスフェノールＡである、請求項１記載のアルキルフェ
ノール類の測定方法。2. An alkylphenol having 4 to 1 carbon atoms.
The method for measuring alkylphenols according to claim 1, wherein the alkylphenol is an alkylphenol having two alkyl groups and / or bisphenol A.
アルキル基を有するアルキルフェノールである、請求項
１記載のアルキルフェノール類の測定方法。3. The method for measuring an alkylphenol according to claim 1, wherein the alkylphenol is an alkylphenol having an alkyl group having 4 to 9 carbon atoms.
ノールである、請求項１記載のアルキルフェノール類の
測定方法。4. The method according to claim 1, wherein the alkylphenol is p-nonylphenol.
ある、請求項１記載のアルキルフェノール類の測定方
法。5. The method for measuring an alkylphenol according to claim 1, wherein the fluorescent labeling agent is dansyl chloride.
触媒の存在のもと、水試料中のアルキルフェノール類を
蛍光ラベル化剤と超音波処理下で反応させて、蛍光ラベ
ル化されたアルキルフェノール類を生成させる反応装置
と、（２）未反応の蛍光ラベル化剤と前工程の副生成物
とを除去する除去装置と、（３）前記蛍光ラベル化され
たアルキルフェノール類を逆相液体クロマトグラフィー
により分離した後に化学発光検出する検出装置と、を備
えたことを特徴とするアルキルフェノール類の測定装
置。6. A fluorescently labeled alkylphenol by reacting an alkylphenol in a water sample with a fluorescent labeling agent under ultrasonic treatment under alkaline conditions and in the presence of a phase transfer catalyst. (2) a removing device for removing unreacted fluorescent labeling agent and by-products of the previous step, and (3) reverse-phase liquid chromatography of the fluorescent-labeled alkylphenols And a detection device for detecting chemiluminescence after separation by the method described above.
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|---|---|---|---|
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- 1999-10-26 JP JP30388599A patent/JP2001124750A/en not_active Withdrawn
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