JP2001120092A - Plants resistant to herbicidal agent - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a plant that is resistant to protoporphyrinogen IX oxidase inhibitor type herbicide. SOLUTION: This objective plant is a plant having the protoporphyrinogen IX oxidase activities that is described in the following (1) and (2): (1) Having the activities that substantially differs from the protoporphyrinogen IX oxidase activities in the naturally occurring plant. (2) Capable of imparting the resistance to the herbicide in an amount of inhibiting protoporphyrinogen IX oxidase activities in the naturally occurring plant to another plant. A plant into which the genes encoding the proteins having the properties of the following (3), (4) and (5) are transduced and can express these genes: (3) Specifically bonds to the substances relating to the protoporphyrinogen IX oxidase activities, (4) Substantially has no denaturation ability to the substance to which the proteins specifically bond, (5) Substantially not includes the frame work region in the variable region of the immunoglobulin.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明が属する技術分野】本発明は、除草剤耐性植物に
関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a herbicide-tolerant plant.

【０００２】[0002]

【従来の技術】プロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼ阻害型除草剤は、広範囲な種類の雑草の防除に有効な
除草剤として使用されている。ところが、該除草剤の使
用場面において、作物と近縁の雑草とを明確に区別し
て、雑草のみを選択的に防除することは困難な場合があ
る。2. Description of the Related Art Protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicides have been used as effective herbicides for controlling a wide variety of weeds. However, in the use scene of the herbicide, it may be difficult to clearly distinguish a crop from a closely related weed and selectively control only the weed.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】そこで、作物の栽培領
域の雑草防除をプロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼ阻害型除草剤によって効率よく実施するために、該除
草剤に対する耐性を有する作物の作出が切望されてい
る。Therefore, in order to efficiently control weeds in a cultivated area of a crop with a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide, it has been desired to produce a crop resistant to the herbicide. ing.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、ある種のタンパク質を
植物の細胞で産生させることにより、プロトポルフィリ
ノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤に対して耐性を示
す植物を作出しうることを見出し本発明に至った。即
ち、本発明は、 １）下記(1)および(2)の特性を有するプロトポルフィリ
ノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物であって、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。かつ、下記(3)、(4)および(5)の性質を有す
るタンパク質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺
伝子を発現する植物(以下、本発明植物１と記す。)。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (4)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ２）タンパク質が、植物細胞内プロトポルフィリノーゲ
ンIXオキシダーゼ阻害型除草剤の殺草活性発現に関わる
植物細胞内因性物質に特異的に結合する性質を有するタ
ンパク質である前項１）記載の植物、 ３）タンパク質がプロトポルフィリンIXに特異的に結合
する性質を有するタンパク質である前項１）または２）
記載の植物、 ４）タンパク質が、マグネシウムケラターゼのプロトポ
ルフィリンIX結合サブユニットタンパク質であるか、ま
たは該タンパク質の改変タンパク質であってプロトポル
フィリンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク質
である前項１）、２）または３）記載の植物、 ５）下記(1)および(2)の特性を有するプロトポルフィリ
ノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物であって、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。 かつ、下記(3)、(4)および(5)の性質を有するタンパク
質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現
する植物（以下、本発明植物２と記す。）。 (3)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ６）タンパク質が、フェロケラターゼであるか、または
該タンパク質の改変タンパク質であってプロトポルフィ
リンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク質であ
る前項５）記載の植物、 ７）下記(1)、(2)および(3)の特性を有するプロトポル
フィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物であっ
て、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。 (3)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たないタンパク質により担われる。かつ、下記
(4)、(5)および(6)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現する植物
（以下、本発明植物３と記す。）。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (5)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持
つ。 (6)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ８）タンパク質が、コプロポルフィリノーゲンIIIオキ
シダーゼであるか、または該タンパク質の改変タンパク
質であってプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合
する性質を有するタンパク質である前項７）記載の植
物、 ９）前項１）〜８）記載の植物を増殖させることを特徴
とする除草剤耐性植物の製造方法、 １０）前項１）〜８）記載の植物の栽培域に除草剤を散
布する雑草防除方法、 １１）前項１）〜８）記載の植物の栽培域にプロトポル
フィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤を散布する
プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤
耐性植物の選抜方法、 １２）前項１）〜８）記載の植物の細胞の培養域にプロ
トポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤を添
加するプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型
除草剤耐性植物細胞の選抜方法、 １３）下記(1)の性質を有するタンパク質をコードする
遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、(2)、(3)
および(4)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝
子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含むことを特
徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (2)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (3)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (4)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 １４）下記(1)および(2)の特性を有するプロトポルフィ
リノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物細胞に、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。下記(3)、(4)および(5)の性質を有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含
むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (3)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (4)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 １５）下記(1)、(2)および(3)の性質を有するタンパク
質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現
する植物細胞に、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (2)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。下記(4)の性質を有するタンパク質
をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含むこと
を特徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (4)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 １６）下記(1)の性質を有するタンパク質をコードする
遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、(2)、(3)
および(4)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝
子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含むことを特
徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (2)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (4)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 １７）下記(1)および(2)の特性を有するプロトポルフィ
リノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物細胞に、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。下記(3)、(4)および(5)の性質を有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含
むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (3)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 １８）下記(1)、(2)および(3)の性質を有するタンパク
質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現
する植物細胞に、 (1)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (2)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。下記(4)の性質を有するタンパク質
をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含むこと
を特徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (4)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 １９）下記(1)および(2)の性質を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、
(3)、(4)および(5)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含む
ことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (2)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を実質
的に持たない。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (4)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を有す
る。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ２０）下記(1)、(2)および(3)の特性を有するプロトポ
ルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物細胞
に、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。 (3)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たないタンパク質により担われる。下記(4)、(5)
および(6)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝
子を導入し発現させる工程を含むことを特徴とする除草
剤耐性植物の作製方法、 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (5)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を有す
る。 (6)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ２１）下記(1)、(2)および(3)の性質を有するタンパク
質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現
する植物細胞に、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (2)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を有す
る。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。下記(4)および(5)の性質を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を
含むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法、 (4)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (5)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を実質
的に持たない。 を提供するものである。Under these circumstances, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, produced a certain kind of protein in plant cells to obtain protoporphyrinogen IX oxidase-inhibited herbicide. The present inventors have found that a plant showing resistance to the agent can be produced, and have reached the present invention. That is, the present invention provides: 1) a plant having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2), wherein (1) the natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant is Substantially different. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. A plant into which a gene encoding a protein having the following properties (3), (4) and (5) has been introduced and which expresses the gene (hereinafter referred to as the present plant 1). (3) It specifically binds to a substance related to the herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide. (4) The protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 2) The plant according to 1), wherein the protein is a protein having a property of specifically binding to a plant cell endogenous substance involved in the expression of herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide in a plant cell. 1) or 2), wherein the protein has a property of specifically binding to protoporphyrin IX
4) The plant according to the above 1), wherein the protein is a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase or a modified protein of the protein and has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. ), A plant according to 2) or 3), 5) a plant having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2), wherein (1) a natural protoporphyrinogen of the plant: Substantially different from IX oxidase activity. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. A plant into which a gene encoding a protein having the following properties (3), (4) and (5) has been introduced and which expresses the gene (hereinafter referred to as the present plant 2). (3) Specific binding to protoporphyrin IX. (4) Substantially no change to protoporphyrinogen IX. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 6) The plant according to 5), wherein the protein is ferrochelatase or a modified protein of the protein and has a property of specifically binding to protoporphyrin IX; 7) the following (1), (2) A plant having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the characteristics of (1) and (3), wherein (1) the plant is substantially different from the native protoporphyrinogen IX oxidase activity. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. (3) It is carried by a protein having substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen IX. And the following
A plant into which a gene encoding a protein having the properties of (4), (5) and (6) has been introduced and which expresses the gene (hereinafter, referred to as plant 3 of the present invention). (4) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (5) It has the ability to transform coproporphyrinogen IX. (6) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 8) The plant according to the above item 7), wherein the protein is coproporphyrinogen III oxidase or a modified protein of the protein, which is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrinogen IX. A method for producing a herbicide-tolerant plant, which comprises growing the plant according to the above 1) to 8); A) a method for selecting a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide-resistant plant, which comprises spraying a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide on the cultivation area of the plant according to the above items 1) to 8); ). A protoporphyrinogen IX oxidase, which comprises adding a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide to the culture area of the plant cell according to (1). The method selected harm herbicide resistant plant cells, 13) a step of a gene encoding a protein having the following properties (1) is introduced into a plant cell expression, (2), (3)
And introducing a gene encoding a protein having the properties of (4) into plant cells and expressing the herbicide-tolerant plant, wherein (1) substantially reducing the activity of protoporphyrinogen IX oxidase Have. (2) It specifically binds to a substance related to the herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide. (3) The protein has substantially no ability to alter a substance to which it specifically binds. (4) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 14) Plant cells having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following properties (1) and (2): (1) substantially different from the natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. (3), (4) and (5) a method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the properties of (5) protoporphyrinogen IX It specifically binds to substances related to the herbicidal activity of oxidase-inhibiting herbicides. (4) The protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 15) To a plant cell into which a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) has been introduced and expressing the gene: (1) Protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide Specifically binds to substances related to herbicidal activity. (2) the protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds; (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. (4) a method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following property (4); (4) substantially having protoporphyrinogen IX oxidase activity. 16) a step of introducing a gene encoding a protein having the following property (1) into a plant cell and expressing the gene; (2), (3)
And introducing a gene encoding a protein having the properties of (4) into plant cells and expressing the herbicide-tolerant plant, wherein (1) substantially reducing the activity of protoporphyrinogen IX oxidase Have. (2) Specific binding to protoporphyrin IX. (3) It has substantially no metamorphosis to protoporphyrinogen IX. (4) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 17) In plant cells having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2), (1) substantially different from the natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. The following (3), (4) and (5) a method for producing a herbicide-tolerant plant, which comprises a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the properties of (3) specific to protoporphyrin IX To combine. (4) Substantially no change to protoporphyrinogen IX. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 18) It specifically binds to protoporphyrin IX to a plant cell into which a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) has been introduced and which expresses the gene. (2) It does not substantially have the ability to transform protoporphyrinogen IX. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. (4) a method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following property (4); (4) substantially having protoporphyrinogen IX oxidase activity. 19) a step of introducing a gene encoding a protein having the following properties (1) and (2) into a plant cell and expressing the gene;
(3) a method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising the steps of: introducing a gene encoding a protein having the properties of (4) and (5) into plant cells and expressing the gene; Substantially has Linogen IX oxidase activity. (2) It does not substantially have the conversion property to coproporphyrinogen III. (3) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (4) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 20) Plant cells having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following properties (1), (2) and (3): (1) The natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant is substantially different. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. (3) It is carried by a protein having substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen IX. (4), (5) below
And (6) a method for producing a herbicide-tolerant plant, which comprises a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the property described in (6). (4) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (5) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (6) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 21) Specific binding to protoporphyrinogen IX to a plant cell into which a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) has been introduced and expressing the gene: I do. (2) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising the step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following properties (4) and (5), (4) substantially reducing the activity of protoporphyrinogen IX oxidase. Have. (5) Substantially no conversion property to coproporphyrinogen III. Is provided.

【０００５】[0005]

【発明の実施の形態】以下、さらに詳細に本発明を説明
する。プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型
除草剤とは、プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ
(protoporphyrinogen IX oxidase; EC 1.3.3.4。以下、
ＰＰＯと記す。)の活性を阻害する化合物（以下、ＰＰ
Ｏ阻害型除草性化合物と記す。）を有効成分として含む
除草剤を意味する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. Protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide is protoporphyrinogen IX oxidase
(protoporphyrinogen IX oxidase; EC 1.3.3.4.
Notated as PPO. )) (Hereinafter referred to as PP
O-inhibited herbicidal compounds. ) As an active ingredient.

【０００６】本発明において、ＰＰＯ阻害型除草剤の殺
草活性に関わる物質（以下、本物質と記す。）とは、Ｐ
ＰＯ阻害型除草性化合物、および、ＰＰＯ阻害型除草剤
が植物に施用された際に植物細胞内で該除草剤の殺草活
性発現に関わる植物細胞内因性物質を意味する。具体的
には、例えばＰＰＯ阻害型除草性化合物としては、Duk
e, S.O., Rebeiz, C.A. ACS Symposium Series 559, Po
rphyric Pesticides, Chemistry, Toxicology, and Pha
rmaceutical Applications. American Chemical Societ
y, Washington DC (1994)等に記載の化合物等があげら
れる。 ＰＰＯ阻害型除草性化合物は多くの異なる構造の分子種
を包含し[Duke et al., Weed Sci. 39: p465(1991); Na
ndihalli et al.、Pesticide Biochem. Physiol. 43: p
193(1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: p35(19
89); Yanase, Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 3
5: p70(1989)]、具体的には、ジフェニルエーテル〔例
えばクロルメトキシニル、ビフェノックス、クロルニト
ロフェン(CNP)、アシフルオルフェン{5-[2-クロロ-4-
(トリフルオロメチル)フェノキシ]-2-ニトロ安息香
酸}、アシフルオルフェンのエチルエステル、アシフル
オルフェン-ソディウム、オキシフルオルフェン[2-クロ
ロ-1-(3-エトキシ-4-ニトロフェノキシ)-4-トリフルオ
ロメチルベンゼン]、オキサジアゾール〔例えばオキサ
ジアゾン｛3-[2,4-ジクロロ-5-(1-メチルエトキシ)フェ
ニル]-5-(1,1-ジメチルエチル)-1,3,4-オキサジアゾー
ル-2 (3H)-オン）}〕、環状イミド〔例えば S-23142[N-
(4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパギルオキシフェニル)-
3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド]、クロロフタリム
［N-(4-クロロフェニル)-3,4,5,6-テトラヒドロフタル
イミド］〕、フェニルピラゾール〔例えば TNPP-エチル
{エチル 2-[1-(2,3,4-トリクロロフェニル)-4-ニトロピ
ラゾリル-5-オキシ]プロピオネート}〕、ピリジン誘導
体〔例えば LS82-556［N3-(1-フェニルエチル)-2,6-ジ
メチル-5-プロピオニルニコチンアミド］〕、フェノピ
レート、フェノピレートの O-フェニルピロリジノカル
バメート類似体、フェノピレートのピペリジノカルバメ
ート類似体等である。In the present invention, the substance (hereinafter, referred to as the present substance) relating to the herbicidal activity of a PPO-inhibiting herbicide is P.
A PO-inhibiting herbicidal compound and a plant cell endogenous substance involved in the herbicidal activity of the herbicide in a plant cell when the PPO-inhibiting herbicide is applied to a plant. Specifically, for example, Puk-inhibiting herbicidal compounds include Duk
e, SO, Rebeiz, CA ACS Symposium Series 559, Po
rphyric Pesticides, Chemistry, Toxicology, and Pha
rmaceutical Applications. American Chemical Societ
y, Washington DC (1994) and the like. PPO-inhibiting herbicidal compounds encompass many different structural molecular species [Duke et al., Weed Sci. 39: p465 (1991);
ndihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: p
193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: p35 (19
89); Yanase, Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 3
5: p70 (1989)], specifically, diphenyl ether [eg, chloromethoxynil, bifenox, chlornitrophen (CNP), acifluorfen {5- [2-chloro-4-
(Trifluoromethyl) phenoxy] -2-nitrobenzoic acid}, ethyl ester of acifluorfen, acifluorfen-sodium, oxyfluorfen [2-chloro-1- (3-ethoxy-4-nitrophenoxy) -4- Trifluoromethylbenzene], oxadiazole [eg oxadiazone {3- [2,4-dichloro-5- (1-methylethoxy) phenyl] -5- (1,1-dimethylethyl) -1,3,4- Oxadiazole-2 (3H) -one)}], cyclic imide [eg, S-23142 [N-
(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyphenyl)-
3,4,5,6-tetrahydrophthalimide], chlorophthalim [N- (4-chlorophenyl) -3,4,5,6-tetrahydrophthalimide], phenylpyrazole [eg TNPP-ethyl
{Ethyl 2- [1- (2,3,4-trichlorophenyl) -4-nitropyrazolyl-5-oxy] propionate}], pyridine derivative [for example, LS82-556 [N3- (1-phenylethyl) -2, 6-dimethyl-5-propionylnicotinamide]], phenopyrates, O-phenylpyrrolidinocarbamate analogs of phenopyrates, piperidinocarbamate analogs of phenopyrates and the like.

【０００７】特に重要なジフェニルエーテルとしては、
下記 化１記載の構造式１〜７で示される化合物等があ
げられる［構造式４: Maigrot et al.、Brighton Crop
Protection Conference-Weeds:47-51(1989) 参照； 構
造式５: Hayashi et al.、Brighton Crop Protection C
onference-Weeds: 53-58(1989) 参照； 構造式６: ビフ
ェノックス、Dest et al.、Proc. Northeast Weed Sci.
Conf. 27:31(1973)参照］。Particularly important diphenyl ethers include:
Examples include compounds represented by the following structural formulas 1 to 7 [Structural formula 4: Maigrot et al., Brighton Crop
See Protection Conference-Weeds: 47-51 (1989); Structural formula 5: Hayashi et al., Brighton Crop Protection C
onference-Weeds: 53-58 (1989); Structural formula 6: Bifenox, Dest et al., Proc. Northeast Weed Sci.
Conf. 27:31 (1973)].

【化１】 Embedded image

【０００８】さらに、その他の特に重要なＰＰＯ阻害型
除草性化合物として、下記 化２記載の一般式で示され
る化合物等をあげることができ、より具体的には、下記
化７〜化１０記載の構造式８〜３７で示される化合物
などがあげられる。Further, other particularly important PPO-inhibiting herbicidal compounds include compounds represented by the following general formula (2), and more specifically, compounds represented by the following chemical formulas (7) to (10): Compounds represented by structural formulas 8 to 37 are exemplified.

【化２】Ｊ−Ｇ ここで、Ｇとしては下記 化３記載のＧ−１〜９で示さ
れる基があげられ、Ｊとしては下記 化４〜６記載のＪ
−１〜３０で示される基があげられる。Wherein G is a group represented by G-1 to G-9 shown in the following Chemical Formula 3, and J is a J shown in the following Chemical Formulas 4 to 6.
And groups represented by -1 to 30.

【化３】 Embedded image

【化４】 Embedded image

【化５】 Embedded image

【化６】 Embedded image

【０００９】ここで、式 J-5、J-6、J-12 および J-24
における破線は、左側の環が一重結合のみを含むことま
たは環内のひとつの結合が炭素原子間の二重結合である
ことを表し、X は酸素原子または硫黄原子を表し、Y は
酸素原子または硫黄原子を表し、R¹ は水素原子または
ハロゲン原子を表し、R² は水素原子、C₁-C₈ アルキル
基、C₁-C₈ ハロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、-O
R²⁷ 基、-SH 基、-S(O)pR²⁷ 基、-COR²⁷ 基、-CO₂R²⁷
基、-C(O)SR²⁷基、-C(O)NR²⁹R³⁰ 基、-CHO 基、-CR²⁷=N
OR³⁶ 基、-CH=CR³⁷CO₂R²⁷ 基、-CH₂CHR ³⁷CO₂R²⁷ 基、-C
O₂N=CR³¹R³² 基、ニトロ基、シアノ基、-NHSO₂R³³ 基、
-NHSO₂NHR³³ 基、-NR²⁷R³⁸ 基、-NH₂ 基、または、1つ
以上の同種もしくは異種の C1-C4アルキル基で置換され
ていてもよいフェニル基を表し、p は 0、1 または 2
を表し、R³ は C₁-C₂ アルキル基、C₁-C₂ ハロアルキル
基、-OCH₃ 基、-SCH₃ 基、-OCHF₂基、ハロゲン原子、シ
アノ基、またはニトロ基を表し、R⁴ は水素原子、C₁-C₃
アルキル基、C₁-C₃ ハロアルキル基、またはハロゲン
原子を表し、R⁵ は水素原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロ
ゲン原子、C₁-C₃ ハロアルキル基、シクロプロピル基、
ビニル基、C₂ アルキニル基、シアノ基、-C(O)R³⁸ 基、
-CO₂R^{3 8} 基、-C(O)NR³⁸R³⁹ 基、-CR³⁴R³⁵CN 基、-CR³⁴R
³⁵C(O)R³⁸ 基、-CR³⁴R³⁵CO₂R³⁸基、-CR³⁴R³⁵C(O)NR³⁸R
³⁹ 基、-CHR³⁴OH 基、-CHR³⁴OC(O)R³⁸ 基、または -OCH
R³⁴OC(O)NR³⁸R³⁹ 基を表すか、あるいは、G が G-2 も
しくは G-6 の場合に R⁴とR⁵とはこれらが結合している
炭素原子とで C=O 基を表していてもよく、R⁶ は C₁-C₆
アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₂-C₆ アルコキ
シアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ ア
ルキニル基を表し、X¹ は直接結合、酸素原子、硫黄原
子、-NH基、-N(C₁-C₃ アルキル)基、-N(C₁-C₃ハロアル
キル)基、または -N(アリル)基を表し、R⁷ は水素原
子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、ハロゲ
ン原子、-S(O)₂(C₁-C₆アルキル)基、または -C(=O)R⁴⁰
基を表し、R⁸ は水素原子、C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈
シクロアルキル基、C₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキ
ニル基、C₁-C₈ ハロアルキル基、C₂-C₈ アルコキシアル
キル基、C₃-C₈ アルコキシアルコキシアルキル基、C₃-C
₈ ハロアルキニル基、C₃-C₈ハロアルケニル基、C₁-C₈
アルキルスルホニル基、C₁-C₈ ハロアルキルスルホニル
基、C₃-C₈ アルコキシカルボニルアルキル基、-S(O)₂NH
(C₁-C₈ アルキル)基、-C(O)R⁴¹ 基、またはフェニル環
上で R⁴² で置換されていてもよいベンジル基を表し、n
および m はそれぞれ独立して 0、1、2 または 3 であ
り、かつ m + n が 2または 3 を表し、Z は -CR⁹R¹⁰
基、酸素原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂ 基、また
は -N(C₁-C ₄ アルキル)基を表し、それぞれの R⁹ は独
立して水素原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロゲン原子、ヒ
ドロキシ基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル
基、C₁-C₆ ハロアルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニ
ルオキシ基、または C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオ
キシ基を表し、それぞれの R¹⁰ は独立して水素原子、C
₁-C₃ アルキル基、ヒドロキシ基、またはハロゲン原子
を表し、R¹¹ および R¹² はそれぞれ独立して水素原
子、ハロゲン原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケニ
ル基、または C₁-C₆ ハロアルキル基を表し、R¹³ は水
素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃
-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ ア
ルキニル基、C₃-C₆ ハロアルキニル基、HC(=0)基、(C₁-
C₄ アルキル)C(=O) 基、または -NH₂ 基を表し、R¹⁴ は
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ アルキルチオ基、C₁-C₆ ハ
ロアルキル基、または -N(CH₃)₂ 基を表し、W は窒素原
子または -CR¹⁵ 基を表し、R¹⁵ は水素原子、C₁-C₆ ア
ルキル基、ハロゲン原子、または、C₁-C₆ アルキル基、
1 ないし 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基も
しくは -CF₃ 基で置換されていてもよいフェニル基を表
し、それぞれの Q は独立して酸素原子または硫黄原子
を表し、Q¹ は酸素原子または硫黄原子を表し、Z¹ は -
CR¹⁶R¹⁷ 基、酸素原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂
基、または -N(C₁-C₄ アルキル)基を表し、それぞれの
R¹⁶ は独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C
₆ ハロアルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニルオキシ
基、または C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオキシ基を
表し、それぞれの R¹⁷ は独立して水素原子、ヒドロキ
シ基、または ハロゲン原子を表し、R¹⁸ は C₁-C₆ アル
キル基、ハロゲン原子、または C₁-C₆ ハロアルキル基
を表し、R¹⁹ および R²⁰ はそれぞれ独立して水素原
子、C₁-C₆ アルキル基、または C₁-C ₆ ハロアルキル基
を表し、Z² は酸素原子、硫黄原子、-NR⁹ 基、または-C
R⁹R¹⁰ 基を表し、R²¹ および R²² はそれぞれ独立して
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アル
ケニル基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、またはC₃-C₆ ハロアルキニル基を表し、R²³ は水素
原子、ハロゲン原子、またはシアノ基を表し、R²⁴ は C
₁-C₆ アルキルスルフォニル基、C₁-C₆ アルキル基、C₁-
C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アル
キニル基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ハロアルコキシ
基、またはハロゲン原子を表し、R²⁵ は C₁-C₆ アルキ
ル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、ま
たは C₃-C₆ アルキニル基を表し、R²⁶ は C₁-C₆ アルキ
ル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、または、環上で C₁-C₆
アルキル基、1 ないし 2 個のハロゲン原子、1 ないし
2 個のニトロ基、C₁-C₆ アルコキシ基、および CF₃ 基
からなるグループの中から選択される置換基で置換され
ていてもよいフェニル基を表し、W¹ は窒素原子または
CH 基を表し、T は下記の一般式T-1、T-2、またはT-3
のいずれかの基を表し、 （式中、E¹、E²、E³、E⁴、E⁵、E⁶、E⁷、E⁸、E⁹、E¹⁰、E
¹¹、E¹² はそれぞれ水素原子または C₁-C₃ アルキル基
を表す。） R²⁷ は C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈ シクロアルキル基、C
₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキニル基、C₁-C₈ ハロ
アルキル基、C₂-C₈ アルコキシアルキル基、C₂-C₈アル
キルチオアルキル基、C₂-C₈ アルキルスルフィニルアル
キル基、C₂-C₈ アルキルスルフォニルアルキル基、C₁-C
₈ アルキルスルフォニル基、フェニル環上でハロゲン原
子および C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から
選択される少なくともひとつの置換基で置換されていて
もよいフェニルスルフォニル基、C₄-C₈ アルコキシアル
コキシアルキル基、C₄-C₈ シクロアルキルアルキル基、
C₆-C₈ シクロアルコキシアルキル基、C₄-C₈ アルケニル
オキシアルキル基、C₄-C₈アルキニルオキシアルキル
基、C₃-C₈ ハロアルコキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアル
ケニルオキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアルキニルオキシ
アルキル基、C₆-C₈ シクロアルキルチオアルキル基、C₄
-C₈ アルケニルチオアルキル基、C₄-C₈ アルキニルチオ
アルキル基、環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基お
よび C₁-C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から
選択される少なくともひとつの置換基で置換されていて
もよいフェノキシ基で置換された C₁-C₄ アルキル基、
環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-C₃
ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少
なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジ
ルオキシ基で置換されたC₁-C₄ アルキル基、C₄-C₈トリ
アルキルシリルアルキル基、C₃-C₈ シアノアルキル基、
C₃-C₈ ハロシクロアルキル基、C₃-C₈ ハロアルケニル
基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル基、C₅-C₈ ハロアルコ
キシアルキニル基、C₅-C₈ アルキルチオアルケニル基、
C₃-C₈ ハロアルキニル基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル
基、C₅-C₈ ハロアルコキシアルキニル基、C₅-C₈ アルキ
ルチオアルキニル基、C₂-C₈ アルキルカルボニル基、環
上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-C₃ ハ
ロアルキル基からなるグループの中から選択される少な
くともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル
基、-CHR³⁴COR²⁸ 基、-CHR³⁴COOR²⁸ 基、-CHR³⁴P(O)(OR
²⁸)₂ 基、-CHR³⁴P(S)(OR²⁸)₂基、-CHR³⁴C(O)NR²⁹R³⁰
基、または -CHR³⁴C(O)NH₂ 基を表し、R²⁸ は C₁-C₆ ア
ルキル基、C₂-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル基、
またはテトラヒドロフラニル基を表し、R²⁹ および R³¹
は独立して水素原子、または C₁-C₄ アルキル基を表
し、R³⁰ および R³² は独立して C₁-C₄ アルキル基、ま
たは環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-
C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から選択され
る少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフ
ェニル基を表し、あるいは、R²⁹と R³⁰とで -(CH₂)₅-、
-(CH₂)₄-、または -CH₂CH₂OCH₂CH₂- を表していてもよ
く、このようにして形成されるそれぞれの環では、 C₁-
C₃ アルキル基、フェニル基およびベンジル基からなる
グループの中から選択される置換基で置換されていても
よい、あるいは、R³¹と R³²とはこれらが結合している
炭素原子とで C₃-C₈ シクロアルキル基を表していても
よく、R³³ は C₁-C₄ アルキル基、C₁-C₄ ハロアルキル
基、または C₃-C₆ アルケニル基を表し、R³⁴ および R
³⁵ は独立して水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表
し、R³⁶ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケ
ニル基、または C₃-C₆ アルキニル基を表し、R³⁷ は水
素原子、C₁-C₄ アルキル基、またはハロゲン原子を表
し、R³⁸ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ シクロ
アルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₂-C₆ アルコキシアルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル
基、環上でハロゲン原子、C₁-C₄ アルキル基および C₁-
C₄ アルコキシ基からなるグループの中から選択される
少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェ
ニル基、-CH₂CO₂(C₁-C₄ アルキル)基、または -CH(CH₃)
CO₂(C₁-C₄ アルキル)基を表し、R³⁹ は水素原子、C₁-C₂
アルキル基、または C(O)O(C₁-C₄ アルキル)基を表
し、R⁴⁰ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ アルコ
キシ基、または NH(C₁-C₆ アルキル)基を表し、R⁴¹ は
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C₆ アル
コキシ基、NH(C₁-C₆ アルキル)基、R⁴² 基で置換されて
いてもよいフェニル基、ベンジル基、または C₂-C₈ ジ
アルキルアミノ基を表し、R⁴² は C₁-C₆ アルキル基、1
ないし 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基、ま
たは CF₃ 基を表す。Where the formulas J-5, J-6, J-12 and J-24
Indicates that the ring on the left contains only a single bond.
Or one bond in a ring is a double bond between carbon atoms
X represents an oxygen atom or a sulfur atom, and Y represents
Represents an oxygen or sulfur atom, R¹ Is a hydrogen atom or
Represents a halogen atom, R^Two Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl
Group, C₁-C₈ Haloalkyl group, halogen atom, hydroxyl group, -O
R²⁷ Group, -SH group, -S (O) pR²⁷ Group, -COR²⁷ Group, -CO_TwoR²⁷ 
Group, -C (O) SR²⁷Group, -C (O) NR²⁹R³⁰ Group, -CHO group, -CR²⁷= N
OR³⁶ Group, -CH = CR³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -CH_TwoCHR ³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -C
O_TwoN = CR³¹R³² Group, nitro group, cyano group, -NHSO_TwoR³³ Group,
-NHSO_TwoNHR³³ Group, -NR²⁷R³⁸ Group, -NH_Two Group or one
Substituted with the same or different C1-C4 alkyl groups
Represents an optionally substituted phenyl group, p is 0, 1 or 2
And R^Three Is C₁-C_Two Alkyl group, C₁-C_Two Haloalkyl
Group, -OCH_Three Group, -SCH_Three Group, -OCHF_TwoGroup, halogen atom,
Represents an ano group or a nitro group, R^Four Is a hydrogen atom, C₁-C_Three
 Alkyl group, C₁-C_Three Haloalkyl group or halogen
Represents an atom, R^Five Is a hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl group, halo
Gen atom, C₁-C_Three Haloalkyl group, cyclopropyl group,
Vinyl group, C_Two Alkynyl group, cyano group, -C (O) R³⁸ Group,
-CO_TwoR^{Three 8} Group, -C (O) NR³⁸R³⁹ Group, -CR³⁴R³⁵CN group, -CR³⁴R
³⁵C (O) R³⁸ Group, -CR³⁴R³⁵CO_TwoR³⁸Group, -CR³⁴R³⁵C (O) NR³⁸R
³⁹ Group, -CHR³⁴OH group, -CHR³⁴OC (O) R³⁸ Group, or -OCH
R³⁴OC (O) NR³⁸R³⁹ Represents a group, or G is G-2
Or R for G-6^FourAnd R^FiveAnd these are combined
And a carbon atom may represent a C = O group;⁶ Is C₁-C₆
 Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Two-C₆ Alkoki
Silalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ A
X represents a rukinyl group;¹ Is a direct bond, an oxygen atom, a sulfur atom
, -NH group, -N (C₁-C_Three Alkyl) group, -N (C₁-C_ThreeHaloal
Kill) group, or -N (allyl) group, R⁷ Is hydrogen field
Child, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, halogen
Atom, -S (O)_Two(C₁-C₆Alkyl) group, or -C (= O) R⁴⁰ 
Represents a group, R⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ 
Cycloalkyl group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Archi
Nyl group, C₁-C₈ Haloalkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyal
Kill group, C_Three-C₈ Alkoxyalkoxyalkyl group, C_Three-C
₈ Haloalkynyl group, C_Three-C₈Haloalkenyl group, C₁-C₈ 
Alkylsulfonyl group, C₁-C₈ Haloalkylsulfonyl
Group, C_Three-C₈ Alkoxycarbonylalkyl group, -S (O)_TwoNH
(C₁-C₈ Alkyl) group, -C (O) R⁴¹ Group or phenyl ring
On R⁴² Represents a benzyl group optionally substituted with
 And m are each independently 0, 1, 2 or 3.
And m + n represents 2 or 3, and Z is -CR⁹R^Ten 
Group, oxygen atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two Group, also
Is -N (C₁-C _Four Alkyl) group, each R⁹ Is German
Standing hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl group, halogen atom, ar
Droxy group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl
Group, C₁-C₆ Haloalkoxy group, C_Two-C₆ Alkyl carboni
Roxy group, or C_Two-C₆ Haloalkylcarbonylo
Represents a xy group, each R^Ten Is independently a hydrogen atom, C
₁-C_Three Alkyl group, hydroxy group, or halogen atom
And R¹¹ And R¹² Are independently hydrogen sources
Child, halogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Alkene
Or C₁-C₆ Represents a haloalkyl group, R¹³ Is water
Elementary atom, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three
-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ A
Rukinyl group, C_Three-C₆ Haloalkynyl group, HC (= 0) group, (C₁-
C_Four Alkyl) C (= O) group, or -NH_Two Represents a group, R¹⁴ Is
 C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Alkylthio group, C₁-C₆ C
Loalkyl group, or -N (CH_Three)_Two W represents a nitrogen atom
Child or -CR^Fifteen Represents a group, R^Fifteen Is a hydrogen atom, C₁-C₆ A
Alkyl group, halogen atom, or C₁-C₆ Alkyl group,
1 or 2 halogen atoms, C₁-C₆ Alkoxy groups
Or -CF_Three Phenyl group which may be substituted
And each Q is independently an oxygen or sulfur atom
And Q¹ Represents an oxygen atom or a sulfur atom; Z¹ Is-
CR¹⁶R¹⁷ Group, oxygen atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two 
Group, or -N (C₁-C_Four Alkyl) group,
R¹⁶ Is independently a hydrogen atom, a halogen atom, hydroxy
Group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C
₆ Haloalkoxy group, C_Two-C₆ Alkylcarbonyloxy
Group or C_Two-C₆ A haloalkylcarbonyloxy group
Represent each R¹⁷ Is independently hydrogen atom, hydroxy
Or a halogen atom, R¹⁸ Is C₁-C₆ Al
Kill group, halogen atom, or C₁-C₆ Haloalkyl group
And R¹⁹ And R²⁰ Are independently hydrogen sources
Child, C₁-C₆ Alkyl group, or C₁-C ₆ Haloalkyl group
And Z^Two Is an oxygen atom, a sulfur atom, -NR⁹ Group, or -C
R⁹R^Ten Represents a group, R^{twenty one} And R^{twenty two} Are independent of each other
C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Al
Kenyl group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, or C_Three-C₆ Represents a haloalkynyl group, R^{twenty three} Is hydrogen
Represents an atom, a halogen atom, or a cyano group; R^{twenty four} Is C
₁-C₆ Alkylsulfonyl group, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-
C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Al
Quinyl group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆Haloalkoxy
Represents a group or a halogen atom, R^{twenty five} Is C₁-C₆ Archi
Group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group,
Or C_Three-C₆ Represents an alkynyl group, R²⁶ Is C₁-C₆ Archi
Group, C₁-C₆ Haloalkyl group or C on the ring₁-C₆ 
An alkyl group, one or two halogen atoms, one to
Two nitro groups, C₁-C₆ Alkoxy group, and CF_Three Base
Substituted with a substituent selected from the group consisting of
Represents a phenyl group which may be¹ Is a nitrogen atom or
Represents a CH group, where T is the following general formula T-1, T-2, or T-3
Represents any group of(Where E¹, E^Two, E^Three, E^Four, E^Five, E⁶, E⁷, E⁸, E⁹, E^Ten, E
¹¹, E¹² Is a hydrogen atom or C₁-C_Three Alkyl group
Represents ) R²⁷ Is C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, C
_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl group, C₁-C₈ Halo
Alkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyalkyl group, C_Two-C₈Al
Quilthioalkyl group, C_Two-C₈ Alkylsulfinyl al
Kill group, C_Two-C₈ Alkylsulfonylalkyl group, C₁-C
₈ Alkyl sulfonyl group, halogen source on phenyl ring
Child and C₁-C_Four From the group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one selected substituent
Phenylsulfonyl group, C_Four-C₈ Alkoxyal
Coxyalkyl group, C_Four-C₈ Cycloalkylalkyl group,
C₆-C₈ Cycloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Alkenyl
Oxyalkyl group, C_Four-C₈Alkynyloxyalkyl
Group, C_Three-C₈ Haloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Haloal
Kenyloxyalkyl group, C_Four-C₈ Haloalkynyloxy
Alkyl group, C₆-C₈ Cycloalkylthioalkyl group, C_Four
-C₈ Alkenylthioalkyl group, C_Four-C₈ Alkynylthio
Alkyl group, halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group
And C₁-C_Three From the group consisting of haloalkyl groups
Substituted with at least one selected substituent
Substituted with a good phenoxy group₁-C_Four Alkyl group,
Halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-C_Three 
Selected from the group consisting of haloalkyl groups
Benzy optionally substituted with at least one substituent
C substituted with a ruoxy group₁-C_Four Alkyl group, C_Four-C₈bird
Alkylsilylalkyl group, C_Three-C₈ Cyanoalkyl group,
C_Three-C₈ Halocycloalkyl group, C_Three-C₈ Haloalkenyl
Group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Halo alco
Xylalkynyl group, C_Five-C₈ Alkylthioalkenyl group,
C_Three-C₈ Haloalkynyl group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl
Group, C_Five-C₈ Haloalkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Archi
Luthioalkynyl group, C_Two-C₈ Alkylcarbonyl group, ring
A halogen atom, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-C_Three C
Selected from the group consisting of
Benzyl optionally substituted with at least one substituent
Group, -CHR³⁴COR²⁸ Group, -CHR³⁴COOR²⁸ Group, -CHR³⁴P (O) (OR
²⁸)_Two Group, -CHR³⁴P (S) (OR²⁸)_TwoGroup, -CHR³⁴C (O) NR²⁹R³⁰ 
Group, or -CHR³⁴C (O) NH_Two Represents a group, R²⁸ Is C₁-C₆ A
Lucyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group,
Or a tetrahydrofuranyl group, R²⁹ And R³¹
 Is independently a hydrogen atom, or C₁-C_Four Table showing alkyl groups
Then R³⁰ And R³² Is independently C₁-C_Four Alkyl group
Or a halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-
C_Three Selected from the group consisting of haloalkyl groups
A group optionally substituted with at least one substituent
Represents a phenyl group, or R²⁹And R³⁰And in-(CH_Two)_Five-,
-(CH_Two)_Four-Or -CH_TwoCH_TwoOCH_TwoCH_Two-May be represented
In each ring thus formed, C₁-
C_Three Consists of alkyl, phenyl and benzyl groups
Even if substituted with a substituent selected from the group
Good or R³¹And R³²And these are combined
C with carbon atoms_Three-C₈ Even if it represents a cycloalkyl group
Well, R³³ Is C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Group or C_Three-C₆ Represents an alkenyl group, R³⁴ And R
³⁵ Is independently a hydrogen atom or C₁-C_Four Table showing alkyl groups
Then R³⁶ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Arche
Nyl group, or C_Three-C₆ Represents an alkynyl group, R³⁷ Is water
Elementary atom, C₁-C_Four Displays an alkyl group or halogen atom
Then R³⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Cyclo
Alkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C_Two-C₆ Alkoxyalkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl
Group, halogen atom on the ring, C₁-C_Four Alkyl group and C₁-
C_Four Selected from the group consisting of alkoxy groups
Fe which may be substituted with at least one substituent
Nyl group, -CH_TwoCO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, or -CH (CH_Three)
CO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, R³⁹ Is a hydrogen atom, C₁-C_Two
 Alkyl group or C (O) O (C₁-C_Four Alkyl) group
Then R⁴⁰ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Arco
Xyl group, or NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴¹ Is
C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C₆ Al
Coxy group, NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴² Substituted with a group
Optionally phenyl, benzyl, or C_Two-C₈ The
Represents an alkylamino group, R⁴² Is C₁-C₆ Alkyl group, 1
 Or two halogen atoms, C₁-C₆ An alkoxy group
Or CF_Three Represents a group.

【００１０】[0010]

【化７】 Embedded image

【化８】 Embedded image

【化９】 Embedded image

【化１０】 Embedded image

【００１１】さらに、ＰＰＯ阻害型除草性化合物とし
て、下記 化１１記載の一般式で示される N-置換ピラ
ゾール（国際特許公開 WO 94/08999、WO 93/10100 およ
び Schering に対する米国特許第5405829参照）等があ
げられる。Further, as PPO-inhibiting herbicidal compounds, N-substituted pyrazoles represented by the following general formula (see International Patent Publications WO 94/08999, WO 93/10100 and US Pat. No. 5,405,829 to Schering) and the like: Is raised.

【化１１】 ここで、R⁴³ は C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁴⁴ は C₁-C
₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルキルチオ基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基、 C₁-C₄ハロアルキル基、 C₁-C₄ ハロアルキル
チオ基、または C₁-C₄ ハロアルコキシ基を表し、ある
いは、R⁴³ とR⁴⁴とで-(CH₂)₃- または -(CH₂)₄- を表し
ていてもよく、R⁴⁵ は水素原子またはハロゲン原子を表
し、R⁴⁶ は水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁴⁷ は水素原子、ニトロ基、シアノ基、-COOR⁴⁹ 基、-C
(=X)NR⁵⁰R⁵¹ 基、または-C(=X²)R⁵² 基を表し、R⁴⁸ は
水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ハロゲン原子およ
び水酸基からなるグループの中から選択される少なくと
もひとつの置換基で置換されていてもよいC₁-C₄ アルキ
ル基、 C₁-C₄ アルコキシ基、環上でハロゲン原子、ニ
トロ基、シアノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基およびハロ-C₁-C₄ アルキル基からなるグループ
の中から選択される少なくともひとつの置換基で置換さ
れていてもよいフェニル基、ピローリル基、 C₂-C₈ ア
ルキル基、 C₃-C₈ アルケニル基、 C₃-C₈ アルキニル
基、 C₃-C₈ アルコキシ基、（該C₂-C₈ アルキル基、該
C ₃-C₈ アルケニル基、 該C₃-C₈ アルキニル基および 該
C₃-C₈ アルコキシ基には少なくともひとつ以上の酸素原
子が挿入されていてもよい）、または以下に示す基を表
し、 R⁴⁹ R⁵⁰ およびR⁵¹ は同じであっても異なってもよく、
水素原子または C₁-C₄アルキル基を表し、あるいは、R
⁵⁰ とR⁵¹とはこれらが結合する窒素原子とで5員もしく
は6員の飽和した環を形成していてもよい、R⁵² は水素
原子、 C₁-C₄ アルキル基、または少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換された C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁵³ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニ
ル基、 C₃-C₆ アルキニル基、フェニル基（該 C₁-C₄ ア
ルキル基、該 C₂-C₆ アルケニル基、該C₃-C₆ アルキニ
ル基、および該フェニル基はハロゲン原子で置換されて
いてもよい）、 C ₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチ
ル基、または R⁶³CO-基を表し、R⁵⁴ は水素原子、ハロ
ゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₆ アルキル基、
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₂-C₆ アルケニ
ル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい C₃-C₆ ア
ルキニル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェ
ニル基、 C₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチル基、
C₁-C₄ アルコキシ C ₁-C₆ アルキル基、 ジ C₁-C₄ アル
キルアミノ C₁-C₄ アルキル基、テトラヒドロフルフリ
ルメチル基、 C₃-C₆ アルキニルオキシ C₁-C₄ アルキル
基、ベンジル基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シア
ノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基および
ハロ C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から選択
される置換基で置換されていてもよいベンジル基、-C(=
X²)R⁶³基、-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁰ 基、-(CH₂)_a-O-(CH₂)_b-R
⁷⁰ 基、または-(CH₂)_a-X²-R⁷⁶基を表し、あるいは、R⁵³
とR⁵⁴とはこれらが結合している窒素原子とで、3員、5
員もしくは6員の飽和した環または5員もしくは6員の芳
香環（該飽和した環および該芳香環においては1つの炭
素原子が1つの酸素原子で置換されていてもよい）を形
成していてもよい、R⁵⁵ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ アルキニル基
を表し、あるいはR⁵⁵ とR⁵⁶ とで-(CH₂)_e-基を形成して
いてもよい、R⁵⁶ とR⁵⁷ はそれぞれ C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基もしく
はフェニル基（該C₁-C₄ アルキル基、 該C₂-C₆ アルケ
ニル基、該C₃-C₆ アルキニル基および該フェニル基はハ
ロゲン原子で置換されていてもよい）、 水素原子、 C₃
-C₆ シクロアルキル基、-X²R⁶⁰ 基、または-NR⁶¹R⁶²基
を表し、R⁵⁸ は水素原子、 C₁-C₆ アルキル基、 C₂-C₆
アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基、 C₁-C₄ アルキル
カルボニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ アル
コキシカルボニル C₁-C₄ アルキル基、ジ C₁-C₄ アルコ
キシカルボニル C₁-C₄アルキル基、ベンジル基、 C₁-C₄
アルコキシ- C₁-C₄アルキニル基、-(CH₂)_a-R⁷⁵基、-(CH
₂)_a-X²-R⁷²基、-(CH₂)_a-X²-(CH₂)_b-R⁷²基、または-(C
H₂)_a-X²-(CH₂)_b-X ²-(CH₂)_c-R⁷²基を表し、R⁵⁹ は水素原
子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆
アルキニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルカルボニル C₁-C₃ アルキル基、またはフェニル
基を表し、R⁶⁰ は少なくとも1つのハロゲン原子で置換
されていてもよい C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶¹ とR⁶²
は同じであっても異なってもよく、水素原子、または
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶³ は少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₄ アルキル
基、 C₁-C₄ アルコシキ C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルチオ C₁-C₄ アルキル基、 C₃-C₆ シクロアルキル
基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、 C₁-C₄
アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基およびハロ C₁-C₄
アルキル基からなるグループの中から選択されるひとつ
の置換基で置換されていてもよいフェニル基、-NR⁷³R⁷⁴
基、または-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁵基を表し、R⁶⁴ は C₁-C₄
アルコキシカルボニル基、またはカルボキシル基を表
し、R⁶⁵ はクロロメチル基、シアノメチル基、少なくと
も1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆ シ
クロアルキル基、または C₁-C₄ アルコキシカルボニル
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁶ は水酸基、または-NR⁶⁷R
⁶⁸を表し、A は -NR⁶⁷R⁶⁸、または -S(O)_f-R⁶⁹基を表
し、R⁶⁷ とR⁶⁸ は同じであっても異なってもよく、水素
原子、または C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁹ は C₁-C₄
アルキル基、または C₁-C₄ ハロアルキル基を表し、R⁷⁰
は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、少なくとも1つ以
上の C₁-C₄ アルコキシ基で置換されていてもよい C₁-C
₄ アルキル基、少なくとも1つ以上の酸素原子が挿入さ
れていてもよい C₃-C₆シクロアルキル基、1もしくは2個
のメチル基で置換されていてもよい C₃-C₆シクロアルキ
ル基、フリル基、チエニル基、または -C(=O)R⁷¹基を表
し、R⁷¹ とR⁷² は同じであっても異なってもよく、 C₁-
C₄ アルキル基、または C₁-C ₄ アルコキシ基を表し、R
⁷³ とR⁷⁴ は同じであっても異なってもよく、 C₁-C₄ ア
ルキル基、またはフェニル基を表し、R⁷⁵ は少なくとも
1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆シク
ロアルキル基、1または2個のメチル基で置換されていて
もよい C₃-C₆シクロアルキル基、フリル基、チエニル
基、または -C(=O)R⁷¹基を表し、R⁷⁶ は C₁-C₄ アルキ
ル基を表し、a、b、およびc はそれぞれ独立して1、2、
または3を表し、d は0または1を表し、e は2または3を
表し、f は1または2を表し、X² は酸素原子または硫黄
原子を表す。Embedded imageWhere R⁴³ Is C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁴⁴ Is C₁-C
_Four Alkyl group, C₁-C_Four Alkylthio group, C₁-C_Four Arco
Xyl group, C₁-C_FourHaloalkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Thio group, or C₁-C_Four Represents a haloalkoxy group;
Well, R⁴³ And R⁴⁴And in-(CH_Two)_Three-Or- (CH_Two)_Four-Represents
May be R⁴⁵ Represents a hydrogen atom or a halogen atom
Then R⁴⁶ Is a hydrogen atom or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁴⁷ Is hydrogen atom, nitro group, cyano group, -COOR⁴⁹ Group, -C
(= X) NR⁵⁰R⁵¹ Group, or -C (= X^Two) R⁵² Represents a group, R⁴⁸ Is
Hydrogen atom, halogen atom, cyano group, halogen atom and
At least selected from the group consisting of
May also be substituted with one substituent₁-C_Four Archi
Group, C₁-C_Four An alkoxy group, a halogen atom on the ring,
Toro, cyano, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Arco
Xy group and halo-C₁-C_Four Group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one substituent selected from
Optionally substituted phenyl, pyrrolyl, C_Two-C₈ A
Ruquil group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl
Group, C_Three-C₈ An alkoxy group, (the C_Two-C₈ An alkyl group,
C _Three-C₈ An alkenyl group, the C_Three-C₈ An alkynyl group and
C_Three-C₈ An alkoxy group contains at least one oxygen source
Or a group shown below.
AndR⁴⁹ R⁵⁰ And R⁵¹ May be the same or different,
Hydrogen atom or C₁-C_FourRepresents an alkyl group, or R
⁵⁰ And R⁵¹Is a 5-member or a nitrogen atom to which these bind
May form a 6-membered saturated ring, R⁵² Is hydrogen
Atom, C₁-C_Four An alkyl group, or at least one or more
C substituted with a halogen atom₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁵³ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkene
Group, C_Three-C₆ Alkynyl group, phenyl group (C₁-C_Four A
Alkyl group, the C_Two-C₆ Alkenyl group, the C_Three-C₆ Alkini
And the phenyl group is substituted with a halogen atom.
May be present), C _Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethy
Or R⁶³Represents a CO- group, R⁵⁴ Is a hydrogen atom, halo
C optionally substituted with a gen atom₁-C₆ Alkyl group,
C optionally substituted with a halogen atom_Two-C₆ Alkene
C, which may be substituted with_Three-C₆ A
Alkynyl group,
Nyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethyl group,
C₁-C_Four Alkoxy C ₁-C₆ Alkyl group, di C₁-C_Four Al
Killamino C₁-C_Four Alkyl group, tetrahydrofurfury
Methyl group, C_Three-C₆ Alkynyloxy C₁-C_Four Alkyl
Group, benzyl group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano
No group, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four An alkoxy group and
Halo C₁-C_Four Select from groups consisting of alkyl groups
Benzyl group which may be substituted with a substituent represented by -C (=
X^Two) R⁶³Group,-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁰ Group,-(CH_Two)_a-O- (CH_Two)_b-R
⁷⁰ Group, or-(CH_Two)_a-X^Two-R⁷⁶Represents a group, or R⁵³
 And R⁵⁴Is the nitrogen atom to which they are attached, 3 members, 5 members
6 or 6 membered saturated ring or 5 or 6 membered ring
Aromatic ring (in the saturated ring and the aromatic ring, one carbon
Element atom may be replaced by one oxygen atom)
May be formed, R⁵⁵ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ Alkynyl group
Or R⁵⁵ And R⁵⁶ And in-(CH_Two)_e-Form a group
May be, R⁵⁶ And R⁵⁷ Is C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group or
Is a phenyl group (the C₁-C_Four An alkyl group, the C_Two-C₆ Arche
Nyl group, the C_Three-C₆ An alkynyl group and the phenyl group are
Hydrogen atom, C_Three
-C₆ Cycloalkyl group, -X^TwoR⁶⁰ Group, or -NR⁶¹R⁶²Base
And R⁵⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Two-C₆ 
Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group, C₁-C_Four Alkyl
Carbonyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four Al
Coxycarbonyl C₁-C_Four Alkyl group, di C₁-C_Four Arco
Xycarbonyl C₁-C_FourAlkyl group, benzyl group, C₁-C_Four
Alkoxy-C₁-C_FourAlkynyl group,-(CH_Two)_a-R⁷⁵Group,-(CH
_Two)_a-X^Two-R⁷²Group,-(CH_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-R⁷²Group, or-(C
H_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-X ^Two-(CH_Two)_c-R⁷²Represents a group, R⁵⁹ Is hydrogen field
Child, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆
 Alkynyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucylcarbonyl C₁-C_Three Alkyl group or phenyl
Represents a group, R⁶⁰ Is replaced by at least one halogen atom
May be C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶¹ And R⁶²
 May be the same or different and represent a hydrogen atom, or
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶³ Is at least one
C optionally substituted with a halogen atom₁-C_Four Alkyl
Group, C₁-C_Four Alkoshki C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucircio C₁-C_Four Alkyl group, C_Three-C₆ Cycloalkyl
Group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano group, C₁-C_Four
 Alkyl group, C₁-C_Four Alkoxy group and halo C₁-C_Four 
One selected from the group consisting of alkyl groups
A phenyl group optionally substituted with a substituent of -NR⁷³R⁷⁴
Group, or-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁵Represents a group, R⁶⁴ Is C₁-C_Four
Displays an alkoxycarbonyl group or carboxyl group
Then R⁶⁵ Is a chloromethyl group, a cyanomethyl group, at least
May also have one or more oxygen atoms inserted C_Three-C₆ Shi
Chloroalkyl group, or C₁-C_Four Alkoxycarbonyl
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁶ Is a hydroxyl group, or -NR⁶⁷R
⁶⁸And A is -NR⁶⁷R⁶⁸, Or -S (O)_f-R⁶⁹Table
Then R⁶⁷ And R⁶⁸ May be the same or different, and hydrogen
Atom, or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁹ Is C₁-C_Four 
Alkyl group, or C₁-C_Four Represents a haloalkyl group, R⁷⁰
 Is a hydrogen atom, hydroxyl group, halogen atom, at least one
C on₁-C_Four C optionally substituted with an alkoxy group₁-C
_Four Alkyl group, at least one oxygen atom is inserted
May be C_Three-C₆1 or 2 cycloalkyl groups
C optionally substituted with a methyl group_Three-C₆Cycloalkyl
Group, furyl group, thienyl group, or -C (= O) R⁷¹Table
Then R⁷¹ And R⁷² May be the same or different and C₁-
C_Four Alkyl group, or C₁-C _Four Represents an alkoxy group, R
⁷³ And R⁷⁴ May be the same or different and C₁-C_Four A
Represents a alkyl group or a phenyl group;⁷⁵ Is at least
One or more oxygen atoms may be inserted C_Three-C₆Shiku
Substituted with 1 or 2 methyl groups,
Good C_Three-C₆Cycloalkyl group, furyl group, thienyl
Group, or -C (= O) R⁷¹Represents a group, R⁷⁶ Is C₁-C_Four Archi
A, b, and c are each independently 1, 2,
Or 3; d represents 0 or 1; e represents 2 or 3
Represents, f represents 1 or 2, X^Two Is an oxygen atom or sulfur
Represents an atom.

【００１２】その他の N-置換ピラゾールとして、下記
化１２記載の構造式３８で示されるニピラクロフェ
ン{"The Pesticide Manual"，9th ed.、C. R. Worthing
編、British Crop Protection Council，Surrey (199
1) の 621 頁参照}、および 3-置換-2-アリール-4,5,6,
7-テトラヒドロインダゾール{Lyga et al., PesticideS
ci. 42: p29(1994)}をあげられる。Other N-substituted pyrazoles include
Nipiraclofen represented by Structural Formula 38 described in Chemical Formula 12 {"The Pesticide Manual", 9th ed., CR Worthing
Ed., British Crop Protection Council, Surrey (199
1), p. 621}, and 3-substituted-2-aryl-4,5,6,
7-tetrahydroindazole {Lyga et al., PesticideS
ci. 42: p29 (1994)}.

【化１２】 Embedded image

【００１３】ＰＰＯ阻害型除草剤が植物に施用された際
に植物細胞内で該殺草活性発現に関わる植物細胞内因性
物質としては、例えば、ＰＰＯの基質または該基質の前
駆体もしくは代謝物であって、植物細胞内で蓄積すると
細胞の機能傷害を惹起する物質、あるいは、このような
物質により植物細胞内で生成する物質であって細胞の機
能傷害を惹起する物質等があげられる。より具体的に
は、植物にＰＰＯ阻害型除草性化合物を処理した際に、
該植物の細胞内にＰＰＯの基質であるプロトポルフィリ
ノーゲンIXが蓄積し、これが細胞内で代謝されてプロト
ポルフィリンIXを生じ、さらに、プロトポルフィリンIX
と光の存在下に細胞内で活性酸素が生成し、その結果、
細胞機能が傷害を受けることが知られており（宮本純之
編、1993年、新しい農薬の科学 第3章 3.3節、p106、広
川書店 東京）、この系におけるプロトポルフィリノー
ゲンIX、プロトポルフィリンIXおよび活性酸素をあげる
ことができる。[0013] Plant cell endogenous substances involved in the expression of the herbicidal activity in plant cells when the PPO-inhibiting herbicide is applied to plants include, for example, PPO substrates or precursors or metabolites of the substrates. There are substances that cause cell dysfunction when accumulated in plant cells, and substances that are produced in plant cells by such substances and cause cell dysfunction. More specifically, when a plant is treated with a PPO-inhibiting herbicidal compound,
Protoporphyrinogen IX, a substrate of PPO, accumulates in the cells of the plant and is metabolized in the cells to produce protoporphyrin IX.
And active oxygen is generated in the cell in the presence of light,
It is known that cell function is damaged (Sumiyuki Miyamoto, 1993, New Agrochemical Science Chapter 3, Section 3.3, p106, Hirokawa Shoten Tokyo), protoporphyrinogen IX, protoporphyrin IX in this system And active oxygen.

【００１４】本発明植物１は、下記の(1)および(2)の特
性を有するＰＰＯ活性を有する。 (1)植物の天然のＰＰＯ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のＰＰＯ活性を阻害する量の除草剤に対
する耐性を植物に付与し得る。 本発明において、「植物の天然のＰＰＯ活性」とは、直
接、間接を問わず人為的操作を受けていない状態の植物
において天然に生ずるＰＰＯ活性を意味する。また、
「植物の天然のＰＰＯ活性とは実質的に異なる」とは、
前記のような植物の天然のＰＰＯ活性とは、植物の天然
のＰＰＯ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物
に付与し得るように異なることを意味する。そして、
「植物の天然のＰＰＯ活性を阻害する量の除草剤に対す
る耐性を付与し得る。」とは、天然のＰＰＯ活性を阻害
することにより通常の植物の生育に影響を及ぼし除草剤
としての機能を果たしうる量のＰＰＯ阻害型除草剤に対
して耐性を示すように変化させ得ることを意味する。上
記の(1)および(2)の特性を有するＰＰＯ活性を植物に付
与する方法としては、例えば、野生型のＰＰＯをコード
する遺伝子を植物の細胞において高発現させる方法（US
P5767373等に記載）、ＰＰＯ阻害型除草性化合物によっ
て阻害されないＰＰＯ活性を有する変異型ＰＰＯをコー
ドする遺伝子を植物の細胞で発現させる方法（USP59396
02等に記載）、または、ＰＰＯ阻害型除草性化合物によ
って阻害されないＰＰＯ活性を有するバクテリア由来の
ＰＰＯをコードする遺伝子を植物の細胞で発現させる方
法（EP0770682やWO9833927等に記載）等をあげることが
できる。このような方法に使用され得る遺伝子は、いず
れも「ＰＰＯ活性を実質的に有する」タンパク質をコー
ドする遺伝子であって、植物の細胞において産生させる
ことにより、該細胞に上記(1)および(2)の特性を有する
ＰＰＯ活性をもたらすことのできるタンパク質をコード
する遺伝子である。かかる遺伝子としては、天然に存在
するＰＰＯをコードする遺伝子であってもよく、天然に
存在するＰＰＯにアミノ酸の置換、付加、または欠失等
が導入されてなりＰＰＯ活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子であってもよく、ＰＰＯ活性を指標に選抜
されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
また、これらの遺伝子は、植物の天然のＰＰＯ活性を阻
害する量の除草剤によって阻害されるＰＰＯ活性を有す
るタンパク質をコードしていてもよいし、該除草剤によ
って阻害されないＰＰＯ活性を有するタンパク質をコー
ドしていてもよい。具体的には例えば、天然に存在する
ＰＰＯをコードする遺伝子としては、大腸菌Esherichia
coli (Genebank accession X68660)、枯草菌Bacillus
subtilis (Genebank accession M97208)、Haemophilus
influnzae (Genebank accession L42023)、マウス(Gene
bank accessionD45185)、ヒト(Genebank accession D38
537)、シロイヌナズナ(Genebank accession D83139)ま
たはタバコ(Genebank accession Y13465, Y13466)等由
来の遺伝子をあげることができる。また、ＰＰＯ阻害型
除草性化合物によって阻害されないＰＰＯ活性を有する
変異型ＰＰＯをコードする遺伝子としては、例えばUS59
39602やWO9704089等に示される遺伝子をあげることがで
きる。本発明植物１は、また、下記の(1-3)、(1-4)およ
び(1-5)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子
が導入されてなり該遺伝子を発現する。 (1-3)本物質に特異的に結合する。 (1-4)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する
変性能を実質的に持たない。 (1-5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない。 本発明において、タンパク質が物質に「特異的に結合す
る」とは、例えば、酵素と基質、または、酵素と阻害剤
もしくは活性調節因子との間の酵素化学的結合、受容体
とリガンドとの間の受容体化学的結合等において示され
るような親和性と特異性に基いて、タンパク質が物質に
結合することを意味する。「当該タンパク質が特異的に
結合する物質に対する変性能を実質的に持たない」と
は、該物質との酵素化学的な反応性が不活性である{但
し、上記の性質(1-3)でいう本物質との特異的結合性を
除く}ことを意味し、例えば、該物質を、該物質を示す
化学構造式とは異なる化学構造式で示される物質に変換
する酵素化学的反応を触媒する能力を実質的に持たない
場合をあげることができる。「変性能を実質的に持たな
い」タンパク質は、例えば、該タンパク質をコードする
遺伝子を、当該変性能を有するタンパク質をコードする
遺伝子が欠失し通常の条件では生育できなくなった微生
物に、発現可能な状態で導入した場合に、該微生物の生
育が相補されないことを指標に選択することもできる。
本発明において、「免疫グロブリンの可変領域のフレー
ムワーク領域を実質的に含まない」とは、免疫グロブリ
ンの可変領域に特有の立体構造を形成しないことを意味
する。ここで、「免疫グロブリンの可変領域のフレーム
ワーク領域」とは、免疫グロブリン分子を構成するH鎖
およびL鎖の可変領域のうち、超可変領域（hypervariab
le region）を除いた残りの領域であって、アミノ酸配
列の保存性が比較的高く、可変領域の高度に保存された
立体構造の保持に働く領域である。可変領域が前記の立
体構造をとることにより、H鎖およびL鎖のそれぞれ３ヶ
所に散在する超可変領域が該立体構造上の１か所にまと
まり、抗原結合部位が形成される[Alberts, B., et al.
ed. (1983) Molecular Biology of the Cell p979,Gar
land Publishing, Inc. New York]。「免疫グロブリン
の可変領域のフレームワーク領域を実質的に含まない」
タンパク質は、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列に
基づいて選び出すことができ、このようなタンパク質と
して具体的には例えば、免疫グロブリンの可変領域のフ
レームワーク領域の既知のアミノ酸配列と約６０％以上
の相同性を示す約３０アミノ酸以上からなるアミノ酸配
列を含まないタンパク質をあげることができる。また、
上記のフレームワーク領域を含むか否かは、例えば、該
タンパク質をコードする遺伝子を鋳型にして、免疫グロ
ブリンのH鎖もしくはL鎖由来の可変領域をコードする塩
基配列を有するDNAを増幅可能なプライマー、具体的に
は例えば、Clackson, T. et al., Nature 352; p624(19
91)に記載されるプライマーVH1BACKとVH1FOR-2、もしく
は、VK2BACKとVK4FOR、または、組換え抗体遺伝子のク
ローニングのための市販のキット、例えばRecombinant
Phage Antibody System(Pharmacia Biotech社製)に含ま
れるプライマーHeavy primers mixもしくはLight prime
r mixなどを用いてＰＣＲを行い、特定の長さのDNA断片
の増幅の有無を分析することによって確認することもで
きる。The plant 1 of the present invention has a PPO activity having the following characteristics (1) and (2). (1) Substantially different from the natural PPO activity of the plant. (2) It can confer resistance to plants on amounts of herbicides that inhibit the plant's natural PPO activity. In the present invention, “natural PPO activity of a plant” means a PPO activity that occurs naturally in a plant that has not been subjected to artificial manipulation, directly or indirectly. Also,
"Substantially different from the natural PPO activity of a plant"
The natural PPO activity of a plant as described above is meant to be different such that the plant can be rendered resistant to an amount of herbicide that inhibits the natural PPO activity of the plant. And
"Can confer resistance to a herbicide in an amount that inhibits the natural PPO activity of the plant." By inhibiting natural PPO activity, it affects normal plant growth and acts as a herbicide. It means that it can be altered to be resistant to possible amounts of PPO-inhibiting herbicides. Examples of a method for imparting the PPO activity having the above-mentioned properties (1) and (2) to a plant include, for example, a method for highly expressing a gene encoding a wild-type PPO in plant cells (US
P5767373), a method of expressing in a plant cell a gene encoding a mutant PPO having PPO activity not inhibited by a PPO-inhibiting herbicidal compound (USP59396).
02, etc.) or a method of expressing in a plant cell a gene encoding a bacterial PPO having PPO activity not inhibited by a PPO-inhibiting herbicidal compound (described in EP0770682, WO9833927, etc.). it can. The genes that can be used in such a method are all genes that encode proteins having “substantially have PPO activity”, and are produced in plant cells to cause the cells to have the above (1) and (2). ) Is a gene that encodes a protein capable of producing PPO activity having the property (1). Such a gene may be a gene encoding a naturally-occurring PPO, or a gene encoding a protein having PPO activity in which amino acid substitution, addition, deletion or the like is introduced into a naturally-occurring PPO. Or a gene encoding a protein selected using PPO activity as an index.
In addition, these genes may encode a protein having PPO activity inhibited by a herbicide in an amount that inhibits the natural PPO activity of a plant, or a protein having PPO activity not inhibited by the herbicide. May be coded. Specifically, for example, as a gene encoding a naturally occurring PPO, Escherichia coli Esherichia
coli (Genebank accession X68660), Bacillus subtilis
subtilis (Genebank accession M97208), Haemophilus
influnzae (Genebank accession L42023), mouse (Gene
bank accession D45185), human (Genebank accession D38
537) and genes derived from Arabidopsis thaliana (Genebank accession D83139) or tobacco (Genebank accession Y13465, Y13466). Examples of a gene encoding a mutant PPO having PPO activity not inhibited by a PPO-inhibiting herbicidal compound include, for example, US59
39602 and WO9704089. The plant 1 of the present invention has a gene encoding a protein having the following properties (1-3), (1-4) and (1-5) introduced therein and expresses the gene. (1-3) Specific binding to the substance. (1-4) The protein has substantially no ability to alter a substance to which it specifically binds. (1-5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. In the present invention, the term “specifically binds” a substance to a substance refers to, for example, an enzyme-substrate or an enzyme-chemical bond between an enzyme and an inhibitor or an activity regulator, a receptor-ligand. Means that a protein binds to a substance based on affinity and specificity as shown in the receptor chemical binding and the like. "Substantially does not have the ability to alter the substance to which the protein specifically binds" means that enzymatic reactivity with the substance is inactive (provided that the above property (1-3) Excluding specific binding with the substance), for example, catalyzes an enzymatic chemical reaction that converts the substance into a substance represented by a chemical structural formula different from the chemical structural formula representing the substance. There are cases where they have virtually no ability. A protein "having substantially no metamorphosis" can express, for example, a gene encoding the protein in a microorganism in which the gene encoding the protein having the metamorphic property has been deleted and cannot grow under normal conditions. Can be selected as an indicator that the growth of the microorganism is not complemented when introduced in a proper state.
In the present invention, "substantially not containing the framework region of the immunoglobulin variable region" means that a three-dimensional structure specific to the immunoglobulin variable region is not formed. Here, the “framework region of the immunoglobulin variable region” refers to the hypervariable region (hypervariab) of the variable regions of the heavy and light chains constituting the immunoglobulin molecule.
le region), which is a region having a relatively high conservation of amino acid sequence and a function of maintaining a highly conserved three-dimensional structure of the variable region. By taking the three-dimensional structure of the variable region, hypervariable regions scattered at three positions of each of the H chain and the L chain are united at one position on the three-dimensional structure to form an antigen binding site [Alberts, B ., et al.
ed. (1983) Molecular Biology of the Cell p979, Gar
land Publishing, Inc. New York]. "Substantially free of framework regions of immunoglobulin variable regions"
The protein can be selected, for example, based on the amino acid sequence of the protein. Specifically, for example, the protein has a homology of about 60% or more with the known amino acid sequence of the framework region of the immunoglobulin variable region. And a protein that does not contain an amino acid sequence consisting of about 30 amino acids or more. Also,
Whether or not the above-mentioned framework region is included, for example, using a gene encoding the protein as a template, a primer capable of amplifying a DNA having a nucleotide sequence encoding a variable region derived from an immunoglobulin H chain or L chain More specifically, for example, Clackson, T. et al., Nature 352; p624 (19
91) described in primers VH1BACK and VH1FOR-2, or VK2BACK and VK4FOR, or a commercially available kit for cloning a recombinant antibody gene, such as Recombinant
Primer Heavy primers mix or Light prime contained in Phage Antibody System (Pharmacia Biotech)
It can also be confirmed by performing PCR using r mix or the like and analyzing the presence or absence of amplification of a DNA fragment of a specific length.

【００１５】本発明植物１において、その遺伝子が発現
することにより産生される上記(1-3)、(1-4)および(1-
5)の性質を有するタンパク質としては、天然に存在する
タンパク質であってもよく、天然のタンパク質にアミノ
酸の置換、付加、または欠失等が導入されてなるタンパ
ク質であってもよく、ランダムなアミノ酸配列を有する
人為的に作出されたタンパク質の中から本物質との結合
性を指標に選抜されたタンパク質であってもよい。尚、
本発明において、「タンパク質」とは、２個以上のアミ
ノ酸がペプチド結合によって結合した物質をいい、例え
ば、４〜１００個程度のアミノ酸がペプチド結合によっ
て結合してなる物質も含まれる。上記の性質(1-3)、(1-
4)および(1-5)を有するタンパク質の具体例として、下
記のようなタンパク質をあげることができる。プロトポ
ルフィリンIXに特異的に結合するタンパク質として、例
えば、マグネシウムケラターゼ(magnesium protoporphy
rin IX chelatase)のプロトポルフィリンIX結合サブユ
ニットタンパク質、または該タンパク質の改変タンパク
質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結合するタ
ンパク質をあげることができ、より具体的には、該サブ
ユニットタンパク質からオルガネラ移行シグナル配列が
除去されたタンパク質等があげられる。また、フェロケ
ラターゼ(protoheme ferrolyase; EC 4.9.9.1)の改変タ
ンパク質であって、プロトポルフィリンIXに対する変性
能を持たずプロトポルフィリンIXに特異的に結合するタ
ンパク質をあげることもでき、より具体的には、フェロ
ケラターゼにおいて鉄イオンとの結合部位と推定される
領域が改変されてなりプロトポルフィリンIXに対する変
性能を持たないタンパク質等をあげることができる。さ
らに、コバルトケラターゼ(cobaltochelatase)の基質結
合サブユニットタンパク質、または該タンパク質の改変
タンパク質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結
合するタンパク質をあげることもできる。プロトポルフ
ィリノーゲンIXに特異的に結合するタンパク質として
は、ＰＰＯの改変タンパク質であって、プロトポルフィ
リノーゲンIXを酸化する能力を持たずプロトポルフィリ
ノーゲンIXに特異的に結合するタンパク質をあげること
ができ、より具体的には、ＰＰＯにおいてFAD結合部位
と推定される領域(アミノ酸配列GXGXXGを有する領域で
あって、ここでXは任意のアミノ酸を示す。例えば、シ
ロイヌナズナ葉緑体局在型ＰＰＯのアミノ末端から63〜
68番目のアミノ酸からなり、アミノ酸配列GGGISGを有す
る領域)が欠失したタンパク質等をあげることができ
る。また、プロトポルフィリノーゲンIXに結合するタン
パク質としては、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシ
ダーゼ(coproporphyrinogen III oxidase; EC 1.3.3.3)
の改変タンパク質であって、プロトポルフィリノーゲン
IXおよびコプロポルフィリノーゲンIIIを酸化する能力
を持たずプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合す
るタンパク質をあげることもできる。上記のようなタン
パク質が、細胞内で本物質と結合することにより、該物
質によって惹起される細胞機能傷害が防がれ、除草剤耐
性が発現され得る。かかるタンパク質をコードする遺伝
子は、例えば次のようにして得ることができる。In the plant 1 of the present invention, the above (1-3), (1-4) and (1-
The protein having the property of 5) may be a naturally-occurring protein, or may be a protein in which amino acid substitution, addition, or deletion has been introduced into a natural protein, and may be a random amino acid. It may be a protein selected from artificially created proteins having a sequence based on the binding to the substance. still,
In the present invention, “protein” refers to a substance in which two or more amino acids are bound by peptide bonds, and includes, for example, a substance in which about 4 to 100 amino acids are bound by peptide bonds. The above properties (1-3), (1-
Specific examples of the proteins having 4) and (1-5) include the following proteins. As a protein that specifically binds to protoporphyrin IX, for example, magnesium keratase (magnesium protoporphy
rin IX chelatase) protoporphyrin IX binding subunit protein, or a modified protein of the protein, which specifically binds to protoporphyrin IX, and more specifically, an organelle from the subunit protein. Examples include proteins from which the translocation signal sequence has been removed. Further, ferrokeratase (protoheme ferrolyase; EC 4.9.9.1) is a modified protein, which can also include a protein that does not have the ability to alter protoporphyrin IX and specifically binds to protoporphyrin IX, and more specifically, In ferrochelatase, a protein or the like in which a region presumed to be a binding site with iron ions is modified and has no ability to alter protoporphyrin IX can be mentioned. Furthermore, a substrate binding subunit protein of cobalt chelatase (cobaltochelatase) or a modified protein of the protein, which specifically binds to protoporphyrin IX can also be mentioned. Proteins that specifically bind to protoporphyrinogen IX include modified proteins of PPO that do not have the ability to oxidize protoporphyrinogen IX and specifically bind to protoporphyrinogen IX. More specifically, a region predicted to be a FAD binding site in PPO (a region having the amino acid sequence GXGXXG, where X represents any amino acid. For example, Arabidopsis thaliana chloroplast-localized PPO From the amino terminal of
A protein consisting of the 68th amino acid and lacking the amino acid sequence GGGISG). Further, as a protein that binds to protoporphyrinogen IX, coproporphyrinogen III oxidase (coproporphyrinogen III oxidase; EC 1.3.3.3)
A modified protein, comprising protoporphyrinogen
Proteins that do not have the ability to oxidize IX and coproporphyrinogen III but specifically bind to protoporphyrinogen IX can also be mentioned. By binding of the protein as described above to the substance in the cell, cell dysfunction caused by the substance is prevented, and herbicide resistance can be expressed. A gene encoding such a protein can be obtained, for example, as follows.

【００１６】マグネシウムケラターゼのプロトポルフィ
リンIX結合サブユニットタンパク質をコードする遺伝子
(chlH遺伝子)としては、光合成細菌Rhodobacter capsul
atus(Genebank accession M74001)、シロイヌナズナ(Ge
nebank accession Z68495)、オオムギ(Genebank access
ion U96216)、キンギョソウ(Genebank accession X7314
4)、Synechocystis P.C.C.6803(Genebank accession U2
9131)等由来の遺伝子の塩基配列が知られている。このよ
うな塩基配列既知の遺伝子は、目的の遺伝子を持つ生物
のゲノムDNAまたはcDNAを鋳型にして、その遺伝子にコ
ードされるタンパク質のアミノ末端付近に相当する塩基
配列およびカルボキシ末端付近に相当する塩基配列をも
とに作製したプライマーを用いてPCRを行うことにより
増幅しこれを単離することができる。また、上記以外の
光合成生物から、マグネシウムケラターゼのプロトポル
フィリンIX結合サブユニットタンパク質をコードする遺
伝子を取得することもできる。まず、目的とする光合成
生物からmRNAを調製し、該mRNAを鋳型として逆転写酵素
を用いてcDNAを合成し、これをZAPIIなどのファージベク
ターまたはpUCなどのプラスミドベクターに組み込んでc
DNAライブラリーを作製する。このcDNAライブラリーを鋳
型にして、上記のような塩基配列既知の遺伝子間で良好
に保存された塩基配列に基づき設計し合成されたプライ
マーを用いてPCRを行うことによって、マグネシウムケ
ラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタン
パク質遺伝子の少なくとも一部を含むDNA断片を増幅す
ることができる。このDNA断片をプローブにしてcDNAライ
ブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを選抜す
る。選抜したクローンの有するDNAの塩基配列を決定する
ことによって、目的とするマグネシウムケラターゼのプ
ロトポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質の遺伝
子であることを確認することができる。 マグネシウムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サ
ブユニットタンパク質の改変タンパク質であってプロト
ポルフィリンIXに特異的に結合するタンパク質をコード
する遺伝子を取得するには、例えば、該サブニユットタ
ンパク質の遺伝子に塩基の置換、欠失、付加等の変異を
導入し、該遺伝子をGibson, L.C.D. etal., Proc. Aca
d. Sci. USA, 92; p1941(1995)に記載の方法に準じて大
腸菌BL21(DE3)株に導入して形質転換株を取得し、導入
した遺伝子が高発現する条件で該形質転換株を培養す
る。培養菌体が赤色化し、プロトポルフィリンIXの蓄積
を示す蛍光吸収（励起波長405nm、蛍光波長630nm）が観
察される株を選抜することにより、該サブユニットタン
パク質の改変タンパク質であってプロトポルフィリンIX
に特異的に結合するタンパク質をコードする遺伝子を得
ることができる。Gene encoding protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase
(chlH gene) as a photosynthetic bacterium Rhodobacter capsul
atus (Genebank accession M74001), Arabidopsis (Ge
nebank accession Z68495), barley (Genebank access
ion U96216), snapdragon (Genebank accession X7314
4), Synechocystis PCC6803 (Genebank accession U2
9131) and the like are known. Such a gene having a known base sequence is prepared by using a genomic DNA or cDNA of an organism having the target gene as a template, and a base sequence corresponding to the vicinity of the amino terminal and a base corresponding to the vicinity of the carboxy terminal of the protein encoded by the gene. It can be amplified and isolated by performing PCR using primers prepared based on the sequence. In addition, a gene encoding a protoporphyrin IX-binding subunit protein of magnesium keratase can be obtained from a photosynthetic organism other than those described above. First, mRNA is prepared from the desired photosynthetic organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template by using a reverse transcriptase, and the cDNA is incorporated into a phage vector such as ZAPII or a plasmid vector such as pUC.
Create a DNA library. By using this cDNA library as a template and performing PCR using primers designed and synthesized based on a base sequence well-conserved among genes whose base sequence is known as described above, protoporphyrin of magnesium keratase A DNA fragment containing at least a part of the IX binding subunit protein gene can be amplified. Using this DNA fragment as a probe, a cDNA library is screened to select a positive clone. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the selected clone, it can be confirmed that the gene is the protoporphyrin IX-binding subunit protein gene of the target magnesium keratase. In order to obtain a gene encoding a protein that specifically binds to protoporphyrin IX, which is a modified protein of the protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase, for example, substituting a base for the subunit protein gene , Deletion, addition, etc., and the gene was transferred to Gibson, LCD et al., Proc.
d. Sci. USA, 92; introduced into E. coli BL21 (DE3) strain according to the method described in p1941 (1995) to obtain a transformant, and transforming the transformant under conditions in which the introduced gene is highly expressed. Incubate. By selecting strains in which the culture cells turn red and exhibit fluorescence absorption (excitation wavelength 405 nm, fluorescence wavelength 630 nm) indicating accumulation of protoporphyrin IX, a modified protein of the subunit protein, protoporphyrin IX
To obtain a gene encoding a protein that specifically binds to.

【００１７】フェロケラターゼをコードする遺伝子とし
ては、これまでに大腸菌Esherichiacoli (Genebank acc
ession D90259)、枯草菌Bacillus subtilis (Genebank
accession M97208)、Bradyrhizobium japonicum (Geneb
ank accession M92427)、酵母Saccharomyces cerevisia
e (Genebank accession J05395)、マウス(Genebankacce
ssion J05697)、ヒト(Genebank accession D00726)、オ
オムギ(Genebank accession D26105)、キュウリ(Geneba
nk accession D26106)等由来の遺伝子の塩基配列が知ら
れている。このような塩基配列既知の遺伝子は、目的の
遺伝子を持つ生物のゲノムDNAもしくはcDNAを鋳型にし
て、その遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ末端
付近に相当する塩基配列およびカルボキシ末端付近に相
当する塩基配列をもとに作製したプライマーを用いてPC
Rを行うことにより、増幅し単離することができる。ま
た、塩基配列の知られていないフェロケラターゼ遺伝子
を取得するには、まず、目的とする生物からmRNAを調製
し、該mRNAを鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成
し、これをZAPIIなどのファージベクターまたはpUCなど
のプラスミドベクターに組み込んでcDNAライブラリーを
作製する。このcDNAライブラリーを、Miyamoto,K.,et a
l. Plant Physiol., 105; p769 (1994)に記載の大腸菌
のフェロケラターゼ欠失変異株VS200に導入し相補試験
を行うことによって、該cDNAライブラリーから目的の生
物由来のフェロケラターゼ遺伝子を有するクローンを選
抜することができる。また、前記cDNAライブラリーを鋳
型にして、上記のような塩基配列既知の遺伝子間で良好
に保存された塩基配列に基づき作製されたプライマーを
用いてPCRを行うことによってDNA断片を増幅し、該DNA
断片をプローブにして前記cDNAライブラリーをスクリー
ニングし、陽性クローンを選抜してもよい。このように
して選抜されたクローンの有するDNAの塩基配列を決定
することによって、目的とするフェロケラターゼ遺伝子
であることを確認することができる。 フェロケラターゼの改変タンパク質であってプロトポル
フィリンIXに対する変性能を持たずプロトポルフィリン
IXに特異的に結合するタンパク質、例えば、フェロケラ
ターゼにおいて鉄イオンとの結合部位と推定される領域
が改変されてなりプロトポルフィリンIXに対する変性能
を持たないタンパク質をコードする遺伝子を取得するに
は、該領域付近のアミノ酸配列をコードする塩基配列に
基づき、該領域に変異を導入するためのプライマーを作
製し、この変異導入プライマーを用いて、市販の部位特
異的変異導入キット(Mutan-Super Express Km、宝酒造
製)を用いたPCRを行うことにより、上記領域の変異体を
コードする遺伝子を調製することができる。具体的に
は、野生型のフェロケラターゼ遺伝子をプラスミドベク
ターpKF19kのクローニング部位に挿入し、得られたプラ
スミドのDNAを鋳型に、前述の変異導入プライマーとpKF
19kのカナマイシン耐性遺伝子上にあるアンバー変異を
復帰させるための選抜プライマーとを用いてPCRを行う。
該PCRで増幅された遺伝子を大腸菌MV1184株（サプレッ
サーフリー）に導入し、遺伝子導入株をカナマイシン耐
性で選抜することにより、目的の領域を構成するアミノ
酸に相当する塩基配列が改変されたフェロケラターゼ遺
伝子を持つ大腸菌を単離することができる。該大腸菌の
有するプラスミドDNAの塩基配列を解析することによっ
て、単離した遺伝子が目的とする改変タンパク質をコー
ドする遺伝子であることを確認することができる。As a gene encoding ferrochelatase, Escherichia coli (Genebank acc.
ession D90259), Bacillus subtilis (Genebank
accession M97208), Bradyrhizobium japonicum (Geneb
ank accession M92427), yeast Saccharomyces cerevisia
e (Genebank accession J05395), mouse (Genebankacce
ssion J05697), human (Genebank accession D00726), barley (Genebank accession D26105), cucumber (Geneba
nk accession D26106) and the like are known. Such a gene having a known base sequence is prepared by using a genomic DNA or cDNA of an organism having the gene of interest as a template, and a base sequence corresponding to the vicinity of the amino terminal and a base corresponding to the vicinity of the carboxy terminal of the protein encoded by the gene. PC using primers prepared based on the sequence
By performing R, it can be amplified and isolated. To obtain a ferrochelatase gene whose base sequence is not known, first, mRNA is prepared from the target organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template by using a reverse transcriptase, and this is used as a ZAPII or the like. A cDNA library is prepared by incorporating the plasmid into a phage vector or a plasmid vector such as pUC. This cDNA library was transferred to Miyamoto, K., et a
l. Plant Physiol., 105; p769 (1994), by introducing into a ferrochelatase deletion mutant VS200 of Escherichia coli and performing a complementation test, a clone having a ferrochelatase gene derived from the target organism was selected from the cDNA library. can do. Further, using the cDNA library as a template, a DNA fragment is amplified by performing PCR using primers prepared based on a nucleotide sequence well-conserved between genes having a known nucleotide sequence as described above, DNA
The cDNA library may be screened using the fragment as a probe to select a positive clone. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the clone thus selected, it can be confirmed that the clone is the target ferrochelatase gene. Protoporphyrin, a modified protein of ferrochelatase, that does not have the ability to alter protoporphyrin IX
To obtain a gene encoding a protein that specifically binds to IX, for example, a protein in which a region presumed to be a binding site for iron ions in ferrochelatase is modified and has no metamorphic property to protoporphyrin IX, Based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence in the vicinity of the region, a primer for introducing a mutation into the region is prepared, and a commercially available site-directed mutagenesis kit (Mutan-Super Express Km, By performing PCR using Takara Shuzo, a gene encoding a mutant in the above region can be prepared. Specifically, the wild-type ferrochelatase gene was inserted into the cloning site of the plasmid vector pKF19k, and the above-mentioned mutagenesis primer and pKF
PCR is performed using a selection primer for reversing the amber mutation on the 19k kanamycin resistance gene.
By introducing the gene amplified by the PCR into Escherichia coli MV1184 strain (suppressor-free) and selecting the transfected strain with kanamycin resistance, a ferrokeratase gene having a modified base sequence corresponding to the amino acid constituting the target region was obtained. Can be isolated. By analyzing the base sequence of the plasmid DNA of the Escherichia coli, it can be confirmed that the isolated gene is a gene encoding the desired modified protein.

【００１８】ＰＰＯ遺伝子は、これまでに大腸菌Esheri
chia coli (Genebank accession X68660)、枯草菌Bacil
lus subtilis (Genebank accession M97208)、Haemophi
lusinflunzae (Genebank accession L42023)、マウス(G
enebank accession D45185)、ヒト(Genebank accession
D38537)、シロイヌナズナ(Genebank accession D8313
9)、タバコ(Genebank accession Y13465, Y13466)等由
来の遺伝子の塩基配列が知られている。このような塩基
配列既知の遺伝子は、目的の遺伝子を持つ生物のゲノム
DNAもしくはcDNAを鋳型にして、その遺伝子にコードさ
れるタンパク質のアミノ末端付近に相当する塩基配列お
よびカルボキシ末端付近に相当する塩基配列をもとに作
製したプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅
し、これを単離することができる。また、塩基配列の知
られていないＰＰＯ遺伝子を取得するには、まず、目的
の遺伝子を持つ生物から前述の方法でcDNAライブラリー
を作製する。このcDNAライブラリーを、Narita,S., et
al., Gene, 182; p169 (1996)等に記載の大腸菌のＰＰ
Ｏ欠失変異株VSR800に導入し相補試験を行うことによっ
て、該cDNAライブラリーから目的の生物由来のＰＰＯ遺
伝子を有するクローンを選抜することができる。また、
前記cDNAライブラリーを鋳型にして、上記のような塩基
配列既知の遺伝子間で良好に保存された塩基配列に基づ
き作製されたプライマーを用いてPCRを行うことによっ
てDNA断片を増幅し、該DNA断片をプローブにして前記cD
NAライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを選
抜してもよい。選抜されたクローンの有する塩基配列を
決定することによって、目的とするＰＰＯ遺伝子である
ことを確認することができる。 ＰＰＯの改変タンパク質であって、プロトポルフィリノ
ーゲンIXを酸化する能力を持たずプロトポルフィリノー
ゲンIXに特異的に結合するタンパク質の遺伝子を取得す
るには、例えば、ＰＰＯ遺伝子に塩基の置換、欠失、付
加等の変異を導入し、該改変遺伝子をＰＰＯ阻害型除草
剤処理によって光依存的に増殖が阻害される上述の大腸
菌に導入する。該大腸菌をヘミン、アミノレブリン酸お
よびＰＰＯ阻害型除草剤存在下に培養して明所でも生育
可能なクローンを選抜することにより、プロトポルフィ
リノーゲンIX結合能を有するタンパク質をコードする遺
伝子を選抜することができる。このようにして選抜され
た改変遺伝子を大腸菌等の宿主細胞で発現させて該遺伝
子のコードするタンパク質を調製し、得られたタンパク
質のプロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化能を、例
えば、Jacob,N.J.and Jacobs,J.M.(1982) Enzyme, 28,
206-219等に記載の方法に準じて測定することにより、
プロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化能を持たない
タンパク質の遺伝子を選抜することができる。より具体
的には、上記改変遺伝子を大腸菌用の発現ベクターに挿
入して、Yamamoto,F.et al., Japanese J. Genet.,63;
p237(1988)等に記載されている大腸菌BT3株のような、
ＰＰＯ遺伝子(hemG遺伝子座)欠損突然変異系統大腸菌に
導入し、該大腸菌に導入したベクター上の選抜マーカー
に対応する細胞生育阻害剤に加えヘミンおよびアミノレ
ブリン酸を含む培地で該大腸菌を培養して形質転換株を
取得し、該形質転換株から上記改変遺伝子のコードする
タンパク質を調製してもよい。また、該形質転換株をヘ
ミンおよびアミノレブリン酸を実質的に含まない培地で
培養し、生育しない株を確認することにより、該形質転
換株からその宿主細胞のＰＰＯ遺伝子欠損を相補しない
遺伝子を得ることができ、かかる方法をプロトポルフィ
リノーゲンIXに対する酸化能を持たないタンパク質をコ
ードする遺伝子の選抜に利用してもよい。また、ＰＰＯ
においてFADとの結合部位と推定される領域(アミノ酸配
列GXGXXGを有する領域であって、ここでＸは任意のアミ
ノ酸を示す。)を欠失したタンパク質をコードする遺伝
子を取得するには、まず、該領域付近のアミノ酸配列を
コードする塩基配列に基づき、該領域の欠失変異を導入
するためのプライマーを作製する。この変異導入プライ
マーを用いて、前述のように市販の部位特異的変異導入
キット(Mutan-Super Express Km、宝酒造製)を用いてPC
Rを行い該領域の欠失変異体をコードする遺伝子を調製
することができる。The PPO gene has been used for Escherichia coli Esheri.
chia coli (Genebank accession X68660), Bacillus subtilis Bacil
lus subtilis (Genebank accession M97208), Haemophi
lusinflunzae (Genebank accession L42023), mouse (G
enebank accession D45185), human (Genebank accession
D38537), Arabidopsis (Genebank accession D8313)
9), base sequences of genes derived from tobacco (Genebank accession Y13465, Y13466) and the like are known. Such a gene whose base sequence is known is the genome of the organism having the gene of interest.
Using DNA or cDNA as a template, amplification is performed by performing PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminus and the nucleotide sequence near the carboxy terminus of the protein encoded by the gene. Can be isolated. To obtain a PPO gene whose base sequence is not known, first, a cDNA library is prepared from an organism having a target gene by the above-described method. This cDNA library was purchased from Narita, S., et.
al., Gene, 182; PP of Escherichia coli described in p169 (1996) and the like.
By introducing the gene into the O-deletion mutant VSR800 and performing a complementation test, a clone having the PPO gene derived from the target organism can be selected from the cDNA library. Also,
Using the cDNA library as a template, amplify a DNA fragment by performing PCR using primers prepared based on a base sequence well-conserved among genes whose base sequence is known as described above, Using the above cD
The NA library may be screened to select positive clones. By determining the nucleotide sequence of the selected clone, it can be confirmed that it is the target PPO gene. To obtain a gene for a PPO modified protein that does not have the ability to oxidize protoporphyrinogen IX and specifically binds to protoporphyrinogen IX, for example, base substitution, deletion, The modified gene is introduced into the above-mentioned Escherichia coli whose growth is inhibited in a light-dependent manner by treatment with a PPO-inhibiting herbicide. Selecting a gene encoding a protein having binding ability to protoporphyrinogen IX by culturing the Escherichia coli in the presence of hemin, aminolevulinic acid and a PPO-inhibiting herbicide and selecting a clone capable of growing in the light; Can be. The modified gene thus selected is expressed in a host cell such as Escherichia coli to prepare a protein encoded by the gene, and the oxidizing ability of the obtained protein with respect to protoporphyrinogen IX is determined, for example, by Jacob, NJ and Jacobs. , JM (1982) Enzyme, 28,
By measuring according to the method described in 206-219 etc.,
A gene of a protein having no oxidizing ability to protoporphyrinogen IX can be selected. More specifically, the modified gene is inserted into an expression vector for Escherichia coli, Yamamoto, F. et al., Japanese J. Genet., 63;
such as the E. coli BT3 strain described in p237 (1988), etc.
A PPO gene (hemG locus) -deficient mutant strain Escherichia coli was introduced, and the Escherichia coli was cultured in a medium containing hemin and aminolevulinic acid in addition to a cell growth inhibitor corresponding to the selectable marker on the vector introduced into the Escherichia coli. A transformant may be obtained, and a protein encoded by the modified gene may be prepared from the transformant. Further, by culturing the transformant in a medium substantially free of hemin and aminolevulinic acid, and confirming the strain that does not grow, obtaining a gene that does not complement the PPO gene deficiency of the host cell from the transformant Such a method may be used to select a gene encoding a protein having no ability to oxidize protoporphyrinogen IX. Also, PPO
In order to obtain a gene encoding a protein in which a region presumed to be a binding site to FAD (a region having the amino acid sequence GXGXXG, where X represents an arbitrary amino acid), Based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence in the vicinity of the region, a primer for introducing a deletion mutation in the region is prepared. Using this mutagenesis primer, as described above, using a commercially available site-directed mutagenesis kit (Mutan-Super Express Km, Takara Shuzo)
By performing R, a gene encoding a deletion mutant of the region can be prepared.

【００１９】コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダー
ゼをコードする遺伝子としては、これまでに大腸菌Eshe
richia coli (Genebank accession X75413)、Salmonell
a typhimurium (Genebank accession L19503)、酵母Sac
charomyces cerevisiae (Genebank accession J0387
3)、マウス(Genebank accession D16333)、ヒト(Geneba
nk accession D16611)、ダイズ(Genebank accession X7
1083)、オオムギ(Genebank accession X82830)、タバコ
(Genebank accession X82831)等由来の遺伝子の塩基配
列が知られている。このような塩基配列既知の遺伝子
は、目的の遺伝子を持つ生物のゲノムDNAもしくはcDNA
を鋳型にして、その遺伝子にコードされるタンパク質の
アミノ末端付近に相当する塩基配列およびカルボキシ末
端付近に相当する塩基配列をもとに作製したプライマー
を用いてPCRを行うことにより、増幅し単離することが
できる。また、塩基配列の知られていないコプロポルフ
ィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子を取得するには、
まず、目的とする生物からmRNAを調製し、該mRNAを鋳型
として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、これをSikorsk
i,R.S. et al. Genetics, 122; p19 (1989)に記載のpRS
313などのプラスミドベクターに組み込んでcDNAライブ
ラリーを作製する。このcDNAライブラリーを、Troup, B.
et al. J. Bacteriol., 176; p673 (1994)に記載の酵
母コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ欠失変異
株HEM13に導入して相補試験を行い、生育可能なクロー
ンを選抜することによって、該cDNAライブラリーから目
的の生物由来のコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダ
ーゼ遺伝子を有するクローンを選抜することができる。
また、前記cDNAライブラリーを鋳型にして、上記のよう
な塩基配列既知の遺伝子間で良好に保存された塩基配列
に基づき作製されたプライマーを用いてPCRを行うこと
によってDNA断片を増幅し、該DNA断片をプローブにして
前記cDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性クロー
ンを選抜してもよい。このようにして選抜されたクロー
ンの有するDNAの塩基配列を決定することによって、目
的とするコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子であることを確認することができる。 コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼの改変タン
パク質であって、プロトポルフィリノーゲンIXおよびコ
プロポルフィリノーゲンIIIに対する酸化能を持たずプ
ロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合するタンパク
質の遺伝子を取得するには、例えば、コプロポルフィリ
ノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子に塩基の置換、欠失、
付加等の変異を導入し、該改変遺伝子をＰＰＯ阻害型除
草剤処理によって光依存的に増殖が阻害される上述の大
腸菌に導入する。該大腸菌をヘミン、アミノレブリン酸
およびＰＰＯ阻害型除草剤存在下に培養して明所でも生
育可能なクローンを選抜することにより、プロトポルフ
ィリノーゲンIX結合能を有するタンパク質をコードする
遺伝子を選抜することができる。このようにして選抜さ
れた改変遺伝子を、例えば、大腸菌等の宿主細胞で発現
させて該遺伝子のコードするタンパク質を調製し、得ら
れたタンパク質のプロトポルフィリノーゲンIXに対する
酸化能を、例えば、Jacob,N.J.and Jacobs,J.M.(1982)
Enzyme, 28, 206-219等に記載の方法に準じて測定する
ことにより、プロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化
能を持たないタンパク質の遺伝子を選抜することができ
る。さらに、前記のようにして大腸菌から調製されたタ
ンパク質について、コプロポルフィリノーゲンIIIをプ
ロトポルフィリノーゲンIXに変換する能力(コプロポル
フィリノーゲンIIIオキシダーゼ活性)を、例えば、Yosh
inaga, T.,Sano,S., J. Biol. Chem., 255; p4722(198
0)等に記載の方法に準じて測定することにより、コプロ
ポルフィリノーゲンIIIに対する酸化能を持たないタン
パク質の遺伝子を選抜することができる。As a gene encoding coproporphyrinogen III oxidase, Escherichia coli Eshe
richia coli (Genebank accession X75413), Salmonell
a typhimurium (Genebank accession L19503), yeast Sac
charomyces cerevisiae (Genebank accession J0387
3), mouse (Genebank accession D16333), human (Geneba
nk accession D16611), soybean (Genebank accession X7
1083), barley (Genebank accession X82830), tobacco
(Genebank accession X82831) and the like are known. Such a gene whose base sequence is known is a genomic DNA or cDNA of an organism having the gene of interest.
Amplified and isolated by performing PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminal and the nucleotide sequence near the carboxy terminal of the protein encoded by the gene as a template can do. To obtain a coproporphyrinogen III oxidase gene whose base sequence is not known,
First, mRNA is prepared from the target organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template using reverse transcriptase, and
pRS described in i, RS et al. Genetics, 122; p19 (1989)
A cDNA library is prepared by incorporating it into a plasmid vector such as 313. This cDNA library was transferred from Troup, B.
et al. J. Bacteriol., 176; p673 (1994), introduced into the yeast coproporphyrinogen III oxidase deletion mutant HEM13, performed a complementation test, and selected a viable clone to obtain the cDNA. From the library, a clone having the coproporphyrinogen III oxidase gene derived from the target organism can be selected.
Further, using the cDNA library as a template, a DNA fragment is amplified by performing PCR using primers prepared based on a nucleotide sequence well-conserved between genes having a known nucleotide sequence as described above, The cDNA library may be screened using a DNA fragment as a probe to select a positive clone. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the clone selected in this way, it can be confirmed that the gene is the target coproporphyrinogen III oxidase gene. To obtain a gene for a protein that is a modified protein of coproporphyrinogen III oxidase and does not have the ability to oxidize protoporphyrinogen IX and coproporphyrinogen III and specifically binds to protoporphyrinogen IX, For example, base substitution, deletion, in coproporphyrinogen III oxidase gene,
A mutation such as addition is introduced, and the modified gene is introduced into Escherichia coli described above whose growth is inhibited in a light-dependent manner by treatment with a PPO-inhibiting herbicide. Selecting a gene encoding a protein having binding ability to protoporphyrinogen IX by culturing the Escherichia coli in the presence of hemin, aminolevulinic acid and a PPO-inhibiting herbicide and selecting a clone capable of growing in the light; Can be. The modified gene thus selected is expressed, for example, in a host cell such as Escherichia coli to prepare a protein encoded by the gene, and the oxidizing ability of the obtained protein to protoporphyrinogen IX is determined, for example, by Jacob. , NJand Jacobs, JM (1982)
By measuring according to the method described in Enzyme, 28, 206-219, etc., a gene of a protein having no ability to oxidize protoporphyrinogen IX can be selected. Furthermore, for the protein prepared from E. coli as described above, the ability to convert coproporphyrinogen III to protoporphyrinogen IX (coproporphyrinogen III oxidase activity), for example, Yosh
inaga, T., Sano, S., J. Biol. Chem., 255; p4722 (198
By performing the measurement according to the method described in (0) and the like, a gene of a protein having no oxidizing ability to coproporphyrinogen III can be selected.

【００２０】本物質に特異的に結合可能なタンパク質の
遺伝子は、例えば、Sugimoto,N., Nakano,S., Chem. Le
tt., p939(1997)等に記載のように、コンビナトリアル
ケミストリー法を用いて合成されたペプチドライブラリ
ーから本物質に対して結合性を示すペプチドを選抜し、
選抜されたペプチドのアミノ酸配列をペプチドシークエ
ンサーで解析し、該アミノ酸配列をコードする塩基配列
を含む遺伝子を設計してこれをDNA合成装置等で合成す
ることによっても、取得することができる。また、ファ
ージディスプレー法を用いて、本物質に対して結合性を
有するタンパク質を提示するファージクローンをファー
ジライブラリーから選抜し取得することもできる。具体
的には、例えば、M13ファージ遺伝子のコートタンパク
質pIIIをコードする領域の上流側に、ランダムなアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を挿入
することによって、M13ファージ粒子表面にランダムな
アミノ酸配列を有するタンパク質が提示されたファージ
ライブラリーを構築する。一方、ビオチン標識化した本物
質を、アビジンもしくはストレプトアビジンでコートし
たプレートに結合させることにより、本物質でコートさ
れた支持体を作製する。前述のファージライブラリーを
この本物質でコートされたプレート上でスクリーニング
すると、本物質に結合性のある目的のタンパク質を提示
したファージを単離することができ、単離されたファー
ジから目的のタンパク質の遺伝子を取得することができ
る。The genes of proteins capable of specifically binding to this substance are described, for example, in Sugimoto, N., Nakano, S., Chem.
As described in tt., p939 (1997), etc., a peptide showing a binding property to the substance was selected from a peptide library synthesized using a combinatorial chemistry method,
It can also be obtained by analyzing the amino acid sequence of the selected peptide with a peptide sequencer, designing a gene containing a base sequence encoding the amino acid sequence, and synthesizing it with a DNA synthesizer or the like. Further, a phage clone displaying a protein having a binding property to the present substance can be selected from a phage library and obtained by using a phage display method. Specifically, for example, by inserting a nucleotide sequence encoding a protein having a random amino acid sequence upstream of the region encoding the coat protein pIII of the M13 phage gene, a random amino acid sequence on the surface of the M13 phage particle To construct a phage library displaying a protein having On the other hand, a biotin-labeled substance is bound to a plate coated with avidin or streptavidin to prepare a support coated with the substance. By screening the phage library described above on a plate coated with this substance, it is possible to isolate a phage displaying a target protein that binds to this substance, and to isolate the target protein from the isolated phage. Gene can be obtained.

【００２１】本発明植物１は、例えば、上記ような「Ｐ
ＰＯ活性を実質的に有する」タンパク質をコードする遺
伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、上述の(1-
3)、(1-4)および(1-5)の性質を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含
む方法により作製することができる。具体的には例え
ば、「ＰＰＯ活性を実質的に有する」タンパク質をコー
ドする遺伝子と、(1-3)、(1-4)および(1-5)の性質を有
するタンパク質をコードする遺伝子とを同時に植物細胞
へ導入し、得られた細胞からこれらの遺伝子を発現する
本発明植物１を作出してもよいし、片方の遺伝子を導入
した植物細胞にもう片方の遺伝子を導入し、得られた細
胞からこれらの遺伝子を発現する本発明植物１を作出し
てもよい。また、「ＰＰＯ活性を実質的に有する」タン
パク質をコードする遺伝子、および、(1-3)、(1-4)およ
び(1-5)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子
を、それぞれ単独で植物細胞に導入して各々の遺伝子を
発現する本発明植物１を作出し、得られた植物を交配す
ることにより、両方の遺伝子を発現する植物を作製して
もよい。さらに、上述の(1)および(2)の特性を有するＰ
ＰＯ活性を有する植物細胞に、(1-3)、(1-4)および(1-
5)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入
し、得られた細胞から該遺伝子を発現する本発明植物１
を作出してもよく、また、(1-3)、(1-4)および(1-5)の
性質を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入され
該遺伝子を発現する植物細胞に、「ＰＰＯ活性を実質的
に有する」タンパク質をコードする遺伝子を導入し、得
られた細胞からこれらの遺伝子を発現する本発明植物１
を作出してもよい。尚、いずれの場合も、「ＰＰＯ活性
を実質的に有する」タンパク質をコードする２種類以上
の遺伝子、または、(1-3)、(1-4)および(1-5)の性質を
有するタンパク質をコードする２種類以上の遺伝子を植
物細胞に導入してもよい。The plant 1 of the present invention is, for example,
Introducing a gene encoding a protein having substantially PO activity into plant cells and expressing the gene;
3) a step of introducing a gene encoding a protein having the properties of (1-4) and (1-5) into a plant cell and expressing the gene in a plant cell. Specifically, for example, a gene encoding a protein having “substantially having PPO activity” and a gene encoding a protein having the properties of (1-3), (1-4) and (1-5) At the same time, the plant 1 of the present invention which expresses these genes may be produced from the obtained cells by introducing the gene into the plant cells, or the other gene may be introduced into a plant cell into which one of the genes has been introduced. The plant 1 of the present invention which expresses these genes from cells may be produced. Further, a gene encoding a protein having “substantially having PPO activity” and a gene encoding a protein having the properties of (1-3), (1-4) and (1-5) are each independently used. Plants expressing both genes may be produced by producing plant 1 of the present invention that expresses each gene by introducing it into plant cells and crossing the obtained plants. Furthermore, P having the above-mentioned characteristics (1) and (2)
(1-3), (1-4) and (1-
The plant 1 of the present invention, in which a gene encoding a protein having the property of 5) is introduced, and the gene is expressed from the obtained cells.
And a gene encoding a protein having the properties of (1-3), (1-4) and (1-5) is introduced into a plant cell expressing the gene. The present invention, which comprises introducing a gene encoding a protein having “substantially having” and expressing these genes from the obtained cells.
May be created. In each case, two or more types of genes encoding proteins having “substantially have PPO activity” or proteins having the properties of (1-3), (1-4) and (1-5) May be introduced into plant cells.

【００２２】本発明植物２は、本発明植物１と同様に上
記(1)および(2)の特性を有するＰＰＯ活性を有する植物
であって、かつ、下記の(2-3)、(2-4)および(2-5)の性
質を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入されて
なり該遺伝子を発現する植物である。 (2-3)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (2-4)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持
たない。 (2-5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない。 ここで、「プロトポルフィリンIXに特異的に結合する」
とは、前述のごとく、例えば、酵素と基質、または、酵
素と阻害剤もしくは活性調節因子との間の酵素化学的結
合、受容体とリガンドとの間の受容体化学的結合等にお
いて示されるような親和性と特異性に基いて、当該タン
パク質がプロトポルフィリンIXに結合することを意味す
る。また、「プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性
能を持たない」とは、プロトポルフィリノーゲンIXとの
酵素化学的な反応性が不活性であることを意味し、例え
ば、プロトポルフィリノーゲンIXを、その化学構造式と
は異なる化学構造式で示される物質に変換する酵素化学
的反応を触媒する能力を実質的に持たない場合をあげる
ことができる。「免疫グロブリンの可変領域のフレーム
ワーク領域を実質的に含まない」とは、前述のとおり、
免疫グロブリンの可変領域に特有の立体構造を形成しな
いことを意味する。本発明植物２において、その遺伝子
が発現することにより産生される上記(2-3)、(2-4)およ
び(2-5)の性質を有するタンパク質としては、天然に存
在するタンパク質であってもよく、天然のタンパク質に
アミノ酸置換、付加、欠失等が導入されてなるタンパク
質であってもよく、ランダムなアミノ酸配列を有する人
為的に作出されたタンパク質の中からプロトポルフィリ
ンIXとの結合性を指標に選抜されたタンパク質であって
もよい。このようなタンパク質の具体例としては、例え
ば、マグネシウムケラターゼ、および、マグネシウムケ
ラターゼの改変タンパク質であってプロトポルフィリン
IXに特異的に結合しプロトポルフィリノーゲンIXを変性
する能力を持たないタンパク質をあげることができる。
また、フェロケラターゼ、および、フェロケラターゼの
改変タンパク質であって、プロトポルフィリンIXに特異
的に結合しプロトポルフィリノーゲンIXを変性する能力
を持たないタンパク質をあげることもできる。The plant 2 of the present invention is a plant having PPO activity having the above-mentioned characteristics (1) and (2), similarly to the plant 1 of the present invention, and has the following (2-3), (2- It is a plant into which a gene encoding a protein having the properties of 4) and (2-5) has been introduced and which expresses the gene. (2-3) Specific binding to protoporphyrin IX. (2-4) It does not have the ability to transform protoporphyrinogen IX. (2-5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. Here, "specifically binds to protoporphyrin IX"
As described above, for example, as indicated in an enzymatic chemical bond between an enzyme and a substrate or an enzyme and an inhibitor or an activity modulator, a receptor chemical bond between a receptor and a ligand, and the like. Means that the protein binds to protoporphyrin IX based on high affinity and specificity. Also, `` has no metamorphic property to protoporphyrinogen IX '' means that the enzymatic chemical reactivity with protoporphyrinogen IX is inactive, for example, protoporphyrinogen IX, There may be mentioned a case where the compound does not substantially have the ability to catalyze an enzymatic chemical reaction for converting into a substance represented by a chemical structural formula different from the chemical structural formula. "Substantially free of the framework regions of the immunoglobulin variable regions", as described above,
It does not form a conformation unique to the variable region of an immunoglobulin. In the plant 2 of the present invention, the protein having the properties (2-3), (2-4) and (2-5) produced by expressing the gene is a naturally occurring protein. May be a protein in which amino acid substitutions, additions, deletions, etc. are introduced into a natural protein, and may be selected from artificially created proteins having a random amino acid sequence to bind to protoporphyrin IX May be a protein selected using as an index. Specific examples of such a protein include, for example, magnesium keratase and a modified protein of magnesium keratase such as protoporphyrin
Proteins that specifically bind to IX and do not have the ability to denature protoporphyrinogen IX can be mentioned.
In addition, ferrochelatase and modified proteins of ferrochelatase, which specifically bind to protoporphyrin IX and do not have the ability to denature protoporphyrinogen IX, can also be mentioned.

【００２３】上記のタンパク質をコードする遺伝子は、
例えば、以下のようにして取得することができる。マグ
ネシウムケラターゼは、プロトポルフィリンIXにマグネ
シウムイオンを配位しマグネシウムポルフィリンIXを生
成する能力を有し、プロトポルフィリンIX結合サブユニ
ットタンパク質、Ｉサブユニットタンパク質およびＤサ
ブユニットタンパク質で構成される。マグネシウムケラ
ターゼを植物で発現させるには、これらの３つのサブユ
ニットタンパク質をコードする遺伝子を取得する。マグ
ネシウムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユ
ニットタンパク質をコードする遺伝子は、前記の方法で
取得することができる。マグネシウムケラターゼのＩサ
ブユニットタンパク質をコードする遺伝子として、光合
成細菌Rhodobacter sphaerides (Genebank accession A
F017642)、光合成細菌Rhodobacter capsulatus (Geneba
nk accession Z11165)、シロイヌナズナ(Genebank acce
ssion D49426)、オオムギ(Genebank accession U2654
5)、ダイズ(Genebank accession D45857)、タバコ(Gene
bank accession AF14053)、Synechocystis P.C.C.6803
(Genebank accession U35144)等由来の遺伝子が知られ
ている。このような公知の遺伝子(塩基配列が公知)は、
目的の遺伝子を持つ生物のゲノムDNAまたはcDNAを鋳型
にして、その遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ
末端付近に相当する塩基配列およびカルボキシ末端付近
に相当する塩基配列をもとに作製したプライマーを用い
てPCRを行うことにより増幅しこれを単離することがで
きる。また、上記以外の光合成生物から、マグネシウム
ケラターゼＩサブユニットタンパク質をコードする遺伝
子を取得することもできる。まず、目的とする光合成生
物からmRNAを調製し、該mRNAを鋳型として逆転写酵素を
用いてcDNAを合成し、これをZAPIIなどのファージベクタ
ーまたはpUCなどのプラスミドベクターに組み込んでcDN
Aライブラリーを作製する。このcDNAライブラリーを鋳型
にして、上記のような公知の遺伝子との間で良好に保存
された塩基配列に基づき設計し合成されたプライマーを
用いてPCRを行うことによって、マグネシウムケラター
ゼのIサブユニットタンパク質の遺伝子の少なくとも一
部を含むDNAを増幅することができる。このDNAをプロー
ブにしてcDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性ク
ローンを選抜する。選抜したクローンの有するDNAの塩基
配列を決定することによって、目的とするマグネシウム
ケラターゼのＩサブユニットタンパク質の遺伝子である
ことを確認することができる。 また、マグネシウムケラターゼのＤサブユニットタンパ
ク質をコードする遺伝子として、光合成細菌Rhodobacte
r sphaerides (Genebank accession AJ001690)、光合成
細菌Rhodobacter capsulatus (Genebank accession Z11
165)、エンドウ(Genebank accession AF014399)、タバ
コ(Genebank accession Y10022)、Synechocystis P.C.
C.6803(Genebank accession X96599)等由来の遺伝子が
知られている。マグネシウムケラターゼDサブユニットタ
ンパク質をコードする遺伝子は、前記のマグネシウムケ
ラターゼＩサブユニットタンパク質をコードする遺伝子
を取得する方法と同様の方法で取得することができる。
これらの3つのサブユニットタンパク質からなるマグネ
シウムケラターゼの活性の検出は、例えば、Gibson, L.
C.D. et al., Proc. Acad. Sci. USA, 92; p1941(1995)
等に記載の方法に準じて実施することができる。フェロ
ケラターゼをコードする遺伝子は前述の方法で取得する
ことができる。フェロケラターゼの活性の検出は、例え
ば、Porra, R.J., Anal. Biochem., 68;p289(1975)等に
記載の方法に準じて実施することができる。The gene encoding the above protein is
For example, it can be obtained as follows. Magnesium keratase has the ability to coordinate magnesium ions to protoporphyrin IX to generate magnesium porphyrin IX, and is composed of protoporphyrin IX binding subunit protein, I subunit protein and D subunit protein. To express magnesium keratase in plants, genes encoding these three subunit proteins are obtained. The gene encoding the protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase can be obtained by the above-described method. As a gene encoding the I subunit protein of magnesium keratase, a photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaerides (Genebank accession A
F017642), photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus (Geneba
nk accession Z11165), Arabidopsis (Genebank acce
ssion D49426), barley (Genebank accession U2654)
5), soybean (Genebank accession D45857), tobacco (Gene
bank accession AF14053), Synechocystis PCC6803
(Genebank accession U35144) and the like are known. Such a known gene (having a known base sequence)
Using a genomic DNA or cDNA of the organism having the gene of interest as a template, a primer prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminus and the nucleotide sequence near the carboxy terminus of the protein encoded by that gene is used. Amplification and isolation can be performed by performing PCR. In addition, a gene encoding a magnesium keratase I subunit protein can be obtained from a photosynthetic organism other than those described above. First, mRNA is prepared from the desired photosynthetic organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template using reverse transcriptase, and this is incorporated into a phage vector such as ZAPII or a plasmid vector such as pUC to obtain cDN.
Create A library. Using this cDNA library as a template, PCR is performed using primers designed and synthesized based on the base sequence well-conserved between the above-mentioned known genes, and the I-subunit of magnesium keratase is obtained. DNA containing at least a part of the gene of the unit protein can be amplified. Using this DNA as a probe, a cDNA library is screened to select positive clones. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the selected clone, it can be confirmed that the gene is the gene for the target I subunit protein of magnesium keratase. In addition, a gene encoding the D subunit protein of magnesium keratase is used as a photosynthetic bacterium Rhodobacte.
r sphaerides (Genebank accession AJ001690), photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus (Genebank accession Z11
165), pea (Genebank accession AF014399), tobacco (Genebank accession Y10022), Synechocystis PC
Genes derived from C.6803 (Genebank accession X96599) and the like are known. The gene encoding the magnesium keratase D subunit protein can be obtained by the same method as the method for obtaining the gene encoding the magnesium keratase I subunit protein.
Detection of the activity of magnesium keratase consisting of these three subunit proteins is described, for example, in Gibson, L.
CD et al., Proc.Acad.Sci. USA, 92; p1941 (1995)
And the like. The gene encoding ferrochelatase can be obtained by the method described above. The detection of the activity of ferrochelatase can be carried out, for example, according to the method described in Porra, RJ, Anal. Biochem., 68; p289 (1975) and the like.

【００２４】本発明植物２は、例えば、上記ような「Ｐ
ＰＯ活性を実質的に有する」タンパク質をコードする遺
伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、上述の(2-
3)、(2-4)および(2-5)の性質を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含
む方法により作製することができる。具体的には例え
ば、「ＰＰＯ活性を実質的に有する」タンパク質をコー
ドする遺伝子と、(2-3)、(2-4)および(2-5)の性質を有
するタンパク質をコードする遺伝子とを同時に植物細胞
へ導入し、得られた細胞からこれらの遺伝子を発現する
本発明植物２を作出してもよいし、片方の遺伝子を導入
した植物細胞にもう片方の遺伝子を導入し、得られた細
胞からこれらの遺伝子を発現する本発明植物２を作出し
てもよい。また、「ＰＰＯ活性を実質的に有する」タン
パク質をコードする遺伝子、および、(2-3)、(2-4)およ
び(2-5)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子
を、それぞれ単独で植物細胞に導入して各々の遺伝子を
発現する植物を作出し、得られた植物を交配することに
より、両方の遺伝子を発現する本発明植物２を作製して
もよい。さらに、上述の(1)および(2)の特性を有するＰ
ＰＯ活性を有する植物細胞に、(2-3)、(2-4)および(2-
5)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入
し、得られた細胞から該遺伝子を発現する本発明植物２
を作出してもよく、また、(2-3)、(2-4)および(2-5)の
性質を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入され
該遺伝子を発現する植物細胞に、「ＰＰＯ活性を実質的
に有する」タンパク質をコードする遺伝子を導入し、得
られた細胞からこれらの遺伝子を発現する本発明植物２
を作出してもよい。尚、いずれの場合も、「ＰＰＯ活性
を実質的に有する」タンパク質をコードする２種類以上
の遺伝子、または、(2-3)、(2-4)および(2-5)の性質を
有するタンパク質をコードする２種類以上の遺伝子を植
物細胞に導入してもよい。The plant 2 of the present invention is, for example,
Introducing a gene encoding a protein having substantially PO activity into plant cells and expressing the gene;
3) a step of introducing a gene encoding a protein having the properties of (2-4) and (2-5) into a plant cell and expressing the gene in the plant cell. Specifically, for example, a gene encoding a protein “substantially having PPO activity” and a gene encoding a protein having the properties of (2-3), (2-4) and (2-5) At the same time, the plant 2 of the present invention which expresses these genes may be produced from the obtained cells by introducing the gene into the plant cells, or the other gene may be introduced into the plant cells into which one gene has been introduced. The plant 2 of the present invention that expresses these genes may be produced from cells. Further, a gene encoding a protein having “substantially having PPO activity” and a gene encoding a protein having the properties of (2-3), (2-4) and (2-5) are each independently used. Plants expressing the respective genes may be produced by introducing them into plant cells, and the resulting plants may be crossed to produce the plant 2 of the present invention which expresses both genes. Furthermore, P having the above-mentioned characteristics (1) and (2)
(2-3), (2-4) and (2-
5) a plant of the present invention which introduces a gene encoding a protein having the property of 5) and expresses the gene from the obtained cells;
And a gene encoding a protein having the properties of (2-3), (2-4) and (2-5) is introduced into a plant cell expressing the gene. The present invention, which comprises introducing a gene encoding a protein having "substantially having" and expressing these genes from the obtained cells.
May be created. In each case, two or more types of genes encoding proteins having “substantially have PPO activity” or proteins having the properties of (2-3), (2-4) and (2-5) May be introduced into a plant cell.

【００２５】本発明植物３は、下記(1)、(2)および(3)
の特性を有するＰＰＯ活性を有する植物であって、 (1)植物の天然のＰＰＯ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のＰＰＯ活性を阻害する量の除草剤に対
する耐性を植物に付与し得る。 (3)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たないタンパク質により担われる。かつ、下記(3
-4)、(3-5)および(3-6)の性質を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現する植
物である。 (3-4)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合す
る。 (3-5)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持
つ。 (3-6)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない。 ここで、「プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合
する」とは、前述のごとく、例えば、酵素と基質、また
は、酵素と阻害剤もしくは活性調節因子との間の酵素化
学的結合、受容体とリガンドとの間の受容体化学的結合
等において示されるような親和性と特異性に基いて、当
該タンパク質がプロトポルフィリノーゲンIXに結合する
ことを意味する。「コプロポルフィリノーゲンIIIに対
する変性能を持つ」とは、コプロポルフィリノーゲンII
Iに対して酵素化学的な反応性を有することを意味し、
例えば、コプロポルフィリノーゲンIIIを、その化学構
造式とは異なる化学構造式で示される物質に変換する酵
素化学的反応を触媒する能力を実質的に持つ場合をあげ
ることができる。具体的には例えば、コプロポルフィリ
ノーゲンIIIをプロトポルフィリノーゲンIXに変換する
能力(コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ活性)
をあげることができ、該変換能力は、例えば、Yoshinag
a, T.,Sano,S., J. Biol. Chem., 255; p4722(1980)等
に記載の方法に準じて測定することができる。また、
「コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を実質
的に持たない」とは、コプロポルフィリノーゲンIIIに
対する酵素化学的な反応性が実質的に無いことを意味す
る。「免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない」とは、前述のとおり、免疫グロブ
リンの可変領域に特有の立体構造を形成しないことを意
味する。本発明植物３における上記(1)、(2)および(3)
の特性を有するＰＰＯ活性は、例えば、大腸菌Esherich
ia coli (Genebank accession X68660)、枯草菌Bacillu
s subtilis (Genebank accession M97208)、Haemophilu
s influnzae (Genebankaccession L42023)、マウス(Gen
ebank accession D45185)、ヒト(Genebank accession D
38537)、シロイヌナズナ(Genebank accession D83139)
またはタバコ(Genebank accession Y13465, Y13466)等
由来の野生型ＰＰＯ遺伝子や、US5939602やWO9704089等
に記載される変異型ＰＰＯ遺伝子などを植物の細胞で発
現させることにより、付与することができる。本発明植
物３において、その遺伝子が発現することにより産生さ
れる上記(3-4)、(3-5)および(3-6)の性質を有するタン
パク質としては、天然に存在するタンパク質であって
も、天然のタンパク質にアミノ酸置換、付加、欠失等が
導入されてなるタンパク質であっても、ランダムなアミ
ノ酸配列を有する人為的に作出されたタンパク質の中か
らプロトポルフィリノーゲンIXとの結合性を指標に選抜
されたタンパク質であってもよい。このようなタンパク
質としては、具体的には、コプロポルフィリノーゲンII
Iオキシダーゼ、および、コプロポルフィリノーゲンIII
オキシダーゼの改変タンパク質であってコプロポルフィ
リノーゲンIIIを酸化してプロトポルフィリノーゲンIX
を生成する能力を持つタンパク質などがあげられる。コ
プロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼをコードする
遺伝子は、例えば、前述の方法で取得することができ
る。The plant 3 of the present invention comprises the following (1), (2) and (3)
(1) substantially different from the natural PPO activity of the plant. (2) It can confer resistance to plants on amounts of herbicides that inhibit the plant's natural PPO activity. (3) It is carried by a protein having substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen IX. And the following (3
-4), a plant into which a gene encoding a protein having the properties of (3-5) and (3-6) has been introduced and which expresses the gene. (3-4) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (3-5) It has a strange performance to coproporphyrinogen IX. (3-6) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. Here, the term "specifically binds to protoporphyrinogen IX" refers to, for example, an enzyme-substrate, or an enzyme-chemical bond between an enzyme and an inhibitor or an activity regulator, a receptor, as described above. Means that the protein binds to protoporphyrinogen IX on the basis of affinity and specificity as shown in receptor chemical binding between the protein and the ligand. `` It has an inferior ability to coproporphyrinogen III '' means that coproporphyrinogen II
Means enzymatic chemical reactivity to I,
For example, there may be mentioned a case where coproporphyrinogen III substantially has an ability to catalyze an enzymatic chemical reaction to convert a substance represented by a chemical structural formula different from the chemical structural formula. Specifically, for example, the ability to convert coproporphyrinogen III to protoporphyrinogen IX (coproporphyrinogen III oxidase activity)
The conversion ability is, for example, Yoshinag
a, T., Sano, S., J. Biol. Chem., 255; p4722 (1980) and the like. Also,
"Substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen III" means that there is substantially no enzymatic chemical reactivity to coproporphyrinogen III. The expression "substantially free of the framework region of the immunoglobulin variable region" means that a three-dimensional structure specific to the immunoglobulin variable region is not formed, as described above. The above (1), (2) and (3) in the plant 3 of the present invention.
PPO activity having the properties of
ia coli (Genebank accession X68660), Bacillus subtilis Bacillu
s subtilis (Genebank accession M97208), Haemophilu
s influnzae (Genebankaccession L42023), mouse (Gen
ebank accession D45185), human (Genebank accession D
38537), Arabidopsis (Genebank accession D83139)
Alternatively, it can be provided by expressing a wild-type PPO gene derived from tobacco (Genebank accession Y13465, Y13466) or the like, or a mutant PPO gene described in US5939602 or WO9704089 or the like in plant cells. In the plant 3 of the present invention, the protein having the above-mentioned properties (3-4), (3-5) and (3-6) produced by expressing the gene is a naturally occurring protein. Also, even if it is a protein in which amino acid substitutions, additions, deletions, etc. are introduced into a natural protein, binding to protoporphyrinogen IX from among artificially created proteins having a random amino acid sequence May be a protein selected using as an index. Specific examples of such proteins include coproporphyrinogen II
I oxidase and coproporphyrinogen III
A modified oxidase protein that oxidizes coproporphyrinogen III to produce protoporphyrinogen IX
And proteins having the ability to produce. The gene encoding coproporphyrinogen III oxidase can be obtained, for example, by the method described above.

【００２６】本発明植物３は、例えば、上記ような「Ｐ
ＰＯ活性を実質的に有し」「コプロポルフィリノーゲン
IIIに対する変性能を実質的に持たない」タンパク質を
コードする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程
と、上述の(3-4)、(3-5)および(3-6)の性質を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入し発現さ
せる工程とを含む方法により作製することができる。例
えば、「ＰＰＯ活性を実質的に有し」「コプロポルフィ
リノーゲンIIIに対する変性能を実質的に持たない」タ
ンパク質をコードする遺伝子と、(3-4)、(3-5)および(3
-6)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子とを
同時に植物細胞へ導入し、得られた細胞からこれらの遺
伝子を発現する本発明植物３を作出してもよいし、片方
の遺伝子を導入した植物細胞にもう片方の遺伝子を導入
し、得られた細胞からこれらの遺伝子を発現する本発明
植物３を作出してもよい。また、「ＰＰＯ活性を実質的
に有し」「コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性
能を実質的に持たない」タンパク質をコードする遺伝
子、および、(3-4)、(3-5)および(3-6)の性質を有する
タンパク質をコードする遺伝子を、それぞれ単独で植物
細胞に導入して各々の遺伝子を発現する植物を作出し、
得られた植物を交配することにより、両方の遺伝子を発
現する本発明植物３を作製してもよい。さらに、上記の
(1)、(2)および(3)の特性を有するＰＰＯ活性を有する
植物細胞に、(3-4)、(3-5)および(3-6)の性質を有する
タンパク質をコードする遺伝子を導入し、得られた細胞
から該遺伝子を発現する本発明植物３を作出してもよ
く、また、(3-4)、(3-5)および(3-6)の性質を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子が導入され該遺伝子を発現
する植物細胞に、「ＰＰＯ活性を実質的に有し」「コプ
ロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を実質的に持
たない」タンパク質をコードする遺伝子を導入し、得ら
れた細胞からこれらの遺伝子を発現する本発明植物３を
作出してもよい。尚、いずれの場合も、「ＰＰＯ活性を
実質的に有し」「コプロポルフィリノーゲンIIIに対す
る変性能を実質的に持たない」タンパク質をコードする
２種類以上の遺伝子、または、(3-4)、(3-5)および(3-
6)の性質を有するタンパク質をコードする２種類以上の
遺伝子を植物細胞に導入してもよい。The plant 3 of the present invention is, for example,
"Has substantially PO activity" and "coproporphyrinogen
A step of introducing and expressing a gene encoding a protein `` having substantially no metamorphosis to III '' into plant cells, and having the above-mentioned properties (3-4), (3-5) and (3-6) Introducing a gene encoding a protein into a plant cell and expressing the gene in a plant cell. For example, a gene encoding a protein “substantially having PPO activity” and “substantially not having the ability to alter coproporphyrinogen III” and (3-4), (3-5) and (3
The gene encoding the protein having the property of -6) may be simultaneously introduced into a plant cell, and the plant 3 of the present invention which expresses these genes may be produced from the obtained cells, or one of the genes may be introduced. The other gene may be introduced into a plant cell, and the plant 3 of the present invention expressing these genes may be produced from the obtained cell. Also, a gene encoding a protein “substantially having PPO activity” and “substantially having no ability to alter coproporphyrinogen III”, and (3-4), (3-5) and (3 -6) to produce a plant that expresses each gene by introducing a gene encoding a protein having the properties described above into a plant cell alone,
By crossing the obtained plants, the plant 3 of the present invention which expresses both genes may be produced. In addition,
Genes encoding proteins having the properties of (3-4), (3-5) and (3-6) are added to plant cells having PPO activity having the properties of (1), (2) and (3). The plant 3 of the present invention which expresses the gene may be produced from the cells obtained by the introduction, and may encode a protein having the properties of (3-4), (3-5) and (3-6). A gene encoding a protein having "substantially having PPO activity" and "having substantially no ability to alter coproporphyrinogen III" is introduced into a plant cell into which a gene to be introduced is expressed. The plant 3 of the present invention expressing these genes may be produced from the obtained cells. In each case, two or more kinds of genes encoding proteins having “substantially have PPO activity” and “have substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen III”, or (3-4) , (3-5) and (3-
Two or more genes encoding proteins having the property of 6) may be introduced into plant cells.

【００２７】本発明植物１〜３を作製するに際し、遺伝
子を植物の細胞に導入する方法としては、アグロバクテ
リウム感染方法(特公平2-58917および特開昭60-7008
0)、プロトプラストへのエレクトロポレーション方法
(特開昭60-251887および特開平5-68575)、またはパーテ
ィクルガン方法(特表平5-508316および特開昭63-25852
5)などの公知の手段を用いることができる。細胞に導入
する遺伝子は、細胞生育阻害剤耐性を該細胞に付与し得
る遺伝子などの選抜マーカー遺伝子を有するベクターに
組み込んでおくとよい。目的とする遺伝子を植物の細胞
で発現させるには、相同組換え[Fraley,R.T. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; p4803 (1983)]によっ
て該遺伝子を植物の染色体に導入し該遺伝子を発現する
細胞を選抜してもよいし、該遺伝子をあらかじめ、植物
細胞で機能可能なプロモーターおよび植物細胞で機能可
能なターミネーターと機能可能な形で結合させて、これ
を細胞に導入してもよい。ここで、「機能可能な形で」
とは、目的とする遺伝子が、導入される植物の細胞にお
いて前記プロモーターおよびターミネーターの制御下に
発現するように、これらのプロモーターおよびターミネ
ーターと結合された状態にあることを意味する。植物細
胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、ノパリ
ン合成酵素遺伝子プロモーター、オクトピン合成酵素遺
伝子プロモーター等のT-DNA由来の構成型プロモータ
ー、カリフラワーモザイクウィルス由来の19Sプロモー
ターもしくは35Sプロモーター等の植物ウィルス由来の
プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺
伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモー
ター、Pathogenesis-related protein遺伝子プロモータ
ー等の誘導型プロモーターなどを挙げることができる。
さらに、これらに限定されない他の植物プロモーターを
用いてもよい。また、植物細胞で機能可能なターミネー
ターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子ターミ
ネーターなどT-DNA由来のターミネーター、ニンニクウ
ィルスGV1,GV2のターミネーターなどの植物ウィルス由
来のターミネーターなどを挙げることができる。さら
に、これらに限定されない他の植物ターミネーターを用
いるてもよい。In producing the plants 1 to 3 of the present invention, the method for introducing a gene into plant cells includes the Agrobacterium infection method (Japanese Patent Publication No. 2-58917 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-7008).
0), electroporation method to protoplasts
(JP-A-60-251887 and JP-A-5-68575), or a particle gun method (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 5-508316 and JP-A-63-25852).
Known means such as 5) can be used. The gene to be introduced into the cell is preferably incorporated into a vector having a selectable marker gene such as a gene capable of imparting cell growth inhibitor resistance to the cell. To express the gene of interest in plant cells, homologous recombination [Fraley, RT et al., P.
USA, 80; p4803 (1983)] to select cells expressing the gene by introducing the gene into the chromosome of the plant, or to allow the gene to function in plant cells in advance. It may be operably linked to a possible promoter and a terminator operable in a plant cell and introduced into the cell. Here, "in a functional way"
The expression means that the gene of interest is in a state linked to these promoters and terminators so that the gene is expressed under the control of the promoters and terminators in the cells of the plant to be introduced. Examples of a promoter operable in a plant cell include, for example, a nopaline synthase gene promoter, a constitutive promoter derived from T-DNA such as an octopine synthase gene promoter, a plant virus such as a cauliflower mosaic virus-derived 19S promoter or 35S promoter. Inducible promoters such as a promoter, a phenylalanine ammonia lyase gene promoter, a chalcone synthase gene promoter, and a Pathogenesis-related protein gene promoter can be exemplified.
Further, other plant promoters not limited to these may be used. Examples of the terminator that can function in a plant cell include a T-DNA-derived terminator such as a nopaline synthase gene terminator, and a plant virus-derived terminator such as a garlic virus GV1 or GV2 terminator. Further, other plant terminators not limited to these may be used.

【００２８】かかる遺伝子を導入する細胞としては、植
物組織の細胞、植物個体の細胞、培養細胞、種子などを
用いることができる。また、かかる遺伝子を導入する植
物種としては、例えば、タバコ、ワタ、ナタネ、テンサ
イ、シロイヌナズナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、バレ
イショ、アルファルファ、レタス、バナナ、ダイズ、エ
ンドウ、その他のマメ類、マツ、ポプラ、リンゴ、ブド
ウ、オレンジ、レモン、その他の柑橘類、アーモンド、
クルミ、その他のナッツ類等の双子葉植物、トウモロコ
シ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ソ
ルガム、オートムギ、サトウキビ、芝類等の単子葉植物
をあげることができる。導入された遺伝子を発現する形
質転換植物細胞は、該遺伝子が導入された細胞を、該遺
伝子に座上・連結させた選抜マーカー遺伝子に対応する
選抜用培地、例えば細胞生育阻害剤を含む培地等で培養
し、該培地において増殖可能なクローンを単離すること
によって取得することができる。また、前記形質転換植
物細胞は、遺伝子が導入された細胞を、耐性付与対象の
除草剤またはその有効成分を含む培地で培養し増殖可能
なクローンを単離することによっても選抜することもで
きる。このようにして得られた形質転換植物細胞から、
例えば、植物遺伝子操作マニュアル：トランスジェニッ
ク植物の作り方（内宮著、講談社サイエンティフィック
1990年）、27-55頁などに記載されている植物細胞培養
方法により植物体を再生させることによって、導入され
た遺伝子を発現する植物を得ることができる。より具体
的には、例えば、モデル植物の実験プロトコール イネ
・シロイヌナズナ編（島本功、岡田清孝監修、秀潤社19
96年）、第4章に記載の方法によって、導入された遺伝
子を発現するイネやシロイヌナズナを得ることができ
る。また、特開平3-291501に記載されている方法で、パ
ーティクルガンを用いて遺伝子をダイズ不定胚に導入
し、導入された遺伝子を発現するダイズを得ることがで
きる。同様に、Fromm,M.E.,et al. Bio/Technology, 8;
p838 (1990)に記載されている方法に準じて、パーティ
クルガンを用いて遺伝子をトウモロコシ不定胚に導入
し、導入された遺伝子を発現するトウモロコシを得るこ
とができ、宅見ら著、育種学会雑誌、1995年、第44巻、
別冊1号、57頁に記載されている通常の方法に準じて、
パーティクルガンを用いて無菌培養したコムギ未熟胚盤
に遺伝子を導入し、導入された遺伝子を発現するコムギ
を得ることができる。同様に、萩尾ら著、育種学会雑
誌、1995年、第44巻、別冊1号、67頁に記載されている
通常の方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培
養したオオムギ未熟胚盤に遺伝子を導入し、導入された
遺伝子を発現するオオムギを得ることができる。As a cell into which such a gene is introduced, plant tissue cells, plant individual cells, cultured cells, seeds and the like can be used. Examples of plant species into which such genes are introduced include, for example, tobacco, cotton, rape, sugar beet, Arabidopsis, canola, flax, sunflower, potato, alfalfa, lettuce, banana, soybean, pea, other legumes, pine, poplar , Apples, grapes, oranges, lemons, other citrus, almonds,
Examples include dicotyledonous plants such as walnuts and other nuts, and monocotyledonous plants such as corn, rice, wheat, barley, rye, oat, sorghum, oats, sugarcane, and lawn. A transformed plant cell that expresses the introduced gene may be a selection medium corresponding to a selection marker gene linked to the gene-transfected cell, for example, a medium containing a cell growth inhibitor. And a clone capable of growing in the medium is isolated. The transformed plant cells can also be selected by culturing the cells into which the gene has been introduced in a medium containing a herbicide to which resistance is to be imparted or an active ingredient thereof, and isolating a clone that can grow. From the transformed plant cells thus obtained,
For example, Plant Gene Manipulation Manual: How to Make Transgenic Plants (by Uchimiya, Kodansha Scientific
1990), pp. 27-55, and the like, and a plant expressing the introduced gene can be obtained by regenerating the plant by the plant cell culture method. More specifically, for example, an experimental protocol for a model plant, edited by Rice and Arabidopsis (Isao Shimamoto, supervised by Kiyotaka Okada, Shujunsha 19)
1996), the rice and Arabidopsis thaliana expressing the introduced gene can be obtained by the method described in Chapter 4. Further, a gene can be introduced into a soybean somatic embryo using a particle gun by a method described in JP-A-3-291501, and a soybean expressing the introduced gene can be obtained. Similarly, Fromm, ME, et al. Bio / Technology, 8;
According to the method described in p838 (1990), the gene was introduced into a maize somatic embryo using a particle gun, and corn expressing the introduced gene could be obtained. 1995, Volume 44,
Separate volume 1, according to the usual method described on page 57,
The gene can be introduced into the immature scutellum of a wheat that has been aseptically cultured using a particle gun, and a wheat expressing the introduced gene can be obtained. Similarly, according to the usual method described by Hagio et al., Journal of the Japanese Society of Breeding, 1995, Vol. 44, Separate Volume 1, page 67, the gene was added to the barley immature scutellum aseptically cultured using a particle gun. And a barley expressing the introduced gene can be obtained.

【００２９】本発明植物のＰＰＯ阻害型除草剤に対する
耐性は、例えば、該植物の栽培域にＰＰＯ阻害型除草剤
を散布し、該植物の生育度を測定することにより確認す
ることができる。より定量的に確認するには、例えば、
該植物の葉片を様々な濃度のＰＰＯ阻害型除草剤を含む
水溶液中に浸すか、または、該植物の葉片にＰＰＯ阻害
型除草剤水溶液を噴霧し寒天培地上で明所室温で放置
し、数日後、該葉片からMacknney, G., J. Bol. Chem.,
140; p315(1941)に記載の方法に準じてクロロフィルを
抽出してクロロフィル含量を測定するとよい。The resistance of the plant of the present invention to a PPO-inhibiting herbicide can be confirmed, for example, by spraying the PPO-inhibiting herbicide on the cultivation area of the plant and measuring the growth of the plant. To check more quantitatively, for example,
Leaf pieces of the plant are immersed in an aqueous solution containing various concentrations of PPO-inhibiting herbicide, or the leaf pieces of the plant are sprayed with an aqueous solution of PPO-inhibiting herbicide and allowed to stand on an agar medium at room temperature in a light place. Days later, Macknney, G., J. Bol. Chem.,
140; p315 (1941), chlorophyll may be extracted and the chlorophyll content measured according to the method described in p315 (1941).

【００３０】本発明によって、 ＰＰＯ阻害型除草剤に
対して耐性を示す植物を作製することができる。即ち、
本発明によって目的の栽培植物にＰＰＯ阻害型除草剤に
対する耐性を付与し、該植物を栽培してその栽培域に前
記のＰＰＯ阻害型除草剤を散布することにより、雑草を
より効率よく取り除くことができ、該栽培植物の収量の
向上、高品質化、雑草防除作業の省力化などを図ること
が可能となる。According to the present invention, it is possible to produce a plant that is resistant to a PPO-inhibiting herbicide. That is,
According to the present invention, a target cultivated plant is given resistance to a PPO-inhibiting herbicide, and the weed is more efficiently removed by cultivating the plant and spraying the PPO-inhibiting herbicide on its cultivation area. It is possible to improve the yield of the cultivated plant, improve the quality, save labor for weed control, and the like.

【００３１】[0031]

【実施例】以下、実施例および参考例により本発明をよ
り詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples and reference examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００３２】参考例１ タバコマグネシウムケラターゼ
のプロトポルフィリンIX結合サブユニットの改変タンパ
ク質をコードする遺伝子が導入されたタバコおよび除草
剤耐性変異を有するシロイヌナズナＰＰＯ遺伝子が導入
されたタバコの作出 （１）タバコマグネシウムケラターゼのプロトポルフィ
リンIX結合サブユニットの改変タンパク質をコードする
遺伝子の取得 タバコ（Nicotiana tabacum cv. SR1）の葉部組織か
ら、RNeasy Plant Kit(QIAGEN社製)を用いて付属のマニ
ュアルにしたがって操作を行ない、全 RNA を調製し
た。さらに、RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1（宝酒造社
製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行ない、
葉緑体移行シグナルを欠失したタバコマグネシウムケラ
ターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタンパ
ク質(以下、本改変タバコケラターゼサブユニットと記
す。)をコードする遺伝子を含むDNA断片を取得した。ま
ず、プライマーとして前記キットに含まれるOligo dT-A
daptor Primerを用い、タバコ全RNAを鋳型として、前記
キットに含まれる逆転写酵素を添加して1st strand cDN
Aを合成した。続いて、該1st strand cDNAを鋳型とし
て、前記キットに含まれるLA Taq polymeraseを用いてP
CRを行い、本改変タバコケラターゼサブユニットをコー
ドする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。ここでＰＣＲ
のプライマーとしては、配列番号１で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番
号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いた。該オリゴヌクレオチドはDNA合成装
置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチ
ド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステムズ
社：OPCカートリッジ）で精製した。また、ＰＣＲは、9
4℃にて2分間の保温を1回行い、続いて、94℃にて30秒
間、次いで50℃にて30秒間、さらに72℃にて7分間の保
温を１サイクルとしてこれを30サイクル実施した。前記
のＰＣＲ反応後、TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を
用いて付属のマニュアルに従って操作を行ない、該ＰＣ
Ｒ反応で増幅されたDNA断片をpCR2.1プラスミドにクロ
ーニングした。得られたプラスミドを制限酵素KpnIで消
化した後、アガロースゲル電気泳動で分析し、8.0kbのD
NA断片が検出されたプラスミドをpTCHLHと名付けた。該
プラスミドは、本改変タバコケラターゼサブユニットを
コードする遺伝子がlacプロモーターの制御下で発現可
能な方向に挿入された構造を有する。さらに、このプラ
スミドpTCHLHを制限酵素KpnIで消化した後、自己環化さ
せ、約60塩基からなるDNA断片がプラスミドpTCHLHから
除去された構造を有するプラスミドpTCHLH1(図１)を得
た。Reference Example 1 Tobacco into which a gene encoding a modified protein of the protoporphyrin IX binding subunit of tobacco magnesium keratase was introduced and tobacco into which an Arabidopsis thaliana PPO gene having a herbicide-resistant mutation was introduced (1) Tobacco Acquisition of gene encoding modified protein of protoporphyrin IX binding subunit of magnesium keratase Manipulation from leaf tissue of tobacco (Nicotiana tabacum cv. SR1) using RNeasy Plant Kit (QIAGEN) according to the attached manual Was performed to prepare total RNA. In addition, perform the operation using RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1 (Takara Shuzo) according to the attached manual,
A DNA fragment containing a gene encoding a protoporphyrin IX binding subunit protein of tobacco magnesium keratase lacking a chloroplast translocation signal (hereinafter, referred to as the present modified tobacco keratase subunit) was obtained. First, Oligo dT-A included in the kit as a primer
Using daptor Primer, using the tobacco total RNA as a template, adding the reverse transcriptase included in the kit, 1st strand cDN
A was synthesized. Subsequently, using the 1st strand cDNA as a template, PTA was performed using LA Taq polymerase included in the kit.
CR was performed to amplify a DNA fragment containing the gene encoding the modified tobacco keratase subunit. Where PCR
As the primers, an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 were used. The oligonucleotide was prepared using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA /
It was synthesized using an RNA Synthesizer, and purified using an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). In addition, PCR
Insulation was performed once at 2 minutes at 4 ° C., followed by 30 cycles at 94 ° C. for 30 seconds, then at 50 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 7 minutes. . After the PCR reaction described above, the operation was performed using a TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached manual, and the PC
The DNA fragment amplified by the R reaction was cloned into the pCR2.1 plasmid. The resulting plasmid was digested with the restriction enzyme KpnI, and analyzed by agarose gel electrophoresis.
The plasmid in which the NA fragment was detected was named pTCHLH. The plasmid has a structure in which a gene encoding the modified tobacco keratase subunit is inserted in a direction that allows expression under the control of a lac promoter. Furthermore, the plasmid pTCHLH was digested with the restriction enzyme KpnI and then self-cyclized to obtain a plasmid pTCHLH1 (FIG. 1) having a structure in which a DNA fragment consisting of about 60 bases was removed from the plasmid pTCHLH.

【００３３】（２）本改変タバコケラターゼサブユニッ
トをコードする遺伝子のタバコへの導入 本改変タバコケラターゼサブユニットをコードする遺伝
子をアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラ
スミドを構築した。まず、参考例１(1)で作製されたプ
ラスミドpTCHLH1を制限酵素KpnIとSalIとで消化するこ
とにより、本改変タバコケラターゼサブユニットをコー
ドする遺伝子を含むDNA断片を調製した。一方、バイナ
リーベクターpBI121(Clontech社製)を制限酵素SmaIで消
化し、そこへKpnIリンカー(宝酒造製)を挿入することに
より、pBI121のSmaI認識部位が除去されKpnI認識部位が
付加されたプラスミドpBI121Kを作製した。該プラスミ
ドpBI121Kを制限酵素SacIで消化した後、DNA polymeras
e Iを用いて2本鎖DNAのギャップにヌクレオチドを付加
して該DNAの末端を平滑化した。次に仔牛小腸由来のAlk
aline phosphataseで該DNAの5'末端を脱りん酸化し、り
ん酸化SalIリンカー(宝酒造製4680P)を挿入して環化さ
せ、プラスミドpBI121KSを構築した。該バイナリーベク
ターpBI121KSを制限酵素KpnIとSalIとで消化することに
よりβ-glucuronidase遺伝子を除去し、これに替えて、
前記の本改変タバコケラターゼサブユニットをコードす
る遺伝子を含むDNA断片を挿入し、該遺伝子が35Sプロモ
ーターの下流に結合されてなるプラスミドpBITCHLH（図
２）を作製した。また、バイナリーベクターpBI121(Clo
ntech社製)を制限酵素BamHIとSacIで消化することによ
りβ-glucuronidase遺伝子を除去し、得られたDNA断片
の末端をT4DNA polymeraseを用いて平滑化した後、T4 D
NA ligaseを用いて自己環化させプラスミドpNO(図３)を
構築した。該プラスミドは遺伝子発現プラスミドのベク
ターコントロールとして用いた。前記プラスミドpBITCH
LHおよびpNOをそれぞれ、Agrobacterium tumefaciens L
BA4404（Clontech社製）に導入し、これらを300μg/ml
ストレプトマイシン、100μg/mlリファンピシン、25μg
/mlカナマイシンを含むＬＢ培地(0.5% Yeast extract,
1.0% Bacto tryptone, 0.5% NaCl)で培養して形質転換
体を選抜することによってpBITCHLHを持つアグロバクテ
リウム株およびpNOを持つアグロバクテリウム株を単離
した。次いで、植物遺伝子操作マニュアル(内宮博文
著、講談社サイエンティフィック、1992年)に記載され
ている方法に準じて、タバコへの遺伝子導入を行った。
プラスミドpBITCHLHを持つアグロバクテリウム株をLB培
地中で28℃にて終夜培養し、該培養液に無菌培養したタ
バコ(Nicotiana tabacum cv. SR1)の葉片を浸漬した。
該タバコ葉片を0.8%寒天、0.1mg/lナフタレン酢酸およ
び1.0mg/lベンジルアミノプリンを含むMurashige T. an
d Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15,p473に記載の
Murashige-Skoog培地(MS培地)上で室温にて2日間培養し
た。次に、該タバコ葉片を滅菌水で洗浄した後、0.8%寒
天、0.1mg/lナフタレン酢酸、1.0mg/lベンジルアミノプ
リン、および、500μg/mlセフォタキシムを含むMS培地
上で7日間培養した。次いで、該タバコ葉片を0.8%寒
天、0.1mg/lナフタレン酢酸、1.0mg/lベンジルアミノプ
リン、500μg/mlセフォタキシム、および、100μg/mlカ
ナマイシンを含むMS培地(以下、選抜用MS培地と記す。)
上に移植し培養した。該培養は、前記タバコ葉片を1ヶ
月後毎に新鮮な選抜用MS培地に移植しながら継続的に４
ヶ月間実施した。この間に、該タバコ葉片から出現した
茎葉分化したシュートを、0.8%寒天、300μg/mlセフォ
タキシム、および、50μg/mlカナマイシンを含むMS培地
に移植して発根させ再生個体を得た。該再生個体を0.8%
寒天、および、50μg/mlカナマイシンを含むMS培地に移
植して培養し、本改変タバコケラターゼサブユニットを
コードする遺伝子が導入されたタバコ個体を取得した。
また、同様にして、pNOを持つアグロバクテリウム株を
タバコの葉片に感染させ、該タバコ葉片から再生個体を
得て、タバコ個体（以下、コントロール組換えタバコと
記す。）を取得した。(2) Introduction of Gene Encoding the Modified Tobacco Keratase Subunit into Tobacco A plasmid for introducing the gene encoding the modified tobacco keratase subunit into plants by the Agrobacterium method was constructed. First, a DNA fragment containing a gene encoding the modified tobacco keratase subunit was prepared by digesting the plasmid pTCHLH1 prepared in Reference Example 1 (1) with restriction enzymes KpnI and SalI. On the other hand, by digesting the binary vector pBI121 (manufactured by Clontech) with the restriction enzyme SmaI and inserting a KpnI linker (manufactured by Takara Shuzo), the plasmid pBI121K to which the SmaI recognition site of pBI121 was removed and the KpnI recognition site was added was added. Produced. After digesting the plasmid pBI121K with the restriction enzyme SacI, the DNA polymeras
Using eI, nucleotides were added to the gaps in the double-stranded DNA to blunt the ends of the DNA. Next, Alk from calf small intestine
The 5 ′ end of the DNA was dephosphorylated with aline phosphatase, and a phosphorylated SalI linker (4680P, manufactured by Takara Shuzo) was inserted and cyclized to construct plasmid pBI121KS. The β-glucuronidase gene was removed by digesting the binary vector pBI121KS with restriction enzymes KpnI and SalI.
A DNA fragment containing the gene encoding the present modified tobacco keratase subunit was inserted, and a plasmid pBITCHLH (FIG. 2) in which the gene was linked downstream of the 35S promoter was prepared. The binary vector pBI121 (Clo
ntech) was digested with restriction enzymes BamHI and SacI to remove the β-glucuronidase gene, and the resulting DNA fragment was blunt-ended using T4 DNA polymerase.
Self-cyclization was performed using NA ligase to construct a plasmid pNO (FIG. 3). The plasmid was used as a vector control for the gene expression plasmid. The plasmid pBITCH
LH and pNO, respectively, Agrobacterium tumefaciens L
Introduced into BA4404 (manufactured by Clontech), and 300 µg / ml
Streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, 25 μg
/ ml kanamycin-containing LB medium (0.5% Yeast extract,
Agrobacterium strains having pBITCHLH and Agrobacterium strains having pNO were isolated by culturing in 1.0% Bacto tryptone, 0.5% NaCl) and selecting transformants. Next, the gene was introduced into tobacco according to the method described in a plant gene manipulation manual (Hirofumi Uchimiya, Kodansha Scientific, 1992).
An Agrobacterium strain having the plasmid pBITCHLH was cultured overnight in an LB medium at 28 ° C., and the aseptically cultured tobacco (Nicotiana tabacum cv. SR1) leaf pieces were immersed in the culture solution.
Murashige T. an containing 0.8% agar, 0.1 mg / l naphthalene acetic acid and 1.0 mg / l benzylaminopurine
d Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, p473
The cells were cultured on Murashige-Skoog medium (MS medium) at room temperature for 2 days. Next, the tobacco leaf pieces were washed with sterile water, and then cultured on an MS medium containing 0.8% agar, 0.1 mg / l naphthalene acetic acid, 1.0 mg / l benzylaminopurine, and 500 μg / ml cefotaxime for 7 days. Next, the tobacco leaf pieces were treated with an MS medium containing 0.8% agar, 0.1 mg / l naphthalene acetic acid, 1.0 mg / l benzylaminopurine, 500 μg / ml cefotaxime, and 100 μg / ml kanamycin (hereinafter referred to as a selection MS medium). )
The cells were transplanted and cultured. The cultivation was performed continuously while transplanting the tobacco leaf pieces into a fresh selection MS medium every one month.
Conducted for months. During this time, shoots differentiated in foliage emerged from the tobacco leaf pieces were transplanted to an MS medium containing 0.8% agar, 300 μg / ml cefotaxime, and 50 μg / ml kanamycin to root and obtain regenerated individuals. 0.8% of the regenerated individuals
The cells were transplanted and cultured on agar medium and MS medium containing 50 μg / ml kanamycin to obtain tobacco individuals into which the gene encoding the modified tobacco keratase subunit was introduced.
Similarly, an Agrobacterium strain having pNO was transmitted to tobacco leaf pieces, and a regenerated individual was obtained from the tobacco leaf pieces to obtain tobacco individuals (hereinafter referred to as control recombinant tobacco).

【００３４】（３）除草剤耐性変異を有するシロイヌナ
ズナＰＰＯ遺伝子の取得 Narita, S. et al., Gene 182; p169(1996)に記載の方
法で取得されたシロイヌナズナのＰＰＯ遺伝子を有する
プラスミドを、制限酵素NcoIで消化しDNA polymerase I
を用いて2本鎖DNAのギャップにヌクレオチドを付加して
該DNAの末端を平滑化した。次に仔牛小腸由来のAlkalin
e phosphataseで該DNAの5'末端を脱りん酸化し、りん酸
化BamHIリンカー(宝酒造製4810P)を挿入して環化させ、
プラスミドpAGE17Bを構築した。このプラスミドpAGE17B
をBamHIとSacIで消化してシロイヌナズナＰＰＯ遺伝子
を含む遺伝子断片を取得し、これを部位特異的変異導入
に用いられる市販のベクターpKF19k(宝酒造製)のBamHI
とSacIの間に挿入しプラスミドpKFATPを作製した。次
に、WO9534659に示されたシロイヌナズナＰＰＯタンパ
ク質におけるＰＰＯ阻害型除草剤に対する耐性変異であ
る220番目のアラニンをバリンに変化(A220V)させるため
のDNAの塩基置換(659番目のCをTに置換)を上記シロイヌ
ナズナＰＰＯ遺伝子に導入した。まず、配列番号３で示
される変異導入用のオリゴヌクレオチドプライマーを合
成した。該オリゴヌクレオチドプライマーはDNA合成装
置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチ
ド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステムズ
社：OPC カートリッジ）で精製し、T4 DNA kinaseを用
いて該オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端をりん酸
化した。市販の部位特異的変異導入キットMutan-Super
Express Km(宝酒造製)を用い添付のマニュアルにしたが
って、鋳型DNAとして上記のプラスミドpKFATPを10ng、
添付の選抜プライマー5pmol、上記のりん酸化した変異
導入用のオリゴヌクレオチドプライマー5pmol等を含む
反応液を調製しＰＣＲを行った。ＰＣＲは、94℃にて1
分間次いで55℃にて1分間さらに72℃で3分間の保温を1
サイクルとして30サイクル行った。得られた反応液をエ
タノール沈殿で精製した後5μlの滅菌蒸留水に溶解し、
そのうち2μlを用い添付のマニュアルにしたがって市販
の大腸菌コンピテントセルMV1184(宝酒造製)に導入し、
50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地(1% トリプト
ン、0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl、1% 寒天)にプレーテ
ィングした。37℃で培養した後得られたクローンを50μ
g/mlのカナマイシンを含むLB液体培地で培養しプラスミ
ドDNAを調製した。得られたプラスミドpKFATP1に含まれ
るシロイヌナズナＰＰＯ遺伝子の塩基配列を解析するこ
とによって目的の除草剤耐性変異A220Vが導入されてい
ることを確認した。(3) Obtaining Arabidopsis thaliana PPO Gene Having Herbicide-Resistant Mutation The plasmid having the Arabidopsis thaliana PPO gene obtained by the method described in Narita, S. et al., Gene 182; p169 (1996) is restricted. Digested with enzyme NcoI and DNA polymerase I
Was used to add nucleotides to the gaps in the double-stranded DNA to blunt the ends of the DNA. Next, Alkalin from calf small intestine
Dephosphorylate the 5 'end of the DNA with e phosphatase, insert a phosphorylated BamHI linker (Takara Shuzo 4810P) to cyclize,
Plasmid pAGE17B was constructed. This plasmid pAGE17B
Was digested with BamHI and SacI to obtain a gene fragment containing the Arabidopsis thaliana PPO gene, and the obtained fragment was BamHI of a commercially available vector pKF19k (Takara Shuzo) used for site-directed mutagenesis.
Plasmid pKFATP was prepared by inserting between SacI and SacI. Next, a base substitution of DNA to change the 220th alanine to a valine (A220V), which is a resistance mutation to a PPO-inhibiting herbicide in Arabidopsis thaliana PPO protein shown in WO9534659 (replace C at 659 with T) Was introduced into the Arabidopsis thaliana PPO gene. First, an oligonucleotide primer for introducing a mutation represented by SEQ ID NO: 3 was synthesized. The oligonucleotide primer is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA /
The oligonucleotide was synthesized using an RNA Synthesizer, purified using an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge), and the 5 ′ end of the oligonucleotide primer was phosphorylated using T4 DNA kinase. Commercial site-directed mutagenesis kit Mutan-Super
Using Express Km (Takara Shuzo) according to the attached manual, 10 ng of the above plasmid pKFATP as template DNA,
A reaction solution containing 5 pmol of the attached selection primer, 5 pmol of the above-mentioned phosphorylated oligonucleotide primer for mutagenesis and the like was prepared and subjected to PCR. PCR was performed at 94 ° C for 1
1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C for 3 minutes.
30 cycles were performed. The resulting reaction solution was purified by ethanol precipitation, and then dissolved in 5 μl of sterile distilled water.
Using 2 μl of them, introduced into commercially available E. coli competent cell MV1184 (Takara Shuzo) according to the attached manual,
The cells were plated on LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% agar) containing 50 μg / ml kanamycin. After culturing at 37 ° C, the clone obtained was
The cells were cultured in an LB liquid medium containing g / ml kanamycin to prepare plasmid DNA. By analyzing the nucleotide sequence of the Arabidopsis thaliana PPO gene contained in the obtained plasmid pKFATP1, it was confirmed that the target herbicide-resistant mutation A220V was introduced.

【００３５】（４）除草剤耐性変異を有するシロイヌナ
ズナＰＰＯ遺伝子のタバコへの導入 除草剤耐性変異を有するシロイヌナズナＰＰＯ遺伝子
[以下、シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子と記す。]
をアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラス
ミドを構築した。プラスミドpBI121(Clontech社製)を制
限酵素BamHIとSacIとで消化することによりβ-glucuron
idase遺伝子を除去し、一方、参考例1(3)記載のプラス
ミドpKFATP1を制限酵素BamHIとSacIとで消化してシロイ
ヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子を含むDNA断片を調製し、
該DNA断片を前記のβ-glucuronidase遺伝子に替えてプ
ラスミドpBI121に挿入することにより、シロイヌナズナ
ＰＰＯ(A220V)遺伝子が35Sプロモーターの下流に結合さ
れてなるプラスミドpNATP（図４）を作製した。該プラ
スミドpNATPをAgrobacterium tumefaciens LBA4404に導
入し、これを300μg/mlストレプトマイシン、100μg/ml
リファンピシン、25μg/mlカナマイシンを含むＬＢ培地
で培養して形質転換体を選抜することによってpNATPを
持つアグロバクテリウム株を単離した。該アグロバクテ
リウム株を無菌培養したタバコの葉片に感染させ、参考
例1(2)記載の方法と同様の操作で、シロイヌナズナＰＰ
Ｏ(A220V)遺伝子が導入されたタバコを取得した。(4) Introduction of Arabidopsis thaliana PPO Gene Having Herbicide Resistance Mutation into Tobacco Arabidopsis PPO Gene Having Herbicide Resistance Mutation
[Hereinafter referred to as the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene. ]
Was introduced into plants by the Agrobacterium method. Β-glucuron by digesting plasmid pBI121 (Clontech) with restriction enzymes BamHI and SacI
Remove the protease gene, on the other hand, to prepare a DNA fragment containing the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene by digesting the plasmid pKFATP1 described in Reference Example 1 (3) with restriction enzymes BamHI and SacI,
By inserting the DNA fragment into the plasmid pBI121 instead of the β-glucuronidase gene, a plasmid pNATP (FIG. 4) in which the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene was linked downstream of the 35S promoter was prepared. The plasmid pNATP was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, and 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml
An Agrobacterium strain having pNATP was isolated by culturing in an LB medium containing rifampicin and 25 μg / ml kanamycin and selecting transformants. The Agrobacterium strain was infected aseptically into tobacco leaf pieces, and the same procedure as described in Reference Example 1 (2) was carried out.
Tobacco into which the O (A220V) gene was introduced was obtained.

【００３６】実施例１ シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)
遺伝子と本改変タバコケラターゼサブユニットをコード
する遺伝子とが導入されたタバコの作出と除草剤耐性の
確認 （１）シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子と本改変タ
バコケラターゼサブユニットをコードする遺伝子とを持
つ組換えタバコの作出 シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子と本改変タバコケ
ラターゼサブユニットをコードする遺伝子の両方をアグ
ロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを
構築した。まず、配列番号４で示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５で示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合
成した。該オリゴヌクレオチドプライマーはDNA合成装
置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチ
ド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステムズ
社：OPC カートリッジ）で精製した。該プライマーを用
い、参考例１(3)で作製されたプラスミドpKFATP1を鋳型
DNAとして用いてＰＣＲを行うことによってシロイヌナ
ズナＰＰＯ(A220V)遺伝子を含むDNA断片を調製した。Ｐ
ＣＲは、94℃にて1分間次いで55℃にて2分間さらに72℃
で3分間の保温を1サイクルとして30サイクル行った。増
幅したDNA断片を制限酵素HindIIIとSalIで消化しシロイ
ヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子を含むDNA断片を取得し、
該DNA断片を市販のベクターpUC19のHindIIIとSalI切断
部位の間に挿入しプラスミドpAPを構築した。一方、Shi
ota, N. et al. Plant Physiol., 106; p17(1994)に記
載のプラスミドpNG01を制限酵素HindIIIで消化し、DNA
polymerase Iを用いて2本鎖DNAのギャップにヌクレオチ
ドを付加して該DNAの末端を平滑化した後自己環化させ
プラスミドpNG04を作製した。次に、このプラスミドpNG
04を制限酵素XbaIで消化し得られるノパリン合成酵素の
ターミネーターと35Sプロモーターからなる約1.1kbのDN
A断片を単離し、上記のプラスミドpAPのXbaI切断部位に
挿入した。シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子の下流
にノパリン合成酵素のターミネーターが結合されている
プラスミドpAPNSを選抜するために、制限酵素HindIIIと
PstIで消化しシロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子とノ
パリン合成酵素のターミネーターからなる約2.0kbのDNA
断片を生成するクローンを選抜した。さらに、このプラ
スミドpAPNSを制限酵素HindIIIで消化し、DNA polymera
se Iを用いて2本鎖DNAのギャップにヌクレオチドを付加
して該DNAの末端を平滑化した後、仔牛小腸由来のAlkal
inephosphataseで該DNAの5'末端を脱りん酸化し、りん
酸化KpnIリンカー(宝酒造製4668P)を挿入して環化させ
プラスミドpAPNSKを作製した。該プラスミドpAPNSKを制
限酵素KpnIとDraIで消化し、シロイヌナズナＰＰＯ(A22
0V)遺伝子、ノパリン合成酵素のターミネーター、およ
び35Sプロモーターからなる約2.8kbのDNA断片を単離
し、参考例1(2)で作製されたプラスミドpBITCHLHのKpnI
切断部位に挿入した。シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺
伝子および本改変タバコケラターゼサブユニットをコー
ドする遺伝子の両方が35Sプロモーターの制御下で発現
可能な向きに挿入されたプラスミドpBIAPTCH(図５)を選
抜するために、得られたプラスミドをBamHIで消化しシ
ロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子、ノパリン合成酵素
のターミネーター、および35Sプロモーターからなる約
2.8kbのDNA断片を生成するクローンを選抜した。該プラ
スミドpBIAPTCHをAgrobacterium tumefaciens LBA4404
に導入し、これを300μg/mlストレプトマイシン、100μ
g/mlリファンピシン、25μg/mlカナマイシンを含むＬＢ
培地で培養して形質転換体を選抜することによってpBIA
PTCHを持つアグロバクテリウム株を単離した。該アグロ
バクテリウム株を無菌培養したタバコの葉片に感染さ
せ、参考例1(2)記載の方法と同様の操作で、シロイヌナ
ズナＰＰＯ(A220V)遺伝子と本改変タバコケラターゼサ
ブユニットをコードする遺伝子の両方が導入されたタバ
コを取得した。Example 1 Arabidopsis thaliana PPO (A220V)
Production of tobacco into which the gene and the gene encoding the modified tobacco keratase subunit have been introduced and confirmation of herbicide resistance (1) The Arabidopsis PPO (A220V) gene and the gene encoding the modified tobacco keratase subunit Production of Recombinant Tobacco Carrying Plasmid A plasmid was constructed for introducing both the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the gene encoding the modified tobacco keratase subunit into plants by the Agrobacterium method. First, an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 were synthesized. The oligonucleotide primer is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA /
It was synthesized using an RNA Synthesizer and purified using an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Using the primer, the plasmid pKFATP1 prepared in Reference Example 1 (3) was used as a template.
A DNA fragment containing the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene was prepared by performing PCR using the DNA. P
CR at 94 ° C for 1 minute, then at 55 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C
And 30 cycles were performed with 1 minute of 3 minutes. Digest the amplified DNA fragment with restriction enzymes HindIII and SalI to obtain a DNA fragment containing Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene,
The DNA fragment was inserted between the HindIII and SalI sites of the commercially available vector pUC19 to construct plasmid pAP. Meanwhile, Shi
ota, N. et al. Plant Physiol., 106; Digest the plasmid pNG01 described in p17 (1994) with HindIII
Nucleotides were added to the gaps of the double-stranded DNA using polymerase I to blunt the ends of the DNA, followed by self-cyclization to prepare plasmid pNG04. Next, this plasmid pNG
No. 1.1kb DN consisting of a nopaline synthase terminator and 35S promoter obtained by digesting 04 with the restriction enzyme XbaI
The A fragment was isolated and inserted into the XbaI cleavage site of the above plasmid pAP. To select a plasmid pAPNS having a nopaline synthase terminator downstream of the Arabidopsis PPO (A220V) gene, restriction enzymes HindIII and
Approximately 2.0 kb DNA digested with PstI and consisting of Arabidopsis PPO (A220V) gene and nopaline synthase terminator
Clones producing fragments were selected. Furthermore, this plasmid pAPNS was digested with restriction enzyme HindIII, and DNA polymera
After adding nucleotides to the gaps of the double-stranded DNA using se I to blunt the ends of the DNA, Alkal derived from calf small intestine was used.
The 5 ′ end of the DNA was dephosphorylated with inephosphatase, and a phosphorylated KpnI linker (4668P, manufactured by Takara Shuzo) was inserted to cyclize to prepare plasmid pAPNSK. The plasmid pAPNSK was digested with restriction enzymes KpnI and DraI, and Arabidopsis thaliana PPO (A22
0V) gene, a terminator of nopaline synthase, and an approximately 2.8 kb DNA fragment consisting of the 35S promoter were isolated, and KpnI of the plasmid pBITCHLH prepared in Reference Example 1 (2) was isolated.
Inserted at the cleavage site. Both the Arabidopsis PPO (A220V) gene and the gene encoding the modified tobacco keratase subunit were obtained to select a plasmid pBIAPTCH (FIG. 5) in which the gene was inserted in an orientation that allows expression under the control of the 35S promoter. The plasmid was digested with BamHI to obtain an Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene, a nopaline synthase terminator, and a 35S promoter.
A clone producing a 2.8 kb DNA fragment was selected. The plasmid pBIAPTCH was replaced with Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
, 300 μg / ml streptomycin, 100 μl
LB containing g / ml rifampicin, 25 μg / ml kanamycin
PBIA by culturing in a medium and selecting transformants
Agrobacterium strain with PTCH was isolated. The Agrobacterium strain was infected into aseptically cultured tobacco leaf pieces, and the same procedure as described in Reference Example 1 (2) was carried out. Both acquired cigarettes that were introduced.

【００３７】（２）シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝
子と本改変タバコケラターゼサブユニットをコードする
遺伝子とが導入されたタバコの除草剤耐性の確認 実施例1(1)で作製されたシロイヌナズナＰＰＯ(A220V)
遺伝子と本改変タバコケラターゼサブユニットをコード
する遺伝子の両方が導入されたタバコの葉、参考例１
(4)で作製されたシロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子が
導入されたタバコの葉、および参考例１(2)で作製され
たコントロール組換えタバコの葉をそれぞれ採取して、
これらをそれぞれ主葉脈に沿って左右均等に２分割し、
一方の葉片に前記 構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除
草性化合物を2.0ppmの濃度で含む水溶液を全面に塗布し
た。尚、他方の葉片には前記の除草性化合物の塗布を行
なわなかった。これらの葉片を、0.8%寒天を含むMS培地
上に置き、明所、室温にて7日間放置した。次いで、各
葉片を、それぞれ乳鉢と乳棒で5mlの80%アセトン水溶液
中で磨砕してクロロフィルを抽出した。抽出液を80%ア
セトン水溶液で10倍に希釈した後、750nm、663nm、645n
mにおける吸光度を測定し、Macknney G., J. Biol. Che
m. (1941) 140, p315記載の方法によって総クロロフィ
ル含量を算出した。供試した除草性化合物に対する耐性
度は、除草性化合物処理した葉片の総クロロフィル含量
の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対する百分率
で表した。コントロール組換えタバコの耐性度は２．８
８％、シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子が導入され
たタバコの耐性度は１２．２％、シロイヌナズナＰＰＯ
(A220V)遺伝子と本改変タバコケラターゼサブユニット
をコードする遺伝子の両方が導入された本発明のタバコ
の耐性度は６１．６％であった。(2) Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the gene encoding the present modified tobacco keratase subunit have been introduced Arabidopsis thaliana PPO (A220V) )
Tobacco leaf into which both the gene and the gene encoding the modified tobacco keratase subunit were introduced, Reference Example 1
The tobacco leaf into which the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene produced in (4) was introduced and the control recombinant tobacco leaf produced in Reference Example 1 (2) were collected, respectively.
These are equally divided into two right and left along the main vein,
An aqueous solution containing the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by Structural Formula 8 at a concentration of 2.0 ppm was applied to one leaf piece. The other leaf piece was not coated with the herbicidal compound. These leaf pieces were placed on an MS medium containing 0.8% agar and allowed to stand in the light at room temperature for 7 days. Next, each leaf piece was ground in a 5 ml 80% aqueous acetone solution with a mortar and pestle to extract chlorophyll. After diluting the extract 10 times with 80% acetone aqueous solution, 750 nm, 663 nm, 645 n
m, absorbance was measured, and Macknney G., J. Biol.
m. (1941) 140, p315 The total chlorophyll content was calculated. The degree of resistance to the tested herbicidal compounds was expressed as a percentage of the total chlorophyll content of the leaf pieces treated with the herbicidal compound relative to the total chlorophyll content of the untreated leaf pieces. The degree of resistance of the control recombinant tobacco is 2.8.
8%, tobacco into which the Arabidopsis PPO (A220V) gene was introduced had a resistance of 12.2%, and Arabidopsis PPO
The degree of resistance of the tobacco of the present invention into which both the (A220V) gene and the gene encoding the present modified tobacco keratase subunit were introduced was 61.6%.

【００３８】参考例２ 葉緑体局在型のシロイヌナズナ
フェロケラターゼ遺伝子を導入したタバコの作出 （１）葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ
をコードする遺伝子の取得 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ecotype WS）
の葉部組織から、RNeasy Plant Kit(QIAGEN社製)を用い
て付属のマニュアルにしたがって操作を行ない、全 RNA
を調製した。さらに、RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1
（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作
を行ない、葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラタ
ーゼ遺伝子を含むDNA断片を取得した。まず、プライマ
ーとして前記キットに含まれるOligo dT-Adaptor Prime
rを用い、シロイヌナズナ全RNAを鋳型として、前記キッ
トに含まれる逆転写酵素を添加して1st strand cDNAを
合成した。続いて、該1st strand cDNAを鋳型として、
前記キットに含まれるLA Taq polymeraseを用いてPCRを
行い、葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ
をコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。ここで
ＰＣＲのプライマーとしては、配列番号６で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、および
配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。該オリゴヌクレオチドはDNA
合成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 39
4 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌク
レオチド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシス
テムズ社：OPC カートリッジ）で精製した。また、ＰＣ
Ｒは、94℃にて2分間の保温を1回行い、続いて、94℃に
て30秒間、次いで50℃にて30秒間、さらに72℃にて7分
間の保温を１サイクルとしてこれを30サイクル実施し
た。前記のＰＣＲ反応後、TA Cloning Kit（Invitrogen
社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行な
い、該ＰＣＲ反応で増幅されたDNA断片をpCR2.1プラス
ミドにクローニングした。得られたプラスミドを制限酵
素BamHIで消化した後、アガロースゲル電気泳動で分析
し、5.3kbのDNA断片が検出されたプラスミドをpCRATF
(図６)と名付けた。該プラスミドは、葉緑体局在型のシ
ロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝子がlacプロモータ
ーによる転写方向に挿入された構造を有する。このプラ
スミドに含まれる葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロ
ケラターゼ遺伝子の塩基配列を解析したところ、Smith,
A.G.et al., J.Biol.Chem., 269;p13405(1994)に記載
の葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼをコ
ードする遺伝子の塩基配列と一致した。Reference Example 2 Production of tobacco into which chloroplast-located Arabidopsis ferrochelatase gene was introduced (1) Acquisition of gene encoding chloroplast-located Arabidopsis ferrochelatase Arabidopsis thaliana ecotype WS )
From the leaf tissue of, using the RNeasy Plant Kit (QIAGEN) according to the attached manual,
Was prepared. In addition, RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1
By using (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached manual, a DNA fragment containing a chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase gene was obtained. First, Oligo dT-Adaptor Prime included in the kit as a primer
Using r, the reverse transcriptase contained in the kit was added to Arabidopsis thaliana as a template to synthesize 1st strand cDNA. Subsequently, using the 1st strand cDNA as a template,
PCR was performed using LA Taq polymerase included in the kit to amplify a DNA fragment containing a gene encoding chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase. Here, as a primer for PCR, an oligonucleotide primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and an oligonucleotide primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 were used. The oligonucleotide is DNA
Synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 39)
4 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Also, PC
R was once insulated at 94 ° C for 2 minutes, followed by 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 7 minutes as one cycle. A cycle was performed. After the PCR reaction, the TA Cloning Kit (Invitrogen
And the DNA fragment amplified by the PCR reaction was cloned into the pCR2.1 plasmid. After digesting the obtained plasmid with the restriction enzyme BamHI, it was analyzed by agarose gel electrophoresis, and the plasmid in which the 5.3 kb DNA fragment was detected was replaced with pCRATF.
(FIG. 6). The plasmid has a structure in which a chloroplast-localized Arabidopsis thaliana ferrochelatase gene is inserted in the direction of transcription by the lac promoter. Analysis of the nucleotide sequence of the chloroplast-located Arabidopsis ferrochelatase gene contained in this plasmid revealed that Smith,
The nucleotide sequence of the gene encoding the chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase described in AGet al., J. Biol. Chem., 269; p13405 (1994) was consistent.

【００３９】（２）葉緑体局在型のシロイヌナズナフェ
ロケラターゼをコードする遺伝子のタバコへの導入 葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼをコー
ドする遺伝子をアグロバクテリウム法で植物へ導入する
ためのプラスミドを構築した。まず、参考例2(1)で作製
されたプラスミドpCRATFを制限酵素BamHIとSacIとで消
化することにより、葉緑体局在型シロイヌナズナフェロ
ケラターゼ遺伝子を含むDNA断片を調製した。バイナリ
ーベクターpBI121(Clontech社製)を制限酵素BamHIとSac
Iとで消化することによりβ-glucuronidase遺伝子を除
去し、これに替えて、前記の葉緑体局在型シロイヌナズ
ナフェロケラターゼ遺伝子を含むDNA断片を挿入し、該
遺伝子が35Sプロモーターの下流に結合されてなるプラ
スミドpBIATF（図７）を作製した。該プラスミドpBIATF
をAgrobacterium tumefaciens LBA4404に導入し、これ
を300μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlリファンピ
シン、25μg/mlカナマイシンを含むＬＢ培地で培養して
形質転換体を選抜することによってpBIATFを持つアグロ
バクテリウム株を単離した。該アグロバクテリウム株を
無菌培養したタバコの葉片に感染させ、参考例1(2)記載
の方法と同様の操作で、葉緑体局在型のシロイヌナズナ
フェロケラターゼ遺伝子が導入されたタバコを取得す
る。(2) Introduction of a gene encoding a chloroplast-localized Arabidopsis ferrokeratase into tobacco A gene encoding a chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase is introduced into a plant by the Agrobacterium method. A plasmid for constructing the plasmid was constructed. First, a DNA fragment containing a chloroplast-localized Arabidopsis thaliana ferrochelatase gene was prepared by digesting the plasmid pCRATF prepared in Reference Example 2 (1) with restriction enzymes BamHI and SacI. Binary vector pBI121 (Clontech) was digested with restriction enzymes BamHI and Sac
The β-glucuronidase gene was removed by digestion with I, and instead, a DNA fragment containing the chloroplast-located Arabidopsis ferrochelatase gene was inserted, and the gene was bound downstream of the 35S promoter. The resulting plasmid pBIATF (FIG. 7) was prepared. The plasmid pBIATF
Was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, and this was cultured in an LB medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin, and an Agrobacterium strain having pBIATF was isolated by selecting transformants. did. The Agrobacterium strain was infected aseptically into leaf pieces of tobacco, and a tobacco into which the chloroplast-localized Arabidopsis ferrokeratase gene had been introduced was obtained in the same manner as in the method described in Reference Example 1 (2). I do.

【００４０】実施例２ シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)
遺伝子と葉緑体局在型シロイヌナズナフェロケラターゼ
遺伝子とを持つ組換えタバコの作出と除草剤耐性の確認 （１）シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子と葉緑体局
在型シロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝子の両方を持
つ組換えタバコの作出 シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子と葉緑体局在型シ
ロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝子の両方をアグロバ
クテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築
する。まず、実施例1(1)で作製されたプラスミドpAPNS
を制限酵素HindIIIで消化し、DNA polymerase Iを用い
て2本鎖DNAのギャップにヌクレオチドを付加して該DNA
の末端を平滑化した後、仔牛小腸由来のAlkaline phosp
hataseで該DNAの5'末端を脱りん酸化し、りん酸化BamHI
リンカー(宝酒造製4610P)を挿入して環化させプラスミ
ドpAPNSBを作製する。該プラスミドpAPNSBを制限酵素Ba
mHIとDraIで消化し、シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝
子、ノパリン合成酵素のターミネーター、および35Sプ
ロモーターからなる約2.8kbのDNA断片を単離し、参考例
2(2)で作製されたプラスミドpBIATFのBamHI切断部位に
挿入する。シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子および
葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝子
の両方が35Sプロモーターの制御下で発現可能な向きに
挿入されたプラスミドpBIAPATF(図８)を選抜するため
に、得られたプラスミドを制限酵素NotIとSacIで消化し
35Sプロモーターと葉緑体局在型のシロイヌナズナフェ
ロケラターゼ遺伝子からなる約2.2kbのDNA断片を生成す
るクローンを選抜する。該プラスミドpBIAPATFをAgroba
cterium tumefaciens LBA4404に導入し、これを300μg/
mlストレプトマイシン、100μg/mlリファンピシン、25
μg/mlカナマイシンを含むＬＢ培地で培養して形質転換
体を選抜することによってpBIAPATFを持つアグロバクテ
リウム株を単離する。該アグロバクテリウム株を無菌培
養したタバコの葉片に感染させ、参考例1(2)記載の方法
と同様の操作で、シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子
と葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝
子とが導入されたタバコを取得する。Example 2 Arabidopsis thaliana PPO (A220V)
Production of Recombinant Tobacco Having Gene and Chloroplast-Localized Arabidopsis Ferrochelatase Gene and Confirmation of Herbicide Resistance (1) Both Arabidopsis PPO (A220V) Gene and Chloroplast-Localized Arabidopsis Ferrochelatase Gene Preparation of Recombinant Tobacco Having the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the chloroplast-localized Arabidopsis thaliana ferrochelatase gene are constructed into a plasmid for introduction into a plant by the Agrobacterium method. First, plasmid pAPNS prepared in Example 1 (1)
Was digested with the restriction enzyme HindIII, and nucleotides were added to the gaps of the double-stranded DNA using DNA polymerase I to add the DNA.
Alkaline phosp from calf small intestine after blunting
Dephosphorylate the 5 'end of the DNA with hatase, and phosphorylate BamHI
A linker (4610P manufactured by Takara Shuzo) is inserted and cyclized to prepare plasmid pAPNSB. The plasmid pAPNSB is replaced with the restriction enzyme Ba.
Digested with mHI and DraI, isolated about 2.8 kb DNA fragment consisting of Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene, terminator of nopaline synthase, and 35S promoter, Reference Example
Insert into the BamHI cleavage site of plasmid pBIATF prepared in 2 (2). The Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase gene were obtained to select a plasmid pBIAPATF (FIG. 8) in which the plasmid was inserted in an orientation capable of being expressed under the control of the 35S promoter. Digested with restriction enzymes NotI and SacI.
A clone producing a DNA fragment of about 2.2 kb comprising a 35S promoter and a chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase gene is selected. The plasmid pBIAPATF was
cterium tumefaciens introduced into LBA4404, 300 μg /
ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, 25
An Agrobacterium strain having pBIAPATF is isolated by culturing in LB medium containing μg / ml kanamycin and selecting transformants. The Agrobacterium strain was aseptically cultured to infect leaf pieces of tobacco, and in the same manner as described in Reference Example 1 (2), the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase gene were used. And get a cigarette that was introduced.

【００４１】（２）シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝
子と葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ遺
伝子とが導入されたタバコの除草剤耐性の確認 実施例２(1)で作製されたシロイヌナズナＰＰＯ(A220V)
遺伝子と葉緑体局在型シロイヌナズナフェロケラターゼ
遺伝子とが導入されたタバコを、実施例1(2)と同様の操
作で試験し、該タバコの除草性化合物に対する耐性度を
定量的に確認する。(2) Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase gene have been introduced The Arabidopsis thaliana PPO ( (A220V)
The tobacco into which the gene and the chloroplast-localized Arabidopsis ferrokeratase gene have been introduced is tested by the same operation as in Example 1 (2), and the degree of resistance of the tobacco to the herbicidal compound is quantitatively confirmed. .

【００４２】参考例３ ダイズのコプロポルフィリノー
ゲンIIIオキシダーゼ遺伝子を導入したタバコの作出 （１）ダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダ
ーゼ遺伝子の取得 ダイズ（Glycine max cv. Jack）の葉部組織から、RNea
sy Plant Kit(QIAGEN社製)を用いて付属のマニュアルに
したがって操作を行ない、全 RNA を調製した。さら
に、RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1（宝酒造社製）を用
いて付属のマニュアルに従って操作を行ない、ダイズの
コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子を含
むDNA断片を取得した。まず、プライマーとして前記キ
ットに含まれるOligo dT-Adaptor Primerを用い、ダイ
ズ全RNAを鋳型として、前記キットに含まれる逆転写酵
素を添加して1st strand cDNAを合成した。続いて、該1
st strand cDNAを鋳型として、前記キットに含まれるLA
Taq polymeraseを用いてPCRを行い、ダイズのコプロポ
ルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子を含むDNA断片
を増幅した。ここでＰＣＲのプライマーとしては、配列
番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
プライマー、および配列番号９で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。該オリゴ
ヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシス
テムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて
合成し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PEア
プライドバイオシステムズ社：OPC カートリッジ）で精
製した。また、ＰＣＲは、94℃にて2分間の保温を1回行
い、続いて、94℃にて30秒間、次いで50℃にて30秒間、
さらに72℃にて7分間の保温を１サイクルとしてこれを3
0サイクル実施した。前記のＰＣＲ反応後、TA Cloning
Kit（Invitrogen社製）を用いて付属のマニュアルに従
って操作を行ない、該ＰＣＲ反応で増幅されたDNA断片
をpCR2.1プラスミドにクローニングした。得られたプラ
スミドを制限酵素BamHIで消化した後、アガロースゲル
電気泳動で分析し、1.2kbのDNA断片が検出されたプラス
ミドをpCRSCPOX(図９)と名付けた。該プラスミドは、ダ
イズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝
子がlacプロモーターによる転写方向と逆方向に挿入さ
れた構造を有する。このプラスミド中の該DNA断片の塩
基配列を解析したところ、ダイズのコプロポルフィリノ
ーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子であることを確認した。Reference Example 3 Production of tobacco into which soybean coproporphyrinogen III oxidase gene was introduced (1) Acquisition of soybean coproporphyrinogen III oxidase gene From the leaf tissue of soybean (Glycine max cv. Jack)
Using a sy Plant Kit (manufactured by QIAGEN), the operation was performed according to the attached manual to prepare total RNA. Further, the operation was carried out using RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached manual to obtain a DNA fragment containing soybean coproporphyrinogen III oxidase gene. First, the oligo dT-Adaptor Primer included in the kit was used as a primer, and the reverse transcriptase included in the kit was added to soybean total RNA as a template to synthesize 1st strand cDNA. Then, the 1
Using the st strand cDNA as a template, LA contained in the kit
PCR was performed using Taq polymerase to amplify a DNA fragment containing soybean coproporphyrinogen III oxidase gene. Here, as a primer for PCR, an oligonucleotide primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 and an oligonucleotide primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9 were used. The oligonucleotide was synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). The PCR was performed once at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 94 ° C. for 30 seconds, then at 50 ° C. for 30 seconds,
In addition, one cycle of keeping the temperature at 72 ° C for 7 minutes is 3
0 cycles were performed. After the above PCR reaction, TA Cloning
Using a kit (manufactured by Invitrogen), the operation was performed according to the attached manual, and the DNA fragment amplified by the PCR reaction was cloned into pCR2.1 plasmid. The resulting plasmid was digested with the restriction enzyme BamHI and analyzed by agarose gel electrophoresis. The plasmid in which a 1.2 kb DNA fragment was detected was named pCRSCPOX (FIG. 9). The plasmid has a structure in which the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene is inserted in the direction opposite to the direction of transcription by the lac promoter. Analysis of the nucleotide sequence of the DNA fragment in this plasmid confirmed that it was the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene.

【００４３】（２）ダイズのコプロポルフィリノーゲン
IIIオキシダーゼ遺伝子のタバコへの導入 ダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子をアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプ
ラスミドを構築した。まず、参考例３(1)で作製された
プラスミドpCRSCPOXを制限酵素BamHIとSalIとで消化す
ることにより、ダイズのコプロポルフィリノーゲンIII
オキシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を調製した。参考例1
(2)で作製されたバイナリーベクターpBI121KSを制限酵
素BamHIとSalIとで消化することによりβ-glucuronidas
e遺伝子を除去し、これに替えて、前記のダイズのコプ
ロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子を含むDNA
断片を挿入し、該遺伝子が35Sプロモーターの下流に結
合されてなるプラスミドpBISCPOX（図１０）を作製し
た。該プラスミドpBISCPOXをAgrobacterium tumefacien
s LBA4404に導入し、これを300μg/mlストレプトマイシ
ン、100μg/mlリファンピシン、25μg/mlカナマイシン
を含むＬＢ培地で培養して形質転換体を選抜することに
よってpBISCPOXを持つアグロバクテリウム株を単離し
た。該アグロバクテリウム株を無菌培養したタバコの葉
片に感染させ、参考例1(2)記載の方法と同様の操作で、
ダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子が導入されたタバコを取得する。(2) Coproporphyrinogen in soybean
Introduction of III oxidase gene into tobacco A plasmid for introducing the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene into plants by the Agrobacterium method was constructed. First, the plasmid pCRSCPOX prepared in Reference Example 3 (1) was digested with restriction enzymes BamHI and SalI to obtain soybean coproporphyrinogen III.
A DNA fragment containing the oxidase gene was prepared. Reference example 1
Β-glucuronidas by digesting the binary vector pBI121KS produced in (2) with restriction enzymes BamHI and SalI
e, the DNA containing the coproporphyrinogen III oxidase gene of the soybean
The fragment was inserted to prepare a plasmid pBISCPOX (FIG. 10) in which the gene was ligated downstream of the 35S promoter. The plasmid pBISCPOX was replaced with Agrobacterium tumefacien
s LBA4404 was introduced, and this was cultured in an LB medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin, and a transformant was selected to isolate an Agrobacterium strain having pBISCPOX. The Agrobacterium strain was aseptically cultured to infect leaf pieces of tobacco, and in the same manner as described in Reference Example 1 (2),
A soybean tobacco into which the coproporphyrinogen III oxidase gene has been introduced is obtained.

【００４４】実施例３ シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)
遺伝子とダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシ
ダーゼ遺伝子とを持つ組換えタバコの作出と除草剤耐性
の確認 （１）シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子とダイズの
コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子とを
持つ組換えタバコの作出 シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子とダイズのコプロ
ポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子の両方をア
グロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミド
を構築する。実施例1(1)で作製されたプラスミドpAPNSB
を制限酵素BamHIとDraIで消化し、シロイヌナズナＰＰ
Ｏ(A220V)遺伝子、ノパリン合成酵素のターミネータ
ー、および35Sプロモーターからなる約2.8kbのDNA断片
を単離し、参考例３(2)で作製されたプラスミドpBISCPO
XのBamHI切断部位に挿入する。シロイヌナズナＰＰＯ(A
220V)遺伝子およびダイズのコプロポルフィリノーゲンI
IIオキシダーゼ遺伝子の両方が35Sプロモーターの制御
下で発現可能な向きに挿入されたプラスミドpBIAPSCP
(図１１)を選抜するために、得られたプラスミドを制限
酵素NotIとSalIで消化し35Sプロモーターとダイズのコ
プロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子からな
る約2.0kbのDNA断片を生成するクローンを選抜する。該
プラスミドpBIAPSCPをAgrobacterium tumefaciens LBA4
404に導入し、これを300μg/mlストレプトマイシン、10
0μg/mlリファンピシン、25μg/mlカナマイシンを含む
ＬＢ培地で培養して形質転換体を選抜することによって
pBIAPSCPを持つアグロバクテリウム株を単離する。該ア
グロバクテリウム株を無菌培養したタバコの葉片に感染
させ、参考例1(2)記載の方法と同様の操作で、シロイヌ
ナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子とダイズのコプロポルフィ
リノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子の両方が導入された
タバコを取得する。Example 3 Arabidopsis thaliana PPO (A220V)
Production of Recombinant Tobacco Having Gene and Soybean Coproporphyrinogen III Oxidase Gene and Confirmation of Herbicide Resistance (1) Recombinant Tobacco Having Arabidopsis PPO (A220V) Gene and Soybean Coproporphyrinogen III Oxidase Gene Construction of a plasmid for introducing both Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and soybean coproporphyrinogen III oxidase gene into a plant by the Agrobacterium method. Plasmid pAPNSB prepared in Example 1 (1)
Was digested with restriction enzymes BamHI and DraI, and Arabidopsis PP was digested.
An approximately 2.8 kb DNA fragment consisting of the O (A220V) gene, the nopaline synthase terminator, and the 35S promoter was isolated, and the plasmid pBISCPO prepared in Reference Example 3 (2) was isolated.
Insert into X at the BamHI cleavage site. Arabidopsis thaliana PPO (A
220V) Gene and soybean coproporphyrinogen I
Plasmid pBIAPSCP in which both II oxidase genes have been inserted in an orientation that allows expression under the control of the 35S promoter
In order to select (FIG. 11), the obtained plasmid is digested with restriction enzymes NotI and SalI, and a clone that produces a DNA fragment of about 2.0 kb consisting of 35S promoter and soybean coproporphyrinogen III oxidase gene is selected. . The plasmid pBIAPSCP was replaced with Agrobacterium tumefaciens LBA4
404, this was added to 300 μg / ml streptomycin, 10
Transformants are selected by culturing in LB medium containing 0 μg / ml rifampicin and 25 μg / ml kanamycin
Isolate the Agrobacterium strain with pBIAPSCP. The Agrobacterium strain was infected aseptically into tobacco leaf pieces, and both the Arabidopsis PPO (A220V) gene and the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene were treated in the same manner as described in Reference Example 1 (2). Get introduced cigarettes.

【００４５】（２）シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝
子とダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダー
ゼ遺伝子の両方が導入されたタバコの除草剤耐性の確認 実施例３(1)で作製されたシロイヌナズナＰＰＯ(A220V)
遺伝子とダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシ
ダーゼ遺伝子の両方が導入されたタバコを、実施例1(2)
と同様の操作で試験し、該タバコの除草性化合物に対す
る耐性度を定量的に確認する。(2) Confirmation of herbicide resistance of tobacco to which both the Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene and the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene have been introduced The Arabidopsis thaliana PPO (A220V) produced in Example 3 (1)
Tobacco into which both the gene and soybean coproporphyrinogen III oxidase gene were introduced, Example 1 (2)
And the degree of resistance of the tobacco to the herbicidal compound is quantitatively confirmed.

【００４６】[0046]

【発明の効果】本発明により、ＰＰＯ阻害型除草剤に対
する耐性を有する植物が提供可能となる。Industrial Applicability According to the present invention, a plant having resistance to a PPO-inhibiting herbicide can be provided.

【００４７】[配列表フリーテキスト] 配列番号１ タバコのchlH遺伝子の部分塩基配列を有するDNA断片を
増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２ タバコのchlH遺伝子の部分塩基配列を有するDNA断片を
増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号３ シロイヌナズナＰＰＯ遺伝子に変異を導入するために設
計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号４ シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子を増幅するために
設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号５ シロイヌナズナＰＰＯ(A220V)遺伝子を増幅するために
設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６ シロイヌナズナの葉緑体局在型フェロケラターゼ遺伝子
を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライ
マー 配列番号７ シロイヌナズナの葉緑体局在型フェロケラターゼ遺伝子
を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライ
マー 配列番号８ ダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号９ ダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー[Sequence Listing Free Text] SEQ ID NO: 1 Oligonucleotide primer designed to amplify a DNA fragment having a partial base sequence of tobacco chlH gene SEQ ID NO: 2 DNA fragment having a partial base sequence of tobacco chlH gene SEQ ID NO: 3 Oligonucleotide primer designed to introduce mutation in Arabidopsis thaliana PPO gene SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide primer designed to amplify Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene SEQ ID NO: 5 Oligonucleotide primer designed to amplify Arabidopsis thaliana PPO (A220V) gene SEQ ID NO: 6 Oligonucleotide primer designed to amplify chloroplast-localized ferrochelatase gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 7 Oligonucleotide primer designed to amplify chloroplast-localized ferrochelatase gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 8 Oligonucleotide primer designed to amplify coproporphyrinogen III oxidase gene of soybean SEQ ID NO: 9 Oligonucleotide primers designed to amplify the coproporphyrinogen III oxidase gene

【００４８】[0048]

【配列表】[Sequence list]

SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Herbicide resistant plants <130> P150843 <160> 9 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify D
NA fragment having partial sequence of tobacco chl
H gene <400> 1 ccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify D
NA fragment having partial sequence of tobacco chl
H gene <400> 2 gagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg 34 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to intriduce
mutation into arabidopsis PPO gene <400> 3 tgttcaggtg tttatgttgg tgatccttca aaactg 36 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify h
erbicide resistant arabidopsis PPO(A220V) gene <400> 4 ccatgcggaa gcttatggag ttatctcttc tc 32 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Designed oligonucleotide primer to amplify h
erbicide resistant arabidopsis PPO(A220V) gene <400> 5 gggagattta atgtcgacca tttacttgta agcg 34 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify A
rabidopsis chloroplastferrochelatase gene <400> 6 gatcggttct gaaatttgga tccatgcagg c 31 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify A
rabidopsis chloroplastferrochelatase gene <400> 7 cacaaaacca acgagctcct ataggttccg g 31 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify s
oybean coproporphyrinogen III oxidase gene <400> 8 gaatcggatc cgaagcatga tgcattgtgc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify s
oybean coproporphyrinogen III oxidase gene <400> 9 gggggtcgac tgatgaatta gatccattcc 30SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Herbicide resistant plants <130> P150843 <160> 9 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify D
NA fragment having partial sequence of tobacco chl
H gene <400> 1 ccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify D
NA fragment having partial sequence of tobacco chl
H gene <400> 2 gagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg 34 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to intriduce
mutation into arabidopsis PPO gene <400> 3 tgttcaggtg tttatgttgg tgatccttca aaactg 36 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify h
erbicide resistant arabidopsis PPO (A220V) gene <400> 4 ccatgcggaa gcttatggag ttatctcttc tc 32 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><213> Designed oligonucleotide primer to amplify h
erbicide resistant arabidopsis PPO (A220V) gene <400> 5 gggagattta atgtcgacca tttacttgta agcg 34 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify A
rabidopsis chloroplastferrochelatase gene <400> 6 gatcggttct gaaatttgga tccatgcagg c 31 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify A
rabidopsis chloroplastferrochelatase gene <400> 7 cacaaaacca acgagctcct ataggttccg g 31 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify s
oybean coproporphyrinogen III oxidase gene <400> 8 gaatcggatc cgaagcatga tgcattgtgc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify s
oybean coproporphyrinogen III oxidase gene <400> 9 gggggtcgac tgatgaatta gatccattcc 30

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】プラスミドpTCHLH1の制限酵素地図を示す。TCH
LH1は葉緑体移行シグナルを欠失したタバコのマグネシ
ウムケラターゼサブユニットをコードする遺伝子であ
り、 lac proラクトースオペロンのプロモーター配列を
意味する。 また、Amp^rはアンピシリン耐性遺伝子、lac
I^qはラクトースオペロンのリプレッサータンパク質遺伝
子、oriは複製開始点を表す。FIG. 1 shows a restriction map of plasmid pTCHLH1. TCH
LH1 is a gene encoding a tobacco magnesium keratase subunit lacking a chloroplast translocation signal, and means the promoter sequence of the lac pro lactose operon. Amp ^r is an ampicillin resistance gene, lac
^Iq represents a lactose operon repressor protein gene, and ori represents an origin of replication.

【図２】プラスミドpBITCHLHの制限酵素地図を示す。 T
CHLHは葉緑体移行シグナルを欠失したタバコのマグネシ
ウムケラターゼサブユニットをコードする遺伝子であ
り、 NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター配列
を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列
を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモー
ターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝
子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 2 shows a restriction map of plasmid pBITCHLH. T
CHLH is a gene encoding the tobacco magnesium keratase subunit lacking the chloroplast translocation signal, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the cauliflower It means 35S promoter of mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図３】プラスミドpNOの制限酵素地図を示す。 NPはノ
パリン合成酵素遺伝子のプロモーター配列を、NTはノパ
リン合成酵素遺伝子のターミネーター配列を、35Sはカ
リフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターを意味
する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、RB及びL
BはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 3 shows a restriction map of plasmid pNO. NP means the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT means the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S means the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII is a kanamycin resistance gene, RB and L
B represents the right and left border sequence of T-DNA.

【図４】プラスミドpNATPの制限酵素地図を示す。PPO(A
220V)は除草剤耐性変異(A220V)を持つＰＰＯ遺伝子であ
り、 NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター配列
を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列
を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモー
ターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝
子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 4 shows a restriction map of plasmid pNATP. PPO (A
(220V) is a PPO gene having a herbicide resistance mutation (A220V), NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus . NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図５】プラスミドpBIAPTCHの制限酵素地図を示す。 P
PO(A220V)は除草剤耐性変異(A220V)を持つＰＰＯ遺伝子
であり、TCHLHは葉緑体移行シグナルを欠失したタバコ
のマグネシウムケラターゼサブユニット遺伝子である。
NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター配列を、NT
はノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列を、35
Sはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターを
意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、RB
及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 5 shows a restriction map of plasmid pBIAPTCH. P
PO (A220V) is a PPO gene having a herbicide tolerance mutation (A220V), and TCHLH is a tobacco magnesium keratase subunit gene lacking a chloroplast translocation signal.
NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT
Is the nopaline synthase gene terminator sequence, 35
S means cauliflower mosaic virus 35S promoter. NPTII is a kanamycin resistance gene, RB
And LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図６】プラスミドpCRATFの制限酵素地図を示す。ATF
は葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝
子であり、lac proはラクトースオペロンのプロモータ
ー配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン耐性遺伝
子、Km^rはカナマイシン耐性遺伝子、oriは複製開始点を
表す。FIG. 6 shows a restriction map of plasmid pCRATF. ATF
Is a chloroplast-localized Arabidopsis ferrochelatase gene, and lac pro means a lactose operon promoter sequence. Amp ^r is an ampicillin resistance gene, Km ^r is a kanamycin resistance gene, and ori is a replication origin.

【図７】プラスミドpBIATFの制限酵素地図を示す。ATF
は葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケラターゼ遺伝
子であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター
配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター
配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロ
モーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性
遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 7 shows a restriction map of plasmid pBIATF. ATF
Is the chloroplast-located Arabidopsis ferrochelatase gene, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図８】プラスミドpBIAPATFの制限酵素地図を示す。 P
PO(A220V)は除草剤耐性変異(A220V)を持つＰＰＯ遺伝子
であり、ATFは葉緑体局在型のシロイヌナズナフェロケ
ラターゼ遺伝子である。NPはノパリン合成酵素遺伝子の
プロモーター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のタ
ーミネーター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィ
ルスの35Sプロモーターを意味する。また、NPTIIはカナ
マイシン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列
を表す。FIG. 8 shows a restriction map of plasmid pBIAPATF. P
PO (A220V) is a PPO gene having a herbicide tolerance mutation (A220V), and ATF is a chloroplast-localized Arabidopsis ferrokeratase gene. NP means the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT means the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S means the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図９】プラスミドpCRSCPOXの制限酵素地図を示す。SC
POXはダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダー
ゼ遺伝子であり、lac proはラクトースオペロンのプロ
モーター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン耐
性遺伝子、Km^rはカナマイシン耐性遺伝子、oriは複製開
始点を表す。FIG. 9 shows a restriction map of plasmid pCRSCPOX. SC
POX is the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene, and lac pro means the promoter sequence of the lactose operon. Amp ^r is an ampicillin resistance gene, Km ^r is a kanamycin resistance gene, and ori is a replication origin.

【図１０】プラスミドpBISCPOXの制限酵素地図を示す。
SCPOXはダイズのコプロポルフィリノーゲンIIIオキシ
ダーゼ遺伝子であり、 NPはノパリン合成酵素遺伝子の
プロモーター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のタ
ーミネーター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィ
ルスの35Sプロモーターを意味する。また、NPTIIはカナ
マイシン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列
を表す。FIG. 10 shows a restriction map of plasmid pBISCPOX.
SCPOX is the soybean coproporphyrinogen III oxidase gene, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図１１】プラスミドpBIAPSCPの制限酵素地図を示す。
PPO(A220V)は除草剤耐性変異(A220V)を持つＰＰＯ遺伝
子であり、SCPOXはダイズのコプロポルフィリノーゲンI
IIオキシダーゼ遺伝子である。NPはノパリン合成酵素遺
伝子のプロモーター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝
子のターミネーター配列を、35Sはカリフラワーモザイ
クウィルスの35Sプロモーターを意味する。また、NPTII
はカナマイシン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境
界配列を表す。FIG. 11 shows a restriction map of plasmid pBIAPSCP.
PPO (A220V) is a PPO gene with a herbicide tolerance mutation (A220V), and SCPOX is soybean coproporphyrinogen I
II oxidase gene. NP means the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT means the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S means the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. Also, NPTII
Indicates a kanamycin resistance gene, and RB and LB indicate left and right border sequences of T-DNA.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ０１Ｎ 43/30 Ａ０１Ｎ 43/30 43/38 43/38 43/40 １０１ 43/40 １０１Ｑ １０１Ａ 43/50 43/50 Ｑ 43/52 43/52 43/54 43/54 Ｆ 43/56 43/56 Ｄ 43/58 43/58 Ｃ 43/60 43/60 43/64 １０４ 43/64 １０４ 43/653 43/653 Ｑ 43/713 43/713 43/76 １０１ 43/76 １０１ 43/78 １０１ 43/78 １０１ 43/80 １０２ 43/80 １０２ 43/824 43/84 １０１ 43/84 １０１ １０２ １０２ 43/88 43/88 43/90 １０４ 43/90 １０４ Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/88 9/02 Ａ０１Ｎ 43/82 １０１Ｅ 9/88 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD10 4B024 AA08 BA07 BA08 BA79 BA80 CA04 DA01 EA05 FA02 FA07 GA11 HA20 4B050 CC03 DD09 LL10 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC10 AC20 BA02 CA24 CA28 CA53 4H011 AB01 AB03 BB04 BB06 BB08 BB09 BB10 DD03 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A01N 43/30 A01N 43/30 43/38 43/38 43/40 101 43/40 101Q 101A 43/50 43 / 50 Q 43/52 43/52 43/54 43/54 F 43/56 43/56 D 43/58 43/58 C 43/60 43/60 43/64 104 43/64 104 43/653 43/653 Q 43/713 43/713 43/76 101 43/76 101 43/78 101 43/78 101 43/80 102 43/80 102 43/824 43/84 101 43/84 101 102 102 43/88 43/88 43/90 104 43/90 104 C12N 9/02 C12N 5/10 9/88 9/02 A01N 43/82 101E 9/88 C12N 5/00 C 15/09 ZNA 15/00 ZNAA F-term (reference) 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD10 4B024 AA08 BA07 BA08 BA79 BA80 CA04 DA01 EA05 FA02 FA07 GA11 HA20 4B050 CC03 DD09 LL10 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC10 AC20 BA02 CA24 CA28 CA53 4H011 AB01 AB03 BB04 BB06 BB08 BB09 BB10 DD03

Claims (32)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】下記(1)および(2)の特性を有するプロトポ
ルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物であ
って、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。かつ、下記(3)、(4)および(5)の性質を有す
るタンパク質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺
伝子を発現する植物。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (4)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。1. A plant having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2), wherein (1) the natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant is substantially different. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. In addition, a plant which has a gene encoding a protein having the following properties (3), (4) and (5) introduced therein and expresses the gene. (3) It specifically binds to a substance related to the herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide. (4) The protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項２】遺伝子が、植物細胞で機能可能なプロモー
ターおよび植物細胞で機能可能なターミネーターと機能
可能な形で結合されてなる遺伝子である請求項１記載の
植物。2. The plant according to claim 1, wherein the gene is a gene operably linked to a promoter operable in plant cells and a terminator operable in plant cells. 【請求項３】タンパク質が、植物細胞内でプロトポルフ
ィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤の殺草活性発
現に関わる植物細胞内因性物質に特異的に結合する性質
を有するタンパク質である請求項１または２記載の植
物。3. The protein according to claim 1, wherein the protein has a property of specifically binding to a plant cell endogenous substance involved in expressing the herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide in a plant cell. 2. The plant according to 2. 【請求項４】プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ
阻害型除草剤が、下記(1)〜(3)のいずれかの化合物群の
中から選ばれる化合物を有効成分とする除草剤である請
求項1、２または3記載の植物。 （１）クロルメトキシニル、ビフェノックス、クロルニ
トロフェン(CNP)、アシフルオルフェン〔5-[2-クロロ-4
-(トリフルオロメチル)フェノキシ]-2-ニトロ安息香
酸〕およびそのエチルエステル、アシフルオルフェン-
ソディウム、オキシフルオルフェン〔2-クロロ-1-(3-エ
トキシ-4-ニトロフェノキシ)-4-トリフルオロメチルベ
ンゼン〕、オキサジアゾン〔3-[2,4-ジクロロ-5-(1-メ
チルエトキシ)フェニル]-5-(1,1-ジメチルエチル)-1,3,
4-オキサジアゾール-2 (3H)-オン〕、S-23142〔2-[4-ク
ロロ-2-フルオロ-5-(プロップ-2-イニロキシ)フェニル]
-2,3,4,5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジ
オン〕、クロロフタリム〔N-(4-クロロフェニル)-3,4,
5,6-テトラヒドロフタルイミド〕、 TNPP-エチル〔エチ
ル2-[1-(2,3,4-トリクロロフェニル)-4-ニトロピラゾリ
ル-5-オキシ]プロピオネート〕、LS82-556〔N3-(1-フェ
ニルエチル)-2,6-ジメチル-5-プロピオニルニコチンア
ミド〕 （２）一般式Ｉで示される化合物 Ｊ−Ｇ (一般式I) ここで、Ｇは下記のＧ−1〜9で示される基、Ｊは下記の
Ｊ−1〜30で示される基である。 ここで、式 J-5、J-6、J-12 および J-24 における破線
は、左側の環が一重結合のみを含むことまたは環内のひ
とつの結合が炭素原子間の二重結合であることを表し、
X は酸素原子または硫黄原子を表し、Y は酸素原子また
は硫黄原子を表し、R¹ は水素原子またはハロゲン原子
を表し、R² は水素原子、C₁-C₈ アルキル基、C₁-C₈ ハ
ロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、-OR²⁷ 基、-SH
基、-S(O)pR²⁷ 基、-COR²⁷ 基、-CO₂R²⁷ 基、-C(O)SR²⁷
基、-C(O)NR²⁹R³⁰ 基、-CHO 基、-CR²⁷=NOR³⁶ 基、-CH=
CR³⁷CO₂R²⁷ 基、-CH₂CHR ³⁷CO₂R²⁷ 基、-CO₂N=CR³¹R³²
基、ニトロ基、シアノ基、-NHSO₂R³³ 基、-NHSO₂NHR³³
基、-NR²⁷R³⁸ 基、-NH₂ 基、または、1つ以上の同種も
しくは異種の C1-C4アルキル基で置換されていてもよい
フェニル基を表し、p は 0、1 または 2 を表し、R³ は
C₁-C₂ アルキル基、C₁-C₂ ハロアルキル基、-OCH₃
基、-SCH₃ 基、-OCHF₂基、ハロゲン原子、シアノ基、ま
たはニトロ基を表し、R⁴ は水素原子、C₁-C₃ アルキル
基、C₁-C₃ ハロアルキル基、またはハロゲン原子を表
し、R⁵ は水素原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロゲン原
子、C₁-C₃ ハロアルキル基、シクロプロピル基、ビニル
基、C₂ アルキニル基、シアノ基、-C(O)R³⁸ 基、-CO₂R^3
8 基、-C(O)NR³⁸R³⁹ 基、-CR³⁴R³⁵CN 基、-CR³⁴R³⁵C(O)
R³⁸ 基、-CR³⁴R³⁵CO₂R³⁸基、-CR³⁴R³⁵C(O)NR³⁸R³⁹ 基、
-CHR³⁴OH 基、-CHR³⁴OC(O)R³⁸ 基、または -OCHR³⁴OC
(O)NR³⁸R³⁹ 基を表すか、あるいは、G が G-2 もしくは
G-6 の場合に R⁴とR⁵とはこれらが結合している炭素原
子とで C=O 基を表していてもよく、R⁶ は C₁-C₆ アル
キル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₂-C₆ アルコキシアル
キル基、C₃-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ アルキニ
ル基を表し、X¹ は直接結合、酸素原子、硫黄原子、-NH
基、-N(C₁-C₃ アルキル)基、-N(C₁-C₃ハロアルキル)
基、または -N(アリル)基を表し、R⁷ は水素原子、C₁-C
₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、ハロゲン原子、
-S(O)₂(C₁-C₆アルキル)基、または -C(=O)R⁴⁰ 基を表
し、R⁸ は水素原子、C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈ シクロ
アルキル基、C₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキニル
基、C₁-C₈ ハロアルキル基、C₂-C₈ アルコキシアルキル
基、C₃-C₈ アルコキシアルコキシアルキル基、C₃-C₈ ハ
ロアルキニル基、C₃-C₈ハロアルケニル基、C₁-C₈ アル
キルスルホニル基、C₁-C₈ ハロアルキルスルホニル基、
C₃-C₈ アルコキシカルボニルアルキル基、-S(O)₂NH(C₁-
C₈ アルキル)基、-C(O)R⁴¹ 基、またはフェニル環上で
R⁴² で置換されていてもよいベンジル基を表し、n およ
び m はそれぞれ独立して 0、1、2 または 3 であり、
かつ m + n が2または3を表し、Z は -CR⁹R¹⁰ 基、酸素
原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂ 基、または -N(C₁-
C ₄ アルキル)基を表し、それぞれの R⁹ は独立して水素
原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C
₆ ハロアルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニルオキシ
基、または C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオキシ基を
表し、それぞれの R¹⁰ は独立して水素原子、C₁-C₃ ア
ルキル基、ヒドロキシ基、またはハロゲン原子を表し、
R¹¹ および R¹² はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲ
ン原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、また
は C₁-C₆ ハロアルキル基を表し、R¹³ は水素原子、C₁-
C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケ
ニル基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₃-C₆ ハロアルキニル基、HC(=0)基、(C₁-C₄ アル
キル)C(=O) 基、または -NH₂ 基を表し、R¹⁴ は C₁-C₆
アルキル基、C₁-C₆ アルキルチオ基、C₁-C₆ ハロアルキ
ル基、または -N(CH₃)₂ 基を表し、W は窒素原子または
-CR¹⁵ 基を表し、R¹⁵ は水素原子、C₁-C₆ アルキル
基、ハロゲン原子、または、C₁-C₆ アルキル基、1 ない
し 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基もしくは
-CF₃ 基で置換されていてもよいフェニル基を表し、そ
れぞれの Q は独立して酸素原子または硫黄原子を表
し、Q¹ は酸素原子または硫黄原子を表し、Z¹ は -CR¹⁶
R¹⁷ 基、酸素原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂ 基、
または -N(C₁-C₄ アルキル)基を表し、それぞれの R¹⁶
は独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、C₁
-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C₆ ハロ
アルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニルオキシ基、ま
たは C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオキシ基を表し、
それぞれの R¹⁷ は独立して水素原子、ヒドロキシ基、
または ハロゲン原子を表し、R¹⁸ は C₁-C₆ アルキル
基、ハロゲン原子、または C₁-C₆ ハロアルキル基を表
し、R¹⁹ および R²⁰ はそれぞれ独立して水素原子、C₁-
C₆ アルキル基、または C₁-C ₆ ハロアルキル基を表し、
Z² は酸素原子、硫黄原子、-NR⁹ 基、または -CR⁹R¹⁰
基を表し、R²¹ および R²² はそれぞれ独立して C₁-C₆
アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル
基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ アルキニル基、ま
たはC₃-C₆ ハロアルキニル基を表し、R²³ は水素原子、
ハロゲン原子、またはシアノ基を表し、R²⁴ は C₁-C₆
アルキルスルフォニル基、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハ
ロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ハロアルコキシ基、ま
たはハロゲン原子を表し、R²⁵ は C₁-C₆ アルキル基、C
₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、または C₃
-C₆ アルキニル基を表し、R²⁶ は C₁-C₆ アルキル基、C
₁-C₆ ハロアルキル基、または、環上で C₁-C₆ アルキル
基、1 ないし 2 個のハロゲン原子、1 ないし 2 個のニ
トロ基、C₁-C₆ アルコキシ基、および CF₃ 基からなる
グループの中から選択される置換基で置換されていても
よいフェニル基を表し、W¹ は窒素原子または CH 基を
表し、T は下記の一般式T-1、T-2、またはT-3 のいずれ
かの基を表し、 （式中、E¹、E²、E³、E⁴、E⁵、E⁶、E⁷、E⁸、E⁹、E¹⁰、E
¹¹、E¹² はそれぞれ水素原子または C₁-C₃ アルキル基
を表す。） R²⁷ は C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈ シクロアルキル基、C
₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキニル基、C₁-C₈ ハロ
アルキル基、C₂-C₈ アルコキシアルキル基、C₂-C₈アル
キルチオアルキル基、C₂-C₈ アルキルスルフィニルアル
キル基、C₂-C₈ アルキルスルフォニルアルキル基、C₁-C
₈ アルキルスルフォニル基、フェニル環上でハロゲン原
子および C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から
選択される少なくともひとつの置換基で置換されていて
もよいフェニルスルフォニル基、C₄-C₈ アルコキシアル
コキシアルキル基、C₄-C₈ シクロアルキルアルキル基、
C₆-C₈ シクロアルコキシアルキル基、C₄-C₈ アルケニル
オキシアルキル基、C₄-C₈アルキニルオキシアルキル
基、C₃-C₈ ハロアルコキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアル
ケニルオキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアルキニルオキシ
アルキル基、C₆-C₈ シクロアルキルチオアルキル基、C₄
-C₈ アルケニルチオアルキル基、C₄-C₈ アルキニルチオ
アルキル基、環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基お
よび C₁-C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から
選択される少なくともひとつの置換基で置換されていて
もよいフェノキシ基で置換された C₁-C₄ アルキル基、
環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-C₃
ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少
なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジ
ルオキシ基で置換されたC₁-C₄ アルキル基、C₄-C₈トリ
アルキルシリルアルキル基、C₃-C₈ シアノアルキル基、
C₃-C₈ ハロシクロアルキル基、C₃-C₈ ハロアルケニル
基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル基、C₅-C₈ ハロアルコ
キシアルキニル基、C₅-C₈ アルキルチオアルケニル基、
C₃-C₈ ハロアルキニル基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル
基、C₅-C₈ ハロアルコキシアルキニル基、C₅-C₈ アルキ
ルチオアルキニル基、C₂-C₈ アルキルカルボニル基、環
上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-C₃ ハ
ロアルキル基からなるグループの中から選択される少な
くともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル
基、-CHR³⁴COR²⁸ 基、-CHR³⁴COOR²⁸ 基、-CHR³⁴P(O)(OR
²⁸)₂ 基、-CHR³⁴P(S)(OR²⁸)₂基、-CHR³⁴C(O)NR²⁹R³⁰
基、または -CHR³⁴C(O)NH₂ 基を表し、R²⁸ は C₁-C₆ ア
ルキル基、C₂-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル基、
またはテトラヒドロフラニル基を表し、R²⁹ および R³¹
は独立して水素原子、または C₁-C₄ アルキル基を表
し、R³⁰ および R³² は独立して C₁-C₄ アルキル基、ま
たは環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-
C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から選択され
る少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフ
ェニル基を表し、あるいは、R²⁹と R³⁰とで -(CH₂)₅-、
-(CH₂)₄-、または -CH₂CH₂OCH₂CH₂- を表していてもよ
く、このようにして形成されるそれぞれの環では、 C₁-
C₃ アルキル基、フェニル基およびベンジル基からなる
グループの中から選択される置換基で置換されていても
よい、あるいは、R³¹と R³²とはこれらが結合している
炭素原子とで C₃-C₈ シクロアルキル基を表していても
よく、R³³ は C₁-C₄ アルキル基、C₁-C₄ ハロアルキル
基、または C₃-C₆ アルケニル基を表し、R³⁴ および R
³⁵ は独立して水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表
し、R³⁶ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケ
ニル基、または C₃-C₆ アルキニル基を表し、R³⁷ は水
素原子、C₁-C₄ アルキル基、またはハロゲン原子を表
し、R³⁸ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ シクロ
アルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₂-C₆ アルコキシアルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル
基、環上でハロゲン原子、C₁-C₄ アルキル基および C₁-
C₄ アルコキシ基からなるグループの中から選択される
少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェ
ニル基、-CH₂CO₂(C₁-C₄ アルキル)基、または -CH(CH₃)
CO₂(C₁-C₄ アルキル)基を表し、R³⁹ は水素原子、C₁-C₂
アルキル基、または C(O)O(C₁-C₄ アルキル)基を表
し、R⁴⁰ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ アルコ
キシ基、または NH(C₁-C₆ アルキル)基を表し、R⁴¹ は
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C₆ アル
コキシ基、NH(C₁-C₆ アルキル)基、R⁴² 基で置換されて
いてもよいフェニル基、ベンジル基、または C₂-C₈ ジ
アルキルアミノ基を表し、R⁴² は C₁-C₆ アルキル基、1
ないし 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基、ま
たは CF₃ 基を表す。 (3)一般式IIで示される化合物およびニピラクロフェン 一般式(II) ここで、R⁴³ は C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁴⁴ は C₁-C
₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルキルチオ基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基、 C₁-C₄ハロアルキル基、 C₁-C₄ ハロアルキル
チオ基、または C₁-C₄ ハロアルコキシ基を表し、ある
いは、R⁴³ とR⁴⁴とで-(CH₂)₃- または -(CH₂)₄- を表し
ていてもよく、R⁴⁵ は水素原子またはハロゲン原子を表
し、R⁴⁶ は水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁴⁷ は水素原子、ニトロ基、シアノ基、-COOR⁴⁹ 基、-C
(=X)NR⁵⁰R⁵¹ 基、または-C(=X²)R⁵² 基を表し、R⁴⁸ は
水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ハロゲン原子およ
び水酸基からなるグループの中から選択される少なくと
もひとつの置換基で置換されていてもよいC₁-C₄ アルキ
ル基、 C₁-C₄ アルコキシ基、環上でハロゲン原子、ニ
トロ基、シアノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基およびハロ-C₁-C₄ アルキル基からなるグループ
の中から選択される少なくともひとつの置換基で置換さ
れていてもよいフェニル基、ピローリル基、 C₂-C₈ ア
ルキル基、 C₃-C₈ アルケニル基、 C₃-C₈ アルキニル
基、 C₃-C₈ アルコキシ基、（該C₂-C₈ アルキル基、該
C ₃-C₈ アルケニル基、 該C₃-C₈ アルキニル基および 該
C₃-C₈ アルコキシ基には少なくともひとつ以上の酸素原
子が挿入されていてもよい）、または以下に示す基を表
し、 R⁴⁹ R⁵⁰ およびR⁵¹ は同じであっても異なってもよく、
水素原子または C₁-C₄アルキル基を表し、あるいは、R
⁵⁰ とR⁵¹とはこれらが結合する窒素原子とで5員もしく
は6員の飽和した環を形成していてもよい、R⁵² は水素
原子、 C₁-C₄ アルキル基、または少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換された C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁵³ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニ
ル基、 C₃-C₆ アルキニル基、フェニル基（該 C₁-C₄ ア
ルキル基、該 C₂-C₆ アルケニル基、該C₃-C₆ アルキニ
ル基、および該フェニル基はハロゲン原子で置換されて
いてもよい）、 C ₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチ
ル基、または R⁶³CO-基を表し、R⁵⁴ は水素原子、ハロ
ゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₆ アルキル基、
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₂-C₆ アルケニ
ル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい C₃-C₆ ア
ルキニル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェ
ニル基、 C₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチル基、
C₁-C₄ アルコキシ C ₁-C₆ アルキル基、 ジ C₁-C₄ アル
キルアミノ C₁-C₄ アルキル基、テトラヒドロフルフリ
ルメチル基、 C₃-C₆ アルキニルオキシ C₁-C₄ アルキル
基、ベンジル基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シア
ノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基および
ハロ C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から選択
される置換基で置換されていてもよいベンジル基、-C(=
X²)R⁶³基、-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁰ 基、-(CH₂)_a-O-(CH₂)_b-R
⁷⁰ 基、または-(CH₂)_a-X²-R⁷⁶基を表し、あるいは、R⁵³
とR⁵⁴とはこれらが結合している窒素原子とで、3員、5
員もしくは6員の飽和した環または5員もしくは6員の芳
香環（該飽和した環および該芳香環においては1つの炭
素原子が1つの酸素原子で置換されていてもよい）を形
成していてもよい、R⁵⁵ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ アルキニル基
を表し、あるいはR⁵⁵ とR⁵⁶ とで-(CH₂)_e-基を形成して
いてもよい、R⁵⁶ とR⁵⁷ はそれぞれ C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基もしく
はフェニル基（該C₁-C₄ アルキル基、 該C₂-C₆ アルケ
ニル基、該C₃-C₆ アルキニル基および該フェニル基はハ
ロゲン原子で置換されていてもよい）、 水素原子、 C₃
-C₆ シクロアルキル基、-X²R⁶⁰ 基、または-NR⁶¹R⁶²基
を表し、R⁵⁸ は水素原子、 C₁-C₆ アルキル基、 C₂-C₆
アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基、 C₁-C₄ アルキル
カルボニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ アル
コキシカルボニル C₁-C₄ アルキル基、ジ C₁-C₄ アルコ
キシカルボニル C₁-C₄アルキル基、ベンジル基、 C₁-C₄
アルコキシ- C₁-C₄アルキニル基、-(CH₂)_a-R⁷⁵基、-(CH
₂)_a-X²-R⁷²基、-(CH₂)_a-X²-(CH₂)_b-R⁷²基、または-(C
H₂)_a-X²-(CH₂)_b-X ²-(CH₂)_c-R⁷²基を表し、R⁵⁹ は水素原
子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆
アルキニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルカルボニル C₁-C₃ アルキル基、またはフェニル
基を表し、R⁶⁰ は少なくとも1つのハロゲン原子で置換
されていてもよい C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶¹ とR⁶²
は同じであっても異なってもよく、水素原子、または
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶³ は少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₄ アルキル
基、 C₁-C₄ アルコシキ C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルチオ C₁-C₄ アルキル基、 C₃-C₆ シクロアルキル
基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、 C₁-C₄
アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基およびハロ C₁-C₄
アルキル基からなるグループの中から選択されるひとつ
の置換基で置換されていてもよいフェニル基、-NR⁷³R⁷⁴
基、または-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁵基を表し、R⁶⁴ は C₁-C₄
アルコキシカルボニル基、またはカルボキシル基を表
し、R⁶⁵ はクロロメチル基、シアノメチル基、少なくと
も1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆ シ
クロアルキル基、または C₁-C₄ アルコキシカルボニル
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁶ は水酸基、または-NR⁶⁷R
⁶⁸を表し、A は -NR⁶⁷R⁶⁸、または -S(O)_f-R⁶⁹基を表
し、R⁶⁷ とR⁶⁸ は同じであっても異なってもよく、水素
原子、または C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁹ は C₁-C₄
アルキル基、または C₁-C₄ ハロアルキル基を表し、R⁷⁰
は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、少なくとも1つ以
上の C₁-C₄ アルコキシ基で置換されていてもよい C₁-C
₄ アルキル基、少なくとも1つ以上の酸素原子が挿入さ
れていてもよい C₃-C₆シクロアルキル基、1もしくは2個
のメチル基で置換されていてもよい C₃-C₆シクロアルキ
ル基、フリル基、チエニル基、または -C(=O)R⁷¹基を表
し、R⁷¹ とR⁷² は同じであっても異なってもよく、 C₁-
C₄ アルキル基、または C₁-C ₄ アルコキシ基を表し、R
⁷³ とR⁷⁴ は同じであっても異なってもよく、 C₁-C₄ ア
ルキル基、またはフェニル基を表し、R⁷⁵ は少なくとも
1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆シク
ロアルキル基、1もしくは2個のメチル基で置換されてい
てもよい C₃-C₆シクロアルキル基、フリル基、チエニル
基、または -C(=O)R⁷¹基を表し、R⁷⁶ は C₁-C₄ アルキ
ル基を表し、a、b、およびc はそれぞれ独立して1、2、
または3を表し、d は0または1を表し、e は2または3を
表し、f は1または2を表し、X² は酸素原子または硫黄
原子を表す。4. A protoporphyrinogen IX oxidase
Inhibition type herbicide is a compound of any of the following (1) to (3)
A herbicide containing a compound selected from the group
The plant according to claim 1, 2, or 3. (1) Chlormethoxynil, bifenox, chlorni
Trophen (CNP), acifluorfen [5- [2-chloro-4
-(Trifluoromethyl) phenoxy] -2-nitrobenzoate
Acid] and its ethyl ester, acifluorfen
Sodium, oxyfluorfen [2-chloro-1- (3-E
(Toxi-4-nitrophenoxy) -4-trifluoromethylbe
Benzene), oxadiazone (3- [2,4-dichloro-5- (1-
Tylethoxy) phenyl] -5- (1,1-dimethylethyl) -1,3,
4-oxadiazole-2 (3H) -one], S-23142 [2- [4-
Loro-2-fluoro-5- (prop-2-iniloxy) phenyl]
-2,3,4,5,6,7-Hexahydro-1H-isoindole-1,3-di
On), chlorophthalim (N- (4-chlorophenyl) -3,4,
5,6-tetrahydrophthalimide), TNPP-ethyl (ethyl
2- [1- (2,3,4-trichlorophenyl) -4-nitropyrazoli
-5-oxy] propionate], LS82-556 [N3- (1-Fe
Nylethyl) -2,6-dimethyl-5-propionylnicotinia
Mido] (2) Compound JG represented by general formula I (general formula I) where G is a group represented by the following G-1 to 9;
Groups represented by J-1 to 30. Where the dashed lines in equations J-5, J-6, J-12 and J-24
Indicates that the ring on the left contains only a single bond or
Represents that one bond is a double bond between carbon atoms,
X represents an oxygen atom or a sulfur atom; Y represents an oxygen atom or
Represents a sulfur atom; R¹ Is a hydrogen atom or a halogen atom
And R^Two Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl group, C₁-C₈ C
Roalkyl group, halogen atom, hydroxyl group, -OR²⁷ Group, -SH
Group, -S (O) pR²⁷ Group, -COR²⁷ Group, -CO_TwoR²⁷ Group, -C (O) SR²⁷
Group, -C (O) NR²⁹R³⁰ Group, -CHO group, -CR²⁷= NOR³⁶ Group, -CH =
CR³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -CH_TwoCHR ³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -CO_TwoN = CR³¹R³² 
Group, nitro group, cyano group, -NHSO_TwoR³³ Group, -NHSO_TwoNHR³³ 
Group, -NR²⁷R³⁸ Group, -NH_Two Group or one or more of the same species
Or different C1-C4 alkyl groups
Represents a phenyl group, p represents 0, 1 or 2;^Three Is
 C₁-C_Two Alkyl group, C₁-C_Two Haloalkyl group, -OCH_Three 
Group, -SCH_Three Group, -OCHF_TwoGroup, halogen atom, cyano group,
Or a nitro group, R^Four Is a hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl
Group, C₁-C_Three Shows haloalkyl group or halogen atom
Then R^Five Is a hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl group, halogen source
Child, C₁-C_Three Haloalkyl group, cyclopropyl group, vinyl
Group, C_Two Alkynyl group, cyano group, -C (O) R³⁸ Group, -CO_TwoR^Three
8 Group, -C (O) NR³⁸R³⁹ Group, -CR³⁴R³⁵CN group, -CR³⁴R³⁵C (O)
R³⁸ Group, -CR³⁴R³⁵CO_TwoR³⁸Group, -CR³⁴R³⁵C (O) NR³⁸R³⁹ Group,
-CHR³⁴OH group, -CHR³⁴OC (O) R³⁸ Group, or -OCHR³⁴OC
(O) NR³⁸R³⁹ Represents a group, or G is G-2 or
 R for G-6^FourAnd R^FiveIs the carbon source to which they are attached
And a child may represent a C = O group;⁶ Is C₁-C₆ Al
Kill group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Two-C₆ Alkoxyal
Kill group, C_Three-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ Alkini
X¹ Is a direct bond, an oxygen atom, a sulfur atom, -NH
Group, -N (C₁-C_Three Alkyl) group, -N (C₁-C_ThreeHaloalkyl)
Group, or -N (allyl) group, R⁷ Is a hydrogen atom, C₁-C
₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, halogen atom,
-S (O)_Two(C₁-C₆Alkyl) group, or -C (= O) R⁴⁰ Table
Then R⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ Cyclo
Alkyl group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl
Group, C₁-C₈ Haloalkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyalkyl
Group, C_Three-C₈ Alkoxyalkoxyalkyl group, C_Three-C₈ C
Loalkynyl group, C_Three-C₈Haloalkenyl group, C₁-C₈ Al
Killsulfonyl group, C₁-C₈ Haloalkylsulfonyl group,
C_Three-C₈ Alkoxycarbonylalkyl group, -S (O)_TwoNH (C₁-
C₈ Alkyl) group, -C (O) R⁴¹ Group, or on the phenyl ring
R⁴² Represents a benzyl group which may be substituted with n and n and
And m are each independently 0, 1, 2 or 3;
And m + n represents 2 or 3, and Z is -CR⁹R^Ten Group, oxygen
Atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two Group, or -N (C₁-
C _Four Alkyl) group, each R⁹ Is independently hydrogen
Atom, C₁-C_Three Alkyl group, halogen atom, hydroxy
Group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C
₆ Haloalkoxy group, C_Two-C₆ Alkylcarbonyloxy
Group or C_Two-C₆ A haloalkylcarbonyloxy group
Represent each R^Ten Is independently a hydrogen atom, C₁-C_Three A
Represents a alkyl group, a hydroxy group, or a halogen atom,
R¹¹ And R¹² Are each independently a hydrogen atom, halogen
Atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl groups, also
Is C₁-C₆ Represents a haloalkyl group, R¹³ Is a hydrogen atom, C₁-
C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Arche
Nyl group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C_Three-C₆ Haloalkynyl group, HC (= 0) group, (C₁-C_Four Al
Kill) C (= O) group, or -NH_Two Represents a group, R¹⁴ Is C₁-C₆ 
Alkyl group, C₁-C₆ Alkylthio group, C₁-C₆ Haloalk
Or -N (CH_Three)_Two W represents a nitrogen atom or
 -CR^Fifteen Represents a group, R^Fifteen Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl
Group, halogen atom, or C₁-C₆ No alkyl group, 1
And two halogen atoms, C₁-C₆ An alkoxy group or
-CF_Three Represents a phenyl group which may be substituted with
Each Q independently represents an oxygen or sulfur atom
Then Q¹ Represents an oxygen atom or a sulfur atom; Z¹ Is -CR¹⁶
R¹⁷ Group, oxygen atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two Group,
Or -N (C₁-C_Four Alkyl) group, each R¹⁶ 
Is independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, C₁
-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C₆ Halo
Alkoxy group, C_Two-C₆ An alkylcarbonyloxy group,
Or C_Two-C₆ Represents a haloalkylcarbonyloxy group,
Each R¹⁷ Is independently a hydrogen atom, a hydroxy group,
Or represents a halogen atom, R¹⁸ Is C₁-C₆ Alkyl
Group, halogen atom, or C₁-C₆ Table showing haloalkyl groups
Then R¹⁹ And R²⁰ Are each independently a hydrogen atom, C₁-
C₆ Alkyl group, or C₁-C ₆ Represents a haloalkyl group,
Z^Two Is an oxygen atom, a sulfur atom, -NR⁹ Group, or -CR⁹R^Ten 
Represents a group, R^{twenty one} And R^{twenty two} Are each independently C₁-C₆ 
Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl
Group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group
Or C_Three-C₆ Represents a haloalkynyl group, R^{twenty three} Is a hydrogen atom,
Represents a halogen atom or a cyano group, R^{twenty four} Is C₁-C₆ 
Alkylsulfonyl group, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ C
Loalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆Haloalkoxy groups
Or a halogen atom, R^{twenty five} Is C₁-C₆ Alkyl group, C
₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, or C_Three
-C₆ Represents an alkynyl group, R²⁶ Is C₁-C₆ Alkyl group, C
₁-C₆ Haloalkyl group or C on the ring₁-C₆ Alkyl
Group, one or two halogen atoms, one or two
Toro group, C₁-C₆ Alkoxy group, and CF_Three Consisting of
Even if substituted with a substituent selected from the group
Represents a good phenyl group, W¹ Represents a nitrogen atom or a CH group
And T is any of the following general formulas T-1, T-2, or T-3
Represents a group of(Where E¹, E^Two, E^Three, E^Four, E^Five, E⁶, E⁷, E⁸, E⁹, E^Ten, E
¹¹, E¹² Is a hydrogen atom or C₁-C_Three Alkyl group
Represents ) R²⁷ Is C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, C
_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl group, C₁-C₈ Halo
Alkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyalkyl group, C_Two-C₈Al
Quilthioalkyl group, C_Two-C₈ Alkylsulfinyl al
Kill group, C_Two-C₈ Alkylsulfonylalkyl group, C₁-C
₈ Alkyl sulfonyl group, halogen source on phenyl ring
Child and C₁-C_Four From the group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one selected substituent
Phenylsulfonyl group, C_Four-C₈ Alkoxyal
Coxyalkyl group, C_Four-C₈ Cycloalkylalkyl group,
C₆-C₈ Cycloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Alkenyl
Oxyalkyl group, C_Four-C₈Alkynyloxyalkyl
Group, C_Three-C₈ Haloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Haloal
Kenyloxyalkyl group, C_Four-C₈ Haloalkynyloxy
Alkyl group, C₆-C₈ Cycloalkylthioalkyl group, C_Four
-C₈ Alkenylthioalkyl group, C_Four-C₈ Alkynylthio
Alkyl group, halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group
And C₁-C_Three From the group consisting of haloalkyl groups
Substituted with at least one selected substituent
Substituted with a good phenoxy group₁-C_Four Alkyl group,
Halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-C_Three 
Selected from the group consisting of haloalkyl groups
Benzy optionally substituted with at least one substituent
C substituted with a ruoxy group₁-C_Four Alkyl group, C_Four-C₈bird
Alkylsilylalkyl group, C_Three-C₈ Cyanoalkyl group,
C_Three-C₈ Halocycloalkyl group, C_Three-C₈ Haloalkenyl
Group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Halo alco
Xylalkynyl group, C_Five-C₈ Alkylthioalkenyl group,
C_Three-C₈ Haloalkynyl group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl
Group, C_Five-C₈ Haloalkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Archi
Luthioalkynyl group, C_Two-C₈ Alkylcarbonyl group, ring
A halogen atom, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-C_Three C
Selected from the group consisting of
Benzyl optionally substituted with at least one substituent
Group, -CHR³⁴COR²⁸ Group, -CHR³⁴COOR²⁸ Group, -CHR³⁴P (O) (OR
²⁸)_Two Group, -CHR³⁴P (S) (OR²⁸)_TwoGroup, -CHR³⁴C (O) NR²⁹R³⁰ 
Group, or -CHR³⁴C (O) NH_Two Represents a group, R²⁸ Is C₁-C₆ A
Lucyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group,
Or a tetrahydrofuranyl group, R²⁹ And R³¹
 Is independently a hydrogen atom, or C₁-C_Four Table showing alkyl groups
Then R³⁰ And R³² Is independently C₁-C_Four Alkyl group
Or a halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-
C_Three Selected from the group consisting of haloalkyl groups
A group optionally substituted with at least one substituent
Represents a phenyl group, or R²⁹And R³⁰And in-(CH_Two)_Five-,
-(CH_Two)_Four-Or -CH_TwoCH_TwoOCH_TwoCH_Two-May be represented
In each ring thus formed, C₁-
C_Three Consists of alkyl, phenyl and benzyl groups
Even if substituted with a substituent selected from the group
Good or R³¹And R³²And these are combined
C with carbon atoms_Three-C₈ Even if it represents a cycloalkyl group
Well, R³³ Is C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Group or C_Three-C₆ Represents an alkenyl group, R³⁴ And R
³⁵ Is independently a hydrogen atom or C₁-C_Four Table showing alkyl groups
Then R³⁶ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Arche
Nyl group, or C_Three-C₆ Represents an alkynyl group, R³⁷ Is water
Elementary atom, C₁-C_Four Displays an alkyl group or halogen atom
Then R³⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Cyclo
Alkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C_Two-C₆ Alkoxyalkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl
Group, halogen atom on the ring, C₁-C_Four Alkyl group and C₁-
C_Four Selected from the group consisting of alkoxy groups
Fe which may be substituted with at least one substituent
Nyl group, -CH_TwoCO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, or -CH (CH_Three)
CO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, R³⁹ Is a hydrogen atom, C₁-C_Two
 Alkyl group or C (O) O (C₁-C_Four Alkyl) group
Then R⁴⁰ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Arco
Xyl group, or NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴¹ Is
C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C₆ Al
Coxy group, NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴² Substituted with a group
Optionally phenyl, benzyl, or C_Two-C₈ The
Represents an alkylamino group, R⁴² Is C₁-C₆ Alkyl group, 1
 Or two halogen atoms, C₁-C₆ An alkoxy group
Or CF_Three Represents a group. (3) a compound represented by the general formula II and nipyraclofen general formula (II)Where R⁴³ Is C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁴⁴ Is C₁-C
_Four Alkyl group, C₁-C_Four Alkylthio group, C₁-C_Four Arco
Xyl group, C₁-C_FourHaloalkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Thio group, or C₁-C_Four Represents a haloalkoxy group;
Well, R⁴³ And R⁴⁴And in-(CH_Two)_Three-Or- (CH_Two)_Four-Represents
May be R⁴⁵ Represents a hydrogen atom or a halogen atom
Then R⁴⁶ Is a hydrogen atom or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁴⁷ Is hydrogen atom, nitro group, cyano group, -COOR⁴⁹ Group, -C
(= X) NR⁵⁰R⁵¹ Group, or -C (= X^Two) R⁵² Represents a group, R⁴⁸ Is
Hydrogen atom, halogen atom, cyano group, halogen atom and
At least selected from the group consisting of
May also be substituted with one substituent₁-C_Four Archi
Group, C₁-C_Four An alkoxy group, a halogen atom on the ring,
Toro, cyano, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Arco
Xy group and halo-C₁-C_Four Group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one substituent selected from
Optionally substituted phenyl, pyrrolyl, C_Two-C₈ A
Ruquil group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl
Group, C_Three-C₈ An alkoxy group, (the C_Two-C₈ An alkyl group,
C _Three-C₈ An alkenyl group, the C_Three-C₈ An alkynyl group and
C_Three-C₈ An alkoxy group contains at least one oxygen source
Or a group shown below.
AndR⁴⁹ R⁵⁰ And R⁵¹ May be the same or different,
Hydrogen atom or C₁-C_FourRepresents an alkyl group, or R
⁵⁰ And R⁵¹Is a 5-member or a nitrogen atom to which these bind
May form a 6-membered saturated ring, R⁵² Is hydrogen
Atom, C₁-C_Four An alkyl group, or at least one or more
C substituted with a halogen atom₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁵³ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkene
Group, C_Three-C₆ Alkynyl group, phenyl group (C₁-C_Four A
Alkyl group, the C_Two-C₆ Alkenyl group, the C_Three-C₆ Alkini
And the phenyl group is substituted with a halogen atom.
May be present), C _Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethy
Or R⁶³Represents a CO- group, R⁵⁴ Is a hydrogen atom, halo
C optionally substituted with a gen atom₁-C₆ Alkyl group,
C optionally substituted with a halogen atom_Two-C₆ Alkene
C, which may be substituted with_Three-C₆ A
Alkynyl group,
Nyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethyl group,
C₁-C_Four Alkoxy C ₁-C₆ Alkyl group, di C₁-C_Four Al
Killamino C₁-C_Four Alkyl group, tetrahydrofurfury
Methyl group, C_Three-C₆ Alkynyloxy C₁-C_Four Alkyl
Group, benzyl group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano
No group, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four An alkoxy group and
Halo C₁-C_Four Select from groups consisting of alkyl groups
Benzyl group which may be substituted with a substituent represented by -C (=
X^Two) R⁶³Group,-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁰ Group,-(CH_Two)_a-O- (CH_Two)_b-R
⁷⁰ Group, or-(CH_Two)_a-X^Two-R⁷⁶Represents a group, or R⁵³
 And R⁵⁴Is the nitrogen atom to which they are attached, 3 members, 5 members
6 or 6 membered saturated ring or 5 or 6 membered ring
Aromatic ring (in the saturated ring and the aromatic ring, one carbon
Element atom may be replaced by one oxygen atom)
May be formed, R⁵⁵ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ Alkynyl group
Or R⁵⁵ And R⁵⁶ And in-(CH_Two)_e-Form a group
May be, R⁵⁶ And R⁵⁷ Is C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group or
Is a phenyl group (the C₁-C_Four An alkyl group, the C_Two-C₆ Arche
Nyl group, the C_Three-C₆ An alkynyl group and the phenyl group are
Hydrogen atom, C_Three
-C₆ Cycloalkyl group, -X^TwoR⁶⁰ Group, or -NR⁶¹R⁶²Base
And R⁵⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Two-C₆ 
Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group, C₁-C_Four Alkyl
Carbonyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four Al
Coxycarbonyl C₁-C_Four Alkyl group, di C₁-C_Four Arco
Xycarbonyl C₁-C_FourAlkyl group, benzyl group, C₁-C_Four
Alkoxy-C₁-C_FourAlkynyl group,-(CH_Two)_a-R⁷⁵Group,-(CH
_Two)_a-X^Two-R⁷²Group,-(CH_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-R⁷²Group, or-(C
H_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-X ^Two-(CH_Two)_c-R⁷²Represents a group, R⁵⁹ Is hydrogen field
Child, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆
 Alkynyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucylcarbonyl C₁-C_Three Alkyl group or phenyl
Represents a group, R⁶⁰ Is replaced by at least one halogen atom
May be C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶¹ And R⁶²
 May be the same or different and represent a hydrogen atom, or
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶³ Is at least one
C optionally substituted with a halogen atom₁-C_Four Alkyl
Group, C₁-C_Four Alkoshki C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucircio C₁-C_Four Alkyl group, C_Three-C₆ Cycloalkyl
Group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano group, C₁-C_Four
 Alkyl group, C₁-C_Four Alkoxy group and halo C₁-C_Four 
One selected from the group consisting of alkyl groups
A phenyl group optionally substituted with a substituent of -NR⁷³R⁷⁴
Group, or-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁵Represents a group, R⁶⁴ Is C₁-C_Four
Displays an alkoxycarbonyl group or carboxyl group
Then R⁶⁵ Is a chloromethyl group, a cyanomethyl group, at least
May also have one or more oxygen atoms inserted C_Three-C₆ Shi
Chloroalkyl group, or C₁-C_Four Alkoxycarbonyl
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁶ Is a hydroxyl group, or -NR⁶⁷R
⁶⁸And A is -NR⁶⁷R⁶⁸, Or -S (O)_f-R⁶⁹Table
Then R⁶⁷ And R⁶⁸ May be the same or different, and hydrogen
Atom, or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁹ Is C₁-C_Four 
Alkyl group, or C₁-C_Four Represents a haloalkyl group, R⁷⁰
 Is a hydrogen atom, hydroxyl group, halogen atom, at least one
C on₁-C_Four C optionally substituted with an alkoxy group₁-C
_Four Alkyl group, at least one oxygen atom is inserted
May be C_Three-C₆1 or 2 cycloalkyl groups
C optionally substituted with a methyl group_Three-C₆Cycloalkyl
Group, furyl group, thienyl group, or -C (= O) R⁷¹Table
Then R⁷¹ And R⁷² May be the same or different and C₁-
C_Four Alkyl group, or C₁-C _Four Represents an alkoxy group, R
⁷³ And R⁷⁴ May be the same or different and C₁-C_Four A
Represents a alkyl group or a phenyl group;⁷⁵ Is at least
One or more oxygen atoms may be inserted C_Three-C₆Shiku
Substituted with 1 or 2 methyl groups
May be C_Three-C₆Cycloalkyl group, furyl group, thienyl
Group, or -C (= O) R⁷¹Represents a group, R⁷⁶ Is C₁-C_Four Archi
A, b, and c are each independently 1, 2,
Or 3; d represents 0 or 1; e represents 2 or 3
Represents, f represents 1 or 2, X^Two Is an oxygen atom or sulfur
Represents an atom. 【請求項５】タンパク質が、プロトポルフィリンIXに特
異的に結合する性質を有するタンパク質である請求項
１、２、３または４記載の植物。5. The plant according to claim 1, wherein the protein is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 【請求項６】タンパク質が、マグネシウムケラターゼの
プロトポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質であ
るか、または該タンパク質の改変タンパク質であってプ
ロトポルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタ
ンパク質である請求項１、２、３、４または５記載の植
物。6. The protein according to claim 1, wherein the protein is a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase, or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. The plant according to 2, 3, 4, or 5. 【請求項７】タンパク質が、植物由来のマグネシウムケ
ラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタン
パク質であるか、または該タンパク質の改変タンパク質
であってプロトポルフィリンIXに特異的に結合する性質
を有するタンパク質である請求項１、２、３、４、５ま
たは６記載の植物。7. The protein is a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase derived from a plant, or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. The plant according to claim 1, 2, 3, 4, 5, or 6. 【請求項８】タンパク質が、タバコ由来のマグネシウム
ケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタ
ンパク質であるか、または該タンパク質の改変タンパク
質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結合する性
質を有するタンパク質である請求項１、２、３、４、
５、６または７記載の植物。8. The protein is a protoporphyrin IX-binding subunit protein of tobacco-derived magnesium keratase, or a modified protein of said protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. Claims 1, 2, 3, 4,
The plant according to 5, 6, or 7. 【請求項９】下記(1)および(2)の特性を有するプロトポ
ルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物であ
って、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。かつ、下記(3)、(4)および(5)の性質を有す
るタンパク質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺
伝子を発現する植物。 (3)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。9. A plant having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2), wherein (1) the natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant is substantially different. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. In addition, a plant which has a gene encoding a protein having the following properties (3), (4) and (5) introduced therein and expresses the gene. (3) Specific binding to protoporphyrin IX. (4) Substantially no change to protoporphyrinogen IX. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項１０】タンパク質が、フェロケラターゼである
か、または該タンパク質の改変タンパク質であってプロ
トポルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタン
パク質である請求項９記載の植物。10. The plant according to claim 9, wherein the protein is ferrochelatase or a modified protein of the protein, which is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 【請求項１１】下記(1)、(2)および(3)の特性を有する
プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する
植物であって、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。 (3)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たないタンパク質により担われる。かつ、下記
(4)、(5)および(6)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子が導入されてなり該遺伝子を発現する植物。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (5)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持
つ。 (6)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。11. A plant having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1), (2) and (3), wherein (1) a natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of the plant: Are substantially different. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. (3) It is carried by a protein having substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen IX. And the following
A plant into which a gene encoding a protein having the properties of (4), (5) and (6) has been introduced and which expresses the gene. (4) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (5) It has the ability to transform coproporphyrinogen IX. (6) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項１２】(4)、(5)および(6)の性質を有するタン
パク質が、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ
であるか、または該タンパク質の改変タンパク質であっ
てプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する性質
を有するタンパク質である請求項１１記載の植物。12. The protein having the properties of (4), (5) and (6) is coproporphyrinogen III oxidase, or a modified protein of said protein, which is specific for protoporphyrinogen IX. 12. The plant according to claim 11, which is a protein having a property of binding to. 【請求項１３】請求項１〜１２記載の植物を増殖させる
ことを特徴とする除草剤耐性植物の製造方法。13. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising growing the plant according to claim 1. 【請求項１４】請求項１〜１２記載の植物の栽培域に除
草剤を散布する雑草防除方法。14. A method for controlling weeds, which comprises applying a herbicide to a cultivation area of the plant according to claim 1. 【請求項１５】請求項１〜１２記載の植物の栽培域にプ
ロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤を
散布するプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害
型除草剤耐性植物の選抜方法。15. A method for selecting a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide-tolerant plant, which comprises spraying a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide on the cultivation area of the plant according to claim 1. 【請求項１６】請求項１〜１２記載の植物の細胞の培養
域にプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤を添加するプロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼ阻害型除草剤耐性植物細胞の選抜方法。16. A method for selecting protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide-tolerant plant cells, wherein a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide is added to the plant cell culture area according to claim 1. 【請求項１７】下記(1)の性質を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、
(2)、(3)および(4)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含む
ことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (2)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (3)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (4)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。17. A step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following property (1) into a plant cell,
Introducing a gene encoding a protein having the properties of (2), (3) and (4) into a plant cell and expressing the gene in the plant cell. (1) It has protoporphyrinogen IX oxidase activity substantially. (2) It specifically binds to a substance related to the herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide. (3) The protein has substantially no ability to alter a substance to which it specifically binds. (4) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項１８】(2)、(3)および(4)の性質を有するタン
パク質が、植物細胞内でプロトポルフィリノーゲンIXオ
キシダーゼ阻害型除草剤の殺草活性発現に関わる植物細
胞内因性物質に特異的に結合する性質を有するタンパク
質である請求項１７記載の方法。18. A protein having the properties of (2), (3) and (4), which is a plant cell endogenous substance involved in the expression of herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide in a plant cell. 18. The method according to claim 17, which is a protein having a property of specifically binding. 【請求項１９】(2)、(3)および(4)の性質を有するタン
パク質が、プロトポルフィリンIXに特異的に結合する性
質を有するタンパク質である請求項１７または１８記載
の方法。19. The method according to claim 17, wherein the protein having the properties of (2), (3) and (4) is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 【請求項２０】(2)、(3)および(4)の性質を有するタン
パク質が、マグネシウムケラターゼのプロトポルフィリ
ンIX結合サブユニットタンパク質であるか、または該タ
ンパク質の改変タンパク質であってプロトポルフィリン
IXに特異的に結合する性質を有するタンパク質である請
求項１７、１８または１９記載の方法。20. The protein having the properties of (2), (3) and (4) is a protoporphyrin IX-binding subunit protein of magnesium keratase, or a modified protein thereof, wherein the protein is protoporphyrin.
The method according to claim 17, 18 or 19, which is a protein having a property of specifically binding to IX. 【請求項２１】(2)、(3)および(4)の性質を有するタン
パク質が、植物由来のマグネシウムケラターゼのプロト
ポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質であるか、
または該タンパク質の改変タンパク質であってプロトポ
ルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク
質である請求項１７、１８、１９または２０記載の方
法。21. A protein having the properties of (2), (3) and (4), which is a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase derived from a plant,
21. The method according to claim 17, 18, 19, or 20, which is a modified protein of the protein and has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 【請求項２２】(2)、(3)および(4)の性質を有するタン
パク質が、タバコ由来のマグネシウムケラターゼのプロ
トポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質である
か、または該タンパク質の改変タンパク質であってプロ
トポルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタン
パク質である請求項１７、１８、１９、２０または２１
記載の方法。22. The protein having the properties of (2), (3) and (4) is a protoporphyrin IX-binding subunit protein of magnesium keratase derived from tobacco, or a modified protein thereof. 22. A protein having a property of specifically binding to protoporphyrin IX.
The described method. 【請求項２３】下記(1)および(2)の特性を有するプロト
ポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物細
胞に、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。下記(3)、(4)および(5)の性質を有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含
むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (4)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。23. A plant cell having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2): (1) substantially different from a plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity . (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following properties (3), (4) and (5). (3) It specifically binds to a substance related to the herbicidal activity of a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide. (4) The protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項２４】下記(1)、(2)および(3)の性質を有する
タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝
子を発現する植物細胞に、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除
草剤の殺草活性に関わる物質に特異的に結合する。 (2)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。下記(4)の性質を有するタンパク質
をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含むこと
を特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。24. A plant cell into which a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) has been introduced and expressing said gene: (1) Protoporphyrinogen IX oxidase inhibition It specifically binds to substances related to the herbicidal activity of herbicides. (2) the protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds; (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following property (4). (4) having substantially protoporphyrinogen IX oxidase activity; 【請求項２５】下記(1)の性質を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程と、
(2)、(3)および(4)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程とを含む
ことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (2)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (4)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。25. A step of introducing a gene encoding a protein having the following property (1) into a plant cell and expressing the gene;
Introducing a gene encoding a protein having the properties of (2), (3) and (4) into a plant cell and expressing the gene in the plant cell. (1) It has protoporphyrinogen IX oxidase activity substantially. (2) Specific binding to protoporphyrin IX. (3) It has substantially no metamorphosis to protoporphyrinogen IX. (4) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項２６】(2)、(3)および(4)の性質を有するタン
パク質が、フェロケラターゼであるか、または該タンパ
ク質の改変タンパク質であってプロトポルフィリンIXに
特異的に結合する性質を有するタンパク質である請求項
２５記載の方法。26. The protein having the properties of (2), (3) and (4) is ferrochelatase or a modified protein thereof, which has the property of specifically binding to protoporphyrin IX 26. The method of claim 25, wherein 【請求項２７】下記(1)および(2)の特性を有するプロト
ポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する植物細
胞に、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。下記(3)、(4)および(5)の性質を有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含
むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (3)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。27. A plant cell having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1) and (2): (1) substantially different from natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of a plant . (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following properties (3), (4) and (5). (3) Specific binding to protoporphyrin IX. (4) Substantially no change to protoporphyrinogen IX. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項２８】下記(1)、(2)および(3)の性質を有する
タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝
子を発現する植物細胞に、 (1)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (2)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。下記(4)の性質を有するタンパク質
をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を含むこと
を特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。28. A plant cell into which a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) has been introduced and expressing the gene: (1) specific for protoporphyrin IX Join. (2) It does not substantially have the ability to transform protoporphyrinogen IX. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following property (4). (4) having substantially protoporphyrinogen IX oxidase activity; 【請求項２９】下記(1)および(2)の性質を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる
工程と、(3)、(4)および(5)の性質を有するタンパク質
をコードする遺伝子を植物細胞に導入し発現させる工程
とを含むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (1)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (2)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を実質
的に持たない。 (3)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (4)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を有す
る。 (5)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。29. A step of introducing a gene encoding a protein having the following properties (1) and (2) into a plant cell and expressing the same, Introducing a gene encoding the gene into a plant cell and expressing the gene in the plant cell. (1) It has protoporphyrinogen IX oxidase activity substantially. (2) It does not substantially have the conversion property to coproporphyrinogen III. (3) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (4) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (5) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項３０】(3)、(4)および(5)の性質を有するタン
パク質が、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ
であるか、または該タンパク質の改変タンパク質であっ
てプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する性質
を有するタンパク質である請求項２９記載の方法。30. The protein having the properties of (3), (4) and (5) is coproporphyrinogen III oxidase, or a modified protein thereof which is specific for protoporphyrinogen IX. 30. The method according to claim 29, which is a protein having a property of binding to. 【請求項３１】下記(1)、(2)および(3)の特性を有する
プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を有する
植物細胞に、 (1)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性とは実質的に異なる。 (2)植物の天然のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を植物に付
与し得る。 (3)コプロポルフィリノーゲンIXに対する変性能を実質
的に持たないタンパク質により担われる。下記(4)、(5)
および(6)の性質を有するタンパク質をコードする遺伝
子を導入し発現させる工程を含むことを特徴とする除草
剤耐性植物の作製方法。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (5)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を有す
る。 (6)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。31. A plant cell having protoporphyrinogen IX oxidase activity having the following characteristics (1), (2) and (3): (1) The natural protoporphyrinogen IX oxidase activity of a plant Substantially different. (2) It can confer on plants resistance to herbicides in amounts that inhibit the plant's natural protoporphyrinogen IX oxidase activity. (3) It is carried by a protein having substantially no metamorphosis to coproporphyrinogen IX. (4), (5) below
And a method for producing a herbicide-tolerant plant, which comprises a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the properties of (6). (4) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (5) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (6) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項３２】下記(1)、(2)および(3)の性質を有する
タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなり該遺伝
子を発現する植物細胞に、 (1)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (2)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を有す
る。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。下記(4)および(5)の性質を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子を導入し発現させる工程を
含むことを特徴とする除草剤耐性植物の作製方法。 (4)プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を実
質的に有する。 (5)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を実質
的に持たない。32. A plant cell into which a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) has been introduced and expressing the gene: (1) specific to protoporphyrinogen IX To combine. (2) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. A method for producing a herbicide-tolerant plant, comprising a step of introducing and expressing a gene encoding a protein having the following properties (4) and (5). (4) having substantially protoporphyrinogen IX oxidase activity; (5) Substantially no conversion property to coproporphyrinogen III.