JP2001057886A - 遺伝子の発現量を増大させる新規ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子の発現量を増大させる新規ＤＮＡ断片
を提供する。 【解決手段】 配列番号１の１ないし１５２番目付近の
塩基から２５９ないし３７４番目付近の塩基までの塩基
配列を含み、且つ遺伝子の発現量を増大させるＤＮＡ断
片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現を顕
著に増大させる作用を有する新規なＤＮＡ断片に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、様々な植物種において遺伝子工学
的手法を応用した分子育種が盛んに行われるようになっ
てきた。遺伝子工学的手法を用いて植物で外来遺伝子を
発現させる場合、植物に導入した遺伝子が必ずしも十分
に高レベルな発現をするわけではなく、得られた発現量
が予測していたよりも低いことがしばしば生じる。ま
た、植物で物質生産を試みる場合には、導入遺伝子の高
発現は必須の要件であり、高発現を達成するための技術
の開発は非常に重要である。

【０００３】外来遺伝子の発現を促進する技術の一つと
して、遺伝子発現を促進する塩基配列を有するＤＮＡ断
片の利用が挙げられる。このようなＤＮＡ断片として、
５’非翻訳リーダー配列や、イントロン配列がある。例
えば、トウモロコシのShrunken-1遺伝子の第一エクソン
（５’非翻訳リーダー配列）（Maas et al. Plant Mol.
Biol. 16：199-207、1991）や、ヒマのカタラーゼ遺伝
子の第一イントロン（特開平3-103182号公報）を外来遺
伝子の上流に挿入して当該外来遺伝子を発現させること
により、当該外来遺伝子の発現が促進されることが報告
されている。これら以外にも植物由来のいくつかの５’
非翻訳リーダー配列や、イントロン配列に遺伝子発現を
促進する効果のあることが報告されている（Koziel et
al. Plant Mol. Biol. 32：393-405（1996））。

【０００４】イントロン配列による遺伝子発現促進効果
は、隣接するエクソン配列の長さに影響される。例え
ば、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝
子の第６イントロンの場合、その５’側に76bpのエクソ
ン、３’側に53bpのエクソンが隣接して存在するときに
最大の効果を発揮する（Mascarenhas et al. Plant Mo
l. Biol. 15：913-920、1990）。

【０００５】イントロンによる遺伝子発現増幅効果は、
これ以外にもプロモーターの種類や、植物種、構造遺伝
子の塩基配列など多くの要因に影響される（Koziel et
al.Plant Mol. Biol. 32：393-405、1996）。また全て
の５’非翻訳リーダーやイントロンが発現を促進するわ
けではない。従って理想的には、場合に応じたより多く
の種類の、より強力な遺伝子発現増幅効果を持つ５’非
翻訳リーダーやイントロン配列を同定、利用することが
望ましい。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、遺伝
子の発現を顕著に増大させることの出来る新規なＤＮＡ
断片を提供することである。本発明の他の目的は、上記
の新規なＤＮＡ断片を用いて、宿主における遺伝子、特
に外来遺伝子の発現を顕著に増大させる方法を提供する
ことである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、イネの花器で優勢に発現する遺伝子として単離可
能な遺伝子（RPC213遺伝子；配列番号３）の、転写開始
点付近から三つめに出現するATGの直前付近までの配列
（配列番号１）からなるＤＮＡ断片の全体または一部
が、同ＤＮＡ断片中のイントロンを含むまたは含まない
場合のいずれにおいても、遺伝子の発現を大幅に促進す
る効果を有することを見出し、本発明を完成した。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
DNA断片は、RPC213遺伝子のプロモーター発現解析の過
程でその遺伝子発現量の増加効果が示唆され、実際にカ
リフラワーモザイクウイルス３５ＳRNA遺伝子のプロモ
ーターと、β−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子の間に
挿入され、トウモロコシプロトプラストの発現系に導入
された場合において、それを挿入しない場合と比較して
顕著なGUS活性の増加効果が確認されたものである。こ
の効果は、イネの花器に特異的なものではなく、多くの
植物細胞に普遍的な効果である。なお、RPC213遺伝子
は、イネの花器で優勢に発現する遺伝子として、例えば
水稲品種IR24から、後記実施例１に記載する様にして単
離することができる。

【０００９】本発明の第一の態様は、配列表の配列番号
１に示す、RPC213遺伝子の転写開始点から三つ目のATG
直前までのゲノム配列である。この配列は、８１ｂｐの
イントロンを含み、３７４ｂｐからなる。この配列を上
記発現系のプロモーターと発現させようとする遺伝子の
間に挿入すると、挿入しない場合の９０倍以上の遺伝子
発現量の増幅効果が得られることが確認された。この配
列はRPC213のゲノムクローン（RPG106;後記実施例２の
E)を参照）の塩基配列である配列番号４の第４９９６番
目から第５３６９番目の塩基配列に相当する。

【００１０】第二の態様は、配列表の配列番号７に示し
た改変ゲノム配列である。この配列は、RPC213遺伝子由
来の、配列番号１に示したゲノム配列とほとんど同じ配
列を有するが、配列中に、異なる読み枠で存在する二つ
のATGのT（チミン）を、A（アデニン）に変化させてあ
る。従って、この配列からイントロンがスプライシング
された後の配列にはATGが含まれないので、遺伝子の翻
訳がRPC213由来のATGから開始される可能性を除去でき
る。この配列の上記発現系における遺伝子発現増強効果
は６０倍程度と非常に高いことが確認された。

【００１１】第三の態様は、配列番号５に示した改変ゲ
ノムDNA配列である。この配列は配列番号１の配列の
５’側が３４ｂｐ、３’側が１５ｂｐ欠失した３２５ｂ
ｐからなる配列で、配列中に唯一含まれるATG（RPC213
の二つめのATG）のT（チミン）を、A（アデニン）に変
化させた配列である。８１ｂｐのイントロンは含まれ
る。この配列は、配列番号４の第５０３０番目から第５
３５４番目の塩基配列に相当する。この配列の遺伝子発
現増強効果は１１倍程度と高いことが確認された。この
配列からイントロンがスプライシングされた後の配列に
はATGが含まれないので、遺伝子の翻訳がRPC213由来のA
TGから開始される可能性を除去できる。

【００１２】第四の態様は、配列番号２に示した配列で
ある。この配列はRPC213遺伝子の８１ｂｐのイントロン
配列の５’側に１５ｂｐのエクソン配列が、また３’側
には１２ｂｐのエクソン配列が付加された配列で、サイ
ズは１０８ｂｐである。この配列は、配列番号４の第５
１４７番目から第５２５４番目の塩基配列に相当する。
この配列の遺伝子発現増強効果は４倍程度であることが
確認された。この配列からイントロンがスプライシング
された後の配列にはATGが含まれない。

【００１３】第五の態様は配列表の配列番号８に示した
配列で、RPC213遺伝子の転写開始点から三つ目のATG直
前までのcDNA配列である。この配列は、イントロンを含
まず、２９３ｂｐからなる。この配列は、配列番号３の
第２番目から第２９４番目の塩基配列に相当するが、配
列中に、異なる読み枠で存在する二つのATGのT（チミ
ン）を、A（アデニン）に変化させてある。従って発現
させようとする遺伝子の翻訳がRPC213由来のATGから開
始される可能性を除去できる。この配列の遺伝子発現増
強効果は１０倍程度と高いことが確認された。

【００１４】これらの結果から、植物細胞内における内
生RPC213遺伝子の発現制御、特に転写制御のための、転
写開始点から3rd ATG直前までのＤＮＡ一次構造は、高
度に最適化されていることが示唆される。そして、転写
開始点から3rd ATG直前までのＤＮＡからイントロンを
取り除くと発現増強効果は低下したものの（第五の発
明）、ほぼイントロンのみでも約４倍の発現増強効果が
あったことから、イントロンとイントロンを含まない転
写開始点から3rd ATG直前までのＤＮＡ一次構造とは、
発現増強効果に関して相乗作用を発揮している可能性が
ある。

【００１５】したがって、本発明は、配列番号１に示さ
れる配列からなるＤＮＡ断片の全体または一部、ならび
にイントロンを含むまたは含まない同配列からなるＤＮ
Ａ断片、およびそれらのＤＮＡ断片から容易に修飾でき
且つ遺伝子の発現増強効果を保持しているＤＮＡ断片で
あり、例えば、イントロンを含むまたは含まない配列番
号１の１ないし１５１番目付近のいずれか一つの塩基か
ら２５９ないし３７４番目付近のいずれか一つの塩基ま
での塩基配列を含み、且つ遺伝子の発現量を増大させる
ＤＮＡ断片である。

【００１６】配列番号１に示される配列からなるＤＮＡ
断片は、後記実施例の記載にしたがって、イネから単離
することができる。あるいは、配列番号１に示される配
列の両端部分とそれぞれ対合する二つのオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、イネのゲノムを鋳型とす
るＰＣＲを実施して容易に得ることが出来る。あるいは
また、ＤＮＡ合成装置で一部又は全体を合成し、適宜ラ
イゲーションして調製することもできる。配列番号２，
５，７または８に示した塩基配列からなる配列も、同様
にして後記実施例の記載にしたがって調製可能であり、
あるいはＤＮＡ合成装置で一部又は全体を合成し、適宜
ライゲーションして調製することもできる。

【００１７】また、一般に生理活性を有するＤＮＡの塩
基配列が若干変更された場合に、実質上同一の生理活性
を有する場合があることはよく知られている。したがっ
て、配列番号１，２，５，７または８に示した塩基配列
若しくはそれらの一部の配列のうち、１または複数のヌ
クレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列
を有するDNA断片も、遺伝子発現増強活性を有するDNA断
片であるかぎり、本発明の範囲に含まれる。ヌクレオチ
ドの付加、挿入、欠失又は置換は、例えば、周知技術で
ある部位特異的変異誘発（例えばNucl. Acids Res.10:
6487-6500, 1982)により実施することができ、本明細書
において「１又は複数のヌクレオチド」とは、部位特異
的変異誘発法により付加、挿入、欠失又は置換できる程
度の数のヌクレオチドを意味する。部位特異的変異誘発
は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は変異
を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うこと
ができる。すなわち、プライマーとして上記合成オリゴ
ヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成さ
せ、得られた二重鎖ＤＮＡでファージ担持性宿主細菌を
形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプ
レートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを
形成せしめる。そうすると、理論的には、５０％の新コ
ロニーが単鎖として変異を有するファージを含有し、残
りの５０％が元の配列を有する。得られたプラークを、
上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものと
はハイブリッド形成するが、もとの鎖を有する不一致の
ものとはハイブリッド形成しない温度において、キナー
ゼ処理された合成プローブとハイブリッド形成せしめ
る。次に該プローブとハイブリド形成するプラークを拾
い、培養し、ＤＮＡを回収する。

【００１８】また、イネ以外の植物のゲノムを鋳型とし
て、配列番号１に示される配列の両端部分とそれぞれ対
合する二つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、ＰＣＲを実施して、本発明と同様に遺伝子発現の増
強作用をもつが、配列番号１とは多少異なる配列を有す
るDNA断片が得られることは十分予測される。そのよう
なDNA断片は一般にストリンジェントな条件で配列番号
１に示される配列からなるDNA断片とハイブリダイズす
る。したがって、そのようなDNA断片も、遺伝子の発現
量を増大させる限り本発明に含まれる。ストリンジェン
トな条件とは、例えば６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶
液、０．１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドで、室温〜４
２℃のような条件である。

【００１９】本発明のDNA断片は、遺伝子発現の増強を
もたらす。本明細書において、遺伝子発現の増強効果と
は、本発明のDNA断片を、プロモーターと該プロモータ
ーにコントロールされる遺伝子の上流、下流、または好
ましくは中間に組み込んだ場合、組み込まなかった場合
と比較して、遺伝子の発現量が少なくとも１倍、好まし
くは２倍、最も好ましくは３倍より多くなることを意味
する。発現の増強効果がもたらされる遺伝子は、好まし
くは外来遺伝子であるが、細胞本来の遺伝子であっても
よい。

【００２０】本発明のDNA断片が遺伝子の発現を増強さ
せる活性を確認するには、どのような発現系を用いても
良いが、例えば後記実施例４のトランジェントアッセイ
が都合よく使用できる。

【００２１】本発明はさらに、宿主細胞で発現させるた
めに外来遺伝子をプロモーターの下流に配置したＤＮＡ
断片からなるＤＮＡ構築物に、本発明のいずれかのＤＮ
Ａ断片を組み込み、該ＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転
換することにより、該ＤＮＡ断片が組み込まれていない
ＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転換した場合に比べて、
宿主細胞による外来遺伝子の発現を増大させる方法も提
供する。

【００２２】宿主細胞の例は、動・植物細胞や、菌類の
細胞などの真核細胞であるが、好ましくは植物細胞、特
に好ましくは単子葉植物細胞である。

【００２３】外来遺伝子は、使用する宿主細胞中で発現
しうる任意の遺伝子であり、タンパク質をコードする遺
伝子であってもよく、コードしない遺伝子（たとえばア
ンチセンスRNAを転写させるための遺伝子）であっても
よい。

【００２４】プロモーターは、使用する宿主細胞で機能
する任意のプロモーターである。植物細胞を宿主とする
場合に好ましいプロモーターは、例えば、カリフラワー
モザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロ
モーター、アクチンプロモーター、PPDKプロモーター、
PEPCプロモーターなどである。

【００２５】本発明のDNA断片の組み込みは、本発明のD
NA断片を、プロモーターおよびそのコントロール下にあ
る外来遺伝子と共に、宿主に適合するベクターまたはプ
ラスミドに連結し、このベクターまたはプラスミドで宿
主細胞を形質転換することにより行うことができる。ベ
クターまたはプラスミドは、形質転換体の選択のための
マーカーも有することが好ましい。本発明のDNA断片を
組み込む位置は、好ましくはプロモーターと外来遺伝子
の間であるが、当該DNA断片の遺伝子発現増強効果が発
揮される位置ならば、その限りではない。形質転換され
た宿主細胞は、本発明のDNA断片、プロモーターおよび
外来遺伝子を、染色体に組み込まれた状態で有しても良
く、発現ベクターに組み込まれた状態で有しても良い。

【００２６】また、外来遺伝子の発現量は、外来遺伝子
の転写速度、転写物の蓄積、タンパク質の蓄積、タンパ
ク質が酵素である場合はその活性のいずれに関するもの
であってもよい。以下、実施例に基づいて本発明をさら
に具体的に説明する。

【００２７】

【実施例】実施例１ RPC213cDNAの単離 水稲品種「月の光」および「IR24」を温室で栽培し、以
下の実験に供試した。 A) RNAの抽出 「IR24」の葉、未熟・成熟雌蕊、葯、鱗被、内・外穎、
未熟種子、発芽種子、根、カルス、および未熟穎花（長
さ4.5〜6.0mm）を採取後直ちに液体窒素中で凍結し-80
℃で保存した。これらの組織よりフェノール-SDS法（ W
atanabe and Price, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 7
9, 6304-6308, 1982）により全RNAを抽出した。ただ
し、抽出緩衝液へ酸化防止剤βメルカプトエタノールを
最終濃度10 %(V/V)になるように添加した。また、逆転
写PCR実験に供試する組織については微量のDNAの混入を
極力抑えるために、塩化リチウム沈澱の代わりに、RNas
eインヒビター（RNAguard Pharmacia社）存在下でDNase
I(FPLCpure Pharmacia社)処理を行った。すなわち、40
mM Tris-Cl pH7.5、6 mM MgCl₂の緩衝液中に、0.375 μ
g/μlの全核酸と1.75 units/μl RNaseインヒビターを
混合し、ここへ、0.375 units/μlのDNaseI（濃度はい
ずれも最終濃度）を加え、37℃で10〜30分間保温した。
その後DNaseIはフェノール・クロロフォルム抽出により
失活させた。

【００２８】葉、根（表１では根（土）と表記）は播種
後１ケ月の温室育成の株より、未熟雌蕊は出穂前１週間
〜２週間の株より、成熟雌蕊、葯、鱗被、内外穎は、開
花直前〜数日前、未熟種子は開花後1〜2週間の株より採
取した。また、発芽種子、根は、N6培地（Chu et al. S
cientia Sinica, 18, 659-668, 1975）上で播種後それ
ぞれ１、３週間無菌的に育成した植物体のものを用い
た。カルスは、2,4-Dを2mg/l添加したN6固形培地上で種
子より誘導し、同じ組成の液体培地中で３週間振盪培養
をしたものを用いた。雌蕊および葉の全RNAについて
は、Oligotex-dT30super（宝酒造）を用いて添付説明書
に従ってポリA+RNAを調製した。

【００２９】B)雌蕊cDNAライブラリーの構築 雌蕊より単離精製した約1μgのポリA+RNAを鋳型とし、Z
AP-cDNA合成キット（STRATAGENE社）を用いてcDNA合成
を行った。キット添付の説明書に従ってcDNAにEcoRIア
ダプターをつなぎ、XhoIで消化した後、ベクターUniZAP
XRへ連結した。その後ファージDNAをGiga pack Gold p
ackaging extract（STRATAGENE社）を用いてファージ粒
子へパッケージングした。

【００３０】C)ディファレンシャルスクリーニング 高倉ら（WO98/29542）の方法に従った。B)で構築したcD
NAライブラリーから、約30,000個のプラークを供試した
結果、雌蕊プローブでハイブリダイゼーションシグナル
が強く検出され、しかも、葉プローブではシグナルが弱
いプラークが一次選抜で198個選抜された。このうちの1
52クローンに関して、二次選抜を行った。この際、プラ
ークハイブリダイゼーションの高いバックグラウンドを
避けるため、また、選抜の効率化を図るため以下の方法
で選抜を行った。まず一次選抜されたプラークをクロロ
フォルムを一滴滴下した200 μlのSM緩衝液（0.1 M NaC
l、7 mM MgSO₄、50mMTris-ClpH7.5、0.01% ゼラチン)中
で4℃で保存した。この保存液を希釈し、プラークがご
く低密度（10〜100 pfu/プレート）になるようにファー
ジを播き、互いに離れたプラークを1つ単離し、同じ緩
衝液中で保存した。この保存液からファージを高濃度で
含むプレート溶菌液を用意し、ZAP cDNA合成キットの説
明書に従って in vivo excision を行い、ファージゲノ
ムよりプラスミド（pBluescriptSK(-)）を調製した。

【００３１】制限酵素EcoRI及びXhoI（宝酒造）で消化
することによりcDNAインサートを単離精製した。これを
0.8 %アガロースゲル電気泳動で分画後、HybondN+ナイ
ロンメンブレンフィルターに転写し、雌蕊、葉プローブ
の他、葯、発芽種子、根、カルスまたは未熟種子の全RN
AからオリゴdTプライマーを用いて合成した一本鎖cDNA
プローブを用いてディファレンシャルハイブリダイゼー
ションを行った。その結果、雌蕊プローブにハイブリダ
イズし、他のプローブに対しては殆どハイブリダイズし
ない6つのcDNAクローンが得られた。このうちインサー
トcDNAの長さが約1.5kbのクローンを「RPC213」と命名
し、以下の実験に供試した。

【００３２】D)ｃＤＮＡクローンの発現器官特異性の解
析 上記C)で選抜されたcDNAクローン「RPC213」について各
器官での発現パターン及びその発現量を見るためにノー
ザンハイブリダイゼーションを行った。フィルターの作
製は以下のように行った。

【００３３】まず上述A)の各器官の全RNA20 μgを Samb
rook et al.（Molecular Cloning,1982)の方法に従っ
て、脱イオンした GlyoxalとDMSOを用いて二次構造を除
去した後、1 %アガロースゲル中で分画した。次いで常
法によりRNAをナイロンメンブレン Gene Screen Plus
（DU PONT社）に転写した。80℃、真空で、１時間乾燥
させた後、フィルターを20 mM Tris-Cl pH8.0中で5分間
煮沸しGlyoxalを除去した。プローブは上記cDNAのEcoRI
-XhoI 1.5 kb断片をマルチプライムラベリングシステム
(Amersham社）でRIラベルしたものを用いた。プレハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションはフ
ィルター添付の説明書に従い行った。洗浄は2×SSC、1%
SDS及び0.2×SSC、1% SDSを各々室温で５分、0.16×SS
C、1% SDS、65℃で15分を２回行った後、2×SSC、室温
で１分間という条件で行った。Kodak X-Omatフィルムを
一晩-70℃でフィルターに露光させた。

【００３４】その結果、成熟雌蕊において強いハイブリ
ダイゼーションシグナルが検出され、内・外穎とカルス
において弱いシグナルが検出され、さらに葉と葯、およ
び未熟種子において極めて弱いシグナルが検出された。
その他の諸器官においてはシグナルは検出されなかっ
た。従って、ノーザン分析の結果から、単離されたクロ
ーンは成熟雌蕊において比較的強く発現し、内・外穎と
カルスにおいては弱く発現し、また葉と葯、および未熟
種子においては極く微量にしか発現しないことが明らか
となった。なお転写物のサイズは、およそ1.6kbと推定
された。

【００３５】cDNAクローンの器官特異的発現についてよ
り高い感度で解析するために、イネ各器官のRNAを鋳型
とした逆転写PCRを行った。まず、GENESIS 2000蛍光シ
ークエンサー（DuPont社）を用いて、プラスミド pBlue
script SK(-)に挿入されたcDNAの塩基配列を部分的に決
定した。シークエンサー添付の説明書に従い、M13およ
びM4プライマー（宝酒造）より T7 DNA polymerase反応
を行い、6 %アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
5'(EcoRI)側、3'(XhoI)側の両方向からの塩基配列の決
定を行った。このうち3'側の約400ヌクレオチド（mRNA
センス鎖）分のDNA塩基配列を参考にしてプライマー 213S ；5'-CGCTATGGCCCGTTTCAGCT-3'および、 213AS；5'-GTCGTCCTGTCGCTTCATTAC-3' をDNA合成機（ABI社）により合成し、OPCカートリッジ
（ABI社）により精製し、逆転写PCR実験に供試した。こ
のプライマーにより約250 bpの産物が増幅されることが
期待される。また、イネアクチン1遺伝子(RAc1, McElro
y et al. Plant Mol. Biol. 14, 163-171, 1990）の配
列を基に合成したプライマー 5'-GTATCCATGAGACTACATACAACT-3'および、 5'-TACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3' も対照として用いた。このプライマーはイントロンを挟
んだ形で設計してあるので鋳型DNAにゲノム DNAが混入
している場合、cDNA由来の267 bpの産物の他にゲノムDN
A由来の350 bpの産物が増幅されることが予想される。

【００３６】上述の各器官の全RNA10 μgを、500 ngの
オリゴ dT15プライマー（Amersham社）と混合し、55μl
の反応液中で70℃、１０分間処理し二次構造を解離さ
せ、氷上で急冷した後、1×1st strand buffer（BRL
社）、0.5 mM dNTPmix、10 mM DTT、2 units/μl RNase
インヒビター（RNAguard Pharmacia社）、10 units/μ
l逆転写酵素Superscript（BRL社）（濃度はいずれも最
終濃度）の100 μlの反応液中で37℃、60分間保温し
た。続いて95℃で５分間処理しRNA-cDNAハイブリッドを
解離させた後、氷上で冷却した。この溶液のcDNA濃度を
100 ng/μlと見なした。次に合成された各器官のcDNAを
希釈し、100 ng/μl、10 ng/μl、1 ng/μl、0.1ng/μl
の4種類の希釈系列を作製し、PCR反応の鋳型とした。

【００３７】PCR反応は以下の条件で行った。まずcDNA
希釈液1μlに対し、最終濃度で0.5 pmole/μlプライマ
ー、0.2 mM dNTP、1×PCR緩衝液、0.05 U Taqポリメラ
ーゼ（宝酒造）の反応液20μlを調製した。これをGeneA
mp9600（Perkin Elmer社）を用いて94℃３分を１回、94
℃0.5分、60℃１分、72℃１分を30回、72℃６分を１回
という条件でPCRを行った。PCR産物はアガロースゲル電
気泳動、エチジウムブロマイド染色後、写真撮影した。
各バンドの濃度を比較し、同じ濃さの２サンプルには、
本遺伝子に由来するcDNAが等量含まれていると評価し
た。

【００３８】まず対照実験としてイネにおいて全ての器
官で構成的に発現していると考えられるRac1遺伝子のプ
ライマーを用いて各器官より調製した全RNAの逆転写産
物についてPCRを行った。その結果、調査した全ての器
官で期待された267 bpの PCR産物が検出され、350 bpの
産物は検出されなかった。従って、鋳型cDNA中にはゲノ
ムDNAの混入はほとんどないと考えられた。

【００３９】RPC213遺伝子のプライマーについては、予
めプラスミドクローンを使って期待される分子量の産物
が増幅されることを確認した。このプライマーを用いて
逆転写PCR実験を行ったところ、100 ngのcDNAを鋳型に
用いた場合、成熟雌蕊と内・外穎、およびカルスにおい
て濃いPCR産物のバンドが検出され、葯と未熟種子では
薄いバンドが、また葉と発芽種子、根においては非常に
薄いバンドが検出された。このうち成熟雌蕊と内・外穎
では、鋳型cDNA量を1 ngにまで希釈した場合にもPCR産
物が検出されたのに対し、カルス、葯および未熟種子で
は10 ngまでしか産物が検出されなかった。さらに葉と
発芽種子、根においては100 ngより鋳型を希釈すると産
物が検出されなかった。これらバンドの検出の有無、お
よびバンドの濃淡の比較の結果からRPC213遺伝子のイネ
各器官における発現量を比較すると、成熟雌蕊を１とし
た場合、内・外穎では１〜1/10程度、葯と未熟種子、お
よびカルスでは1/10程度、その他の器官では1/100程度
と推定された。

【００４０】次に、花器の各部位および発達段階におけ
る発現を解析した。鋳型として、成熟雌蕊全体、成熟雌
蕊の柱頭、成熟雌蕊の子房、未熟雌蕊全体、鱗被より調
製したcDNAを用いた。また、葉のcDNAおよびプラスミド
DNAを対照として用いた。対照実験としてまずアクチン
プライマーを用いてPCRを行った。その結果、全ての鋳
型cDNAで267 bpの産物が増幅された。次にRPC213特異的
プライマーでPCRを行った。その結果、10 ngのcDNAを鋳
型とした場合、葉以外の全ての器官でPCR産物が検出さ
れた。このうち未熟雌蕊、柱頭および鱗被においては鋳
型を0.1 ngにまで希釈しても産物が検出されたのに対
し、成熟雌蕊およびその子房部においては1 ngまでしか
産物が検出されなかった。このことから、花器各部位に
おけるRPC213の発現量は、成熟雌蕊全体を１とした場
合、未熟雌蕊、柱頭および鱗被では10程度、また子房で
は１程度であると推定された。従って逆転写PCRの結果
から、RPC213遺伝子は未熟雌蕊と成熟雌蕊の柱頭および
鱗被で強く優勢に発現し、成熟雌蕊の子房と内・外穎で
弱く、その他の組織では微量にしか発現しない遺伝子で
あることが明らかとなった。

【００４１】以上ノーザン分析の結果と RTーPCRの結果
を併せて表１にまとめた。

【表１】

【００４２】E) RPC213の塩基配列の決定 花器特異的発現を示すcDNAクローンRPC213（約1.5 kb
p）の全塩基配列を、蛍光シークエンサー（モデル373
A、Applied Biosystems社）を用いて決定した。先に述
べた、M13プライマー（宝酒造）を用いて決定した塩基
配列情報を基に、プライマーを合成し、さらに未解読領
域の塩基配列を決定した。このプライマーウォーキング
を重ねることにより、最終的に、総塩基配列数1496 bp
のRPC213の塩基配列を決定した。ORF検索を行い、最大
のORFをとる読み枠を同定した。この読み枠において、
翻訳終止コドンTGAのおよそ70 bpおよび90 bp下流に、
ポリAシグナル様配列（Heidecker and Messing, Annu.
Rev. Plant Physiol.37, 439-466,1986）が位置してい
た。RPC213の全塩基配列を配列表３に示す。ただし、配
列表３の塩基配列には、後で述べるゲノムクローンの塩
基配列を参考に、転写開始点以降の28 bp分を付加して
あるので、総塩基数は1524 bpである。

【００４３】実施例２ RPC213プロモーターの単離 A)ゲノミックライブラリーの作製 ゲノミックDNAを播種後約2ヶ月のイネ品種「IR24」の葉
からSDS−フェノール法と塩化リチウム沈殿法で単離精
製した。ゲノミックDNAを制限酵素MboI(宝酒造）で部分
分解した後、ショ糖密度勾配遠心に供試した。ショ糖は
緩衝液（20 mMTris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 200 mM Na
Cl）へ溶解し、濃度を5段階（10, 17.5, 25, 32.5, 40
％）作成した。このショ糖溶液を遠心管（40PA、日立）
へ下からこの順で重層し、最後に部分分解DNA溶液を重
層した。SRP28SA（日立）ローターを用いて20,000 rp
m、17時間、20℃で遠心後、ペリスタポンプを用いて0.5
mlづつ80画分に分け、16〜23 kbのDNAを最も多く含む
画分を調製した。このDNA画分をベクターλ DASH II/ B
amHI(STRATAGENE社)へT4 DNAリガーゼ(BOEHRINGER MANN
HEIM社）を用いてライゲーションし、GigapackII Gold
packaging extract（STRATAGENE社）でファージ粒子へ
パッケージングした。

【００４４】B)クローンの選抜 約10,000 pfuのファージを感染用の大腸菌SRBP2と混合
し、14X10 cm角型シャーレへ展開し、39℃で一晩培養し
た。ナイロンメンブレンフィルターHybondN+(Amersham
社）をプラーク表面と接触させ、フィルター添付の説明
書に従ってフィルターを処理した。イネ花器特異的cDNA
（RPC213) の5'側のEcoRI-SalI 0.6 kb断片をマルチプ
ライムラベリングシステム(Amersham社）でRIラベルし
たものをプローブとして用い、プラークハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーション及び洗浄の
条件は実施例１Ｃ)に従った。この方法により100,000個
のプラークから６個の陽性クローンを選抜した。次に、
これらのプラークからファージDNAを調製し、これらを
鋳型としてRPC213特異的プライマー213S、213ASを用い
たPCRを行った。その結果、２クローン（RPG106、RPG10
7と命名）において期待される約250bpの産物が増幅され
た。

【００４５】C)プロモーターを含む領域のサブクローニ
ング 上記２つのRPC213のゲノムクローンからDNAを抽出し、
制限酵素SacI、HindIII（宝酒造）で消化後、0.8 %アガ
ロースゲル中でDNA断片を分画した。また、水稲品種ア
キヒカリ、IR24の播種後約１ヶ月の植物体から、フェノ
ール-SDS法（Komari et al. Theor. Appl. Genet. 77,
547-552, 1989）によりDNAを単離精製した。約5 μgのD
NAをSacI、HindIIIで消化し、同様に電気泳動を行っ
た。次にDNAをナイロンメンブレンフィルターHybondN+
(Amersham社）にブロッテングした後、前記1.5 kbのcDN
A断片を実施例１のD)と同様にRIラベルしたものをプロ
ーブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。

【００４６】ハイブリダイゼーション及び先浄の条件は
フィルター添付の説明書に従った。その結果、RPG106に
おいて全ゲノムDNAの場合と同サイズのバンドが現れ
た。そこでプローブと反応したRPG106のSacI 6.0 kb断
片をpBluescriptの同サイトにサブクローニングした。
次にプロモーターを含んだ領域をさらに特定するために
BglII、HindIII、SacI、SalIの計４種の制限酵素を用い
て物理地図を作成した。

【００４７】D) RPG106 SacI-SalI 5.4 kbの全塩基配列
の決定 ゲノムクローンRPG106には、４所のBglII部位がある。
これらの制限部位を利用してサブクローニングを行い、
M13プライマー（宝酒造）を用いて蛍光シークエンサー
（モデル 373A、Applied Biosystems社）により両鎖の
塩基配列を決定した。この方法で明確に解読できなかっ
た領域、及びサブクローニングに利用した制限部位の近
傍は、プライマーウォーキングにより塩基配列を決定し
た。最終的に、総塩基配列数5396 bpのRPG106 SacI-Sal
I 5.4 kbの全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列
表４に示した。この塩基配列と、RPC213cDNAクローンの
塩基配列を比較した結果、ディファレンシャルスクリー
ニングで単離されたcDNAクローンは部分長cDNAではある
が、ほとんど全てのORFを含むことが明らかとなった。
即ち単離されたcDNAクローンの５’末端の７塩基上流に
ATGが存在していた。このATGを含む読み枠は、先に述べ
たcDNAの読み枠と一致した。また、RPC213遺伝子のこの
一つめのATGと、それと同じ読み枠で存在する三つめのA
TGとの間には81 bpのイントロン配列が存在することが
明らかとなった。一つめのATGとイントロンの間には、
読み枠の合わない二つめのATGがさらに存在していた。
なお、cDNAの5'末端から１つめのSalIサイトまで領域
（およそ300 bp）と、この領域に相当するゲノムDNA RP
G106の塩基配列は、イントロン配列以外は完全に一致し
た。

【００４８】E)転写開始点の決定 プライマー伸長法による転写開始点の決定を行った。２
つのプライマー 213Z ；5'ーTGCTGGTATGGATGTGATG-3' 213Z-2；5'-CTGACGAGGCTGTTGCTG-3' を合成した。両プライマー10 pmolesを、MEGARABEL(宝
酒造)キットにより、[γ- ³²P]ATPを用いて5'末端をラベ
ルした。この末端ラベルされたプライマー0.1 pmole
（0.3×10⁶ cpm）と未熟穎花（出穂前１〜２週間）と葉
の全RNA 50μgとを、3units/μlのRNaseインヒビター
（ RNAguard, Pharmacia社）存在下で緩衝液（0.25 M K
Cl, 2 mM Tris-HCl pH8.0, 0.2 mM EDTA）中で10μlの
反応系で42℃、２時間アニーリングさせた。その後、緩
衝液（66 mM Tris-HCl pH8.3, 6.6 mM MgCl₂, 1.3 mM D
TT, 0.66 mM dNTP, 130 μg/mlアクチノマイシンD）を3
0μl、逆転写酵素（SUPERSCRIPT ,BRL社）を1 μl(200
units)加え、42℃で１時間保温した。さらに酢酸アンモ
ニウムを用いたエタノール沈殿を行い、70％エタノール
で洗浄後、風乾し泳動用緩衝液（T7 Sequencing kit(Ph
armacia社)の反応停止液と0.1 M NaOH, 1 mM EDTAを
２：１に混合したもの）に溶解した。

【００４９】全量を95℃で３分間加熱した後、6 ％アク
リルアミドゲルで電気泳動を行った。また同じプライマ
ーを用い、RPG106 BglII 2.3 kbを含むプラスミドを鋳
型にT7 Sequencing kitでシーケンス反応を行った産
物、および、10 bp、50 bpラダー（BRL社）をMEGARABEL
キットと[γ-³²P]ATPを用いて交換反応により末端ラベ
ルした産物もマーカーとして同時に泳動した。その結
果、この遺伝子が発現していない葉のRNAからは伸長産
物が得られなかったのに対し、未熟穎花の全RNAを鋳型
にした場合には、213Zプライマーでは2本、213Z-2プラ
イマーでは3本の伸長産物のバンドが検出された。隣接
して泳動したシーケンスラダーと比較したところ、産物
の検出された位置は両プライマーとも同じであった。こ
の結果により、RPC213遺伝子には、連続する３ヶ所の転
写開始塩基"CAA"が存在し、転写はこれらシトシンある
いはアデニンから開始されることが判明した。最上流の
転写開始点のＣ（シトシン）の31bp上流にはTATAボック
ス様配列（5'-TATAAAT-3'）が位置していた。このTATA
ボックスから転写開始点までの距離は、植物における他
の遺伝子の例（Joshi, Nucleic Acids Res., 15, 6643-
6653, 1987）とよく似ている。また、この転写開始点Ｃ
の21 bp下流に仮想翻訳開始コドン（一つめのATG）が存
在していた。

【００５０】実施例３ RPC213プロモーターの発現解析 A) プロモーター発現解析用ベクターの構築とイネの形
質転換 単離したプロモーターの発現をin vivoで解析するため
に、GUSレポーター遺伝子を連結したベクターの構築を
以下のように行った（図１）。ベクターはpSB21（Komar
i et al. Plant J., 10, 165-174, 1996）を採用した。
このベクター内の35Sプロモーターの両端にある単一のH
indIII部位と、BamHI部位を利用した。

【００５１】まず、RPG106 SacI 6.0 kb(pBluescript)
をHindIII、BglIIで二重消化し、RPC213遺伝の１つめの
ATGの87 bp下流にあるBglII部位からの上流域約1.8 kbp
から成るプロモーター断片を調製した。この断片を、予
め同酵素で消化し35Sプロモーターを除去したベクターp
SB21と接続した。このプラスミドベクターをpYOT213αG
と命名した。pYOT213αGにおいて、RPC213遺伝子の１つ
めのATGとGUS遺伝子のATGは同じ読み枠となっている。
従って、RPC213遺伝子の翻訳が一つめのATGから開始さ
れた場合、GUSタンパクは融合タンパクとして翻訳され
る。

【００５２】次に、RPC213遺伝子の翻訳が三つめのATG
から開始されることを想定して、また、より広い範囲の
プロモーター断片を調製するために、以下のような方法
でベクターを構築した。まず、ＰＣＲによりプロモータ
ー領域の一部を増幅するため、１組のプライマー 213P-5H-2 ；5'-GACGTGATCCACGGCATTGACG-3' 213P 2ndATG-Bam；5'-CGGGGATCCGTTCTCCTCCACCCACGC-3' を合成した。213P-5H-2はRPG106の唯一のHindIII部位の
上流に位置している。また、213P 2ndATG-BamはRPC213
遺伝子の三つめのＡＴＧ直上流の塩基配列とBamHI部位
を有している。プライマー各100 pmolesと、鋳型のRPG1
06を予めアルカリ変性させたDNA約1 μgと、Extaq（宝
酒造）を用いて100 μlの反応系でＰＣＲを行った。

【００５３】反応条件は、94℃３分を１回、94℃１分、
60℃１分、72℃2.5分を20回、72℃６分を１回とした。
増幅産物をpCRII(Invitrogen社)へクローニングした
後、塩基配列を確認した。このプラスミドをHindIIIとB
amHIで消化し、RPC213プロモーター2.0 kb断片を単離し
た後、予め同酵素で処理して35Sプロモーターを除去し
たベクターpSB21と連結した。完成したプラスミドをさ
らにHindIIIで消化し、脱リン酸化後、RPG106 SacI6.0
kb（pBluescript）をHindIII消化して切り出したRPG106
HindIII 3.3 kb断片を挿入した。このプラスミドベク
ターをpYOT213βGと命名した。このベクターは、RPC213
遺伝子の三つめのATGの直上流約5.3kbのプロモーター断
片の下流にGUS遺伝子が配置された構造を有する。こう
して構築された両ベクターをそれぞれAgrobacterium tu
mefaciens LBA4404株へ三菌系接合により導入してイネ
の形質転換実験に供試した。イネの形質転換は、Hiei e
t al.（Plant J., 6, 271 -282 ,1994）の方法に従い、
イネ品種「月の光」の未熟胚由来カルスを材料とした。

【００５４】B) GUSの組織学的観察によるプロモーター
発現部位解析 pYOT213αGまたはpYOT213βGを導入した形質転換体に関
して、各々の個体から葉、根、および出穂・開花期の穎
花を採取し、Jefferson et al.(EMBO J., 6, 3901-390
7, 1987)の方法に従い、X-gluc.(5-bromo-4-chloro-3-i
ndolyl-β-D-glucuronic acid)を基質としたGUS染色を
行い、実体顕微鏡および光学顕微鏡下で細胞組織学的観
察を行った。穎花内部における調査器官は、雌蕊、葯、
鱗被、内・外穎、および穎花基部とし、プロモーターに
よるGUS発現の強さを４段階設定した（図２）。

【００５５】その結果、pYOT213αGを導入した形質転換
体では、調査を行ったいずれの器官においても、GUS染
色されない個体が多かったが、任意の器官でプロモータ
ー活性によるGUS遺伝子の発現の見られた形質転換体が
５個体得られた。これらの個体のうち、pYOT213αG-17
では、雌蕊と鱗被においてGUS発現が観察され、内・外
穎と穎花基部においても非常に弱い発現が認められた。
この結果は、ノーザンハイブリダイゼーション分析やRT
-PCRの結果とほぼ一致する。またpYOT213αGー4につい
てはGUS発現が雌蕊特異的に検出された。雌蕊での発現
部位は花柱と子房との境界部分であった。５個体のうち
葉と根、および葯におけるGUS発現の見られた個体はな
く、雌蕊における発現が見られたものが２個体、鱗被に
おける発現が見られたものが１個体であった。また、非
常に弱い発現ではあるが、内・外穎、穎花基部における
発現が見られた個体がそれぞれ４個体、３個体あった。

【００５６】一方、pYOT213βGを導入した形質転換体で
は、１３個体中、葉と根におけるGUS発現が全くない
か、または非常に弱く、かつ、花器におけるGUS発現が
検出された個体、即ち花器特異的プロモーター活性を示
した個体が５個体（pYOT213βG-3,7,8,16,17）得られ
た。このうち、雌蕊、鱗被で比較的強く、葯では非常に
弱い、即ちノーザンハイブリダイゼーション分析やRT-P
CRの結果とよく一致する形質転換体は２個体（pYOT213
βG-7と8）であった。花器特異的発現が観察された個体
以外の形質転換体計８個体においても、葉や根における
発現は見られるものの、花器における比較的強いプロモ
ーター活性が認められた。例えば、pYOT213βG-6では、
葉や根におけるGUS発現は観察されるが、それ以上に、
特に雌蕊において強いGUS発現が見られた。また、内・
外穎や、葯、鱗被、および穎花基部において、弱い発現
が見られた。pYOT213βG-17では、葉や根においては発
現が非常に弱いか、または発現がほとんどないが、雌蕊
において比較的強い発現が見られた。pYOT213βGを導入
した形質転換体の雌蕊において、GUS発現が観察される
部位は主に柱頭部で、柱頭軸および柱頭の毛状組織で発
現が見られた。

【００５７】器官別にGUS発現結果をまとめる（図２）
と、葉、根においては、強い発現の見られた個体はな
く、葉で全体の1/2強、根で全体の1/3弱の個体で普通〜
弱い発現が認められたが、残りの個体に関しては発現が
非常に弱いか、または全くなかった。これに対して、花
器においては、葯以外の全ての器官、即ち雌蕊、鱗被、
内・外穎、および穎花基部において、強いプロモーター
活性が認められた。このうち特に雌蕊については、１３
個体全てにおいて明確なGUS発現が認められ、うち１個
体で青色に強く染まるGUS染色像（強い発現）が得られ
た。また、鱗被と内・外穎においても全体の2/3程度の
個体でプロモーター活性によるGUS遺伝子の発現が認め
られ、このうちのさらに半数以上の個体（それぞれ５個
体、６個体）で強いGUS発現が検出された。また、穎花
基部で強い発現を示す個体が２個体あった。

【００５８】以上のことから、GUS遺伝子と接続した２
つのDNA断片が、花器で優勢なプロモーター活性を有し
ていることが明らかとなった。また、その活性の強さ
は、断片長のより長い２１３βの方が高かった。２１３
βのプロモーター活性が２１３αの活性よりも高かった
一方で、上述のように両プロモーター断片の器官特異性
はよく似ていることから、２１３βの塩基配列中に含ま
れ、かつ２１３αの塩基配列中には存在しない２１３α
より５’側のSacI-HindIII 3.3 kb断片か、若しくは２
１３αより３’側のBglIIからRPC213遺伝子の３つめのA
TGまでのDNA配列中に（おそらく後者に）RPC213プロモ
ーターの発現量を制御する（高発現に寄与する）塩基配
列が含まれているものと考えられる。

【００５９】実施例４ RPC213遺伝子の第一イントロン
配列、それに隣接する転写開始点から3rd ATGまでのエ
クソン配列、ならびにその両方からなる配列の遺伝子発
現増強効果の解析 RPC213遺伝子は、最も上流の転写開始点から21bp下流に
一つめのATG(1st ATG)がある。その146bp下流には長さ8
1bpのイントロン（第一イントロン）が存在し、また354
bp下流には三つめのATG(3rd ATG)がある。イントロンの
スプライシングが起こるとこれら二つのATGは同じ読み
枠となる。1st ATGの112bp下流に別のフレームでATG(2n
d ATG)が存在するが、このフレームではイントロンのス
プライシングが起こると、3rd ATGの23bp上流に終止コ
ドン（TGA）が出現し、長いORFが組めない（図３、
４）。従って、この2nd ATGは植物細胞内においてRPC21
3遺伝子の翻訳開始コドンとしては使用されていないも
のと考えられる。

【００６０】先述のプロモーター発現解析の結果から、
213遺伝子の1st ATGから3rd ATGまでの領域が、同遺伝
子の発現制御に重要な役割を果たしていることが示唆さ
れたので、この領域の遺伝子発現増強効果を解析した。

【００６１】A）プラスミドの構築 上記のＤＮＡ配列情報を基にＰＣＲを用いてRPC213遺伝
子の第一イントロン、およびそれを含む転写開始点から
3rd ATG直前までのエクソン配列をクローン化した。 第一イントロンの増幅用として一組のプライマー 213inFW1 5'-GGGTCTAGACCTGCACGTACTAGGTATAGTAGC-3' 213inRV1 5'-CACCCCGGGCCGTCGTCCCCTGCAAGG-3' を合成した。また、第一イントロンを含み、転写開始点
から3rd ATG直前まで配列の増幅には以下の一組のプラ
イマー 213ledFW1 5'-TCGTCTAGAAAGGCAGAAAAGAAAGCCAATG-3' 213ledRV1 5'-AGCGGGCCCGGGTTCTCCTCCACCCACGC-3' を合成した。これらのプライマー内部には、後のクロー
ニング用にXbaIまたはSmaIの制限部位が組み込んであ
る。イントロン増幅用プライマーによって増幅されるＤ
ＮＡ断片には81bpのイントロンの他に、その５’側に15
bpのエクソン、３’側に12bpのエクソンが付加される。
また、第一イントロンを含み、転写開始点から3rd ATG
直前まで配列増幅用プライマーによって得られるＤＮＡ
断片は、374bpの長さの配列をもつことになる。ＰＣＲ
反応液の組成は、50μlの反応溶液中に、10ngの鋳型Ｄ
ＮＡ（RPG106 SacI 6.0kb）、10pmolesのプライマー、
0.2mM dNTPs、１×GCbuffer (takara)、2.5 UのEx-taq
とした。反応条件は96℃3分を１回、96℃1分、55℃1
分、72℃1分を30回、最後に72℃6分を１回行った。ＰＣ
Ｒ産物はベクターpCRII（Invitrogen社）へ一旦クロー
ニングし、塩基配列の確認を行った。その結果、ＰＣＲ
産物の塩基配列と、それに対応する鋳型ＤＮＡの塩基配
列は完全に一致した。以上２つの塩基配列を配列表の配
列番号２および１に示した。

【００６２】次にpCRIIにクローニングされたイントロ
ンと、それを含む転写開始点から3rdATG直前までの配列
を、XbaIとSmaIで二重消化することで抜き出し、同酵素
で消化したベクターpBI221 (CLONTECH社より購入)へ組
み込んだ（それぞれpYT213I、pYT213RI、図４）。

【００６３】pYT213RIにおいて、もし1st ATGから翻訳
が開始された場合でも、GUS遺伝子のフレームと一致す
る。この場合、GUSタンパク質のＮ末端に新たに90残基
のアミノ酸が付加されることになる。そこで、このよう
な可能性を除去するために、1st ATGと、その112bp下流
に別のフレームで存在する2nd ATGの両方を持たない、R
PC213遺伝子の転写開始点から3rd ATG直前まで配列、お
よび第一イントロン配列を含む同配列をＰＣＲにより作
成した。

【００６４】RPC213遺伝子の1st ATG周辺の配列から成
り、このATGが、AAGに置換されたプライマー 213ledFW-atg 5'-TCGTCTAGAAAGGCAGAAAAGAAAGCCAAAGGC
GTC-3' を合成し、先述の213ledRV1と組み合わせ、RPG106 SacI
6.0kbを鋳型にPCRを行った（図３A）。PCRの反応液の
組成、反応条件はpYT213RI、pYT213Iの場合に準じた。P
CR産物をpCRIIへクローニングし、塩基配列を確認した
後、制限酵素XbaI、SmaIで二重消化し、断片を同酵素で
消化したベクターpBI221へ組み込んだ（プラスミド
A）。

【００６５】RPC213遺伝子は、1st ATGの11bp下流に制
限部位StuI、3rd ATGの20bp上流に制限部位MluIが存在
する。また1st ATGとイントロンの間に制限部位BglII、
イントロンと3rd ATGの間に制限部位Eco52Iが、図３に
示した配置で存在する。上述のRPG106 SacI 6.0kbを制
限酵素StuI、MluIで二重消化し、得られた約0.32kb断片
の両端をklenow(takara)で処理し平滑末端化した。この
断片を、pBI221をSmaIで消化しCIP処理を行ったプラス
ミドとライゲーションし、35SプロモーターとGUS遺伝子
の間にRPC213の第一イントロンと隣接エクソンからなる
配列が正しい方向に組み込まれたプラスミドを構築した
（プラスミドB）。プラスミドAおよびBに含まれるRPC21
3遺伝子由来のＤＮＡ断片には、ただ一つのATG（一つめ
のATGの112bp下流に別のフレームで存在する2nd ATG）
が存在するが、このATGから翻訳が開始された場合、先
述のように短いORF内で翻訳が終了してしまう可能性が
あるので、このATGをリンキングPCRを用いて以下のよう
に消去した（図３B、C）。

【００６６】まず、この2nd ATG周辺の配列から成り、
このATGの部分がAAGに置換されたプライマー 213FWlink 5'-CTTCTCCAAGGCCTGTACGG-3'を、 また、それに相補的なプライマー 213RVlink 5'-CCGTACAGGCCTTGGAGAAG-3' を合成した。次に、先述のBglI部位の上流部に位置する
プライマー 213FW5Bg 5'-CCAATCATCACATCCATACC-3'を、 また、Eco52I部位の下流部に位置するプライマー 213RV3E52 5'-CCGCCGCAGTCCACACC-3' を合成し、213FWlinkと213RV3E52の組み合わせ、213FW5
Bgと213RVlinkの組み合わせで、別々にPCRを行った（1s
t PCR、図３B、C）。PCR反応は、100μlの反応溶液中
に、800ngの鋳型ＤＮＡ[RPG106 SacI 6.0kb（図３B）、
またはRPC213cDNA（図３C）]、100pmolesのプライマ
ー、0.2mM dNTPs、１×EX-taq buffer (takara)、5.0 U
のEx-taqとした。反応条件は98℃3分を１回、98℃1分、
60℃1分、72℃1分を15回、最後に72℃6分を１回行っ
た。その結果、ゲノムクローン（RPG106 SacI 6.0kb）
を鋳型にした場合、期待通り213FWlinkと213RV3E52の組
み合わせからは153bp断片（図３B frg.1）が、213FW5Bg
と213RVlinkの組み合わせからは67bp断片（同 frg.2）
が増幅した。また、cDNAクローン（RPC213cDNA）を鋳型
にした場合も、期待通りそれぞれ72bp（図３C frg.
4）、67bp断片（同 frg.5）が増幅した。これらのPCR産
物は、klenowで処理し末端のアデニンを取り除いた後、
ゲル精製した。次に213FWlinkと213RV3E52の組み合わせ
によるPCR産物と、213FW5Bgと213RVlinkの組み合わせに
よるPCR産物を同一のチューブ内にいれ、これらを鋳型
に、外側のプライマー213FW5Bgと213RV3E52を用いて、2
nd PCRを行った。PCR反応は、100μlの反応溶液中に、1
00〜500ngの鋳型ＤＮＡ、100pmolesのプライマー、0.2m
M dNTPs、１×EX-taq buffer (takara)、5.0 UのEx-taq
とした。反応条件は98℃3分を１回、98℃1分、60℃1
分、72℃1分を10回、最後に72℃6分を１回行った。この
2nd PCRにより、ゲノムクローン（RPG106 SacI 6.0kb）
を鋳型にした場合、201bpの断片（図３B frg.3）が、ま
た、cDNAクローン（RPC213cDNA）を鋳型にした場合、12
0bpの断片（図３C frg.6）が期待通りそれぞれ増幅し
た。ゲノム配列由来の201bp断片のリンキングPCR産物
を、制限酵素BglII、Eco52Iで二重消化し、同酵素で消
化したプラスミドAまたはプラスミドBへ、組み込むこと
により、それぞれpYT213RI-A、pYT213dRIを構築した
（図４）。また、cDNA配列由来の120bp断片を同様に制
限酵素BglII、Eco52Iで二重消化し、同酵素で消化した
プラスミドAまたはプラスミドBへ、組み込むことによ
り、それぞれpYT213R-A、pYT213dRを構築した（図
４）。pYT213dRI、pYT213dR、pYT213RI-A、およびpYT21
3R-Aに組み込まれたRPC213遺伝子由来のＤＮＡの塩基配
列をそれぞれ、配列表の配列番号５から８に示した。pY
T213RI-Aに含まれるRPC213由来の配列は、転写開始点か
ら3rd ATG直前までのイントロンを含む全配列を含み、1
st ATGと2ndATGのT（チミン）がともにA（アデニン）に
置換されている。pYT213R-Aでは、このうちイントロン
配列がない。また、pYT213dRIでは、pYT213RI-Aに含ま
れるRPC213遺伝子由来の配列のうち、５’側が32bp（従
って、1st ATGは存在しない）、３’側が20bp欠失して
おり、pYT213dRではさらにイントロン配列を欠いてい
る。

【００６７】B）トランジェントアッセイ トウモロコシの黄化葉を材料に、プロトプラストの単離
を行った。植物材料、生育条件、およびプロトプラスト
の単離は基本的にはSheenの文献（Sheen、Plant Cell
3、225-245、1991）に従った。単離したプロトプラスト
はエレクトロポレーション用緩衝液（0.6 M マンニトー
ル、20 mM KClを含む4 mM Mes-NaOH, pH5.7）に懸濁し
た。エレクトロポレーションはバイオラッド社のGene P
ulser を用いて125 μF 、400 V/cmの条件で行った。一
回のエレクトロポレーションで、0.8 mlのエレクトロポ
レーションバッファー中に懸濁された約1 x 10⁵個のプ
ロトプラスト、GUS遺伝子を含む30μgのプラスミドDN
A、ルシフェラーゼ遺伝子を含む15μgのpDO432 (Ow et
al. Science 234: 856-859,1986)、および 75 μgのサ
ケ***DNAを使用した。エレクトロポレーション後、プ
ロトプラストは暗黒下25℃で培養した。回収したプロト
プラストを75μl の 50 mM Tirs-H₃PO₄, pH7.5に懸濁
し、等量の Lysis Reagent Luc (Toyo Ink MFG., Toky
o, Japan)を加えた後、超音波処理により破壊して、酵
素を抽出した。GUSアッセイ（蛍光アッセイ）はJeffers
on の方法に従った。またルシフェラーゼ活性のアッセ
イは、PicaGene (Toyo Ink MFG.)を用いて行った。GUS
活性はco-transformしたルシフェラーゼ活性によって標
準化した (Leckie et al. Biotechniques 17: 52-3, 56
-7、1994)。

【００６８】トランジェントアッセイの結果を表２にま
とめた。

【表２】 表２ RPC213遺伝子の第一イントロン、転写開始点から3rd ATG直前まで配列、 および第一イントロンを含む転写開始点から3rd ATG直前まで配列の遺伝 子発現増強効果 ---------------------------------------------------------------------- プラスミド 構成 GUS活性の相対値 ---------------------------------------------------------------------- pBI221 35Spro-GUS-NOS 1 pYT213RI 35Spro-213leader+intron-GUS-NOS 92.9 pYT213I 35Spro-213intron-GUS-NOS 3.9 pYT213dRI 35Spro-213△5'&3'leader+intron-GUS-NOS 11.3 pYT213dR 35Spro-213△5'&3'leader-GUS-NOS 0.3 pYT213RI-A 35Spro-213leader(-ATG)+intron-GUS-NOS 60.4 pYT213R-A 35Spro-213leader(-ATG)-GUS-NOS 10.5 ---------------------------------------------------------------------- GUS活性はpBI221のそれを１とした場合の相対値で示した。

【００６９】pYT2113RIにおいて、対照としたpBI221の9
0倍以上のGUS活性が検出されたことから、RPC213遺伝子
の第一イントロンを含む転写開始点から3rd ATG直前ま
で配列には非常に強力な遺伝子発現増強効果があること
が明らかとなった。またイントロン配列のみでも、対照
の3.9倍のGUS活性が見られた（pYT213I）。

【００７０】一般にGUSタンパクは、融合タンパク質と
して発現させてもその活性が保持されることが知られて
いる。pYT213RIの場合、トランジェントアッセイに供試
したトウモロコシ葉由来プロトプラスト内において、1s
t ATGから翻訳が開始されている場合、GUSタンパクのN
末端に90残基のアミノ酸配列が付加されている可能性が
ある。これがGUSタンパク質の安定性を増加させ、結果
的に高いGUS活性が検出された可能性が残る。そこで、R
PC213遺伝子由来の断片から翻訳が開始されないような
コンストラクト（ATGフリーコンストラクト）も実験に
供試した。その結果、ATGフリーのpYT213RI-Aにおいて
も、対照の60倍以上のGUS活性が検出された。これはRPC
213のイントロンを含む転写開始点から3rd ATG直前まで
配列そのものに、転写レベルでの遺伝子発現増強効果が
あることを示している。そしてその効果は非常に強力で
ある。また、イントロンを含まない転写開始点から3rd
ATG直前までの配列のみでも対照の10倍程度のGUS活性が
見出された（pYT213R-A）。

【００７１】一方、RPC213遺伝子の転写開始点から3rd
ATG直前まで配列、およびイントロンを含む同配列の遺
伝子発現増強効果は、それらの５’および３’のＤＮＡ
配列を数十塩基削るだけで、効果がかなり低下すること
が明らかとなった。即ち、pYT213dRIでは、pYT213RI-A
のおよそ1/6の活性となり（対照の約11倍）、pYT213dR
では効果はなくなった。これらの結果から、植物細胞内
における内生RPC213遺伝子の発現制御、特に転写制御の
ための、転写開始点から3rd ATG直前までのＤＮＡ一次
構造は、高度に最適化されていることが示唆される。

【００７２】以上の結果から、RPC213遺伝子の転写開始
点から3rd ATG直前までの配列には約10倍の、第一イン
トロンには約4倍の、およびそれらを両方含むＤＮＡ配
列には約60倍の遺伝子発現増強効果があることが明らか
となった。これらのエレメントは、遺伝子工学における
外来遺伝子の高発現に大きく寄与することが期待され
る。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco Inc. <120> 遺伝子の発現量を増大させる新規ＤＮＡ断片 <130> 991306 <160> 25 <210> 1 <211> 374 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 組織の種類：緑葉 直接の起源： ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASHIIゲノミックライブラリー クローン名：RPG106 SacI-SalI 5.4 kb <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴：nt1、nt2：プライマー伸長によって決定されたRPC213遺伝 子の転写開始点 nt21〜nt23：RPC213遺伝子の一つめのATG nt133〜nt135：RPC213遺伝子の二つめのATG nt167〜nt247：RPC213遺伝子の第一イントロン <400> 1 aaaggcagaa aagaaagcca atggcgtctt caggcctcgc agttgcagca acagcctcgt 60 cagcctggct ctgctgcccc aatcatcaca tccataccag cagcagcaga tctcgcaagc 120 atcttcttct ccatggcctg tacgggtctg cacctgcacg tactaggtat agtagctgca 180 actttattca caatgtgatg tcacgttatt atatatgttt cgtcgtcaat ggcggcgaac 240 cttgcagggg acgacggccg ccggtgtgga ctgcggcggc ggccaccgca gcagcgccgg 300 cggacacggc ggcgtcggcg cggcgggagc aggtggagat cgcccggtcg ctgaacgcgt 360 gggtggagga gaac 374 <210> 2 <211> 108 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 組織の種類：緑葉 直接の起源： ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASHIIゲノミックライブラリー クローン名：RPG106 SacI-SalI 5.4 kb <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴：nt16〜nt96：RPC213遺伝子の第一イントロン <400> 2 acctgcacgt actaggtata gtagctgcaa ctttattcac aatgtgatgt cacgttatta 60 tatatgtttc gtcgtcaatg gcggcgaacc ttgcagggga cgacggcc 108 <210> 3 <211> 1524 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 組織の種類：雌蕊 直接の起源： ライブラリー名：雌蕊mRNA由来λZAPII cDNAライブラリー クローン名：RPC213 <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴：nt1、nt2、nt3：プライマー伸長によって決定されたRPC2 13遺伝子の転写開始点 nt22〜nt24：RPC213遺伝子の一つめのATG nt134〜nt136：RPC213遺伝子の二つめのATG nt295〜nt297：RPC213遺伝子の三つめのATG nt1276〜nt1278：RPC213遺伝子の翻訳終止コドン nt1343〜nt1348、nt1365〜nt1370：ポリA付加シグナル nt1507〜nt1524：ポリA <400> 3 caaaggcaga aaagaaagcc a atg gcg tct tca ggc ctc gca gtt gca gca 51 Met Ala Ser Ser Gly Leu Ala Val Ala Ala 1 5 10 aca gcc tcg tca gcc tgg ctc tgc tgc ccc aat cat cac atc cat acc 99 Thr Ala Ser Ser Ala Trp Leu Cys Cys Pro Asn His His Ile His Thr 15 20 25 agc agc agc aga tct cgc aag cat ctt ctt ctc cat ggc ctg tac ggg 147 Ser Ser Ser Arg Ser Arg Lys His Leu Leu Leu His Gly Leu Tyr Gly 30 35 40 tct gca cct gca cgt act agg gga cga cgg ccg ccg gtg tgg act gcg 195 Ser Ala Pro Ala Arg Thr Arg Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala 45 50 55 gcg gcg gcc acc gca gca gcg ccg gcg gac acg gcg gcg tcg gcg cgg 243 Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg 60 65 70 cgg gag cag gtg gag atc gcc cgg tcg ctg aac gcg tgg gtg gag gag 291 Arg Glu Gln Val Glu Ile Ala Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu 75 80 85 90 aac atg ctc ccg ctg ctc acc ccc gtc gac tcc gcg tgg cag ccg cac 339 Asn Met Leu Pro Leu Leu Thr Pro Val Asp Ser Ala Trp Gln Pro His 95 100 105 gac ttc ctt ccc tgc tcg gcc gcg ggc ggc ggc gag gcg ctg gcg gcg 387 Asp Phe Leu Pro Cys Ser Ala Ala Gly Gly Gly Glu Ala Leu Ala Ala 110 115 120 ttc acg gag ggc gtg gcc gag ctg cgc gcg ggc gcc gcc ggc gtg ccg 435 Phe Thr Glu Gly Val Ala Glu Leu Arg Ala Gly Ala Ala Gly Val Pro 125 130 135 gac gag gtg ctg gtc tgc ctc gtg ggg aac atg gtg acg gag gag gcg 483 Asp Glu Val Leu Val Cys Leu Val Gly Asn Met Val Thr Glu Glu Ala 140 145 150 ctc ccG acg tac cag agc atg ggc aac cgc gcc gag ggc ctc gcc gac 531 Leu Pro Thr Tyr Gln Ser Met Gly Asn Arg Ala Glu Gly Leu Ala Asp 155 160 165 170 ggc acc ggc gtg agc ccc ctc ccc tgg gcg cgc tgg ctc cgc ggc tgg 579 Gly Thr Gly Val Ser Pro Leu Pro Trp Ala Arg Trp Leu Arg Gly Trp 175 180 185 acc gcc gag gag aac cgc cac ggc gac ctc ctc aac cgc tac ctc tac 627 Thr Ala glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Arg Tyr Leu Tyr 190 195 200 ctc tcc ggc cgc gtc gac atg cgc cag gtc gag gcc acc gtg cac cgc 675 Leu Ser Gly Arg Val Asp Met Arg Gln Val Glu Ala Thr Val His Arg 205 210 215 ctc ctc cGc aac ggc atg gag atg ctg gcg ccg gcg agc ccg tac cac 723 Leu Leu Arg Asn Gly Met Glu Met Leu Ala Pro Ala Ser Pro Tyr His 220 225 230 ggc ctg atc tac ggc gcg ttc cag gag cgc gcc acc ttc atc tcc cac 771 Gly Leu Ile Tyr Gly Ala Phe gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile Ser His 235 240 245 250 ggc cac acg gcg agg ctc gcg ggg cag cac ggc gac cgg gcg ctc gcc 819 Gly His Thr Ala Arg Leu Ala Gly Gln His Gly Asp Arg Ala Leu Ala 255 260 265 aag atc tgc ggc gtg atc gcc gcc gac gag agg cgg cac gag gcg ggc 867 Lys Ile Cys Gly Val Ile Ala Ala Asp Glu Arg Arg His Glu Ala Gly 270 275 280 tac acg atg gcg tcc gcc agg ctg ttc gag ctc gac ccg gac ggc atg 915 Tyr Thr Met Ala Ser Ala Arg Leu Phe Glu Leu Asp Pro Asp Gly Met 285 290 295 gcg cgc gcg ctg gcg gac gtc atg cgc ggg aag gtg acc atg ccg ggg 963 Ala Arg Ala Leu Ala Asp Val Met Arg Gly Lys Val Thr Met Pro Gly 300 305 310 cag ctc atg tcg gac ggc cgc gac ggc gac ggc gag cac agc ctg ttc 1011 Gln Leu Met Ser Asp Gly Arg Asp Gly Asp Gly Glu His Ser Leu Phe 315 320 325 330 gcc cgg ttc tcc gcc gtg gcg gag cgc gcc ggc gtg tac acg gcg agg 1059 Ala Arg Phe Ser Ala Val Ala Glu Arg Ala Gly Val Tyr Thr Ala Arg 335 340 345 gac tac ggc gaa ctc gtc gag cac ttc gtg cgg agg tgg cgg gtg gcg 1107 Asp Tyr Gly Glu Leu Val Glu His Phe Val Arg Arg Trp Arg Val Ala 350 355 360 gag ctc gcg gcg ggg ctc tcc ggc gag ggc cga cgc gcg cag gag tac 1155 Glu Leu Ala Ala Gly Leu Ser Gly Glu Gly Arg Arg Ala Gln Glu Tyr 365 370 375 ctg tgc ggg ttg gcg ccc aag atc cgg agg atg gag gag ctg gcc cac 1203 Leu Cys Gly Leu Ala Pro Lys Ile Arg Arg Met Glu Glu Leu Ala His 380 385 390 cgg agg gcg gcc cgc atc gag ccc gct atg gcc cgt ttc agc tgg atc 1251 Arg Arg Ala Ala Arg Ile Glu Pro Ala Met Ala Arg Phe Ser Trp Ile 395 400 405 410 ttc gat agg ccc gtc atg ctg ggc tga tcaacccggg gcttcggtta tggtttt 1305 Phe Asp Arg Pro Val Met Leu Gly 415 atgggcccgt ttactgggct ctgcttgctc aaattataat aagctacatc gtgtgctaaa 1365 ataatttatc tttgttatta aggattcgtg tgagaaagct attttgtttt ctgtagcaag 1425 tttaggaatg taatgtaatg taatgaagcg gcaggacgac tgccatttga ttaagaaaag 1485 actcgcgctt gtttgtagtc caaaaaaaaa aaaaaaaaa 1524 <210> 4 <211> 5396 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 直接の起源： ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASHIIゲノミックライブラリー クローン名：RPG106 SacI-SalI 5.4 kb <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴：nt1〜nt5369、nt3335〜nt5108：GUSによってプロモーター 活性を確認した配列 nt4964〜nt4969：TATAボックス様配列 nt4995、4996、4997：プライマー伸長によって決定されたRP C213遺伝子の転写開始点 nt5016〜nt5018：RPC213遺伝子の一つめのATG nt5128〜nt5130：RPC213遺伝子の二つめのATG nt5370〜nt5372：RPC213遺伝子の三つめのATG nt5162〜nt5242：イントロン配列 nt1〜nt6：制限酵素SacI部位 nt729〜nt734、nt2811〜nt2816、nt5103〜nt5108： 制限酵素BglII部位 nt3335〜nt3340：制限酵素HindIII部位 <400> 4 gagctcatgt gaccgttctc ggtgagttca gagataacgt ttagacttcc cttatcagcc 60 tcgtgcgggc acctataggg tttgtctgag tcaatctccg atgtcagcca agaaagaaca 120 gagcatacga gtaaatctcc cgtcttgctg taatcaagaa tttggattga agtcaagaaa 180 ttttatctcg gcaggtacac catctcttca ttccgtattc cttgtcgaga tccaccaacc 240 gttctcgagt gatcgagaag gtgtagaatc tgcgacggag ctttgtcgac atttgtcgta 300 ctcgccttag tcgatcttgg tgtagaacca tagagacatg gagccttcgt caatgtcgaa 360 tagaattttc ctgaaatcaa tactcataaa agaatattag atagaaataa cccccgagcg 420 aacgctcaaa gggtaacatg ttatacaatg tatggaaaac tgaaaatgaa ttaaatttac 480 agaccaatgt tttgtatatg agcgtctact cttttaccga cttcgatcag tcaatttgtt 540 aagttatata ctttccctag cccctagcct tgtcgttgga gaatcgttct cggaagataa 600 ggctcttgga cctttgacct gcctcggttg aacaagcact aatcctagcc cccagccgtg 660 aagttggaaa acccgatttc cgattacacg gcttggttaa tacgcacggc gagaactctt 720 acacgaccag atcttacatg gtcttttgtc tctacagtat ccgacaaggc cttattggct 780 ctgggcgtcc ccagccgaag ttcccttagg ttcctcggag gccttgtcaa gacggtgtaa 840 agggacagta ggataggttt caacgctagg tgtcatcgtg gtaagggatc tctgggtaaa 900 acacttggcg atcttgtgta cctgatatca actttgttgg agtaaaggta atgggagaat 960 cgctacacct ctggttgagg accaggtggt agtcgcaact cgaccacttg aagtagaaat 1020 agtgggagaa tcgctacacc gctggtcgag aaccaagtag tagtctaaac tcgaccacta 1080 gaattaaagg tagtgggaga atcgctacac cgctggtcga gaactaggta tagtctaaac 1140 tcgaccacta gaagtaaagg tagtgggaga atcgctacac cgctggtcga ggaccaggta 1200 gtagtcgtaa ctcgaccact agaagtggaa atagtgggag aatcgctaca ccgctggtcg 1260 agaaccaggt gtaatctaaa ctcgaccact tgaagtaaat gtgcgagaga tcgctacgat 1320 tgacgggtct agaaccagtg agtaggtgtc tctcaaccat cttaagtcat ggtgcgagga 1380 ctgctgcgtt attgctgtag tcgtacctcg accatctaaa gttaaggtgc gagagattgc 1440 tacgttttac tagttcaaga accagcgagc gagtagaatt atctctcgaa caccaatgaa 1500 agttgcggtg cgagagattg ctacgtactg gttcgaggac catcgagcga gtagaattat 1560 ctctcgaaca ccaatggaag ttgcggtgcg agagatttct acgtactggt tcgagaacca 1620 gcgagcgagt agaatcatct ctcgaacacc aatggaggtt gcggtgcgaa agattaatat 1680 gcactggttc gaggaccagc gaacgtgtag agttatatct cgaacaccaa tggaagttgc 1740 ggtgcgagag attgctacgt actagttcga ggaccatcga gcgagtagaa ttatttctcg 1800 aacaccaatg gaagttgcgg tgcgagagat tgctacgtac tggttcgaga accagcgagc 1860 gagtagaatt atctctcgaa caccaatgga agtttgcggt gcgagagatt gctacgtact 1920 ggttcaagaa ccatggaagt tgcggtgcga gagatttcta tgtactggtt cgaggaccag 1980 ggagcgagta gaattatctc tcgaacacca atggaagttt gcggtgcgag agattgctac 2040 gtactggttc gagaaccagt gaatgtgtag agttatctct cgaacaccaa tggaggttgc 2100 ggtgcgagag attgctacgt actggttcga gaaccagcga acgtgtagag ttatctctcg 2160 aacacatgga ggttgcggtg cgagagattg ctacgtactg gttcgaggac cagtgaacgt 2220 gtagagttat ctctcgaaca ccaatggagg tgctagagtt ggtttattac atatgcgtct 2280 catgtggcca gcatgactca cacacccaac ttgtagcata tccggatgtc tgttcgcaag 2340 catgtcgggt gatcaagccg acagcgctcg cgaggaatta tccgttaaca accttttctc 2400 gagtagtcta gccatggcgg gtgctatgag ataggtcgtc ggtcttcgtt ggtgggttgg 2460 gcgtgacgac tttgcatttg tcgagatcgt tctcgataat gcggtgtact tgaccacaac 2520 ctagtcgagt gctcaattgt tcctgaaaaa tattttctag aagacaagac atatagcaga 2580 taatatcgag tatgtactca gaaaactgca tggatcttct agtattatca ggatgtaacg 2640 agcagatgta aatattaggc attatgtaaa ccgtaaacaa gcatgattca tacaaaagag 2700 aatagagcga gccccagtgt tagaccgttg tcggcctaac accggaaaca ctcacataat 2760 aaatattgta taaaaaacat gctctaggta aacataataa attatattat agatctgaca 2820 attctgtatg atctgaatag gtacgataaa ttgcatataa aatattgcgt acctttgtag 2880 atacatgccg gatgtatcta cgaaattagt agattcaatc tactgaatac ctttgccttc 2940 ttggtgagga acagcaactc cttaatatgc ttttgcgtgc atggtactgt cccccgtgca 3000 cgtaccatgt aatctggtca tttaattgac ctgtttgtct ttagccccga gtcagattgc 3060 tgcctagaga ttggatagta gtgcagacgt ggaaactccc cgagtccgac tagcatttac 3120 accaataagc agatcaatcc gacgctttga tttccgctcc acgacgcgct tgttttgttg 3180 gtggagatcg atgccgtgtt cggcttggac gcggttaatc gagccctcca ccagttgatg 3240 tggcgcgtgt attggtactg atcaatctcg aaggttgtct gcactgttga ttgacaacct 3300 caaaattgac gtgatccacg gcattgacgt cttgaagctt gagcgatcct gataaatcga 3360 atttgttgac gacgattgtt ccgatctcgt cgggacacgt attctggtag gtttagatca 3420 cccaacagcg aagttgtcga gtagattgtt gtcggagaat ccatctctta aacccatctc 3480 gtcgaaatcc tgaagcacca aaatccccct acctggcgtg ccattatcga cgtttgatgt 3540 ctcgactacg gtatttgcat gtcatggggg atcgttggta ctaggatata cgcgagactg 3600 acgtaaaaga gatggagaca gggattttta tacaggttcg ggcccctgaa ttgtcatata 3660 ataaccctac atcctgttgg ccgaagccgg tattgctctt attcatgata atcacaccat 3720 tacaatattt agggtagcct atctaactat tgtcgacatg gcggtctgac gatctgactc 3780 gtagtcgaca acagggtagc cttcctcctc gaacctgtgc ctgacgagat cagagatagc 3840 gctttcgtct ctcctgacag tatcctgaga caccgtaggg gacttgtcgt gcctatctct 3900 gaagtcgata tccggcgtct tgtcttggcg tatgttggct tgtattggct tgtggctttg 3960 tggcgtttat gttgctcgta tattgtggtg ggtgtgtatt gtccgtgtct tgtatggtgg 4020 gtgtcgattg tgtcccattt ccttctaggg gaccttgtat ttatacccat aggtgtcccc 4080 ttgtccaagt agaactaggg aaaccaatat ggatacaatc cgattagtcc tttgtcgttt 4140 ccatgtagaa ctttggttgt ctttctttat ccggaactcc tcctatatcc gcaggttatt 4200 ttcgtatagg acatgttatg tggtgggtcc taccgagatt tagtcaacta ctattaggta 4260 tgtggtatcc ataaccctga cacataccat gatttttctg tctatcaata actgcctcgg 4320 tgaacttgaa gaagtaggtt gttattgcag caataatgag acaaactagt atttatttat 4380 gatatccctt ggttaagtag tcatgcgtta taataggaac ctctaattcc ctcgtaaata 4440 cagctaagtt tattataaca agagctttaa taatattaaa attgtagcct tttttggatt 4500 tgtacgaaat aattagcctt aaaaaacatt taatgttggt tagctcaaaa tatttggaaa 4560 tggagtgagt atatgttact gacttcaaaa atttttcaaa cggtattcat gtcgttttcg 4620 tgagtggact gaaacagcag taattacatt gaacatttga acacctgtat aaagtattaa 4680 atatatacta aaaaataatt aattatacat attacgacta atttgcaaga cgaatctttt 4740 aagcataatt gctccatgat ttaacaatat agtgctacag taaacatgtg ctaatgacgg 4800 attaattagg cttaataaat tcgtctcacg tttactgacg gattctataa ttgatttttt 4860 tattaatgcc caaacacccc atacaacact ctatataata ctcaatgtga cgtgccaaaa 4920 ctttagacac ctggatgtaa acaccactct gttccttctc ctctataaat ggcaccgggg 4980 tggtttgtcg gcaccaaagg cagaaaagaa agcca atg gcg tct tca ggc ctc 5033 Met Ala Ser Ser Gly Leu 1 5 gca gtt gca gca aca gcc tcg tca gcc tgg ctc tgc tgc ccc aat cat 5081 Ala Val Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Trp Leu Cys Cys Pro Asn His 10 15 20 cac atc cat acc agc agc agc aga tct cgc aag cat ctt ctt ctc cat 5129 His Ile His Thr Ser Ser Ser Arg Ser Arg Lys His Leu Leu Leu His 25 30 35 ggc ctg tac ggg tct gca cct gca cgt act ag[g tatagtagct gcaactttat5182 Gly Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Ala Arg Thr Arg 40 45 tcacaatgtg atgtcacgtt attatatatg tttcgtcgtc aatggcggcg aaccttgcag]5242 g gga cga cgg ccg ccg gtg tgg act gcg gcg gcg gcc acc gca gca gcg 5291 Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala Ala Ala Ala thr Ala Ala Ala 50 55 60 65 ccg gcg gac acg gcg gcg tcg gcg cgg cgg gag cag gtg gag atc gcc 5339 Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg Arg Glu Gln Val Glu Ile Ala 70 75 80 cgg tcg ctg aac gcg tgg gtg gag gag aac atg ctc ccg ctg ctc acc 5387 Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu Asn Met Leu Pro Leu Leu Thr 85 90 95 ccc gtc gac 5396 Pro Val Asp 100 <210> 5 <211> 325 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 直接の起源： ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASHIIゲノミックライブラリー クローン名：RPG106 SacI-SalI 5.4 kb <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：改変ゲノムＤＮＡ 配列の特徴：nt1〜nt3：制限部位StuIの後半 nt321〜nt325：制限部位MluIを平滑末端化した前半 nt100：変異導入（チミンをアデニンに） nt133〜nt213：RPC213遺伝子の第一イントロン <400> 5 cctcgcagtt gcagcaacag cctcgtcagc ctggctctgc tgccccaatc atcacatcca 60 taccagcagc agcagatctc gcaagcatct tcttctccaa ggcctgtacg ggtctgcacc 120 tgcacgtact aggtatagta gctgcaactt tattcacaat gtgatgtcac gttattatat 180 atgtttcgtc gtcaatggcg gcgaaccttg caggggacga cggccgccgg tgtggactgc 240 ggcggcggcc accgcagcag cgccggcgga cacggcggcg tcggcgcggc gggagcaggt 300 ggagatcgcc cggtcgctga acgcg 325 <210> 6 <211> 244 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 組織の種類：雌蕊 直接の起源： ライブラリー名：雌蕊mRNA由来λZAPII cDNAライブラリー クローン名：RPC213 <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：改変cDNA to mRNA 配列の特徴：nt1〜nt3：制限部位StuIの後半 nt240〜nt244：制限部位MluIを平滑末端化した前半 nt100：変異導入（チミンをアデニンに） <400> 6 cctcgcagtt gcagcaacag cctcgtcagc ctggctctgc tgccccaatc atcacatcca 60 taccagcagc agcagatctc gcaagcatct tcttctccaa ggcctgtacg ggtctgcacc 120 tgcacgtact aggggacgac ggccgccggt gtggactgcg gcggcggcca ccgcagcagc 180 gccggcggac acggcggcgt cggcgcggcg ggagcaggtg gagatcgccc ggtcgctgaa 240 cgcg 244 <210> 7 <211> 374 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 直接の起源： ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASHIIゲノミックライブラリー クローン名：RPG106 SacI-SalI 5.4 kb <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：改変ゲノムＤＮＡ 配列の特徴：nt1、nt2：プライマー伸長によって決定されたRPC213遺伝 子の転写開始点 nt22：変異導入（チミンをアデニンに） nt134：変異導入（チミンをアデニンに） nt167〜nt247：RPC213遺伝子の第一イントロン <400> 7 aaaggcagaa aagaaagcca aaggcgtctt caggcctcgc agttgcagca acagcctcgt 60 cagcctggct ctgctgcccc aatcatcaca tccataccag cagcagcaga tctcgcaagc 120 atcttcttct ccaaggcctg tacgggtctg cacctgcacg tactaggtat agtagctgca 180 actttattca caatgtgatg tcacgttatt atatatgttt cgtcgtcaat ggcggcgaac 240 cttgcagggg acgacggccg ccggtgtgga ctgcggcggc ggccaccgca gcagcgccgg 300 cggacacggc ggcgtcggcg cggcgggagc aggtggagat cgcccggtcg ctgaacgcgt 360 gggtggagga gaac 374 <210> 8 <211> 293 <212> DNA <213> Oryza sativa L. 品種名：IR24 組織の種類：雌蕊 直接の起源： ライブラリー名：雌蕊mRNA由来λZAPII cDNAライブラリー クローン名：RPC213 <220> <223> 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：改変cDNA to mRNA 配列の特徴：nt1、nt2：プライマー伸長によって決定されたRPC213遺伝 子の転写開始点 nt22：変異導入（チミンをアデニンに） nt134：変異導入（チミンをアデニンに） <400> 8 aaaggcagaa aagaaagcca aaggcgtctt caggcctcgc agttgcagca acagcctcgt 60 cagcctggct ctgctgcccc aatcatcaca tccataccag cagcagcaga tctcgcaagc 120 atcttcttct ccaaggcctg tacgggtctg cacctgcacg tactagggga cgacggccgc 180 cggtgtggac tgcggcggcg gccaccgcag cagcgccggc ggacacggcg gcgtcggcgc 240 ggcgggagca ggtggagatc gcccggtcgc tgaacgcgtg ggtggaggag aac 293 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 cgctatggcc cgtttcagct 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 gtcgtcctgt cgcttcatta c 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gtatccatga gactacatac aact 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tactcagcct tggcaatcca ca 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 tgctggtatg gatgtgatg 19 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 ctgacgaggc tgttgctg 18 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 gacgtgatcc acggcattga cg 22 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 cggggatccg ttctcctcca cccacgc 27 <210> 17＜２１１＞ ３３ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜４００＞ １７ ｇｇｇｔｃｔａｇａｃ ｃｔｇｃａｃｇｔａｃ ｔａｇ
ｇｔａｔａｇｔ ａｇｃ 33 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 caccccgggc cgtcgtcccc tgcaagg 27 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 tcgtctagaa aggcagaaaa gaaagccaat g 31 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 agcgggcccg ggttctcctc cacccacgc 29 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 tcgtctagaa aggcagaaaa gaaagccaaa ggcgtc 36 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 cttctccaag gcctgtacgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 ccgtacaggc cttggagaag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 ccaatcatca catccatacc 20 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 ccgccgcagt ccacacc 17

【図面の簡単な説明】

【図１】プロモーター発現解析用ベクターの構築手順を
示した模式図である。

【図２】２１３プロモーターのＧＵＳによる発現部位解
析結果をまとめたグラフである。

【図３】ATGフリー断片の調製手順を示した模式図であ
る。

【図４】トランジェントアッセイに供試したプラスミド
の構造を示した模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA12 CA04 DA01 EA04 FA02 FA10 GA11 HA14 HA20 4B063 QA01 QA08 QQ04 QQ09 QQ43 QR08 QR32 QR55 QS25 QS34 QX07

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の１ないし１５２番目付近の
   いずれか一つの塩基から２５９ないし３７４番目付近の
   いずれか一つの塩基までの塩基配列を含み、且つ遺伝子
   の発現量を増大させるＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号１の１番目付近の塩基から３７
   ４番目付近の塩基までの塩基配列を含み、且つ遺伝子の
   発現量を増大させるＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号１の３５番目付近の塩基から３
   ５９番目付近の塩基までの塩基配列を含み、且つ遺伝子
   の発現量を増大させるＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 配列番号１の１５２番目付近の塩基から
   ２５９番目付近の塩基までの塩基配列を含み、且つ遺伝
   子の発現量を増大させるＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか１項におい
   て定義された塩基配列から、配列番号１の１６７番目付
   近の塩基から２４７番目付近の塩基までの部分が除去さ
   れた塩基配列を含み、且つ遺伝子の発現量を増大させる
   ＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれか１項におい
   て定義された塩基配列中において、最初に出現する開始
   コドンＡＴＧおよび二番目に出現する開始コドンＡＴＧ
   の一方または両方が開始コドン以外のコドンに修飾され
   た塩基配列を含み、且つ遺伝子の発現量を増大させるＤ
   ＮＡ断片。
7. 【請求項７】 配列番号１、２、５、７または８に示し
   た塩基配列、もしくはそれらの一部の配列、またはこれ
   らの配列のうち１または複数のヌクレオチドが欠失、置
   換、挿入もしくは付加された塩基配列を含み、且つ遺伝
   子の発現量を増大させるＤＮＡ断片。
8. 【請求項８】 配列番号１、２、５、７または８に示し
   た塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条
   件でハイブリダイズし、且つ遺伝子の発現量を増大させ
   るＤＮＡ断片。
9. 【請求項９】 宿主細胞で発現させるために外来遺伝子
   をプロモーターの下流に配置したＤＮＡ断片からなるＤ
   ＮＡ構築物に、請求項１ないし８のいずれか１項のＤＮ
   Ａ断片を組み込み、該ＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転
   換することにより、請求項１ないし８のいずれか１項の
   ＤＮＡ断片が組み込まれていないＤＮＡ構築物で宿主細
   胞を形質転換した場合に比べて、宿主細胞による外来遺
   伝子の発現を増大させる方法。