JP2001031564A - Telomerase inhibitor - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a telomerase inhibitor having an inhibitory action on telomerase activity of cancer cells, therefore useful in the therapies of various carcinomas as an antitumor agent, esp. anti-malignant tumor agent by including flavomannin. SOLUTION: This inhibitor is obtained by including, as active ingredient, flavomannin of the formula or a physiologically acceptable salt thereof. The compound of the formula is obtained, preferably, by using, as flavomannin- productive bacteria, microorganisms belonging to the order Eurotiales, the class Plectomycetes, the subphylum Ascomycotina, culturing the above microorganism, and isolating the objective compound from the cultured product, wherein it is preferable that the above culture is carried out under aerobic conditions at 15-30 deg.C. The compound of the formula may by used directly as a medicament, however, it is desirable that a pharmaceutical composition is prepared by adding at least one ingredient for pharmaceutical use to the above compound and administered, wherein the above pharmaceutical composition may be formulated with an active ingredient, or the like, of another telomerase inhibitor or antitumor agent.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明はフラボマンニン又は
生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むテロ
メレース阻害剤に関する。また、本発明はフラボマンニ
ン又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含
み、抗腫瘍剤として有用な医薬に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a telomerase inhibitor containing flavomannin or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient. The present invention also relates to a medicament which contains flavomanin or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient and is useful as an antitumor agent.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、ホジキン病に代表されるいくつか
の癌が根治可能となり、他の多くの癌種に対しても有効
な治療方法が開発されている。また、細胞の悪性化のメ
カニズム、増殖因子やその受容体、細胞内情報伝達系、
癌遺伝子や癌抑制遺伝子の役割に関して多くの報告がな
されている。もっとも、癌に対しての理解が深まるにつ
れて、癌を形成するに至る悪性化のメカニズムが個々の
癌に共通のものではなく、癌が非常に多様性に富んだ疾
患であることも解明されつつあり、それぞれの癌が持つ
悪性化要因の組み合わせの複雑さが癌治療の大きな障壁
となることも明らかになってきている。2. Description of the Related Art In recent years, some cancers typified by Hodgkin's disease have become curable, and effective treatment methods have been developed for many other cancer types. In addition, the mechanism of malignant transformation of cells, growth factors and their receptors, intracellular signaling systems,
There have been many reports on the role of oncogenes and tumor suppressor genes. However, as the understanding of cancer deepens, it is becoming clear that the mechanism of malignancy that leads to the formation of cancer is not common to individual cancers, and that cancer is a very diverse disease. It is becoming clear that the complexity of the combination of malignant factors in each cancer is a major barrier to cancer treatment.

【０００３】一方、最近、正常細胞の老化と癌細胞の不
死化のメカニズムとの関係が遺伝子レベルで解明されつ
つある。真核細胞の染色体ＤＮＡは直鎖状であり、この
末端部分はテロメアと呼ばれる単純な繰返し配列からな
る。このテロメアが染色体の構造、機能に重要な役割を
果たすことは以前から知られていたが［Ｍｏｙｚｉｓ
Ｒ．Ｋ.ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ、８５、ｐ．６６２２（１９８８年）］、細胞が
***を重ねるごとにテロメアを徐々に失い、一定回数分
裂した後に増殖能力を失って細胞の老化が生じること
と、テロメアを合成付加する酵素テロメレースが癌細胞
の不死化に重要な働きを担っていることが示唆された。
［Ｋｉｍ Ｎ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６、ｐ．
２０１１（１９９４年）］。On the other hand, recently, the relationship between the aging of normal cells and the mechanism of immortalization of cancer cells has been elucidated at the genetic level. The chromosomal DNA of eukaryotic cells is linear, and its terminal portion consists of a simple repeating sequence called telomere. It has long been known that this telomere plays an important role in chromosome structure and function [Moyzis
R. K. et al., Proc Natl Acad Sci.
USA, 85, p. 6622 (1988)], the cells gradually lose telomeres as they divide, and after a certain number of divisions, lose their proliferative ability, resulting in senescence of the cells, and the enzyme telomerase, which synthesizes and adds telomeres, immortalizes cancer cells. It is suggested that they play an important role in the development.
[Kim N. W. Et al., Science, 266, p.
2011 (1994)].

【０００４】ほとんどの癌細胞はテロメレース活性を有
していることが既に知られており、これにより細胞***
に伴うテロメア短小化に拮抗することで無制限な増殖を
可能にしていると考えられる。一方、多くの正常体細胞
はテロメレース活性をもたず、細胞***にともなうテロ
メア短小化と、それによる細胞老化が観察される。これ
らのことから、テロメレース活性の阻害剤は癌細胞の無
限増殖性を選択的に阻害することができ、より多様な癌
種に適応可能な抗腫瘍剤になると考えられる［Ｅｇｏｒ
ｏｖ Ｅ．Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６２、
ｐ．１２９６（１９９７年）］。[0004] It is known that most cancer cells have telomerase activity, and it is thought that this allows antagonism of telomere shortening accompanying cell division to allow unlimited growth. On the other hand, many normal somatic cells do not have telomerase activity, and telomere shortening accompanying cell division and cell senescence due to the shortening are observed. From these facts, it is considered that an inhibitor of telomerase activity can selectively inhibit the infinite proliferation of cancer cells and be an antitumor agent applicable to a wider variety of cancer types [Egor
ovE. E. FIG. Et al., Biochemistry, 62,
p. 1296 (1997)].

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、テロ
メレース阻害剤を提供することにある。また、本発明の
別の課題は、テロメース阻害作用を有する物質を有効成
分として含み、抗腫瘍剤などに有用な医薬を提供するこ
とにある。An object of the present invention is to provide a telomerase inhibitor. Another object of the present invention is to provide a medicament useful as an antitumor agent or the like, which contains a substance having a telomere inhibitory action as an active ingredient.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物が
抗生物質などの生理活性物質を生産することに着目し、
自然界より多数の試料を採取して、それらから分離され
た多種類の培養物についてテロメレース阻害作用を有す
る物質を見出すべく鋭意検討を重ねた。その結果、子嚢
菌亜門不整子嚢菌綱ユーロチウム目に属する菌株の培養
物中にテロメレース阻害作用を有する物質が含有されて
いることを見出した。本発明者らはその物質の構造を明
らかにし、本発明を完成するに至った。The present inventors have focused on the fact that microorganisms produce bioactive substances such as antibiotics,
Numerous samples were collected from nature, and intensive studies were conducted on various types of cultures separated therefrom to find substances having a telomerase inhibitory action. As a result, they found that a substance having an inhibitory effect on telomerase was contained in a culture of a strain belonging to the order of the order Eurotium of the subphylum Ascomycota. The present inventors have clarified the structure of the substance and completed the present invention.

【０００７】すなわち、本発明により、下記の式
（Ｉ）：That is, according to the present invention, the following formula (I):

【化２】 で表わされるフラボマンニン又は生理学的に許容される
その塩を有効成分として含むテロメレース阻害剤が提供
される。別の観点からは、本発明により、上記の式
（Ｉ）で表されるフラボマンニン又は生理学的に許容さ
れるその塩を有効成分として含む医薬が提供される。こ
の医薬は、癌細胞のテロメース活性を抑制する作用を有
しており、抗腫瘍剤、好ましくは抗悪性腫瘍剤として多
様な癌種の治療に用いることができる。Embedded image A telomerase inhibitor comprising as an active ingredient flavomannin or a physiologically acceptable salt thereof represented by the following formula: From another aspect, the present invention provides a medicament comprising as an active ingredient flavomannin represented by the above formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof. This medicament has an action of suppressing the telomere activity of cancer cells, and can be used as an antitumor agent, preferably an antineoplastic agent, for treating various cancer types.

【０００８】また、さらに別の観点からは、テロメレー
ス阻害剤の製造のための上記の式（Ｉ）で表されるフラ
ボマンニン又はその塩の使用、及び上記の医薬、好まし
くは抗腫瘍剤、より好ましくは抗悪性腫瘍剤の製造のた
めの上記の式（Ｉ）で表されるフラボマンニン又はその
塩の使用；腫瘍、好ましくは悪性腫瘍の治療方法であっ
て、上記の式（Ｉ）で表されるフラボマンニン又は生理
学的に許容されるその塩の治療有効量をヒトを含む哺乳
類動物に投与する工程を含む方法が提供される。[0008] Further, from still another viewpoint, the use of flavomannin represented by the above formula (I) or a salt thereof for the production of a telomerase inhibitor, and the above medicine, preferably an antitumor agent, more preferably Is a method for treating a tumor, preferably a malignant tumor, which is a method for treating a tumor, preferably a malignant tumor, which is represented by the above formula (I). There is provided a method comprising administering to a mammal, including a human, a therapeutically effective amount of flavomannin or a physiologically acceptable salt thereof.

【０００９】さらに、上記の式（Ｉ）で表されるフラボ
マンニンの産生菌を培養し、得られた培養物からフラボ
マンニンを分離する工程を含むフラボマンニンの製造方
法において、フラボマンニン産生菌として子嚢菌亜門不
整子嚢菌綱ユーロチウム目に属する微生物、好ましくは
Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ ＭＣ
Ｉ ３７０８株を用いることを特徴とする方法が本発明
により提供される。Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔ
ｍａｎｎｉｉ ＭＣＩ ３７０８株は、平成１２年５月
１６日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本
国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託番号「ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１７８５６」として寄託されている。Further, in a method for producing flavomannin, which comprises a step of culturing a flavomannin-producing bacterium represented by the above formula (I) and separating flavomannin from the obtained culture, Microorganisms belonging to the order of the order Eurotium, preferably Talaromyces wortmannii MC
The present invention provides a method characterized by using strain I3708. Talaromyces wort
mannii MCI 3708 strain was deposited on May 16, 2000 at the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the deposit number "FE."
RM P-17856 ".

【００１０】[0010]

【発明の実施の形態】上記式（Ｉ）で表わされるフラボ
マンニンは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｏｒｔｍａｎ
ｎｉｉの代謝産物として１９６８年に構造決定されてお
り[Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、ｐ２５６０（１９
６８年）]、上記文献に記載された方法により入手する
ことができる（上記文献には微生物の寄託先及び寄託番
号としてＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｍｙｃｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｅｗ，ｎｏ．３１，３
８９が記載されているが、寄託先施設の名称はＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅに変更されており、現在の受託番号は「Ｉ
ＭＩ Ｎｏ．０３１３８９」である）。フラボマンニン
の製造に用いる微生物は、フラボマンニンの産生能を有
する微生物であれば特に限定されないが、例えば、フラ
ボマンニンの産生能を有し、子嚢菌亜門不整子嚢菌綱に
分類されるカビ類を用いることができる。好ましくは子
嚢菌亜門不整子嚢菌綱ユーロチウム目に属するＴａｌａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ ＭＣＩ ３７
０８株を用いることができる。通常は、該産生菌を培養
して得られる培養物からフラボマンニンを通常の方法で
分離・精製することにより、効率よくフラボマンニンを
製造することができるが、フラボマンニンを全合成又は
半合成などの化学的な手法、又は遺伝子工学的な手法で
製造することもできる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Flavomannin represented by the above formula (I) is Penicillium wortman.
The structure was determined in 1968 as a metabolite of nii [J. Chem. Soc. (C), p2560 (19
1968)], and can be obtained by the method described in the above-mentioned document (in the above-mentioned document, Commonwealth Mycology as a deposit destination and a deposit number of the microorganism).
cal Institute, Kew, no. 31,3
89, but the name of the depositary facility is Inte
rational Mylogical Ins
title and the current accession number is "I
MI No. 031389 ”). The microorganism used for the production of flavomannin is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce flavomannin. Can be. Preferable Tala belonging to the order of the order Ascomycota Subarachnid Ascomycetes Eurotium
romyces wortmannii MCI 37
08 strains can be used. Usually, flavomannin can be efficiently produced by separating and purifying flavomannin by a usual method from a culture obtained by culturing the producing bacterium, but it is possible to produce flavomannin efficiently by chemical synthesis such as total synthesis or semi-synthesis. It can also be produced by a simple technique or a genetic engineering technique.

【００１１】例えば、子嚢菌亜門不整子嚢菌綱に分類さ
れ、フラボマンニンの産生能を有する微生物は、通常の
微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養するこ
とができる。炭素源としては、米、グルコース、水ア
メ、デキストリン、シュクロース、デンプン、糖蜜、動
・植物油等を使用できる。また窒素源としては、大豆
粉、小麦胚芽、コーンスティープ・リカー、綿実粕、肉
エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝
酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他、必要に応じ
て、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、コバルト、塩素、リン酸、硝酸およびその他のイオ
ンを生成することのできる無機塩類を培地に添加するこ
とが有効な場合がある。また、菌の生育を助け、フラボ
マンニンの生産を促進するような適宜の有機物又は無機
物を培地に適宜添加することができる。For example, microorganisms classified into the subphylum Ascomycota ascomycetes and capable of producing flavomannin can be cultured in a medium containing nutrients that can be used by ordinary microorganisms. Rice, glucose, water syrup, dextrin, sucrose, starch, molasses, animal and vegetable oils, etc. can be used as the carbon source. As the nitrogen source, soybean flour, wheat germ, corn steep liquor, cottonseed meal, meat extract, peptone, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea and the like can be used. In addition, if necessary, it may be effective to add an inorganic salt capable of producing sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, nitric acid and other ions to the medium. In addition, an appropriate organic or inorganic substance that helps the growth of bacteria and promotes the production of flavomannin can be appropriately added to the medium.

【００１２】上記微生物の培養法としては、好気的条件
下での培養法、特に寒天培地等を用いた固体培養法、及
び液体培地を用いた深部培養法が最も適している。培養
に適当な温度は１５〜３０℃であるが、好ましくは２０
〜２７℃付近で培養することができる。フラボマンニン
の生産は、培地や培養条件により異なるが、フラスコ内
の固体培養法である寒天培地表面培養法では、通常７〜
２１日の間にその蓄積が最高に達する。培養物中のフラ
ボマンニンの蓄積量が最高になった時にに培養を停止
し、培養物からフラボマンニンを分離・精製することが
望ましい。The most suitable culture method for the microorganisms is a culture method under aerobic conditions, in particular, a solid culture method using an agar medium or the like and a submerged culture method using a liquid medium. A suitable temperature for culturing is 15 to 30 ° C, preferably 20 to 30 ° C.
It can be cultured at about -27 ° C. The production of flavomannin varies depending on the culture medium and culture conditions.
Its accumulation peaks in 21 days. It is desirable to stop the cultivation when the amount of accumulated flavomannin in the culture becomes maximum, and to separate and purify the flavomannin from the culture.

【００１３】培養物からフラボマンニンを分離・精製す
る方法は特に限定されず、当業者に利用可能な手段はい
ずれも利用可能であるが、フラボマンニンは脂溶性であ
るため、この特性を利用することにより、効率よく培養
物からフラボマンニンを分離し、精製することが可能に
なる。例えば、酢酸エチル、クロロルホルム等による溶
媒抽出法；シリカゲル、アルミナ、ＯＤＳ、ダイヤイオ
ンＨＰ−２０（三菱化学製）等の合成吸着剤や、セファ
デックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等のゲル濾過
剤を用いたカラムクロマトグラフィー；高速液体クロマ
トグラフィー；シリカゲル等を担体とした分取薄層クロ
マトグラフィー等の１種又は２種以上を組み合わせて分
離及び精製を行うことが有効である。The method for separating and purifying flavomannin from the culture is not particularly limited, and any means available to those skilled in the art can be used. However, since flavomannin is fat-soluble, it can be used by taking advantage of this property. Thus, it is possible to efficiently separate and purify flavomannin from a culture. For example, a solvent extraction method using ethyl acetate, chloroform, or the like; a synthetic adsorbent such as silica gel, alumina, ODS, and Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical), or a gel filtration agent such as Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia). It is effective to perform separation and purification by one or a combination of two or more types, such as column chromatography using high-performance liquid chromatography; preparative thin-layer chromatography using silica gel or the like as a carrier.

【００１４】本発明のフラボマンニンの製造方法に用い
る子嚢菌亜門不整子嚢菌綱ユーロチウム目に属するＴａ
ｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ ＭＣＩ
３７０８株（以下、「ＭＣＩ ３７０８株」と略記する
ことがある）は、天然の土壌より分離された子嚢菌亜門
不整子嚢菌綱ユーロチウム目に属する菌株である。[0014] Ta belonging to the order of the order Eurotium of the subphylum Ascomycota used in the process for producing flavomannin of the present invention
laromyces wortmannii MCI
The 3708 strain (hereinafter may be abbreviated as “MCI 3708 strain”) is a strain belonging to the order Eurotium of the Ascomycota subphylum Ascomycota isolated from natural soil.

【００１５】（１）ＭＣＩ ３７０８株の形態学的性状 コロニーはツアペックイースト寒天培地（ＣＹＡ）上、
２４℃、７日間培養で直径１５ｍｍに達する。コロニー
は黄色、中央部のみ白色。コロニー裏面は薄黄茶色を呈
し、長期の培養により褐色の可溶性色素を生産する。麦
芽寒天培地（ＭＥＡ）上２４℃、７日間培養で直径１５
ｍｍ、表面は黄色、辺縁部はオリーブ色。裏面は黄土色
で可溶性色素の生産は認められない。５℃、及び３７℃
で生育せず、高張性培地（Ｇ２５Ｎ）上、２４℃、７日
間培養で直径６ｍｍに達する。子嚢果及び子嚢胞子は麦
芽寒天培地上、２４℃、７日培養後に観察される。子嚢
果は表在性、球形で孔口を欠き、直径２００μｍに達す
る。子嚢果壁はゆるく織り混ざった菌糸からなる。(1) Morphological Properties of MCI 3708 Strain Colonies were grown on Tupec yeast agar medium (CYA).
The culture reaches a diameter of 15 mm after culturing at 24 ° C. for 7 days. Colonies are yellow, white only in the center. The back of the colony has a pale yellow-brown color, and produces a brown soluble pigment by long-term culture. Culture for 15 days at 24 ° C on malt agar medium (MEA)
mm, surface yellow, margins olive. The back side is ocher and no production of soluble pigment is observed. 5 ° C and 37 ° C
And grows up to 6 mm in diameter after culturing on a hypertonic medium (G25N) at 24 ° C. for 7 days. Ascocarps and ascospores are observed after culturing on malt agar medium at 24 ° C. for 7 days. The ascocarp is superficial, spherical, lacks a hole, and reaches 200 μm in diameter. The ascocarp consists of loosely interlaced hyphae.

【００１６】子嚢は球形〜亜球形、無色、８胞子性、
８．１〜１０．６×７．２〜９．７μｍ。子嚢壁は一重
膜で成熟時に消失する。子嚢胞子は薄黄色、楕円形、表
面に微細な棘状突起を有する。４．１〜５．６×２．５
〜４．１μｍ。分生子柄は培地表面あるいは気菌糸上よ
り生じ、表面は平滑、長さ４５０μｍに達する。表面は
平滑、先端に二輪性（ｂｉｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｅ）
のペニシリを生じる。フィアライドはメトラあたり４〜
６個生じ、針状形、９．７〜１２．８×１．６〜２．２
μｍ。分生子は一細胞性、楕円形ないし紡錘形、無色で
表面は平滑、２．８〜３．４×１．９〜２．８μｍ。The ascus is spherical to subglobular, colorless, 8-spore,
8.1 to 10.6 × 7.2 to 9.7 μm. The ascus wall is a monolayer and disappears at maturity. Ascospores are pale yellow, oval, with fine spines on the surface. 4.1-5.6 × 2.5
~ 4.1 [mu] m. The conidiophores are formed on the surface of the medium or on the aerial mycelium, and the surface is smooth and reaches a length of 450 μm. The surface is smooth and the tip is biverticillate
Of Penicillium. Fearride is 4 ~ per metra
6 formed, needle-shaped, 9.7-12.8 × 1.6-2.2
μm. Conidia are unicellular, elliptical or spindle-shaped, colorless and smooth in surface, 2.8-3.4 x 1.9-2.8 [mu] m.

【００１７】（２）ＭＣＩ ３７０８株の分類学的考察 本菌株は１）孔口を欠いた閉子嚢殻中に球形で消失性の
子嚢を形成する、２）子嚢果壁はゆるく織り混ざった菌
糸からなる、３）アナモルフはペニシリウムでペニシリ
は二輪性となるなどの特徴を有することから、子嚢菌亜
門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、不整子嚢菌綱（Ｐｌ
ｅｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ユーロチウム目（Ｅｕｒｏ
ｔｉａｌｅｓ）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属に属すると
考えられる。(2) Taxonomic considerations of strain MCI 3708 The present strain 1) forms a spherical, evanescent ascus in an azoosperm lacking a foramen; 2) the ascocarp wall is loosely woven 3) Anamorph is penicillium and penicillium is bicyclic, and so on. Ascomycotina and Ascomycota (Pl)
ectomycetes, Eurotium (Euro)
tials), and is considered to belong to the genus Talaromyces.

【００１８】Ｊ．Ｉ．Ｐｉｔｔ著「Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ」（１９７９年）によれば、
Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属として１６種が記載されてい
る。ＭＣＩ ３７０８は表面が棘状で楕円形の子嚢胞子
を生産する。そこで同書４７０ページの検索表を用いて
本菌株の形態学的特徴に基づく検索を行ったところ、本
菌株の種名はＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎ
ｎｉｉとなり、また同書４９１〜４９４ページにおける
同種の記載ともほぼ一致した。以上の性質から、本菌株
をＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉと同
定した。本菌株は、平成１２年５月１６日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１７８５
６」として寄託されている。J. I. Pitt, The genus
According to Penicillium (1979),
Sixteen species are described as genus Talaromyces. MCI 3708 produces oval ascospores with spines on the surface. Therefore, a search based on the morphological characteristics of the strain was performed using the search table on page 470 of the same book, and the species name of the strain was Talaromyces wortman.
nii, and almost coincided with the description of the same kind in the same book on pages 491 to 494. Based on the above properties, this strain was identified as Talaromyces wortmannii. This strain was deposited on May 16, 2000 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the deposit number "FERM P-1785".
No. 6 ".

【００１９】上記のフラボマンニンはテロメレース阻害
作用を有しており、抗腫瘍剤、好ましくは悪性腫瘍の治
療のための医薬の有効成分として有用である。テロメレ
ース阻害作用は、Ｔａｔｅｍａｔｓｕらの方法［Ｔａｔ
ｅｍａｔｓｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、
１３、ｐ２２６５（１９９６年）、特公平８−０１８８
０３号公報］や本明細書の実施例に具体的に記載した方
法などに従って、当業者が容易に確認することが可能で
ある。本発明の医薬を抗腫瘍剤として用いる場合には、
対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍又は
非固形腫瘍のいずれにも適用可能である。固形腫瘍又は
非固形腫瘍の種類も特に限定されない。例えば、胃癌、
食道癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢
癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、脳腫瘍、
皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、神経芽腫などの固形
腫瘍、白血病、悪性リンパ腫などの非固形腫瘍などを挙
げることができるが、本発明の医薬の適用対象はこれら
の疾患に限定されることはない。The above-mentioned flavomannin has a telomerase inhibitory action and is useful as an active ingredient of an antitumor agent, preferably a medicament for treating a malignant tumor. The telomerase inhibitory effect is determined by the method of Tatematsu et al. [Tat
ematsu, T .; et al. , Oncogene,
13, p2265 (1996), Tokuhei 8-0188
No. 03 gazette] and the methods specifically described in the examples of the present specification, etc., can be easily confirmed by those skilled in the art. When the medicament of the present invention is used as an antitumor agent,
The type of target tumor is not particularly limited, and can be applied to both solid tumors and non-solid tumors. The type of solid tumor or non-solid tumor is not particularly limited. For example, gastric cancer,
Esophageal cancer, duodenal cancer, small intestine cancer, colon cancer, liver cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, bladder cancer, oral cavity cancer, bone cancer, brain tumor,
Skin cancer, breast cancer, uterine cancer, prostate cancer, solid tumors such as neuroblastoma, leukemia, non-solid tumors such as malignant lymphoma and the like, but the subject of application of the pharmaceutical of the present invention is limited to these diseases Never.

【００２０】本発明の医薬の有効成分としては、フラボ
マンニン及び生理学的に許容されるフラボマンニンの
塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からな
る群から選ばれる物質を用いることができる。フラボマ
ンニンの生理学的に許容される塩としては塩基付加塩を
用いることができ、例えば、ナトリウム塩、カリウム
塩、マグネシウム塩などの金属付加塩などを用いること
ができる。フラボマンニンは２個の不斉炭素を有してお
り、光学活性体又はジアステレオ異性体が存在し得る
が、本発明の医薬の有効成分としては実質的に純粋な形
態の光学活性体（［α］ _D＝−１４００゜程度のもの）
を用いることが好ましい。The active ingredient of the medicament of the present invention is flavo.
Mannin and physiologically acceptable flavomannin
Salts, and their hydrates and solvates.
A substance selected from the group consisting of: Flavomas
Base addition salts are physiologically acceptable salts of ninnin.
It can be used, for example, sodium salt, potassium
Use of metal addition salts such as salts and magnesium salts
Can be. Flavomannin has two asymmetric carbons
And optically active or diastereoisomers may be present
However, as the active ingredient of the medicament of the present invention, substantially pure form
Optically active form ([α] _D= -1400 ゜)
It is preferable to use

【００２１】本発明の医薬の有効成分としては、フラボ
マンニン及び生理学的に許容されるフラボマンニンの
塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からな
る群から選ばれる物質をそのまま医薬として用いてもよ
いが、通常は、１種又は２種以上の製剤用添加物を用い
て医薬組成物を製造して投与することが望ましい。医薬
組成物には、他のテロメレース阻害剤又は抗腫瘍剤の有
効成分などを配合してもよい。本発明の医薬の投与経路
は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれも
選択可能である。As the active ingredient of the medicament of the present invention, a substance selected from the group consisting of flavomannin and physiologically acceptable salts of flavomannin, and hydrates and solvates thereof can be used as a medicament as it is. Usually, it is desirable to produce and administer a pharmaceutical composition using one or more pharmaceutical additives. The pharmaceutical composition may contain other telomerase inhibitors or active ingredients of antitumor agents. The administration route of the medicament of the present invention is not particularly limited, and either oral administration or parenteral administration can be selected.

【００２２】経口投与に適する医薬組成物としては、例
えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、溶液
剤、懸濁剤などを挙げることができ、非経口投与に適す
る医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐
剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経
皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを挙げることができる。も
っとも、本発明の医薬の形態はこれらに限定されること
はない。医薬組成物の形態に応じて適宜の製剤用添加物
を用いることができ、常法に従って製剤化することがで
きる。Pharmaceutical compositions suitable for oral administration include, for example, tablets, capsules, granules, fine granules, powders, solutions, suspensions and the like, and pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration. Examples thereof include injections, drops, suppositories, inhalants, eye drops, ear drops, ointments, creams, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, and the like. However, the form of the medicament of the present invention is not limited to these. Appropriate pharmaceutical additives can be used depending on the form of the pharmaceutical composition, and can be formulated according to a conventional method.

【００２３】経口投与用の固形製剤を調製するにあた
り、製剤用添加物として、慣用の賦形剤、結合剤、滑択
剤、着色剤、又は崩壊剤等を用いることができる。賦形
剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステア
リン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギ
ン酸ナトリウム、アラビアゴムなど挙げることができ、
結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエー
テル、エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、
白糖などを挙げることができる。滑沢剤としてはステア
リン酸マグネシウム、タルク等が挙げら、着色剤、崩壊
剤も通常使用されるものから適宜選択可能である。In preparing a solid preparation for oral administration, conventional excipients, binders, lubricants, coloring agents, disintegrating agents and the like can be used as additives for the preparation. Examples of the excipient include lactose, starch, talc, magnesium stearate, crystalline cellulose, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, glycerin, sodium alginate, gum arabic, and the like.
As a binder, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, gum arabic, shellac,
Sucrose and the like can be mentioned. Examples of the lubricant include magnesium stearate, talc and the like, and a coloring agent and a disintegrant can be appropriately selected from those usually used.

【００２４】錠剤は周知の方法により腸溶性コーティン
グなどを施してもよい。水性または油性の懸濁液、溶
液、シロップ、エリキシル剤などの液状製剤は、通常用
いられる方法で適宜の水性媒体を用いて調製可能であ
る。注射剤を調製する場合には、ｐＨ調整剤、緩衝剤、
安定化剤、等張剤、又は局所麻酔剤等などの製剤用添加
物を加え、常法により皮下、筋肉内、静脈内用の注射剤
として調製すればよい。坐剤を製造する際の基剤として
は、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ラノリ
ン、脂肪酸トリグリセライド、ウイテプゾール（ダイナ
マイトノーベル社の登録商標）等の油脂性基剤を用いる
ことができる。Tablets may be provided with an enteric coating or the like by well-known methods. Liquid preparations such as aqueous or oily suspensions, solutions, syrups, and elixirs can be prepared using a suitable aqueous medium by a commonly used method. When preparing an injection, a pH adjuster, a buffer,
Additives for preparations such as stabilizers, isotonic agents, local anesthetics and the like may be added to prepare injections for subcutaneous, intramuscular, and intravenous injections in a conventional manner. As a base for producing suppositories, for example, oleaginous bases such as cacao butter, polyethylene glycol, lanolin, fatty acid triglyceride, and witepsol (registered trademark of Dynamite Nobel) can be used.

【００２５】本発明の医薬の投与量は特に限定されない
が、治療すべき腫瘍の種類、患者の症状、体重、年齢、
他の抗腫瘍剤の使用の有無などの条件によって適宜選択
することが望ましい。例えば、フラボマンニンの量とし
て、通常、成人１日あたり約１〜２０００ｍｇの範囲が
好ましい。上記投与量を１日１〜４回に分けて投与する
ことができ、数日又は数週間に一回の割合で間欠的に投
与してもよい。The dosage of the medicament of the present invention is not particularly limited, but the type of tumor to be treated, the condition of the patient, weight, age,
It is desirable to select as appropriate depending on conditions such as whether or not other antitumor agents are used. For example, the amount of flavomannin is usually preferably in the range of about 1 to 2000 mg per adult day. The above dose can be administered in 1 to 4 times a day, and may be administered intermittently once every several days or several weeks.

【００２６】[0026]

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１：フラボマンニンの製造 （１）ＭＣＩ ３７０８株の培養 三角フラスコに米と水道水をとり軽く撹拌したのち、１
２１℃において２０分間高圧蒸気滅菌した。これにＭＣ
Ｉ ３７０８株を植菌し、２７℃において１４日間静置
培養した。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to the following Examples. Example 1: Production of Flavomannin (1) Culture of MCI 3708 strain Rice and tap water were taken in an Erlenmeyer flask, and then lightly stirred.
Autoclaved at 21 ° C. for 20 minutes. MC
The I3708 strain was inoculated and allowed to stand at 27 ° C. for 14 days.

【００２７】（２）培養により製造したフラボマンニン
の精製 培養を終了した三角フラスコに５０％アセトン水溶液を
添加・撹拌し、一昼夜４℃において放置した。このアセ
トン水溶液を遠心分離し、上清を一定量ずつ試験管にと
り、真空ポンプを連結した遠心濃縮機（東京理化器械株
式会社製、ＣＶＥ−２０００）を用いて乾固した。乾固
したサンプルに水１Ｌと酢酸エチル１Ｌを加え、水層を
塩酸でｐＨ４に調整して抽出した。酢酸エチル層を分取
し、溶媒を減圧留去して残渣を得た。これを蒸留水に懸
濁し、オクタデシルシリカゲル（ＭＣＩ ＧＥＬ ＯＤ
Ｓ １ＭＹ）を充填したカラム上にチャージした。カラ
ムをアセトニトリル−水混液（１：４）で洗った後、ア
セトニトリル−水混液（２：３）で溶出した画分を減圧
下で濃縮し、粗フラボマンニンを得た。(2) Purification of Flavomannin Produced by Cultivation A 50% aqueous acetone solution was added to the Erlenmeyer flask after the completion of the cultivation, stirred, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The acetone aqueous solution was centrifuged, and the supernatant was put into a test tube in a fixed amount, and dried using a centrifugal concentrator (CVE-2000, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) connected to a vacuum pump. 1 L of water and 1 L of ethyl acetate were added to the dried sample, and the aqueous layer was adjusted to pH 4 with hydrochloric acid and extracted. The ethyl acetate layer was separated, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a residue. This was suspended in distilled water and octadecyl silica gel (MCI GEL OD
S 1MY) was charged onto the column. After the column was washed with an acetonitrile-water mixture (1: 4), the fraction eluted with the acetonitrile-water mixture (2: 3) was concentrated under reduced pressure to obtain a crude flavomannin.

【００２８】上記で得られた粗フラボマンニンを、分取
用逆相分配カラム（資生堂、Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ
１８ ＵＧ１２０、５μｍ、３０ｍｍ×２５０ｍｍ）を
用い、溶出液として流速９ｍｌ／分、アセトニトリル１
０％から５０％の８０分間の直線濃度勾配を用いてＨＰ
ＬＣで分取した。フラボマンニンは７９分目から８２分
目に溶出した。このフラクションを集めて溶媒を留去
し、フラボマンニンを得た。The crude flavomannin obtained above was applied to a preparative reversed-phase partition column (Shiseido, Capcellpak C).
18 UG120, 5 μm, 30 mm × 250 mm), a flow rate of 9 ml / min, acetonitrile 1
HP using a linear concentration gradient from 0% to 50% for 80 minutes
Separated by LC. Flavomannin eluted between 79 minutes and 82 minutes. The fractions were collected and the solvent was distilled off to obtain flavomannin.

【００２９】（３）構造決定 こうして精製されたフラボマンニンは、下記の理化学的
性質より構造解析をした結果、前記式（Ｉ）のフラボマ
ンニンであると同定された。 １）陽イオン ＳＩマススペクトル：５４７（［Ｍ＋
Ｈ］⁺） ２）ＵＶスペクトル（エタノール中）λ_max（ｎｍ）：
２３６，２８１，３２６，３３７，４１７ ３）¹Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール中、５００ＭＨｚ）δ
（ｐｐｍ） １．３９（６Ｈ，ｓ），２．７７（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），２．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１
７．２Ｈｚ），３．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈ
ｚ），３．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ），６．
６５（２Ｈ，ｓ），６．８６（２Ｈ，ｓ）(3) Determination of Structure The thus-purified flavomannin was identified as flavomannin of the above formula (I) as a result of structural analysis based on the following physicochemical properties. 1) Positive ion SI mass spectrum: 547 ([M +
H] ⁺ ) 2) UV spectrum (in ethanol) λ _max (nm):
236, 281, 326, 337, 417 3) ¹ H-NMR (in deuterated methanol, 500 MHz) δ
(Ppm) 1.39 (6H, s), 2.77 (2H,
d, J = 17.2 Hz), 2.87 (2H, d, J = 1)
7.2 Hz), 3.01 (2H, d, J = 16.0H)
z), 3.07 (2H, d, J = 16.0 Hz), 6.
65 (2H, s), 6.86 (2H, s)

【００３０】 ４）¹³Ｃ−ＮＭＲ（重メタノール中、１２５ＭＨｚ）δ
（ｐｐｍ） ２９．０１（ｑ），４３．８９（ｔ），５
１．６７（ｔ），７１．４３（ｓ），１０３．０５
（ｄ），１０８．１１（ｓ），１０８．１８（ｓ），１
０９．０７（ｓ），１１７．９６（ｄ），１３７．２６
（ｓ），１４２．０６（ｓ），１５８．７７（ｓ），１
６１．９４（ｓ），１６７．２３（ｓ），２０３．４７
（ｓ） ５）旋光度（エタノール中、ｃ＝０．０５５） ［α］
_D＝−１４００゜ 上記物理化学的データはフラボマンニンの文献値[Ｊ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）ｐ２５６０（１９６８年）]
と一致した。4) ¹³ C-NMR (in heavy methanol, 125 MHz) δ
(Ppm) 29.01 (q), 43.89 (t), 5
1.67 (t), 71.43 (s), 103.05
(D), 108.11 (s), 108.18 (s), 1
09.07 (s), 117.96 (d), 137.26
(S), 142.06 (s), 158.77 (s), 1
61.94 (s), 167.23 (s), 203.47
(S) 5) Optical rotation (c = 0.055 in ethanol) [α]
_D = -1400 ° The above physicochemical data is based on the literature value of flavomannin [J.
Chem. Soc. (C) p2560 (1968)]
And matched.

【００３１】例２ 上記例１で得られたフラボマンニンについて、テロメレ
ースの阻害活性を測定した。この測定はＴａｔｅｍａｔ
ｓｕ Ｋ.らの方法［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１３、ｐ２２
６５（１９９６年）、特公平８−０１８８０３号公報］
を改変して行った。 （１）テロメレース抽出液の調製 １０％非働化ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変最小必
須培地中、５％ＣＯ₂、３７℃で培養したテロメレース
活性陽性腫瘍細胞株ＰＡ−１（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をリン酸
緩衝生理食塩水で洗浄後、培養皿からはがして遠心回収
した。この細胞に細胞溶解液［１０ｍＭトリス塩酸 ｐ
Ｈ ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５％ ３−
［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕ
ｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５
ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０％ グリセロー
ル、０．１ｍＭ ４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−
ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｎｅ（ＡＥＢＳＦ）］を加えて懸濁した。氷中に３
０分静置した後、１６，０００×ｇ、４℃で３０分間遠
心した。その上清をテロメレース抽出液として、ドライ
アイス／エタノールバス中で急速凍結した後、使用する
まで−８０℃で保存した。Example 2 The telomerase inhibitory activity of the flavomannin obtained in Example 1 was measured. This measurement is a Tatemat
su K. et al. [Oncogene, 13, p22
65 (1996), Japanese Patent Publication No. 8-018803]
Was modified. (1) Preparation of Telomerase Extract A telomerase activity-positive tumor cell line PA-1 (AmericanType) cultured in 5% CO ₂ at 37 ° C. in Dulbecco's modified minimum essential medium containing 10% inactivated fetal bovine serum.
e Culture Collection) was washed with phosphate-buffered saline, and then separated from the culture dish and collected by centrifugation. A cell lysate [10 mM Tris-HCl p
H 7.5, 1 mM MgCl ₂ , 0.5% 3-
[(3-cholamidepropyl) -dim
[thyl-ammonio] -1-propanesu
Ifonate (CHAPS), 1 mM EGTA, 5
mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.1 mM 4- (2-aminoethyl)-
benzenesulfonyl hydrochloro
line (AEBSF)]. 3 in ice
After standing for 0 minutes, the mixture was centrifuged at 16,000 × g and 4 ° C. for 30 minutes. The supernatant was rapidly frozen in a dry ice / ethanol bath as a telomerase extract, and stored at -80 ° C until use.

【００３２】（２）テロメレース反応 フラボマンニン（または溶媒のジメチルスルホキシ
ド）、及び２μＭ ｂｐＴＧ３（基質プライマー：ビオ
チン化５'−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴ
ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧ−３'）を含
む２倍濃度のテロメレース反応液（２ｍＭ ｄＴＴＰ、
２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰ、１００ｍＭ ト
リス酢酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、
１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ スペルミン、２ｍＭ
スペルミジン）に細胞溶解液で希釈したテロメレース
抽出液を等量混合し、３０℃で保温した。一定時間後、
最終濃度１６ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えて９５℃
で加熱し、反応を停止した（得られた液を「テロメレー
ス反応産物」とする）。なお、反応開始前に予め２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを加え、テロメレースを不活化した条件で
得られた値をバックグランドとして結果より差し引い
た。(2) Telomerase reaction Flavomannin (or dimethyl sulfoxide as a solvent), and 2 μM bpTG3 (substrate primer: biotinylated 5′-GTAAACACCGGGCCAGTTT)
A telomerase reaction solution (2 mM dTTP) containing GGGGTTGGGGGTTGGGGTTG-3 ′) at a double concentration.
2 mM dATP, 2 mM dGTP, 100 mM Tris acetic acid (pH 8.0), 100 mM potassium acetate,
10 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM MgC
l ₂ , 2 mM EGTA, 2 mM spermine, 2 mM
Spermidine) was mixed with an equal amount of a telomerase extract diluted with a cell lysate, and the mixture was kept at 30 ° C. After a certain time,
Add EDTA to a final concentration of 16 mM and add
To stop the reaction (the obtained liquid is referred to as “telomerase reaction product”). Before starting the reaction, 20 m
The value obtained under the conditions in which M EDTA was added to inactivate telomerase was subtracted from the results as a background.

【００３３】（３）アビジンコートＰＣＲプレートの作
成 ９６ウェルＰＣＲプレートに、滅菌水に溶解したストレ
プトアビジンを９μｌ／ウェルにて加え、０．１Ｍ ２
−[Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）に溶
解した１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（Ｅ
ＤＣ、シグマ）を９μｌ／ウェルにて追加し、３７℃で
一定時間保温した。ツイン２０（シグマ）を含むＴＢＳ
及び滅菌水で洗浄・乾燥し「アビジンクロスリンクプレ
ート」とした。(3) Preparation of avidin-coated PCR plate To a 96-well PCR plate, 9 μl / well of streptavidin dissolved in sterile water was added, and 0.1M 2
-[N-Morpholino] ethanesulfo
1-ethyl-3- (3-dimethylyl) dissolved in nic acid (MES) buffer (pH 6.0)
(minopropyl) carbodiimide (E
DC, Sigma) at 9 μl / well and incubated at 37 ° C. for a certain period of time. TBS including Twin 20 (Sigma)
Then, it was washed and dried with sterile water to obtain an “avidin crosslink plate”.

【００３４】（４）ストレッチＰＣＲ ２５μｌのテロメレース反応産物をアビジンクロスリン
クプレートに加え、３７℃で保温してテロメレース反応
産物をプレートに結合させ、蒸留水で洗浄した。２５μ
ｌ／ウェルのＰＣＲ反応液［２０ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％ Ｗ−
１、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、４μＭ ｐＴＧ３（セン
スプライマー）、１μＭ ｐＴＡＧγ（アンチセンスプ
ライマー：５'−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ
ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ−３
´）、５０μＭ ｄＡＴＰ、５０μＭ ｄＧＴＰ、５０
μＭ ｄＣＴＰ、５０μＭ ｄＴＴＰ、１Ｕ／２５μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメレース］を加え、ＰＣＲサーマ
ルサイクラーＭＰ（宝酒造）を用いてＰＣＲを行った
（９３℃１分、６９℃１分、７２℃２分を３０サイク
ル）。ＰＣＲ終了後、反応液２５μｌに滅菌水を１００
μｌ加え計１２５μｌとした（「ＰＣＲ産物」）。ＰＣ
Ｒに用いたプライマー及び試薬は全てライフテックオリ
エンタルより購入した。(4) Stretch PCR 25 μl of the telomerase reaction product was added to an avidin crosslink plate, and the temperature was maintained at 37 ° C. to bind the telomerase reaction product to the plate, followed by washing with distilled water. 25μ
1 / well of the PCR reaction solution [20 mM Tris-HCl (p
H8.3), 75 mM KCl, 0.005% W-
1, 1.5 mM MgCl ₂ , 4 μM pTG3 (sense primer), 1 μM pTAGγ (antisense primer: 5′-CAGGGAAACAGCTATGAC
CCCTAACCCCTAACCCCTAACCCT-3
'), 50 μM dATP, 50 μM dGTP, 50
μM dCTP, 50 μM dTTP, 1 U / 25 μl
Taq DNA polymerase] and PCR was performed using PCR Thermal Cycler MP (Takara Shuzo) (30 cycles of 93 ° C. for 1 minute, 69 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes). After completion of the PCR, 100 μl of sterilized water was added to 25 μl of the reaction solution.
Add a total of 125 μl (“PCR product”). PC
All primers and reagents used for R were purchased from Lifetech Oriental.

【００３５】（５）ストレッチＰＣＲ産物の定量 １００μｌのＰＣＲ産物を９６ウェル黒色プレート（住
友ベークライト）に移し、これに滅菌水で２００倍希釈
したピコグリーン（モレキュラプロブス）を１００μｌ
加え５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長
５３８ｎｍにおける蛍光強度を蛍光プレートリーダー、
フルオロスキャンＩＩ（大日本製薬）にて測定した。そ
の結果、テロメレースに対するフラボマンニンの５０％
阻害濃度は８μＭであり、フラボマンニンが低濃度でテ
ロメレースを阻害することが明らかとなった。(5) Quantification of Stretch PCR Product 100 μl of PCR product was transferred to a 96-well black plate (Sumitomo Bakelite), and 100 μl of pico green (Molecular Probes) diluted 200-fold with sterile water was added thereto.
After 5 minutes of addition, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 485 nm and an absorption wavelength of 538 nm was measured using a fluorescence plate reader.
It was measured by Fluoroscan II (Dainippon Pharmaceutical). As a result, 50% of flavomannin against telomerase
The inhibitory concentration was 8 μM, indicating that flavomannin inhibited telomerase at low concentrations.

【００３６】[0036]

【発明の効果】フラボマンニンは低濃度でテロメレース
を阻害するので、フラボマンニンを有効成分として含む
本発明の医薬は、多様な腫瘍の治療剤として有用であ
る。EFFECT OF THE INVENTION Since flavomannin inhibits telomerase at a low concentration, the medicament of the present invention containing flavomannin as an active ingredient is useful as a therapeutic agent for various tumors.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｐ 15/00 //(Ｃ１２Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 原田 直純 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者 ▲高▼嶋 純子 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者 杉山 直人 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者 神田 三奈 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat II (Reference) C12P 15/00 C12P 15/00 // (C12P 15/00 C12R 1: 645) (72) Inventor Naozumi Harada Yokohama, Kanagawa 1000 Kamoshita-cho, Aoba-ku, Yokohama Mitsubishi Chemical Corporation Yokohama Research Laboratory (72) Inventor ▲ Taka ▼ Junko Shima 1000 Kamoshita-cho, Aoba-ku, Yokohama-shi, Kanagawa Prefecture Mitsubishi Chemical Corporation Yokohama Research Laboratory (72) Inventor Naoto Sugiyama 1000, Kamoshita-cho, Aoba-ku, Yokohama-shi, Kanagawa, Japan Mitsubishi Chemical Corporation Yokohama Research Laboratory (72) Inventor Mika Kanda 1000, Kamoshita-cho, Aoba-ku, Yokohama-shi, Kanagawa prefecture Mitsubishi Chemical Corporation Yokohama Research Laboratory

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の式（Ｉ）： 【化１】 で表わされるフラボマンニン又は生理学的に許容される
その塩を有効成分として含むテロメレース阻害剤。1. The following formula (I): A telomerase inhibitor comprising, as an active ingredient, a flavomannin represented by the formula or a physiologically acceptable salt thereof. 【請求項２】 請求項１に記載の式（Ｉ）で表されるフ
ラボマンニン又は生理学的に許容されるその塩を有効成
分として含む医薬。2. A medicament comprising the flavomannin represented by the formula (I) according to claim 1 or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient. 【請求項３】 抗腫瘍剤として用いる請求項２に記載の
医薬。3. The medicament according to claim 2, which is used as an antitumor agent. 【請求項４】 請求項１に記載の式（Ｉ）で表されるフ
ラボマンニンの産生菌を培養し、得られた培養物から上
記フラボマンニンを分離する工程を含む請求項１に記載
の式（Ｉ）で表されるフラボマンニンの製造方法におい
て、上記フラボマンニン産生菌として子嚢菌亜門不整子
嚢菌綱ユーロチウム目に属する微生物を用いることを特
徴とする方法。4. The method according to claim 1, comprising the step of culturing a flavomannin-producing bacterium represented by the formula (I) according to claim 1 and isolating the flavomannin from the obtained culture. ), Wherein a microorganism belonging to the order of the order Eurotium is used as the flavomannin-producing bacterium. 【請求項５】 Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａ
ｎｎｉｉ ＭＣＩ ３７０８株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７８
５６）を用いる請求項４に記載の方法。5. Talaromyces wortma
nnii MCI 3708 strain (FERM P-178
5. The method according to claim 4, wherein (56) is used.