JP2001021563A - 特異的結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】簡便で、かつ高感度であり、精度の高い被検物
質の検出を可能にする、非特異的吸着の少ない特異的結
合体ならびに簡便であり、精度の高い免疫クロマトグラ
フ法および該免疫クロマトグラフ法に好適な免疫クロマ
トグラフィー用キットを提供すること。 【解決手段】水分散型高分子粒子を担体とし、該担体の
表面に被検物質に対する特異的結合物質と、非特異的吸
着のブロッキング剤とを有した特異的結合体；該特異的
結合体が、さらに、標識剤で標識された標識特異的結合
体；該特異的結合体および標識特異的結合体からなる群
より選ばれた１種を用いることを特徴とする免疫クロマ
トグラフ法；ならびに該特異的結合体および標識特異的
結合体からなる群より選ばれた１種を含有した免疫クロ
マトグラフィー用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非特異的吸着が少
ない特異的結合体に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっている大腸菌Ｏ１５７を
はじめとする病原性微生物などの食品中や患者からの検
出は、多くの日数、煩雑な操作を要する場合がある。さ
らに、疾患によってはより迅速な診断が要求される場合
も多い。これらの診断には、標識化免疫測定法などの種
々の免疫測定法（イムノアッセイ）が好適に用いられて
いる。近年になり迅速かつ簡便にイムノアッセイが行え
る方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されている
が、簡便性、感度などの点において十分なものが得られ
ていないのが現状である。

【０００３】また、従来のラテックスとニトロセルロー
ス膜とを用いた酵素免疫クロマトグラフィーにより、高
感度検出を行なった場合、該ラテックス粒子がニトロセ
ルロース膜上に固定された固定相の抗体に対して非特異
的吸着を起こすことがある。したがって、非特異的吸着
を起こしにくい手法が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便で、か
つ高感度であり、精度の高い被検物質の検出を可能にす
る、非特異的吸着の少ない特異的結合体、好ましくは免
疫クロマトグラフィー用の特異的結合体を提供すること
を目的とする。さらに、本発明は、簡便であり、精度の
高い免疫クロマトグラフ法および該免疫クロマトグラフ
法に好適な免疫クロマトグラフィー用キットを提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、〔１〕
水分散型高分子粒子を担体とし、該担体の表面に被検
物質に対する特異的結合物質と、非特異的吸着のブロッ
キング剤とを有してなる特異的結合体、〔２〕 前記
〔１〕記載の特異的結合体が、さらに、標識剤で標識さ
れてなる標識特異的結合体、〔３〕 前記〔１〕記載の
特異的結合体および前記〔２〕記載の標識特異的結合体
からなる群より選ばれた１種を用いることを特徴とする
免疫クロマトグラフ法、ならびに〔４〕 前記〔１〕記
載の特異的結合体および前記〔２〕記載の標識特異的結
合体からなる群より選ばれた１種を含有してなる免疫ク
ロマトグラフィー用キット、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の特異的結合体は、水分散
型高分子粒子を担体とし、該担体表面に被検物質に対す
る特異的結合物質と、非特異的吸着のブロッキング剤と
を有する。即ち、本発明の特異的結合体は、ラテックス
粒子などの水分散型高分子粒子の担体表面がウシ血清ア
ルブミン、ガゼイン、スキムミルクなどの非特異的吸着
のブロッキング剤により処理されているため、非特異的
吸着が少ない、被検物質の検出を可能にする。本発明の
特異的結合体は、免疫クロマトグラフ法を用いた免疫測
定法による被検物質の検出に好適である。

【０００７】膜だけをブロッキングした場合には、条件
によってはラテックスの非特異的吸着が生じることがあ
る。非特異的吸着に関係するのは膜だけではなく、ラテ
ックス側にも原因があるので、ラテックス側もブロッキ
ングすることにより、より確実に非特異的吸着を防止す
ることができる。

【０００８】なお、本明細書において、「被検物質」と
は、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）によりサ
ンドイッチ免疫複合体を形成し得るものであれば特に制
限されない。例えば、細菌（特に大腸菌Ｏ−１５７、メ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性細菌）、放線
菌、酵母、かび、ウイルス（特に、ＨＩＶ、ＨＢＶ、Ｈ
ＣＶ等）などの微生物またはそれらに対する抗体、細菌
等が産生する毒素、あるいは腫瘍マーカー抗原などの生
体試料中の抗原性ペプチド等が挙げられる。

【０００９】本発明の特異的結合体に用いられる非特異
的吸着のブロッキング剤とは、免疫クロマトグラフを行
う際に、ニトロセルロース膜などの基材に固定された固
定相の抗体に特異的結合体が非特異的に結合することを
ブロックする物質を意味し、例えば、ウシ血清アルブミ
ン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、γ−グロブリ
ン、ウシ胎仔血清、正常ウサギ血清などが挙げられる。
かかるブロッキング剤は、単独でまたは２種以上を混合
して用いることができる。本発明においては、入手のし
やすさや汎用性の観点から、ウシ血清アルブミン、カゼ
インおよびスキムミルクからなる群より選ばれた少なく
とも１種が好ましい。

【００１０】特異的結合体に用いられる担体としては、
その表面上に、非特異的吸着のブロッキング剤、特異的
結合物質および任意に使用される標識剤を固定すること
ができる担体であればよく、例えば、水分散型高分子粒
子などが挙げられる。前記水分散型高分子粒子のなかで
は、ラテックスが好ましい。

【００１１】前記水分散型高分子粒子は、不飽和二重結
合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合によって
調製される。かかる単量体としては、例えば、エチレ
ン、プロピレンなどのオレフィン系単量体、酢酸ビニ
ル、塩化ビニルなどのビニル系単量体、スチレン、メチ
ルスチレン、クロロスチレンなどのスチレン系単量体、
アクリル酸メチルなどのメタクリル酸エステル系単量
体、ブタジエンなどのジエン系単量体などが用いられ
る。

【００１２】水分散型高分子粒子は、上記単量体の単独
重合体や共重合体のほか、得られる粒子に官能基やイオ
ン性基を付与し、または粒子の水性媒体中での分散安定
性を高めるなどの目的で、改質用単量体を共重合するこ
ともできる。このような改質用単量体としては、例え
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメチルメタクリレートなどのフッ素化メタク
リル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、
スルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ
−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアク
リレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリ
シジルメタクリレートなどが用いられる。

【００１３】また本発明においては、市販されている種
々の水分散型高分子粒子も好適である。市販されている
水分散型高分子粒子としては、例えば、スチレンまたは
その誘導体、例えば、ｐ−クロロスチレンからなる単独
重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ス
チレン−アクリロニトリル−ブタジエン共重合体などの
種々のスチレン共重合体からなるエマルジョンを挙げる
ことができる。また、（メタ）アクリル酸の長鎖アルキ
ルエステルやその誘導体からなる単独重合体や、これら
と（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチ
ル、グリシジル（メタ）アクリレートなどとの共重合体
も本発明において用いられる。上述したスチレンやその
誘導体と、（メタ）アクリレートエステルやその誘導体
との共重合体も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポ
リウレタン、微結晶質セルロースなども挙げられる。

【００１４】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を担体として使用された特異的結合
体が、その使用時や保存時に融着、凝集を起こさないよ
うに、当該高分子粒子が所要のガラス転移点を有するよ
うに選ばれる。水分散型高分子粒子のガラス転移点は、
好ましくは１０℃以上、特に室温以上が好ましい。

【００１５】上記水分散型高分子粒子のうち、粒子の安
定性の点から、スチレン系単量体を主成分とする重合体
が好ましく、また、特異的結合物質、任意に標識剤を固
定するために、アクリル酸やメタクリル酸などのカルボ
キシル基を有する単量体を共重合した高分子粒子が好ま
しい。

【００１６】前記担体は、色を有する粒子であってもよ
い。色を有する担体を用いた場合、被検物質の濃度が高
いと酵素反応を行う前に着色の程度により判定が可能と
なる。ここで用いる色を有する担体としては、肉眼で色
を検出することが可能なできる担体であれば特に限定さ
れないが、例えば、スダンブルーやスダンレッドIV、ス
ダン III、オイルオレンジ、キニザリングリーンなどに
代表される顔料や染料などで着色された水分散型高分子
粒子などを用いることができる。目視確認性の点から
は、青色、赤色、緑色またはオレンジ色に呈色した水分
散型高分子粒子が好ましい。分散安定性や被検物質の検
出感度の調整し易さなどの点から青色、赤色などに呈色
した着色ラテックスが望ましい。

【００１７】前記担体は、表面への非特異的吸着のブロ
ッキング剤、特異的結合物質および任意の標識剤の固
定、スペーサーの導入、あるいは水分散状態での安定性
の向上のために官能基を有していてもよい。このような
官能基としては、例えばカルボキシル基、水酸基、グリ
シジル基、アミノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イ
ソチオシアナート基、アジドカルボニル基、ヒドラジド
基、酸無水物基などを挙げることができ、好ましくはカ
ルボキシル基が導入される。これらの官能基を有する担
体を調製するには、単量体成分として、例えば、アクリ
ル酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基を有する単
量体、例えばヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒド
ロキシエチルメタクリレートのような水酸基を有する単
量体、例えば、グリシジルメタクリレートのようなグリ
シジル基を有する単量体を、必要に応じて、他の共重合
性単量体と乳化共重合させることによって、それぞれカ
ルボキシル基、水酸基およびグリシジル基を有する担体
を得ることができる。また、所要の単量体成分を重合さ
せた後、得られた担体に官能基を導入することもでき
る。

【００１８】担体の粒子径は、分散性、ならびに非特異
的吸着のブロッキング剤、特異的結合物質などの固定性
の観点から、好ましくは３μｍ以下、さらに好ましくは
２μｍ以下であり、得られた特異的結合体の精製の容易
性の観点から、好ましくは０．０１μｍ以上、さらに好
ましくは０．１μｍ以上である。

【００１９】特異的結合物質は、被検物質と特異的に結
合する物質であればよく、抗原、ハプテン、抗体、オリ
ゴヌクレオチド、エフェクター、レセプター、酵素、酵
素補助因子、酵素阻害剤などが例示される。本発明にお
いては、前記特異的結合物質は、抗原、ハプテン、抗体
などの免疫化学的成分が好ましい。前記特異的結合物質
は、１種類であってもよく、数種類の被検物質とそれぞ
れ特異的に結合する数種類の特異的結合物質を混合して
用いることもできる。

【００２０】抗原およびハプテンとしては、クラミジア
・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター
・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、ト
キソプラズマ・ゴンディ、ボレリアなどの各種微生物抗
原、マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、
ＨＢｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、前
記抗原に由来するハプテンなどが挙げられる。

【００２１】抗体としては、モノクローナル抗体および
ポリクローナル抗体のいずれでもよい。具体的には、抗
大腸菌抗体、抗大腸菌Ｏ１５７抗体、抗サルモネラ菌抗
体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗
ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキ
シン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブ
ミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロ
ブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣ
Ｇ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレ
プトリジンＯ抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗
β−グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ア
デノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗
体、抗ＲＦ抗体などが挙げられる。

【００２２】オリゴヌクレオチドとしては、前記抗原と
して例示された各種微生物、マイコプラズマ、各種ウイ
ルスに由来する核酸成分に相補的なオリゴヌクレオチド
などが挙げられる。

【００２３】本発明の特異的結合体は、さらに、標識剤
で標識してもよい。標識剤としては、酵素、蛍光標識体
などが挙げられ、単独でまたは２種以上を混合して用い
ることができる。

【００２４】前記酵素としては、公知の標識に用いられ
る任意の酵素を用いることができる。具体的にはペルオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラー
ゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙
げられる。好ましくはより高感度で安定な検出を達成す
ることが可能なペルオキシダーゼまたはアルカリホスフ
ァターゼである。

【００２５】前記蛍光標識としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネートなどが挙げられる。

【００２６】本発明の特異的結合体は、担体としての水
分散型高分子粒子の表面に、非特異的吸着のブロッキン
グ剤、特異的結合物質および任意に標識剤を固定させる
ことにより得られる。

【００２７】担体に、非特異的吸着のブロッキング剤を
固定させる方法としては、例えば、特異的結合物質およ
び任意の標識剤を固定させた担体に非特異的吸着のブロ
ッキング剤を物理吸着させる方法、特異的結合物質およ
び任意の標識剤を固定させた担体を含有した液に非特異
的吸着のブロッキング剤を溶解させる方法などが挙げら
れる。

【００２８】前記非特異的吸着のブロッキング剤の処理
濃度は、非特異的反応を抑制するという観点から、１〜
３０重量％が好ましく、８〜１５重量％がより好まし
い。

【００２９】また、担体に、特異的結合物質および任意
の標識剤を固定させる方法としては、疎水結合（物理的
吸着）、イオン結合、共有結合などが利用できる。安定
性の観点から、共有結合により強力に固定することが好
ましい。また、本発明においては、共有結合を介して結
合させる際に、必要に応じて、特異的結合物質などの当
該高分子粒子上での自由度を高めるために、スペーサー
基を介在させることができる。

【００３０】このようにして得られた特異的結合体中に
含まれる非特異的吸着のブロッキング剤の固定量は、担
体の乾燥重量１ｇあたり、好ましくは１〜１５０ｍｇ、
さらに好ましくは５〜５０ｍｇである。また、特異的結
合物質および任意の標識剤の総固定量は、担体の乾燥重
量１ｇあたり好ましくは５〜２００ｍｇであり、その量
は上記の範囲内で、使用する特異的結合物質、標識剤の
種類などによって適宜変更し得る。例えば、担体が水分
散型高分子粒子の場合、当該粒子の表面積に鑑みると、
前記総固定量は、水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあ
たり２００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１５
０ｍｇ以下であり、被検物質の検出の迅速性、感度、再
現性の観点から、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ以上
がさらに好ましい。

【００３１】ここで、水分散型高分子粒子の「乾燥重
量」とは、一定量の水分散型高分子粒子を１２０℃で２
時間乾燥した後の重量をいう。

【００３２】本発明において、標識剤として、酵素を用
いる場合、酵素量はその活性としても表すことができ
る。勿論、固定される酵素の種類、その基質、温度など
種々の条件によって異なる。担体に固定される酵素がペ
ルオキシダーゼである場合には、活性は以下の方法で測
定する。基質である、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジン）０．２ｍｇ／ｍｌと過酸化水素
０．０１％とを含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ
４．５）３．３ｍｌに、特異的結合体０．０１２５％懸
濁液を１００μｌ混合して、２５℃で反応、５８０ｎｍ
の波長での吸光度を経時的に測定し、１分間に当該吸光
度を１増加させる酵素活性を１Ｕ（ユニット）として換
算する。

【００３３】ペルオキシダーゼの場合、特異的結合体
が、水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり、５，０
００〜３００，０００Ｕ、好ましくは１０，０００〜３
００，０００Ｕ、より好ましくは５０，０００〜３０
０，０００Ｕの酵素活性を有するように当該酵素が固定
されている事が望ましい。

【００３４】特異的結合物質が、ペプチドを有する抗
体、抗原、ハプテンである場合および標識剤が酵素であ
る場合、その固定量の測定は、色素結合法等を用いて測
定し、タンパク質の量として算出する。特異的結合物質
がオリゴヌクレオチドの場合は、固定後の遊離のオリゴ
ヌクレオチドを２６０ｎｍの吸光度を測定することによ
り算出する。

【００３５】このように担体に非特異的吸着のブロッキ
ング剤、特異的結合物質および任意の標識剤を固定させ
た後、例えば膜分離法や濾過、遠心分離法などの慣用の
分離法によって、本発明の特異的結合体を分離精製する
ことができる。このようにして得られた本発明の特異的
結合体は、水中に浸漬して保存してもよく、または凍結
乾燥して保存してもよい。

【００３６】本発明の免疫クロマトグラフ法は、前記特
異的結合体および標識特異的結合体からなる群より選ば
れた１種を用いることを１つの特徴とする。本発明の免
疫クロマトグラフ法は、前記特異的結合体または標識特
異的結合体を用いるため、非特異的吸着が少なく精度の
高い、被検物質の検出を可能にする。免疫クロマトグラ
フ法は、一般に以下のような工程を含むが、その検出方
法は特に限定されない。すなわち、被検物質に対する特
異的結合物質を固定化した固定相を有する吸水性基材か
らなる試験片の一端より、該被検物質に対する他の特異
的結合物質を有する標識特異的結合体と被検液との混合
物を吸収させて展開すると、該混合物中で形成された標
識特異的結合体−被検物質複合体は固定相上に固定化さ
れた特異的結合物質と結合して捕捉される。したがっ
て、該固定相に結合した標識特異的結合体を測定するこ
とにより被検液中の被検物質を測定することができる。
この場合、検出用の標識物質として酵素を用いた場合、
固定相で捕捉され形成される複合体が酵素標識複合体と
なり、酵素反応により生じる産物を測定することにより
検出を行なうことができる。また、標識物質として蛍光
標識体を用いた場合、該蛍光標識体から生じる蛍光を測
定することにより行なうことができる。

【００３７】本発明の免疫クロマトグラフィー用キット
は、前記免疫クロマトグラフ法に好適であり、前記特異
的結合体および標識特異的結合体からなる群より選ばれ
た１種を含有することを１つの特徴とする。本発明のキ
ット前記特異的結合体および標識特異的結合体からなる
群より選ばれた１種を含有するため、非特異的吸着が少
なく、精度の高い、被検物質の検出を可能にする。前記
キットには、さらに、緩衝液、発色基質溶液などの展開
用もしくは検出用試薬、被検物質と特異的に結合し得る
抗体などの特異的結合物質を固定化した固定相を有する
吸水性基材からなる試験片などを適宜含有してもよい。

【００３８】

【実施例】以下、実施例および実験例を挙げ、さらに具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定
されるものではない。

【００３９】実施例１：特異的結合体の作製 １）水分散型高分子粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレング
リコールメタクリレート０．２ｇ、蒸留水４４０ｇから
なる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持し、攪拌
しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム０．２５
ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１０時間重
合を行なった。その結果、カルボキシル化された水分散
型高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテッ
クス粒子（平均粒子径：約０．２μｍ）を得た。得られ
たカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を０．０
１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２に固形分濃度が５重量％
になるように分散した。

【００４０】２）固定化 ｉ）特異的結合物質の固定 本実施例では特異的結合物質として抗体を上記１）で作
製したラテックス粒子に以下のようにして固定した。

【００４１】上記ラテックス粒子の分散液３ｍｌに、水
溶性カルボジイミド（DOJIN 社製、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．２）０．５ｍｌ、抗ベロトキシン（以下、ＶＴ１と
いう）マウスモノクローナル抗体（トキシンテクノロジ
ー社製、５ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．２）２．１ｍｌを加えて１０℃で３時間反応させた
後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２
を用いて遠心分離洗浄を行い、同緩衝液で固形分濃度５
重量％に調製した。

【００４２】ii）酵素の固定 次いで、上記で作製した抗体固定化ラテックス粒子懸濁
液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド（DOJIN 社製、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩
衝液ｐＨ８．２）１ｍｌ、西洋ワサビ由来ペルオキシダ
ーゼ〔以下ＨＲＰと略す：和光純薬社製、２４ｍｇ／ｍ
ｌ（比活性２５０〜３５０Ｕ／ｍｇ）、０．０１Ｍ−ホ
ウ酸緩衝液ｐＨ８．２）２ｍｌを加えて１０℃で３時間
反応させた後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
ｐＨ８．２を用いて遠心分離洗浄を行なった。同緩衝液
で固形分濃度２重量％に調製し、抗ＶＴ１抗体およびＨ
ＲＰを固定化したラテックス粒子を作製した。

【００４３】実施例２ 非特異的吸着のブロッキング剤
の特異的結合体への物理的吸着 非特異的吸着を減じるための成分であるウシ血清アルブ
ミン（オリエンタル酵母社製）を１００ｍｇ／ｍｌとな
るように０．０１Ｍホウ酸緩衝液に溶解した。ついで、
実施例１のようにして得られた特異的結合体０．５ｇに
対して、前記ウシ血清アルブミン溶液を１０ｍｌ添加
し、２５℃で、３時間静置することにより、該ウシ血清
アルブミンの特異的結合体への物理的吸着を行なった。

【００４４】実験例１ 抗体および酵素の固定量の測定 実施例１で作製した抗ＶＴ１抗体とＨＲＰとを固定化し
たラテックス粒子について、抗体および酵素の各固定後
の上清をタンパク質定量して算出したタンパク質量と固
定化前に使用した抗体および酵素のそれぞれの量との差
からラテックス粒子の乾燥重量１ｇあたりの各固定量を
算出した。なお、当該タンパク質定量は以下のようにし
て行なった。

【００４５】（タンパク質定量−色素結合法(Bradford
法))固定化抗体、酵素量の定量にはCoomassie Brillian
t Blue G-250による色素結合法を用いた。実際の測定
は、市販キットである『Coomassie Protein Assay Reag
ent 』(PIERCE 社製) を使用した。測定法は附属の手順
書に従った。

【００４６】検量線は、濃度既知の該抗体、該酵素溶液
を用いて上記の試薬にて発色した後、５９５ｎｍの吸光
度を測定して作成した。適宜希釈した各固定化後の上清
を、上記の試薬にて発色させた後、５９５ｎｍの吸光度
を測定、検量線から当該抗体および当該酵素の濃度を算
出し、それぞれの量を決定した。測定は、室温（２５
℃）で行なった。反応時間は特に限定がないが、発色後
９０分以内に吸光度測定を実施した。

【００４７】その結果、抗体（分子量約１６万）の固定
量は２０．８ｍｇ、酵素（分子量約４万）の固定量は
３．６ｍｇであった。また、この結果より抗体１分子あ
たりの酵素数を算出すると、０．７分子であった。

【００４８】実験例２ 抗体および酵素の固定されたラ
テックス粒子の酵素活性の測定 実施例１で作製した抗ＶＴ１抗体とＨＲＰとを固定化し
たラテックス粒子について、その酵素活性を測定した。
ＴＭＢ（3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine) membr
ane Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perr
y LaboratoriesInc. 社製、ｐＨ４．５）を基質液とし
て使用した。キュベット内で、上記の基質液３．３ｍｌ
に０．０１２５重量％に希釈した酵素−抗体固定化ラテ
ックス粒子分散液０．１ｍｌを混合し、２５℃で反応
後、分光光度計で５８０ｎｍにおける１分間の吸光度上
昇を測定した。吸光度を１分間に１上昇させる活性を１
Ｕ（ユニット）と定義し、ラテックス粒子の乾燥重量１
ｇあたりの活性で表現した。その結果、ラテックス粒子
の乾燥重量１ｇあたり２０３２０Ｕであった。

【００４９】実験例３ 非特異的吸着のブロッキング剤
の固定量の測定 特異的結合体に吸着して固定されたウシ血清アルブミン
の量は、該タンパク質吸着後の上清中のタンパク質を定
量して算出したタンパク質量と、吸着前に使用した全タ
ンパク質量との差により求めた。その結果、特異的結合
体の乾燥重量１ｇあたり、８ｍｇの吸着量であった。

【００５０】実施例３：免疫クロマトグラフ型試験片の
使用 １）試験片の作製 ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ、６ｍｍ×６
０ｍｍ）の一端から３０ｍｍの箇所に抗ＶＴ１抗体（１
ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４）を１．
５μｌ、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した
（固定相）。

【００５１】このメンブレンをウシ血清アルブミン（オ
リエンタル酵母社製、１重量％）およびポリオキシエチ
レン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業
社製、０．１重量％）、サッカロース（和光純薬工業社
製、１重量％）からなる水溶液中に１０分間浸漬させて
のち、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、このメンブ
レンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステルフィ
ルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせ
た。

【００５２】抗体塗布箇所から５ｍｍの箇所にポリエス
テル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り
合わせた。これを基質溶液滴下領域とした。なお、抗体
塗布箇所からみて、基質溶液滴下領域側を上流とする。

【００５３】メンブランの上流端にポリエステル不織布
（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合わせた。
これを試料受領部とする。

【００５４】２）測定 ０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ８．０）に、ＶＴ１（トキシンテクノロジー社製）を
表１に示した濃度で分散させた被検試料を調製した。

【００５５】この被検試料に実施例２で作製したウシ血
清アルブミン処理−特異的結合体または実施例１で得ら
れたウシ血清アルブミン未処理−特異的結合体を、固形
分濃度０．０２重量％となるように混合した後、混合物
６０μｌを上記１）で作製した各試験片のポリエステル
不織布部（試料受領部）に滴下した。

【００５６】５分後、各試験片について、０．２Ｍ 塩
化アンモニウム緩衝液〔ｐＨ８．０、洗浄液１という〕
６０μｌを同試料受領部に滴下して非吸着物を洗浄し
た。洗浄液１による洗浄５分後、さらに０．１Ｍ クエ
ン酸緩衝液〔ｐＨ４．５、洗浄液２という〕６０μｌを
滴下して非吸着物を洗浄した。洗浄液２による洗浄５分
後、ＴＭＢ（3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine) m
embrane Peroxidase Substrate System (Kirkegaard &
Perry Laboratories Inc. 社製、ｐＨ４．５）を含む基
質溶液６０μｌを基質溶液滴下領域に滴下し、１０分後
の発色の有無を目視観察した。

【００５７】判断基準 ＋：強い発色 ±：弱い発色 −：発色なし

【００５８】

【表１】

【００５９】非特異的吸着のブロッキング剤を吸着した
特異的結合体である、ウシ血清アルブミン処理−特異的
結合体を用いた場合、ＶＴ１濃度０ｎｇ／ｍｌでは、発
色がなく陰性であり、０．１ｎｇ／ｍｌ以上で発色が生
じ、陽性として検出された。一方、ブロッキング剤を吸
着していない特異的結合体である、ウシ血清アルブミン
未処理−特異的結合体を用いた場合、ＶＴ１濃度０ｎｇ
／ｍｌでは、弱い発色が認められ、擬陽性として検出さ
れた。以上の結果より、特異的結合体に非特異的吸着を
減じるための成分を吸着させることにより、非特異的な
反応を抑制することができることが示された。

【００６０】

【発明の効果】本発明の特異的結合体は、水分散型高分
子粒子である担体自体の表面に非特異的吸着のブロッキ
ング剤を有しているため、簡便で、且つ高感度な非特異
的吸着の少ない検出を可能にするという優れた効果を奏
する。また、本発明の免疫クロマトグラフ法によれば、
前記特異的結合体を用いるため、非特異的吸着が少な
く、精度の高い、被検物質の検出を可能にするという優
れた効果を奏する。また、本発明の免疫クロマトグラフ
ィー用キットは、前記特異的結合体および標識特異的結
合体からなる群より選ばれた１種を含有しているため、
前記免疫クロマトグラフ法に好適であり、非特異的吸着
が少なく、精度の高い、被検物質の検出を可能にする優
れた効果を奏する。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水分散型高分子粒子を担体とし、該担体
   の表面に被検物質に対する特異的結合物質と、非特異的
   吸着のブロッキング剤とを有してなる特異的結合体。
2. 【請求項２】 非特異的吸着のブロッキング剤が、ウシ
   血清アルブミン、カゼインおよびスキムミルクからなる
   群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１記載の
   特異的結合体。
3. 【請求項３】 該特異的結合物質が、抗体、抗原、ハプ
   テンおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれた
   少なくとも１種である、請求項１または２記載の特異的
   結合体。
4. 【請求項４】 水分散型高分子粒子が着色ラテックスで
   ある、請求項１〜３いずれか記載の特異的結合体。
5. 【請求項５】 請求項１〜４いずれか記載の特異的結合
   体が、さらに、標識剤で標識されてなる標識特異的結合
   体。
6. 【請求項６】 標識剤が、酵素および蛍光標識体からな
   る群より選ばれた少なくとも１種である、請求項５記載
   の標識特異的結合体。
7. 【請求項７】 請求項１〜４いずれか記載の特異的結合
   体および請求項５または６記載の標識特異的結合体から
   なる群より選ばれた１種を用いることを特徴とする免疫
   クロマトグラフ法。
8. 【請求項８】 請求項１〜４いずれか記載の特異的結合
   体および請求項５または６記載の標識特異的結合体から
   なる群より選ばれた１種を含有してなる免疫クロマトグ
   ラフィー用キット。