JP2001019699A - Measurement of ns3 protease activity of hcv - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a synthetic substrate capable of determining the activity of a nonstructural protein 3 protease of hepatitis C virus in high sensitivity by bonding a fluorescent group and a quenching group to arbitrary positions through covalent bonds to get a specific amino acid sequence. SOLUTION: The objective synthetic substrate is produced by bonding a fluorescent group and a quenching group to arbitrary positions through covalent bonds in a manner to get amino acid sequences of (A) R1-Thr-Thr-Pro-Cys-Ser- Gly-Ser-Lys-Arg-R2 (R1 is H or an amino acid residue; R2 is OH, amino or an amino acid residue; Thr is threonine; Pro is proline; Cys is cysteine; Ser is serine; Gly is glycine; Lys is lysine; Arg is arginine), (B) R1-Thr-Thr-Pro-Cys- Ser-Gly-Ser-Lys-Arg-Asp-Ile-Trp-Asp-R2 (Asp is aspartic acid; Ile is isoleucine; Trp is tryptophan), etc.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明はＨＣＶのＮＳ３プロ
テアーゼ活性の測定に関するものである。The present invention relates to the measurement of NS3 protease activity of HCV.

【０００２】[0002]

【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）は、Ｃ型肝炎の原因ウイル
スである。Ｃ型肝炎は患者数が多い上、慢性化しやす
く、肝硬変、肝癌に移行する確率が高いと言われ（Ｎ．
Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１巻、１４９４〜１５０
０頁、８９年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８７巻、６５４７〜６５４９頁、９０年
発行。ビロロジー、４巻、３０５〜３１２頁、９３年発
行）、その治療が重大な臨床上の問題となっている。従
って、その治療薬はエイズ治療薬と並んで、現在最も切
望されているウイルス疾患治療薬と言える。現在、Ｃ型
肝炎の治療にはインターフェロンが使用されているが、
有効率が低く、治療効果には限界があると言われてい
る。2. Description of the Related Art Hepatitis C virus (Hepatitis)
C virus (HCV) is the causative virus of hepatitis C. It is said that hepatitis C has a large number of patients, is likely to become chronic, and has a high probability of transition to liver cirrhosis or liver cancer (N.
Engl. J. Med. , 321, 1494-150
0 pages, published in 1989. Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, Vol. 87, pp. 6547-6549, published in 1990. Virology, 4, 305-312, 1993), the treatment of which is a serious clinical problem. Therefore, the therapeutic agent can be said to be the most coveted viral disease therapeutic agent at present along with the AIDS therapeutic agent. Currently, interferon is used to treat hepatitis C,
It is said that the efficacy rate is low and the therapeutic effect is limited.

【０００３】ＨＣＶゲノムは、９４００塩基からなる一
本鎖ＲＮＡ（＋鎖）からなり、約３０００アミノ酸から
なる一本のポリプロテインをコードしている。この前駆
体蛋白には、Ｎ末端より（ＮＨ₂ ）−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−
ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ
５Ｂ−（ＣＯＯＨ）の順に９種類のウイルス蛋白が含ま
れる（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７４巻、１１０３〜
１１１３頁、９３年発行。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７巻、
１３８５〜１３９５頁・４０１７〜４０２６頁、９３年
発行）。宿主細胞由来のプロテアーゼ（ＮＳ３プロテア
ーゼとｃｐｒｏｌ）によりポリプロテインがプロセッシ
ングを浮け、ウイルスの増殖に必要な蛋白質が供給され
る。[0003] The HCV genome is composed of a single-stranded RNA (+ strand) consisting of 9400 bases and encodes a single polyprotein consisting of about 3000 amino acids. This precursor protein has (NH ₂ ) -C-E1-E2-
NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS
Nine types of viral proteins are included in the order of 5B- (COOH) (J. Gen. Virol., Vol. 74, 1103-
Published on page 1113, 1993. J. Virol. , 67 volumes,
1385 to 1395, 4017 to 4026, published in 1993). Host proteins derived from the host cells (NS3 protease and cprol) allow the polyprotein to process and supply the proteins necessary for virus growth.

【０００４】非構造蛋白３（ＮＳ３）のＮ末側の３分の
１にＮＳ３プロテアーゼ活性は存在し、ウイルス複製に
必要な蛋白質をコードする非構造領域内の４カ所（それ
ぞれの切断部位は「ＮＳ３／４Ａ」「ＮＳ４Ａ／４Ｂ」
「ＮＳ４Ｂ／５Ａ」「ＮＳ５Ａ／５Ｂ」と呼ばれる）を
切断する（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７巻、２８３２〜２８
４３頁、９３年発行）。その結果、ＮＳ３からＮＳ５の
領域において、ＮＳ３（ｐ７０）、ＮＳ４Ａ（ｐ４）、
ＮＳ４Ｂ（ｐ２７）、ＮＳ５Ａ（ｐ５８／５６）および
ＮＳ５Ｂ（ｐ６６）の５つの蛋白質が生じる（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０巻、
１０７７３頁、９３年発行）。ＮＳ３プロテアーゼは単
独では活性が弱く、別の非構造蛋白質の一つであるＮＳ
４Ａがコファクター（補助因子）となり、プロテアーゼ
の基質切断活性を増強することが知られている（Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．，６８巻、３７５３〜３７６０頁、９４年発
行）。ＮＳ３プロテアーゼで切断される４カ所の塩基配
列のうち、トランスに切断される３カ所（ＮＳ４Ａ／４
Ｂ、ＮＳ４Ｂ／５Ａ、ＮＳ５Ａ／５Ｂ）についてはＰ１
位がシステインであり、ＮＳ３プロテアーゼは今までに
知られていない基質特異性を有している。このように、
ＮＳ３プロテアーゼはウイルス増殖に必要であること、
また宿主のプロテアーゼとは異なる基質特異性を有して
いることから、抗ＨＣＶ薬の有力な候補の一つと考えら
れている。すなわち、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤のスク
リーニングによって、抗ＨＣＶ薬の有力な候補を見出す
ことが可能であると考えられる。[0004] NS3 protease activity is present in the N-terminal one-third of non-structural protein 3 (NS3), and is located at four sites in the non-structural region encoding a protein required for viral replication (each cleavage site is " NS3 / 4A, NS4A / 4B
(Referred to as "NS4B / 5A" and "NS5A / 5B") (J. Virol., 67, 2832-28).
43, 1993). As a result, in the region from NS3 to NS5, NS3 (p70), NS4A (p4),
Five proteins occur, NS4B (p27), NS5A (p58 / 56) and NS5B (p66) (Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA. , 90 volumes,
10773, published in 1993). NS3 protease alone has a weak activity, and NS3 is another nonstructural protein.
It is known that 4A becomes a cofactor (cofactor) and enhances the substrate cleavage activity of protease (JV
irol. 68, 3753-3760, published in 1994). Of the four nucleotide sequences cleaved by NS3 protease, three sites cleaved in trans (NS4A / 4
B, NS4B / 5A, NS5A / 5B)
At position cysteine, the NS3 protease has a previously unknown substrate specificity. in this way,
NS3 protease is required for virus growth,
In addition, since it has a substrate specificity different from that of the host protease, it is considered to be one of the potential candidates for anti-HCV drugs. That is, it is considered that a potential anti-HCV drug candidate can be found by screening for an NS3 protease inhibitor.

【０００５】ところで、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤をス
クリーニングするためには、ＨＣＶのＮＳ３プロテアー
ゼの活性測定系が必要であることは言うまでもないが、
合成基質を用いた迅速で簡便なＨＣＶのＮＳ３プロテア
ーゼの活性測定系は、未だ確立されていないのが現状で
ある。特に、酵素活性測定用の合成基質は、酵素に対す
る高度の感受性と特異性、水または生物学的試験液に対
する良好な溶解性および消化生成物の易出性の４点を満
足することが重要であると言われているが、これらの条
件を満たすＮＳ３プロテアーゼのための合成基質につい
ては全く知見がない。By the way, it goes without saying that a screening system for NS3 protease activity of HCV is required for screening NS3 protease inhibitors.
At present, a rapid and simple HCV NS3 protease activity measurement system using a synthetic substrate has not yet been established. In particular, it is important that the synthetic substrate for measuring the enzyme activity satisfies the four points of high sensitivity and specificity to the enzyme, good solubility in water or a biological test solution, and easy release of digestion products. Although it is said, there is no knowledge of a synthetic substrate for NS3 protease that meets these conditions.

【０００６】これまで、ＮＳ３プロテアーゼ活性は、イ
ンビトロの転写−翻訳系または細胞内発現系で、プロテ
アーゼと基質を共発現し、基質の切断を免疫沈降または
ウエスタンブロットで確認するという方法で行われてい
た（ビロロジー、２０９巻、５２〜５９頁、９５年発
行。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８巻、３７５３〜３７６０頁
・５０４５〜５０５５頁・５０６３〜５０７３頁・７３
５１〜７３５７頁、９４年発行。同、６９巻、２５３４
〜２５３９頁、９５年発行）。これらの方法は、免疫沈
降、電気泳動の操作が必要なため、阻害剤スクリーニン
グのための簡便なアッセイ法とは言い難い上に、酵素と
基質の発現量を判断しにくいことから、酵素学的な解析
には不向きであった。Hitherto, NS3 protease activity has been carried out by co-expressing a protease and a substrate in an in vitro transcription-translation system or intracellular expression system, and confirming the cleavage of the substrate by immunoprecipitation or Western blot. (Birology, 209, 52-59, published in 1995. J. Virol., 68, 3753-3760, 5045-5055, 5063-5073, 73.
Pages 51 to 7357, published in 1994. Ibid, 69, 2534
~ 2539, published in 1995). These methods require immunoprecipitation and electrophoresis operations, so they are not a simple assay for screening inhibitors, and it is difficult to determine the expression levels of enzymes and substrates. It was not suitable for any analysis.

【０００７】また、合成ペプチド基質を用いたＮＳ３プ
ロテアーゼのアッセイ法も報告されている（ＢＢＲ
Ｃ．，２１０巻、１０５９〜１０６５頁、９５年発
行）。これは、ＮＳ５Ａ／５Ｂ間の配列を模した２０ア
ミノ酸のＮ末端にダンシル基を導入した基質を用いた系
であるが、基質の消化を逆相ＨＰＬＣで検出する必要が
あり、活性測定にかなりの時間と手間を要することか
ら、多くの検体数をこなす必要がある阻害剤のスクリー
ニングには適した方法とは言えない。[0007] Also, an assay method for NS3 protease using a synthetic peptide substrate has been reported (BBR).
C. 210, 1059-1065, 1995). This is a system using a substrate having a dansyl group introduced at the N-terminus of 20 amino acids, which mimics the sequence between NS5A / 5B. However, it is necessary to detect the digestion of the substrate by reverse-phase HPLC, and it is quite necessary to measure the activity. Therefore, it is not a suitable method for screening an inhibitor that needs to handle a large number of samples.

【０００８】分子内蛍光消光を利用した合成基質は既に
知られており、基質配列の切断点を挟んで消光団と蛍光
団とを有し、酵素による切断前は消光団により蛍光が抑
えられているが、切断後は消光が解除され蛍光強度が増
加することを特徴としている。この基質は、ストロムラ
イシン１（マトリックスプロテアーゼ−３、ＪＢＣ．，
２６９巻、２０９５２〜２０９５７頁、９４年発行）、
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）プロテアーゼ（特公平
６−６１２７９号公報。サイエンス、２４７巻、９５４
〜９５８頁、９０年発行）、ウシファクターＩＸαβ、
Ｘαβ（バイオケミストリー、２２巻、１０２１〜１０
２９頁、８３年発行）等の活性測定に利用されている。[0008] Synthetic substrates utilizing intramolecular fluorescence quenching are already known and have a quencher and a fluorophore across a cleavage point in the substrate sequence, and the fluorescence is suppressed by the quencher before cleavage by an enzyme. However, after cutting, the quenching is released and the fluorescence intensity is increased. The substrate is stromlysin 1 (matrix protease-3, JBC.,
269, 2095-20957, published in 1994),
HIV (human immunodeficiency virus) protease (Japanese Patent Publication No. 6-61279; Science, 247, 954).
958, published in 1990), Bovine Factor IXαβ,
Xαβ (Biochemistry, Volume 22, 1021-10
29, published in 1983).

【０００９】ＮＳ３プロテアーゼのアッセイのために分
子内蛍光消光を利用した合成基質を利用する方法として
は、ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−ｙ−Ｌｙｓ（式中、ｘ
は単結合またはＬｙｓを、ｙは単結合またはＴｙｒを示
す）の基本骨格を有し、蛍光団および消光団を共有結合
した合成基質を用いてＨＣＶのＮＳ４Ａ由来のペプチド
存在下で測定する方法（ＷＯ公開９７−０８１９４号公
報）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）ま
たはＡｓｐ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）を用
いる方法（特表平１０−５１１５５６号公報）などが報
告されている。なお、ＥＤＡＮＳは５−［（２−アミノ
エチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸を、ＤＡ
ＢＣＹＬは４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安
息香酸を、Ａｂｕはα−アミノ酪酸を示す。また、Ａｓ
ｐ（ＥＤＡＮＳ）はＡｓｐ側鎖のカルボキシル基にＥＤ
ＡＮＳが共有結合していることを、Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹ
Ｌ）はＬｙｓ側鎖のアミノ基にＤＡＢＣＹＬが共有結合
していることを示す。As a method of using a synthetic substrate utilizing intramolecular fluorescence quenching for assaying NS3 protease, x-Asp-Lys-Ile-Val-Pro-C
ys-Ser-Met-Ser-y-Lys (where x
Is a single bond or Lys, and y is a single bond or Tyr), and is measured in the presence of a NS4A-derived peptide of HCV using a synthetic substrate to which a fluorophore and a quencher are covalently bonded ( WO publication 97-08194), Asp-Glu-Asp (EDANS) -Glu
-Glu-Abu-Ala-Lys (DABCYL) or Asp-Asp (EDANS) -Met-Glu-
A method using Glu-Abu-Ala-Lys (DABCYL) (Japanese Patent Laid-Open No. 10-511556) and the like have been reported. Note that EDANS is obtained by converting 5-[(2-aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid into DA
BCYL represents 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid, and Abu represents α-aminobutyric acid. Also, As
p (EDANS) is ED at the carboxyl group of the Asp side chain.
Lys (DABCY) indicates that ANS is covalently bonded.
L) indicates that DABCYL is covalently bound to the amino group of the Lys side chain.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、高感度にＮ
Ｓ３プロテアーゼ活性を測定するための、新規な合成基
質を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該
合成基質を用いたＮＳ３プロテアーゼ活性の測定方法お
よびその利用方法を提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a high sensitivity N
An object of the present invention is to provide a novel synthetic substrate for measuring S3 protease activity. A further object of the present invention is to provide a method for measuring NS3 protease activity using the synthetic substrate and a method for using the same.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の事情
を考慮して研究を行った結果、従来技術とは異なる新規
な合成基質を用いて、高感度にＮＳ３プロテアーゼ活性
を測定できることを見出して、本発明を完成した。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted a study in consideration of the above circumstances, and as a result, have found that NS3 protease activity can be measured with high sensitivity using a novel synthetic substrate different from the prior art. We have completed the present invention.

【００１２】本発明は１）特定のアミノ酸配列を基本骨
格として有し、蛍光団および消光団を共有結合した合成
基質、２）当該合成基質を用いたＮＳ３プロテアーゼ活
性の測定方法、３）当該合成基質を含む同酵素活性の測
定試薬、４）当該測定試薬または方法を用いて同酵素に
対する阻害作用を有する化合物を選別する方法、５）当
該選別方法により選別された化合物に関する。以下に詳
細を説明する。The present invention provides 1) a synthetic substrate having a specific amino acid sequence as a basic skeleton and a covalently bound fluorophore and quencher, 2) a method for measuring NS3 protease activity using the synthetic substrate, and 3) the synthesis. The present invention relates to a reagent for measuring the enzyme activity containing a substrate, 4) a method of selecting a compound having an inhibitory effect on the enzyme using the measurement reagent or the method, and 5) a compound selected by the screening method. The details will be described below.

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】Ａ）合成基質 本発明の合成基質は、以下の構造式（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）で表されるアミノ酸配列を基本骨格として有す
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A) Synthetic Substrate The synthetic substrate of the present invention has an amino acid sequence represented by the following structural formula (a), (b) or (c) as a basic skeleton.

【００１４】（ａ）：Ｒ¹ −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｒ
² （ｂ）：Ｒ¹ −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｒ² （ｃ）：Ｒ¹ −Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｘ−
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｒ² (A): R ¹ -Thr-Thr-Pro-
Cys-Ser-Gly-Ser-Lys-Arg-R
² (b): R ¹ -Thr-Thr-Pro-Cys-Se
r-Gly-Ser-Lys-Arg-Asp-Ile
^{-Trp-Asp-R 2 (c} ): R 1 -Glu-Asp-Val-Val-X-
Cys-Ser-Met-Ser-Lys-Arg-A
rg-Arg-R ²

【００１５】式中のＲ¹ はＨまたはアミノ酸残基を示
す。Ｒ² はＯＨ、アミノまたはアミノ酸残基を示す。ア
ミノ酸残基は合成基質として同等の機能を有するもので
あればよく、１〜４個程度のアミノ酸配列が挙げられ
る。Ｘはα型アミノ酸残基を示す。α型アミノ酸として
は、α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）等が例示される。R ¹ in the formula represents H or an amino acid residue. R ² represents OH, amino or amino acid residue. The amino acid residues may be those having the same function as a synthetic substrate, and include about 1 to 4 amino acid sequences. X represents an α-type amino acid residue. Examples of the α-type amino acid include α-aminobutyric acid (Abu) and the like.

【００１６】なお、本明細書においては、アミノ酸を３
文字表記法で表す。すなわち、Ａｌａはアラニンを、Ｃ
ｙｓはシステインを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｇｌ
ｕはグルタミン酸を、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｇ
ｌｙはグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｉｌｅはイ
ソロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｌｅｕはロイシン
を、Ｍｅｔはメチオニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ａｒｇは
アルギニンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｔｈｒはスレオニン
を、Ｖａｌはバリンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンをそれぞれ示す。In this specification, the amino acid is 3
Expressed in character notation. That is, Ala replaces alanine with C
ys for cysteine, Asp for aspartic acid, Gl
u is glutamic acid, Phe is phenylalanine, G
ly for glycine, His for histidine, Ile for isoleucine, Lys for lysine, Leu for leucine, Met for methionine, Asn for asparagine,
Pro for proline, Gln for glutamine, Arg for arginine, Ser for serine, Thr for threonine, Val for valine, Trp for tryptophan, T
yr represents tyrosine, respectively.

【００１７】本発明の合成基質としては、具体的には以
下のようなアミノ酸配列を基本骨格として有するものが
例示される。Specific examples of the synthetic substrate of the present invention include those having the following amino acid sequence as a basic skeleton.

【００１８】Ｈ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ₂ 、Ｈ−
Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｓ
ｐ−ＯＨ、Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｂ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ₂ H-Thr-Thr-Pro-Cys-S
er-Gly-Ser-Lys-Arg-NH ₂ , H-
Thr-Thr-Pro-Cys-Ser-Gly-S
er-Lys-Arg-Asp-Ile-Trp-As
p-OH, H-Glu-Asp-Val-Val-Ab
u-Cys-Ser-Met-Cys-Lys-Arg
-Arg-Arg-NH ₂

【００１９】上記の合成基質は、分子内の任意の位置に
蛍光団および消光団を共有結合してなる。蛍光団は蛍光
性を有する基であればよく、公知のものを使用できる。
なお、蛍光とは光の吸収により分子や原子が光を放出す
ることをいう。蛍光団としては、例えば、Ｎ−メチルア
ントラニル酸（Ｎｍａ）、（７−メトキシクマリン−４
−イル）アセチル（ＭＯＣＡｃ）、５−［（２−アミノ
エチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡ
ＮＳ）、２−アミノベンジル基（Ａｂｚ）等が例示され
る。結合位置としては、Ｎ末端に位置するアミノ酸のア
ミノ基、ＡｓｐまたはＧｌｕの側鎖のカルボキシル基等
が例示される。The above-mentioned synthetic substrate has a fluorophore and a quencher covalently bonded at any position in the molecule. The fluorophore may be any group having a fluorescent property, and a known group can be used.
Note that fluorescence means that molecules and atoms emit light by absorption of light. Examples of the fluorophore include N-methylanthranilic acid (Nma) and (7-methoxycoumarin-4).
-Yl) acetyl (MOCAc), 5-[(2-aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid (EDA
NS), 2-aminobenzyl group (Abz) and the like. Examples of the bonding position include an amino group of an amino acid located at the N-terminus, and a carboxyl group of a side chain of Asp or Glu.

【００２０】消光団は蛍光消光の性質を有する基であれ
ばよく、公知のものが使用できる。例えば、２，４−ジ
ニトロフェノール（Ｄｎｐ）、４−（４−ジメチルアミ
ノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ニト
ロベンジルアミド（Ｎｂａ）等が例示される。結合位置
としてはＬｙｓまたはＡｒｇの側鎖のアミノ基等が例示
される。The quencher may be any group having a property of fluorescence quenching, and known groups can be used. For example, 2,4-dinitrophenol (Dnp), 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL), 4-nitrobenzylamide (Nba) and the like are exemplified. Examples of the bonding position include an amino group on the side chain of Lys or Arg.

【００２１】本発明の合成基質の具体例としては以下の
ような構造式を有するものが例示される。Specific examples of the synthetic substrate of the present invention include those having the following structural formulas.

【００２２】Ｎｍａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ａｒｇ
−ＮＨ₂ 、Ｎｍａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｎｍａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−ＮＨ₂ Nma-Thr-Thr-Pro-Cys
-Ser-Gly-Ser-Lys (Dnp) -Arg
_{-NH 2, Nma-Thr-Thr} -Pro-Cys-
Ser-Gly-Ser-Lys (Dnp) -Arg-
Asp-Ile-Trp-Asp-OH, Nma-Gl
u-Asp-Val-Val-Abu-Cys-Ser
-Met-Ser-Lys (Dnp) -Arg-Arg
-Arg-NH ₂

【００２３】なお、ＮｍａはＮ末のアミノ基に、Ｄｎｐ
はＬｙｓ側鎖のアミノ基に、各々共有結合している。Nma is the amino group at the N-terminus and Dnp
Is covalently bonded to the amino group of the Lys side chain.

【００２４】基本骨格となるアミノ酸配列は、ペプチド
合成法、遺伝子工学的な手法等により製造することがで
きる。また、アミノ酸と蛍光団、アミノ酸と消光団との
共有結合は、エステル化、アミド化、エーテル化、ジス
ルフィド化等により行うことができる。この共有結合は
アミノ酸配列作成の前後のいずれで行ってもよい。The amino acid sequence serving as the basic skeleton can be produced by a peptide synthesis method, a genetic engineering technique, or the like. The covalent bond between the amino acid and the fluorophore or between the amino acid and the quencher can be formed by esterification, amidation, etherification, disulfide formation, or the like. This covalent bonding may be performed before or after the amino acid sequence is prepared.

【００２５】Ｂ）測定試薬 測定試薬を構成する要素（コンポーネント）としては、
Ａ）の合成基質の他に、ＮＳ４Ａ由来のペプチド、測定
用溶媒、ＮＳ３プロテアーゼ、測定用担体（支持体）等
が例示される。B) Measuring Reagent The components constituting the measuring reagent include:
In addition to the synthetic substrate of A), a peptide derived from NS4A, a measurement solvent, NS3 protease, a measurement carrier (support) and the like are exemplified.

【００２６】合成基質の使用濃度は１〜１０００μＭ程
度である。The working concentration of the synthetic substrate is about 1 to 1000 μM.

【００２７】ＨＣＶのＮＳ４Ａ由来のペプチドはコファ
クターとして使用する。当該ペプチドとしては、Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇあるいはそのＣ末のカルボキシル基のアミド体等が
例示される。当該ペプチドの使用濃度は１〜１００μＭ
程度である。The NS4A peptide derived from HCV is used as a cofactor. The peptide includes Gly
-Ser-Val-Val-Ile-Val-Gly-
Arg-Ile-Ile-Leu-Ser-Gly-A
Examples include rg or an amide of a carboxyl group at the C-terminus. The working concentration of the peptide is 1 to 100 μM.
It is about.

【００２８】測定用溶媒としては、緩衝液等が使用され
る。緩衝液としてはリン酸系、炭酸系、酢酸系、トリス
系等が例示される。当該測定用溶媒のｐＨとしては６〜
９程度、塩濃度としては１０〜１０００ｍＭ程度が例示
される。As the measuring solvent, a buffer or the like is used. Examples of the buffer include phosphate, carbonate, acetate, and Tris. The pH of the measuring solvent is 6 to
For example, the salt concentration is about 9 and about 10 to 1000 mM.

【００２９】その他の添加剤として、界面活性剤、ポリ
オール、還元剤等が安定化のために使用できる。界面活
性剤としては、非イオン系のもののが好ましい。例え
ば、一般名ノニデットＰ４０（商品名ＮＰ４０）、ポリ
エチレンオキサイドのアルキルフェノールエーテル（商
品名トリトン）、ポリエチレンオキサイドのソルビタン
脂肪酸エステル（商品名トウイーン）、ポリエチレンオ
キサイドのラウリルアルコールエーテル（商品名ブリ
ジ）等が例示される。また、３−［（３−コラミド−プ
ロピル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンス
ルホネート（ＣＨＡＰＳ）、アルキル化グリコシド類
（例えば、オクチルグルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ
−マルトシド等）を使用することもできる。当該界面活
性剤の使用濃度は０．００１〜１％ｗ／ｖ程度である。As other additives, surfactants, polyols, reducing agents and the like can be used for stabilization. The surfactant is preferably a nonionic surfactant. Examples include Nonidet P40 (trade name NP40), alkylphenol ether of polyethylene oxide (trade name: Triton), sorbitan fatty acid ester of polyethylene oxide (trade name: Tween), lauryl alcohol ether of polyethylene oxide (trade name: Briji), and the like. You. Also, 3-[(3-cholamido-propyl) -dimethyl-ammonium] -1-propanesulfonate (CHAPS), alkylated glycosides (for example, octylglucoside, n-dodecyl-β-D)
-Maltoside) can also be used. The concentration of the surfactant used is about 0.001 to 1% w / v.

【００３０】ポリオールとしては、エチレングリコー
ル、グリセロール、糖アルコール（ソルビトール、マン
ニトール、アラビトール、キシリトールなど）、単糖類
（フルクトース、ガラクトース、グルコース）、二糖類
（シュークロースなど）等が例示される。当該ポリオー
ルの使用濃度は０．１〜１０Ｍ（０．５〜５０％ｗ／
ｖ）程度である。Examples of the polyol include ethylene glycol, glycerol, sugar alcohols (sorbitol, mannitol, arabitol, xylitol, etc.), monosaccharides (fructose, galactose, glucose), and disaccharides (sucrose, etc.). The concentration of the polyol used is 0.1 to 10 M (0.5 to 50% w /
v) degree.

【００３１】還元剤としてはジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、シ
ステイン、アスコルビン酸等が例示される。当該還元剤
の使用濃度は０．１〜１００ｍＭ程度である。As a reducing agent, dithiothreitol (DT)
T), mercaptoethanol, reduced glutathione, cysteine, ascorbic acid and the like. The working concentration of the reducing agent is about 0.1 to 100 mM.

【００３２】本試薬においてはＮＳ３プロテアーゼを、
被検体中の同酵素活性測定時には陽性コントロールとし
て、あるいは阻害アッセイ時には添加用試薬として使用
する。本酵素は遺伝子工学的手法等により調製すること
ができる（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０２巻、２０
９〜２１２頁、９７年発行）。当該酵素の使用濃度は
０．０１〜１００μＭ程度である。In this reagent, NS3 protease is used.
It is used as a positive control when measuring the same enzyme activity in a sample, or as a reagent for addition during an inhibition assay. This enzyme can be prepared by a genetic engineering technique or the like (FEBS Letters, 402, 20
9-212, 1997). The working concentration of the enzyme is about 0.01 to 100 μM.

【００３３】本試薬においては、測定用担体（支持体）
を使用することができる。例えば、マイクロプレート、
プラスチックチューブ、プラスチックボール、不溶性ゲ
ル（デキストラン系、セルロース系など）等が例示され
る。In the present reagent, a carrier for measurement (support)
Can be used. For example, microplate,
Examples include plastic tubes, plastic balls, and insoluble gels (dextran-based, cellulose-based, etc.).

【００３４】Ｃ）測定方法 ＮＳ３プロテアーゼの酵素活性を測定する場合は、各種
の構成要素（コンポーネント）を混合反応後に酵素基質
生成物の生成量を測定する。反応条件としては、２０〜
３５℃、１０分〜２時間程度が例示される。酵素基質生
成物の定量には蛍光光度測定法等を用いることができ
る。蛍光光度測定時の条件は蛍光団の種類に応じて適宜
設定される。具体的には、例えば、Ｎｍａの場合、Ｅｘ
３２０〜３７０ｎｍ、Ｅｍ４５０〜４７０ｎｍ程度が例
示される。また、ＭＯＣＡｃの場合、Ｅｘ３２０〜３４
０ｎｍ、Ｅｍ３９０〜４１０ｎｍ程度が例示される。C) Measurement Method When measuring the enzyme activity of NS3 protease, the amount of the enzyme substrate product produced is measured after the various components are mixed and reacted. The reaction conditions are as follows:
35 ° C., about 10 minutes to 2 hours are exemplified. For the determination of the enzyme substrate product, a fluorometric method or the like can be used. The conditions at the time of measuring the fluorescence intensity are appropriately set according to the type of fluorophore. Specifically, for example, in the case of Nma, Ex
Examples are about 320 to 370 nm and Em 450 to 470 nm. In the case of MOCAc, Ex320-34
0 nm and Em 390-410 nm are exemplified.

【００３５】測定の手法としては、反応を停止してエン
ドポイントアッセイを行う方法、時間依存的に測定する
動力学的測定法などが挙げられる。エンドポイントアッ
セイ法によれば、例えば、５Ｎの水酸化ナトリウム等の
塩基を用いてｐＨを１２以上に上げることにより反応を
停止した後に測定することができる。また、動力学的測
定法によれば、反応を停止することなく、および酵素未
添加時の対照反応液をコントロールとしておくことな
く、時間依存的にＥｍを測定し、発色量の増加として酵
素活性を測定することができる。また、単位時間当たり
の変化量でとらえることもできる。Examples of the measuring method include a method of performing an endpoint assay after stopping the reaction, and a kinetic measuring method of performing time-dependent measurement. According to the end point assay method, for example, measurement can be performed after the reaction is stopped by raising the pH to 12 or more using a base such as 5N sodium hydroxide. In addition, according to the kinetic measurement method, Em was measured in a time-dependent manner without stopping the reaction and without using a control reaction solution to which no enzyme was added as a control. Can be measured. In addition, the change amount per unit time can be captured.

【００３６】Ｄ）阻害剤の選別 上記の測定方法あるいは測定試薬を利用して、阻害アッ
セイ系を組み立てることにより、ＮＳ３プロテアーゼに
対する阻害作用を有する化合物（酵素活性阻害剤）を選
別することができる。阻害アッセイ法の場合は、当該阻
害剤とＮＳ３プロテアーゼを事前に混合反応させてお
く。反応条件は２０〜３５℃、１０分〜２時間程度であ
る。その後は上記の同様の手法によりＮＳ３プロテアー
ゼの酵素活性を測定し、阻害の程度を確認することがで
きる。D) Screening of Inhibitor A compound having an inhibitory effect on NS3 protease (enzyme activity inhibitor) can be screened by assembling an inhibition assay system using the above-mentioned measuring method or measuring reagent. In the case of the inhibition assay, the inhibitor and the NS3 protease are mixed and reacted in advance. The reaction conditions are 20 to 35 ° C., and about 10 minutes to 2 hours. Thereafter, the enzyme activity of NS3 protease is measured by the same method as described above, and the degree of inhibition can be confirmed.

【００３７】あるいは基質と阻害剤を混合したものに、
酵素を添加して反応を開始させ、時間依存的な酵素活性
の変化を観察することにより、阻害の程度を確認するこ
ともできる。この場合の反応条件は、全体として２０〜
３５℃、１０分〜２時間程度である。Alternatively, in a mixture of a substrate and an inhibitor,
The degree of inhibition can also be confirmed by adding the enzyme to start the reaction and observing a time-dependent change in enzyme activity. The reaction conditions in this case are generally 20 to
35 ° C., about 10 minutes to 2 hours.

【００３８】また、一般式（ａ）または（ｂ）と、
（ｃ）の合成基質を組合せることにより、または使い分
けることにより、ＮＳ３プロテアーゼに対して結合部位
の異なる阻害化合物を選別（スクリーニング）すること
ができる。In addition, general formula (a) or (b):
By combining or selectively using the synthetic substrates of (c), inhibitory compounds having different binding sites for NS3 protease can be selected (screened).

【００３９】Ｅ）選別された化合物 本発明で対象となる当該化合物として好ましいのは、Ｎ
Ｓ３プロテアーゼに対する阻害作用を有する新規物質あ
るいは、ＮＳ３プロテアーゼに対する阻害作用を有する
ことが初めて見出された公知化合物である。当該化合物
はペプチド型、非ペプチド型のいずれでもよい。当該化
合物はＨＣＶ感染症、あるいは同様の機序で発現するそ
の他の肝炎ウイルス感染症の予防治療等に有用なことが
期待できる。E) Selected Compounds Preferred as the compounds of interest in the present invention are N
It is a novel substance having an inhibitory action on S3 protease, or a known compound that has been found for the first time to have an inhibitory action on NS3 protease. The compound may be either a peptide type or a non-peptide type. The compound is expected to be useful for the prevention and treatment of HCV infection and other hepatitis virus infections expressed by a similar mechanism.

【００４０】[0040]

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定され
るものではない。The present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples, but the present invention is not limited thereto.

【００４１】実施例１〜３：合成基質の調製 実施例１ ペプチド自動合成機（商品名ＰＳＳＭ−８、島津製作所
製）を用いて、Ｃ末固定化法により、本発明の合成基質
を調製した。すなわち、支持体にＡｒｇのＤ体を固定化
した後に、そのＮ末側にアミノ酸を一つずつ連結した。
すなわち、ＬｙｓのＬ体の側鎖のアミノ基にＤｎｐを結
合したもの、ＳｅｒのＬ体、ＧｌｙのＬ体、ＳｅｒのＬ
体、ＣｙｓのＬ体、ＰｒｏのＬ体、ＴｈｒのＬ体、Ｔｈ
ｒのＬ体の順に反応させた。その後に、Ｎ末端のＴｈｒ
のアミノ基にＮｍａを連結した。反応終了後にＴＦＡ
（トリフロロ酢酸）を用いて当該合成基質を支持体から
分離した。最終的に得られた合成基質の物性として、外
観、分子量、純度、ＨＰＬＣのピーク位置、アミノ酸分
析値を確認した。分子量はＭＳによった。純度はＨＰＬ
Ｃによった。その条件は、ＯＤＳ系カラム、展開液ＣＨ
₃ ＣＮ／０．１％ＴＦＡとした。アミノ酸分析は６Ｎ塩
酸、１１０℃、２２時間の加水分解後、常法により測定
した。結果は以下のとおりであった。Examples 1-3: Preparation of synthetic substrate Example 1 The synthetic substrate of the present invention was prepared by a C-terminal immobilization method using an automatic peptide synthesizer (trade name: PSSM-8, manufactured by Shimadzu Corporation). . That is, after immobilizing the D-form of Arg on the support, amino acids were linked one by one to the N-terminal side.
That is, Dnp bonded to the amino group in the side chain of L-form of Lys, L-form of Ser, L-form of Gly, L-form of Ser
Body, Cys L body, Pro L body, Thr L body, Th
The reaction was performed in the order of the L-isomer of r. After that, N-terminal Thr
Was linked to Nma. After completion of the reaction, TFA
The synthetic substrate was separated from the support using (trifluoroacetic acid). The appearance, molecular weight, purity, HPLC peak position, and amino acid analysis value were confirmed as physical properties of the finally obtained synthetic substrate. The molecular weight was determined by MS. Purity is HPL
According to C. The conditions are ODS column, developing solution CH
₃ CN / 0.1% TFA. Amino acid analysis was measured by a conventional method after hydrolysis of 6N hydrochloric acid at 110 ° C. for 22 hours. The results were as follows.

【００４２】構造式： Ｎｍａ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｈ
ｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌｙ
−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｎ
Ｈ₂ （配列表配列番号１） 外観 ： 黄色凍結乾燥 分子量： １２３４ 純度 ： ９８％以上 ＨＰＬＣ： １１．２８６分にピークを有する アミノ酸分析値： Ｔｈｒ（２）１．８１、Ｓｅｒ
（２）１．７６、Ｇｌｙ（１）１．００、Ａｒｇ（１）
１．０２、Ｐｒｏ（１）１．００、Ｃｙｓ（１）０．９
４、ＮＨ₃ （１）１．５３。括弧内は理論値を示す。Structural formula: Nma-L-Thr-L-Th
r-L-Pro-L-Cys-L-Ser-L-Gly
-L-Ser-L-Lys (Dnp) -D-Arg-N
H ₂ (SEQ ID NO: 1) Appearance: Lyophilized yellow Molecular weight: 1234 Purity: 98% or more HPLC: Peak at 11.286 minutes Amino acid analysis value: Thr (2) 1.81, Ser
(2) 1.76, Gly (1) 1.00, Arg (1)
1.02, Pro (1) 1.00, Cys (1) 0.9
4, NH ₃ (1) 1.53. The values in parentheses indicate theoretical values.

【００４３】実施例２ 実施例１と同様にして以下の合成基質を調製した。Example 2 The following synthetic substrate was prepared in the same manner as in Example 1.

【００４４】構造式： Ｎｍａ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｈ
ｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌｙ
−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ
−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−
Ａｓｐ−ＯＨ （配列表配列番号２）Structural formula: Nma-L-Thr-L-Th
r-L-Pro-L-Cys-L-Ser-L-Gly
-L-Ser-L-Lys (Dnp) -L-Arg-L
-Arg-L-Asp-L-Ile-L-Trp-L-
Asp-OH (SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing)

【００４５】実施例３ 実施例１に準じて以下の合成基質を調製した。Example 3 The following synthetic substrate was prepared according to Example 1.

【００４６】構造式： Ｎｍａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓ
ｐ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｌ
−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｍｅｔ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｄｎ
ｐ）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ₂ （配列表配列番号３） 外観 ： 黄色凍結乾燥 分子量： １４８９ 純度 ： ９６％以上 ＨＰＬＣ： １５．２１１分にピークを有する アミノ酸分析値： Ａｓｐ（１）０．９９、Ｓｅｒ
（２）１．７４、Ｇｌｕ（１）０．８９、Ｖａｌ（２）
１．４９、Ｍｅｔ（１）０．９８、Ａｒｇ（３）２．９
６、Ｃｙｓ（１）１．０４、Ａｂｕ（１）１．００、Ｎ
Ｈ₃ （１）１．５１Structural formula: Nma-L-Glu-L-As
pL-Val-L-Val-Abu-L-Cys-L
-Ser-L-Met-L-Ser-L-Lys (Dn
p) -D-Arg-D-Arg-D-Arg-NH ₂ (SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing) Appearance: Yellow freeze-dried Molecular weight: 1489 Purity: 96% or more HPLC: amino acid analysis value having a peak at 15.211 minutes : Asp (1) 0.99, Ser
(2) 1.74, Glu (1) 0.89, Val (2)
1.49, Met (1) 0.98, Arg (3) 2.9
6, Cys (1) 1.04, Abu (1) 1.00, N
H ₃ (1) 1.51

【００４７】実施例４〜８：試薬の調製 実施例４ 合成基質として実施例１で調製したものを用いた。ＨＣ
ＶのＮＳ４Ａ由来ペプチドとして、Ｌ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｓ
ｅｒ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｖａ
ｌ−Ｌ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｉｌｅ
−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｒｇ−
ＮＨ₂ （ペプチド研究所製、配列表配列番号４）を用い
た。測定用溶媒として、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
０．１％ｗ／ｖポリエチレンオキサイドのアルキルフェ
ノールエーテル（商品名トリトンＸ１００）、２０％ｗ
／ｖグルセロール、１０ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製した。ＨＣＶのＮＳ３
プロテアーゼは前記文献に準じて調製した。Examples 4 to 8: Preparation of reagents Example 4 The synthetic substrate prepared in Example 1 was used. HC
V-NS4A-derived peptide, L-Gly-LS
er-L-Val-L-Val-L-Ile-L-Va
IL-Gly-L-Arg-L-Ile-L-Ile
-L-Lys-L-Ser-L-Gly-L-Arg-
NH ₂ (manufactured by Peptide Research Laboratories, SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing) was used. As a measurement solvent, 150 mM sodium chloride,
Alkyl phenol ether of 0.1% w / v polyethylene oxide (trade name: Triton X100), 20% w
/ V glycerol, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 10 mM DTT was prepared. HCV NS3
Protease was prepared according to the literature.

【００４８】実施例５ 合成基質として実施例２のものを用いる以外は、全て実
施例４に準じて測定用試薬を調製した。Example 5 A measuring reagent was prepared in the same manner as in Example 4 except that the synthetic substrate used in Example 2 was used.

【００４９】実施例６ 合成基質として実施例３のものを用いる以外は、全て実
施例４に準じて測定用試薬を調製した。Example 6 A measuring reagent was prepared in the same manner as in Example 4 except that the synthetic substrate used in Example 3 was used.

【００５０】実施例７ 界面活性剤としてノニデットＰ４０（商品名ＮＰ−４
０）、ポリエチレンオキサイドのソルビタン脂肪酸エス
テル（商品名トウイーン８０）またはポリオキシエチレ
ンオキサイドのラウリルアルコールエーテル（商品名ブ
リジ３５）を用いる以外は、全て実施例４に準じて測定
用試薬を調製した。Example 7 Nonidet P40 (trade name: NP-4) was used as a surfactant.
0), sorbitan fatty acid ester of polyethylene oxide (trade name: Tween 80) or lauryl alcohol ether of polyoxyethylene oxide (trade name: BRIDI 35) were used to prepare measurement reagents in the same manner as in Example 4.

【００５１】実施例８ ポリオールとしてエテレングリコールを用いる以外は、
全て実施例４に準じて測定用試薬を調製した。Example 8 Except for using ethylene glycol as the polyol,
All of the reagents for measurement were prepared according to Example 4.

【００５２】実施例９：測定方法 実施例４の試薬を用いて測定実験を行った。合成基質２
０μＬ（最終濃度１０μＭ）、ＮＳ３プロテアーゼ２０
μＬ（濃度範囲７８ｎＭ〜５μＭ）、ＮＳ４Ａペプチド
２０μＬ（最終濃度１０μＭ）、緩衝液１４０μＬを混
合し、２５℃で３０分間反応させた。反応前および終了
後にＥｘ３５５ｎｍ、Ｅｍ４６０ｎｍの条件下で蛍光光
度計を用いて蛍光強度を測定した。反応前後の蛍光強度
の差を単位時間当たりの値に換算した。ＮＳ３プロテア
ーゼ濃度と蛍光強度の関係を表１に示す。Example 9: Measurement method A measurement experiment was performed using the reagent of Example 4. Synthetic substrate 2
0 μL (final concentration 10 μM), NS3 protease 20
μL (concentration range: 78 nM to 5 μM), 20 μL of NS4A peptide (final concentration: 10 μM), and 140 μL of buffer were mixed and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. Before and after the reaction, the fluorescence intensity was measured using a fluorometer under conditions of Ex355 nm and Em460 nm. The difference in the fluorescence intensity before and after the reaction was converted to a value per unit time. Table 1 shows the relationship between the NS3 protease concentration and the fluorescence intensity.

【００５３】 [0053]

【００５４】当該濃度範囲で直線性が維持されることが
判明した。It was found that linearity was maintained in the above concentration range.

【００５５】実施例１０：阻害アッセイ系 ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤として、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａ
ｓｐ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｃｙ
ｓ−Ｔｉｃ−Ｎｌｅ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｔｉｃ
はテトラヒドロイソキニリン−３−カルボン酸、Ｎｌｅ
はノルロイシンを示す。ペプチド研究所製。配列表配列
番号５。濃度範囲は０．０１〜１００μＭ）を用いた。
その他は実施例４の試薬を用いて測定を行った。ＮＳ３
プロテアーゼ２０μＬ（最終濃度５μＭ）と２５℃で３
０分間反応させた。次いで、合成基質２０μＬ（最終濃
度１０μＭ）、ＮＳ４Ａペプチド２０μＬ（最終濃度１
０μＭ）、緩衝液１４０μＬを混合し、２５℃で３０分
間反応させた。反応前および終了後にＥｘ３５５ｎｍ、
Ｅｍ４６０ｎｍの条件下で蛍光光度計を用いて測定し
た。反応前後の蛍光強度の差を単位時間当たりの値に換
算した。得られた値から酵素阻害の度合いを算出した。
すなわち、酵素阻害剤を未添加の場合を０％、酵素が完
全に阻害される場合を１００％として、各々の酵素阻害
率を算出した。ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の濃度と酵素
阻害率の関係を表２に示す。Example 10: Inhibition assay system As an NS3 protease inhibitor, L-Glu-LA was used.
sp-L-Val-L-Val-L-Leu-L-Cy
s-Tic-Nle-L-Ser-L-Tyr (Tic
Is tetrahydroisoquiniline-3-carboxylic acid, Nle
Represents norleucine. Made by Peptide Institute. Sequence Listing SEQ ID NO: 5. The concentration range was 0.01 to 100 μM).
Others were measured using the reagent of Example 4. NS3
Protease 20 μL (final concentration 5 μM) and 3 at 25 ° C.
The reaction was performed for 0 minutes. Next, 20 μL of the synthetic substrate (final concentration 10 μM) and 20 μL of the NS4A peptide (final concentration 1
0 μM) and 140 μL of a buffer solution, and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. Ex355nm before and after reaction,
It was measured using a fluorimeter under the condition of Em460 nm. The difference in fluorescence intensity before and after the reaction was converted to a value per unit time. The degree of enzyme inhibition was calculated from the obtained value.
That is, each enzyme inhibition rate was calculated assuming that 0% when no enzyme inhibitor was added and 100% when the enzyme was completely inhibited. Table 2 shows the relationship between the concentration of the NS3 protease inhibitor and the enzyme inhibition rate.

【００５６】 [0056]

【００５７】濃度依存的にＮＳ３プロテアーゼが阻害さ
れており、阻害アッセイ系として十分に機能しているこ
とが判明した。The NS3 protease was inhibited in a concentration-dependent manner, and it was found that the NS3 protease functioned sufficiently as an inhibition assay system.

【００５８】[0058]

【発明の効果】本発明の合成基質を用いることにより、
ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを高感度に測定することが
できる。従って、本発明の合成基質は、当該酵素活性の
測定、あるいは阻害アッセイ系の構築に極めて有用であ
る。By using the synthetic substrate of the present invention,
HC3 NS3 protease can be measured with high sensitivity. Therefore, the synthetic substrate of the present invention is extremely useful for measuring the enzyme activity or constructing an inhibition assay system.

【００５９】[0059]

【配列表フリーテキスト】 配列表配列番号１：ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼに対す
る合成基質 配列表配列番号２：ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼに対す
る合成基質 配列表配列番号３：ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼに対す
る合成基質 配列表配列番号４：ＨＣＶのＮＳ４Ａ由来のペプチド 配列表配列番号５：ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害
するペプチド[Sequence Listing Free Text] Sequence Listing SEQ ID No. 1: Synthetic substrate for NS3 protease of HCV Sequence Listing SEQ ID No. 2: Synthetic substrate for NS3 protease of HCV Sequence Listing SEQ ID No. 3: Synthetic substrate for NS3 protease of HCV Sequence Listing SEQ ID No. 4 : Peptide derived from NS4A of HCV Sequence Listing SEQ ID NO: 5: Peptide that inhibits NS3 protease of HCV

【００６０】[0060]

【配列表】 SPECIMEN SEQUENCE LISTING <110> Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. <120> MEASURING ACTIVITY OF HCV NS3 PROTEASE <130> F3213 <160> 5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic substrate for HCV NS3 protease <220> <222> 1 <223> Xaa is Thr combined with Nma through amino group of Thr <220> <222> 8 <223> Xaa is Lys combined with Dnp through amino group of branch cha in of Lys <220> <222> 9 <223> Xaa is D-Arg modified by amidation of carboxyl group thereof <400> 1 Xaa Thr Pro Cys Ser Gly Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic substrate for HCV NS3 protease <220> <222> 1 <223> Xaa is Thr combined with Nma through amino group of Thr <220> <222> 8 <223> Xaa is Lys combined with Dnp through amino group of branch cha in of Lys <400> 2 Xaa Thr Pro Cys Ser Gly Ser Xaa Arg Asp Ile Trp Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic substrate for HCV NS3 protease <220> <222> 1 <223> Xaa is Glu combined with Nma through amino group thereof <220> <222> 5 <223> Xaa is Abu <220> <222> 10 <223> Xaa is Lys combined with Dnp through amino group of branch cha in of Lys <220> <222> 11, 12 <223> Xaa is D-Arg <220> <222> 13 <223> Xaa is D-Arg modified by amidation of carboxyl group thereof <400> 3 Xaa Asp Val Val Xaa Cys Ser Met Ser Lys Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide derived from HCV NS4A <220> <222> 14 <223> Xaa is Ser modified by amidation of carboxyl group thereof <400> 4 Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide inhibiting HCV NS3 protease <220> <222> 7 <223> Xaa is tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylic acid (Tic) <220> <222> 8 <223> Xaa is norleucine (Nle) <400> 5 Glu Asp Val Val Leu Cys Xaa Xaa Ser Tyr 1 5 10[Sequence List] SPECIMEN SEQUENCE LISTING <110> Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. <120> MEASURING ACTIVITY OF HCV NS3 PROTEASE <130> F3213 <160> 5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic substrate for HCV NS3 protease <220> <222> 1 <223> Xaa is Thr combined with Nma through amino group of Thr <220> <222> 8 <223> Xaa is Lys combined with Dnp through amino group of branch cha in of Lys <220> <222> 9 <223> Xaa is D-Arg modified by amidation of carboxyl group there <400> 1 Xaa Thr Pro Cys Ser Gly Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 2 < 211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic substrate for HCV NS3 protease <220> <222> 1 <223> Xaa is Thr combined with Nma through amino group of Thr <220> <222 > 8 <223> Xaa is Lys combined with Dnp through amino group of branch cha in of Lys <400> 2 Xaa Thr Pro Cys Ser Gly Ser Xaa Arg Asp Ile Trp Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212 > PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic substrate for HCV NS3 pr otease <220> <222> 1 <223> Xaa is Glu combined with Nma through amino group accordingly <220> <222> 5 <223> Xaa is Abu <220> <222> 10 <223> Xaa is Lys combined with Dnp through amino group of branch cha in of Lys <220> <222> 11, 12 <223> Xaa is D-Arg <220> <222> 13 <223> Xaa is D-Arg modified by amidation of carboxyl group accordingly <400 > 3 Xaa Asp Val Val Xaa Cys Ser Met Ser Lys Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide derived from HCV NS4A <220> < 222> 14 <223> Xaa is Ser modified by amidation of carboxyl group there <400> 4 Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT < 213> Artificial sequence <220> <223> Peptide inhibiting HCV NS3 protease <220> <222> 7 <223> Xaa is tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylic acid (Tic) <220> <222> 8 <223> Xaa is norleucine (Nle) <400> 5 Glu Asp Val Val Leu Cys Xaa Xaa Ser Tyr 1 5 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA06 QA18 QQ10 QQ36 QQ95 QR48 QR58 QS03 QS36 QX02 4H045 AA10 AA30 BA70 CA02 DA56 DA89 EA29 EA50 EA55 FA34 HA03  ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4B063 QA01 QA06 QA18 QQ10 QQ36 QQ95 QR48 QR58 QS03 QS36 QX02 4H045 AA10 AA30 BA70 CA02 DA56 DA89 EA29 EA50 EA55 FA34 HA03

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 任意の位置に蛍光団および消光団を共
有結合してなり、下記の一般式（ａ）、（ｂ）または
（ｃ）で表されるアミノ酸配列を有する合成基質 （ａ）：Ｒ¹ −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｒ² （ｂ）：Ｒ¹ −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｒ² （ｃ）：Ｒ¹ −Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｘ−
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｒ² （式中、Ｒ¹ はＨまたはアミノ酸残基を、Ｒ² はＯＨ、
アミノまたはアミノ酸残基を、Ｘはα型アミノ酸残基を
示す）1. A synthetic substrate comprising a covalently bound fluorophore and quencher at any position and having an amino acid sequence represented by the following general formula (a), (b) or (c): R ¹ -Thr-Thr-Pro-Cys-Se
r-Gly-Ser-Lys- Arg-R 2 (b): R 1 -Thr-Thr-Pro-Cys-Se
r-Gly-Ser-Lys-Arg-Asp-Ile
^{-Trp-Asp-R 2 (c} ): R 1 -Glu-Asp-Val-Val-X-
Cys-Ser-Met-Ser-Lys-Arg-A
rg-Arg-R ² (wherein R ¹ is H or an amino acid residue, R ² is OH,
An amino or amino acid residue, and X represents an α-type amino acid residue) 【請求項２】 請求項１の合成基質を用いてＨＣＶの
ＮＳ３プロテアーゼ活性を測定する方法2. A method for measuring NS3 protease activity of HCV using the synthetic substrate according to claim 1. 【請求項３】 さらにＨＣＶのＮＳ４Ａ由来のペプチ
ドを用いる請求項２の測定方法3. The method according to claim 2, further comprising using a peptide derived from NS4A of HCV. 【請求項４】 請求項１の合成基質を含むＨＣＶのＮ
Ｓ３プロテアーゼ活性を測定するための試薬4. The N of HCV containing the synthetic substrate according to claim 1.
Reagent for measuring S3 protease activity 【請求項５】 さらにＨＣＶのＮＳ４Ａ由来のペプチ
ドを含む請求項４の測定試薬5. The reagent according to claim 4, further comprising a peptide derived from NS4A of HCV. 【請求項６】 請求項２の測定方法または請求項４の
測定試薬を用いて、検体からＨＣＶのＮＳ３プロテアー
ゼに対する阻害作用を有する化合物を選別する方法6. A method for selecting a compound having an inhibitory effect on HCV NS3 protease from a specimen using the measurement method according to claim 2 or the measurement reagent according to claim 4. 【請求項７】 請求項６の方法により選別されたＨＣ
ＶのＮＳ３プロテアーゼに対する阻害作用を有する化合
物7. HC separated by the method of claim 6.
Compound having an inhibitory effect on NS3 protease of V