JP2001017165A - New glycine aminopeptidase - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規グリシンアミ
ノペプチダーゼ、該グリシンアミノペプチダーゼを含む
蛋白質加水分解酵素製剤、該グリシンアミノペプチダー
ゼを利用した蛋白質及びペプチドの加水分解方法に関す
る。蛋白質及びペプチドの加水分解物は、調味料及び調
味料原料として利用される。[0001] The present invention relates to a novel glycine aminopeptidase, a protein hydrolase preparation containing the glycine aminopeptidase, and a method for hydrolyzing proteins and peptides using the glycine aminopeptidase. Hydrolysates of proteins and peptides are used as seasonings and seasoning raw materials.
【0002】[0002]
【従来の技術】蛋白質の加水分解は、従来、高濃度の塩
酸存在下に加熱することにより行われており、この方法
により多くの蛋白質から調味料及び調味料原料及び食品
素材が製造されている。しかし、これらの食品を取り扱
う業界では、消費者の天然物指向の拡大に伴い、化学薬
品である塩酸を使用しない方法が望まれるようになりつ
つある。塩酸加水分解法に代わる方法として、蛋白分解
酵素を用いる加水分解方法が考えられるが、酵素のコス
トが塩酸に比べて高価であること、また、塩酸を用いて
加水分解した場合と同程度に加水分解率を高めることは
困難であったことから、実用化された例は少ない。2. Description of the Related Art Proteins have been conventionally hydrolyzed by heating in the presence of a high concentration of hydrochloric acid, and seasonings, seasoning raw materials and food materials are produced from many proteins by this method. . However, in the industry dealing with these foods, a method that does not use hydrochloric acid, which is a chemical, has been demanded as consumers have become more and more oriented toward natural products. As an alternative to the hydrochloric acid hydrolysis method, a hydrolysis method using a protease is conceivable.However, the cost of the enzyme is higher than that of hydrochloric acid, and hydrolysis is performed to the same extent as when hydrolysis is performed using hydrochloric acid. Since it was difficult to increase the decomposition rate, few examples have been put to practical use.
【0003】既存のプロテアーゼ製剤の例としては、ア
スペルギルス オリゼ由来のロイシンアミノペプチダー
ゼなどが挙げられる。アスペルギルス オリゼやその酵
素製剤は、複数のプロテアーゼを含み、広く食品の蛋白
加水分解に用いられている。しかし、蛋白加水分解物中
にあるアミノ酸の遊離率を調べたところ、グリシンの遊
離率がロイシンやアラニンと比べて低いことが判明し
た。蛋白加水分解物に頻用されるコラーゲンや小麦蛋白
質は、グリシンを最も多く含むので、グリシンの遊離率
が低いと加水分解度を十分挙げることができない。グリ
シンを含むペプチド結合は、グリシン以外のアミノ酸か
らなる通常のペプチド結合と比べると、回転の自由度が
高いため、立体構造がより複雑になる傾向にある。した
がって、通常の蛋白質加水分解酵素による加水分解を受
けにくい。一方、グリシン特異的ペプチダーゼはペプチ
ド中のグリシン残基部分を特定的に加水分解する酵素で
あるので、効率よくグリシン残基を遊離できる。したが
って、グリシンアミノペプチダーゼを併用すれば、既存
のプロテアーゼ製剤の欠点を補い、加水分解度を上げら
れると思われる。しかし、グリシンに特異的なアミノペ
プチダーゼは、食品加工用途に使用可能な安全性が高い
微生物からは報告されておらず、食経験がある微生物か
ら得られるグリシンアミノペプチダーゼが望まれてい
た。[0003] Examples of existing protease preparations include leucine aminopeptidase derived from Aspergillus oryzae. Aspergillus oryzae and its enzyme preparations contain multiple proteases and are widely used for proteolysis of foods. However, when the release rate of amino acids in the protein hydrolyzate was examined, it was found that the release rate of glycine was lower than that of leucine or alanine. Collagen and wheat protein frequently used in protein hydrolysates contain the highest amount of glycine, so that a low degree of glycine release cannot provide a sufficient degree of hydrolysis. Peptide bonds containing glycine have a higher degree of freedom in rotation than ordinary peptide bonds consisting of amino acids other than glycine, and thus tend to have a more complicated three-dimensional structure. Therefore, it is less susceptible to hydrolysis by ordinary protein hydrolases. On the other hand, glycine-specific peptidase is an enzyme that specifically hydrolyzes a glycine residue in a peptide, and thus can efficiently release glycine residues. Therefore, it seems that the combined use of glycine aminopeptidase can compensate for the drawbacks of existing protease preparations and increase the degree of hydrolysis. However, an aminopeptidase specific to glycine has not been reported from microorganisms having high safety that can be used for food processing applications, and glycine aminopeptidase obtained from a microorganism having experience in eating has been desired.
【0004】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、食経験があ
る微生物由来のグリシンアミノペプチダーゼを見出し、
該酵素を用いた蛋白質の加水分解を行うことにより、遊
離アミノ酸量が高く、かつ、呈味の高い調味料の製法を
確立することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made to find a glycine aminopeptidase derived from a microorganism having dietary experience,
It is an object of the present invention to establish a method for producing a seasoning having a high free amino acid content and a high taste by hydrolyzing a protein using the enzyme.
【0005】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を行った結果、アクチノムコー
ル エレガンス(Actinomucor elega
ns)IFO 6408がグリシンアミノペプチダーゼ
を生産することを見出し、また、該グリシンアミノペプ
チダーゼを用いた蛋白質の加水分解において高い加水分
解率が達成できることを見出し、さらに、該グリシンア
ミノペプチダーゼを単離し、その性質を調べることによ
り、本発明を完成するに到った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that Actinomucor elegance is required.
ns) found that IFO 6408 produces glycine aminopeptidase, found that a high hydrolysis rate can be achieved in protein hydrolysis using the glycine aminopeptidase, further isolated the glycine aminopeptidase, By examining the properties, the present invention has been completed.
【0006】すなわち、本発明は、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による分子量が94,000±5
000であり、ヨード酢酸及びp−クロロメルクリ安息
香酸により阻害されることを特徴とするグリシンアミノ
ペプチダーゼであり、また、アクチノムコール エレガ
ンス培養液より抽出され、前記グリシンアミノペプチダ
ーゼを含むことを特徴とする蛋白質加水分解酵素製剤で
あり、さらに、前記グリシンアミノペプチダーゼまたは
蛋白質加水分解酵素製剤を加水分解反応に使用すること
を特徴とする蛋白質及びペプチドの加水分解方法であ
る。That is, according to the present invention, the molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is 94,000 ± 5.
Glycine aminopeptidase, wherein the glycine aminopeptidase is characterized by being inhibited by iodoacetic acid and p-chloromercuribenzoic acid, and further comprising the glycine aminopeptidase extracted from a culture solution of Actinomucor elegans. A method for hydrolyzing proteins and peptides, which is a protein hydrolase preparation, and further comprising using the glycine aminopeptidase or protein hydrolase preparation for a hydrolysis reaction.
【0007】本発明のグリシンアミノペプチダーゼは、
以下の特徴を有する。 (1)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が94,000±5000である。 (2)ヨード酢酸及びp−クロロメルクリ安息香酸によ
り阻害される。 (3)反応の最適pHが8.0±1.0であり、pH6
ないし10における活性が最適pHにおける活性の40
%以上である。 (4)20℃における活性が最適温度における活性の9
0%以上である。 これらの特徴は、後述の実施例に記載の方法により測定
する。The glycine aminopeptidase of the present invention comprises
It has the following features. (1) The molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is 94,000 ± 5000. (2) Inhibited by iodoacetic acid and p-chloromercuribenzoic acid. (3) The optimum pH for the reaction is 8.0 ± 1.0,
The activity at to 10 is 40% of the activity at the optimum pH.
% Or more. (4) The activity at 20 ° C. is 9% of the activity at the optimum temperature.
0% or more. These characteristics are measured by the methods described in the examples described below.
【0008】本発明におけるグリシンアミノペプチダー
ゼの例としては、アクチノムコールエレガンス(Act
inomucor elegans)IFO 6408
が生産するアミノペプチダーゼが挙げられる。なお、ア
クチノムコール エレガンス(Actinomucor
elegans)IFO 6408は財団法人発酵研
究所が保有する微生物であり、同所に依頼することによ
り誰でもこの菌株の分譲を受けることができる。[0008] Examples of the glycine aminopeptidase in the present invention include Actinomucol elegance (Act).
inomucor elegans) IFO 6408
And aminopeptidase produced by the company. In addition, Actinomucor elegance (Actinomucor
elegans) IFO 6408 is a microorganism owned by the Fermentation Research Institute, and any strain can be obtained by requesting the same site.
【0009】本発明のグリシンアミノペプチダーゼは、
このようなグリシンアミノペプチダーゼを生産する能力
のある微生物を培地に播種し、一定時間培養を行った
後、培養液より該酵素を抽出することにより製造するこ
とができる。該グリシンアミノペプチダーゼを生産する
能力のある微生物をグルコース、綿実蛋白質、酵母エキ
ス等を含む培地に接種し、25〜30℃で3〜7日好気
培養することにより、該ペプチダーゼが生産される。該
ペプチダーゼは培養上清中にも多少蓄積するため、これ
を濃縮してもよいが、多量の酵素を取得する場合には、
菌体を遠心分離などにより集め、ホモジナイザー、超音
波処理、浸透圧ショック処理や界面活性剤処理を行い、
菌体内に存在する該ペプチダーゼを抽出することが望ま
しい。該抽出液より公知の常法、例えば、イオン交換ク
ロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲル濾過クロ
マトグラフィ等による分画等を用いることにより、本発
明の酵素を精製することができる。The glycine aminopeptidase of the present invention comprises
Such a glycine aminopeptidase-producing microorganism can be inoculated in a medium, cultured for a certain period of time, and then extracted from the culture solution to produce the glycine aminopeptidase. A microorganism capable of producing the glycine aminopeptidase is inoculated into a medium containing glucose, cottonseed protein, yeast extract, and the like, and aerobically cultured at 25 to 30 ° C. for 3 to 7 days to produce the peptidase. . Since the peptidase slightly accumulates in the culture supernatant, it may be concentrated, but when obtaining a large amount of the enzyme,
Collect the cells by centrifugation, etc., perform homogenizer, ultrasonic treatment, osmotic shock treatment and surfactant treatment,
It is desirable to extract the peptidase present in the cells. The enzyme of the present invention can be purified from the extract by a known method, for example, fractionation by ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography or the like.
【0010】本発明のグリシンアミノペプチダーゼを用
いて蛋白質及びペプチドを加水分解する際、必ずしも酵
素を精製することは必要ではない。加水分解反応もしく
は加水分解物に悪影響を与える因子が混在せず、かつ、
食品衛生上の問題がなければ、該酵素の粗精製品または
培養液からの抽出物をそのまま反応に利用することも可
能である。アクチノムコール属は中国で腐乳を製造する
際に使われる糸状菌であり、食経験が豊富で安全性も確
立している。なお、アクチノムコール エレガンス(A
ctinomucor elegans)IFO 64
08の培養液より調製した粗酵素には、グリシンアミノ
ペプチダーゼの他にプロリルイミノペプチダーゼ(PI
P)、グリシルジペプチダーゼ、ロイシルジペプチダー
ゼ、酸性プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ
(LAP)などが含まれており、加水分解すべき蛋白質
やペプチドの種類によっては、該粗酵素または該微生物
をそのまま加水分解に用いた方が高い加水分解率が得ら
れることもある。When hydrolyzing proteins and peptides using the glycine aminopeptidase of the present invention, it is not always necessary to purify the enzyme. Factors that adversely affect the hydrolysis reaction or hydrolyzate are not mixed, and
If there is no problem in food hygiene, a crude product of the enzyme or an extract from a culture solution can be used as it is in the reaction. Actinomucor is a filamentous fungus used in the manufacture of milk in China, has abundant food experience and has established safety. In addition, actinom call elegance (A
ctinomucor elegans) IFO 64
08 in addition to glycine aminopeptidase, prolyliminopeptidase (PI
P), glycyl dipeptidase, leucyl dipeptidase, acid protease, leucine aminopeptidase (LAP) and the like. Depending on the type of protein or peptide to be hydrolyzed, the crude enzyme or the microorganism is directly hydrolyzed. In some cases, a higher degree of hydrolysis may be obtained by using the above.
【0011】本発明のグリシンアミノペプチダーゼを用
いた蛋白質及びペプチドを加水分解する方法は、公知の
ペプチダーゼを用いる反応と何ら変わりはない。蛋白質
を高度に加水分解する場合には、原料蛋白質を複数のプ
ロテアーゼ及びペプチダーゼで処理することが必要であ
るが、異なる複数のプロテアーゼ製剤を同時にまたは連
続して使用するよりも、複数のプロテアーゼ及び公知の
ペプチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤を用いる方
が有利である。複数のプロテアーゼ及び公知のペプチダ
ーゼを同時に含むプロテーゼ製剤の例としては、ノボ・
ノルディスク社(Novo NORDISK A/S、
デンマーク)のフレーバーザイム(Flavourzy
me)が挙げられる。該プロテアーゼ製剤にはアスペル
ギルスオリゼ(Aspergillus oryza
e)由来で、その中には、約23kDa、約31kD
a、約35kDa、約38kDa、約53kDaの少な
くとも5種のプロテアーゼ及びペプチダーゼが含まれて
おり、さらに、それ以外にも約32kDa、約42kD
a、約47kDa、約100kDaのプロテアーゼ及び
ペプチダーゼが含まれていることもある。このような酵
素製剤と本発明のグリシンアミノペプチダーゼとを、同
時にまたは別々に蛋白質に作用させることにより、蛋白
質の高度加水分解が達成される。本発明のグリシンアミ
ノペプチダーゼによる加水分解は、反応液のpHが5〜
11、好ましくは6〜9の範囲で、反応温度は10〜5
0℃、好ましくは30〜40℃で行うことが必要であ
る。The method for hydrolyzing proteins and peptides using the glycine aminopeptidase of the present invention is no different from the reaction using a known peptidase. When a protein is highly hydrolyzed, it is necessary to treat the raw material protein with a plurality of proteases and peptidases. It is advantageous to use a protease preparation which simultaneously contains the peptidase of Examples of prosthesis formulations containing multiple proteases and known peptidases simultaneously include Novo
Nordisk Corporation (Novo NORDISK A / S,
Flavorzy in Denmark
me). The protease preparation includes Aspergillus oryzae.
e) of which about 23 kDa, about 31 kD
a, about 35 kDa, about 38 kDa, about 53 kDa, at least five proteases and peptidases, and about 32 kDa, about 42 kDa
a, about 47 kDa, about 100 kDa protease and peptidase may be included. By allowing such an enzyme preparation and the glycine aminopeptidase of the present invention to act on a protein simultaneously or separately, a high degree of hydrolysis of the protein is achieved. In the hydrolysis by the glycine aminopeptidase of the present invention, the pH of the reaction solution is 5 to 5.
11, preferably in the range of 6-9, the reaction temperature is 10-5
It is necessary to carry out at 0 ° C., preferably at 30 to 40 ° C.
【0012】[0012]
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施例を示すが、
本発明はこれに限定されるものではない。この実施例で
得られた酵素の性質は、下記のようにして求めた。 (1)蛋白質量の測定 精製酵素を10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)
で適宜希釈後、同緩衝液をブランクとして280nmの
吸光度を島津分光光度計UV−160Aを用いて測定し
た。蛋白質量は、280nmにおける吸光度1の蛋白質
溶液1ml中に含まれる蛋白質を1単位とする吸光度単
位で示した。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Embodiments of the present invention will be described below.
The present invention is not limited to this. The properties of the enzyme obtained in this example were determined as follows. (1) Measurement of protein content The purified enzyme was treated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
After the dilution, the absorbance at 280 nm was measured using Shimadzu spectrophotometer UV-160A with the same buffer as a blank. The protein mass was represented by an absorbance unit with one unit of protein contained in 1 ml of the protein solution having an absorbance of 1 at 280 nm.
【0013】(2)グリシンパラニトロアニリドを使用
したグリシンアミノペプチダーゼ活性測定 グリシンパラニトロアニリドを1mg/mlになるよう
に調製した。1,4−ジオキサン;Wako 40%溶
液にグリシンパラニトロアニリドを溶解し、さらに、グ
リシンパラニトロアニリド−40%ジオキサン溶液の
1.5倍容の50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.
7)を加えて基質溶液とした。酵素液は50mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7.7)で適宜希釈し、その500
μlに基質溶液100μlを加えて37℃で5〜15分
間反応させた。反応液に1M酢酸緩衝液(pH4.0)
300μlを加えて反応を停止させ、適宜遠心分離で不
溶物を除去し、遊離パラニトロアニリンに由来する41
0nmの吸光度を測定した。酵素1単位はグリシンパラ
ニトロアニリドを基質とした場合に37℃、1分間の反
応で1μモルのパラニトロアニリンを遊離させる酵素量
と定義した。なお、パラニトロアニリンの分子吸光係数
は9480M−1・cm−1とした。(2) Measurement of glycine aminopeptidase activity using glycine paranitroanilide Glycine paranitroanilide was prepared at 1 mg / ml. Glycine paranitroanilide is dissolved in 1,4-dioxane; Wako 40% solution, and further 1.5 times the volume of glycine paranitroanilide-40% dioxane solution in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0).
7) was added to obtain a substrate solution. The enzyme solution was appropriately diluted with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7),
100 μl of the substrate solution was added to μl, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 to 15 minutes. 1M acetate buffer (pH 4.0)
The reaction was stopped by adding 300 μl, and the insolubles were removed by appropriate centrifugation.
The absorbance at 0 nm was measured. One unit of the enzyme was defined as the amount of enzyme that released 1 μmol of paranitroaniline in a reaction at 37 ° C. for 1 minute when glycine paranitroanilide was used as a substrate. In addition, the molecular extinction coefficient of paranitroaniline was set to 9480 M-1cm-1.
【0014】(3)グリシンβナフチルアミドを使用し
たグリシンアミノペプチダーゼ活性測定 活性測定はYoshimoto、D.、and Wal
ter,R.(1977)Biochim.Bioph
ys.Acta 485,391−401に示した方法
を改良して行った。20mMトリス−塩酸緩衝液,(p
H7.0)800μlに、グリシンβナフチルアミド
3mM(20mMトリス−塩酸緩衝液,pH7.0)1
00μlを加え、37℃で予備加熱した後、酵素液10
0μlを加え、37℃で10分間反応を行った。500
μlのFast GarnetGBCを1mg/ml
と、トライトンX−100を10%含んだ1M酢酸緩衝
液(pH4.0)500μlを加えて反応を停止させ
た。発色したアゾ色素に由来する550nmの吸光度を
測定した。酵素1単位はグリシンβナフチルアミドを基
質とした場合に37℃、1分間の反応で1μモルの基質
を分解する酵素量を1単位と定義した。グリシンパラニ
トロアニリドとグリシンβナフチルアミドを同じ酵素液
でそれぞれ実測し、グリシンパラニトロアニリドは0.
115μmol/分、グリシンβナフチルアミドは0.
336μmol/分で、約3倍の値となった。(3) Measurement of glycine aminopeptidase activity using glycine β-naphthylamide The activity was measured by Yoshimoto, D .; , And Wal
ter, R.S. (1977) Biochim. Bioph
ys. The method described in Acta 485, 391-401 was modified and performed. 20 mM Tris-HCl buffer, (p
H7.0) In 800 μl, add glycine β-naphthylamide
3 mM (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0) 1
After adding 00 μl and preheating at 37 ° C., the enzyme solution 10
0 μl was added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 10 minutes. 500
μl of Fast Garnet GBC at 1 mg / ml
And 500 μl of 1 M acetate buffer (pH 4.0) containing 10% of Triton X-100 were added to stop the reaction. The absorbance at 550 nm derived from the developed azo dye was measured. One unit of enzyme was defined as the amount of enzyme that decomposes 1 μmol of the substrate in a reaction at 37 ° C. for 1 minute when glycine β-naphthylamide was used as the substrate. Glycine para-nitroanilide and glycine β-naphthylamide were measured with the same enzyme solution, respectively.
115 μmol / min.
At 336 μmol / min, the value was approximately tripled.
【0015】(4)阻害剤の影響 阻害剤の酵素に及ぼす効果を以下のように調べた。酵素
液に各種阻害剤を一定量添加して500μlとし、室温
で20分間放置した後、上述の基質溶液100μlを添
加して37℃で5分間反応させた。(4) Effect of Inhibitor The effect of the inhibitor on the enzyme was examined as follows. After a certain amount of various inhibitors were added to the enzyme solution to make 500 μl and left at room temperature for 20 minutes, 100 μl of the above-mentioned substrate solution was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes.
【0016】(5)最適温度 20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)の緩衝液
中、各種温度で10分間酵素反応を行い、グリシンβナ
フチルアミドを加水分解する活性を比較した。(5) Optimum temperature An enzyme reaction was performed for 10 minutes at various temperatures in a buffer of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and the activity of hydrolyzing glycine β-naphthylamide was compared.
【0017】(6)分子量の測定 酵素の分子量はファルマシア社製ファストシステム(P
hast system)を用いたSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により測定した。ポリアクリルア
ミドの濃度は12.5%である。分子量マーカーとして
ファルマシア社製ホスホリラーゼb(分子量94,00
0)、アルブミン(分子量67,000)、オボアルブ
ミン(分子量43,000)、カルボニック・アンヒド
ラーゼB(分子量30,000)、トリプシンインヒビ
ター(分子量20,100)、α−ラクトアルブミン
(分子量14,400)を用い、これらの泳動位置から
求めた校正曲線より分子量を求めた。(6) Measurement of molecular weight The molecular weight of the enzyme is determined by the Fast System (Pharmacia)
The measurement was carried out by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using the HST system. The concentration of polyacrylamide is 12.5%. As a molecular weight marker, Phosphorylase b manufactured by Pharmacia (molecular weight: 94,00
0), albumin (molecular weight 67,000), ovalbumin (molecular weight 43,000), carbonic anhydrase B (molecular weight 30,000), trypsin inhibitor (molecular weight 20,100), α-lactalbumin (molecular weight 14,400) Was used to determine the molecular weight from the calibration curve determined from these migration positions.
【0018】(7)最適pH 40mM Britton−Robinson緩衝液
中、各pHにおいてグリシンβナフチルアミド 3mM
(20mMトリス−塩酸緩衝液,pH7.0)100μ
lを加え、37℃で予備加熱した後、酵素液100μl
を加え、37℃で10分間反応を行った。500μlの
Fast Garnet GBCを1mg/mlとトラ
イトンX−100を10%含んだ1M酢酸緩衝液(pH
4.0)を加えて反応を停止させた。発色したアゾ色素
に由来する550nmの吸光度を測定した。(7) Optimum pH 40 mM Glycine β-naphthylamide 3 mM at each pH in Britton-Robinson buffer
(20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0) 100 μ
After preheating at 37 ° C., 100 μl of the enzyme solution was added.
Was added and the reaction was carried out at 37 ° C. for 10 minutes. 1 M acetate buffer containing 500 μl of Fast Garnet GBC 1 mg / ml and Triton X-100 10% (pH
4.0) was added to stop the reaction. The absorbance at 550 nm derived from the developed azo dye was measured.
【0019】(8)蛋白質の加水分解度 蛋白質の加水分解度はOPA法で遊離のアミノ基を修飾
して測定した。四ほう酸ナトリウム・10水和物 9.
525gとドデシル硫酸ナトリウム250mgとを20
0mlの脱イオン水に溶解させた。完全に溶解した後、
o−フタル酸アルデヒド(97%純度)200mgを4
mlのエタノールに溶解させ、脱イオン水でリンスしな
がら全量加えた。さらに、ジチオスレイトール(99%
純度)220mgを脱イオン水でリンスしながら全量加
えた。脱イオン水で250mlにメスアップし、OPA
試薬を調製した。セリン標準液はL−セリン50mgを
250mlにメスアップして調製した。蛋白質加水分解
物を精秤し、25mlの脱イオン水に溶解した。ブラン
クとして脱イオン水200μl入りの試験管6本、標準
としてセリン標準液200μl入りの試験管6本を用意
した。サンプル溶液は1検体につき2本づつ200μl
入りの試験管を用意した。測定は標準液3本→ブランク
6本→サンプル溶液→標準液3本の順に行った。OPA
試薬3mlを上記試験管に注ぎ、ミキサーで撹拌した
後、正確に2分間静置した。反応液の吸光度を340n
mで定量した。標準液のODは約0.8、ブランクのO
Dは約0.07である。(8) Degree of Hydrolysis of Protein The degree of hydrolysis of protein was measured by modifying a free amino group by the OPA method. 8. Sodium tetraborate decahydrate
525 g and sodium dodecyl sulfate 250 mg in 20
Dissolved in 0 ml deionized water. After complete dissolution,
200 mg of o-phthalic aldehyde (97% purity)
Dissolved in ml of ethanol and added all while rinsing with deionized water. In addition, dithiothreitol (99%
(Purity) 220 mg was added while rinsing with deionized water. Make up to 250ml with deionized water and OPA
Reagents were prepared. The serine standard solution was prepared by adding 50 mg of L-serine to 250 ml. The protein hydrolyzate was precisely weighed and dissolved in 25 ml of deionized water. Six test tubes containing 200 μl of deionized water as blanks and six test tubes containing 200 μl of a standard serine solution were prepared as standards. 200 µl each of two sample solutions per sample
A test tube was prepared. The measurement was performed in the order of 3 standard solutions → 6 blanks → sample solution → 3 standard solutions. OPA
3 ml of the reagent was poured into the above test tube, stirred with a mixer, and allowed to stand exactly 2 minutes. 340 n absorbance of the reaction solution
Quantified in m. The OD of the standard solution is about 0.8 and the blank O
D is about 0.07.
【0020】(9)アミノ酸遊離率 蛋白質酵素加水分解物を10000gで5分間遠心分離
して不溶物を除いた。得られた上清部分をディスミック
13cp(東洋濾紙会社製)でろ過し、島津製作所製ア
ミノ酸分析計ALC−1000で遊離アミノ酸を定量し
た。得られた遊離アミノ酸mgを基質蛋白質中のアミノ
酸量mgで割って遊離率を%で示した。(9) Amino acid release rate The protein enzyme hydrolyzate was centrifuged at 10,000 g for 5 minutes to remove insolubles. The obtained supernatant was filtered through a discic 13 cp (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), and free amino acids were quantified using an amino acid analyzer ALC-1000 manufactured by Shimadzu Corporation. The obtained free amino acid mg was divided by the amount of amino acid in the substrate protein mg, and the release rate was shown in%.
【0021】[0021]
【実施例1】アクチノムコール エレガンス(Acti
nomucor elegans)IFO 6408を
綿実蛋白質2.0%、大豆蛋白質0.5%、グルコース
0.5%、塩化ナトリウム0.3%、りん酸二カリウム
0.1%、炭酸カルシウム0.2%、硫酸マグネシウム
0.050%よりなる培地2.5リットルを入れた5リ
ットル容ジャーファーメンターに接種し、25℃で96
時間通気・撹拌培養した。培養液より集菌し、310g
の湿菌体を得た。これにグリセリンを終濃度10%にな
るように添加し、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)に懸濁させた。これをNIHONSEIKI
KAISHA製Ace Homogenizerで10
000rpm、5分間撹拌し、12000gで10分間
遠心分離して上清625mlを回収した液を粗酵素液と
した。粗酵素液の各種合成基質に対する加水分解活性を
測定し、その結果を表1に示した。表1のように、本粗
酵素抽出液中にはグリシンアミノペプチダーゼ(GA
P)活性の他に、プロリルイミノペプチダーゼ(PI
P)、ロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)の各活性
が認められた。[Example 1] Actinom call elegance (Acti
Nomucor elegans) IFO 6408 was prepared from 2.0% cottonseed protein, 0.5% soy protein, 0.5% glucose, 0.3% sodium chloride, 0.1% dipotassium phosphate, 0.2% calcium carbonate, A 5 liter jar fermenter containing 2.5 liters of a medium consisting of 0.050% magnesium sulfate was inoculated and incubated at 25 ° C. for 96 hours.
The cells were cultured under aeration and stirring for hours. Collect cells from culture broth, 310g
Was obtained. Glycerin was added to this to a final concentration of 10%, and 10 mM Tris-HCl buffer (pH
8.0). This is NIHONSEIKI
10 with Ace Homogenizer manufactured by KAISHA
The mixture was stirred at 000 rpm for 5 minutes, and centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to collect 625 ml of the supernatant, which was used as a crude enzyme solution. The hydrolysis activity of the crude enzyme solution for various synthetic substrates was measured, and the results are shown in Table 1. As shown in Table 1, glycine aminopeptidase (GA) was contained in the crude enzyme extract.
P) In addition to activity, prolyliminopeptidase (PI
P) and leucine aminopeptidase (LAP) activities were observed.
【0022】[0022]
【表1】 [Table 1]
【0023】DEAE−Toyopearlを充填した
カラムを20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)で
平衡化した。10%グリセリンを含む10mMトリス−
塩酸緩衝液(pH8.0)で予め透析した粗酵素を上記
カラムにアプライし、0から1Mの塩化ナトリウム濃度
勾配で酵素を溶出させた。各画分につき280nmの吸
光度と、グリシンβナフチルアミドを加水分解する活性
について測定した結果を図1に示した。DEAEカラム
クロマトグラフィで得られた活性画分(フラクション6
4ないし68)を混合し、これを50%硫安を含んだ2
0mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)で平衡化した
Toyopearl HW65Cにアプライして、50
%→0%の硫安濃度勾配により酵素を溶出させた(図
2)。The column packed with DEAE-Toyopearl was equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0). 10 mM Tris containing 10% glycerin
The crude enzyme dialyzed in advance with a hydrochloric acid buffer (pH 8.0) was applied to the column, and the enzyme was eluted with a 0 to 1 M sodium chloride concentration gradient. FIG. 1 shows the results of measuring the absorbance at 280 nm and the activity of hydrolyzing glycine β-naphthylamide for each fraction. Active fraction (fraction 6) obtained by DEAE column chromatography
4 to 68) and mix them with 2% containing 50% ammonium sulfate.
Applying to Toyopearl HW65C equilibrated with 0 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 50
The enzyme was eluted with an ammonium sulfate concentration gradient of% → 0% (FIG. 2).
【0024】疎水性クロマトグラフィで得られた活性画
分(フラクション70ないし71)を集め、150mM
のNaClを含んだ50mMリン酸緩衝液pH7.0で
平衡化したSuperdex 200HR10/30を
充填したカラムにアプライし、24分後に溶出した活性
画分を回収した(図3)。本酵素精製プロフィールを表
2に示した。The active fractions (fractions 70 to 71) obtained by the hydrophobic chromatography were collected and 150 mM
Was applied to a column packed with Superdex 200HR10 / 30 equilibrated with 50 mM phosphate buffer pH 7.0 containing NaCl, and the active fraction eluted 24 minutes later was collected (FIG. 3). The enzyme purification profile is shown in Table 2.
【0025】[0025]
【表2】 [Table 2]
【0026】[0026]
【実施例2】実施例1で調製した精製酵素を10〜15
%のポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結
果、分子量は94,000±5000と推定された。図
4に蛋白質の移動度から推定した分子量を示す。本グリ
シンアミノペプチダーゼに対する各種阻害剤の影響を調
べた結果を表3に示す。本発明のグリシンアミノペプチ
ダーゼは、キレート剤であるo−フェナントロリン(O
PT)やEDTA、セリン酵素の阻害剤であるジイソプ
ロピルフルオロリン酸(DFP)には阻害されず、チオ
ール酵素の阻害剤であるパラクロロメルクリ安息香酸
(PCMB)やヨード酢酸により阻害されたことから、
チオール残基を活性中心に持つ酵素であると考えられ
た。Example 2 The purified enzyme prepared in Example 1 was
As a result of analysis by% polyacrylamide gel electrophoresis, the molecular weight was estimated to be 94,000 ± 5000. FIG. 4 shows the molecular weight estimated from the mobility of the protein. Table 3 shows the results of examining the effects of various inhibitors on the present glycine aminopeptidase. The glycine aminopeptidase of the present invention comprises a chelating agent, o-phenanthroline (O
PT), EDTA, and diisopropylfluorophosphate (DFP), which is an inhibitor of serine enzyme, and was inhibited by parachloromercuribenzoic acid (PCMB) and iodoacetic acid, which are inhibitors of thiol enzyme.
It was considered that the enzyme had a thiol residue at its active center.
【0027】[0027]
【表3】 [Table 3]
【0028】実施例1で得られた精製酵素は、反応の最
適pHが8.0±1.0であり、pH6ないし10にお
ける活性が最適pHにおける活性の40%以上である。
精製酵素のpHプロファイルを図5に示す。該酵素は2
0℃における活性が最適温度30℃における活性の90
%以上であり、低温でも十分機能することが示された
(図6)。一方、温度安定性試験において、20℃ない
し30℃では最適温度30℃での活性を100%維持で
きたが、42℃で残存活性が50%になった(図7)。
したがって、該酵素は特に30℃以下の低温で有効な酵
素である。The purified enzyme obtained in Example 1 has an optimum pH for the reaction of 8.0 ± 1.0, and the activity at pH 6 to 10 is 40% or more of the activity at the optimum pH.
FIG. 5 shows the pH profile of the purified enzyme. The enzyme is 2
The activity at 0 ° C is 90% of the activity at the optimal temperature of 30 ° C.
% Or more, and it was shown to function well even at low temperatures (FIG. 6). On the other hand, in the temperature stability test, the activity at the optimum temperature of 30 ° C. was maintained at 100% at 20 ° C. to 30 ° C., but the residual activity was 50% at 42 ° C. (FIG. 7).
Therefore, the enzyme is an enzyme particularly effective at a low temperature of 30 ° C. or less.
【0029】精製酵素の各種合成基質に対する加水分解
活性を測定した。該グリシンアミノペプチダーゼは主に
グリシンアミノペプチダーゼ活性を有するが、アラニン
βナフチルアミド、メチオニンβナフチルアミド、アル
ギニンβナフチルアミド、ロイシンβナフチルアミド、
セリンβナフチルアミドを基質とした場合にも加水分解
活性を有した。一方、該精製酵素は、トリプトファンβ
ナフチルアミド、ピログルタミルβナフチルアミド、ア
スパラギン酸βナフチルアミド、リジンβナフチルアミ
ド、バリンβナフチルアミド、プロリンβナフチルアミ
ドに対する特異性がないことがことが判明した。精製酵
素の基質特異性を表4に示す。The hydrolysis activity of the purified enzyme on various synthetic substrates was measured. The glycine aminopeptidase has mainly glycine aminopeptidase activity, but alanine β naphthylamide, methionine β naphthylamide, arginine β naphthylamide, leucine β naphthylamide,
Serine β-naphthylamide also had hydrolysis activity when used as a substrate. On the other hand, the purified enzyme is tryptophan β
It was found that there was no specificity for naphthylamide, pyroglutamyl β-naphthylamide, aspartic acid β-naphthylamide, lysine β-naphthylamide, valine β-naphthylamide, and proline β-naphthylamide. Table 4 shows the substrate specificity of the purified enzyme.
【0030】[0030]
【表4】 [Table 4]
【0031】[0031]
【実施例3】蛋白質を高度に加水分解する方法として、
ノポ・ノルディスク社製のアルカラーゼとフレーバーザ
イムを併用する系が既に知られている。そこで、アルカ
ラーゼとフレーバーザイムを併用する系を標準とし、さ
らに、アクチノムコール エレガンスから得られた該粗
酵素を該標準反応系に加えた場合に、加水分解度がどの
ように変化するかを調べた。実施例1で得られた該粗酵
素をグリセリン10%存在下で透析し、濃縮した結果、
0.912U/mlのグリシンアミノペプチダーゼ活性
がある粗酵素液を得た。Example 3 As a method for highly hydrolyzing a protein,
A system using a combination of Alcalase from Nopo Nordisk and flavorzyme is already known. Therefore, a system using a combination of Alcalase and flavorzyme was used as a standard, and further, when the crude enzyme obtained from Actinomucol elegance was added to the standard reaction system, it was examined how the degree of hydrolysis changes. . The crude enzyme obtained in Example 1 was dialyzed in the presence of 10% glycerin and concentrated.
A crude enzyme solution having a glycine aminopeptidase activity of 0.912 U / ml was obtained.
【0032】ゼラチンの2%溶液にそれぞれノボ・ノル
ディスク社製のアルカラーゼ2.4リットルを酵素基質
比で0.5%とノボ・ノルディスク社製のフレーバーザ
イム1000リットルを酵素基質比で2.0%加え、さ
らに、上記粗酵素液をグリシンアミノペプチダーゼ活性
として0、0.25U/ml、0.5U/ml添加し
て、50℃で18時間反応させた。反応後80℃で10
分間加熱し、酵素を失活させた。それぞれの加水分解物
につき、o−フタル酸アルデヒド法で遊離のアミノ基を
定量し加水分解率を計算した。その結果、該粗酵素を加
えずにフレーバーザイムとアルカラーゼのみで加水分解
を行った時と比べて、アクチノムコールエレガンスから
得られた粗酵素をさらに加えた時には、約13%高い加
水分解率を示し、グリシンアミノペプチダーゼが加水分
解反応に及ぼす効果が確認された。それぞれの条件で得
られた加水分解度を表5に示す。In a 2% solution of gelatin, 2.4 liters of Alcalase manufactured by Novo Nordisk and 0.5% based on the enzyme substrate ratio and 1000 liters of flavorzyme manufactured by Novo Nordisk and an enzyme substrate ratio of 2. 0% was added, and the crude enzyme solution was further added with 0, 0.25 U / ml and 0.5 U / ml as glycine aminopeptidase activity, and reacted at 50 ° C. for 18 hours. After the reaction, 10
Heated for minutes to inactivate the enzyme. For each hydrolyzate, the free amino group was quantified by the o-phthalic aldehyde method, and the hydrolysis rate was calculated. As a result, when the crude enzyme obtained from Actinomucol elegance was further added, the hydrolysis rate was about 13% higher than when hydrolysis was performed only with the flavorzyme and alcalase without adding the crude enzyme. The effect of glycine aminopeptidase on the hydrolysis reaction was confirmed. Table 5 shows the degree of hydrolysis obtained under each condition.
【0033】[0033]
【表5】 [Table 5]
【0034】該蛋白質酵素加水分解物のアミノ酸遊離率
を定量した。基質蛋白質中のアミノ酸を100%とし、
得られた遊離アミノ酸の割合を表6に示す。ゼラチン蛋
白質中で最も存在比が多いグリシンの遊離率を上げるこ
とができた。2番目に存在比が多いプロリンの遊離率
は、対照の約3倍に上げることができた。The amino acid release rate of the protein enzyme hydrolyzate was determined. 100% amino acid in the substrate protein,
Table 6 shows the ratio of the obtained free amino acids. The release rate of glycine, which is the most abundant in gelatin protein, could be increased. The release rate of proline, which is the second most abundant, could be increased about three times as compared with the control.
【0035】[0035]
【表6】 [Table 6]
【0036】[0036]
【発明の効果】本発明によれば、グリシンに特異性が高
く、低温でも十分作用するグリシンアミノペプチダーゼ
が食経験豊富で安全性が確立されている微生物より新た
に見出され、該酵素を用いることにより、グリシン含量
が多い蛋白質も高度に加水分解できるようになった。該
蛋白質酵素加水分解物は呈味上有用なアミノ酸の遊離率
が高い。According to the present invention, glycine aminopeptidase having high specificity for glycine and sufficiently acting even at a low temperature is newly found from microorganisms having abundant food experience and having established safety, and using the enzyme. As a result, proteins having a high glycine content can be highly hydrolyzed. The enzyme hydrolyzate of the protein has a high rate of releasing useful amino acids in taste.
【図1】DEAE−Toyopearlクロマトグラフ
ィによるグリシンアミノペプチダーゼの分画パターンで
ある。FIG. 1 is a pattern of fractionation of glycine aminopeptidase by DEAE-Toyopearl chromatography.
【図2】Toyopearl HW65Cクロマトグラ
フィによるグリシンアミノペプチダーゼの分画パターン
である。FIG. 2 is a fractionation pattern of glycine aminopeptidase by Toyopearl HW65C chromatography.
【図3】Superdex 200HR10/30分子
ふるいクロマトグラフィによるグリシンアミノペプチダ
ーゼの分画パターンである。FIG. 3 is a fractionation pattern of glycine aminopeptidase by Superdex 200 HR10 / 30 molecular sieve chromatography.
【図4】SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り求めたグリシンアミノペプチダーゼの分子量を示す。FIG. 4 shows the molecular weight of glycine aminopeptidase determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
【図5】グリシンアミノペプチダーゼ精製標品のpHプ
ロファイルを示す。FIG. 5 shows the pH profile of a purified glycine aminopeptidase preparation.
【図6】グリシンアミノペプチダーゼ精製標品の反応最
適温度を示す。FIG. 6 shows the optimum reaction temperature of a purified glycine aminopeptidase preparation.
【図7】グリシンアミノペプチダーゼ精製標品の温度安
定性を示す。FIG. 7 shows the temperature stability of a purified glycine aminopeptidase preparation.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:645) (C12P 21/06 C12R 1:69) Fターム(参考) 4B047 LB06 LG18 LP18 4B050 CC01 DD03 FF04E FF09E FF11E FF12E LL02 4B064 AG01 CA05 CB01 CE04 CE07 CE09 CE11 DA10 4B065 AA58X AC14 CA33 CA41──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (reference) C12R 1: 645) (C12P 21/06 C12R 1:69) F term (reference) 4B047 LB06 LG18 LP18 4B050 CC01 DD03 FF04E FF09E FF11E FF12E LL02 4B064 AG01 CA05 CB01 CE04 CE07 CE09 CE11 DA10 4B065 AA58X AC14 CA33 CA41
Claims (6)
動による分子量が94,000±5000であり、ヨー
ド酢酸及びp−クロロメルクリ安息香酸により阻害され
ることを特徴とするグリシンアミノペプチダーゼ。1. A glycine aminopeptidase having a molecular weight of 94,000 ± 5000 as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and inhibited by iodoacetic acid and p-chloromercuribenzoic acid.
or)属糸状菌由来であることを特徴とする請求項1に
記載のグリシンアミノペプチダーゼ。2. Actinomuc
The glycine aminopeptidase according to claim 1, wherein the glycine aminopeptidase is derived from a filamentous fungus.
り抽出され、請求項1のグリシンアミノペプチダーゼを
含むことを特徴とする蛋白質加水分解酵素製剤。3. A protein hydrolase preparation which is extracted from a culture of Actinomucol elegance and contains the glycine aminopeptidase of claim 1.
リシンアミノペプチダーゼまたは蛋白質加水分解酵素製
剤を加水分解反応に使用することを特徴とする蛋白質及
びペプチドの加水分解方法。4. A method for hydrolyzing proteins and peptides, which comprises using the glycine aminopeptidase or protein hydrolase preparation according to claim 1 for a hydrolysis reaction.
つ、分子量がそれぞれ約23kDa、約27kDa、約
31kDa、約32kDa、約35kDa、約38kD
a、約42kDa、約47kDa、約53kDa、及び
約100kDaの中から選ばれる少なくとも5種のプロ
テアーゼ及びペプチダーゼを含む酵素製剤を加水分解反
応に併用して使用することを特徴とする請求項4に記載
の加水分解方法。5. Derived from Aspergillus oryzae and having a molecular weight of about 23 kDa, about 27 kDa, about 31 kDa, about 32 kDa, about 35 kDa, about 38 kD, respectively.
5. The method according to claim 4, wherein an enzyme preparation containing at least five proteases and peptidases selected from a, about 42 kDa, about 47 kDa, about 53 kDa, and about 100 kDa is used in combination with the hydrolysis reaction. Hydrolysis method.
分子量が約23kDa、約31kDa、約35kDa、
約38kDa、約53kDaである請求項5に記載の加
水分解方法。6. The five proteases and peptidases have a molecular weight of about 23 kDa, about 31 kDa, about 35 kDa,
The hydrolysis method according to claim 5, wherein the hydrolysis is about 38 kDa and about 53 kDa.
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