JP2001011100A - Substrate for detection of hiv protease and expression vector therefor - Google Patents
Substrate for detection of hiv protease and expression vector thereforInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶプロテアー
ゼの活性の活性の検出に有用な蛍光タンパク質標識を有
するタンパク質分解酵素用の標識化基質、この標識化基
質をコードするＤＮＡ配列を有し、該標識化基質の宿主
での発現を可能とする組換えベクター、及び該タンパク
質分解酵素用標識化基質または該組換えベクターを用い
るタンパク質分解酵素活性の検出方法、更にはＨＩＶプ
ロテアーゼによる切断部位として利用し得る切断配列ペ
プチドに関する。The present invention relates to a labeled substrate for a protease having a fluorescent protein label useful for detecting the activity of HIV protease activity, a DNA sequence encoding the labeled substrate, A recombinant vector that enables expression of a labeled substrate in a host, a method for detecting a protease that uses the labeled substrate for the protease or the recombinant vector, and a site for cleavage by HIV protease. The resulting cleavage sequence peptide.
【０００２】[0002]
【従来の技術】生体内には様々なタンパク質分解酵素が
あり恒常性の維持に関わるほか、疾病発症に重大な役割
を果たしていることが知られている。ＨＩＶ（ヒト免疫
不全症ウィルス）は、それ自身の有するプロテアーゼ
（ＨＩＶプロテアーゼ）の作用により前駆体タンパク質
を切断してＨＩＶウィルスの増殖に必要な酵素と構造タ
ンパク質を生成し、感染ウィルスとなる。この過程はＨ
ＩＶの増殖に必須であり、ＨＩＶプロテアーゼを阻害す
ることはエイズの有効な治療法になると考えられる。2. Description of the Related Art It is known that various proteolytic enzymes are present in a living body and are involved in maintenance of homeostasis and also play an important role in the onset of disease. HIV (human immunodeficiency virus) cleaves its precursor protein by the action of its own protease (HIV protease) to produce enzymes and structural proteins necessary for the propagation of the HIV virus, and becomes an infectious virus. This process is H
Essential for IV growth, inhibiting HIV protease is thought to be an effective treatment for AIDS.
【０００３】従って、ＨＩＶプロテアーゼの活性を容易
に測定することができれば、細胞内でのＨＩＶプロテア
ーゼ活性のモニタリングだけではなく、ＨＩＶプロテア
ーゼの活性を抑制するインヒビター開発の効率化が図れ
る。[0003] Therefore, if the activity of HIV protease can be easily measured, not only the monitoring of the activity of HIV protease in cells, but also the efficiency of the development of inhibitors that suppress the activity of HIV protease can be improved.
【０００４】一方、酵素活性の測定における基質の標識
化の技術に関しては、従来、タンパク質分解酵素の基質
ぺプチド内において、ある距離をおいて位置するアミノ
酸側鎖の２箇所の一方に発光色素団、他方に消光団を結
合し、これら色素団の間での蛍光共鳴エネルギー転移
（ＦＲＥＴ）を見ることによりタンパク質分解酵素活性
を検出する手法が開発されている（例えば特表平９−５
０４７７８号公報）。On the other hand, regarding the technique of labeling a substrate in the measurement of enzymatic activity, conventionally, a luminescent chromophore is added to one of two amino acid side chains located at a certain distance in a substrate peptide of a protease. On the other hand, a technique has been developed in which a quencher is bound to the other, and the proteolytic enzyme activity is detected by observing the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between these chromophores (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-5 / 1990)
No. 04778).
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】従来技術では、蛍光強
度の強弱変化すなわちモノカラー信号としてタンパク質
分解酵素活性を検出しており、信号の微妙な変化を検出
することが困難であった。更に、従来の手法では基質ペ
プチドのアミノ酸側鎖に煩雑な化学的手法により蛍光色
素を共有結合させる必要があった。また、従来法では、
細胞外からタンパク質分解酵素用基質を導入して細胞内
のタンパク質分解酵素活性を直接検出するような、細胞
内の活性測定は困難であった。In the prior art, the proteolytic enzyme activity is detected as a change in fluorescence intensity, that is, a monocolor signal, and it has been difficult to detect a subtle change in the signal. Furthermore, in the conventional method, it was necessary to covalently bind a fluorescent dye to the amino acid side chain of the substrate peptide by a complicated chemical method. In the conventional method,
It has been difficult to measure intracellular activities such as direct detection of intracellular protease activity by introducing a protease substrate from outside the cell.
【０００６】本発明はこのような従来技術における問題
に鑑みなされたものであり、蛍光信号の微妙な変化を検
出することができ、製造が容易で、かつ検出対象として
の試料が微生物や細胞である場合における試料内でのＨ
ＩＶプロテアーゼ活性の検出を可能とする構成を有する
ＨＩＶプロテアーゼ検出用の標識化基質、該標識化基質
の発現用のベクター、該ベクターを用いた標識化基質の
製造方法及び該標識化基質を用いたＨＩＶプロテアーゼ
活性の検出方法を提供することにある。The present invention has been made in view of such problems in the prior art, and is capable of detecting a subtle change in a fluorescence signal, is easy to manufacture, and is a method in which a sample to be detected is a microorganism or a cell. H in the sample in some cases
A labeled substrate for detecting HIV protease having a configuration capable of detecting IV protease activity, a vector for expressing the labeled substrate, a method for producing a labeled substrate using the vector, and the labeled substrate were used. An object of the present invention is to provide a method for detecting HIV protease activity.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明の標識化基質は、
ＨＩＶプロテアーゼ用の基質であって、該ＨＩＶプロテ
アーゼにより切断し得る切断部位を有するポリペプチド
と、該ポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端のそ
れぞれに結合した蛍光タンパク質とを有し、前記ポリペ
プチドが前記切断部位から切断されることでこれらの蛍
光タンパク質からの蛍光特性が変化するものであること
を特徴とする。The labeled substrate of the present invention comprises:
A substrate for an HIV protease, comprising a polypeptide having a cleavage site capable of being cleaved by the HIV protease, and a fluorescent protein bound to each of the amino terminus and the carboxy terminus of the polypeptide, wherein the polypeptide is It is characterized in that the fluorescence characteristics from these fluorescent proteins are changed by being cleaved from the cleavage site.
【０００８】また、本発明のＨＩＶプロテアーゼ用標識
化基質の発現用の組換えベクターは、プロモーターと、
上記構成の標識化基質をコードするＤＮＡ配列と、ベク
ター部分とを有し、該プロモーターに該ＤＮＡ配列が宿
主での発現可能に接続していることを特徴とする。[0008] The recombinant vector for expressing the labeled substrate for HIV protease of the present invention comprises a promoter,
It has a DNA sequence encoding the labeled substrate having the above structure and a vector part, and the promoter is connected to the DNA sequence so that the DNA sequence can be expressed in a host.
【０００９】また、本発明の標識化基質の生産方法は、
上記の構成の組換えベクターを宿主に導入して形質転換
し、得られた形質転換体を培養して該形質転換体に該組
換えベクター中にコードされた標識化基質を生産させる
工程を有することを特徴とする。[0009] The method for producing a labeled substrate of the present invention comprises:
A step of introducing the recombinant vector having the above structure into a host, transforming the resultant, culturing the obtained transformant, and causing the transformant to produce a labeled substrate encoded in the recombinant vector. It is characterized by the following.
【００１０】更に、本発明の標識化基質のＨＩＶプロテ
アーゼによる切断配列として有用なペプチドは、ＨＩＶ
プロテアーゼに切断され得るアミノ酸配列としてGly-Th
r-Leu-Asn-Phe-Pro-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr（配列番号：
１）を有することを特徴とする。Furthermore, a peptide useful as a cleavage sequence of the labeled substrate of the present invention by HIV protease is HIV.
Gly-Th as an amino acid sequence that can be cleaved by protease
r-Leu-Asn-Phe-Pro-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr (SEQ ID NO:
It is characterized by having 1).
【００１１】また、本発明のＨＩＶプロテアーゼ活性の
検出方法は、試料中のＨＩＶプロテアーゼ活性を検出す
る方法であって、試料と上記構成の標識化基質とを反応
させて、該標識化基質の有するタンパク質分解酵素によ
る切断部位からの切断による蛍光タンパク質からの蛍光
特性の変化をＨＩＶプロテアーゼ活性として検出するこ
とを特徴とする。[0011] The method for detecting HIV protease activity of the present invention is a method for detecting HIV protease activity in a sample, which comprises reacting the sample with the labeled substrate having the above-mentioned structure to form a sample having the labeled substrate. It is characterized in that a change in the fluorescent property from the fluorescent protein due to cleavage from the cleavage site by the protease is detected as HIV protease activity.
【００１２】上述のとおり、本発明のＨＩＶプロテアー
ゼ検出用として有用な標識化基質は、標識物質としての
蛍光タンパク質が、タンパク質分解酵素であるＨＩＶプ
ロテアーゼによる切断部位を有するポリペプチドのアミ
ノ末端（Ｎ−末端）とカルボシキ末端（Ｃ−末端）に結
合した構造を有するので、例えば蛍光タンパク質が結合
した状態の基質（標識化基質）をコードするＤＮＡ配列
を発現用のベクターに組み込んで、これを宿主に発現さ
せることで、目的とする標識化基質を宿主中に産生させ
ることができ、基質への蛍光タンパク質の結合という煩
雑な工程を省略することができる。As described above, the labeling substrate useful for detecting the HIV protease of the present invention is such that the fluorescent protein as the labeling substance has an amino terminus (N-terminal) of a polypeptide having a cleavage site by HIV protease which is a protease. End) and a carboxy terminal (C-terminal), so that, for example, a DNA sequence encoding a substrate (labeled substrate) to which a fluorescent protein is bound is inserted into an expression vector, and this is used as a host. By expression, the target labeled substrate can be produced in the host, and the complicated step of binding the fluorescent protein to the substrate can be omitted.
【００１３】更に、ＨＩＶプロテアーゼ活性の有無を検
出する対象としての試料自体がこの宿主としての機能を
有する場合には、試料中で標識化基質を直接産生させる
ことができ、産生された標識化基質を用いて試料として
の宿主中でのＨＩＶプロテアーゼ活性の検出が可能とな
る。すなわち、in vivoでのＨＩＶプロテアーゼ活性の
検出が可能となる。[0013] Further, when the sample itself for detecting the presence or absence of the HIV protease activity has the function of this host, the labeled substrate can be directly produced in the sample, and the produced labeled substrate can be produced. Can be used to detect HIV protease activity in a host as a sample. That is, it becomes possible to detect HIV protease activity in vivo.
【００１４】[0014]
【発明の実施の形態】本発明の標識化基質は、ＨＩＶプ
ロテアーゼによる切断部位を有するポリペプチド部分
と、このポリペプチド部分のＮ−末端に結合した蛍光タ
ンパク質と、Ｃ−末端に結合した蛍光タンパク質とを有
する。酵素用基質の両端に蛍光タンパク質を結合する方
法としては、例えば、蛍光タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を酵素用基質をコードするＤＮＡ配列の５’末端
と３’末端に結合したＤＮＡ配列を作成し、これを適当
な宿主中で発現させる遺伝子組換え技術を利用した方法
が好適に利用できる。この方法によれば、酵素用基質に
蛍光タンパク質を共有結合する操作が省略でき、確実か
つ効率の良い蛍光タンパク質での酵素用基質の標識化が
可能となる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The labeled substrate of the present invention comprises a polypeptide moiety having a cleavage site by HIV protease, a fluorescent protein bound to the N-terminus of the polypeptide moiety, and a fluorescent protein bound to the C-terminus. And As a method for binding a fluorescent protein to both ends of an enzyme substrate, for example, DN encoding a fluorescent protein is used.
A method using a gene recombination technique in which a DNA sequence in which the A sequence is linked to the 5 'end and 3' end of a DNA sequence encoding a substrate for an enzyme is prepared and expressed in an appropriate host can be suitably used. . According to this method, the operation of covalently binding the fluorescent protein to the enzyme substrate can be omitted, and the enzyme substrate can be reliably and efficiently labeled with the fluorescent protein.
【００１５】上記のように蛍光タンパク質で標識化され
た状態の酵素用基質自体をコードするＤＮＡ配列は、Ｈ
ＩＶプロテアーゼの検出対象である試料が、微生物や各
種細胞である場合に、このＤＮＡ配列を発現ベクター中
に組み込んでこれらの試料中に導入して、これを発現さ
せることで、試料中で標識化基質を産生させることがで
きる。産生された標識化基質は、試料がＨＩＶプロテア
ーゼを持っている場合は、これと反応し、その反応に基
づく蛍光特性の変化を測定することでＨＩＶプロテアー
ゼの検出が可能となる。The DNA sequence encoding the enzyme substrate itself labeled with the fluorescent protein as described above is H
When the sample to be detected for the IV protease is a microorganism or various cells, the DNA sequence is incorporated into an expression vector, introduced into these samples, and expressed, whereby labeling is performed in the sample. A substrate can be produced. If the sample has an HIV protease, the produced labeled substrate reacts with the HIV protease, and the change in the fluorescent property based on the reaction can be measured to detect the HIV protease.
【００１６】標識化基質の発現用のベクターは、これを
導入する試料（宿主）の種類に応じて選択したプロモー
ターを、必要に応じて複製開始点、エンハンサー、発現
確認用のマーカー等を有するベクター中に有する構成の
ものを好適に利用することができる。試料（宿主）とし
ては、例えば細菌等の微生物、ヒトや動物由来の各種培
養細胞などを挙げることができる。なお、発現用のベク
ターと標識化酵素の生産用の宿主との組合せを適宜選択
することで、標識化基質を宿主内に生産させたり、宿主
外に分泌生産させることもできる。宿主内に生産させた
標識化酵素は、通常の各種分離、精製方法を用いて単離
することができる。The vector for expressing the labeled substrate is a vector having a promoter selected according to the type of the sample (host) into which the vector is to be introduced, and optionally having a replication origin, an enhancer, a marker for confirming expression, and the like. The one having the configuration therein can be suitably used. Examples of the sample (host) include microorganisms such as bacteria, and various cultured cells derived from humans and animals. By appropriately selecting the combination of the expression vector and the host for producing the labeled enzyme, the labeled substrate can be produced in the host or secreted out of the host. The labeled enzyme produced in the host can be isolated using various conventional separation and purification methods.
【００１７】酵素用基質としては、宿主での発現が可能
であり、ＨＩＶプロテアーゼによって特異的に切断され
る部位を有するものが利用され、検出対象としてのＨＩ
Ｖプロテアーゼの特性に応じて選択あるいは設計でき
る。このような配列としては先に挙げた配列番号：１の
アミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。As a substrate for the enzyme, a substrate that can be expressed in a host and has a site that is specifically cleaved by an HIV protease is used.
It can be selected or designed according to the characteristics of V protease. Examples of such a sequence include a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 described above.
【００１８】一方、酵素用基質に結合させる蛍光タンパ
ク質としては、酵素用基質の両端に結合している状態で
の蛍光特性と、酵素用基質がＨＩＶプロテアーゼによっ
て切断された場合における蛍光特性とが異なるものが利
用される。このような切断前後での蛍光特性の変化を提
供し得る蛍光タンパク質の組合せとしては、蛍光共鳴エ
ネルギー転移(FRET)の供与体と受容体の組合せを形成し
得るものを挙げることができる。例えば、酵素用基質の
アミノ末端に結合した蛍光タンパク質とカルボキシ末端
に結合した蛍光タンパク質とで、これら蛍光タンパク質
の励起に必要な励起光の波長及び励起状態での放射光の
波長が異なる組合せを好適なものとして例示できる。こ
のような励起放射光の波長が異なる組合せの好ましい例
としては、アミノ末端に結合した蛍光タンパク質とカル
ボキシ末端に結合した蛍光タンパク質の一方が、緑色蛍
光タンパク質（GFP）であり、他方が青色蛍光タンパク
質（BFP）である組合せを挙げることができ、励起放射
光の色変化評価を用いてタンパク質分解酵素活性の検出
における高精度化を達成できる。On the other hand, the fluorescent property of the fluorescent protein bound to the enzyme substrate is different from the fluorescent property when bound to both ends of the enzyme substrate and the fluorescent property when the enzyme substrate is cleaved by HIV protease. Things are used. Combinations of fluorescent proteins that can provide such a change in fluorescence properties before and after cleavage include those that can form a combination of a donor and an acceptor for fluorescence resonance energy transfer (FRET). For example, a combination of a fluorescent protein bound to the amino terminus and a fluorescent protein bound to the carboxy terminus of an enzyme substrate, in which the wavelength of the excitation light required for exciting these fluorescent proteins and the wavelength of the emitted light in the excited state are preferably different. Can be illustrated as an example. As a preferable example of such a combination in which the wavelength of the excitation radiation is different, one of the fluorescent protein bound to the amino terminus and the fluorescent protein bound to the carboxy terminus is green fluorescent protein (GFP), and the other is blue fluorescent protein. (BFP), which can achieve high accuracy in detecting proteolytic enzyme activity by using color change evaluation of excitation radiation.
【００１９】FRETは蛍光分子間の距離に依存した励起状
態の相互作用であり、隣接して存在する一方の蛍光分子
の発光と他方の励起とがカップリングして起きる。例え
ば、GFPとBFPの組合せを用いた酵素用基質に380nm付近
の励起用の光を照射するとBFPから440nm付近の光が放射
されるが、BFPにGFPが充分近接して位置するため、BFP
からの光はGFPに励起光として吸収され全体として酵素
用基質からは510nm付近の放射光が観察されることにな
る。一方、酵素用基質がタンパク質分解酵素によってBF
PとGFPをつなぐポリペプチド部分で切断されると、両蛍
光タンパク質はFRETを起こすほど近接して位置しなくな
るために380nm付近の光を照射するとBFPからの440nm付
近の放射光のみが観測され、このことによって、サンプ
ル中のタンパク質分解酵素の存在を検出することが可能
になる。このように、FRETを利用する場合には、励起光
の波長が異なり、かつ一方の蛍光タンパク質からの励起
状態での放射光が他方の蛍光タンパク質の励起光となる
ような２種の蛍光タンパク質の組合せが好適に用いられ
る。FRET is an interaction between excited states depending on the distance between fluorescent molecules, and is caused by coupling between emission of one adjacent fluorescent molecule and excitation of the other. For example, when a substrate for enzyme using a combination of GFP and BFP is irradiated with light for excitation around 380 nm, light around 440 nm is emitted from BFP, but since GFP is located sufficiently close to BFP, BFP
Is absorbed by GFP as excitation light, and emission light of about 510 nm is observed from the enzyme substrate as a whole. On the other hand, the enzyme substrate is
When cleaved at the polypeptide portion connecting P and GFP, both fluorescent proteins are not located close enough to cause FRET, so when irradiating light around 380 nm, only emission around 440 nm from BFP is observed, This makes it possible to detect the presence of proteolytic enzymes in the sample. As described above, when FRET is used, two types of fluorescent proteins having different wavelengths of excitation light and emitting light in an excited state from one fluorescent protein serving as excitation light of the other fluorescent protein are used. Combinations are preferably used.
【００２０】本発明の標識化基質を用いたＨＩＶプロテ
アーゼ活性の検出は、ＨＩＶプロテアーゼ活性の検出対
象としての試料とこの標識化基質とを、ＨＩＶプロテア
ーゼ活性が有効に作用し得る条件下で反応させて、反応
の前と後での蛍光特性の変化を測定し、得られた測定値
に基づいて試料中のＨＩＶプロテアーゼの活性の有無、
あるいは活性の強度を求めることによって行うことがで
きる。この検出のための各操作自体については公知の方
法を利用することができる。In the detection of the HIV protease activity using the labeled substrate of the present invention, the sample to be detected for the HIV protease activity is reacted with the labeled substrate under conditions where the HIV protease activity can effectively act. Then, the change in the fluorescence characteristics before and after the reaction is measured, and based on the obtained measured value, the presence or absence of HIV protease activity in the sample,
Alternatively, it can be performed by determining the intensity of the activity. For each operation itself for this detection, a known method can be used.
【００２１】[0021]
【実施例】以下実施例により、ＨＩＶプロテアーゼ活性
の検出に有用な標識化基質の生産について詳述する。EXAMPLES The production of labeled substrates useful for detecting HIV protease activity will be described in detail in the following examples.
【００２２】実施例１ ＨＩＶプロテアーゼ活性の検出用基質として利用できる
ポリペプチド（タンパク質）、すなわちＨＩＶプロテア
ーゼによって認識され、その作用により切断され得るア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの遺伝子配列の設計
をするためには、ＨＩＶプロテアーゼ認識ペプチドのＮ
末側、Ｃ末側のそれぞれに標識（GFP、BFP）が配置され
るだけでなく、フォールディングしたタンパク質上にお
いてGFP、BFPが正しく折りたたまれ、かつＨＩＶプロテ
アーゼによって認識・切断される部分が、タンパク質表
面上に配置される必要がある。そこで、GFPの３次構造
(PDBデータバンク)とＨＩＶプロテアーゼ認識配列を元
にコンピュータモデリングの手法によりGFPのＣ末端、
ＨＩＶプロテアーゼ認識配列ペプチド、BFPのＮ末端が
スムーズなループ構造でつがるようにリンカーをつけた
ＨＩＶプロテアーゼ認識配列ペプチドを設計した（Gly-
Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr：配列番号
１）。さらに分子動力学計算によりこの融合タンパク質
の安定性を確かめた。Example 1 To design a gene sequence of a polypeptide (protein) that can be used as a substrate for detecting HIV protease activity, that is, a polypeptide containing an amino acid sequence that can be recognized by HIV protease and cleaved by its action. Contains the HIV protease recognition peptide N
Not only is the label (GFP, BFP) placed on the terminal side and C-terminal side, but also the GFP and BFP are correctly folded on the folded protein, and the part recognized and cleaved by HIV protease is located on the protein surface. Need to be placed on top. Therefore, the tertiary structure of GFP
(PDB data bank) and the C-terminus of GFP by computer modeling based on the HIV protease recognition sequence,
An HIV protease recognition sequence peptide was designed with a linker attached so that the N-terminus of the HIV protease recognition sequence peptide, BFP was connected with a smooth loop structure (Gly-
Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr: SEQ ID NO: 1). Furthermore, the stability of this fusion protein was confirmed by molecular dynamics calculations.
【００２３】BFP遺伝子を含むベクター「pEBFP」（クロ
ンテック社製）を鋳型とし、５’センスプライマー：5'
-CTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'（配列番号：２）と
３’アンチセンスプライマー：5'-GGATCCCGGGAAATTCAGG
GTGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCC-3'（配列番
号：３）を用いてＰＣＲを行った。具体的には１００μ
ｌの反応液中に１００ｎｇの「ｐＥＢＦＰ」、０．２μ
Ｍのプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．
５ｍＭのＭｇＣｌ2及び２．５Ｕの「Ｔａｋａｒａ Ｔ
ａｑ」（宝酒造）に対し「９５℃で１分、５５℃で２
分、７２℃で２分（最後のサイクルでは７２℃７分）」
の処理を３０サイクル行った。これにより得られたＰＣ
Ｒ産物をアガロースゲル電気泳動と「Ｓｕｐｒｅｃ０
１」（宝酒造）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物
を制限酵素「ＰｓｔＩ」、「ＢａｍＨＩ」（宝酒造）で
３７℃、３時間の切断処理を行った後、フェノール・ク
ロロホルム抽出とエタノール沈殿［村松、ラボマニュア
ル遺伝子工学、第２９−３３頁、丸善（１９９０）］に
よって精製した。得られた制限酵素切断ＰＣＲ産物を、
同じく制限酵素「Ｐｓｔ Ｉ」、「Ｂａｍ ＨＩ」（宝
酒造）で３７℃、３時間の切断処理、フェノール・クロ
ロホルム抽出、エタノール沈殿を行ったＧＦＰ遺伝子を
含むベクター「ｐＥＧＦＰ」（クロンテック社製）に
「Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（宝酒
造）を用いて挿入した。得られたプラスミドを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９コンピテントセル（宝酒造）に導入し、カナマ
イシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イー
ストエクストラクト、０．５％塩化ナトリウム、５０μ
ｇ／ｍｌカナマイシン）で３７℃、２０時間培養した。
カナマイシンに抵抗性を示す形質転換体の中からＥＧＦ
Ｐ、ＥＢＦＰおよびＨＩＶプロテアーゼ基質に対するコ
ーディングを含むクローンを選択、培養し、プラスミド
を抽出した。以上の結果得られたプラスミドの制限酵素
地図と作成手順を図１に示した。Using the vector “pEBFP” (manufactured by Clontech) containing the BFP gene as a template, a 5 ′ sense primer: 5 ′
-CTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3 '(SEQ ID NO: 2) and 3' antisense primer: 5'-GGATCCCGGGAAATTCAGG
PCR was performed using GTGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3). Specifically, 100μ
100 ng of “pEBFP”, 0.2 μl
M primers, 0.2 mM dNTPs, 10 mM T
ris-Cl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.
5 mM MgCl 2 and 2.5 U of Takara T
aq ”(Takara Shuzo) for 1 minute at 95 ° C, 2 minutes at 55 ° C
Minutes, 72 ° C for 2 minutes (72 ° C for 7 minutes in the last cycle) ”
Was performed for 30 cycles. PC obtained by this
The R product was subjected to agarose gel electrophoresis and “Suprec0
1 "(Takara Shuzo). After purifying the purified PCR product with restriction enzymes “PstI” and “BamHI” (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation [Muramatsu, Lab Manual Genetic Engineering, No. 29-33] Page, Maruzen (1990)]. The obtained restriction enzyme-cleaved PCR product is
Similarly, the vector "pEGFP" (manufactured by Clontech) containing the GFP gene, which had been digested with restriction enzymes "Pst I" and "Bam HI" (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours, extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol, was added to Takara Ligation Kit "(Takara Shuzo). The obtained plasmid was used for E. coli J
M109 competent cells (Takara Shuzo) were introduced, and LB medium containing kanamycin (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 50 μm)
g / ml kanamycin) at 37 ° C for 20 hours.
EGF from among transformants showing resistance to kanamycin
Clones containing coding for P, EBFP and HIV protease substrates were selected, cultured and plasmids were extracted. FIG. 1 shows a restriction enzyme map of the plasmid obtained as described above and a procedure for preparing the same.
【００２４】このプラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテントセル（宝酒造）に導入し、これを形質転換し
て、BFPとGFPとが末端に結合した標識化基質を大腸菌内
に生産させた。生産された標識化基質は、定法により菌
体から分離精製し、ＨＩＶプロテアーゼ活性の検出に好
適に利用可能であった。This plasmid was introduced into Escherichia coli JM109 competent cells (Takara Shuzo), which was transformed to produce a labeled substrate having BFP and GFP bound to the ends in Escherichia coli. The produced labeled substrate was separated and purified from cells by a conventional method, and could be suitably used for detecting HIV protease activity.
【００２５】[0025]
【発明の効果】本発明ではＨＩＶプロテアーゼ検出用の
基質の両端に、例えば蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の
供与体と受容体の組合せを形成し、かつ励起波長及び放
射波長の異なる２種の蛍光タンパク質を結合させた融合
タンパク質をコードする組換え遺伝子を作製し、この組
換え遺伝子を細菌等の微生物や、ヒトまたは動物由来の
各種培養細胞に導入し発現させることで、ＨＩＶプロテ
アーゼ検出の標識化基質の作製が容易になる。According to the present invention, for example, a combination of a donor and an acceptor for fluorescence resonance energy transfer (FRET) is formed at both ends of a substrate for detecting HIV protease, and two types of fluorescence having different excitation wavelengths and emission wavelengths are used. A recombinant gene encoding a fusion protein to which a protein is bound is prepared, and the recombinant gene is introduced into a microorganism such as a bacterium or various cultured cells derived from humans or animals to express the recombinant gene. Preparation of the substrate is facilitated.
【００２６】更に、上記のような蛍光共鳴エネルギー転
移(FRET)の供与体と受容体の組合せを形成する２種の蛍
光タンパク質を用いることで、信号の微妙な変化を検出
することが可能となる。Further, by using two kinds of fluorescent proteins forming a combination of a donor and an acceptor of the above-mentioned fluorescence resonance energy transfer (FRET), it becomes possible to detect a subtle change in a signal. .
【００２７】一方、検出対象試料が、この組換え遺伝子
を導入した細菌等の微生物や、ヒトまたは動物由来の培
養細胞を用いることにより、in vivoでのＨＩＶプロテ
アーゼ活性の検出において励起放射光の色変化評価を用
いて高精度化を達成できる。On the other hand, when a sample to be detected is a microorganism such as a bacterium into which the recombinant gene has been introduced, or a cultured cell derived from a human or animal, the color of the excitation radiation in the detection of HIV protease activity in vivo can be improved. Higher accuracy can be achieved using change evaluation.
【００２８】[0028]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>NEC Corporation <120>Substrate for detection of HIV protease and Expression vector there of <130>34103477 <160>3 <210>1 <211>11 <212>PRT <213>Artificial Sequence <400>1 Gly Thr Leu Asn Phe Pro Gly Ser Ile Ala Thr 1 5 10 <210>2 <211>15 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>2 ctgcagatgg tgagcaaggg cgagg 25 <210>3 <211>54 <212>PRT <213>Artificial Sequence <400>3 ggatcccggg aaattcaggg tgcccttgta cagctcgtcc atgccgagag tgatccc 57[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> NEC Corporation <120> Substrate for detection of HIV protease and Expression vector there of <130> 34103477 <160> 3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Gly Thr Leu Asn Phe Pro Gly Ser Ile Ala Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ctgcagatgg tgagcaaggg cgagg 25 <210> 3 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 ggatcccggg aaattcaggg tgcccttgta cagctcgtcc atgccgagag tgatccc 57
【図１】蛍光タンパク質によって標識したＨＩＶプロテ
アーゼに対する基質の発現用の組換えDNAの構造を示す
図である。FIG. 1 shows the structure of recombinant DNA for expression of a substrate for HIV protease labeled with a fluorescent protein.
１ 青色蛍光タンパク質BFPの遺伝子をもつベクターpEB
FP（4.7ｋｂ） ２ BFP遺伝子 ３ センスプライマー ４ アンチセンスプライマー ５ ＨＩＶプロテアーゼ切断配列を含む基質ペプチドを
コードするＤＮＡ配列 ６ 緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの遺伝子をもつベクター
pEGFP（4.7ｋｂ） ７ マルチクローニング部位 ８ ＧＦＰ遺伝子 ９ ＨＩＶプロテアーゼに対する基質発現用組換えベク
ター1. Vector pEB carrying the gene for the blue fluorescent protein BFP
FP (4.7 kb) 2 BFP gene 3 Sense primer 4 Antisense primer 5 DNA sequence encoding substrate peptide containing HIV protease cleavage sequence 6 Vector having green fluorescent protein GFP gene
pEGFP (4.7 kb) 7 Multicloning site 8 GFP gene 9 Recombinant vector for substrate expression for HIV protease
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/58 Ｚ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 金子 寛生 東京都港区芝五丁目７番１号 日本電気株 式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BB20 CB21 DA20 FA29 FB01 FB12 GC15 4B024 AA11 AA14 BA80 CA05 EA04 4B064 AG01 CA19 CC24 DA15 4H045 AA10 AA20 BA10 CA01 CA50 FA72 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 33/15 G01N 33/50 Z 33/50 33/58 Z 33/58 C12N 15/00 ZNAA // ( C12P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Hiroki Kaneko 5-7-1 Shiba, Minato-ku, Tokyo F-term in NEC Corporation (reference) 2G045 AA25 BB20 CB21 DA20 FA29 FB01 FB12 GC15 4B024 AA11 AA14 BA80 CA05 EA04 4B064 AG01 CA19 CC24 DA15 4H045 AA10 AA20 BA10 CA01 CA50 FA72 FA74
Claims (13)
該ＨＩＶプロテアーゼにより切断し得る切断部位を有す
るポリペプチドと、該ポリペプチドのアミノ末端とカル
ボキシ末端のそれぞれに結合した蛍光タンパク質とを有
し、前記ポリペプチドが前記切断部位から切断されるこ
とでこれらの蛍光タンパク質からの蛍光特性が変化する
ものであることを特徴とするＨＩＶプロテアーゼ用の標
識化基質。1. A substrate for an HIV protease, comprising:
A polypeptide having a cleavage site that can be cleaved by the HIV protease, and a fluorescent protein bound to each of the amino terminus and the carboxy terminus of the polypeptide, wherein the polypeptide is cleaved from the cleavage site. 3. A labeled substrate for HIV protease, wherein the fluorescent property of the fluorescent protein is changed.
Pro-Gly-Ser-Ile-Ala-Thrで示されるアミノ酸配列を有
する請求項１に記載の標識化基質。2. The cleavage site is Gly-Thr-Leu-Asn-Phe-
The labeled substrate according to claim 1, which has an amino acid sequence represented by Pro-Gly-Ser-Ile-Ala-Thr.
質と前記カルボキシ末端に結合した蛍光タンパク質は、
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の供与体と受容体の組合
せを形成し得るものである請求項１または２に記載の標
識化基質。3. The fluorescent protein bound to the amino terminus and the fluorescent protein bound to the carboxy terminus,
The labeled substrate according to claim 1 or 2, which is capable of forming a combination of a donor and an acceptor for fluorescence resonance energy transfer (FRET).
質と前記カルボキシ末端に結合した蛍光タンパク質は、
これら蛍光タンパク質の励起に必要な励起光の波長及び
励起状態での放射光の波長が異なるものである請求項１
〜３のいずれかに記載の標識化基質。4. The fluorescent protein bound to the amino terminus and the fluorescent protein bound to the carboxy terminus,
The wavelength of the excitation light necessary for exciting these fluorescent proteins and the wavelength of the emitted light in the excited state are different.
4. The labeled substrate according to any one of items 1 to 3.
質と前記カルボキシ末端に結合した蛍光タンパク質の一
方が、緑色蛍光タンパク質であり、他方が青色蛍光タン
パク質である請求項１〜４のいずれかに記載の標識化基
質。5. The fluorescent protein according to claim 1, wherein one of the fluorescent protein bound to the amino terminus and the fluorescent protein bound to the carboxy terminus is a green fluorescent protein and the other is a blue fluorescent protein. Labeled substrate.
かに記載の標識化基質をコードするＤＮＡ配列と、ベク
ター部分とを有し、該プロモーターに該ＤＮＡ配列が宿
主での発現可能に接続していることを特徴とするＨＩＶ
プロテアーゼ用標識化基質の発現用の組換えベクター。6. A promoter, a DNA sequence encoding the labeled substrate according to any one of claims 1 to 5, and a vector portion, wherein the DNA sequence is connected to the promoter so that the DNA sequence can be expressed in a host. HIV characterized by doing
Recombinant vector for expression of labeled substrates for proteases.
ターが微生物中で機能し得るものである請求項６に記載
の組換えベクター。7. The recombinant vector according to claim 6, wherein the host is a microorganism, and the promoter can function in the microorganism.
の組換えベクター。8. The recombinant vector according to claim 7, wherein the microorganism is a bacterium.
ーターが真核細胞中で機能し得るものである請求項６に
記載の組換えベクター。9. The recombinant vector according to claim 6, wherein said host is a eukaryotic cell, and said promoter is capable of functioning in a eukaryotic cell.
えベクターを宿主に導入して形質転換し、得られた形質
転換体を培養して該形質転換体に該組換えベクター中に
コードされた標識化基質を生産させる工程を有すること
を特徴とする標識化基質の製造方法。10. Transformation by introducing the recombinant vector according to any one of claims 6 to 9 into a host, culturing the obtained transformant and adding the transformant into the recombinant vector. A method for producing a labeled substrate, comprising the step of producing an encoded labeled substrate.
ミノ酸配列としてGly-Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Gly-Ser-Il
e-Ala-Thrを有することを特徴とするＨＩＶプロテアー
ゼ切断配列ペプチド。11. An amino acid sequence that can be cleaved by HIV protease, Gly-Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Gly-Ser-Il.
An HIV protease cleavage sequence peptide having e-Ala-Thr.
出する方法であって、試料と請求項１〜５のいずれかに
記載の標識化基質とを反応させて、該標識化基質の有す
るタンパク質分解酵素による切断部位からの切断による
蛍光タンパク質からの蛍光特性の変化をＨＩＶプロテア
ーゼ活性として検出することを特徴とするＨＩＶプロテ
アーゼ活性の検出方法。12. A method for detecting HIV protease activity in a sample, comprising reacting the sample with the labeled substrate according to any one of claims 1 to 5, and proteolytic enzyme possessed by the labeled substrate. A method for detecting HIV protease activity, comprising detecting, as HIV protease activity, a change in fluorescence properties from a fluorescent protein due to cleavage from a cleavage site by HIV.
り、請求項６〜９のいずれかに記載の組換えベクターを
該試料中に導入して、該試料中で該組換えベクターの有
する標識化基質をコードするＤＮＡ配列を発現させて産
生される標識化基質を用いて試料中のタンパク質分解酵
素活性を検出する請求項１２に記載の検出方法。13. The sample is a microorganism or a eukaryotic cell, and the recombinant vector according to claim 6 is introduced into the sample, and a label of the recombinant vector in the sample is obtained. 13. The detection method according to claim 12, wherein the proteolytic enzyme activity in the sample is detected using a labeled substrate produced by expressing a DNA sequence encoding a labeled substrate.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11186573A JP2001011100A (en) | 1999-06-30 | 1999-06-30 | Substrate for detection of hiv protease and expression vector therefor |
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| JP (1) | JP2001011100A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8071167B2 (en) | 2002-06-14 | 2011-12-06 | Applied Materials, Inc. | Surface pre-treatment for enhancement of nucleation of high dielectric constant materials |
| CN112683867A (en) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 复旦大学附属中山医院 | Method for detecting depigmentin D on living cells in real time and application thereof |
-
1999
- 1999-06-30 JP JP11186573A patent/JP2001011100A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8071167B2 (en) | 2002-06-14 | 2011-12-06 | Applied Materials, Inc. | Surface pre-treatment for enhancement of nucleation of high dielectric constant materials |
| CN112683867A (en) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 复旦大学附属中山医院 | Method for detecting depigmentin D on living cells in real time and application thereof |
| CN112683867B (en) * | 2020-12-21 | 2023-08-04 | 复旦大学附属中山医院 | Method for detecting mesothelin D on living cells in real time and application thereof |
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