JP2001004627A - Immunological detection method for autoantibody against maillard reaction latter-period product - Google Patents
Immunological detection method for autoantibody against maillard reaction latter-period productInfo
- Publication number
- JP2001004627A JP2001004627A JP2000074398A JP2000074398A JP2001004627A JP 2001004627 A JP2001004627 A JP 2001004627A JP 2000074398 A JP2000074398 A JP 2000074398A JP 2000074398 A JP2000074398 A JP 2000074398A JP 2001004627 A JP2001004627 A JP 2001004627A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- age
- antibody
- late
- maillard
- product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、メイラード反応後
期生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅ
ｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；以下、「ＡＧＥ」と略す）に
対する自己抗体を免疫学的に測定して検出する方法に関
する。さらに、本発明は、ＡＧＥに対する自己抗体の測
定による、ＡＧＥの生成および蓄積が関与する糖尿病、
糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患
等の検査方法、その検査用キット、検査用試薬ならびに
ＡＧＥの生成および蓄積が関与する疾患治療薬の薬効評
価方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a late product of the Maillard reaction (Advanced Glycation E).
and AGEs (hereinafter referred to as “AGE”). In addition, the present invention relates to diabetes, which involves the generation and accumulation of AGE, by measuring autoantibodies to AGE,
The present invention relates to a method for testing diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging, a kit for testing the same, a reagent for testing, and a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease involving generation and accumulation of AGE.
【０００２】[0002]
【従来の技術】メイラード反応は、ブドウ糖などの還元
糖によるタンパク質の非酵素的糖化反応（Ｍａｉｌｌａ
ｒｄ，Ｌ．Ｃ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１５４；６６−６
８（１９１２））であり、近年、生体内におけるメイラ
ード反応が糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症および老化
に伴う疾患など種々の疾患の発症要因の１つであること
が明らかにされた。2. Description of the Related Art The Maillard reaction is a non-enzymatic saccharification reaction of proteins with reducing sugars such as glucose (Mailla).
rd, L .; C. , Acad. Sci. 154; 66-6
8 (1912)), and in recent years, it has been revealed that the Maillard reaction in vivo is one of the causes of various diseases such as diabetic complications, non-diabetic nephropathy, and diseases associated with aging.
【０００３】メイラード反応は、大きく前期反応と後期
反応の二段階に分けられている。前期段階反応では、タ
ンパク質のアミノ基と還元糖との反応によりアマドリ転
位生成物（前期反応生成物）が可逆的に生成される。生
体内における前期反応生成物として、ヘモグロビンＡｌ
ｃおよびフルクトサミン（糖化アルブミン）が知られて
おり、糖尿病における臨床マーカーとして用いられてい
る。後期段階では、酸化・脱水・重合・開裂などの複雑
な反応を経てＡＧＥと呼ばれる後期反応生成物が不可逆
的に生成される。ＡＧＥの特徴として褐色変化、蛍光
性、あるいは分子内・分子間架橋形成などが挙げられて
いる。ＡＧＥの構造として、ピラリン、ペントシジン、
クロスリン、Ｘ１、イミダゾロン、およびカルボキシメ
チルリジンなどが提唱されているが、これら以外にも未
知の構造が存在していると考えられている。[0003] The Maillard reaction is roughly divided into two stages, an early stage reaction and a late stage reaction. In the first-stage reaction, an Amadori rearrangement product (first-stage reaction product) is reversibly generated by the reaction between the amino group of the protein and the reducing sugar. Hemoglobin Al as a pre-reaction product in vivo
c and fructosamine (glycated albumin) are known and used as clinical markers in diabetes. In the late stage, a late reaction product called AGE is irreversibly generated through a complex reaction such as oxidation, dehydration, polymerization, and cleavage. The features of AGE include browning, fluorescence, and intra- and intermolecular cross-link formation. As the structure of AGE, pyralin, pentosidine,
Crosulin, X1, imidazolone, carboxymethyl lysine, and the like have been proposed, but it is thought that unknown structures other than these exist.
【０００４】メイラード反応は、健常人でも見られる現
象であるが、糖尿病のような高血糖状態が持続する場合
や、腎臓疾患のようなクリアランスの低下が認められる
場合、あるいは加齢により、代謝速度の遅いタンパク質
にＡＧＥが蓄積されることが報告されている。[0004] The Maillard reaction is a phenomenon that is observed even in healthy individuals, but when a hyperglycemic state such as diabetes persists, when clearance such as kidney disease is reduced, or when aging, the metabolic rate increases. It has been reported that AGE accumulates in late proteins.
【０００５】生体内でのＡＧＥの生成が報告されている
タンパク質として、ヘモグロビン、アルブミン、皮膚や
血管壁等の結合組織のコラーゲンやエラスチン、腎臓の
糸球体基底膜、神経ミエリン、眼球クリスタリンなどが
あり、これらのタンパク質がメイラード反応を受けるこ
とによって、タンパク質の変性、機能低下および異常を
もたらし、血管系の障害、腎症、神経障害、網膜症およ
び白内障などの糖尿病性合併症や老化に伴う疾患を引き
起こす原因の１つと考えられている（Ｈａｒｄｉｎｇ，
Ｊ．，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．，３７；２４７−
３３４（１９８５））。[0005] Proteins reported to produce AGE in vivo include hemoglobin, albumin, collagen and elastin in connective tissues such as skin and blood vessel walls, glomerular basement membrane of kidney, myelin nerve, and crystallin of eyeball. These proteins undergo the Maillard reaction, which causes protein denaturation, loss of function, and abnormalities, causing diabetic complications such as vascular disorders, nephropathy, neuropathy, retinopathy, and cataracts, and diseases associated with aging. It is believed to be one of the causes (Harding,
J. , Adv. Prot. Chem. , 37; 247-
334 (1985)).
【０００６】したがって、早期にＡＧＥの生成および蓄
積を把握することは、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿
病性腎症ならびに老化に伴う疾患などの予防および治療
に対して極めて有効であると考えられている。ＡＧＥ量
の測定は、当初、蛍光強度（Ｐ．Ａ．Ｆｉｎｏｔ，Ｉｎ
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ．Ｒ．Ｅ．Ｆｅｅｎｙ ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｈｉｔａ
ｋｅｒ ｅｄｉｔｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．
Ｃ．１９８：９１−１２４（１９８２））を用いて行わ
れていたが、近年、主に抗メイラード反応後期生成物抗
体（以下、「抗ＡＧＥ抗体」という）を用いた抗原抗体
反応により行われている。また、臨床検査で用いられる
方法として、血液中のヘモグロビンあるいはアルブミン
中のＡＧＥ量を抗ＡＧＥ抗体で測定する方法が報告され
ている（特開平７−５０２５３４、特開平９−１７８４
０、特開平９−２５７７９２）。[0006] Therefore, grasping the generation and accumulation of AGE at an early stage is considered to be extremely effective for prevention and treatment of diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy and diseases associated with aging. ing. The measurement of the AGE amount is based on the fluorescence intensity (PA Finot, In
Modification of Protein
s. R. E. FIG. Feney and J.M. R. White
ker edited. , American Chemi
cal Society, Washington, D.C.
C. 198 : 91-124 (1982)), but in recent years, it has been performed mainly by an antigen-antibody reaction using an anti-Maillard reaction late product antibody (hereinafter, referred to as "anti-AGE antibody"). . As a method used in a clinical test, a method of measuring the amount of AGE in hemoglobin or albumin in blood with an anti-AGE antibody has been reported (JP-A-7-502534, JP-A-9-1784).
0, JP-A-9-257792).
【０００７】しかし、血中ヘモグロビンやアルブミン中
のＡＧＥ量を測定しても、これらのタンパク質は、代謝
回転が比較的速いため、臓器中に蓄積している代謝回転
の遅いタンパク質中のＡＧＥの存在を知ることは困難で
ある。また、測定の意義として、ヘモグロビンＡｌｃと
糖化アルブミンとの違いも不明瞭である。その上、血中
ヘモグロビンやアルブミン中のＡＧＥ量は、血糖コント
ロールや血液透析などの影響を受けやすい。However, even when the amount of AGE in blood hemoglobin or albumin is measured, the turnover of these proteins is relatively fast, and the presence of AGE in the slow turnover proteins accumulated in the organs is present. It is difficult to know. Further, as a significance of the measurement, the difference between hemoglobin Alc and glycated albumin is not clear. In addition, the amount of AGE in blood hemoglobin and albumin is easily affected by blood sugar control and hemodialysis.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】以上の問題点に鑑み、
本発明は、臨床検査に多用されている血漿または血清を
用いて、実際には摘出検査が困難な臓器中のＡＧＥの存
在を知ることを目的とする。このようなＡＧＥの存在を
知るために、本発明は血液または血清中の、ＡＧＥに対
する自己抗体の測定方法を提供し、さらに、ＡＧＥの生
成および蓄積が関与する、糖尿病、糖尿病性合併症、非
糖尿病性腎症または老化に伴う疾患などに対して、この
自己抗体を新規臨床マーカーとした検査方法を提供す
る。また、ＡＧＥの生成・蓄積量を知るための検査用試
薬、検査用キットを提供する。さらにまた、糖尿病、糖
尿病性合併症、非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患の
治療薬の薬効評価方法を提供する。In view of the above problems,
An object of the present invention is to use plasma or serum frequently used in clinical tests to determine the presence of AGE in an organ that is actually difficult to perform a resection test. In order to know the presence of such AGEs, the present invention provides a method for measuring autoantibodies to AGEs in blood or serum, and furthermore, diabetes, diabetic complications, non-diabetic complications involving the generation and accumulation of AGEs. The present invention provides a test method using this autoantibody as a novel clinical marker for diabetic nephropathy or diseases associated with aging. Further, the present invention provides a test reagent and a test kit for knowing the amount of AGE generated and accumulated. Furthermore, the present invention provides a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy, or diseases associated with aging.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、以
下の発明を包含する。 （１）メイラード反応後期生成物に対する自己抗体を免
疫学的測定法により検出する方法。 （２）該自己抗体が、メイラード反応後期生成物におけ
るN−カルボキシメチルリジン以外をエピトープとして
認識する、1項に記載の方法。 （３）該自己抗体が、N−カルボキシエチルリジンをエ
ピトープとして認識する、1項に記載の方法。That is, the present invention includes the following inventions. (1) A method for detecting an autoantibody to the late product of the Maillard reaction by an immunological assay. (2) The method according to (1), wherein the autoantibody recognizes an epitope other than N-carboxymethyllysine in the late product of the Maillard reaction as an epitope. (3) The method according to item 1, wherein the autoantibody recognizes N-carboxyethyllysine as an epitope.
【００１０】（４）該免疫学的測定法が、標識構造体を
用いた標識免疫学的測定法である、1〜3項のいずれかに
記載の方法。 （５）標識構造体が、標識されたメイラード反応後期生
成物、抗メイラード反応後期生成物抗体または抗免疫グ
ロブリン抗体である、4項に記載の方法。 （６）該標識が、酵素、放射性同位体、蛍光化合物およ
び化学発光化合物から選ばれる、4または５項に記載の
方法。(4) The method according to any one of items 1 to 3, wherein the immunological assay is a labeled immunoassay using a labeled structure. (5) The method according to item 4, wherein the labeled structure is a labeled Maillard reaction late product, anti-Maillard reaction late product antibody or anti-immunoglobulin antibody. (6) The method according to (4) or (5), wherein the label is selected from an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound and a chemiluminescent compound.
【００１１】（７）メイラード反応後期生成物に対する
自己抗体を免疫学的測定法により検出する工程と、検出
された自己抗体の抗体価を健常人の自己抗体の抗体価と
比較する工程とを含む、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖
尿病性腎症または老化に伴う疾患の検査方法。 （８）少なくとも、検体用希釈液およびメイラード反応
後期生成物を含む、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病
性腎症または老化に伴う疾患の検査用キット。(7) a step of detecting an autoantibody to the late product of the Maillard reaction by an immunoassay, and a step of comparing the antibody titer of the detected autoantibody with the antibody titer of a healthy human autoantibody. , Diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or aging related diseases. (8) A kit for testing diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or a disease associated with aging, comprising at least a sample diluent and a late product of the Maillard reaction.
【００１２】（９）標識されたメイラード反応後期生成
物、標識された抗メイラード反応後期生成物抗体または
標識された抗免疫グロブリン抗体をさらに含む、８項に
記載の検査用キット。 （１０）メイラード反応後期生成物、抗メイラード反応
後期生成物イディオタイプ抗体または抗メイラード反応
後期生成物抗体を固相化するための固相をさらに含む、
８または９項に記載の検査用キット。(9) The test kit according to item 8, further comprising a labeled late Maillard reaction late product, a labeled anti-Maillard late reaction product antibody or a labeled anti-immunoglobulin antibody. (10) further comprising a solid phase for immobilizing a Maillard reaction late product, an anti-Maillard reaction late product idiotype antibody or an anti-Maillard reaction late product antibody;
Item 10. The test kit according to item 8 or 9.
【００１３】（１１）メイラード反応後期生成物、標識
されたメイラード反応後期生成物、抗メイラード反応後
期生成物イディオタイプ抗体、抗メイラード反応後期生
成物抗体、標識された抗メイラード反応後期生成物抗体
および標識された抗免疫グロブリン抗体から選ばれる１
以上を含む、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症
または老化に伴う疾患の検査用試薬(11) Maillard reaction late product, labeled Maillard reaction late product, anti-Maillard reaction late product idiotype antibody, anti-Maillard reaction late product antibody, labeled anti-Maillard reaction late product antibody and 1 selected from labeled anti-immunoglobulin antibodies
Including the above, reagents for testing diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging
【００１４】（１２） 糖尿病、糖尿病性合併症、非糖
尿病性腎症または老化に伴う疾患の治療薬を投与したヒ
トを含む動物の血漿または血清中の、メイラード反応後
期生成物に対する自己抗体を免疫学的測定法により測定
し、これと治療薬を投与しないヒトを含む動物の血漿ま
たは血清中の、メイラード反応後期生成物に対する自己
抗体を免疫学的測定法により測定し、上記２つの測定値
を比較して評価することからなる、糖尿病、糖尿病性合
併症、非糖尿病性腎症またはは老化に伴う疾患の治療薬
の薬効評価方法。(12) Immunization of autoantibodies against the late product of the Maillard reaction in plasma or serum of animals, including humans, administered with a therapeutic agent for diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging. And autoantibodies against the late product of the Maillard reaction in plasma or serum of animals including humans to which no therapeutic agent is administered are measured by immunoassay, and the above two measured values are measured. A method for evaluating the efficacy of a drug for treating diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy, or a disease associated with aging, comprising comparing and evaluating.
【００１５】上記したとおり、本発明では、生体試料中
に存在するＡＧＥに対する自己抗体を免疫学的測定法に
より検出して測定する。上記自己抗体は、ＡＧＥにおけ
るＮ−カルボキシメチルリジン以外のエピトープを認識
するものであることが好ましく、Ｎ−カルボキシエチル
リジンをエピトープとして認識するものであることがさ
らに好ましい。As described above, in the present invention, an autoantibody against AGE present in a biological sample is detected and measured by an immunoassay. The autoantibody preferably recognizes an epitope other than N-carboxymethyllysine in AGE, and more preferably recognizes N-carboxyethyllysine as an epitope.
【００１６】また、上記免疫学的測定法は、標識免疫測
定法が好ましく、またこの場合、自己抗体に対して反応
性を有する標識構造体としては、ＡＧＥ、抗ＡＧＥ抗体
または抗免疫グロブリン抗体であることが好ましく、上
記標識は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、および化
学発光化合物から選ばれるものであることが好ましい。The immunoassay is preferably a labeled immunoassay. In this case, the labeled structure having reactivity with an autoantibody may be AGE, anti-AGE antibody or anti-immunoglobulin antibody. Preferably, the label is selected from an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, and a chemiluminescent compound.
【００１７】本発明はまた、ＡＧＥに対する自己抗体を
免疫学的測定法により検出する工程と、検出された抗体
価を健常人の抗体価と比較する工程とを含む、糖尿病、
糖尿病合併症、非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患の
検査方法に関する。上記自己抗体は、ＡＧＥにおけるＮ
−カルボキシメチルリジン以外のエピトープを認識する
ものであることが好ましく、Ｎ−カルボキシエチルリジ
ンを認識するものであることがさらに好ましい。The present invention also provides a method for treating diabetes, comprising the steps of detecting an autoantibody against AGE by immunoassay and comparing the detected antibody titer with the antibody titer of a healthy subject.
The present invention relates to a method for testing diabetic complications, non-diabetic nephropathy, or diseases associated with aging. The autoantibodies are identified by N in AGE.
Preferably, it recognizes an epitope other than -carboxymethyllysine, and more preferably, it recognizes N-carboxyethyllysine.
【００１８】上記免疫学的測定法としては、標識免疫測
定法が好ましく、またこの場合、自己抗体に対して反応
性を有する標識構造体は、ＡＧＥ、抗ＡＧＥ抗体または
抗免疫グロブリン抗体であることが好ましい。また、上
記標識は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物および化学
発光化合物から選ばれることが好ましい。As the above immunoassay, a labeled immunoassay is preferable. In this case, the labeled structure having reactivity with an autoantibody is AGE, anti-AGE antibody or anti-immunoglobulin antibody. Is preferred. The label is preferably selected from an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound and a chemiluminescent compound.
【００１９】本発明はまた、少なくとも、生体試料用希
釈液と、ＡＧＥとを含む、糖尿病、糖尿病合併症、非糖
尿病性腎症あるいは老化に伴う疾患の検査用キットに関
する。上記キットは、標識されたＡＧＥ、標識された抗
ＡＧＥ抗体あるいは標識された抗免疫グロブリン抗体の
いずれかをさらに含むことが好ましい。また、上記キッ
トは、ＡＧＥ、抗ＡＧＥイディオタイプ抗体あるいは抗
ＡＧＥ抗体を固定化する固相を更に含むことができる。The present invention also relates to a kit for testing diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or a disease associated with aging, comprising at least a diluent for a biological sample and AGE. It is preferable that the kit further includes a labeled AGE, a labeled anti-AGE antibody or a labeled anti-immunoglobulin antibody. Further, the kit may further include a solid phase for immobilizing AGE, anti-AGE idiotype antibody, or anti-AGE antibody.
【００２０】本発明はさらにまた、ＡＧＥ、標識された
ＡＧＥ、標識された抗免疫グロブリン抗体、抗ＡＧＥイ
ディオタイプ抗体、抗ＡＧＥ抗体、標識された抗ＡＧＥ
抗体を含む糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症ま
たは老化に伴う疾患の検査用試薬に関する。上記標識
は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物および化学発光化
合物から選ばれるものであることが好ましい。The present invention further relates to AGEs, labeled AGEs, labeled anti-immunoglobulin antibodies, anti-AGE idiotype antibodies, anti-AGE antibodies, labeled anti-AGE
The present invention relates to a reagent for testing diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or a disease associated with aging, including an antibody. The label is preferably selected from enzymes, radioisotopes, fluorescent compounds and chemiluminescent compounds.
【００２１】本発明はさらにまた、糖尿病、糖尿病性合
併症、非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患の治療薬を
投与したヒトを含む動物の血漿または血清中の、メイラ
ード反応後期生成物に対する自己抗体を免疫学的測定法
により測定し、これと治療薬を投与しないヒトを含む動
物の血漿または血清中の、メイラード反応後期生成物に
対する自己抗体を免疫学的測定法により測定し、上記２
つの測定値を比較して評価することからなる、糖尿病、
糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症またはは老化に伴う疾
患の治療薬の薬効評価方法に関する。[0021] The present invention further relates to the autologous reaction to the late product of the Maillard reaction in the plasma or serum of animals, including humans, administered drugs for treating diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging. The antibody was measured by immunoassay, and the autoantibody against the Maillard reaction late product in the plasma or serum of animals including humans to which no therapeutic agent was administered was measured by immunoassay.
Diabetes, which consists of comparing and evaluating two measurements
The present invention relates to a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging.
【００２２】[0022]
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本明細書において、「ＡＧＥ」とは、アミノ化合物
とカルボニル化合物のメイラード反応によって生成する
構造体をいう。アミノ化合物としては、アミン、アミノ
酸、ペプチド、タンパク質、核酸の塩基などが挙げら
れ、またカルボニル化合物としては、還元糖、脂質およ
びこれらから生成するアルデヒド、ケトン、その他ポリ
フェノール、アスコルビン酸、ステロイド等が挙げられ
る。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail. In this specification, "AGE" refers to a structure formed by a Maillard reaction between an amino compound and a carbonyl compound. Examples of the amino compound include amines, amino acids, peptides, proteins, bases of nucleic acids, and the like. Examples of the carbonyl compound include reducing sugars, lipids, and aldehydes, ketones, and other polyphenols, ascorbic acid, and steroids generated from these. Can be
【００２３】メイラード反応を受けている生体タンパク
質は、カルモジュリン、ヘモグロビン（Ａｌａ １、Ａ
ｌａ ２、Ａｌｃ、ＡＯ、Ｓ）、水晶体のクリスタリ
ン、筋繊維タンパク質、チューブリンなどの細胞内タン
パク質、アルブミン、アンチトロンビンIII 、フェリチ
ン、リポタンパク質、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）など
の血漿タンパク質、インスリン、甲状腺ホルモンなどの
ホルモン、皮膚、腱、大動脈、糸球体基底膜などのコラ
ーゲン、毛髪、爪などの角質層、尿中ペプチド、骨中の
オステオカルシン、アルコールデヒドロゲナーゼ、カテ
プシンＢ、リゾチーム等の酵素、赤血球グルコーストラ
ンスポーター、赤血球スペクトリン、赤血球膜タンパク
質などの細胞膜タンパク質などが例示される。Biological proteins undergoing the Maillard reaction include calmodulin and hemoglobin (Ala1, A
la2, Alc, AO, S), crystalline cells of the lens, intracellular proteins such as muscle fiber proteins, tubulin, albumin, antithrombin III, ferritin, lipoproteins, plasma proteins such as immunoglobulin G (IgG), insulin, Hormones such as thyroid hormone, collagen such as skin, tendon, aorta, glomerular basement membrane, stratum corneum such as hair and nail, urinary peptide, bone osteocalcin, alcohol dehydrogenase, enzymes such as cathepsin B and lysozyme, erythrocyte glucose Examples thereof include transporters, erythrocyte spectrin, and cell membrane proteins such as erythrocyte membrane proteins.
【００２４】これらのタンパク質の糖化は、糖尿病など
の生活習慣や老化の成因に強く関連していることが明ら
かにされつつある。図１にアルドースとタンパク質との
メイラード反応の反応経路を示す。タンパク質の関与す
るメイラード反応は、図１のように進行するが、この反
応経路の中でアマドリ転移生成物までを前期段階（また
は初期段階）、それ以降を後期段階として区別してい
る。生体内におけるメイラード反応前期段階で生成され
る物質を「メイラード反応前期段階生成物」という。メ
イラード反応前期段階生成物の１つとして、ヘモグロビ
ンβ鎖のＮ末端のバリンにグルコースがアマドリ型とし
て結合した糖化タンパク質であるヘモグロビンＡｌｃ
（ＨｂＡｌｃ）が知られている。ＨｂＡｌｃの含量は血
糖値をよく反映するので、現在、臨床検査によく用いら
れており、また、糖尿病患者の場合には、アマドリ転位
生成物のレベルが健常人の場合と比べて２〜４倍に増大
することが報告されている。It is becoming clear that saccharification of these proteins is strongly related to lifestyle such as diabetes and the cause of aging. FIG. 1 shows the reaction route of the Maillard reaction between aldose and protein. The Maillard reaction involving proteins proceeds as shown in FIG. 1. In this reaction path, up to the Amadori transfer product is distinguished as an early stage (or an early stage), and subsequent stages are distinguished as a late stage. The substance produced in the early stage of the Maillard reaction in the living body is referred to as “the early stage product of the Maillard reaction”. One of the products of the early stage of the Maillard reaction is hemoglobin Alc, a glycated protein in which glucose is bonded to the valine at the N-terminal of the hemoglobin β chain in an Amadori form.
(HbAlc) is known. Since the HbAlc content reflects the blood glucose level well, it is currently used in clinical examinations. In the case of diabetic patients, the level of the Amadori transposition product is 2 to 4 times that in a healthy person. Is reported to increase.
【００２５】図１に示すタンパク質のメイラード反応が
後期段階に進むと、タンパク質のＮ末端のアミノ基のほ
かに、ε−リジン残基でメイラード反応が起こるほか
に、アルギニン残基、トリプトファン残基の損傷が顕著
に起こり、褐変、蛍光の発生、架橋形成などの現象が見
られる。特に、代謝回転の遅い生体タンパク質、例えば
コラーゲンや水晶体のクリスタリンなどには後期段階の
メイラード反応が起こっていることが証明されている。When the Maillard reaction of the protein shown in FIG. 1 proceeds to a later stage, in addition to the N-terminal amino group of the protein, a Maillard reaction occurs not only at the ε-lysine residue but also at the arginine residue and the tryptophan residue. Damage occurs remarkably, and phenomena such as browning, generation of fluorescence, and cross-linking are observed. In particular, it has been proved that a late stage Maillard reaction has occurred in biological proteins having a slow turnover, such as collagen and crystallin in the lens.
【００２６】ＡＧＥは単一の化合物ではなく、リジンの
ε−アミノ基がピロールアルデヒドで修飾されたリジル
ピラリン、リジン残基とアルギニン残基とがペントース
を介して架橋したイミダゾピリジニウム環を形成してい
るペントシジン、グルコース２分子とリジン２分子とか
らなる架橋生成物であるクロスリン、その他Ｘ１、イミ
ダゾロン化合物，カルボキシメチルリジン等が混合した
ものである。AGE is not a single compound but forms an imidazopyridinium ring in which lysylpyraline in which the ε-amino group of lysine is modified with pyrrolealdehyde, and a lysine residue and an arginine residue are crosslinked via pentose. Pentosidine, a cross-linked product composed of two molecules of glucose and two molecules of lysine, a mixture of X1, an imidazolone compound, carboxymethyl lysine, and the like.
【００２７】本明細書中において「生体試料」とは、ヒ
トまたは動物から単離した各種の組織および体液をい
う。各種の組織としては、腎臓、肝臓、眼球などの各種
の臓器から得られる組織、動脈、静脈等の脈管、坐骨神
経や末梢神経などの神経組織、および血液などが例示さ
れるが、これらに限定されるものではない。As used herein, the term "biological sample" refers to various tissues and body fluids isolated from humans or animals. Examples of various tissues include tissues obtained from various organs such as kidney, liver and eyeball, vessels such as arteries and veins, nerve tissues such as sciatic nerve and peripheral nerve, and blood. It is not limited.
【００２８】メイラード反応はブドウ糖などの還元糖に
よるタンパク質の非酵素的糖化反応であり、糖尿病性合
併症や老化に起因する疾患などの発症要因の１つである
ことから、こうした疾病の発症時に病変が顕著に見られ
る、腎臓、水晶体、大動脈、坐骨神経等の各種の組織、
および血液を生体試料として好適に使用することができ
る。生体試料中において自己抗体を検出するためのＡＧ
Ｅは、以下のようにして作製することができる。The Maillard reaction is a non-enzymatic saccharification reaction of proteins caused by reducing sugars such as glucose, and is one of the onset factors such as diabetic complications and diseases caused by aging. Various tissues such as kidney, lens, aorta, sciatic nerve,
And blood can be suitably used as a biological sample. AG for detecting autoantibodies in biological samples
E can be produced as follows.
【００２９】メイラード反応後期生成物を得るために
は、上述のようにアミノ化合物とカルボニル化合物とが
必要である。アミノ化合物としては、アルブミン、ヘモ
グロビンなどの単純タンパク質、コラーゲンなどの糖タ
ンパク質、リンタンパク質、リポタンパク質、金属タン
パク質などの複合タンパク質あるいはリジンを有するペ
プチド等を使用することができる。また、カルボニル化
合物としては、グルコース等のアルドース、フルクトー
ス等のケトース、デオキシグルコース等のデオキシ糖、
グルコサミン等のアミノ糖、グルクロン酸等のウロン
酸、オリゴ糖等の糖類のほか、グリオキシル酸などのア
ルデヒド化合物、ピルビン酸などのケト化合物、アスコ
ルビン酸などを利用できる。In order to obtain the late product of the Maillard reaction, an amino compound and a carbonyl compound are required as described above. Examples of the amino compound include simple proteins such as albumin and hemoglobin, glycoproteins such as collagen, complex proteins such as phosphoproteins, lipoproteins, and metalloproteins, and peptides having lysine. Further, as the carbonyl compound, aldose such as glucose, ketose such as fructose, deoxy sugar such as deoxyglucose,
In addition to amino sugars such as glucosamine, uronic acids such as glucuronic acid, and sugars such as oligosaccharides, aldehyde compounds such as glyoxylic acid, keto compounds such as pyruvic acid, and ascorbic acid can be used.
【００３０】例えば、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳ
Ａ」という）とグルコースを使用して、ＡＧＥ化ウシ血
清アルブミン（以下「ＡＧＥ−ＢＳＡ」という）を得る
場合、ＢＳＡを、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液にグ
ルコースとともに溶解して滅菌し、この溶液を、無菌状
態にて数十日間、好ましくは５０〜１２０日の間、所定
の温度、好ましくは約３７℃でインキュベーションす
る。For example, bovine serum albumin (hereinafter “BS”)
A)) and glucose to obtain AGE-modified bovine serum albumin (hereinafter referred to as “AGE-BSA”), BSA is dissolved in, for example, sodium phosphate buffer together with glucose and sterilized. Is incubated under sterile conditions for several tens of days, preferably 50 to 120 days, at a predetermined temperature, preferably about 37 ° C.
【００３１】また、ＢＳＡとグリオキシル酸を使用して
Ｎ−カルボキシメチルリジン化ＢＳＡ（以下「ＣＭＬ−
ＢＳＡ」という）を得る場合、ＢＳＡを例えば、リン酸
ナトリウム緩衝液にグリオキシル酸と共に溶解して、水
素化ホウ素ナトリウムあるいは水素化シアノホウ素ナト
リウム存在下で、この溶液を所定の温度および時間、好
ましくは約３７℃で２４時間インキュベーションする。Further, N-carboxymethyllysinated BSA (hereinafter referred to as “CML-
BSA ") is obtained by dissolving BSA together with glyoxylic acid in, for example, a sodium phosphate buffer, and in the presence of sodium borohydride or sodium cyanoborohydride, the solution is subjected to a predetermined temperature and time, preferably Incubate at about 37 ° C. for 24 hours.
【００３２】また、ＢＳＡとピルビン酸ナトリウムを使
用してＮ−カルボキシエチルリジン化ＢＳＡ（以下「Ｃ
ＥＬ−ＢＳＡ」という）を得る場合、ＢＳＡを例えば、
リン酸ナトリウム緩衝液にピルビン酸ナトリウムと共に
溶解して、水素化ホウ素ナトリウムあるいは水素化シア
ノホウ素ナトリウム存在下で、この溶液を所定の温度及
び時間、好ましくは約３７℃で２４時間インキュベーシ
ョンする。Further, using BSA and sodium pyruvate, N-carboxyethyl lysinated BSA (hereinafter referred to as "C
EL-BSA "), the BSA is, for example,
This solution is dissolved in sodium phosphate buffer together with sodium pyruvate, and the solution is incubated at a predetermined temperature and time, preferably at about 37 ° C. for 24 hours in the presence of sodium borohydride or sodium cyanoborohydride.
【００３３】カルボキシエチルリジン（ＣＥＬ）は、リ
ン酸緩衝液に溶解したＮα−フォルミルリジンとリン酸
緩衝液に溶解したヨウ化酢酸とを、例えば、室温で約４
０時間インキュベーションすることにより得ることがで
きる。未反応のヨウ化酢酸をアンモニア水で除き、つい
で終夜インキュベーションする。この反応液を、例え
ば、Ｄｏｗｅｘ１−Ｘ８アセテートカラムにアプライし
てリン酸およびヨードを除去し、吸着画分を酢酸で溶出
する。溶出画分を濃縮し、塩酸で脱フォルミル化する。Carboxyethyl lysine (CEL) is obtained by mixing Nα-formyl lysine dissolved in a phosphate buffer and acetic acid iodide dissolved in a phosphate buffer, for example, at room temperature for about 4 hours.
It can be obtained by incubating for 0 hour. Unreacted acetic acid iodide is removed with aqueous ammonia, followed by incubation overnight. The reaction solution is applied to, for example, a Dowex1-X8 acetate column to remove phosphoric acid and iodine, and the adsorbed fraction is eluted with acetic acid. The eluted fraction is concentrated and deformylated with hydrochloric acid.
【００３４】ＣｈｉｎとＷｏｌｄの方法（Ｃｈｉｎ，
Ｃ．Ｃ．Ｑ．，ａｎｄ Ｗｏｌｄ，Ｆ．（１９７５）Ａ
ｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６７：４
４８−４５１）に従い、この画分を、例えば、Ｄｏｗｅ
ｘ５０−Ｘ８によるイオン交換クロマトグラフィーにか
けるとＣＥＬを単離することができる。The method of Chin and Wold (Chin,
C. C. Q. And Wold, F .; (1975) A
rch. Biochem. Biophys. 167 : 4
48-451), this fraction is, for example, Dowe
CEL can be isolated by ion exchange chromatography on x50-X8.
【００３５】「抗体」とは、抗原刺激の結果、免疫反応
によって生体内に産生されるタンパク質で、免疫原（抗
原）と特異的に結合する活性を有するものをいい、外来
性の非自己抗原に結合する活性を有する抗体のみなら
ず、自己抗原に結合する活性を有する自己抗体も含まれ
る。"Antibody" refers to a protein produced in vivo by an immune reaction as a result of antigen stimulation and having an activity of specifically binding to an immunogen (antigen). Not only an antibody having an activity of binding to self, but also an autoantibody having an activity of binding to a self antigen is included.
【００３６】「自己抗体」とは、一般的にはある個体自
身の構成物を抗原成分（自己抗原）として認識する抗体
をいうが、本明細書中においては、その個体自身の中で
生成されたＡＧＥに対して産生された抗体であり、ＡＧ
Ｅを認識する抗体をいう。The term “autoantibody” generally refers to an antibody that recognizes a component of a certain individual as an antigen component (self antigen). In the present specification, the term “autoantibody” refers to an antibody produced within the individual itself. Antibodies raised against AGEs,
Refers to an antibody that recognizes E.
【００３７】本発明で用いる抗ＡＧＥ抗体は、以下のよ
うな標準的な方法で作製できる。上記抗ＡＧＥ抗体がモ
ノクローナル抗体の場合には、以下のようにして作製す
る。すなわち、マウス、ラット、家兎その他適当な動物
にＡＧＥを標準的な方法で投与して、これらの動物を感
作動物とする。使用する動物は、必要とされる脾臓リン
パ球の数に応じて適当に選択すればよく、特に限定され
ない。The anti-AGE antibody used in the present invention can be prepared by the following standard method. When the anti-AGE antibody is a monoclonal antibody, it is prepared as follows. That is, AGE is administered to mice, rats, rabbits and other suitable animals by a standard method, and these animals are used as sensitized animals. The animal to be used may be appropriately selected depending on the required number of spleen lymphocytes, and is not particularly limited.
【００３８】これらの動物に、適当なアジュバントに懸
濁させたＡＧＥ−ＢＳＡを適当量投与する。投与部位と
しては、皮内（ｉ．ｄ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内
（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）等を挙げることがで
きるが、投与する動物の大きさ等に応じて、適宜選択す
ればよい。These animals receive an appropriate amount of AGE-BSA suspended in an appropriate adjuvant. The administration site may be intradermal (id), subcutaneous (sc), intraperitoneal (ip), intramuscular (im), or the like. May be selected as appropriate according to the size of the object.
【００３９】アジュバントとしては、フロイントの完全
アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣ
Ｇ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多
糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュ
バント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、
フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）とフロイント
の不完全アユバント（ＦＩＡ）とを組み合わせて使用す
ることが好ましい。具体的には、ＡＧＥ−ＢＳＡをフロ
イントの完全アジュバントにエマルジョン化させた後、
例えばマウスの皮下に投与し、さらに追加免疫を数回、
適当な日数を経過したときに行う。Adjuvants include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, and BC
G, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), alum adjuvant, silica adjuvant, and the like.
It is preferred to use Freund's complete adjuvant (FCA) in combination with Freund's incomplete adjuvant (FIA). Specifically, after emulsifying AGE-BSA in Freund's complete adjuvant,
For example, subcutaneously administered to mice, and several booster immunizations,
Performed after an appropriate number of days.
【００４０】ついで、感作の終了したこれらの動物から
脾臓を摘出し、得られた脾臓細胞を標準的な方法でミエ
ローマ細胞と融合させて抗体を産生するハイブリドーマ
を作製する。例えば、マウスの場合には、頸椎脱臼によ
って屠殺し、脾臓を摘出し、摘出した脾臓を、例えば、
ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に置き、ピンセッ
トで細胞を押し出して脾臓リンパ球を得る。Next, the spleen is removed from these sensitized animals, and the obtained spleen cells are fused with myeloma cells by a standard method to prepare a hybridoma that produces an antibody. For example, in the case of a mouse, it is sacrificed by cervical dislocation, the spleen is removed, and the removed spleen is, for example,
Place in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) and extrude cells with forceps to obtain spleen lymphocytes.
【００４１】こうして得られた脾臓リンパ球を、トリパ
ンブルー等の染色液で染めてバイアブルカウントし、ミ
エローマ細胞と融合させてハイブリドーマとする。ミエ
ローマ細胞としては、特に限定されるものではなく，公
知のものを使用できる。例えば、マウスのものとして
は、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−０１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−
ＮＳ１−１−Ａｇ４−１（ＮＳ４）、ＳＰ２／０−Ａｇ
１４（ＳＰ２）等を挙げることができる。ミエローマ細
胞を選択するに際しては、抗体産生細胞との適合性を考
慮する必要がある。The spleen lymphocytes thus obtained are stained with a staining solution such as trypan blue, viable counted, and fused with myeloma cells to obtain a hybridoma. The myeloma cells are not particularly limited, and known myeloma cells can be used. For example, as for mice, P3-X63-Ag8-01 (P3U1),
NS1-1-Ag4-1 (NS4), SP2 / 0-Ag
14 (SP2). When selecting myeloma cells, it is necessary to consider compatibility with antibody-producing cells.
【００４２】細胞の融合は、センダイウイルス法、ポリ
エチレングリコール法、プロトプラスト法等、当業者に
公知の方法で行えばよく、特に限定されないが、ポリエ
チレングリコール法で融合させる方法が、細胞毒性も比
較的少なく、融合操作も簡単であるという理由から好ま
しい。The cell fusion may be performed by a method known to those skilled in the art, such as the Sendai virus method, polyethylene glycol method, protoplast method, etc., and is not particularly limited. It is preferable because it is small and the fusion operation is simple.
【００４３】得られたハイブリドーマを、常法に従っ
て、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、お
よびチミジン含有培地）中で適当な期間培養し、ハイブ
リドーマの選択を行う。次いで、目的とする抗体を産生
するハイブリドーマを得るためのスクリーニングを行っ
た後、クローニングを行う。スクリーニング法として
は、抗体を検出するための公知の方法を用いることがで
きる。例えば、酵素イムノアッセイ（以下「ＥＬＩＳ
Ａ」という）法、ラジオイムノアッセイ（以下「ＲＩ
Ａ］という）法、プラーク法、凝集反応法などを用いる
ことができる。The obtained hybridoma is cultured in a HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine) for an appropriate period according to a conventional method, and the hybridoma is selected. Next, after performing screening for obtaining a hybridoma producing the desired antibody, cloning is performed. As a screening method, a known method for detecting an antibody can be used. For example, an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as “ELIS
A), radioimmunoassay (hereinafter referred to as "RI
A]), plaque method, agglutination reaction method and the like.
【００４４】また、クローニング法としては、免疫学的
に公知の方法を用いればよく、限界希釈法、軟寒天法お
よびＦＡＣＳ法などを使用できる。上記のようにして得
たハイブリドーマを、適当な培地中で培養するか、ある
いはハイブリドーマと適合性のある、例えばマウス腹腔
内に投与する。これにより得られる培養液中または腹水
中から塩析、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィなどの常法により、所
望のモノクロ−ナル抗体を単離精製することができる。As a cloning method, a method known in immunology may be used, and a limiting dilution method, a soft agar method, a FACS method and the like can be used. The hybridoma obtained as described above is cultured in an appropriate medium or administered intraperitoneally, for example, in a mouse compatible with the hybridoma. Salting out from the culture solution or ascites fluid obtained by this, ion exchange chromatography, gel filtration,
The desired monoclonal antibody can be isolated and purified by a conventional method such as affinity chromatography.
【００４５】ＡＧＥに対するポリクローナル抗体は、例
えば、以下のようにして作製する。すなわち、フロイン
トの完全アジュバント中に懸濁したＡＧＥ−ＢＳＡを、
例えば、家兎の皮下または真皮内に投与する。更に、追
加免疫を数回、適当な日数を経過した後に行う。適当な
日数を経過した後に部分採血を行い、抗体価を測定す
る。この抗体価の測定は、公知の方法により行うことが
でき、例えば沈降反応、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等を用
いることができる。抗体価の充分な上昇を確認した後に
全採血を行い、抗血清を得る。これを、塩析、イオン交
換クロマトグラフィ、ゲル濾過、アフィニティクロマト
グラフィ等の公知の方法を用いて精製する。A polyclonal antibody against AGE is prepared, for example, as follows. That is, AGE-BSA suspended in Freund's complete adjuvant is
For example, it is administered subcutaneously or intradermally to rabbits. In addition, several boosters are performed after an appropriate number of days. After an appropriate number of days have elapsed, partial blood collection is performed, and the antibody titer is measured. The measurement of the antibody titer can be performed by a known method, for example, a precipitation reaction, an ELISA method, an RIA method, or the like can be used. After confirming a sufficient increase in the antibody titer, whole blood is collected to obtain an antiserum. This is purified using a known method such as salting out, ion exchange chromatography, gel filtration, and affinity chromatography.
【００４６】上記のようにして得られるモノクロ−ナル
抗体、ポリクローナル抗体は、ＡＧＥに存在するエピト
ープのみを特異的に認識する。「エピトープ」とは、抗
原の中で生体の免疫反応を促し、産生された抗体と特異
的に結合する部分をいう。上記の抗体が認識するエピト
ープとしては、カルボキシエチルリジンその他のものが
挙げられる。本発明において、上記のようにして作製し
たＡＧＥあるいは抗ＡＧＥ抗体を用いてＡＧＥに対する
自己抗体を測定する。The monoclonal and polyclonal antibodies obtained as described above specifically recognize only the epitopes present in AGE. The term “epitope” refers to a part of an antigen that promotes a biological immune response and specifically binds to a produced antibody. Epitopes recognized by the above antibodies include carboxyethyl lysine and others. In the present invention, an autoantibody against AGE is measured using AGE or anti-AGE antibody prepared as described above.
【００４７】本発明において、上記の自己抗体は、免疫
学的測定法により検出する。用いる免疫学的測定法とし
ては、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫
比ろう法、免疫比濁法などいずれを用いてもよいが、特
に標識免疫測定法が自己抗体を高感度に検出でき、かつ
多数の検体を自動的に測定できるので、病院あるいは研
究機関などでの使用に好適である。In the present invention, the above autoantibody is detected by an immunological assay. The immunoassay to be used may be any of immunoprecipitation, immunoagglutination, labeled immunoassay, immunoturbidimetry, and turbidimetric immunoassay. Since it can be detected with high sensitivity and can automatically measure a large number of samples, it is suitable for use in hospitals or research institutions.
【００４８】標識免疫測定法としては、公知の測定法が
応用できる。例えば、ELISA法、RIA法、蛍光免疫測定
法、化学発光免疫測定法などが挙げられる。用いる標識
物質は、上記の測定法に応じて、酵素、放射性同位体、
蛍光化合物、および化学発光化合物などを適宜選択すれ
ばよい。As the labeled immunoassay, a known assay can be applied. For example, ELISA, RIA, fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay and the like can be mentioned. The labeling substance to be used may be an enzyme, a radioisotope,
A fluorescent compound, a chemiluminescent compound, and the like may be appropriately selected.
【００４９】具体的な標識物質として、酵素としては、
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホス
ファターゼ、グルコースオキシダーゼなどを挙げること
ができる。さらに、上記の標識物質とアビジン−ビオチ
ン複合体を用いることにより、標識物質の検出感度を向
上させることが可能である。放射性同位体としては、主
に125Iが、蛍光化合物としては、フルオレセインイソチ
オシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチ
オシアネート（RITC)などが挙げられる。化学発光化合
物としては、ロフィン、ルミノール、ルシゲニンなどが
挙げられる。上記の標識物質は、常法に従って標識して
使用すればよい。As specific labeling substances, enzymes include:
Peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase and the like can be mentioned. Further, by using the above-mentioned labeling substance and the avidin-biotin complex, it is possible to improve the detection sensitivity of the labeling substance. The radioisotope is mainly 125I, and the fluorescent compounds include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC). Chemiluminescent compounds include lophine, luminol, lucigenin and the like. The above-mentioned labeling substance may be labeled and used according to a conventional method.
【００５０】標識免疫測定法により、自己抗体を検出す
る測定系は、公知の非競合反応系あるいは競合反応系を
用いて構築することができる。非競合反応系において
は、固相が必要である（固相法）。競合反応系において
は、必ずしも固相を必要としない（液相法）が、固相を
用いた方が、測定操作が簡便であり好ましい。固相の材
質として、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコン
ラバー、セルロースなどが挙げられ、固相の形状として
は、球状、ウェル状、チューブ状、シート状など標識免
疫測定法に用いられる公知のものを応用できる。A measurement system for detecting an autoantibody by a labeled immunoassay can be constructed using a known non-competitive reaction system or a competitive reaction system. A non-competitive reaction system requires a solid phase (solid phase method). In a competitive reaction system, a solid phase is not necessarily required (liquid phase method), but using a solid phase is preferred because the measurement operation is simpler. Examples of the material of the solid phase include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, and cellulose, and examples of the shape of the solid phase include spheres, wells, tubes, and sheets known in the art that are used in labeling immunoassays. Can be applied.
【００５１】本発明における測定操作として、非競合反
応系では、例えば、抗原を固相化した後に、検体と反応
させる。次に、固相化されている抗原と反応している自
己抗体を、あらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリン
抗体（二次抗体）と反応させ、標識物質によって自己抗
体を検出することができる。検出する標識量は抗AGE自
己抗体量と正相関する。As a measurement operation in the present invention, in a non-competitive reaction system, for example, an antigen is immobilized and then reacted with a sample. Next, the autoantibody reacting with the immobilized antigen is reacted with a pre-labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody), and the autoantibody can be detected by the labeling substance. The amount of label detected is positively correlated with the amount of anti-AGE autoantibody.
【００５２】また、競合反応系では、例えば、抗原を固
相化した後に、あらかじめ抗原を添加し反応させた検体
を反応させる。次に、固相化された抗原と反応している
自己抗体を、あらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリ
ン抗体（二次抗体）と反応させ、標識物質によって自己
抗体を検出することができる。検出する標識量は、添加
する抗原量と逆相関する。そのほかの競合反応系として
は、抗原を固相化して、検体を反応させた後、あらかじ
め標識しておいた、前述した抗AGE抗体（ポリクローナ
ル抗体あるいはモノクローナル抗体）を固相化した抗原
と反応させる。検出する標識量は自己抗体量と逆相関す
る。このような競合反応系の使用は、自己抗体の抗原エ
ピトープを解析する場合に、特に好ましい。In a competitive reaction system, for example, after immobilizing an antigen, the antigen is added in advance and reacted with a specimen. Next, the autoantibody reacting with the immobilized antigen is reacted with a pre-labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody), and the autoantibody can be detected by the labeling substance. The amount of label to be detected is inversely correlated with the amount of added antigen. In another competitive reaction system, the antigen is immobilized, the specimen is reacted, and the previously labeled anti-AGE antibody (polyclonal antibody or monoclonal antibody) is reacted with the immobilized antigen. . The amount of label to be detected is inversely correlated with the amount of autoantibody. Use of such a competitive reaction system is particularly preferable when analyzing an antigen epitope of an autoantibody.
【００５３】上記の抗原としては、例えば、メイラード
反応後期生成物を、前述したようにタンパク質などから
化学的に合成したもの、あるいは生体試料中から精製し
たものなどが挙げられる。さらに、本発明の方法では、
AGEのかわりとして、抗AGEイディオタイプ抗体などが使
用できる。Examples of the antigen include those obtained by chemically synthesizing the late product of the Maillard reaction from a protein or the like as described above, or those purified from a biological sample. Further, in the method of the present invention,
As an alternative to AGE, an anti-AGE idiotype antibody or the like can be used.
【００５４】上記の生体試料中からＡＧＥを分離精製す
るには、慣用的な手技、例えばアフィニティークロマト
グラフィーを使用できる。すなわち、メイラード反応後
期生成物に対するポリクローナル抗体、あるいはモノク
ローナル抗体を前述したような方法により作製する。さ
らに、これらの抗体を用いて、公知の方法でアフィニテ
ィーカラムを調製し利用することにより、生体試料から
メイラード反応後期生成物を分離精製できる。In order to separate and purify AGE from the above biological sample, a conventional technique such as affinity chromatography can be used. That is, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against the late product of the Maillard reaction is prepared by the method described above. Furthermore, by using these antibodies to prepare and use an affinity column by a known method, the late product of the Maillard reaction can be separated and purified from a biological sample.
【００５５】「抗AGEイディオタイプ抗体」とは、免疫
グロブリンのAGE結合部位をエピトープとして認識する
抗体のことである。いいかえると、抗AGEイディオタイ
プ抗体は、抗原のエピトープと同様の立体構造をとりう
るため、抗原の代わりに使用することも可能である。抗
イディオタイプ抗体は、公知の方法により作製が可能で
あり、本発明においては、例えば、前述したAGEに対す
る、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を
用いて作製することが可能である。また、抗AGEイディ
オタイプ抗体は抗体分子をそのまま使用するか、あるい
は抗体を酵素処理して得られる抗原結合部位を含む抗体
フラグメントであるFab、Fab'、F(ab')2を使用してもよ
い。"Anti-AGE idiotype antibody" refers to an antibody that recognizes the AGE binding site of immunoglobulin as an epitope. In other words, the anti-AGE idiotype antibody can have the same three-dimensional structure as the epitope of the antigen, and thus can be used instead of the antigen. The anti-idiotype antibody can be prepared by a known method, and in the present invention, for example, it can be prepared using a monoclonal antibody or a polyclonal antibody against AGE described above. Alternatively, the anti-AGE idiotype antibody may use the antibody molecule as it is, or use an antibody fragment containing an antigen-binding site obtained by enzymatically treating the antibody, Fab, Fab ', F (ab') 2. Good.
【００５６】上記した固相化の方法としては、物理的吸
着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法など公知の方
法を使用できる。なかでも、物理的吸着法が簡便であり
好ましい。上記した抗免疫グロブリン抗体としては、例
えば抗IgG抗体、抗IgM抗体などが挙げられる。これらの
抗体は、抗体分子をそのまま使用、あるいは抗体を酵素
処理して得られる抗原結合部位を含む抗体フラグメント
であるFab、Fab'、F(ab')2を使用してもよい。さらに、
本発明の方法では、標識した抗免疫グロブリン抗体の代
わりに、抗体分子に特異的な親和性をもつ物質、例えば
IgGに特異的な親和性をもつプロテインAなどを標識して
使用することもできる。As the above solid phase immobilization method, known methods such as a physical adsorption method, a covalent bonding method, an ionic bonding method and a cross-linking method can be used. Among them, the physical adsorption method is simple and preferred. Examples of the above-mentioned anti-immunoglobulin antibody include an anti-IgG antibody, an anti-IgM antibody and the like. These antibodies may use antibody molecules as they are, or Fab, Fab ', F (ab') 2 which is an antibody fragment containing an antigen-binding site obtained by treating an antibody with an enzyme. further,
In the method of the present invention, instead of a labeled anti-immunoglobulin antibody, a substance having a specific affinity for the antibody molecule, for example,
Protein A having a specific affinity for IgG or the like can be labeled and used.
【００５７】本発明で利用可能な検体はヒトを含む動物
の体液であり、血漿、血清などの血液成分、髄液、関節
液、腹水などが挙げられるが、採取の容易な血漿あるい
は血清が好ましい。本発明方法において、上記の検体は
無希釈、好ましくは適当な溶液で希釈して用いることが
できる。さらに、検体中に、測定に用いた抗原中のAGE
以外の構造をエピトープとする抗体を多く含む検体の場
合には、本発明方法で測定する前に、不要な特異性を有
する抗体を除くための操作（以下、「吸収」という）
を、加えることが可能である。Samples that can be used in the present invention are body fluids of animals including humans, and include blood components such as plasma and serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, ascites, etc., and plasma or serum that is easily collected is preferable. . In the method of the present invention, the above sample can be used undiluted, preferably diluted with an appropriate solution. Furthermore, AGE in the antigen used for measurement was
In the case of a sample containing a large number of antibodies having epitopes having structures other than the above, an operation for removing antibodies having unnecessary specificity (hereinafter referred to as "absorption") before measurement by the method of the present invention
Can be added.
【００５８】上記した吸収には、免疫学的に公知の方法
が応用できる。例えば、抗原としてBSAから作製したAGE
-BSAを用いた場合、吸収抗原として例えばBSAを検体に
十分量を加えたものをそのまま測定に使用するか、ある
いは遠心して吸収抗原抗体複合体を沈殿させて、上清を
測定に使用すればよい。そのほか、吸収抗原を不溶性担
体、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲ
ル、セルロースゲルなどに公知の方法で結合させた調製
ゲルを用いたカラム法あるいはバッチ法により、吸収を
行うことも可能である。A known immunological method can be applied to the above-mentioned absorption. For example, AGE prepared from BSA as an antigen
If -BSA is used, for example, a sample obtained by adding a sufficient amount of BSA to a sample as an absorbed antigen can be used as it is for measurement, or it can be centrifuged to precipitate the absorbed antigen-antibody complex and the supernatant used for measurement. Good. In addition, absorption can be performed by a column method or a batch method using a prepared gel in which the absorbed antigen is bound to an insoluble carrier such as agarose gel, polyacrylamide gel, or cellulose gel by a known method.
【００５９】上記のカラム法とは、上記の調製ゲルを用
いてカラムを作製した後、検体を流し、カラム非吸着画
分を測定に使用する方法である。また、バッチ法とは、
上記の調製ゲルを検体に適量加えて十分に反応させた
後、遠心除去して上清を測定に使用する方法である。バ
ッチ法はカラム法にくらべて、一度に多検体を処理する
ことができるので好ましい。The above-mentioned column method is a method in which a column is prepared using the above-prepared gel, a sample is allowed to flow, and a column non-adsorbed fraction is used for measurement. Also, the batch method
In this method, an appropriate amount of the above-prepared gel is added to a sample, reacted sufficiently, and then centrifuged off to use the supernatant for measurement. The batch method is preferable because it can process multiple samples at a time as compared with the column method.
【００６０】また、本発明の自己抗体の測定方法では、
検体中の抗体価を検出した標識量で表すほかに、既知濃
度あるいは既知抗体価の抗AGE抗体などを標準液として
用いることで相対的に表すこともできる。すなわち、標
準液と検体を同測定系にて同時に測定し、標準液の値を
基準にして検体中の抗体価を相対的に表すことができ
る。Further, in the method for measuring an autoantibody of the present invention,
In addition to expressing the antibody titer in the sample by the detected label amount, the antibody titer can be relatively expressed by using an anti-AGE antibody having a known concentration or a known antibody titer as a standard solution. That is, the standard solution and the sample are simultaneously measured by the same measurement system, and the antibody titer in the sample can be relatively expressed based on the value of the standard solution.
【００６１】本発明のAGEに対する自己抗体の測定方法
は、AGEが関与する疾患の検査方法としても有益であ
る。先に述べたように、AGEは、糖尿病のような高血糖
状態が持続する場合や腎臓疾患のようなクリアランスの
低下が認められる場合、また健常人においても加齢によ
り、代謝回転の遅いタンパク質中に著しく蓄積される。
蓄積が認められるタンパク質としては、ヘモグロビン、
アルブミン、神経ミエリン、眼球クリスタリン、そのほ
か皮膚、血管壁、腎臓の糸球体基底膜などの結合組織の
コラーゲンやエラスチンなどが挙げられる。これらのタ
ンパク質にAGEが生成すると、変性や機能低下などが生
じて各種疾患が惹起される。AGEが関与している疾患と
しては、糖尿病や冠動脈性疾患、末梢循環障害、脳血管
障害、動脈硬化症、凝固障害症、神経障害、腎症、関節
硬化症、骨減少症、白内障および網膜症などの糖尿病性
合併症、糸球体腎炎などの非糖尿病性腎症、そのほか老
化に伴う疾患としてアテローム性動脈硬化症、骨関節
症、関節周囲硬直症、関節硬化症、老人性骨粗鬆症、老
人性白内障、アルツハイマー病などが挙げられる。The method for measuring an autoantibody to AGE of the present invention is also useful as a method for testing a disease associated with AGE. As described above, AGEs are present in proteins with slow turnover when hyperglycemia such as diabetes persists, when clearance is reduced such as kidney disease, and in healthy subjects due to aging. Is remarkably accumulated.
Hemoglobin,
Examples include albumin, nerve myelin, ocular crystallin, collagen, elastin, and the like of connective tissues such as skin, blood vessel walls, and glomerular basement membrane of kidney. When AGE is produced in these proteins, various diseases are caused by denaturation and reduced functions. AGE-related diseases include diabetes and coronary artery disease, peripheral circulatory disorders, cerebrovascular disorders, arteriosclerosis, coagulopathy, neuropathy, nephropathy, arthrosclerosis, osteopenia, cataract and retinopathy. Diabetic complications, non-diabetic nephropathy such as glomerulonephritis, and other aging-related diseases such as atherosclerosis, osteoarthritis, periarticular stiffness, arthriosclerosis, senile osteoporosis, senile cataract And Alzheimer's disease.
【００６２】このように、糖尿病や腎症の進行あるいは
老化によりAGEの蓄積量が増加するのに伴って、上述し
た各組織または血中におけるAGEに対する抗体価も上が
ることから、両者の間には一定の相関関係があるものと
考えられる。したがって、血中における自己抗体の量を
測定することにより、ある個体が当該疾患である可能性
や当該疾患のどの段階（病期）まで進行しているかなど
を診断することができる。さらに、AGEに対する抗体価
を測定することによって、当該疾患に対する治療薬の薬
効を評価することもできる。As described above, as the amount of accumulated AGE increases due to the progression or aging of diabetes or nephropathy, the antibody titer against AGE in each of the above-mentioned tissues or blood also increases. It is considered that there is a certain correlation. Therefore, by measuring the amount of autoantibodies in the blood, it is possible to diagnose the possibility that a certain individual has the disease or to what stage (stage) the disease has progressed. Further, by measuring the antibody titer against AGE, the efficacy of the therapeutic agent for the disease can be evaluated.
【００６３】本発明の自己抗体測定方法を用いた当該疾
患の検査方法としては、検体中の抗体価を上述した自己
抗体測定方法により測定し、得られた抗体価を当該疾患
の抗体価の平均値、あるいは当該疾患の各病期例えば糖
尿病性腎症の場合、腎症前期、早期腎症、顕性腎症期、
腎不全期および透析療法期における抗体価の平均値と比
較することで、当該疾患の可能性あるいはどの病期に相
当するかを診断することができる。As a method for examining the disease using the autoantibody measurement method of the present invention, the antibody titer in a sample is measured by the above-described autoantibody measurement method, and the obtained antibody titer is averaged over the antibody titer of the disease. Value, or each stage of the disease, such as diabetic nephropathy, early nephropathy, early nephropathy, overt nephropathy,
By comparing the average value of the antibody titers in the renal failure phase and the dialysis therapy phase, it is possible to diagnose the possibility of the disease or the stage to which the disease corresponds.
【００６４】また、本発明の当該疾患の検査方法を、当
該疾患の治療薬の薬効評価方法として使用する場合に
は、検体中の抗体価を上述した自己抗体測定方法により
測定し、治療薬の投与による抗体価の低下度を算出して
評価することができる。本発明の自己抗体測定方法を用
いた当該疾患の検査用試薬としては、上述した自己抗体
測定方法に用いた試薬を用いることができる。具体的に
は、AGE、標識された抗免疫グロブリン抗体などが挙げ
られる。When the method for testing a disease of the present invention is used as a method for evaluating the efficacy of a therapeutic drug for the disease, the antibody titer in the sample is measured by the above-described autoantibody measurement method, and The degree of decrease in antibody titer due to administration can be calculated and evaluated. As the reagent for testing the disease using the autoantibody measurement method of the present invention, the reagent used in the above-described autoantibody measurement method can be used. Specific examples include AGE, labeled anti-immunoglobulin antibody and the like.
【００６５】本発明の検査キットは、上述した自己抗体
測定方法に用いた試薬、少なくとも検体用希釈液、AG
E、抗AGEイディオタイプ抗体、抗AGE抗体および抗免疫
グロブリン抗体を含む試薬のいずれかから構成される。
上記の構造物および抗体は、上述したような標識物質で
標識されたものであってもよい。The test kit of the present invention comprises the reagent used in the above-described autoantibody measurement method, at least a sample diluent,
E, comprising any of reagents including anti-AGE idiotype antibodies, anti-AGE antibodies and anti-immunoglobulin antibodies.
The above structure and antibody may be labeled with a labeling substance as described above.
【００６６】さらに標識物質を検出するための試薬とし
て、例えば標識物質が酵素の場合は、酵素基質、酵素基
質溶解液、酵素反応停止液を添付するのが好ましい。検
体用希釈液とは、上述のように検体を希釈するために使
用するもので、例えばPBS（生理的リン酸緩衝液、ｐＨ
７．４）、１３７mMの塩化ナトリウムおよび３ｍＭの塩
化カリウムを含むpH7.4で20mMのトリス−塩酸緩衝液
（以下、「TBSと」略す）、0.05％Tween 20や0.1〜1％
のBSAを含有させたPBSあるいはTBSなどがあげられる。
この検体用希釈液は、検体のほか上記のAGEや抗体の希
釈の場合にも用いられる。Further, as a reagent for detecting the labeling substance, for example, when the labeling substance is an enzyme, it is preferable to attach an enzyme substrate, an enzyme substrate solution and an enzyme reaction stopping solution. The sample diluent is used for diluting the sample as described above. For example, PBS (physiological phosphate buffer, pH
7.4) 20 mM Tris-HCl buffer (hereinafter abbreviated as "TBS") at pH 7.4 containing 137 mM sodium chloride and 3 mM potassium chloride, 0.05% Tween 20 and 0.1 to 1%
And TBS containing BSA.
This sample diluent is used not only for the sample but also for the dilution of the above-mentioned AGE and antibody.
【００６７】本発明キット中に、上記のAGEあるいは抗
体を固相化させる、上述した固相をさらに含めてもよ
い。固相は、予めこれらを固相化させたものでも、固相
と固相化に必要な固相化試薬を添付したものでもよい。
固相化試薬として、例えば物理的吸着による固相化の場
合は、50mM炭酸塩緩衝液（pH 9.6)、10 mMトリス−塩酸
緩衝液(pH8.5、100mM塩化ナトリウム含有)、PBSなどの
コーティング液と、さらに必要に応じてコーティング液
に0.5％のゼラチンなどを含有させたブロッキング液が
挙げられる。The kit of the present invention may further include the above-mentioned solid phase for immobilizing the above-mentioned AGE or antibody. The solid phase may be one in which these are solid-phased in advance, or one in which a solid phase and a solid-phase immobilization reagent necessary for solid-phase immobilization may be attached.
As the solid phase immobilization reagent, for example, in the case of solid phase immobilization by physical adsorption, coating with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5, containing 100 mM sodium chloride), PBS, etc. Liquid and, if necessary, a blocking liquid containing 0.5% gelatin or the like in the coating liquid.
【００６８】また、本発明のキットに上述の吸収抗原を
含む吸収試薬をさらに含めてもよい。吸収試薬として
は、適当な濃度の吸収抗原をPBSなどに溶解させたも
の、あるいは上述のように吸収抗原をゲルに結合させた
もの（以下、「吸収用ゲル」と略す）などが挙げられ
る。吸収用ゲルはさらに適量を、バッチ法による吸収処
理用に0.5〜2 mｌ程度のマイクロ遠沈チューブに予めパ
ッケージングしてもよく、あるいはカラム法による吸収
処理用にカラム容量が0.1 〜5 mlのミニカラムに予め充
填しておいてもよい。そのほか、本発明のキットに上述
の標準液をさらに含めてもよい。標準液としては、既知
濃度あるいは既知抗体価の抗AGE抗体を含むものなどが
挙げられる。The kit of the present invention may further contain an absorption reagent containing the above-mentioned absorbed antigen. Examples of the absorption reagent include a solution in which an appropriate concentration of the absorbed antigen is dissolved in PBS or the like, or a solution in which the absorbed antigen is bound to a gel as described above (hereinafter, abbreviated as “absorption gel”). Further, an appropriate amount of the gel for absorption may be pre-packaged in a microcentrifuge tube of about 0.5 to 2 ml for the absorption treatment by the batch method, or the column having a volume of 0.1 to 5 ml for the absorption treatment by the column method. The mini-column may be filled in advance. In addition, the kit of the present invention may further include the above-mentioned standard solution. Examples of the standard solution include those containing an anti-AGE antibody having a known concentration or a known antibody titer.
【００６９】本発明に使用する試薬が溶液の場合、防腐
剤の添加が可能なときには、適当な防腐剤、例えば0.01
％〜0.1％程度のアジ化ナトリウムを含有させることが
好ましい。また、抗体の場合、必要に応じてさらに適当
な安定化剤、例えば1〜10mg/mL程度のBSAを含有させる
こともできる。また、試薬溶液をパッケージングする場
合は、高濃度の試薬溶液を0.1〜10mL程度適当な容器に
パッケージングして希釈液を添付するか、予め適当な濃
度に希釈した試薬を10〜200mL程度適当な容器にパッケ
ージングすることができる。そのほか、試薬が粉末の場
合は適当な溶解液を添付するのが好ましい。When the reagent used in the present invention is a solution, when a preservative can be added, a suitable preservative, for example, 0.01
% To about 0.1% of sodium azide. In the case of an antibody, if necessary, a suitable stabilizer, for example, about 1 to 10 mg / mL of BSA can be contained. When packaging the reagent solution, package the high-concentration reagent solution in about 0.1 to 10 mL in an appropriate container and attach the diluent, or add about 10 to 200 mL of the reagent diluted to an appropriate concentration in advance. It can be packaged in various containers. In addition, when the reagent is a powder, it is preferable to attach an appropriate dissolving solution.
【００７０】[0070]
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 （実施例１）使用した試薬 （１）試薬 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）
およびストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、Ｓｉｇｍａ社
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、米国）より購入した。Ｄ−
グルコース、グリオキシ酸および水素化シアノホウ素ナ
トリウムは和光純薬工業より購入した。ＰＢＳ（−）
は、ニッスイ製薬より購入した。The present invention will be described below in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. (Example 1) Reagents used (1) Reagent Bovine serum albumin (BSA, fraction V)
And streptozotocin (STZ) were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA). D-
Glucose, glyoxyacid and sodium cyanoborohydride were purchased from Wako Pure Chemical Industries. PBS (-)
Was purchased from Nissui Pharmaceutical.
【００７１】ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体のビオチン化調製物
は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入した。ペルオキシダー
ゼ結合ヒツジ抗ラットＩｇＧ抗体および抗マウスＩｇＧ
はＡｍｅｒｓｈａｍ社（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒ
ｅ、英国）より購入した。９６ウェルイムノプレート
（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ II）は、Ｎａｌ
ｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｒｏ
ｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）より購入した。フォルミル
セルロファインゲルは生化学工業より購入した。A biotinylated preparation of a goat anti-human IgG antibody was obtained from Vector Laboratories (Bur
(Lingame, CA). Peroxidase-conjugated sheep anti-rat IgG antibody and anti-mouse IgG
Amersham (Buckinghamshir)
e, UK). 96-well immunoplates (Nunc Immunoplate II) are available from Nal
Ge Nunc International (Ro
skide, Denmark). Formylcellulofine gel was purchased from Seikagaku Corporation.
【００７２】（実施例２）ＡＧＥ構造体の作製 （１）ＡＧＥ化ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）
の作製 ＡＧＥ−ＢＳＡを以下のようにして調製した。１．６ｇ
のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を３．０ｇのＤ−グルコー
スとともに、０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）１０ｍＬに溶解した。この溶解液を濾過滅菌
（孔径０．４５μｍのフィルター、ミリポア社製）した
後に、３７℃で９カ月間インキュベーションし、１００
０倍容の０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し
た。グルコースを除く他はすべて同様の操作をＢＳＡに
対して行い、ＡＧＥ−ＢＳＡの対照とした。(Example 2) Preparation of AGE structure (1) AGE-modified bovine serum albumin (AGE-BSA)
Preparation of AGE-BSA was prepared as follows. 1.6g
BSA (manufactured by Sigma) together with 3.0 g of D-glucose and 0.5 M sodium phosphate buffer (pH
7.4) Dissolved in 10 mL. The solution was sterilized by filtration (0.45 μm pore size filter, manufactured by Millipore) and incubated at 37 ° C. for 9 months.
Dialysis was performed against 0 volumes of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.15 M sodium chloride. Except for glucose, the same operation was performed on BSA except that glucose was used as a control for AGE-BSA.
【００７３】（２）ＣＭＬ化ウシ血清アルブミン（ＣＭ
Ｌ−ＢＳＡ)の調製 ＣＭＬ−ＢＳＡはＩｋｅｄａらおよびＤｕｎｎらの方法
（２７、２９；Ｋ．Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：８０７５−８０８３（１９
９６），Ｊ．Ａ．Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１２０５−１２１０（１９９
１））にて調製した。以下、簡単に説明する。(2) CML-modified bovine serum albumin (CM
Preparation of L-BSA) CML-BSA was prepared according to the method of Ikeda et al. And Dunn et al. (27, 29; K. Ikeda et al., Bio).
chemistry, 35: 8075-8083 (19
96); A. Dunn et al. , Bioch
chemistry, 30: 1205-1210 (199)
1)). Hereinafter, a brief description will be given.
【００７４】２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを、７５０ｍＭの
グリオキシル酸（Ｉｋｅｄａらの論文では１．０〜４５
０ｍＭ）および３００ｍＭ（同じく７５０ｍＭ）の水素
化シアノホウ素ナトリウムとともに、０．５Ｍのリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中にて、３７℃で２４
時間インキュベーションした後、ＰＢＳに対して透析し
た。生成したCMLは、アミノ酸分析計にて確認した。グ
リオキシル酸および水素化ホウ素ナトリウムを除く他は
すべて同様の操作をＢＳＡに対して行い、ＣＭＬ−ＢＳ
Ａの対照とした。20 mg / mL BSA was added to 750 mM glyoxylic acid (1.0-45 in Ikeda et al.'S paper).
0 mM) and 300 mM (also 750 mM) sodium cyanoborohydride in 0.5 M sodium phosphate buffer (pH 7.4) at 37 ° C.
After incubation for hours, it was dialyzed against PBS. The generated CML was confirmed with an amino acid analyzer. Except for glyoxylic acid and sodium borohydride, the same operation was performed on BSA, and CML-BS
A was used as a control.
【００７５】（３）CEL化ウシ血清アルブミン（CEL-BS
A)の作製 CEL-BSAをＡｈｍｅｄらの方法（Ｍ．Ｕ．Ａｈｍｅｄ
ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３２４：５６５
−５７０（１９７７））にて調整した。すなわち、４０
ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを、０．２Ｍピルビン酸ナトリウム
と０．３Ｍ水素化シアノホウ素ナトリウムを含む１０ｍ
ＭＰＢＳ中３７℃で２４時間反応させた後、ＰＢＳにて
透析した。生成したＣＥＬは、アミノ酸分析計にて確認
した。ピルビン酸および水素化シアノホウ素ナトリウム
を除く他はすべて同様の操作をＢＳＡに対して行い、Ｃ
ＥＬ−ＢＳＡの対照とした。(3) CEL-modified bovine serum albumin (CEL-BS
Preparation of A) CEL-BSA was prepared according to the method of Ahmed et al. (MU Ahmed).
et al. Biochem J. et al. , 324: 565
-570 (1977)). That is, 40
mg / mL BSA containing 0.2 M sodium pyruvate and 0.3 M sodium cyanoborohydride
After reacting in MPBS at 37 ° C. for 24 hours, it was dialyzed against PBS. The generated CEL was confirmed with an amino acid analyzer. With the exception of pyruvic acid and sodium cyanoborohydride, the same procedure was performed on BSA, and C
EL-BSA was used as a control.
【００７６】（実施例３）ＡＧＥ−ＢＳＡに対する抗体
の調製 （１）ＡＧＥ−ＢＳＡに対するモノクローナル抗体の作
製 ＡＧＥ−ＢＳＡに対するモノクローナル抗体は、以下の
ようにして作製した。Ｂａｌｂ／ｃ（８週齢、日本ＳＬ
Ｃ社より購入）に、５０％のフロイントの完全アジュバ
ントに懸濁した０．１ｍｇのＡＧＥ−ＢＳＡを２週間間
隔で４回皮下投与した。免疫したマウスの血清中のＡＧ
Ｅ−ＢＳＡに対する抗体価は、以下のようにＥＬＩＳＡ
で測定した。Example 3 Preparation of Antibody to AGE-BSA (1) Preparation of Monoclonal Antibody to AGE-BSA A monoclonal antibody to AGE-BSA was prepared as follows. Balb / c (8 weeks old, Japan SL
(Purchased from Company C), 0.1 mg of AGE-BSA suspended in 50% Freund's complete adjuvant was subcutaneously administered twice every two weeks. AG in serum of immunized mice
The antibody titer against E-BSA was determined by ELISA as follows.
Was measured.
【００７７】９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社
製）のウェルに、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）で
0.1〜１０００ｎｇ／mＬに希釈したAGE-BSAおよび対照
としてＢＳＡを１００μＬ分注し、室温で１時間静置し
て固相化させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
（以下，「緩衝液Ａ」という）で３回洗浄後、０．５％
ゼラチン含有５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）を２０
０μＬ分注し、室温で１時間静置してウェルをブロッキ
ングした。緩衝液Ａで３回洗浄後、０．１％ＢＳＡ含有
緩衝液Ａ（以下、「希釈溶液」という）で２０倍希釈し
たマウス血清を１００μl分注し、室温で１時間反応さ
せた。次いで、緩衝液Aで３回洗浄後、希釈溶液で２０
００倍希釈したビオチン化抗マウスIgG抗体を１００μ
Ｌ分注した。室温で３０分間反応させた後、緩衝液Aで
３回で洗浄した。A well of a 96-well immunoplate (manufactured by Nunc) was filled with 50 mM carbonate buffer (pH 9.7).
100 μL of AGE-BSA diluted to 0.1 to 1000 ng / mL and BSA as a control were dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour to solidify. PBS containing 0.05% Tween 20
(Hereinafter referred to as "buffer A") three times, and then 0.5%
20 mM carbonate buffer (pH 9.7) containing gelatin
0 μL was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour to block wells. After washing three times with buffer A, 100 μl of mouse serum diluted 20-fold with buffer A containing 0.1% BSA (hereinafter referred to as “dilution solution”) was dispensed, and reacted at room temperature for 1 hour. Then, after washing three times with buffer A, 20
100-fold diluted biotinylated anti-mouse IgG antibody
L was dispensed. After reacting at room temperature for 30 minutes, it was washed with buffer A three times.
【００７８】これに、アビジンービオチン西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ複合体溶液を１００μＬ分注し、室温で
１時間反応させた後、緩衝液Aで３回洗浄した。次い
で、ｏ―フェニレンジアミン５５ｍｇを１００ｍＬの
０．１Ｍクエン酸―０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶解し、使用直前に５０μＬの３０％
過酸化水素水を添加して、ペルオキシダーゼ基質溶液を
調整した。この基質溶液を１００μＬ分注して室温で発
色させ、１０分間後に１００μＬの１Ｍ硫酸を添加して
反応を停止した。To this, 100 μL of avidin-biotin horseradish peroxidase complex solution was dispensed, reacted at room temperature for 1 hour, and washed three times with buffer A. Next, 55 mg of o-phenylenediamine was dissolved in 100 mL of 0.1 M citric acid-0.2 M sodium phosphate buffer (pH 5.0), and immediately before use, 50 μL of 30%
A peroxidase substrate solution was prepared by adding aqueous hydrogen peroxide. 100 μL of the substrate solution was dispensed and the color was developed at room temperature. After 10 minutes, 100 μL of 1 M sulfuric acid was added to stop the reaction.
【００７９】Ｍｉｃｒｏ−ＥＬＩＳＡプレートリーダー
（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＰＬＵＳ
ＭＫＩＩ）を用いて、４９２ｎｍの波長で吸光度を測定
した。最初の投与から２ケ月後に、最も高い抗体価を有
するマウスに、０．１ｍｇのＡＧＥ−ＢＳＡを腹腔内に
ブースター投与した。この３日後に、このマウスから脾
臓リンパ球を採取し、ポリエチレングリコールの存在下
で、ミエローマであるＰ３Ｕ１細胞と融合させて融合細
胞を得た（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７
３：３−４７（１９８１））。Micro-ELISA plate reader (Titertek Multiscan PLUS)
MKII) was used to measure absorbance at a wavelength of 492 nm. Two months after the first dose, the mice with the highest antibody titer were boosted intraperitoneally with 0.1 mg of AGE-BSA. Three days later, spleen lymphocytes were collected from the mice, and fused with P3U1 cells, which are myeloma cells, in the presence of polyethylene glycol to obtain fused cells (G. Galfree and C. Milst).
ein, Methods in Enzymol. 7
3: 3-47 (1981)).
【００８０】上記融合細胞を、１０％のBSAを含むＨＡ
Ｔ培地中にて培養しハイブリドーマを得た。ハイブリド
ーマの培養上清中の抗体のＡＧＥ−ＢＳＡまたはＢＳＡ
に対する反応性を上記のＥＬＩＳＡ系で測定し、限界希
釈法によってサブクローニングした。このスクリーニン
グの結果、ＡＧＥ−ＢＳＡとは反応し、ＢＳＡとは反応
しない２株のハイブリドーマが得られた。これらの２株
をそれぞれ、６Ｄおよび１Ｄ６と命名した。The above fused cells were treated with HA containing 10% BSA.
The cells were cultured in T medium to obtain hybridomas. AGE-BSA or BSA of antibody in culture supernatant of hybridoma
Was measured in the above-mentioned ELISA system and subcloned by the limiting dilution method. As a result of this screening, two hybridomas that reacted with AGE-BSA but did not react with BSA were obtained. These two strains were named 6D and 1D6, respectively.
【００８１】Ｂａｌｂ／Ｃマウス（８週齢、♀）にプリ
スタンを０．５ｍＬ／マウス腹腔内投与した１週間後、
これらのハイブリドーマをそれぞれＢａｌｂ／ｃに１ｘ
１０7個／マウスで ０．５ｍＬ投与して腹水を産生さ
せ、投与１〜２週間後に腹水を採取した。採取した腹水
を３０００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心して上清をと
った。５０ｍＬの無細胞上清に４０％飽和となるように
硫酸アンモニウムを添加して、それぞれの抗体を沈殿さ
せた。One week after intraperitoneal administration of 0.5 mL / mouse of pristane to Balb / C mice (8 weeks old, ♀),
Each of these hybridomas was 1x Balb / c.
0.5 mL was administered at 10 7 mice / mouse to produce ascites, and ascites was collected 1-2 weeks after administration. The collected ascites was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes to obtain a supernatant. Ammonium sulfate was added to 50 mL of the cell-free supernatant to 40% saturation to precipitate each antibody.
【００８２】沈殿物を５０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、同じ緩衝液に対して透
析し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を溶
離液として、ＤＥＡＥ−セルロースカラムで精製した。
これらのモノクローナル抗体を、０．１Ｍクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶離液として、プロテイ
ンＡアフィニティカラムでさらに精製し、サブクラスを
ＩｇＧ1 と決定した。The precipitate was washed with 50 mL of 10 mM Tris-
HCl (pH 8.0), dialyzed against the same buffer, and purified on a DEAE-cellulose column using 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) as eluent.
These monoclonal antibodies were further purified on a protein A affinity column using 0.1 M sodium citrate buffer (pH 6.0) as an eluent, and the subclass was determined to be IgG1.
【００８３】（２）ＡＧＥ−ＢＳＡに対するポリクロー
ナル抗体の作製 ５０％のフロイントの完全アジュバント中に１．０ｍｇ
の抗ＡＧＥ−ＢＳＡを懸濁させ、白色家兎（日本ＳＬＣ
社より購入、体重２〜３ｋｇ）の皮内に２０〜３０箇所
投与した。皮内投与後１０日目に、５０％のフロイント
の完全アジュバントに懸濁した同量のＡＧＥ−ＢＳＡで
ブースターをかけ、週１回ずつ４週間、追加のブースタ
ー接種を行った。各家兎の皮内および筋肉内に５０％の
フロイントの不完全アジュバントに懸濁した２．０ｍｇ
の同じ抗原を最終投与した。最終投与後、１０日目に採
血し、血清を得た。(2) Preparation of polyclonal antibody against AGE-BSA 1.0 mg in 50% Freund's complete adjuvant
Was suspended in white rabbits (Japan SLC
20 to 30 places intradermally (purchased from the company, weight 2-3 kg). Ten days after intradermal administration, boosters were boosted with the same amount of AGE-BSA suspended in 50% Freund's complete adjuvant, and booster boosters were given once a week for four weeks. 2.0 mg suspended in 50% Freund's incomplete adjuvant intradermally and intramuscularly in each rabbit
Of the same antigen was given last. On the 10th day after the final administration, blood was collected to obtain serum.
【００８４】この抗血清は、ＡＧＥ−ＢＳＡを用いた二
重免疫拡散法で単一の沈降線を示した。フォルミルセル
ロファインゲルにＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡを結合さ
せ、１．４×１０ｃｍのカラムに０．０２％のＮａＮ3
を含むＰＢＳで充填した。２０ｍＬの抗血清をこのカラ
ムにかけ、非吸着画分を得て、さらに、同じゲルを充填
した別のカラムにかけてＢＳＡに反応する抗体の集団を
完全に除去した。This antiserum showed a single sedimentation line by the double immunodiffusion method using AGE-BSA. BSA or AGE-BSA was bound to the formyl cellulofine gel and 0.02% NaN3 was applied to a 1.4 × 10 cm column.
And filled with PBS. 20 mL of the antiserum was applied to this column to obtain a non-adsorbed fraction, and further applied to another column packed with the same gel to completely remove the BSA-reactive antibody population.
【００８５】非吸着画分を合わせて、ＡＧＥ−ＢＳＡを
結合させたフォルミルセルロファインゲル（１．５×１
０ｃｍ）にアプライし、このカラムをＰＢＳで洗浄し
た。カラム吸着画分を０．１Ｍのグリシン−塩酸緩衝液
（ｐＨ３．０）で溶出し、抗体画分を得た。この抗体画
分を中和し、濃縮し、ＰＢＳに対して透析した。タンパ
ク質量は７ｍｇであった。The non-adsorbed fractions were combined, and AGE-BSA-bound formyl cellulofine gel (1.5 × 1
0 cm) and the column was washed with PBS. The column-adsorbed fraction was eluted with a 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.0) to obtain an antibody fraction. This antibody fraction was neutralized, concentrated and dialyzed against PBS. The amount of protein was 7 mg.
【００８６】（実施例４）糖尿病ラット血漿中における
自己抗体の検出 （１）糖尿病ラットの作製 以下のように、ラットに糖尿病を誘発した。体重１５０
ｇのＷｉｓｔａｒ系ラット（雄、６週齢、日本ＳＬＣ社
より購入）を、ランダムに健常群と糖尿病群とに群分け
した。Example 4 Detection of Autoantibodies in Diabetic Rat Plasma (1) Preparation of Diabetic Rat Diabetes was induced in rats as follows. Weight 150
g Wistar rats (male, 6 weeks old, purchased from Japan SLC) were randomly divided into a healthy group and a diabetic group.
【００８７】糖尿病群のラットに、１０ｍＭのクエン酸
緩衝液（ｐＨ４．３）に溶解したＳＴＺ（ストレプトゾ
トシン、シグマ社製）を５０ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与
して、糖尿病を誘発した。水と餌とは、両群ともに自由
に摂取させた。ＳＴＺ投与後、１週、３週、５週、１４
週、および２９週間後に、エーテル麻酔下で、採血およ
び組織の摘出を行った。表１に各週のラットの状態を示
す。STZ (streptozotocin, Sigma) dissolved in a 10 mM citrate buffer (pH 4.3) was administered to rats in the diabetic group at 50 mg / kg in the tail vein to induce diabetes. Water and food were available ad libitum in both groups. 1 week, 3 weeks, 5 weeks, 14 weeks after STZ administration
Weeks and 29 weeks later, blood was collected and tissues were removed under ether anesthesia. Table 1 shows the state of the rats for each week.
【００８８】[0088]
【表１】 [Table 1]
【００８９】ＳＴＺ投与後１〜２９週の間、糖尿病ラッ
ト群は同週齢の健常ラット群と比較して、体重は有意に
少なかったが、血糖値は有意に高かった。 （２−１）ラット組織の調製 ＳＴＺ誘発糖尿病ラット群および同週齢の健常ラット群
の水晶体、腎臓、動脈、坐骨神経組織を摘出し、４℃あ
るいは氷上で調製した。上記の組織はそれぞれミンス
し、氷冷ＰＢＳにより３回洗浄し、組織の１０倍容の５
ｍＭのＥＤＴＡを含む氷冷ＰＢＳ中で破砕した。これら
のホモジネートに最終濃度が０．１ＭとなるようにＮａ
ＯＨを添加し、４℃で１晩、振盪した。４℃にて、１
２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上清
を試料（アルカリ可溶性画分）とした。During the period from 1 to 29 weeks after STZ administration, the diabetic rat group had significantly lower body weight but significantly higher blood glucose level than the healthy rat group of the same age. (2-1) Preparation of rat tissue The lens, kidney, artery, and sciatic nerve tissue of the STZ-induced diabetic rat group and the same-age healthy rat group were excised and prepared at 4 ° C or on ice. Each of the above tissues was minced, washed three times with ice-cold PBS, and 5 times the volume of the tissue.
Crushed in ice-cold PBS containing mM EDTA. NaOH was added to these homogenates to a final concentration of 0.1M.
OH was added and shaken at 4 ° C. overnight. At 4 ° C, 1
The mixture was centrifuged at 2,000 rpm for 15 minutes, and the obtained supernatant was used as a sample (alkali-soluble fraction).
【００９０】赤血球は、これらの各ラットの血液５ｍＬ
を遠心分離して採取し、５ｍＬの氷冷ＰＢＳにより３回
洗浄した。洗浄後、赤血球を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む
０．１ＭのＮａＯＨ２ｍＬ中に懸濁し、以下、上記の組
織の場合と同様に処理を行った。Erythrocytes were obtained from 5 mL of blood from each of these rats.
Was collected by centrifugation and washed three times with 5 mL of ice-cold PBS. After washing, the erythrocytes were suspended in 2 mL of 0.1 M NaOH containing 5 mM EDTA, and the treatment was performed in the same manner as in the case of the above tissue.
【００９１】（２−２）ＡＧＥの測定 実施例３と同様の非競合ＥＬＩＳＡ法で、上記ラット組
織抽出液中のＡＧＥ化タンパク質を測定した。５０ｍＭ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）で各ラット組織抽出液を１０
ｎｇ−１０μｇ／ｍＬに希釈し、４℃で一晩静置して固
相化した。ブロッキング処理後、希釈溶液で１μｇ／ｍ
Ｌに希釈した抗ＡＧＥモノクロ−ナル抗体（６Ｄ１２）
を１００μＬ分注し、室温にて１時間反応させた。次い
で、希釈溶液で２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（以下，「ＨＲＰ」という）標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を１００μＬ分注し、室温で３０分間反応させ
た。次に、実施例３と同様に調製したペルオキシダーゼ
基質溶液を１００μＬ分注し、室温で発色させた後、１
００μＬの１Ｍ硫酸を添加して反応を停止させ、４９２
ｎｍの吸光度を測定した。(2-2) Measurement of AGE The AGE-converted protein in the above rat tissue extract was measured by the same non-competitive ELISA method as in Example 3. 50 mM
Extract each rat tissue extract with carbonate buffer (pH 9.7)
The mixture was diluted to ng-10 μg / mL, and allowed to stand at 4 ° C. overnight to solidify. After blocking treatment, 1 μg / m
Anti-AGE monoclonal antibody diluted in L (6D12)
Was dispensed in an amount of 100 μL and reacted at room temperature for 1 hour. Next, horseradish peroxidase (hereinafter referred to as “HRP”) labeled anti-mouse Ig diluted 2000-fold with the diluted solution
100 μL of the G antibody was dispensed and reacted at room temperature for 30 minutes. Next, 100 μL of a peroxidase substrate solution prepared in the same manner as in Example 3 was dispensed, and the color was developed at room temperature.
The reaction was stopped by adding 00 μL of 1 M sulfuric acid and 492
The absorbance at nm was measured.
【００９２】それぞれの組織中のＡＧＥ量は、ＡＧＥ−
ＢＳＡ（１ｐｇ−１μｇ／ｍＬ）を６Ｄ１２と反応させ
て作成した検量線より算出し、１ｍｇのタンパク質当た
りのＡＧＥ−ＢＳＡ換算量を求めた。結果は、健常ラッ
ト組織中ＡＧＥ量を１として糖尿病ラット組織中ＡＧＥ
量を算出した相対比として表した。The amount of AGE in each tissue was as follows:
Calculated from a calibration curve prepared by reacting BSA (1 pg-1 μg / mL) with 6D12, the amount of AGE-BSA conversion per 1 mg of protein was determined. The results are as follows: AGE in healthy rat tissue is set to 1 and AGE in diabetic rat tissue is considered.
The amounts were expressed as calculated relative ratios.
【００９３】図２に示すように、赤血球においてＳＴＺ
投与後１週間で、健常ラットと比較して１．３倍のＡＧ
Ｅの有意な増加が認められた。さらに、その後も増加が
続き、ＳＴＺ投与後５週間で定常状態（１．９倍）とな
った。他の組織（腎臓、水晶体、動脈および坐骨神経）
においても、それぞれのＡＧＥの増加速度に違いがある
ものの、同様にＡＧＥの顕著な増加が認められた。[0093] As shown in FIG.
One week after the administration, 1.3 times more AG was obtained compared to healthy rats.
A significant increase in E was observed. Furthermore, the increase continued thereafter, and reached a steady state (1.9 times) 5 weeks after STZ administration. Other tissues (kidney, lens, artery and sciatic nerve)
In the above, although there was a difference in the rate of increase of each AGE, a remarkable increase of the AGE was also observed.
【００９４】以上の結果ならびに他の研究者らの同様の
報告（Ｈ．Ｎａｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ４２：３４５−３５０（１９９３）；Ｔ．Ｍｉ
ｔｓｈｕｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
４２：８２６−８３２（１９９３））により、実際
に、ＳＴＺ誘発糖尿病状態では、赤血球、水晶体、腎
臓、動脈および坐骨神経の組織中において、ＡＧＥが生
成されることが明らかになった。The above results and similar reports from other researchers (H. Nakayama, et al., Diabet)
tes 42 : 345-350 (1993); Mi
shushushi, et al. , Diabetes
42 : 826-832 (1993)) revealed that in the STZ-induced diabetic state, AGEs are actually produced in tissues of red blood cells, lens, kidney, artery and sciatic nerve.
【００９５】（3）AGEに対する免疫活性の測定 実施例3と同様の非競合ELISA法で、AGEに対する免疫活
性を測定した。10μg/mLのAGE-BSAおよび対照としてBSA
を100μL分注して固相化した後、ブロッキング処理を行
った。ついで、希釈溶液で1mg/mLに希釈したラット血漿
を100μL 分注して室温で１時間反応させた後、希釈溶
液で2,000倍希釈したHRP標識抗ラットIgG抗体を100μL
分注し、室温で３０分間反応させた。次に、ペルオキシ
ダーゼ基質溶液を100μL 分注し、室温で１０分間発色
させた後、100μLの１Ｍ硫酸100μLを添加して反応を停
止させ、492ｎｍの吸光度を測定した。(3) Measurement of AGE Immune Activity The AGE immune activity was measured by the same non-competitive ELISA method as in Example 3. 10 μg / mL AGE-BSA and BSA as control
Was dispensed in an amount of 100 μL and immobilized, and then a blocking treatment was performed. Then, 100 μL of rat plasma diluted to 1 mg / mL with the diluting solution was dispensed and allowed to react at room temperature for 1 hour. Then, 100 μL of HRP-labeled anti-rat IgG antibody diluted 2,000-fold with the diluting solution was used.
The mixture was dispensed and reacted at room temperature for 30 minutes. Next, 100 μL of a peroxidase substrate solution was dispensed, and the color was developed at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 100 μL of 1 M sulfuric acid (100 μL) was added to stop the reaction, and the absorbance at 492 nm was measured.
【００９６】図3に、AGE-BSAあるいはBSAに対する健常
ラット血漿および糖尿病ラット血漿の免疫活性の経時変
化を示す。 AGE-BSAおよびBSAに対する免疫活性は、健
常ラットではいずれも変化はなかったが、糖尿病ラット
では、糖尿病の進行（罹病期間の長期化）とともにAGE-
BSA対する免疫活性が大きく上昇することが示された。
これより、糖尿病ラットにおいて組織中にAGEが生成す
るにつれ、これに対する自己抗体が産生されることが示
唆された。FIG. 3 shows the time course of the immunological activity of AGE-BSA or plasma of healthy rats and diabetic rats against BSA. AGE-BSA and immune activity against BSA did not change in healthy rats, but in diabetic rats, AGE-BSA increased with progression of diabetes (prolonged illness).
It was shown that the immune activity against BSA was greatly increased.
This suggested that as AGEs were produced in tissues in diabetic rats, autoantibodies against AGEs were produced.
【００９７】（実施例5）糖尿病ラット血漿中の自己抗
体のAGEに対する特異性競合ELISA法により、上記の糖尿
病ラット血漿中（ STZ投与5週間後）の自己抗体のAGEに
対する特異性について検討を行った。実施例3の非競合E
LISA法の場合と同様に、10μg/mLのAGE-BSAを100μL分
注して固相化した後、ブロッキング処理を行った。次
に、あらかじめ1mg/mLの糖尿病ラット血漿中に0〜1mg/m
Lになるように競合物質を添加し、室温で30分間反応さ
せた血漿100μLを入れた。競合物質としては、実施例2
で作製したAGE構造体のAGE-BSA、CML-BSAおよびCEL-BS
A、さらに対照としてBSAを用いた。室温で1時間血漿を
反応させた後、実施例4と同様に2000倍希釈のHRP標識抗
ラットIgG抗体と反応させて、492ｎｍの吸光度を測定し
た。(Example 5) Specificity of autoantibodies in diabetic rat plasma for AGE The specificity of autoantibodies in diabetic rat plasma (5 weeks after STZ administration) for AGE was examined by competitive ELISA. Was. Non-competitive E of Example 3
As in the case of the LISA method, 100 μL of 10 μg / mL AGE-BSA was dispensed and immobilized, followed by blocking treatment. Next, 0-1 mg / m in 1 mg / mL diabetic rat plasma in advance.
A competitor was added so as to obtain L, and 100 μL of plasma reacted at room temperature for 30 minutes was added. As a competitor, Example 2
AGE-BSA, CML-BSA and CEL-BS of the AGE structure prepared in
A, BSA was used as a control. After allowing the plasma to react at room temperature for 1 hour, it was reacted with a 2000-fold diluted HRP-labeled anti-rat IgG antibody as in Example 4, and the absorbance at 492 nm was measured.
【００９８】結果は、競合物質の非存在下に対する以下
に示す相対比（B/B0）で表した。B/B0 = （競合物質存
在下の吸光度）/（競合物質非存在下の吸光度）図4に示
すように糖尿病ラット血漿中の自己抗体のAGE-BSAに対
する反応性は、AGE構造体であるAGE-BSA、CML-BSAおよ
びCEL-BSAにより阻害されたが、BSAによっては阻害され
なかった。このことから、糖尿病ラット血漿中の自己抗
体は、AGE構造に対して特異的であることが示唆され
た。The results were expressed by the following relative ratio (B / B0) to the absence of a competitor. B / B0 = (absorbance in the presence of competitor) / (absorbance in absence of competitor) As shown in FIG. 4, the reactivity of autoantibodies in diabetic rat plasma with AGE-BSA is determined by the AGE structure -Inhibited by BSA, CML-BSA and CEL-BSA, but not by BSA. This suggested that autoantibodies in diabetic rat plasma were specific for the AGE structure.
【００９９】（実施例6）糖尿病ラットにおける自己抗
体の抗体価 非競合ELISA法により、上記の糖尿病ラット血漿中（STZ
投与5週間後）のAGEに対する自己抗体の抗体価を測定し
た。実施例3の非競合ELISA法と同様に、10μg/mLのAGE-
BSA、CML-BSA、CEL-BSAおよび対照としてBSAを100μL分
注して固相化を行った。以下、実施例4の非競合ELISA法
と同じ操作により最終的に492ｎｍの吸光度を測定し、
各血漿試料のAGE-BSA、CML-BSAあるいはCEL-BSAに対す
る吸光度から、対照のBSAに対する吸光度を差し引いた
値（Δ492nm)をAGE構造に特異的な反応性とし、自己抗
体の抗体価の指標とした。上記した結果を示す図5から
明らかなとおり、健常ラットに比較して糖尿病ラットに
おいては、AGEに対する抗体価の有意な上昇が示され
た。(Example 6) Antibody titer of autoantibodies in diabetic rats In non-competitive ELISA, plasma (STZ
Five weeks after the administration), the antibody titer of the autoantibody to AGE was measured. As in the non-competitive ELISA method of Example 3, 10 μg / mL AGE-
100 μL of BSA, CML-BSA, CEL-BSA and BSA as a control were dispensed and immobilized. Hereinafter, finally measured absorbance at 492 nm by the same operation as the non-competitive ELISA method of Example 4,
The value obtained by subtracting the absorbance for control BSA (Δ492 nm) from the absorbance for AGE-BSA, CML-BSA or CEL-BSA of each plasma sample was defined as the specific reactivity to the AGE structure. did. As is clear from FIG. 5 showing the results described above, the diabetic rat showed a significant increase in the antibody titer against AGE as compared with the healthy rat.
【０１００】（実施例7）糖尿病患者血漿中の自己抗体
の検出 （1）自己抗体のカラムによる精製 AGE-BSAあるいはBSAをフォルミルセルロファインゲル
に、Takataらの方法（K.Takata et al., J. Biol.Chem.
263:14819-14825(1988)）に従ってカップリングした。
８名の糖尿病患者の血漿 20mLを、PBSにより充填したBS
Aカップリング-フォルミルセルロファインゲルカラム
（1.0×10cm）に通した。カラム非吸着画分を、AGE-BSA
カップリング-フォルミルセルロファインゲル充填カラ
ム（1.5×10cm）に通した。大量のPBSでカラムを洗浄し
た後、カラム吸着画分を50mLの1.0Mグリシン-塩酸緩衝
液（pH3.0）にて溶出させた。溶出画分をＰＢＳにて透
析した後、自己抗体測定用試料とした。Example 7 Detection of Autoantibodies in Diabetic Patient Plasma (1) Purification of Autoantibodies by Column AGE-BSA or BSA was applied to formylcellulofine gel by the method of Takata et al. (K.Takata et al. , J. Biol. Chem.
263: 14819-14825 (1988)).
BS filled with 20 mL of plasma from 8 diabetic patients
The solution was passed through an A coupling-formyl cellulofine gel column (1.0 × 10 cm). AGE-BSA
The solution was passed through a coupling-formyl cellulofine gel packed column (1.5 × 10 cm). After washing the column with a large amount of PBS, the column-adsorbed fraction was eluted with 50 mL of 1.0 M glycine-HCl buffer (pH 3.0). The eluted fraction was dialyzed against PBS and used as a sample for autoantibody measurement.
【０１０１】（2）自己抗体のAGE構造に対する特異性 実施例5と同様の競合ELISA法により検討した。実施例5
の非競合ELISAと同様に、10μg/mLのAGE-BSAを100μL分
注して固相化した後、ブロッキング処理を行った。つい
で、あらかじめ0.1μg/mLの上記の自己抗体測定用試料
に0〜1mg/mLになるように競合物質を添加して、室温で3
0分間反応させたものを100μL入れた。競合物質として
は、実施例5と同じくAGE-BSA、CML-BSA、CEL-BSA、およ
びBSAを用いた。室温で1時間反応させた後、2000倍希釈
のビオチン化抗ヒトIgG抗体と室温で30分間反応させ
た。ついで、アビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合体溶液と反応させ後、ペルオキシダーゼ基質
溶液で発色させて492ｎｍの吸光度を測定した。結果
は、実施例5と同様にB/B0で表した。(2) Specificity of the autoantibody for the AGE structure [0107] The autoantibody was examined by the same competitive ELISA method as in Example 5. Example 5
Similarly to the non-competitive ELISA described above, 100 μL of 10 μg / mL AGE-BSA was dispensed and immobilized, followed by blocking treatment. Then, a competitor was added to the autoantibody measurement sample at 0.1 μg / mL at a concentration of 0 to 1 mg / mL in advance, and the mixture was added at room temperature for 3 hours.
100 µL of the mixture reacted for 0 minutes was added. As competitors, AGE-BSA, CML-BSA, CEL-BSA and BSA were used as in Example 5. After reacting for 1 hour at room temperature, it was reacted with a biotinylated anti-human IgG antibody diluted 2000-fold for 30 minutes at room temperature. Next, after reacting with an avidin-biotin horseradish peroxidase complex solution, the color was developed with a peroxidase substrate solution, and the absorbance at 492 nm was measured. The results were represented by B / B0 as in Example 5.
【０１０２】図６に示すように、自己抗体のAGE-BSAに
対する反応性は、AGE構造体であるAGE-BSA、CML-BSAお
よびCEL-BSAにより阻害されたが、BSAによっては阻害さ
れなかった。この結果から、糖尿病患者においても糖尿
病ラットと同様に、AGEに対して特異的な自己抗体が存
在することが示唆された。As shown in FIG. 6, the reactivity of the autoantibody to AGE-BSA was inhibited by the AGE structures AGE-BSA, CML-BSA and CEL-BSA, but not by BSA. . This result suggests that diabetic patients have autoantibodies specific to AGE similarly to diabetic rats.
【０１０３】（実施例８）糖尿病患者、糖尿病性腎症お
よび非糖尿病性腎症患者血漿中の自己抗体の測定 糖尿病患者、糖尿病性腎症および非糖尿病性腎症患者血
漿中の自己抗体を実施例6と同様に非競合ELISA法により
測定した。 （1）ヒト血漿試料 ヒトの血漿試料は、下記表2の6グループ(各10名で構
成）より採取した。(Example 8) Measurement of autoantibodies in plasma of diabetic patients, diabetic nephropathy and non-diabetic nephropathy patients Autoantibodies in plasma of diabetic patients, diabetic nephropathy and non-diabetic nephropathy patients The measurement was performed by a non-competitive ELISA method as in Example 6. (1) Human plasma samples Human plasma samples were collected from the following six groups of Table 2 (consisting of 10 persons each).
【０１０４】[0104]
【表２】 [Table 2]
【０１０５】表中、糖尿病性腎症：早期は微量アルブミ
ン尿を伴う糖尿病患者を、糖尿病性腎症：顕性期は持続
性タンパク尿を伴う糖尿病患者をそれぞれ表す。透析患
者からの採血は透析治療直前に行った。 （2）AGE-BSAを用いた自己抗体の測定 表2に示した患者血漿に以下の前処理を行った後、非競
合ELISA法にて自己抗体を測定した。In the table, diabetic nephropathy: the early stage represents a diabetic patient with microalbuminuria, and the diabetic nephropathy: the overt phase represents a diabetic patient with persistent proteinuria. Blood was collected from dialysis patients immediately before dialysis treatment. (2) Measurement of autoantibodies using AGE-BSA After performing the following pretreatment on the patient plasma shown in Table 2, autoantibodies were measured by a non-competitive ELISA method.
【０１０６】（2-1）ヒトの血漿試料のバッチ法による
前処理 マイクロ遠沈チューブ（容量1.5mL）に、ゲル容量が500
μLとなるようにBSAカップリング-フォルミルセルロフ
ァインゲルを充填した後、500μL のPBSを添加する。こ
のチューブに６グループそれぞれの血漿100μLを加え
て、４℃で１晩振盪させた後15,000rpmで30秒間遠心し
た。(2-1) Pretreatment of Human Plasma Sample by Batch Method A micro centrifuge tube (capacity 1.5 mL) has a gel volume of 500
After filling with BSA coupling-formyl cellulofine gel to make up to μL, add 500 μL of PBS. 100 μL of each group of plasma was added to the tube, and the tube was shaken at 4 ° C. overnight, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 30 seconds.
【０１０７】上清 550μL を、ゲル容量500μLのAGE-BS
Aカップリング-フォルミルセルロファインゲル充填マイ
クロ遠沈チューブ（容量1.5mL）に添加し、４℃で６時
間振盪した。ゲルを3回 PBSで洗浄した後、500μLの0.1
Ｍのグリシンー塩酸緩衝液（pH2.3）に添加して、４℃
で30分間振盪後15,000rpmで30秒間遠心した。400μLの
上清に１Ｍトリスー塩酸緩衝液（pH9.5）を50μL添加し
て中和し、自己抗体測定用の試料とした。550 μL of the supernatant was mixed with 500 μL of gel volume of AGE-BS.
A coupling was added to a microcentrifuge tube (volume: 1.5 mL) filled with formylcellulofine gel, and shaken at 4 ° C. for 6 hours. After washing the gel three times with PBS, 500 μL of 0.1
M glycine-HCl buffer (pH 2.3)
And then centrifuged at 15,000 rpm for 30 seconds. To 400 μL of the supernatant, 50 μL of 1M Tris-HCl buffer (pH 9.5) was added to neutralize, and used as a sample for autoantibody measurement.
【０１０８】（2-2）AGE-BSAを用いた非競合ELISA法に
よる測定 実施例6の非競合ELISA法と同様に、10μg/mLのAGE-BS
A、および対照としてBSAを100μL分注して固相化し、ブ
ロッキング処理を行った。次に、希釈溶液で2倍希釈し
た上記自己抗体測定用試料を100μL入れて、室温で1時
間反応させた後、ビオチン化抗ヒトIgG抗体を室温で30
分間反応させた。以下、実施例4の非競合ELISA法と同じ
操作により最終的に492ｎｍの吸光度を測定し、各測定
試料のAGE-BSAに対する吸光度から、対照のBSAに対する
吸光度を差し引いた値（Δ492nm)をAGE構造に特異的な
反応性とし、自己抗体の抗体価の指標とした。(2-2) Measurement by non-competitive ELISA method using AGE-BSA As in the non-competitive ELISA method of Example 6, 10 μg / mL AGE-BS
A and 100 μL of BSA were dispensed as a control and immobilized, and a blocking treatment was performed. Next, 100 μL of the autoantibody measurement sample diluted 2-fold with the diluting solution was added, and reacted at room temperature for 1 hour.
Allowed to react for minutes. Hereinafter, the absorbance at 492 nm was finally measured by the same operation as the non-competitive ELISA method of Example 4, and the value obtained by subtracting the absorbance for control BSA from the absorbance for AGE-BSA of each measurement sample (Δ492 nm) was used as the AGE structure. , And used as an index for the antibody titer of the autoantibody.
【０１０９】図７に示すように、ヒト血漿中の抗体価は
糖尿病により上昇し、さらに糖尿病性合併症の糖尿病性
腎症においては腎症の進展とともに顕著な上昇が認めら
れた。特に、糖尿病性腎症の顕性期および透析療法期の
患者においては、健常人に対してだけでなく腎症を伴わ
ない糖尿病患者に対しても有意な上昇を示した。また、
糖尿病の他にAGEの関与が示唆されている非糖尿病性腎
症においても、有意な上昇が示された。As shown in FIG. 7, the antibody titer in human plasma increased due to diabetes, and in diabetic nephropathy, which is a diabetic complication, a remarkable increase was observed as the nephropathy progressed. In particular, in the patients in the overt phase and dialysis treatment phase of diabetic nephropathy, a significant increase was shown not only in healthy subjects but also in diabetic patients without nephropathy. Also,
In non-diabetic nephropathy, where the involvement of AGE was suggested in addition to diabetes, a significant increase was also shown.
【０１１０】（3）CEL-BSAを用いた自己抗体の測定 表2に示した患者血漿に以下の前処理を行った後、非競
合ELISA法にて自己抗体を測定した。 （3-1）ヒトの血漿試料の前処理 10mg/mLのBSA含有PBS１．５ｍＬに、上記６グループそ
れぞれの血漿5μLを添加して４℃で一晩静置したものを
測定用試料とした。(3) Measurement of autoantibodies using CEL-BSA After the following pretreatment was performed on the patient plasma shown in Table 2, autoantibodies were measured by a non-competitive ELISA method. (3-1) Pretreatment of human plasma sample A sample for measurement was prepared by adding 5 μL of each of the above-mentioned 6 groups of plasma to 1.5 mL of PBS containing 10 mg / mL BSA and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
【０１１１】（3-2）CEL-BSAを用いた非競合ELISA法に
よる測定 実施例6の非競合ELISA法と同様に、10μg/mLのCEL-BS
A、および対照としてBSAを100μL分注して固相化し、ブ
ロッキング処理を行った。次に、希釈溶液で300倍希釈
した上記の血漿を100μL入れて、室温で1時間反応させ
た。以下、実施例8（2-2）と同じ操作により最終的に49
2ｎｍの吸光度を測定し、各測定試料のCEL-BSAに対する
吸光度から、対照のBSAに対する吸光度を差し引いた値
（Δ492nm)をAGEに特異的な反応性とし、自己抗体の抗
体価の指標とした。(3-2) Measurement by non-competitive ELISA using CEL-BSA As in the non-competitive ELISA of Example 6, 10 μg / mL CEL-BS
A and 100 μL of BSA were dispensed as a control and immobilized, and a blocking treatment was performed. Next, 100 μL of the above plasma diluted 300-fold with the diluted solution was added thereto, and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the same operation as in Example 8 (2-2) was finally performed to obtain 49
The absorbance at 2 nm was measured, and the value obtained by subtracting the absorbance of control sample against BSA from the absorbance of CEL-BSA (Δ492 nm) was defined as AGE-specific reactivity, which was used as an index of autoantibody antibody titer.
【０１１２】上記結果を示す図８から明らかなように、
図７のAGEとしてAGE-BSAを用いて測定した場合と同様
に、ヒト血漿中の抗体価は、糖尿病により上昇し、さら
に糖尿病性腎症および非糖尿病性腎症において健常に対
して有意な上昇が認められた。As is clear from FIG. 8 showing the above results,
As in the case of using AGE-BSA as the AGE in FIG. 7, the antibody titer in human plasma increases due to diabetes, and further significantly increases in diabetic nephropathy and non-diabetic nephropathy with respect to normal. Was observed.
【０１１３】[0113]
【発明の効果】本発明の方法により、ＡＧＥに対する自
己抗体を免疫学的に測定することにより、ＡＧＥの生成
および蓄積が関与する疾患、すなわち、糖尿病、糖尿病
性合併症、非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患を検査
できる。本発明は、このような疾患の検査用キットおよ
び検査用試薬を提供する。これらの検査試薬または検査
キットを使用すれば、自己抗体の量から糖尿病合併症な
どがどの段階にあるかを精度よく判断することができ
る。また、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症ま
たは老化に伴う疾患に対する治療薬あるいは治療薬候補
化合物を投与したときと投与しなかったときのＡＧＥに
対する自己抗体を測定して、比較することにより上記疾
患治療薬の薬効を評価することができる。According to the method of the present invention, autogenous antibodies against AGE are immunologically measured to determine the diseases involved in the generation and accumulation of AGE, ie, diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or It can test for diseases associated with aging. The present invention provides a test kit and a test reagent for such a disease. If these test reagents or test kits are used, it is possible to accurately judge the stage of the diabetic complication or the like based on the amount of autoantibodies. In addition, to measure and compare autoantibodies to AGE when a therapeutic agent or a therapeutic candidate compound for diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or a disease associated with aging is administered and not administered. Thus, the efficacy of the above therapeutic drug can be evaluated.
【図１】メイラード反応の反応経路を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a reaction route of a Maillard reaction.
【図２】糖尿病ラット組織中のＡＧＥの増加を示す図で
ある。FIG. 2 shows the increase of AGE in diabetic rat tissue.
【図３】糖尿病ラット血漿のＡＧＥに対する免疫反応性
と糖尿病罹病期間との関係を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the relationship between the immunoreactivity of diabetic rat plasma for AGE and the duration of diabetes.
【図４】糖尿病ラット血漿の自己抗体のＡＧＥ特異性を
示す図である。FIG. 4 shows the AGE specificity of autoantibodies in diabetic rat plasma.
【図５】糖尿病ラット血漿の自己抗体価を示す図であ
る。FIG. 5 is a graph showing the autoantibody titer of diabetic rat plasma.
【図６】糖尿病患者血漿中の自己抗体のＡＧＥ特異性を
示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the AGE specificity of autoantibodies in the plasma of diabetic patients.
【図７】ＡＧＥ−ＢＳＡを用いて測定したヒト血漿の自
己抗体価と疾患との関係を示す図である。FIG. 7 is a graph showing the relationship between autoantibody titers in human plasma measured using AGE-BSA and diseases.
【図８】ＣＥＬ−ＢＳＡを用いて測定したヒト血漿の自
己抗体価と疾患との関係を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing the relationship between autoantibody titers in human plasma measured using CEL-BSA and diseases.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4H045 AA10 AA11 BA10 BA50 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA51 FA52 FA72 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/08 C12P 21/08 (C12P 21/08 C12R 1:91) F-term (Reference) 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4H045 AA10 AA11 BA10 BA50 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA51 FA52 FA72
Claims (12)
抗体を免疫学的測定法により検出する方法。1. A method for detecting an autoantibody against a late product of the Maillard reaction by an immunoassay.
物におけるN−カルボキシメチルリジン以外をエピトー
プとして認識する、請求項1に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the autoantibody recognizes an epitope other than N-carboxymethyllysine in a late product of the Maillard reaction as an epitope.
ジンをエピトープとして認識する、請求項1に記載の方
法。3. The method of claim 1, wherein said autoantibody recognizes N-carboxyethyllysine as an epitope.
た標識免疫学的測定法である、請求項1〜3のいずれかに
記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the immunoassay is a labeled immunoassay using a labeled structure.
応後期生成物、抗メイラード反応後期生成物抗体または
抗免疫グロブリン抗体である、請求項4に記載の方法。5. The method according to claim 4, wherein the labeled structure is a labeled Maillard reaction late product, anti-Maillard reaction late product antibody or anti-immunoglobulin antibody.
合物および化学発光化合物から選ばれる、請求項4また
は５に記載の方法。6. The method according to claim 4, wherein said label is selected from an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound and a chemiluminescent compound.
抗体を免疫学的測定法により検出する工程と、検出され
た自己抗体の抗体価を健常人の自己抗体の抗体価と比較
する工程とを含む、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病
性腎症または老化に伴う疾患の検査方法。7. A step of detecting an autoantibody against the late product of the Maillard reaction by an immunoassay, and a step of comparing the antibody titer of the detected autoantibody with the antibody titer of a healthy human autoantibody. A method for testing diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging.
ード反応後期生成物を含む、糖尿病、糖尿病性合併症、
非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患の検査用キット。8. Diabetes, diabetic complications comprising at least a sample diluent and a Maillard late reaction product.
A kit for testing nondiabetic nephropathy or diseases associated with aging.
標識された抗メイラード反応後期生成物抗体または標識
された抗免疫グロブリン抗体をさらに含む、請求項８に
記載の検査用キット。9. A labeled late product of the Maillard reaction,
The test kit according to claim 8, further comprising a labeled anti-Maillard reaction late product antibody or a labeled anti-immunoglobulin antibody.
ード反応後期生成物イディオタイプ抗体または抗メイラ
ード反応後期生成物抗体を固相化するための固相をさら
に含む、請求項８または９に記載の検査用キット。10. The test according to claim 8, further comprising a solid phase for immobilizing the late Maillard reaction product, anti-Maillard late reaction product idiotype antibody, or anti-Maillard late product antibody. Kit.
たメイラード反応後期生成物、抗メイラード反応後期生
成物イディオタイプ抗体、抗メイラード反応後期生成物
抗体、標識された抗メイラード反応後期生成物抗体およ
び標識された抗免疫グロブリン抗体から選ばれる１以上
を含む、糖尿病、糖尿病性合併症、非糖尿病性腎症また
は老化に伴う疾患の検査用試薬11. A Maillard late product, a labeled Maillard late product, an anti-Maillard late product idiotype antibody, an anti-Maillard late product antibody, a labeled anti-Maillard late product antibody and a label A reagent for testing diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or diseases associated with aging, comprising one or more selected from selected anti-immunoglobulin antibodies
腎症または老化に伴う疾患の治療薬を投与したヒトを含
む動物の血漿または血清中の、メイラード反応後期生成
物に対する自己抗体を免疫学的測定法により測定し、こ
れと治療薬を投与しないヒトを含む動物の血漿または血
清中の、メイラード反応後期生成物に対する自己抗体を
免疫学的測定法により測定し、上記２つの測定値を比較
して評価することからなる、糖尿病、糖尿病性合併症、
非糖尿病性腎症または老化に伴う疾患の治療薬の薬効評
価方法。12. Immunology of autoantibodies to the late product of the Maillard reaction in the plasma or serum of an animal, including a human, administered a therapeutic agent for diabetes, diabetic complications, non-diabetic nephropathy or a disease associated with aging. Auto-antibodies to the late product of the Maillard reaction in plasma or serum of animals including humans not treated with a therapeutic agent were measured by immunoassay, and the two measured values were compared. Diabetes, diabetic complications,
A method for evaluating the efficacy of a therapeutic drug for non-diabetic nephropathy or a disease associated with aging.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000074398A JP2001004627A (en) | 1999-04-19 | 2000-03-16 | Immunological detection method for autoantibody against maillard reaction latter-period product |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-111314 | 1999-04-19 | ||
| JP11131499 | 1999-04-19 | ||
| JP2000074398A JP2001004627A (en) | 1999-04-19 | 2000-03-16 | Immunological detection method for autoantibody against maillard reaction latter-period product |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001004627A true JP2001004627A (en) | 2001-01-12 |
Family
ID=26450736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000074398A Pending JP2001004627A (en) | 1999-04-19 | 2000-03-16 | Immunological detection method for autoantibody against maillard reaction latter-period product |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001004627A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101433362B1 (en) | 2013-02-04 | 2014-08-26 | 한국식품연구원 | Composition for immunological enhancement comprising glycoprotein produced by Maillard reaction between alpha-lactalbumin and dextran |
| CN104634943A (en) * | 2015-01-22 | 2015-05-20 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | Method for measuring salt content of saline and alkaline soil on line |
| CN105739575A (en) * | 2016-01-29 | 2016-07-06 | 中国农业大学 | Greenhouse vegetable environmental parameter data fusion method, data fusion device, and data fusion system |
| CN108508202A (en) * | 2018-03-30 | 2018-09-07 | 南京师范大学 | A kind of methods and applications of hypersensitive, multi-residue determination Advanced glycation endproducts |
| CN109239350A (en) * | 2018-08-06 | 2019-01-18 | 连步生物科技(南京)有限公司 | Body fluid AGEs autoantibody is preparing the application in diabetogenous nephrosis disease early diagnosis reagent |
-
2000
- 2000-03-16 JP JP2000074398A patent/JP2001004627A/en active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101433362B1 (en) | 2013-02-04 | 2014-08-26 | 한국식품연구원 | Composition for immunological enhancement comprising glycoprotein produced by Maillard reaction between alpha-lactalbumin and dextran |
| CN104634943A (en) * | 2015-01-22 | 2015-05-20 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | Method for measuring salt content of saline and alkaline soil on line |
| CN104634943B (en) * | 2015-01-22 | 2016-11-16 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | A kind of On-line Measuring Method of salinized soil salinity |
| CN105739575A (en) * | 2016-01-29 | 2016-07-06 | 中国农业大学 | Greenhouse vegetable environmental parameter data fusion method, data fusion device, and data fusion system |
| CN108508202A (en) * | 2018-03-30 | 2018-09-07 | 南京师范大学 | A kind of methods and applications of hypersensitive, multi-residue determination Advanced glycation endproducts |
| CN109239350A (en) * | 2018-08-06 | 2019-01-18 | 连步生物科技(南京)有限公司 | Body fluid AGEs autoantibody is preparing the application in diabetogenous nephrosis disease early diagnosis reagent |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100257733B1 (en) | Immunochemical detection of in vivo advanced glycosylation end products | |
| US20140322723A1 (en) | Diabetes diagnosis through the detection of glycated proteins in urine | |
| US5766590A (en) | Therapeutic methods and pharmaceutical compositions | |
| USRE39138E1 (en) | Monoclonal antibody specific for advanced glycosylation endproducts in biological samples | |
| WO1996020958A9 (en) | Monoclonal antibodies specific for advanced glycosylation endproducts in biological samples | |
| EP0840126B1 (en) | Marker and immunological reagent for dialysis-related amyloidosis, diabetes mellitus and diabetes mellitus complications | |
| JP2001004627A (en) | Immunological detection method for autoantibody against maillard reaction latter-period product | |
| JP3490715B2 (en) | Method for detecting hemoglobin-promoting glucosylated end products | |
| JP6141257B2 (en) | C1q-adiponectin complex and use thereof | |
| JP2003300961A (en) | New pyridinium derivative and method for utilizing the same | |
| JP3542227B2 (en) | Immunoreagent | |
| JP3944499B2 (en) | Method for measuring glycation end product bound to protein | |
| JP2002243732A (en) | New antibody, and immune reagent containing the antibody | |
| JP3479453B2 (en) | Method for measuring tegafur in urine | |
| JP3542245B2 (en) | Uses and immunoreagents as markers for diabetes or diabetic complications | |
| JPH08313530A (en) | Method for measuring total hemoglobin and measuring kit | |
| JP3671095B2 (en) | Method for measuring glycation end product bound to protein | |
| JPH0821835A (en) | Immunoassay for d-chiloinositol | |
| JP4590117B2 (en) | Immunoassay reagent | |
| JP4505800B2 (en) | Anti-renal type IV monoclonal antibody | |
| JP3542240B2 (en) | Use as marker for dialysis amyloidosis and immunoreagent for dialysis amyloidosis | |
| JPH01224400A (en) | Monoclonal antibody recognizing human arteriosclerosis and its production | |
| JP2010271295A (en) | Measuring reagent | |
| JP2007332122A (en) | Anti-nc1 monoclonal antibody reactive peptide | |
| JPH03156369A (en) | Measurement of human albumin |