【発明の詳細な説明】
核酸センサー
発明の分野
本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在の検出に使用するためのバ
イオセンサーおよびサンプル中の選択された核酸(ＮＡ)配列の存在を検出する方
法に関する。
発明の背景
サンプル中の特有なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在のためのアッセイは多くの
分野における適用を有する。例えば、特異的な微生物を持った患者の感染は、そ
の微生物に特有なＮＡ配列の存在のために患者からの生物学的サンプルの分析に
より評価することができる。別の適用は、食品または環境のサンプルの不純物を
検出するための分析を含む。突然変異によって生じる遺伝病の検出もまた、これ
らの技法によって達成することができる。
これまで、このより高い感受性の方法の普及した使用は、特異的な核酸配列の
量の顕著な増殖化の要求のために及び／又は増殖したＤＮＡを分析するための特
殊化された技法を用いることの要求のため、制限されていた。この増殖化は一般
に、ポリメラーゼ連鎖又はリガーゼ連鎖反応を用いて達成され、さらに増殖され
たＤＮＡはゲル上で分離され、そのゲルがＤＮＡの特異的なバンドの存在により
分析される。
別な方法は、核酸検出の方法を教示する米国特許第4,840,893号に含まれる。
該方法は接合されたリガンドを持ったプローブ配列、第２のリガンドに結合し且
つ該酵素が触媒的に活性である時に電極表面に電荷を転移することができる酵素
メディエーター系(enzyme mediator system)、及び該第１と第２のリガンドと結
合を競うアンチリガンドを用いる。該アッセイは競合系(competition system)で
あり、サンプル中の標的配列の結合は第１のリガンドの能力に影響を及ぼし且つ
電極への電荷転移の割合を変える。本発明は、酵素触媒によって発生した信号に
頼らない、直接ゲート化メカニズム(direct gating mechanism)を提供すること
の効
果を有する。
米国特許第4,868,104号は、重合化することができる第１の及び検出系を有す
る第２の、標的分析物上の異なる配列に結合する、２つのポリヌクレオチド試薬
の使用によってヌクレオチド配列を検出する方法を記載する。核酸検出方法を記
載する幾つかの他の特許は、大部分がプローブの標識化を含む。これらは：米国
特許第4,968,602号；米国特許第5,116,733号；米国特許第4,868,105号；米国特
許第4,716,106号；米国特許第4,883,750号；米国特許第5,242,794号；来国特許
第4,996,142号；米国特許第5,348,855号及び米国特許第5,053,326号を含む。
図面の簡単な説明
図１から３は、実施例１から３において得られた結果を示す。
図４はリンカーグラミシジンＢを示す
図５は膜スパンニング脂質を示す
図６はリンカー脂質Ａを示す
図７はビオチニル化グラミシジンＥを示す
発明の詳細な説明
本発明者は、サンプル中の特異的なＮＡ配列の存在を検出するために使用する
ことができる装置を提案する。その装置は、それが脂質膜の使用を含むバイオセ
ンサーとして最もよく記載される。バイオセンサーにおいて用いるための膜は、
国際特許出願 Nos PCT/AU88/00273，PCT/AU/89/00352，PCT/AU90/00025及びPCT/
AU92/00132中に開示されている。これらの出願の開示は参考によってここに包含
される。
これらの出願中に開示された通り、好適に修正された脂質分子は、電極／イオ
ンレザバー／隔離二層の、すなわちイオンチャンネルとイオノフォアの合併のた
めに好適である組合せの中に構築することによるであろう。それはまた、これら
の膜のコンダクタンスが分析物(analyte)の存在又は不存に基づいていることも
開示される。二層膜におけるイオンチャンネルを含む各層において、その膜のコ
ンダクタンスは、膜にのびる連続的なイオンチャンネルを形成するためのそれぞ
れの層中のモノマーの整列に基づく。これらの連続的なイオンチャンネルが恒常
的
に形成され及び破壊されるように、その膜のコンダクタンスはこれらの連続的な
イオンチャンネルの寿命に依存される。
第１の態様において、本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検
出することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電
極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を
存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダク
タンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいてお
り、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１
の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモ
ノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノ
マーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該
下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する
第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分
の先端に付着し、且つ該選択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付
着したマーカーが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの残部
の先端に付着している。
本発明の好ましい実施態様において、該膜は、その膜内の横方向の拡散を妨げ
る膜スパンニング両親媒体(membrane spanning amphiphiles)を含む。
第２の態様において、本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検
出することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電
極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を
存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダク
タンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいてお
り、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、該膜内の横方向に拡散するの
を防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に拡散された第１の半膜スパンニン
グモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多
数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に
横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に
拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが
該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端
又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ該選
択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが該膜の表
面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくとも一部以外又は該膜
の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着している。
第３の態様において本発明は、サンプル内の選択された核酸配列の存在を検出
する方法であり、該方法は上記第１の又は第２の態様のバイオセンサーに該サン
プルを加えることを備える。
当業者によって理解されるであろうように、本発明のバイオセンサーと方法は
、イオンチャンネルを経て膜を横切るためのイオンの能力の変更を生じさせる第
１及び第２のリガンドへの選択された核酸配列の結合によって特徴付けられる。
その検出の特異性は、選択された核酸配列のための第１のリガンドの特異性によ
って提供される。この特異性は多くの手法により提供されてよいが、しかしなが
ら、それは、選択された核酸の中の第１の配列に相補的な配列を含む核酸分子又
はＰＮＡを備える第１のリガンドの使用によりこれが達成されることが目下のと
ころ好適である。理解されるであろうように、第１のリガンド内の配列は、感受
性の要求されるレベルを提供するために十分な何れかの長さ、典型的には少なく
とも１０残基である。その核酸分子は修正された塩基を含んでよいこともまた、
理解されるであろう。
その特異性は第１のリガンドによって最初に提供されるように、第２のリガン
ドは選択された核酸配列のために特異的であることは必須でなく、その第２のリ
ガンドが核酸又はそれに付着したマーカーと結合することが単に必要とされる。
従って、該第２のリガンドはＤＮＡに対して指示する抗体、またはそれの結合フ
ラグメントであってよい。第２のリガンドはまた、挿入剤、主溝又は小溝バイン
ダー、三重螺旋形成可能な作因(agent)又はＤＮＡに共有結合できる作因または
それの組合せであってもよい。第２のリガンドは、それぞれの選択されたすなわ
ち検出されるべき核酸配列のために作製される必要のあるただ一つの特異的なリ
ガンドと同じくこれが該バイオセンサーの簡単な構築の結果になる選択された核
酸配列のために特異的でないことが好適である。
該バイオセンサーはまた、該バイオセンサーを越えて変わる第２のリガンドの
多様性を含んでよい。例えば、膜スパンニング両親媒物に付着する第２のリガン
ドは、別の膜スパンニング両親媒物に付着する第２のリガンドの異なる部分であ
ってよい。その必須の特徴は、核酸に又はそれに付着したマーカーに結合した第
２のリガンドである。従って、用語「第２のリガンド」は、核酸又はそれに付着
したマーカーに結合する部分の単独の又は複数の種におよぶものと解される。
多数の適用におけるその分野の当業者によって予期されるであろうように、検
出されるべき核酸配列はマーカー、例えばビオチニル化ＰＣＲ生成物で標識され
るであろう。
それは、しかしながら、第１及び第２のリガンドの両方が、選択された核酸配
列のために特異的であることが本発明の範囲内であることも明らかである。その
ような実施態様において、第１と第２のリガンドは選択された核酸配列の中の異
なる配列によって特異的である。
第１及び第２のリガンドは、多数の手法のいずれかで付着させてよい。例えば
ストレプトアビジンは上記した出願中に記載された通り付着されてよい。これは
ビオチニル化核酸を結合させるために使用することもできる。第１及び第２のリ
ガンドは、リンカーを経てイオンチャンネル又は膜スパンニング脂質に付着させ
ることが好適である。リンカーを使用する場合、該リンカーはホスホラミダイト
(phosphoramidite)基であることがさらに好適である。
そのリンカー長の変更は、バイオセンサーにおいて検出されたゲート化応答に
影響を及ぼしてよいことも、予期される。
第１及び第２のリガンドが核酸配列である場合、これは、中央におけるＲＮＡ
配列とそれぞれの端でリガンドとして作用するものである２つのＤＮＡ配列を有
する分子の生成によって有利には達成されてよい。その分子の２つの端は、バイ
オセンサーの表面に付着され、さらにその主要なＲＮＡ部分は付着した２つの分
離したＤＮＡ配列をバイオセンサーから離すためにＲＮａｓｅＨで消化される。
好適な実施態様において、第１のリガンドは、選択された核酸の中の第１の配
列に相補の配列を含む核酸分子を備える。第２のリガンドは、選択された核酸配
列内の第２の配列に相補の配列を含む核酸分子を備えることがさらに好適である
。
そのような相補の配列の存在のため、第１と第２のリガンドは、ハイブリッド形
成によって選択された核酸に結合する。
第１と第２のリガンドは、サンプル中の選択された核酸配列の異なる領域に結
合するために選択したオリゴヌクレオチド配列であることが目下の処好適である
。国際特許出願 Nos PCT/AU88/00273，PCT/AU88/00273，PCT/AU89/00352，PCT/A
U90/00025及びPCT/AU92/00132に記載されたインピーダンスブリッジを用いて特
異的なＮＡ配列を検出する又は感知するための方法は、例えばビオチニル化膜ス
パンニング脂質(ＭＳＬ)とビオチニル化グラミシジンの両方を持った膜を作製す
ることによって達成されてよい。ビオチンに強力に結合するストレプトアビジン
は、これらのビオチニル化化合物との反応によって固定化される。
２つのビオチニル化オリゴヌクレオチド配列の混合物(第１と第２のリガンド)
は次いでストレプトアビジンに付着される。これらの配列は、相補でないことが
好適である。関係のある配列のために適当なプローブであろう１つの配列、例え
ば感染性生物プローブ、及びその他の配列は、標的ＤＮＡの別の部分に相補とさ
れるだろう。
検出すべきＤＮＡの添加に関して、２つのビオチニル化配列の架橋が、もしそ
のＤＮＡが２つの付着した、しかし異なっていない配列にハイブリダイズする配
列を含むならば生じる。
第４の態様において本発明は、サンプル内の選択された核酸の存在の検出方法
であり、該方法は、以下の工程：
（ｉ）電極と上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に
空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該
膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又
は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、
該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散
された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネル
を含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散で
き且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散する
のを防ぎ、第１の核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表
面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着し、且
つ第２の核酸配列と特異的に反応する第２のリガンドが該膜の表面に近接
した第１の半膜スパンニングモノマーの残部の先端に付着し、該第１又は
第２の核酸配列のいずれか一方は選択された核酸の配列内にある、バイオ
センサーを用意すること；
（ii）該バイオセンサーに、選択された核酸を含むことが推測されるサンプルを
加えること、及び該膜のコンダクタンス及び／又はインピーダンスを測定
すること；及び
（iii）（ii）からバイオセンサーに対抗核酸を加えること、及び該膜のコンダ
クタンス及び／又はインピーダンスを測定すること、該対抗配列はそれが
第１及び第２の核酸配列の両方を含むように選択される、
を備える。
もしその標的核酸がサンプル中に存在するならば、その対抗配列は、第１及び
第２のリガンドの両方に結合することかできず、かくて架橋する。(ii)と(iii)
において、コンダクタンス／インピーダンス測定における相違の不存は、サンプ
ル中の選択された核酸の存在を示している。
第５の態様において本発明は、サンプル内の選択された核酸の存在の検出方法
であり、該方法は以下の工程：
（ｉ）電極と上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に
空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該
膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又
は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、該
膜内の横方向に拡散するのを防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に
拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２
の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該
第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第
２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、
該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に
近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端又は該
膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ該選
択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが該
膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくとも一部
以外又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し
た、バイオセンサーを用意すること；
（ii）該バイオセンサーに、選択された核酸を含むことが推測されるサンプルを
加えること、及び該膜のコンダクタンス及び／又はインピーダンスを測定
すること；及び
（iii）（ii）からバイオセンサーに対抗核酸を加えること、及び該膜のコンダ
クタンス及び／又はインピーダンスを測定すること、該対抗配列はそれが
第１及び第２の核酸配列の両方を含むように選択される、
を備える。
もしその標的核酸がサンプル中に存在するならば、その対抗配列は、第１及び
第２のリガンドの両方に結合することができず、かくて架橋する。(ii)と(iii)
において、コンダクタンス／インピーダンス測定における相違の不存は、サンプ
ル中の選択された核酸の存在を示している。
第６の態様において本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出
することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電極
と上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を存在
させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダクタン
ス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいており、
該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１の半
膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマ
ーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマー
は該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層
内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１
のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分の先
端に付着し且つ第２のリガンドが該膜の表面に近接した該第１の半膜スパンニン
グモノマーの残部の先端に付着し、該第２のリガンドは該第１のリガンドが該第
２のリガンドに結合するように該選択された核酸配列のそれに結合され或いはそ
の中に含まれている。
第７の態様において本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出
することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電極
と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を存
在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダクタ
ンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいており
、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、該膜内の横方向に拡散するのを
防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に拡散された第１の半膜スパンニング
モノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数
のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横
方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡
散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該
膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端又
は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ第２の
リガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくと
も一部以外又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し
、該第２のリガンドは該第１のリガンドが該第２のリガンドに結合するように該
選択された核酸配列のそれに結合され或いはその中に含まれている。
第６と第７の態様において特異化された配置において、該バイオセンサーは競
合によって選択された核酸配列の存在を検出する。その選択された核酸配列は、
もし試験するべきサンプル中に在るならば、第１のリガンドに結合するための第
２のリガンドと競合する。
第８の態様において本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出
することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは、電
極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を
存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダク
タンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいてお
り、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１
の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモ
ノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノ
マーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該
下層内の横方向に拡散するのを防ぎ且つ該選択された核酸配列と特異的に反応す
る第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部
分の先端に付着している。
選択された核酸配列を含むサンプルの付加に関するこの構成において、第１の
リガンドは選択されたＤＮＡ配列に結合するであろうし、且つ第１の半膜モノマ
ーの移動性を変化させ又は該チャンネルを通るイオン流を制限するであろう。こ
れは、異なるコンダクタンスを持った膜の結果を与えるであろう。
本発明の他の好適な実施態様において、第１及び第２の半膜スパンニングモノ
マーはグラミシジン又はその誘導体の一つである。本発明のさらに好適な実施態
様において、二層膜は、膜と電極の間に空間が存在するようにリンカー分子(lin
king molecules)を経て電極に付着される。好ましいリンカー分子は、出願PCT/A
U92/00132中に開示されたそれらである。本発明のよりさらに好適な実施態様に
おいて、第２の半膜スパンニングモノマーはリンカー基を経て電極に付着される
。
本発明のさらに別の好適な実施態様において、二層膜は、膜スパンニング脂質
、アルカエバクテリア(archaebacteria)中に見出されるそれらと同じ、を含む。
「架橋」は、第２の半膜スパンニングモノマーによる整列の外に第１の半膜ス
パンニングモノマーを運ぶ架橋配列によって特徴付けされる。これは、第１のコ
ンダクタンスとは異なる第２のコンダクタンスを有する膜を生じる。コンダクタ
ンスにおけるこの相違は測定が可能であり且つサンプル中の選択されたＤＮＡ配
列の存在の証拠となるであろう。
第１と第２のリガンドは同じであっても又は異なっていてもよい。特異的なＮ
Ａ配列に結合するオリゴヌクレオチドリガンドは、当該技術分野で周知である。
本発明の代替の実施態様において、該リガンドはペプチド核酸(ＰＮＡ)である
。ＰＮＡに関する情報は、Science，1991，254，1497 1500;J．Am．Chem．Soc.
，1992，114，1895 1897，J．Am．Chem．Soc.，1992，114，9677 78;J．Chem．S
oc．Chem．Commun.,1993，800 801．Nature，1993，365，566，68;米国特許第4,
795,700号と国際特許出願No.WO 93/18187中に見出されるものでよく、さらにこ
れらの文献の開示は参考によってここに併合される。これらは、リガンドとして
ＰＮＡの使用によって多くの効果が得られる。これらは、二重鎖ＤＮＡにおいて
特異的な配列を認めるための及び鎖置換(strand displacement)又は三重螺旋構
造によるいずれか一方のそれに結合するためのＰＮＡの能力を含む。これは、単
鎖又は二重鎖との結合が可能であるが鎖置換によって結合できないオリゴヌクレ
オチドと対照をなす。ＰＮＡは単鎖ＤＮＡに結合することも可能であることに注
目すべきである。その標的プローブ配列は緊密な結合のためにＰＮＡ分子とする
ことができる。
代替の実施態様において、二つのビオチニル化オリゴヌクレオチド配列の混合
物はストレプトアビジン上に固定化される。一つは標的プローブ配列であり第２
は選択のいずれかの適当な架橋配列である。サンプルの添加によって、標的分析
物は捕捉される。その標的分析物は、関係のある配列を有することのみが要求さ
れる。架橋は起こらず、それ故にゲート化(gating)は観測されず、さらにコンダ
クタンスの第１の測定が実行される。第２のオリゴヌクレオチド配列は、そのシ
ステムに対抗するために用いられる。この対抗配列は、標的オリゴヌクレオチド
配列と架橋配列と相補の配列の両方を含む。もし両方のエピトープの結合が生じ
ると、架橋が起こるであろうし、かくしてイオンチャンネルがゲートオフになり
(gating off)、さらに膜のコンダクタンスが変化する。もしエピトープ２つでの
み結合か生じると(標識ＤＮＡの、そのプローブ配列への結合のために)、架橋が
起こることがなく、かくしてゲート化が見られることはない。対抗配列の付加に
続いて起こるコンダクタンスにおける変化の不存は、それ故に標的分析物の存在
の証拠である。
ＮＡプローブ配列は特に、いずれかの長さとすることができ且つ検出のための
標的分析物に相補の塩基配列を含むであろう。その標的分析物はＤＮＡ又はＲＮ
Ａ配列とすることができる。ＰＮＡプローブ配列もまた、いずれかの長さとする
ことができ且つ検出のための標的分析物に相補の塩基配列を含むであろう。その
標的分析物はＰＮＡが両方に結合するようなＤＮＡ又はＲＮＡ配列とすることが
できる。ＰＮＡはＤＮＡよりもより緊密にＤＮＡとＲＮＡと結合し、故に該対抗
配列は既に結合された標的配列と置換できないものとすべきである。
標的配列の幾つかの実施例が下記に示される。
Listeria monocytogenes;36SrRNA配列のために特異的な１９塩基対オリゴ
ヌクレオチド；食品工業において検出(牛乳、チーズ等)参照：R.F．Wang
W.W．Cao及びM.G．Johnson，App．Environ．Microbiol.，1991,3666-70。
コレラ菌(Vibrio cholerea c)の全てのコレラ毒素生産株は２３塩基対オ
リゴヌクレオチド配列とともに特にハイブリッド形成する(水検出、健康)
。参照：A C．Wrightら，J．Clin．Microbiol.，1992，2302。
Chiamydia及びGonorrhoeaの各種の株の検出のための特異的なオリゴヌク
レオチドプローブ(健康工業)。参照；R．Rossauら，u.Clin．Microbiol.
，1990,944 8;Gen．Microbiol，1989,135,1735 45;Loeffelholz，M．J，J
．Clin．Microbiol.，1992,2847 51。
使用するＤＮＡプローブが"DNA Probes",第二版:G．H Keller & M.M．
Manak，Stockton Press，1993中に見出される、最新技術の優秀な要約。
本発明の本質がより明確に理解できるためにその好適な形態が以下の限定する
ものでない実施例に関連してここに記載されるであろう。
実施例１：ＤＮＡの横方向分離
標的ポリヌクレオチド配列の検出は、特異的なＤＮＡゲート化が５ｎＭ(１pmo
le)の標的ＤＮＡ濃度により観測される以下の実施例によって説明することがで
きる。非-相補的なプローブ配列の存在中のいずれかの応答のトータルの欠落は
コントロール中で認めることができる。
第１の層： ９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ
１．１μＭ膜スパンナー(spanner)脂質Ｄ
２７．５ｎＭ膜スパンナー脂質Ｃ
３７μＭジチオジグリコン酸
７５μＭリンカー脂質Ａ
第２の層： １４ｍＭ(DPE-PC:GDPE=7:3)：ビオチニル化グラミシジンＥ＝
５０，０００：１ エタノール中
顕微鏡スライドガラス上のクロム吸着層(200Å)上に新たに蒸着した金(1000Å
)を持った電極は該第１の層の成分のエタノール溶液内に１時間室温で浸漬され
、エタノールで濯がれ、次いでインピーダンス測定のために用いられるまで４℃
でエタノール中に保存される。そのスライドは、ほぼ１６ｍｍ2として作動する
電極のエリアを定義したテフロン被覆したウェルを含むブロック内に固定される
。
全ての工程は室温で実行される。第２の層の５μＬは、１８０μＬ容量のリン
酸緩衝塩溶液(１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＰＢＳ)の添加の以前に作動電極に加えられる。その電
極はＰＢＳを用いて４回洗浄される。ストレプトアビジンが全てのウェルに添加
され(ＰＢＳ中５μＬ 0.01ｍｇ／ｍＬ)、そしてＰＢＳで過量の未結合のストレ
プトアビジンを洗い流す以前に１０−１５分間ビオチニル化グラミシジンＥと反
応させる。ＤＮＡプローブＦ(200nM)：ＤＮＡプローブＧ(PBS中200nM)の１：１
混合物の５μＬがセンサーウェルに加えられる。ＤＮＡ非-特異的結合プローブ
Ｈ(PBS中400nM ５μＬ)がコントロールウェルに加えられる。そのプローブはス
トレプトアビジンと１０−１５分間反応させ、次いで過量の非結合プローブがＰ
ＢＳで洗い流される。ＰＢＳ中のＤＮＡ標的Ｉ(10nM)の１００μＬが各ウェルに
加えられる。センサーウェルへのＤＮＡ標的Ｉの結合は、最小相でのアドミッタ
ンス(admittance at minimum phase)における増加を与えるがしかし、コントロ
ールウェル中の膜アドミッタンスにおいて顕著な変化はない(図１)。最小相での
アドミッタンスの増加の量と割合は試験溶液中のＤＮＡ存在量に関連し且つそれ
故に試験溶液中の濃度を決定するために使用することができる。
ＤＮＡプローブＦ：
ビオチンとＤＮＡの間に３１-原子ホスホラミダイト(phosphoramidite)リン
カー基を持った５’ビオチニル化リステリア(listeria)プローブＤＮＡ。
ＤＮＡプローブＧ：
ビオチンとＤＮＡの間に３１-原子ホスホラミダイトリンカー基を持った５'
ビオチニル化コレラ毒プローブＤＮＡ。
ＤＮＡ非-特異的結合プローブＨ：
標的ＤＮＡ配列のすべての部に非-相補的である、ビオチンとＤＮＡの間に
３１-原子ホスホラミダイトリンカー基を持った５'ビオチニル化１５-merオ
リゴヌクレオチド。
ＤＮＡ標的Ｉ：
１９-塩基リステリア配列、１０塩基‘スペーサー’と２３塩基コレラ毒配
列を含んだ６７塩基ＤＮＡ配列。
式中：
実施例２：酵素的開裂により続行されるＤＮＡの横方向分離
この試験は、第２の、確認工程を実行するための能力を説明し、それによって
酵素は結合したポリヌクレオチドを開裂するために使用することができ、かくし
て関係のある特異的領域が存在することを確認する。
第１の層： ９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ
１．１μＭ膜スパンナー(spanner)脂質Ｄ
２７．５ｎＭ膜スパンナー脂質Ｃ
３７μＭジチオジグリコン酸
７５μＭリンカー脂質Ａ
第２の層： １４ｍＭ(DPE-PC:GDPE=7:3)：ビオチニル化グラミシジンＥ＝
５０，０００：１ エタノール中
電極が調製され、さらに第２層が実施例１中に記載される通り加えられる。次
のストレプトアビジン、ＤＮＡプローブ及びＤＮＡ標的配列は、それらが３０℃
で実行されることを除いて、実施例１中に記載された通り加えられる。
ＤＮＡゲート化の１５分後、非結合ＤＮＡ標的Ｉが、DNaseＩ活性化緩衝液で
洗い流される。DNaseＩ活性化緩衝液は５０ｎＭトリス塩酸、ｐＨ7.6、５０ｎＭ
ＮａＣｌ、１０ｎＭ ＭｇＣｌ2、１０ｎＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳ
Ａからなる。DNaseＩ(２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ2の５
０％w/vグリセリン溶液中の１ｍｇ／ｍＬ ２μＬ)がセンサーとコントロールウ
ェルに
加えられる。DNaseＩの添加はセンサーウェルの最小相でのアドミッタンスの増
加を与えるがしかし、コントロールウェルの顕著な増加はなく(図２)、ＤＮＡの
開裂が検出されることを示す。
実施例３：２ ビオチニル化相補ポリヌクレオチド配列の付加によるＤＮＡゲー
ト化
この実施例は標的中に併合した捕捉分子を有することによって関係のあるポリ
ヌクレオチド上のただ一つの特異的配列の検出の可能性を説明する。またそれは
ペプチド核酸(ＰＮＡ)配列の使用をも説明する。
第１の層： ９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ
１．１μＭ膜スパンナー(spanner)脂質Ｄ
５．５ｎＭ膜スパンナー脂質Ｃ
３７μＭジチオジグリコン酸
７５μＭリンカー脂質Ａ
第２の層： １４ｍＭ(DPE-PC:GDPE=7:3)：ビオチニル化グラミシジンＥ＝
５０，０００：１ エタノール中
電極が調製され且つ第２層が実施例１中に記載された通り加えられる。全ての
工程は室温で実行される。第２の層の５μＬは、１８０μＬ容量のリン酸緩衝塩
溶液(１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．
７ｍＭ ＫＣｌ、ＰＢＳ)の添加の以前に作動電極に加えられる。その電極はＰＢ
Ｓを用いて４回洗浄される。ストレプトアビジンが全てのウェルに添加され(Ｐ
ＢＳ中５μＬ 0.01ｍｇ／ｍＬ)、そしてＰＢＳで過量の未結合のストレプトアビ
ジンを洗い流す以前に１０−１５分間ビオチニル化グラミシジンＥと反応させる
。
ＰＮＡ配列Ｊと相補のＤＮＡ配列Ｋのそれぞれの５ｎＭ(1.14μL 1.75μM)が
センサーウェルに連続して素早く加えられる。ＰＮＡ又はＤＮＡ配列のないもの
がコントロールウェルに加えられる。ストレプトアビジンに対するＰＮＡ(Ｊ)と
Ｄ
ＮＡ(Ｋ)及び互いの結合は最小相でのアドミッタンスの増加を与えるがしかし、
コントロールウェル中の膜アドミッタンスにおける顕著な変化はない(図３)。最
小相でのアドミッタンスの増加の量と割合は試験溶液中のＤＮＡ又はＰＮＡ存在
量に関連し且つそれ故に試験溶液中の濃度を決定するために使用することができ
る。
ＰＮＡ配列Ｊ：
８-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸リンカーの溶解性をプラスにするために
グリシンとリシンを含むＮ-ビオチニル化リステリアプローブ配列ＰＮＡ。
ＤＮＡ配列Ｋ：
ビオチンとＤＮＡの間にリンカー基を持たない５'-ビオチニル化リステリア
ＤＮＡ。
式中
広く記載された本発明の精神と範囲から逸脱することなく各種の変更及び／又
は修正を特有の実施態様中に示されたような本発明に遂行できることは当業者に
よって予測されるであろう。これらはＰＣＲ(又は別の増殖法)生成物の検出及び
遺伝に起因する病気における遺伝子突然変異、ここでその突然変異は知られる、
の検出を含む。欠陥のある遺伝子のためのおよそ３５００の患者のリストがMcKu
sickの"Mendelian Inheritance in Man"中に見出すことができ、そしてさらなる
実例が科学雑誌中に恒常的に報告される。本実施態様は、それ故に説明として関
連する全てを考慮すべきであり限定するものでない。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to biosensors for use in detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample and the presence of a selected nucleic acid (NA) sequence in a sample. How to detect. Background of the Invention Assays for the presence of unique DNA or RNA sequences in a sample have applications in many fields. For example, infection of a patient with a specific microorganism can be assessed by analysis of a biological sample from the patient for the presence of NA sequences unique to that microorganism. Another application involves analysis to detect impurities in food or environmental samples. Detection of genetic diseases caused by mutations can also be achieved by these techniques. Heretofore, the widespread use of this more sensitive method has been due to the need for significant growth of specific nucleic acid sequence quantities and / or using specialized techniques for analyzing the grown DNA. Was restricted due to the demands of that. This amplification is generally achieved using the polymerase chain or ligase chain reaction, and the amplified DNA is separated on a gel, which is analyzed by the presence of specific bands of DNA. Another method is included in US Pat. No. 4,840,893, which teaches a method for nucleic acid detection. The method includes a probe sequence with a conjugated ligand, an enzyme mediator system capable of binding a second ligand and transferring charge to an electrode surface when the enzyme is catalytically active, And an antiligand that competes for binding with the first and second ligands. The assay is a competition system, where the binding of the target sequence in the sample affects the ability of the first ligand and alters the rate of charge transfer to the electrode. The present invention has the effect of providing a direct gating mechanism that does not rely on signals generated by enzyme catalysis. U.S. Pat. No. 4,868,104 discloses a method for detecting a nucleotide sequence by the use of two polynucleotide reagents that bind to different sequences on a target analyte, a first having a polymerizable and a second detection system. Is described. Some other patents describing nucleic acid detection methods mostly involve the labeling of probes. These include: US Patent No. 4,968,602; US Patent No. 5,116,733; US Patent No. 4,868,105; US Patent No. 4,716,106; US Patent No. 4,883,750; US Patent No. 5,242,794; US Patent No. 4,996,142; US Patent No. 5,348,855. And US Patent No. 5,053,326. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIGS. 1 to 3 show the results obtained in Examples 1 to 3. FIG. 4 shows linker gramicidin B FIG. 5 shows membrane spanning lipid FIG. 6 shows linker lipid A FIG. 7 shows biotinylated gramicidin E Detailed description of the invention We propose an apparatus that can be used to detect the presence of NA sequences. The device is best described as a biosensor where it involves the use of a lipid membrane. Membranes for use in biosensors are disclosed in International Patent Applications Nos PCT / AU88 / 00273, PCT / AU / 89/00352, PCT / AU90 / 00025 and PCT / AU92 / 00132. The disclosures of these applications are hereby incorporated by reference. As disclosed in these applications, suitably modified lipid molecules are by building into electrode / ion reservoir / isolation bilayers, ie, combinations that are suitable for the merging of ion channels and ionophores. There will be. It also discloses that the conductance of these membranes is based on the presence or absence of an analyte. For each layer containing an ion channel in a bilayer membrane, the conductance of the membrane is based on the alignment of the monomers in each layer to form a continuous ion channel that spans the membrane. The conductance of the membrane is dependent on the lifetime of these continuous ion channels so that these continuous ion channels are constantly formed and destroyed. In a first aspect, the invention is a biosensor for use in detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample, the biosensor comprising an electrode and a bilayer membrane having an upper layer and a lower layer. The lower layer is proximate to and coupled to the electrode in such a way that there is a space between the membrane and the electrode, and the conductance or impedance of the membrane is based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence. The membrane comprises a densely packed array of amphiphilic molecules, a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer and a second semi-membrane spanning monomer diffused into the lower layer. Wherein the first semi-membrane spanning monomer is capable of laterally diffusing into the upper layer and the second semi-membrane spanning monomer is laterally diffusing within the lower layer. A first ligand that specifically reacts with the selected nucleic acid sequence is attached to the tip of a portion of a first semi-membrane spanning monomer proximate the surface of the membrane, and A second ligand that reacts with the nucleic acid or a marker attached thereto is attached to the tip of the remainder of the first semi-membrane spanning monomer close to the surface of the membrane. In a preferred embodiment of the present invention, the membrane comprises membrane spanning amphiphiles that impede lateral diffusion within the membrane. In a second aspect, the invention is a biosensor for use in detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample, the biosensor comprising an electrode and a bilayer membrane having an upper layer and a lower layer. The lower layer is proximate to and coupled to the electrode in such a way that there is a space between the membrane and the electrode, and the conductance or impedance of the membrane is based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence. The membrane is a densely packed array of amphipathic molecules, a membrane spanning amphiphile to prevent lateral diffusion within the membrane, and a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer And a plurality of ion channels including a second semi-membrane spanning monomer diffused into the lower layer, wherein the first semi-membrane spanning monomer is capable of laterally diffusing into the upper layer and A second half-membrane spanning monomer prevents lateral diffusion in the underlayer, and a first ligand, which specifically reacts with the selected nucleic acid sequence, causes a first half in close proximity to the surface of the membrane. A second ligand or a marker attached to the tip of at least a portion of the membrane spanning monomer or to the tip of the membrane spanning amphiphile proximate to the surface of the membrane and reacting with the selected nucleic acid is provided. At least a portion of the first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane or attached to a tip of the membrane spanning amphiphile proximate to the surface of the membrane. In a third aspect, the invention is a method of detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample, the method comprising adding the sample to the biosensor of the first or second aspect. As will be appreciated by those skilled in the art, the biosensors and methods of the present invention have selected selected first and second ligands that cause a change in the ability of ions to cross membranes through ion channels. Characterized by the binding of nucleic acid sequences. The specificity of the detection is provided by the specificity of the first ligand for the selected nucleic acid sequence. This specificity may be provided by a number of techniques, however, it may be provided by the use of a nucleic acid molecule comprising a sequence complementary to a first sequence in a selected nucleic acid or a first ligand comprising a PNA. What is achieved is presently preferred. As will be appreciated, the sequence within the first ligand is any length, typically at least 10 residues, sufficient to provide the required level of sensitivity. It will also be appreciated that the nucleic acid molecule may include modified bases. The second ligand is not required to be specific for the selected nucleic acid sequence, as its specificity is first provided by the first ligand, and the second ligand is attached to the nucleic acid or to the nucleic acid. It is simply required to bind to the designated marker. Thus, the second ligand may be an antibody directed against DNA, or a binding fragment thereof. The second ligand may also be an intercalating agent, a major or minor groove binder, a triple helix-forming agent or an agent capable of covalently binding to DNA or a combination thereof. The second ligand is selected as is the result of the simple construction of the biosensor as well as the only specific ligand that needs to be created for each selected or nucleic acid sequence to be detected. Preferably, it is not specific due to the nucleic acid sequence used. The biosensor may also include a diversity of second ligands that varies across the biosensor. For example, a second ligand attached to a membrane spanning amphiphile may be a different portion of the second ligand attached to another membrane spanning amphiphile. An essential feature is a second ligand bound to the nucleic acid or to a marker attached to it. Thus, the term “second ligand” is understood to cover one or more species of the moiety that binds to the nucleic acid or the marker attached thereto. As would be expected by one of skill in the art in many applications, the nucleic acid sequence to be detected will be labeled with a marker, such as a biotinylated PCR product. It is, however, clear that within the scope of the present invention that both the first and second ligand are specific for the selected nucleic acid sequence. In such embodiments, the first and second ligands are specific for different ones of the selected nucleic acid sequences. The first and second ligands may be attached in any of a number of ways. For example, streptavidin may be attached as described in the above-mentioned application. It can also be used to attach biotinylated nucleic acids. Suitably, the first and second ligands are attached to an ion channel or a membrane spanning lipid via a linker. If a linker is used, it is further preferred that the linker is a phosphoramidite group. It is also anticipated that altering the linker length may affect the gating response detected in the biosensor. Where the first and second ligands are nucleic acid sequences, this may be advantageously achieved by the generation of a molecule having an RNA sequence in the middle and two DNA sequences that act as ligands at each end. . The two ends of the molecule are attached to the surface of the biosensor, and the major RNA portion is digested with RNaseH to separate the two attached DNA sequences from the biosensor. In a preferred embodiment, the first ligand comprises a nucleic acid molecule comprising a sequence complementary to a first sequence in a selected nucleic acid. More preferably, the second ligand comprises a nucleic acid molecule comprising a sequence complementary to the second sequence in the selected nucleic acid sequence. Due to the presence of such a complementary sequence, the first and second ligands bind to the selected nucleic acid by hybridization. It is presently preferred that the first and second ligands are oligonucleotide sequences selected to bind to different regions of the selected nucleic acid sequence in the sample. Detect specific NA sequences using impedance bridges described in International Patent Applications Nos PCT / AU88 / 00273, PCT / AU88 / 00273, PCT / AU89 / 00352, PCT / A U90 / 00025 and PCT / AU92 / 00132 Methods for doing or sensing may be achieved, for example, by making a membrane with both biotinylated membrane spanning lipid (MSL) and biotinylated gramicidin. Streptavidin, which binds strongly to biotin, is immobilized by reaction with these biotinylated compounds. The mixture of the two biotinylated oligonucleotide sequences (first and second ligand) is then attached to streptavidin. Preferably, these sequences are not complementary. One sequence that would be a suitable probe for the sequence of interest, such as an infectious organism probe, and other sequences, would be complementary to another portion of the target DNA. With respect to the addition of the DNA to be detected, a cross-link of the two biotinylated sequences will occur if the DNA contains sequences that hybridize to two attached but not distinct sequences. In a fourth aspect, the present invention is a method for detecting the presence of a selected nucleic acid in a sample, the method comprising the following steps: (i) comprising an electrode and a two-layer membrane having an upper layer and a lower layer; Is close to and coupled to the electrode in such a way that there is a space between the membrane and the electrode, and the conductance or impedance of the membrane is based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence; The membrane includes a tightly packed array of amphipathic molecules, a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer, and a second semi-membrane spanning monomer diffused into the lower layer. A plurality of ion channels, wherein the first semi-membrane spanning monomer can diffuse laterally into the upper layer and the second semi-membrane spanning monomer prevents lateral diffusion into the lower layer. , A first nucleic acid sequence and A differentially reactive first ligand is attached to the tip of a portion of the first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane, and a second ligand that specifically reacts with a second nucleic acid sequence. A ligand is attached to the tip of the remainder of the first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane, and either the first or second nucleic acid sequence is within the sequence of the selected nucleic acid. Providing a sensor; (ii) adding a sample suspected of containing the selected nucleic acid to the biosensor, and measuring the conductance and / or impedance of the membrane; and (iii) (ii) B) adding a counter nucleic acid to the biosensor and measuring the conductance and / or impedance of the membrane, wherein the counter sequence is selected such that it contains both the first and second nucleic acid sequences. To be provided. If the target nucleic acid is present in the sample, the opposing sequence will not be able to bind to both the first and second ligand and will thus crosslink. In (ii) and (iii), the absence of a difference in conductance / impedance measurements indicates the presence of the selected nucleic acid in the sample. In a fifth aspect, the invention is a method for detecting the presence of a selected nucleic acid in a sample, the method comprising the following steps: (i) comprising an electrode and a two-layer membrane having an upper layer and a lower layer, wherein the lower layer comprises The conductance or impedance of the membrane is based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence in a manner such that there is a space between the membrane and the electrode; The membrane is a densely packed array of amphipathic molecules, a membrane spanning amphiphile that prevents lateral diffusion within the membrane, and a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer and the lower layer. A plurality of ion channels including a second semi-membrane spanning monomer diffused therein, wherein the first semi-membrane spanning monomer is capable of laterally diffusing into the upper layer and the second semi-membrane spanning monomer. Ning monomer A first ligand that specifically reacts with the selected nucleic acid sequence to prevent lateral diffusion within the underlayer, wherein at least a portion of a first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane; A second ligand or marker attached to the tip or the tip of the membrane spanning amphiphile proximate to the surface of the membrane and reacting with the selected nucleic acid is attached to the first ligand adjacent to the surface of the membrane. Providing a biosensor attached to the tip of the membrane spanning amphiphile other than the at least a portion of the semi-membrane spanning monomer or in close proximity to the surface of the membrane; (ii) selected for the biosensor Adding a sample suspected of containing the nucleic acid, and measuring the conductance and / or impedance of the membrane; and (iii) transferring a counter-nucleic acid to the biosensor from (ii). Adding and measuring the conductance and / or impedance of the membrane, wherein the counter sequence is selected such that it includes both the first and second nucleic acid sequences. If the target nucleic acid is present in the sample, the counter sequence is unable to bind to both the first and second ligand and thus crosslinks. In (ii) and (iii), the absence of a difference in conductance / impedance measurements indicates the presence of the selected nucleic acid in the sample. In a sixth aspect, the present invention is a biosensor for use in detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample, wherein the biosensor comprises an electrode and a bilayer membrane having an upper and lower layer. A lower layer is proximate to and coupled to the electrode in such a way that there is a space between the membrane and the electrode, the conductance or impedance of the membrane being based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence; The membrane includes a densely packed array of amphipathic molecules, a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer, and a second semi-membrane spanning monomer diffused into the lower layer. Including a plurality of ion channels, the first semi-membrane spanning monomer can diffuse laterally into the upper layer and the second semi-membrane spanning monomer diffuses laterally into the lower layer A first ligand that specifically reacts with the selected nucleic acid sequence is attached to the tip of a portion of the first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane, and the second ligand is Attached to the remaining tip of the first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane, the second ligand is the nucleic acid selected such that the first ligand binds to the second ligand Attached to or contained within that of the sequence. In a seventh aspect, the invention is a biosensor for use in detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample, the biosensor comprising an electrode and a bilayer membrane having an upper layer and a lower layer, The lower layer is proximate to and coupled to the electrode in such a way that there is a space between the membrane and the electrode, and the conductance or impedance of the membrane is based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence. The membrane comprises a densely packed array of amphipathic molecules, a membrane spanning amphiphile which prevents lateral diffusion within the membrane, and a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer. A plurality of ion channels including a second semi-membrane spanning monomer diffused into the lower layer, wherein the first semi-membrane spanning monomer is capable of laterally diffusing into the upper layer and The second half-membrane spanning monomer prevents lateral diffusion in the lower layer, and a first ligand that specifically reacts with the selected nucleic acid sequence has a first half-membrane close to the surface of the membrane. A first half-membrane spanning monomer attached to at least a tip of a spanning monomer or a tip of the membrane spanning amphiphile proximate to the surface of the membrane, and wherein a second ligand is proximate to the surface of the membrane; Attached to a tip of the membrane spanning amphiphile other than at least a portion of or in proximity to the surface of the membrane, wherein the second ligand is selected such that the first ligand binds to the second ligand. Is linked to or contained within the nucleic acid sequence. In the arrangements specified in the sixth and seventh aspects, the biosensor detects the presence of a nucleic acid sequence selected by competition. The selected nucleic acid sequence, if present in the sample to be tested, competes with the second ligand for binding to the first ligand. In an eighth aspect, the invention is a biosensor for use in detecting the presence of a selected nucleic acid sequence in a sample, the biosensor comprising an electrode and a bilayer membrane having an upper layer and a lower layer. The lower layer is proximate to and coupled to the electrode in such a way that there is a space between the membrane and the electrode, and the conductance or impedance of the membrane is based on the presence or absence of the selected nucleic acid sequence. The membrane comprises a densely packed array of amphiphilic molecules, a first semi-membrane spanning monomer diffused into the upper layer and a second semi-membrane spanning monomer diffused into the lower layer. Wherein the first semi-membrane spanning monomer is capable of laterally diffusing into the upper layer and the second semi-membrane spanning monomer is laterally diffusing within the lower layer. A first ligand that prevents the first nucleic acid sequence and reacts specifically with the selected nucleic acid sequence is attached to the tip of a portion of the first semi-membrane spanning monomer proximate to the surface of the membrane. In this configuration for the addition of a sample containing the selected nucleic acid sequence, the first ligand will bind to the selected DNA sequence and alter the mobility of the first half-membrane monomer or pass through the channel. Will limit ion flow. This will give results for films with different conductances. In another preferred embodiment of the present invention, the first and second half-membrane spanning monomers are gramicidin or one of its derivatives. In a further preferred embodiment of the invention, the bilayer membrane is attached to the electrode via lin king molecules so that there is a space between the membrane and the electrode. Preferred linker molecules are those disclosed in application PCT / A U92 / 00132. In an even more preferred embodiment of the present invention, the second semi-membrane spanning monomer is attached to the electrode via a linker group. In yet another preferred embodiment of the present invention, the bilayer membrane comprises a membrane spanning lipid, the same as those found in archaebacteria. "Cross-linking" is characterized by a cross-linking sequence that carries the first half-spanning monomer in addition to the alignment with the second half-spanning monomer. This results in a membrane having a second conductance different from the first conductance. This difference in conductance is measurable and will be evidence of the presence of the selected DNA sequence in the sample. The first and second ligands can be the same or different. Oligonucleotide ligands that bind to specific NA sequences are well known in the art. In an alternative embodiment of the invention, the ligand is a peptide nucleic acid (PNA). Information on PNAs can be found in Science, 1991, 254, 1497 1500; Am. Chem. Soc. , 1992, 114, 1895 1897, J. Am. Am. Chem. Soc. J., 1992, 114, 9677 78; Chem. Soc. Chem. Commun. , 1993, 800 801. Nature, 1993, 365, 566, 68; U.S. Patent No. 4,795,700 and International Patent Application No. It may be found in WO 93/18187, and the disclosures of these documents are hereby incorporated by reference. These have many effects by using PNA as a ligand. These include the ability of PNA to recognize specific sequences in duplex DNA and to bind to it either by strand displacement or triple helical structure. This is in contrast to oligonucleotides that can bind to single or double strands but cannot bind due to strand displacement. It should be noted that PNA can also bind to single-stranded DNA. The target probe sequence can be a PNA molecule for tight binding. In an alternative embodiment, a mixture of two biotinylated oligonucleotide sequences is immobilized on streptavidin. One is the target probe sequence and the second is any suitable bridging sequence of choice. Upon addition of the sample, the target analyte is captured. The target analyte need only have the relevant sequence. No cross-linking occurs, and therefore no gating is observed, and a first measurement of conductance is performed. A second oligonucleotide sequence is used to counter the system. The counter sequence includes both the target oligonucleotide sequence and the sequence complementary to the bridging sequence. If binding of both epitopes occurs, crosslinking will occur, thus gating off the ion channel and further altering the conductance of the membrane. If binding occurs only at two epitopes (due to the binding of the labeled DNA to its probe sequence), no cross-linking occurs and thus no gating is seen. The absence of a change in conductance following the addition of the countersequence is therefore evidence of the presence of the target analyte. The NA probe sequence, in particular, can be of any length and will include a base sequence that is complementary to the target analyte for detection. The target analyte can be a DNA or RNA sequence. The PNA probe sequence can also be of any length and will include a base sequence complementary to the target analyte for detection. The target analyte can be a DNA or RNA sequence such that PNA binds to both. PNA binds DNA and RNA more tightly than DNA, so the counter sequence should not be able to displace the already bound target sequence. Some examples of target sequences are shown below. Listeria monocytogenes; 19 base pair oligonucleotide specific for 36S rRNA sequence; detected in food industry (milk, cheese, etc.). F. Wang W. W. Cao and M. G. Johnson, App. Environ. Microbiol. , 1991,3666-70. All cholera toxin producing strains of Vibrio cholerea c hybridize specifically with the 23 base pair oligonucleotide sequence (water detection, health). Reference: AC. Wright et al. Clin. Microbiol. , 1992, 2302. Specific oligonucleotide probes for the detection of various strains of Chiamydia and Gonorrhoea (Health Industry). See; Rossau et al., U. Clin. Microbiol. , 1990, 9448; Gen. Microbiol, 1989, 135, 1735 45; Loeffelholz, M .; J, J. Clin. Microbiol. , 1992, 2847 51. The DNA probe used is "DNA Probes", 2nd edition: G. H Keller & M. M. An excellent summary of the latest technology found in Manak, Stockton Press, 1993. In order that the nature of the invention may be more clearly understood, preferred forms thereof will now be described in connection with the following non-limiting examples. Example 1 Lateral Separation of DNA Detection of target polynucleotide sequences can be illustrated by the following example in which specific DNA gating is observed with a target DNA concentration of 5 nM (1 pmol). The total lack of any response in the presence of the non-complementary probe sequence can be seen in the control. First layer: 9. 3 nM linker gramicidin B 1 μM membrane spanner lipid D 5 nM membrane spanner lipid C 37 μM dithiodiglyconic acid 75 μM linker lipid A Second layer: 14 mM (DPE-PC: GDPE = 7: 3): biotinylated gramicidin E = 50,000: 1 in ethanol Chromium adsorption layer on microscope slide The electrode with the newly deposited gold (1000 Å) on (200 Å) was immersed in an ethanol solution of the components of the first layer for 1 hour at room temperature, rinsed with ethanol and then used for impedance measurement. Stored in ethanol at 4 ° C until complete. The slide is almost 16mm Two Fixed within a block containing Teflon-coated wells that define the area of the electrodes that will operate as. All steps are performed at room temperature. 5 μL of the second layer was filled with a 180 μL volume of phosphate buffered saline (10 mM Na). Two HPO Four , 1 mM KH Two PO Four (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, PBS) is added to the working electrode. The electrode is washed four times with PBS. Streptavidin is added to all wells (5 μL 0.01 mg / mL in PBS) and reacted with biotinylated gramicidin E for 10-15 minutes before washing away excess unbound streptavidin with PBS. 5 μL of a 1: 1 mixture of DNA probe F (200 nM): DNA probe G (200 nM in PBS) is added to the sensor wells. DNA non-specific binding probe H (5 μL of 400 nM in PBS) is added to control wells. The probe is allowed to react with streptavidin for 10-15 minutes, then excess unbound probe is washed away with PBS. 100 μL of DNA Target I (10 nM) in PBS is added to each well. Binding of DNA target I to the sensor wells gives an increase in admittance at minimum phase, but no significant change in membrane admittance in control wells (FIG. 1). The amount and rate of increase in admittance at the minimum phase is related to the DNA abundance in the test solution and can therefore be used to determine the concentration in the test solution. DNA probe F: 5 'biotinylated listeria probe DNA having a 31-atom phosphoramidite linker group between biotin and DNA. DNA probe G: 5 ′ biotinylated cholera venom probe DNA having a 31-atom phosphoramidite linker group between biotin and DNA. DNA non-specific binding probe H: 5 'biotinylated 15-mer oligo with a 31-atom phosphoramidite linker group between biotin and DNA that is non-complementary to all parts of the target DNA sequence nucleotide. DNA target I: 67-base DNA sequence including a 19-base Listeria sequence, a 10-base 'spacer' and a 23-base cholera venom sequence. Where: Example 2 Lateral Separation of DNA Continued by Enzymatic Cleavage This test illustrates the ability to perform a second, validation step, whereby the enzyme is used to cleave bound polynucleotides And thus confirm that the specific region of interest is present. First layer: 9.3 nM linker gramicidin B 1.1 μM membrane spanner lipid D 27.5 nM membrane spanner lipid C 37 μM dithiodiglyconic acid 75 μM linker lipid A Second layer: 14 mM (DPE-PC: GDPE = 7: 3): Biotinylated gramicidin E = 50,000: 1 in ethanol An electrode is prepared and a second layer is added as described in Example 1. The following streptavidin, DNA probe and DNA target sequence are added as described in Example 1, except that they are performed at 30 ° C. Fifteen minutes after DNA gating, unbound DNA target I is washed away with DNase I activation buffer. DNase I activation buffer was 50 nM Tris-HCl, pH 7.6, 50 nM NaCl, 10 nM MgCl Two , 10 nM MnCl Two , 0.2 mg / mL BSA. DNase I (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM MgCl Two 50% of w / v 1 mg / mL in glycerin solution (2 μL) is added to the sensor and control wells. Addition of DNase I gives an increase in admittance in the minimal phase of the sensor wells, but no significant increase in control wells (FIG. 2), indicating that DNA cleavage is detected. Example 3: DNA gating by addition of two biotinylated complementary polynucleotide sequences This example demonstrates the possibility of detecting only one specific sequence on a polynucleotide of interest by having the capture molecule merged into the target. Will be described. It also describes the use of peptide nucleic acid (PNA) sequences. First layer: 9.3 nM linker gramicidin B 1.1 μM membrane spanner lipid D 5.5 nM membrane spanner lipid C 37 μM dithiodiglyconic acid 75 μM linker lipid A Second layer: 14 mM (DPE-PC: GDPE = 7: 3): Biotinylated gramicidin E = 50,000: 1 in ethanol An electrode is prepared and a second layer is added as described in Example 1. All steps are performed at room temperature. 5 μL of the second layer was filled with a 180 μL volume of phosphate buffered saline (10 mM Na). Two HPO Four , 1 mM KH Two PO Four 137 mM NaCl; (7 mM KCl, PBS) is added to the working electrode before addition. The electrode is washed four times with PBS. Streptavidin is added to all wells (5 μL 0.01 mg / mL in PBS) and allowed to react with biotinylated gramicidin E for 10-15 minutes before washing away excess unbound streptavidin with PBS. 5 nM (1.14 μL 1.75 μM) of each of the DNA sequences K complementary to the PNA sequence J is added quickly and continuously to the sensor wells. Those without PNA or DNA sequences are added to control wells. Binding of PNA (J) and DNA (K) to streptavidin and each other gives an increase in admittance at the minimum phase, but without significant changes in membrane admittance in control wells (FIG. 3). The amount and rate of increase in admittance at the minimum phase relates to the amount of DNA or PNA present in the test solution and can therefore be used to determine the concentration in the test solution. PNA Sequence J: N-biotinylated Listeria probe sequence PNA containing glycine and lysine to increase the solubility of the 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid linker. DNA sequence K: 5′-biotinylated Listeria DNA having no linker group between biotin and DNA. In the formula It will be appreciated by those skilled in the art that various changes and / or modifications may be made to the invention as set forth in the specific embodiments without departing from the spirit and scope of the broadly described invention. These include the detection of PCR (or another propagation method) product and the detection of genetic mutations in diseases caused by inheritance, where the mutations are known. A list of approximately 3500 patients for the defective gene can be found in McKusick's "Mendelian Inheritance in Man", and further examples are regularly reported in scientific journals. This embodiment is therefore to be considered in all respects and not restrictive, as an explanation.
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