JP2000513588A - DNA sequences, expression of these DNAs, thermophilic laccase encoded by said DNAs and uses thereof - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の１つを有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。また本発明はこれらのＤＮＡ配列の発現、前記のＤＮＡにコードされる好熱性ラッカーゼならびにセルロースの脱リグニン、高分子凝集物の解重合、古紙の脱インキ、廃液、特にセルロースの漂白からの廃液中の芳香族化合物の重合、着色剤の酸化および顔料の生成のための着色剤の活性化、ならびに芳香族化合物のカップリング反応もしくは芳香族側鎖の酸化における有機合成でのその使用に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to a DNA sequence having one of the DNA sequences (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) and encoding a protein having laccase activity. The present invention also relates to the expression of these DNA sequences, the thermophilic laccase encoded by the DNA and the delignification of cellulose, the depolymerization of polymer aggregates, the deinking of waste paper, and the waste liquid, especially the waste liquid from the bleaching of cellulose. To the polymerization of aromatic compounds, the activation of colorants for the oxidation of colorants and the formation of pigments, and their use in organic synthesis in the coupling reaction of aromatic compounds or oxidation of aromatic side chains.

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ配列、これらのＤＮＡの発現、該ＤＮＡによってコードされる好熱性ラッ カーゼならびにその使用 本発明はラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、これら のＤＮＡ配列の発現、該ＤＮＡ配列によってコードされる好熱性ラッカーゼなら びにその使用に関する。 工業的使用に非常に関心を持たれている酵素の種類は、ラッカーゼ酵素（ｐ− ヒドロキシフェノールオキシダーゼ、ＥＣ １．１０．３．２）の種類である。 ラッカーゼは“青色銅タンパク質”と称されるファミリーに属し、一般に４個の 銅イオンを有し、これらはタイプ１〜タイプ３を示す３つの銅中心に配置されて いる。ラッカーゼは一般に分泌タンパク質であり、かつ場合により分子量の１０ 〜４５％のグリコシル化含有率を有していることが特徴である。ラッカーゼは酸 化する芳香族化合物に対して非常に広範な基質特異性を有している。この酸化に おいて生ずる電子を使用して酸素を還元する。これにより水が生じる。ホワイト ロットフンギ(white rot fungi)に存在するラッカーゼの機能は就中リグニンの 分解である。これはパルプの脱リグニンに関する製紙工業でのラッカーゼの使用 への関心の理由でもある。 高分子化合物、例えばリグニンの分解の他に、ラッカーゼは、特に芳香族化合 物の重合を触媒することもできる。この例は、植物に存在するラッカーゼに関連 する植物におけるリグニンの生合成である。従って、ラッカーゼの可能な工業的 適用は、例えば廃水処理のあらゆる種類の重合反応が挙げられる。有機化学合成 におけるラッカーゼの使用は、例えば芳香族化合物のカップリング反応もしくは 側鎖酸化においても公知である。しかしながらこれらの多くの可能な適用に関し ては、殆どの公知のラッカーゼが中温性である、すなわち低温至適および限られ た熱安定性を有することである。 ラッカーゼ酵素の工業的使用のための予備条件は、該酵素を廉価な費用で製造 できることである。一般にこのことは組み換え技術によって製造される酵素の使 用によってのみ可能である。種々の原核性および真核性の発現系がタンパク質製 造のために使用可能である。原核性発現系の例はＥｓｃｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌ ｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである。広範に使用される真核性 発現系は哺乳類細胞および昆虫細胞の両者細胞培養系ならびに真核微生物、例え ば酵母もしくは糸状菌である。 ＷＯ９６／００２９０号は不完全菌類のサブクラスの糸状菌Ｐｏｌｙｐｏｒｕ ｓ ｐｉｎｓｉｔｕｓからの５種のラッカーゼ遺伝子を記載している。これらの ラッカーゼ遺伝子の１つ（ＬＣＣ１）は組み換えタンパク質として製造される。 この酵素の好熱特性は更には調査されていないが、記載されている染髪の目的の ためのＬＣＣ１ラッカーゼの使用はこの酵素が中温性特性を有しているというこ とを暗示している。 不完全菌類のサブクラスの糸状菌Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌｕｍからの好熱特性を有する組み換えラッカーゼの製造はＷＯ９５／３３８ ３７号に記載されている。この酵素がパルプの漂白に適当であるかどうかは知ら れていない。 今までのところ、不完全菌類のサブクラスの糸状菌からの好熱性ラッカーゼを 組み換えタンパク質として製造するための方法は記載されていない。 ＣＡ：ＡＮ９６−２０３１４２号は好熱性ラッカーゼの種々の特性を開示して いる。この種のタンパク質のＤＮＡまたはタンパク質配列は開示されていない。 本発明は、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１の位置７６から位置１５７２を含めた位置までのＤＮＡ配列もしくはＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：２の位置７６から位置１５７２を含めた位置までのＤＮＡ配列 または前記ＤＮＡに８０％以上の配列ホモロジーを有しているＤＮＡ配列を有す るＤＮＡ配列に関する。 ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤＮＯ：２の位置１から位置７５まで はタンパク質の分泌のため のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を表す。このシグナル配列はタンパク質 分泌のための他の任意のシグナル配列と交換することができる。 新規ＤＮＡ配列は、例えば不完全菌株Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏ ｒ ＴＶ−１ （ＤＳＭＺ（Mikroorganismen und Zellkulturen）ＧｍｂＨ（Ｄ −３８１２４ブラウンシュヴァイク）に番号ＤＳＭ１１５２３で寄託）からのク ローニングによって得ることができる。この目的のためにＴｒａｍｅｔｅｓ ｖ ｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１から自体公知の方法によって遺伝子バンクを作成 する。 遺伝子バンクにおいて新規ＤＮＡ配列を単離するために、ラッカーゼ特異的Ｄ ＮＡ配列を有するＤＮＡプローブを使用する。この種のＤＮＡプローブは、例え ばＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１からのゲノムＤＮＡから のＤＮＡプライマーを使用するＰＣＲ反応によって得ることができる。 使用されるプライマーは、有利には１４〜２７ｂｐの長さを有する縮重（dege netrate）ＤＮＡ配列であり、これらの配列は公知のラッカーゼ遺伝子との比較 によって得られる。 有利にはプライマーとして適当なＤＮＡ切片は確立したＤＮＡ切片のオリゴヌ クレオチド合成によって得られる。 新規のラッカーゼ遺伝子は、例えば例１〜５に記載 のように単離できる。 例の方法によって単離されるラッカーゼ遺伝子を当業者に公知の技術、例えば 部位特異的突然変異によって配列中の任意の所望の位置において改変することが できる。従って本発明はラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置７６から位置１５７２を含めた位置までのＤＮＡ配列も しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置７６から位置１５７２を含めた位置までの ＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列に８０％より高い配列ホモロジーを有するＤＮＡ 配列を含むＤＮＡ配列を含んでいる。 新規ＤＮＡを発現するために、後者のものを自体公知の方法において発現ベク ターにクローニングし、このラッカーゼ遺伝子を有する発現ベクターを微生物中 に導入し、該微生物中で発現させる。 発現ベクターは宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれ、ゲノムＤＮＡと一緒 に複製されるＤＮＡ構成体であってよい。選択的に宿主ゲノムに組み込まれない 自己複製性のＤＮＡ構成体、例えばプラスミド、人工染色体または匹敵する染色 体外遺伝因子であってもよい。 適当な発現ベクターは有利には以下の遺伝因子を有するべきである： 宿主生物においてラッカーゼ遺伝子の発現を促進するプロモーター。有利には プロモーターは高い発現効 率を保証できるように強力なプロモーターであるべきである。有利にはプロモー ターはラッカーゼ遺伝子の５’末端に機能的に（functionally）に結合する。 適当かつ有利なプロモーターはｔａｃプロモーター、サブチリシンプロモータ ー、ＧＡＬプロモーター、ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロ モーター、グルコアミラーゼプロモーター、ｇａｐＤＨプロモーターおよびアル コールオキシダーゼプロモーターの群から選択される。 Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現にはｔａｃプロモーターが、Ｂａｃｉｌｌｕｓに おける発現にはサブチリシンプロモーターが、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現にはＧＡＬプロモーターが、Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒにおける発現にはＴＡＫＡアミラーゼプロモーターが、バ キュロウイルスを感染させた昆虫細胞における発現のためにはポリヘドリンプロ モーターが、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのグルコアミラー ゼプロモーターもしくは酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのアルコール オキシダーゼプロモーターが適当かつ有利である。 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼプロモーターま たは酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのアルコールオキシダーゼプロモ ーターが新規の好熱性ラッカーゼの発現のために特に 適当である。 有利には発現ベクターは、宿主生物に適当な転写終結のためのシグナルおよび 真核生物においては更にポリアデニル化のためのシグナルを有しているべきであ り、これらはラッカーゼ遺伝子の３’末端に機能的に結合するべきである。 有利には発現させたタンパク質は宿主生物によって培地に分泌されるべきであ る。宿主生物による分泌はＮ−末端シグナル配列によって媒介される。シグナル 配列はラッカーゼ遺伝子中に存在する天然のシグナル配列であるか、または異種 のシグナル配列であり、これらのコード化ＤＮＡは発現ベクター中でラッカーゼ 遺伝子の５’末端に機能的に結合する。 以下の分泌タンパク質のシグナル配列が有利である：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａからのα−シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのサブチリシン、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ ｓからの酸ホスファターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのα−ア ミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ ａｗａｍｏｒｉからのグルコアミラーゼまたはラッカーゼ遺伝子中に天然に 存在するシグナル配列。 特に適当なものはラッカーゼ遺伝子中に天然に存在 するシグナル配列および以下の異種のシグナル配列である：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉからのグルコ アミラーゼのシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅからのα因子のシグナル配列またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの酸 ホスファターゼのシグナル配列。 またラッカーゼの分泌は、分泌タンパク質もしくは該タンパク質の分泌される 断片のための遺伝子を発現ベクター中でラッカーゼ遺伝子に機能的に結合させた 融合タンパク質の発現によって達成することができる。この点において特に有利 なものはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼのＮ−末 端断片および好熱性ラッカーゼからなる融合タンパク質の発現である。 更に有利にはグルコアミラーゼとラッカーゼとの結合点は、この結合点のアミ ノ酸配列が宿主細胞の分泌装置におけるプロセシングペプチダーゼのための認識 部位となるように選択され、その際、発現した融合タンパク質は生体内で分解さ れ、ラッカーゼが放出される。 また有利には発現ベクターは選択マーカーのための遺伝子を有する。遺伝子に よってコードされる選択マーカーは宿主生物に抗生物質耐性を付与するか、また は宿主生物の欠陥を補足してもよい。 有利な選択マーカーは抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラ ムフェニコール、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、ゼオシン（zeocin）も しくはバイアラホス（bialaphos）に耐性を付与する遺伝子である。生育の欠陥 を補足するために有利な選択マーカーは遺伝子、例えばａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ｔ ｒｐＣ、Ｈｉｓ４、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、またはｈｙｇＢである。 選択マーカーとして特に適当なものはａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびに Ｈｉｓ４遺伝子および抗生物質ゼオシンのための耐性遺伝子である。 更に選択マーカ一遺伝子は１個のＤＮＡ分子中にラッカーゼ遺伝子と一緒に存 在するか、またはこれらの２個の遺伝子は異なるＤＮＡ分子中に別々に存在して もよい。後者の場合には、両者のＤＮＡ分子を一緒に同時形質転換する。 またこのように本発明は新規のＤＮＡ配列を有する発現ベクターに関する。 新規の発現ベクターを発現させるための適当かつ有利な微生物は、細菌由来の 微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、真 核生物由来の微生物、例えば属ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓもしくはＰｉｃｈｉ ａの酵母、あるいは属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅ ｕｒｏｓｐｏｒａもしくはＳｃｈｙｚｏｐｈｉｌｌｕｍ の糸状菌または真核性の細胞培養、例えばバキュロウイルスを感染させた昆虫細 胞である。 特に適当なものは属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたは 酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉ ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。 新規ＤＮＡによってコードされるタンパク質は以下の生物化学的特性を有して いる： 該タンパク質はラッカーゼの酵素活性を有している。該酵素活性の至適ｐＨは 酸性の範囲であり、かつｐＨ２．０で最大であり、ｐＨ４．０で最大の酵素活性 の半分を有する。４５℃およびｐＨ４．５〜６．０の該酵素の安定性は２時間ま での時間で１００％である。 ４５℃およびｐＨ３．０での該酵素の安定性は１時間までの時間で５０％であ る。ｐＨ４．５での至適温度は７０℃である。６５〜７５℃での酵素活性は依然 として最大活性の８０％である。５０〜８０℃での酵素活性は依然として最大活 性の５０％である。ｐＨ４．５および温度５５℃以下での酵素安定性は２時間ま での時間で９０％である。ｐＨ４．５および温度６５℃での酵素安定性は１時間 までの時間で５０％である。 新規のタンパク質はタンパク質配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含んでいる。 有利には新規タンパク質を前記の微生物における新規ＤＮＡ配列の発現によっ て製造する。 有利にはＤＮＡを前記の発現ベクターの１種を使用して微生物中で発現させる 。 このように本発明は新規ＤＮＡ配列または新規発現ベクターを有する微生物に も関する。 微生物からのタンパク質の分泌を可能にする微生物と発現系との組合せを使用 することが特に有利である。かかる有利な組合せの例は： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａ ｍｏｒｉにおける新規ＤＮＡ配列を発現するためのグルコアミラーゼプロモータ ーの使用。この発現系において有利に使用される分泌シグナルは好熱性ラッカー ゼ自体のシグナル配列またはグルコアミラーゼ−ラッカーゼ融合タンパク質のグ ルコアミラーゼ部分のシグナル配列である。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける新規ＤＮＡ配列を発現するためのア ルコールオキシダーゼプロモーターの使用。この発現系において使用される分泌 シグナルは有利には好熱性ラッカーゼ自体のシグナル配列またはＳａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子のシグナル配列またはＰｉｃ ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの酸ホスファターゼの シグナル配列である。 新規のタンパク質はラッカーゼに関する公知の全ての適用に適当である。これ らはパルプの脱リグニンならびに高分子量の凝集物(aggregate)の解重合のため に特に適当である。ラッカーゼは古紙の脱インキ、廃水の処理、特にこの点につ いてはパルプの漂白からのリグニン含有廃水における芳香族化合物の重合におい てもしくは汚染された土壌の解毒における広範な適用において更に使用される。 他の使用範囲は前駆成分との反応によって染料の酸化および染料の活性化をし、 顔料を形成することに関する。有機合成での使用範囲は芳香族化合物のカップリ ング反応または芳香族置換基の酸化を含んでおり、この点については例えばベン ジルアルコールの相応のアルデヒドへの酸化を更なる酸化によるカルボン酸の形 成を回避して実施することを含んでいる。前記の使用において、ラッカーゼは関 連の反応においてそれ自体で、あるいは反応促進メデイエーター(reaction-prom oting mediator)と組み合わせて使用することができる。かかるメディエーター の例はＡＢＴＳもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。 このように本発明は、パルプの脱リグニン、高分子量凝集物の解重合、古紙の 脱インキ、廃水、特にパルプの漂白からのリグニン含有廃水中の芳香族化合物の 重合、染料の酸化、もしくは顔料形成のための染料の 活性化のための新規タンパク質の使用、芳香族化合物のカップリング反応もしく は芳香族側鎖の酸化のための有機合成での使用に関する。 前記の使用は新規ラッカーゼをそれ自体もしくは反応促進メディエーターとの 組合せで使用することによって実施できる。 図１はＤＮＡベクターｐＡＮｌａｃ１Ｓの構造を示している。 図２はＤＮＡベクターｐＡＮｌａｃ２Ｓの構造を示している。 図３はＤＮＡベクターｐＬ５１２の構造を示している。 図４はＤＮＡベクターｐＬ５３２の構造を示している。 図５は新規のラッカーゼの活性のｐＨによる依存を示している。 図６は新規のラッカーゼのｐＨ安定性を示している。 図７は新規のラッカーゼの活性の温度による依存を示している。 図８は新規のラッカーゼの温度安定性を示している。 以下の実施例は本発明を更に詳細に説明している。ＤＮＡもしくはＲＮＡの処 理のために実施例中で使用される標準的な方法、例えば制限エンドヌクレアーゼ 、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等による処理、ならびに標準的な方法、例え ば菌の形質転換、サザンおよびノーザン分析、ＤＮＡ塩基配列決定、放射線標識 およびＰＣＲ技術は特に記載がない限り使用されるキットの製造者によって推奨 されるように実施するか、または製造者の説明書を使用できない場合には標準的 な教本から公知の従来の技術に従って実施する。 例１Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１からのｃＤＮＡバンクの作 成 Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１株を使用した。まず麦芽 寒天プレート（３％麦芽抽出物、０．３％ペプトン（大豆ミール）、１．５％寒 天、ｐＨ５．０）上の２８℃での７日間の培養によってＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅ ｒｓｉｃｏｌｏｒから菌糸体を得た。３片を麦芽寒天プレートから採り、これを 使用して５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍｌの滅菌麦芽抽出物 培地（３％麦芽抽出物、０．３％ペプトン（大豆ミール）、ｐＨ５．０）に植え た。該培養を２８℃で１００ｒｐｍで振盪しながら７日間インキュベートした。 このようにして製造した菌糸体の懸濁液を磁製漏斗で吸引濾過し、０．９％の生 理食塩水で洗浄し、菌糸体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢および乳棒を使用して 破砕した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。 菌 糸体２００ｍｇからの収量はＲＮＡ１００μｇであった。 ＲＮＡ６００μｇを使用してｍＲＮＡを単離した。これはオリゴ−ｄＴセファ ロース（ｍＲＮＡ単離キット、ファルマシア）上でのクロマトグラフィーによっ て実施した。ｍＲＮＡの収量は２６μｇであった。単離したｍＲＮＡ７．２５μ ｇを使用してｃＤＮＡを合成した。このためにストラタジーンからのｃＤＮＡ合 成キットを使用した。分別後に、アガロースゲル電気泳動によってｃＤＮＡを０ ．８〜２．１ｋｂおよび２．１〜５ｋｂの大きさの範囲で分別した。両画分のｃ ＤＮＡをアガロース（Ｑｉａｇｅｎ ゲル抽出キット）から単離し、単離したｃ ＤＮＡを使用してｃＤＮＡバンクを作成した。ｃＤＮＡバンクはラムダファージ （ストラタジーン、ＺＡＰ発現クローニングシステム）において作成した。０． ８〜２．１ｋｂの画分からは４×１０⁵ファージ／ベクターＤＮＡ（μｇ）が得 られた。２．１〜５ｋｂの画分からは１×１０⁵ファージ／ベクターＤＮＡ（μ ｇ）が得られた。得られたファージをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ 株（ストラタジーン）に感染させることによって増幅させた。 例２Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからの染色体遺伝子バンクの作成 Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１ からの菌糸体を例１に記載のように調製した。菌糸体を磁製漏斗で吸引濾過し、 ０．９％の生理食塩水で洗浄し、次いで液体窒素中で凍結させ、乳鉢および乳棒 を使用して破砕し、１ｇ部に分けた。破砕した菌糸体の各１ｇ部を滅菌試料容器 中に取り、直ちに抽出溶液（０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０、０．１ＭＥＤＴ Ａ、０．２５ＭのＮａＣｌ、０．６ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ）５ｍｌおよび ナトリウムラウロイルサルコシンの１０％（ｗ／ｖ）溶液０．５ｍｌと混合した 。５０℃で少なくとも２時間のインキュベーション後に、混合物を５ＭのＮａＣ ｌ０．８５ｍｌおよび０．７ＭのＮａＣｌ中の１０％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢ溶液 ０．７ｍｌと混合し、６５℃で３０分間インキュベートした。クロロホルム／イ ソアミルアルコール混合物（２４：１）７ｍｌの添加後に、混合物を振盪し、遠 心分離によって２相を分離させた。水相を分離し、イソプロパノール０．６容量 部の添加によって染色体ＤＮＡが沈殿した。引き続き沈殿したＤＮＡをカラム（ Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ）上で精製した。このようにして１６ｇ の菌糸体から染色体ＤＮＡ０．５ｍｇを単離できた。 染色体遺伝子バンクを作成するために、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌ ｏｒ ＴＶ−１からの染色体ＤＮＡ９０μｇをＥｃｏＲＩで完全に切断し、アガ ロースゲル電気泳動によって分離した。染色体ＤＮＡ断 片を２〜４ｋｂおよび４〜１０ｋｂの大きさの範囲で単離し、それぞれの場合に おいてラムダファージ（ストラタジーン、ＺＡＰクローニングシステム）にクロ ーニングした。２〜４ｋｂのＤＮＡ画分からは１×１０５ファージ／ベクターＤ ＮＡ（μｇ）が得られ、４〜１０ｋｂのＤＮＡ画分からは５．４×１０⁴ファー ジ／ベクターＤＮＡ（μｇ）が得られた。ファージをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株に感染させることによって増幅させた。 例３Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからのゲノムＤＮＡからのラッカーゼ 特異的ＤＮＡプローブの調製 ラッカーゼ遺伝子を単離するためのＤＮＡプローブをＴ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏ ｒのゲノムＤＮＡからの縮重プライマーでのＰＣＲ増幅によって調製した。縮重 プライマーは公知のラッカーゼ遺伝子の配列の比較に基づいて構築された。ＥＭ ＢＬ遺伝子データバンクに含まれるＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｃｏ ｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ、Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ、Ａｇａｒ ｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓおよび不完全菌類のサブクラスから詳細に分類され ていない糸状菌からのラッカーゼ遺伝子のアミノ酸配列を比較した。配列の比較 によって、全てのラッカーゼで完全に保存されている５〜７アミノ酸長を有する ４種の ペプチドを同定することが可能である。これらのペプチドを、縮重プライマーの 調製のために縮重コドンを考慮してＤＮＡに翻訳し直した。該プライマーは以下 の配列を有する： プライマーＣおよびＤは５’末端にＢａｍＨＩ開裂部位（下線部）を有し、そ こにその都度適当な縮重ラッカーゼ配列が結合する。 Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからのゲノムＤＮＡを例２に記載のような振盪フラ スコ培養の菌糸体から単離した。ＰＣＲ増幅を当業者に公知の方法で実施した。 第１のＰＣＲ反応においては、Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの染色体ＤＮＡ２００ ｎｇを、更にＴａｑポリメラーゼ１．２５Ｕ、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、各４ 種のｄＮＴＰ０．２ｍＭ、およびそれぞれの場合にプライマーＡおよびＢ１００ ピコモルを含有させて１００μｌのＰＣＲ反応に使用した。必要なＰＣＲ生成物 の特異的増幅のための他の条件は：９４℃で５分間、その後に９４℃で０．５分 間、４０℃で１分間および６０℃で２．５分間を７サイクル、ならびに９４℃で ０．５分間、５０℃で１分間および７２℃で２．５分間を３０サイクルである。 第１のＰＣＲ反応からの１μｌを、更にＴａｑポリメラーゼ１．２５Ｕ、ＭｇＣ ｌ₂ １．２５ｍＭ、各４種のｄＮＴＰ０．２ｍＭ、それぞれの場合にプライマーＣお よびＤ１００ピコモルを含有させて第２のＰＣＲ反応に使用した。必要なＰＣＲ 生成物の特異的増幅のための更なる条件は：９４℃で５分間、その後に９４℃で ０．５分間、４０℃で１分間および６０℃で２．５分間を７サイクル、ならびに ９４℃で０．５分間、５０℃で１分間および７２℃で２．５分間を３０サイクル である。約１．１ｋｂのＰＣＲ生成物が得られた。ＰＣＲ生成物をアガロースゲ ル電気泳動によって精製し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩで切断し たｐＵＣ１８ベクター中にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。形質 転換したＥ．ｃｏｌｉの培養からプラスミドを単離した。５’末端および３’末 端のＤＮＡ配列分析によってクローニングしたＤＮＡ配列がラッカーゼ遺伝子の 断片であることが示された。 ラッカーゼ遺伝子をスクリーニングするためのＤＮＡプローブを調製するため に、ラッカーゼ特異的ＰＣＲ断片をＢａｍＨＩでの処理によって切断し、アガロ ース電気泳動によって単離し、α−［³²Ｐ］−ｄＡＴＰ（ランダムプライミング キツト（random priming kit）、ベーリンガーマンハイム）で放射線標識した。 遊離放射能をセファデックスＧ２５（ファルマシア）上でのクロマトグラフィー によって除去した。放射線標識したＤＮＡプローブの特異的活性は１×１０⁷ｃ ｐｍ／ＤＮＡ（μｇ）であった。 例４Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１からのラッカーゼのｃＤＮ Ａ遺伝子の単離 例１に記載したＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１からのｃ ＤＮＡ遺伝子バンクを使用した。ラッカーゼｃＤＮＡ遺伝子のためのスクリーニ ングを従来の技術に従って実施した。第１のスクリーニング段階において、まず Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’の細胞を１０個のペトリ皿上で培 養し、次いでペトリ皿１個あたりｃＤＮＡバンク（０．８〜２．１ｋｂの画分、 例１参照）の５００００ファージを感染させた。３７℃での一晩のインキュベー ション後に、新たに形成したファージをナイロンフィルター（ストラタジーン） に移した。次いで該フィルターを、放射線標識したラッカーゼ特異的プローブ（ 例３参照）を使用して製造者の説明書に従ってハイブリダイズさせた。ハイブリ ダイゼーション温度は５０％のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション 緩衝液中で４５℃であった。陽性のクローンを採り、スクリーニング工程の反復 によって精製した。単離の第３段階後に、２０個の強力にハイブリダイズするフ ァージクローンを前記のスクリーニングで単離し、インビボ切り出し（in vivo excision）によって製造者（ストラタジーン）のプロトコールに従ってｐＢＫ ＣＭ Ｖベクター（ストラタジーン）に再クローニング（reclone）した。制限エンド ヌクレアーゼ消化およびＤＮＡ塩基配列決定によるクローンの分析は、ＤＮＡレ ベルで実質的に同一の２種のラッカーゼ遺伝子が単離されたことを示した。２種 のクローンの完全なＤＮＡ塩基配列決定は、これらがアミノ酸配列において同一 のラッカーゼ遺伝子の対立遺伝子であることを示した。２種のラッカーゼｃＤＮ Ａ遺伝子をＬａｃ５．５およびＬａｃ５．６と呼ぶ。同様に該ラッカーゼｃＤＮ Ａ遺伝子を有するプラスミドをｐＬａｃ５．５およびｐＬａｃ５．６と呼ぶ。 例５Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１からのラッカーゼの染色体 遺伝子の単離 Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１からの例２に記載される 染色体遺伝子バンク（２〜１０ｋｂ画分、例２参照）における染色体のラッカー ゼ遺伝子のためのスクリーニングを例４に記載のｃＤＮＡクローンのためのスク リーニングと類似に実施した。例３に記載の放射線標識されたラッカーゼ特異的 プローブを再度使用した。ハイブリダイゼーション温度は５０％ホルムアミドを 含有するハイブリダイゼーション緩衝液中で４５℃であった。スクリーニングに おいて３個の強力にハイブリダイズしたファージクローンを単離し、インビボ切 り出しによって製造者（スト ラタジーン）のプロトコールに従ってｐＢＫＣＭＶベクター（ストラタジーン） に再クローニングした。制限エンドヌクレアーゼでの分析は全ての３クローンは 同一であり、約７ｋｂの長さを有しているという結論を導いた。ＤＮＡ塩基配列 決定による分析は、全ての３クローンがラツカーゼＬａｃ５．６の染色体遺伝子 に相当することを示した。クローンのコーディング領域およびその都度５’およ び３’領域中の約１ｋｂの末端配列の塩基配列決定をした（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：８）。 例６ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのラッカーゼＬａｃ５．５の発現のためのＤＮＡ構成体 の調製 Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのラッカーゼＬａｃ５．５のｃＤＮ Ａを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓファミリーからの糸状菌に特異的な発現シグナル に機能的に結合させた。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからの以下の遺伝子発現エレメ ントを使用した： ａ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌ ａＡ）のためのプロモーター（J.C.Verdoes，P.J.Punt，J.M.Schrickx，H.M.van Verseveld，A.H.StouthamerおよびC.A.M.J.J.van den Hondel Transgenic Rese arch 2(1993)，84-92）。 ｂ）シグナル配列をコードするＤＮＡ断片および成熟グルコアミラーゼの断片を 下流に有するｇｌａＡプロ モーター。これにＫＥＸ２プロテアーゼの開裂部位をコードするＤＮＡ配列を結合 させる（M.P.Broekhuijsen，I.E.Mattern，R.Contreras，J.R.Kinghorn，C.A.M. J.J.van den Hondel(1993)，J.Biotechnol.31，135-145）。 ｃ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓからのｔｒｐＣ遺伝子の転写タ ーミネーター（E.J.Mullaney，J.E.Hamer，M.M.YeltonおよびW.E.Timberlake(19 85)，Mol.Gen.Genet.199，37-45）。 しかしながらＬａｃ５．５ｃＤＮＡとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの発現シグナル との機能的結合のためにはまずＬａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子の５’および３’領 域を改変する必要がある。Ａ：ラッカーゼＬａｃ５．５ｃＤＮＡとｇｌａＡプロモーターとの結合 更なるプロセシングのために、Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子をベクターｐＵＣ １９に再クローニングした。この目的のために、Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子を 例１で得られたｐＢＫ ＣＭＶベクターからの１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、事前にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断したｐＵＣ１９ベ クターにサブクローニングした。得られた４．６ｋｂのプラスミドをｐＬａｃ５ と呼ぶ。 Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧの改変のために、プライマー ＥおよびＦを使用した。 プライマーＥ中の下線部はＢｓｐＨＩ開裂部位を示し、プライマーＦ中の下線 部はＳｍａＩまたはＸｍａＩの開裂部位を示す。 Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子の３’領域の改変のためにプライマーＧおよびＨ を使用した。 プライマーＧ中の下線部はＢｂｓＩ開裂部位を示し、プライマーＨ中の下線部 はＡｆｌＩＩ開裂部位を示す。 プライマーＥおよびＦを使用して、ＰＣＲ反応によってＬａｃ５．５ｃＤＮＡ 遺伝子の５’領域において１８８ｂｐの大きさの断片を増幅した。プライマーＧ およびＨを使用して、Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子の３’領域において１１０ｂ ｐの大きさの断片を増幅した。１００μｌのＰＣＲ混合物はその都度Ｌａｃ５． ５ｃＤＮＡ（ｐＢＫ ＣＭＶベクター中）１０ｎｇ、Ｔｔｈポリメラーゼ０．５ Ｕ、ＭｇＣｌ₂１．２５ｍＭ、各４種のｄＮＴＰ０．２ｍＭおよびプライマーＥ およびＦのペアまたはプライマーＧおよびＨのペアのどちらか１４０ピコモルを 含有する。ＰＣＲ反応は以下の 条件下で実施する：９４℃で５分間、その後に９４℃で１分間、５０℃で２分間 および７２℃で１分間を３０サイクル、最後に７２℃で７分間。 まずプライマーＥおよびＦでのＰＣＲ反応からのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよ びＸｍａＩで切断し、次いでゲル電気泳動で精製し、事前にＥｃｏＲＩおよびＸ ｍａＩで切断したベクターｐＬａｃ５にクローニングした。これにより、翻訳の 開始コドンＡＴＧにＢｓｐＨＩ開裂部位が組み込まれたベクターｐＬａｃ５１が 得られた。 まずプライマーＧおよびＨでのＰＣＲ反応からのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよ びＸｂａＩで切断し、次いでゲル電気泳動によって精製し、事前にＥｃｏＲＩお よびＸｂａＩで切断したｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。約１００ｂｐ の大きさのインサートを、得られたプラスミドｐＬＴ５からＢｂｓＩおよびＸｂ ａＩで切断した。最終的にＢｂｓＩ−ＸｂａＩ断片を事前にＢｂｓＩおよびＸｂ ａＩで切断したベクターｐＬａｃ５１にクローニングした。これにより、ラッカ ーゼｃＤＮＡ遺伝子の３’末端に新規のＡｆｌＩＩ開裂部位を有するベクターｐ Ｌａｃ５１３が得られた。 改変した５’および３’領域を有するＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏ ｒのラッカーゼＬａｃ５．５のためのｃＤＮＡ遺伝子をプラスミドｐＬａｃ５１ ３のＢｓｐＨＩによる部分消化によって単離した。これ により、Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子のコーディング領域およびｐＵＣ１９ベク ターの約１．１ｋｂを有する２．６ｋｂの断片が得られた。この断片を第２段階 でＡｆｌＩＩで切断し、１．５ｋｂの大きさの得られたＬａｃ５．５ｃＤＮＡ断 片を単離した。この断片をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからの４．０ｋ ｂの大きさの断片、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓからのｔｒｐＣ 転写ターミネーターの０．７ｋｂの大きさの断片およびｐＵＣ１８ベクターの２ ．７ｋｂの大きさの断片を有するベクターｐＡＮ５２−１２からの７．４ｋｂの 大きさのＡｆｌＩＩ−ＮｃｏＩ断片にライゲーションした。得られた８．８ｋｂ の大きさのベクターをｐＡＮｌａｃ１と呼ぶ。ｐＡＮｌａｃ１においてｇｌａＡ プロモーター領域はＮｃｏＩ−ＢｓｐＨＩ間領域（intersection）を介してラッ カーゼｃＤＮＡ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに機能的に結合する。Ｂ：Ｎ−末端シグナル配列をグルコアミラーゼ断片と交換することによるラッカ ーゼＬａｃ５．５ｃＤＮＡとｇｌａＡプロモーターとの結合 成熟ラッカーゼＬａｃ５．５のＮ末端をコードするｃＤＮＡ遺伝子の領域を改 変するために、プライマーＩおよびＦを使用した。 プライマーＩ中の下線部はＥｃｏＲＶ開裂部位を示す。 Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子の３’領域を改変するために、プライマーＧおよ びＨを使用した（この例のＡ参照）。 プライマーＩおよびＦを使用して、ＰＣＲ反応によってＬａｃ５．５ｃＤＮＡ 遺伝子の５’領域において１１０ｂｐの大きさの断片を増幅した。プライマーＧ およびＨを使用して、Ｌａｃ５．５ｃＤＮＡ遺伝子の３’領域において１１０ｂ ｐの大きさの断片を増幅した。ＰＣＲ反応はこの例のＡに記載のように実施した 。 プライマーＩおよびＦでのＰＣＲ反応からのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＸ ｍａＩで切断し、次いでゲル電気泳動によって精製し、事前にＥｃｏＲＩおよび ＸｍａＩで切断したベクターｐＬａｃ５にクローニングした。これにより成熟ラ ッカーゼタンパク質の最初のアミノ酸のためのコドンの前の５’末端にＥｃｏＲ Ｖ開裂部位、その後に配列Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１４）のアミノ酸のためのコドンが挿入されたベクターｐＬａｃ５２が得ら れた。この配列はＫＥＸ２プロテアーゼのための認識部位で ある。ベクターｐＬａｃ５２中のラッカーゼｃＤＮＡ遺伝子の３’領域をベクタ ーｐＬａｃ５１に関して記載したように改変した。プライマーＧおよびＨでのＰ ＣＲ反応からの約１００ｂｐの大きさのインサートをＢｂｓＩおよびＸｂａＩを 使用してプラスミドｐＬＴ５から切断し、単離した。最終的にＢｂｓＩ−Ｘｂａ Ｉ断片を、ＢｂｓＩおよびＸｂａＩで切断したベクターｐＬａｃ５２にクローニ ングした。これによりラッカーゼｃＤＮＡ遺伝子の３’末端に新規のＡｆｌＩＩ 開裂部位を有するベクターｐＬａｃ５２３が得られた。 Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのラッカーゼＬａｃ５．５のための 改変された５’および３’領域を有するｃＤＮＡ遺伝子がＥｃｏＲＶおよびＡｆ １ＩＩでプラスミドｐＬａｃ５２３を切断することによって得られ、得られた１ ．５ｋｂの大きさのＬａｃ５．５ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動の後に 単離した。この断片を、ベクターｐＡＮ５６−９の９．３ｋｂの大きさのＡｆｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片にライゲーションした。ベクターｐＡＮ５６−９は４．０ ｋｂの大きさのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのｇｌａＡプロモータ ー、その後にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのｇｌａＡグルコアミラーゼ の断片をコードする２．０ｋｂの大きさの断片、ＫＥＸ２開裂部位の４アミノ酸 をコードする短いＤＮＡ切 片、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓからの０．７ｋｂの大きさのｔ ｒｐＣ転写ターミネーターの断片ならびに２．７ｋｂの大きさのｐＵＣ１８ベク ターの断片を有する。ＥｃｏＲＶおよびＡＦｌＩＩ開裂部位をＫＥＸ２開裂部位 の３’に配置した。Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換によって、１０．８ｋｂの大きさ のベクターが得られ、これをｐＡＮｌａｃ２と呼ぶ。ｐＡＮｌａｃ２において、 成熟ラッカーゼＬａｃ５．５のためのｃＤＮＡのコーディング領域を、発現の際 にまずシグナル配列を含むグルコアミラーゼの断片、ＫＥＸ２プロテアーゼのた めの認識配列の断片および完全なラッカーゼＬａｃ５．５の断片からなる融合タ ンパク質が生成するようにグルコアミラーゼ遺伝子のコーディング領域に結合し た。分泌の際にこの融合タンパク質はＫＥＸ２プロテアーゼによって開裂され、 成熟ラッカーゼが培養上清に分泌された。Ｃ：ベクターｐＡＮｌａｃ１および ＡＮｌａｃ２へのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ の選択マーカーの組み込み ｐＡＮｌａｃ１およびｐＡＮｌａｃ２をそれぞれのベクター５μｇのＮｏｔＩ による一晩の消化によって直鎖化した。次いで子牛（calf）腸内アルカリ性ホス ファターゼで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿をし た。選択マーカーのための遺伝子ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）およびｐｙｒＧ （オロチジン−５’−一リン酸デカルボキシラーゼ） をプラスミドｐＡＮ５２−１１に導入し、これからＮｏｔＩでの消化後に６．４ ｋｂの大きさの断片として前記遺伝子を単離することができた。それぞれの直鎖 化しかつホスファターゼ処理したベクターｐＡＮｌａｃ１およびｐＡＮｌａｃ２ の０．２μｇを、単離したＮｏｔＩ断片０．６μｇにライゲーションし、これを 使用してＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。プラスミドＤＮＡをこれら の形質転換からのアンピシリン耐性のコロニーから調製し、ＮｏｔＩで切断し、 アガロースゲル電気泳動によって分析した。ベクターｐＡＮｌａｃ１での形質転 換からの８個の分析したクローンの６個ならびにベクターｐＡＮｌａｃ２での形 質転換からの７個の分析したクローンの５個は６．４ｋｂのＮｏｔＩ遺伝子断片 を有していた。選択マーカー遺伝子を有したベクターをｐＡＮｌａｃ１Ｓ（大き さ１５．３ｋｂ、図１）およびｐＡＮｌａｃ２Ｓ（大きさ１７．２ｋｂ、図２） と呼ぶ。得られた６個のｐＡＮｌａｃ１Ｓクローンの３個は図１に示される望ま しい方向でＮｏｔＩ断片を有し、得られた５個のｐＡＮｌａｃ２Ｓクローンの１ 個は図２に示される望ましい方向でＮｏｔＩ断片を有していた。 例７Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの形質転換 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのＡＢ１．１３株（ｐｙｒＧ^-）（W.van Hartingsveldt，I.E.Matter n，C.M.J.van Zeijl，P.H.PouwelsおよびC.A.M.J.J.van den Hondel(1987)Mol.G en.Genet.206，71-75）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ（ＡＴ ＣＣ １１３５８株）を形質転換のために使用した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの 形質転換を従来の技術に従って実施した（P.J.PuntおよびC.A.J.J.van den Hond el(1992)，Meth.Enzymology 216，447-457）。 ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのプロトプラストをＮｏｖｏｚｙｍ２３４での菌糸体 の処理によって得た。１個のフラスコからの菌糸体を、新しく製造しかつ濾過滅 菌（sterile-filtred）した、滅菌エルレンマイヤーフラスコ中のＯＭ培地（０ ．２７Ｍ塩化カルシウム、０．６ＭのＮａＣｌ）中の溶解酵素混合物Ｎｏｖｏｚ ｙｍ２３４（ノボノルディスク）の溶液１５ｍｌ中に懸濁した。酵素溶液中に再 懸濁した菌糸体を３０℃で低速（８０ｒｐｍ）で１〜３時間インキュベートした 。インキュベーションの間に、顕微鏡によってプロトプラストの形成を観察した 。自由に移動可能なプロトプラストは通常１時間後に見られる。大量の自由に移 動可能なプロトプラストが得られた後に、これらをガラス濾過器でＭｉｒａｃｌ ｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を通して濾過することによって残留している菌 糸体から分離し、慎重にＳＴＣ培地（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ塩化カル シウム、３５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５）で洗浄した。 プ ロトプラストを滅菌試料容器中での懸濁液の遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、 １０分間）によって単離し、ＳＴＣ培地で２回洗浄した。プロトプラストの濃度 を計数盤で顕微鏡によって測定した。プロトプラスト懸濁液をプロトプラスト再 生（regeneration）または形質転換に関する実験のために１×１０⁸プロトプラ スト／ｍｌの濃度に調整した。 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａ ｍｏｒｉからのプロトプラストをプラスミドｐＡＮｌａｃ１ＳおよびｐＡＮｌａ ｃ２Ｓで形質転換した。両者のプラスミドはｐｙｒＧ遺伝子（オロチジン−５’ −リン酸デカルボキシラーゼをコードする）ならびにａｍｄＳ遺伝子（アセトア ミダーゼをコードする）を選択マーカーとして有する。プロトプラストの０．１ ｍｌアリコートを容量１２ｍｌのインキュベーション容器中でプラスミドＤＮＡ １０μｇと混合し、氷上で２５分間インキュベートした。次いで６０％のＰＥＧ ４０００溶液（６０％ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリ ス塩酸、ｐＨ７．５）１．２５ｍｌを混合を繰り返しながら形質転換混合物にゆ っくりと添加した。更に２０℃で２０分間インキュベートした後に、反応容器を ＳＴＣ培地で満たし、混合し、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿物を再懸濁し 、ソルビトールで浸透的に安定化した選択培地上にプレーティングした。プレー トを３０℃で７日間インキュベートし、コロニーの生育を観察した。幾つかの実 験での形質転換率はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに関しては１〜５形質 転換体／プラスミドＤＮＡ（μｇ）であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍ ｏｒｉに関しては０．１〜０．５形質転換体／プラスミドＤＮＡ（μｇ）であっ た。 形質転換体をアセトアミドを有する選択プレートに移行することによって純化 （purify）した。高いコピー数を有する形質転換体をアクリルアミドを有する選 択プレート上にプレーティングすることによって同定した。アクリルアミドは、 アセトアミドとは反対にａｍｄＳ遺伝子によってコードされるアセトアミダーゼ 酵素の不良な基質であり、高いコピー数のａｍｄＳ遺伝子を有する形質転換体の みが生育可能である。ラッカーゼ酵素の機能的な発現を可能にする形質転換体を 、まずマルトデキストリン、ｇｌａＡプロモーターの発現のインデューサーを有 するプレートに植えかえることによって同定し、２８℃で２日間生育させた後に ＡＢＴＳ寒天（ＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．５）中の０．１％ＡＢＴ Ｓ、１％アガロース）で覆った。ラッカーゼを発現する形質転換体は緑色のハロ の形成によって示された。胞子の懸濁液をアクリルアミドプレート上での良好な 生育およびＡＢＴＳによる活性試験における陽性反応の両方を示した形質転換体 から製造した。 例８ＡｓｅｒｉｌｌｕｓにおけるＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのラッカ ーゼＬａｃ５．５の発現 ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおけるラッカーゼＬａｃ５．５の発現を振盪フラス コ規模で調査した。以下の培養培地を使用した：水道水中のマルトデキストリン の５％（ｗ／ｖ）溶液を２０分間オートクレーブにかけた。次いで１Ｍ硫酸マグ ネシウム１ｍｌ、１０００×の微量元素溶液０．５ｍｌ、５０×のＡｓｐＡ溶液 １０ｍｌおよび１０％（ｗ／ｖ）カザミノ酸５ｍｌを前記のベース培地５００ｍ ｌに添加した。１０００×の微量元素溶液は以下の組成を有している：ｚｎＳＯ₄ ×７Ｈ₂Ｏ２．２ｇ、Ｈ₃ＢＯ₃１．１ｇ、ＭｎＣｌ₂×４Ｈ₂Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳ Ｏ₄×７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ、ＣｏＣｌ₂×５Ｈ₂Ｏ０．１７ｇ、ＣｕＳＯ₄×５Ｈ₂Ｏ０ ．１６ｇ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄×２Ｈ₂Ｏ０．１５ｇおよびＥＤＴＡ５ｇをＨ₂Ｏ８０ｍ ｌ中に溶解した。５０×のＡｓｐＡ溶液は以下の組成を有する：ＮａＮＯ₃１５ ０ｇ、ＫＣｌ１３ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄３８ｇをＨ₂Ｏ５００ｍｌ中に溶解させ、ｐＨ を１０ＭのＫＯＨによって５．５に調整した。この培地にＣｕＳＯ₄×５Ｈ₂Ｏを 最終濃度０．５ｍＭで添加した。 発現実験のために、３００ｍｌのエルレンマイヤー フラスコ中の培養培地５０ｍｌに１×１０⁶胞子／ｍｌを植えた。培養を振盪培 養器中で３０℃および３００ｒｐｍで実施した。試料を１週間にわたり毎日採取 し、培養上清中でのラッカーゼ活性を測定した。最大ラッカーゼ活性は６０〜１ ００時間の間の生育において観測され、これは０．５〜２．５Ｕ／ｍｌの間であ った。ラッカーゼ活性を基質ＡＢＴＳ（アッセイにおいて０．１ｍＭ）を使用し てＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．５）中および３７℃で比色法（colori metry）によって測定した。ＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液は０．２ＭのＮａ₂ＨＰ Ｏ₄溶液に対する０．１Ｍクエン酸溶液のｐＨ４．５への滴定によって製造した 。４２０ｎｍでの吸光度の増加が測定された（ＡＢＴＳの４２０ｎｍでの吸光係 数：３．６×１０⁴１×モル¹×ｃｍ^-1）。ラッカーゼ活性１Ｕは１分間あたりで 変換されるＡＢＴＳ基質１マイクロモルとして定義した。 例９Ｐｉｃｈｉａ ａｓｔｏｒｉｓにおけるＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏ ｒのラッカーゼＬａｃ５．５の発現 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている発現系を関連の発現ベクター（ｐＰ ＩＣ３およびｐＰＩＣ９）およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＧＳ１１ ５およびＫＭ７１）と一緒に使用した。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５株およびＫＭ７１株はヒスチジン要求株である。 発現ベクターはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのアルコールオキシダーゼ 遺伝子ＡＯＸ１のプロモーターおよびターミネーターを有する。Ｔｒａｍｅｔｅ ｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのラッカーゼＬａｃ５．５のｃＤＮＡ遺伝子を前記の ２個の遺伝子調節因子の間にクローニングした。ベクターｐＰＩＣ９はＡＯＸ１ プロモーターの下流にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから のα因子タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を有し、その後に認 識配列Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（ＳＥＱ Ｉ ＤＮＯ：１５）をコードする短いＤＮＡ切片を有する。該ベクターはＥ．ｃｏｌ ｉでの選択のためにアンピシリン耐性遺伝子を有している。該ベクターはＰｉｃ ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでの選択のためにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓか らのＨＩＳ４遺伝子を有している。Ａ：ラッカーゼＬａｃ５．５のシグナル配列を有するラッカーゼＬａｃ５．５発 現ベクターの構築 プラスミドｐＬａｃ５．５ならびにプライマーＫおよびＬをラッカーゼ遺伝子 の増幅のために使用した。プライマーＦおよびＧは以下の配列を有している： プライマーＫはＥｃｏＲＩ開裂部位（下線部）を有し、その後にラッカーゼＬ ａｃ５．５のシグナル配列の最初の７アミノ酸に関するＤＮＡ配列を有している 。プライマーＬはＮｏｔ開裂部位（下線部）を有し、その後に相補的かつ逆方向 で翻訳の停止コドンならびにラッカーゼＬａｃ５．５の最後の７アミノ酸のため のＤＮＡ配列を有している。 ＰＣＲ増幅を当業者に公知の方法で実施した。ｐＬａｃ５．５ＤＮＡ２０ｎｇ を、更にＶｅｎｔポリメラーゼ０．５Ｕ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、各４種のｄＮＴ Ｐ０．２ｍＭおよびそれぞれの場合においてプライマーＫおよびＬ１００ピコモ ルを含有して５０μｌのＰＣＲ反応において使用した。必要なＰＣＲ生成物の特 異的な増幅のための他の条件は：９４℃で５分間、その後に９４℃で１分間、５ ５℃で１分間および７２℃で２分間を２５サイクルである。予想された１．５ｋ ｂの大きさのＰＣＲ断片が得られた。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精 製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、エタノールで沈殿させ、Ｈ₂ Ｏ中に取った。ベクターｐＰＩＣ３をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、ア ガロースゲル電気泳動によって精製し、単離し、アルカリ性ホスファターゼで処 理 した。次いでフェノール／クロロホルム（比３：１）で抽出し、エタノール沈殿 をした。ＰＣＲ増幅によって製造したラッカーゼＬａｃ５．５のＤＮＡ断片を前 記のように製造したｐＰＩＣ３べクターにライゲーションし、これを使用してＥ ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。プ ラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性クローンから単離し、クローニングした１． ５ｋｂのインサートをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩによる制限消化によって同定し た。調査した１２個のクローンの内９個が陽性であった。このようにして得られ たべクターをｐＬ５１２（図３）と呼ぶ。Ｂ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子のシグナル 配列を有するラッカーゼＬａｃ５．５の発現ベクターの構築 プラスミドｐＬａｃ５．５ならびにプライマーＬおよびＭを使用してラッカー ゼ遺伝子を増幅した。プライマーＭは以下の配列を有している： プライマーＭはＥｃｏＲＩ開裂部位（下線部）のための配列、その後にプロセ シングされるラッカーゼＬａｃ５．５の推測されるＮ−末端の最初の９アミノ酸 のためのＤＮＡ配列を有している。プロセシングされるラッカーゼＬａｃ５．５ のＮ−末端は他のラッカー ゼ配列との比較によって導いた。 ラッカーゼＬａｃ５．５のプロセシングされた形のためのＤＮＡ断片をこの例 のＡに記載のようにｐＬａｃ５．５ｃＤＮＡならびにプライマーＬおよびＭでの ＰＣＲ増幅によって製造した。ベクターｐＰＩＣ９をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ で切断し、この例のＡに記載のｐＰＩＣ３のように製造し、ＰＣＲ増幅によって 製造したラッカーゼＬａｃ５．５のＤＮＡ断片にライゲーションし、これを使用 してＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し た。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性クローンから単離し、クローニングし た１．５ｋｂのインサートをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでの制限消化によって同 定した。調査した１２個のクローンの内３個が陽性であった。このようにして得 られたベクターをｐＬ５３２（図４）と呼ぶ。Ｃ：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換 まずＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５株およびＫＭ７１株をＹＰ Ｄ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）５ｍｌにおいて ３０℃で一晩培養した。前記の前培養０．２ｍｌ部を使用して２つの本培養をＹ ＰＤ培地２５０ｍｌにそれぞれ植え、再び光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）が１．３ 〜１．５になるまで３０℃で一晩培養した。２５０ｍｌの本培養からの酵母細胞 を遠心分離（１５００×ｇ を５分間）し、毎回Ｈ₂Ｏ２００ｍｌで２回洗浄し、１Ｍのソルビトール１０ｍ ｌで１回洗浄し、最終的に１Ｍのソルビトール０．５ｍｌ中に取った。 ベクターｐＬ５１２またはｐＬ５３２のプラスミドＤＮＡをＳｔｕＩまたはＮ ｓｉＩのどちらかで直鎖化し、エタノールを使用して沈殿させ、１μｌあたりＤ ＮＡ１μｇの濃度で水中に取った。形質転換混合物はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ ｒｉｓ細胞８０μｌおよび直鎖化したベクターＤＮＡ１０μｇを含有している。 形質転換を１５００Ｖ、２５μＦおよび２００オーム（バイオラッドのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）でのエレクトロポレーションによって実施した。放電時間は約 ４．２ミリ秒であった。１Ｍのソルビトール１ｍｌを形質転換混合物に添加し、 これを氷上で３０分間インキュベートし、次いでヒスチジン不含のＭＤプレート （１．３４％ＹＮＢ、酵母の窒素ベース（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ）、４× １０^-5％ビオチン、１％デキストロース、１．５％寒天）上に０．３ｍｌのアリ コートでプレーティングした。形質転換体は３０℃での３〜５日間のインキュベ ーション後に現れた。形質転換体をＭＤプレート上に２回ストリークすることに よって精製した。ラッカーゼの生産体をＭＭインディケータープレート（MM ind icator plate）上で同定した。ＭＭインディケータープレートは１．３４％ＹＮ Ｂ、４×１０^-5％ビオチン、０．５％メタノール、１．５％寒天、１ｍ ＭＡＢＴＳおよび０．１ｍＭ硫酸銅を含有している。インデューサーのメタノー ルをペトリ皿の蓋に供し、拡散によりコロニーにメタノールが供給されることを 保証するために毎日新しくした。ラッカーゼの生産者は３０℃での２〜３日間の インキュベーション後に緑色のハロを形成した。 Ｅ：振盪フラスコ中での発現 ＢＭＧＹ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐ Ｈ６．０、１．３４％ＹＮＢ、４×１０^-5％ビオチン、１％グリセロール）５０ ｍｌにラッカーゼを生産するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換体を植 え、振盪機（３００ｒｐｍ）上で２８℃で４８時間培養した。この前培養からの 細胞を遠心分離（１５００×ｇで１０分間）によって単離し、本培養培地（ＭＭ Ｙ、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、４×１０^-5％ビオチン 、３％メタノール）１０ｍｌ中に懸濁した。ＭＭＹ培地に０．５ｍＭ硫酸銅を供 給し、更に本培養を振盪機上で３００ｒｐｍおよび室温で培養した。本培養にメ タノール（０．３ｍｌ／培地１０ｍｌ）を２４時間間隔で供給した。組み換えラ ッカーゼＬａｃ５．５の生産は２４時間後に始まった。４Ｕ／ｍｌまでの生産率 は本培養開始後１９０時間で達した。 例１０組み換えラッカーゼＬａｃ５．５の単離 組み換えラッカーゼＬａｃ５．５を例８に記載のように形質転換したＡｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ株の振盪フラスコ中での培養によって得た。ラッカーゼＬａｃ５ ．５を含有する培養上清をクロスフロー濾過によって濃縮した。このために除去 限界（exclusion limit）３０ｋＤを有するＳａｒｔｏｃｏｎマイクロ濾過モジ ュール（micro filtration module）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用した。次い で濃縮したラッカーゼＬａｃ５．５を凍結乾燥し、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ ｐＨ６．０）中に溶解させた。濃縮した組み換えラッカーゼＬａｃ５．５の活性 は１８．６Ｕ／ｍｌであった。 クロスフロー濾過によって濃縮したラッカーゼを２０ｍＭビストリス塩酸（ｐ Ｈ６．５）に対して透析した。この後に導電率１．５ｍＳ／ｃｍが測定された。 次いで透析したラッカーゼを、２０ｍＭのビストリス塩酸（ｐＨ６．５）（ロー ディングバッフアー）で較正したＤＥＡＥセファロース（フアルマシア）のカラ ム上でのクロマトグラフィーを実施した。これらの条件下でラッカーゼはＤＥＡ Ｅセファロースに結合する。ローディングバッファー中の０Ｍから０．５Ｍへの ＮａＣｌの直線のグラジエントでの溶離によって、ラッカーゼ活性は塩濃度０． １５ＭのＮａＣｌで回復した。ＤＥＡＥセファロースカラムからのラッカーゼ画 分と硫酸アンモニウムとを２０％飽和になるまで混合し、かつ酢酸ナトリウム（ ｐＨ４．５）を混合し（最 終濃度２０ｍＭ）、ｐＨを酢酸によって４．５に調整した。次いでこのようにし て調製したラッカーゼ画分をローディングバッファー（２０ｍＭ酢酸ナトリウム （ｐＨ４．５）、２０％飽和の硫酸アンモニウム）で較正したフェニル−セファ ロース（ファルマシア）のカラム上でのクロマトグラフィーを実施した。これら の条件下でラッカーゼはフェニル−セファロースに結合する。２０ｍＭ酢酸ナト リウム（ｐＨ４．５）中の２０〜０％飽和の硫酸アンモニウムの直線のグラジエ ントでの溶離によって、ラッカーゼ活性は硫酸アンモニウム飽和１６％で回復し た。ラッカーゼ画分を２０ｍＭビストリス塩酸（ｐＨ６．５）に対して透析し、 ＤＥＡＥセファロースへの結合および引き続いて実施する０．３ＭのＮａＣｌで の段階的な溶離によって濃縮した。結合および０．３ＭのＮａＣｌでの溶離はい ずれも２０ｍＭのビストリス塩酸（ｐＨ６．５）中で実施した。ラッカーゼ活性 は出発材料に対して２０％が得られた。単離したラッカーゼをＮ−末端アミノ酸 配列決定によって分析した。これによって決定された配列： はｃＤＮＡ配列およびホモロジー比較とから得られる成熟ラッカーゼＬａｃ５． ５のＮ末端一致した。 例１１組み換えラッカーゼＬａｃ５．５の生物化学的特性 例８に記載のようにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中で製造される組み換えラッカー ゼＬａｃ５．５の至適ｐＨと至適温度ならびにｐＨと温度の安定性を調査した。 これらの実験のために、組み換えラッカーゼＬａｃ５．５の緩衝液を、セファデ ックスＧ２５（ファルマシア、ＰＤ１０カラム）上でＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝 液（ｐＨ４．５）に取り替えた。Ａ：至適ｐＨ 図５に示される各ｐＨ値に適当な緩衝液を、緩衝されないクエン酸ナトリウム およびリン酸ナトリウムの溶液の適当な混合によって製造した。図５から明らか なように、ラッカーゼＬａｃ５．５は基質ＡＢＴＳに対して強酸性域に活性至適 を有する。Ｂ：ｐＨ安定性 ラッカーゼＬａｃ５．５を、ｐＨ３．０、４．５および６．０（温度３７℃） のＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液中でプレインキュベートした。アリコートを０、 ３０、６０および１２０分後に取り、ＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．５ ）中に希釈し、３７℃でラッカーゼ活性を測定した。ラッカーゼ活性はｐＨ４． ５および６．０での前処理によって悪影響を受けなかった。ｐＨ３．０でのラッ カーゼの半減期は６０および１２０分の間であった（図６）。Ｃ：至適温度 組み換えラッカーゼＬａｃ５．５のラッカーゼ活性を図７に示される温度で測 定した。ラッカーゼ活性はＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．５）でのＡＢ ＴＳアッセイを使用して測定した。意想外にもこれからラッカーゼＬａｃ５．５ の至適温度が７０℃であることが判明した。測定されるラッカーゼ活性が最大値 の半分である温度は５０℃および８０℃であった。Ｄ：温度安定性 ラッカーゼＬａｃ５．５をＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．５）中で４ ５、５５および６５℃でプレインキュベートした。アリコートを０、３０、６０ および１２０分後に取り、ＭｃＩｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ４．５）中に希釈 し、ラッカーゼ活性を３７℃で測定した。ラッカーゼ活性は４５℃での前処理に よって悪影響を受けなかった。５５℃での１２０分間のプレインキュベーション 後の測定によって８０％の活性が依然として残留していることが示された。６５ ℃でのラッカーゼの半減期は６０分間であった（図８）。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｕｅｒ ｅｌｅｃｔｏｒｏｃｈｅｍ ｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ ＧｍｂＨ （Ｂ）町：ツィールシュタットシュトラーセ２０ （Ｃ）市：ミュンヘン （Ｅ）国：ドイツ （Ｆ）郵便コード：Ｄ−８１３７９ （Ｇ）電話：０８９ ７４８４４０ （Ｈ）テレファックス：０８９ ７４８４４３５０ （ｉｉ）発明の名称：ＤＮＡ配列、これらのＤＮＡの発現、該ＤＮＡによって コードされる好熱性ラッカーゼならびにその使用 （ｉｉｉ）配列の数：１９ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース＃１．０、バージョン＃１ ．２５（ＥＰＯ） （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：１５７２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡからのｍＲＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ （Ｂ）株名：ＴＶ−１ （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：ｐｌａｃ５５ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The DNA sequence, the expression of these DNAs, and the thermophilic Case and its use   The present invention relates to a DNA sequence encoding a protein having laccase activity, Expression of the DNA sequence of And its use.   A class of enzymes of great interest for industrial use is the laccase enzyme (p- Hydroxyphenol oxidase, EC 1.10.3.2). Laccases belong to a family called "blue copper proteins" and generally have four Having copper ions, which are located at three copper centers, indicating type 1 to type 3 I have. Laccase is generally a secreted protein and sometimes has a molecular weight of 10%. It is characterized by having a glycosylation content of ~ 45%. Laccase is an acid It has a very broad substrate specificity for the aromatic compounds to be converted. In this oxidation The resulting oxygen is used to reduce oxygen. This produces water. white The function of laccase present in white rot fungi is Decomposition. This is the use of laccase in the paper industry for delignification of pulp. It is also a reason for interest in.   In addition to the degradation of macromolecular compounds, such as lignin, laccases are particularly useful for aromatic compounds. Can also catalyze the polymerization of the product. This example relates to laccase present in plants Biosynthesis of lignin in growing plants. Therefore, the industrial potential of laccase Applications include, for example, all types of polymerization reactions in wastewater treatment. Organic chemical synthesis The use of laccase in, for example, the coupling reaction of aromatic compounds or It is also known for side chain oxidation. However, regarding these many possible applications Most known laccases are mesophilic, i.e., low temperature optimal and limited. Thermal stability.   Preconditions for the industrial use of laccase enzymes are that they can be produced at low cost What you can do. In general, this means the use of recombinantly produced enzymes. It is only possible depending on the application. Various prokaryotic and eukaryotic expression systems are protein-based It can be used for building. Examples of prokaryotic expression systems are described in Escherichia. col i and Bacillus subtilis. Widely used eukaryotic Expression systems include cell culture systems for both mammalian and insect cells and eukaryotic microorganisms, such as For example, yeast or filamentous fungi.   WO 96/00290 is a subclass of the incomplete fungi, the filamentous fungus Polyporu. Five laccase genes from S. spintus have been described. these One of the laccase genes (LCC1) is produced as a recombinant protein. The thermophilic properties of this enzyme have not been further investigated, but are described for the purpose of hair dyeing. The use of LCC1 laccase for the purpose is that this enzyme has mesophilic properties. Implying that   Filamentous fungus Scytalidium thermophoph of the subclass of incomplete fungi Production of recombinant laccase with thermophilic properties from ilum is described in WO 95/338. No. 37. It is not known whether this enzyme is suitable for pulp bleaching. Not.   So far, thermophilic laccases from filamentous fungi of the subclass of defective fungi have been identified. No method is described for producing it as a recombinant protein.   CA: AN96-203142 discloses various properties of thermophilic laccase I have. No DNA or protein sequence for this type of protein is disclosed.   The present invention encodes a protein having laccase activity and comprises SEQ ID N O: DNA sequence or SE from position 76 of position 1 to position including position 1572 DNA sequence from position 76 to position including position 1572 of Q ID NO: 2 Alternatively, the DNA has a DNA sequence having a sequence homology of 80% or more. DNA sequence.   From position 1 to position 75 of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 Is for protein secretion Represents a DNA sequence encoding the signal sequence of This signal sequence is a protein It can be exchanged for any other signal sequence for secretion.   The novel DNA sequence can be found, for example, in the incomplete strain Trametes versicolo. r TV-1 (DSMZ (Mikroorganismen und Zellkulturen) GmbH (D -38124 Braunschweig) (deposited under number DSM11523) Can be obtained by cloning. Trametes v for this purpose Gene bank is prepared from ericolorTV-1 by a method known per se I do.   To isolate new DNA sequences in the gene bank, a laccase-specific D A DNA probe having an NA sequence is used. This type of DNA probe is, for example, From genomic DNA from Trametes versicolor TV-1 Can be obtained by a PCR reaction using the DNA primers.   The primers used are preferably degenerate (dege) having a length of 14 to 27 bp. netrate) DNA sequences, which are compared to known laccase genes Obtained by   Advantageously, DNA sections suitable as primers are oligonucleotides of established DNA sections. Obtained by nucleotide synthesis.   Novel laccase genes are described, for example, in Examples 1-5 Can be isolated as follows.   The laccase gene isolated by the example method can be obtained by techniques known to those skilled in the art, for example, It can be modified at any desired position in the sequence by site-directed mutagenesis. it can. Therefore, the present invention encodes a protein having laccase activity,   The DNA sequence from position 76 to position including position 1572 of ID NO: 1 is also Or from position 76 of SEQ ID NO: 2 to the position including position 1572 DNA sequence or DNA having greater than 80% sequence homology to said DNA sequence DNA sequence containing the sequence.   In order to express novel DNA, the latter is expressed in an expression vector in a manner known per se. The laccase gene and the expression vector containing the laccase gene in a microorganism. And expressed in the microorganism.   The expression vector is integrated into the genomic DNA of the host organism and is DNA constructs that are replicated in Not selectively integrated into host genome Self-replicating DNA constructs, such as plasmids, artificial chromosomes or comparable staining It may be an extracorporeal genetic factor.   A suitable expression vector should advantageously have the following genetic elements:   A promoter that promotes laccase gene expression in the host organism. Advantageously Promoter has high expression efficiency It should be a strong promoter to guarantee the rate. Advantageously promoted Is functionally linked to the 5 'end of the laccase gene.   Suitable and advantageous promoters are tac promoter, subtilisin promoter -, GAL promoter, TAKA amylase promoter, polyhedrin pro Motor, glucoamylase promoter, gapDH promoter and It is selected from the group of call oxidase promoters.     E. FIG. For expression in E. coli, the tac promoter is added to Bacillus. Subtilisin promoter is used for expression in yeast, Saccharomyces yeast cerevisiae is expressed by the GAL promoter, Aspergi For expression in lplus niger, a TAKA amylase promoter is used. Polyhedrin pro for expression in insect cells infected with culovirus Glucoa mirror with motor or from Aspergillus niger Zepromoter or alcohol from the yeast Pichia pastoris Oxidase promoters are suitable and advantageous.   Glucoamylase promoter from Aspergillus niger Or an alcohol oxidase promoter from the yeast Pichia pastoris Especially for the expression of novel thermophilic laccases Appropriate.   Advantageously, the expression vector contains a signal for transcription termination appropriate to the host organism. In eukaryotes, it should also have a signal for polyadenylation. They should be operably linked to the 3 'end of the laccase gene.   Advantageously, the expressed protein should be secreted into the medium by the host organism. You. Secretion by the host organism is mediated by an N-terminal signal sequence. signal The sequence is the natural signal sequence present in the laccase gene or These encoding DNAs are contained in the expression vector Functionally linked to the 5 'end of the gene.   The following secretory protein signal sequences are advantageous: Klebsiella α-cyclodextrin glucosyltransferase from oxytoca, Subtilisin from Bacillus subtilis, Saccharom alpha factor from Yces cerevisiae, Pichia pastori acid phosphatase from Aspergillus niger, α-A from Aspergillus niger Mirase, Aspergillus niger or Aspergillus naturally occurring in the glucoamylase or laccase gene from Sawamori Existing signal sequence.   Particularly suitable are naturally occurring in the laccase gene Signal sequence and the following heterologous signal sequence: Aspergill gluco from Aspergillus awamori or Aspergillus awamori Amylase signal sequence, Saccharomyces cerevisia signal sequence of α-factor from E or acid from Pichia pastoris Phosphatase signal sequence.   Laccase is secreted by secreted proteins or secreted proteins The gene for the fragment was operably linked to the laccase gene in an expression vector This can be achieved by expressing the fusion protein. Particularly advantageous in this regard Is the N-terminal of glucoamylase from Aspergillus niger Expression of a fusion protein consisting of an end fragment and a thermophilic laccase.   More advantageously, the point of attachment of the glucoamylase to the laccase is determined by the Noic acid sequences recognize for processing peptidases in the secretory apparatus of host cells Site, where the expressed fusion protein is degraded in vivo. Laccase is released.   Also advantageously, the expression vector has a gene for a selectable marker. To the gene Thus, the encoded selectable marker confers antibiotic resistance on the host organism, or May complement defects in the host organism.   Advantageous selectable markers include antibiotics such as ampicillin, kanamycin, chlora Mufenicol, tetracycline, hygromycin, zeocin Or a gene that confers resistance to bialaphos. Growth defects Selectable markers that are advantageous for complementing are genes, such as amdS, pyrG, t rpC, His4, niaD, argB, or hygB.   Particularly suitable as selectable markers are the amdS and pyrG genes and It is a resistance gene for the His4 gene and the antibiotic zeocin.   Furthermore, the selection marker gene is present together with the laccase gene in one DNA molecule. Or these two genes are present separately in different DNA molecules Is also good. In the latter case, both DNA molecules are co-transformed together.   Thus, the present invention also relates to an expression vector having a novel DNA sequence.   Suitable and advantageous microorganisms for expressing the novel expression vectors are those derived from bacteria. Microorganisms such as E. E. coli or Bacillus subtilis, true Microorganisms derived from eukaryotes, such as the genus Saccharomyces or Pichi a, or genus Aspergillus, Trichoderma, Ne urospora or Schyzophilum Fungal or eukaryotic cell cultures, such as insect cells infected with baculovirus Vesicles.   Particularly suitable are filamentous fungi of the genus Aspergillus, such as Aspergi lplus niger or Aspergillus awamori or Yeasts such as Saccharomyces cerevisiae or Pi chia pastoris.   The protein encoded by the novel DNA has the following biochemical properties Is:   The protein has laccase enzymatic activity. The optimal pH for the enzyme activity is Maximum enzyme activity in the acidic range and maximum at pH 2.0 and maximum at pH 4.0 Having half of the The stability of the enzyme at 45 ° C and pH 4.5-6.0 is up to 2 hours. Time is 100%.   The stability of the enzyme at 45 ° C. and pH 3.0 is 50% for up to 1 hour. You. The optimum temperature at pH 4.5 is 70 ° C. Enzyme activity at 65-75 ° C is still As 80% of the maximum activity. Enzyme activity at 50-80 ° C is still maximal 50%. Enzyme stability at pH 4.5 and temperatures below 55 ° C is up to 2 hours. Time is 90%. 1 hour enzyme stability at pH 4.5 and 65 ° C Until 50%.   The new protein contains the protein sequence SEQ ID NO: 3.   Advantageously, the novel protein is transformed by the expression of a novel DNA sequence in said microorganism. Manufacturing.   Advantageously, the DNA is expressed in a microorganism using one of the expression vectors described above. .   Thus, the present invention relates to a microorganism having a novel DNA sequence or a novel expression vector. Also concerns.   Uses a combination of microorganism and expression system that allows secretion of proteins from the microorganism It is particularly advantageous to do so. Examples of such advantageous combinations are:   Aspergillus niger or Aspergillus awa Glucoamylase promoter for expressing novel DNA sequences in mori Use. Secretion signals advantageously used in this expression system are thermophilic lacquers The signal sequence of the enzyme itself or the glucoamylase-laccase fusion protein This is the signal sequence of the lecoamylase moiety.   An approach for expressing novel DNA sequences in Pichia pastoris Use of the alcohol oxidase promoter. Secretion used in this expression system The signal is advantageously the signal sequence of the thermophilic laccase itself or Sacchar Omyces cerevisiae α-factor signal sequence or Pic acid phosphatase from H. pastoris Signal sequence.   The novel proteins are suitable for all known applications for laccase. this Et al. For delignification of pulp and depolymerization of high molecular weight aggregates It is particularly suitable for Laccase is used to deink waste paper and treat wastewater, especially in this regard. On the polymerization of aromatic compounds in lignin-containing wastewater from pulp bleaching And further in widespread applications in the detoxification of contaminated soil. Other areas of use include oxidation of the dye and activation of the dye by reaction with the precursor component, It relates to forming pigments. The range of use in organic synthesis is the coupling of aromatic compounds. Reaction or oxidation of aromatic substituents; Carboxylic acid form by further oxidation of the oxidation of zircohol to the corresponding aldehyde This includes avoiding implementation. In said use, laccase is In a series of reactions, by itself or by a reaction-promoter oting mediator). Such mediator Examples are ABTS or N-hydroxybenzotriazole.   Thus, the present invention relates to delignification of pulp, depolymerization of high molecular weight aggregates, Deinking, removal of aromatic compounds in wastewater, especially lignin-containing wastewater from pulp bleaching Dyes for polymerization, oxidation of dyes, or pigment formation Use of novel proteins for activation, coupling reactions of aromatic compounds or Relates to the use in organic synthesis for the oxidation of aromatic side chains.   The use described above allows the novel laccase to interact with itself or with a reaction-promoting mediator. It can be implemented by using in combination.   FIG. 1 shows the structure of the DNA vector pANlac1S.   FIG. 2 shows the structure of the DNA vector pANlac2S.   FIG. 3 shows the structure of the DNA vector pL512.   FIG. 4 shows the structure of the DNA vector pL532.   FIG. 5 shows the dependence of the activity of the novel laccase on pH.   FIG. 6 shows the pH stability of the new laccase.   FIG. 7 shows the temperature dependence of the activity of the novel laccase.   FIG. 8 shows the temperature stability of the new laccase.   The following examples illustrate the invention in more detail. DNA or RNA processing Standard methods used in the examples for the control, such as restriction endonucleases , DNA polymerase, reverse transcriptase, etc., and standard methods, such as Bacterial transformation, Southern and Northern analysis, DNA sequencing, radiolabeling And PCR techniques are recommended by the kit manufacturer used unless otherwise noted Or standard if manufacturer's instructions are not available This is performed according to a conventional technique known from a textbook.   Example 1Creation of cDNA bank from Trametes versicolor TV-1 Success   Trametes versicolor TV-1 strain was used. First malt Agar plate (3% malt extract, 0.3% peptone (soybean meal), 1.5% cold Cultures at 28 ° C. for 7 days on heavens, pH 5.0) Mycelium was obtained from rsiccolor. Take three pieces from a malt agar plate Use 100ml sterile malt extract in 500ml Erlenmeyer flask using Planted in medium (3% malt extract, 0.3% peptone (soybean meal), pH 5.0) Was. The culture was incubated at 28 ° C. with shaking at 100 rpm for 7 days. The suspension of the mycelium thus produced was filtered by suction with a porcelain funnel to give 0.9% Wash with saline, freeze mycelium in liquid nitrogen and use mortar and pestle Crushed. RNA was isolated using the RNeasy kit (Qiagen). Fungus The yield from 200 mg of thread was 100 μg of RNA.   MRNA was isolated using 600 μg of RNA. This is an oligo-dT Sepha Chromatography on Loose (mRNA isolation kit, Pharmacia) It was carried out. The yield of mRNA was 26 μg. 7.25μ of isolated mRNA g was used to synthesize cDNA. For this purpose, cDNA synthesis from Stratagene A kit was used. After separation, the cDNA was reduced to 0 by agarose gel electrophoresis. . The fractions ranged in size from 8 to 2.1 kb and 2.1 to 5 kb. C for both fractions DNA was isolated from agarose (Qiagen gel extraction kit) and the isolated c A cDNA bank was created using the DNA. Lambda phage cDNA bank (Stratagene, ZAP expression cloning system). 0. 4 × 10 from the fraction of 8 to 2.1 kb^FivePhage / vector DNA (μg) obtained Was done. 1 × 10 from the fraction of 2.1 to 5 kb^FivePhage / vector DNA (μ g) was obtained. The resulting phage was transformed into E. coli. coli XL Blue MRF ' Amplification was achieved by infecting the strain (Stratagene).   Example 2Creation of a chromosome gene bank from Trametes versicolor   Trametes versicolor TV-1 Was prepared as described in Example 1. The mycelium was suction filtered through a porcelain funnel, Wash with 0.9% saline, then freeze in liquid nitrogen, mortar and pestle And divided into 1 g portions. Each 1 g portion of the crushed mycelium is placed in a sterile sample container. And immediately extract solution (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 MEDT) A, 0.25 M NaCl, 0.6 mg / ml protease K) 5 ml and Mixed with 0.5 ml of a 10% (w / v) solution of sodium lauroyl sarcosine . After incubation at 50 ° C. for at least 2 hours, the mixture is washed with 5M NaC 10% (w / v) CTAB solution in 0.85 ml and 0.7 M NaCl Mix with 0.7 ml and incubate at 65 ° C. for 30 minutes. Chloroform / a After addition of 7 ml of the soamyl alcohol mixture (24: 1), the mixture was shaken and centrifuged. The two phases were separated by centrifugation. Separate the aqueous phase, isopropanol 0.6 volume Chromosomal DNA was precipitated by the addition of a part. Subsequently, the precipitated DNA is applied to a column ( Purified on a Qiagen Genomic Tip). 16g in this way 0.5 mg of chromosomal DNA could be isolated from the mycelium.   To create a chromosomal gene bank, Trametes versicol or 90 μg of chromosomal DNA from TV-1 was completely digested with EcoRI and Separated by Rose gel electrophoresis. Chromosomal DNA breaks The pieces were isolated in the size range of 2-4 kb and 4-10 kb, in each case To lambda phage (Stratagene, ZAP cloning system) Learning. From the DNA fraction of 2 to 4 kb, 1 × 105 phage / vector D NA (μg) was obtained. From the DNA fraction of 4 to 10 kb, 5.4 × 10^Fourfur Di / vector DNA (μg) was obtained. The phage was transformed into E. coli. coli XL-1 Amplification was achieved by infecting the Blue MRF 'strain.   Example 3Laccase from genomic DNA from Trametes versicolor Preparation of specific DNA probe   A DNA probe for isolating the laccase gene was obtained from T. versicolo r was prepared by PCR amplification with degenerate primers from genomic DNA. Degeneracy Primers were constructed based on a comparison of known laccase gene sequences. EM Neurospora crassa, Co included in BL Gene Data Bank riolus hirsutus, Phlebia radiata, Agar Icus bisporus and subclasses of incomplete fungi The amino acid sequences of the laccase genes from non-filamentous fungi were compared. Compare arrays Has a length of 5-7 amino acids that is completely conserved in all laccases Four kinds It is possible to identify the peptide. These peptides are used as degenerate primers The DNA was retranslated into DNA in consideration of degenerate codons for preparation. The primer is With an array of:  Primers C and D have a BamHI cleavage site (underlined) at the 5 'end, and In each case, an appropriate degenerate laccase sequence binds.   T. Genomic DNA from Versicolor was shaken as described in Example 2. It was isolated from mycelium of Sco culture. PCR amplification was performed by methods known to those skilled in the art. In the first PCR reaction, Versicolor chromosomal DNA 200 ng, plus 1.25 U of Taq polymerase, 1.25 mM MgCl_Two, Each 4 0.2 mM of species dNTPs and primers A and B100 in each case Picomoles were included and used in a 100 μl PCR reaction. Required PCR products Other conditions for the specific amplification of are: 5 minutes at 94 ° C, followed by 0.5 minutes at 94 ° C. 7 cycles of 1 minute at 40 ° C. and 2.5 minutes at 60 ° C., and 94 ° C. 30 cycles of 0.5 minutes, 1 minute at 50 ° C and 2.5 minutes at 72 ° C. 1 μl from the first PCR reaction was further added to Taq polymerase 1.25 U, MgC l_Two 1.25 mM, 0.2 mM for each of the four dNTPs, primer C in each case And 100 picomoles of D and used for the second PCR reaction. Required PCR Further conditions for specific amplification of the product are: 94 ° C. for 5 minutes, followed by 94 ° C. 7 cycles of 0.5 minutes, 1 minute at 40 ° C. and 2.5 minutes at 60 ° C., and 30 cycles of 94 ° C for 0.5 minutes, 50 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2.5 minutes It is. An approximately 1.1 kb PCR product was obtained. Transfer the PCR product to agarose Purified by electrophoresis, digested with the restriction enzyme BamHI, digested with BamHI. Cloned into the pUC18 vector coli. Trait The converted E. Plasmids were isolated from E. coli cultures. 5 'end and 3' end The DNA sequence cloned by DNA sequence analysis of the end It was shown to be a fragment.   To prepare a DNA probe for screening the laccase gene Next, the laccase-specific PCR fragment was digested by treatment with BamHI, Α- [³²P] -dATP (random priming Radiolabeled with a kit (random priming kit, Boehringer Mannheim). Chromatography of free radioactivity on Sephadex G25 (Pharmacia) Removed by The specific activity of the radiolabeled DNA probe is 1 × 10⁷c pm / DNA (μg).   Example 4Laccase cDN from Trametes versicolor TV-1 Isolation of A gene   C from Trametes versicolor TV-1 described in Example 1 DNA gene bank was used. Screeni for laccase cDNA gene Was performed according to conventional techniques. In the first screening stage, E. FIG. E. coli XL-1 Blue MRF 'cells were cultured on 10 Petri dishes. And then a cDNA bank per petri dish (0.8-2.1 kb fraction, 50,000 phages (see Example 1) were infected. Incubation overnight at 37 ° C After the filtration, newly formed phages are filtered with a nylon filter (Stratagene). Moved to The filter is then used to form a radiolabeled laccase-specific probe ( (See Example 3) and hybridized according to the manufacturer's instructions. Hybrid Hybridization containing 50% formamide 45 ° C. in buffer. Take a positive clone and repeat the screening process Purified. After the third stage of isolation, 20 strongly hybridizing Large clones were isolated by the above-described screening and excised in vivo (in vivo excision) according to the manufacturer's (Stratagene) protocol. CM It was recloned (reclone) into a V vector (Stratagene). Restriction end Analysis of the clones by nuclease digestion and DNA sequencing Bells indicated that two substantially identical laccase genes were isolated. 2 types Complete DNA sequencing of the clones indicates that they are identical in amino acid sequence. Laccase gene. Two kinds of laccase cDN The A gene is called Lac5.5 and Lac5.6. Similarly, the laccase cDN Plasmids containing the A gene are called pLac5.5 and pLac5.6.   Example 5Laccase chromosome from Trametes versicolor TV-1 Gene isolation   Described in Example 2 from Trametes versicolor TV-1 Chromosome lacquer in chromosome gene bank (2-10 kb fraction, see Example 2) Screening for the zeogene was performed using the screen for cDNA clones described in Example 4. Performed similarly to leaning. Radiolabeled laccase specific as described in Example 3 The probe was used again. Hybridization temperature is 50% formamide 45 ° C. in the containing hybridization buffer. For screening Three strongly hybridized phage clones were isolated in The manufacturer (strike PBKCMV vector (Stratagene) according to the protocol of (Latagene) Recloned. Analysis with restriction endonuclease revealed that all three clones It was the same and led to the conclusion that it had a length of about 7 kb. DNA base sequence Analysis by determination showed that all three clones had the chromosomal gene of Latcase Lac5.6. Is shown. The coding region of the clone and the 5 'and And the nucleotide sequence of the terminal sequence of about 1 kb in the 3 'region was determined (SEQ ID NO: : 8).   Example 6DNA constructs for expression of Aspergillus laccase Lac5.5 Preparation of   CDN of Laccase Lac 5.5 from Trametes versicolor A is a filamentous fungus-specific expression signal from the Aspergillus family Functionally coupled to The following gene expression elements from Aspergillus Used the following: a) Glucoamylase gene (gl) from Aspergillus niger aA) (J.C.Verdoes, P.J.Punt, J.M.Schrickx, H.M.van)  Verseveld, A.H.Stouthamer and C.A.M.J.J.van den Hondel Transgenic Rese arch 2 (1993), 84-92). b) the DNA fragment encoding the signal sequence and the mature glucoamylase fragment GlaA pro to have downstream motor. A DNA sequence encoding the cleavage site of KEX2 protease was ligated to this. (M.P.Broekhuijsen, I.E.Mattern, R.Contreras, J.R.Kinghorn, C.A.M. J.J.van den Hondel (1993), J.Biotechnol.31, 135-145). c) Transcription of trpC gene from Aspergillus nidulans Terminators (E.J.Mullaney, J.E.Hamer, M.M.Yelton and W.E.Timberlake (19 85), Mol.Gen.Genet.199, 37-45).   However, Lac5.5 cDNA and Aspergillus expression signals First, the 5 'and 3' regions of the Lac5.5 cDNA gene The area needs to be modified.A: Binding of laccase Lac5.5 cDNA with glaA promoter   For further processing, the Lac5.5 cDNA gene was transferred to the vector pUC. 19 and was recloned. For this purpose, the Lac5.5 cDNA gene was 1.9 kb EcoRI-Xba from pBK CMV vector obtained in Example 1 PUC19 vector isolated as an I fragment and previously cut with EcoRI and XbaI. And subcloned into the vector. The resulting 4.6 kb plasmid was cloned into pLac5 Call.   Primers for modification of the start codon ATG of the Lac5.5 cDNA gene E and F were used.  The underlined part in the primer E indicates the BspHI cleavage site, and the underlined part in the primer F The part indicates the cleavage site of SmaI or XmaI.   Primers G and H for modification of the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene It was used.   The underlined part in the primer G indicates the BbsI cleavage site, and the underlined part in the primer H Indicates an AflII cleavage site.   Lac5.5 cDNA by PCR reaction using primers E and F A 188 bp fragment was amplified in the 5 'region of the gene. Primer G And H using the 110b in the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene A fragment of size p was amplified. 100 μl of the PCR mixture was in each case Lac5. 5 ng cDNA (in pBK CMV vector) 10 ng, Tth polymerase 0.5 U, MgCl_Two1.25 mM, 0.2 mM each of four dNTPs and primer E And F pairs or primers G and H pairs at 140 pmol contains. The PCR reaction is as follows Performed under conditions: 5 minutes at 94 ° C., then 1 minute at 94 ° C., 2 minutes at 50 ° C. And 30 cycles of 1 minute at 72 ° C, and finally 7 minutes at 72 ° C.   First, the DNA fragment from the PCR reaction with primers E and F was And XmaI, and then purified by gel electrophoresis. It was cloned into the vector pLac5 cut with maI. This allows the translation The vector pLac51 in which the BspHI cleavage site has been incorporated into the start codon ATG is Obtained.   First, the DNA fragment from the PCR reaction with primers G and H was And XbaI, followed by purification by gel electrophoresis, and prior to EcoRI and And cloned into the pUC19 vector cut with XbaI. About 100bp Inserts of size BbsI and Xb from the resulting plasmid pLT5. Cut with aI. Finally, the BbsI-XbaI fragment was previously prepared with BbsI and Xb It was cloned into the vector pLac51 cut with aI. This allows lacquer Vector having a novel AflII cleavage site at the 3 'end of the Lac513 was obtained.   Trametes versicol with modified 5 'and 3' regions r cDNA gene for laccase Lac5.5 3 by partial digestion with BspHI. this The coding region of the Lac5.5 cDNA gene and the pUC19 vector A 2.6 kb fragment with about 1.1 kb of ter was obtained. This fragment is the second stage Digested with AflII and cut the resulting Lac5.5 cDNA of 1.5 kb in size. Pieces were isolated. This fragment was taken from the 4.0 k from Aspergillus niger. b size fragment, trpC from Aspergillus nidulans A 0.7 kb fragment of the transcription terminator and 2 pUC18 vectors . A 7.4 kb fragment from vector pAN52-12 with a 7 kb fragment. Ligation to the large AflII-NcoI fragment. 8.8 kb obtained Is called pANlac1. glaA in pANlac1 The promoter region is ligated through the NcoI-BspHI intersection. Functionally binds to the translation initiation codon ATG of the case cDNA gene.B: lacquer by replacing the N-terminal signal sequence with a glucoamylase fragment Between Lac5.5 cDNA and glaA promoter   The region of the cDNA gene encoding the N-terminus of the mature laccase Lac5.5 was modified. To vary, primers I and F were used.  The underlined portion in Primer I indicates the EcoRV cleavage site.   To modify the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene, primer G and And H (see A in this example).   Lac5.5 cDNA by PCR reaction using primers I and F A 110 bp fragment was amplified in the 5 'region of the gene. Primer G And H using the 110b in the 3 'region of the Lac5.5 cDNA gene A fragment of size p was amplified. PCR reactions were performed as described in A of this example. .   The DNA fragments from the PCR reaction with primers I and F were Cleavage with maI, then purification by gel electrophoresis, prior to EcoRI and It was cloned into the vector pLac5 cut with XmaI. This allows mature la EcoR at the 5 'end before the codon for the first amino acid of the casease protein V cleavage site followed by the sequence Ile Ser Lys Arg (SEQ ID N O: The vector pLac52 into which the codon for the amino acid of 14) was inserted was obtained. Was. This sequence is a recognition site for KEX2 protease is there. The 3 'region of the laccase cDNA gene in the vector pLac52 -Modified as described for pLac51. P with primers G and H Approximately 100 bp inserts from the CR reaction were replaced with BbsI and XbaI. Cleavage and isolation from plasmid pLT5. Finally BbsI-Xba The I fragment was cloned into the vector pLac52 cut with BbsI and XbaI. I did. This allows a new AflII at the 3 'end of the laccase cDNA gene. The vector pLac523 having a cleavage site was obtained.   For Trametes versicolor laccase Lac 5.5 The cDNA gene having the modified 5 'and 3' regions is EcoRV and Af 1II, which was obtained by cutting plasmid pLac523. . A 5 kb Lac5.5 cDNA fragment was obtained after agarose gel electrophoresis. Isolated. This fragment was ligated with the 9.3 kb Afl vector of vector pAN56-9. Ligation to the II-EcoRV fragment. Vector pAN56-9 is 4.0 glaA promoter from Aspergillus niger of kb size -Followed by Aspergillus niger glaA glucoamylase 2.0 kb fragment encoding the above fragment, 4 amino acids at the KEX2 cleavage site Short DNA fragment encoding Piece, 0.7 kb t from Aspergillus nidulans a fragment of the rpC transcription terminator and a 2.7 kb pUC18 vector With a fragment of the EcoRV and AFII cleavage sites are replaced with KEX2 cleavage sites 3 '. E. FIG. 10.8 kb by transformation into E. coli This vector is called pANlac2. In pANlac2, The coding region of the cDNA for the mature laccase Lac5.5 was First, a glucoamylase fragment containing a signal sequence, KEX2 protease Fusion fragment consisting of a fragment of the recognition sequence and a fragment of the complete laccase Lac5.5 It binds to the coding region of the glucoamylase gene so that protein is produced. Was. Upon secretion, this fusion protein is cleaved by KEX2 protease, Mature laccase was secreted into the culture supernatant.C: amdS and pyrG into the vectors pANlac1 and ANlac2 Incorporating Selection Markers   pANlac1 and pANlac2 were combined with 5 μg NotI of each vector. Linearized by overnight digestion with. Then calf intestinal alkaline phos Treat with Phatase, extract with phenol / chloroform, precipitate with ethanol Was. Genes amdS (acetamidase) and pyrG for selectable markers (Orotidine-5'-monophosphate decarboxylase) Was introduced into plasmid pAN52-11 from which 6.4 after digestion with NotI. The gene could be isolated as a fragment of kb in size. Each straight chain And phosphatase treated vectors pANlac1 and pANlac2 Was ligated to 0.6 μg of the isolated NotI fragment, which was Using E. E. coli JM109 was transformed. Plasmid DNA Prepared from ampicillin resistant colonies from the transformation of Analyzed by agarose gel electrophoresis. Transformation with the vector pANlac1 Six of the eight analyzed clones from the exchange as well as the form in the vector pANlac2 Five of the seven analyzed clones from the transversion were a 6.4 kb NotI gene fragment. Had. The vector having the selectable marker gene was replaced with pANlac1S (size 15.3 kb, FIG. 1) and pANlac2S (17.2 kb, FIG. 2). Call. Three of the six pANlac1S clones obtained were the desired ones shown in FIG. Of the resulting 5 pANlac2S clones with the NotI fragment in Individuals had the NotI fragment in the desired orientation shown in FIG. Example 7Transformation of Aspergillus   Aspergillus niger strain AB1.13 (pyrG^-) (W.van  Hartingsveldt, I.E.Matter n, C.M.J.van Zeijl, P.H.Pouwels and C.A.M.J.J.J.van den Hondel (1987) Mol.G en.Genet.206, 71-75) and Aspergillus awamori (AT CC 11358 strain) was used for transformation. Aspergillus Transformations were performed according to conventional techniques (P.J.Punt and C.A.J.J.van den Hond el (1992), Meth. Enzymology216, 447-457).   Mycelium of Aspergillus protoplasts in Novozym 234 Obtained by the above treatment. Freshly produce mycelium from one flask and filter out OM medium (sterile-filtred) in a sterile Erlenmeyer flask . Novoz, a lytic enzyme mixture in 27M calcium chloride, 0.6M NaCl) ym234 (Novo Nordisk) in 15 ml. Re-enzyme solution The suspended mycelium was incubated at 30 ° C. at low speed (80 rpm) for 1-3 hours. . Microscopic observation of protoplast formation during incubation . Free-moving protoplasts are usually seen after 1 hour. Mass free movement After mobile protoplasts have been obtained, they are passed through a glass filter to Miracl. bacteria remaining by filtration through oth (Calbiochem) Separate from the filaments and carefully use STC medium (1.2 M sorbitol, 50 mM calcium chloride). Washed with 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5). Step Rotoplasts are centrifuged (2000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) and washed twice with STC medium. Protoplast concentration Was measured by microscope on a counter. Protoplast suspension 1 × 10 for experiments on regeneration or transformation⁸Protopura It was adjusted to a concentration of strike / ml.   Aspergillus niger and Aspergillus awa protoplasts from plasmids pANlac1S and pANla1 Transformed with c2S. Both plasmids contain the pyrG gene (orotidine-5 '). -Phosphate decarboxylase) and the amdS gene (acetoa (Encoding midase) as a selectable marker. Protoplast 0.1 aliquots of plasmid DNA in a 12 ml incubation vessel Mix with 10 μg and incubate on ice for 25 minutes. Then 60% PEG 4000 solution (60% PEG 4000, 50 mM calcium chloride, 10 mM Hydrochloric acid, pH 7.5) while repeatedly mixing 1.25 ml to the transformation mixture. It was added very well. After further incubation at 20 ° C. for 20 minutes, the reaction vessel is removed. Filled with STC medium, mixed and centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes. Resuspend the precipitate Were plated on selective media osmotically stabilized with sorbitol. play The colonies were incubated at 30 ° C. for 7 days, and the growth of the colonies was observed. Some fruit The transformation rate in the experiment was 1 to 5 for Aspergillus niger. Transformants / plasmid DNA (μg), Aspergillus awam For ori, 0.1 to 0.5 transformant / plasmid DNA (μg) was used. Was.   Purification by transferring transformants to selection plates with acetamide (Purify). A transformant having a high copy number was selected using acrylamide. Identified by plating on selective plates. Acrylamide is Acetamidase encoded by the amdS gene as opposed to acetamide A transformant that is a poor substrate for the enzyme and has a high copy number of the amdS gene Only can grow. Transformants that enable functional expression of laccase enzymes First, we have inducers for maltodextrin and glaA promoter expression. After growing for 2 days at 28 ° C. 0.1% ABT in ABTS agar (McIllvaine buffer, pH 4.5) S, 1% agarose). Transformants expressing laccase are green halo Indicated by the formation of Transfer the spore suspension to a good plate on an acrylamide plate. Transformant showing both growth and positive response in ABTS activity test Manufactured from.   Example 8Trametes versicolor lacquer in Aserillus Expression of Lac 5.5   Expression of Laccase Lac5.5 in Aspergillus The survey was conducted on a co-scale. The following culture medium was used: maltodextrin in tap water A 5% (w / v) solution of was autoclaved for 20 minutes. Then 1M sulfuric acid mug 1 ml of cesium, 0.5 ml of 1000 × trace element solution, 50 × AspA solution 10 ml and 5 ml of 10% (w / v) casamino acid were added to the base medium 500 m 1. The 1000 × trace element solution has the following composition: znSO_Four × 7H_TwoO2.2g, H_ThreeBO_Three1.1 g, MnCl_Two× 4H_TwoO0.5g, FeS O_Four× 7H_TwoO0.5g, CoCl_Two× 5H_TwoO 0.17g, CuSO_Four× 5H_TwoO0 . 16g, Na_TwoMoO_Four× 2H_Two0.15 g of O and 5 g of EDTA_TwoO80m dissolved in l. The 50 × AspA solution has the following composition: NaNO_ThreeFifteen 0 g, KCl 13 g, KH_TwoPO_Four38 g to H_TwoDissolved in 500 ml of O, pH Was adjusted to 5.5 with 10 M KOH. This medium contains CuSO_Four× 5H_TwoO Added at a final concentration of 0.5 mM.   For expression experiments, 300 ml Erlenmeyer 1 × 10 to 50 ml of culture medium in flask⁶Spores / ml were planted. Shake the culture The test was performed at 30 ° C. and 300 rpm in a fermentor. Collect samples daily for one week Then, the laccase activity in the culture supernatant was measured. Maximum laccase activity is 60-1 00 growth was observed between 0.5 and 2.5 U / ml. Was. Laccase activity was determined using the substrate ABTS (0.1 mM in the assay). Colorimetric method in McIllveine buffer (pH 4.5) and at 37 ° C. measurement). McIllveine buffer is 0.2 M Na_TwoHP O_FourPrepared by titration of 0.1 M citric acid solution to pH 4.5 against solution . The increase in absorbance at 420 nm was measured (absorption coefficient at 420 nm for ABTS). Number: 3.6 × 10^Four1 x mole¹× cm^-1). 1U of laccase activity per minute It was defined as 1 micromole of ABTS substrate to be converted.   Example 9Trametes versicolo in Pichia astoris Expression of Laccase Lac5.5   An expression system commercially available from Invitrogen is connected to the relevant expression vector (pP IC3 and pPIC9) and Pichia pastoris strain (GS11 5 and KM71). Pichia Pastoris strains GS115 and KM71 are histidine auxotrophs. The expression vector was alcohol oxidase from Pichia pastoris. It has the promoter and terminator of the gene AOX1. Tramete s versicolor laccase Lac5.5 cDNA gene as described above It was cloned between two gene regulators. The vector pPIC9 is AOX1 From Saccharomyces cerevisiae downstream of the promoter DNA sequence encoding the signal sequence of the α-factor protein of Knowledge sequence Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala (SEQ I It has a short DNA section encoding DNO: 15). The vector is E. coli. col It has an ampicillin resistance gene for selection in i. The vector is Pic Pichia pastoris for selection in H. pastoris Have the HIS4 gene.A: Laccase Lac 5.5 having the signal sequence of Laccase Lac 5.5 Construction of the current vector   Plasmid pLac5.5 and primers K and L were replaced with the laccase gene. Used for amplification. Primers F and G have the following sequences:   Primer K has an EcoRI cleavage site (underlined) followed by laccase L has the DNA sequence for the first 7 amino acids of the ac5.5 signal sequence . Primer L has a Not cleavage site (underlined) followed by a complementary and reverse orientation For the translation stop codon and the last seven amino acids of the laccase Lac 5.5 Has a DNA sequence of   PCR amplification was performed by methods known to those skilled in the art. 20 ng of pLac5.5 DNA With 0.5 U of Vent polymerase, 1 mM MgCl_Two, 4 types of dNT each P 0.2 mM and in each case the primers K and L100 picomo And used in a 50 μl PCR reaction. Characteristics of required PCR products Other conditions for differential amplification are: 5 minutes at 94 ° C, followed by 1 minute at 94 ° C. 25 cycles of 1 minute at 5 ° C and 2 minutes at 72 ° C. 1.5k expected A PCR fragment of size b was obtained. The PCR fragment is purified by agarose gel electrophoresis. And cut with restriction enzymes EcoRI and NotI, precipitated with ethanol,_Two Taken in O. The vector pPIC3 was cut with EcoRI and NotI, and Purify, isolate, and treat with alkaline phosphatase by garose gel electrophoresis. Reason did. Then, extract with phenol / chloroform (ratio 3: 1) and precipitate with ethanol. Did. The laccase Lac5.5 DNA fragment produced by PCR amplification was Ligation to pPIC3 vector produced as described above and . E. coli Top10F 'cells (Invitrogen) were transformed. Step Rasmid DNA was isolated and cloned from ampicillin resistant clones. A 5 kb insert was identified by restriction digestion with EcoRI and NotI. Was. Nine of the 12 clones examined were positive. Obtained in this way The vector is called pL512 (FIG. 3).B: α-factor signal from Saccharomces cerevisiae Of expression vector for laccase Lac5.5 having sequence   Lacquer using plasmid pLac5.5 and primers L and M The ze gene was amplified. Primer M has the following sequence:   Primer M is the sequence for the EcoRI cleavage site (underlined) followed by the process Putative N-terminal first 9 amino acids of laccase Lac5.5 DNA sequence for Laccase Lac 5.5 to be processed N-terminal is another lacquer Derived by comparison with the sequence.   The DNA fragment for the processed form of Laccase Lac 5.5 PLac5.5 cDNA and primers L and M as described in Produced by PCR amplification. The vector pPIC9 was replaced with EcoRI and NotI. And prepared as in pPIC3 described in A of this example and by PCR amplification Ligation was performed on the prepared DNA fragment of laccase Lac5.5, and this was used. And E. E. coli Top10F 'cells (Invitrogen) Was. Plasmid DNA was isolated from ampicillin resistant clones and cloned. Of the inserted 1.5 kb insert by restriction digestion with EcoRI and NotI. Specified. Three of the twelve clones examined were positive. Gain in this way The resulting vector is called pL532 (FIG. 4).C: Transformation of Pichia pastoris   First, GS115 strain and KM71 strain of Pichia pastoris were converted to YP. In 5 ml of D medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) Cultured at 30 ° C. overnight. Using the 0.2 ml portion of the preculture described above, two Each plant was inoculated in 250 ml of PD medium, and the optical density (OD600 nm) was 1.3 again. Cultured overnight at 30 ° C. until に な る 1.5. Yeast cells from 250 ml main culture Is centrifuged (1500 × g For 5 minutes) and H_TwoWash twice with 200 ml of O, 10m of 1M sorbitol 1 × and finally taken up in 0.5 ml of 1M sorbitol.   Plasmid DNA of the vector pL512 or pL532 is Linearize with either siI, precipitate using ethanol and add D Taken in water at a concentration of 1 μg NA. The transformation mixture was Pichia pasto Contains 80 μl of ris cells and 10 μg of linearized vector DNA. Transformations were performed at 1500 V, 25 μF and 200 ohms (BioRad Gene).   (Pulser). Discharge time is about 4.2 milliseconds. Adding 1 ml of 1 M sorbitol to the transformation mixture, This is incubated for 30 minutes on ice, then MD plate without histidine (1.34% YNB, yeast nitrogen base, 4 × 10^-Five% Biotin, 1% dextrose, 1.5% agar). Plated on coat. Transformants were incubated at 30 ° C for 3-5 days. Appeared after the game. To streak the transformant twice on the MD plate Therefore, it was purified. Laccase producers are transferred to the MM indicator plate (MM ind icator plate). MM indicator plate is 1.34% YN B, 4 × 10^-Five% Biotin, 0.5% methanol, 1.5% agar, 1m Contains MABTS and 0.1 mM copper sulfate. Inducer Methaneau The petri dish to the lid of the Petri dish to ensure that methanol is supplied to the colonies by diffusion. New every day to guarantee. Laccase producers can work at 30 ° C for 2-3 days. A green halo formed after the incubation. E:Expression in shake flask   BMGY medium (1% yeast extract, 2% peptone, 0.1 M potassium phosphate, p H6.0, 1.34% YNB, 4 × 10^-Five% Biotin, 1% glycerol) 50 ml of a Pichia pastoris transformant producing laccase Then, the cells were cultured at 28 ° C. for 48 hours on a shaker (300 rpm). From this preculture Cells were isolated by centrifugation (1500 × g for 10 minutes) and the main culture medium (MM Y, 1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% YNB, 4 × 10^-Five% Biotin (3% methanol) in 10 ml. Supply 0.5 mM copper sulfate to MMY medium. The main culture was fed at 300 rpm and room temperature on a shaker. Main culture Tanol (0.3 ml / 10 ml of medium) was supplied at 24 hour intervals. Recombination la Production of the case Lac 5.5 began after 24 hours. Production rate up to 4U / ml Reached 190 hours after the start of the main culture.   Example 10Isolation of recombinant laccase Lac5.5   Aspe transformed with the recombinant laccase Lac5.5 as described in Example 8 It was obtained by culturing the rgillus strain in shake flasks. Laccase Lac5 . The culture supernatant containing 5 was concentrated by cross-flow filtration. Removed for this Sartocon microfiltration module with an exclusion limit of 30 kD A microfiltration module (Sartorius) was used. Next The laccase Lac 5.5 concentrated in the above is freeze-dried, pH 6.0). Activity of concentrated recombinant laccase Lac5.5 Was 18.6 U / ml.   Laccase concentrated by cross-flow filtration was treated with 20 mM bistris-hydrochloric acid (p H6.5). Thereafter, a conductivity of 1.5 mS / cm was measured. The dialyzed laccase was then washed with 20 mM bistris-hydrochloric acid (pH 6.5) (low Color of DEAE Sepharose (Pharmacia) calibrated with Dingbuffer) The chromatography on the system was performed. Under these conditions the laccase is DEA Bind to E Sepharose. 0M to 0.5M in loading buffer By elution with a linear gradient of NaCl, the laccase activity was reduced to a salt concentration of 0.1. Recovered with 15M NaCl. Laccase fraction from DEAE Sepharose column And ammonium sulfate until 20% saturation and sodium acetate ( pH 4.5). (Final concentration 20 mM), pH was adjusted to 4.5 with acetic acid. Then do this The laccase fraction prepared in the above was loaded into a loading buffer (20 mM sodium acetate). (PH 4.5, 20% saturated ammonium sulfate) Chromatography on a column of Loose (Pharmacia) was performed. these Laccase binds to phenyl-Sepharose under the following conditions: 20 mM sodium acetate Linear gradient of 20-0% saturated ammonium sulphate in lithium (pH 4.5) Laccase activity was recovered at 16% saturation with ammonium sulfate. Was. The laccase fraction was dialyzed against 20 mM bistris-HCl (pH 6.5), Binding to DEAE Sepharose and subsequent run with 0.3 M NaCl Was concentrated by stepwise elution. Binding and elution with 0.3 M NaCl The displacement was also performed in 20 mM bistris-hydrochloric acid (pH 6.5). Laccase activity Gave 20% of the starting material. The isolated laccase is converted to the N-terminal amino acid Analyzed by sequencing. The sequence determined by this: Is a mature laccase Lac5. Obtained from cDNA sequence and homology comparisons. 5 N-terminal matches.   Example 11Biochemical properties of the recombinant laccase Lac5.5   Recombinant lacquer produced in Aspergillus as described in Example 8 The optimum pH and temperature and the stability of pH and temperature of ZeLac5.5 were investigated. For these experiments, the buffer of recombinant laccase Lac5.5 was McIllvaine buffer on a X G25 (Pharmacia, PD10 column) The solution (pH 4.5) was replaced.A: Optimum pH   Buffer appropriate for each pH value shown in FIG. And a suitable mixture of sodium phosphate solutions. Clear from FIG. Thus, laccase Lac5.5 is optimally active in the strongly acidic region with respect to the substrate ABTS Having.B: pH stability   Laccase Lac 5.5 was used at pH 3.0, 4.5 and 6.0 (temperature 37 ° C). Pre-incubated in McIllveine buffer. Aliquot 0, Take after 30, 60 and 120 minutes and use McIllveine buffer (pH 4.5). ) And the laccase activity was measured at 37 ° C. Laccase activity is pH 4. Pretreatment with 5 and 6.0 was not adversely affected. pH 3.0 The half-life of the case was between 60 and 120 minutes (FIG. 6).C: Optimum temperature   The laccase activity of the recombinant laccase Lac5.5 was measured at the temperatures shown in FIG. Specified. Laccase activity was determined by AB in McIllveine buffer (pH 4.5). Measured using the TS assay. Surprisingly, Laccase Lac 5.5 Was found to be 70 ° C. Maximum measured laccase activity The temperatures which were half of were 50 ° C and 80 ° C.D: Temperature stability   Laccase Lac 5.5 was added in McIllvine buffer (pH 4.5) for 4 hours. Preincubated at 5, 55 and 65 ° C. Aliquot 0, 30, 60 And after 120 minutes, diluted in McIllveine buffer (pH 4.5) The laccase activity was measured at 37 ° C. Laccase activity for pretreatment at 45 ° C Therefore, it was not adversely affected. Preincubation at 55 ° C for 120 minutes Later measurements showed that 80% of the activity was still retained. 65 The half life of laccase at 60 ° C. was 60 minutes (FIG. 8).   Sequence listing (1) General information:   (I) Applicant:     (A) Name: Consortium fuel electrochem ische Industry GmbH     (B) Town: Zirstadtstrasse 20     (C) City: Munich     (E) Country: Germany     (F) Postal code: D-81379     (G) Telephone: 089 748440     (H) Telefax: 089 74844350   (Ii) Title of the invention: DNA sequences, expression of these DNAs, Coded thermophilic laccase and uses thereof   (Iii) Number of sequences: 19   (Iv) Computer readable form:     (A) Medium type: floppy disk     (B) Computer: IBM PC compatible     (C) Operating system: PC-DOS / MS-DOS     (D) Software: Patent In Release # 1.0, Version # 1 . 25 (EPO) (2) Information on SEQ ID NO: 1:   (I) Sequence characteristics:     (A) Length: 1572 base pairs     (B) type: nucleic acid     (C) Number of chains: single strand     (D) Topology: linear   (Ii) Sequence type: mRNA from cDNA   (Iii) Hypothetical: NO   (Iii) Antisense: NO   (Vi) Origin:     (A) Organism name: Trametes versicolor     (B) Stock name: TV-1   (Vii) immediate origin:     (B) Clone: plac55   (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 1

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9/02 9/02 5/00 Ａ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/21 C12N 1/21 5/10 9/02 9/02 5/00 A

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置７６から位置１５７２を含めた位置までの ＤＮＡ配列もしくはＳＥＱＩＤ ＮＯ：２の位置７６から位置１５７２を含めた 位置までのＤＮＡ配列または前記のＤＮＡ配列と８０％より高い配列ホモロジー を有するＤＮＡ配列を有する、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする ＤＮＡ配列。 ２．請求項１記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクター。 ３．付加的に宿主生物でのラッカーゼ遺伝子の発現を媒介するプロモーター、 宿主生物に適当であり、請求項１記載のＤＮＡ配列の３’末端に機能的に結合し ている転写終結のためのシグナルを有する請求項２記載の発現ベクター。 ４．プロモーターがｔａｃプロモーター、サブチリシンプロモーター、ＧＡＬ プロモーター、ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、 グルコアミラーゼプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびアルコールオキ シダーゼプロモーターから選択される、請求項３記載の発現ベクター。 ５．付加的にＮ−末端シグナル配列を有する請求項３または４記載の発現ベク ター。 ６．Ｎ−末端シグナル配列がラッカーゼ遺伝子中に 存在する天然のシグナル配列であるか、以下の分泌タンパク質：Ｋｌｅｂｓｉｅ ｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａからのα−シクロデキストリングルコシルトランスフェ ラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのサブチリシン、Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓからの酸ホスファターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒからの α−アミラーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉからのグルコアミラーゼのシグナル配列の群から 選択される、請求項５記載の発現ベクター。 ７．分泌タンパク質のための遺伝子またはタンパク質の分泌される断片のため の遺伝子切片がラッカーゼ遺伝子に機能的に結合している請求項５記載の発現ベ クター。 ８．請求項１記載のＤＮＡ配列または請求項２から７までのいずれか１項記載 の発現ベクターを有している微生物株。 ９．タンパク質配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するタンパク質。 １０．パルプの脱リグニン、高分子凝集物の解重合、古紙の脱インキ、廃水、 特にパルプ漂白からのリグニン含有廃水中の芳香族化合物の重合、染料の酸化も しくは顔料の形成のための染料の活性化のため、また は芳香族化合物のカップリング反応のための有機合成もしくは芳香族側鎖の酸化 での請求項９記載の使用。[Claims]   1. SEQ ID NO: 1 from position 76 to position including position 1572 Included from position 76 to position 1572 of the DNA sequence or SEQ ID NO: 2 DNA sequence up to the position or sequence homology greater than 80% with said DNA sequence Encodes a protein having laccase activity, having a DNA sequence having DNA sequence.   2. An expression vector having the DNA sequence according to claim 1.   3. A promoter that additionally mediates the expression of the laccase gene in the host organism, 2. Suitable for the host organism and operably linked to the 3 'end of the DNA sequence of claim 1. The expression vector according to claim 2, which has a signal for terminating transcription.   4. Promoter is tac promoter, subtilisin promoter, GAL Promoter, TAKA amylase promoter, polyhedrin promoter, Glucoamylase promoter, GAPDH promoter and alcohol The expression vector according to claim 3, which is selected from a sidase promoter.   5. 5. The expression vector according to claim 3, further comprising an N-terminal signal sequence. Tar.   6. N-terminal signal sequence in laccase gene An existing natural signal sequence or the following secreted protein: Klebsie α-cyclodextrin glucosyl transfer from lla oxytoca Lase, subtilisin from Bacillus subtilis, Sacch alpha factor from aromyces cerevisiae, Pichia pas acid phosphatase from toris, from Aspergillusniger α-amylase or Aspergillus niger or Asper From the group of glucoamylase signal sequences from G. awamori The expression vector according to claim 5, which is selected.   7. For genes or secreted fragments of secreted proteins The expression vector according to claim 5, wherein the gene slice of the present invention is functionally linked to the laccase gene. Doctor.   8. A DNA sequence according to claim 1 or any one of claims 2 to 7. A microorganism strain having the expression vector of (1).   9. A protein having the protein sequence SEQ ID NO: 3.   10. Pulp delignification, depolymerization of polymer aggregates, waste paper deinking, wastewater, In particular, polymerization of aromatic compounds in lignin-containing wastewater from pulp bleaching and oxidation of dyes Or for the activation of dyes for the formation of pigments, Is organic synthesis or aromatic side chain oxidation for the coupling reaction of aromatic compounds The use according to claim 9, wherein