JP2000513230A

JP2000513230A - ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域由来のオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖を調節するためのその使用方法

Info

Publication number: JP2000513230A
Application number: JP10503679A
Authority: JP
Inventors: エイ．ライト，ジム; エイチ．ヤング，エイピング
Original assignee: エイ．ライト，ジム; エイチ．ヤング，エイピング
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2000-10-10
Also published as: CA2259123A1; US7223849B1; WO1998000532A3; CA2259123C; EP0954574A2; WO1998000532A2; US20070032442A1; AU3249897A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域由来のオリゴヌクレオチド、ならびにそれを使用する細胞増殖を調節するための方法および組成物に関する。詳細には、本発明は、ハウスキーピング遺伝子由来の非翻訳領域（UTR）、詳細にはリボヌクレオチドレダクターゼのR1およびR2成分のUTRの、腫瘍細胞増殖を阻害するための使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域由来のオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖を調節するためのその使用方法発明の分野本発明は、ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域由来のオリゴヌクレオチド、ならびにそれを使用する細胞の増殖および分化を調節するための方法および組成物に関する。詳細には、本発明は、ハウスキーピング遺伝子由来の非翻訳領域（ UTR）、詳細にはリボヌクレオチドレダクターゼのR1およびR2成分のUTRの、腫瘍細胞の増殖および転移を阻害するための使用に関する。発明の背景 DNA合成を導く最初の特有の段階は、リボヌクレオチドのそれらの対応するデオキシリボヌクレオチドへの転換であり、これは細胞周期特異的様式で、ハウスキーピング遺伝子であるリボヌクレオチドレダクターゼにより触媒される反応である[Lewisら、1978；Reichard，1993；Wrightら、1989a；Wrightら、1990a；St ubbe，1989]。哺乳動物酵素は、しばしばR1およびR2と呼ばれる２つの異なるダイマータンパク質成分から構成され、これらは異なる染色体上に位置する２つの動物タンパク質R1は、ホモダイマー構造であり、約170kDaの分子量を有し、そして酵素活性および基質特異性を制御する基質部位およびアロステリックエフェクター部位を有する[Wright，1989；Thelanderら、1990；Carasら、1985；Wright ら、1990a]。タンパク質R2は、ホモダイマーであり、88KDaの分子量を有し、そして触媒のために必要とされるチロシンフリーラジカルを安定化する２つの等価な二核鉄中心を形成する[Wrightら、1990a；Thelanderら、1985；McClartyら、1 990]。R1およびR2タンパク質は、それらのＣ末端において相互作用して、活性なホロ酵素を形成する[Reichard，1993；Wrightら、1990a；Davisら、1994]。 R1およびR2は、細胞周期の間にディファレンシャルに調節される。そのデノボ合成から生じるR2タンパク質のＳ期相関性増加が存在する[Lewisら、1978；Mann ら、1987]。リボヌクレオチドレダクターゼの活性、ならびにそれゆえDNA合成および細胞増殖は、増殖中の細胞において、細胞周期の間に、R2成分の合成および分解によって制御される[Erikssonら、1984]。速度制限R2成分は、細胞周期進行のCDC2およびCDK2タンパク質キナーゼメディエーターによりリン酸化され得るリンタンパク質であり[Chanら、1993]、そして酵素活性のために必要とされる特有のチロシンフリーラジカルを安定化する非ヘム鉄を含む[Reichard，1993；McCla rtyら、1990]。 R1タンパク質のレベルは、増殖中の細胞の細胞周期の間に実質的に変化しないようであり、そして細胞周期を通して検出され得る。R1 mRNAの合成は、R2 mRNA と同様に、主にＳ期の間に生じるようである[Erikssonら、1984；Choyら、1988 ；Mannら、1987]。細胞周期の間のR1タンパク質のより広い分布は、R2タンパク質に比較してより長いその半減期に帰因する[Choyら、1988；Mannら、1987]。リボヌクレオチドレダクターゼ、および特にR2成分の調節は、腫瘍プロモーターまたは増殖因子TGF-βへ曝露された悪性細胞において顕著に変化される[Amara ら、1994；Chenら、1993；Amaraら、1995b；HurtaおよびWright，1995；Hurtaら、1991]。より高レベルの酵素活性が、非悪性細胞に比較した場合に、培養悪性細胞において観察されており[Weber，1983；TakedaおよびWeber，1981；Wright ら、1989a]、そして増加したレベルのR2タンパク質およびR2mRNAが、正常コントロール組織サンプルに比較して、前悪性および悪性組織において見出されている [Saekiら、1995；Jensenら、1994]。リボヌクレオチドレダクターゼ、および特にR2成分の調節は、腫瘍プロモーターまたはトランスフォーミング増殖因子βへ曝露されたトランスホームされた細胞において、腫瘍進行の増殖因子媒介性機構で、有意に上昇される[Amaraら、1996；Chenら、1993；Amaraら、1995b]。これらの研究は、齧歯類およびヒト組織から得られた腫瘍細胞[Weber，1983；Wright ら、1989a；Saekiら、1995；Jensonら、1994]、ならびにヒドロキシ尿素のような抗腫瘍剤に対する耐性について選択された培養細胞[Lewisら、1978；Wrightら、1989b]における。ヒドロキシ尿素のような化学療法化合物は、R2タンパク質の鉄中心を不安定化してチロシンフリーラジカルの破壊を引き起こし[McClartyら、1990]、そして細胞を細胞周期のＳ期を通っての進行から防止することにより[AshiharaおよびBas erga，1979]、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を阻害する。細胞周期制御に加えて、リボヌクレオチドレダクターゼは、DNA修復のために重要であるＳ期非依存性機構により調節され得る。リボヌクレオチドレダクターゼ活性は、Ｓ期の外側で、クロラムブシルのようなDNA架橋剤により、およびUV照射により誘導され得、このことは、この酵素のDNA修復プロセスにおける役割を示す[HurtaおよびWright，1992；Filatovら、1996]。最近の研究は、リボヌクレオチドレダクターゼ活性が、12-0-テトラデカノイルホルボル-13-アセテートのような腫瘍プロモーターの存在下において、迅速に上昇されることを示した[Amaraら、1994；Chenら、1993]。このプロセスは、少なくとも部分的に、R1およびR2mRNAの半減期の増加に媒介されており、これは、２つのタンパク質R1BPおよびR2BPの、R1およびR2メッセージの3'非翻訳領域（3' UTR）中のシスエレメント配列との減少した相互作用と平行する[Amaraら、1994 ；Chenら、1993；Chenら、1994a；Chenら、1994b]。このシス−トランス反応における変化は、リボヌクレオチドレダクターゼを標的化する化学療法剤に対する感受性を決定することにおける役割を担い得る[Amaraら、1995a]。 TGF-β₁へのトランスホームされた線維芽細胞の曝露は、R2メッセージの半減期を増加させ得、これはR2mRNA 3'UTR内のシス−トランス相互作用に媒介されるプロセスである[Amaraら、1995b；HurtaおよびWright，1995]。他の研究は、mRN Aの非コード領域が、Xenopus卵母細胞におけるbFGFの発現[KimelmanおよびKirsc hner，1989]、Caenorhabditis elegansの発達事象のタイミング[Leeら、1993]、ニワトリ胚軟骨細胞におけるα1(I)コラーゲンの発現[FarrellおよびLukens，19 95]、および非ハウスキーピング遺伝子であるαトロポミオシンの3'UTR由来のRN Aによる黄紋筋肉腫の腫瘍形成性の抑制[Rastinejadら、1993]のような、細胞の重要な生物学的特性を制御し得ることを実証した。 PCT特許出願第WO 94/21661号は、細胞構造タンパク質のUTRの、細胞***または細胞分化を調節するための使用を論じ、そしていかにして外因性UTRが細胞調節に影響し得るかの考察を提供する。この出願は、特に、αトロポミオシンのUT Rに関する。 mRNA代謝回転の調節は、メッセージの豊富さ、およびそれゆえ哺乳動物細胞における遺伝子発現の制御における重要な段階である。メッセージの分解または安定性は、細胞増殖または細胞分化における重要な役割を担い、そして個々の細胞および組織の正常な生物学的機能を維持する機構において重要である。異常なmR NA代謝回転は、通常、タンパク質の変化したレベルを導き、これは細胞特性を劇的に改変し得る。例えば、オンコジーンまたは増殖因子の過剰発現は、しばしば異常な細胞増殖および悪性トランスホーメーションに関連する。メッセージ代謝回転は遺伝子調節の重要な成分であるので、重要な増殖調節遺伝子のメッセージ安定性特性が厳密に制御されていることを見出すことは驚くべきことではない。 mRNAレベルで調節される遺伝子発現の機構を詳細に記載する、いくつかの優れた総説が入手可能である[Ross，1995；HakeおよびRicher，1997]。メッセンジャーRNAは、タンパク質をコードするか、または転写後に遺伝子発現を制御する特異的調節領域を有するかのいずれかの異なるドメインから構成される。構造的には、キャップ（5'-GpppG-）を含む5'末端、コード領域、およびポリアデニル化尾部を含む3'末端の、mRNA分子の３つの異なる領域が存在する。 mRNAの構造エレメントは、翻訳およびmRNA安定性を調節する機構における肝要な役割を担うことが知られており、これは次にメッセージの翻訳効率および代謝回転速度、およびそれゆえ合成される特異的タンパク質の量に直接的に影響を及ぼすことが知られている。 mRNA分子の5'末端は、タンパク質には翻訳されず、それゆえ5'非翻訳領域（UT R）として知られる配列を含み、そしてヌクレアーゼ耐性特性を与えるmRNAキャップを含む。メッセージの5'末端が翻訳開始の調節に重要に関与していることを示す相当な証拠が存在する[Ross，1995；HakeおよびRicher，1997]。翻訳調節の変化は、結果として合成されるタンパク質の量に直接的に影響を及ぼすだけでなく、それはまたメッセージの安定性特性を有意に改変し得、それゆえタンパク質レベルをこの機構により同様に改変し得る。例えば、いくつかのウイルスは、キャップ領域を含む5'UTRへの調節タンパク質の結合を改変し得、そしてこのプロセスを介して宿主対ウイルス遺伝子発現を制御する。メッセージの5'UTRは、比較的短くあり得るか、または数百ヌクレオチド長であり得る。コード配列の後に、変動する長さの、タンパク質に翻訳されない領域がまた存在し、そしてこの3'UTR（これは、数百ヌクレオチド長であり得る）は、メッセージ安定性特性の決定における優勢な役割を担うようである。トランス作用タンパク質に結合して、mRNA代謝回転速度を制御するメッセージのこの部分における特有のシスエレメントの多数の例が、現在存在する[Ross，1995；HakeおよびRic her，1997]。さらに、大部分のmRNAは、ポリアデニル化（ポリ(A)）尾部を3'末端に有し、これは、翻訳効率およびメッセージ代謝回転特性に重要ないくつかの機能に作用し得る。例えば、ポリ(A)尾部は、メッセージを、いくつかの系において分解から保護し、そして脱アデニル化がメッセージ分解の第１段階であり得ることが実証されている。ポリ(A)尾部の単なる存在は、保護のために必ずしも十分ではなく、代わりに、ポリ(A)尾部は、ヌクレアーゼ作用からの保護を提供するために、最小の長さ、例えば20〜30ヌクレオチド長であるべきである。残基の数が実験的に変化される場合、分解の速度は、特定の数の残基の非存在または存在により、増加または減少され得る。ポリ(A)結合タンパク質を含むいくつかのタンパク質がこの調節に関与し、そしてポリ(A)尾部がRNA分解に関与するエキソヌクレアーゼのアセンブリをブロックすることが示唆されている[Sachs，1993；Fordら、 1997]。正確なヌクレオチド配列を有するシスエレメントと、トランス作用タンパク質との間の相互作用のほかに、ステム−ループおよびヘアピン構造のような二次構造コンホメーションもまた、mRNAの非翻訳領域（UTR）における調節機能に作用する。例えば、いくつかの場合において、UTR由来の興味深い構造的特徴を含む配列を、１つのmRNAから別のmRNAに移行させ、そしてレシピエントmRNAの安定性特性を変化させることが可能であることが示されている。確かに、ステム−ループ構造は、ヒストンmRNAのメッセージ調節[MarzluffおよびPandey，1988]、またはフェリチンおよびトランスフェリンレセプターmRNA調節[KlausnerおよびHartf ord，1989]における重要な役割を担う。ヒストンmRNAは、細胞周期で調節され、そしてポリ(A)尾部を欠くが、全てのヒストンmRNAにおいて見出される６塩基対のステムおよび４塩基のループのモチーフを含む3'UTR中の構造情報は、翻訳および分解の速度の制御における重要な役割を担う。一般に、二次構造特徴は重要である。なぜなら、それらは、mRNAとヌクレアーゼとの間の相互作用に直接的もしくは間接的に影響を及ぼす調節タンパク質の結合に影響するから、および／またはそれらは、特定のヌクレアーゼ活性についての優先的な認識部位として、もしくはヌクレアーゼ作用のインヒビターとして直接的に作用し得るからである。ガンの変換および進行の基礎をなす遺伝子変化は、細胞のゲノム安定性の減少に伴われ[CifoneおよびFidler，1981；Wolman，1983；Rowley，1990；Huangら、 1995a]、これは腫瘍細胞集団の不均質性、化学療法に対する応答の変化、および増加した悪性潜在性を導く。悪性トランスホーメーションの間に観察され、そして疾患の進行した段階において最も顕著である変化の多数は、少なくとも部分的に、例えば、DNA増幅についての増加した潜在性により現されるような、ゲノム／メッセージ安定性の変化に起因する[Rowley，1990；Wrightら、1990b；Tlsty ，1990]。正常二倍体は、まれにそのDNAを増幅するが、オンコジーンおよび薬剤耐性を決定する遺伝子の増幅はしばしば腫瘍細胞集団において観察され、そしてこれは、正常細胞を腫瘍細胞から区別する最も印象的な特性の１つである[Wrigh tら、1990b；Tlsty，1990]。悪性進行における根本的な役割を担うことが知られているいくつかの遺伝子の発現は、メッセージの安定性特性を制御する機構を介して、転写後レベルで、厳密に調節される。明らかに、ゲノム／メッセージ不安定化を導く機構は、ガンのトランスホーメーションおよび進行において重要であり、そしてガンの処置において利用され得る方法が、ゲノム不安定化を逆転または制御するために必要とされる。発明の要旨本発明者らは、直接的証拠により、ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域（特に、リボヌクレオチドレダクターゼR1およびR2）が、動物において腫瘍成長速度を有意に減少させることを示した。本発明者らはまた、ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域（特に、リボヌクレオチドレダクターゼR2）が、腫瘍細胞が転移する能力を減少させることを、直接的に示した。従って、広く述べると、本発明は、ハウスキーピング遺伝子由来の非翻訳領域由来の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む単離されたオリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子はリボヌクレオチドレダクターゼR1またはR2である。１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示すリボヌクレオチドレダクターゼR1の 3'非翻訳領域由来の少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、もしくは配列番号49に示す核酸配列またはそのアナログを有する。別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２に示すリボヌクレオチドレダクターゼR2の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号６〜配列番号43に示す核酸配列またはそのアナログを有する。本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明のオリゴヌクレオチドに相同もしくは相補的である配列、およびオリゴヌクレオチドを切断するために必要な触媒中心を有するリボザイム配列を含む。転写制御領域および、本発明の、オリゴヌクレオチドをコードする配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイム配列を含むDNA配列、およびこのDNA配列を含むベクターもまた意図される。本発明はまた、本発明の、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイム配列を、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して含む、細胞増殖、特に腫瘍細胞増殖を調節するための薬学的組成物を提供する。本発明はなおさらに、リボヌクレオチドレダクターゼR2の非翻訳領域由来の、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイム配列を、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して含む、細胞が転移する能力を減少させるための薬学的組成物を提供する。本発明はまた、細胞増殖、および特に腫瘍細胞増殖を調節するための、および腫瘍細胞が転移する能力を減少させるための医薬品を調製するための、本発明によるオリゴヌクレオチドの使用を意図する。腫瘍細胞の増殖または転移を調節する物質を同定するための方法もまた提供され、この方法は：（ａ）試験物質を、ハウスキーピング遺伝子のmRNAの非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドと、試験物質とオリゴヌクレオチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で反応させる工程、および（ｂ）複合体、遊離物質、および／または非複合体化オリゴヌクレオチドについてアッセイして、物質がオリゴヌクレオチドに結合し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節するかどうかを決定する工程、を包含する。化合物を、本発明のオリゴヌクレオチドの、このオリゴヌクレオチドに結合する物質との相互作用を阻害または増強し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節する能力について評価するための方法がさらに提供され、この方法は：（ａ）既知の濃度のオリゴヌクレオチドおよびこのオリゴヌクレオチドに結合し得る物質、ならびに候補化合物を、物質とオリゴヌクレオチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で提供する工程、ならびに（ｂ）複合体、遊離物質、および／または非複合体化オリゴヌクレオチドについてアッセイして、化合物が、物質とオリゴヌクレオチドとの相互作用を阻害または増強し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節するかどうかを決定する工程、を包含する。図面の簡単な説明本発明の他の利点は、それが、添付の図面とともに考慮した場合に以下の詳細な説明を参照にしてより良く理解されるようになると、容易に理解される。図１は、ベクタートランスフェクトRMP-6細胞における組換え3'UTRの発現を示すゲルの写真であり（実施例１）；そして図２は、同系マウスにおける皮下腫瘍の成長を示すグラフである（実施例１）。好ましい実施態様の詳細な説明オリゴヌクレオチド、アンチセンス、およびリボザイム本発明は、ハウスキーピング遺伝子由来の非翻訳領域（UTR）を含む、細胞の増殖および分化を調節するオリゴヌクレオチドに関する。腫瘍細胞増殖の低減または阻害は、本発明により意図される調節の好ましい形態である。腫瘍細胞増殖の低減または阻害は、分化した正常な増殖パターン（すなわち、正常な細胞*** および増殖）を示す腫瘍細胞および／または腫瘍細胞の傷害により証明され得る。本発明のオリゴヌクレオチドの特定の型はまた、リンパ管または血管による、あるいは漿液腔またはクモ膜下空間もしくは他の空間を通した腫瘍細胞の直接的伸長による腫瘍細胞の流布から生じる、転移、すなわち、原発性腫瘍の部位から離れた身体の部分における腫瘍細胞の出現におけるような、身体のある部分から別の部分への腫瘍細胞の蔓延、を調節することが見出された。用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に生じる塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語はまた、同様に機能する、非天然のモノマーを含む修飾または置換されたオリゴマーまたはその部分を含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、増強した細胞取り込みまたはヌクレアーゼの存在下での増大した安定性のような特性のために、天然に生じる形態以上に好ましくあり得る。この用語また、２つ以上の化学的に異なる領域を含むキメラオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益な特性（例えば、増大したヌクレアーゼ耐性、細胞への増大した取り込み）を付与する修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含み得るか、または本発明の２つ以上のオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドを形成するように連結され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に生じる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む）を含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、修飾塩基（例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6- メチル、2-プロピル、および他のアルキルアデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザウラシル、6-アザシトシン、および6-アザチミン、プソイドウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシアデニン、および他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオールアルキルグアニン、8-ヒドロキシグアニン、および他の8-置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、またはグアニン、5- トリフルオロメチルウラシル、および5-トリフルオロシトシン）を含み得る。本発明の他のオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格における修飾されたリン、酸素ヘテロ原子、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式の糖間結合を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、およびホスホロジチオエートを含み得る。本発明の実施態様において、４〜６の3'末端塩基の間のホスホロチオエート結合連結が存在する。別の実施態様において、ホスホロチオエート結合は全てのヌクレオチドを連結する。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、治療試薬または実験試薬としてより良好に適合され得るヌクレオチドアナログを含み得る。オリゴヌクレオチドアナログの例は、DNA（またはRNA）におけるデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチドに見出されるものと同様のポリアミド骨格で置換された、ペプチド核酸（PNA）である（P.E.Nielsenら、Science 1991,254,1497）。PNAアナログは、酵素による分解に耐性であり、そしてインビボおよびインビトロで延長した寿命を有することが示された。PNAはまた、PNA鎖とDNA鎖との間の電荷反発の欠如により相補的DNA配列により強く結合する。他のオリゴヌクレオチドは、ポリマー骨格、環式骨格、または非環式骨格を含むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドは、モルフォリノ骨格構造を有し得る（米国特許第5,034,506 号）。オリゴヌクレオチドはまた、レポーター基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基のような基を含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、糖模倣物を有し得る。オリゴヌクレオチドは、それらがダイマー形成、自己相補的相互作用、および UTR配列への結合可能性の最も少ない見込みを示すように選択され得る。これらの特性は、コンピューターモデリングプログラムOLIGO Primer Analysis softwa re Version 3.4（National Biosciences）を用いて決定され得る。このプログラムは、これらの３つのパラメーターの質的推定の決定を可能にし、そして「可能性無（no potential）」；「可能性有（some potential）」；または「本質的に完全な可能性（essentially complete potential）」を示す。３つ全てのパラメーターにおいて、好ましくは「可能性有」または「可能性無」、最も好ましくは「可能性無」の推定を有するオリゴヌクレオチドが選択される。オリゴヌクレオチドはまた、それらの機能が実質的に任意の修飾または置換により影響されないように選択される。オリゴヌクレオチドの天然のコンホメーションが保持されることが好ましい。本明細書中で使用される用語「ハウスキーピング遺伝子」は、多細胞生物の特殊化した細胞および組織により使用される「ラクシャリー」遺伝子／機能／活性とは対照的に、大部分の周期（cycling）細胞により必要とされ、そして一般的な細胞代謝に重大に関連付けられる遺伝子／機能／活性をいう（一般的に、「Mo lecular Biology of the Gene」、Albertsら、Garland Publishing Inc.,New Yo rk,1983：「Explorations in Developmental Biology」（C.FultonおよびA.O．K lein編）Vail-Ballou Press，Inc．1976；「Principles of Genetics」Herskowi tz，The Macmillian Company，New York，1973を参照のこと）。ハウスキーピング遺伝子は、DNAおよびRNA合成ならびに細胞代謝に関連し得る。特に、ハウスキーピング遺伝子はDNA合成および修復を調節するタンパク質をコードし得、そしてプリンおよびピリミジン合成に関与し得る。ハウスキーピング遺伝子は、リボヌクレオチドのそれらの対応するデオキシリボヌクレオチドへの変換に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ；細胞の増殖および生存に必要なポリアミンの合成に関与する酵素をコードするオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）；カルバミルリン酸シンテターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ活性を含む多機能タンパク質をコードするCAD；ならびにビタミンである葉酸のその活性形態であるテトラヒドロ葉酸（これは、DNAのヌクレオチド結合ブロックであるチミジル酸の合成に関与する）への還元に関与する酵素をコードするジヒドロ葉酸レダクターゼを含む任意のハウスキーピング遺伝子から選択され得る。ハウスキーピング遺伝子の例を表３に示す。本発明の好ましいハウスキーピング遺伝子は、リボヌクレオチドのそれらの対応するデオキシリボヌクレアーゼへの変換に関与するリボヌクレオチドレダクターゼである。オリゴヌクレオチドは、ハウスキーピング遺伝子の任意の非翻訳領域に由来し得る。オリゴヌクレオチドは、全体の3'または5'非翻訳領域またはその一部を含み得る。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであり得、そしてそれらは１本鎖または２本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、代表的に、ハウスキーピング遺伝子のUTRに由来する少なくとも７つの連続的なヌクレオチド、ハウスキーピング遺伝子のUTRに由来する、通常少なくとも15の連続的なヌクレオチド、および好ましくは少なくとも 20の連続的なヌクレオチドである。１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼR1またはR2の非翻訳領域に由来する少なくとも７つの連続的なヌクレオチドを含む。非翻訳領域は、好ましくは、リボヌクレオチドレダクターゼR1またはR2のmRNA由来の3'UTR全体（それぞれ、配列番号１もしくは２）またはその少なくとも７つの連続的なヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドの例は、表４および５に見出される。本発明はまた、変異を有する表４および５に示されるオリゴヌクレオチドを含む。変異は、置換、挿入、および欠失であり得、そして通常10％より少ない変化が存在する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、６〜48、または49の配列、最も好ましくは６〜12または45の１つにおいて同定される配列を有する。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供するために、天然配列の代わりにまたはこれに加えて（すなわち、5'から3'の方向または3'から5'の方向のいずれか）使用され得る。アンチセンス配列は、天然に生じるヌクレオチドまたは本明細書中に記載される修飾もしくは置換されたヌクレオチドを含み得る。アンチセンス配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの効果を阻害または増強するために使用され得る。本発明の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全UTRに相補的な配列を含む。 UTRを切断するリボザイム配列はまた、本発明のオリゴヌクレオチドの活性を調節するために使用され得る。（リボザイムの総説についてはCechを参照のこと）。リボザイムは、本発明のオリゴヌクレオチドに相同なまたは相補的な配列およびオリゴヌクレオチドの切断に必要な触媒中心を有する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを破壊する相同リボザイム配列が選択され得る。本発明の実施態様において、リボザイム配列は、リボヌクレオチドヌクレアーゼR1またはR2 由来のUTRまたはその一部に相補的または相同である。本発明において利用されるリボザイムの型は、当該分野で公知の型から選択され得る。いくつかのリボザイム構造ファミリー（グループＩイントロン、RNaseP 、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、タバコ輪紋ウイルスサテライトRNA(sTRSV)の一鎖にもとは由来するヘアピン型リボザイムを含む）が同定されている（Sullivan，1994，米国特許第5,225,347号、４〜５欄）。後者の２つのファミリーは、ウイロイドおよびウイルソイドに由来し、ここでリボザイムは、ローリングサークル型複製の間に作製されるオリゴマーからモノマーを分離すると考えられている（Symons,1989および1992）。ハンマーヘッド型およびヘアピン型リボザイムモチーフは、遺伝子治療のためのmRNAのトランス切断に最も一般的に適応される（Sullivan，1994）。現在臨床試験中であるヘアピン型リボザイムが、好ましくは、本発明において使用される。一般的に、リボザイムは、長さが30〜100ヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、従来のそして周知の技術により調製され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、固相合成を用いて、特に市販の装置（例えば、Applied Biosystemsから入手可能な装置）を用いて調製され得る。オリゴヌクレオチドがそれらの活性を妨げない任意の他の因子を含まないように、オリゴヌクレオチドを実質的に精製することもまた好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、遺伝子相補技術を用いてまたは本明細書中に記載されるプローブを用いて同定され得る。修飾または置換されたオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムを調製することもまた、十分に当業者の範囲内である。適用プローブ本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者が、細胞、組織、および生物学的材料中の相同性非翻訳領域の検出（例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術による）における使用のためにヌクレオチドプローブを構築することを可能にする。従って、プローブを使用して、細胞増殖調節活性好ましくは、腫瘍成長低減または阻害活性を有する、他のUTRについてスクリーニングし得る。適切なプローブは、表４および５に示されるようなリボヌクレオチドレダクターゼR1またはR2の3'UTRの領域に由来する核酸配列に基づく核酸分子を含む。ヌクレオチドプローブは、検出可能な物質（例えば、適切なシグナルを提供し、そして十分な半減期を有する放射性標識（例えば、³²P、³H、¹⁴Cなど））を用いて標識され得る。使用され得る他の検出可能物質は、特異的な標識抗体により認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体、および発光化合物を含む。プローブの検出されるべきヌクレオチドへのハイブリダイゼーションおよび結合の速度、およびハイブリダイゼーションに利用可能なヌクレオチドの量を考慮して、適切な標識が選択され得る。標識プローブは、固相支持体（例えば、一般的に、Sambrookら、1989、Molecular Cloning，A LaboratryMa nual(第２版)に記載されるような、ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜）上で核酸にハイブリダイズされ得る。核酸プローブを使用して、好ましくは、細胞増殖、特に腫瘍細胞増殖を調節するハウスキーピング遺伝子のUTRに由来する核酸分子をヒト細胞において検出し得る。抗体本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、抗体を調製し得る。抗体を調製するために従来の方法が使用され得る。核酸に対する抗体は、米国特許第4,723,847 号に記載される。例えば、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的な方法を用いて作製され得る。哺乳動物（例えば、マウス、ハムスター、またはウサギ）は、哺乳動物において抗体応答を誘発するオリゴヌクレオチドの免疫原性形態を用いて免疫され得る。オリゴヌクレオチドに免疫原性を付与するための技術は、キャリアへの結合または当該分野で周知の他の技術を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によりモニターされ得る。標準的なELIS Aまたは他の免疫アッセイ手順は、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原を用いて使用され得る。免疫後に、抗血清が得られ得、そして所望であれば、ポリクローナル抗体が血清から単離され得る。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）は、免疫された動物から採集され、そして標準的な体細胞融合手順によりミエローマ細胞と融合され、従ってこれらの細胞を不死化し、そしてハイブリドーマ細胞を生じ得る。このような技術(例えば、KohlerおよびMilstein(Nature 256,495-497(1975) により最初に開発されたハイブリドーマ技術)、ならびに他の技術（例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunol．Today 4，72(1983)）、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclon al Antibodies in Cancer Therapy（1985）Allen R．Bliss，Inc.，77-96頁）、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huseら、Science 246，1275(1989)）)は当該分野で周知である。ハイブリドーマ細胞は、オリゴヌクレオチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングされ、そしてモノクローナル抗体が単離され得る。従って、本発明はまた、本発明のオリゴオリゴヌクレオチドに対する特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を意図する。本明細書中で使用する用語「抗体」は、これもまたオリゴヌクレオチドと特異的に反応するそのフラグメントを含むことが意図される。抗体は、従来の技術を用いてフラグメント化され得、そしてフラグメントは上記のような同じ様式で有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、F(ab')₂フラグメントは、ペプシンで抗体を処理することにより生成され得る。得られたF(ab')₂フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元してFab'フラグメントを生じるように処理され得る。キメラ抗体誘導体（すなわち、非ヒト動物可変領域とヒト定常領域とを組み合せた抗体分子）もまた、本発明の範囲内で意図される。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域を有するマウス、ラット、または他種の抗体に由来する抗原結合ドメインを含み得る。従来の方法を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドを認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製し得る（例えば、Morr isonら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．81，6851（1985）；Takedaら、Nature 314，452(1985)、Cabillyら、米国特許第4,816,567号；Bossら、米国特許第4,8 16,397号；Tanaguchiら、欧州特許公報EP171496；欧州特許公報0173494、英国特許GB 2177096Bを参照のこと）。キメラ抗体は、ヒト被験体において、対応する非キメラ抗体より低く免疫原性であることが期待される。本明細書中に記載される本発明のオリゴヌクレオチドと特異的に反応するモノクローナルまたはキメラ抗体は、ヒト定常領域キメラを生成することによりさらにヒト化され、ここで可変領域の一部、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域はヒト起源であり、そして超可変領域のみが非ヒト起源である。このような免疫グロブリン分子は、当該分野で公知の技術により作製され得る（例えば、Tengら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，80，7308-7312(1983)；Kozb orら、Immunology Today，4，7279(1983)；Olssonら、Meth．Enzymol.,92,3-16( 1982)、およびPCT公報WO92/06193またはEP 0239400）。ヒト化抗体はまた、商業的に産生され得る（Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex， Great Britain）。本発明のオリゴヌクレオチドに対して反応性の特異的な抗体または抗体フラグメントはまた、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、細菌において発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより生成され得る。例えば、完全なFabフラグメント、VH領域、およびFV領域は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌において発現され得る（例えば、Wardら、Nature 341，544-546(1989)；Huseら、Science 246，1275 -1281(1989)；およびMcCaffertyら、Nature 348，552-554(1990)を参照のこと）。あるいは、例えば、Genpharmにより開発されたモデルであるSCID-huマウスを使用して、抗体またはそのフラグメントを産生し得る。オリゴヌクレオチドと特異的に反応する抗体またはそのアナログ（例えば、酵素結合体または標識誘導体）を使用して、種々の生物学的材料におけるUTRを検出し得、例えば、それらは任意の公知の免疫アッセイにおいて使用され得る。このようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、 ELISA）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、赤血球凝集、および組織化学学的試験である。従って、抗体を使用して、サンプル中のUTRを検出および定量し得る。特に、本発明の抗体は、UTRを検出し、それを特定の細胞および組織ならびに特定の細胞下位置に局在化し、そしてUTRのレベルを定量するために、免疫組織化学的分析において、例えば、細胞レベルおよび細胞下レベルで使用され得る。光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて抗原を局在化するための当該分野で公知の細胞化学技術を使用して、UTRを検出し得る。一般的に、本発明の抗体は検出可能物質で標識され得、そしてUTRは、検出可能物質の存在に基づいて組織に局在化され得る。検出可能物質の例は、種々の酵素、蛍光物質、発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；発光物質の例はルミノールを含み；そして適切な放射性物質の例は、放射性ヨウ素I¹²⁵ 、I¹³¹またはトリチウムを含む。抗体はまた、電子顕微鏡により容易に可視化される、高電子密度物質（例えば、フェリチンまたはコロイド状金）にカップリングされ得る。１次抗原-抗体反応が、オリゴヌクレオチドに対して反応性の抗体に対して特異性を有する第２の抗体の導入により増幅される、間接的な方法もまた使用され得る。例のために、オリゴヌクレオチドに対して特異性を有する抗体がウサギIg G抗体である場合、第２の抗体は、本明細書中に記載される検出可能物質で標識されたヤギ抗ウサギγグロブリンであり得る。放射性標識が検出可能物質として使用される場合、UTRは、ラジオオートグラフィーにより局在化され得る。ラジオオートグラフィーの結果は、種々の光学的方法によるラジオオートグラフにおける粒子の密度を決定することにより、または粒を計数することにより定量され得る。細胞状態／治療のモニタリング本発明のオリゴヌクレオチド（またはUTR）の存在は、細胞の状態を示し得る。UTRの非存在は、腫瘍増殖の可能性を示し得る。UTRの存在／非存在について細胞をアッセイすることは、ガン治療の進行のモニタリングに有用であり得る。このうなアッセイは、上記に詳細に記載されるようなUTRを結合するプローブまたは抗体を用いて行われ得る。細胞増殖を調節する物質および化合物の評価本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドと相互作用し、そして特にこれに結合する能力について物質を評価するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用を含む。このような物質はまた、正または負の方向に、細胞増殖、および特に腫瘍細胞増殖または転移を調節し得る。このような物質は、核酸配列およぼタンパク質を含む。特に、物質は、本明細書中に記載されるハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域における特有のシスエレメントを伴うトランス作用因子（一般的に、タンパク質）であり得る。従って、本発明は、腫瘍細胞の増殖または転移を調節する物質を同定するための方法であって、（ａ）試験物質とオリゴヌクレオチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、試験物質と、ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドとを反応させる工程、および（ｂ）物質がオリゴヌクレオチドに結合し、それにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節するかどうかを決定するために、複合体について、遊離物質について、非複合体化オリゴヌクレオチドについてアッセイする工程、を包含する、方法を提供する。物質-オリゴヌクレオチド複合体、遊離物質、または非複合体化タンパク質は、従来の単離技術により、例えば、UVまたは化学的架橋、続く架橋複合体の電気泳動またはクロマトグラフィー（例えば、移動度ゲルシフト）を使用して単離され得る。成分のアッセイを容易にするために、オリゴヌクレオチドもしくは物質、または標識オリゴヌクレオチド、または標識物質に対する抗体が利用され得る。抗体、オリゴヌクレオチド、または物質は、上記のように検出可能物質で標識され得る。本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドまたは物質は不溶化され得る。例えば、オリゴヌクレオチドまたは物質は、適切なキャリアに結合され得る。適切なキャリアの例は、アガロース、セルロース、デキストラン、Sephadex 、Sepharose、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン -メチルビニル-エーテル-マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などである。キャリアは、例えば、チューブ、試験プレート、ビーズ、ディスク、球などの形状であり得る。不溶化オリゴヌクレオチドまたは物質は、公知の化学的または物理的方法（例えば、臭化シアンカップリング）を用いて材料と適切な不溶性キャリアとを反応させることにより調製され得る。本発明の実施態様において、トランス作用タンパク質は、ガン細胞抽出物を本発明のオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングすることにより同定される。一般的に、移動度ゲルシフトおよびUV架橋手順は、タンパク質およびそれが結合する配列の存在を同定するために使用される（Amaraら、1993）。結合タンパク質は、当該分野で公知の方法により精製され、そして例えば、セファロースビーズに付着された本発明のオリゴヌクレオチドを利用するアフィニティ精製手順を使用し得る。一旦タンパク質が精製および同定されると、標準的な技術を使用して、これらのタンパク質の遺伝子をクローニングし得る。あるいは、タンパク質をコードするmRNAをコードするcDNAのクローニングは、例えば、ノースウェスタン手順を用いて発現ライブラリーを本発明のオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングすることにより達成され得る（Qianら、1993）。本発明はまた、オリゴヌクレオチドと相互作用するか、またはそれに結合する物質へのオリゴヌクレオチドの結合を阻害または増強する能力について、化合物を評価するためのオリゴヌクレオチドの使用を含む。従って、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに結合する物質との相互作用を阻害または増強し、それにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節する能力について化合物を評価するための方法であって、（ａ）物質とオリゴヌクレオチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、既知濃度のオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドに結合し得る物質、ならびに候補化合物を提供する工程、ならびに（ｂ）化合物が、物質およびオリゴヌクレオチドの相互作用を阻害または増強し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節するかどうかを決定するために、複合体について、遊離物質について、および／または非複合体化オリゴヌクレオチドについてアッセイする工程を包含する、方法を提供する。本発明の方法を用いてアッセイされ得るアゴニストおよびアンタゴニスト（すなわち、インヒビターおよびエンハンサー）が、アゴニスト結合部位、競合的アンタゴニスト結合部位、非競合的アンタゴニスト結合部位またはアロリステリック部位を含むオリゴヌクレオチドまたは物質上の１つ以上の結合部位に作用し得ることが理解される。本発明はまた、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに結合し得る物質との相互作用のアゴニストの効果を阻害するアンタゴニストについてスクリーニングすることを可能にする。従って、本発明は、オリゴヌクレオチドの同じ結合部位について競合する化合物についてアッセイするために使用され得る。本明細書中に記載される方法により同定される物質および化合物は、腫瘍細胞の増殖を調節するために、または転移を低減するために使用され得る。物質および化合物は、本明細書中に記載される薬学的組成物に処方され得る。本発明はまた、特定の非翻訳領域の機能を調べるための方法を提供する。特定のUTRまたはその一部を欠く細胞、組織、および非ヒト動物は、UTR領域またはその一部において特定の欠失または挿入変異を有する本発明の組換え発現ベクターを用いて開発され得る。組換え発現ベクターを使用して、内因性UTR領域またはその一部を相同組換えにより不活化または変化させ、それによりUTR欠損または変異体細胞、組織、または動物を作製し得る。細胞増殖／転移を調節するための方法および化合物本発明の方法を用いて同定されたオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ならびに物質および化合物は、細胞増殖、および特に腫瘍細胞増殖を調節する。従って、細胞増殖、好ましくは腫瘍細胞増殖に干渉するための方法であって、組織または細胞と、１つ以上の、本発明の方法を用いて同定されるオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに物質および化合物とを接触させる工程を包含する、方法、が提供される。好ましくは、リボヌクレオチドレダクターゼR1またはR2由来の3'UTR （配列番号１または２）を含むオリゴヌクレオチドが、腫瘍細胞増殖を低減するのに有効な量で投与される。最も好ましくは、表４および５に示されるオリゴヌクレオチドが投与される。用語「接触」は、液体キャリア中の、オリゴヌクレオチド、リボザイムなどの、細胞懸濁液もしくは組織サンプルへの添加、またはオリゴヌクレオチドなどを、動物内の細胞または組織に直接的もしくは間接的に投与することをいう。この方法を用いて、増殖性障害（ガンの種々の形態（例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織のガン腫、低酸素症腫瘍、口、咽喉、喉頭、および肺の偏平上皮細胞ガン腫、泌尿生殖器ガン（例えば、子宮頸ガンおよび膀胱ガン）、造血ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、頭部および頸部ガン、ならびに神経系ガン）、良性障害（例えば、乳頭腫、関節硬化、新脈管形成）、ならびにウイルス感染（例えば、HIV感染、肝炎、またはヘルペス感染）を含む）を処置し得る。本発明の方法を用いて同定されるオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに物質および化合物をまた用いて、薬物耐性腫瘍を処置し得る。薬物耐性腫瘍の例は、ヒドロキシ尿素に耐性の腫瘍；複数の抗ガン剤（例えば、コルヒチン、ビンブラスチン、およびドキソルビシン）に対する耐性を付与することが知られる高レベルのP-糖タンパク質を発現する腫瘍；またはR.Deeleyら、Science，258:1650-1654，1992に記載されるような多薬剤耐性タンパク質を発現する腫瘍である。本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、転移を低減させることが見出された。本発明の実施態様において、被験体において転移を低減させるための方法であって、リボヌクレオチドレダクターゼR2のUTRまたはその一部、好ましくはリボヌクレオチドレダクターゼR2の3'UTR（配列番号２）またはその一部、あるいは配列番号６〜43のうちの1つに示されるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの量を投与する工程を包含する、方法、が提供される。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号６〜12に示されるオリゴヌクレオチドである。選択されるオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、物質、および化合物は、本明細書中に記載されるように、細胞増殖、および特に腫瘍細胞増殖を調節するそれらの能力、またはインビトロおよびインビボにおいて転移を低減するそれらの能力について試験され得る。治療適用のために、本発明の方法を用いて同定されるオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ならびに物質および化合物は、薬学的組成物に処方され得る。薬学的組成物は、被験体への投与に適した生物学的に適合した形態の、被験体への投与のための、１つ以上の、本発明の方法を用いて同定されるオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ならびに物質および化合物を含み得る。本発明の組成物は、ヒトおよび種々の他の哺乳動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、およびネコ）への投与のために意図され得る。本発明の薬学的組成物は、局所的または全身的処置が所望されるかどうかに依存して、そして処置される領域に依存して、異なる方法で投与され得る。組成物は、経口的に、皮下的に、または非経口的に（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および鼻内投与、ならびに処置される悪性細胞により必要とされる鞘内技術および注入技術を含む）投与され得る。CNS内の送達のために、鞘内送達が、例えば、Ommayaリザーバーまたは当該分野で公知の他の方法を用いて使用され得る。薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびにインプラントキャリアは、一般的に、本発明の有効成分と反応しない、不活性の非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化材料をいう。カチオン性脂質（例えば、Lipofectin，Life Technologies）はまた、オリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために組成物に含まれ得る。化合物のインプラントはまた有用である。一般的に、薬学的組成物は無菌である。本発明のオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて送達され得る。配列は、本発明のオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞中で発現されるようにカセットまたは構築物に組込まれ得る。一般的に、構築物は、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞中で転写されることを可能にするように適切な転写制御領域を含む。従って、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列に作動可能に連結された転写制御配列を含むベクターを提供する。本発明は、これらのベクターで形質転換された、適切な真核生物および原核生物細胞から選択された宿主細胞をさらに提供する。このような形質転換細胞は、悪性腫瘍の機能および調節ならびに本発明の処置の研究を可能にする。ベクターは公知であるか、または当業者により構築され得、そして配列の所望の転写を達成するのに必要な全ての発現エレメントを含むべきである。異なる形態の核酸の回収のための機構のような他の有益な特徴はまた、ベクター内に含まれ得る。ファージミドは、それらがプラスミドとしてまたはバクテリオファージベクターとしてのいずれかで使用され得るので、このような有益なベクターの特定の例である。他のベクターの例は、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルス）、DNAウイルス、リポソーム、ならびに他の組換えベクターを含む。ベクターはまた、原核生物または真核生物のいずれかの宿主系における使用のためのエレメントを含み得る。当業者は、どの宿主系が特定のベクターに適合することを知る。ベクターは、任意の種々の当該分野で公知の方法により細胞または組織に導入され得る。このようは方法は、一般的に、Sambrookら、Molecular Cloning:A La boratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989，1992)、Au subelら、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Ba ltimore，Maryland(1989)、Changら、Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann A rbor，MI(1995)、Vegaら、Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)、 Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterwort hs，Boston MA(1988)、およびGilboaら（1986）に記載されることが見出され得、そして例えば、組換えウイルスベクターでの安定なまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および感染を含む。感染による核酸の導入はいくつかの利点を提供する。より高い効率は、それらの感染性質により得られ得る。さらに、ウイルスは非常に特殊化されており、そして代表的には、特定の細胞型において感染および増殖する。従って、それらの天然の特異性を使用して、ベクターを、インビボにおいてまたは組織もしくは細胞の混合培養物内で特異的な細胞型を標的化し得る。ウイルスベクターはまた、レセプター媒介事象を介する標的特異性を変化させるために、特異的なレセプターまたはリガンドを用いて改変され得る。 UTR mRNA R1および／またはR2配列を導入および発現するためのDNAウイルスベクターの特定の例は、アデノウイルス由来ベクターAdenop53TKである。このベクターは、ポジティブまたはネガティブ選択のいずれかのためのヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子およびアンチセンス配列のような所望の組換え配列のための発現カセットを発現する。このベクターを使用して、大部分の上皮起源のガンならびにその他を含むアデノウイルスレセプターを有する細胞を感染し得る。このベクターならびに同様の所望の機能を示すその他のベクターを使用して、細胞の混合集団（例えば、インビトロもしくはエクスビボの細胞培養物、組織、またはヒト被験体を含む）を処理し得る。さらなる特徴をベクターに付加して、その安全性を確実にし得、そして／またはその治療効力を増強し得る。このような特徴は、例えば、組換えウイルスに感染した細胞に対してネガティブに選択するために使用され得るマーカーを含む。このようなネガティブ選択マーカーの例は、抗ウイルス性ガンシクロビルに対する感受性を付与する上記のTK遺伝子である。従って、ネガティブ選択は、それが抗生物質の添加を介する誘導性自殺を提供するので、それによって感染が制御され得る手段である。このような保護は、例えば、ウイルスベクターまたは配列の変化した形態を生成する変異が起こった場合に、細胞トランスフオーメーションが起こらないことを確実にする。特定の細胞型に対して発現を制限する特徴もまた含まれ得る。このような特徴は、例えば、所望の細胞型に特異的なプロモーターおよび調節エレメントを含む。組換えウイルスベクターは、それらが水平（lateral）感染および標的化特異性のような利点を提供するので、所望の核酸のインビボ導入に有用なベクターの別の例である。水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、そして単一の感染細胞が、出芽しそして隣接する細胞に感染する多くの子孫ビリオンを生成するプロセスである。結果は、広い領域が急速に感染されるようになることであり、この大部分はもとのウイルス粒子により最初に感染されなかった。これは、感染性因子が娘子孫を介してのみ広がる垂直型感染とは対照的である。水平に広がり得ないウイルスベクターもまた生成され得る。この特性は、所望の目的が、特定の遺伝子を局在化された数の標的化細胞にのみ導入することである場場合に有用で有り得る。本発明の方法において使用されるべきベクターは、標的化されるべき所望の細胞型に依存して選択され得る。例えば、乳ガンが処置されるべきである場合、このような上皮細胞に特異的なベクターが使用されるべきである。同様に、造血系の細胞が処置されるべきである場合、血液細胞およびそれらの前駆体、好ましくは造血細胞の特定の型に特異的なウイルスベクターが使用されるべきである。レトロウイルスベクターは、感染性粒子として機能するか、または単一の初回の感染のみを受けるかのいずれかのように構築され得る。前者の場合、ウイルスのゲノムは、それが新たなウイルスタンパク質およびRNAを合成するための全ての必要な遺伝子、調節配列、およびパッケージングシグナルを維持するように改変される。一旦これらの分子が合成されると、宿主細胞は、RNAを、さらなる回の感染を受け得る新たなウイルス粒子にパッケージングする。ベクターのゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードおよび発現するように操作される。非感染性ウイルスベクターの場合、ベクターゲノムは、通常、RNAをウイルス粒子にカプセル化するために必要とされるウイルスパッケージングシグナルを破壊するように変異される。このようなシグナルなしでは、形成される任意の粒子はゲノムを含まず、従って、後の回の感染を通って進行し得ない。ベクターの特定の型は、意図される適用に依存する。実際のベクターはまた公知であり、そして当該分野内で容易に利用可能であるか、または周知の方法論を用いて当業者により構築され得る。ウイルスベクターが使用される場合、例えば、手順は、それらの標的特異性を利用し得、そしてその結果として、疾患部位に局所的に投与される必要はない。しかし、局所的投与は、より速くそしてより有効な処置を提供し得、投与はまた、例えば、被験体への静脈内または皮下注射により行われ得る。ウイルスベクターの骨髄液への注射はまた、特に、神経変性疾患の場合において、投与の１つの様式として使用され得る。注射後、ウイルスベクターは、それらが感染のために適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。トランスフェクションビヒクル（例えば、リポソーム）はまた、上記の非ウイルスベクターを、接種される領域内のレシピエント細胞に導入するために使用され得る。このようなトランスフェクションビヒクルは、当業者に公知である。本発明の薬学的組成物およびベクターは、良好な医学的実施と一致して、他の薬物との組み合わせで（例えば、細胞傷害剤、免疫毒素、アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、および他の抗ガン薬物ならびに当該分野で公知の処置様式（modality））または単独で投与され得る。オリゴヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、物質および化合物の投薬は、数日から数ヶ月続く処置の過程で、または疾患の縮小が達成されるまで、処置されるべき状態の重篤度および応答性に依存する。最適の投薬スケジュールは、身体中の薬物蓄積の測定を使用して計算され得る。当業者は、最適投薬量、投薬方法論、および反復速度を容易に決定し得る。最適の投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効能に依存して変化し得、そして一般的に、インビトロおよびインビボ動物研究においてED₅₀に基づいて決定され得る。以下の非限定的な実施例は、本発明を例示する。実施例一般的な方法：分子生物学における一般的な方法：当該分野で公知であり、そして具体的に記載されていない標準的な分子生物学技術は、一般的に、Sambrookら、Molecular Cl oning:A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989 ，1992)；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley a nd Sons，Baltimore，Maryland(1989)；およびPerbal，A Practical Guide to M olecular Cloning，John Wile ＆ Sons，New York(1988)に従った。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、一般的に、PCR Protocols：A Guide to Methods And Applications，Academic Press，San Diego，CA(1990)におけるように行った。ベクターは、当業者により本発明のために構築され得、そして配列の所望の転写を達成するために必要な全ての発現エレメントを含むべきである。発現エレメントは、標的化される細胞においてのみ発現を可能にするように選択され得る。他の有益な特性（例えば、異なる形態の核酸の回収のための機構）はまた、ベクター内に含まれ得る。当業者は、どの発現エレメントが特定の細胞型に適合するかを知る。ベクターは、本明細書中に上記で記載されるような当該分野内の種々の公知の方法の任意のものにより細胞または組織に導入され得る。免疫学における一般的な方法：当該分野で公知であり、そして具体的に記載されていない免疫学における標準的な方法は、一般的に、Stitesら（編）、Basic an d Clinical Immunology(第８版)、Appleton ＆ Lange，Norwalk，CT(1994)ならびにMishellおよびShiigi（編）、Selected Methods in Cellular Immunology， W.H.Freeman and Co.，New York(1980)に従った。腫瘍形成性および転移についてのアッセイ：悪性腫瘍の可能性を、以前に報告されたように決定した（Wright，1989a；Eganら、1987a、1987b；Damenら、1989； Taylorら、1992；Stokoeら、1994）。６〜８週齢のC3H/HeN同系マウス（Charles River，Quebec）を使用して、細胞の腫瘍形成性および転移性の可能性を評価した。細胞をサブコンフルエントな対数増殖中の培養物から調製し、トリプシン／ EDTA溶液での穏やかな処理により収集し、そして平衡化塩溶液中で適切な濃度に調整した。腫瘍形成性（腫瘍潜伏）アッセイのために、0.1ml容量中の１×10⁵の細胞を皮下でマウスの背中に注射し、そして触診により検出可能な腫瘍（２×２mm）を形成するために必要とされる時間を記録した。腫瘍の成長をまた、腫瘍直径を測定し、そして腫瘍出現後の各日での腫瘍基部面積を評価することにより評価した（ Damenら、1989）。腫瘍サイズを、腫瘍の横断面の寸法をかけることにより決定した。腫瘍をマウスから取り出し、そして腫瘍の重量を21日後に記録した。腫瘍形成がない場合、マウスを注射後２ヶ月間保持し、次いで屠殺した。実験的転移アッセイ（転移可能性の決定）のために、0.2ml容量中の１×10⁵の細胞を、６〜８週齢のC3H/HeN同系マウスの尾静脈に注射し、そして肺腫瘍の数を21日後に評価した。マウスを屠殺し、そして肺をブワン溶液（ピクリン酸、ホルムアルデヒド、酢酸（15:5:1）を気管内に注射することにより染色した（Egan ら、1987b；Damenら、1989）。肺腫瘍を、解剖顕微鏡の助けをかりて計数した。等しい数の試験細胞およびコントロール細胞を注射したことを確認するために、増殖培地を含む２連の培養プレートに、１プレートあたり100の細胞を接種した。10日間の培養後、プレートをメチレンブルーで染色し、そしてコロニーを記録した。実施例１新生物形成性トランスフォーメーションは、通常、多数の遺伝子変化の蓄積を介して進行する多段階プロセスである（Nowell，1986；Wrightら、1993）。特定のオンコジーンの活性化および腫瘍サプレッサー遺伝子の不活化は、この機構において重要な役割を担う。以前の研究において、出願人らは、T24-H-ras、ヒトc -myc、およびp53のプロリン193変異体形態の組み合わせでトランスフェクトされたマウス10T_1/2繊維芽細胞が、同系マウスにおいて腫瘍形成性および転移性の特性を示すことを示した（Taylorら、1992；Huangら、1995b）。RMP-6は、これらの初期の研究において特徴付けられたこれらの高度に悪性の細胞株のうちの１つである。出願人らは、悪性細胞におけるこれらのRNA領域の発現が、RMP-6細胞株を用いて悪性腫瘍関連特性を改変するかどうかを試験した。これらの実験のための準備において、RMP-6細胞を、R1 3'UTR（配列番号１）、R2 3'UTR（配列番号２）を含む発現プラスミドを用いて、またはコントロールとして空のベクターを用いてリン酸カルシウム沈殿手順によりトランスフェクトして、それぞれ、細胞株RMPM1U、RMPM2U、およびRMP-VCを得た。RMP-6細胞をまた、同じプラスミド構築物を用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトして、細胞株eRMPMlU(R1 3'UTR)、eRMPM2U(R2 3'UTR)、およびeRMP-VC(空のベクター)を生成した（図１）。リン酸カルシウム沈殿またはエレクトロポレーションのいずれかによりトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされた3' UTRを発現する。さらに、クラミジアDNAによりコードされる831塩基のフラグメントを、pHNC0.8でトランスフェクトした細胞において発現させた。プラスミド構築物はまた、ルシフェラーゼ酵素のコード領域を含み、そして期待されたように、全てのトランスフェクトした細胞株は、ルシフェラーゼ活性を含んだ。材料および方法リボヌクレオチドレダクターゼの3'UTRのための発現プラスミドの構築：哺乳動物チミジンキナーゼプロモーター、ハイグロマイシン遺伝子のコード領域、およびチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルを含む組換えハイグロマイシン遺伝子の1854bpフラグメントを、プラスミドpEBVHis(Invitrogen Corp.，San Diego ，CA)からPCR増幅し、そして哺乳動物発現プラスミドpcDNA3(Invitrogen Corp.) のBst1107I部位に挿入して、プラスミドpHNを得た。ホタルルシフェラーゼcDNA の1650bpのコード領域および46bpの3'UTRをカバーする1696塩基対（bp）フラグメントを、pMAMneo-luc(Clontech，Palo Alto，CA)から増幅し、そしてHindIII およびKpnIで制限したpHNに挿入した。得られたプラスミドのKpnIおよびXhoI部位に、pCD-R1およびpCD-R2プラスミドから増幅した、R1 3'UTRの446bpフラグメントおよびR2 3'UTRの876bpフラグメントを挿入し（Amaraら、1994；Chenら、19 93；ThelanderおよびBerg,1986）、それぞれ、R1およびR2 3'UTR発現プラスミド、pHNM1UおよびpHNM2Uを生成した。コントロール発現プラスミドpHNC0.8もまた、Chlamydla trachomatisゲノムDN Aの831bpフラグメントを同じベクターのBamHIおよびXhoI部位に挿入することにより構築した。831bpのクラミジアフラグメントは、チミジル酸シンターゼをコードするオープンリーディングフレームの3'部分である（Fanら、1996C）。pHNM 1U、pHNM2U、およびpHNC0.8において、（5'→3'に）ルシフェラーゼコード領域、ルシフェラーゼ3'UTRの46塩基、およびR1、R2、またはクラミジア配列の完全長3'UTRを含む組換えルシフェラーゼmRNAの合成は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下である。さらに、R1またはR2 3'UTRのcDNAフラグメントを、KpnI／XhoI切断pcDNA3プラスミドに方向付けてクローニングして、それぞれ、発現ベクターpD3M1UおよびpD 3M2Uを得た。これらの後者の２つのベクターにおいて、上流ルシフェラーゼコードフラグメントを有さない完全長R1またはR2 3'UTRもまた、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下である。全ての組換えプラスミドにおける挿入物の方向を、配列決定キット（Gibco BRL，Burlington，Ontarlo）を用いた配列分析により確認した。プラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション：発現プラスミドDNAを、リン酸カルシウム沈殿によりヒトHela細胞に、およびリン酸カルシウム沈殿またはエレクトロポレーションによりRMP-6細胞に導入した（Taylorら、1992；Huangら、19 95b）。リン酸カルシウム沈殿のために、５×10⁵の細胞を、10％血清（Fetal Cl one III，Hyclone，UT）を補充した10mlのα-最小必須培地（Gibco）を含む10cm 細胞培養ディッシュに播種した。５％CO₂の存在下での37℃での約16時間の培養後、培地を交換し、そして細胞をさらに３時間培養した。20μｇのDNAを、各ディッシュの細胞のトランスフェクションのために使用し；DNA-リン酸沈殿物を以前に記載のように調製した（Taylorら、1992；HuangおよびWright，1994）。16 時間の細胞培養後、沈殿物を取り出し、そして細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ pH7.2）で２回洗浄し、そして新鮮な培地を一晩の培養のために添加した。次いで、RPM-6細胞を、400μｇ/mlのハイグロマイシン（Boehringer-Mannheim，Mann heim，Germany）を含む培地中で培養し、そしてHela細胞を、800μｇ/mlのgenet icin（Gibco）を含む培地中で培養した。選択された安定なトランスフェクタントコロニー（合計500を超える）を同定し、トリプシン溶液を用いて取り出し、プールし、そしてそれらが薬物耐性であることを確実にするためにさらに10日間選択培地中で培養した（HuangおよびWright,1994）。エレクトロポレーションのために、発現プラスミドをSsp1で線状化し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿し、そして10mM Hepes(pH7.2) を含む無血清培地に再溶解した。対数増殖中の細胞をトリプシン溶解を用いて取り出し、そして10mM Hepes（pH7.2）で２回洗浄した。エレクトロポレーション混合物を、エレクトロポレーションキュベットにおいて調製し、そしてそれは総容量400μｌ中に７×10⁶の細胞および20μｇのSspI消化プラスミドDNAを含んだ。エレクトロポレーションを、960μＦおよび250Vの設定でGene Pulser(Bio-Rad， Mississauga，ON)を用いることにより達成した。室温で５分間のインキュベーション後、細胞を、15mlの増殖培地を含む10cm培養ディッシュに移した。一晩培養後、ハイグロマイシンを使用して、安定なトランスフェクタントを選択した（Hu angおよびWright，1994）。逆転写酵素PCR(RT-PCR)；全細胞RNAを、製造者（Strategene，La Jolla，CA）により指図されるように、Micro RNA Isolation Kitを使用することにより約70％コンフルエント培養物から抽出した。ベクター（R1またはR2 3'UTRをクローニングした）のXhoI切断部位の20bp下流に位置するSp6プライマー（5'GGATTTAGGTGAC ACTATAG3'、配列番号２）を、UTRを含む組換えmRNAからの逆転写に使用した。第２のプライマー（5'TGAGAAAAGCGGGGCCTG3'、配列番号３）（これは、R1 3'UTRの最初の18bpである）、および第３のプライマー（5'TAAGTAACTGATCGTGTGCTC3'、配列番号４）（これは、R2 3'UTRの最初の21bpを示す）を、Sp6プライマーと組み合せて使用して、組換えcDNAを増幅した。クラミジアDNAプライマー（5'TTAAG ACTTTTTACGCGATTC3'、配列番号５）をSp6プライマーと共に使用して、pHNC0.8トランスフェクト細胞における細菌フラグメントの発現を検出した。 EZ rTth RNA PCR Kit（Perkin Elmer，Branchburg，NJ)をRT-PCRのために使用した。簡単には、RT-PCR反応物は、総容量50μｌ中に、１×EZ緩衝液（Perkin E lmer）、300μＭの各デオキシリボヌクレオシド３リン酸、2.5mM Mn(OAc)₂、100 ngのRNAテンプレート、各々0.45μＭの２つのプライマー、および5.0単位のrTth ポリメラーゼを含んだ。最終増幅産物が、RNAサンプル中の可能なDNA混入物ではなく、RNAから最初に増幅されたことを確実にするために、平行反応を行い、ここで１μｇのDNaseフリーRNase Aを反応混合物に添加し、そしてポリメラーゼの添加前に５分間反応混合物とインキュベートした。テンプレートmRNAからのcDNAの合成、およびcDNAの後の増幅を、60℃での60分間の、次いで94℃での２分間のインキュベーション、続いて、94℃で20秒間の変性、60℃で90秒間のアニーリングおよび伸長の40回の温度サイクル、ならびに最後の60℃での７分間のインキュベーションにより達成した。反応の終わりに、10 μｌのサンプルを、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析した。腫瘍形成性および転移分析：悪性の可能性を、本明細書中上記に記載のように決定した。結果リボヌクレオチドレダクターゼ3'UTRの発現が腫瘍形成性に影響する可能性を評価するために、同系マウスに、トランスフェクト細胞株を皮下注射し、そして腫瘍の重量および増殖を決定した。同系マウスにおける転移の可能性を、尾静脈実験的肺転移アッセイにより評価した。R1およびR2 3'UTRを発現する細胞は、空のベクターでトランスフェクトしたコントロール細胞を用いて得られた結果と比較した場合に、重量が有意に低減した皮下腫瘍を生じた（表１）。同様の結果を、リン酸カルシウム沈殿手順でトランスフェクトした細胞、およびエレクトロポレーションによりトランスフェクトした細胞を用いて得た（表１）。これらの観察と一致して、図２は、R1またはR2mRNA由来の3'UTRでトランスフェクトした腫瘍細胞の増殖が、ベクター単独でトランスフェクトした細胞の増殖より有意に遅かったことを示す。 R1またはR2 3'UTRを発現する細胞について観察された低減した腫瘍形成性における特異性をさらに調べるために、831塩基のクラミジア配列を発現するpHNC0.8 でトランスフェクトした細胞の腫瘍形成性を、空のベクターでトランスフェクトした細胞と比較した。腫瘍の重量（表１）または腫瘍の潜伏（データは示さず）を評価することにより決定したところ、２つの細胞集団間で有意な差異はなかった。ガンの死亡は、腫瘍細胞が転移する能力により主に引き起こされる（Norwel l，1986）。興味深いことに、R2 3'UTR（配列番号２）を発現する細胞は、ベクター単独でトランスフェクトしたコントロール細胞と比較して、有意に低減した、同系動物の肺に散在する能力を示した（表１）。R1 3'UTR（配列番号１）の発現は、コントロール集団に比較した場合に、転移の可能性を有意には変化させず（表１）、これはR1 3'UTRの発現が腫瘍形成性の可能性を抑制するが、転移性の可能性を抑制しないことを示す。 R2 3'UTR（配列番号２）は、腫瘍形成性および転移性の両方の抑制効果を示し、そして腫瘍形成性研究において観察されたように、トランスフェクタントの転移特性は、トランスフェクションを行うために使用した方法と本質的に独立した。マウスR1およびR2 3'UTRがヒト腫瘍細胞可能性を抑制し得るか否かを決定するために、Hela細胞を、R1 3'UTR（Hela M1U細胞）またはR2 3'UTR（Hela M2U細胞）のいずれかを含む発現ベクターを用いてリン酸カルシウム沈殿によりトランスフェクトした。マウス腫瘍細胞について観察されたように、Hela MIU細胞および Hela M2U細胞の増殖は、R1またはR2 3'UTR配列を有さない発現ベクターを含むコントロールHela細胞と比較した場合に有意に低減した（表２）。実施例２ R1およびR2非翻訳領域を用いたさらなる結果本明細書中上記の方法を用いて、表４および５に示すR1およびR2 3'-UTR mRNA セグメントのオリゴヌクレオチドを、相対的コロニー形成効率実験における腫瘍細胞傷害性についてスクリーニングした（HuangおよびWright，1994）。Hela S3 およびHela 1mM腫瘍細胞、ならびに表６および７に示す種々のヒトガン細胞株を使用した。細胞を、10％ウシ胎児血清を含む増殖培地において37℃で24時間培養した。細胞を、リポフェクチン+/-オリゴヌクレオチド処理前に一回、５mlのリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.2）で洗浄した。試験するオリゴヌクレオチドを、2.5μｇのDOTMA/DOPE(Lipofectin；Lefe Tec hnologies，Inc)の存在下で細胞培養物に４時間添加した。オリゴヌクレオチドを、他に示さない限り0.2μＭで試験した。コントロールは、リポフェクチンで処理したが、オリゴヌクレオチドを含まない培養物であった。４時間後、オリゴヌクレオチドを含む培地を取り出し、そして5mlの増殖培地で洗浄した。次いで、細胞を、７〜10日間、10％ウシ胎児血清を含む増殖培地において培養した。いくつかの実験において、細胞アリコートを培養物から取り出し、そして生存性をトリパンブルー排除試験（Phillips，1973）を用いて決定した。結果を、コントロール細胞と比較しての生存細胞のパーセントとして分析した。短いオリゴデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート配列、Sen-II-2229B -20（配列番号７；表５）を使用して、相対的コロニー形成効率実験においてヒト腫瘍細胞（Hela）の増殖を阻害した。Hela S3細胞（American Type Culture C ollection，Rockville，Maryland，U.S.;ATCC）および抗腫瘍剤ヒドロキシ尿素に対する耐性について以前に選択されたHela細胞株（Hela １mM）（Wrightら、1 987）を、これらの実験において使用した（表６）。明らかに、Sen-II-2229B-20 は、ヒト腫瘍細胞コロニー形成能力の非常に有効なインヒビターである。Sen-II -2229B-20はまた、臨床的に意義のある化学療法化合物であるヒドロキシ尿素に対して耐性を示すヒト腫瘍細胞の増殖阻害においても有効である。 Sen-II-2229B-20（配列番号７）およびSen-II-2229A-20（配列番号６）は代替配列であり、2229AをGENBANK中のR2の変形から選択し（Pavloffにより提出された）、そして2229BをPavloffらにより公開された変形から選択した。２つの配列は同様の結果を提供した。 Sen-II-2229B-20（配列番号７）およびR2の3'-UTRの配列セグメント（フラグメント）に対応する６つの他の20マーオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（配列番号６、８〜12）およびR1の3'-UTRに対応する配列（配列番号45；表４）を、種々のヒトガン細胞を用いて阻害効果を決定するために、相対的コロニー形成効率実験において試験した。これらの種々のオリゴヌクレオチドの相対的コロニー形成能力の推定％阻害を示す結果を表７に提供する。明らかに、全ての化合物は、膀胱、結腸、肺、***、および膵臓に由来するヒトガン細胞に対する有効な抗腫瘍剤であった。さらに、オリゴヌクレオチド曝露の３日後のトリパンブルー排除試験によるHe la S3細胞およびWI38（正常株）細胞の生存性の分析は、Hela S3腫瘍細胞が、４〜８回の測定にわたって平均した正常非腫瘍形成性WI38細胞よりも、Sen-II-222 9B-20オリゴヌクレオチドの細胞傷害性効果に対して約３倍感受性であることを示した。本願を通して、種々の刊行物（米国特許および公開特許出願を含む）は、著者および年号または番号により参照される。刊行物についての完全な引用を以下に列挙する。これらの刊行物および特許の開示は、それらの全体が、本発明が関連する技術分野の水準をより十分に記載するために、本明細書により本願に参考として援用される。本発明は例示的な様式で記載され、そして使用された用語は、限定よりむしろ説明の単語の性質を帯びていると意図されることが理解されるべきである。明らかに、本発明の多くの改変および変形は、上記の教示に照らして可能である。従って、添付の請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載された以外に実施され得ることが理解されるべきである。本願を通して、種々の刊行物（米国特許および公開特許出願を含む）は、著者および年号または番号により参照される。刊行物についての完全な引用を以下に列挙する。これらの刊行物および特許の開示は、それらの全体が、本発明が関連する技術分野の水準をより十分に記載するために、本明細書により本願に参考として援用される。図１および２についての詳細な脚注もまた以下のページに提供する。本発明は例示的な様式で記載され、そして使用された用語は、限定よりむしろ説明の単語の性質を帯びていると意図されることが理解されるべきである。明らかに、本発明の多くの改変および変形は、上記の教示に照らして可能である。従って、添付の請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載された以外に実施され得ることが理解されるべきである。表１ RMP-6トランスフェクト細胞株の腫瘍形成性および転移能力 ¹スチューデントｔ検定を使用して、RMPM1UおよびRMPM2U細胞を用いて得られた腫瘍形成性の結果における差は、RMP-VC細胞を用いて得られた結果に比較した場合、それぞれ＜0.02および＜0.001のｐ値で、統計学的に有意であることが見出された。同様に、eRMPM1UおよびeRMPM2U細胞を用いて得られた腫瘍形成性の結果は、eRMP-VC細胞を用いて得られた結果と、両方の場合において、＜0.01のｐ値で、有意に異なった。² スチューデントt検定を使用して、RMPM1UおよびeRMPM1U細胞を用いて得られた実験的転移についての数は、それぞれ、RMP-VCまたはeRMP-VCコントロール細胞集団を用いて得られた結果と、統計学的に異なるとは見出されなかった。しかし、RMPM2UおよびeRMPM2U細胞を用いて観察された実験的転移の数は、RMP-VCまたはeRMP-VC細胞を用いて得られた観察に比較した場合、両方の場合において、＜0 .02のｐ値で、有意に異なった。³ 動物の数／実験を（）内に示す。⁴ 特異性についての追加のコントロールとして、RMP-VC細胞の腫瘍形成性を、pHN C0.8でトランスフェクトしてRMPC0.8細胞株を生成した細胞（これは、831塩基のクラミジア配列を発現する（図１を参照のこと））に比較した。有意差は観察されなかった；それぞれRMP-VCおよびRMPC0.8細胞について、1.19±0.26（ｎ＝８）および1.24±0.33（ｎ＝７）の腫瘍重量（ｐ値。0.5）。表２ヒトHELAトランスフェクト細胞株の腫瘍形成能力 ¹スチューデントｔ検定を使用して、Hela M1UおよびHela M2U細胞を用いて得られた腫瘍形成性の結果における差は、Hela-VC細胞を用いて得られた結果に比較した場合、それぞれ＜0.01および＜0.05のｐ値で、統計学的に有意であることが見出された。動物の数／実験は５であった。表３ハウスキーピング遣伝子の部分的リスト＊で示す遺伝子は、ガン細胞において変化されていることが観察されている。表４ R1 3'-UTRオリゴヌクレオチド配列表５ R2 3'UTRオリゴヌクレオチド配列表５（続き）表５（続き）表４および５についての脚注^* 名称は以下を含む： Sen＝センスＩ＝R1 または II＝R2 第１の数字は、R2mRNA配列における最初のヌクレオチド位置である。第２の数字は、配列セグメントの長さである。¹ Tm℃＝形成されるオリゴヌクレオチド二重鎖の融点² dG＝オリゴヌクレオチド−相補物ダイマー形成についての自由エネルギー値³ Ｄ＝可能なダイマー形成体の推定（Ｖ＝可能性無；Ｘ＝可能性有）⁴ Ｈ＝可能な自己相補相互作用についての推定（Ｖ＝可能性無；Ｘ＝可能性有）⁵ Ａ＝R1またはR2メッセージ中の配列に結合する可能性についての推定（Ｖ＝可能性無；Ｘ＝可能性有）推定を、コンピューターモデリングプログラムOLIGO Primer Analysis Softwa re，Version3.4（National Biosciencesにより配給される）を使用することにより決定した。このプログラムは、これら３つのパラメーターの質的推定の決定を可能にし、そして「可能性無（no potential）」、または「可能性有（some pot ential）」、または「本質的完全可能性（essentially complete potential）」を示す。３つ全てのパラメーターにおいて可能性無の推定を有したセグメントを、一般に、選択した。しかし、表５に示すいくつかのセグメントは、「可能性有」の範疇であるパラメーターを有し、そして減少した（いくらかの）可能性を有してなお有効であった。パラメーターの均衡を選択において使用した。表６ R2 UTR Sen-II-2229b-20での処理後のコロニー形成効率の用量依存性減少表７図面の詳細な説明図１は、ベクタートランスフェクトRMP-6細胞における組換え3'UTRの発現を示すゲルの写真である（実施例１）。DNaseフリーRNase Aの存在下または非存在下で前処理した全細胞RNAを、逆転写酵素−PCRのために使用した。5'および3'プライマーは、それぞれ、UTRおよびベクター向きであった。RMP-VC（レーン２、７、12）、RMPM1U（レーン３、４、８、９）、RMPM2U（レーン５、６）、およびRM PC0.8（レーン13、14）は、それぞれ、リン酸カルシウム沈澱による、ベクターコントロール、R1 3'UTRを含むベクター、R2 3'UTRを含むベクター、またはクラミジア配列でのトランスフェクション後、RMP-6細胞に由来した。eRMP-VC（レーン12）、eRMPMlU（レーン５、６）、およびeRMPMU2（レーン10、11）を、プラスミドのRMP-6細胞中へのエレクトロポレーションにより得た。左のレーン（レーン１）は、100 bpラダーマーカー（Pharmacia）の移動度を示し、そして最下バンドは100bpである。図２は、同系マウスにおける皮下腫瘍の成長を示すグラフである（実施例１）。各点についてのデータ±SEは、５匹のマウスについて得られた結果を表す。RM P-VC（●）、RMPM1U（■）、およびRMPM2U（▲）腫瘍細胞についての潜伏期間は、注射後８、９、および10日間であった。曲線の傾きの検討は、RMP-VC細胞の腫瘍成長速度が、それぞれRMPM1U（ｐ＜0.01）またはRMPM2U（ｐ＜0.005）細胞についての速度より有意に大きかったことを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヤング，エイピングエイチ. カナダ国アール３イー１ジー１マニトバ，ウィニペグ，パシフィックアベニュー 717

Claims

【特許請求の範囲】１．リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドの、腫瘍細胞増殖を阻害するための使用。２．リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドの、腫瘍細胞転移を減少するための使用。３．配列番号１に示すリボヌクレオチドレダクターゼR1の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項１に記載の使用。４．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、もしくは配列番号49に示す核酸配列またはそのアナログを有する、請求項３に記載の使用。５．配列番号２に示すリボヌクレオチドレダクターゼR2の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項１または２に記載の使用。６．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、もしくは配列番号12に示す核酸配列またはそのアナログを有する、請求項５に記載の使用。７．前記オリゴヌクレオチドが、表５に示す配列番号６〜配列番号43に示す核酸配列またはそのアナログを有する、請求項５に記載の使用。８．リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドの、腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬品を調製するための使用。９．リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドの、腫瘍細胞転移を減少するための医薬品を調製するための使用。１０．配列番号１に示すリボヌクレオチドレダクターゼR1の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項８に記載の使用。１１．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、もしくは配列番号49に示す核酸配列またはそのアナログを有する、請求項１０に記載の使用。１２．配列番号２に示すリボヌクレオチドレダクターゼR2の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項８または９に記載の使用。１３．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、もしくは配列番号12に示す核酸配列またはそのアナログを有する、請求項１２に記載の使用。１４．前記オリゴヌクレオチドが、表５に示す配列番号６〜配列番号43に示す核酸配列またはそのアナログを有する、請求項１２に記載の使用。１５．腫瘍細胞の増殖または転移を調節する物質を同定するための方法であって：（ａ）試験物質を、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドと、該試験物質と該オリゴヌクレオチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で反応させる工程、および（ｂ）複合体、遊離物質、および／または非複合体化オリゴヌクレオチドについてアッセイして、該物質が該オリゴヌクレオチドに結合し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節するかどうかを決定する工程、を包含する、方法。１６．前記物質がトランス作用タンパク質である、請求項１５に記載の方法。１７．化合物を、オリゴヌクレオチドの、該オリゴヌクレオチドに結合する物質との相互作用を阻害または増強し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節する能力について評価するための方法であって、ここで該オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の非翻訳領域の少なくとも７つの連続するヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを有し：（ａ）既知の濃度の該オリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドに結合し得る物質、ならびに候補化合物を、該物質とオリゴヌクレオチドとの間の複合体の形成を可能にする条件下で提供する工程、ならびに（ｂ）複合体、遊離物質、および／または非複合体化オリゴヌクレオチドについてアッセイして、該化合物が、該物質およびオリゴヌクレオチドの相互作用を阻害または増強し、そしてそれにより腫瘍細胞の増殖または転移を調節するかどうかを決定する工程、を包含する、方法。１８．リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む修飾されたオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼの存在下において増加した安定性を有し、そして腫瘍細胞増殖を阻害し得ることにより特徴付けられる、オリゴヌクレオチド。１９．リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の3'非翻訳領域由来の少なくとも７つの連続的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む修飾されたオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼの存在下において増加した安定性を有し、そして腫瘍細胞転移を減少し得ることにより特徴付けられる、オリゴヌクレオチド。２０．前記リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子が配列番号１に示すリボヌクレオチドレダクターゼR1である、請求項１８に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。２１．前記リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子が配列番号２に示すリボヌクレオチドレダクターゼR2である、請求項１８または１９に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。２２．前記オリゴヌクレオチドが減少されたダイマー形成、減少された自己相補的相互作用、および非翻訳領域への減少された結合能力を示す、請求項１８〜２１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。２３．配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、および配列番号49からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド、またはそのアナログ。２４．配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、および配列番号12からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド、またはそのアナログ。２５．表５に示す配列番号６〜配列番号43からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド、またはそのアナログ。２６．転写開始領域、および請求項１８〜２５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをコードする配列を含む、DNA配列。２７．請求項２６に記載のDNA配列を含むベクター。２８．請求項１８〜２５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ。２９．請求項１８〜２５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの配列に相補的または相同な核酸配列、および該オリゴヌクレオチドを切断するための触媒中心を有する、リボザイム配列。３０．請求項１８〜２５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して含む、薬学的組成物。