JP2000512625A

JP2000512625A - 生きている組織の保存用組成物および方法

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Publication number: JP2000512625A
Application number: JP09541244A
Authority: JP
Inventors: エムウィギンズ、フィリッパ; ビイフレグソン、アレクサンダー
Original assignee: バイオストアニュージーランドリミテッド
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2000-09-26
Also published as: DE69625254T2; NZ333030A; DE69625254D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、器官、組織および細胞を最小限の生物学的活性の喪失で長期間保存できる生物学的物質の保存溶液および方法を提供する。本発明の溶液は（ｉ）保存すべき生物学的物質と実質的に等張であり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まず、および／または（ｉｉ）少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と、約２００未満の分子量を有し、親水性および疎水性の両部分を有する第二の中性溶質とを含むことができる。本発明の溶液はＣａＳＯ₄を、ホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からのアニオンおよびカチオンの組み合わせ、例えばＫ₂ＳＯ₄など、と共に含むのが好ましい。本発明は、生物学的物質を保存溶液に先立って酪酸ナトリウムで前処理することも含める。

Description

【発明の詳細な説明】生きている組織の保存用組成物および方法発明の技術分野本発明は生物学的物質の保存分野に関するものであり、より詳細に述べるならば、哺乳動物、海洋生物および植物の器官、組織および細胞を保存するための組成物および方法に関するものである。発明の背景生物学的物質の保存法は多くの臨床的および獣医学的用途に用いられ、その際器官、組織および細胞を含める生体物質を取得し、使用するまでの或る期間インビトロで保存する。このような用途の例は器官保存および移植、自己−および同種骨髄移植、全血移植、血小板移植、胚転移、人工授精、インビトロ受精、皮膚移植および診断目的のための組織生検保存などを含める。保存技術は、病院、産業界、大学およびその他の研究所において実験的に使用される細胞系統の保存にも重要である。細胞生物学的物質の保存のために現在用いられる方法は、食塩水を基礎とする培地への浸漬、凍結温度より若干高い温度での保存、約−８０℃における保存、および約−１９６℃の温度の液体窒素中における保存などである。これらの方法の目的は生きている生物学的物質を正常な生物学的構造および機能の損失を最小にして長時間保存することである。器官、例えば心臓および腎臓などを０℃未満の温度で保存すると、多くの細胞の損失とそれに伴うその器官の生存率能力の減少をおこすことがよくある。このような複雑な生物学的物質は、それゆえ典型的には水性食塩液を基礎とした培地中で凍結温度より高い温度、典型的には約４℃で保存する。食塩液を基礎とした培地は普通は等張食塩水（塩化ナトリウム０.１５４Ｍ）からなり、それに低濃度の種々の無機イオン、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩化物、リン酸塩および炭酸水素塩を付加して細胞外環境に似せるように改変したものである。少量の、グルコース、ラクトース、アミノ酸およびビタミンなどの化合物を代謝に必要な物質として加えることも多い。生物学的物質の保存に用いられるすべての食塩水を基礎とした培地は高い電気伝導度を有する。現在生物学的物質の保存に用いられる培地の例は、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)、Ｍ−２(ヘペス緩衝ネズミ培養培地)、リンゲル溶液およびクレブス炭酸水素塩緩衝培地などである。食塩水を基礎とした培地に保存された生物学的物質の生存率能力は、経時的に徐々に減少する。生存率能力の喪失は、連続的代謝活動による毒性排出物の蓄積、代謝産物およびその他の補助的化合物の損失によると考えられている。従来の食塩水を基礎とした培地を用いるとき、生きている組織は比較的短期間しか保存できない。時間的上限の近くまで保存した器官の微小構造を測定すると、心筋のミトコンドリアなどが劣化し、ひとたび置換した器官の性能はかなり低下している。例えば、ヒト心臓はドナーから摘出後冷イオン水に約５時間しか保存できず、このためその心臓を運搬する距離が著しく制限される。生物学的物質を保存するために凍結技術を用いる場合、凍結中の氷結晶の生成によって細胞に起きる損傷量を制限するために、凍結防止剤、例えばグリセロール、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、グリコール類またはプロパンジオールなどを凍結前の材料に挿入することが多い。凍結防止剤の選択および濃度、凍結防止剤の添加の時間的手順、および凍結防止剤を挿入する温度はすべてその保存法の成功に重要な役割を果たす。さらに、細胞損失を減らすために、凍結の速度および時間的手順、解凍の速度および時間的手順、さらに室温または体温までの加温、および組織塊における凍結防止剤溶液の生理食塩溶液への置換等の様々な点を注意深くコントロールすることが重要である。凍結技術に必要な多数の操作段階は細胞損失を増加させる。生物学的物質の保存に現在用いられる凍結技術は、技術的要求が厳しく、時間がかかる。生物学的物質を凍結によって保存する場合のその他の欠点は、細胞生存率能力の減少、再注入したときに凍結防止剤が患者に及ぼす毒性効果の可能性、および処理および保存の高コストなどである。一例として、一般に凍結防止剤としてＤＭＳＯの添加を含める凍結保存は、現在、例えば高用量の化学療法または放射線治療などに続く、移植処置に使用するために取得した骨髄を保存するために用いられている。自己移植においては骨髄を長期間、数週間から数カ月保存しなければならない。しかしながら、この技術は幹細胞回収の顕著な減少（５０％以下までのレベル）をおこす。この技術のその他の欠点は、種々の成熟細胞を著しく損傷し得ることであり、そのため凍結前にこれらの細胞を取り出すための処置がさらに必要になることである。最後にＤＭＳＯの使用は、保存骨髄の再注入時に患者に中程度ないし重度の毒性を与える。このため当業者には、生きている生物学的物質を保存するための改良された方法がいまだに必要である。概要本発明は器官、組織および細胞を含める材料を、生物学的活性の損失を最小にして、長期間保存することを可能とする、生物学的物質を保存するための組成物および方法を提供する。第一の面において、本発明は、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まない溶液であって、保存すべき生物学的物質と実質的に等張である溶液を提供する。このような溶液は、少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する、正味電荷をもたない第一の中性溶質と、約２００未満の分子量を有する第二の中性質とを含む。ここで第二の溶質はさらに親水性および疎水性部分の両方を有する。本発明の保存溶液は、１つ以上のイオンを含んでもよい。保存溶液の多くの種類には、カルシウム塩、好適にはＣａＳＯ₄またはＣａＣｌ₂が約２ｍＭ未満の濃度で使用されている。付加的イオン類は、アニオンまたはカチオンのホフマイスター系列におけるそれらの特異的位置によって選択される。特に、ホフマイスター系列のタンパク質安定化末端のイオンが本発明の保存溶液に含まれる。適したイオンおよび選択基準を以下に詳細に記載する。一つの実施態様において、第一の中性溶質は二糖類か三糖類かのどちらかであり、好適にはラフィノース、トレハロース、スクロース、ラクトースおよびそれらの類似体からなる群から選択される。類似体は天然に存在するものでも合成物でもよい。第二の中性溶質は好適にはトリメチルアミノオキシド(ＴＭＡＯ)、ベタイン、タウリン、サルコシン、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシトールおよびこれらの類似体からなる群から選択される。本発明の溶液は硫酸ナトリウムおよびカルシウムを含むことができ、カルシウムは好適には硫酸カルシウムとして約１.５ｍＭ〜約２.０ｍＭ濃度、最も好適には約１.７５ｍＭ濃度で存在する。生物学的物質の保存のための好適溶液は、保存すべき特定の生物学的物質に依存するが、ラフィノースとＴＭＡＯ、またはトレハロースとＴＭＡＯのどちらかを含む溶液が多くの生物学的物質の保存において特に効果的であることがわかった。一つの実施態様において、本発明による溶液はラフィノースおよびＴＭＡＯを約１.４：１〜約１.８：１の比、より好適には１.６：１の比で含む。好適には本発明の溶液は約６０％と約８０％との間のラフィノースとＴＭＡＯ、約４０％と約２０％との間の硫酸ナトリウム、および約１.５ｍＭと約２.０ｍＭとの間の硫酸カルシウムを含み、ラフィノースおよびＴＭＡＯは約１.６：１の比で存在する。最も好適には、溶液は約７０％のラフィノースおよびＴＭＡＯ、約３０％の硫酸ナトリウム、そして約１.７５ｍＭ硫酸カルシウムを含み、ラフィノースおよびＴＭＡＯは約１.６：１の比で存在する。第二の実施態様では、溶液はトレハロースおよびＴＭＡＯを約１.１：１〜約１.４：１の比で、最も好適には１.３：１の比で含み、硫酸カルシウムが添加される。本発明の保存溶液の重量オスモル濃度は保存すべき生物学的物質によって変化し、哺乳動物の生物学的物質には約０.２８〜約０.３２ＯｓＭの重量オスモル濃度が好ましく、植物の生物学的物質には約７０〜約８０ｍＯｓＭの重量オスモル濃度が好ましく、海洋の生物学的物質には約０.９〜約１.０ＯｓＭの重量オスモル濃度が好ましい。関連する面において、本発明は、本発明の保存溶液の脱水および濃縮形を提供する。このような形は粉末または錠剤のような固体でもよいし、液体でもよい。また別の面において、本発明は哺乳動物、植物および海洋物質を含める生物学的物質の保存法であって、生物学的物質を１つ以上の本発明の溶液と接触させることを含んでなる方法を提供する。もう一つの面において、白血病の治療法が提供され、その方法は患者から骨髄を取り出し、その骨髄を本発明の保存組成物または溶液と少なくとも約３日間接触させて骨髄から白血病細胞を浄化し、その浄化した骨髄をその対象（患者）に戻すことを含んでなる。以下に詳述するように、本発明の溶液および方法を用いて、細胞、組織および器官などの生物学的物質の生存率能力を、従来の保存方法で一般的に可能な時間よりも長時間維持し、それによって、臓器移植および骨髄移植のような用途に用いるための生物学的物質の改善された保存および運搬時間を提供する。本発明の保存方法は生物学的物質の保存のために用いられる多くの一般的方法よりも複雑でなく、そのため経費は減少し、使用し易さおよび保存操作の利用可能性が高められる。さらに、本発明の組成物は低毒性で、移植臓器のような生物学的物質を患者に戻す場合、不都合な副作用がほとんどない。下記のより詳細な説明を参照し、添付の図面に関連づけて読むことによって、本発明の、上記およびその他の特徴、およびそれらを得る方法は明らかになり、本発明を最もよく理解することができる。図面の簡単な説明図１Ａ、ＢおよびＣは、１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むスクロースおよび種々のクラスＩＩ溶質の水溶液に、４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後のマウス胚の生存を示す。図２Ａ、ＢおよびＣは、１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むラクトースおよび種々のクラスＩＩ溶質の水溶液に、４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後のマウス胚の生存を示す。図３Ａ、ＢおよびＣは、１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むトレハロースおよび種々のクラスＩＩ溶質の水溶液に、４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後のマウス胚の生存を示す。図４Ａ、ＢおよびＣは、１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むラフィノースおよび種々のクラスＩＩ溶質の水溶液に、４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後のマウス胚の生存を示す。図５Ａ、ＢおよびＣは、１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含む、ＴＭＡＯに対するラフィノースの種々のモル比の水溶液に、４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後のマウス胚の生存を示す。図６は、４℃で２および３日間、ラフィノース／ＴＭＡＯ中に保存後のマウス胚生存のＣａ²⁺依存性を示す。図７（ｉ）Ａ、ＢおよびＣは１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むラフィノース／ＴＭＡＯとＮａ₂ＳＯ₄との混合物中に、４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後のマウス胚の生存を示す。図７（ｉｉ）は、種々の重量オスモル濃度の溶液７０／３０中に１、２、３および４日間保存した後のマウス胚の生存の平均値およびＳＥＭを示す。図８Ａ、ＢおよびＣは、ＰＢＳ中５、１０または１５ｍＭ酪酸ナトリウムで、室温にて１０、２０または３０分間前処理した後、溶液７０／３０に４℃でそれぞれ１、２および３日間保存後、後期胞胚期に達するマウス胚のパーセントを示す。図８Ｄ、ＥおよびＦは、ＰＢＳ中５、１０または１５ｍＭ酪酸ナトリウムで室温にて１０、２０または３０分間前処理した後、溶液７０／３０に４℃でそれぞれ１、２および３日間保存した後に生存率しているマウス胚のパーセントを示す。図９は、ＰＢＳ中７０ｍＭ酪酸塩て前処理し、または前処理せずに、ＰＢＳ、ラフィノース／ＴＭＡＯ(比１.６：１)、または溶液７０／３０中に４℃で保存した後のマウス胚の生存を示す。図１０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＰＢＳ中２５ｍＭ酪酸ナトリウムで５、１０または１５分間前処理した後、１、２、３および４日間、溶液７０／３０中に保存した後のマウス胚の生存を示す。図１１は、血漿、またはＣａ²⁺を含有しない溶液７０／３０のどちらかに、４ ℃で保存した後の血小板の生存を示す。図１２Ａ、ＢおよびＣは、患者１から得た骨髄をハンクス緩衝食塩溶液、ラフィノース／ＴＭＡＯ、トレハロース／ベタインまたは溶液７０／３０のいずれかに保存した後の、その骨髄中のＣＤ４５−およびＣＤ３４−陽性細胞およびコロニー形成単位の数をそれぞれ示す。図１３Ａ、ＢおよびＣは、患者２から得た骨髄を１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むラフィノース／ＴＭＡＯ中またはＭ−２中に４℃で保存した後の、骨髄中のコロニー形成単位、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−陽性細胞のパーセントをそれぞれ示す。図１４ＡはＰＢＳまたは溶液７０／３０中に４℃または−８０℃で保存したネズミ骨髄細胞の回収パーセントを示す。図１４Ｂは、溶液７０／３０中に−８０ ℃で８日間保存後に解凍したネズミ骨髄細胞を注射し、その後８日目に致死量を照射したマウスの脾臓に見いだされる細胞コロニー数を示す。図１５は溶液７０／３０に４℃で４時間保存した後のラット心臓における圧力変換器からの曲線を示す。図１６は、生理食塩液または本発明の保存溶液に４℃で４８時間まで保存した後、トリチウム化チミジンの取り込みによって評価したジュルカット細胞（急性Ｔ−細胞白血病）の増殖を示す。図１７は、生理食塩液または本発明の保存溶液に４℃で４８時間まで保存した後、トリチウム化チミジンの取り込みによって評価したＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞の増殖を示す。図１８は、ＰＢＳおよび本発明の種々の保存溶液に４℃で保存後のネズミ骨芽細胞の融合に至る増殖を示す。図１９はＰＢＳまたは溶液７０／３０に保存後の、ネズミ角膜細胞系統Ｔ７Ｔの回収パーセントを示す。図２０はＰＢＳまたは溶液７０／３０に保存後の、ネズミ３Ｔ３線維芽細胞の回収パーセントを示す。詳細な説明本発明の溶液および方法は哺乳動物、植物および海洋細胞、細胞系、組織および器官を含める生物学的物質の保存に用いることができる。生物学的物質を保存するとき、その材料が保存から元に戻すとき正常な生物学的活性を取り戻すことができるように、その生存能力はインビトロで長期間維持される。そのため保存中、生物学的物質は可逆的休眠状態に維持され、代謝活性は正常時より実質的に低い。例えば、保存中において心臓は拍動の停止が認められる。本発明を用いて保存できる哺乳動物の生物学的物質の例は、心臓のような器官、細胞および組織、例えば造血幹細胞、骨髄、胚、血小板、骨芽細胞、***、そして組織培養で確立された種々の動物細胞系統を含める。ヒト生物学的物質の保存に加えて、本発明の溶液および方法は獣医学的用途にも、植物組織の保存にも用いることができる。本発明の保存溶液は使用するばかりになった形でも、または使用前に水で希釈する濃縮形、例えば粉末または錠剤などの固体でもよい。本発明の溶液は使用者が希釈する濃縮液体形でもよい。従来の保存溶液のように、本発明の溶液も無菌である。本発明の溶液は保存すべき生物学的物質と実質上等張である。等張溶液中の細胞は収縮も膨張もしない。本発明の保存溶液は保存すべき生物学的物質の重量オスモル濃度と実質的に等しい重量オスモル濃度を有するが、これは本発明の要求事項ではない。なぜならば若干の溶液は、その溶液の重量オスモル濃度を高めるが半透膜を自由に通過できて、そのため細胞膜の両側で等しく浸透圧を高める１種類以上の成分を含むことができるからである。以下に詳述するように、咄乳動物の生物学的物質の保存溶液では約０.２８ＯｓＭと約０.３２ＯｓＭとの間の重量オスモル濃度が好ましいことが確認されている。海洋および植物の生物学的物質の保存には、それぞれ約０.９〜約１.０ＯｓＭの重量オスモル濃度および約７０〜約８０ｍＯｓＭの重量オスモル濃度が好ましい。１価のオキシアニオン類、例えばＨ₂ＰＯ₄ ^-、ＨＣＯ₃ ^-、ＮＯ₃ ^-およびＨＳＯ₄ ^- などの混入は保存中の代謝活性レベルを高めることが認められた。例えばＨＳＯ₄ ^-の混入はラット心臓をゆっくりと、弱く拍動させるが、１価のオキシアニオン類が存在しないと拍動は起きないことが認められた。大部分の用途では、本発明の保存溶液には１価オキシアニオン類は排除される。本発明の溶液は、少なくとも約３３５の分子量と、少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質(以後、クラスＩ溶質と呼ぶ)および約２００未満の分子量を有する第二の中性溶質(以後、クラスＩＩ溶質と呼ぶ)とを含んでなり、第二の中性溶質は付加的に親水性および疎水性の両部分を有する。クラスＩ溶質は通常細胞膜を通過するには大きすぎ、主として本発明の溶液の重量オスモル濃度を高めるように作用する。好適にはクラスＩ溶質は二糖類または三糖類である。そのような溶質の例としてはラフィノース、トレハロース、スクロース、ラクトースおよびこれらの合成または天然の類似体がある。ラフィノースおよびトレハロースが好適クラスＩ溶質である。クラスＩＩ溶質は通常細胞膜を横切らないが、浸透圧的変動（ｉｎｓｕｌｔ）に応答して細胞に活発に取り込まれる。それらは細胞内オスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）として多くの細胞に用いられる。このような溶質の例としてはＴＭＡＯ、ベタイン、タウリン、サルコシン、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトールおよびイノシトールおよびそれらの合成または天然の類似体がある。ＴＭＡＯは多くの生物学的物質のための好適なクラスＩＩ溶質である。ラフィノースおよびＴＭＡＯは好適には約１.４：１〜約１.８：１のモル比、最も好適には約１.６：１のモル比であり、トレハロースおよびＴＭＡＯは好適には約１.１：１〜約１.４：１のモル比、最も好適には約１.３：１のモル比が生物学的物質の保存のために特に有用であることがわかった。本発明の溶液はさらに１種類以上のイオンを含むことができるが、１価のオキシアニオンおよびヨウ化物は実質上含まない。保存溶液にはＣａＳＯ₄のようなカルシウムイオンが約２ｍＭ未満の濃度で多くの用途に用いられる。その他のイオン種はアニオンおよび／またはカチオンのホフマイスター系列におけるそれらの特徴的位置によって選択することができる。アニオンおよびカチオンのホフマイスター系列はタンパク質および膜の安定性を減少させるようにランクづけされている（ホフマイスター、エフ.）、「塩類の効果の理解について。第２報。塩類の沈殿効果の規則性およびそれらの生理的挙動との関連性。」Naunyn-Schmied ebergs Archiv Fuer Experimentalle Pathologic und Pharmakologic （ライプチッヒ）１４巻、２４７−２６０ページ、１９８８；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｄ.）およびウォッシャボー(Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｗ.)、「ホフマイスター効果および界面における水の挙動。」Quarterly.Rev.Biophys.１８巻、３２３−４２２ページ、１９８５)。アニオンの順位は次のようである。クエン酸塩＞酢酸塩＞リン酸二水素塩＞硫酸塩＞ヒドロキシル＞フッ化物＞塩化物＞臭化物＞ヨウ化物＞リン酸水素塩＞炭酸水素塩＞硫酸水素塩＞硝酸塩。カチオンの順位は次のようである。テトラメチルアンモニウム＞アンモニウム＞セシウム＞ルビジウム＞カリウム＞ナトリウム＞リチウム＞カルシウム＞マグネシウム。１価オキシアニオン類およびヨウ化物を除くイオン類はそれらの順位とは関係なく、本発明の保存溶液に約２ｍＭ未満の濃度で含むことができる。約２ｍＭより大きいイオン濃度では下記の選択基準が適用される。（ｉ）塩化物の左側の各アニオンがナトリウムまたはナトリウムの左側のカチオンと結合して中性塩になる。（ｉｉ）塩化物の右側のアニオンは除外される。そして、（ｉｉｉ）ナトリウムの右側のカチオンは塩化物のみと結合できる。保存溶液に用いるための特に好適なイオンは、カリウム、テトラメチルアンモニウム、アンモニウム、セシウムおよびクエン酸塩を含む。マグネシウムも約２ｍＭ未満の濃度では好適カチオンである。以下に詳細に述べるように、血小板を除き、生物学的物質の有効保存時間は、保存組成物にカルシウムを添加すると増加することが確認されている。これはおそらく、細胞膜に見いだされるホスホリピド二重層をカルシウムが安定化し、細胞間付着を安定化するためであろう。好適にはカルシウムは硫酸カルシウムとして存在し、１.５ｍＭ〜約２.０ｍＭの濃度、最も好適には１.７５ｍＭの濃度で存在する。硫酸ナトリウムの添加も多くの生物学的物質の有効保存時間を延長する。約６０％〜約８０％、好適には約７０％のラフィノースおよびＴＭＡＯ、約４０％〜約２０％、好適には約３０％の硫酸ナトリウム、および約１.７５ｍＭ硫酸カルシウムを含んでなり、ラフィノースとＴＭＡＯとが約１.６：１の比で存在することを含む組成物が多くの生物学的物質の保存に特に有効であることがわかった。本発明の組成物に含まれるその他の成分としては、微生物をコントロールする抗生物質、および胚などの生物学的物質の表面への付着を阻止するためのタンパク質、例えばウシ血清アルブミンなどがある。幾つかの用途、例えば心臓の保存などでは、保存溶液を使用前に酸素で飽和してもよい。理論によって束縛されたくはないが、発明者は、本発明の保存溶液がイオンチャンネルの開口を阻止し、それによって細胞を休眠状態に維持することによって、細胞膜を通って運ばれる外部刺激シグナルから細胞を分離すると考える。保存すべき生物学的物質を標準的技術を用いて取得し、本発明の水性保存溶液に接触させ、好適には浸漬する。生物学的物質は、もし必要ならば、浸漬前にその保存溶液ですすいでもよい。生物学的物質は凍結する手前の温度で保存してもよいが、材料は約４℃の温度で保存するのが便利である。保存後、保存溶液を材料から除去し、標準食塩水を基礎とした培地に置き換えるか、または保存した材料を保存溶液に入れたまま直接用いてもよい。生物学的物質を凍結温度より低い温度で保存するとき、熟練した当業者には公知の方法に用いられるように、有効濃度の凍結防止剤をその保存溶液に加えることもできる。本発明の溶液はこうして生物学的物質の長期保存にも短期保存にも用いることができる。以下の例２に詳述するように、例えば胚のようないくつかの生物学的物質の保存時間はクラスＩＩ溶質または酪酸ナトリウムのどちらかによる前処理によって増加してもよい。下記の例は説明のためのものであって、制限するものではない。例１マウス胚の保存における本発明の溶液の有効性を以下に記載のように試験した。胚は速やかに***する細胞からなるから、それらを停止させるのは難しく、したがって保存溶液の感度テストを提供する。胚は、保存中の生存を、保存１〜５日後の培養時における孵化能力によって評価することができるという長所も有する。生育可能のマウス胚をＰＢＳ中、またはラフィノース、トレハロース、スクロースまたはラクトース（クラスＩ溶質）のいづれかと、トリメチルアミンオキシド(ＴＭＡＯ)、ベタイン、タウリン、サルコシン、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシトールおよびタウリン（クラスＩＩ溶質）からなる群から選択される溶質との水溶液(クラスＩＩ溶質に対するクラスＩ溶質の比が１.６：１)中で、４℃で１、２または３日間保存した。各クラスＩ／クラスＩＩ溶液は１.７５ｍＭ濃度の硫酸カルシウムも含んでいた。それら溶液は０.１〜１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２５ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンも含んでいた。すべての試薬はシグマケミカル社（セントルイス、エムオー）から入手した。胚の生存はその後のダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、ライフテクノロジー、グランドアイランド、ニューヨーク）における培養によって評価し、保存後に存在する生きている胚の数、および３７℃で４８時間培養後に孵化した胚の数としてあらわした。これらの実験結果を、スクロース、ラクトース、トレハロースおよびラフィノースの溶液についてそれぞれ図１〜４に示す。ここでＨＢ＋ＬＢは、孵化した、または後期胞胚段階に達している胚のパーセントをあらわす。ほとんどの溶質の組み合わせで１日保存後、高い割合で胚が孵化したが、３日間保存後は、高い割合で孵化がみられたのはラフィノース、トレハロースまたはスクロースとＴＭＡＯとの組み合わせのみであった。ラフィノースが最良のクラスＩ溶質で、ＴＭＡＯが最良のクラスＩＩ溶質であることが分かった。トレハロースおよびベタインはそれぞれ二番目に良いクラスＩおよびクラスＩＩ溶質であった。マウス胚の保存のためのクラスＩ／クラスＩＩ溶液の最適な総重量オスモル濃度は０.３０ＯｓＭであることがわかった。クラスＩおよびクラスＩＩ溶質の最良の３つの組み合わせをその後再試験し、クラスＩＩ溶質に対するクラスＩ溶質の最適モル比を決定した。これら３つの溶質のうちで、ラフィノース：ＴＭＡＯ、モル比１.６：１、において胚の生存率が最も高かった(図５参照)。二番目に高い生存率はトレハロース：ＴＭＡＯのモル比１.３：１で得られた。三番目に高い生存率はラフィノース：ベタインのモル比１.４：１で得られた。ＴＭＡＯに対するラフィノースのモル比（１.６：１）および種々の濃度のＣａ²⁺を含む溶液に保存後、孵化した胚のパーセントを図６に示す。胚の保存のためにはＣａ²⁺が非線型濃度依存的に必要であることか判明した。その後は、すべての溶液および大部分の生物学的物質に１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を用いた。一つの例外は分離した血小板で、それはＣａ²⁺のない溶液中で最も良く生存率することが判明した。１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含むラフィノース／ＴＭＡＯ（１.６：１）溶液の異なる量を、１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄を含む０.３０ＯＳＭのＮａ₂ＳＯ₄溶液と混ぜ合わせた。これらの溶液中で、１、２および３日間保存後に培養して孵化するマウス胚のパーセントを図７（ｉ）Ａ、ＢおよびＣにそれぞれ示す。孵化した胚の最高パーセントは７０％ラフィノース／ＴＭＡＯ(１.６：１)、３０％Ｎａ₂ＳＯ₄および１.７５ｍＭのＣａＳＯ₄の時に得られた(以後は「溶液７０／３０」と表す)。図７（ｉｉ）は種々の重量オスモル濃度の溶液７０／３０に保存した後の胚の生存を示す。最適重量オスモル濃度は３００ｍＯｓＭに近いが、特に重要ではないと思われる。その後、溶液７０／３０を多くの用途に用い、骨髄幹細胞、心臓、赤血球および骨芽細胞に対して、最も有効な保存溶液であることが証明された。Ｃａ²⁺を含まない溶液７０／３０は血小板の保存に最も有効な溶液であることがわかった。例２下に記すように、保存中のマウス胚の生存は、クラスＩＩ溶質または酪酸ナトリウムで前処理することによって、著しく高まることが判明した。マウス胚を酪酸ナトリウムかクラスＩＩ溶質と共に、室温、３０℃または４℃ でインキュベートし、その後溶液７０／３０中、４℃で５日間まで保存した。室温における酪酸ナトリウム濃度（５〜７０ｍＭ）および前処理時間（５〜３０分間）の多くの異なる組み合わせにより保存時間は著しく改善された。酪酸ナトリウムをＰＢＳ中で同濃度の塩化ナトリウムに置き換えた。図８Ａ、Ｂ、およびＣは、５、１０または１５ｍＭ程度の酪酸ナトリウムで１０、２０または３０分間前処理した後に、１、２および３日間それぞれ保存したマウス胚の孵化パーセントを示す。図８Ｄ、ＥおよびＦは、５、１０または１５ｍＭの濃度の酪酸ナトリウムで１０、２０または３０分間前処理した後に、１、２および３日間それぞれ保存した後、生きているマウス胚のパーセントを示す。酪酸ナトリウムによる前処理で、溶液７０／３０に３日間保存した後、８０％の胚が孵化した。高濃度の酪酸ナトリウムで前処理した後に、溶液７０／３０に５日間保存した後、胚の７０％までが孵化した。これに対し前処理しない場合は２％の孵化であった(図９参照)。前処理せずにＰＢＳに保存した胚は３日間より長くは生き続けなかった。酪酸塩を含まないＰＢＳで胚を前処理すると、胚のかなりの損失が起きた。図１０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、室温にて２５ｍＭの酪酸ナトリウムで５、１０または１５分間前処理した後に、溶液７０／３０中に４日間まで保存した後のマウス胚の生存を示す。例３全血の保存における溶液７０／３０の効果を下記に詳述するように試験した。全血を血漿、Ｃａ²⁺を含有する溶液７０／３０またはＣａ²⁺を含有しない溶液７０／３０で１：１の容量比にて希釈し、４℃で２８日間まで保存した。クエン酸塩を基礎とした抗凝固溶液の存在する場合は、血小板が１８日で最初の数の約３０％に減少した。抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いた場合、血小板数はＣａ²⁺を含有しない溶液７０／３０中では正常範囲にとどまり、すなわち約６０％に近い生存率であったが、Ｃａ²⁺を含有する溶液７０／３０または血漿中では正常範囲にはなかった。同じ試験で、クエン酸塩を基礎とした抗凝固剤の存在下における白血球の生存は血小板の生存よりもわずかに高かった。血液をＥＤＴＡを含むバッグに集め、Ｃａ²⁺を含有する溶液７０／３０で１：１（容量比）に希釈し、１８日間保存したとき、Ｃａ²⁺を含有しない溶液７０／３０または血漿に保存した場合と比較して、最も高い生存率が得られた。これは白血球保存のために必要なＣａ²⁺の代わりとなり、そしてクエン酸塩の有害作用を回避した。例４この例は、分離した血小板の保存における本発明の保存溶液の効果を示すものである。血液をＥＤＴＡ中に集め、標準的な遠心分離法を用いて血小板を分離した。最終的な血小板に富んだペレットを５０ｍｌの血漿またはＣａ²⁺を含有しない溶液７０／３０で希釈した。図１１は、４℃で２８日保存後に血小板の８０％が生き残っていることを示す。保存後のこの生存率は、血漿中に保存した場合より明らかに良く、血小板を一般的保存で２１℃に５日間保存した場合よりもかなり良かった。血液をＥＤＴＡ中に集め、クエン酸塩を避け、同時にＣａ²⁺を含有しない溶液７０／３０中に４℃で保存する方法がすぐれていることは非常に明らかである。例５この例は骨髄保存のための本発明の溶液の効果を示すものである。異なる患者２名から骨髄をヘパリン中に集め、本発明の溶液または標準生理的食塩液（ハンクス緩衝食塩溶液（ＨＢＳＳ）または食塩水を基礎とするネズミ培養培地(Ｍ−２)）で１：１（容量比）に希釈した。骨髄を４℃で２８日までの期間保存し、そのときに白血球数および生存率能力、コロニー形成単位数、およびＣＤ３４およびＣＤ４５細胞の数を測定した。図１２Ａ、ＢおよびＣは患者１から取得し、本発明の溶液に２８日間まで保存した骨髄のＣＤ−４５陽性およびＣＤ−３４陽性細胞およびコロニー形成単位の数をそれぞれ示す。図１３Ａ、ＢおよびＣは、患者２から取得し、４℃で保存溶液および対照溶液に保存した骨髄の、コロニー形成単位、ＣＤ４５−陽性およびＣＤ３４−陽性細胞の数をそれぞれ示す。ラフィノース／ＴＭＡＯはモル比１. ６：１で、トレハロース／ベタイン溶液はモル比１.４：１であった。溶液７０／３０は骨髄幹細胞の保存に特に有効で、コロニー形成単位、ＣＤ４５およびＣＤ３４−陽性細胞の数は対照溶液のいずれと比較しても非常に高く、相対的な改善は時間と共に増加した。図１３Ａ、ＢおよびＣは、コロニー形成単位、ＣＤ３４−陽性細胞およびＣＤ４５−陽性細胞の数が、溶液７０／３０に保存後、食塩液培地Ｍ−２に保存後と比較して非常に高いことを証明している。骨髄を凍結せずに２〜３週間保存できることは、骨髄移植において特に好都合である。それは、凍結防止のためのＤＭＳＯの使用に関連した毒性を回避し、再注入前の全身照射などの治療法のための時間を与えるからである。例６ネズミ骨髄細胞の保存のための本発明の溶液の効果を下記のように測定した。ネズミ骨髄を溶液７０／３０またはＰＢＳ中に直接取得した。その溶液を４℃ または−８０℃で保存した。図１４Ａは、４℃で溶液７０／３０に保存したネズミ骨髄が１４日後に２８％の回収を示し、４℃でＰＢＳに１４日間保存した骨髄細胞は生き残っていなかったことを示す。溶液７０／３０中で−８０℃で凍結した骨髄は８および１４日後に２０％の回収を示したが、ＰＢＳに−８０℃で保存した骨髄細胞は２、６、８および１４日間まで生き残らなかった。図１４Ｂは、ネズミ骨髄を溶液７０／３０中で−８０℃で８日間凍結し、解凍し、それから致死量（１０００Ｒ）を照射した同系マウスに注射したとき、注射後８日目に分析した結果脾臓コロニーが生成していたことを示す。５０，０００の骨髄細胞を注射したマウスには１６個のコロニーが生成し、１０，０００の細胞を注射したマウスには４個のコロニーが生成し、２０００の骨髄を注射した１匹のマウスには２個のコロニーが生成した。これらのデータはネズミ造血幹細胞が溶液７０／３０中、−８０℃の凍結下で８日間生きており、インビボ脾臓コロニー形成特性を保有することを示す。例７心臓の保存のための本発明の溶液の効果を下記のように測定した。ラット心臓を外科的に摘出し、４℃にて溶液７０／３０またはラフィノース／ＴＭＡＯ（モル比１.６：１）を大動脈を通して潅流した。その間心拍数は約３００拍動／分から約１８０拍動／分に低下した。次に、心臓を同じ溶液に４〜２４時間保存した。その間心臓は拍動を停止した。心臓にその後カニューレを取り付け、クレプス溶液を再潅流した。そのクレプス溶液は最初は室温でその後２０分間かけて３７℃まで高めた。潅流溶液を重力のみで供給したとき、保存４時間後の心臓の回復は優れており、心拍数も発生した圧力も正常範囲であった(心拍数１７０拍動／分、圧力９８ｍｍＨｇ、図１５参照)。潅流にポンプを用いたときは変動する結果が得られた。通常、ポンプによって心臓にかかる圧力はダメージを与え、そのダメージは非可逆的であることが多いことが判明した。４時間より長時間の保存を実現するには、心臓をクレプス溶液中２５ｍＭのタウリンで、３８℃にて１０分間前処理し、その後***液７０／３０またはラフィノース／ＴＭＡＯで潅流し、４℃で保存した。最初の潅流および再潅流を重力のみで行ったとき、２４時間保存した心臓は正常範囲の心拍数および正常レベルの約半分の圧力を回復した。その後の実験は、約０.２ｍＭのタウリンを保存溶液に加えることによって、タウリンによる前処理を行わずにすみ、内因性タウリンの流出を防止できた。本発明の保存溶液を用いて得られた結果は、冷食塩水を基礎とした培地に保存する先行技術と好ましい比較を示す。その際心臓は、許容不可能な生物学的機能の低下により５時間以内しか保存できない。心臓を劣化させずに２４時間保存することは、移植のために心臓を世界的規模で輸送する時間を与えるであろう。例８種々の腫瘍細胞系統、例えばヒトリンパ性白血病のジュルカートおよびＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞系統などの保存のための本発明の溶液の効果を、上記の例５および６においてヒト骨髄の保存のために試験した溶液を用いて試験した。骨髄前駆細胞とは異なり、腫瘍細胞系統は本発明の溶液中で完全に細胞が死ぬまでたった２日しか生きていなかった(図１６および１７)。このように、本発明の保存溶液に骨髄を３日間より多く保存すると、骨髄から白血病細胞が浄化され、一方骨髄の生存率能力は維持される。例９本発明の溶液の骨芽細胞の保存効果を下記に示した。マウス骨芽細胞を細かく切り、Ｄ−ＭＥＭ培養培地において３８℃で融合近くまで増殖させた。それらをその後Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含有しないリン酸緩衝食塩水中でトリプシンを分散し、Ｄ−ＭＥＭに再接種した。さらに培養後、培地を吸引によって除去し、下記の溶液の１つに置き換えた。ＰＢＳ、ベタイン、ガラクトース、ソルビトール、マンノース、トレハロース、ラフィノース、ラフィノース／ＴＭＡＯ(比１.６：１)、ラフィノース／ベタイン（比１.６：１）トレハロース／ＴＭＡＯ（比１.６：１）およびトレハロース／ベタイン(比１.６：１) 。４℃で種々の時間保存した後、保存溶液を吸引により除去し、Ｄ−ＭＥＭに置き換えた。その後骨芽細胞が融合に至るまで増殖したものを保存の成功とした。図１８に示すように、骨芽細胞は本発明の溶液中の保存では、ＰＢＳの場合より非常に長時間生き残った。骨芽細胞は重量オスモル濃度の変動に対し、胚に比べてよりよく耐えることが判明した。例１０ネズミＴ７Ｔケラチノサイト腫瘍細胞系統の保存における本発明の溶液の効果を下記のように試験した。５％血清を補充したＤ−ＭＥＭ中で増殖しているＴ７Ｔの付着性培養物から培養培地を吸引によって除去し、ＰＢＳまたは溶液７０／３０に置き換え、４℃で保存した。４、７、１２および１４日後、これらの溶液を除去し、付着性細胞をトリプシン処理によって取り出し、回収率を測定した。図１９は、Ｔ７Ｔ細胞がＰＢＳ中では生き残らず、溶液７０／３０中では１４日間保存後、生きているＴ７Ｔ細胞が回収されたことを示す。例１１ネズミ３Ｔ３線維芽細胞の保存における本発明の溶液の効果が次のように証明された。５％血清を補充したＤ−ＭＥＭ中で増殖した３Ｔ３細胞の付着性培養物から培地を吸引によって除去し、ＰＢＳまたは溶液７０／３０に置き換え、４℃で保存した。１、７および１４日後、これらの溶液を除去し、付着性細胞をトリプシン処理によって除去し、回収率を測定した。図１９に示すように、ＰＢＳ中では生育可能の３Ｔ３細胞は残っていなかったが、溶液７０／３０では生育可能の３Ｔ３細胞が保存１４日後まで回収された。本発明を特別の実施形態の形で説明したが、本発明から逸脱することなく変更および改変を行うことができ、本発明は添付の請求に範囲によってのみ制限されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/34 Ａ６１Ｋ 35/34 35/36 35/36 35/60 35/60 35/78 35/78 ＹＣ１２Ｎ 1/04 Ｃ１２Ｎ 1/04 5/06 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的物質の保存溶液であって（ａ）少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と（ｂ）約２００未満の分子量を有し、親水性部分及び疎水性部分を有する第二の中性溶質とを含んでなる溶液。２．前記溶液が１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まず、前記溶液はホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からの１つ以上のイオンをさらに含む請求項１記載の溶液。３．第一の溶質が二糖類および三糖類からなる群から選択される請求項１記載の溶液。４．第一の溶質がラフィノース、トレハロース、スクロース、ラクトースおよびそれらの類似体からなる群から選択される請求項３記載の溶液。５．第二の中性溶質がトリメチルアミノオキシド、ベタイン、タウリン、サルコシン、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシトールおよびこれらの類似体からなる群から選択される請求項１記載の溶液。６．さらに硫酸ナトリウムを含んでなる請求項１記載の溶液。７．さらにカルシウムを含んでなる請求項１記載の溶液。８．カルシウムが約１.５ｍＭ〜約２.０ｍＭの濃度の硫酸カルシウムとして存在する請求項７記載の溶液。９.カルシウムが約１.７５ｍＭの濃度で存在する請求項８記載の溶液。１０．溶液が濃縮形である請求項１記載の溶液。１１．濃縮形が固体である請求項１０記載の濃縮形。１２．ラフィノースおよびトリメチルアミンオキシドを含んでなり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まない、生物学的物質の保存溶液。１３.ラフィノースおよびトリメチルアミンオキシドが約１.４：１〜約１.８：１の比で存在する請求項１２記載の溶液。１４.さらに硫酸ナトリウムを含んでなる請求項１２記載の溶液。１５．さらにカルシウムを含んでなる請求項１２記載の溶液。１６．カルシウムが約１.５ｍＭ〜約２.０ｍＭの濃度の硫酸カルシウムとして存在する請求項１５記載の溶液。１７.硫酸カルシウムが約１.７５ｍＭの濃度で存在する請求項１６記載の溶液。１８．約６０％〜約８０％のラフィノースおよびＴＭＡＯ、約４０％〜約２０％の硫酸ナトリウム、ならびに約１.７５ｍＭの硫酸カルシウムを含んでなり、ラフィノースおよびＴＭＡＯが約１.６：１の比で存在する、生物学的物質の保存溶液。１９.約７０％のラフィノースおよびＴＭＡＯ、ならびに約３０％硫酸ナトリウムを含む請求項１８記載の溶液。２０．トレハロースおよびトリメチルアミンオキシドを含み、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まない生物学的物質の保存溶液。２１．トレハロースおよびトリメチルアミノオキシドが約１.１：１〜約１.４：１の比で存在する請求項２０記載の溶液。２２．トレハロースおよびトリメチルアミンオキシドが約１.３：１の比で存在する請求項２０記載の溶液。２３．さらにカルシウムを含む請求項２０記載の溶液。２４．カルシウムが約１.５ｍＭ〜約２.０ｍＭ濃度の硫酸カルシウムとして存在する請求項２３記載の溶液。２５.硫酸カルシウムが約１.７５ｍＭの濃度で存在する請求項２４記載の組成物。２６．生物学的物質と実質的に等張てあり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まない、生物学的物質の保存溶液。２７．哺乳動物の生物学的物質の保存溶液であって（ａ）少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と（ｂ）約２００未満の分子量を有し、親水性部分及び疎水性部分を有する第二の中性溶質とを含んでなり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まず、ホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からの１つ以上のイオンをさらに含み、さらに約０.２８〜約０.３２ＯｓＭの重量オスモル濃度を有する保存溶液。２８．植物性生物学的物質の保存溶液であって（ａ）少なくとも約３４２の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と（ｂ）約２００未満の分子量を有し、親水性部分及び疎水性部分を有する第二の中性溶質とを含んでなり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まず、ホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からの１つ以上のイオンをさらに含み、さらに約７０〜約８０ｍＯｓＭの重量オスモル濃度を有する保存溶液。２９．海洋性生物学的物質の保存溶液であって（ａ）少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と（ｂ）約２００未満の分子量を有し、親水性部分及び疎水性部分を有する第二の中性溶質とを含んでなり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まず、ホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からの１つ以上のイオンをさらに含み、さらに約０.９〜約１.０ＯｓＭの重量オスモル濃度を有する保存溶液。３０．生物学的物質を溶液と接触させることを含んでなり、前記溶液は前記生物学的物質と実質的に等張であり、かつ１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まない、生物学的物質の生存能力を保存する方法。３１．溶液が、少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と、約２００未満の分子量を有しかつ親水性部分及び疎水性部分を有する第二の中性溶質とを含み、さらにホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からの１つ以上のイオンを含む請求項３０記載の方法。３２．生物学的物質が哺乳動物性、海洋性および植物性物質からなる群から選択される請求項３０記載の方法。３３.生物学的物質が哺乳動物の物質であり、溶液が約０.２８〜約０.３２ＯｓＭの重量オスモル濃度を有する請求項３２記載の方法。３４．生物学的物質が心臓、幹細胞、骨髄、胚、血小板、骨芽細胞および皮膚細胞からなる群から選択される哺乳動物の物質である請求項３２記載の方法。３５．生物学的物質が海洋性物質であり、溶液が約０.９〜約１.０ＯｓＭの重量オスモル濃度を有する請求項３２記載の方法。３６．生きている組織が植物組織であり、溶液が約７０〜約８０ｍＯｓＭの重量オスモル濃度を有する請求項３２記載の方法。３７．（ａ）対象から骨髄を取り出し（ｂ）前記骨髄を請求項１記載の組成物と少なくとも約３日間接触させ、そして諸段階を含む白血病の治療方法。３８．（ａ）生物学的物質を酪酸ナトリウムを含む溶液で前処理し、そして（ｂ）前記生物学的物質を保存溶液と接触させる諸段階を含む生物学的物質の保存方法。３９．保存溶液が生物学的物質と実質的に等張であり、１価オキシアニオン類およびヨウ化物を実質的に含まない請求項３８記載の方法。４０．保存溶液が少なくとも約３３５の分子量および少なくとも約０.３Ｍの水への溶解度を有する第一の中性溶質と、約２００未満の分子量を有しかつ親水性部分および疎水性部分を有する第二の中性溶質とを含み、さらにホフマイスター系列のタンパク質安定化末端からの１つ以上のイオンを含む請求項３９記載の方法。