【発明の詳細な説明】
ヒトインターロイキン-ljおよびそのアンタゴニスト
発明の分野
本発明は、ヒト免疫系に影響を及ぼすための組成物および方法に関する。特に
、免疫系の応答および発達を調節する、核酸、タンパク質、ならびに抗体および
他のアンタゴニストを提供する。これらの物質の診断および治療使用も開示され
る。
発明の背景
組換えDNA技法とは、一般的に、例えば宿主への導入による、引き続くプロセ
シングのために、ドナー供給源からベクターへ遺伝情報を組み込み、それによっ
て移入された遺伝情報が、新しい環境でコピーおよび／または発現される技法を
いう。普通、遺伝情報は、所望のタンパク質産物をコードするメッセンジャ-RNA
（mRNA）に由来する相補的DNA（cDNA）の形態で存在する。キャリアは、頻繁に
は、宿主での後の複製のためにcDNAを取り込む能力を有し、そして、いくつかの
場合には、実際にcDNAの発現を制御する能力を有し、これによって宿主中でコー
ドされた産物の合成を指向する、プラスミドである。
しばらくの間は、哺乳動物免疫応答が、「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連
の複雑な細胞相互作用に基づくことが公知であった。最近の研究は、このネット
ワークの内部作用への新しい洞察を提供した。多くの応答が、実際にはリンパ球
、マクロファージ、顆粒球、および他の細胞のネットワーク様相互作用のまわり
を循環することが明らかなままであるが、免疫学者らは、現在、一般的に、リン
ホカイン、サイトカイン、またはモノカインとして知られる可溶性タンパク質が
、これらの細胞相互作用の制御に重要な役割を演じるという意見を有している。
したがって、細胞調節因子の単離、特徴付け、および作用のメカニズムにかな
り興味があり、その理解は、多くの医学的異常（例えば、免疫系疾患）の診断お
よび治療における顕著な進歩を導く。
リンホカインは、明らかに、種々の方法で細胞活性を媒介する。これらは、複
雑な免疫系を作り上げる別々の細胞系統を含む非常に多数の始原細胞への、多能
性造血肝細胞の増殖、成長、および分化を支持することが示されている。細胞成
分間の適切かつ調和のとれた相互作用は、健常な免疫応答に必要である。リンホ
カインが他の薬剤と一緒に投与される場合、異なる細胞系統は、しばしば、異な
る様式で応答する。
免疫応答に特に重要な細胞系統は、２つのクラスのリンパ球を含む：免疫グロ
ブリン（その除去を行うための外来物質を認識しそしてこれに結合する能力を有
するタンパク質）を産生および分泌し得るＢ細胞、ならびにリンホカインを分泌
しそしてＢ細胞を誘導または抑制する種々のサブセットのＴ細胞および免疫ネッ
トワークを作り上げる種々の他の細胞（他のＴ細胞を含む）。これらのリンパ球
は、他の多くの細胞型と相互作用する。
別の重要な細胞系統は、マスト細胞（これは、すべての哺乳動物種で陽性には
同定されていない）であり、これは、体全体に毛細血管の近位に位置する顆粒含
有結合組織細胞である。これらの細胞は、肺、皮膚、ならびに胃腸管および尿生
殖器管で特に高濃度で見い出される。マスト細胞は、アレルギー関連疾患、特に
以下のように、アナフィラキシーにおいて中心的な役割を演じる：選択された抗
原が、マスト細胞表面のレセプターに結合した１つのクラスの免疫グロブリンを
架橋する場合、マスト細胞は、脱顆粒し、そしてアレルギー反応（例えば、アナ
フィラキシー）を引き起こすメディエーター（例えば、ヒスタミン、セロトニン
、ヘパリン、およびプロスタグランジン）を放出する。
種々の免疫疾患をより理解しそして処置するための研究は、免疫系の細胞をイ
ンビトロで一般的に維持できないことが妨げになっている。免疫学者らは、これ
らの細胞を培養することが、Ｔ細胞および他の細胞上清（多くのリンホカインを
含む種々の増殖因子を含む）の使用によって達成され得ることを発見した。
Okamuraら（1995）Nature 378:88-91は、特定のＴ細胞を誘導してインターフ
ェロンγ（IFN-γ）を産生する新しいサイトカインを記載し、このサイトカイン
はIGIFと命名されている。この因子は、マウスKupffer細胞および活性化したマ
クロフアージで同定されている。これまでに、ヒト等価物は記載されていない。
上記から、新しいリンホカインの発見および開発が、免疫系および／または造
血細胞を直接または間接的に含む広範な変性または異常状態についての新しい治
療に寄与し得ることが明らかである。特に、公知のリンホカインの有益な活性を
促進または増強するリンホカインの発見および開発は、高度に有利である。本発
明は、新しいインターロイキン組成物および関連化合物、ならびにそれらの使用
方法を提供する。
発明の要旨
本発明は、霊長類（例えば、ヒト）のインターロイキン-1γ（IL-1γ）および
その生物学的活性に関する。これは、ポリペプチド自体をコードする核酸ならび
にそれらの産生および使用の方法を包含する。本発明の核酸は、本明細書中に含
まれるクローン化相補的DNA（cDNA）配列への相同性によって、および／または
これらの核酸によって代表的にコードされるポリペプチドに適用されるIL-1γ活
性についての機能的アッセイによって部分的に特徴づけられる。免疫応答の制御
を調節または介在する方法が提供される。
本発明は、IL-1γ活性を有するタンパク質を発現し得るヒトcDNAの発見および
クローニングに部分的に基づく。等価なベクターは、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）技術および挿入物の配列を使用することによって構築され得る。
本発明は、特に、実質的に純粋な霊長類IL-1γ、霊長類IL-1γ配列を含む融合
タンパク質、霊長類IL-1γへの結合に特異的な抗体、およびヒトIL-1γまたはそ
の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
実質的に純粋なIL-1γの実施態様では、IL-lγは、配列番号２に規定されるア
ミノ酸配列内に含まれる成熟配列を含み得る。後者の配列は、代表的なシグナル
配列ではないが、コンベルターゼ様酵素によって切断されるIL-1bプロドメイン
に類似のプロ配列のように、アミノ酸１位（met）から約36位（asp）まで続くよ
うであるシグナル配列を含む。Dinarello（1994）FASEB J ．1314-1325を参照の
こと。成熟タンパク質は、約37位（tyr）で始まるべきである。あるいは、IL-1
γは、天然IL-1γとは異なる翻訳後改変パターンを示し得る。別の実施態様では
、組成物は、霊長類IL-1γおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。一般的に
、IL-1γは、Ｔ細胞またはNK細胞により、単独またはIL-12もしくはIL-2と組み
合
わせて、IFN-γの産生を誘導し得る。
本発明の融合タンパク質は、IL-1γ、または結合パートナーに共有結合される
IL-1γの実質的フラグメントを含む。１つの融合タンパク質の実施態様では、タ
ンパク質は、配列番号２の配列および／もしくは別のサイトカインまたはケモカ
インの配列を含み得る。このようなタンパク質は、88位（tyr）〜96位（met）で
の配列番号２のアミノ酸残基に対応する配列における改変を含み得；またはIL-1
γアゴニスト活性を示し得、そして37位（tyr）〜82位（ile）もしくは102位（v
al）〜191位（asn）での配列番号２のアミノ酸残基に対応する配列における置換
を含み得る。
別の融合タンパク質の実施態様では、IL-1γまたはそのフラグメントの薬物速
度論的半減期は、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン（Ig）鎖、好まし
くは定常領域（Fc）の部分）への結合によって、またはときどきPEG化(pegylati
on)と呼ばれるポリエチレングリコール（PEG）分子への結合によって、増大する
。このような融合タンパク質は、それぞれ、IL-1γ-IgおよびPEG-IL-1γと呼ば
れ得る。ポリエチレングリコール（PEG）基およびIg鎖、その一部または他のポ
リペプチドを、タンパク質に連結する方法は、当該技術分野で周知である。
例えば、サイトカインの循環半減期を増加させるための、種々のサイトカイン
への免疫グロブリン鎖由来のポリペプチドの融合を記載する、国際特許出願公開
第WO 96/18412号を参照のこと。PEGをタンパク質に結合する方法は、例えば、Da
visら（米国特許第4,179,337号）、Nakagawaら（米国特許第4,791,192号）、お
よびNiteckiら（米国特許第4,902,502号）に記載されている。
特定の抗体の実施態様では、IL-1γはヒトタンパク質であり;抗体は配列番号
２のペプチド配列に対して惹起され；抗体は精製された霊長類IL-1γに対して惹
起され；抗体はモノクローナル抗体であり；または抗体は標識される。
種々の核酸の実施態様では、IL-1γはヒト由来であり；核酸（例えば、配列番
号１）は配列番号２のペプチド配列をコードし；核酸は発現ベクターであり；ま
たは核酸はデオキシリボ核酸ヌクレオチドを含む。
本発明はまた、実質的に純粋な霊長類IL-1γ、もしくはそのフラグメント；霊
長類IL-1γを特異的に結合する抗体；またはヒトIL-1γもしくはペプチドをコー
ドする核酸を含むキットを包含する。種々のこれらのキットは、定性または定量
分析を行い得る。
本発明の別の実施態様は、細胞の生理機能または発生を調節する方法を包含し
、これは、細胞、または細胞を含む免疫系を、霊長類IL-1γのアゴニストまたは
アンタゴニストと接触させる工程を包含する。これは、接触させる工程が、IL-2
および／またはIL-12と組み合わせである方法を包含する。あるいは、本発明は
、接触させる工程が、アンタゴニスト（例えば、霊長類IL−1γに対する抗体）
との接触であり、そしてIL-2および／またはIL-12に対するアンタゴニストと組
み合わせられ得る方法を提供する。しばしば、調節することは、IFN-γ産生の調
節であり；そしてヒトIL-1γのアゴニストと接触させる工程を包含する。他の実
施態様では、調節することは、感染性疾患；ワクチン応答；アレルギー性反応；
Ｔへルパー媒介応答；またはガンの調節である。
発明の説明
本明細書に引用されたすべての参考文献は、その全体を参考として本明細書に
援用される。
本発明は、構造および生物学的の両方の特定の所定の特性を有するヒトインタ
ーロイキン分子のアミノ酸配列およびDNA配列を提供し、これは、本明細書では
ヒトインターロイキン-1γ（IL-1γ）と命名される。この分子をコードするcDNA
を、活性化ヒト単球cDNAライブラリーから得、M1と命名した。
いくつかの標準的方法が、例えば、Maniatisら（1982）Molecular Cloning ，A Laboratory Manual
，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Pr
ess；Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，（第２版）
，1-3巻，CSH Press，NY；Ausubelら，Biology，Greene Publishing Associates
，Brooklyn，NY；またはAusubelら（1987および定期的補遺）Current Protocols in Molecular Biology
，Greene/Wiley，New York；に記載または参照され、そ
のすべては、それぞれ参考として本明細書に援用される。
ヒト遺伝子の単離は、その単離を少しも確実にしない不確定を解決した。これ
らの不確定には、（1）マウスタンパク質のヒト相対物が存在するかどうか；（2
）
コード核酸配列の類似性のレベル；（3）配列中のどこに、PCRアプローチに有用
な相同性が存在するか；（4）天然のcDNA遺伝子部分を単離するために有用な供
給源を提供する発現のレベル；（5）例えば、マウス細胞を使用する発現クロー
ニングの状況において有用な、交差種生物学的活性；および(6)抗体結合に基づ
くアプローチに重要な、免疫学的抗体交差反応が含まれる。交差種単離をうまく
誘導することには、多くの他の問題が存在する。
ヒトIL-1γコードセグメントの完全なヌクレオチド配列（配列番号１）および
対応するアミノ酸配列（配列番号２）を、配列表に提供する。ヒト単離物は、マ
ウス相対物に対して相同性を示し、ヌクレオチドレベルで約71％の同一性；およ
びアミノ酸レベルで約65％の同一性である。
本明細書で使用する場合、用IL-1γは、配列番号２に示される成熟アミノ酸配
列を有するタンパク質またはペプチドセグメントを含むタンパク質、あるいはそ
の実質的フラグメントを記載するために使用される。本発明はまた、ムテインア
ゴニストまたはアンタゴニストを包含する。代表的には、このようなアゴニスト
は、約10％より低い配列相違性を示し、したがって、しばしば、１〜11倍の置換
を有する。本発明は、記載されたタンパク質の対立遺伝子および他の改変体（例
えば、天然の多型）もまた包含する。本発明は、代表的には、その対応する生物
学的レセプターに高い親和性で、例えば、少なくとも約100nM、通常は約30nMよ
り良好に、好ましくは約10nMより良好に、およびより好ましくは約３nMより良好
に、結合する。この用語はまた、ヒトタンパク質の関連の天然に存在する形態（
例えば、対立遺伝子、多型改変体、および代謝改変体）をいうために本明細書で
使用される。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列との実質的なアミノ酸配列相同性を
有するタンパク質またはペプチドを包含するが、マウスで見られる対応するIGIF
タンパク質と実質的に同じかまたはより少ないアミノ酸配列相同性を示す任意の
タンパク質またはペプチドを除外する。本発明は、比較的少ない置換（例えば、
好ましくは約３〜５未満の置換）を有する配列改変体を包含する。
実質的なポリペプチド「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも
約８アミノ酸、一般的には少なくとも10アミノ酸、より一般的には少なくとも12
アミノ酸、頻繁には少なくとも14アミノ酸、より頻繁には少なくとも16アミノ酸
、代表的には少なくとも18アミノ酸、より代表的には少なくとも20アミノ酸、通
常少なくとも22アミノ酸、より通常には少なくとも24アミノ酸、好ましくは少な
くとも26アミノ酸、より好ましくは少なくとも28アミノ酸、および特に好ましい
実施態様では少なくとも約30以上のアミノ酸の、アミノ酸残基の範囲である。異
なるタンパク質のセグメントの配列は、適切な長さの範囲にわたり互いに比較さ
れ得る。
アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、必要ならば、必要に応じてギャッ
プを導入することによって、残基適合を最適化することによって決定される。例
えば、Needlehamら，（1970）J ．Mol．Biol．48:443-453；Sankoffら，（1983）Time Warps ，String Edits，and Macromolecules:The Theory and Practice of Sequence Comparsion
の第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；およびIntelliGe
netics，Mountain View，CAからのソフトウエアパッケージ；およびUniversity
of Wisconsin Genetics Computer Group（GCG），Madison，WIを参照のこと；こ
れらのそれぞれは、参考として本明細書に援用される。これは、適合するような
保存的置換を考慮する場合に変化する。保存的置換は、代表的には、以下の群内
の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパ
ラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リ
ジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
相同アミノ酸配列は、サイトカイン配列中に天然対立遺伝子および種間改変体
を含むことを意図する。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、配列番号２
のアミノ酸配列セグメントと、50〜100％相同性（ギャップが導入され得る場合
）から60〜100％相同性（保存的置換が導入される場合）を有する。相同性の基
準は、少なくとも約70％、一般的には少なくとも76％、より一般的には少なくと
も81％、頻繁には少なくとも85％、より頻繁には少なくとも88％、代表的には少
なくとも90％、より代表的には少なくとも92％、通常少なくとも94％、より通常
には少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、およびより好ましくは少なく
とも97％、および特に好ましい実施態様では少なくとも98％以上である。相同性
の程度は、比較されるセグメントの長さによって変化する。対立遺伝子改変体
のような相同なタンパク質またはペプチドは、配列番号２に記載の実施態様とほ
とんどの生物学的活性を共有する。好ましくは、関連のポリペプチドは、多数の
このような適合するフラグメントを、例えば、少なくとも２、好ましくは３、４
、５、またはそれ以上の特異的または分類した長さを含む。
本明細書で使用される場合、用語「生物学的活性」は、抗Ｉ型または抗II型IL
-1レセプター抗体とともにまたはなしで、IL-12またはIL-2と組み合わせたIFN-
γの牌臓細胞による相乗効果誘導を、あるいは上記のヒトIL-1γと同じものまた
は多型改変体に対して惹起した抗体とのレセプター結合および交差反応性として
のさらに構造的な特性を、限定することなく記載するために使用される。
用語リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびアナログは、IL-1γまた
はIL-1γ様タンパク質に対する特徴的な細胞応答を調節する分子、ならびに、例
えば、レセプターが天然のレセプターまたは抗体である場合、リガンド−レセプ
ター相互作用のより標準的な構造的結合競合特徴を有する分子を含む。細胞応答
は、おそらく、Ｉ型またはII型IL-1レセプターとは異なる細胞レセプターへのIL
-1γの結合によって媒介される。また、リガンドは、レセプターが結合するまた
はそのアナログが結合するいずれかの天然のリガンドとして作用する分子、ある
いは天然のリガンドの機能的アナログである分子である。機能的アナログは、構
造的改変を有するリガンドであり得、あるいは適切なリガンド結合決定基と相互
作用する分子形状を有する全く関連のない分子であり得る。リガンドは、アゴニ
ストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、Goodmanら（編）（1990
）Goodman & Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics，Pergamon
Press，New Yorkを参照のこと。
合理的なドラッグデザインはまた、レセプターまたは抗体および他のエフェク
ターまたはリガンドの分子形状の構造研究に基づき得る。エフェクターは、リガ
ンド結合に応答して他の機能を媒介する他のタンパク質、またはレセプターと通
常相互作用をする他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質
と相互作用するかを決定するための１つの手段は、物理学的構造決定法、例えば
、Ｘ線結晶学または２次元NMR技法である。これらは、どのアミノ酸残基が分子
接触領域を形成するかについての指針を提供する。タンパク質構造決定の詳細な
記
載については、例えば、BlundellおよびJohnson（1976）Protein Crystallograp hy
，Academic Press，New Yorkを参照のこと。
ヒトIL-1γタンパク質は、多くの異なる生物学的活性を有する。ヒトIL-1γは
、マウスIGIFタンパク質と相同であるが、構造的差異を有する。例えば、ヒトIL
-1γ遺伝子コード配列は、マウスIGIFのヌクレオチドコード配列と、わずか約71
％の相同性を有する。アミノ酸レベルでは、約64％同一性がある。類似性のこの
レベルは、新しいIL-1γタンパク質が、他のIL-1αおよびIL-1βに関連すること
を示唆する。
マウスIGIF分子は、かなり最少に定義された生物学的活性を有する。特に、脾
臓細胞においてNK活性を増大させるIFN-γ産生を刺激する能力を有する。0kamur
aら（1995）Nature 378:88-91を参照のこと。
マウスIL-1α、IL-1β、およびIGIFの活性は、SCID牌臓細胞および精製NK細胞
において、単独で、またはIL-2もしくはIL-12との組み合わせで、IFN-γを誘導
する能力について比較されてきた。Hunterら（1995）J ．Immunol．155:4347-435
４；およびBancroftら（1991）Immunol ．Revs．124:5-xxxを参照のこと。IGIFは
、IL-1αまたはIL-1βよりもIFN-1γを刺激することに非常により強力であるこ
とが見いだされた。
IL-2で活性化したNK細胞では、IFN-γ産生は、抗IL-1β抗体の添加によってブ
ロックされる。Hunterら（1995）を参照のこと。しかし、マウスIGIFは、このブ
ロックを克服しそしてIFN-γを誘導し得る。これは、これを行い得ることが公知
の唯一のサイトカインである。さらに、インビボで、寄生虫T．Cruziで感染した
マウスへのマウスIGIFの投与は、寄生虫血症を著しく減少させる。
本発明の開示はまた、マウスIGIF分子を使用して発見された新しい活性を記載
する。本出願人らは、本明細書で特徴づけられるヒトIL-1γタンパク質と類似の
組換え手段によって産生されたマウスIGIF分子が、IFN-γを産生するようにＴ細
胞を誘導する生物学的活性を示すことを確認した。例えば、de Waal Malefytら
、de Vriesおよびde Waal Malefyt（編，1995）「Interleukin-10」Landes Co.
，Austin，TXに記載のアッセイを参照のこと。これはまた、NK細胞によってIFN-
γを適度に刺激する。しかし、上記のヒトの場合ように、IL-12との実質的相乗
作用
がある。
交差種生物学的活性は、これらのアッセイで未だ検出されておらず（例えば、
ヒト細胞におけるマウスIGIFの生物学的活性は、未だ証明されておらず）、また
ヒトIL-1γの活性も、マウス細胞で証明されていない。これは、多数の異なるポ
リペプチド鎖を含むと予測されるレセプターが、その対応するリガンドへの種特
異性を示すことを示唆する。IL-1αおよびIL-1βリガンドは両方ともヘテロダイ
マーレセプターを介してシグナルを送る。
本発明はさらに、単離された核酸またはフラグメント（例えば、このタンパク
質または密接に関連したタンパク質、またはそのフラグメントを、生物学的に活
性な対応するポリペプチドをコードするためにコードするもの）の使用を意図す
る。さらに、本発明は、生物学的に活性なタンパク質または特徴的IL-1γ活性を
有するポリペプチドをコードする単離されたまたは組換えDNAをカバーする。代
表的には、核酸は、適切な条件下で、配列番号１の核酸配列セグメントとハイブ
リダイズし得る。この生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、全長
タンパク質またはフラグメントであり得、そして代表的には配列番号２に示され
るものと高度に相同なアミノ酸配列のセグメントを有する。さらに、本発明は、
開示されたIL-1γタンパク質に相同であるフラグメントを有するタンパク質をコ
ードする、単離された核酸または組換え核酸、またはそれらのフラグメントの使
用をカバーする。単離された核酸は、5’および3’隣接でそれぞれの調節配列、
例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、および天然の遺伝
子由来の他のものを有し得る。
「単離された」核酸は、核酸、例えば、RNA、DNA、または混合されたポリマー
を意味するように本明細書で定義され、これは、実質的に純粋であり、例えば、
リボソーム、ポリメラーゼ、および起源の種からの隣接ゲノム配列のような天然
のままの配列を天然に伴う他の成分とは分離される。この用語は、天然に存在す
る環境から除去された核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローン化DNA単
離物を含み、それによりこれらは、天然に存在する組成物、および化学的に合成
されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成されたアナログとは区別さ
れ得る。実質的に純粋な分子は、完全に純粋または実質的に純粋のいずれかの分
子の単離された形態を含む。
単離された核酸は、一般的に、分子の均質な組成物であるが、いくつかの実施
態様では、不均質性（好ましくはわずかな）を含む。この不均質性は、代表的に
は、所望の生物学的機能または活性に重要でないポリマー末端または部分で見い
出される。
「組換え」核酸は、その産生方法またはその構造のいずれかによって本明細書
で定義される。産生方法、例えば、プロセスによって作製される産物に関しては
、このプロセスは、例えば、ヌクレオチド配列中にヒト介入を包含する組換え核
酸技法の使用である。代表的には、この介在は、インビトロ操作を包含するが、
特定の状況下では、より古典的な動物繁殖技法を包含し得る。あるいは、互いに
天然に隣接しない２つのフラグメントの融合を含む配列を生成することによって
作成された核酸であり得るが、天然の産物、例えば、天然の状態で見い出される
ように天然に存在する変異体を排除することを意味する。したがって、例えば、
任意の天然に存在しないべクターで細胞を形質転換することによって作成された
産物は、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して誘導した配列を含む
核酸と同様に、包含される。このようなプロセスは、しばしば、あるコドンを、
同じまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンと置換するように行われるが
、代表的には、制限酵素配列認識部位を導入または除去することによって行われ
る。
あるいは、プロセスは、例えば、融合タンパク質をコードする、普通の利用可
能な天然の形態で見られない機能の所望の組み台わせを含む単一の遺伝単位を生
成する、所望の機能の核酸セグメントとともに連結するように行われる。制限酵
素認識部位は、しばしばこのような人工操作の標的であるが、他の部位特異的標
的（例えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列、または他の有
用な特徴）が、設計によって導入され得る。同様の概念が、組換え（例えば、融
合）ポリペプチドについて意図される。これは、ダイマーリピートを含む。特に
、遺伝コード重複によって、IL-1γのフラグメントに類似のポリペプチドをコー
ドする合成核酸、および種々の異なるインターロイキンまたは関連分子（例えば
、増殖因子）からの配列の融合物が含まれる。
核酸の状況での「フラグメント」は、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的に
は少なくとも21ヌクレオチド、より一般的には少なくとも25ヌクレオチド、普通
は少なくとも30ヌクレオチド、より普通には少なくとも35ヌクレオチド、しばし
ば少なくとも39ヌクレオチド、よりしばしば少なくとも45ヌクレオチド、代表的
には少なくとも50ヌクレオチド、より代表的には少なくとも55ヌクレオチド、通
常は少なくとも60ヌクレオチド、より通常には少なくとも66ヌクレオチド、好ま
しくは少なくとも72ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも79ヌクレオチドの
、および特に好ましい実施態様では少なくとも85以上のヌクレオチドの連続する
セグメントを意味するように、本明細書中で定義される。代表的には、種々の遺
伝配列のフラグメントは、適切な長さの範囲にわたり互いに比較され得る。
IL-1γをコードする核酸は、それ自体または密接に関連するタンパク質をコー
ドする遺伝子、mRNA、およびcDNA種を、ならびに、例えば、異なる個体からの、
多型改変体、対立遺伝子改変体、または他の遺伝改変体をコードするDNAを同定
するために、特に有用である。このようなスクリーニングに好ましいプローブは
、異なる多型改変体間で保存される、または特異性のないヌクレオチドを含むイ
ンターロイキンの領域であり、そして好ましくは全長またはほとんど全長である
。他の状況では、多型改変体特異的配列は、より有用である。
本発明は、さらに、本明細書に記載の単離されたDNAと同一または高度に相同
な核酸配列を有する組換え核酸分子およびフラグメントをカバーする。特に、こ
の配列は、しばしば、転写、翻訳、およびDNA複製を制御するDNAセグメントに作
動可能に連結される。これらの追加のセグメントは、代表的には、所望の核酸セ
グメントの発現を助ける。
互いにまたは配列番号１の配列と比較した場合、相同な核酸配列は、著しい類
似性を示す。核酸における相同性についての標準は、配列比較によって当該技術
分野で一般的に使用される相同性についての基準か、またはハイブリダイゼーシ
ョン条件に基づく相同性についての基準のいずれかである。比較ハイブリダイゼ
ーション条件は、以下にさらに詳細に記載される。
核酸配列比較の状況での実質的な相同性は、セグメントまたはその相補鎖が比
較される場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列される場合に、
少なくとも約60％のヌクレオチドで、一般的には少なくとも66％、普通少なくと
も71％、しばしば少なくとも76％、よりしばしば少なくとも80％、通常は少なく
とも84％、より通常には少なくとも88％、代表的には少なくとも91％、より代表
的には少なくとも約93％、好ましくは少なくとも約95％、より好ましくは少なく
とも約96〜98％以上、および特に好ましい実施態様では約99％以上の高度なヌク
レオチドで同一である。
あるいは、実質的な相同性は、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション
条件下で、代表的には、配列番号１に由来する配列を使用して、１本の鎖または
その相補物にハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、選択的ハイブリ
ダイゼーションは、少なくとも約14ヌクレオチドの範囲にわたり、少なくとも約
55％相同性、より代表的には少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約75％、
およびより好ましくは少なくとも約90％がある場合に生じる。Kanehisa（1984）Nuc ．Acids Res．
12:203-213を参照のこと、これは参考として本明細書に援用さ
れる。上記のように、相同性比較長さは、より長い範囲にわたり得、そして特定
実施態様では、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的には少なくとも約20ヌクレ
オチド、普通は少なくとも約24ヌクレオチド、通常は少なくとも約28ヌクレオチ
ド、代表的には少なくとも約32ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約40ヌ
クレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド、およびより好ましくは少
なくとも約75〜100またはそれ以上のヌクレオチドの範囲にわたる。好ましくは
、関連する核酸は、多数のこのような適合するフラグメント、例えば、少なくと
も２、好ましくは３、４、５以上の特定のまたは類別された長さを含む。
ハイブリダイゼーションの状況での相同性をいう場合、ストリンジェント条件
は、塩、温度、有機溶媒、およびハイブリダイゼーション反応において代表的に
制御される他のパラメータのストリンジェントな組み合わせ条件である。ストリ
ンジェント温度条件は、通常、約30℃を越える、より通常には約37℃を越える、
代表的には約45℃を越える、より代表的には約55℃を越える、好ましくは約65℃
を越える、およびより好ましくは約70℃を越える温度を含む。ストリンジェント
塩条件は、通常、約500mM未満、通常は約400mM未満、より通常には約300mM未満
、代表的には約200mM未満、好ましくは約100mM未満、およびより好ましくは約80
mM未満であり、約20mM未満までさえ低くなる。しかし、パラメータの組み合わせ
は、
任意の単一のパラメータの基準よりも非常により重要である。例えば、Wetmurお
よびDavidson（1968）J ．Mol．Biol．31:349-370を参照のこと。
単離されたDNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入
、およびヌクレオチド範囲の反転によって容易に改変され得る。これらの改変は
、このタンパク質をコードする新規DNA配列、その誘導体、またはIL-1γ活性を
有するタンパク質を生じる。これらの改変された配列は、変異体タンパク質（ム
テイン）を産生するために、または改変体種の発現を増強するために使用され得
る。増強された発現は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻訳、および他の
メカニズムを包含し得る。このような変異体IL-1γ誘導体は、遺伝コード縮重を
使用するサイレント変異を含む、タンパク質またはそのフラグメントの予め決定
されたまたは部位特異的変異を包含する。
本明細書で定義される場合、「変異体IL-1γ」は、そうでなければ上記のヒト
IL-1γの相同性の定義に入るが、欠失、置換、または挿入のいずれかによって、
天然で見られるようなヒトIL-1γとは異なるアミノ酸配列を有する他のポリペプ
チドを包含する。特に、「部位特異的変異体IL-1γ」は、配列番号２の配列との
実質的な相同性を有するタンパク質を包含し、そして代表的には、本明細書に開
示された形態の生物学的活性のほとんどを共有する。
部位特異的変異部位は予め決定されるが、変異体は部位特異的である必要はな
い。ヒトIL-1γ変異誘発は、発現と連結して、遺伝子においてアミノ酸挿入また
は欠失を作成することによって達成され得る。置換、欠失、挿入、または任意の
組み合わせは、最終構築物に到達するように生成され得る。挿入は、アミノまた
はカルボキシ末端融合を包含する。ランダム変異誘発は、標的コドンで行われ得
、次いで、発現されたヒトIL-1γ変異体は、所望の活性についてスクリーニング
され得る。公知配列を有するDNAにおける予め決定された部位で置換変異を作成
する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、M13プライマー変異誘発によ
る。Sambrookら（1989）およびAusubelら（1987および定期的補遺）も参照のこ
と。
DNAにおける変異は、正常には、リーディングフレームの外にコード配列を配
置すべきではなく、そして好ましくは、ループまたはヘアピンのような二次mRNA
構造を生じるようにハイブリダイズし得る相補領域を生成しない。
BeaucageおよびCarruthers（1981）Tetra ．Letts．22:1859-1862によって記載
されるホスホルアミダイト法は、適切な合成DNAフラグメントを生成する。二本
鎖フラグメントは、しばしば、相補鎖を合成し、そして適切な条件下で鎖を一緒
にアニールすることによって、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメ
ラーゼを使用する相補鎖を付加することによってのいずれかで、得られる。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技法は、しばしば、変異誘発に適用され得る。
あるいは、変異誘発プライマーは、予め決定された部位で所定の変異を生成する
ために普通に使用される方法である。例えば、Innisら（1990編）PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications
Academic Press，San Diego,CAを参照
のこと。
上記のように、本発明は、配列が配列番号２で定義されそして上で記載される
ヒトIL-1γを包含する。対立遺伝子改変体および他の改変体も意図される。
本発明はまた、組換えタンパク質、例えば、このヒトタンパク質からのセグメ
ントを使用する異種融合タンパク質を提供する。異種融合タンパク質は、天然に
は同じ様式で正常に融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。
したがって、増殖因子のインターロイキンとの融合産物は、代表的には単一の翻
訳産物として作成される代表的なペプチド結合で融合した配列を有し、そして各
供給源のペプチド由来の特性を示す連続するタンパク質分子である。類似の概念
は、異種核酸配列に適用される。
さらに、新しい構築物は、他の関連のタンパク質、例えば、増殖因子または他
のサイトカイン由来の類似の機能的または構造ドメインを組み合わせることによ
り作成され得る。例えば、レセプター結合または他のセグメントは、種々の新し
い融合ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換」され得る。例えば、Cunnin
ghamら（1989）Science 243:1330-1336；およびO'Dowdら（1988）J ．Biol．Chem .
263:15985-15992を参照のこと。これらのそれぞれは、参考として本明細書に援
用される。したがって、特異性の新しい組み合わせを示す新しいキメラポリペプ
チドは、レセプター結合特異性の機能的連結から生じる。例えば、他の関連する
リガンド分子由来のレセプター結合ドメインは、このタンパク質または関連のタ
ンパク質の他のドメインについて付加または置換され得る。得られるタンパク質
は、しばしば、ハイブリッド機能および特性を有する。
例えば、融合タンパク質は、特定の器官への融合タンパク質の隔離を提供する
ように作用し得る標的化ドメイン、例えば、牌臓細胞に特異的に結合されそして
牌臓に蓄積するように作用するリガンド部分を含み得る。
候補融合パートナーおよび配列は、種々の配列データベース（例えば、GenBan
k，c/o IntelliGenetics，Mountain View，CA;およびBCG，University of Wisco
nsin Biotechnology Computing Group，Madison，WI）から選択され得る。
本発明は、特に、IL-1γのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するム
テインを提供する。ヒトおよびマウスIL-1γとIL-1ファミリーの他のメンバーと
の構造整列は、保存された特徴／残基、特に、βトレホイルフォールドに折り畳
まれた12β鎖を示す。Bazanら（1996）Nature 379:591を参照のこと。ヒトIL-1
γ配列との整列（シグナルペプチドのmet開始残基を使用して）は、β1（leu 41
〜val 47）、β2（val 55〜asp 59）、β3（pro 64〜asp 68）、β4（phe 83〜t
yr 88）、β5（met 96〜val 102）、β6（ser 108〜glu 113）、β7（lys 115〜
lys 120）、β8（phe 137〜pro 143）、β9（asn 147〜ser 153）、β10（phe 1
60〜glu 64）、β11（phe 170〜lys 175）、およびβ12（phe 187〜asn 191）鎖
が、マウスIGIFにおいて類似の配列に対応することを示す。Lodiら（1994）Scie nce
263:1762-1766；Sayleおよび情ilner-White（1995）TIBS 20:374-376；およ
びGronenbergら（1991）Protein Engineering 4:263-269もまた参照のこと。
IL-1αおよびIL-1βリガンドは、一次レセプターとしてIL-1レセプターＩ型を
結合し、次いでこの複合体は、III型IL-1レセプターとの高親和性レセプター複
合体を形成する。マウスIL-1γは、公知のＩ、II（デコイレセプター）、または
III型マウスIL-1レセプターに結合しない。さらに、マウスIGIF生物学的活性は
、抗Ｉ、IIまたはIII型抗体でブロックされ得ない。これは、関連のマウスIGIF
が、既に単離されたが、IGIFについてのレセプターとして同定されていない、IL
-1レセプターに関連するレセプターに結合することを示唆する。
しかし、IL-1βについての解明された構造、天然のIL-1レセプターアンタゴニ
スト（IL-1Ra）、およびIL-1Ra/IL-1レセプターＩ型の共構造は、マウスIGIFま
たはヒトIL-1γアンタゴニストをどのように作成するかを示唆する。β4鎖とβ5
鎖との間のループは、レセプターIII型への他のIL-1リガンドについての一次結
合セグメントである。IL-1αおよびIL-1βリガンドにおいて、このループは８残
基の範囲にわたるが、IL-1Raでは、このループは「切り離される」（２残基のみ
残ったままである）。したがって、IL-1Raは、レセプターＩ型に正常に結合する
が、レセプターIII型とは相互作用し得ない。これは、IL-1Raを効果的なIL-1ア
ンタゴニストにする。
これは、β4とβ5鎖との間のループへの改変が、予測可能な生物学的活性を有
する変異体を導くことを示唆する。例えば、マウスIGIF（またはEPHに対するヒ
トIL-1γの対応するKDSQPRGM）におけるKDSEVRGL（β4とβ5鎖との間の残基、β
5鎖における最初の残基を有する）のEPH（対応するIL-1Ra残基）との置換は、IG
IFアンタゴニストを生じるべきである。あるいは、マウスIGIFのKDSEVRのQGEESN
D（β4とβ5鎖との間のIL-1β残基）との置換は、III型レセプターとの相互作用
を可能にすべきである（ヒトIL-1γでは、KDSQPRをQGEESNDと置換する）。マウ
スIL-1Raとともに、マウスIL-1Ra残基のこれらのマウスIL-1β残基との置換が、
IL-1RaにおけるIL-1活性を導入することが示された（IL-1Raは、現在III型レセ
プターを結合し得る）。これは、III型レセプターがマウスIGIFによって使用さ
れ得るかどうかを確立する。
さらに、マウスIGIFのKDSEVRをFlagエピトープDYKDDDDKで置換する構築物は、
おそらく、一次IGIFレセプターに結合する。ヒトIL-1γでは、置換はDYKDDDDKと
のKDSQPRである。この変異体タンパク質は、アンタゴニストとして作用し得る（
二次mIL-1γレセプターを結合し得ない）。このタグ化分子は、このように同定
されていないマウスIGIF一次レセプターをクローニングするために有用であるべ
きである。
ヒトIL-1γリガンド配列、例えば、残基88〜96の間の対応する領域における類
似の改変は、レセプターとの類似の相互作用を提供すべきである。マウス配列ま
たはヒト配列のいずれかとの置換が指示される。反対に、レセプター結合相互作
用領域と離れた保存的置換は、おそらく、ほとんどの生物学的活性を保存する。
ヒトIL-1γの「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、代謝
的誘導体、および他の化学部分との共有または集合結合体を含む。共有誘導体は
、
例えば、当該技術分野で周知の手段によって、IL-1γアミノ酸側鎖であるいはＮ
またはＣ末端で見出される基への機能性の連結によって調製され得る。これらの
誘導体は、カルボキシル末端のまたはカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族エス
テルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基の0-アシル誘導体、およびアミノ末
端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のN-ア
シル誘導体を、限定することなく、含み得る。アシル基は、C3〜C18正常アルキ
ルを含むアルキル部分の群より選択され、それによってアルカノイルアロイル種
を形成する。
特に、グリコシル化改変には、例えば、その合成およびプロセシング中に、ま
たはさらなるプロセシング工程で、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変
することによって作成される改変が含まれる。これを完成するために特に好まし
い手段は、このようなプロセシングを正常に提供する細胞由来のグリコシル化酵
素、例えば、哺乳動物グリコシル化酵素に、ポリペプチドを曝露することによる
。脱グリコシル化酵素も意図される。リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホ
スホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを含む、他のマイナー改
変を有する同じ一次アミノ酸配列の改変も包含される。
誘導体の主要な群は、インターロイキンまたはそのフラグメントの、他のタン
パク質のポリペプチドとの共有結合体である。これらの誘導体は、ＮまたはＣ末
端融合物のような組換え培養物での、または反応性側鎖を介してタンパク質を架
橋することにおける有用性について当該分野で公知の薬剤の使用によって、合成
され得る。架橋薬剤との好ましい誘導化部位は、遊離アミノ基、炭水化物部分、
およびシステイン残基である。
インターロイキンと他の同種または異種タンパク質との間の融合ポリペプチド
も提供される。同種ポリペプチドは、種々の増殖因子間の融合物であり得、例え
ば、多数の異なるレセプターに対するリガンド特異性を示すハイブリッドタンパ
ク質、またはそのレセプターへの結合の広がるまたは弱くなる特異性を有し得る
リガンドを生じる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを
示す異種融合物が、構築され得る。代表的な例は、レセプターのセグメントまた
はドメイン（例えば、リガンド結合セグメント）を有するリポーターポリペプチ
ド（例えば、ルシフェラーゼ）の融合物であり、その結果、所望のリガンドの存
在または位置が容易に決定され得る。例えば、Dullら，米国特許第4,859,609号
を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーには、グルタチオン-S-トランスフェ
ラーゼ（GST）、細菌β-ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインＡ、β-ラクタマ
ーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙
げられる。例えば、Godowskiら（1988）Science 241:812-816を参照のこと。
BeaucageおよびCarruthers（1981）Tetra ．Letts．22:1859-1862に記載のホス
ホルアミダイト方法は、適切な合成DNAフラグメントを生じる。二本鎖フラグメ
ントは、しばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で一緒に鎖をアニーリン
グすることによって、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを
使用して相補鎖を付加することによってのいずれかで得られる。
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、硫酸化、ビオチン化、または他の
部分の付加もしくは除去によって化学的に改変されているアミノ酸残基、特にリ
ン酸基に類似の分子形状を有するものを有し得る。いくつかの実施態様では、改
変は、有用な標識化試薬であるか、または精製標的、例えば、アフィニティーリ
ガンドとして作用する。
融台タンパク質は、代表的には、組換え核酸方法によって、または合成ポリペ
プチド方法によってのいずれかで作成される。核酸操作および発現のための技法
は、一般的に、例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory M anual
（第２版），1-3巻，Cold Spring Harbor Laboratory、およびAusubelら（
編）（1987および定期的補遺）Current Protocols in Molecular Biology，Gree
ne/Wiley，New Yorkに記載され、これらはそれぞれ参考として本明細書に援用さ
れる。ポリペプチドの合成のための技法は、例えば、Merrifield（1963）J ．Ame r．Chem．Soc．
85:2149-2156；Merrifield（1986）Science 232:341-347；およ
びAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Appriach，
IRL Press，Oxfordに記載され；これらのそれぞれは参考として本明細書に援用
される。より大きなポリペプチドを作成するための方法については、Dawsonら（
1994）Science 266:776-779も参照のこと。
本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化における改変以外のヒトIL-l
γの誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との共有または集
合結合を包含し得る。これらの誘導体は、一般的に、３つのクラスに分かれる：
(1)塩、(2)側鎖および末端残基共有改変、および(3)例えば、細胞膜との、吸着
複合体。このような共有または集合誘導体は、免疫原として、イムノアッセイに
おける試薬として、またはレセプターもしくは他の結合分子（例えば、抗体）の
アフィニティー精製のような精製方法において有用である。
例えば、ヒトIL-1γリガンドは、IL-1γレセプター、抗体、または他の類似の
分子のアッセイまたは精製における使用ために、当該技術分野で周知である方法
によって臭化シアン活性化Sepharoseのような固体支持体への共有結合によって
固定され、あるいはグルタルアルデヒド架橋でまたはなしで、ポリオレフィン表
面に吸着され得る。IL-1γはまた、診断アッセイでの使用のために、例えば、ク
ロラミンＴ手順によって放射性ヨウ素化された、希土類キレートに共有結合した
、あるいは別の蛍光部分に結合した、検出可能な基で標識され得る。
本発明のヒトIL-1γは、インターロイキンまたはその任意のフラグメントに特
異的な、例えば、マウスIGIFとヒトIL-1γとの間を区別し得る、抗血清または抗
体の産生のための免疫原として使用され得る。精製されたインターロイキンは、
タンパク質を含む不純な調製物の種々の形態での免疫によって調製されたモノク
ローナル抗体または抗原結合フラグメントをスクリーニングするために使用され
得る。特に、用語「抗体」はまた、天然の抗体の抗原結合フラグメントを包含す
る。精製されたインターロイキンはまた、発現の上昇したレベルの存在、または
内因性サイトカインに対する抗体産生を導く免疫学的疾患に応じて生じた任意の
抗体を検出するための試薬として使用され得る。さらに、IL-1γフラグメントは
また、以下にすぐ記載のように、本発明の抗体を産生するための免疫原として作
用し得る。例えば、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列、そのフラグメン
ト、または相同ペプチドに対する結合親和性を有する抗体またはこれらに対して
惹起される抗体を意図する。特に、本発明は、天然のサイトカインの外部タンパ
ク質表面で曝露された、そこにあると予測される、または実際にある特異的フラ
グメントに対する結合親和性を有するまたはそれに対して惹起されている抗体を
意図する。
これらのインターロイキンに対する生理学的応答のブロッキングは、おそらく
競合阻害による、レセプターへのリガンドの結合の阻害から生じ得る。したがっ
て、本発明のインビトロアッセイは、しばしば、抗体、これらの抗体のリガンド
結合セグメント、または固相基質に結合したフラグメントを使用する。これらの
アッセイはまた、結合領域変異および改変、またはリガンド変異および改変（例
えば、リガンドアナログ）のいずれかの効果の診断決定を可能にする。
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、例えば、イ
ンターロイキンまたはフラグメントに対する中和抗体は、レセプターまたは抗体
への結合についてのテスト化合物と競合する。このように、中和抗体またはフラ
グメントは、レセプターへの１つ以上の結合部位を共有する任意のポリペプチド
の存在を検出するために使用され得、そしてまた、他にインターロイキンを結合
し得るレセプターで結合部位を占領するために使用され得る。
タンパク質またはそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成によって、c
DNAライブラリーをスクリーニングして、または広範な種々の細胞株または組織
試料から調製されたゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ら
れ得る。天然の配列は、標準的方法および本明細書で配列番号１で提供される配
列を使用して単離され得る。
このDNAは、例えば、順に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生
するために使用され得る全長ヒトインターロイキンまたはフラグメントの合成の
ために；結合研究のために；改変されたアゴニスト／アンタゴニスト分子の構築
および発現のために；および構造／機能研究のために；広範な種々の宿主細胞で
発現され得る。各変異体またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質
転換またはトランスフェクトされる宿主細胞で発現され得る。これらの分子は、
組換え宿主に由来する以外のタンパク質または細胞夾雑物を実質的に含み得ず、
したがって、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤と合わせた場合
、薬学的組成物で特に有用である。ヒトタンパク質、その一部は、他のタンパク
質との融合物として発現され得る。
発現ベクターは、代表的には、通常適切な宿主細胞で認識される適切な遺伝子
制御エレメントを作動可能に連結した、所望のレセプター遺伝子またはそのフラ
グメントを含む自己複製DNAまたはRNA構築物である。これらの制御エレメントは
、適切な宿主内で発現を達成し得る。発現を達成するために必要な制御エレメン
トの特異的タイプは、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般的に、遺伝
子制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現
制御系を含み得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する
ための任意のオペレーター、mRNA発現レベルを上昇させるための転写エンハンサ
ー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終結
する配列が含まれる。発現ベクターはまた、通常、ベクターが独立して複製され
る宿主細胞の複製起点を含む。
本発明のベクターは、上記のように、タンパク質をコードするDNAを含むもの
、または生物学的に活性な等価なポリペプチドをコードするそのフラグメントを
含むものを包含する。DNAは、ウイルスプロモーターの制御下にあり得、そして
選択マーカーをコードし得る。本発明は、さらに、原核生物または真核生物宿主
においてこのようなタンパク質をコードする真核生物cDNAを発現し得るこのよう
な発現ベクターの使用を意図し、ここでベクターは宿主と適合可能であり、そし
てレセプターをコードする真核生物cDNAは、ベクターを含む宿主の増殖が問題の
cDNAを発現するようなベクターに挿入される。通常、発現ベクターは、宿主細胞
における安定な複製について、または１細胞当たりの望ましい遺伝子のコピーの
総数を非常に増加させるための増幅について設計される。発現ベクターが宿主細
胞で複製することを必要とすることが必ずしも必要ではなく、例えば、宿主細胞
によって認識される複製起点を含まないべクターを使用して種々の宿主でインタ
ーロイキンタンパク質またはそのフラグメントの一過性発現を行うことが可能で
ある。組換えによって宿主DNAへのヒトタンパク質またはそのフラグメントの組
込みを引き起こすべクターを使用することも可能である。
本明細書で使用される場合、べクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオ
ファージ、組込み可能なDNAフラグメント、および宿主のゲノムへのDNAフラグメ
ントの組込みを可能にする他のべヒクルを含む。発現べクターは、作動可能に連
結した遺伝子の発現を達成する遺伝子制御エレメントを含む特殊化されたべクタ
ーである。プラスミドは、最も通常に使用される形態のベクターであるが、等価
の機能を果たしそして当該分野で公知であるまたは公知になるすべての他の形態
のベクターは、本明細書での使用に適切である。例えば、Pouwelsら（1985およ
び補遺）Cloning Vectors:A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.、およびRodri
quezら（編）Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses
，Buttersworth，Boston，1988を参照のこと、これらは参考として本明細書中で
援用される。
形質転換された細胞は、組換えDNA技法を使用して構築されたレセプターベク
ターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳動物細胞で
ある。形質転換された宿主細胞は、通常、所望のタンパク質またはそのフラグメ
ントを発現するが、そのDNAをクローニング、増幅、および操作する目的では、
本発明のタンパク質を発現する必要はない。本発明は、さらに、栄養培地中で形
質転換された細胞を培養すること、そのため培養物中にインターロイキンを蓄積
させることを意図する。タンパク質は、培養物または培養培地のいずれかから回
収され得る。
本発明の目的のために、核酸配列は、互いに機能的に関連する場合、作動可能
に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのDNAは、プレタ
ンパク質として発現されるか、あるいは細胞膜へポリペプチドを指向することに
、またはポリペプチドの分泌に関与する場台、ポリペプチドに作動可能に連結さ
れる。プロモーターは、ポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動
可能に連結され；リボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように配置される場
合、コード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結されるとは、隣
接しそしてリーディングフレームにあることを意味するが、リプレッサー遺伝子
のような特定の遺伝子エレメントは、隣接して連結されないが、次に発現を制御
するオペレーター配列にさらに結合する。
適切な宿主細胞には、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物が含まれ
る。原核生物には、グラム陰性およびグラム陽性生物の両方とも（例えば、E．
ｃoliおよびB．subtilis）が含まれる。下等真核生物には、酵母（例えば、S．c
erevisiaeおよびPichia）、ならびにDictyoste1ium属の種が含まれる。高等真核
生物には、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞、および鳥類）、および哺乳動物
起
源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物細胞からの樹立された
組織培養細胞株が含まれる。
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種についての広範な種々のベクタ
ーを含む。本明細書で使用される場合、E．coliおよびそのベクターは、他の原
核生物で使用される等価のベクターを含むように一般的に使用される。DNAを増
幅するための代表的なベクターは、pBR322またはその多くの誘導体である。レセ
プターまたはそのフラグメントを発現するために使用され得るベクターには、la
cプロモーター（pUCシリーズ）；trpプロモーター（pBR322-trp）；Ippプロモー
ター（pINシリーズ）；λ-pPまたはpRプロモーター（pOTS）；またはptacのよう
なハイブリッドプロモーター（pDR540）のようなベクターが含まれるが、これら
に限定されない。Brosiusら（1988）「Expression Vectors Employing Lambda-
，trp-，lac-，and Ipp-derived Promotersl Vectors:A Survey of Molecular C loning Vectors and Their Uses
，(Rodriguezおよびenhardt編)，Buttersworth
，Boston，10章，205-236頁を参照のこと、これは参考として本明細書に援用さ
れる。
下等真核生物、例えば、酵母およびDictyoste1iumは、IL-1γ配列含有ベクタ
ーで形質転換され得る。本発明の目的のために、最も通常の下等真核生物宿主は
、パン酵母、Saccharomyces cerevisiaeである。多数の他の株および種もまた利
用可能であるが、これが下等真核生物を一般的に代表するために使用される。酵
母ベクターは、代表的には、複製起点（組込み型のほかは）、選択遺伝子、プロ
モーター、レセプターまたはそのフラグメントをコードするDNA、ならびに翻訳
終結、ポリアデニル化、および転写終結のための配列からなる。酵母に適切な発
現ベクターには、3-ホスホグリセレートキナーゼおよび種々の他の解糖系酵素遺
伝子プロモーターのような構成的プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナ
ーゼ２プロモーターもしくはメタロチオネインプロモーターのような誘導性プロ
モーターが含まれる。適切なベクターには、以下のタイプの誘導体が含まれる：
自己複製低コピー数（例えば、YRpシリーズ）；自己複製高コピー数（例えば、Y
Epシリーズ）；組込み型（例えば、YIpシリーズ）、またはミニ染色体（例えば
、YCpシリーズ）。
高等真核生物組織培養細胞は、通常は、機能的に活性なインターロイキンタン
パク質の発現に好ましい宿主細胞である。原則的に、任意の高等真核生物組織培
養細胞株は、無脊椎動物または脊椎動物からにかかわらず、使える（例えば、昆
虫バキュロウイルス発現系）。しかし、哺乳動物細胞が好ましい。このような細
胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、日常的な手順になる。
有用な細胞株の例には、HeLa細胞、チャイニーズハムスタ一卵巣(CH0)細胞株、
ベビーラット腎臓（BRK）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（COS）
細胞株が挙げられる。このような細胞株についての発現ベクターは、通常、複製
起点、プロモーター、翻訳開始部位、RNAスプライス部位（ゲノムDNAが使用され
る場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクター
もまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、プ
ラスミド、ウイルス、または、例えば、アデノウイルス、SV40、パルボウイルス
、ワクシニアウイルス、もしくはサイトメガロウイルスのような供給源に由来す
るプロモーターを有するレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表
的な例には、pCDNA1；pCD（Okayamaら（1985）Mol ．Cell Biol．5:1136-1142を
参照のこと）；pMClneo PolyA（Thomasら（1987）Cell 51:503-512を参照のこと
）；およびpAC 373またはpAC 610のようなバキュロウイルスベクターが挙げられ
る。
分泌されたタンパク質については、オープンリーディングフレームは、通常、
シグナルペプチドにＮ末端で共有結合した成熟または分泌された産物からなるポ
リペプチドをコードする。シグナルペプチドは、成熟または活性ポリペプチドの
分泌の前に切断される。切断部位は、経験則、例えば、von-Heijne（1986）Nucl eic Acids Research
14:4683-4690から高い程度の精度で予測され得、そしてシ
グナルペプチドの正確なアミノ酸組成は、その機能に重要ではないようである（
例えば、Randallら（1989）Science 243:1156-1159；Kaiserら（1987）Science
235:312-317）。
特異的または所定のグリコシル化パターンを提供する系においてこれらのポリ
ペプチドを発現することがしばしば望まれる。この場合、通常のパターンは、発
現系によって天然に提供されるパターンである。しかし、パターンは、ポリペプ
チド（例えば、非グリコシル化形態）を、異種発現系に導入された適切なグリコ
シル化タンパク質に曝露することによって、改変可能である。例えば、インター
ロイキン遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素をコードする１つ以上
の遺伝子で同時形質転換され得る。このアプローチを使用して、特定の哺乳動物
グリコシル化パターンは、原核生物または他の細胞で達成可能である。
ヒトIL-1γの供給源は、上記のような組換えhuIL-１γDNAを発現する真核生物
または原核生物宿主であり得る。供給源はまた、マウスSwiss 3T3線維芽細胞の
ような細胞株であり得るが、他の哺乳動物細胞株もまた、本発明によって意図さ
れ、好ましい細胞株はヒト種由来である。
全体の配列が公知であるので、ヒトIL-1γ、そのフラグメント、または誘導体
は、ペプチドを合成するための従来のプロセスによって調製され得る。これらに
は、StewartおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chem
ical Co.，Rockford，IL；BodanszkyおよびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthesis
，Springer-Verlag，New York；およびBodanszky（1984）The Principles of Peptide Synthesis
，Springer-Verlag，New Yorkに記載のよう
なプロセスが含まれる；これらのそれぞれのすべてが参考として本明細書に援用
される。例えば、アジドプロセス、酸クロリドプロセス、酸無水物プロセス、混
合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、p-ニトロフェニルエステル
、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カル
ボジイミダゾールプロセス、酸化−還元プロセス、またはジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCCD）／付加プロセスが使用され得る。固相および溶液相合成は、
両方とも上記のプロセスに適用可能である。
IL-1γタンパク質、フラグメント、または誘導体は、代表的にはペプチド合成
で用いられるような上記のプロセスに従って、一般的には、順に１つずつ末端ア
ミノ酸にアミノ酸を縮合する工程を包含するいわゆる段階的プロセスによって、
あるいは末端アミノ酸にペプチドフラグメントをカップリングすることによって
のいずれかで、適切に調製される。カップリング反応で使用されていないアミノ
基は、代表的には、正しくない位置でのカップリングを防止するために保護され
なければならない。
固相合成が採用される場合、Ｃ末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して
不溶性キャリアまたは支持体に結合される。不溶性キャリアは、反応性カルボキ
シル基への結合能力を有する限り、特に限定されない。このような不溶性キャリ
アの例には、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂のようなハロメチル樹脂
、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert-アルキルオキシカルボニルヒ
ドラジド化樹脂などが挙げられる。
アミノ基保護されたアミノ酸は、漸進的にペプチドを合成するために、その活
性化されたカルボキシル基と既に形成されたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基
との縮合によって順に結合される。完全な配列を合成した後、ペプチドは、ペプ
チドを生成するための不溶性キャリアから切り離される。この固相アプローチは
、一般的に、Merrifieldら（1963）J ．Am．Chem．Soc．85:2149-2156に記載され
、これは参考として本明細書に援用される。
調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段によっ
て、例えば、抽出、沈殿、電気泳動、種々の形態のクロマトグラフィーなどによ
って、反応混合物から単離および精製され得る。本発明のインターロイキンは、
所望の使用に依存する種々の程度の純度で得られ得る。精製は、本明細書に開示
されたタンパク質精製技法（以下を参照のこと）の使用によって、または免疫吸
着アフィニティークロマトグラフィーの方法で本明細書に記載の抗体の使用によ
って、達成され得る。この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーは、最初
に抗体を固体支持体に連結する工程、および次いで連結された抗体を適切な細胞
の可溶化した溶解物、インターロイキンを発現する他の細胞の溶解物、またはDN
A技術の結果としてそのタンパク質を生成する細胞の溶解物もしくは上清と接触
させる工程によって行われる（以下を参照のこと）。
一般的に、精製されたタンパク質は、少なくとも約40％純粋、通常には少なく
とも約50％純粋、通常少なくとも約60％純粋、代表的には少なくとも約70％純粋
、より代表的には少なくとも約80％純粋、好ましくは少なくとも約90％純粋、お
よびより好ましくは少なくとも約95％純粋、そして特定の実施態様では、97％〜
99％以上である。純度は、通常、重量ベースであるが、モルベースでもあり得る
。種々のアッセイが、適切に適用される。
抗体は、天然に存在する天然の形態でおよびその組換え形態での両方で、種々
のヒトIL-1γタンパク質およびそのフラグメントに対して惹起され得、その差異
は、活性リガンドに対する抗体が、天然の構造でのみ存在するエピトープを認識
することがより起こりそうなことである。
抗イデオタイプ抗体もまた意図され、これは天然のレセプターまたは抗体のア
ゴニストまたはアンタゴニストとして有用である。
結合フラグメントおよび一本鎖型を含む、タンパク質の予め決定されたフラグ
メントに対する抗体は、フラグメントの免疫原性タンパク質との結合体での動物
の免疫によって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細
胞から調製される。これらの抗体は、正常または防御タンパク質への結合につい
てスクリーニングされ得るか、あるいはアゴニストまたはアンタゴニスト活性に
ついてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なく
とも約１mMのKDで、より通常には少なくとも約300μＭで、代表的には少なくと
も約100μＭで、より代表的には少なくとも約30μＭで、好ましくは少なくとも
約10μＭで、およびより好ましくは少なくとも約３μＭ以上で結合する。
抗体抗原結合フラグメントを含む、本発明の抗体は、著しい診断または治療価
値を有し得る。これらは、インターロイキンに結合、そしてレセプターへの結合
を阻害するか、またはヒトIL-1γが生物学的応答を誘起する能力を阻害する、強
力なアンタゴニストであり得る。これらはまた、非中和抗体として有用であり得
、そして産生細胞、またはインターロイキンの供給源に限局された細胞を結合す
るためにトキシンまたは放射性核種にカップリングされ得る。さらに、これらの
抗体は、リンカーによって直接的または間接的のいずれかで、薬物または他の治
療薬剤に結合され得る。
本発明で使用される、用語「抗体抗原結合フラグメント」は、例えば、Fab，F
c、F(ab)2、Fv、およびscFvフラグメントを含み、これらは、その標準的な免疫
学的意味で用いられる。例えば、Klein，Immunolgy（JOhn Wiley，New York，１
982）；Parham，14章，Weir編Immunochemistry，第4版(Blackwell Scientific P
ublishers，Oxford，1986)を参照のこと。このようなフラグメントは、組換えDN
A方法論の使用による化学的切断によって未処理の抗体から作成され得る。例え
ば、組換えFvフラグメントの産生を記載する米国特許第4,642,334号、およびscF
vについてのWO 93/11236を参照のこと。
本発明の抗体はまた、診断適用に有用であり得る。捕獲または非中和抗体とし
て、これらは、レセプター結合を阻害することなくインターロイキンに結合し得
る。中和抗体として、これらは競合結合アッセイに有用であり得る。これらはま
た、IL-1γを検出または定量することに有用である。
タンパク質フラグメントは、免疫原として使用されるべきポリペプチドを融合
または共有結合したように、他の物質、特にポリペプチドに連結され得る。ヒト
IL-1γおよびそのフラグメントは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血
清アルブミン、破傷風トキシンなどのような種々の免疫原に融合または共有結合
され得る。ポリクローナル抗血清を調製する方法の記載については、Microbiolo gy
，Hoeber Medical Division，Harper and Row，1969；Landsteiner（1962）Sp ecificity of Serological Reactions
，Dover Publications，New York；および
Williamsら（1967）Methods in Immunology and Immunochemistry，第1巻，Acad
emic Press，New Yorkを参照のこと；これらのそれぞれは参考として本明細書に
援用される。代表的方法は、抗原での動物の過剰免疫を包含する。次いで、動物
の血液を、繰り返しの免疫後すぐに収集し、そしてγグロブリンを単離する。
ある場合には、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどのような種々の哺乳動物宿
主からモノクローナル抗体を調製することが望まれる。このようなモノクローナ
ル抗体を調製するための技法の記載は、例えば、Stitesら（編）Basic and Clin ical Immunology
(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CAおよび
そこで引用された参考文献；HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Laborator y Manual
，CSH Press；Goding（1986）Monoclonal Antibodies:Principles and Practice
（第2版）Academic Press，New York；および特に、KohlerおよびMilst
ein（1975）Nature 256:495-497（これはモノクローナル抗体を生成する１つの
方法を論議する）で見られ得る。これらの参考文献のそれぞれは、参考として本
明細書に援用される。簡単に要約すると、この方法は、免疫原を動物に注射する
ことを包含する。次いで、動物を屠殺し、そして細胞を牌臓から取り出し、次い
でこれをミエローマ細胞と融合する。その結果は、ハイブリッド細胞すなわち
「ハイブリドーマ」であり、これはインビトロで再生し得る。次いで、ハイブリ
ドーマの集団を、個々のクローンを単離するためにスクリーニングし、そのそれ
ぞれは、免疫原に対する単一の抗体種を分泌する。このように、得られた個々の
抗体種は、免疫原物質上の認識される特異的部位に対する応答を生じる免疫動物
からの、不死化およびクローン化された単一のＢ細胞の産物である。
他の適切な技法は、抗原ポリペプチドへのリンパ球のインビトロ曝露、または
二者択一的に、ファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選
択を包含する。Huseら（1989）「Generation of a Large Combinatorial Librar
y of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda」，Science 246:1275-1
281；およびWardら（1989）Nature 341:544-546を参照のこと。本発明のポリペ
プチドおよび抗体は、改変してまたは改変なしで使用され得、キメラまたはヒト
化抗体を含む。頻繁には、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提
供する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかで結合することによって標
識される。多様な標識および結合技法は公知であり、そして科学および特許文献
の両方に広く報告される。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、
インヒビター、蛍光分子、化学発光分子、磁性粒子などが含まれる。このような
標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,
939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,24
1号が挙げられる。また、組換えまたはキメラ免疫グロブリンが産生され得、Cab
illy，米国特許第4,816,567号を参照のこと。
本発明の抗体はまた、IL-1γを単離することにおけるアフィニティークロマト
グラフィーに使用され得る。カラムが調製され得、そこでは、抗体が、固体支持
体（例えば、アガロース、Sephadexなどのような粒子）に連結され、細胞溶解物
がカラムを通過し得、カラムを洗浄し、次いで穏やかな変性剤の濃度を増加させ
、それによって精製されたタンパク質が放出される。
抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングする
ために使用され得る。通常、このような手順で使用される抗体は、抗体結合によ
って抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。
各ヒトIL-1γに対して惹起された抗体もまた、抗イデオタイプ抗体を惹起する
ために使用される。これらは、タンパク質の発現に関連する種々の免疫学的症状
をまたはこのタンパク質についてのレセプターを発現する細胞を検出または診断
することに有用である。これらはまた、インターロイキンのアゴニストまたはア
ンタゴニストとして有用であり、これらは、天然に存在するリガンドに対して競
合的インヒビターまたは基質であり得る。
本発明のヒトIL-1γ分子の天然に存在する形態および組換え形態の両方とも、
キットおよびアッセイ方法に特に有用である。例えば、これらの方法はまた、結
合活性、例えば、これらのタンパク質に対するレセプターについてのスクリーニ
ングに適用される。自動化アッセイのいくつかの方法が、１年当たり数万個の化
合物のスクリーニングを可能にするように、近年開発されている。例えば、BI0M
EK automated workstation，Beckman Instruments，Palo Alto，California、お
よびFodorら（1991）Science 251:767-773を参照のこと、これは参考として本明
細書に援用される。後者は、固体基質上で合成された多数の所定のポリマーによ
る結合を試験するための手段を記載する。レセプターまたはアゴニスト／アンタ
ゴニスト相同タンパク質についてスクリーニングするための適切なアッセイの開
発は、本発明によって提供されるような、活性状態での大量の精製された可溶性
IL-1γの利用可能性によって、非常に容易にされ得る。
精製されたIL-1γは、上記のレセプタースクリーニング技法での使用のための
プレート上に直接コーティングされ得る。しかし、これらのタンパク質に対する
非中和抗体は、例えば、診断使用に有用な、固相上にそれぞれのインターロイキ
ンを固定するための捕獲抗体として使用され得る。
本発明はまた、タンパク質またはそのレセプターの存在を検出するための種々
の診断キットおよび方法における、IL-1γ、そのフラグメント、ペプチド、およ
びそれらの融合産物の使用を意図する。あるいは、またはさらに、この分子に対
する抗体は、キットおよび方法に組み入れられ得る。代表的には、キットは、所
定のIL-1γペプチドまたは遺伝子セグメントまたは一方もしくは他方を認識する
試薬のいずれかを含むコンパートメントを有する。代表的には、ペプチドの場合
において、認識試薬はレセプターまたは抗体であり、あるいは遺伝子セグメント
の場合においては、通常、ハイブリダイゼーションプローブである。
試料、例えば、IL-1γの濃度を決定するための好ましいキットは、代表的には
、陽性コントロールとしてのIL-1γ、IL-1γの供給源（天然に存在するまたは組
換え）に対する公知の結合親和性を有する標識された化合物、例えば、レセプタ
ーまたは抗体、ならびに、遊離の標識された化合物から結合体を分離するための
手段、例えば、試験試料中でIL-1γを固定するための固相を含む。試薬および装
置を含むコンパートメントが、通常は提供される。
ヒトIL-1γまたはペプチドフラグメントに特異的な抗原結合フラグメントを含
む抗体、またはレセプターフラグメントは、IL-1γおよび／またはそのフラグメ
ントの上昇したレベルの存在を検出するための診断適用に有用である。診断アッ
セイは、同種（遊離試薬と抗体−抗原複合体との間の分離工程なし）または異種
（分離工程あり）であり得る。種々の市販のアッセイが存在し、例えば、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、固相酵素免疫検定法（ELISA）、酵素イムノアッセイ（
EIA）、酵素多数化イムノアッセイ技法（EMIT）、基質標識蛍光イムノアッセイ
（SLFIA）などである。例えば、非標識抗体は、標識されそしてIL-1γに対する
またはその特定のフラグメントに対する抗体を認識する２次抗体を使用すること
によって用いられ得る。これらのアッセイはまた、文献に広く論議されている。
例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Laboratory Manual，CSH.、お
よびColigan（編）(1991)および定期的補遺，Current Protocols In Immunology
Greene/Wiley，New Yorkを参照のこと。
抗イデオタイプ抗体は、IL-1γのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用
するための類似の使用を有し得る。これらは、適切な環境下で治療試薬として有
用であるはずである。
頻繁には、診断アッセイのための試薬は、アッセイの感度を最適にするように
、キットで供給される。本発明については、アッセイ、プロトコル、および標識
の性質に依存して、標識または非標識抗体、または標識レセプターのいずれかが
提供される。これは、通常、緩衝液、安定化剤、酵素に対する基質のようなシグ
ナル産生に必要な物質などのような、他の添加物との組合わせである。好ましく
は、キットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処分のための装置を含む
。代表的には、キットは、各有用な試薬のためのコンパートメントを有し、そし
て適
切な使用および試薬の処分のための装置を含む。望ましくは、試薬は凍結乾燥粉
末として提供され、ここでは試薬はアッセイを行うために適切な濃度を有する水
性培地中で再構成され得る。
診断アッセイの上記の構成物のいずれかは、改変なしで使用され得るか、また
は種々の方法で改変され得る。例えば、標識する工程は、検出可能なシグナルを
直接または間接的に提供する部分を共有または非共有結合することによって達成
され得る。これらのアッセイのいずれかでは、試験化合物のIL-1γまたはそれに
対する抗体は、直接的または間接的のいずれかで標識され得る。直接標識のため
の可能性は、標識基を含む：125Iのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよび
アルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第3,645,090号）、および蛍光
強度、波長シフト、または蛍光偏光の変化をモニターし得る蛍光標識（米国特許
第3,940,475号）。両方の特許とも、参考として本明細書に援用される。間接的
標識のための可能性は、１つの構成成分のビオチン化、次いで上記標識基の１つ
にカップリングしたアビジンへの結合を包含する。
遊離のリガンドから結合体を、あるいは遊離の試験化合物から結合体を分離す
る多くの方法もまた存在する。IL-1γは、種々のマトリックス上に固定され次い
で洗浄され得る。適切なマトリクスには、ELISAプレートのようなプラスチック
、フィルター、およびビーズが挙げられる。レセプターをマトリクスに固定する
方法には、プラスチックへの直接接着、捕獲抗体の使用、化学カップリング、お
よびビオチン−アビジンが挙げられ、これらに限定されない。このアプローチに
おける最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒または
硫酸アンモニウムのような塩を利用することを含むいくつかの方法のいずれかに
よる、抗体／抗原複合体の沈殿を包含する。他の適切な分離技法には、Rattleら
（1984）Clin ．Chem. 30(9):1457-1461に記載の蛍光抗体磁化粒子方法、および
米国特許第4,659,678号に記載のような二重抗体磁性粒子分離が挙げられ、これ
らに限定されず、このそれぞれは、参考として本明細書に援用される。
タンパク質またはフラグメントを種々の標識に連結する方法は、文献に広く報
告されており、そして本明細書では詳細な論議を必要としない。技法の多くは、
ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの
使用による活性化カルボキシル基の使用、連結のためのクロロアセチルのような
活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンと、メルカプト基と
の反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質もまた、これ
らの適用での使用を見いだす。
本発明の別の診断局面は、IL-1γの配列から得られたオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、免疫学的疾患を有
する疑いのある患者においてIL-1γのレベルを検出するためのプローブとして使
用され得る。RNAおよびDNAの両方のヌクレオチド配列の調製、この配列の標識、
およびこの配列の好ましいサイズは、文献での十分な記述および議論を受け入れ
た。正常には、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、
通常は少なくとも約18ヌクレオチドを有し、そしてポリヌクレオチドプローブは
、数キロベースまでであり得る。種々の標識、最も普通には放射性核種、特に32
Pが用いられ得る。しかし、ポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変し
たヌクレオチドを使用するような、他の技法もまた用いられ得る。次いで、ビオ
チンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用し、これらは、放
射性核種、蛍光剤、酵素などのような広範な標識で標識され得る。
あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖、DNA-RNAハイブリッド二本鎖、またはDNA-
タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。抗体
は、次いで標識され得、そして二本鎖が表面に結合される場合アッセイが行われ
、そのため表面での二本鎖の形成の際に、二本鎖に結合した抗体の存在が検出さ
れ得る。新規アンチセンスRNAに対するプローブの使用は、核酸ハイブリダイゼ
ーション、プラスおよびマイナススクリーニング、組換えプロービング、ハイブ
リッド放出翻訳法（HRT）、およびハイブリッド翻訳阻害法（HART）のような任
意の従来の技法で行われ得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のよ
うな増幅技法を含む。
他のマーカーの定性的または定量的存在についてもテストする診断キットも意
図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指示の組み合わ
せに依存し得る。したがって、キットは、マーカーの組み合わせについてテスト
し得る。例えば、Vialletら（1989）Progress in Growth Factor Res ．1:89-97
を参照のこと。
本発明はまた、著しい治療価値を有する試薬を提供する。IL-1γ（天然に存在
するまたは組換え）、そのフラグメント、ミューテインアゴニストまたはアンタ
ゴニスト、および抗体は、インターロイキンまたはそのレセプターもしくは抗体
に対する結合親和性を有するとして同定された化合物とともに、インターロイキ
ンの異常発現を示す症状の処置に有用であるべきである。このような異常性は、
代表的には、免疫学的疾患によって示される。さらに、本発明は、インターロイ
キンに対する応答の異常発現または異常誘発に関連する種々の病気または疾患に
おける治療価値を提供するはずである。マウスIGIFは、腫瘍、アレルギー、およ
び感染性疾患、例えば、肺結核症、癩病、劇症肝炎、およびHIVのようなウイル
ス感染に関連することが示唆されている。
さらに、樹状細胞発現プロフィールは、活性化された樹状細胞で主に発現され
るヒトIL-1γを示す、活性化された樹状細胞はまた、IL-12の主要なプロデュー
サーであり、そしてこの樹状細胞が産生したIL-12が、Th1タイプ応答を指示する
主要な役割を果たすと考えられる。IL-1γとIL-12との組み合わせは、IFN-γを
誘導する点で非常に強力であるはずである。ある環境下でのこれらの２つのプロ
炎症性サイトカインの組み合わせが、敗血症性ショックを導き得ることが考えら
れる。IL-1γアンタゴニスト、ムテイン、または抗体は、この状況で非常に有用
であることを示し得る。天然のIL-1γアンタゴニストが、IL-1γの効果を妨げる
ためにNK細胞または活性化されたＴ細胞によって産生されることが可能である。
組換えIL-1γ、ムテインアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはIL-1γ抗
体は精製され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は、治療用途のため
に、例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中で、生理学的に
無害の安定化剤および賦形剤とともに、さらなる有効成分と組み合わされ得る。
これらの組み合わせ物は滅菌濾過され得、そして投与量バイアル中の凍結乾燥ま
たは安定化した水性調製物中での貯蔵によるような、投与形態中に置かれ得る。
本発明はまた、抗体または補体結合しないその結合フラグメントの使用を意図す
る。
IL-1γまたはそのフラグメントを使用するレセプタースクリーニングは、イン
ターロイキンに対する結合親和性を有する分子を同定するために行われ得る。次
いで、その後の生物学的アッセイは、レセプターが、本質的な刺激活性をブロッ
クし得る競合結合を提供し得るかどうかを決定するために利用され得る。レセプ
ターフラグメントは、IL-1γの活性をブロックする点で、ブロッカーまたはアン
タゴニストとして使用され得る。同様に、本質的な刺激活性を有する化合物は、
レセプターを活性化し得、したがって、IL-1γの活性を刺激する点で、アゴニス
トである。本発明は、さらに、IL-1γに対する抗体、およびアンタゴニストとし
ての他の分子の治療用途を意図する。
効果的な治療に必要な試薬の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状
態、および投与される他の医薬品を含む多くの種々の因子に依存する。したがっ
て、処置投与量は、安全性および効率を最適にするために滴定されるべきである
。代表的には、インビトロで使用される投与量は、これらの試薬のインサイチュ
投与に有用な量で有用なガイダンスを提供し得る。特定の疾患の処置のための効
果的用量の動物テストは、ヒト投与量の予測適用をさらに提供する。
種々の考慮が、例えば、Gilmanら（編）（1990）Goodman and Gilman's:The P harmacological Bases of Therapeutics
，第８版，Pergamon Press；およびRemi ngtoon's Pharmaceutical Sciences
，第17版（1990），Mack Publishing Co.,Ea
ston，Penn.に記載される。投与方法は、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔
内投与、または筋肉内投与、経皮拡散などについては、これらおよび以下に考察
される。薬学的に受容可能なキャリアには、水、生理食塩水、緩衝液、および例
えば、Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jerseyに記載の他の化合物が含
まれる。IL-1γとそのレセプターとの間のおそらく高い親和性結合のため、これ
らの試薬の低い投与量は、最初は効果的であると予測される。したがって、投与
量範囲は、適切なキャリアとともに、普通は１mM未満の濃度、代表的には約10μ
Ｍ未満の濃度、通常は約100nM未満、好ましくは約10pM（ピコモル）未満、およ
び最も好ましくは約１fM（フェムトモル）未満の量であると予測される。遅延放
出処方物または遅延放出装置は、しばしば、持続投与に利用される。
IL-1γ、そのフラグメント、および抗体またはそのフラグメント、アンタゴニ
スト、ならびにアゴニストは、処置される宿主に直接的に投与され得るか、また
は化合物のサイズに依存して、それらの投与前にオボアルブミンまたは血清アル
ブミンのようなキャリアタンパク質にそれらを結合することが所望され得る。治
療処方物は、任意の従来の投与処方物で投与され得る。活性成分が単独投与され
ることが可能であるが、薬学的処方物として存在することが好ましい。処方物は
、上記のような少なくとも１つの活性成分を、その１つ以上の受容可能なキャリ
アとともに含む。各キャリアは、他の成分と適合可能であり患者に有害でないと
いう意味で、薬学的および生理学的の両方で受容でなければならない。処方物は
、経口、直腸内、鼻内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含
む）投与に適切なものを含む。処方物は、単位投与形態で便利に存在し得、そし
て薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら
（編）（1990）Goodman and Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeu tics
，第８版，Pergamon Press；およびRemington's Pharmaceutical Sciences ，
第17版（1990），Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；Avisら（編）（1993
）Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker，NY；Lieberm
anら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker，NY；および
Liebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems De
kker,NYを参照のこと。本発明の治療は、他の治療薬剤と組み合わせられ得また
は関連して使用され得る。
本明細書ではIL-1γリガンドの記載は、上記のように、レセプターを同定する
ための手段を提供する。このようなレセプターは、理論的に高い親和性でIL-1γ
に特異的に結合すべきである。レセプターを検出するためにIL-1γのいずれかの
標識を可能にする種々の構築物が、利用可能になる。例えば、IL-1γを直接的に
標識すること、２次標識のためのマーカー（例えば、FLAGまたは他のエピトープ
タグ）を融合することなどは、レセプターの検出を可能にする。これは、生化学
的精製のためのアフィニティー方法として、組織学的、または発現クローニング
アプローチにおける標識もしくは選択であり得る。利用可能なIL-1γ配列との適
切な構築物を作成するツーハイブリッド選択システムもまた、適用され得る。例
えば、FieldsおよびSong（1989）Nature 340:245-246を参照のこと。
本発明の広い範囲は、以下の実施例を参照にして最もよく理解され、これは、
本発明を特定の実施態様に限定することを意図しない。
実施例
Ｉ．一般的方法
標準的方法のいくつかは、例えば、Maniatisら（1982）Molecular Cloning ，A Laboratory Manual
，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Pr
ess；Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A LaboratoryManual，(第２版)，1
-3巻，CSH Press，NY；Ausubelら，Biology，Greene Publishing Associates，B
rooklyn，NY；またはAusubelら（1987および補遺）Current Protocols in Molec ular Biology
，Greene/Wiley，New Yorkに記載または参照される。タンパク質の
精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法
、遠心分離法、結晶化法などのような方法を含む。例えば、Ausubelら（1987お
よび定期的補遺）；Deutscher（1990）「Guide to Protein Purification」Meth ods in Enzymology
，第182巻およびこのシリーズの他の巻；ならびにタンパク質
精製産物の使用についての製造者の文献、例えば、Pharmacia，Piscataway，N.J
.、またはBio-Rad，Richmond，CAを参照のこと。組換え技法との組み合わせは、
適切なセグメントへの、例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去可能な配列に
よって融合され得る等価物への融合を可能にする。例えば、Hochuli（1989）Che mische Industrie
12:69-70；Hochuli（1990）「Purification of Recombinant
Proteins with Metal Chelate Absorbent」Setlow(編)Genetic Engineering ，Pr inciple and Methods
12:87-98，Plenum Press，N.Y.；およびCroweら（1992）Q IAexpress:The High Level Expression & Protein Purification System
QUIAGE
N，Inc.，Chatsworth，CAを参照のこと。
コンピュータ配列分析を、例えば、GCG（U．Wisconsin）およびGenBank供給源
からのものを含む利用可能なソフトウエアプログラムを使用して行う。公表の配
列データベース(例えば、GenBankなどによる）も、使用した。
IL-4およびIL-10に適用可能な多くの技法は、例えば、米国特許第5,017,691号
（IL-4）、米国特許出願第07/453,951号（IL-10）、および米国特許出願第08/11
0,683号（IL-10レセプター）に記載のように、IL-1γに適用され得る。
II．PCRによるヒトIL-1γフラグメントの増幅
２つのプライマーを選択する（配列番号１を参照のこと）。RT-PCRを、メッセ
ージの存在について選択した適切なmRNA試料で使用して、cDNA、例えば、活性化
ヒト単球細胞試料を産生する。
III．ヒトIL-1γの組織分布
IL-1γをコードする遺伝子についてのメッセージは、樹状細胞で検出されてい
る。発現は、５日目の樹状細胞、LPS活性化樹状細胞、GM-CSFおよびIL-4処理樹
状細胞で、および樹状細胞の混合物で高い。Ｂ細胞またはNK細胞では、高い発現
は検出されていない。いくつかの単球細胞cDNAライブラリーで、低レベルが検出
された。発現は、一般的には胎児組織では検出されないが、胎児牌臓、肺、およ
び小腸では低レベルが見られた。低レベルはまた、胎児胆嚢、および成人扁桃で
検出される。
IV．マウスIGIFタンパク質の産生
GST融合構築物を、E．coliでの発現のために操作した。タンパク質を発現させ
、そして標準的手順を使用して精製した。類似の方法は、ヒトIL-1γに適用可能
である。
マウスIGIF pGexプラスミドを構築し、そしてE．coliに形質転換した。新鮮な
形質転換細胞を、50μｇ/mlアンピシリンを含むLB培地で培養し、そしてIPTG（S
igma，St．Louis，MO）で誘導した。一晩の誘導後、細菌を採取し、そしてIGIF
を含むペレットを単離した。ペレットを、２リットルのTE緩衝液（50mM Tris塩
基pH8.0、10mM EDTA、および2mM pefabloc）でホモジナイズした。この物質を、
ミクロフルイダイザー（Microfluidics，Newton，MA）を３回通した。流動化し
た上清を、SorvallGs-3ローターで13,000rpmにて１時間回転させた。IGIFを含む
得られた上清を濾過し、そして50mM Tris塩基pH8.0で平衡化したグルタチオン-S
EPHAROSEカラムに通した。IGIF-GST融合タンパク質を含む画分をプールし、そし
てトロンビン（Enzyme Research Laboratories，Inc.，South Bend，IN）で
切断した。次いで、切断したプールを、50mM Tris塩基で平衡化したQ-SEPHAROSE
カラムに通した。IGIFを含む画分をプールし、そして冷たい蒸留H2Oで希釈して
、伝導率を低下させ、そして新しいQ-Sepharoseカラムに再度通した。IGIFを含
む画分をプールし、小分けし、そして−70℃フリーザーで保存した。
マウスIL-1βとのCDスペクトルの比較は、タンパク質が正確に折り畳まれるこ
とを示唆する。Hazudaら（1969）J ．Biol．Chem．264:1689-1693を参照のこと。
Ｖ．マウスIGIFでの生物学的アッセイ
生物学的アッセイで、Ｔ細胞におけるIFN-γ誘導活性を確認した。IGIFは、精
製したNK細胞によるIFN-γの産生を刺激し、そしてその誘導は、IL-12またはIL-
2と強く相乗作用する。同様のアッセイを、ヒトIL-1γで行う。
マウスIGIFは、例えば、ヒトレセプターを介して、ヒト細胞で効率的に機能し
ないようである。
マウスIGIFは、上記のように、SCIDマウスからの牌臓細胞によってIFN-γを誘
導することを確立した。したがって、牌臓細胞は、マウスIGIFに対するレセプタ
ーを発現する。誘導はまた、IL-12またはIL-2と相乗作用する。
マウスIGIFはまた、IL-12（およびTNF-α）と組み台わせて、IL-2活性化NK細
胞を誘導して、IFN-γを産生した。IL-2活性化NK細胞の場合、抗IL-1βでの処理
がIFN-γ産生をブロックするので、この誘導はIL-1β依存的であるようである。
マウスIGIFは、このブロックを克服し、そしてIFN-γを誘導し得る。
VI．IL-1γに特異的な抗体の調製
近交Balb/cマウスを、ヒトタンパク質の組換え形態で、例えば、精製した可溶
性IL-1γFLAGまたは安定にトランスフェクトしたNIH-3T3細胞で、腹腔内に免疫
する。動物に、追加のアジュバントありまたはなしで、適切な時点にタンパク質
で追加免疫して、抗体産生をさらに刺激する。血清を採集するか、または採取し
た脾臓を用いてハイブリドーマを産生する。
あるいは、Balb/cマウスを、遺伝子またはそのフラグメントで形質転換した細
胞で、内因性または外因性のいずれかの細胞、または抗原の発現に富む単離され
た膜で、免疫する。血清を、適切なときに、代表的には、多数のさらなる投与後
に採集する。種々の遺伝子治療技法が、例えば、インサイチュでタンパク質を産
生するにおいて、免疫応答を生じるために有用であり得る。
モノクローナル抗体を作成し得る。例えば、牌臓細胞を、適切な融合パートナ
ーと融合させ、そしてハイブリドーマを、標準的手順によって増殖培地中で選択
する。ハイブリドーマ上清を、例えば、ELISAまたは他のアッセイによって、ヒ
トIL-1γに結合する抗体の存在についてスクリ−ニングする。ヒトIL-1γを特異
的に認識するが種改変体を認識しない抗体もまた選択し、そして調製し得る。
他の方法では、合成ペプチドまたは精製したタンパク質を、モノクローナルま
たはポリクローナル抗体を生成するための免疫系に提示する。例えば、Coligan
（1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene；およびHarlowおよび
Lane（1989）Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Pressを参
照のこと。適切な状況では、結合試薬は、上記のように、例えば、蛍光などで標
識されるか、またはパンニング方法についての基質に固定されるかのいずれかで
ある。核酸もまた、動物において細胞に導入されて、抗原を産生し得、これは免
疫応答を誘発するように作用する。例えば、Wangら（1993）Proc ．Nat'l．Acad ．Sci．
90:4156-4160；Barryら（1994）BioTechniques 16:616-619；およびXian
gら（1995）Immunity 2:129-135を参照のこと。
VII．IL-1γとの融合タンパク質の産生
種々の融合構築物を、IL-1γを用いて作成する。遺伝子のこの部分を、エピト
ープタグ（例えば、FLAGタグ）に、またはツーハイブリッドシステム構築物に融
合させる。例えば、FieldsおよびSong（1989）Nature 340:245-246を参照のこと
。
エピトープタグを、抗FLAG抗体での検出を伴なう発現クローニング手順におい
て使用して、結合パートナー（例えば、IL-1γに対するレセプター）を検出し得
る。ツーハイブリッドシステムもまた使用して、IL-1γに特異的に結合するタン
パク質を単離し得る。
VIII．インサイチュハイブリダイゼーションによるヒトIL-1γのマッピング
染色体スプレッドを調製する。インサイチュハイブリダイゼーションを、72時
間培養したフィトヘマグルチニンで刺激したヒトリンパ球から得られた染色体調
製物で行う。5-ブロモデオキシウリジンを、培養の最後の７時間添加し（60μｇ
/培地1ml）、良好な質のハイブリダイゼーション後染色体バンド法を確実にする
。
総Ｂ細胞cDNAテンプレートについてプライマーの援助を用いて増幅した適切な
フラグメント（例えば、PCRフラグメント）を、適切なベクター中にクローニン
グする。ベクターを、3Hでのニックトランスレーションによって標識する。放射
標識したプローブを、Matteiら（1985）Hum ．Genet．69:327-331に記載のように
、中期スプレッドにハイブリダイズさせる。
核飛跡乳濁剤（KODAK NTB2）でのコーティング後、スライドを、例えば、４℃
にて18時間曝露する。バンド法手順中の銀粒の滑りを避けるために、染色体スプ
レッドを、最初に、緩衝化ギムザ溶液で染色し、そして中期写真撮影する。次い
で、Ｒバンド法を、蛍光色素−光分解−ギムザ（FPG）方法によって行い、そし
て分析前に中期を再度写真撮影する。
IX．構造活性相関
特定の残基の臨界についての情報を、標準的手順および分析を使用して決定す
る。標準的変異誘発分析を、例えば、決定された位置で、例えば、上記で同定さ
れた位置で、多くの異なる改変体を生成し、そして改変体の生物学的活性を評価
することによって行う。これは、活性を改変する位置を決定する程度まで、また
は生物学的活性を保持、ブロック、もしくは調節のいずれかのために置換され得
る残基を決定するために特異的な位置に焦点を絞るために、行われ得る。
あるいは、天然の改変体の分析は、どの位置が天然の変異を容認するかを示し
得る。これは、個体のうちの、または系統もしくは種にまたがる、偏差の母集団
分析から得られ得る。選択された個体由来の試料を、例えば、PCR分析および配
列決定によって、分析する。これは、母集団多型の評価を可能にする。
Ｘ．ヒトIL-1γに対するレセプターの単離
ヒトIL-1γを、その結合の特異性を利用することによって、その結合パートナ
ーを同定するための特異的試薬として使用し得、同様に抗体を使用する。結合試
薬を、例えば、蛍光などで、上記のように標識するか、またはパンニング方法の
ための基質に固定するかのいずれかする。
結合組成物を使用して、結合パートナー（すなわちレセプター）を発現する細
胞株から作成される発現ライブラリーをスクリーニングする。標準的染色技法を
使用して、細胞内もしくは表面で発現されたレセプターを検出または分類するか
、あるいは表面発現する形質転換した細胞を、パンニングによってスクリーニン
グする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色または免疫蛍光手順によっ
て行う。McMahanら（1991）EMBO J ．10:2821-2832もまた参照のこと。
例えば、０日目に、2-チャンバーpermanoxスライドを、PBS中フイブロネクチ
ンl0ng/mlのチャンバー当たり１mlで、室温にて30分間プレコーティングする。P
BSで１回リンスする。次いで、1.5mlの増殖培地中チャンバー当たり２〜３×105
細胞でCOS細胞をプレーティングする。37℃にて一晩インキュベートする。
各試料について１日目に、66μｇ/ml DEAE-デキストラン、66μM クロロキン
、および４μｇ DNAの無血清DMEの0.5mlの溶液を調製する。各セットについて、
例えば、１および1/200希釈のヒトIL-1γ-FLAG cDNAの、陽性コントロール、お
よび陰性模擬物を調製する。細胞を無血清DMEでリンスする。DNA溶液を添加し、
そして37℃にて５時間インキュベートする。培地を除去し、そしてDME中10％DMS
Oの0.5mlを2.5分間添加する。これを除去しそしてDMEで１回洗浄する。1.5mlの
増殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする。
２日目に、培地を交換する、３または４日目に、細胞を固定し、そして染色す
る。細胞をハンクス緩衝化生理食塩溶液（HBSS）で２回リンスし、そして４％パ
ラホルムアルデヒド（PFA）／グルコースで５分間固定する。HBSSで３回洗浄す
る。全ての液体を除去した後、スライドを−80℃で保存し得る。各チャンバーに
ついて、0.5mlのインキュベーションを、以下のように行う。32μｌ/mlの1M NaN3
とともにHBSS/サポニン（0.1％）を20分間添加する。次いで、細胞を、HBSS/サ
ポニンで１回洗浄する。ヒトIL-1γまたはIL-1γ/抗体複合体を細胞に添加し、
そして30分間インキュベートする。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。適切
ならば、第１の抗体を30分間添加する。二次抗体、例えば、ベクター抗マウス抗
体を、1/200希釈で添加し、そして30分間インキュベートする。ELISA溶液、例え
ば、Vector Elite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を調製し、そして30分間
プレインキュベートする。例えば、2.5ml HBSS/サポニン当たり１滴の溶液Ａ（
アビジン）および１滴の溶液Ｂ（ビオチン）を使用する。細胞をHBSS/サポニン
で２回洗浄する。ABCHRP溶液を添加し、そして30分間インキュベートする。細胞
をHBSSで２回洗浄し、２回目の洗浄は２分間で、これは細胞の間を詰める。次い
で、ベクタージアミノ安息香酸（DAB）を５〜10分間添加する。ガラス蒸留した
水５ml当たり２滴の緩衝液＋４滴のDAB＋２滴のH2O2を使用する。注意深くチャ
ンバーを取り出し、そしてスライドを水でリンスする。２、３分間空気乾燥させ
、次いで１滴のCrystal Mountおよびカバースリップを添加する。85〜90℃で５
分間焼く。
陽性染色のプールを評価し、そして結合に応答性の単一の遺伝子の単離のため
に漸次サブクローニングする。
あるいは、IL-1γ試薬を使用して、レセプターを発現する細胞をアフィニティ
ー精製または分別する。例えば、SambrookらまたはAusubelらを参照のこと。
他の方策は、パンニングによって膜結合したレセプターをスクリーニングする
ことである。レセプターcDNAを、上記のように構築する。リガンドを、固定しそ
して発現細胞を固定するために使用し得る。固定化は、例えば、IL-1γ融合構築
物のFLAG配列を認識する適切な抗体の使用によって、または第１の抗体に対して
惹起された抗体の使用によって、達成され得る。選択および増幅の反復サイクル
は、適切なクローンの富化およびレセプター発現クローンの最終的単離を導く。
フアージ発現ライブラリーは、ヒトIL-1γによってスクリーニングされ得る。
適切な標識技法（例えば、抗FLAG抗体）は、適切なクローンの特異的標識を可能
にする。
本発明の多くの改変および変更は、当業者に明らかであるので、その意図およ
び範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書に記載の特定の実施態様は、
実施例によってのみ提供され、そして本発明は、添付の請求の範囲の用語によっ
て、このような請求の範囲が与える同義語の全範囲とともに限定されるべきであ
る；そして本発明は、実施例によって本明細書に示されている特定の実施態様に
よって限定されるべきでない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Human interleukin-lj and its antagonist
Field of the invention
The present invention relates to compositions and methods for affecting the human immune system. In particular
Regulates the response and development of the immune system, nucleic acids, proteins, and antibodies and
Other antagonists are provided. The diagnostic and therapeutic uses of these substances are also disclosed.
You.
Background of the Invention
Recombinant DNA techniques generally involve subsequent processing, for example, by introduction into a host.
The genetic information from the donor source into the vector for
Technology that allows the transferred genetic information to be copied and / or expressed in a new environment
Say. Usually, the genetic information is a messenger-RNA that encodes the desired protein product
Exists in the form of complementary DNA (cDNA) derived from (mRNA). Career often
Has the ability to take up the cDNA for later replication in the host, and
In some cases, it has the ability to actually control cDNA expression, thereby
Plasmid that directs the synthesis of the loaded product.
For some time, the mammalian immune response is a series of events called the "immune network."
It is known to be based on complex cell interactions. Recent research has shown this net
It provided new insights into the internal workings of the workpiece. Many responses are actually lymphocytes
Around network-like interactions of cells, macrophages, granulocytes, and other cells
Although it remains clear that circulating, immunologists are now generally
Soluble proteins known as hokines, cytokines, or monokines
Have an opinion that it plays an important role in controlling these cell interactions.
Therefore, the mechanism of isolation, characterization, and action of cell regulatory factors is critical.
The understanding is important for the diagnosis and diagnosis of many medical abnormalities (eg, immune system disorders).
And lead to significant advances in treatment.
Lymphokines apparently mediate cellular activity in a variety of ways. These are multiple
Pluripotency to a very large number of progenitor cells, including separate cell lines that make up a complex immune system
It has been shown to support the proliferation, growth, and differentiation of sexual hematopoietic hepatocytes. Cell formation
A proper and harmonious interaction of minutes is necessary for a healthy immune response. Linho
When caine is administered with other drugs, different cell lines often have different
Respond in a manner that suits you.
Cell lines of particular importance for the immune response include two classes of lymphocytes: the immunoglobulin.
Blin, which has the ability to recognize and bind foreign substances to perform its removal
B cells capable of producing and secreting proteins) and secreting lymphokines
Subsets of T cells and immune cells that induce and suppress B cells
Various other cells that make up the network, including other T cells. These lymphocytes
Interacts with many other cell types.
Another important cell line is mast cells (which are positive in all mammalian species).
Unidentified), which contains granules throughout the body proximal to the capillaries.
Connected tissue cells. These cells are found in the lung, skin, and gastrointestinal tract and urinary
It is found at particularly high concentrations in incubator tubes. Mast cells are used in allergy-related diseases, especially
Plays a central role in anaphylaxis as follows: selected anti
Gen is a class of immunoglobulins that bind to mast cell surface receptors.
When cross-linked, mast cells degranulate and allergic reactions (eg,
Mediators that cause phylaxis (eg histamine, serotonin)
, Heparin, and prostaglandins).
Research to better understand and treat various immune diseases has led to
The general lack of sustainability in the in vitro is hindering. Immunologists say that
In culturing these cells, T cells and other cell supernatants (many lymphokines are
(Including a variety of growth factors).
Okamura et al. (1995)Nature 378: 88-91 induces specific T cells and
Describes a new cytokine that produces E. coli γ (IFN-γ).
Is named IGIF. This factor is expressed in mouse Kupffer cells and activated
Identified in Clofarge. To date, no human equivalent has been described.
From the above, the discovery and development of new lymphokines has been linked to the immune system and / or
New cures for a wide range of degenerative or abnormal conditions involving blood cells directly or indirectly
It is clear that it can contribute to treatment. In particular, the beneficial activity of known lymphokines
The discovery and development of promoting or enhancing lymphokines is highly advantageous. Departure
Ming discloses new interleukin compositions and related compounds and their use
Provide a way.
Summary of the Invention
The present invention relates to primate (eg, human) interleukin-1γ (IL-1γ) and
Regarding its biological activity. This is the nucleic acid that encodes the polypeptide itself, as well as
And methods of their production and use. The nucleic acids of the invention are included herein.
By homology to the cloned complementary DNA (cDNA) sequence and / or
IL-1γ activity applied to polypeptides typically encoded by these nucleic acids
Characterized in part by functional assays for gender. Controlling the immune response
Are provided.
The present invention relates to the discovery of a human cDNA capable of expressing a protein having IL-1γ activity and
Based in part on cloning. An equivalent vector is the polymerase chain reaction (PC
R) can be constructed by using techniques and sequences of inserts.
The invention is particularly directed to substantially pure primate IL-1γ, fusions comprising a primate IL-1γ sequence.
Proteins, antibodies specific for binding to primate IL-1γ, and human IL-1γ or
A nucleic acid encoding the fusion protein of
In an embodiment of substantially pure IL-1γ, IL-lγ is an antigen as defined in SEQ ID NO: 2.
It may include the mature sequence contained within the amino acid sequence. The latter sequence is a representative signal
IL-1b prodomain not sequence but cleaved by convertase-like enzyme
It extends from amino acid position 1 (met) to about position 36 (asp) like a pro sequence similar to
Including a signal sequence. Dinarello (1994)FASEB J .See 1314-1325
thing. The mature protein should start at about position 37 (tyr). Alternatively, IL-1
γ may exhibit a different post-translational modification pattern than native IL-1γ. In another embodiment,
The composition comprises primate IL-1γ and a pharmaceutically acceptable carrier. Typically
, IL-1γ can be used alone or in combination with IL-12 or IL-2 by T cells or NK cells.
Combination
Together, it can induce IFN-γ production.
The fusion proteins of the invention are covalently linked to IL-1γ, or a binding partner
Includes substantial fragments of IL-1γ. In one fusion protein embodiment, the
The protein may comprise the sequence of SEQ ID NO: 2 and / or another cytokine or chemokine.
In sequence. Such proteins are located at positions 88 (tyr) to 96 (met)
Or a modification in the sequence corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 2;
may exhibit gamma agonist activity, and may be at positions 37 (tyr) to 82 (ile) or 102 (v
al) A substitution in the sequence corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 2 from position 191 to (asn)
May be included.
In another fusion protein embodiment, the drug rate of IL-1γ or a fragment thereof is
The stoichiometric half-life may be different for other polypeptides (eg, immunoglobulin (Ig) chains, preferably
PEGylation (pegylati) or sometimes by conjugation to the constant region (Fc).
on) by attachment to a polyethylene glycol (PEG) molecule called
. Such fusion proteins are called IL-1γ-Ig and PEG-IL-1γ, respectively.
Can be Polyethylene glycol (PEG) groups and Ig chains, some or other
Methods for linking a polypeptide to a protein are well known in the art.
For example, various cytokines to increase the circulating half-life of cytokines
International Patent Application Publication describes fusion of a polypeptide derived from an immunoglobulin chain to a polypeptide
See WO 96/18412. Methods for attaching PEG to proteins include, for example, Da
vis et al. (U.S. Pat. No. 4,179,337); Nakagawa et al. (U.S. Pat. No. 4,791,192);
And Nitecki et al. (US Pat. No. 4,902,502).
In certain antibody embodiments, IL-1γ is a human protein;
Antibody raised against purified primate IL-1γ.
Raised; the antibodies are monoclonal antibodies; or the antibodies are labeled.
In various nucleic acid embodiments, the IL-1γ is from a human; the nucleic acid (eg, SEQ ID NO:
No. 1) encodes the peptide sequence of SEQ ID NO: 2; the nucleic acid is an expression vector;
Or the nucleic acid comprises a deoxyribonucleic acid nucleotide.
The invention also relates to a substantially pure primate IL-1γ, or a fragment thereof;
An antibody that specifically binds long IL-1γ; or human IL-1γ or a peptide
Kits containing the nucleic acids to be loaded. A variety of these kits can be qualitative or quantitative
An analysis can be performed.
Another embodiment of the invention encompasses a method of modulating the physiology or development of a cell.
This can be a cell, or an immune system containing cells, that is an agonist of primate IL-1γ or
Contacting with an antagonist. This is because the contact step is IL-2
And / or methods that are in combination with IL-12. Alternatively, the present invention
Contacting with an antagonist (eg, an antibody against primate IL-1γ)
And in combination with an antagonist to IL-2 and / or IL-12
Provides a method that can be combined. Often, modulating regulates IFN-γ production.
And contacting with an agonist of human IL-1γ. Other fruit
In embodiments, modulating comprises: infectious disease; vaccine response; allergic response;
T helper-mediated response; or regulation of cancer.
Description of the invention
All references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
Incorporated.
The present invention relates to a human interface having certain predetermined properties, both structural and biological.
-Provides the amino acid and DNA sequences of the leukin molecule, which are
Named human interleukin-1γ (IL-1γ). CDNA encoding this molecule
Was obtained from an activated human monocyte cDNA library and was named M1.
Several standard methods are described, for example, in Maniatis et al. (1982)Molecular Cloning , A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Pr
ess; Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second edition)
, Volume 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al.,Biology, Greene Publishing Associates
, Brooklyn, NY; or Ausubel et al. (1987 and periodic addendum)Current Protocols in Molecular Biology
, Greene / Wiley, New York;
Are each incorporated herein by reference.
Isolation of the human gene solved an uncertainty that did not ensure its isolation at all. this
Their uncertainties include (1) whether a human counterpart of the mouse protein exists; (2
)
Level of similarity of the encoding nucleic acid sequence; (3) anywhere in the sequence, useful for PCR approach
(4) a source useful for isolating the natural cDNA gene portion;
Level of expression providing a source; (5) expression clones using, for example, mouse cells.
Cross-species biological activity useful in the context of tanning; and (6) antibody binding
Important to the approach is immunological antibody cross-reactivity. Successful cross-species isolation
There are many other problems with guiding.
The complete nucleotide sequence of the human IL-1γ coding segment (SEQ ID NO: 1) and
The corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) is provided in the sequence listing. Human isolates
Mouse homologues, with about 71% identity at the nucleotide level; and
And about 65% identity at the amino acid level.
As used herein, IL-1γ is a mature amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Or a protein containing a sequenced protein or peptide segment, or
Used to describe a substantial fragment of The present invention also provides muteina
Gonists or antagonists. Typically, such agonists
Show less than about 10% sequence divergence, and therefore often 1-11 fold substitutions
Having. The invention relates to alleles and other variants of the described proteins (eg,
For example, natural polymorphisms) are also included. The present invention typically relates to the corresponding organism
High affinity for biological receptors, e.g., at least about 100 nM, usually about 30 nM.
Better, preferably better than about 10 nM, and more preferably better than about 3 nM
And combine. The term also refers to the related naturally occurring form of the human protein (
For example, alleles, polymorphic variants, and metabolic variants)
used.
The invention also provides for substantial amino acid sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
The corresponding IGIF that includes the protein or peptide that has but is found in mice
Any that show substantially the same or less amino acid sequence homology to the protein
Exclude proteins or peptides. The present invention provides for relatively few substitutions (eg,
(Preferably less than about 3-5 substitutions).
A substantial polypeptide "fragment" or "segment" has at least
About 8 amino acids, typically at least 10 amino acids, more usually at least 12 amino acids
Amino acids, often at least 14 amino acids, more often at least 16 amino acids
Typically at least 18 amino acids, more typically at least 20 amino acids,
Always at least 22 amino acids, more usually at least 24 amino acids, preferably fewer
At least 26 amino acids, more preferably at least 28 amino acids, and particularly preferred
In embodiments, the range of amino acid residues is at least about 30 or more amino acids. Different
The sequences of different protein segments are compared to each other over a range of appropriate lengths.
Can be
Amino acid sequence homology, or sequence identity, if necessary, is
Determined by optimizing the residue match by introducing a loop. An example
For example, Needleham et al., (1970)J . Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff et al., (1983)Time Warps , String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparsion
Chapter 1, Addison-Wesley, Reading, MA; and IntelliGe
software packages from netics, Mountain View, CA; and University
See of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI;
Each of these is incorporated herein by reference. This is like fitting
Changes when considering conservative substitutions. Conservative substitutions are typically made within the following groups:
Including the substitutions: glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; Aspa
Laginic acid, glutamic acid; asparagine, glutamine; serine, threonine;
Gin, arginine; and phenylalanine, tyrosine.
Homologous amino acid sequences include natural alleles and interspecies variants in the cytokine sequence.
It is intended to include A representative homologous protein or peptide is SEQ ID NO: 2
50-100% homology with the amino acid sequence segment (if a gap can be introduced)
) To 60-100% homology (if conservative substitutions are introduced). Group of homology
Standards are at least about 70%, typically at least 76%, and more usually at least
Also 81%, often at least 85%, more often at least 88%, typically less
At least 90%, more typically at least 92%, usually at least 94%, more usually
At least 95%, preferably at least 96%, and more preferably less
At least 98%, and in a particularly preferred embodiment at least 98%. Homology
Depends on the length of the segment being compared. Allelic variant
A homologous protein or peptide such as is similar to the embodiment set forth in SEQ ID NO: 2.
Share most biological activities. Preferably, the related polypeptides are
Such a matching fragment is, for example, at least 2, preferably 3,4
5, or more specific or classified lengths.
As used herein, the term "biological activity" refers to anti-type I or anti-type II IL.
IFN- in combination with IL-12 or IL-2, with or without -1 receptor antibody
Induce the synergistic effect of γ on the spleen cells, or the same as human IL-1γ above or
Indicates the receptor binding and cross-reactivity with antibodies raised against polymorphic variants
Used to describe, without limitation, the further structural properties of
The terms ligand, agonist, antagonist, and analog are IL-1γ or
Are molecules that regulate the characteristic cellular response to IL-1γ-like proteins, and examples
For example, if the receptor is a natural receptor or antibody, the ligand-receptor
Molecules that have more standard structural binding competition characteristics of the ter interaction. Cell response
Is probably IL to a cellular receptor different from the type I or type II IL-1 receptor
It is mediated by -1γ binding. Also, the ligand binds to the receptor
Is a molecule that acts as any natural ligand to which the analog binds
Or a molecule that is a functional analog of a natural ligand. Functional analog
Can be a ligand with a structural modification or interact with an appropriate ligand binding determinant.
It can be a completely unrelated molecule with a working molecular shape. The ligand is Agoni
Can act as a strike or antagonist. For example, Goodman et al. (Eds.) (1990)
)Goodman &Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon
See Press, New York.
Reasonable drug design also requires receptors or antibodies and other effectors.
Based on structural studies of the molecular shape of the ligand or ligand. Effector Riga
Interacts with other proteins or receptors that mediate other functions in response to
It may be another protein that interacts normally. Which sites are specific other proteins
One means for determining whether to interact with is a physical structure determination method, for example,
, X-ray crystallography or two-dimensional NMR techniques. These are the amino acid residues
Provides guidance on forming a contact area. Detailed protein structure determination
Record
See, for example, Blundell and Johnson (1976)Protein Crystallograp hy
See, Academic Press, New York.
Human IL-1γ protein has many different biological activities. Human IL-1γ
Is homologous to the mouse IGIF protein but has structural differences. For example, human IL
The -1γ gene coding sequence has a nucleotide coding sequence of mouse IGIF of only about 71
% Homology. At the amino acid level, there is about 64% identity. This of similarity
Levels indicate that the new IL-1γ protein is related to other IL-1α and IL-1β
Suggests.
The mouse IGIF molecule has a fairly minimally defined biological activity. Especially the spleen
It has the ability to stimulate IFN-γ production, which increases NK activity in kidney cells. 0kamur
a et al. (1995)Nature See 378: 88-91.
Murine IL-1α, IL-1β, and IGIF activities were measured in SCID spleen cells and purified NK cells.
Induces IFN-γ alone or in combination with IL-2 or IL-12
Have been compared for their ability to do so. Hunter et al. (1995)J . Immunol.155: 4347-435
4; and Bancroft et al. (1991)Immunol . Revs.See 124: 5-xxx. IGIF
Are much more potent at stimulating IFN-1γ than IL-1α or IL-1β
Was found.
In NK cells activated by IL-2, IFN-γ production is blocked by the addition of anti-IL-1β antibody.
Locked. See Hunter et al. (1995). However, the mouse IGIF
Can overcome lock and induce IFN-γ. It is known that this can be done
Is the only cytokine. Furthermore, in vivo, the parasite T. Infected with Cruzi
Administration of mouse IGIF to mice significantly reduces parasitemia.
The present disclosure also describes new activities discovered using the mouse IGIF molecule.
I do. Applicants have identified a human IL-1γ protein similar to the one characterized herein.
A mouse IGIF molecule produced by recombinant means has a T-cell to produce IFN-γ.
It was confirmed to show a biological activity of inducing vesicles. For example, de Waal Malefyt et al.
, De Vries and de Waal Malefyt (eds., 1995) "Interleukin-10" Landes Co.
See Assay, Austin, TX. This is also due to IFN-
Stimulates γ moderately. However, as in the case of humans above, substantial synergy with IL-12
Action
There is.
Cross-species biological activity has not yet been detected in these assays (eg,
The biological activity of mouse IGIF in human cells has not yet been demonstrated)
The activity of human IL-1γ has also not been demonstrated in mouse cells. This is because many different
Receptors predicted to contain a repeptide chain have specific properties for their corresponding ligands.
Suggests showing the opposite sex. IL-1α and IL-1β ligands are both heterodimers
Sends a signal through the mer receptor.
The invention further relates to an isolated nucleic acid or fragment (e.g., the protein
Quality or closely related proteins, or fragments thereof,
That encode to encode a sexually corresponding polypeptide)
You. In addition, the present invention relates to biologically active proteins or characteristic IL-1γ activities.
Cover isolated or recombinant DNA encoding a polypeptide having the same. Teens
Typically, the nucleic acid is hybridized with the nucleic acid sequence segment of SEQ ID NO: 1 under appropriate conditions.
Can be redisused. This biologically active protein or polypeptide has the full length
Can be a protein or fragment, and is typically represented by SEQ ID NO: 2.
It has segments of amino acid sequence that are highly homologous to those. Further, the present invention provides
A protein having a fragment homologous to the disclosed IL-1γ protein
Use of isolated or recombinant nucleic acids, or fragments thereof,
For covering. The isolated nucleic acid has the respective regulatory sequences 5 'and 3' adjacent,
For example, promoters, enhancers, polyA addition signals, and natural genetics
May have others from offspring.
An "isolated" nucleic acid is a nucleic acid, e.g., RNA, DNA, or a mixed polymer.
Is defined herein to mean that is substantially pure, for example,
Natural such as ribosomes, polymerase, and flanking genomic sequences from the species of origin
The intact sequence is separated from other components that naturally accompany it. This term is a naturally occurring term
Contain nucleic acid sequences removed from the environment, and
Algae, whereby they are naturally occurring compositions, and chemically synthesized
Analog or biologically synthesized analog by a heterologous system
Can be A substantially pure molecule is a fraction of either completely pure or substantially pure.
Includes isolated forms of offspring.
An isolated nucleic acid is generally a homogeneous composition of molecules, but in some implementations.
Embodiments include heterogeneity (preferably little). This heterogeneity is typically
Are found at polymer ends or moieties that are not important for the desired biological function or activity.
Will be issued.
"Recombinant" nucleic acids are used herein either according to their method of production or their structure.
Is defined by For production methods, e.g., products made by the process
This process involves, for example, recombinant nucleation involving human intervention in the nucleotide sequence.
The use of acid technology. Typically, this intervention involves in vitro manipulation,
Under certain circumstances, more classic animal breeding techniques may be involved. Or each other
By generating a sequence comprising a fusion of two fragments that are not naturally adjacent
Can be a created nucleic acid, but is a natural product, e.g., found in its natural state
As well as eliminating naturally occurring variants. So, for example,
Created by transforming cells with any non-naturally occurring vector
The product contains sequences derived using any synthetic oligonucleotide process
Like nucleic acids, they are included. Such processes often remove certain codons,
Done to replace duplicate codons encoding the same or conservative amino acids
Typically, this is performed by introducing or removing a restriction enzyme sequence recognition site.
You.
Alternatively, the process can be carried out using, for example, a commonly available
Produce a single genetic unit that contains the desired combination of functions not found in the functional native form
And a nucleic acid segment having a desired function. Restriction yeast
Primal recognition sites are often targets for such artificial manipulations, but other site-specific
Target (eg, a promoter, DNA replication site, regulatory sequence, regulatory sequence, or other
Features can be introduced by design. Similar concepts apply to recombinant (eg, fusion)
G) intended for polypeptides. This includes dimer repeats. In particular
Encodes a polypeptide similar to a fragment of IL-1γ by genetic code duplication.
Synthetic nucleic acids, and a variety of different interleukins or related molecules (eg,
, Growth factors).
A "fragment" in the context of nucleic acids is at least about 17 nucleotides, generally
Is at least 21 nucleotides, more usually at least 25 nucleotides, usually
Is at least 30 nucleotides, more usually at least 35 nucleotides, often
At least 39 nucleotides, more often at least 45 nucleotides, typical
At least 50 nucleotides, more typically at least 55 nucleotides,
Usually at least 60 nucleotides, more usually at least 66 nucleotides, preferably
Or at least 72 nucleotides, more preferably at least 79 nucleotides
And, in a particularly preferred embodiment, a contiguous sequence of at least 85 or more nucleotides
Defined herein to mean a segment. Typically, various remains
Fragments of the sequences can be compared to one another over a suitable length range.
The nucleic acid encoding IL-1γ encodes itself or a closely related protein.
Gene, mRNA, and cDNA species to be administered, and, for example, from different individuals,
Identify DNA encoding polymorphic variants, allelic variants, or other genetic variants
It is particularly useful for Preferred probes for such screening are
Containing nucleotides that are conserved or have non-specificity between different polymorphic variants
Interleukin region, and is preferably full length or almost full length
. In other situations, polymorphic variant-specific sequences are more useful.
The present invention further provides the same or a high degree of homology to the isolated DNA described herein.
Recombinant nucleic acid molecules and fragments having different nucleic acid sequences. In particular,
Sequences often form DNA segments that control transcription, translation, and DNA replication.
Movably connected. These additional segments typically comprise the desired nucleic acid sequence.
To the development of the pigment.
Homologous nucleic acid sequences when compared to each other or to the sequence of SEQ ID NO: 1
Show similarity. Standards for homology in nucleic acids can be obtained by sequence comparisons.
A homology criterion commonly used in the field or hybridization
Either of the criteria for homology based on the Comparative hybridization
The optional conditions are described in more detail below.
Substantial homology in the context of nucleic acid sequence comparison is the ratio of the segment or its complement.
When compared to an appropriate nucleotide insertion or deletion,
At least about 60% nucleotides, typically at least 66%, usually at least
Even 71%, often at least 76%, more often at least 80%, usually less
Both 84%, more usually at least 88%, typically at least 91%, more representative
Typically at least about 93%, preferably at least about 95%, more preferably less
At least about 96-98%, and in a particularly preferred embodiment, at least about 99%,
Same for leotide.
Alternatively, substantial homology is achieved when the segment is selectively hybridized.
Under conditions, typically using a sequence derived from SEQ ID NO: 1, a single strand or
Present when hybridizing to its complement. Typically, selective hybridization
Dilation can range from at least about 14 nucleotides and at least about
55% homology, more typically at least about 65%, preferably at least about 75%,
And more preferably when there is at least about 90%. Kanehisa (1984)Nuc . Acids Res.
12: 203-213, which is incorporated herein by reference.
It is. As noted above, the homology comparison length can span a longer range and
In embodiments, at least about 17 nucleotides, typically at least about 20 nucleotides,
Otides, usually at least about 24 nucleotides, usually at least about 28 nucleotides
, Typically at least about 32 nucleotides, more typically at least about 40 nucleotides.
Nucleotides, preferably at least about 50 nucleotides, and more preferably
It ranges from at least about 75 to 100 or more nucleotides. Preferably
Related nucleic acids can be any number of such compatible fragments, for example, at least
Also include 2, preferably 3, 4, 5 or more specific or graded lengths.
When referring to homology in the context of hybridization, stringent conditions
Is typically used in salts, temperatures, organic solvents, and hybridization reactions.
Stringent combination of other parameters to be controlled. Story
The transient temperature conditions are usually above about 30 ° C, more usually above about 37 ° C,
Typically above about 45 ° C., more typically above about 55 ° C., preferably about 65 ° C.
And more preferably above about 70 ° C. Stringent
Salt conditions are usually less than about 500 mM, usually less than about 400 mM, and more usually less than about 300 mM.
, Typically less than about 200 mM, preferably less than about 100 mM, and more preferably about 80 mM.
below mM and even down to less than about 20 mM. But the combination of parameters
Is
Much more important than any single parameter criterion. For example, Wetmur
And Davidson (1968)J . Mol. Biol.See 31: 349-370.
Isolated DNA contains nucleotide substitutions, nucleotide deletions, and nucleotide insertions.
, And by inversion of the nucleotide range. These modifications are
Novel DNA sequence encoding this protein, its derivatives, or IL-1γ activity
Results in a protein having These modified sequences provide the mutant protein (mu)
Tein) or to enhance expression of variant species
You. Enhanced expression may result in increased gene amplification, increased transcription, increased translation, and other
A mechanism may be included. Such a mutant IL-1γ derivative has reduced genetic code degeneracy.
Predetermining the protein or fragment thereof, including the silent mutation to be used
Or site-specific mutations.
As defined herein, a "mutant IL-1γ" refers to a human
Although falling into the definition of homology of IL-1γ, either by deletion, substitution, or insertion,
Other polypeptides having an amino acid sequence different from human IL-1γ as found in nature
Includes tide. In particular, the “site-specific mutant IL-1γ”
Encompasses proteins having substantial homology, and are typically disclosed herein.
Share most of the indicated forms of biological activity.
Although site-specific mutation sites are predetermined, variants need not be site-specific.
No. Human IL-1γ mutagenesis, coupled with expression,
Can be achieved by making a deletion. Substitutions, deletions, insertions, or any
Combinations can be generated to arrive at the final construct. Insertion can be amino or
Includes a carboxy terminal fusion. Random mutagenesis can be performed at the target codon
The expressed human IL-1γ mutant is then screened for the desired activity
Can be done. Create substitution mutations at predetermined sites in DNAs with known sequences
Methods are well known in the art, for example, by M13 primer mutagenesis.
You. See also Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1987 and periodic addendum).
When.
Mutations in DNA normally place the coding sequence out of the reading frame.
Should not be placed and preferably a secondary mRNA such as a loop or hairpin
It does not create complementary regions that can hybridize to give rise to structure.
Beaucage and Carruthers (1981)Tetra . Letts.22: 1859-1862 described by
The phosphoramidite method yields the appropriate synthetic DNA fragments. two
Strand fragments often synthesize complementary strands and join the strands together under appropriate conditions.
By annealing or with the appropriate primer sequence
It is obtained either by adding a complementary strand using an enzyme.
Polymerase chain reaction (PCR) techniques can often be applied to mutagenesis.
Alternatively, the mutagenic primer generates a predetermined mutation at a predetermined site
This is a commonly used method for For example, Innis et al. (1990)PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications
See Academic Press, San Diego, CA
That.
As noted above, the present invention provides that the sequence is defined in SEQ ID NO: 2 and described above.
Human IL-1γ. Allelic variants and other variants are also contemplated.
The present invention also relates to a recombinant protein, for example, a segme from this human protein.
A heterologous fusion protein using the same is provided. Heterologous fusion proteins naturally
Is a fusion of proteins or segments that are not successfully fused in the same manner.
Thus, a fusion product of a growth factor with an interleukin typically results in a single translation.
Having a sequence fused with a typical peptide bond created as a translation product, and
Contiguous protein molecules that exhibit properties from the source peptide. Similar concepts
Applies to heterologous nucleic acid sequences.
In addition, the new constructs may contain other related proteins, such as growth factors or other
By combining similar functional or structural domains from different cytokines
Can be created. For example, receptor binding or other segments
Can be "swapped" between different fusion polypeptides or fragments. For example, Cunnin
gham et al. (1989)Science 243: 1330-1336; and O'Dowd et al. (1988)J . Biol. Chem .
263: 15985-15992. Each of these is incorporated herein by reference.
Used. Therefore, a new chimeric polypeptide showing a new combination of specificities
Tides result from the functional linkage of receptor binding specificity. For example, other related
The receptor binding domain from the ligand molecule is used to identify this protein or related
Additional domains can be added or substituted for other domains of the protein. The resulting protein
Often have hybrid functions and properties.
For example, fusion proteins provide for sequestration of the fusion protein into specific organs
Specifically bound to the spleen cells, and
It may include a ligand moiety that acts to accumulate in the spleen.
Candidate fusion partners and sequences can be found in various sequence databases (eg, GenBan
k, c / o IntelliGenetics, Mountain View, CA; and BCG, University of Wisco
nsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI).
The invention is particularly useful for mums that act as agonists or antagonists of IL-1γ.
Provide tein. With human and mouse IL-1γ and other members of the IL-1 family
Alignment of conserved features / residues, in particular, folds into β-trefoil fold
2 shows the inserted 12β chain. Bazan et al. (1996)Nature See 379: 591. Human IL-1
Alignment with the gamma sequence (using the met start residue of the signal peptide) is equivalent to β1 (leu 41
~ Val 47), β2 (val 55 ~ asp 59), β3 (pro 64 ~ asp 68), β4 (phe 83 ~ t
yr 88), β5 (met 96 to val 102), β6 (ser 108 to glu 113), β7 (lys 115 to
lys 120), β8 (phe 137 to pro 143), β9 (asn 147 to ser 153), β10 (phe 1
60-glu 64), β11 (phe 170-lys 175), and β12 (phe 187-asn 191) chains
Indicates that it corresponds to a similar sequence in mouse IGIF. Lodi et al. (1994)Scie nce
263: 1762-1766; Sayle and Jon ilner-White (1995)TIBS 20: 374-376; and
And Gronenberg et al. (1991)Protein Engineering See also 4: 263-269.
IL-1α and IL-1β ligands use IL-1 receptor type I as the primary receptor
Binds, and then forms a high affinity receptor complex with the type III IL-1 receptor.
Form coalescence. Mouse IL-1γ is known I, II (decoy receptor), or
Does not bind to type III mouse IL-1 receptor. In addition, mouse IGIF biological activity
, Anti-type I, II or III antibodies. This is the related mouse IGIF
Has been isolated but not identified as a receptor for IGIF, IL
Suggests binding to a receptor related to the -1 receptor.
However, the elucidated structure for IL-1β, the native IL-1 receptor antagony
(IL-1Ra) and the co-structure of IL-1Ra / IL-1 receptor type I
Or how to make a human IL-1γ antagonist. β4 chain and β5
The loop between the chains is the primary link for other IL-1 ligands to receptor type III.
It is a combined segment. In IL-1α and IL-1β ligands, this loop has 8 residues.
Although spanning the group, in IL-1Ra this loop is "cut off" (only two residues
Remains). Thus, IL-1Ra binds normally to receptor type I
But cannot interact with receptor type III. This will make IL-1Ra an effective IL-1
Be an antagonist.
This means that modifications to the loop between the β4 and β5 chains have predictable biological activity.
This suggests that the mutant will For example, mouse IGIF (or
KDSEVRGL (residue between β4 and β5 chains, β
Substitution of EPH (having the first residue in the 5 chain) with the corresponding IL-1Ra residue is equivalent to IG
Should produce an IF antagonist. Or mouse IGIF KDSEVR QGEESN
Substitution with D (IL-1β residue between β4 and β5 chains) interacts with type III receptor
(Replace KDSQPR with QGEESND for human IL-1γ). Mau
Along with IL-1Ra, the replacement of mouse IL-1Ra residues with these mouse IL-1β residues
It has been shown to introduce IL-1 activity in IL-1Ra (IL-1Ra is currently a type III receptor).
Putter). This is because the type III receptor is used by mouse IGIF.
Establish whether you can.
Furthermore, a construct that replaces the KDSEVR of mouse IGIF with the Flag epitope DYKDDDDK,
Possibly binds to the primary IGIF receptor. For human IL-1γ, the substitution is DYKDDDDK
KDSQPR. This mutant protein can act as an antagonist (
Cannot bind secondary mIL-1γ receptor). This tagged molecule is thus identified
Should be useful for cloning the unrecognized mouse IGIF primary receptor.
It is.
Human IL-1γ ligand sequences, such as those in the corresponding region between residues 88-96
Similar modifications should provide a similar interaction with the receptor. Mouse array
Alternatively, a substitution with any of the human sequences is indicated. Conversely, receptor binding interactions
Conservative substitutions away from the storage region probably conserve most biological activities.
“Derivatives” of human IL-1γ include amino acid sequence variants, glycosylation variants, metabolism
Derivatives and covalent or associative conjugates with other chemical moieties. Covalent derivatives
,
For example, by means well known in the art, at the IL-1γ amino acid side chain or at N
Alternatively, they can be prepared by functional linkage to a group found at the C-terminus. these
Derivatives are aliphatic esters of carboxyl-terminal or residues containing carboxyl side chains.
Ter or amide, 0-acyl derivative of hydroxyl group-containing residue, and amino terminal
N-terminal of the terminal amino acid or amino group-containing residue (eg, lysine or arginine)
Sil derivatives may include without limitation. Acyl groups are C3-C18 normal alkyl
Selected from the group of alkyl moieties containing alkanoyl aroyl species
To form
In particular, glycosylation modifications include, for example, during their synthesis and processing.
Alter the glycosylation pattern of the polypeptide in an additional or additional processing step
And the modifications created by doing so. Especially preferred to complete this
A good means is a glycosylation enzyme derived from a cell that normally provides such processing.
By exposing the polypeptide to an amino acid, for example, a mammalian glycosylation enzyme.
. Deglycosylases are also contemplated. Phosphorylated amino acid residues, e.g.
Other minor modifications, including schotyrosine, phosphoserine, or phosphothreonine
Alterations of the same primary amino acid sequence with alterations are also included.
The main group of derivatives is the interleukins or their fragments, other proteins.
It is a covalent conjugate of a protein with a polypeptide. These derivatives are N- or C-terminal
Mount proteins in recombinant cultures, such as end fusions, or via reactive side chains.
Synthetic by using agents known in the art for their utility in bridging
Can be done. Preferred derivatization sites with crosslinking agents include free amino groups, carbohydrate moieties,
And cysteine residues.
Fusion polypeptides between interleukins and other homologous or heterologous proteins
Is also provided. An allogeneic polypeptide can be a fusion between various growth factors, for example,
A hybrid protein that exhibits ligand specificity for a number of different receptors
Protein or its specificity to spread or weaken its binding to its receptor
Generates a ligand. Similarly, the combination of properties or activities of the derivative protein
The indicated heterologous fusion can be constructed. Typical examples are receptor segments or
Is a reporter polypeptide having a domain (eg, a ligand binding segment)
(Eg, luciferase), resulting in the presence of the desired ligand.
The location or location can be easily determined. See, for example, Dull et al., U.S. Pat. No. 4,859,609.
checking ... Other gene fusion partners include glutathione-S-transfer
Rase (GST), bacterial β-galactosidase, trpE, protein A, β-lactam
Enzymes, α-amylase, alcohol dehydrogenase, and yeast α-mating factor
I can do it. For example, Godowski et al. (1988)Science See 241: 812-816.
Beaucage and Carruthers (1981)Tetra . Letts.22: 1859-1862
The foramidite method yields the appropriate synthetic DNA fragments. Double-stranded fragment
Often synthesize the complementary strand and anneal the strand together under appropriate conditions.
DNA polymerase with appropriate primer sequences
Obtained by adding a complementary strand using the same.
Such polypeptides can also be phosphorylated, sulfated, biotinylated, or other
Amino acid residues that have been chemically modified by the addition or removal of
It may have one having a molecular shape similar to an acid group. In some embodiments, the modification
The modification may be a useful labeling reagent or a purification target, such as an affinity reagent.
Acts as a gand.
Fusion proteins are typically obtained by recombinant nucleic acid methods or by synthetic polypeptides.
Created either by the peptide method. Techniques for nucleic acid manipulation and expression
Are generally described, for example, in Sambrook et al. (1989).Molecular Cloning: A Laboratory M anual
(2nd edition), Volume 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, and Ausubel et al. (
(Ed.) (1987 and regular supplements)Current Protocols in Molecular Biology， Gree
ne / Wiley, New York, each of which is incorporated herein by reference.
It is. Techniques for polypeptide synthesis are described, for example, in Merrifield (1963)J . Ame r. Chem. Soc.
85: 2149-2156; Merrifield (1986)Science 232: 341-347; and
And Atherton et al. (1989)Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Appriach,
Described in IRL Press, Oxford; each of which is incorporated herein by reference.
Is done. For methods for making larger polypeptides, see Dawson et al. (
1994)Science See also 266: 776-779.
The invention also relates to human IL-l other than modifications in amino acid sequence or glycosylation.
The use of derivatives of γ is contemplated. Such derivatives can be shared or aggregated with chemical moieties.
Couplings may be included. These derivatives generally fall into three classes:
(1) salt, (2) side chain and terminal residue covalent modification, and (3) adsorption to, for example, cell membranes
Complex. Such covalent or assembled derivatives can be used as immunogens in immunoassays.
As a reagent in a receptor or other binding molecule (eg, an antibody)
Useful in purification methods such as affinity purification.
For example, a human IL-1γ ligand can be an IL-1γ receptor, an antibody, or other similar
Methods well known in the art for use in assaying or purifying molecules
By covalent attachment to a solid support such as cyanogen bromide activated Sepharose
Fixed or with or without glutaraldehyde crosslinking, polyolefin tables
Can be adsorbed to the surface. IL-1γ is also useful for use in diagnostic assays, for example,
Covalently bound to rare earth chelates radioiodinated by the Lolamine T procedure
Alternatively, it can be labeled with a detectable group attached to another fluorescent moiety.
The human IL-1γ of the present invention is characterized by interleukin or any fragment thereof.
An antiserum or anti-serum, which can distinguish between, for example, mouse IGIF and human IL-1γ.
It can be used as an immunogen for production in the body. The purified interleukin is
Monoclones prepared by immunization with various forms of impure preparations containing proteins
Used to screen for lonal antibodies or antigen-binding fragments
obtain. In particular, the term “antibody” also encompasses antigen-binding fragments of the native antibody.
You. Purified interleukins may also be present in the presence of elevated levels of expression, or
Any that arises in response to an immunological disorder that leads to the production of antibodies to endogenous cytokines
It can be used as a reagent for detecting antibodies. In addition, the IL-1γ fragment
In addition, as described immediately below, it can be used as an immunogen to produce the antibody of the present invention.
Can be used. For example, the present invention relates to an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
Or an antibody having binding affinity for a homologous peptide or
An antibody to be raised is intended. In particular, the present invention relates to external proteins of natural cytokines.
Specific flags that were exposed, predicted to be, or actually
Antibodies that have or are raised against binding
Intend.
Blocking the physiological response to these interleukins is probably
It can result from the inhibition of binding of the ligand to the receptor by competitive inhibition. Accordingly
Thus, in vitro assays of the invention often involve antibodies, ligands of these antibodies.
A binding segment, or a fragment bound to a solid substrate is used. these
Assays may also include binding region mutations and modifications, or ligand mutations and modifications (eg,
(Eg, a ligand analog).
The invention also contemplates the use of competitive drug screening assays, e.g.,
Neutralizing antibodies to interleukins or fragments
Competes with the test compound for binding to Thus, neutralizing antibodies or
Is any polypeptide that shares one or more binding sites for the receptor
Can also be used to detect the presence of
Can be used to occupy the binding site with a potential receptor.
The DNA encoding the protein or fragment thereof can be obtained by chemical synthesis.
Screen DNA libraries or use a wide variety of cell lines or tissues
Obtained by screening a genomic library prepared from the sample.
Can be The native sequence is prepared using standard methods and the sequence provided herein in SEQ ID NO: 1.
Can be isolated using columns.
This DNA, for example, produces polyclonal or monoclonal antibodies in sequence
For the synthesis of full-length human interleukins or fragments that can be used to
For binding studies; Construction of modified agonist / antagonist molecules
And for expression; and for structure / function studies; in a wide variety of host cells
Can be expressed. Each mutant or its fragment is transformed with an appropriate expression vector.
It can be expressed in a transformed or transfected host cell. These molecules are
May be substantially free of proteins or cellular contaminants other than those derived from the recombinant host,
Therefore, when combined with a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent
Particularly useful in pharmaceutical compositions. Human proteins, some of which are other proteins
Can be expressed as a fusion with the protein.
Expression vectors typically contain a suitable gene that is normally recognized by a suitable host cell.
A desired receptor gene or its fragment, operably linked to a control element.
A self-replicating DNA or RNA construct that contains a fragment. These control elements
Expression can be achieved in a suitable host. Control elements required to achieve expression
The specific type of protocol depends on the ultimate host cell used. Generally, genetic
Offspring control elements can be prokaryotic or eukaryotic promoter expression
May include a regulatory system, and typically controls transcriptional initiation, transcription
Any operator for transcription enhancers to increase mRNA expression levels
-Sequence encoding the appropriate ribosome binding site, and terminate transcription and translation
Sequence is included. Expression vectors also usually allow the vector to be replicated independently.
Host cell origin of replication.
The vector of the present invention contains a DNA encoding a protein, as described above.
Or a fragment thereof encoding a biologically active equivalent polypeptide.
Including those that include. DNA can be under the control of a viral promoter, and
Can encode a selectable marker. The invention further relates to a prokaryotic or eukaryotic host.
Can express a eukaryotic cDNA encoding such a protein in
Intended for use in expression vectors, where the vector is compatible with the host, and
Eukaryotic cDNAs that encode receptors are difficult to grow in hosts containing vectors.
Inserted into a vector that expresses the cDNA. Usually, the expression vector is a host cell
For stable replication in cells or copies of the desired gene copy per cell
Designed for amplification to greatly increase the total number. If the expression vector is
Need to be replicated in cells, such as the host cell
Interact with various hosts using vectors that do not contain an origin of replication recognized by
-Transient expression of leukin protein or its fragment
is there. Set of human proteins or fragments thereof into host DNA by recombination
It is also possible to use a vector that causes indentation.
As used herein, vectors are plasmids, viruses, bacterio
Phage, integratable DNA fragments, and DNA fragments into the host genome
Includes other vehicles that allow for integration of the event. The expression vector is operably linked.
Specialized vectors containing gene regulatory elements to achieve expression of the ligated gene
It is. Plasmids are the most commonly used form of vector, but have the equivalent
And any other form known or becoming known in the art
Are suitable for use herein. For example, Pouwels et al. (1985 and
And addendum)Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., and Rodri
quez et al. (ed.)Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses
, Buttersworth, Boston, 1988, which are incorporated herein by reference.
Incorporated.
Transformed cells are transformed with a receptor vector constructed using recombinant DNA techniques.
Cells or transfected cells, preferably mammalian cells.
is there. Transformed host cells usually contain the desired protein or its fragment.
To express, but to clone, amplify, and manipulate that DNA,
It is not necessary to express the protein of the invention. The invention further relates to a method for forming
Culturing transformed cells, thus accumulating interleukins in the culture
It is intended to be. Protein is recovered from either the culture or the culture medium.
Can be collected.
For the purposes of the present invention, nucleic acid sequences are operable if they are functionally related to each other.
Linked to For example, DNA for a presequence or secretory leader
To be expressed as a protein or to direct the polypeptide to the cell membrane
Operably linked to a polypeptide, or a platform involved in secretion of the polypeptide.
It is. Promoters act on coding sequences to control transcription of a polypeptide
Ribosome binding site, where the ribosome binding site is positioned to permit translation.
If so, it is operably linked to the coding sequence. Normally, operably linked means that
Contiguous and in reading frame, but implicit in the repressor gene
Certain genetic elements, such as
Further bind to the operator sequence.
Suitable host cells include prokaryotes, lower eukaryotes, and higher eukaryotes.
You. Prokaryotes include both Gram-negative and Gram-positive organisms (eg, E. coli).
coli and B. subtilis). Lower eukaryotes include yeast (eg, S. c.
erevisiae and Pichia), as well as species of the genus Dictyoste1ium. Higher eukaryote
Organisms include non-mammalian sources (eg, insect cells, and birds), and mammals.
Ki
Established from animal cells of both source (eg, human, primate, and rodent)
Tissue culture cell lines are included.
Prokaryotic host-vector systems provide a wide variety of vectors for many different species.
Including As used herein, E.I. coli and its vectors
It is commonly used to include equivalent vectors for use in eukaryotes. Increase DNA
An exemplary vector for spreading is pBR322 or many derivatives thereof. Rece
Vectors that can be used to express the butter or fragments thereof include la
c promoter (pUC series); trp promoter (pBR322-trp); Ipp promoter
(PIN series); λ-pP or pR promoter (pOTS); or like ptac
Vector, such as a simple hybrid promoter (pDR540).
It is not limited to. Brosius et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-
, Trp-, lac-, and Ipp-derived PromoterslVectors: A Survey of Molecular C loning Vectors and Their Uses
, (Edited by Rodriguez and enhardt), Buttersworth
See Boston, Chapter 10, pages 205-236, which is incorporated herein by reference.
It is.
Lower eukaryotes, such as yeast and Dictyoste1ium, are vectors containing an IL-1γ sequence.
Can be transformed. For the purposes of the present invention, the most common lower eukaryotic host is
, Baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae. Numerous other strains and species are also available.
Although available, it is used to generally represent lower eukaryotes. Yeast
The mother vector typically contains an origin of replication (other than for the integration type), a selection gene,
DNA encoding motor, receptor or fragment thereof, and translation
Consists of sequences for termination, polyadenylation, and transcription termination. A source suitable for yeast
Current vectors include 3-phosphoglycerate kinase and various other glycolytic enzymes.
A constitutive promoter, such as a gene promoter, or alcohol dehydrogena
Inducible promoters such as thease 2 promoter or metallothionein promoter
Motor included. Suitable vectors include the following types of derivatives:
Self-replicating low copy number (eg, YRp series); self-replicating high copy number (eg, YRp series)
Ep series); integrated (eg, YIp series), or minichromosomes (eg,
, YCp series).
Higher eukaryotic tissue culture cells usually contain functionally active interleukintan.
Preferred host cells for the expression of proteins. In principle, any higher eukaryotic tissue culture
Cell cultures can be used whether from invertebrates or vertebrates (eg,
Insect baculovirus expression system). However, mammalian cells are preferred. Such a fine
Transformation or transfection and propagation of vesicles is a routine procedure.
Examples of useful cell lines include HeLa cells, Chinese Hamster Ovary (CH0) cell line,
Baby rat kidney (BRK) cell line, insect cell line, bird cell line, and monkey (COS)
Cell lines. Expression vectors for such cell lines are usually replicated.
Origin, promoter, translation initiation site, RNA splice site (genomic DNA is used
), A polyadenylation site, and a transcription termination site. These vectors
They also usually contain a selection gene or an amplification gene. Suitable expression vectors are
Rasmid, virus or, for example, adenovirus, SV40, parvovirus
, Vaccinia virus, or cytomegalovirus
Retroviruses having different promoters. Representative of suitable expression vectors
Typical examples include pCDNA1; pCD (Okayama et al. (1985)Mol . Cell Biol.5: 1136-1142
PMClneo PolyA (Thomas et al. (1987)).Cell See 51: 503-512
And baculovirus vectors such as pAC373 or pAC610.
You.
For secreted proteins, the open reading frame is usually
Consisting of a mature or secreted product covalently linked at the N-terminus to a signal peptide
Encodes a repeptide. The signal peptide is the mature or active polypeptide
Cleaved before secretion. The cleavage site is determined by a rule of thumb, for example, von-Heijne (1986)Nucl eic Acids Research
14: 4683-4690 can be predicted with a high degree of accuracy, and
The exact amino acid composition of the gnal peptide does not appear to be important for its function (
For example, Randall et al. (1989)Science 243: 1156-1159; Kaiser et al. (1987)Science
235: 312-317).
These poly in a system that provides a specific or predetermined glycosylation pattern
It is often desirable to express the peptide. In this case, the normal pattern is
This is a pattern naturally provided by the current system. But the pattern is polypep
The tide (eg, non-glycosylated form) can be replaced by the appropriate glycosylation introduced into the heterologous expression system.
It can be modified by exposure to a silylated protein. For example, Inter
The leukin gene contains one or more genes encoding a mammalian or other glycosylation enzyme.
Can be co-transformed. Using this approach, certain mammals
Glycosylation patterns can be achieved in prokaryotes or other cells.
The source of human IL-1γ is a eukaryote expressing recombinant huIL-1γ DNA as described above.
Or it may be a prokaryotic host. The source is also from mouse Swiss 3T3 fibroblasts.
However, other mammalian cell lines are also contemplated by the present invention.
Preferred cell lines are from human species.
Because the entire sequence is known, human IL-1γ, a fragment or derivative thereof
Can be prepared by conventional processes for synthesizing peptides. To these
Is Stewart and Young (1984)Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem
ical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984)The Practice of Peptide Synthesis
, Springer-Verlag, New York; and Bodanszky (1984)The Principles of Peptide Synthesis
, Springer-Verlag, New York
All of which are incorporated herein by reference.
Is done. For example, azide process, acid chloride process, acid anhydride process, mixed
Anhydride process, active ester process (for example, p-nitrophenyl ester
, N-hydroxysuccinimide ester or cyanomethyl ester),
Bodiimidazole process, oxidation-reduction process, or dicyclohexylcar
A bodiimide (DCCD) / addition process may be used. Solid and solution phase synthesis
Both are applicable to the above process.
IL-1γ proteins, fragments, or derivatives are typically used for peptide synthesis.
In accordance with the above process as used in
By a so-called stepwise process involving the step of condensing amino acids with amino acids,
Alternatively, by coupling a peptide fragment to the terminal amino acid
And is appropriately prepared. Amino acids not used in coupling reactions
The group is typically protected to prevent coupling at the incorrect position.
There must be.
When solid phase synthesis is employed, the C-terminal amino acid is linked via its carboxyl group.
Attached to an insoluble carrier or support. The insoluble carrier is a reactive carboxylic acid.
There is no particular limitation as long as it has a binding ability to a sil group. Such an insoluble carrier
Examples of halomethyl resins such as chloromethyl resin or bromomethyl resin
, Hydroxymethyl resin, phenol resin, tert-alkyloxycarbonyl
Drazidified resin and the like are included.
Amino-protected amino acids are used for their progressive synthesis of peptides.
Reactive carboxyl group and reactive amino group of already formed peptide or chain
In turn by condensation with After synthesizing the complete sequence, the peptide is
Separated from insoluble carrier to produce tide. This solid-phase approach
And, generally, Merrifield et al. (1963)J . Am. Chem. Soc.85: 2149-2156
Which is incorporated herein by reference.
The prepared protein and its fragments are separated by means of peptide separation.
For example, extraction, precipitation, electrophoresis, various forms of chromatography, etc.
Thus, it can be isolated and purified from the reaction mixture. The interleukin of the present invention
It can be obtained in varying degrees of purity depending on the desired use. Purification disclosed herein
By using modified protein purification techniques (see below) or
The use of the antibodies described herein in the method of
Can be achieved. This immunosorbent affinity chromatography was the first
Linking the antibody to a solid support, and then linking the linked antibody to a suitable cell
Lysate, lysate of other cells expressing interleukin, or DN
Contact with cell lysates or supernatants that produce the protein as a result of technology A
(See below).
Generally, a purified protein will be at least about 40% pure, usually less
Both about 50% pure, usually at least about 60% pure, typically at least about 70% pure
More typically at least about 80% pure, preferably at least about 90% pure,
And more preferably at least about 95% pure, and in certain embodiments from 97% to
99% or more. Purity is usually on a weight basis, but can also be on a molar basis
. Various assays are suitably applied.
Antibodies exist in a variety of forms, both naturally occurring and in their recombinant form.
Of human IL-1γ protein and its fragments
Indicates that the antibody to the active ligand recognizes an epitope that exists only in its native structure
Is more likely to happen.
Anti-idiotypic antibodies are also contemplated, which are antibodies to natural receptors or antibodies.
Useful as gonists or antagonists.
Predetermined flags for proteins, including binding fragments and single-stranded form
Antibodies against the fragment of an animal in a conjugate of the fragment with an immunogenic protein.
Can be caused by immunization. Monoclonal antibodies are those that secrete the desired antibody.
Prepared from vesicles. These antibodies are responsible for binding to normal or protective proteins.
Or can be screened for agonist or antagonist activity.
Can be screened for. These monoclonal antibodies are usually
Both have a KD of about 1 mM, more usually at least about 300 μM, typically at least
At about 100 μM, more typically at least about 30 μM, preferably at least
Binds at about 10 μM, and more preferably at least about 3 μM or more.
Antibodies of the invention, including antibody antigen binding fragments, have significant diagnostic or therapeutic value.
May have a value. These bind to interleukins and to receptors
Or the ability of human IL-1γ to elicit a biological response
It can be a powerful antagonist. These may also be useful as non-neutralizing antibodies
, And binds producer cells, or cells restricted to a source of interleukin
Can be coupled to a toxin or radionuclide. In addition, these
Antibodies, either directly or indirectly through a linker, may be drugs or other therapeutics.
Can be coupled to a therapeutic agent.
As used herein, the term "antibody-antigen binding fragment" refers to, for example, Fab, F
c, F (ab)Two, Fv, and scFv fragments, which contain
Used in a scientific sense. For example, Klein, Immunolgy (JOhn Wiley, New York, 1
982); Parham, Chapter 14, Immunochemistry, 4th edition, edited by Weir (Blackwell Scientific P
ublishers, Oxford, 1986). Such a fragment is a recombinant DN
A can be made from intact antibodies by chemical cleavage using the A methodology. example
No. 4,642,334 describing the production of recombinant Fv fragments, and scF
See WO 93/11236 for v.
The antibodies of the present invention may also be useful for diagnostic applications. As capture or non-neutralizing antibodies
Thus, they can bind to interleukins without inhibiting receptor binding.
You. As neutralizing antibodies, they may be useful in competitive binding assays. These
In addition, it is useful for detecting or quantifying IL-1γ.
Protein fragments fuse polypeptides to be used as immunogens
Alternatively, it can be linked to another substance, particularly a polypeptide, as a covalent bond. Human
IL-1γ and its fragments are keyhole limpet hemocyanin, bovine blood
Fused or covalently linked to various immunogens such as serum albumin, tetanus toxin, etc.
Can be done. For a description of how to prepare polyclonal antisera, seeMicrobiolo gy
, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962)Sp ecificity of Serological Reactions
, Dover Publications, New York; and
Williams et al. (1967)Methods in Immunology and Immunochemistry, Volume 1, Acad
See emic Press, New York; each of which is incorporated herein by reference.
Incorporated. Representative methods include hyperimmunization of the animal with the antigen. Then animals
Blood is collected immediately after repeated immunizations and gamma globulin is isolated.
In some cases, various mammalian accommodations such as mice, rodents, primates, humans, etc.
It is mainly desired to prepare monoclonal antibodies. Monochromena like this
For a description of techniques for preparing antibodies, see, for example, Stites et al.Basic and Clin ical Immunology
(4th edition), Lange Medical Publications, Los Altos, CA and
References cited there; Harlow and Lane (1988)Antibodies: A Laborator y Manual
, CSH Press; Goding (1986)Monoclonal Antibodies: Principles and Practice
(Second Edition) Academic Press, New York; and, in particular, Kohler and Milst
ein (1975)Nature 256: 495-497 (this is one of the monoclonal antibodies
(Discussing methods). Each of these references is included in the book as a reference.
Incorporated in the specification. Briefly, this method involves injecting an immunogen into an animal
It is included. The animals are then sacrificed and the cells are removed from the spleen and
This is fused with myeloma cells. The result is a hybrid cell,
"Hybridomas", which can be regenerated in vitro. Then, the hybrid
A population of domas is screened to isolate individual clones,
Each secretes a single antibody species against the immunogen. Thus, the individual obtained
An antibody species is an immunized animal that produces a response to a recognized specific site on an immunogen.
From a single B cell that has been immortalized and cloned.
Other suitable techniques include in vitro exposure of lymphocytes to an antigenic polypeptide, or
Alternatively, selection of a library of antibodies in phage or similar vectors
Include alternatives. Huse et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Librar."
y of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda ",Science 246: 1275-1
281; and Ward et al. (1989).Nature See 341: 544-546. Polype of the present invention
Peptides and antibodies can be used with or without modification, chimeric or human.
Antibodies. Frequently, polypeptides and antibodies provide a detectable signal.
The substance to be supplied is labeled by binding either covalently or non-covalently.
Be recognized. A wide variety of labels and conjugation techniques are known and described in the scientific and patent literature.
Both are widely reported. Suitable labels include radionuclides, enzymes, substrates, cofactors,
Inhibitors, fluorescent molecules, chemiluminescent molecules, magnetic particles and the like are included. like this
Patents teaching the use of labels include U.S. Patent Nos. 3,817,837; 3,850,752;
Nos. 939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,24.
No. 1 is mentioned. Also, recombinant or chimeric immunoglobulins can be produced,
See illy, U.S. Patent No. 4,816,567.
The antibodies of the present invention also provide affinity chromatography in isolating IL-1γ.
Can be used for photography. A column can be prepared where the antibody is supported on a solid support.
Cell lysate linked to the body (eg, particles such as agarose, Sephadex, etc.)
Can pass through the column, wash the column, and then increase the concentration of mild denaturant.
, Thereby releasing the purified protein.
Antibodies also screen expression libraries for specific expression products
Can be used for Usually, the antibodies used in such procedures are based on antibody binding.
Labeled with a moiety that allows easy detection of the presence of the antigen.
Antibodies raised against each human IL-1γ also raise anti-idiotypic antibodies
Used for These are the various immunological conditions associated with protein expression.
Detect or diagnose cells that express the receptor for or this protein
Useful to do. These are also interleukin agonists or agonists.
Useful as antagonists, they compete with naturally occurring ligands.
It can be a combined inhibitor or substrate.
Both naturally occurring and recombinant forms of the human IL-1γ molecules of the present invention include:
Particularly useful in kits and assay methods. For example, these methods also
Synthetic activity, such as screening for receptors for these proteins
Applied to Several automated assay methods can generate tens of thousands per year
It has been recently developed to allow screening of compounds. For example, BI0M
EK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, California,
And Fodor et al. (1991)Science 251: 767-773, which is hereby incorporated by reference.
Incorporated in the book. The latter is due to the large number of certain polymers synthesized on solid substrates.
A means for testing binding is described. Receptor or agonist / antha
Develop appropriate assays to screen for gonist homologous proteins
Development is in large quantities of purified soluble in the active state as provided by the present invention.
It can be greatly facilitated by the availability of IL-1γ.
Purified IL-1γ can be used for use in the receptor screening techniques described above.
It can be coated directly on the plate. However, for these proteins
Non-neutralizing antibodies can be, for example, each interleukin on a solid phase useful for diagnostic use.
Used as capture antibodies to immobilize proteins.
The present invention also provides various methods for detecting the presence of a protein or its receptor.
IL-1γ, its fragments, peptides, and
And the use of their fusion products. Alternatively, or in addition,
Antibodies can be incorporated into kits and methods. Typically, the kit is
Recognize certain IL-1γ peptides or gene segments or one or the other
It has a compartment containing any of the reagents. Typically, for peptides
, The recognition reagent is a receptor or an antibody, or a gene segment.
In the case of the above, it is usually a hybridization probe.
Samples, for example, preferred kits for determining the concentration of IL-1γ, are typically
, IL-1γ as positive control, source of IL-1γ (naturally occurring or
Compounds having a known binding affinity for, for example, receptors
Or antibodies, and for separating conjugates from free labeled compounds
Means, eg, a solid phase for immobilizing IL-1γ in the test sample. Reagents and equipment
A compartment containing the device is usually provided.
Contains antigen-binding fragments specific for human IL-1γ or peptide fragments
Antibody or receptor fragment may be IL-1γ and / or a fragment thereof.
It is useful in diagnostic applications to detect the presence of elevated levels of a drug. Diagnostic
Say can be homogeneous (no separation step between free reagent and antibody-antigen complex) or heterogeneous
(With separation step). There are a variety of commercially available assays, such as radio
Immunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme immunoassay (
EIA), Enzyme multiplex immunoassay technique (EMIT), Substrate-labeled fluorescence immunoassay
(SLFIA). For example, an unlabeled antibody is labeled and directed against IL-1γ
Or use a secondary antibody that recognizes the antibody to a particular fragment thereof
Can be used. These assays have also been widely discussed in the literature.
For example, Harlow and Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.
And Coligan (eds.) (1991) and periodic supplements,Current Protocols In Immunology
See Greene / Wiley, New York.
Anti-idiotypic antibodies act as IL-1γ agonists or antagonists
To have a similar use. These are useful as therapeutic reagents in appropriate environments.
It should be for you.
Frequently, the reagents for a diagnostic assay will optimize the sensitivity of the assay.
Supplied in kit. Assays, protocols, and labels for the present invention
Depending on the nature of the labeled or unlabeled antibody, or labeled receptor
Provided. This usually involves signals such as buffers, stabilizers, and substrates for enzymes.
Combination with other additives, such as substances required for the production of nulls. Preferably
The kit also includes equipment for proper use and disposal of the contents after use
. Typically, the kit will have a compartment for each useful reagent, and
Suitable
Includes equipment for smart use and disposal of reagents. Preferably, the reagent is lyophilized powder
Provided as a powder, wherein the reagent is water having the appropriate concentration to perform the assay.
Can be reconstituted in a neutral medium.
Any of the above components of the diagnostic assay can be used without modification, or
Can be modified in various ways. For example, the step of labeling involves detecting a detectable signal.
Achieved by covalently or non-covalently linking directly or indirectly provided moieties
Can be done. In either of these assays, the test compound IL-1γ or
Antibodies to may be labeled either directly or indirectly. For direct sign
Possibilities include labeling groups:125Radioactive labels such as I, peroxidase and
Enzymes such as alkaline phosphatase (US Pat. No. 3,645,090) and fluorescence
Fluorescent labels that can monitor changes in intensity, wavelength shift, or fluorescence polarization (US Patent
No. 3,940,475). Both patents are incorporated herein by reference. Indirect
Possibilities for labeling include biotinylation of one component and then one of the above labeling groups
And binding to avidin coupled to avidin.
Separates conjugate from free ligand or conjugate from free test compound
Many methods also exist. IL-1γ is immobilized on various matrices and subsequently
Can be washed. Suitable matrices include plastic such as ELISA plates
, Filters, and beads. Immobilize receptor on matrix
Methods include direct adhesion to plastic, use of capture antibodies, chemical coupling, and
And biotin-avidin. With this approach
The last step in the process is, for example, an organic solvent such as polyethylene glycol or
In any of several ways, including utilizing salts such as ammonium sulfate
And precipitation of the antibody / antigen complex. Other suitable separation techniques include Rattle et al.
(1984)Clin . Chem. 30 (9): Fluorescent antibody magnetized particle method according to 1457-1461, and
Dual antibody magnetic particle separation as described in U.S. Pat.No.4,659,678,
Each of which is incorporated herein by reference.
Methods for linking proteins or fragments to various labels are widely reported in the literature.
And no detailed discussion is required herein. Many of the techniques are
Either carbodiimide or active ester to form a peptide bond
Use of activated carboxyl groups by use, such as chloroacetyl for linking
An activated olefin such as an activated halogen or maleimide and a mercapto group
To form a thioether by the reaction of The fusion protein also
Find use in their applications.
Another diagnostic aspect of the invention is an oligonucleotide or sequence obtained from the sequence of IL-1γ.
Encompasses the use of polynucleotide sequences. These sequences have immunological disorders.
As a probe to detect IL-1γ levels in patients suspected of
Can be used. Preparation of nucleotide sequences for both RNA and DNA, labeling of this sequence,
And the preferred size of this sequence accepts full description and discussion in the literature
Was. Normally, the oligonucleotide probe has at least about 14 nucleotides,
Usually has at least about 18 nucleotides, and the polynucleotide probe
, Up to several kilobases. Various labels, most commonly radionuclides, especially32
P can be used. However, biotin modification for introduction into the polynucleotide
Other techniques, such as using modified nucleotides, may also be used. Then, bio
The tin acts as a site for binding to avidin or antibodies,
It can be labeled with a wide variety of labels such as radionuclides, fluorescers, enzymes and the like.
Alternatively, DNA duplex, RNA duplex, DNA-RNA hybrid duplex, or DNA-
Antibodies that can recognize specific duplexes, including protein duplexes, can be used. antibody
Can then be labeled, and an assay performed if the duplex is bound to a surface.
Therefore, during the formation of the duplex on the surface, the presence of the antibody bound to the duplex is detected.
Can be The use of probes for novel antisense RNA is
Solutions, plus and minus screening, recombination probing, hives
Such as lid release translation (HRT) and hybrid translation inhibition (HART)
It can be done with any conventional technique. It's also a polymerase chain reaction (PCR)
Such amplification techniques.
Diagnostic kits that test for the qualitative or quantitative presence of other markers are also contemplated.
Illustrated. Diagnosis or prognosis is a combination of many indications used as markers
Can depend on Therefore, the kit is tested for marker combinations
I can do it. For example, Viallet et al. (1989)Progress in Growth Factor Res .1: 89-97
checking ...
The present invention also provides reagents with significant therapeutic value. IL-1γ (naturally occurring
Or recombinant), a fragment thereof, a mutein agonist or anta
Gonist and antibody are interleukins or their receptors or antibodies
Along with compounds identified as having a binding affinity for
Should be useful in the treatment of conditions that exhibit abnormal expression of the protein. Such anomalies are:
It is typically indicated by an immunological disease. Further, the present invention provides
Various diseases or disorders related to abnormal expression or induction of response to kin
Should provide therapeutic value. Mouse IGIF is useful for tumors, allergies,
And infectious diseases such as pulmonary tuberculosis, leprosy, fulminant hepatitis, and viruses such as HIV
Has been suggested to be associated with infections.
Furthermore, the dendritic cell expression profile is primarily expressed in activated dendritic cells.
Activated dendritic cells, which display human IL-1γ, are also a major producer of IL-12.
And dendritic cell-produced IL-12 directs a Th1-type response
It is considered to play a major role. In combination with IL-1γ and IL-12, IFN-γ
Should be very powerful in guiding. These two professionals under certain circumstances
It is thought that a combination of inflammatory cytokines can lead to septic shock
It is. IL-1γ antagonists, muteins, or antibodies are very useful in this situation
Can be shown. Natural IL-1γ antagonists block the effects of IL-1γ
To be produced by NK cells or activated T cells.
Recombinant IL-1γ, mutein agonist or antagonist, or IL-1γ anti-
The body can be purified and then administered to a patient. These reagents are for therapeutic use
In a conventional pharmaceutically acceptable carrier or diluent, for example,
It can be combined with further active ingredients, together with harmless stabilizers and excipients.
These combinations can be sterile filtered and lyophilized in dose vials.
Or in a dosage form, such as by storage in a stabilized aqueous preparation.
The present invention also contemplates the use of antibodies or binding fragments thereof that do not fix complement.
You.
Receptor screens using IL-1γ or fragments thereof
This can be done to identify molecules that have binding affinity for tarleukin. Next
Therefore, subsequent biological assays indicate that the receptor blocks essential stimulatory activity.
Can be used to determine whether competitive binding can be provided. Reception
Blockers or blockers in blocking IL-1γ activity.
Can be used as a agonist. Similarly, compounds having intrinsic stimulatory activity are
In terms of being able to activate the receptor and thus stimulating the activity of IL-1γ,
It is. The present invention further provides antibodies and antagonists to IL-1γ.
All other molecules are intended for therapeutic use.
The amount of reagents required for effective treatment depends on the means of administration, the target site, and the physiological condition of the patient.
And many other factors, including the other drug being administered. Accordingly
As such, treatment doses should be titrated to optimize safety and efficiency
. Typically, the doses used in vitro will be based on the in situ
Useful amounts can provide useful guidance for administration. Efficacy for the treatment of certain diseases
Animal testing of efficacious doses further provides predictive application of human doses.
Various considerations can be found, for example, in Gilman et al. (Eds) (1990).Goodman and Gilman's: The P harmacological Bases of Therapeutics
, Eighth Edition, Pergamon Press; andRemi ngtoon's Pharmaceutical Sciences
, 17th edition (1990), Mack Publishing Co., Ea
ston, Penn. Administration methods include, for example, oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration
Intramuscular or intramuscular administration, transdermal diffusion, etc. are discussed below and below
Is done. Pharmaceutically acceptable carriers include water, saline, buffers, and
For example,Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey.
I will. This is probably due to the high affinity binding between IL-1γ and its receptor.
Low doses of these reagents are initially expected to be effective. Therefore, administration
The amount range is usually less than 1 mM, with a suitable carrier, typically about 10 μm.
M, usually less than about 100 nM, preferably less than about 10 pM (picomolar), and
And most preferably less than about 1 fM (femtomole). Delayed release
Dispensing formulations or delayed release devices are often utilized for sustained administration.
IL-1γ, a fragment thereof, and an antibody or a fragment thereof, antagoni
Can be administered directly to the host to be treated, or
Ovalbumin or serum albumin prior to their administration, depending on the size of the compound.
It may be desirable to couple them to a carrier protein such as bumin. Cure
The therapeutic formulation can be administered in any conventional dosage formulation. The active ingredient is administered alone
It is possible, but preferably, to present it as a pharmaceutical formulation. The formulation is
, At least one active ingredient as described above, with one or more acceptable carriers thereof.
Include with a. Each carrier must be compatible with the other ingredients and not harmful to the patient.
In that sense, it must be acceptable both pharmaceutically and physiologically. The formulation is
Oral, rectal, intranasal, or parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, and intradermal)
G) Including those suitable for administration. The formulations may conveniently be presented in unit dosage form and
And can be prepared by any of the methods well-known in the art of pharmacy. For example, Gilman et al.
(Edition) (1990)Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeu tics
, Eighth Edition, Pergamon Press; andRemington's Pharmaceutical Sciences ,
17th edition (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn .; Avis et al. (Eds.) (1993)
)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberm
an et al. (eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; and
Lieberman et al. (Eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems De
See kker, NY. The treatment of the present invention can be combined with other therapeutic agents and
Can be used in conjunction.
The description of the IL-1γ ligand herein identifies the receptor, as described above.
To provide the means for: Such receptors have a theoretically high affinity for IL-1γ
Should specifically bind to Any of IL-1γ to detect the receptor
Various constructs that allow labeling are available. For example, direct IL-1γ
Labeling, markers for secondary labeling (eg, FLAG or other epitope
For example, fusing a tag) allows the detection of the receptor. This is biochemical
Histological or expression cloning
It can be a label or a choice in the approach. Match with available IL-1γ sequences
A two-hybrid selection system that creates a clever construct can also be applied. An example
For example, Fields and Song (1989)Nature See 340: 245-246.
The broad scope of the present invention is best understood by reference to the following examples, which illustrate:
It is not intended that the present invention be limited to any particular embodiment.
Example
I. General method
Some of the standard methods are described, for example, in Maniatis et al. (1982)Molecular Cloning , A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Pr
ess; Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A LaboratoryManual, (Second edition), 1
-3, CSH Press, NY; Ausubel et al.,Biology, Greene Publishing Associates, B
rooklyn, NY; or Ausubel et al. (1987 and addenda)Current Protocols in Molec ular biology
, Greene / Wiley, New York. Protein
Purification methods include ammonium sulfate precipitation, column chromatography, and electrophoresis.
, Centrifugation, crystallization and the like. For example, Ausubel et al. (1987
And periodic supplements); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification"Meth ods in Enzymology
, Volume 182 and other volumes in this series; and proteins
Manufacturer's literature on the use of purified products, eg, Pharmacia, Piscataway, NJ
See, or Bio-Rad, Richmond, CA. Combination with recombinant techniques,
Into the appropriate segment, for example, a FLAG sequence or a protease-removable sequence
This allows for fusion to the equivalent that can be fused. For example, Hochuli (1989)Che mische Industrie
12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant
Proteins with Metal Chelate Absorbent '' Setlow (ed.)Genetic Engineering , Pr inciple and Methods
12: 87-98, Plenum Press, N.Y .; and Crowe et al. (1992).Q IAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System
QUIAGE
See N, Inc., Chatsworth, CA.
Computer sequence analysis, for example, using GCG (U. Wisconsin) and GenBank sources
This is done using available software programs, including those from Announcement distribution
A column database (eg, from GenBank, etc.) was also used.
Many techniques applicable to IL-4 and IL-10 are described, for example, in U.S. Pat.No. 5,017,691.
(IL-4), US patent application Ser. No. 07 / 453,951 (IL-10), and US patent application Ser.
It can be applied to IL-1γ as described in US Pat. No. 0,683 (IL-10 receptor).
II. Amplification of human IL-1γ fragment by PCR
Select two primers (see SEQ ID NO: 1). RT-PCR,
CDNA, e.g., activation, using appropriate mRNA samples selected for the presence of
Produce a human monocyte cell sample.
III. Tissue distribution of human IL-1γ
Messages for the gene encoding IL-1γ have been detected in dendritic cells.
You. Expression was on day 5 dendritic cells, LPS activated dendritic cells, GM-CSF and IL-4 treated trees
High in dendritic cells and in mixtures of dendritic cells. High expression in B cells or NK cells
Has not been detected. Low levels detected in some monocyte cell cDNA libraries
Was done. Expression is not generally detected in fetal tissue, but fetal spleen, lung, and
Low levels were found in the small intestine. Low levels are also found in fetal gallbladder, and in adult tonsils
Is detected.
IV. Production of mouse IGIF protein
The GST fusion construct was constructed using E. coli. Manipulated for expression in E. coli. To express the protein
And purified using standard procedures. Similar method is applicable to human IL-1γ
It is.
The mouse IGIF pGex plasmid was constructed and E. coli. Fresh
The transformed cells are cultured in LB medium containing 50 μg / ml ampicillin, and the IPTG (S
igma, St. Louis, MO). After overnight induction, the bacteria are harvested and IGIF
The pellet containing was isolated. The pellet is mixed with 2 liters of TE buffer (50 mM Tris salt).
(PH 8.0, 10 mM EDTA, and 2 mM pefabloc). This substance
Microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA) was passed three times. Fluidized
The supernatant was spun in a Sorvall Gs-3 rotor at 13,000 rpm for 1 hour. Including IGIF
The resulting supernatant was filtered and glutathione-S equilibrated with 50 mM Tris base pH 8.0
Passed through an EPHAROSE column. Pool the fractions containing the IGIF-GST fusion protein and
Thrombin (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN)
Cut. The cleaved pool was then Q-SEPHAROSE equilibrated with 50 mM Tris base.
Passed through the column. Pool the fractions containing IGIF and cold distilled HTwoDiluted with O
The conductivity was reduced and re-passed through a new Q-Sepharose column. Including IGIF
Fractions were pooled, aliquoted and stored in a -70 ° C freezer.
Comparison of the CD spectrum with mouse IL-1β shows that the protein folds correctly.
And suggest. Hazuda et al. (1969)J . Biol. Chem.See 264: 1689-1693.
V. Biological assays on mouse IGIF
Biological assays confirmed IFN-γ inducing activity in T cells. IGIF
Stimulates the production of IFN-γ by the produced NK cells, and its induction is induced by IL-12 or IL-
Strongly synergistic with 2. A similar assay is performed with human IL-1γ.
Mouse IGIF functions efficiently in human cells, for example, through the human receptor.
It doesn't seem to be.
As described above, mouse IGIF induces IFN-γ by spleen cells from SCID mice.
Established to lead. Therefore, the spleen cells are a receptor for mouse IGIF.
Express. Induction is also synergistic with IL-12 or IL-2.
Mouse IGIF also combines IL-12 (and TNF-α) with IL-2 activated NK cells.
Vesicles were induced to produce IFN-γ. In the case of IL-2 activated NK cells, treatment with anti-IL-1β
Blocks IFN-γ production, so this induction appears to be IL-1β dependent.
Mouse IGIF can overcome this block and induce IFN-γ.
VI. Preparation of antibodies specific for IL-1γ
Inbred Balb / c mice are transformed with the recombinant form of the human protein, e.g., purified soluble
Intraperitoneal immunization with transgenic IL-1γ FLAG or stably transfected NIH-3T3 cells
I do. The animal has the protein at the appropriate time, with or without additional adjuvant.
To further stimulate antibody production. Collect or collect serum
The hybridoma is produced using the spleen.
Alternatively, Balb / c mice may be transformed with cells transformed with the gene or a fragment thereof.
Cells, either endogenous or exogenous cells, or isolated, rich in expression of antigens
Immunize with the membrane. Serum, when appropriate, typically after a number of further doses
To be collected. Various gene therapy techniques, for example, produce proteins in situ
In life, it can be useful for generating an immune response.
Monoclonal antibodies can be made. For example, replace the spleen cells with the appropriate fusion partner
And hybridomas are selected in growth medium by standard procedures
I do. The hybridoma supernatant is purified, for example, by ELISA or other assays.
Screen for the presence of antibodies that bind to IL-1γ. Specific for human IL-1γ
Antibodies that specifically recognize but do not recognize species variants can also be selected and prepared.
In other methods, synthetic peptides or purified proteins can be
Or to the immune system to generate polyclonal antibodies. For example, Coligan
(1991)Current Protocols in Immunology Wiley / Greene; and Harlow and
Lane (1989)Antibodies: A Laboratory Manual Visit Cold Spring Harbor Press
Teru. In appropriate circumstances, the binding reagent may be labeled as described above, for example, by fluorescence.
Or fixed to the substrate for the panning method
is there. Nucleic acids can also be introduced into cells in animals to produce antigens, which are immune.
Acts to elicit an epidemiological response. For example, Wang et al. (1993)Proc . Nat'l. Acad . Sci.
90: 4156-4160; Barry et al. (1994)BioTechniques 16: 616-619; and Xian
g et al. (1995)Immunity See 2: 129-135.
VII. Production of fusion protein with IL-1γ
Various fusion constructs are made using IL-1γ. This part of the gene
Loop tags (eg, FLAG tags) or two-hybrid system constructs
Combine. For example, Fields and Song (1989)Nature See 340: 245-246
.
Epitope tags can be used in expression cloning procedures involving detection with anti-FLAG antibodies.
To detect a binding partner (eg, a receptor for IL-1γ)
You. Two-hybrid systems can also be used to bind proteins that specifically bind to IL-1γ.
The protein can be isolated.
VIII. Mapping of human IL-1γ by in situ hybridization
Prepare a chromosome spread. In situ hybridization at 72 hours
Chromosome tone obtained from human lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin cultured in the cold.
Perform in the product. Add 5-bromodeoxyuridine for the last 7 hours of culture (60 μg
/ Ml of medium), ensure good quality post-hybridization chromosome banding
.
Appropriate amplification of total B cell cDNA template with the aid of primers
Fragments (eg, PCR fragments) are cloned into a suitable vector
To VectorThreeLabel by nick translation at H. radiation
Labeled probes were obtained using Mattei et al. (1985).Hum . Genet.69: 327-331 as described
, Hybridize to mid-term spreads.
Nuclear track emulsifier (KODAK NTBTwo), The slides are, for example, 4 ° C.
Exposure for 18 hours. To avoid silver grain slippage during the banding procedure,
Red is first stained with buffered Giemsa solution and metaphase photographed. Next
Then, the R band method was performed by the fluorescent dye-photolysis-Giemsa (FPG) method, and
Take a picture of the mid-term again before analysis.
IX. Structure-activity relationship
Determine information about the criticality of a particular residue using standard procedures and analyses.
You. A standard mutagenesis assay is performed, e.g., at the determined location, e.g., as identified above.
Generate many different variants at different locations and evaluate the biological activity of the variants
Do by doing. This is to the extent that it determines where to alter the activity, and
Can be substituted for either retaining, blocking, or modulating biological activity
This can be done to focus on specific positions to determine the residues to be determined.
Alternatively, analysis of natural variants indicates which positions tolerate the natural mutation
obtain. This is the population of deviations among individuals or across strains or species
It can be obtained from analysis. Samples from the selected individual are subjected to, for example, PCR analysis and distribution.
Analyze by column determination. This allows for the evaluation of population polymorphisms.
X. Isolation of receptor for human IL-1γ
By utilizing human IL-1γ for its binding specificity, its binding partner
Can be used as specific reagents to identify proteins, and antibodies are used as well. Binding trial
The drug may be labeled as above, eg, with fluorescence, or
Either immobilize on the substrate.
A binding composition is used to express a binding partner (ie, receptor).
Screen an expression library made from the cell line. Standard dyeing techniques
Use to detect or classify intracellular or surface expressed receptors?
Or transforming cells expressing the surface are screened by panning.
To Screening for intracellular expression can be performed by various staining or immunofluorescence procedures.
Do it. McMahan et al. (1991)EMBO J .See also 10: 2821-2832.
For example, on day 0, two-chamber permanox slides were loaded with fibronectin in PBS.
Pre-coat for 30 minutes at room temperature, 1 ml per 10 ng / ml chamber. P
Rinse once with BS. Then 2-3 x 105 per chamber in 1.5 ml growth medium
Plate COS cells with cells. Incubate at 37 ° C overnight.
On day 1 for each sample, 66 μg / ml DEAE-dextran, 66 μM chloroquine
, And a 0.5 ml solution of 4 μg DNA in serum-free DME. For each set,
For example, positive controls and 1/200 dilutions of human IL-1γ-FLAG cDNA
And a negative mimic is prepared. Rinse cells with serum-free DME. Add DNA solution,
Then incubate at 37 ° C for 5 hours. Remove the medium and add 10% DMS in DME
0.5 ml of O is added for 2.5 minutes. Remove it and wash once with DME. 1.5ml
Add growth medium and incubate overnight.
On day 2, medium is changed. On day 3 or 4, cells are fixed and stained.
You. The cells are rinsed twice with Hank's buffered saline solution (HBSS) and 4%
Fix with laformaldehyde (PFA) / glucose for 5 minutes. Wash 3 times with HBSS
You. After removing all liquid, the slides can be stored at -80 ° C. In each chamber
Then, a 0.5 ml incubation is performed as follows. 32 μl / ml 1M NaNThree
And HBSS / saponin (0.1%) for 20 minutes. The cells are then transferred to HBSS /
Wash once with ponin. Adding human IL-1γ or IL-1γ / antibody complex to the cells,
Then incubate for 30 minutes. Wash cells twice with HBSS / saponin. Appropriate
If so, add the first antibody for 30 minutes. Secondary antibodies, such as vector anti-mouse anti
The body is added at a 1/200 dilution and incubated for 30 minutes. ELISA solution, for example
If necessary, prepare a Vector Elite ABC horseradish peroxidase solution and allow
Pre-incubate. For example, one drop of solution A per 2.5 ml HBSS / saponin (
Avidin) and one drop of solution B (biotin). HBSS / saponin cells
And wash twice. Add ABCHRP solution and incubate for 30 minutes. cell
Washes twice with HBSS, the second wash for 2 minutes, which plugs between cells. Next
Add the vector diaminobenzoic acid (DAB) for 5-10 minutes. Glass distilled
2 drops of buffer + 4 drops of DAB + 2 drops of H per 5 ml of waterTwoOTwoUse Carefully
Remove the member and rinse the slides with water. Let it air dry for a few minutes
Then add a drop of Crystal Mount and a coverslip. 5 at 85-90 ° C
Bake for a minute.
Evaluate pools of positive staining and for isolation of single genes responsive to binding
Subcloning gradually.
Alternatively, use the IL-1γ reagent to affinity bind cells expressing the receptor.
-Purify or separate. See, for example, Sambrook et al. Or Ausubel et al.
Another strategy screens for membrane-bound receptors by panning
That is. Receptor cDNA is constructed as described above. Immobilize the ligand
To fix the expressing cells. Immobilization can be performed, for example, by constructing an IL-1γ fusion
By using an appropriate antibody that recognizes the FLAG sequence of the product, or against the first antibody
This can be achieved by using raised antibodies. Iterative cycle of selection and amplification
Leads to the enrichment of appropriate clones and the final isolation of receptor-expressing clones.
Phage expression libraries can be screened with human IL-1γ.
Appropriate labeling techniques (eg, anti-FLAG antibodies) allow specific labeling of appropriate clones
To
Many modifications and variations of this invention will be apparent to those skilled in the art and
And without departing from the scope. Particular embodiments described herein include:
Provided solely by way of example, and the invention is defined by the terms of the appended claims.
Should be limited along with the full scope of synonyms given by such claims.
And the present invention is directed to certain embodiments illustrated herein by way of example.
Therefore it should not be limited.
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 16/24
16/24 19/00
19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，
ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，Ｋ
Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ
，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，
ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ
(72)発明者 ハーディマン，ゲラルド ティー.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040,
マウンテン ビュウ，デイル アベニュー
ナンバー３ 1398
(72)発明者 カステレイン，ロバート エイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94062,
レッドウッド シティー，サミット ドラ
イブ 463
(72)発明者 ベイザン，ジェイ．フェルナンド
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025,
メンロ パーク，ユニバーシティ ドライ
ブ 775──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 14/715 C07K 16/24 16/24 19/00 19/00 C12P 21/02 C C12P 21/02 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ) , BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, GE, HU, IL, I , JP, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UZ, VN, YU (72) Inventor Hardyman, Gerald Tea. United States California 94040, Mountain View, Dale Avenue Number 3 1398 (72) Inventor Castellane, Robert A. United States California 94062, Red Wood City, Summit Drive 463 (72) Inventor Beizan, Jay. Fernando United States California 94025, Menlo Park, University Drive 775