JP2000510684A - Interleukin-3 (IL-3) receptor agonist - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質、ＩＬ-3造血受容体アゴニストタンパク質をコードするＤＮＡ，ＩＬ-3造血受容体アゴニストタンパク質の製造方法およびＩＬ-3造血受容体アゴニストタンパク質の使用方法が開示されている。   (57) [Summary] Novel IL-3 receptor agonist protein, DNA encoding IL-3 hematopoietic receptor agonist protein, method for producing IL-3 hematopoietic receptor agonist protein, and method for using IL-3 hematopoietic receptor agonist protein I have.

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン-3（ＩＬ-3）受容体アゴニスト 本出願は1995年10月05日付出願に係わる米国特許仮出願一連番号第60/004,835 号の35ＵＳＣ§119(e)に基づく優先権を主張するものである。 発明の分野 本発明はヒトインターロイキン-3（ｈＩＬ-3）の受容体アゴニストに関する。 これらのｈＩＬ-3アゴニストは、ネイティブなｈＩＬ-3の活性の１種または２種 以上を維持し、また改良された造血細胞刺激活性および／またはネイティブなｈ ＩＬ-3に伴う望ましくない生物活性の低下を包含する改良された活性像を示し、 および／または溶解性、安定性および再フォールド効率の増大を包含する改良さ れた物理学的性状を有する。 発明の背景 骨髄細胞の分化および／または増殖を刺激するコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は 造血幹細胞由来の細胞のレベルの低下を回復させるそれらの治療的可能性により 多大の興味を生じている。ヒトおよびマウス系両者のＣＳＦは同定され、それら の活性によって識別されている。たとえば、顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）および マクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）は、それぞれ、好中性顆粒球およびマクロ ファージコロニーのインビトロ形成を刺激し、一方ＧＭ-ＣＳＦおよびインター ロイキン-3（ＩＬ-3）はより広範な活性を有し、マクロファージ、好中性および 好酸性顆粒球コロニー両者の形成を刺激する。ＩＬ-3はまた、マスト細胞、巨核 球ならびに純粋および混合赤芽球コロニーの形成を刺激する。 ＩＬ-3は、多くの異なる細胞種の増殖を刺激し、前駆細胞の成長および増殖を 支持するその能力により、疾患または治療的処置たとえば放射線照射および化学 療法により細胞数が低下した症例の造血細胞の正常数への回復における治療的使 用の可能性を有する。 インターロイキン-3（ＩＬ-3）は造血細胞の生存、成長および分化を促進でき る性質を有する造血細胞成長因子である。ＩＬ-3の生物活性には、（ａ）すべ てのまたは実質的にすべての血液細胞系統を担当する前駆細胞の成長および分化 を支持する能力、（ｂ）初期多能幹細胞と相互作用する能力、（ｃ）多能性前駆 細胞の成長を維持する能力、（ｄ）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞の増殖を刺 激する能力、（ｅ）マスト細胞、好酸球および好塩基球の増殖を刺激する能力、 （ｆ）ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞によるＤＮＡ合成を刺激する能力、 （ｇ）細胞にロイコトリエンおよびヒスタミンの産生を誘導する能力、（ｈ）白 血球走化性を誘導する能力、ならびに（ｉ）白血球の接着に必要な細胞表面分子 を誘導する能力がある。 成熟ヒトインターロイキン-3（ｈＩＬ-3）は、133個のアミノ酸から構成され る。それは１個のジスルフィド橋および２個のグリコシル化可能部位を包含する （Youngら，Cell 47:3，1986）。 マウスＩＬ-3（ｍＩＬ-3）はIhleら（J.Immunol．126:2184，1981）によりＴ 細胞関連酵素、20-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの発現を誘導する因 子として最初に同定された。この因子は均一に精製され、多くのサブクラスの初 期造血細胞およびリンパ系前駆細胞の成長および分化を調節することが明らかに された。 1984年に、マウスＩＬ-3をコードするｃＤＮＡクローンが単離された（Fungら ，Nature 307:233，1984およびYokotaら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 81:1070，1 984）。マウスＤＮＡ配列はシグナルペプチド候補を含む166アミノ酸のポリペプ チドをコードしていた。 テナガザルのＩＬ-3配列はテナガザルのｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて得 られた。テナガザルのＩＬ-3配列はついで、ヒトＩＬ-3配列を得るため、ヒトゲ ノムライブラリーに対するプローブとして使用された。 マウスＩＬ-3配列のテナガザルおよびヒトゲノムＤＮＡホモローグはYangら（ Cell 47:3,1986）によって開示された。Yangらによって報告されたヒト配列は成 熟タンパク質配列の位置８にセリン残基を包含した。この発見に続いて他の研究 者によりそのタンパク質配列の位置８にプロリンを有するPro⁸ｈＩＬ-3cＤＮＡ の単離が報告された。すなわち、ｈＩＬ-3には２種の対立形質が存在するものと 思われる。 Dorssersら（Gene 55:115，1987）はヒトｃＤＮＡライブラリーからｍＩＬ-3 とハイブリダイズするクローンを発見した。このハイブリダイゼーションは、ｍ ＩＬ-3とｈＩＬ-3の3'非コード領域間の高度なホモロジーの結果であった。この ｃＤＮＡはｈＩＬ-3（Pro⁸）配列をコードしていた。 米国特許第4,877,729号および米国特許第4,959,455号にはヒトＩＬ-3およびテ ナガザルＩＬ-3ｃＤＮＡならびにそれらがコードするタンパク質配列が開示され ている。開示されたｈＩＬ-3はタンパク質配列の位置８にプロリンではなくセリ ンを有する。 Clark-Lewisら（Science 231:134，1986）は自動ペプチドシンセサイザーで合 成されたマウスＩＬ-3アナローグの機能分析を実施した。この著者らは、完全な 活性には完全分子の安定な三次構造が要求されると結論した。ジスルフィド橋の 役割に関する研究では、４個のすべてのシステインのアラニンによる置換はネイ ティブな分子の500分の１の活性を有する分子を与えることが明らかにされた。C ys残基４個中２個をAlaにより置換すると（Cys⁷⁹，Cys¹⁴⁰→Ala⁷⁹，Ala¹⁴⁰）活 性の上昇を生じた。著者らは、マウスＩＬ-3においては生理的レべルに近い生物 活性を得るためにシステイン17および18の間に１個のジスルフィド橋が要求され ること、ならびにこの構造は多分機能に至適なコンフォーメーションを与えるタ ンパク質の三次構造を安定化すると結論している（Clark-Lewisら，Proc.Natl.A cad.Sci．USA 85:7897，1988）。 国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ88/00598号には、テナガザルおよびヒト様ＩＬ-3 が開示されている。このｈＩＬ-3はSer⁸→Pro⁸置換を含有する。CysをSerで置換 してジスルフィド結合を破壊することおよびグリコシル化部位における１個もし くは２個以上のアミノ酸を置換することが示唆されている。 ＥＰ-Ａ-0275598号（ＷＯ88/04691号）には、Ala¹を欠失させても生物活性は 維持できることが例示されている。ある種の突然変異ｈＩＬ-3配列、たとえば２ 種の二重突然変異体、Ala¹→Asp¹，Trp¹³→Arg¹³（ｐＧＢ/ＩＬ-302）、ならび に１種の三重突然変異体、Ala¹→Asp¹，Leu⁹→Pro⁹，Trp¹³→Arg¹³（ｐＧＢ/Ｉ Ｌ-303）が提供されている。 ＷＯ88/05469号には脱グリコシル化突然変異体の取得方法が記載され、突然変 異体Arg⁵⁴Arg⁵⁵およびArg¹⁰⁸Arg¹⁰⁹Lys¹¹⁰ではSaccharomyces cerevisiaeにおけ る発現に際してＫＥＸ2プロテアーゼによる蛋白分解を回避できることが示唆さ れている。突然変異タンパク質は開示されていない。この場合、酵母内での発現 時のグリコシル化およびＫＥＸ2-プロテアーゼ活性のみが重要である。 ＷＯ88/06161号にはコンフォーメーションおよび抗原的に中性と理論的に考え られる様々な突然変異体について言及されている。実際に実施された突然変異は Met²→Ile²およびIle¹³¹→Leu¹³¹のみである。意図された中性化がこれら２種の 突然変異体で得られたかどうかは開示されていない。 ＷＯ91/00350号には非グリコシル化ｈＩＬ-3アナローグタンパク質たとえばｈ ＩＬ-3（Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰）；Met³ｈＩＬ-3（Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰）；Thr⁴ｈＩＬ-3（ Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰）およびThr⁶ｈＩＬ-3（Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰）が開示されている。こ れらのタンパク質組成はネイティブなｈＩＬ-3に伴うある種の有害な副作用、た とえばマスト細胞およびリンパ球の真皮への侵入に由来する蕁麻疹を示さないと 述べられている。開示されたアナローグｈＩＬ-3タンパク質はMet³，Thr⁴，また はThr⁶にＮ末端を有していてもよい。 ＷＯ91/12874号には天然に存在するアミノ酸残基が少なくとも１個のCys残基 で置換されたＩＬ-3のシステイン付加変異体（ＣＡＶ）が開示されている。 ＷＯ94/12639号には、１〜３個のアミノ酸置換ならびに所望によりＮ末端およ びＣ末端からの欠失を含み、効力が増強され、治療範囲が改良されたＩＬ-3の新 規な変異体が開示されている。 ＷＯ94/12638号には、4〜44個のアミノ酸置換ならびに所望によりＮ末端およ びＣ末端からの欠失を含有し、効力が増強され、治療範囲が改良されたＩＬ-3の 新規な変異体が開示されている。 ＷＯ95/27732号には、Ｇ-ＣＳＦの元の位置69を新たなＮ末端とし、Ｇ-ＣＳＦ の元の位置68を新たなＣ末端とし、循環的に順序を換えたＧ-ＣＳＦリガンドを 創成する位置68/69に切断点を有する循環的に順序を換えたＧ-ＣＳＦリガンドが 記載されてはいるが、その分子が生物活性を有することは示されていない。ＷＯ 95/27732号には、循環的に順序を換えたＧＭ-ＣＳＦ，ＩＬ-2およびＩＬ-4も開 示されている。タンパク質配列の再配列 進化において、ＤＮＡ配列の再配列は、タンパク質の構造および機能の多様性 の発生に重要な役割を果たす。遺伝子重複およびエキソンのシャッフリングは、 とくに基礎突然変異率が低いことから、多様性を迅速に発生させ、それによって 競合的利点を有する生物体を与える重要な機構を提供する（Doolittle，Protein Science 1:191-200，1992）。 組換えＤＮＡ法の開発は、タンパク質のフォールディング、構造および機能に 対する配列転位の効果の検討を可能にした。新たな配列の創成に用いられるアプ ローチはそれらのアミノ酸配列の線状認識が関係する天然に起こるタンパク質対 合の場合に類似する（Cunninghamら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:3218-3222，1 979;Teather & Erfle，J．Bacteriol．172:3837-3841，1990;Schimmingら，Eur. J.Biochem．204:13-19，1992;Yamiuchi & Minamikawa，FEBS Lett．260:127-130 ，1991;MacGregreら，FEBS Lett．378:263-266，1996）。このタイプの再配列の タンパク質への最初のインビトロの適用はGoldenberg & Creighton（J.Mol.Biol ．165:407-413，1983）によって記載された。新たなＮ末端は元の配列の中間部 位（切断点）に選択され、新たな配列は切断点からそれが元のＣ末端またはその 付近のアミノ酸に到達する点まで元の配列と同じ順序のアミノ酸を有する。この 点で、新たな配列は元のＮ末端またはその付近のアミノ酸に直接または配列の付 加的部分（リンカー）を介して接続され、新たな配列は元の配列の切断部位に対 してＮ末端であったアミノ酸またはその付近の点に到達するまで元の配列と同じ 配列で連続して、この残基がこの鎖の新しいＣ末端を形成する。 このアプローチは58〜462アミノ酸サイズ範囲のタンパク質に適用されている （Goldenberg & Creighton，J.Mol.Biol．165:407-413，1983;Li & Coffino，Mo l.Cell.Biol．13:2377-2388，1993）。調べられたタンパク質は広範囲の構造ク ラスに及び、α-ヘリックス（インターロイキン-4；Kreitmanら，Cytokine 7:31 1-318，1995），β-シート（インターロイキン-1；Horlickら，Protein Eng.5:4 27-431，1992）を支配的に含有するタンパク質、あるいはその二者の混合物（酵 母ホスホリボシル／アントラニル酸イソメラーゼ；Lugerら，Science 243:206-2 10，1989）が包含される。これらの配列認識研究においては、以下のよう に、広範なカテゴリーのタンパク質機能が表現されている。 酵素 Ｔ４リゾチーム：Zhangら，Biochemistry 32:12311-12318，1993;Zhangら，Na ture Struct.Biol．1:434-438，1995 ジヒドロ葉酸レダクターゼ：Buchwalderら，Biochemistry 31:1621-1630，19 94;Protasovaら，Prot.Eng．7:1373-1377，1995 リボヌクレアーゼＴ１：Mullinsら，J.Am.Chem.Soc．116:5529-5533，1994;Ga rrettら，Protein Science 5:204-211，1996 バシラスβ−グルカナーゼ：Hahnら，Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A 91:10417-1 0421，1994 アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ：Yang & Schachman，Proc．Natl． Acad．Sci．U.S.A90:11980-11984，1993 ホスホリボシル／アントラニル酸イソメラーゼ：Lugerら，Science 243:206-2 10，1989;Lugerら，Prot．Eng．3:249-258，1990 ペプシン／ペプシノーゲン：Linら，Protein Science 4:159-166，1995 グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ：Vignaisら，Protein Scienc e 4:994-1000，1995 オルニチンデカルボキシラーゼ：Li & Coffino，Mol．Cell．Biol．13:2377-2 388，1993 酵母のホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ：Ritco-Vonsoviciら，Biochemis try34:16543-16551，1995 酵素インヒビター 塩基性膵臓トリプシンインヒビター：Goldenberg & Creighton，J.Mol.Biol． 165:407-413，1983 サイトカイン インターロイキン-1β：Horlickら，Protein Eng．5:427-431，1992 インターロイキン-4：Kreitmanら，Cytoklne 7:311-318，1995 チロシンキナーゼ認識ドメイン α−スペクトリンＳＨ３ドメイン：Vigueraら，J.Mol.Biol．247:670-681， 1995 トランスメンブレンタンパク質 ｏｍｐＡ:Koebnik & Kramer，J.Mol.Biol．250:617-626，1955 キメラタンパク質 インターロイキン-4-シュウドモナスエキソトキシン：Kreitmanら，Proc.Natl .Acad.Sci．U.S.A．91:6889-6893，1994 これらの研究の結果は高度な変動性を示した。多くの場合、実質的に低下した 活性、溶解性または安定性が観察された（大腸菌ジデヒドロ葉酸レダクターゼ、 アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ、ホスホリボシル／アントラニル酸イ ソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンデカ ルボキシラーゼ、ｏｍｐＡ，酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）。他の 場合には、配列が再配列されたタンパク質は、多くのその天然対応物とほぼ同一 の性質を有するように思われた（塩基性膵臓トリプシンインヒビター、Ｔ４リゾ チーム、リボヌクレアーゼＴ1，バシラスβ-グルカナーゼ、インターロイキン-1 β，α-スペクトリンＳＨ３ドメイン、ペプシノーゲン、インターロイキン-4） 。例外的な場合には天然の配列のある性質、たとえば再配列されたα-スペクト リンＳＨ3ドメイン配列については溶解度および再フォールディング率、転位し たインターロイキン-4-シュウドモナスエキソトキシンの受容体親和性および抗 腫瘍活性に対する予期されない改良が観察された（Kreitmanら，Proc．Natl.Aca d．Sci．U.S.A．91:6889-6893，1994;Kreitmanら,CancerRes．55:3357-3363，19 95）。 これらのタイプの研究の一次的な動機は、タンパク質のフォールディングおよ び安定性における短レンジおよび長レンジ相互作用の役割を検討することであっ た。このタイプの配列再配置は、元の配列において長レンジである相互作用のサ ブセットを新しい配列における短レンジ相互作用またはその逆に変換する。これ らの配列再配置の多くが少なくともある種の活性をもつコンフォーメーションを 達成できるという事実は、タンパク質のフォールディングが多重フォールディン グ経路によって起こることの納得できる証拠である（Vigueraら，J．Mol．Biol ．247:670-681，1995）。α-スペクトリンのＳＨ3ドメインの場合には、β-ヘア ピンターンに相当する位置に新たな末端を選択すると、安定性はわずかに低下す るものの、なおフォールディング可能なタンパク質を生じた。 ここに引用した試験に用いられた中間部切断点の位置は、もっぱらタンパク質 の表面上に見出され、末端または中央に対する明らかな偏りはなく線状配列を通 じて分布している（元のＮ末端から切断点までの相対距離の変動は、総配列長の 約10％〜80％である）。これらの研究において元のＮ末端とＣ末端を連結するリ ンカーは0〜9残基の範囲であった。一つの例（Yang & Schachman，Proc.Natl．A cad.Sci．U.S.A．90:11980-11984，1993）では、配列の一部は元のＣ末端セグメ ントから欠失させ、連結は切断されたＣ末端から元のＮ末端に行われた。可撓性 の親水性残基、たとえばGlyおよびSerが、リンカー中に頻繁に使用される。Vigu eraら（J.Mol.Biol．247:670-681，1995）は元のＮおよびＣ末端の３または４残 基リンカーによる接続を比較した。３塩基リンカーの方が熱力学的安定性が低か った。Protasovaら（Protein Eng．7:1373-1377，1994）は大腸菌ジヒドロ葉酸 レダクターゼの元のＮ末端の連結に３または５残基リンカーを使用した。３残基 リンカーのみがタンパク質を好収率で生成させた。 発明の概要 本発明は、新規な組換えヒトインターロイキン-3（ｈＩＬ-3）受容体アゴニス トに関する。これらのｈＩＬ-3アゴニストは、ＮおよびＣ末端のいずれかまたは 両者にアミノ酸置換および／または欠失を含有していてもよい。本発明はまたｈ ＩＬ-3受容体アゴニストを含有する医薬組成物、およびその受容体アゴニストの 使用方法に関する。さらに、本発明は、上記受容体アゴニストをコードするＤＮ Ａ，ｈＩＬ-3受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列からなる組換え発 現ベクター、関連微生物発現系およびその微生物発現系を用いるｈＩＬ-3受容体 アゴニストの製造方法に関する。これらのｈＩＬ-3受容体アゴニストはｈＩＬ-3 と類似のまたはそれより良好な生物活性を有し、場合によって改良された副作用 像を示す。すなわち一部の受容体アゴニストはネイティブなｈＩＬ-3よりも良好 な治療係数を有する。 本発明はまた、ＩＬ-3アンタゴニストとして、またはイムノアッセイおよび免 疫治療プロトコールに有用な抗体産生用の分離された抗原性フラグメントとし て機能できる分子を提供する。ｈＩＬ-3のアンタゴニストは、ＡＭＬ，ＣＭＬお よびある種のＢリンパ系癌のようなある種の癌細胞の成長をブロックするのにと くに有用性が期待される。アンタゴニストが有用な他の状態には、ある種の血液 細胞が異常に大量に産生されるかまたは内因性リガンドによって活性化される状 態が包含される。アンタゴニストは，リガンド、多分天然に存在するヘモポエチ ンたとえば、それらに限定されるものではないが、ＩＬ-3受容体複合体に結合す るそれらの能力により癌細胞の増殖を誘発し増強するＩＬ-3，ＭＧ-ＣＳＦおよ びＩＬ-5と効率的に競合し、一方、リガンドの固有の活性化作用を低下させる。 ＩＬ-3，ＭＧ-ＣＳＦおよび／またはＩＬ-5はある種の喘息応答に役割を果たし ている。ＩＬ-3受容体のアンタゴニストは受容体誘導活性化および炎症細胞の供 給を遮断することによりこの疾患に有用性を有する可能性がある。 本発明の修飾ヒトインターロイキン-3受容体アゴニストは、式 Ｘ¹−(Ｌ)_a−Ｘ² によって表すことができる。 式中、 ａは０または１であり、 Ｘ¹は残基ｎ＋１からＪの配列に相当するアミノ酸配列から構成されるペプチ ドであり、 Ｘ²は残基１からｎの配列に相当するアミノ酸配列から構成されるペプチドで あり、 ｎは１からＪ−１の範囲の整数であり、 Ｌはリンカーである。 上記式中、ヒトＩＬ-3の構成アミノ酸残基にはアミノ末端からカルボキシル末 端に順次、１からＪの番号を付す。このタンパク質内で隣接するアミノ酸対はそ れぞれｎおよびｎ＋１の番号が付される（この場合、ｎは１からＪ−１の範囲の 整数である）。残基ｎ＋１が新たなインターロイキン-3受容体アゴニストの新し いＮ末端となり、残基ｎが新たなインターロイキン-3受容体アゴニストの新しい Ｃ末端となる。 本発明の好ましい実施態様は、式[式中、 位置17におけるXaaは、Ser，Lys，Gly，Asp，Met，GlnまたはArgであり、 位置18におけるXaaは、Asn，His，Leu，Ile，Phe，ArgまたはGlnであり、 位置19におけるXaaは、Met，Phe，Ile，Arg，Gly，AlaまたはCysであり、 位置20におけるXaaは、Ile，Cys，Gln，Glu，Arg，ProまたはAlaであり、 位置21におけるXaaは、Asp，Phe，Lys，Arg，Ala，Gly，Glu，Gln，Asn，Thr ，SerまたはValであり、 位置22におけるXaaは、Glu，Trp，Pro，Ser，Ala，His，Asp，Asn，Gln，Leu ，ValまたはGlyであり、 位置23におけるXaaは、Ile，Val，Ala，Gly，Trp，Lys，Phe，Leu，Serまたは Argであり、 位置24におけるXaaは、Ile，Gly，Val，Arg，Ser，PheまたはLeuであり、 位置25におけるXaaは、Thr，His，Gly，Gln，Arg，ProまたはAlaであり、 位置26におけるXaaは、His，Thr，Phe，Gly，Arg，AlaまたはTrpであり、 位置27におけるXaaは、Leu，Gly，Arg，Thr，SerまたはAlaであり、 位置28におけるXaaはLys，Arg，Leu，Gln，Gly，Pro，ValまたはTrpであり、 位置29におけるXaaはGln，Asn，Leu，Pro，ArgまたはValであり、 位置30におけるXaaはPro，His，Thr，Gly，Asp，Gln，Ser，LeuまたはLysであ り、 位置31におけるXaaは、Pro，Asp，Gly，Ala，Arg，LeuまたはGlnであり、 位置32におけるXaaはLeu，Val，Arg，Gln，Asn，Gly，AlaまたはGluであり、 位置33におけるXaaはPro，Leu，Gln，Ala，ThrまたはGluであり、 位置34におけるXaaは、Leu，Val，Gly，Ser，Lys，Glu，Gln，Thr，Arg，Ala ，Phe，IleまたはMetであり、 位置35におけるXaaは、Leu，Ala，Gly，Asn，Pro，GlnまたはValであり、 位置36におけるXaaはAsp，LeuまたはValであり、 位置37におけるXaaはPhe，Ser，Pro，TrpまたはIleであり、 位置38におけるXaaはAsnまたはAlaであり、 位置40におけるXaaはLeu，TrpまたはArgであり、 位置41におけるXaaは、Asn，Cys，Arg，Leu，His，MetまたはProであり、 位置42におけるXaaは、Gly，Asp，Ser，Cys，Asn，Lys，Thr，Leu，Val，Glu ，Phe，Tyr，Ile，MetまたはAlaであり、 位置43におけるXaaは、Glu，Asn，Tyr，Leu，Phe，Asp，Ala，Cys，Gln，Arg ，Thr，GlyまたはSerであり、 位置44におけるXaaは、Asp，Ser，Leu，Arg，Lys，Thr，Met，Trp，Glu，Asn ，Gln，AlaまたはProであり、 位置45におけるXaaは、Gln，Pro，Phe，Val，Met，Leu，Thr，Lys，Trp，Asp ，Asn，Arg，Ser，Ala，Ile，GluまたはHisであり、 位置46におけるXaaは、Asp，Phe，Ser，Thr，Cys，Glu，Asn，Gln，Lys，His ，Ala，Tyr，Ile，ValまたはGlyであり、 位置47におけるXaaは、Ile，Gly，Val，Ser，Arg，ProまたはHisであり、 位置48におけるXaaは、Leu，Ser，Cys，Arg，Ile，His，Phe，Glu，Lys，Thr ，Ala，Met，ValまたはAsnであり、 位置49におけるXaaはMet，Arg，Ala，Gly，Pro，Asn，HisまたはAspであり、 位置50におけるXaaは、Glu，Leu，Thr，Asp，Tyr，Lys，Asn，Ser，Ala，Ile ，Val，His，Phe，MetまたはGlnであり、 位置51におけるXaaは、Asn，Arg，Met，Pro，Ser，ThrまたはHisであり、 位置52におけるXaaは、Asn，His，Arg，Leu，Gly，SerまたはThrであり、 位置53におけるXaaは、Leu，Thr，Ala，Gly，Glu，Pro，Lys，SerまたはMetで あり、 位置54におけるXaaは、Arg，Asp，Ile，Ser，Val，Thr，Gln，Asn， Lys，His，AlaまたはLeuであり、 位置55におけるXaaは、Arg，Thr，Val，Ser，LeuまたはGlyであり、 位置56におけるXaaは、Pro，Gly，Cys，Ser，Gln，Glu，Arg，His，Thr，Ala ，Tyr，Phe，Leu，ValまたはLysであり、 位置57におけるXaaはAsnまたはGlyであり、 位置58におけるXaaは、Leu，Ser，Asp，Arg，Gln，ValまたはCysであり、 位置59におけるXaaは、Glu，Tyr，His，Leu，ProまたはArgであり、 位置60におけるXaaは、Ala，Ser，Pro，Tyr，AsnまたはThrであり、 位置61におけるXaaは、Phe，Asn，Glu，Pro，Lys，ArgまたはSerであり、 位置62におけるXaaはAsn，His，Val，Arg，Pro，Thr，AspまたはIleであり、 位置63におけるXaaはArg，Tyr，Trp，Lys，Ser，His，ProまたはValであり、 位置64におけるXaaは、Ala，Asn，Pro，SerまたはLysであり、 位置65におけるXaaは、Val，Thr，Pro，His，Leu，PheまたはSerであり、 位置66におけるXaaは、Lys，Ile，Arg，Val，Asn，GluまたはSerであり、 位置67におけるXaaはSer，Ala，Phe，Val，Gly，Asn，Ile，ProまたはHisであ り、 位置68におけるXaaはLeu，Val，Trp，Ser，Ile，Phe，ThrまたはHisであり、 位置69におけるXaaは、Gln，Ala，Pro，Thr，Glu，Arg，Trp，GlyまたはLeuで あり、 位置70におけるXaaは、Asn，Leu，Val，Trp，ProまたはAlaであり、 位置71におけるXaaは、Ala，Met，Leu，Pro，Arg，Glu，Thr，Gln，Trpまたは Asnであり、 位置72におけるXaaはSer，Glu，Met，Ala，His，Asn，ArgまたはAspであり、 位置73におけるXaaはAla，Glu，Asp，Leu，Ser，Gly，ThrまたはArgであり、 位置74におけるXaaは、Ile，Met，Thr，Pro，Arg．GlyまたはAlaであり、 位置75におけるXaaは、Glu，Lys，Gly，Asp，Pro，Trp，Arg，Ser，Glnまたは Leuであり、 位置76におけるXaaは、Ser，Val，Ala，Asn，Trp，Glu，Pro，GlyまたはAspで あり、 位置77におけるXaaは、Ile，Ser，Arg，ThrまたはLeuであり、 位置78におけるXaaは、Leu，Ala，Ser，Glu，Phe，GlyまたはArgであり、 位置79におけるXaaはLys，Thr，Asn，Met，Arg，Ile，GlyまたはAspであり、 位置80におけるXaaはAsn，Trp，Val，Gly，Thr，Leu，GluまたはArgであり、 位置81におけるXaaはLeu，Gln，Gly，Ala，Trp，Arg，ValまたはLysであり、 位置82におけるXaaは、Leu，Gln，Lys，Trp，Arg，Asp，Glu，Asn，His，Thr ，Ser，Ala，Tyr，Phe，Ile，MetまたはValであり、 位置83におけるXaaは、Pro，Ala，Thr，Trp，ArgまたはMetであり、 位置84におけるXaaは、Cys，Glu，Gly，Arg，MetまたはValであり、 位置85におけるXaaは、Leu，Asn，ValまたはGlnであり、 位置86におけるXaaは、Pro, Cys，Arg，AlaまたはLysであり、 位置87におけるXaaは、Leu，Ser，TrpまたはGlyであり、 位置88におけるXaaは、Ala，Lys，Arg，ValまたはTrpであり、 位置89におけるXaaは、Thr，Asp，Cys，Leu，Val，Glu，Hls，AsnまたはSerで あり、 位置90におけるXaaはAla，Pro，Ser，Thr，Gly，Asp，IleまたはMetであり、 位置91におけるXaaはAla，Pro，Ser，Thr，Phe，Leu，AspまたはHisであり、 位置92におけるXaaは、Pro，Phe，Arg，Ser，Lys，His，Ala，Gly,IleまたはL euであり、 位置93におけるXaaはThr，Asp，Ser，Asn，Pro，Ala，LeuまたはArgであり、 位置94におけるXaaは、Arg，Ile，Ser，Glu，Leu，Val，Gln，Lys，His，Ala またはProであり、 位置95におけるXaaは、His，Gln，Pro，Arg，Val，Leu，Gly，Thr，Asn，Lys ，Ser，Ala，Trp，Phe，IleまたはTyrであり、 位置96におけるXaaは、Pro，Lys，Tyr，Gly，IleまたはThrであり、 位置97におけるXaaは、Ile，Val，Lys，AlaまたはAsnであり、 位置98におけるXaaは、His，Ile，Asn，Leu，Asp，Ala，Thr，Glu，Gln，Ser ，Phe，Met，Val，Lys，Arg，TyrまたはProであり、 位置99におけるXaaは、Ile，Leu，Arg，Asp，Val，Pro，Gln，Gly，Ser，Phe またはHisであり、 位置100におけるXaaはLys，Tyr，Leu，His，Arg，Ile，Ser，GlnまたはProで あり、 位置101におけるXaaはAsp，Pro，Met，Lys，His，Thr，Val，Tyr，Glu，Asn， Ser，Ala，Gly，Ile，LeuまたはGlnであり、 位置102におけるXaaは、Gly，Leu，Glu，Lys，Ser，TyrまたはProであり、 位置103におけるXaaは、AspまたはSerであり、 位置104におけるXaaはTrp，Val，Cys，Tyr，Thr，Met，Pro，Leu，Gln，Lys， Ala，PheまたはGlyであり、 位置105におけるXaaはAsn，Pro，Ala，Phe，Ser，Trp，Gln，Tyr，Leu，Lys， Ile，AspまたはHisであり、 位置106におけるXaaは、Glu，Ser，Ala，Lys，Thr，Ile，GlyまたはProであり 、 位置108におけるXaaはArg，Lys，Asp，Leu，Thr，Ile，Gln，His，Ser，Alaま たはProであり、 位置109におけるXaaは、Arg，Thr，Pro，Glu，Tyr，Leu，SerまたはGlyであり 、 位置110におけるXaaはLys，Ala，Asn，Thr，Leu，Arg，Gln，His，Glu，Serま たはTrpであり、 位置111におけるXaaはLeu，Ile，Arg，AspまたはMetであり、 位置112におけるXaaは、Thr，Val，Gln，Tyr，Glu，His，SerまたはPheであり 、 位置113におけるXaaはPhe，Ser，Cys，His，Gly，Trp，Tyr，Asp，Lys，Leu， Ile，ValまたはAsnであり、 位置114におけるXaaは、Tyr，Cys，His，Ser，Trp，ArgまたはLeuであり、 位置115におけるXaaはLeu，Asn，Val，Pro，Arg，Ala，His，Thr，TrpまたはM etであり、 位置116におけるXaaはLys，Leu，Pro，Thr，Met，Asp，Val，Glu，Arg，Trp， Ser，Asn，His，Ala，Tyr，Phe，GlnまたはIleであり、 位置117におけるXaaは、Thr，Ser，Asn，Ile，Trp，LysまたはProであり、 位置118におけるXaaは、Leu，Ser，Pro，Ala，Glu，Cys，AspまたはTyrであり 、 位置119におけるXaaは、Glu，Ser，Lys，Pro，Leu，Thr，TyrまたはArgであり 、 位置120におけるXaaは、Asn，Ala，Pro，Leu，His，ValまたはGlnであり、 位置121におけるXaaは、Ala，Ser，Ile，Asn，Pro，Lys，AspまたはGlyであり 、 位置122におけるXaaはGln，Ser，Met，Trp，Arg，Phe，Pro，His，Ile，Tyrま たはCysであり、 位置123におけるXaaは、Ala，Met，Glu，His，Ser，Pro，TyrまたはLeuであり 、 Xaaで表示された０〜44のアミノ酸はネイティブな（１〜133）ヒトインターロ イキン-3の相当するアミノ酸とは異なり、Ｎ末端からの１〜14のアミノ酸および ／またはＣ末端からの１〜15のアミノ酸は所望により欠失していてもよく、 Ｎ末端は、直接またはＮ末端をＣ末端に接続できるリンカー（Ｌ）を介してＣ 末端に接続され、新しいＣおよびＮ末端をアミノ酸： 26-27 49-50 83-84 27-28 50-51 84-85 28-29 51-52 85-86 29-30 52-53 86-87 30-31 53-54 87-88 31-32 54-55 88-89 32-33 64-65 89-90 33-34 65-66 90-91 34-35 66-67 91-92 35-36 67-68 92-93 36-37 68-69 97-98 37-38 69-70 98-99 38-39 70-71 99-100 39-40 71-72 100-101 40-41 72-73 101-102 41-42 82-83 102-103 または 103-104 に有する］の修飾ヒトインターロイキン-3受容体アゴニストであり、さらに上記 修飾ヒトインターロイキン-3受容体アゴニストは直前に（メチオニン^-1）、（ア ラニン^-1）または（メチオニン^-2，アラニン^-1）が先行していてもよい。 新たなＣ末端およびＮ末端を作成できるさらに好ましい切断点は、 28-29，29-30，30-31，31-32，32-33，33-34，34-35，35-36，36-37，37-38， 38-39，39-40，66-67，67-68，68-69，69-70，70-71，84-85，85-86，86-87， 87-88，88-89，89-90，90-91，98-99，99-100，100-101および101-102 である。 新たなＣ末端およびＮ末端を作成できる最も好ましい切断点は、34-35，69-70 および90-91である。 本発明の好ましい実施態様においては、Ｎ末端をＣ末端に接続させるリンカー （Ｌ）は以下の： GlyGlyGlySer(SEQ ID NO：２) GlyGlyGlySerGlyGlyGlySer（SEQ ID NO：33） GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：34） SerGlyGlySerGlyGlySer（SEQ ID NO：35） GluPheGlyAsnMet（SEQ ID NO：36） GluPheGlyGlyAsnMet（SEQ ID NO：37） GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMet（SEQ ID NO：38）および GlyGlySerAspMetAlaGly（SEQ ID NO：39） からなる群より選択されるポリペプチドである。 図面の簡単な説明 図１はタンパク質の配列再配置を模式的に例示する。ネイティブなタンパク質 のＮ末端（Ｎ）およびＣ末端（Ｃ）はリンカーを介して接続されるかまたは直接 接続される。タンパク質は切断点で開裂して新しいＮ末端（新Ｎ）および新しい Ｃ末端（新Ｃ）を創成させると、新しい線状アミノ酸配列を有するタンパク質が 生成する。再配列された分子は線状分子として新たに合成し、元のＮ末端および Ｃ末端の接続ならびに切断点でのタンパク質の開裂工程を行わなくてもよい。 図２はネイティブなタンパク質の元のＮ末端およびＣ末端をリンカーで接続し て、異なるＮ末端およびＣ末端のタンパク質を生成させる新たなタンパク質創成 のための方法Ｉを模式的に示す。示した例では、配列再配置により元のタンパク 質のアミノ酸97に創成された新しいＮ末端を有し、元のＣ末端（a.a.174）はリ ンカー領域を介してアミノ酸11に接続され（a.a.1〜10は欠失させる）、新しい Ｃ末端は元の配列のアミノ酸97に創成されたタンパク質をコードする新たな遺伝 子を生じる。 図３はネイティブなタンパク質の元のＮ末端およびＣ末端をリンカーを用いな いで接続させ、異なるＮ末端およびＣ末端のタンパク質を生成させる新たなタン パク質創成のための方法IIを模式的に示す。示した例では、配列再配置により元 のタンパク質のアミノ酸97に創成された新しいＮ末端を有し、元のＣ末端（a.a. 174）は元のＮ末端に接続され、新しいＣ末端は元の配列のアミノ酸96に創成さ れたタンパク質をコードする新たな遺伝子を生じる。 図４はネイティブなタンパク質の元のＮ末端およびＣ末端をリンカーで接続し て、異なるＮ末端およびＣ末端のタンパク質を生成させる新たなタンパク質創成 のための方法IIIを模式的に示す。示した例では、配列再配置により元のタンパ ク質のアミノ酸97に創成された新しいＮ末端を有し、元のＣ末端（a.a.174）は リンカー領域を介しアミノ酸１に接続させ、新しいＣ末端は元の配列のアミノ酸 96に創成されたタンパク質をコードする新たな遺伝子を生じる。 発明の詳細な説明 本発明は、ヒトインターロイキン-3（ｈＩＬ-3）の新規な受容体アゴニストに 関し、その配列は新しいＮ末端および新しいＣ末端を有するように再配列され、 またアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失を有していてもよく、 実質的に同一の構造および実質的に同一の生物活性を有する受容体アゴニストで ある。ヒトインターロイキン-3（ｈＩＬ-3）の新規な受容体アゴニストはまた、 ｈＩＬ-3ポリペプチドアミノ酸の天然に存在する変異体のアミノ酸置換（たとえ ば、ｈＩＬ-3ポリペプチド配列中の位置８がセリンではなくプロリンである対立 型）、または翻訳後修飾（たとえばグリコシル化）されたｈＩＬ-3受容体アゴニ ストのような、ＷＯ94/12639号、ＷＯ94/12638号、ＷＯ95/20976号、ＷＯ95/211 97号、ＷＯ95/20977号、ＷＯ95/21254号に記載されたＩＬ-3変異体のアミノ酸置 換を含有していてもよい。 本発明はまた、受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列、実質的に類似のお よび実質的に同一の機能を発揮するＤＮＡ配列、ならびに本発明の受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡと遺伝子コードの縮重によってのみ相違するＤＮＡ配列 を包含する。 本発明にはまた、本発明の受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列、受容体 アゴニストＤＮＡの構築に使用されるオリゴヌクレオチド中間体、およびこれら のオリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも包含する。これらの ポリペプチドはアンタゴニストとしてまたはイムノアッセイおよび免疫療法プロ トコールに有用な抗体産生のための抗原性フラグメントとして有用である。 ヒトＩＬ-3はヒト造血前駆細胞によるコロニー形成を刺激するその能力によっ て特徴づけることができる。形成されるコロニーには、赤芽球、顆粒球、巨核球 、顆粒球マクロファージおよびそれらの混合物が包含される。ヒトＩＬ-3は最初 に霊長類ついでヒトにおいて実施された試験で骨髄機能および末梢血液細胞集団 を治療的に有益なレベルに回復させる能力が証明された（Gillio，A.P.ら，1990 ;Ganser，A.ら，1990;Falk，S.ら，1991）。ｈＩＬ-3の他の活性には、白血球の 遊走および走化性を刺激する能力、ヒト白血球を感作して高レベルの炎症メディ エーターたとえばロイコトリエンおよびヒスタミンを産生させる能力、白血球の 接着に必要な分子の細胞表面発現を誘導する能力、ならびに真皮の免疫応答およ び発熱を誘導する能力が包含される。ＩＬ-3のこれらの生物活性の多くまたはす べてにシグナル伝達および高親和性受容体結合が関与する。本発明の受容体アゴ ニストは、有用な性質たとえばネイティブなｈＩＬ-3に比較して類似のもしくは より大きい生物活性、あるいは半減期の改良、有害な副作用の減弱もしくは物理 的性状の改良またはこれらの性質の組合せを有する。それらはまたアンタゴニス トとして有用な場合もある。ネイティブなｈＩＬ-3に比較してほとんどまたは全 く活性を示さないｈＩＬ-3突然変異ポリペプチドでも、アンタゴニストとして、 免疫学または免疫療法に使用するための抗体産生用の抗原として、遺伝子プロー ブとして、または他の有用なｈＩＬ-3アゴニストの構築のために使用される中間 体として有用な場合がある。ｈＩＬ-3はその受容体（単数または複数）に結合し 、担当シグナル伝達を発生させるセカンドメッセンジャーを誘導することによっ て機能することから、本発明のｈＩＬ-3受容体アゴニストは、これらの活性にい ずれの特定のアミノ酸配列が関与するかの決定の補助に有用である。 本発明の新規なｈＩＬ-3受容体アゴニストは、好ましくはヒトＩＬ-3またはＩ Ｌ-3様成長因子の少なくとも１種の生物学的性質を有し、１種以上のＩＬ-3様生 物学的性質、または改良された性質もしくはヒトＩＬ-3の望ましくない生物学的 性質の低下を示す。 このような性質の一つは、赤血球系、リンパ球系および骨髄系統の担当前駆細 胞の成長および分化の支持である。たとえば、標準ヒト骨髄アッセイにおいて、 ＩＬ-3様生物学的性質とは顆粒球型コロニー、巨核球型コロニー、単球／マクロ ファージ型コロニー、および赤芽球コロニー群の刺激である。他のＩＬ-3様性質 には、初期多能幹細胞との相互作用、多能性前駆細胞の成長の維持、慢性骨髄性 白血病（ＣＭＬ）細胞の増殖を刺激する能力、マスト細胞の増殖を刺激する能力 、各種因子依存性細胞系の成長を支持する能力、ならびに未成熟骨髄細胞前駆細 胞を誘導する能力がある。ＩＬ-3の他の生物学的性質は本技術分野において開示 されている。ヒトＩＬ-3はまた、場合によっては望ましくないある種の生物学的 活性、たとえばロイコトリエンの放出を刺激する能力、ならびに培養およびイン ビボ脾臓および骨髄におけるヒスタミン合成の亢進を刺激する能力を有する。 本発明の受容体アゴニストの一部はまた、改良された副作用像を示す。たとえ ば、それらは、ネイティブなｈＩＬ-3または（15-125）ｈＩＬ-3に比較して、ロ イコトリエン放出またはヒスタミン放出の低下を生じる。このようなｈＩＬ-3ま たはｈＩＬ-3様生物学的性質には、以下の生物学的特性ならびにインビボおよび インビトロ活性の１種または２種以上が包含される。 ｈＩＬ-3および本発明のｈＩＬ-3受容体アゴニストの生物学的活性は、ヒト急 性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）によるＤＮＡ合成によって測定される。因子依存 性細胞系ＡＭＬ193が生物活性の試験における使用に適合された。 「ネイティブな配列」とは遺伝子またはタンパク質の野生型またはネイティブ 型と同一のアミノ酸または核酸配列を意味する。 本発明のｈＩＬ-3受容体アゴニスト、とくにネイティブなｈＩＬ-3と類似のま たはそれより良好な活性を維持するアゴニストの一つの可能性のある利点は、所 望の治療効果を生じるために生物学的に活性な受容体アゴニストのより少量の 使用を可能にすることである。これは、所望の治療効果を生じるために必要な処 置回数を低下させることを可能にする。より少量の使用はまた抗原性作用の可能 性または他の望ましくない副作用の可能性を減少させる。たとえば、所望の治療 効果がより少量のポリペプチドで達成できるならば、ネイティブなＩＬ-3の投与 に伴う副作用、たとえばロイコトリエンおよび／またはヒスタミン放出の刺激を 低減または消失させることができる。本発明のｈＩＬ-3受容体アゴニストはまた 受容体数の少ない幹細胞または前駆細胞の活性化に有用であると思われる。本発 明のｈＩＬ-3受容体アゴニストを含有する医薬組成物は非経口的に、静脈内にま たは皮下に投与することができる。 本発明の修飾されたｈＩＬ-3受容体アゴニストは、末梢血液中の造血前駆細胞 および幹細胞の可動化に有用である。末梢血液由来の前駆細胞は自家骨髄移植の セッティングで患者の体力回復に有効なことが示されている。Ｇ-ＣＳＦおよび ＧＭ-ＣＳＦを含む造血細胞成長因子は末梢血中の循環前駆細胞および幹細胞の 数を増大させることが明らかにされている。これは末梢幹細胞の収集操作を単純 化し、必要なフォレーシスの回数が減ることにより操作の経費を劇的に低下させ た。修飾されたｈＩＬ-3受容体アゴニストは幹細胞の可動化に有用であり、末梢 幹細胞移植の効率をさらに増大させる。 本発明の修飾されたｈＩＬ-3受容体アゴニストは造血前駆細胞および幹細胞の エキソビボ展開にも有用である。たとえばｈＩＬ-3のようなコロニー刺激因子（ ＣＳＦ）は、高用量の化学療法に続いて、このような処置の結果しばしば認めら れる好中球減少症および血小板減少症の処置のために、単独で投与され、他のＣ ＳＦと共投与され、また骨髄移植片と配合して投与される。しかしながら、重篤 な好中球減少症および血小板減少症の期間を完全に消失させることはできない。 単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球を含む）および巨核球からなる骨髄細 胞系統は、生命の危険を伴う感染および出血の防止に重要である。好中球減少症 および血小板減少症はまた、疾患、遺伝子異常、薬物、毒素、放射線照射および 多くの治療的処置たとえば慣用の癌治療の結果である場合もある。 骨髄移植はこの患者群の処置に使用されている。しかしながら、危険に曝され た造血系を回復させるための骨髄の使用には、付随する幾つかの問題、たとえば １）骨髄、脾臓または末梢血中の幹細胞数は限られていること、２）移植片対宿 主病、３）移植片拒絶、および４）腫瘍細胞の夾雑の可能性がある。幹細胞は骨 髄、脾臓および末梢血中の有核細胞の極めて小さな割合を占めるにすぎない。幹 細胞の数が多いほど造血機能の回復は増強される用量依存性の存在が明らかであ る。したがって、幹細胞のインビトロ展開は造血機能の回復および患者の生存率 を増大させることになる。移植用の骨髄の提供には同種ドナーからの骨髄が使用 されている。しかしながら、移植片対宿主病および移植片拒絶はＨＬＡがマッチ した同胞ドナーからのレシピエントにおいても骨髄移植を制限する。同種骨髄移 植の代替法が自家骨髄移植である。自家骨髄移植においては、患者自身の骨髄の 一部を、骨髄破壊療法たとえば高用量化学療法の前に収穫し、その後患者に戻し 移植する。自家移植は、移植片対宿主病および移植片拒絶の危険を消失させる。 しかしながら、自家骨髄移植にもなお、骨髄中の幹細胞の限られた数および腫瘍 細胞による汚染の可能性という意味での問題がある。幹細胞の限られた数は幹細 胞のエキソビボ展開によって克服きる。さらに幹細胞は、骨髄移植片の腫瘍細胞 の夾雑を低下させるために、特異的表面抗原たとえばＣＤ34＋の存在に基づき特 異的に単離することができる。 以下の特許には、幹細胞の分離、ＣＤ34＋細胞、造血因子との細胞の培養、造 血障害患者の処置のためのそれらの細胞の使用、ならびに細胞の展開および遺伝 子療法のための造血因子の使用に関するさらに詳細が含まれている。 第5,061,620号は、供与された細胞からの幹細胞の分離によって得られるヒト 造血幹細胞からなる組成物に関する。 第5,199,942号には、（１）患者からの造血前駆細胞の採取、（２）ＩＬ-3， ｆｌｔ３リガンド，ｃ-ｋｉｔリガンド，ＧＭ-ＣＳＦ，ＩＬ-1，ＧＭ-ＣＳＦ／ ＩＬ-3融合タンパク質およびそれらの配合物から選択される成長因子による細胞 のエキソビボ展開、（３）細胞プレパレーションの患者への投与、からなる自家 造血細胞移植方法が記載されている。 第5,240,856号は、細胞分離過程を自動的に制御する装置を包含する細胞セパ レーターに関する。 ＷＯ91/16116号には、細胞の混合物から標的細胞を選択的に単離および分離す る装置および方法が記載されている。 Ｗ０9l/18972号には、骨髄細胞の懸濁液を中空繊維バイオリアクターを用いて インキュベートすることによる骨髄のインビトロ培養方法が記載されている。 ＷＯ92/18615号は、サイトカインの特定の混合物を含有する培養培地中で移植 に使用するための骨髄細胞を維持および展開する方法に関する。 ＷＯ93/08268号には、（ａ）ＣＤ34＋幹細胞を他の細胞からの分離工程および （ｂ）分離された細胞の幹細胞が選択的に展開される選択培地中においてインキ ュベートする工程からなる幹細胞の選択的展開方法が記載されている。 ＷＯ93/18136号には、末梢血液に由来する哺乳類細胞のインビトロ支持方法が 記載されている。 ＷＯ93/18648号は、ヒト好中球前駆細胞と高含量の骨髄芽球および前骨髄球か らなる遺伝性または後天性好中球減少症の処置のための組成物に関する。 ＷＯ94/08039号には、ｃ-ｋｉｔタンパク質を発現する細胞の選択によるヒト 造血幹細胞の濃縮方法が記載されている。 ＷＯ94/11493号には、対向流溶出法を用いて単離されるＣＤ34＋であり、サイ ズの小さい幹細胞集団が記載されている。 ＷＯ94/27698号は、不均一細胞混合物から有核不均一細胞集団を選択的に分離 するための免疫親和性分離と連続流遠心分離を組み合わせた方法に関する。 ＷＯ94/25848号には、標的細胞の収集および処理のための細胞分離装置が記載 されている。 Brandtら，J.Clin.Invest．86:932-942，1990には、ヒト骨髄からの造血前駆 細胞の高度に濃縮されたＣＤ34＋前駆体の、ＩＬ-1ａ，ＩＬ-3，ＩＬ-6またはＧ Ｍ-ＣＳＦ含有培地中での長期培養が論じられている。 本発明の一態様では幹細胞の選択的なエキソビボ展開方法が提供される。「幹 細胞」の語は、骨髄、脾臓または末梢血液から単離できる全能性造血幹細胞なら びに初期前駆体および前駆細胞を意味する。「展開」の語は、細胞の分化および 増殖を意味する。本発明は（ａ）他の細胞からの幹細胞の分離、（ｂ）分離され た細胞の、本発明のｈＩＬ-3受容体アゴニスト（単数または複数）を含有する選 択培養培地での培養、ならびに（ｃ）培養細胞の収穫の工程からなる幹細胞の 選択的エキソビボ展開方法を提供する。幹細胞、ならびに好中球、赤血球、血小 板等になる運命の担当前駆細胞は、これらの細胞の表面上に存在する特定の前駆 細胞マーカー抗原たとえばＣＤ34の存在もしくは不存在によりおよび／または形 態学的特性により、大部分の他の細胞から識別することができる。高度に濃縮さ れたヒト幹細胞分画の表現型にはＣＤ34＋，Thy-1＋およびlin−が報告されてい るが、本発明はこの幹細胞集団の展開に限定されるものではないことを理解すべ きである。ＣＤ34＋濃縮ヒト幹細胞分画は報告されている多くの方法たとえば親 和性カラムもしくはビーズ、磁性ビーズまたは表面抗原たとえばＣＤ34＋に向け られた抗体を用いるフローサイトメトリーによって分離することができる。さら に、造血前駆細胞の濃縮には物理学的分離方法たとえば対向流溶出法を使用する ことができる。ＣＤ34＋前駆細胞は不均一であり、異種系統関連細胞表面関連抗 原の共発現の存在または不存在によって特徴づけられる数種のサブ集団に分割す ることができる。最も未成熟な前駆細胞は既知の系統関連マーカーたとえばＨＬ Ａ-ＤＲもしくはＣＤ38は発現しないが、ＣＤ90（thy-1）を発現する場合がある 。ＣＤ33，ＣＤ38，ＣＤ41，ＣＤ71，ＨＬＡ-ＤＲまたはｃ-ｋｉｔのような他の 表面抗原も造血前駆細胞の選択的単離に使用することができる。分離された細胞 は、培養フラスコ、滅菌バッグまたは中空繊維内において選択培地中でインキュ ベートすることができる。細胞を選択的に展開させるためには、様々なコロニー 刺激因子が利用できる。骨髄のエキソビボ展開に利用されている代表的な因子に はｃ-ｋｉｔリガンド、ＩＬ-3，Ｇ-ＣＳＦ，ＧＭ-ＣＳＦ，ＩＬ-1，ＩＬ-6，Ｉ Ｌ-11，ｆｌｔ-3リガンドまたはそれらの配合物が包含される。幹細胞の増殖は 、標準方法（たとえば血球計算盤、ＣＦＵ，ＬＴＣＩＣ）またはフローサイトメ トリーにより、インキュベーションの前または後に幹細胞および他の細胞の数を 計数することによってモニターできる。 幹細胞のエキソビボ展開には多くの選択方法および様々なコロニー刺激因子た とえばｃ-ｋｉｔリガンド（Brandtら，Blood 83:1507-1514，1994;McKennaら，B lood 86:3413-3420，1995），ＩＬ-3（Brandtら，Blood 83:1507-1514，1994;Sa toら，Blood 82:3600-3609，1993），Ｇ-ＣＳＦ（Satoら，Blood 82:3600-3609 ，1993），ＧＭ-ＣＳＦ(Satoら，Blood 82:3600-3609，1993)，ＩＬ-1 （Muenchら，Blood 81:3463-3473，1993），ＩＬ-6（Satoら，Blood 82:3600-36 09，1993），ＩＬ−11（Lemoliら，Exp.Hem．21:1668-1672，1993;Satoら，Bloo d 82:3600-3609，1993），flt-3リガンド（McKennaら，Blood 86:3413-3420，19 95）および／またはそれらの配合物（Brandtら，Blood 83:1507-1514，1994;Hay lockら，Blood 80:1405-1412，1992;Kollerら，Biotechnology 11:358-363，199 3;Lemoliら，Exp.Mem．21:1668-1672，1993;McKennaら，Blood86:3413-3420，19 95;Muenchら，Blood 81:3463-3473，1993;Patchenら，Biotherapy 7:13-26，199 4;Satoら，Blood 82:3600-3609，1993;Smithら，Exp.Hem．21:870-877，1993;St eenら，Stem Cell 12:214-224，1994:Tsujinoら，Exp.Hem．21:1379-1386，1993 ）を用いる展開を利用したいくつかの方法が報告されている。個々のコロニー刺 激因子の中ではｈＩＬ-3が末梢血ＣＤ34＋細胞の展開に最も強力な因子の一つで あることが示されている（Satoら，Blood 82:3600-3609，1993;Kobayashiら，Bl ood 73:1836-1841，1989）。しかしながら、単一因子で多重因子の配合物と同等 に有効であることが示された因子はない。本発明は単一因子の単独よりも有効な 修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストを利用するエキソビボ展開方法を提供する。 本発明の他の態様は、造血前駆細胞を維持および／または展開する方法におい て、間質細胞系たとえばＨＳ-5に暴露して調整し（ＷＯ96/02662号，Roecklein & Torok-Strob，Blood 85:997-1105，1995）、本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴ ニストを補充した培養培地を含む培養容器中に細胞を接種することを包含する方 法を提供する。 成長因子の他の突出した臨床的使用は、遺伝子療法のための造血前駆細胞およ び幹細胞のインビトロ活性化においてである。造血前駆細胞の長い寿命およびそ れらの娘細胞の全身を通じての分布により、造血前駆細胞はエキソビボ遺伝子ト ランスフェクションのための優れた候補である。関心遺伝子を造血前駆細胞また は幹細胞のゲノム内に導入するためには、細胞***およびＤＮＡ複製を刺激する ことが必要である。造血幹細胞の周期は極めて低頻度で循環し、これは遺伝子ト ランスダクションを促進し、それにより遺伝子療法の臨床的成功の可能性を高め るために成長因子が有用であることを意味する。遺伝子療法の可能性がある適応 （Crystal，Science 270:404-410，1995の総説参照）には１）多くの先天性代謝 異常および免疫不全（Kay & Woo，Trends Genet．10:253-257，1994），２）神 経障害（Friedmann，Trends Genet．10:210-214，1994），３）癌（Culver & Bl aese，Trends Genet．10:174-178，1994）および４）感染性疾患（Gilboa & Smi th，Trends Genet．10:139-144，1994）がある。造血前駆細胞の長い寿命および それらの娘細胞の全身を通じての分布により、造血前駆細胞はエキソビボ遺伝子 トランスフェクションの優れた候補である。 遺伝子材料の宿主細胞への導入には、本技術分野の熟練者には周知の様々な方 法がある。治療用遺伝子の一次細胞への移送には、ウイルス性、非ウイルス性両 者の多くのベクターが開発されている。ウイルスに基づくベクターには１）複製 欠損組換えレトロウイルス（Boris-Lawrie & Temin，Curr.0pin.Genet.Dev．3:1 02-109，1993;Boris-Lawrie & Temin，Annal．New York Acad．Sci．716:59-71 ，1994:Miller，Current Top．Microbiol．Immunol．158:1-24，1992）および複 製欠損組換えアデノウイルス（Berkner，BioTechniques 6:616-629，1988:Berkn er，Current Top.Microbiol.Immunol.158:39-66，1992;Brody & Crystal，Annal ．New York Acad．Sci．716:90-103，1994）がある。非ウイルスベースのベクタ ーには、タンパク質／ＤＮＡ複合体（Cristianoら，PNAS USA．90:2122-2126，1 993;Curielら，Annal.New York Acad．Sci．716:36-58，1994）、エレクトロポ レーションおよびリポソーム仲介送達たとえば陽イオン性リポソーム（Farhood ら，Annal．New York Acad．Sci．716:23-35，1994）がある。 本発明は、新しい遺伝子材料が導入されている造血細胞を展開する現存の方法 に対する、単一のコロニー刺激因子によっては認められなかった活性を含む改良 された生物活性および／または物理学的性質を有するｈＩＬ-3受容体アゴニスト を用いる方法を提供する点での改良を提供する。 多くの薬物が骨髄抑制または造血不全を引き起こすことがある。このような薬 物の例には、ＡＺＴ，ＤＤＩ，アルキル化剤および化学療法に用いられる抗代謝 物、抗生物質たとえばクロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビール、 ダウノマイシンおよびサルファ剤、フェノチアジン、トランキライザーたとえば メプロバメート、鎮痛剤たとえばアミノピリンおよびジピロン、抗けいれん剤た とえばフェニトインまたはカルバマゼピン、抗甲状腺剤たとえばプロピルチオウ ラシルおよびメチマゾールならびに利尿剤がある。本発明の修飾されたｈＩＬ-3 受容体アゴニストは、これらの薬物で処置された患者にしばしば認められる骨髄 抑制または造血不全の防止または処置に有用である。 造血不全はまた、ウイルス、微生物または寄生虫感染の結果として、および腎 疾患または腎不全の処置たとえば透析の結果としても起こる。本発明の修飾され たｈＩＬ-3受容体アゴニストはこのような造血不全の処置に有用である。 造血不全の処置は修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストを含有する医薬組成物の患者 への投与を包含する。本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストはまた、造血前駆 細胞の患者への注射の前に本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストによりインビ トロで処置するこれらの細胞の活性化および増幅に有用である。 たとえばＴおよび／もしくはＢリンパ球における各種免疫不全または免疫疾患 たとえば慢性関節リウマチも本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストによる処置 によって有利に影響される。免疫不全は、ウイルス感染たとえばＨＴＬＶＩ，Ｈ ＴＬＶII，ＨＴＬＶIIIの感染の結果、大線量照射線への暴露、癌治療または他 の薬物療法の結果である場合もある。本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストは 、単独でまたは他のコロニー刺激因子と併用して、他の血液細胞欠損たとえば栓 球減少症（血小板欠損）または貧血の処置にも使用できる。これらの新規なポリ ペプチドの他の用途には、骨髄移植から回復中の患者のインビボおよびエキソビ ボ処置、ならびに診断および治療用に標準方法で発生されるモノクローナルおよ びポリクローナル抗体の開発がある。 本発明の他の態様は、上述の状態の処置方法および処置用組成物である。この ような組成物は本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストの１種または２種以上の 治療有効量を医薬的に許容される担体と混合してなる組成物である。この組成物 は非経口的、静脈内または皮下のいずれかにより投与できる。投与に際して、本 発明において使用される治療用組成物は、パイロジェンを含まない、非経口投与 が許容される水溶液の形態とすることが好ましい。ｐＨ，等張性、溶解性等を十 分に考慮した非経口投与が許容されるこのようなタンパク質溶液の調製について は本分野の技術の範囲を超えるものではない。 他の態様は、新規なｈＩＬ-3受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列および 遺伝子コードの縮重を除いて同一のＤＮＡ配列を提供することにある。ＤＮＡ配 列に「稀な」コドンを除去するための変更、ＤＮＡ配列のＧＣ含量を変更するた めの修飾、ＲＮＡメッセージの安定性を増大させるための修飾、および特定の宿 主細胞での発現を改善するためのＮ末端における修飾を実施できることは、本技 術分野の熟練者には周知の通りである。 本発明の他の態様は、これらの新規なｈＩＬ-3受容体アゴニストの発現方法に おいて用いられるプラスミドＤＮＡベクターを提供する。これらのベクターは本 発明の新規なポリペプチドをコードする上述の新規なＤＮＡ配列を含有する。ｈ ＩＬ-3受容体アゴニストの発現が可能な微生物をトランスフォームできる適当な ベクターには、ｈＩＬ-3受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列を用い られる宿主細胞に応じて選択される転写および翻訳調節配列に接続してなる発現 ベクターが包含される。 上述の修飾配列を導入するベクターは本発明に包含され、ｈＩＬ-3受容体アゴ ニストの製造に有用である。この方法に用いられるベクターはまた、本発明のＤ ＮＡコード配列に操作性に結合し、選ばれた宿主細胞内でのその複製および発現 を指示できる選択された調節配列を含有する。 本発明の他の態様として、新規な修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストの製造方法が 提供される。本発明の方法は、新規な修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストの発現をコ ードするＤＮＡ配列を含有するベクターでトランスフォームされた適当な細胞ま たは細胞系の培養を包含する。適当な細胞または細胞系は細菌細胞とすることが できる。たとえば、生物工学の分野においては大腸菌の様々な株が宿主細胞とし て周知である。このような株の例には大腸菌株ＪＭ101（Yanish-Perronら，Gene 33:103-119，1985）およびＭＯＮ105（Obukowiczら，Applied Environmental M icrobiology 58:1511-1523，1992）が包含される。本発明にはまたバクテリオフ ァージＭｕに基づく大腸菌の染色体発現ベクターを用いる（Welnbergら，Gene 1 26:25-33，1993）修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質の発現も包含される 。枯草菌の様々な株もこの方法に使用できる。本技術分野の熟練者に周知の酵母 細胞の多くの株も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞とし て利用できる。大腸菌の細胞質で発現させる場合には、本発明の修飾ｈＩＬ-3受 容体アゴニストをコードする遺伝子は遺伝子の５'末端に、そのタンパク質のＮ 末端にMet^-1-Ala^-2-またはMet^-1をコードするコドンが付加されるように構築す ることもできる。大腸菌の細胞質内で作成されるタンパク質のＮ末端はメチオニ ンアミノペプチダーゼ（Ben Bassatら，J．Bac．161:751-757，1987）および多 分他のペプチダーゼによる翻訳後プロセッシングによって発現時にＮ末端からメ チオニンが切断されるように影響される。本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニス トには、Ｎ末端にMet^-1，Ala^-1またはMet^-2-Ala^-1を有する修飾ｈＩＬ-３受容体 アゴニストポリペプチドが包含される。これらの突然変異修飾ｈＩＬ-3受容体ア ゴニストも大腸菌内でＮ末端に分泌シグナルペプチドを融合することにより発現 される。このシグナルペプチドは分泌過程の一部としてそのポリペプチドから切 断される。 本発明における使用には哺乳類細胞たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞 （ＣＨＯ）も適当である。哺乳類細胞における異種遺伝子発現の一般的な方法は Kaufman,R.J.，1987，Genetic Engineering，Principles and Methods，Vol.9， J.K.Setlow編，Plenum Press，New Yorkに総説されている。哺乳類細胞内で機能 できる強力なプロモーターが真核細胞分泌シグナルペプチドコード領域の転写を 駆動し、それが修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストのコード領域に翻訳可能に接続さ れた発現ベクターが構築される。たとえば、ｐｃＤＮＡＩ/Ｎｅｏ，ｐＲｃ/ＲＳ ＶおよびｐＲｃ/ＣＭＶ（Invitrogen Corp.，San Diego，Californiaから入手） のようなプラスミドが使用できる。真核細胞分泌シグナルペプチドコード領域は その遺伝子自体または他の分泌性哺乳類タンパク質からのものとすることができ る（Bayne，M.L.ら，Proc.Natl.Acad.Scl．USA 84:2638-2642，1987）。遺伝子 を含有するベクターの構築後、ベクターＤＮＡを哺乳類細中にトランスフェクト する。このような細胞はたとえば、ＣＯＳ７，ＨｅＬａ，ＢＨＫ，ＣＨＯまたは マウスＬ系統とすることができる。細胞は、たとえばＤＭＥＭ培地（JRH Scient ific）中で培養できる。培地中に分泌されるポリペプチドは、細胞のトランスフ ェクション後24〜72時間の一過性発現に続いて、または抗生物質抵抗性について 選択して安定な細胞系を樹立したのちに、標準的生化学アプローチにより 回収できる。適当な哺乳類宿主細胞の選択ならびにトランスフォーメーション、 培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の産生と精製の方法は本技術分野にお いて周知である。たとえば、Gething & Sambrook，Nature 293:620-625，1981ま たはKaufmanら，Mol.Cell.Biol．5(7)1750-1759もしくはHowleyら,米国特許第4, 419,446号を参照されたい。他の適当な哺乳類細胞系はサルＣＯＳ-1細胞系であ る。同様に有用な哺乳類細胞系はサルＣＶ-1細胞系である。 所望により、本発明の方法における宿主細胞として昆虫細胞を利用することが できる。たとえばMillerら，Genetic Engineering 8:277-298（Plenum Press 19 86）それに引用された参考文献参照。さらに、バキュロウイルスベクターを用い て昆虫細胞中で異種遺伝子を発現させる一般的方法はSummers,M.D．& Smith，G. E.，1987，Amanual of methods for Baculovirus vectors and insect cellcult ure procedures，Texas Agriculture Experiment Station Bull．No．1555に記 載されている。強力なバキュロウイルスプロモーター（たとえばポリヘドロンプ ロモーター）が真核細胞分泌シグナルペプチドコード領域の転写を駆動し、それ を修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストポリペプチドのコード領域に翻訳可能に接続し て構成される発現ベクターが構築される。たとえば、プラスミド（ｐＶＬ1392（ Invitrogen Corp.，San Diego，Californiaから入手）を使用できる。修飾ｈＩ Ｌ-3受容体アゴニストポリペプチドをコードする遺伝子を担持するベクターの構 築後このＤＮＡ２μｇを１μｇのバキュロウイルスＤＮＡ（Summers & Smith，1 987参照）とともに昆虫細胞ＳＦ９株にコトランスフェクトする。修飾ｈＩＬ-3 受容体アゴニスト遺伝子を有する純粋な組換えバキュロウイルスを用いて、たと えばExcell 401無血清培地（JRH Biosciences，Lenexa，Kansas）中で培養細胞 を感染させる。培地中に分泌される修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストは標準生化学 的アプローチにより回収できる。修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質を発 現する哺乳類または昆虫細胞の上清はまず、多くの市販濃縮ユニットのいずれか を用いて濃縮できる。 上述の状態の処置方法における投与計画は担当医師により、薬物の作用を修飾 する様々な因子、たとえば患者の状態、体重、性別および食餌、感染があればそ の重篤度、投与回数ならびに他の臨床的因子を考慮して決定される。一般的に、 １日投与量は体重１kgあたり非グリコシル化ＩＬ-3タンパク質0.2〜150μｇの範 囲とすることができる。この投与糖基準は本明細書に記載するＡＭＬ増殖アッセ イにおいて一般的に約10〜100ピコモルのＥＣ₅₀を有すると認められているネイ ティブなＩＬ-3の標準レベルの生物活性を参照したものである。したがって、投 与量は与えられたムテインの活性とネイティブな（標準）ＩＬ-3の活性を比較し て調整されるものであり、投与基準を体重１kgあたりの１日用量最低0.1μｇ， 最高１mgの範囲とするのは不合理ではないと思われる。さらに、ＩＬ-3受容体ア ゴニストの体重１kgあたり１日投与量を10〜200μｇの範囲より高くまたは低く 調整することになる特殊な環境がある。これらには他のＣＳＦまたは成長因子と の共投与、化学療法剤および／または放射線照射との共投与、グリコシル化ＩＬ -3受容体アゴニストの使用、ならびにこの項で前述した患者に関連する様々な問 題が包含される。上述のように、治療方法および組成物は他のヒト因子との共投 与も包含する。本発明のポリペプチドとの同時または連続共投与に適当な他の造 血促進因子、コロニー刺激因子およびインターロイキン（本明細書においては、 集合的に「コロニー刺激因子」と呼ぶ）の非限定的リストには、ＧＭ-ＣＳＦ， Ｇ-ＣＳＦ，ｃ-ｍｐ１リガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られる），Ｍ -ＣＳＦ，エリスロポエチン（ＥＰＯ），ＩＬ-1，ＩＬ-4，ＩＬ-2，ＩＬ-3，Ｉ Ｌ-5，ＩＬ-6，ＩＬ-7，ＩＬ-8，ＩＬ-9，ＩＬ-10，ＩＬ-11，ＩＬ-12，ＩＬ-13 ，ＩＬ-15，ＬＩＦ，ｆｌｔ3/ｆｌｋ2 リガンド，ヒト成長因子，Ｂ細胞成長因 子，Ｂ細胞分化因子，好酸球分化因子およびスティール因子もしくはｃ-ｋｉｔ リカンドしても知られる幹細胞因子（ＳＣＦ）またはそれらの配合物が包含され る。上述の投与量は治療組成物中のこのような付加成分を補償して調整される。 処置患者の経過は血液学的プロフィルたとえば血球分類を周期的に評価してモニ ターできる。 リンカーの決定 リンカーのアミノ酸配列の長さは経験的にもしくは構造情報からの指針により またはこの両アプローチを用いて選択できる。 構造情報がない場合には、長さを0〜50Åの範囲をまたぐように変動させ、配 列を表面への露出（親水性：Hopp & Woods，Mol.Immunol．20:483-489，1983; Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol．157:105-132，1982），溶媒露出表面積（Lee & Richards，J.Mol.Biol．55:379-400，1971）およびＩＬ-3受容体アゴニストの コンフォーメーションを妨害しないで必要なコンフォーメーションを採用する能 力（コンフォーメーション可撓性：Karplus & Schulz，Naturwissenschaften 72 :212-213，1985）と矛盾しないように選択する設計を用いて試験用に少数の一連 のリンカーを調製することができる。翻訳の平均を残基あたり2.0〜3.8Åと仮定 すると、これは試験すべき長さは0〜30残基であり、好ましい範囲は0〜15残基で あることを意味する。このような経験的シリーズの例では、カセット配列たとえ ばGly-Gly-Gly-Serをｎ回反復使用してリンカーを構築することになる（ｎは１ ，２，３または４である）。本技術分野の熟練者には明らかなように、長さおよ び組成が異なり、リンカーとして機能できるこのような配列には多くの配列があ り、第一に考慮すべき点はそれらが長すぎも短すぎもしないことである（Sandhu ，Critical Rev．12:437-462，1992参照）。長すぎるとエントロピー効果が三次 元フォールドを不安定化するものと考えられ、短すぎるとねじれおよび立体的張 力により分子が不安定化するものと思われる。 タンパク質の構造情報の分析の熟練者には明らかなように、ｃ-α炭素の間の 距離として定義される鎖の末端の間の距離が、使用すべき配列の長さの決定また は少なくともリンカーの経験的選択において試験しなければならない可能性の数 の限定に使用できる。ポリペプチド鎖の末端の位置が、Ｘ線解析から誘導された 構造モデルまたは核磁気共鳴スペクトルデータでははっきりしない場合があり、 したがって、正確な場合にも、要求されるリンカーの長さを的確に推定するため にはこの状態を考慮する必要があることは本技術分野の熟練者には既知の通りで ある。位置がはっきりしている残基から配列中の鎖の末端に近い２つの残基を選 択し、それらのｃ-α炭素間の距離を用いてそれらの間のリンカーのおおよその 長さを計算する。計算された長さ指針として用いて、ある範囲の残基数もつリン カー（残基あたり2〜3.8Åを用いて計算する）をついで選択する。これらのリン カーは最初の配列から構成させるか、必要に応じて短縮または延長させ、延長す る場合は付加的残基を上述のように可撓性および親和性を示すように選択するか 、または所望により最初の配列を一連のリンカー、一例としては上述のGly- Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO：２）カセット法を用いて置換するか、また所望により 、適当な全長を有する最初の配列と新しい配列の組合せを使用する。 アミノおよびカルボキシル末端の決定 生物学的に活性な状態へのフォールディングが可能な配列は、元のポリペプチ ド鎖の内部から最初（アミノ末端）および最後（カルボキシル末端）の位置を適 当に選択し、一方上述のリンカー配列を用いて調製できる。アミノおよびカルボ キシル末端は以下に述べる指針を用いて切断領域と呼ばれる配列の共通のストレ ッチ内から選択される。すなわち、新規なアミノ酸配列は同一の切断領域内から アミノおよびカルボキシル末端を選択することにより発生される。多くの場合、 新しい末端の選択は元のカルボキシル末端の位置が元のアミノ末端の直前にくる ように行われる。しかしながら、本技術分野の熟練者には明らかなように、その 領域内いずれの位置における末端の選択も機能を果たし、これらは新たな配列の アミノまたはカルボキシル部分への欠失または付加を有効に導くものである。 タンパク質の一次アミノ酸配列がその生物学的機能の発現に必要な三次元構造 へのフォールディングを指令することは分子生物学の中心的教義である。タンパ ク質の単一結晶のＸ線解析またはタンパク質溶液の核磁気共鳴スペクトルを用い て三次元構造情報を取得し解釈する方法は本技術分野の熟練者には周知である。 切断領域の同定に関連する構造情報の例には、タンパク質の二次構造（αおよび 3-10ヘリックス、パラレルおよびアンチパラレルβシート、折返し構造およびタ ーンならびにループ：Kabsch & Sander，Biopolymers 22:2577-2637，1983）の 位置およびタイプ、アミノ酸残基の溶媒露出程度、残基相互の作用の程度および タイプ（Chothia，Ann.Rev.Biochem．53:537-572，1984）ならびにポリペプチド 鎖に沿ったコンフォーメーションの静的および動的分布（Alber & Mathews，Met hods Enzymol．154:511-533，1987）がある。一部の場合には、残基の溶媒露出 について付加的情報が得られる。一つの例は炭水化物の翻訳後付着部位であり、 これは必然的にタンパク質の表面上に存在する。実験的な構造情報がないかまた は得ることができない場合には、タンパク質の三次および二次構造、溶媒の接近 容易性ならびにターンおよびループの存在を予測するため、一次アミノ酸配列の 解析も利用できる。直接的な構造決定方法が困難な場合、表面への露出を経 験的に決定するために生化学的方法を適用できる場合もある。たとえば表面露出 を推定するために制限タンパク分解後に鎖の切断部位を同定する方法を使用する （Gentile & Salvatore，Eur．J．Biochem．218:603-621，1993）。すなわち、 実験的に誘導された構造情報もしくは予測方法（たとえばSrinivisan & Rose，P roteins;Struct．Funct．& Genetics，22:81-99，1995）のいずれかを用い、母 体アミノ酸配列を調べて、領域をそれらが二次および三次構造の維持に必須か否 かによって分類する。周期的二次構造（αおよび3-10ヘリックス、パラレルおよ びアンチパラレルβシート）に関与することが知られている領域内の配列の存在 は避けるべき領域である。同様に溶媒露出度の低いことが観察または予測される アミノ酸配列の領域もタンパク質のいわゆる疎水性コアの部分である可能性が高 く、アミノおよびカルボキシル末端の選択は避けるべきである。これに反して表 面ターンまたはループ内にあることが知られているか予測される領域、とくに生 物活性には必要でないことが知られている領域は、ポリペプチド鎖の末端の選定 に好ましい部位である。上述の基準に基づいて好ましいアミノ酸配列の連続スト レッチが切断領域と呼ばれる。 材料および方法 とくに指示のない限りすべての化学試薬はSigma，Co．（St．Louis，MO）から 入手した。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４リガーゼはNew England Biolabs （Beverly，MA）もしくはBoehringer Mannheim（Indianapolis，IN）から入手し た。 大腸菌株のトランスフォーメーション 大腸菌株、たとえばＤＨ５α（登録商標，Life Technologies，Gaithersburg ，MD）およびＴＧ１（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL）をライゲーシ ョン反応物のトランスフォーメーションに用い、哺乳類細胞をトランスフェクト するためのプラスミドＤＮＡの起源とする。大腸菌株たとえばＪＭ101（Yanisch -Perronら，Gene 33:103-119，1985）とＭＯＮ105（Obukowiczら，Appl．Envir ．Micr．58:1511-1523，1992）は本発明の修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストを細胞 質またはペリプラスム間隙中で発現させるために使用できる。 ＭＯＮ105 ＡＴＣＣ #55204：lamda−，ＩＮ(rrnD，rrE)1．rpoD＋，rpoH 358 ＤＨ５α（登録商標）：Ｆ−，phi80dlacZdeltaM15，delta（lacZ Y A-argF)U 169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk−，mk＋)，phoA，supE441amda−，thi-1 ，gyrA96，relA1 ＴＧＩ：delta(lac-pro)，supE，thi-1，hsdD5/F'(traD36，proA＋B＋，lacIq ，lacZdeltaM15) ＪＭ101 ＡＴＣＣ #33876：delta(pro lac)，supE，thi，F'(traD36，proA＋B ＋，lacIq，lacZdeltaM15) ＤＨ５α（登録商標）サブクローニング効率細胞は、コンピテント細胞として 購入し、製造業者のプロトコールを用いてそのままトランスフォーメーションで きるが、ＴＧＩおよびＭＯＮ105の両大腸菌株はＤＮＡを取り込ませるためには ＣａＣｌ₂法を用いてコンピテントにする。通常、20〜50mlの細胞をＬＢ培地（ １％バクトートリプトン，0.5％バクト-酵母エキス，150ｍＭ ＮａＣｌ）中で、 Baush & Lomb Spectronic分光光度計（Rochester，NY）により測定して600ナノ メーターにおける光学密度単位（ＯＤ 600）が約1.0の密度になるまで増殖させ る。細胞を遠心分離によって収集し、培養容量の５分の１のＣａＣｌ₂溶液（50 ｍＭ ＣａＣｌ₂，10ｍＭ Tris-Cl，ｐＨ7.4）に再懸濁して４℃に30分間保持す る。細胞を再び遠心分離により収集し、培養容量の10分の１のＣａＣｌ₂溶液に 再懸濁する。これらの細胞0.2mlにライゲートしたＤＮＡを加え、サンプルを４ ℃に30〜60分間保持する。サンプルを42℃に２分間シフトさせ、1.0mlのＬＢを 添加したのち、サンプルを37℃で１時間振盪する。これらのサンプルからの細胞 を、アンピリシン抵抗性トランスフォーマントを選択する場合はアンピシリン（ 100μｇ/ml）、スペクチノマイシン抵抗性トランスフォーマントを選択する場合 はスペクチノマイシン（75μｇ/ml）を含むプレート（ＬＢ培地＋1.5％バクトア ガール）上に播く。プレートを37℃で一夜インキュベートする。 コロニーを採取し、適当な抗生物質（アンピシリン100μｇ/mlまたはスペクチ ノマイシン75μｇ/ml）を加えたＬＢ中に接種し、振盪しながら37℃で成長させ る。 新たなＮ末端／Ｃ末端を有する遺伝子の創成方法 方法Ｉ：新たなＮ末端／Ｃ末端を有しリンカー領域を含有する遺伝子の創成 新たなＮ末端／Ｃ末端を有し、元のＣ末端とＮ末端を分離するリンカー領域を 含有するする遺伝子は、L.S.Mullinsら，J.Am.Chem.Soc．116:5529-5533，1994 に記載された方法にほぼ従って作成することができる。ポリメラーゼチェーン反 応（ＰＣＲ）増幅の多重工程を用いてタンパク質の一次アミノ酸配列をコードす るＤＮＡ配列を再配列する。工程は図１に例示する。 第１工程においては、プライマーセット（”New start”と”linker start” ）を用いて、元の遺伝子配列から、新たなタンパク質の新たなＮ末端部分および それに続いて元のタンパク質のＣ末端とＮ末端を連結するリンカーをコードする 配列を含有するＤＮＡフラグメント（”Fragment Start”）を創成し、増幅させ る。第２工程ではプライマーセット（”New stop”および”linker stop”）を 用い、元の遺伝子配列から、上に用いたのと同じリンカーおよびそれに続く新た なタンパク質の新たなＣ末端部分をコードするＤＮＡフラグメント（”Fragment Stop”）を創成し、増幅させる。”New start”および”New stop”プライマー は新しい遺伝子の発現プラスミドへのクローニングを可能にする適当な制限部位 を包含するように設計される。通常のＰＣＲ条件は、95℃溶融２分間１サイクル ；94℃変性１分間，50℃アニーリング１分間および72℃伸長１分間25サイクル； プラス72℃伸長７分間１サイクルである。Perkin Elmer Gene AmpPCR Core Reag entキットを用いる。100μlの反応は各プライマ−100pmoleおよび鋳型ＤＮＡ １ μｇ；および１×ＰＣＲ緩衝液，200μＭ ｄＧＴＰ，200μＭ ｄＡＴＰ，200μ Ｍ ｄＴＴＰ，200μＭ ｄＣＴＰ，2.5単位のAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼおよ び２ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む。ＰＣＲ反応は480型ＤＮＡサーマルサイクラー（Per kin Elmer Corporation，Norwalk，CT）によって実施する。 リンカー領域における相補性配列およびリンカーの両側における２個のアミノ 酸のコード配列を有する”Fragment Start”および”Fragment Stop”を第３の ＰＣＲ工程で一緒に接続して、新しいタンパク質をコードする完全長遺伝子を作 成する。ＤＮＡフラグメント”Fragment Start”および”Fragment Stop”は１ ％ＴＡＥゲル上で分割し、エチジウムブロミドで染色し、Qiaex Gel Extraction キット（Qiagen）を用いて単離する。これらのフラグメント等モル量を混合し、 70℃に10分間加熱し、ついで徐々に冷却し、”linker start”と”linker stop ”にそれぞれ配分された配列によってアニーリングさせる。第３ＰＣＲ工程にお いては、プライマー”New start”および”New stop”をアニーリングしたフラ グメントに加え、完全長の新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子を創成し、増幅させる。 通常のＰＣＲ条件は、95℃溶融２分間１サイクル；94℃変性１分間，60℃アニー リング１分間および72℃伸長１分間25サイクル；プラス72℃伸長７分間１サイク ルである。Perkin Elmer Gene Amp PCR Core Reagentキットを使用する。100μ ｌの反応液は各プライマー100pmoleおよびＤＮＡ0.5μｇ；および１×ＰＣＲ緩 衝液，200μＭ ｄＧＴＰ，200μＭ ｄＡＴＰ，200μＭ ｄＴＴＰ，200μＭ ｄＣ ＴＰ，2.5単位AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼおよび2ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する 。ＰＣＲ反応産物はWizard PCR Prepsキット（Promega）を用い精製する。 方法II：新たなＮ末端／Ｃ末端を有しリンカー領域を含まない遺伝子の創成 元のＮ末端とＣ末端をリンカーを用いないで連結した新たなＮ末端／Ｃ末端遺 伝子は、２工程のＰＣＲ増幅およびブラント末端ライゲーションを用いて作成す ることができる。工程は図２に例示する。第１工程においては、プライマーセッ ト（”New start”および”P-bl start”）を用いて、元の遺伝子配列から、新 たなタンパク質の新たなＮ末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡフラグメ ント（”Fragment Start”）を創成し、増幅する。第２工程においては、プライ マーセット（”New stop”および”P-bl stop”）を使用して、元の遺伝子配列 から、新たなタンパク質の新たなＣ末端をコードする配列を含有するＤＮＡフラ グメント（”Fragment Stop”）を創成し、増幅する。”New start”および”Ne w stop”プライマーは、新しい遺伝子の発現プラスミドへのクローニングを可能 にする適当な制限部位を包含するように設計される。通常のＰＣＲ条件は、95℃ 溶融２分間１サイクル；94℃変性１分間，50℃アニーリング45秒間および72℃伸 長45秒間25サイクルである。オーバーハングの出現を減少させるために、Deep V entポリメラーゼ（New England Biolabs）を製造業者の推薦する条件下に使用す る。”P-bl start”および”P-bl stop”プライマーは、その後の”Fragment St art”および”Fragment Stop”相互のブラント末端ライゲーションを補助するた めに５'末端でリン酸化する。反応液100μｌは各プライマー150pmoleおよび鋳型 ＤＮＡ 1μｇ；ならびに１×Vent緩衝液（New England Biolabs），300μＭ ｄＧＴＰ， 300μＭ ｄＡＴＰ，300μＭ ｄＴＴP，300μＭ ｄＣＴＰ，1単位Deep Ventポリ メラーゼを含有する。ＰＣＲ反応は480型ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin El mer Corporation，Norwalk，CT）により実施する。ＰＣＲ反応産物はWizard PCR Prepsキット（Promega）を用いて精製する。 プライマーは新しい遺伝子の発現ベクターへのクローニングを可能にする適当 な制限部位を包含するように設計される。通常、”Fragment Start”はNcoI制限 部位が創成されるように設計され、”Fragment Stop”はHindIII制限部位が創成 されるように設計される。制限消化反応物は、Magic DNA Clean-up Systemキッ ト（Promega）を用いて精製する。Fragment Startおよびstopは１％ＴＡＥゲル 上で分割し、エチジウムブロミドで染色し、Qiaex Gel Extractionキット（Qiag en）を用い単離する。これらのフラグメントをｐＭＯＮ3934の約3800塩基対NcoI /HindIIIベクターフラグメントと混合し、50℃に10分間加熱し、徐々に冷却して その末端にアニーリングさせる。３種のフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼ（Bo ehringer Mannheim）を用いて互いにライゲートさせる。完全長の新しいＮ末端 ／Ｃ末端遺伝子を含有するプラスミドが得られる。ライゲーション反応物の部分 を用いて大腸菌株ＤＨ５α細胞（Life Technologies，Gaithersburg，MD）のト ランスフォーメーションに用いる。プラスミドＤＮＡを精製し、以下のように配 列を確認する。 方法III：新たなＮ末端／Ｃ末端遺伝子の縦列二重化法による創成 新たなＮ末端／Ｃ末端遺伝子は、R.A．Horlickら，Protein Eng．5:427-431， 1992に記載された方法に基づいて作成することができる。新たなＮ末端／Ｃ末端 遺伝子のポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）増幅は、縦列に二重化した鋳型Ｄ ＮＡを用いて実施する。工程は図３に例示する。 縦列に二重化した鋳型ＤＮＡはクローニングにより創成し、２コピーの遺伝子 の元のＣ末端とＮ末端を連結するリンカーをコードするＤＮＡ配列によって分離 された遺伝子２コピーを含有する。縦列に二重化した鋳型ＤＮＡから、完全長の 新たなＮ末端／Ｃ末端遺伝子を創成し、増幅するためには特異的なプライマーセ ットを使用する。これらのプライマーは新しい遺伝子の発現ベクターへのクロー ニングを可能にする適当な制限部位を包含するように設計される。通常のＰＣＲ 条件は、95℃溶融２分間１サイクル；94℃変性１分間，50℃アニーリング１分間 および72℃伸長１分間25サイクル；プラス72℃伸長７分間１サイクルを用いる。 Perkin Elmer Gene Amp PCR Core Reagentキット（Perkin Elmer Corporation， Norwalk，CT）を使用する。100μlの反応は各プライマー100pmoleおよび鋳型Ｄ ＮＡ １μｇ；および１×ＰＣＲ緩衝液，200μＭ ｄＧＴＰ，200μＭ ｄＡＴＰ ，200μＭ ｄＴＴＰ，200μＭ ｄＣＴＰ，2.5単位のAmpliTaq ＤＮＡポリメラー ゼおよび2ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応は480型ＤＮＡサーマルサイク ラー（Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT）によって実施する。ＰＣＲ反 応産物はWizard PCR Prepsキット（Promega）を用いて精製する。 新たなＮ末端／Ｃ末端遺伝子の発現ベクターへのクローニング 新たなＮ末端／Ｃ末端遺伝子を制限ヌクレアーゼで消化して発現ベクターへの 挿入に適合する末端を創成する。この発現ベクターも同様に制限ヌクレアーゼで 消化して適合する末端を形成させる。精製後、遺伝子とベクターＤＮＡとを混合 し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートする。ライゲーション反応物の部分 を用いて大腸菌をトランスフォームする。プラスミドＤＮＡを精製し、正しい挿 入を確認するために配列を決定する。正しいクローンを成長させてタンパク質を 発現させる。 ＤＮＡの単離および特性解析 プラスミドＤＮＡは、多くの様々な方法により、本技術分野の熟練者には周知 の市販キットを用いて単離できる。このような方法の数種を以下に示す。プラス ミドＤＮＡは、Promega Wizard（登録商標）Miniprepキット（Madison，WI）、Q iagen QIAwell Plasmid単離キット（Chatsworth，CA）またはQiagen Plasmid Mi diキットを用いて単離される。これらのキットは同じ一般的操作に従ってプラス ミドＤＮＡの単離に用いられる。略述すれば、細胞を遠心分離（5000×g）によ りペレット化し、プラスミドＤＮＡを連続ＮａＯＨ／酸処理によって放出させ、 遠心分離（10000×g）により細胞屑を除去する。上清（プラスミドＤＮＡを含有 する）をＤＮＡ結合樹脂を含むカラムに負荷し、カラムを洗浄し、プラスミドＤ ＮＡをＴＥで溶出する。コロニーを関心プラスミドについてスクリーニング したのち、選ばれたトランスフォーマントの大腸菌細胞を50〜100mlのＬＢ＋適 当な抗生物質中に接種し、エアインキュベーター中37℃で一夜、振盪しながら増 殖させる。精製したプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定、更なる制限酵素消化 、ＤＮＡフラグメントの付加的サブクローニング、および哺乳類細胞、大腸菌ま たは他の細胞へのトランスフェクションに用いられる。 配列の確認 精製されたプラスミドＤＮＡをｄＨ₂Ｏに再懸濁し、Bausch and Lomb Spectro nic 601型ＵＶ光度計により260/280nmの吸収を測定して定量する。ＤＮＡサンプ ルはABI PRISM（登録商標）DyeDeokisy（登録商標）ターミネーター配列決定化 学（Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation，Lincoln Cit y，CA）キット（部品番号：401388または402078）を用い、製造業者によって示 唆されたプロトコールに従い、通常は配列決定混合物への５％ＤＭＳＯ添加によ る改良によって配列を決定する。配列決定反応は480型ＤＮＡサーマルサイクラ ー（Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT）を用い推薦された増幅条件によ り実施する。サンプルはCentri-Sep（登録商標）スピンカラム（Priceton Separ ations，Adelphia，NJ）で過剰の色素ターミネーターを除去して精製し、ついで 凍結乾燥する。蛍光染料で標識された配列決定反応物を脱イオンホルムアミドに 再懸濁して、変性4.75％ポリアクリルアミド-8M尿素ゲル上ABI 373A型自動ＤＮ Ａシクエンサーを用いて配列を決定する。重複したＤＭＡ配列フラグメントを、 Sequencher v 2.1 ＤＮＡ解析ソフトウエア（Gene Codes Corporation，AnnArbo r，MI）を用いてマスターＤＮＡコンティグに組み立てる。 哺乳類細胞におけるｈＩＬ-3受容体アゴニストの発現 哺乳類細胞トランスフェクション／調整培地の製造 ＢＨＫ-21細胞はＡＴＣＣ（Rockville，MD）から入手できる。細胞は２ｍＭＬ -グルタミンおよび10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）補充ダルベッコ改良イーグル培 地（ＤＭＥＭ／高グルコース）中で培養する。この処方はＢＨＫ生育培地と命名 する。選択培地は453単位/mlハイグロマイシンＢ（Calbiochem，San Diego，CA ）補充ＢＨＫ生育培地である。ＢＨＫ-21細胞系は、プラスミドｐＭＯＮ3359に 見出されるＩＥ110プロモーターをトランス活性化するＨＳＶトランス活性化 プロテインＶＰ16により、以前に安定にトランスフェクトされた（Hippenmeyer ら，Bio/Technology，pp 1037-1041，1993参照）。ＶＰ16プロテインはＩＥ110 プロモーターの後方に挿入された遺伝子の発現を駆動する。トランス活性化プロ テインＶＰ16を発現するＢＨＫ-21細胞はＢＨＫ-ＶＰ16と呼ばれる。プラスミド ｐＭＯＮ1118（Highkinら，Poultry Sci．70:970-981，1991参照）はＳＶ40プロ モーターからハイグロマイシン抵抗性遺伝子を発現する。類似のプラスミドｐＳ Ｖ2-hphもＡＴＣＣから入手できる。 ＢＨＫ-ＶＰ16細胞はトランスフェクション24時間前に、60mm組織培養皿に各 皿あたり3×10⁵細胞を接種する。細胞は各皿あたり、関心遺伝子含有プラスミド ＤＮＡ10μｇ，３μｇのハイグロマイシン抵抗性プラスミドｐＭＯＮ1118，なら びに80μｇのGibco-BRL”LIP0FECTAMINE”（登録商標）を含む”OPTIMEM”（登 録商標；Gibco-BRL，Gaithersburg，MD）3μｌ中で16時間トランスフェクトする 。ついで培地を吸引し、３mlの生育培地で置換する。トランスフェクション48時 間後に各皿から培地を収集し活性をアッセイする（一過性調整培地）。トリプシ ン-ＥＤＴＡにより細胞を皿から取り出し、1:10に希釈し、10mlの選択培地を含 有する100mm組織培養皿に移す。選択培地中に約７日間置くと、抵抗性の細胞は 直径数ミリのコロニーに成長する。コロニーをろ紙（コロニーとほぼ同じサイズ に切断し、トリプシン／ＥＤＴＡで濯ぐ）で皿から取り出し１mlの選択培地を含 有する24ウエルプレートの個々のプレートに移す。クローンがコンフル−エンス に成長したのち、調整培地を再アッセイし、陽性のクローンを増殖培地中に展開 する。 大腸菌におけるｈＩＬ-3受容体アゴニストの発現 関心プラスミドを有する大腸菌株ＭＯＮ105またはＪＭ101をＭ９＋カサミノ酸 培地中、New Brunswick Scientific（Edison，New Jersey）製Ｇ25型エアインキ ュベーター内で振盪しながら37℃で増殖させる。増殖はＯＤ600でモニターしな がら値1.0に達するまで続け、この時点で0.1Ｎ ＮａＯＨ中ナリジキシン酸（10m g/ml）を加えて最終濃度を50μｇ/mlとする。ついで培養液を37℃でさらに３〜 ４時間振盪する。所望の遺伝子産物の最大の産生を達成するため高度の通気を培 養期間を通じて維持する。細胞を光学顕微鏡下に、封入体（ＩＢ）の存在 について調べる。培養液の１mlアリコートを採取し、ペレット化した細胞を煮沸 し、還元緩衝液で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行って蛋白含量を 分析する（Maniatisら，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，1982）。培養 液を遠心分離して（5000×g）細胞をペレット化する。 大腸菌内に封入体として蓄積する修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストの封入体の調 製、抽出、再フォールディング、透析、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、および特 性解析 封入体の単離 330mlの大腸菌培養液からの細胞ペレットを、超音波処理緩衝液［10ｍＭ 2-ア ミノ-2-(ヒドロキシメチル)1,3-プロパンジオール塩酸塩（Tris-ＨＣｌ），ｐＨ 8.0＋１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］15mlに再懸濁する。これら の懸濁した細胞をSonicator Cell Disruptor（Ｗ-375型：Heat Systems-Ultraso nics，Inc.，Farmingdale，New York）のマイクロチッププローブを用いて超音 波処理する。細胞を破壊し、封入体（ＩＢ）を洗浄するためには、超音波処理緩 衝液中での３ラウンドの超音波処理ついで遠心分離を採用する。超音波処理の第 １ラウンドは３分間のバーストついで１分間のバーストとし、超音波処理の最後 の２ラウンドはそれぞれ１分間とする。 封入体ペレットからのタンパク質の抽出および再フォールディング 最終の遠心分離工程後、ＩＢペレットを、50ｍＭ Tris-ＨＣｌ，ｐＨ9.5，8Ｍ 尿素および5ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）10mlに再懸濁し、室温で約45分 間攪拌して、発現したタンパク質を変性させる。 抽出溶液を、50ｍＭ Tris-ＨＣｌ，ｐＨ9.5および2.3Ｍ尿素70mlを含むビーカ ーに移し、空気に曝しながら４℃で18〜48時間穏やかに攪拌してタンパク質を再 フォールドさせる。再フォールディングはVydac（Hesperia，Ca.）Ｃ18逆相高速 液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）カラム（0.46×25cm）上で分析して モニターする。0.1％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有40％〜65％アセトニトリ ルの直線勾配を使用して再フォールドをモニターする。この勾配を流速1.5ml/分 で30分間にわたり展開する。変性タンパク質は一般にこの勾配中では再フォール ドしたタンパク質よりも遅れて溶出する。 精製： 再フォールドしたのち、夾雑した大腸菌タンパク質を酸沈殿により除去する。 再フォールド溶液のｐＨを15％（v/v）酢酸（ＨＯＡｃ）を用いてｐＨ5.0〜5.2 に滴定する。この溶液を４℃で２時間攪拌し、ついで12,000×gで20分間遠心分 離して、不溶性のタンパク質があればペレット化する。 酸沈殿工程からの上清を、分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）3,500ダルトンのS pectra/Por 3メンブランを用い透析する。透析は４Ｌ（50倍過剰）の10ｍＭTris -ＨＣｌ，ｐＨ8.0に対して、これを２回交換して計18時間行う。透析はサンプル の伝導度を低下させ、ＤＥＡＥクロマトグラフィー前に尿素を除去する。サンプ ルをついで遠心分離し（12,000×g）、透析後に不溶性のタンパク質があればペ レット化する。 イオン交換クロマトグラフィーにはBio-Rad Bio-Scale DEAE2カラム（7×52mm ）を使用する。カラムは平衡緩衝液中10ｍＭ Tris-ＨＣｌ，ｐＨ8.0および0〜50 0ｍＭ食塩（ＮａＣｌ）勾配を含有する緩衝液に平衡化し、45カラム容量以上を 使用してタンパク質を溶出する。この操作を通じ流速1.0ml/分を用いる。勾配を 越えてカラム分画（2.0ml/分画）を収集して、Vydac（Hesperia，Ca.）Ｃ18カラ ム（0.46×25cm）上ＲＰ-ＨＰＬＣによって分析する。0.1％トリフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）含有40％〜65％アセトニトリルの直線勾配を使用する。この勾配を流速 1.5ml/分で30分間にわたり展開する。プールした分画をついで４Ｌ（50〜500倍 過剰）の10ｍＭ酢酸アンモニウム（ＮＨ₄Ａｃ）ｐＨ4.0に対し、これを２回交換 して計18時間透析する。透析はＭＷＣＯ3,500ダルトンのSpectra/Por３メンブラ ンを用いて行う。最後にサンプルを0.22μmシリンジフィルター（μStar LB シ リンジフィルター；Costar，Cambridge，Ma.）を用いて滅菌ろ過し、４℃で保存 する。 場合により、フォールドしたタンパク質は、親和性試薬たとえば適当なマトリ ックスに結合させたｍＡｂまたは受容体サブユニットを使用して親和性精製する ことができる。別法として（または付加的に）精製は様々なクロマトグラフィー 法のいずれかたとえばイオン交換、ゲルろ過もしくは疎水性クロマトグラフィー または逆相ＨＰＬＣを用いて達成できる。 これらのおよび他のタンパク質精製方法については、Methods in Enzymology ，182巻，”Guide to Protein Purification”，Murray Deutscher編集，Academ ic Press，San Diego，CA，1990に詳細に記載されている。 タンパク質の特性解析： 精製したタンパク質はＲＰ-ＨＰＬＣ，エレクトロスプレー質量スペクトル， およびＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析する。タンパク質の定量はアミノ酸組成、 ＲＰ-ＨＰＬＣ，およびBradfordタンパク質定量によって行う。場合により、タ ンパク質の同一性を確認するために、トリプシンペプチドマッピングをエレクト ロスプレー質量スペクトルと接合して実施する。 生物活性ヒトインターロイキン-3のＡＭＬ増殖アッセイ ファクター依存性細胞系，ＡＭＬ193はAmerican Type Culture Collection（A TCC，Rockville，MD）から入手した。急性骨髄性白血病の患者から樹立されたこ の細胞系は、ＧＭ-ＣＳＦ補充培地中で増殖の穴進を示す成長因子依存性の細胞 系である（Lange,B.ら，Blood 70:192，1987;Valtieri,M.ら，J.Immunol.138:40 42，1987）。ヒトＩＬ-3の存在下におけるＡＭＬ193細胞の増殖能も報告されて いる（Santoli,D.ら，J.Immunol．139:348，1987）。成長因子をウォッシュアウ トし、サイトカイン依存性ＡＭＬ193細胞を24時間成長因子飢餓状態にして、Ｉ Ｌ-3中での長期生育に適合させた細胞系変異体、ＡＭＬ193 1.3を使用した。細 胞をついで、100U/mlのＩＬ-3を含有する培地中24ウエルプレートに1×10⁵細胞 ／ウエルで再プレーティングする。細胞がＩＬ-3中で迅速に増殖するには約２カ 月を要した。これらの細胞は以後、ヒトＩＬ-3を含む組織培養培地（下記参照） を補充することにより、ＡＭＬ193 1.3として維持する。 ＡＭＬ193 1.3細胞は、冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS，Gibco，Grand Island， NY）中細胞懸濁液を250×gで10分間遠心分離し、ついで上清を傾瀉することによ り６回洗浄する。ペレット化された細胞をＨＢＳＳに再懸濁し、６洗浄サイクル が完了するまで上記操作を反復する。この操作で６回洗浄した細胞は、密度を2 ×10⁵〜5×10⁵生存細胞/mlの範囲として組織培養培地に再懸濁する。この培地は イスコブ改良ダルベッコ培地（IMDM，Hazelton，Lenexa，KS）にアルブミン、ト ランスフェリン、脂質および2-メルカプトエタノールを補充し調製される。 ウシアルブミン（Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN）は500μｇ/mlを加 え、ヒトトランスフェリン（Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN）は100μ ｇ/mlを添加し、大豆脂質（Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN）は50μｇ /mlを加え、2-メルカプトエタノール（Sigma，St.Louis，MO）は5×10^-5Ｍを添 加する。 ヒトインターロイキン-3または修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質の希 釈系列を、上述のように補充した組織培養培地中96ウエルCostar 3596組織培養 プレートに三重に作成する。希釈系列が完成されたならば、各ウエルにインター ロイキン-3または修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質を含む培地50μｌを 含有させる。対照ウエルは組織培養培地単独を含有させる（陰性対照）。上述の ようにして調製されたＡＭＬ193 1.3細胞懸濁液50μｌ（2.5×10⁴細胞）をピペ ットにより各ウエルに加える。組織培養プレートを加湿空気中５％ＣＯ₂，37℃ で３日間インキュベートする。日３に、50μｌの組織培養培地中0.5μCi³Ｈ-チ ミジン（2Ci/ｍＭ，New England Nuclear，Boston，MA）を加える。培養液を加 湿空気中５％ＣＯ₂，37℃で18〜24時間インキュベートする。細胞ＤＮＡを水洗 浄サイクルついで70％エタノール洗浄サイクルを用いたT0NTEC細胞ハーベスター （TONTEC，Orange，CT）によってガラスフィルターマット（Pharmacia LKB，Gai thersburg）上に収穫する。フィルターマットを風乾させ、ついでサンプルバッ グに取り、これにシンチレーション液（Scintiverse II，Fisher Scientific，S t.Louis，MOまたはBetaPlate Scintillation Fruid，Pharmacia LKB，Gaithersb urg，MD）を加える。個々の組織培養ウエルからサンプルのβ放射線をLKB BetaP late 1205型シンチレーションカウンター（Pharmacia LKB，Gaithersburg，MD） によりカウントし、データは各組織培養ウエルから細胞中に導入された³Ｈ-チミ ジンのカウント／分で表す。各ヒトインターロイキン-3プレパレーションまたは 修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質プレパレーションの活性は、インター ロイキン-3または修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストの濃度を漸増させて細胞増殖（³ Ｈ−チミジンの取り込み）を測定することにより定量する。通常、0.05ｐＭ〜1 0⁵ｐＭの濃度範囲がこれらのアッセイで定量される。活性は最大増殖の50％を与 えるインターロイキン-3または修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニス トタンパク質の用量を測定することによって決定される［ＥＤ₅₀＝0.5×（試験 したインターロイキン-3の全濃度の三重培養中ウエルあたりの³Ｈ-チミジンの取 り込みの最大平均カウント／分−インターロイキン-3を欠く三重培養中で観察さ れる³Ｈ-チミジンの取り込みにより測定したバックグランド増殖）］。このＥＣ₅₀ 値はまた１単位の生物活性に等しい。すべてのアッセイは、相対的活性レベル の指示が可能なように対照標準としてネイティブなインターロイキン-3を用いて 実施する。 通常、修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質は、２倍希釈系列に滴定した 2000ｐＭ〜0.06ｐＭの濃度範囲で試験される。 各サンプルの活性は、データに４パラメーターロジスティックモデルをフィッ ティングすることによる最大応答の50％を与えた濃度によって決定する。サンプ ルとそれと比較した標準の上部プラトー（最大応答）には差がないことが認めら れた。したがって、各サンプルについての相対強度計算は上述のようにサンプル と標準についてのＥＣ₅₀評価から決定される。 メチルセルロースアッセイ このアッセイは正常骨髄細胞を刺激するコロニー刺激因子がインビトロで異種 造血コロニーを産生する能力を反映する（Bradleyら，Aust.Exp.Biol.Sci．44:2 87-300，1966;Pluznikら，Cell Comp.Physio 66:319-324，1965）。 方法 新鮮な、正常、健康骨髄の約30ml吸引をインフォームドコンセントを受けた個 体から実施する。滅菌条件下に、サンプルを１×ＰＢＳ（#14040.059 Life Tech nologies，Gaithersburg，MD）溶液で50mlのコニカル管（#25339-50 Corning，C ornibg MD）中1:5に希釈する。希釈サンプルの下にフィコール（Histopaque 107 7 Sigma H-8889）を敷いて300×gで30分間遠心分離する。単核細胞バンドを除去 し、１×ＰＢＳ中で２回および１％ＢＳＡ ＰＢＳ（CellPro Co.，Bothel，WA） で１回洗浄する。単核細胞を計数し、ＣＤ34＋細胞はCeprate LC（ＣＤ34＋）キ ット（CellPro Co.，Bothel，WA）カラムを用いて選択する。骨髄内のすべての 幹細胞および前駆細胞はＣＤ34＋表面抗原を示すことから、この分画化を実施す る。 培養液は、35×10mmペトリ皿（Nunc #174926）中最終容量1.0mlで三重にセッ トアップする。培養培地はTerry Fox Labs（Vancouver，B.C.，Canada）から購 入し、エリスロポエチン（Amgen，Thousand Oaks，CA）を培養培地に添加する。 皿あたり3,000〜10,000ＣＤ34＋細胞を添加する。トランスフェクトした哺乳類 細胞からの調整培地中またはトランスフェクトした哺乳類細胞もしくは大腸菌か らの調整培地から精製した哺乳類細胞または大腸菌から精製した組換えＩＬ-3お よび修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストタンパク質を、0.001〜10ｎＭの最終濃度範 囲を与えるように添加する。組換えｈＩＬ-3．ＧＭ-ＣＳＦ，ｃ-ｍｐｌリガンド ならびに修飾ｈＩＬ-3受容体アゴニストは、自家供給される。Ｇ-ＣＳＦ（Neupo gen）はAmgen（Thousand Oaks，CA）製である。培養液は３ccシリンジを用いて 再懸濁し、皿あたり1.0mlを分配する。対照（基底応答）培養液にはコロニー刺 激因子は加えない。陽性対照培養液には調整培地（ＰＨＡ刺激ヒト細胞：Terry Fox Labs，H2400）を加える。培養液は加湿空気中５％ＣＯ₂，37℃でインキュベ ートする。 50細胞以上と定義された造血コロニーをピーク応答の日（日10〜11）にNikon 倒立相顕微鏡を用い40×対物レンズを組み合わせてカウントする。50細胞未満を 含む細胞群はクラスターと呼ぶ。別法として、コロニーは、コロニーをスライド 上に広げて染色するか、または採取し、再懸濁し、染色のためにサイトスピンス ライド上で回転させて同定することができる。 ヒト臍帯血造血細胞成長因子のアッセイ 造血コロニー刺激因子（ＣＳＦ）活性のインビトロアッセイには伝統的に骨髄 細胞が使用されている。しかしながら、ヒト骨髄は常に利用できるとは限らず、 ドナー間でかなりの変動がある。臍帯血は造血幹細胞および前駆細胞の原料とし ては骨髄に匹敵する（Broxmeyerら，PNAS USA 89:4109-113，1992;Mayaniら，Bl ood 81:3252-3258，1993）。骨髄とは異なり、臍帯血は規則的なベースでの入手 が容易である。また、数人のドナーから新たに得られた細胞をプールするかまた はこの目的で凍結保存細胞のバンクを設立することによって、アッセイの変動性 を低下できる可能性がある。培養条件の改良および／または系統特異的マーカー の分析により、顆粒球／マクロファージコロニー（ＣＦＵ-ＧＭ）、巨核球 ＣＳＦ活性または高度増殖能コロニー形成因子（ＨＰＰ-ＣＦＣ）活性を特異的 にアッセイすることが可能になると思われる。 方法 単核細胞（ＭＮＣ）は臍帯血から、収集24時間以内に、標準密度勾配（1.077g /ml Histopaque）を用いて単離する。臍帯血ＭＮＣは、ＣＤ14−，ＣＤ34＋細胞 の免疫磁性選択、Applied Immune Science（Santa Clara，CA）からのコーティ ングされたフラスコを使用するＳＢＡ−，ＣＤ34＋分画のパンニング、ならびに CellPro（Bothell，WA）アビジンカラムを使用するＣＤ34＋の選択を包含する数 種の操作によって、造血幹細胞および前駆細胞をさらに濃縮する。新たに単離さ れたまたは凍結保存されたＣＤ34＋細胞濃縮分画は、アッセイに使用される。サ ンプルの各希釈系列（濃度範囲１ｐＭ〜1204ｐＭ）の二重培養を、付加的な成長 因子を含まない0.9％メチルセルロース含有培地（Methocult H4230，Stem Cell Technologies，Vancouver，BC）１ml中1×10⁴細胞に調製する。一部の実験にお いては、Methocult H4230の代わりにエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含有するMet hocult H4230を用い、あるいは幹細胞因子（ＳＣＦ）50ng/ml（Biosource Inter national，Camarillo，CA）を添加する。７〜９日間培養したのち、＞30細胞を 含むコロニーをカウントする。計数における主観的な偏見を排除するため、アッ セイオは盲検で計数する。 変異体の創成、それらの細菌、哺乳類または昆虫細胞内発現、所望のタンパク 質の精製および再フォールド、ならびにタンパク質の生物活性を測定するための アッセイに使用できる組換えＤＮＡ法についての更なる詳細は共出願された出願 ＷＯ95/00646号、ＷＯ94/12639号、ＷＯ94/12638号、ＷＯ95/20976号、ＷＯ95/2 1197号、ＷＯ95/20977号、ＷＯ95/21254号、およびＵＳ08/383,035号に見出され る。これらは引用により、その全体が本明細書に導入される。 本技術分野の熟練者に周知の更なる詳細は、引用により本明細書に導入される T.Maniatisら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory（1982）およびそこに引用された参考文献、ならびにJ.Sambrookら ，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，２版，Cold Spring Harbor Labor atory（1989）およびそこに引用された参考文献に見られる。 本明細書に引用された参考文献、特許または出願は、引用により、その全体が 本明細書に記載されていると同様、本明細書に導入される。 表１ オリゴヌクレオチド 表２ ＤＮＡ配列 表３ タンパク質配列 以下の実施例は本発明をさらに詳細に例示するが、本発明はこの特定の例によ って限定されるものではないことを理解すべきである。 実施例１ 縦列二重化プラスミド鋳型，Syntanlの構築 縦列二重化ｈＩＬ-3受容体アゴニストｐＭＯＮ13416鋳型，Syntanl（SEQ ID N O:15）の創成には３種のＤＮＡをＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim）を 用いるライゲーションにより接続させた。３種のＤＮＡは、１）BstE IIおよびS naB Iにより消化したｈＩＬ-3受容体アゴニストｐＭＯＮ13416を含有するｐＭＯ Ｎ13046；２）合成オリゴヌクレオチド，Llsyn.for（SEQ ID NO:３）およびL1sy n.rev（SEQ ID NO:４）のアニーリングした相補性対（これらは元のタンパク質 のＣ末端およびＮ末端を連結するリンカーおよびｐＭＯＮ13416配列の周辺小量 を含有し、適正に組み立てられた場合にはBstE IIおよびCla I末端を生じる）； および３）ｐＭＯＮ13046からCla I［ＤＮＡは、dam−細胞，ＤＭ１（Life Tech nologies）中で予め増殖させた］およびSnaB Iで消化したｈＩＬ-3受容体アゴニ ストｐＭＯＮ13416の部分である。消化したＤＮＡは0.9％ＴＡＥゲル上で分割し 、エチジウムブロミド染色し、Gneclean（Bio101）を用いて単離した。 ライゲーション反応の部分を大腸菌株ＤＨ５α細胞（Life Technologies，Gai thersburg，MD）のトランスフォーメーションに用いた。トランスフォーマント からMiniprep ＤＮＡを単離し、トランスフォーマントをＰＣＲベースのアッセ イを用いてスクリーニングした。選ばれたトランスフォーマントからのプラスミ ドＤＮＡの配列を決定して、正しい鋳型を得た。得られたプラスミドはsyntanl と命名された。 実施例２ 縦列二重化プラスミド鋳型，Syntan3の構築 縦列二重化ｈＩＬ-3受容体アゴニストｐＭＯＮ13416鋳型，Syntan3（SEQ ID N 0：16）の創成には３種のＤＮＡをＴ4ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim） を用いるライゲーションにより接続させた。３種のＤＮＡは、１）BstE IIおよ びSnaB Iにより消化したｈＩＬ-3受容体アゴニストｐＭＯＮ13416を含有す るｐＭＯＮ13046；２）合成オリゴヌクレオチド，L3syn.for（SEQ ID NO：５） およびL3syn.rev（SEQ ID NO：６)のアニーリングした相補性対（これらは元の タンパク質のＣ末端およびＮ末端を連結するリンカーおよびｐＭＯＮ13416配列 の周辺小量をコードする配列を含有し、適正に組み立てられた場合はBstE IIお よびSnaB I末端を生じる）；および３）ｐＭOＮ13046からCla I［ＤＮＡはdam− 細胞，ＤＭ１（Life Technologies）中予め増殖させた］およびSnaB Iで消化し たｈＩＬ-3受容体アゴニストｐＭＯＮ13416の部分である。消化されたＤＮＡは0 .9％ＴＡＥゲル上で分割し、エチジウムブロミドによって染色し、Beneclean（B io101）を用いて単離した。 ライゲーション反応の部分を大腸菌株ＤＨ５α細胞（Life Technologies，Gai thersburg，MD）のトランスフォーメーションに用いた。トランスフォーマント からMiniprep ＤＮＡを単離し、トランスフォーマントをＰＣＲベースのアッセ イを用いてスクリーニングした。選ばれたトランスフォーマントからのプラスミ ドＤＮＡの配列を決定して、正しい鋳型を得た。得られたプラスミドはsyntan3 と命名された。 実施例３ ｐＭＯＮ31155の構築 ｐＭＯＮ31155中新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子は材料および方法の項に記載の 方法IIIを用いて創成される。ｈＩＬ-3受容体アゴニストｐＭＯＮ13416の完全長 新Ｎ末端／Ｃ末端遺伝子は、中間体プラスミドsyntanlから、プライマーセット3 5start（SEQ ID NO：７）および34stop（SEQ ID NO：８）を用いて創成し、増幅 させる。新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡフラグメントをが制限エンドヌ クレアーゼNco IおよびHind IIIで消化する。消化されたフラグメントを１％Ｔ ＡＥゲル上で分割し、エチジウムブロミドによって染色し、Beneclean（Bio101 ，Vista，CA）を用いて単離した。精製された消化ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を用いて発現ベク ターにライゲートする。発現ベクターＤＮＡをNco IおよびHind IIIで消化する 。ライゲーション反応の部分を大腸菌株ＤＨ５α細胞（Life Technologies，Gai thersburg，MD）のトランスフォーメーションに用いる。細菌トランス フォーマントをアンピシリン含有プレート上で選択する。プラスミドＤＮＡを単 離し、配列を決定して，正しい挿入を確認する。得られたプラスミドはｐＭＯＮ 31155と命名する。 大腸菌株ＪＭ101を、タンパク質発現および封入体からのタンパク質の単離の ために、ｐＭＯＮ31155でトランスフォームした。 （SEQ ID NO：17）の遺伝子を含有するプラスミド，ｐＭＯＮ31155は以下のア ミノ酸配列をコードする。 実施例４〜10 実施例４〜10では、実施例３に記載の方法と同様にして表４に指示したプライ マーを用いて構築を行う。得られたタンパク質は表４に示すような新しいＮ末端 およびＣ末端を有する。 本開示を読んだのちには、本技術分野の熟練者には、本発明の精神および範囲 から逸脱することなく様々な他の例が自明であろう。このような他の例はすべて 添付の請求の範囲内に包含することを意図するものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                 Interleukin-3 (IL-3) receptor agonist   This application is related to U.S. Provisional Patent Application Serial No. 60 / 004,835, filed October 5, 1995. Claims 35 USC § 119 (e) to priority.                                 Field of the invention   The present invention relates to human interleukin-3 (hIL-3) receptor agonists. These hIL-3 agonists may comprise one or two of the activities of native hIL-3. To maintain and improve improved hematopoietic cell stimulating activity and / or native h FIG. 4 shows an improved activity profile that includes an undesirable reduction in biological activity associated with IL-3; And / or improvements including increased solubility, stability and refolding efficiency Physical properties.                                 Background of the Invention   Colony stimulating factor (CSF) that stimulates the differentiation and / or proliferation of bone marrow cells Due to their therapeutic potential to restore the reduced levels of cells derived from hematopoietic stem cells Has generated a great deal of interest. CSFs for both human and mouse strains have been identified and Has been identified by its activity. For example, granulocyte-CSF (G-CSF) and Macrophage-CSF (M-CSF) contains neutrophil granulocytes and macrophages, respectively. Stimulates in vitro formation of phage colonies, while GM-CSF and Leukin-3 (IL-3) has a broader spectrum of activity, including macrophages, neutrophils and Stimulates the formation of both eosinophilic granulocyte colonies. IL-3 is also a mast cell, megakaryotic Stimulates the formation of spheres and pure and mixed erythroid colonies.   IL-3 stimulates the proliferation of many different cell types and stimulates the growth and proliferation of progenitor cells Depending on its ability to support disease or therapeutic treatment such as irradiation and chemistry Therapeutic Use in Restoring Hematopoietic Cells to Normal Numbers in Patients with Reduced Cell Counts Have the potential for   Interleukin-3 (IL-3) can promote hematopoietic cell survival, growth and differentiation It is a hematopoietic cell growth factor having the following properties. (A) All biological activities of IL-3 Growth and differentiation of progenitor cells responsible for all or substantially all blood cell lineages (B) ability to interact with early pluripotent stem cells, (c) pluripotent progenitor Ability to sustain cell growth, (d) stimulate proliferation of chronic myeloid leukemia (CML) cells Ability to stimulate, (e) ability to stimulate proliferation of mast cells, eosinophils and basophils, (F) the ability to stimulate DNA synthesis by human acute myeloid leukemia (AML) cells; (G) the ability to induce cells to produce leukotriene and histamine; Ability to induce blood cell chemotaxis, and (i) cell surface molecules required for leukocyte adhesion Has the ability to induce   Mature human interleukin-3 (hIL-3) is composed of 133 amino acids You. It contains one disulfide bridge and two glycosylable sites (Young et al., Cell 47: 3, 1986).   Mouse IL-3 (mIL-3) has been described by Ihle et al. (J. Immunol. 126: 2184, 1981). Factors that induce the expression of cell-related enzymes, 20-hydroxysteroid dehydrogenase First identified as a child. This factor is homogeneously purified and is the first of many subclasses. Regulates growth and differentiation of hematopoietic cells and lymphoid progenitors Was done.   In 1984, a cDNA clone encoding mouse IL-3 was isolated (Fung et al.). , Nature 307: 233, 1984 and Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1070, 1 984). The mouse DNA sequence is a 166 amino acid polypeptide containing a candidate signal peptide. Had coded the pride.   The gibbon IL-3 sequence was obtained using a gibbon cDNA expression library. Was done. The gibbon monkey IL-3 sequence was then used to obtain the human IL-3 sequence. Used as a probe against the nome library.   The gibbon and human genomic DNA homologues of mouse IL-3 sequence are described in Yang et al. Cell 47: 3, 1986). The human sequence reported by Yang et al. A serine residue was included at position 8 of the mature protein sequence. Other research following this discovery Who has a proline at position 8 of its protein sequence⁸hIL-3 cDNA Was reported. That is, hIL-3 has two alleles. Seem.   Dorssers et al. (Gene 55: 115, 1987) reported that mIL-3 was obtained from a human cDNA library. And found a clone that hybridized. This hybridization is m The result was a high degree of homology between the 3 'non-coding region of IL-3 and hIL-3. this cDNA is hIL-3 (Pro⁸A) coded array.   U.S. Pat.Nos. 4,877,729 and 4,959,455 describe human IL-3 and TE. Nagazil IL-3 cDNAs and the protein sequences they encode are disclosed ing. The disclosed hIL-3 contains a serine instead of a proline at position 8 of the protein sequence. Have   Clark-Lewis et al. (Science 231: 134, 1986) synthesized an automated peptide synthesizer. Functional analysis of the resulting mouse IL-3 analog was performed. The authors It was concluded that the activity required a stable tertiary structure of the complete molecule. Disulfide bridge In role studies, the replacement of all four cysteines with alanine was It has been shown to give molecules with 500 times the activity of active molecules. C When two out of four ys residues are replaced by Ala (Cys⁷⁹, Cys¹⁴⁰→ Ala⁷⁹, Ala¹⁴⁰) Live Increased sex. The authors point out that organisms that are close to physiological levels in mouse IL-3 One disulfide bridge between cysteines 17 and 18 is required to obtain activity And that this structure probably gives the optimal conformation for the function. Concludes that it stabilizes the tertiary structure of the protein (Clark-Lewis et al., Proc. Natl. A cad.Sci. USA 85: 7897, 1988).   International Patent Application (PCT) WO 88/00598 includes gibbon and human-like IL-3 Is disclosed. This hIL-3 is Ser⁸→ Pro⁸Contains substitutions. Replace Cys with Ser To break disulfide bonds and to eliminate one at the glycosylation site Alternatively, it has been suggested to replace two or more amino acids.   EP-A-0275598 (WO88 / 04691) includes Ala¹Biological activity It is illustrated that it can be maintained. Certain mutant hIL-3 sequences, such as 2 Ala, a double mutant of the species¹→ Asp¹, Trp¹³→ Arg¹³(PGB / IL-302), and One triple mutant, Ala¹→ Asp¹, Leu⁹→ Pro⁹, Trp¹³→ Arg¹³(PGB / I L-303).   WO 88/05469 describes a method for obtaining deglycosylated mutants, Variant Arg⁵⁴Arg⁵⁵And Arg¹⁰⁸Arg¹⁰⁹Lys¹¹⁰Now in Saccharomyces cerevisiae Suggests that KEX2 protease can avoid proteolysis during expression Have been. No muteins are disclosed. In this case, expression in yeast Only glycosylation and KEX2-protease activity are important.   WO88 / 06161 considers conformationally and antigenically neutral Various mutants are mentioned. The mutations actually performed are Met^Two→ Ile^TwoAnd Ile¹³¹→ Leu¹³¹Only. The intended neutralization is It is not disclosed whether it was obtained in the mutant.   WO 91/00350 discloses non-glycosylated hIL-3 analog proteins such as h IL-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰); Met^ThreehIL-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰); Thr^FourhIL-3 ( Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰) And Thr⁶hIL-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰) Is disclosed. This Their protein composition is associated with certain deleterious side effects associated with native hIL-3, For example, it must show urticaria from mast cells and lymphocytes entering the dermis Has been stated. The disclosed analog hIL-3 protein is Met^Three, Thr^Four,Also Is Thr⁶May have an N-terminus.   WO 91/12874 discloses that naturally occurring amino acid residues have at least one Cys residue. A cysteine addition mutant (CAV) of IL-3 substituted with is disclosed.   WO 94/12639 contains 1-3 amino acid substitutions and optionally N-terminal and IL-3 with enhanced potency and improved therapeutic range, including deletions from the C and C-termini Regular variants have been disclosed.   WO 94/12638 contains 4-44 amino acid substitutions and optionally N-terminal and And IL-3 containing deletions from the C-terminus, with enhanced potency and improved therapeutic range Novel variants have been disclosed.   WO95 / 27732 states that the original position 69 of G-CSF is a new N-terminus and that G-CSF G-CSF ligand which is cyclically permuted with the original position 68 A cyclically permuted G-CSF ligand with a breakpoint at the creating position 68/69 Although described, the molecule is not shown to have biological activity. WO No. 95/27732 also discloses cyclically permuted GM-CSF, IL-2 and IL-4. It is shown.Rearrangement of protein sequence   In evolution, rearrangement of DNA sequences is a matter of protein structural and functional diversity. Play an important role in the occurrence of. Gene duplication and exon shuffling Diversity develops quickly, especially because of the low basal mutation rate, Provides an important mechanism for providing organisms with competitive advantages (Doolittle, Protein  Science 1: 191-200, 1992).   The development of recombinant DNA methods has been focused on protein folding, structure and function. This enabled the study of the effect of sequence rearrangement on the subject. Apps used to create new arrays Roach is a naturally occurring protein pair that involves linear recognition of their amino acid sequences. (Cunningham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3218-3222, 1). 979; Teather & Erfle, J.M. Bacteriol. 172: 3837-3841, 1990; Schimming et al., Eur. J. Biochem. 204: 13-19, 1992; Yamiuchi & Minamikawa, FEBS Lett. 260: 127-130 1991; MacGregre et al., FEBS Lett. 378: 263-266, 1996). Of this type of rearrangement The first in vitro application to proteins was by Goldenberg & Creighton (J. Mol. Biol. . 165: 407-413, 1983). The new N-terminus is in the middle of the original sequence Position (breakpoint), and the new sequence is It has the same order of amino acids as the original sequence up to the point where it reaches a nearby amino acid. this In that respect, the new sequence may be directly or sequenced at the amino acid at or near the original N-terminus. Connected via an additional moiety (linker), the new sequence matches the cleavage site of the original sequence. The same as the original sequence until it reaches the amino acid at or near the N-terminus Contiguous in sequence, this residue forms the new C-terminus of the chain.   This approach has been applied to proteins in the 58-462 amino acid size range (Goldenberg & Creighton, J. Mol. Biol. 165: 407-413, 1983; Li & Coffino, Mo. l. Cell. Biol. 13: 2377-2388, 1993). The investigated proteins have a wide range of structural In the ras, α-helix (interleukin-4; Kreitman et al., Cytokine 7:31 1-318, 1995), β-sheet (interleukin-1; Horlick et al., Protein Eng. 5: 4) 27-431, 1992) or a mixture of the two (enzymes) Mother phosphoribosyl / anthranilate isomerase; Luger et al., Science 243: 206-2. 10, 1989). In these sequence recognition studies, Describe a broad category of protein functions.   enzyme   T4 lysozyme: Zhang et al., Biochemistry 32: 12311-12318, 1993; Zhang et al., Na ture Struct. Biol. 1: 434-438, 1995   Dihydrofolate reductase: Buchwalder et al., Biochemistry 31: 1621-1630,19. 94; Protasova et al., Prot. Eng. 7: 1373-1377, 1995   Ribonuclease T1: Mullins et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 5529-5533, 1994; Ga rrett et al., Protein Science 5: 204-211, 1996.   Bacillus β-glucanase: Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91: 10417-1 0421, 1994   Aspartate transcarbamoylase: Yang & Schachman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A90: 11980-11984, 1993   Phosphoribosyl / anthranilate isomerase: Luger et al., Science 243: 206-2. 10, 1989; Luger et al., Prot. Eng. 3: 249-258, 1990   Pepsin / Pepsinogen: Lin et al., Protein Science 4: 159-166, 1995.   Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: Vignais et al., Protein Scienc e 4: 994-1000, 1995   Ornithine decarboxylase: Li & Coffino, Mol. Cell. Biol. 13: 2377-2 388, 1993   Yeast phosphoglycerate dehydrogenase: Ritco-Vonsovici et al., Biochemis try34: 16543-16551, 1995   Enzyme inhibitors   Basic pancreatic trypsin inhibitor: Goldenberg & Creighton, J. Mol. Biol. 165: 407-413, 1983   Cytokine   Interleukin-1β: Horlick et al., Protein Eng. 5: 427-431, 1992   Interleukin-4: Kreitman et al., Cytoklne 7: 311-318, 1995.   Tyrosine kinase recognition domain   α-Spectrin SH3 domain: Viguera et al., J. Mol. Biol. 247: 670-681, 1995   Transmembrane protein   ompA: Koebnik & Kramer, J. Mol. Biol. 250: 617-626, 1955   Chimeric protein   Interleukin-4-Pseudomonas exotoxin: Kreitman et al., Proc. Natl. .Acad.Sci. U.S.A. 91: 6889-6893, 1994   The results of these studies showed a high degree of variability. Often substantially reduced Activity, solubility or stability was observed (E. coli didehydrofolate reductase, Aspartate transcarbamoylase, phosphoribosyl / anthranilic acid Somerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, ornithine deca Ruboxylase, ompA, yeast phosphoglycerate dehydrogenase). other In some cases, the rearranged protein is nearly identical to many of its natural counterparts (Basic pancreatic trypsin inhibitor, T4 lyso Team, ribonuclease T1, Bacillus β-glucanase, interleukin-1 β, α-spectrin SH3 domain, pepsinogen, interleukin-4) . In exceptional cases, certain properties of the natural sequence, such as rearranged α-spectrum The solubility and refolding rate, translocation Affinity and Anti-Reactivity of Interleukin-4-Pseudomonas Exotoxin An unexpected improvement in tumor activity was observed (Kreitman et al., Proc. Natl. Aca. d. Sci. U.S.A. 91: 6889-6893, 1994; Kreitman et al., Cancer Res. 55: 3357-3363, 19 95).   The primary motivation for these types of studies is protein folding and To examine the role of short-range and long-range interactions in stability and stability. Was. This type of sequence rearrangement can support long-range interactions in the original sequence. Transform the subsets into short-range interactions in the new array or vice versa. this Many of these sequence rearrangements have conformations that have at least some activity. The fact that it can be achieved is that protein folding Is convincing evidence of what happens through the pathway (Viguera et al., J. Mol. Biol. . 247: 670-681, 1995). For the SH3 domain of α-spectrin, β-hair Choosing a new end at the position corresponding to the ping turn slightly reduces stability Although still yielding a protein that could be folded.   The location of the mid-section break point used in the tests cited here is exclusively for protein Found on the surface of (The variation in the relative distance from the original N-terminus to the breakpoint is the variation of the total sequence length. About 10% to 80%). In these studies, the link between the original N-terminus and C-terminus was The anchor ranged from 0 to 9 residues. One example (Yang & Schachman, Proc. Natl. A cad.Sci. U.S.A. 90: 11980-11984, 1993), a portion of the sequence is the original C-terminal segment. The ligation was performed from the truncated C-terminus to the original N-terminus. Flexible Hydrophilic residues, such as Gly and Ser, are frequently used in linkers. Vigu era et al. (J. Mol. Biol. 247: 670-681, 1995) report the original N- and C-terminal 3 or 4 residues. The connection by the base linker was compared. Is the 3-base linker less thermodynamically stable? Was. (Protein Eng. 7: 1373-1377, 1994) describe E. coli dihydrofolate. A 3 or 5 residue linker was used for the original N-terminal ligation of the reductase. 3 residues Only the linker produced the protein in good yield.                                 Summary of the Invention   The present invention relates to a novel recombinant human interleukin-3 (hIL-3) receptor agonis About. These hIL-3 agonists can be at either the N and C termini or Both may contain amino acid substitutions and / or deletions. The present invention also provides Pharmaceutical composition containing IL-3 receptor agonist, and its receptor agonist How to use. Further, the present invention relates to a DNA encoding the receptor agonist. A, a recombinant gene comprising a nucleotide sequence encoding a hIL-3 receptor agonist Current vector, related microbial expression system and hIL-3 receptor using the microbial expression system The present invention relates to a method for producing an agonist. These hIL-3 receptor agonists are hIL-3 Have similar or better biological activity than, and possibly improved side effects An image is shown. That is, some receptor agonists are better than native hIL-3 With a high therapeutic index.   The present invention also relates to IL-3 antagonists or immunoassays and immunoassays. Separated antigenic fragments for the production of antibodies useful in epidemiological treatment protocols Provide molecules that can function. hIL-3 antagonists include AML, CML and And to block the growth of certain cancer cells, such as certain B lymphoid cancers In particular, it is expected to be useful. Other conditions where antagonists are useful include certain blood types A condition in which cells are produced in abnormally large quantities or are activated by endogenous ligands State is included. Antagonists are ligands, possibly naturally occurring hemopoietins For example, but not limited to, binding to the IL-3 receptor complex IL-3, MG-CSF and IL-3, which induce and enhance the growth of cancer cells by their ability to And efficiently compete with IL-5, while reducing the intrinsic activating effect of the ligand. IL-3, MG-CSF and / or IL-5 play a role in certain asthmatic responses ing. IL-3 receptor antagonists provide receptor-induced activation and supply of inflammatory cells. Blocking feeding may have utility for this disease.   The modified human interleukin-3 receptor agonist of the present invention has the formula                               X¹-(L)_a-X^Two Can be represented by   Where:   a is 0 or 1;   X¹Is a peptide consisting of an amino acid sequence corresponding to the sequence of residues n + 1 to J And   X^TwoIs a peptide consisting of an amino acid sequence corresponding to the sequence of residues 1 to n Yes,   n is an integer in the range from 1 to J-1,   L is a linker.   In the above formula, the constituent amino acid residues of human IL-3 are carboxyl-terminal to amino-terminal. Numbers from 1 to J are sequentially assigned to the ends. Adjacent amino acid pairs in this protein are They are numbered n and n + 1, respectively (where n is in the range 1 to J-1) Integer). Residue n + 1 is a new interleukin-3 receptor agonist Residue N is a new interleukin-3 receptor agonist C-terminal.   A preferred embodiment of the present invention has the formula[Where,   Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln or Arg;   Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg or Gln;   Xaa at position 19 is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, or Cys;   Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro or Ala;   Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr , Ser or Val,   Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu , Val or Gly,   Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser or Arg,   Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe or Leu;   Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro or Ala;   Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, or Trp;   Xaa at position 27 is Leu, Gly, Arg, Thr, Ser or Ala;   Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val, or Trp;   Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg or Val;   Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu, or Lys. And   Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu or Gln;   Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala or Glu;   Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr or Glu;   Xaa at position 34 is Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala. , Phe, Ile or Met,   Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln or Val;   Xaa at position 36 is Asp, Leu or Val;   Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp or Ile;   Xaa at position 38 is Asn or Ala;   Xaa at position 40 is Leu, Trp or Arg;   Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met or Pro;   Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu , Phe, Tyr, Ile, Met or Ala,   Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg , Thr, Gly or Ser,   Xaa at position 44 is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn , Gln, Ala or Pro,   Xaa at position 45 is Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp , Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu or His,   Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His. , Ala, Tyr, Ile, Val or Gly,   Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro or His;   Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr , Ala, Met, Val or Asn,   Xaa at position 49 is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His or Asp;   Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile , Val, His, Phe, Met or Gln,   Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr or His;   Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser or Thr;   Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser or Met. Yes,   Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala or Leu,   Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu or Gly;   Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala , Tyr, Phe, Leu, Val or Lys,   Xaa at position 57 is Asn or Gly;   Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val or Cys;   Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro or Arg;   Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, or Thr;   Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg or Ser;   Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp, or Ile;   Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro or Val;   Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser or Lys;   Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe or Ser;   Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu or Ser;   Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro, or His. And   Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr or His;   Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly or Leu Yes,   Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Pro or Ala;   Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp or Asn,   Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg or Asp;   Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr or Arg;   Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg. Gly or Ala,   Xaa at position 75 is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln or Leu,   Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly, or Asp. Yes,   Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr or Leu;   Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly or Arg;   Xaa at position 79 is Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly, or Asp;   Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu or Arg;   Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val, or Lys;   Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr , Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met or Val,   Xaa at position 83 is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg or Met;   Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met or Val;   Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val or Gln;   Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala, or Lys;   Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp or Gly;   Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val or Trp;   Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, Hls, Asn, or Ser. Yes,   Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile, or Met;   Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp or His;   Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile or L eu,   Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu or Arg;   Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala Or Pro   Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys , Ser, Ala, Trp, Phe, Ile or Tyr,   Xaa at position 96 is Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, or Thr;   Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala or Asn;   Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser. , Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr or Pro,   Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe Or His,   Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln or Pro Yes,   Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu or Gln,   Xaa at position 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, or Pro;   Xaa at position 103 is Asp or Ser;   Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe or Gly,   Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp or His   Xaa at position 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly or Pro ,   Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala. Or Pro   Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser or Gly ,   Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser. Or Trp,   Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp or Met;   Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, or Phe ,   Xaa at position 113 is Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val or Asn   Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg or Leu;   Xaa at position 115 is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp or M et   Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln or Ile,   Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys or Pro;   Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, or Tyr ,   Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, or Arg ,   Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val or Gln;   Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, or Gly ,   Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr. Or Cys,   Xaa at position 123 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, or Leu ,   The amino acids 0-44 represented by Xaa are the native (1-133) human interlo Unlike the corresponding amino acids of Ikin-3, 1-14 amino acids from the N-terminus and And / or 1-15 amino acids from the C-terminus may optionally be deleted,   The N-terminus is directly or via a linker (L) that can connect the N-terminus to the C-terminus New C and N-terminal amino acids connected to the terminus:              26-27 49-50 83-84              27-28 50-51 84-85              28-29 51-52 85-86              29-30 52-53 86-87              30-31 53-54 87-88              31-32 54-55 88-89              32-33 64-65 89-90              33-34 65-66 90-91              34-35 66-67 91-92              35-36 67-68 92-93              36-37 68-69 97-98              37-38 69-70 98-99              38-39 70-71 99-100              39-40 71-72 100-101              40-41 72-73 101-102              41-42 82-83 102-103 or 103-104 Having the modified human interleukin-3 receptor agonist, Modified human interleukin-3 receptor agonist is immediately preceding (methionine^-1), (A Lanin^-1) Or (methionine^-2, Alanine^-1) May precede it.   More preferred breakpoints at which new C- and N-termini can be created are   28-29, 29-30, 30-31, 31-32, 32-33, 33-34, 34-35, 35-36, 36-37, 37-38,   38-39, 39-40, 66-67, 67-68, 68-69, 69-70, 70-71, 84-85, 85-86, 86-87,   87-88, 88-89, 89-90, 90-91, 98-99, 99-100, 100-101 and 101-102 It is.   The most preferred breakpoints at which new C- and N-termini can be created are 34-35, 69-70 And 90-91.   In a preferred embodiment of the present invention, a linker connecting the N-terminus to the C-terminus (L) is:     GlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 2)     GlyGlyGlySerGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 33)     GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 34)     SerGlyGlySerGlyGlySer (SEQ ID NO: 35)     GluPheGlyAsnMet (SEQ ID NO: 36)     GluPheGlyGlyAsnMet (SEQ ID NO: 37)     GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMet (SEQ ID NO: 38) and     GlyGlySerAspMetAlaGly (SEQ ID NO: 39) Or a polypeptide selected from the group consisting of:                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 schematically illustrates the sequence rearrangement of a protein. Native protein The N-terminus (N) and C-terminus (C) are connected via a linker or directly Connected. The protein is cleaved at the breakpoint to produce a new N-terminus (new N) and a new When a C-terminus (new C) is created, a protein having a new linear amino acid sequence Generate. The rearranged molecule is newly synthesized as a linear molecule and contains the original N-terminal and The step of connecting the C-terminus and the step of cleaving the protein at the breakpoint may not be performed.   Figure 2 shows the native N- and C-termini of the native protein connected by a linker. New protein to produce different N-terminal and C-terminal proteins 1 schematically illustrates Method I. In the example shown, the original protein is With a new N-terminus created at quality amino acid 97 and the original C-terminus (a.a.174) Connected to amino acid 11 through the anchor region (deleting a.a.1-10) The C-terminus is a new gene encoding a protein created at amino acid 97 of the original sequence Give birth to a child.   FIG. 3 shows that the native N- and C-termini of the native protein were New proteins to produce different N-terminal and C-terminal proteins Figure 2 schematically illustrates Method II for the creation of parkin. In the example shown, the original Has a new N-terminus created at amino acid 97 of the original C-terminus (a.a. 174) is connected to the original N-terminus and a new C-terminus is created at amino acid 96 of the original sequence. This results in a new gene encoding the selected protein.   FIG. 4 shows the native N-terminal and C-terminal of the native protein connected by a linker. New protein to produce different N-terminal and C-terminal proteins 3 schematically illustrates Method III for In the example shown, the rearrangement of the original Has a new N-terminus created at amino acid 97 of the protein and the original C-terminus (a.a.174) Connected to amino acid 1 via the linker region, the new C-terminus is the amino acid of the original sequence A new gene encoding the protein created in 96 is generated.                             Detailed description of the invention   The present invention relates to a novel receptor agonist of human interleukin-3 (hIL-3). In that regard, the sequence is rearranged to have a new N-terminus and a new C-terminus, It may also have amino acid substitutions and / or insertions and / or deletions, A receptor agonist having substantially the same structure and substantially the same biological activity is there. Novel receptor agonists of human interleukin-3 (hIL-3) Amino acid substitutions of naturally occurring variants of hIL-3 polypeptide amino acids (eg, For example, an allele in which position 8 in the hIL-3 polypeptide sequence is proline instead of serine HIL-3 receptor agoni that has been post-translationally modified (eg, glycosylated) WO94 / 12639, WO94 / 12638, WO95 / 20976, WO95 / 211 No. 97, WO95 / 20977, WO95 / 21254 May be included.   The present invention also relates to a DNA sequence encoding a receptor agonist, And a DNA sequence exhibiting substantially the same function, and a receptor agonist of the present invention. DNA sequence that differs only by the degeneracy of the DNA encoding the DNA and the genetic code Is included.   The present invention also provides a DNA sequence encoding the receptor agonist of the present invention, Oligonucleotide intermediates used for construction of agonist DNA, and these And the polypeptides encoded by the oligonucleotides. these Polypeptides can be used as antagonists or in immunoassays and immunotherapy It is useful as an antigenic fragment for the production of antibodies useful for protocol.   Human IL-3 relies on its ability to stimulate colony formation by human hematopoietic progenitor cells. Can be characterized. The formed colonies include erythroblasts, granulocytes, megakaryocytes , Granulocyte macrophages and mixtures thereof. Human IL-3 first Bone marrow function and peripheral blood cell populations in studies performed in primates and then in humans Demonstrated the ability to restore to therapeutically beneficial levels (Gillio, A.P. et al., 1990). Ganser, A. et al., 1990; Falk, S. et al., 1991). Other activities of hIL-3 include leukocyte Ability to stimulate migration and chemotaxis; sensitizes human leukocytes to high levels of inflammatory mediation Eater, such as the ability to produce leukotrienes and histamine, The ability to induce cell surface expression of molecules required for adhesion, as well as the dermal immune response and And the ability to induce heat and fever. Many or any of these biological activities of IL-3 All involve signal transduction and high affinity receptor binding. Receptor jaw of the present invention The nisto may have similar or similar properties compared to native hIL-3. Greater biological activity, or improved half-life, reduced adverse physical effects or physical Have improved properties or a combination of these properties. They are also Antagonis In some cases, it can be useful. Almost or all compared to native hIL-3 HIL-3 mutant polypeptides that do not show high activity, Gene probes as antigens for the production of antibodies for use in immunology or immunotherapy Intermediates used as probes or for the construction of other useful hIL-3 agonists May be useful as a body. hIL-3 binds to its receptor (s) By inducing a second messenger that initiates signaling HIL-3 receptor agonists of the present invention It is useful in assisting in determining whether a particular amino acid sequence of a shift is involved.   The novel hIL-3 receptor agonists of the present invention are preferably human IL-3 or I Having at least one biological property of an L-3-like growth factor and one or more IL-3-like growth factors; Physical properties, or improved properties or undesirable biological properties of human IL-3 Indicates a decrease in properties.   One such property is the progenitor responsible for the erythroid, lymphoid, and myeloid lineages. In support of vesicle growth and differentiation. For example, in a standard human bone marrow assay, IL-3-like biological properties include granulocyte-type colonies, megakaryocyte-type colonies, monocytes / macro Stimulation of phage-type colonies and erythroid colonies. Other IL-3-like properties Include interaction with early pluripotent stem cells, maintenance of pluripotent progenitor cell growth, chronic myeloid Ability to stimulate proliferation of leukemia (CML) cells, ability to stimulate proliferation of mast cells , Ability to support the growth of various factor-dependent cell lines, as well as immature myeloid cell progenitors Capable of inducing vesicles. Other biological properties of IL-3 disclosed in the art Have been. Human IL-3 may also be useful in certain biologically Activity, such as the ability to stimulate the release of leukotrienes, and Has the ability to stimulate enhanced histamine synthesis in the spleen and bone marrow in vivo.   Some of the receptor agonists of the present invention also show an improved side effect profile. for example For example, they can be compared to native hIL-3 or (15-125) hIL-3. This results in reduced icotriene or histamine release. Such hIL-3 Or hIL-3-like biological properties include the following biological properties as well as in vivo and One or more of the in vitro activities are included.   The biological activity of hIL-3 and the hIL-3 receptor agonists of the present invention is It is measured by DNA synthesis by myeloid leukemia cells (AML). Factor dependent The sexual cell line AML193 has been adapted for use in testing for biological activity.   "Native sequence" refers to the wild-type or native gene or protein Means the same amino acid or nucleic acid sequence as the type.   HIL-3 receptor agonists of the present invention, particularly those similar to native hIL-3 One potential advantage of agonists that maintain or better Smaller amounts of biologically active receptor agonists to produce the desired therapeutic effect Is to make use possible. This is the process necessary to produce the desired therapeutic effect. It is possible to reduce the number of installations. Use of smaller amounts also allows for antigenic action Reduces the likelihood of sexual or other undesirable side effects. For example, the desired treatment Administration of native IL-3 if the effect can be achieved with smaller amounts of polypeptide Side effects such as stimulation of leukotriene and / or histamine release Can be reduced or eliminated. The hIL-3 receptor agonist of the present invention also comprises It appears to be useful for activating stem cells or progenitor cells with low receptor numbers. Departure Pharmaceutical compositions containing clear hIL-3 receptor agonists can be administered parenterally or intravenously. Or it can be administered subcutaneously.   The modified hIL-3 receptor agonists of the present invention may be used in hematopoietic progenitor cells in peripheral blood. It is useful for mobilization of stem cells. Progenitor cells derived from peripheral blood The settings have been shown to be effective in restoring the physical strength of patients. G-CSF and Hematopoietic cell growth factors, including GM-CSF, are responsible for circulating progenitor and stem cells in peripheral blood. It has been shown to increase the number. This simplifies the operation of collecting peripheral stem cells. And dramatically reduce operating costs by reducing the number of required forerations. Was. Modified hIL-3 receptor agonists are useful for stem cell mobilization and Further increase the efficiency of stem cell transplantation.   The modified hIL-3 receptor agonists of the present invention are used for hematopoietic progenitor cells and stem cells. It is also useful for ex vivo deployment. For example, a colony stimulating factor such as hIL-3 ( (CSF) is often seen as a result of such treatments following high-dose chemotherapy. Administered alone for the treatment of neutropenia and thrombocytopenia, It is co-administered with SF and is administered in combination with a bone marrow graft. However, serious The period of severe neutropenia and thrombocytopenia cannot be completely eliminated. Bone marrow cells consisting of monocytes (macrophages), granulocytes (including neutrophils) and megakaryocytes The cell line is important in preventing life-threatening infections and bleeding. Neutropenia And thrombocytopenia also include diseases, genetic abnormalities, drugs, toxins, radiation and It may be the result of many therapeutic treatments, such as conventional cancer treatments.   Bone marrow transplantation has been used to treat this group of patients. However, at risk There are several problems associated with the use of bone marrow to restore a hematopoietic system, such as 1) Limited number of stem cells in bone marrow, spleen or peripheral blood 2) Graft versus lodging Possible primary disease, 3) graft rejection, and 4) contamination of tumor cells. Stem cells are bone It makes up only a very small percentage of nucleated cells in the marrow, spleen and peripheral blood. stem The recovery of hematopoietic function is enhanced as the number of cells increases. You. Thus, the in vitro expansion of stem cells can restore hematopoietic function and patient survival Will be increased. Allogeneic donor bone marrow used to provide bone marrow for transplantation Have been. However, graft-versus-host disease and graft rejection do not match HLA Bone marrow transplantation is also restricted in recipients from failed sibling donors. Allogeneic bone marrow transfer An alternative to planting is autologous bone marrow transplantation. In autologous bone marrow transplantation, the patient's own bone marrow Some are harvested before myeloablative therapy, such as high-dose chemotherapy, and then returned to the patient. Transplant. Autologous transplants eliminate the risk of graft-versus-host disease and graft rejection. However, autologous bone marrow transplantation still has a limited number of stem cells in the bone marrow and tumors There is a problem in terms of possible contamination by cells. Stem cells have a limited number of stem cells It can be overcome by the ex vivo expansion of the vesicles. In addition, stem cells are the tumor cells in bone marrow transplants In order to reduce contamination, specific surface antigens such as CD34 + Can be isolated differently.   The following patents include the isolation of stem cells, CD34 + cells, culturing cells with hematopoietic factors, Use of those cells for the treatment of patients with blood disorders, and cell development and inheritance Further details regarding the use of hematopoietic factors for offspring therapy are included.   No. 5,061,620 discloses a human obtained by separating stem cells from donated cells. The present invention relates to a composition comprising hematopoietic stem cells.   No. 5,199,942 discloses (1) collection of hematopoietic progenitor cells from a patient, (2) IL-3, flt3 ligand, c-kit ligand, GM-CSF, IL-1, GM-CSF / Cells with growth factors selected from IL-3 fusion proteins and combinations thereof Ex vivo expansion of (3) self-administration of cell preparation to patients Hematopoietic cell transplantation methods have been described.   No. 5,240,856 describes a cell separator which includes a device for automatically controlling the cell separation process. About the lator.   WO 91/16116 discloses the selective isolation and separation of target cells from a mixture of cells. Apparatus and methods are described.   WO 09/18972 discloses that a suspension of bone marrow cells is prepared using a hollow fiber bioreactor. A method for in vitro culturing of bone marrow by incubation has been described.   WO 92/18615 transplants in a culture medium containing a specific mixture of cytokines And methods for maintaining and expanding bone marrow cells for use.   WO 93/08268 discloses (a) a step of separating CD34 + stem cells from other cells, and (B) ink in a selective medium in which stem cells of the separated cells are selectively developed A method for selective expansion of stem cells comprising a step of culturing cells is described.   WO 93/18136 describes an in vitro method for supporting mammalian cells derived from peripheral blood. Has been described.   WO 93/18648 describes human neutrophil progenitor cells and a high content of myeloblasts and promyelocytes. And / or a composition for the treatment of hereditary or acquired neutropenia.   WO 94/08039 discloses that humans can be selected by selecting cells that express c-kit protein. A method for enriching hematopoietic stem cells is described.   WO 94/11493 describes CD34 + isolated using countercurrent elution and A small population of stem cells is described.   WO 94/27698 selectively separates nucleated heterogeneous cell populations from heterogeneous cell mixtures To a method combining immunoaffinity separation and continuous flow centrifugation.   WO 94/25848 describes a cell separation device for collection and processing of target cells Have been.   Brandt et al., J. Clin. Invest. 86: 932-942, 1990, Hematopoietic progenitors from human bone marrow Of highly enriched CD34 + precursors of cells, IL-1a, IL-3, IL-6 or G Long term cultivation in M-CSF containing media is discussed.   One aspect of the present invention provides a method for selective ex vivo expansion of stem cells. "stem The term "cells" refers to totipotent hematopoietic stem cells that can be isolated from bone marrow, spleen, or peripheral blood. As well as early precursors and progenitor cells. The term "deployment" refers to cell differentiation and Means proliferation. The present invention relates to (a) separation of stem cells from other cells, and (b) separation of stem cells. Cells containing the hIL-3 receptor agonist (s) of the invention Culturing in a selective culture medium, and (c) harvesting the cultured cells. A method for selective ex vivo deployment is provided. Stem cells, as well as neutrophils, red blood cells, and small blood The progenitor cells responsible for fate, such as plates, are specific progenitors present on the surface of these cells. Depending on the presence and / or absence of cell marker antigens such as CD34 and / or form The morphological characteristics allow it to be distinguished from most other cells. Highly concentrated CD34 +, Thy-1 + and lin- have been reported in the phenotypes of the isolated human stem cell fractions. However, it should be understood that the present invention is not limited to the expansion of this stem cell population. It is. The CD34 + enriched human stem cell fraction has been described in a number of Towards compatibility columns or beads, magnetic beads or surface antigens such as CD34 + Can be separated by flow cytometry using the antibody obtained. Further In addition, a physical separation method such as a countercurrent elution method is used for enrichment of hematopoietic progenitor cells. be able to. CD34 + progenitor cells are heterogeneous and have a heterologous lineage-related cell surface-associated Split into several subpopulations characterized by the presence or absence of the original co-expression Can be The most immature progenitor cells are known lineage related markers such as HL Does not express A-DR or CD38, but may express CD90 (thy-1) . CD33, CD38, CD41, CD71, HLA-DR or other such as c-kit Surface antigens can also be used for selective isolation of hematopoietic progenitor cells. Isolated cells Incubate in selective media in culture flasks, sterile bags or hollow fibers. You can bet. To selectively expand cells, various colonies Stimulators are available. Representative factors used for ex vivo expansion of bone marrow Is a c-kit ligand, IL-3, G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-6, I L-11, flt-3 ligands or combinations thereof are included. Stem cell proliferation , Standard methods (eg, haemocytometer, CFU, LTCIC) or flow cytometry Tree counts for stem cells and other cells before or after incubation It can be monitored by counting.   Ex vivo expansion of stem cells involved many selection methods and various colony-stimulating factors For example, c-kit ligand (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514, 1994; McKenna et al., B lood 86: 3413-3420, 1995), IL-3 (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514, 1994; Sa). to et al., Blood 82: 3600-3609, 1993), G-CSF (Sato et al., Blood 82: 3600-3609). GM-CSF (Sato et al., Blood 82: 3600-3609, 1993), IL-1 (Muench et al., Blood 81: 3463-3473, 1993), IL-6 (Sato et al., Blood 82: 3600-36). 09, 1993), IL-11 (Lemoli et al., Exp. Hem. 21: 1668-1672, 1993; Sato et al., Bloo. d 82: 3600-3609, 1993), flt-3 ligand (McKenna et al., Blood 86: 3413-3420, 19). 95) and / or blends thereof (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514, 1994; Hay). lock et al., Blood 80: 1405-1412, 1992; Koller et al., Biotechnology 11: 358-363, 199. 3; Lemoli et al., Exp. 21: 1668-1672, 1993; McKenna et al., Blood 86: 3413-3420, 19 95; Muench et al., Blood 81: 3463-3473, 1993; Patchen et al., Biotherapy 7: 13-26, 199. 4; Sato et al., Blood 82: 3600-3609, 1993; Smith et al., Exp. 21: 870-877, 1993; St een et al., Stem Cell 12: 214-224, 1994: Tsujino et al., Exp. 21: 1379-1386, 1993 Several methods have been reported using deployments using Individual colony sting Among the severe factors, hIL-3 is one of the most powerful factors for the expansion of peripheral blood CD34 + cells. (Sato et al., Blood 82: 3600-3609, 1993; Kobayashi et al., Bl. ood 73: 1836-1841, 1989). However, a single factor is equivalent to a multi-factor formulation No factors have been shown to be effective. The present invention is more effective than single factor alone An ex vivo deployment method utilizing a modified hIL-3 receptor agonist is provided.   Another aspect of the invention is a method of maintaining and / or expanding a hematopoietic progenitor cell. Prepared by exposure to a stromal cell line such as HS-5 (WO 96/02662, Roecklein & Torok-Strob, Blood 85: 997-1105, 1995), the modified hIL-3 receptor jaw of the present invention. Involve inoculating cells into a culture vessel containing culture medium supplemented with nyst Provide the law.   Another prominent clinical use of growth factors is hematopoietic progenitor cells for gene therapy. And in vitro activation of stem cells. Long lifespan of hematopoietic progenitor cells Due to the systemic distribution of these daughter cells, hematopoietic progenitor cells are ex vivo An excellent candidate for transfection. Hematopoietic progenitor cells or genes of interest Stimulates cell division and DNA replication for introduction into the stem cell genome It is necessary. The hematopoietic stem cell cycle circulates very infrequently, Promote transduction, thereby increasing the potential for clinical success of gene therapy Means that growth factors are useful for Possible indications for gene therapy (Refer to the review in Crystal, Science 270: 404-410, 1995) 1) Many innate metabolism Abnormality and immunodeficiency (Kay & Woo, Trends Genet. 10: 253-257, 1994), 2) God Transfusion disorder (Friedmann, Trends Genet. 10: 210-214, 1994), 3) cancer (Culver & Bl aese, Trends Genet. 10: 174-178, 1994) and 4) Infectious diseases (Gilboa & Smi) th, Trends Genet. 10: 139-144, 1994). Long life span of hematopoietic progenitor cells and Due to the distribution of their daughter cells throughout the body, hematopoietic progenitor cells Excellent candidate for transfection.   Various methods well known to those skilled in the art can be used to introduce genetic material into host cells. There is a law. Transfer of the therapeutic gene to primary cells requires both viral and non-viral Many vectors have been developed. 1) Replication for virus-based vectors Defective recombinant retrovirus (Boris-Lawrie & Temin, Curr. 0pin. Genet. Dev. 3: 1 02-109, 1993; Boris-Lawrie & Temin, Annal. New York Acad. Sci. 716: 59-71 , 1994: Miller, Current Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992) and multiple Deficient recombinant adenovirus (Berkner, BioTechniques 6: 616-629, 1988: Berkn er, Current Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-66, 1992; Brody & Crystal, Annal . New York Acad. Sci. 716: 90-103, 1994). Non-viral based vectors The protein / DNA complex (Cristiano et al., PNAS USA. 90: 2122-2126, 1 993; Curiel et al., Annal. New York Acad. Sci. 716: 36-58, 1994), Electropor And liposome-mediated delivery such as cationic liposomes (Farhood Et al., Annal. New York Acad. Sci. 716: 23-35, 1994).   The present invention relates to existing methods for expanding hematopoietic cells into which new genetic material has been introduced. Improvement, including activity not observed by a single colony stimulating factor HIL-3 receptor agonist having enhanced biological activity and / or physical properties An improvement in providing a method using is provided.   Many drugs can cause myelosuppression or hematopoietic failure. Such drugs Examples of AZT, DDI, alkylating agents and antimetabolites used in chemotherapy Substances, antibiotics such as chloramphenicol, penicillin, ganciclovir, Daunomycin and sulfa drugs, phenothiazines, tranquilizers such as Meprobamate, analgesics such as aminopyrine and dipyrone, anticonvulsants For example, phenytoin or carbamazepine, antithyroid agents such as propylthiou There are racil and methimazole and diuretics. Modified hIL-3 of the invention Receptor agonists are found in bone marrow, often found in patients treated with these drugs. It is useful for suppressing or preventing or treating hematopoietic failure.   Hematopoietic failure also occurs as a result of viral, microbial or parasitic infections, and It also occurs as a result of treatment of disease or renal failure, for example, dialysis. Modified of the present invention HIL-3 receptor agonists are useful in treating such hematopoietic failure.   Treatment of hematopoietic dysfunction in patients with a pharmaceutical composition containing a modified hIL-3 receptor agonist Administration to the patient. The modified hIL-3 receptor agonists of the present invention also Prior to injection of the cells into the patient, the modified hIL-3 receptor agonists of the present invention Useful for the activation and expansion of these cells treated with Toro.   For example, various immunodeficiencies or immune diseases in T and / or B lymphocytes For example, rheumatoid arthritis is also treated with the modified hIL-3 receptor agonists of the present invention. Is advantageously influenced by Immunodeficiency is caused by viral infections such as HTLVI, H As a result of TLVII, HTVIII infection, exposure to high-dose radiation, cancer treatment or other It may be the result of drug therapy. The modified hIL-3 receptor agonists of the present invention Other blood cell deficiencies such as plugs, alone or in combination with other colony stimulating factors It can also be used to treat cytopenia (platelet deficiency) or anemia. These new poly Other uses for peptides include in vivo and ex vivo in patients recovering from bone marrow transplantation. Treatment, as well as monoclonal and monoclonal antibodies generated by standard methods for diagnosis and therapy. And the development of polyclonal antibodies.   Another aspect of the present invention is a method and composition for treating the above conditions. this Such compositions comprise one or more of the modified hIL-3 receptor agonists of the present invention. A composition comprising a therapeutically effective amount mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. This composition Can be administered parenterally, intravenously or subcutaneously. At the time of administration Therapeutic compositions used in the invention are pyrogen-free, parenteral administration Is preferably in the form of an aqueous solution in which is acceptable. pH, isotonicity, solubility, etc. Preparation of such a protein solution that allows parenteral administration considering Is not beyond the scope of the art.   Other embodiments include DNA sequences encoding novel hIL-3 receptor agonists and It is to provide an identical DNA sequence except for the degeneracy of the genetic code. DNA distribution Changes to remove "rare" codons in columns, altering GC content of DNA sequence Modifications, modifications to increase the stability of RNA messages, and specific The ability to make modifications at the N-terminus to improve expression in primary cells It is well known to those skilled in the art.   Another aspect of the present invention relates to a method for expressing these novel hIL-3 receptor agonists. And a plasmid DNA vector used in the method. These vectors are It contains the novel DNA sequence described above which encodes the novel polypeptide of the invention. h A suitable microorganism capable of transforming a microorganism capable of expressing an IL-3 receptor agonist The vector uses a nucleotide sequence encoding a hIL-3 receptor agonist. Expression connected to transcription and translation regulatory sequences selected depending on the host cell to be used Vectors are included.   A vector for introducing the above-mentioned modified sequence is included in the present invention, and includes a hIL-3 receptor agon. Useful for making nysts. The vector used in this method also contains the D Operably linked to a NA coding sequence and its replication and expression in a selected host cell Contains selected regulatory sequences.   In another aspect of the present invention, a method for producing a novel modified hIL-3 receptor agonist is provided. Provided. The method of the present invention relates to the expression of a novel modified hIL-3 receptor agonist. Suitable cells transformed with a vector containing the DNA sequence to be loaded. Or culturing cell lines. Suitable cells or cell lines may be bacterial cells it can. For example, in the field of biotechnology, various strains of E. coli are used as host cells. It is well known. Examples of such strains include E. coli strain JM101 (Yanish-Perron et al., Gene  33: 103-119, 1985) and MON105 (Obukowicz et al., Applied Environmental M icrobiology 58: 1511-1523, 1992). The present invention also includes Escherichia coli chromosome expression vector based on phage Mu is used (Welnberg et al., Gene 1). 26: 25-33, 1993) Expression of modified hIL-3 receptor agonist proteins is also included . Various strains of Bacillus subtilis can also be used in this method. Yeasts well known to those skilled in the art Many strains of cells also serve as host cells for expression of a polypeptide of the invention. Available. When expressed in the cytoplasm of Escherichia coli, the modified hIL-3 of the present invention The gene encoding the receptor agonist is located at the 5 'end of the gene and the N Met at the end^-1-Ala^-2-Or Met^-1Is constructed so that codons encoding You can also. The N-terminus of the protein created in the cytoplasm of E. coli is methionine. Aminopeptidase (Ben Bassat et al., J. Bac. 161: 751-757, 1987) and Post-translational processing with other peptidases Thionine is affected to be cleaved. Modified hIL-3 receptor agonis of the present invention Met at the N-terminus^-1, Ala^-1Or Met^-2-Ala^-1Modified hIL-3 receptor having Agonist polypeptides are included. These mutant modified hIL-3 receptor Gonist is also expressed in Escherichia coli by fusing a secretory signal peptide to the N-terminus. Is done. This signal peptide is cleaved from the polypeptide as part of the secretory process. Refused.   For use in the present invention, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) is also suitable. Common methods for heterologous gene expression in mammalian cells Kaufman, R.J., 1987, Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 9, It is reviewed in J.K.Setlow, Plenum Press, New York. Functions in mammalian cells Strong promoter capable of transcription of eukaryotic secretory signal peptide coding region Drives it to be translatably connected to the coding region of the modified hIL-3 receptor agonist. The constructed expression vector is constructed. For example, pcDNAI / Neo, pRc / RS V and pRc / CMV (obtained from Invitrogen Corp., San Diego, California) Plasmids such as The eukaryotic cell secretory signal peptide coding region is Can be from the gene itself or from other secreted mammalian proteins (Bayne, M.L. et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 84: 2638-2642, 1987). gene After construction of a vector containing, the vector DNA is transfected into mammalian cells. I do. Such cells are, for example, COS7, HeLa, BHK, CHO or Mouse L strain can be used. Cells can be prepared, for example, in DMEM medium (JRH Scient ific). The polypeptide secreted into the medium is Following transient expression 24-72 hours after injection or for antibiotic resistance After selecting and establishing a stable cell line, use standard biochemical approaches Can be collected. Selection and transformation of suitable mammalian host cells, Methods for culture, amplification, screening, and product production and purification are known in the art. And are well known. For example, Gething & Sambrook, Nature 293: 620-625, 1981. Or Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5 (7) 1750-1759 or Howley et al., U.S. Pat. See 419,446. Another suitable mammalian cell line is the monkey COS-1 cell line. You. A similarly useful mammalian cell line is the monkey CV-1 cell line.   If desired, insect cells can be utilized as host cells in the method of the present invention. it can. See, for example, Miller et al., Genetic Engineering 8: 277-298 (Plenum Press 19 86) See references cited therein. Furthermore, using a baculovirus vector A general method for expressing heterologous genes in insect cells by insects is described in Summers, M.D. & Smith, G. E., 1987, Manual of methods for Baculovirus vectors and insect cellcult ure procedures, Texas Agriculture Experiment Station Bull. No. Noted in 1555 It is listed. Strong baculovirus promoters (eg polyhedronp) Motor) drives transcription of the eukaryotic cell secretory signal peptide coding region, Is translatably connected to the coding region of the modified hIL-3 receptor agonist polypeptide. Is constructed. For example, the plasmid (pVL1392 ( (Obtained from Invitrogen Corp., San Diego, California). Modified hI Construction of Vector Carrying Gene Encoding L-3 Receptor Agonist Polypeptide After construction, 2 μg of this DNA was replaced with 1 μg of baculovirus DNA (Summers & Smith, 1 987) together with the insect cell line SF9. Modified hIL-3 Using a pure recombinant baculovirus having a receptor agonist gene, For example, cultured cells in Excell 401 serum-free medium (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) Infect. Modified hIL-3 receptor agonist secreted into the medium is standard biochemistry Can be recovered by a strategic approach. Generates modified hIL-3 receptor agonist protein The resulting mammalian or insect cell supernatant is first prepared from one of many commercial enrichment units. Can be concentrated.   The dosing regimen in the treatment of the above conditions modifies the action of the drug by the attending physician Factors such as patient condition, weight, gender and diet, and infection, if any. And the number of doses as well as other clinical factors. Typically, Daily dosages range from 0.2 to 150 μg of non-glycosylated IL-3 protein per kg of body weight. Can be enclosed. This dosing standard is based on the AML growth assay described herein. Generally about 10-100 picomoles of EC in b₅₀Ney that are recognized as having Reference is made to the standard level of biological activity of active IL-3. Therefore, The dosage compares the activity of a given mutein with the activity of native (standard) IL-3. The daily dose per kg of body weight should be at least 0.1 μg, A range of up to 1 mg does not seem unreasonable. In addition, IL-3 receptor Daily dose per kg body weight of gonist higher or lower than the range of 10-200μg There are special environments that will need to be adjusted. These include other CSFs or growth factors Co-administration, co-administration with chemotherapeutic agents and / or radiation, glycosylated IL Use of -3 receptor agonists and various patient-related questions discussed earlier in this section Title is included. As noted above, therapeutic methods and compositions may be co-administered with other human factors. Also includes giving. Other constructs suitable for simultaneous or sequential co-administration with the polypeptides of the invention Blood promoting factor, colony stimulating factor and interleukin (herein, A non-limiting list of collectively referred to as “colony stimulating factors” includes GM-CSF, G-CSF, c-mp1 ligand (also known as TPO or MGDF), M -CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, I L-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 , IL-15, LIF, flt3 / flk2 ligand, human growth factor, B cell growth factor Offspring, B cell differentiation factor, eosinophil differentiation factor and steel factor or c-kit Stem cell factor (SCF), also known as a liquid, or a combination thereof You. The above-mentioned dosages are adjusted to compensate for such additional ingredients in the therapeutic composition. The course of the treated patient is monitored by periodic assessment of hematological profiles, such as blood cell classification. Can be   Linker determination   The length of the linker amino acid sequence can be determined empirically or based on guidelines from structural information. Alternatively, selection can be made using both approaches.   If there is no structural information, change the length so that it extends over the Exposure of rows to surface (hydrophilicity: Hopp & Woods, Mol. Immunol. 20: 483-489, 1983; Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982), solvent exposed surface area (Lee &  Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400, 1971) and IL-3 receptor agonists Ability to adopt the required conformation without disturbing the conformation Force (conformation flexibility: Karplus & Schulz, Naturwissenschaften 72 : 212-213, 1985) and a small series for testing using a design that is consistently selected. Can be prepared. Assuming translation average of 2.0-3.8Å per residue Then this is the length to be tested is 0-30 residues, the preferred range is 0-15 residues It means there is. An example of such an empirical series is the cassette array For example, a linker is constructed by using Gly-Gly-Gly-Ser repeatedly n times (n is 1). , 2, 3 or 4). As will be apparent to those skilled in the art, Such sequences, which differ in composition and composition and can function as linkers, have many sequences. The first thing to consider is that they are neither too long nor too short (Sandhu , Critical Rev. 12: 437-462, 1992). If it is too long, the entropy effect is tertiary It is considered to destabilize the original fold. It appears that the force destabilizes the molecule.   As is apparent to those skilled in the analysis of protein structural information, the c-α carbon The distance between the ends of the chains, defined as distance, determines the length of the sequence to be used or Is the number of possibilities that must be tested, at least in the empirical choice of linker Can be used to limit The position of the end of the polypeptide chain was derived from X-ray analysis It may not be clear from the structural model or nuclear magnetic resonance spectrum data, Therefore, even in the correct case, it is necessary to accurately estimate the required linker length. It is known to those skilled in the art that this condition must be taken into account. is there. Select two residues close to the end of the chain in the sequence from the residues with well-defined positions. And use the distance between their c-α carbons to approximate the linker between them. Calculate the length. Phosphorus with a range of residue numbers can be used as a guide to the calculated length. Kers (calculated using 2-3.8Å per residue) are then selected. These phosphorus Cars may be constructed from the original arrangement or shortened or extended and extended as necessary. If so, are the additional residues selected to be flexible and compatible as described above? Or, if desired, the first sequence is linked to a series of linkers, such as Gly- Replacement using the Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2) cassette method, or optionally Use the combination of the first sequence with the appropriate full length and the new sequence.   Amino and carboxyl terminal determination   The sequence that can fold into a biologically active state is the original polypeptide. The first (amino-terminal) and last (carboxyl-terminal) positions from the inside of the chain. It can be selected using the linker sequences described above, while using the linker sequences described above. Amino and carbo The xyl ends are identified by a common strain of sequences called cleavage regions using the guidelines described below. Selected from within the switch. That is, the novel amino acid sequence is Generated by choosing the amino and carboxyl termini. In many cases, New terminal selection places the original carboxyl terminus immediately before the original amino terminus Is done as follows. However, as will be apparent to those skilled in the art, Selection of ends at any position within the region will also work, and these will It effectively leads to a deletion or addition to the amino or carboxyl moiety.   Three-dimensional structure required for the primary amino acid sequence of a protein to express its biological function Directing folding into is a central tenet of molecular biology. Tampa X-ray analysis of single crystals of dentin or nuclear magnetic resonance spectrum of protein solution Methods for obtaining and interpreting three-dimensional structure information by using the method are well known to those skilled in the art. Examples of structural information relevant to the identification of the cleavage region include the secondary structure of the protein (α and 3-10 helices, parallel and anti-parallel beta sheets, folded structures and tabs And loops: Kabsch & Sander, Biopolymers 22: 2577-2637, 1983) Position and type, degree of solvent exposure of amino acid residues, degree of residue interaction and Type (Chothia, Ann. Rev. Biochem. 53: 537-572, 1984) and polypeptide Static and dynamic distribution of conformations along the chain (Alber & Mathews, Met hods Enzymol. 154: 511-533, 1987). In some cases, solvent exposure of residues Additional information is obtained for One example is the post-translational attachment site for carbohydrates, It is necessarily on the surface of the protein. Whether there is experimental structural information Tertiary and secondary structures of proteins, access to solvents, if not available To predict ease and the presence of turns and loops, Analysis is also available. If a direct structure determination method is difficult, In some cases, biochemical methods can be applied to determine empirically. For example, surface exposure Use of methods to identify strand breaks after restriction proteolysis to estimate (Gentile & Salvatore, Eur. J. Biochem. 218: 603-621, 1993). That is, Experimentally derived structural information or prediction methods (eg, Srinivisan & Rose, P roteins; Struct. Funct. & Genetics, 22: 81-99, 1995) Examine body amino acid sequences to determine if regions are essential for maintaining secondary and tertiary structure Classify according to. Periodic secondary structure (α and 3-10 helices, parallel and And the presence of sequences in regions known to be involved in Is an area to avoid. Similarly observed or predicted low solvent exposure Amino acid sequence regions are also likely to be part of the so-called hydrophobic core of proteins In addition, the choice of amino and carboxyl termini should be avoided. On the contrary Areas known or predicted to be in surface turns or loops, especially raw The region known not to be necessary for the activity of the substance is determined by selecting the end of the polypeptide chain. This is a preferred site. Preferred sequences of amino acid sequences based on the above criteria The reticle is called the cutting area.                              Materials and methods   All chemical reagents were purchased from Sigma, Co. unless otherwise indicated. (St. Louis, MO) obtained. Restriction endonucleases and T4 ligases are available from New England Biolabs (Beverly, MA) or from Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) Was.   Transformation of E. coli strain   E. coli strains such as DH5α (registered trademark, Life Technologies, Gaithersburg) , MD) and TG1 (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) Transfection of mammalian cells using transformation reaction Source of plasmid DNA for E. coli strains such as JM101 (Yanisch -Perron et al., Gene 33: 103-119, 1985) and MON105 (Obukowicz et al., Appl. Envir. . Micr. 58: 1511-1523, 1992) discloses a modified hIL-3 receptor agonist of the present invention It can be used to express in the quality or periplasmic space.   MON105 ATCC # 55204: lamda-, IN (rrnD, rrE) 1. rpoD +, rpoH 358   DH5α (registered trademark): F-, phi80dlacZdeltaM15, delta (lacZYA-argF) U 169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rk−, mk +), phoA, supE441amda−, thi-1 , GyrA96, relA1   TGI: delta (lac-pro), supE, thi-1, hsdD5 / F '(traD36, proA + B +, lacIq , LacZdeltaM15)   JM101 ATCC # 33876: delta (pro lac), supE, thi, F '(traD36, proA + B +, LacIq, lacZdeltaM15)   DH5α (registered trademark) subcloning efficiency cells were used as competent cells. Purchase and use transformation as is using the manufacturer's protocol Yes, both TGI and MON105 E. coli strains CaCl_TwoBecome competent using the method. Usually, 20 to 50 ml of cells are transferred to LB medium ( 1% Bacto-tryptone, 0.5% Bacto-yeast extract, 150 mM NaCl) 600 nanometers measured by Baush & Lomb Spectronic spectrophotometer (Rochester, NY) Grow until the optical density unit (OD 600) in the meter is about 1.0. You. Cells are harvested by centrifugation and 1/5 of the culture volume of CaCl_TwoSolution (50 mM CaCl_Two, 10 mM Tris-Cl, pH 7.4) and keep at 4 ° C for 30 minutes. You. The cells are again collected by centrifugation and CaCl is reduced to one-tenth of the culture volume._TwoIn solution Resuspend. The ligated DNA was added to 0.2 ml of these cells and the sample was Hold at 30 ° C for 30-60 minutes. The sample was shifted to 42 ° C for 2 minutes and 1.0 ml of LB was added. After addition, the sample is shaken at 37 ° C for 1 hour. Cells from these samples Or ampicillin (if you choose ampicillin-resistant transformants) 100μg / ml), when selecting a spectinomycin resistant transformant Is a plate containing spectinomycin (75 μg / ml) (LB medium + 1.5% bactoate) Girl) sow on. Incubate the plate at 37 ° C overnight.   Colonies are picked and a suitable antibiotic (ampicillin 100 μg / ml or Nomycin (75 μg / ml) and grown at 37 ° C. with shaking. You.   Method for creating a gene having a new N-terminal / C-terminal   Method I: Creation of a Gene Having a New N-Terminal / C-Terminal and Containing a Linker Region   A linker region having a new N-terminus / C-terminus and separating the original C-terminus and N-terminus The contained genes are described in L.S.Mullins et al., J.Am.Chem.Soc. 116: 5529-5533, 1994 Can be made substantially according to the method described in US Pat. Polymerase chain anti Encodes the primary amino acid sequence of a protein using multiple steps of reactive (PCR) amplification Rearrange the DNA sequence. The steps are illustrated in FIG.   In the first step, the primer set ("New start" and "linker start") ) From the original gene sequence to a new N-terminal part of the new protein and Followed by a linker that connects the C-terminus and N-terminus of the original protein Create and amplify a DNA fragment containing the sequence ("Fragment Start") You. In the second step, primer sets ("New stop" and "linker stop") From the original gene sequence, using the same linker used above, followed by the new DNA fragment encoding a new C-terminal part of a novel protein ("Fragment  Create "Stop") and amplify "New start" and "New stop" primers Is a suitable restriction site that allows cloning of new genes into expression plasmids It is designed to include Normal PCR conditions are 1 cycle at 95 ° C for 2 minutes. 25 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 50 ° C for 1 minute and extension at 72 ° C for 1 minute; One cycle of plus 72 ° C. extension for 7 minutes. Perkin Elmer Gene AmpPCR Core Reag Use the ent kit. A 100 μl reaction was performed with each primer—100 pmole and template DNA 1 μg; and 1 × PCR buffer, 200 μM dGTP, 200 μM dATP, 200 μM M dTTP, 200 μM dCTP, 2.5 units of AmpliTaq DNA polymerase and And 2 mM MgCl_Twoincluding. The PCR reaction was performed using a type 480 DNA thermal cycler (Per Kin Elmer Corporation, Norwalk, CT).   A complementary sequence in the linker region and two amino acids on each side of the linker "Fragment Start" and "Fragment Stop" with acid coding sequence Connect together in the PCR process to create a full-length gene encoding a new protein To achieve. DNA fragments “Fragment Start” and “Fragment Stop” are 1 % TAE gel, stained with ethidium bromide and Qiaex Gel Extraction Isolate using the kit (Qiagen). Equimolar amounts of these fragments are mixed, Heat to 70 ° C for 10 minutes, then slowly cool down, “linker start” and “linker stop” In the third PCR step. The primers annealed with the primers “New start” and “New stop”. A full-length new N-terminal / C-terminal gene is created and amplified. The usual PCR conditions are 95 ° C melting for 2 minutes, 1 cycle; 94 ° C denaturation for 1 minute, 60 ° C annealing. 25 cycles of 1 minute ring and 72 ° C. extension for 1 minute; plus 1 cycle of 72 ° C. extension for 7 minutes It is. Use the Perkin Elmer Gene Amp PCR Core Reagent kit. 100μ 1 reaction contains 100 pmole of each primer and 0.5 μg of DNA; and 1 × PCR buffer Buffer, 200 μM dGTP, 200 μM dATP, 200 μM dTTP, 200 μM dC TP, 2.5 units AmpliTaq DNA polymerase and 2 mM MgCl_TwoContains . The PCR reaction product is purified using the Wizard PCR Preps kit (Promega).   Method II: Creation of a New Gene Having N / C-Terminals and No Linker Region   New N-terminus / C-terminus linking the original N-terminus and C-terminus without using a linker The gene is made using a two-step PCR amplification and blunt end ligation. Can be The steps are illustrated in FIG. In the first step, the primer set (“New start” and “P-bl start”) from the original gene sequence DNA fragment containing a sequence encoding a new N-terminal portion of a new protein Create ("Fragment Start") and amplify. In the second step, the ply Using Marsets ("New stop" and "P-bl stop"), the original gene sequence From the DNA fragment containing the sequence encoding the new C-terminus of the new protein. Create and amplify the fragment ("Fragment Stop"). "New start" and "Ne w stop ”primer allows cloning of new genes into expression plasmids Designed to include appropriate restriction sites. Normal PCR conditions are 95 ° C 1 cycle of melting for 2 minutes; denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 50 ° C for 45 seconds and elongation at 72 ° C 25 cycles of 45 seconds long. Deep V to reduce the appearance of overhangs Use ent polymerase (New England Biolabs) under conditions recommended by the manufacturer. You. The “P-bl start” and “P-bl stop” primers are followed by “Fragment St "art" and "Fragment Stop" to aid in blunt-end ligation between each other For phosphorylation at the 5 'end. 100 μl of the reaction solution is 150 pmole of each primer and template DNA 1 μg; and 1 × Vent buffer (New England Biolabs), 300 μM dGTP, 300 μM dATP, 300 μM dTTP, 300 μM dCTP, 1 unit Deep Vent poly Contains merase. The PCR reaction was performed using a Type 480 DNA thermal cycler (Perkin El mer Corporation, Norwalk, CT). PCR reaction product is Wizard PCR  Purify using Preps kit (Promega).   Primers are suitable to allow cloning of new genes into expression vectors Are designed to include various restriction sites. Usually "Fragment Start" is NcoI restricted Designed to create a site, “Fragment Stop” creates a HindIII restriction site Designed to be. Restriction digest reaction is performed using the Magic DNA Clean-up System kit. And purified using Promega. Fragment Start and stop are 1% TAE gel , Stained with ethidium bromide, and purified with Qiaex Gel Extraction Kit (Qiag en). These fragments were isolated from the approximately 3800 base pair NcoI of pMON3934. / HindIII vector fragment, heat to 50 ° C for 10 minutes, slowly cool Let it anneal to its end. The three fragments were ligated to T4 DNA ligase (Bo (Ehringer Mannheim). New full-length N-terminal A plasmid containing the / C-terminal gene is obtained. Ligation reaction parts Of Escherichia coli strain DH5α cells (Life Technologies, Gaithersburg, MD) Used for transformation. Purify the plasmid DNA and arrange as follows: Check the columns.   Method III: Creation of a new N-terminal / C-terminal gene by tandem duplication   A new N-terminal / C-terminal gene is described in R.A. Horlick et al., Protein Eng. 5: 427-431, It can be created based on the method described in 1992. New N-terminus / C-terminus Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the gene was performed using the tandem template D Performed using NA. The steps are illustrated in FIG.   The tandemly duplicated template DNA was created by cloning, and two copies of the gene were Separated by a DNA sequence coding for a linker connecting the original C-terminus and N-terminus Contains 2 copies of the cloned gene. From the tandemly duplicated template DNA, the full-length Specific primer sets are needed to create and amplify new N-terminal / C-terminal genes. Use a kit. These primers are used to clone new genes into expression vectors. It is designed to include appropriate restriction sites to allow for Normal PCR The conditions are 1 cycle of melting at 95 ° C for 2 minutes; And 72 cycles of 1 minute extension at 72 ° C; plus 1 cycle of 72 ° C extension for 7 minutes. Perkin Elmer Gene Amp PCR Core Reagent Kit (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT). A 100 μl reaction was performed with 100 pmole of each primer and template D NA 1 μg; and 1 × PCR buffer, 200 μM dGTP, 200 μM dATP , 200 μM dTTP, 200 μM dCTP, 2.5 units of AmpliTaq DNA polymerase And 2 mM MgCl_TwoIt contains. PCR reaction is 480 type DNA thermal cycle (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT). PCR anti The reaction product is purified using the Wizard PCR Preps kit (Promega).   Cloning of a new N-terminal / C-terminal gene into an expression vector   A new N-terminal / C-terminal gene is digested with a restriction nuclease to prepare an expression vector. Create a compatible end for insertion. This expression vector is also restricted with restriction nucleases. Digest to form compatible ends. After purification, mix gene and vector DNA And ligated using T4 DNA ligase. Ligation reaction parts Is used to transform E. coli. Purify plasmid DNA and insert Sequence to confirm entry. Grow the right clone to get protein To be expressed.   DNA isolation and characterization   Plasmid DNA is known to those skilled in the art in a number of different ways. Can be isolated using a commercially available kit. Several such methods are set forth below. plus Mid DNA was prepared using the Promega Wizard® Miniprep Kit (Madison, WI), Q iagen QIAwell Plasmid isolation kit (Chatsworth, CA) or Qiagen Plasmid Mi Isolated using the di kit. These kits follow the same general procedure Used for isolation of mid DNA. Briefly, cells are centrifuged (5000 xg). Pellet and release plasmid DNA by continuous NaOH / acid treatment; Cell debris is removed by centrifugation (10000 xg). Supernatant (contains plasmid DNA ) Is loaded onto a column containing a DNA-binding resin, the column is washed, and plasmid D Elute NA with TE. Screen colonies for plasmids of interest After that, E. coli cells of the selected transformant were mixed with 50-100 ml of LB + Inoculate in appropriate antibiotics and grow overnight in an air incubator at 37 ° C with shaking. Let them breed. The purified plasmid DNA is subjected to DNA sequencing, further restriction enzyme digestion , Additional subcloning of DNA fragments, and mammalian cells, E. coli and Or used for transfection into other cells.   Check the sequence   The purified plasmid DNA is converted to dH_TwoResuspend in Bausch and Lomb Spectro It is quantified by measuring the absorption at 260/280 nm using a nic 601 UV photometer. DNA sump ABI PRISM® DyeDeokisy® Terminator Sequencing (Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation, Lincoln Cit y, CA) kit (part number: 401388 or 402078) and indicated by the manufacturer Follow the suggested protocol, usually by adding 5% DMSO to the sequencing mixture. The sequence is determined by further refinement. The sequencing reaction was performed using a type 480 DNA thermal cycler. -(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT) Implement. The samples were Centri-Sep® spin columns (Priceton Separ ations, Adelphia, NJ) to remove excess dye terminator and purify it. Lyophilize. Sequencing reactions labeled with fluorescent dyes are converted to deionized formamide Re-suspend and denature ABI 373A DN on 4.75% polyacrylamide-8M urea gel The sequence is determined using the A sequencer. Duplicate DMA sequence fragments Sequencher v 2.1 DNA analysis software (Gene Codes Corporation, AnnArbo r, MI) to assemble into a master DNA contig.   Expression of hIL-3 receptor agonist in mammalian cells   Mammalian cell transfection / preparation of conditioned media   BHK-21 cells are available from the ATCC (Rockville, MD). Cells are 2 mML -Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with Glutamine and 10% Fetal Bovine Serum (FBS) Culture in the ground (DMEM / high glucose). This formulation is named BHK Growth Medium I do. The selection medium was 453 units / ml hygromycin B (Calbiochem, San Diego, CA). ) Supplemented BHK growth medium. The BHK-21 cell line was transformed with the plasmid pMON3359. HSV transactivation to transactivate IE110 promoter found Previously stably transfected with protein VP16 (Hippenmeyer Et al., Bio / Technology, pp 1037-1041, 1993). VP16 protein is IE110 Drives expression of the gene inserted behind the promoter. Trans activation pro BHK-21 cells expressing tein VP16 are called BHK-VP16. Plasmid pMON1118 (see Highkin et al., Poultry Sci. 70: 970-981, 1991) is an SV40 pro Express the hygromycin resistance gene from the motor. Similar plasmid pS V2-hph is also available from the ATCC.   BHK-VP16 cells were plated in 60 mm tissue culture dishes 24 hours before transfection. 3 × 10 per dish^FiveInoculate cells. Cells are per plasmid, plasmid containing gene of interest 10 μg of DNA, 3 μg of hygromycin resistance plasmid pMON1118, “OPTIMEM” (registered trademark) containing 80 μg Gibco-BRL “LIP0FECTAMINE” (registered trademark) (Registered trademark; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) for 16 hours in 3 μl . The medium is then aspirated and replaced with 3 ml of growth medium. Transfection 48 After a short time, the medium is collected from each dish and assayed for activity (transient conditioned medium). Trypsi Cells are removed from the dish with 1-EDTA, diluted 1:10 and containing 10 ml of selective medium. Transfer to a 100 mm tissue culture dish. After about 7 days in selective media, resistant cells Grow into colonies several millimeters in diameter. Filter the colony with filter paper (almost the same size as the colony). And rinsed with trypsin / EDTA) and removed from the dish with 1 ml of selective medium. Transfer to individual plates of a 24-well plate. Clones are confluent After regrowth, re-assay the conditioned medium and expand positive clones into growth medium I do.   Expression of hIL-3 receptor agonist in Escherichia coli   E. coli strain MON105 or JM101 carrying the plasmid of interest G25 type air ink manufactured by New Brunswick Scientific (Edison, New Jersey) in medium Grow at 37 ° C. with shaking in an incubator. Do not monitor growth at OD600 Continue until the value reaches 1.0, at which point nalidixic acid in 10 N NaOH (10 mM g / ml) to a final concentration of 50 μg / ml. The culture was then added at 37 ° C for a further 3 ~ Shake for 4 hours. Cultivate a high degree of aeration to achieve maximum production of the desired gene product Maintain throughout the feeding period. Presence of inclusion bodies (IB) under light microscopy of cells Find out about. Take a 1 ml aliquot of the culture and boil the pelleted cells The mixture was treated with a reducing buffer and subjected to electrophoresis by SDS-PAGE to determine the protein content. Analyze (Maniatis et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 1982). culture Centrifuge the liquid (5000 xg) to pellet the cells.   Preparation of modified hIL-3 receptor agonist inclusion bodies that accumulate as inclusion bodies in Escherichia coli Production, extraction, refolding, dialysis, DEAE chromatography, and Sex analysis   Inclusion body isolation   The cell pellet from 330 ml of E. coli culture was added to the sonication buffer [10 mM 2-A Mino-2- (hydroxymethyl) 1,3-propanediol hydrochloride (Tris-HCl), pH 8.0 + 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)]. these The cells suspended in the Sonicator Cell Disruptor (W-375: Heat Systems-Ultraso) nics, Inc., Farmingdale, New York) using a microchip probe Wave treatment. To destroy cells and wash inclusion bodies (IB), sonicate Three rounds of sonication in the buffer followed by centrifugation. Sonication One round consists of a 3-minute burst followed by a 1-minute burst, at the end of sonication. Each of the two rounds is one minute.   Extraction and refolding of proteins from inclusion body pellets   After the final centrifugation step, the IB pellet was washed with 50 mM Tris-HCl, pH 9.5, 8M. Resuspend in 10 ml of urea and 5 mM dithiothreitol (DTT) and allow to stand for 45 minutes at room temperature. Stir for a while to denature the expressed protein.   The extraction solution was added to a beaker containing 50 mM Tris-HCl, pH 9.5 and 70 ml of 2.3 M urea. And gently agitate at 4 ° C for 18-48 hours while exposing to air to re- Fold. Refolding is Vydac (Hesperia, Ca.) C18 reversed phase high speed Analyze on a liquid chromatography (RP-HPLC) column (0.46 × 25cm) Monitor. 40% to 65% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) Monitor refold using a linear gradient of This gradient is flowed at 1.5 ml / min Unfold for 30 minutes. Denatured proteins generally re-fall in this gradient. Elutes later than the loaded protein.   Purification:   After refolding, contaminating E. coli proteins are removed by acid precipitation. The pH of the refold solution was adjusted to pH 5.0 to 5.2 using 15% (v / v) acetic acid (HOAc). Titrate. This solution was stirred at 4 ° C. for 2 hours, and then centrifuged at 12,000 × g for 20 minutes. Release and pellet any insoluble protein.   The supernatant from the acid precipitation step is separated by a molecular weight cut off (MWCO) of 3,500 daltons S Dialyze using pectra / Por 3 membrane. Dialysis is performed using 4 L (50-fold excess) of 10 mM Tris. This is performed twice for -HCl, pH 8.0 for a total of 18 hours. Dialysis is a sample The urea is removed prior to DEAE chromatography. Sump The centrifuge is then centrifuged (12,000 xg) and any insoluble proteins are dialyzed after dialysis. To let.   For ion exchange chromatography, use a Bio-Rad Bio-Scale DEAE2 column (7 x 52 mm ). Column is 10 mM Tris-HCl in equilibration buffer, pH 8.0 and 0-50 Equilibrate to a buffer containing a 0 mM salt (NaCl) gradient and elute Use to elute the protein. A flow rate of 1.0 ml / min is used throughout this operation. The gradient The column fraction (2.0 ml / fraction) was collected over the column, and Vydac (Hesperia, Ca.) Analyze by RP-HPLC on a room (0.46 × 25 cm). 0.1% trifluoroacetic acid ( A linear gradient from 40% to 65% acetonitrile with TFA) is used. This gradient Develop at 1.5 ml / min for 30 minutes. The pooled fractions are then 4L (50-500x Excess) 10 mM ammonium acetate (NH_FourAc) exchange this twice for pH 4.0 And dialyzed for a total of 18 hours. Dialysis is a Spectra / Por3 membrane with a MWCO of 3,500 daltons This is done using Finally, apply the sample to a 0.22 μm syringe filter (μStar LB syringe). Sterile filtration using a syringe filter (Costar, Cambridge, Ma.) And storage at 4 ° C. I do.   Optionally, the folded protein can be used with an affinity reagent such as a suitable matrix. Affinity purification using mAbs or receptor subunits attached to be able to. Alternatively (or additionally) purification can be performed by various chromatography Any of the methods such as ion exchange, gel filtration or hydrophobic chromatography Or it can be achieved using reverse phase HPLC.   See Methods in Enzymology for these and other protein purification methods. 182, “Guide to Protein Purification”, edited by Murray Deutscher, Academ ic Press, San Diego, CA, 1990.   Protein characterization:   The purified protein was analyzed by RP-HPLC, electrospray mass spectrum, And by SDS-PAGE. Protein quantification is based on amino acid composition, Performed by RP-HPLC and Bradford protein quantification. In some cases, Elect tryptic peptide mapping to confirm protein identity Performed in conjunction with a mass loss mass spectrum.   AML proliferation assay of bioactive human interleukin-3   AML193, a factor-dependent cell line, is available from the American Type Culture Collection (A TCC, Rockville, MD). Established from patients with acute myeloid leukemia Are growth factor-dependent cells that show growth pitting in GM-CSF supplemented medium (Lange, B. et al., Blood 70: 192, 1987; Valtieri, M. et al., J. Immunol. 138: 40) 42, 1987). The ability of AML193 cells to proliferate in the presence of human IL-3 has also been reported. (Santoli, D. et al., J. Immunol. 139: 348, 1987). Wash out growth factors And starved cytokine-dependent AML193 cells for 24 hours to growth factor A cell variant, AML1931.3, adapted for long-term growth in L-3 was used. Fine The cells were then placed in a 24-well plate in medium containing 100 U / ml IL-3 at 1 × 10^Fivecell Re-plate / well. Approximately 2 cells are required for cells to grow rapidly in IL-3. It took a month. These cells were subsequently transformed into a tissue culture medium containing human IL-3 (see below). To maintain AML 193 1.3.   AML193 1.3 cells were prepared from cold Hanks balanced salt solution (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) by centrifuging the cell suspension in 250 xg for 10 minutes and decanting the supernatant. Wash 6 times. Resuspend pelleted cells in HBSS, 6 wash cycles The above operation is repeated until is completed. Cells washed 6 times in this procedure have a density of 2 × 10^Five~ 5 × 10^FiveResuspend in tissue culture medium as a range of viable cells / ml. This medium is Albumin, tomato in Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM, Hazelton, Lenexa, KS) Prepared by supplementing transferrin, lipids and 2-mercaptoethanol. Bovine albumin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) is added at 500 μg / ml. Human transferrin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) g / ml, and 50 μg of soybean lipid (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) / ml, and 2-mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO) is 5 × 10^-FiveAdd M Add.   A rare human interleukin-3 or modified hIL-3 receptor agonist protein A 96-well Costar 3596 tissue culture in tissue culture medium supplemented as described above Create in triplicate on a plate. Once the dilution series has been completed, 50 μl of medium containing leukin-3 or modified hIL-3 receptor agonist protein To be included. Control wells contain tissue culture medium alone (negative control). The above 50 μl of the AML193 1.3 cell suspension (2.5 × 10^FourPipette cells) Add to each well by weighing. 5% CO in humidified air with tissue culture plate_Two, 37 ℃ And incubate for 3 days. On day 3, 0.5 μCi in 50 μl tissue culture medium^ThreeH-H Add thymidine (2 Ci / mM, New England Nuclear, Boston, MA). Add culture solution 5% CO in wet air_TwoIncubate at 37 ° C for 18-24 hours. Wash cell DNA with water T0NTEC cell harvester using a purification cycle followed by a 70% ethanol wash cycle Glass filter mat (Pharmacia LKB, Gai) by (TONTEC, Orange, CT) thersburg). Air dry the filter mat and then And add scintillation liquid (Scintiverse II, Fisher Scientific, S t.Louis, MO or BetaPlate Scintillation Fruid, Pharmacia LKB, Gaithersb urg, MD). Β-radiation of samples from individual tissue culture wells using LKB BetaP late 1205 scintillation counter (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) And data were transferred into cells from each tissue culture well^ThreeH-chimi Expressed in gin counts / minute. Each human interleukin-3 preparation or The activity of the modified hIL-3 receptor agonist protein preparation is Increasing the concentration of leukin-3 or modified hIL-3 receptor agonist to increase cell proliferation (^Three H-thymidine incorporation). Usually 0.05 pM to 1 0^FiveThe concentration range of pM is quantified in these assays. Activity gives 50% of maximal growth Interleukin-3 or modified hIL-3 receptor agonis Determined by measuring the protein dose [ED₅₀= 0.5 x (test Of interleukin-3 per well in triple culture^ThreeRemoval of H-thymidine Maximum mean counts of recruitment / min-observed in triplicate cultures lacking interleukin-3 Be^ThreeBackground proliferation measured by incorporation of H-thymidine)). This EC₅₀ The value is also equal to one unit of biological activity. All assays have relative activity levels Using native interleukin-3 as a control to allow for carry out.   Usually, the modified hIL-3 receptor agonist protein was titrated in a two-fold dilution series. Tested in the concentration range of 2000 pM to 0.06 pM.   The activity of each sample was determined by fitting a 4-parameter logistic model to the data. Determined by the concentration that gave 50% of the maximal response from the pitting. Sump No difference in the upper plateau (maximum response) of the standard compared to Was. Therefore, the relative intensity calculation for each sample is And EC on standards₅₀Determined from evaluation.   Methyl cellulose assay   In this assay, colony stimulating factors that stimulate normal bone marrow cells are heterologous in vitro. Reflects the ability to produce hematopoietic colonies (Bradley et al., Aust. Exp. Biol. Sci. 44: 2 87-300, 1966; Pluznik et al., Cell Comp. Physio 66: 319-324, 1965).   Method   Approximately 30 ml of fresh, normal, healthy bone marrow Performed from the body. Under sterile conditions, the sample was washed with 1x PBS (# 14040.059 Life Tech nologies, Gaithersburg, MD) solution in a 50 ml conical tube (# 25339-50 Corning, C ornibg MD) diluted 1: 5. Ficoll (Histopaque 107) beneath the diluted sample 7 Sigma H-8889) and centrifuge at 300 xg for 30 minutes. Remove mononuclear cell band Twice in 1 × PBS and 1% BSA PBS (CellPro Co., Bothel, WA) And wash once. Mononuclear cells were counted and CD34 + cells were counted using Ceprate LC (CD34 +) key. Select using a column (CellPro Co., Bothel, WA). All in the bone marrow This fractionation is performed because stem and progenitor cells display the CD34 + surface antigen. You.   Cultures were set up in triplicate in a final volume of 1.0 ml in 35 × 10 mm Petri dishes (Nunc # 174926). Up. Culture medium was purchased from Terry Fox Labs (Vancouver, B.C., Canada). And erythropoietin (Amgen, Thousand Oaks, CA) is added to the culture medium. Add 3,000-10,000 CD34 + cells per dish. Transfected mammal In conditioned medium from cells or in transfected mammalian cells or E. coli Mammalian cells purified from these conditioned media or recombinant IL-3 and And the modified hIL-3 receptor agonist protein in a final concentration range of 0.001 to 10 nM. Add to give an enclosure. Recombinant hIL-3. GM-CSF, c-mpl ligand In addition, the modified hIL-3 receptor agonist is self-supplied. G-CSF (Neupo gen) is from Amgen (Thousand Oaks, CA). Use a 3cc syringe for culture Resuspend and dispense 1.0 ml per dish. Colony stings in control (basal response) cultures No extraordinary factors are added. The positive control culture medium contains a conditioned medium (PHA-stimulated human cells: Terry Fox Labs, H2400). The culture solution is 5% CO in humidified air._TwoIncubate at 37 ℃ To   Hematopoietic colonies, defined as 50 cells or more, should be used on the day of peak response (days 10-11) Count using an inverted phase microscope with a 40 × objective lens. Less than 50 cells The group of cells containing is called a cluster. Alternatively, colony slides colony Spread out and stain or harvest, resuspend, and cytospin for staining Rotate on the ride to identify.   Human cord blood hematopoietic cell growth factor assay   In vitro assays of hematopoietic colony stimulating factor (CSF) activity have traditionally been Cells have been used. However, human bone marrow is not always available, There is considerable variability between donors. Umbilical cord blood is a source of hematopoietic stem and progenitor cells. (Broxmeyer et al., PNAS USA 89: 4109-113, 1992; Mayani et al., Bl. ood 81: 3252-3258, 1993). Unlike bone marrow, cord blood is available on a regular basis Is easy. Also, pool freshly obtained cells from several donors or Has established a bank of cryopreserved cells for this purpose, May be reduced. Improved culture conditions and / or strain-specific markers Analysis of granulocyte / macrophage colony (CFU-GM), megakaryocyte Specific for CSF activity or highly proliferative colony forming factor (HPP-CFC) activity It would be possible to assay for   Method   Mononuclear cells (MNC) were collected from cord blood within 24 hours of collection using a standard density gradient (1.077 g). / ml Histopaque). Umbilical cord blood MNC is CD14-, CD34 + cells Immunomagnetic selection, coaty from Applied Immune Science (Santa Clara, CA) Panning of the SBA-, CD34 + fraction using a conditioned flask, and Number encompassing selection of CD34 + using CellPro (Bothell, WA) avidin column Hematopoietic stem and progenitor cells are further enriched by seed manipulation. Newly isolated The enriched or cryopreserved CD34 + cell enriched fraction is used for the assay. Sa Duplicate cultures of each dilution series (concentration range 1 pM to 1204 pM) were used for additional growth. Factor-free medium containing 0.9% methylcellulose (Methocult H4230, Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) 1 × 10 in 1 ml^FourPrepare cells. For some experiments Met containing erythropoietin (EPO) instead of Methocult H4230 Use hocult H4230 or stem cell factor (SCF) 50ng / ml (Biosource Inter national, Camarillo, CA). After culturing for 7-9 days,> 30 cells Count colonies containing. To eliminate subjective bias in counting, Seio is counted blindly.   Creation of mutants, their expression in bacterial, mammalian or insect cells, the desired protein Quality and refolding, as well as to determine protein biological activity For further details on recombinant DNA methods that can be used in the assay, see the co-filed application. WO95 / 00646, WO94 / 12639, WO94 / 12638, WO95 / 20976, WO95 / 2 1197, WO95 / 20977, WO95 / 21254, and US08 / 383,035 You. These are incorporated herein by reference in their entirety.   Further details known to those skilled in the art are incorporated herein by reference. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor  Laboratory (1982) and references cited therein, and J. Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Labor atory (1989) and the references cited therein.   References, patents or applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. It is incorporated herein as described herein.                                     Table 1 Oligonucleotide Table 2 DNA sequence Table 3 Protein sequence   The following examples illustrate the invention in more detail, but the invention is not limited to this particular example. It should be understood that this is not a limitation.                                 Example 1 Construction of tandem duplex plasmid template, Syntanl   The tandem duplex hIL-3 receptor agonist pMON13416 template, Syntanl (SEQ ID N O: 15) to create three types of DNA using T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim). Connections were made depending on the ligation used. The three types of DNA are: pMO containing the hIL-3 receptor agonist pMON13416 digested with naB I N13046; 2) synthetic oligonucleotides, Llsyn.for (SEQ ID NO: 3) and L1sy Annealed complementary pairs of n.rev (SEQ ID NO: 4) (these are the original proteins Linker connecting the C-terminus and N-terminus and the small amount around the pMON13416 sequence And, when properly assembled, give rise to BstE II and Cla I ends); And 3) pMON13046 to ClaI [DNA was obtained from dam-cell, DM1 (Life Tech. hIL-3 receptor agoni digested with SnaB I This is the part of the pMON13416. The digested DNA was resolved on a 0.9% TAE gel. , Ethidium bromide stained and isolated using Gneclean (Bio101).   Part of the ligation reaction was performed using Escherichia coli strain DH5α cells (Life Technologies, Gai thersburg, MD). Transformant Miniprep DNA from PCR and transformants into PCR-based assays Screening was performed using A. Plasmid from selected transformants The DNA sequence was determined to obtain the correct template. The resulting plasmid was syntanl Was named.                                 Example 2 Construction of tandem duplex plasmid template, Syntan3   The tandem duplex hIL-3 receptor agonist pMON13416 template, Syntan3 (SEQ ID N 0:16), the three types of DNA were converted to T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim). Were connected by ligation using The three DNAs are 1) BstE II and And contains the hIL-3 receptor agonist pMON13416 digested with PMON13046; 2) Synthetic oligonucleotide, L3syn.for (SEQ ID NO: 5) And L3syn.rev (SEQ ID NO: 6) annealed complementary pairs (these are the original Linker and pMON13416 sequence linking C-terminal and N-terminal of protein BstE II and BstE II And SnaB I end); and 3) pMON13046 to Cla I [DNA is dam- Cells, pre-grown in DM1 (Life Technologies)] and digested with SnaB I Part of the hIL-3 receptor agonist pMON13416. Digested DNA is 0 Separated on a .9% TAE gel, stained with ethidium bromide, Beneclean (B io101).   Part of the ligation reaction was performed using Escherichia coli strain DH5α cells (Life Technologies, Gai thersburg, MD). Transformant Miniprep DNA from PCR and transformants into PCR-based assays Screening was performed using A. Plasmid from selected transformants The DNA sequence was determined to obtain the correct template. The resulting plasmid is syntan3 Was named.                                 Example 3 Construction of pMON31155   The new N-terminal / C-terminal gene in pMON31155 was described in Materials and Methods. Created using Method III. Full length of hIL-3 receptor agonist pMON13416 The new N-terminal / C-terminal gene was obtained from the intermediate plasmid syntanl using primer set 3 Created and amplified using 5start (SEQ ID NO: 7) and 34stop (SEQ ID NO: 8) Let it. The resulting DNA fragment containing the new gene is Digest with creatase Nco I and Hind III. 1% T digested fragment Resolve on an AE gel, stain with ethidium bromide, and use Beneclean (Bio101). , Vista, CA). The purified digested DNA fragment was Expression vector using DNA ligase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) Ligate to the tar. Digest expression vector DNA with Nco I and Hind III . Part of the ligation reaction was performed using Escherichia coli strain DH5α cells (Life Technologies, Gai thersburg, MD). Bacterial trans Formants are selected on plates containing ampicillin. Plasmid DNA Release, sequence and confirm correct insertion. The resulting plasmid was pMON Name it 31155.   E. coli strain JM101 was used for protein expression and isolation of proteins from inclusion bodies. For this, it was transformed with pMON31155.   The plasmid containing the gene of (SEQ ID NO: 17), pMON31155, Encodes a amino acid sequence. Examples 4 to 10   In Examples 4 to 10, in the same manner as described in Example 3, the ply indicated in Table 4 was used. The construction is performed using a marker. The resulting protein has a new N-terminus as shown in Table 4. And has a C-terminus.   After reading this disclosure, those skilled in the art will recognize the spirit and scope of this invention. Various other examples will be apparent without departing from the spirit of the invention. All other examples like this It is intended to be included within the scope of the appended claims.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年１２月２日（１９９７．１２．２） 【補正内容】 7. （補正なし）以下のヌクレオチド配列 から選択されるインターロイキン−３受容体アゴニストポリペプチドをコードす る配列からなる核酸分子。 8. （補正後）請求項４〜７のいずれかに記載の核酸分子からなる複製が可能 なベクター。 9. （補正後）請求項８記載のベクターからなる宿主細胞。 10．（補正後）ヒドインターロイキン−３受容体アゴニストポリペプチドを製 造する方法において、請求項９記載の宿主細胞を上記ポリペプチドの発現に適当 な条件下に培養する工程および上記ポリペプチドを回収する工程からなる方法。 11．（補正後）請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドおよび医薬的に 許容される担体からなる組成物。 12．（補正後）請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、コロニー刺激 因子および医薬的に許容される担体からなる組成物。 13．（補正後）請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド；ＧＭ−ＣＳＦ ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ¹⁷，ｃ−ｍｐｌリガンド，Ｍ−ＣＳＦ，エリ スロポエチン（ＥＰＯ），ＩＬ−１，ＩＬ−４，ＩＬ−２．ＩＬ−３．ＩＬ−５ ．ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ −１３，ＩＬ−１５，ＬＩＦ，ｆ１ｔ３／ｆｌｋ２リガンド，ヒト成長ホルモン ，Ｂ−細胞成長因子，Ｂ−細胞分化因子，好酸球分化因子および幹細胞因子から なる群より選択されるコロニー刺激因子、ならびに医薬的に許容される担体から なる組成物。 14．（補正後）患者の造血細胞の産生を刺激する医薬の製造のための請求項１ 〜４のいずれかに記載のポリペプチドの使用。 15．（補正後）患者の造血細胞の産生を刺激する医薬の製造のための請求項１ １〜１３のいずれかに記載の組成物の使用。 16．（補正後）幹細胞を選択的にエキソビボ展開させる方法において、 （ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｂ）分離した幹細胞を請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドからな る選択された培養培地で培養し、ついで （ｃ）上記培養細胞を収穫する 工程からなる方法。 17．（補正後）幹細胞を選択的にエキソビボ展開させる方法において、 （ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｂ）分離した幹細胞を請求項１１記載の組成物からなる選択された培養培地 で培養し、ついで （ｃ）上記培養細胞を収穫する 工程からなる方法。 18．（補正後）造血障害を有する患者を （ａ）幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドからな る選択された培養培地で培養し、ついで （ｄ）上記培養細胞を収穫する ことにより処置するための医薬の製造における請求項１〜４のいずれかに記載の ポリペプチドの使用。 19．（補正後）造血障害を有する患者を （ａ）幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を請求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物からなる 選択された培養培地で培養し、ついで （ｄ）上記培養細胞を収穫する ことにより処置するための医薬の製造における請求項１１〜１３のいずれかに記 載の組成物の使用。 20．（補正後）（ａ）患者から幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を請求項１〜４のいずれかに記載の造血タンパク質から なる選択された培養培地で培養し、 （ｄ）上記培養細胞にＤＮＡを導入し、ついで （ｅ）上記形質導入細胞を採取する ことによるヒト遺伝子療法用の医薬の製造のための請求項１〜４のいずれかに記 載の造血タンパク質の使用。 21．（補正後）（ａ）患者から幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を請求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物からなる 選択された培養培地で培養し、 （ｄ）上記培養細胞にＤＮＡを導入し、ついで （ｅ）上記形質導入細胞を採取する ことによるヒト遺伝子療法用の医薬の製造のための請求項１１〜１３のいずれか に記載の組成物の使用。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] December 2, 1997 (1997.12.2) [Contents of Amendment] 7. (No amendment) The following nucleotide sequence: A nucleic acid molecule consisting of a sequence encoding an interleukin-3 receptor agonist polypeptide selected from: 8. (After correction) A replicable vector comprising the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 7. 9. A host cell comprising the vector of claim 8 (after correction). Ten. (After correction) In a method for producing a human interleukin-3 receptor agonist polypeptide, a step of culturing the host cell according to claim 9 under conditions suitable for expression of the polypeptide and a step of recovering the polypeptide. Method consisting of. 11． A composition comprising (after correction) the polypeptide according to any one of claims 1 to 4 and a pharmaceutically acceptable carrier. 12． A composition comprising (after correction) the polypeptide according to any one of claims 1 to 4, a colony stimulating factor, and a pharmaceutically acceptable carrier. 13. (After correction) the polypeptide according to any one of claims 1 to 4; GM-CSF, G-CSF, G-CSF Ser ¹⁷ , c-mpl ligand, M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2. IL-3. IL-5. IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3 / flk2 ligand, human growth hormone, B-cell growth factor, B A composition comprising a colony stimulating factor selected from the group consisting of a cell differentiation factor, an eosinophil differentiation factor and a stem cell factor, and a pharmaceutically acceptable carrier. 14. Use of the polypeptide according to any of claims 1 to 4 for the manufacture of a medicament for stimulating the production of hematopoietic cells of a patient (after correction). 15． Use of a composition according to any of claims 11 to 13 (after correction) for the manufacture of a medicament for stimulating the production of hematopoietic cells of a patient. 16． (After correction) In a method for selectively developing stem cells ex vivo, (a) separating stem cells from other cells, and (b) separating the stem cells from the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. Culturing in a selected culture medium, and (c) harvesting the cultured cells. 17． (After correction) In a method for selectively developing stem cells ex vivo, (a) separating stem cells from other cells, and (b) culturing the separated stem cells in a selected culture medium comprising the composition of claim 11. And (c) harvesting the cultured cells. 18． (After correction) a patient having a hematopoietic disorder; (a) collecting stem cells; (b) separating stem cells from other cells; (c) separating the stem cells from the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. Use of a polypeptide according to any of claims 1 to 4 in the manufacture of a medicament for treatment by culturing in a selected culture medium consisting of: (d) harvesting said cultured cells. 19. (After correction) a patient having a hematopoietic disorder (a) collecting stem cells, (b) separating stem cells from other cells, and (c) separating the separated stem cells from the composition according to any one of claims 11 to 13. Use of a composition according to any of claims 11 to 13 in the manufacture of a medicament for treatment by culturing in a selected culture medium consisting of: (d) harvesting the cultured cells. 20. (After correction) (a) collecting stem cells from a patient, (b) separating stem cells from other cells, and (c) selecting the separated stem cells from the hematopoietic protein according to any one of claims 1 to 4. 5. A method for producing a medicament for human gene therapy by: (d) introducing DNA into the cultured cells, and (e) collecting the transduced cells. Use of a hematopoietic protein according to any one of the above. twenty one. (After correction) (a) collecting stem cells from a patient, (b) separating stem cells from other cells, and (c) selecting the separated stem cells from the composition according to any one of claims 11 to 13. 14. A method according to any one of claims 11 to 13 for producing a medicament for human gene therapy by culturing in a culture medium comprising: (d) introducing DNA into the cultured cells; and (e) collecting the transduced cells. Use of a composition according to any of the above.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ０７Ｋ 14/575 14/575 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/00 Ｂ 5/10 Ａ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バウアー，エス．，シー. アメリカ合衆国63068 ミズーリ州ニュー ヘブン，オーチャド ロード 4656 (72)発明者 ザーフルー，リンダ，エル. アメリカ合衆国63122 ミズーリ州カーク ウッド，イー．メイプル 126 (72)発明者 フェン，イージン アメリカ合衆国63130 ミズーリ州セント ルイス，ミッション コート 423 (72)発明者 マッキャーン，ジョン，ピー. アメリカ合衆国63038 ミズーリ州セント ルイス，バブラー メドウズ ドライブ 18612 (72)発明者 バウム，チャールズ，エム. アメリカ合衆国63131 ミズーリ州セント ルイス，メイソン クノール ロード 1712 (72)発明者 マックファーター，チャールズ，エイ. アメリカ合衆国63011 ミズーリ州ワイル ドウッド，サンダーヘッド キャニヨン コート 16564──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 14/54 C07K 14/575 14/575 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/1 / 21 1/21 5/00 B 5/10 A A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN , CU, CZ, DE, K, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN , MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN Bauer, S. United States 63068 Orchard Road, New Haven, Missouri 4656 (72) Inventor Zahuroo, Linda, El. 63122 Kirkwood, Missouri, United States. Maple 126 (72) Inventor Fen, Edinh United States 63130 Mission Court, St. Louis, Missouri 423 (72) Inventor McCann, John, P. United States 63038 St. Louis, Missouri, Bubbler Meadows Drive 18612 (72) Inventor Baum, Charles 6312 Mason Knorr Road, St. Louis, Missouri, United States 63131 McFarter, Charles, A. United States 63011 Wildwood, Missouri Thunderhead Canyon Court 16564

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．式 [式中、 位置17におけるXaaは、Ser，Lys，Gly，Asp，Met，GlnまたはArgであり、 位置18におけるXaaは、Asn，His，Leu，Ile，Phe，ArgまたはGlnであり、 位置19におけるXaaは、Met，Phe，Ile，Arg，Gly，AlaまたはCysであり、 位置20におけるXaaは、Ile，Cys，Gln，Glu，Arg，ProまたはAlaであり、 位置21におけるXaaは、Asp，Phe，Lys，Arg，Ala，Gly，Glu，Gln，Asn，Thr ，SerまたはValであり、 位置22におけるXaaは、Glu，Trp，Pro，Ser，Ala，His，Asp，Asn，Gln，Leu ，ValまたはGlyであり、 位置23におけるXaaは、Ile，Val，Ala，Gly，Trp，Lys，Phe，Leu，Serまたは Argであり、 位置24におけるXaaは、Ile，Gly，Val，Arg，Ser，PheまたはLeuであり、 位置25におけるXaaは、Thr，His，Gly，Gln，Arg，ProまたはAlaであり、 位置26におけるXaaは、His，Thr，Phe，Gly，Arg，AlaまたはTrpであり、 位置27におけるXaaは、Leu，Gly，Arg，Thr，SerまたはAlaであり、 位置28におけるXaaはLys，Arg，Leu，Gln，Gly，Pro，ValまたはTrpであり、 位置29におけるXaaはGln，Asn，Leu，Pro，ArgまたはValであり、 位置30におけるXaaはPro，His，Thr，Gly，Asp，Gln，Ser，LeuまたはLysであ り、 位置31におけるXaaは、Pro，Asp，Gly，Ala，Arg，LeuまたはGlnであり、 位置32におけるXaaはLeu，Val，Arg，Gln，Asn，Gly，AlaまたはGluであり、 位置33におけるXaaはPro，Leu，Gln，Ala，ThrまたはGluであり、 位置34におけるXaaは、Leu，Val，Gly，Ser，Lys，Glu，Gln，Thr，Arg，Ala ，Phe，IleまたはMetであり、 位置35におけるXaaは、Leu，Ala，Gly，Asn，Pro，GlnまたはValであり、 位置36におけるXaaはAsp，LeuまたはValであり、 位置37におけるXaaはPhe，Ser，Pro，TrpまたはIleであり、 位置38におけるXaaはAsnまたはAlaであり、 位置40におけるXaaはLeu，TrpまたはArgであり、 位置41におけるXaaは、Asn，Cys，Arg，Leu，His，MetまたはProであり、 位置42におけるXaaは、Gly，Asp，Ser，Cys，Asn，Lys，Thr，Leu，Val，Glu ，Phe，Tyr，Ile，MetまたはAlaであり、 位置43におけるXaaは、Glu，Asn，Tyr，Leu，Phe，Asp，Ala，Cys，Gln，Arg ，Thr，GlyまたはSerであり、 位置44におけるXaaは、Asp，Ser，Leu，Arg，Lys，Thr，Met，Trp，Glu，Asn ，Gln，AlaまたはProであり、 位置45におけるXaaは、Glu，Pro，Phe，Val，Met，Leu，Thr，Lys，Trp，Asp ，Asn，Arg，Ser，Ala，Ile，GlnまたはHisであり、 位置46におけるXaaは、Asp，Phe，Ser，Thr，Cys，Glu，Asn，Gln，Lys，His ，Ala，Tyr，Ile，ValまたはGlyであり、 位置47におけるXaaは、Ile，Gly，Val，Ser，Arg，ProまたはHisであり、 位置48におけるXaaは、Leu，Ser，Cys，Arg，Ile，His，Phe，Glu，Lys，Thr ，Ala，Met，ValまたはAsnであり、 位置49におけるXaaはMet，Arg，Ala，Gly，Pro，Asn，HisまたはAspであり、 位置50におけるXaaは、Glu，Leu，Thr，Asp，Tyr，Lys，Asn，Ser，Ala，Ile ，Val，His，Phe，MetまたはGlnであり、 位置51におけるXaaは、Asn，Arg，Met，Pro，Ser，ThrまたはHisであり、 位置52におけるXaaは、Asn，His，Arg，Leu，Gly，SerまたはThrであ り、 位置53におけるXaaは、Leu，Thr，Ala，Gly，Glu，Pro，Lys，SerまたはMetで あり、 位置54におけるXaaは、Arg，Asp，Ile，Ser，Val，Thr，Gln，Asn，Lys，His ，AlaまたはLeuであり、 位置55におけるXaaは、Arg，Thr，Val，Ser，LeuまたはGlyであり、 位置56におけるXaaは、Pro，Gly，Cys，Ser，Gln，Glu，Arg，His，Thr，Ala ，Tyr，Phe，Leu，ValまたはLysであり、 位置57におけるXaaはAsnまたはGlyであり、 位置58におけるXaaは、Leu，Ser，Asp，Arg，Gln，ValまたはCysであり、 位置59におけるXaaは、Glu，Tyr，His，Leu，ProまたはArgであり、 位置60におけるXaaは、Ala，Ser，Pro，Tyr，AsnまたはThrであり、 位置61におけるXaaは、Phe，Asn，Glu，Pro，Lys，ArgまたはSerであり、 位置62におけるXaaはAsn，His，Val，Arg，Pro，Thr，AspまたはIleであり、 位置63におけるXaaはArg，Tyr，Trp，Lys，Ser，His，ProまたはValであり、 位置64におけるXaaは、Ala，Asn，Pro，SerまたはLysであり、 位置65におけるXaaは、Val，Thr，Pro，His，Leu，PheまたはSerであり、 位置66におけるXaaは、Lys，Ile，Arg，Val，Asn，GluまたはSerであり、 位置67におけるXaaはSer，Ala，Phe，Val，Gly，Asn，Ile，ProまたはHisであ り、 位置68におけるXaaはLeu，Val，Trp，Ser，Ile，Phe，ThrまたはHisであり、 位置69におけるXaaは、Gln，Ala，Pro，Thr，Glu，Arg，Trp，Glyま たはLeuであり、 位置70におけるXaaは、Asn，Leu，Val，Trp，ProまたはAlaであり、 位置71におけるXaaは、Ala，Met，Leu，Pro，Arg，Glu，Thr，Gln，Trpまたは Asnであり、 位置72におけるXaaはSer，Glu，Met，Ala，His，Asn，ArgまたはAspであり、 位置73におけるXaaはAla，Glu，Asp，Leu，Ser，Gly，ThrまたはArgであり、 位置74におけるXaaは、Ile，Met，Thr，Pro，Arg，GlyまたはAlaであり、 位置75におけるXaaは、Glu，Lys，Gly，Asp，Pro，Trp，Arg，Ser，Glnまたは Leuであり、 位置76におけるXaaは、Ser，Val，Ala，Asn，Trp，Glu，Pro，GlyまたはAspで あり、 位置77におけるXaaは、Ile，Ser，Arg，ThrまたはLeuであり、 位置78におけるXaaは、Leu，Ala，Ser，Glu，Phe，GlyまたはArgであり、 位置79におけるXaaはLys，Thr，Asn，Met，Arg，Ile，GlyまたはAspであり、 位置80におけるXaaはAsn，Trp，Val，Gly，Thr，Leu，GluまたはArgであり、 位置81におけるXaaはLeu，Gln，Gly，Ala，Trp，Arg，ValまたはLysであり、 位置82におけるXaaは、Leu，Gln，Lys，Trp，Arg，Asp，Glu，Asn，His，Thr ，Ser，Ala，Tyr，Phe，Ile，MetまたはValであり、 位置83におけるXaaは、Pro，Ala，Thr，Trp，ArgまたはMetであり、 位置84におけるXaaは、Cys，Glu，Gly，Arg，MetまたはValであり、 位置85におけるXaaは、Leu，Asn，ValまたはGlnであり、 位置86におけるXaaは、Pro，Cys，Arg，AlaまたはLysであり、 位置87におけるXaaは、Leu，Ser，TrpまたはGlyであり、 位置88におけるXaaは、Ala，Lys，Arg，ValまたはTrpであり、 位置89におけるXaaは、Thr，Asp，Cys，Leu，Val，Glu，His，AsnまたはSerで あり、 位置90におけるXaaはAla，Pro，Ser，Thr，Gly，Asp，IleまたはMetであり、 位置91におけるXaaはAla，Pro，Ser，Thr，Phe，Leu，AspまたはHisであり、 位置92におけるXaaは、Pro，Phe，Arg，Ser，Lys，His，Ala，Gly，Ileまたは Leuであり、 位置93におけるXaaはThr，Asp，Ser，Asn，Pro，Ala，LeuまたはArgであり、 位置94におけるXaaは、Arg，Ile，Ser，Glu，Leu，Val，Gln，Lys，His，Ala またはProであり、 位置95におけるXaaは、His，Gln，Pro，Arg，Val，Leu，Gly，Thr，Asn，Lys ，Ser，Ala，Trp，Phe，IleまたはTyrであり、 位置96におけるXaaは、Pro，Lys，Tyr，Gly，IleまたはThrであり、 位置97におけるXaaは、Ile，Val，Lys，AlaまたはAsnであり、 位置98におけるXaaは、His，Ile，Asn，Leu，Asp，Ala，Thr，Glu，Gln，Ser ，Phe，Met，Val，Lys，Arg，TyrまたはProであり、 位置99におけるXaaは、Ile，Leu，Arg，Asp，Val，Pro，Gln，Gly，Ser，Phe またはHisであり、 位置100におけるXaaはLys，Tyr，Leu，His，Arg，Ile，Ser，GlnまたはProで あり、 位置101におけるXaaはAsp，Pro，Met，Lys，His，Thr，Val，Tyr，Glu，Asn， Ser，Ala，Gly，Ile，LeuまたはGlnであり、 位置102におけるXaaは、Gly，Leu，Glu，Lys，Ser，TyrまたはProであり、 位置103におけるXaaは、AspまたはSerであり、 位置104におけるXaaはTrp，Val，Cys，Tyr，Thr，Met，Pro，Leu，Gln，Lys， Ala，PheまたはGlyであり、 位置105におけるXaaはAsn，Pro，Ala，Phe，Ser，Trp，Gln，Tyr，Leu，Lys， Ile，AspまたはHisであり、 位置106におけるXaaは、Glu，Ser，Ala，Lys，Thr，Ile，GlyまたはProであり 、 位置108におけるXaaはArg，Lys，Asp，Leu，Thr，Ile，Gln，His，Ser，Alaま たはProであり、 位置109におけるXaaは、Arg，Thr，Pro，Glu，Tyr，Leu，SerまたはGlyであり 、 位置110におけるXaaはLys，Ala，Asn，Thr，Leu，Arg，Gln，His，Glu，Serま たはTrpであり、 位置111におけるXaaはLeu，Ile，Arg，AspまたはMetであり、 位置112におけるXaaは、Thr，Val，Gln，Tyr，Glu，His，SerまたはPheであり 、 位置113におけるXaaはPhe，Ser，Cys，His，Gly，Trp，Tyr，Asp，Lys，Leu， Ile，ValまたはAsnであり、 位置114におけるXaaは、Tyr，Cys，His，Ser，Trp，ArgまたはLeuであり、 位置115におけるXaaはLeu，Asn，Val，Pro，Arg，Ala，His，Thr，TrpまたはM etであり、 位置116におけるXaaはLys，Leu，Pro，Thr，Met，Asp，Val，Glu，Arg，Trp， Ser，Asn，His，Ala，Tyr，Phe，GlnまたはIleであり、 位置117におけるXaaは、Thr，Ser，Asn，Ile，Trp，LysまたはProであり、 位置118におけるXaaは、Leu，Ser，Pro，Ala，Glu，Cys，AspまたはTyrであり 、 位置119におけるXaaは、Glu，Ser，Lys，Pro，Leu，Thr，TyrまたはArgであり 、 位置120におけるXaaは、Asn，Ala，Pro，Leu，His，ValまたはGlnであり、 位置121におけるXaaは、Ala，Ser，Ile，Asn，Pro，Lys，AspまたはGlyであり 、 位置122におけるXaaはGln，Ser，Met，Trp，Arg，Phe，Pro，His，Ile，Tyrま たはCysであり、 位置123におけるXaaは、Ala，Met，Glu，His，Ser，Pro，TyrまたはLeuであり 、 Xaaで表示された0〜44のアミノ酸はネイティブな（１〜133）ヒトインターロ イキン-3の相当するアミノ酸とは異なり、Ｎ末端からの1〜14のアミノ酸および ／またはＣ末端からの1〜15のアミノ酸は所望により欠失していてもよく、 Ｎ末端は、直接またはＮ末端をＣ末端に接続できるリンカー（Ｌ）を介してＣ 末端に接続され、新しいＣおよびＮ末端をアミノ酸をそれぞれ： に有する］の修飾ヒトインターロイキン-3アミノ酸配列からなるヒトインターロ イキン-3受容体アゴニストポリペプチドであり、さらに上記修飾ヒトインターロ イキン-3受容体アゴニストは直前に（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）または（ メチオニン^-2，アラニン^-1）が先行していてもよいインターロイキン-3受容体ア ゴニストポリペプチド。 ２．リンカー（Ｌ）は からなる群より選択される「請求項１」記載のインターロイキン-3受容体アゴニ ストポリペプチド。 ３．以下のポリペプチド の群から選択される「請求項１」記載のインターロイキン-3受容体アゴニストポ リペプチド。 ４．「請求項１」記載のインターロイキン-3受容体アゴニストポリペプチドを コードする配列からなる核酸分子。 ５．「請求項２」記載のインターロイキン-3受容体アゴニストポリペプチドを コードする配列からなる核酸分子。 ６．「請求項３」記載のインターロイキン-3受容体アゴニストポリペプチドを コードする配列からなる核酸分子。 ７．以下のヌクレオチド配列 から選択されるインターロイキン-3受容体アゴニストポリペプチドをコードする 配列からなる核酸分子。 ８．「請求項４〜７」のいずれかに記載の核酸分子からなる複製が可能なベク ター。 ９．「請求項８」記載のベクターからなる宿主細胞。 10．ヒトインターロイキン-3受容体アゴニストポリペプチドを製造する方法に おいて、「請求項９」記載の宿主細胞を上記ポリペプチドの発現に適当な条件下 に培養する工程および上記ポリペプチドを回収する工程からなる方法。 11．「請求項１〜４」のいずれかに記載のポリペプチドおよび医薬的に許容さ れる担体からなる組成物。 12．「請求項１〜４」のいずれかに記載のポリペプチド、コロニー刺激因子お よび医薬的に許容される担体からなる組成物。 13．「請求項１〜４」のいずれかに記載のポリペプチド；ＧＭ-ＣＳＦ，Ｇ− ＣＳＦ，Ｇ-ＣＳＦ Ser¹⁷，ｃ-ｍｐｌリガンド，Ｍ-ＣＳＦ，エリスロポエチン （ＥＰＯ），ＩＬ-1，ＩＬ-4．ＩＬ-2．ＩＬ-3．ＩＬ-5．ＩＬ-6，ＩＬ-7，ＩＬ -9，ＩＬ-10，ＩＬ-11，ＩＬ-12，ＩＬ-13，ＩＬ-15，ＬＩＦ，ｆｌｔ３/ｆｌｋ ２リガンド，ヒト成長ホルモン，Ｂ-細胞成長因子，Ｂ-細胞分化因子，好酸球分 化因子および幹細胞因子からなる群より選択されるコロニー刺激因子、ならびに 医薬的に許容される担体からなる組成物。 14．患者の造血細胞の産生を刺激する方法において、その患者に「請求項１〜 ４」のいずれかに記載のポリペプチドを投与する工程からなる方法。 15．患者の造血細胞の産生を刺激する方法において、その患者に「請求項11〜 13」のいずれかに記載の組成物を投与する工程からなる方法。 16．幹細胞を選択的にエキソビボ展開させる方法において、 （ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｂ）分離した幹細胞を「請求項１〜４」のいずれかに記載のポリペプチドか らなる選択された培養培地で培養し、ついで （ｃ）上記培養細胞を収穫する 工程からなる方法。 17．幹細胞を選択的にエキソビボ展開させる方法において、 （ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｂ）分離した幹細胞を「請求項11」記載の組成物からなる選択された培養培 地で培養し、ついで （ｃ）上記培養細胞を収穫する 工程からなる方法。 18．造血障害を有する患者の処置方法において、 （ａ）幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を「請求項１〜４」のいずれかに記載のポリペプチドか らなる選択された培養培地で培養し、 （ｄ）上記培養細胞を収穫し、ついで （ｅ）上記培養細胞を患者に移植する 工程からなる方法。 19．造血障害を有する患者の処置方法において、 （ａ）幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を「請求項11〜13」のいずれかに記載の組成物からなる 選択された培養培地で培養し、 （ｄ）上記培養細胞を収穫し、ついで （ｅ）上記培養細胞を患者に移植する 工程からなる方法。 20．ヒト遺伝子療法において、 （ａ）患者から幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を「請求項１〜４」のいずれかに記載の造血タンパク質 からなる選択された培養培地で培養し、 （ｄ）上記培養細胞にＤＮＡを導入し、 （ｅ）上記形質導入した細胞を採取し、ついで （ｆ）上記形質導入細胞を患者に移植する 工程からなる方法。 21．ヒト遺伝子療法において、 （ａ）患者から幹細胞を採取し、 （ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、 （ｃ）分離した幹細胞を「請求項11〜13」のいずれかに記載の組成物からなる 選択された培養培地で培養し、 （ｄ）上記培養細胞にＤＮＡを導入し、 （ｅ）上記形質導入細胞採取し、ついで （ｆ）上記形質導入細胞を患者に移植する 工程からなる方法。[Claims] 1. formula Wherein Xaa at position 17 is Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln or Arg; Xaa at position 18 is Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg or Gln; Xaa at position is Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala or Cys; Xaa at position 20 is Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro or Ala; Xaa at position 21 is Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser or Val; Xaa at position 22 is Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Xaa at position 23 is Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser or Arg; Xaa at position 24 is Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Xaa at position 25 is Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro or Ala; Xaa at position 26 is His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala or Trp; Xaa at position 27 is Leu, Gly Arg, Thr, Ser or Ala; Xaa at position 28 is Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val or Trp; Xaa at position 29 is Gln, Asn, Leu, Pro, Arg or Val. Xaa at position 30 is Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu or Lys; Xaa at position 31 is Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu or Gln; Xaa at position 32 is Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala or Glu; Xaa at position 33 is Pro, Leu, Gln, Ala, Thr or Glu; Xaa at position 34 is Leu, Val , Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile or Met, Xaa at position 35 is Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln or Val at position 36 Xaa is Asp, Leu or Val; Xaa at position 37 is Phe, Ser, Pro, Trp or Ile; Xaa at position 38 is Asn or Ala; Xaa at position 40 is Leu, Trp or Xaa at position 41 is Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met or Pro; Xaa at position 42 is Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met or Ala; Xaa at position 43 is Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly or Ser; Xaa at position is Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala or Pro; Xaa at position 45 is Glu, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Gln or His; Xaa at position 46 is Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val or Gly; Xaa at position 47 is Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro or His; Xaa at position 48 is Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val or Asn; Xaa in the formula is Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His or Asp. Xaa at position 50 is Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His. , Phe, Met or Gln; Xaa at position 51 is Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr or His; Xaa at position 52 is Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser or Thr. Xaa at position 53 is Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser or Met; Xaa at position 54 is Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn , Lys, His, Ala or Leu, Xaa at position 55 is Arg, Thr, Val, Ser, Leu or Gly; Xaa at position 56 is Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg , His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val or Lys; Xaa at position 57 is Asn or Gly; Xaa at position 58 is Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val or Cys. Xaa at position 59 is Glu, Tyr, His, Leu, Pro or Arg; Xaa at position 60 is Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn or Thr; Xaa at position 61 is Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg or Xaa at position 62 is Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp or Ile; Xaa at position 63 is Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro or Val; Xaa at position 64 is Ala, Asn, Pro, Ser or Lys; Xaa at position 65 is Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe or Ser; Xaa at position 66 is Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu or Ser; Xaa at position 67 is Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro or His; Xaa at position 68 is Leu, Val, Trp, Ser, Xaa at position 69 is Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly or Leu; Xaa at position 70 is Asn, Leu, Val, Trp, Ile, Phe, Thr or His. With Pro or Ala Xaa at position 71 is Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp or Asn; Xaa at position 72 is Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg or Asp Xaa at position 73 is Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr or Arg; Xaa at position 74 is Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly or Ala; Xaa at position is Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln or Leu, and Xaa at position 76 is Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly or Asp. Xaa at position 77 is Ile, Ser, Arg, Thr or Leu; Xaa at position 78 is Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly or Arg; Xaa at position 79 is Lys, Thr , Asn, Met, Arg, Ile, Gly or Asp, Xaa at position 80 is Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu or Arg, and Xaa at position 81 is Leu, Gln, Gly, Ala. , Trp, Arg, Val and Lys; Xaa at position 82 is Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met or Val; Is Pro, Ala, Thr, Trp, Arg or Met; Xaa at position 84 is Cys, Glu, Gly, Arg, Met or Val; Xaa at position 85 is Leu, Asn, Val or Gln. Xaa at position 86 is Pro, Cys, Arg, Ala or Lys; Xaa at position 87 is Leu, Ser, Trp or Gly; Xaa at position 88 is Ala, Lys, Arg, Val or Xaa at position 89 is Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn or Ser; Xaa at position 90 is Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile or Met Xaa at position 91 is Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp or His; Xaa at position 92 is Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile or Leu, Xaa at position 93 is Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu or Arg; Xaa at position 94 is Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala or Pro Xaa at position 95 is His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile or Tyr; Xaa at position 96 is Proa , Lys, Tyr, Gly, Ile or Thr; Xaa at position 97 is Ile, Val, Lys, Ala or Asn; Xaa at position 98 is His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr , Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr or Pro; Xaa at position 99 is Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe or His Xaa at position 100 is Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln or Pro, and Xaa at position 101 is Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu. , Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu or Gln Xaa at 102 is Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr or Pro; Xaa at position 103 is Asp or Ser; Xaa at position 104 is Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Xaa at position 105 is Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe or Gly; Xaa at position 105 is Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp or His; Xaa at 106 is Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly or Pro; Xaa at position 108 is Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala or Pro. Xaa at position 109 is Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser or Gly; Xaa at position 110 is Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser. Or Trp; Xaa at position 111 is Leu, Ile, Arg, Asp or Met; Xaa at position 112 is Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser or Phe; Is Phe, Ser, Cy s, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val or Asn; Xaa at position 114 is Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg or Leu; Xaa at position 115 Is Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp or Met, and Xaa at position 116 is Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser. , Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln or Ile; Xaa at position 117 is Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys or Pro; Xaa at position 118 is Leu, Ser, Pro , Ala, Glu, Cys, Asp or Tyr; Xaa at position 119 is Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr or Arg; Xaa at position 120 is Asn, Ala, Pro, Leu , His, Val or Gln; Xaa at position 121 is Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp or Gly; Xaa at position 122 is Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr or Cys, position 12 Xaa in 3 is Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr or Leu, and the amino acids 0 to 44 represented by Xaa are the corresponding amino acids of native (1-133) human interleukin-3 Alternatively, 1-14 amino acids from the N-terminus and / or 1-15 amino acids from the C-terminus may be deleted as desired, and the N-terminus can be directly or connect the N-terminus to the C-terminus Connected to the C-terminus via a linker (L), the new C- and N-terminus have amino acids respectively: Modified human interleukin in] with the interleukin -3 is a human interleukin-3 receptor agonist polypeptide consisting of the amino acid sequence, further the said modified human interleukin-3 receptor agonist just prior (methionine ^-1), (alanine ^{- 1} ) or an interleukin-3 receptor agonist polypeptide optionally preceded by (methionine- ² , alanine- ¹ ). 2. The linker (L) The interleukin-3 receptor agonist polypeptide according to claim 1, which is selected from the group consisting of: 3. The following polypeptides The interleukin-3 receptor agonist polypeptide according to claim 1, which is selected from the group consisting of: 4. A nucleic acid molecule comprising a sequence encoding the interleukin-3 receptor agonist polypeptide according to claim 1. 5. A nucleic acid molecule comprising a sequence encoding the interleukin-3 receptor agonist polypeptide according to claim 2. 6. A nucleic acid molecule comprising a sequence encoding the interleukin-3 receptor agonist polypeptide according to claim 3. 7. The following nucleotide sequence A nucleic acid molecule consisting of a sequence encoding an interleukin-3 receptor agonist polypeptide selected from the group consisting of: 8. A replicable vector comprising the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 7. 9. A host cell comprising the vector according to claim 8. Ten. A method for producing a human interleukin-3 receptor agonist polypeptide, comprising the steps of culturing the host cell according to claim 9 under conditions suitable for expression of the polypeptide, and recovering the polypeptide. Method. 11． A composition comprising the polypeptide according to any one of claims 1 to 4 and a pharmaceutically acceptable carrier. 12． A composition comprising the polypeptide according to any one of claims 1 to 4, a colony stimulating factor, and a pharmaceutically acceptable carrier. 13. Polypeptide according to any one of "claims 1 to 4"; GM-CSF, G- CSF, G-CSF Ser 17, c-mpl ligand, M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL- Four. IL-2. IL-3. IL-5. IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3 / flk2 ligand, human growth hormone, B-cell growth factor, A composition comprising a colony stimulating factor selected from the group consisting of B-cell differentiation factor, eosinophil differentiation factor and stem cell factor, and a pharmaceutically acceptable carrier. 14. A method for stimulating hematopoietic cell production in a patient, the method comprising administering to the patient the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. 15． A method for stimulating the production of hematopoietic cells of a patient, the method comprising administering to the patient the composition according to any one of claims 11 to 13. 16． In a method for selectively expanding stem cells ex vivo, (a) separating stem cells from other cells, and (b) selecting the isolated stem cells from the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. (C) harvesting the cultured cells. 17． In a method for selectively developing stem cells ex vivo, (a) separating stem cells from other cells, and (b) culturing the separated stem cells in a selected culture medium comprising the composition according to claim 11. And (c) harvesting the cultured cells. 18． A method for treating a patient having a hematopoietic disorder, comprising: (a) collecting stem cells; (b) separating stem cells from other cells; and (c) separating the separated stem cells according to any one of claims 1 to 4. Culturing in a selected culture medium comprising a polypeptide, (d) harvesting the cultured cells, and (e) transplanting the cultured cells into a patient. 19. A method for treating a patient having a hematopoietic disorder, comprising: (a) collecting stem cells; (b) separating stem cells from other cells; and (c) separating the separated stem cells according to any one of claims 11 to 13. Culturing in a selected culture medium comprising the composition, (d) harvesting the cultured cells, and (e) transplanting the cultured cells into a patient. 20. In human gene therapy, (a) collecting stem cells from a patient, (b) separating stem cells from other cells, and (c) separating the separated stem cells from the hematopoietic protein according to any one of claims 1 to 4. (D) introducing DNA into the cultured cells, (e) collecting the transduced cells, and (f) transplanting the transduced cells into a patient. Method. twenty one. In human gene therapy, (a) collecting stem cells from a patient, (b) separating stem cells from other cells, and (c) separating the separated stem cells from the composition according to any one of claims 11 to 13. Culturing in a selected culture medium, (d) introducing DNA into the cultured cells, (e) collecting the transduced cells, and (f) transplanting the transduced cells into a patient.