JP2000507947A

JP2000507947A - 無細胞性赤血球代用物を製造する方法及び装置

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Publication number: JP2000507947A
Application number: JP9534650A
Authority: JP
Inventors: イーデウォスキンリチャード; ディーダブルデイマーク
Original assignee: ノースフイールドラボラトリーズインコーポレイテツド
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2000-06-27
Also published as: NO324121B1; CN1219939A; AP1028A; US20050065067A1; DE69722422D1; RO121089B1; EP0928294A1; BG102810A; DK0928294T3; BR9708388A; CZ310098A3; US20030191050A1; UA64710C2; IS4854A; SK134398A3; PT928294E; CN1129608C; AU2425397A; US7521417B2; IL126376A

Abstract

(57)【要約】実質的にテトラー不含の、実質的にストローマ不含の、重合した、ピリドキシル化されたヘモグロビンの製造方法を開示する。また、ヒトの患者に約５リットル以下の量で注入することができる実質的にテトラマー不含の、実質的にストローマ不含の、重合した、ピリドキシル化されたヘモグロビン生成物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】無細胞性赤血球代用物を製造する方法及び装置発明の分野本発明は、無細胞性赤血球代用製品、即ちヘモクロビン製品を製造する方法及び装置に関する。更に、本発明は、ストローマ性汚染物質を有しない、主としてテトラマー不含の、重合した、ピリドキシル化されたヘモクロビン溶液に関する。従来の技術数十年来、血液バンクは、外傷又はその他の状況のために手術中に全血を提供して来た。しかしながら、ヒトのドナーから得られた全血は種々の使用のためには不適当である。特に、全血の使用は、ドナー型、安定性及び貯蔵寿命の問題及びウイルス及び他の汚染物質により惹起される毒性に対する要求のために問題がある。これらの問題は、特に軍による血液の使用のような、緊急の状況に関する。従って、ヒトのドナーから得られる全血のための代用物の開発に多大な努力がなされて来た。この努力は、ヒト又はその他の哺乳類源からの血液に対する多種多様な変性を生じた。ストローマ不含のへモクロビンは、当業者には酸素輸送及び可逆的酸素（又はリガンド）結合能力を有することは公知である。毒性問題が血液代用物としての使用を排除して来たので、ストローマ不含のヘモクロビンには非毒性の、有用な製薬学的製品の対する更なる変性が要求された。これらの変性は、（１）ストローマ及びストローマ汚染物質不含又は実質的に不含のヘモクロビンを提供する、（２）ピリドキシル化、（３）重合又は架橋、（４）テトラマーの除去及び（５）一酸化炭素又はその他のリガンドでの変性を包含する。しかしながら、これらの技術によって製造されたヘモクロビンは、生命を維持するために酸素の十分量を輸送する能力を有しているが、多くの好ましくない副作用及び特性の欠点を有する。例えば、主な障害となる副作用は、腎臓機能の減退である。これらの変化は、細菌の内毒素又は赤血球膜の断片（ストローマ）のような望ましくない汚染物質の存在に基づくものと考えられていた。このような汚染物質は確かに腎臓の変質を惹起するが、前記の汚染物質を実質的に不含のヘモクロビン溶液はなお重大な腎臓の機能障害を生じる。腎臓機能障害のための原因は、生理的に受容されない量の未重合のヘモクロビンテトラマーに起因せしめられた。テトラマーのヘモクロビンの注入の他の好ましくない副作用は、血管収縮、血球素尿症、心拍度数の低下、平均動脈血圧の上昇及び特に腹腔内への注入物の溢出である。実際に、全体的に毒性問題を回避することにおいては、公知のヘモクロビン誘発血液代用物は成功していない。また、これらの製品は、ヒトの患者に投与した後の許容できない程の低い半減期を有する。このような半減期は、短期間に亙る血液容量の置換反復性を必要とする。従って、患者にとって無毒性でありかつ投与後の十分な半減期を有するヘモクロビン製品に対する重大な必要性が存在する。勿論、これらの製品は全血により達成されるような組織に対する酸素の可逆的輸送を行うことができるべきである。発明の概要本発明は、ヒトに対して無毒性でありかつヒトに投与した場合に少なくとも１５時間の実質的半減期を有するヘモグロビン代用物を提供することにある。本発明のヘモグロビンは、ストローマ不含の、ピリドキシル化されかつ重合しており、並びにウイルス性及び他の毒性汚染物質不含である。更に、これらの生成物は、実質的に白血球（白血球細胞）及び血小板不含である。本発明はまた、本発明によるヘモグロビン代用物を製造するための方法に関する。該方法は、血液から白血球及び血小板を除去すること、赤血球を洗浄及び溶解すること、ストローマ性汚染物質及びストローマを濾過及び熱処理により除去すること、ヘモグロビンのデオキシ形を製造すること及びピリドキシル化及び重合、更に精製及び濃縮、及び脱酸素化を包含する。次いで、生じるヘモグロビン生成物は、正常な生理学的範囲内の種々の電解質のレベルを有するヘモグロビン製品を提供するために製剤化することができる。本発明はまた、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンの水性製剤に関し、この場合ヘモグロビンは、図３の平均分子量プロフィールを有する、テトラマー材料を含有するグルタルアルデヒド重合したヘモグロビンである。この製剤は、無細胞性赤血球構造を調製するために使用することができる。この態様においては、テトラマーを除去するために該製剤を精製しかつ次いで適当な量の電解質と合して生理学的に認容される無細胞性の赤血球代用物を製造し、該代用物は、次いで酸素担体の注入を必要とするヒトを治療するために使用することができる。図面の簡単な説明図１は、ピリドキシル化及び重合のために製造された脱酸素化したヘモグロビンを得るために使用される工程及び装置の部分を示す略示図である。図２は、ピリドキシル化及び重合で開始しかつ脱酸素化され、精製し、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビン生成物を生じる工程及び装置の部分、及び電解質の生理学的レベルを有する最終的ヘモグロビン製品を調製するために使用される工程及び装置の部分を示す略示図である。図３は、精製前のグリシン処理後の重合した材料のＨＰＬＣトレースである。重合した生成物は、保留時間（ＲＴ）１５．５７，１６．０８，１７．００及び１８．１９でのピークにより示されている。テトラマー材料は、ＲＴ１９．８８及び２０．５１により示されている。ポリマーは、この材料の７６．２％である。図４は、本発明によるヘモグロビン生成物のＨＰＬＣトレースを示す図である。重合したヘモグロビンは、ＲＴ１５．７，１６．３３，１７．３２及び１８．５６のピークで示されている。テトラマーは、ＲＴ２１．１８のピークで示されている。図５は、本発明で使用したカラムクロマトグラフィー精製工程を示す略示図である。図６は、本発明で使用した膜精製工程を示す略示図である。本発明の詳細な説明本発明は、実質的にストローマ、ストローマ性汚染物質及びその他の汚染物質を有しない、主としてテトラマー不含の、架橋、重合、ピリドキシル化したヘモクロビンからなる無細胞性赤血球代用物に関する。以下に使用する用語「架橋」は、分子の形状、寸法、機能又は物理的特性を変化させる目的を有する分子上もしくは内への又は分子間の分子の「橋」の化学的位置を意味する。架橋した分子は、重合していてもよく又はしていなくてもよい、即ち架橋した分子はテトラマーであってよい。以下に使用する用語「テトラマー」は、約６４Ｋｄの分子量を有するヘモグロビン分子に関する；即ち、この用語は、天然のかつ分子内架橋したヘモグロビン分子の両者に関する。以下に使用する用語「実質的にテトラマー不含」は、哺乳類に投与したテトラマーに対する特定の生物学的反応がもはや存在しないテトラマー濃度に関する純度のレベルを表す。主な基準は、製薬学的に有効な量を注入した場合、腎臓機能における変化が存在しないことである、即ち、約９９％又はそれ以上（テトラマー約１％未満は存在する）である。本発明による方法により製造された有利な生成物は、全ヘモグロビン（ＴＨｂ）の重量を基準としてテトラマー約０．８％以上は含有しない。換言すれば、本発明による実質的テトラマー不含の生成物は、未重合のヘモグロビンの生理学的に認容されない量より多くは含有しない。本発明の特に有利な生成物は、テトラマー約０．５％未満を含有する、本発明の最も特に有利な生成物は、テトラマー約０．３〜０．４％を含有する。このような量のテトラマーは、生理学的に認容されることが判明している。以下に使用する用語「超精製生成物」又は「精製生成物」は、用語「実質的にテトラマー不含」と同じ意味を有する。以下に使用する全ヘモグロビン（ＴＨｂ）％は、ヘモグロビンｇ／溶液１００ｍｌとして定義される。以下に使用する用語「重合する溶液」は、生化学的に適するキャリヤ内の「架橋剤」又は重合剤、例えばグルタルアルデヒド、イミドエステル、ジアスピリン又はその他を意味する。以下に使用する用語「重合した」は、生じた重合した分子の寸法が天然又はテトラマーヘモグロビンを基準として増大した分子もしくはテトラマーサブユニット間の分子橋の位置を意味する。以下に使用する用語「ヘモグロビンの溶液」とは、テトラマーヘモグロビン又は重合したヘモグロビン分子（該分子は赤血球には含有されていない）の溶液を意味する。このような溶液は、赤血球ストローマ又はストローマ性汚染物質不含であるか又は実質的に不含であることを必要としない。しかしながら、有利な重合したヘモグロビン溶液は、赤血球ストローマ又はストローマ性汚染物質不含である。「半透過性膜」とは、いくらかの分子種は透過するが、その他は透過しない膜、即ち特定の分子量を排除する選択的フィルターとして作用する膜を意味する。本発明による生成物、即ち熱処理され、ウイルス的に不活性化されたヘモグロビンから製造された、実質的にテトラマー（天然又は分子内架橋した）ヘモグロビン、ストローマ性及び種々の他の汚染物質不含の重合したピリドキシル化されたヘモグロビン溶液は、生理学的に認容され並びに治療学的かつ臨床的に有用である。該生成物は、酸素輸送のために必須である可逆的酸素結合能力を有する。最も注目すべきことに、該生成物は、全血に類似した酸素−ヘモグロビン解離曲線（Ｐ₅₀）を有することに関連する方法において良好な負荷及び非負荷特性を示す。該生成物は肺を通る毛管内で高い親和力をもって酸素を結合しかつ次いで適宜に酸素を体内の組織に開放する。該生成物はまた受血者との相容性研究を必要としない。また、該生成物はヒトに投与した場合、少なくとも約１５時間、より有利には約２４時間の半減期を有する。このヘモクロビン生成物は、約３．０Ｌ以下、更には約５．０Ｌ以下の量で患者に注入することができる。換言すれば、本発明によるヘモグロビン生成物は、血管収縮、腎臓毒性、ヘモグロビン尿症、又はその他の、合成もしくは準合成酸素キャリヤ及び血液代用物の静脈内投与と関連した問題を伴うことなく、ヒトの患者の血液容量の実質的に全てを補充するために使用することができる。従って、本発明は、患者、特にヒトの患者に、患者に対して無毒性であるストローマ不含、テトラマー不含の、重合した、ピリドキシル化されたヘモグロビンの一定量（該量は少なくとも５．０Ｌ未満である）を輸注する方法を包含する。このような方法は、患者に注入又は輸注するための注入装置又は他のそのような設備に患者又は物体を設置することを包含する。本発明による方法は、収率において生成物が溶液中の全てンヘモクロビンの重量に対して、約１重量％以下、有利には０．８重量％のテトラマーのレベルを有することにおいて新規である。本発明による方法は、実質的に微生物及びウイルスの抗原及び病原体を有しない最終生成物を提供することができるという別の利点を有する。このような微生物及びウイルスの抗原及び病原体は、換言すれば、検出不能な水準まで減少せしめられる。該生成物は、合衆国薬局方ＸＸIII章（U nited States Pharmacopeia，XXIII Chapter<71>規定さている分折により決定されるように無菌である。このような抗原及び病原体の例は、例えば、細菌、リケッチア、真菌、原生動物、ウイルス及びその他の微生物を包含する。最も重要なことは、該方法は、肝炎及び後天性の免疫不全性症候群（ＡＩＤＳ）を誘発するウイルス不含の生物学的生成物を提供することである。生理学的特性に関する限り、本発明による生物学的生成物は、少なくとの約５．０Ｌ以下の量で注入する場合、血管収縮、腎臓毒性、血液素尿症及びその他の生理学的に望ましくない量のテトラマーヘモクロビンを含有する公知のヘモクロビン溶液の静脈内投与に関連した他の問題を惹起しない。ここに記載する方法により製造された生成物の静脈内投与は、尿生産における認識され得る減少、糸球体濾過速度における認識され得る低下、認識され得る腹腔内への溢出及び生産される尿の色における認識され得る変化を生じない。従って、本発明による方法は、外傷、心筋梗塞、発作、急性貧血症及び酸素欠乏症、例えば完全酸素飽和血液の対する肺の欠乏又は血管に基づく低酸素血症、低酸素症又は最終段階の酸素欠乏において有用である。また、該生成物は、蘇生液体（例えば外傷、特に主血性ショック）、脈間内容積増量剤又は交換輸血において有用である。医学的治療に加えて、該生成物は移植組織のための器官の予防において有用である。本発明は、以下の手順を包含する：１）赤血球吸引及び濾過、２）細胞洗浄／溶解、３）心臓治療、４）限外濾過、５）ガス抜き、６）化学的変性、７）精製、８）ＵＰポリ濃縮、９）脱酸素化、１０）調剤本発明による方法における有利な出発材料は、古いヒトの全血又は包装された赤血球である。古くない（indated）血液を使用することもできる。有利には、バッグに記載された有効期限を２週間以上経過して貯蔵された全血は使用すべきでない。２週間以上経過した全血の使用は、ヘモクロビンの抽出及び細胞性残留物、例えばストローマ性蛋白質及び汚染物質を除去する点で付加的な困難性を提供する。ここに記載する全ての方法は、従来の既述の範囲内の可能な僅かな変更で別の哺乳類の血液のためにも適用可能である。該方法の殆どは、約２℃〜約８℃、有利には約４℃で実施することができる。赤血球吸引及び濾過中に、赤血球（ＲＢＣ）は、空気を血液中に導入することなくドナーバッグから無菌で抽出されかつ一連のフィルターを通過して白血球及び血小板の量を減少したＲＢＣ懸濁液を生じる。次いで得られた懸濁液を細胞洗浄／溶解処理する。該懸濁液を、一酸化炭素雰囲気下で約１％のＮａＣｌ溶液で洗浄し、残留血漿蛋白質を除去する。次いで、洗浄したＲＢＣを、細胞を溶解させるために注射用水（ＷＦＩ）で処理しかつ得られた混合物をクロスフロー濾過ユニットを使用して清澄化する。次いで、清澄化した生成物を熱処理して付加的なストローマ物質を沈殿させ、濾過により除去する。この手順の生成物は、約３％（ｗ／ｖ）のＴＨＢを有するストローマ不含のヘモクロビン（ＳＦＨ）である。カルボキシヘモクロビンを含有する熱処理したかつストローマ不含の溶液を濃縮しかつガス抜きし、デオキシヘモクロビンを含有するＳＦＨ溶液を得る。ガス抜きは、まずカルボキシヘモクロビン溶液を酸素で約１６時間飽和させ、酸素添加したヘモクロビン及び、ヘモクロビンの全重量に対して約７重量％のカルボキシヘモクロビンの溶液を得る。引き続き、酸素を窒素、アルゴン又はヘリウムで追出し、遊離ヘモクロビン、即ち錯体化されていないヘモクロビン、及びヘモクロビンの全重量に対して約７重量％のオキシヘモクロビンを含有する溶液を形成する。生じたガス抜きした溶液を濾過しかつ化学変性のための容器に移す。ガス抜きに引き続き、ストローマ不含のヘモクロビン溶液を、ピリドキサール −５’−ホスフェート（Ｐ５Ｐ）を使用してピリドキサール−５’−ホスフェート対ヘモクロビンのモル比１：１〜３：１でピリドキシル化する。選択的に、ストローマ不含のヘモクロビンを、２−ノル−２ホルミルピリドキサール−５’− ホスフェートを使用してピリドキシル化してもよい。該ピリドキシル化混合物にシアノホウ水素化ナトリウム又は有利にはホウ水素化ナトリウムのような還元剤を添加する。過剰の反応剤及び塩は、発熱物質不含の水に対する透析、又は有利にはＷＦＩを用いた透析濾過により除去する。次いで、ピリドキシル化したヘモクロビンをグルタルアルデヒドで重合させる。ストローマ不含のピリドキシル化したヘモクロビンをグルタルアルデヒド水溶液を使用して重合させる。重合時間及びグルタルアルデヒドの添加量は、ヘモクロビン溶液の容量、ポリマーの所望の収率及び所望の分子量分布に依存する。一般に、長い重合時間は、ポリマーの収率及び分子量分布を増大させる。ヘモクロビンの全重量に対して、約７６重量％のポリマーの収率は、約１６〜１８時間で得られる。重合の有利な最終時点は、該溶液が、サイズ排除ＨＰＬＣでモニターして、全ヘモクロビン重量を基準として約７５重量％のポリマーを含有する時点である。選択的に、終了時点は、該溶液がヘモクロビンの仝重量に対してポリマー約６５重量％を含有する時点として規定される、即ち約２．５時間である。重合反応は、水性グリシンを添加することにより停止させる。緩衝剤は、可能な限り迅速に添加すべきでる。次いで、再び可能な限り迅速に、ホウ水素化ナトリウム水溶液を添加することにより、架橋を安定化させる。引き続き、この重合した溶液を濃縮しかつ次いで該溶液を酸素添加するために酸素の雰囲気下で透析濾過する。最後に、該溶液に、溶液がヘモクロビン約４重量％を含有するようになるまでの水を加える。本発明に基づく重合は、図３及び以下の実施例１に示すような狭い分子量範囲を有する高収率のポリマーを生じる。次いで、重合し、ピリドキシル化されたヘモクロビン溶液をカラムクロマトグラフィー、濾過、例えば膜濾過、又は両者で精製して、溶液から残留した未重合（テトラマー）ヘモクロビンを除去する。精製した重合した溶液を、次いで、ガス交換のための製法において限外濾過装置を使用して約６％に濃縮する。次いで、濃縮した溶液を窒素で脱酸素化する、脱酸素化は、約１０〜１２℃で、溶液中のオキシヘモクロビンが全ヘモクロビンの約１６重量％未満になるまで実施する。得られた脱酸素化し、精製し、かつ重合したヘモクロビン溶液を、次いで冷却容器内で窒素雰囲気下で限外濾過により濃縮する。ｐＨは約８．８〜９．０に調整し、かつ電解質の量は必要に応じて正常な血漿が示すレベルに調整する。付加的に、グルタチオン、アスコルベート又はグルコースのような慣用の酸化防止剤を場合によりに添加することもできる。該溶液を所望のレベル、有利には重合し、ピリドキシル化され、精製したテトラマー不含、ストローマ不含のヘモクロビン約１０重量％に濃縮した後に、溶液を濾過により滅菌しかつ無菌搬送装置を介して適当な製薬学的に認容される容器に移す。生じたヘモクロビン溶液の特性を以下に示す：１分光測定的に測定した重合ヘモグロビンでのレベル２浸透圧測定法により測定した重合ヘモグロビンでのレベル３イオン特異性電極により測定した重合ヘモグロビンでのレベル４原子吸収により測定した重合ヘモグロビンでのレベル５サイズ排除ＨＰＬＣにより測定した６ Association of Cape Codから市販されているアッセイを使用するＬＡＬにより測定した（アッセイ成分のカタログ番号は100-5,800-1,3100-5 である）７ＨＰＴＬＣにより測定した以下の実施例は、本発明の特定の態様を示す。しかしながら、これらの実施例は、本発明の構成及び範囲を説明することを目的としたものであって、本発明を制限することを目的としたものでは全くない。全ての温度は、他に断りのない限り、摂氏である。他に断りのない限り、例えば全ヘモクロビン（ＴＨｂ）のパーセンテージは、重量／容量（ｗ／ｖ）で示されている。また、典型的反応条件が（例えば温度、反応時間）が記載されている場合、これらの特定の範囲の上又は下の両者にある条件も、一般には好ましくないが、使用できると見なされるべきである。制限するものではないが、本発明による方法で使用される全ての容器及びタンクは、３１６Ｌのステンレススチール、特に、高度に研磨され、従って容易かつ迅速に清浄化されるようなステンレススチールの製薬学的グレードのものからなる。種々の接続導管及びチューブは、同じステンレススチール又は製薬学的グレードのテフロンもしくはシリコーンチューブから製造されている。該方法で使用されるフィルター及び膜は、Millipore Inc., Pall-Filtron又はCuno Incから市販されているものでよい。本発明の得られた生成物の半減期は、哺乳類、例えばヒトにおける生体内で測定する。典型的には、哺乳動物に生成物を注射して一定期間後に哺乳動物から血液試料を採取する。次いで、該生成物の量を、血液試料を遠心分離し、血漿画分を圧出し、血漿ヘモクロビンレベルを分光光度分析的に測定しかつ次いで哺乳動物内に残留する生成物の量を生成物の半減期に相関させることにより決定する。本発明に基づくサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣは、以下のようにして実施する：試料を、０．２ＭのｐＨ６．９燐酸カリウム緩衝液で０．２ｇ／ｄｌに希釈し、０．２μフィルターを通して濾過しかつ以下の構成部品（システムフローの順序）からなるＨＰＬＣシステムに注入する：１．パルマシア・モデル（Pharmacia model）２２４８ポンプ −移動相は０．２ＭのｐＨ６．９燐酸ナトリウムである。 −流速は１．０ｍｌ／分である。２．４５ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチューブ、内径０．０１０ｉｎ．３．２００μｌのＰＥＥＫサンプル・ループを有するレオダイン・モデル（Rh eodyne model）７７２５ｉインジェクター４．１８ｃｍＰＥＥＫ又はチタンチューブ、内径０．０１０ｉｎ．５．アップチャーチ・モデル（Upchurch model）Ａ４３１０．５μフィルター６．９ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチューブ、内径０．０１０ｉｎ．７．Phenomenex Biosep SEC S-3000 75×7.8mm Guard column ８．２４ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチューブ、内径０．０１０ｉｎ．９．Phenomenex Biosep SEC S-3000 600×7.8mm Analytical column 10．２３ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチュウーブ、内径０．０１０ｉｎ． 11.Pharmacia Uvicord SD UV detector 波長２８０ｎｍフローセル容積８μｌ、路長２．５ｍｍ範囲２ＡＵＦＳ時定数１０秒２８０ｎｍでのピーク吸収を、ＬＫＢ２２２１積分器で記録した。該積分器は、それぞれのポリマー種に対する個々のピーク面積を積分しかつ全ヘモクロビン面積を計算した。以下の実施例により、本発明を一層明確に説明する。例１図１を参照して、古い血液（全血又はパックされた赤血球）のドナーバッグ２０を適当な無菌の吸引装置２２内に設置する。１つの例として、適当な吸引装置は、２つの吸引ステーションを有するシステムである。ドナーバッグを該吸引装置に設置したら、吸引装置内の針をドナーバッグに突き刺し、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム約１５０ｍｌを導入しかつ減圧又は真空下でドナーバッグから古い血液を吸引する。吸引した血液を、深さ１００μのフィルター２４及び引き続き２つの深さ５μのフィルター２６を連続して通過させる。血液が深さ５μのフィルターを通過する際に、白血球は血液から除去される。典型的には、古い全血約１７０単位を吸引し、濾過しかつ引き続き図１に示されているようなタンクに搬送する。次いで、該フィルターを１％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム水溶液約７５リットルですすぐ。血液をタンク１に導入する前に、タンク１に１％の塩化ナトリウム水溶液７０Ｌを充填する。古い全血全部で１７０単位を吸引し、濾過しかつ搬送し、かつフィルターをすすいだ後に、タンクに４％の全ヘモクロビン溶液約２５０リットルを入れる。吸引及び濾過工程中に、タンク１を減圧、即ち２０〜２８”Ｈｇに維持する。全ての古い血液をタンク１に移した後に、真空を遮断しかつタンクに一酸化炭素を、タンクが一酸化炭素の雰囲気を含有するようになるように導入する。図１に示されているように、タンク１には０．６５μタンジェンシャル・フロー・フィルターが接続されている。４％の全ヘモクロビン溶液２５０リットルの初期の装入量を、タンジェンシャル・フロー・フィルターを通過させるマイクロ濾過により８％の全ヘモクロビン溶液約１２５Ｌに濃縮する。この地点でのヘモクロビン溶液のｐＨは、約６〜６．５である。８％の全溶液への濃縮に引き続き、該溶液を１％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム溶液を添加することにより洗浄し、透析濾過しかつ濾液を、塩化ナトリウム溶液が添加されると同じ速度で除去する。ヘモグロビン溶液１２５Ｌを典型的には１％の塩化ナトリウム溶液約８倍容量（約１０００Ｌ）で洗浄する。洗浄に引き続き、該溶液を約７０Ｌ、即ち約１４％の全ヘモクロビンに濃縮し、かつ注射用水（ＷＦＩ）を、該溶液の容量が約１８０Ｌになるまで加える。ＷＦＩの添加に伴い、細胞は膨潤しかつ破裂してヘモクロビンを溶液に放出する。生じるヘモクロビン溶液の濃度は、約５％の全ヘモクロビン（ＴＨｂ）である。生じる溶液を、タンク１にある間に清澄化する。該溶液を先ず約５０Ｌに濃縮しかつ濾液をタンク２に移す。溶液はフィルターを通過して圧送されるので、赤血球ストローマ汚染物質及び細胞壁物質は保留されかつフィルターにより除去される。タンク１内の残留溶液５０ＬをＷＦＩ約２．倍容量で洗浄する。この２．５倍容量の洗浄液をタンク２に加える。次いで、タンク１に残留する材料を約２０Ｌに濃縮しかつ該濾液をタンク２に加える。タンク２に生じる容量は、３．３％の全ヘモクロビン溶液約２８０Ｌである。次いで、生じたストローマ不含のヘモクロビンの溶液を、タンク２内で約６０〜６２℃で約１０時間熱処理する。この時間中、該溶液を適度に撹拌する。溶液を加熱しかつ約５５℃の温度で通過させると、沈殿物が形成される。次いで、生じた３．３％のＴＨｂ（ｗ／ｖ）ストローマ不含の、熱処理したヘモグロビン溶液を、０．２μのフィルター３０、引き続き０．１μのフィルター３２を通過させかつタンク３に移す。次いで、濾過したヘモグロビン溶液を約１８％のＴＨｂに濃縮しかつ引き続き４倍量のＷＦＩ（１８０Ｌ）で透析濾過する。該濃縮及び透析濾過は、１０キロドルトン（ｋｄ）分子量の限外濾過器３４を使用して実施する。限外濾過器３４と接続されたドレイン３５で濾液を捕集する。この時点で、１８％の全ヘモグロビン溶液４５Ｌは、約６〜６，５のｐＨでヘモグロビン１ｇ当たりリン脂質５０ｎｇ未満、ヘモグロビン１ｇ当たり糖脂質２ｎｇ未満、メトヘモグロビン１％未満、１ｍｌ当たり内毒素約０．０３単位未満を含有する。この溶液中のヘモグロビンは、カルボキシヘモグロビンである。次いで、生じたヘモグロビン溶液をタンク４に搬送し、ここでカルボキシヘモグロビンをまず酸化しかつ次いで脱酸素化する。タンク４には、酸素及び窒素ガス導管に結合されたガススパージリング、タンク４の頂部に配置された計量スプレー装置へのタンク底からのフィードフォームカン１に接続されたフォームオーバフロー捕集器を装備しており、それによりタンク４内に発生したフォームは、フォームカン３６に供給され、そこでフォームは液体に凝縮されかつタンク４に戻される。タンク４は、更にタンク容積のほぼ１／３に充填されたパル・リング（Pall Ring）のセットを有する。フォームカン３６は、ガスを除去するためにガス抜きを有する。タンク４内の溶液は、１３％の全ヘモグロビン溶液である。最初の酸素添加工程中に、酸素を、容器内にガスの均一な分散が行われるために十分な速度で溶液内をスパージさせる。容積２００Ｌの容器に、ガスを約２５Ｌ／分の速度でスパージさせる。カルボキシヘモグロビンの酸素添加は、得られる溶液が全ヘモグロビンの重量を基準としてカルボキシヘモグロビン５％未満を含有するように、約１６時間実施する。酸素添加は、約１０℃の温度で実施する。タンク４内に発生したフォームはフォームカン３６内に捕集しかつ沈降後、生じた溶液をタンク４に戻す。酸素添加後に、溶液を同じ窒素流で約６時間、又は全ヘモグロビンの重量に対してオキシヘモグロビン１０％未満が溶液内に残留するまで、スパージする。窒素スパージは、温度約１０℃及びｐＨ約６〜６．５で実施する。選択的に、カルボキシヘモグロビンは膜交換器を使用してデオキシヘモグロビンに転換することができる。一般にフォーミング工程から予測されるような、ヘモグロビンの変性は実質的に起こらないことに留意されるべきである。次に図２に関して説明すれば、デオキシヘモグロビン溶液を、化学変性のためにタンク５に搬送する。次いで、約４℃の溶液でデオキシヘモグロビンを有するタンク５に、ピリドキシル−５−ホスフェート（Ｐ５Ｐ）の水溶液（９３．７５ｇ／Ｌ）を１：１〜３：１のＰ５Ｐ対ヘモグロビンのモル比で加える。Ｐ５Ｐ対ヘモグロビンの２：１のモル比が有利である。ピリドキシル化は、約４℃の温度で実施する。Ｐ５Ｐ溶液は、典型的には約１分間かけて加えかつ約１５分間混合し、その後ホウ水素化ナトリウム／水酸化ナトリウム溶液を、約２０：１のホウ水素化ナトリウム対ヘモグロビンのモル比でヘモグロビン溶液に加える。適当なホウ水素化ナトリウム／水酸化ナトリウム水溶液は、２リットル当たり水酸化ナトリウム０．８ｇ及び２リットル当たりホウ水素化ナトリウム９０．８ｇを含有する。ホウ水素化物溶液は、１分間に亙り可能な限り迅速に添加しかつ１時間撹拌する。得られたピリドキシル化されたヘモグロビンの溶液５０Ｌを、引き続き１０Ｋドルトンの限外濾過器３８を使用して４倍量のＷＦＩを用いて過剰の反応体を除去する。限外濾過器３８と結合したドラム４０で、フィルター３８からの濾液を捕集する。４倍量、即ち２００ＬのＷＦＩで透析濾過した後に、ピリドキシル化されたヘモグロビンを有するタンク５に、４．５％の全ヘモグロビン溶液（ヘモグロビン溶液約１７５Ｌ）を調製するために十分な量のＷＦＩを加える。グルタルアルデヒド溶液を、ピリドキシル化されたヘモグロビン溶液に、グルタルアルデヒド対ヘモグロビンのモル比約２４：１で加える。グルタルアルデヒドは、典型的にはヘモグロビン溶液に計量ポンプにより約２．５時間かけて加える。重合反応は、約１８時間進行させる。目標分子量分布は、ポリマー約７５％及びテトラマー２５％である。目標ポリマーは、１００,０００〜３５０,０００範囲内に存在する分子量の主フラクションで約６００,０００未満の分子量分布を有する。重合反応が目標分子量分布に達すると（約１８時間後）、水性グリシン（約１６６ｇ／Ｌ）をヘモグロビンにグリシン対ヘモグロビンの１４０：１のモル比で加える（急冷“quench”として）。生じた重合したグリシン急冷ヘモグロビン生成物のＨＰＬＣトレーシングである図３参照。次いで、生じた溶液を約１０分間混合し、その後ホウ水素化ナトリウム／水酸化ナトリウム溶液（前記に定義した濃度を有する）ヘモグロビン溶液にホウ水素化ナトリウム対ヘモグロビンの２８：１のモル比で加える。この生じた混合物を約１時間撹拌する、次いで、該溶液を約５０Ｌに濃縮し（限外濾過器３８）かつ４倍量（２００Ｌ）のＷＦＩで洗浄する。濃縮した溶液にホウ水素化ナトリウムの付加的アリコートを前記に示したと同じモル比で加えかつ再び１時間混合する。得られた溶液を４倍量のＷＦＩ（２００Ｌ）で洗浄し、熱処理した、重合した、ピリドキシル化されたストローマ不含のヘモグロビンが生じる。得られた溶液を、該溶液を酸素雰囲気下に放置することにより酸素添加しかつ引き続き精製システム４２に搬送する。該精製は、カラムクロマトグラフィー、濾過、有利には膜濾過（透析濾過）又は濾過とカラムクロマトグラフィーの組み合わせにより達成することができる。１実施例では、溶液をクロマトグラフィー供給容器、図５に示されているようなタンク６に搬送する。この実施例では、生じたオキシヘモグロビンの溶液を、次いでタンク６内で約２００Ｌ（４％の全ヘモグロビン）に希釈しかつ塩化物の濃度を塩化ナトリウム溶液で２２ｍＭに調整する。ナトリウム濃度の調整は不必要である。次いで、生じるヘモグロビン溶液の５つの４０Ｌアリコートをカラム４４を使用してクロマトグラフィー処理する。カラム４４は、テトラマーよりもポリマーに対して大きな親和性を有する黄色染料（Affinity Chromatography，Ltd.からM imetic Yellow No.1として市販）で変性したアガロースゲルである親和性ゲルを含有する。クロマトグラフィー処理は、以下のようにして実施する。酸素添加した、重合した、ピリドキシル化された、ストローマ不含のヘモグロビン溶液４０Ｌをカラム４４に装填する。該カラムを、１５倍のカラム容量の３０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（約７５０Ｌ）で洗浄して、テトラマーを除去する。次いで、該カラムを３００ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液約２５０Ｌで洗浄して、ポリマーを洗い流す。ポリマーフラクションをタンク７に捕集する。所望しないフラクションは、ドレイン４６に沈降させる。各アリコートを除去した後に、該カラムを１５ｍＭのＨＣｌ溶液（１５０Ｌ）で再生させ、３０ｍＭの水性ＮａＣｌ（２５０Ｌ）で再平衡化しかつ供給溶液の別のアリコート（４０Ｌ）をカラム装填する。該カラム再び３０ｍＭのＮａＣｌ、引き続き３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄する。該カラムにヘモグロビン溶液の４０Ｌアリコートを加えかつクロマトグラフィー処理しかつタンク６を空にする。タンク７内の捕集したフラクションを、ドレイン５０と結合したフィルター４８を使用して約４０Ｌの容量（６％の全ヘモグロビン）に限外濾過する。次いで、濃縮したヘモグロビン溶液を脱酸素化のためにガス交換タンク８に搬送する。選択的に、該溶液を、図６に示されているように濾過再循環容器１０に搬送する。次いで、ヘモグロビンをタンク１０内で約４％のＴＨｂに希釈する。次いで、４％のＴＨｂ溶液を１０ｍＭのＮａＣｌ及びPall-Filrtonから市販されている３００,０００分子量フィルターを使用して透析濾過する。濾過は、ヘモグロビン材料の約９７％がフィルターを通過しかつタンク１１に流入するまで継続する（該材料の約３％は、即ち高分子量ポリマーはタンク１０内に残留する）。ヘモグロビンの量は、コオキシメータを使用して分光分析的に測定する。生じたタンク１１内の材料は、約２〜４％ＴＨｂでありかつＴＨｂを基準としてテトラマー約７〜１０％を含有する。次いで、２〜４％ＴＨｂを１０ｍＭのＮａＣｌ及び、ドレイン又はトラップ５６に結合されたPall-Filrtonから市販されている１００，０００分子量フィルター５４を使用して透析濾過する。BioSep S EC-S3OOO 600×7.8mmカラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したテトラマーのレベルがヘモグロビン質量０．８重量％未満になるまで継続する。生じた精製されたヘモグロビン溶液は、最初はタンク１１内に残留しかつ引き続き脱酸素化のためにガス交換タンクに搬送する。ガス交換タンク８は、タンク４と同じタンクで又は有利には異なるタンクであってよい。ガス交換タンク８は、図１におけるガス交換タンク４と実質的に同じ形式で装備されおりかつタンク４と同一の形式でフォームカン５８及びフォームカン３６に接続されている。脱酸素化は、約１０℃及び約７．５の溶液ｐＨで窒素スパージで約２．５時間実施する。窒素スパージは、全ヘモグロビンの重量を基準として、オキシヘモグロビン約１６％未満が溶液内に残留するようになるまで継続する。生じたデオキシヘモグロビン溶液は、引き続き調剤のためにタンク９に搬送する。調剤タンク９内で、溶液をまず約７％の全ヘモグロビン濃度に濃縮しかつｐＨを４℃で約８．８〜９．０に調整する。ｐＨは、０．２ＭのＮａＯＨを用いて調整する。次いで、電解質溶液をｐＨ８．８〜９．０のヘモグロビン溶液に添加する。それぞれ約５ｇ／Ｌ及び１．７５ｇ／Ｌの最終濃度を達成するためにグルコース及びグリシンを加える。約３．５〜４．５ｍＭのカリウム濃度を得るために、溶液に塩化カリウムを添加する。次いで、３Ｍの塩化ナトリウムを添加して、８５〜１１０ｍＭの塩化物濃度を得る。引き続き、乳酸ナトリウムを添加して、１３５〜１５５ｍＭのナトリウムイオンの濃度を得る。最後に、アスコルビン酸濃度を約１０００ｍｇ／Ｌまで上昇させるために０．４５モルのアスコルビン酸溶液を加える。アスコルビン酸は、貯蔵のための防腐剤／酸化防止剤として加える。得られたヘモグロビン溶液は、１ｋｇ当たり約２８０〜３６０ミリモルの最終浸透圧重量モル濃度を有する。次いで、調製したヘモグロビン溶液をトラップ６２に結合したフィルター６０を使用して約１０％の全ヘモグロビンに濃縮しかつ次いで１０％のヘモグロビン溶液をフィルター６４で濾過することにより滅菌しかつ前滅菌したバッグに無菌で充填する。この実施例で製造した生成物、バッチＡの特性は、表１に示されている。更に、バッチＢ及びＣ（両者ともバッチＡにために前述した方法に基づき製造した）は表１に示されている。前記には、本発明の有利な実施例を詳細に記載したが、説明のためであって、本発明を制限するものではない。勿論、あらゆる別の修正、分枝及び等価思想も、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内に包含されることは当業者には自明のことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトの患者に、腎臓機能を低下させずに約１．５リットル以下の量で注入することができる、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンの水溶液。２．ヒトの患者における半減期約１５時間を有する、請求項１記載のヘモグロビン溶液。３．ヒトの患者における半減期約２４時間を有する、請求項１記載のヘモグロビンの溶液。４．約５リットル以下の量で注入することができる、請求項１記載の溶液。５．ヒトの患者に、腎臓機能を低下させず約３リットル以下の量で注入することができかつヒトの患者における半減期約２４時間を有する、請求項１記載のヘモグロビンの溶液。６．ヒトの患者に約３リットル以下の量で注入することができる、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンの溶液を製造する方法において、ａ）赤血球を含有する混合物を、白血球の通過を阻止するのに十分な平均孔サイズを有するフィルターを通して濾過することにより白血球を除去する、ｂ）赤血球を溶解する、ｃ）ｂ）の生成物に一酸化炭素を添加しかつ約６０〜６２℃の温度に約１０時間加熱して、熱処理したヘモグロビン溶液を得る、ｄ）熱処理したヘモグロビン溶液を濾過して、加熱により沈殿したストローマ及びストローマ性汚染物質を除去する、ｅ）熱処理したヘモグロビン溶液を、フォームを発生させるために約１０℃の温度で熱処理した溶液を通して酸素及び次いで窒素をスパージングすることによりガス抜きして、ガス抜きし、熱処理したヘモグロビン溶液を得る、ｅ）ガス抜きした溶液をピリドキシル化して、ピリドキシル化されたヘモグロビンを得る、ｆ）ピリドキシル化されたヘモグロビンの溶液を重合させて、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンの溶液を製造する、ｇ）前記溶液に酸素添加する、ｇ）テトラマーのヘモグロビンを除去するために前記溶液を精製しかつ精製した、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンを捕集する、その際該溶液はフモグロビンの全重量を基準としてテトラマー０．８％未満を含有する、ｈ）精製した、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンを脱酸素化する、ｉ）精製した、ピリドキシル化され、重合したヘモグロビンの溶液内のｐＨ及び電解質レベルを生理学的レベルに調整することを特徴とする無細胞性赤血球代用物を製造する方法。７．ガス抜きした溶液をピリドキサール−５−ホスフェートと、ピリドキサール −５−ホスフェート対ヘモグロビンのモル比約１：１〜３：１で接触させることによりガス抜きした溶液をピリドキシル化する、請求項６記載の方法。８．ガス抜きした溶液をピリドキサール−５−ホスフェートと、ピリドキサール −５−リン酸対ヘモグロビンとのモル比約２：１で接触させることによりガス抜きした溶液をピリドキシル化する、請求項６記載の方法。９．ピリドキサール−５−ホスフェートをヘモグロビン及びホウ水素化物と約１時間接触させる、請求項７記載の方法。 10．ピリドキシル化された溶液をグルタルアルデヒドと、グルタルアルデヒド対ヘモグロビンのモル比約２４：１で接触させることにより、ピリドキシル化溶液中のヘモグロビンを重合させる、請求項９記載の方法。 11．ピリドキシル化された溶液をグルタルアルデヒドと約１８時間接触させかつ次いで急冷する、請求項１０記載の方法。 12．患者にピシドキシル化され、重合したヘモグロビン溶液約１．５リットル以下を投与することを特徴とする、輸注を必要とするヒトの患者への輸注方法。 13．患者にピシドキシル化され、重合したヘモグロビン溶液約３．０リットル以下を投与することを特徴とする、輸注を必要とするヒトの患者への輸注方法。 14．患者にピシドキシル化され、重合したヘモグロビン溶液約５．０リットル以下を投与することを特徴とする、輸注を必要とするヒトの患者への輸注方法。 15．ヘモグロビンがグルタルアルデヒド重合したヘモグロビンである、請求項１４記載の方法。 16．ヘモグロビンが図４記載の分子量分布を有する、請求項１５記載の方法。 17．ヘモグロビンが図４記載の分子量分布を有するグルタルアルデヒド重合したヘモグロビンである、請求項１記載の溶液。