【発明の詳細な説明】
ファフィア株を形質転換する改良法、そのようにして得られた
形質転換したファフィア株及び前記方法における組換えDNA
技術分野
本発明は、ファフィア(Phaffia)酵母を形質転換する方法、形質転換したファ
フィア株、及びそれに使用するための組換えDNAに関する。
発明の背景
酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)の形質転換方法は、欧州特
許出願第0 590 707 A1号に開示されている。その方法は、プロトプラストとDN
Aのインキュベーション又はファフィア細胞とDNAのインキュベーションに続
いて酢酸リチウム処理を必要とする。その方法でファフィア株を形質転換するた
めに用いられる組換えDNAは、G418又はフレオマイシンに対する耐性をコード
する選択マーカー遺伝子の発現を引き起こすファフィアアクチン遺伝子プロモー
ターから構成された。該方法は長時間のPEGと酢酸リチウムのインキュベーシ
ョン時間を含み、形質転換頻度が低い。プロトプラストが用いられる場合、形質
転換頻度はプロトプラスト浮遊液の品質に依存し、方法の信頼性を低くする。
最近、ファフィア株を形質転換する方法がAdrio J.L.& Veiga M.(Jul.1995,
Biotechnology Techniques Vol.9,No.7,pp.509-512)によって報告された。そ
の方法においては形質転換頻度はDNA1μgあたり形質転換細胞3〜13個の範
囲であり低い。その著者らによって開示された方法の欠点は、更に、形質転換細
胞の倍加時間が長いことにある。これは自律複製ベクターの染色体複製による妨
害によるものであると著者らは仮定した。
ファフィア株を異種DNAで形質転換する信頼性のあるかつ効率のよい方法が
なお求められていることは明らかである。本発明の目的は、それを達成する方法
と手段を提供することである。本発明の目的は、更に、ファフィアをある種の有
効な化合物の適切な生産ホストにするためにファフィア・ロドザイマ中でのある
種の遺伝子の発現を最適化することである。発明の要約
本発明は、形質転換したファフィア株を得る方法であって、ファフィア株の細
胞又はプロトプラストと組換えDNAとをその取込みを伝達する条件下で接触さ
せ、前記組換えDNAが転写プロモーターと前記転写プロモーターと異種である
発現すべき下流配列を操作可能な結合で含む工程、前記組換えDNAを発現可能
な形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロトプラストを同定し、該転写プ
ロモーターが高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリーディングフレーム
の上流に見られる領域を含む工程を含む、前記方法を提供する。本発明の好適実
施態様によれば、前記高度に発現したファフィア遺伝子は解糖系遺伝子であり、
更に好ましくは該解糖系遺伝子はグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ(GAPDH)をコードする。本発明の態様によれば、前記異種下流配列は、G418
又はフレオマイシンのような選択薬剤に対する耐性をコードするオープンリーデ
ィングフレームを含んでいる。
本発明の他の好ましい方法は、前記組換えDNAが発現すべき前記DNAから
下流の転写ターミネーターを作用可能な結合で更に含み、その転写ターミネータ
ーはファフィア遺伝子のオープンリーディングフレームの下流に見られる領域を
含んでいる。組換えDNAは、更に、線状DNAの形であることが好ましい。
他の好適実施態様は、上記工程のほかにファフィア細胞又はプロトプラストと
DNAとを接触させた後に電気パルスをかける工程を含む。
別の実施態様によれば、本発明は、本発明の方法によって得られる、異種DN
A配列の高レベル発現が可能な形質転換したファフィア株を提供する。好ましく
は、前記ファフィア株は、少なくとも10コピーの染色体のようなゲノムに組込
まれた前記組換えDNAを、特に前記染色体のリボソームDNA遺伝子座に含む
。
本発明は、また、転写プロモーター及び発現すべき異種下流配列を作用可能な
結合で含む組換えDNAであって、該転写プロモーターが高度に発現したファフ
ィア遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見られる領域、好ましくは
解糖遺伝子、更に好ましくはグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子を含む、前記組換えDNAを提供する。
また、該異種下流配列が選択薬剤、好ましくはG418又はフレオマイシンに対す
る感受性低下をコードするオープンリーディングフレームを含む本発明の組換え
DNAが提供される。前記組換えDNAは、好ましくは、前記発現すべき異種D
NA配列から下流の転写ターミネーターを作用可能な結合で更に含む。
本発明の態様は、更に、本発明の組換えDNAを保持する微生物、好ましくは
ファフィア株、更に好ましくはファフィア・ロドザイマ株、及びその培養物に関
する。
他の好適実施態様によれば、ファフィアGAPDH遺伝子又はその断片を含む単離
したDNA断片、及び組換えDNA構築物を作成するためのかかる断片の使用が
提供される。本態様の実施態様によれば、前記断片は、GAPDHをコードするオー
プンリーディングフレームの上流又は下流に位置する調節領域であり、発現すべ
き異種配列と共にその制御下で用いられる。
別の態様によれば、本発明は、タンパク質又は色素の生産を伝達する条件下で
ファフィア株を培養することによりタンパク質又は色素を生産する方法であって
、該ファフィア株が本発明の形質転換したファフィア株である、前記方法を提供
する。
本発明の他の態様によれば、形質転換したファフィア株を得る方法であって、
ファフィア株の細胞又はプロトプラストと組換えDNAとをその取込みを伝達
する条件下で接触させ、前記組換えDNAが転写プロモーター及び発現すべき下
流配列を作用可能な結合で含む工程、
前記組換えDNAを発現可能な形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロ
トプラストを同定する工程
を含み、該発現すべき下流配列がファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成
経路に関与する酵素をコードする単離したDNA配列を含む、前記方法が提供さ
れる。好ましくは、前記酵素は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)
、フィトエンシンターゼ(crtB)、フィトエンデサチュラーゼ(crtI)及びリコペン
シクラーゼ(crtY)より選ばれた活性をもち、更に好ましくは、配列番号13、配列
番号15、配列番号17及び配列番号19で表される配列より選ばれたアミノ酸配列を
もつ。実施態様によれば、更に、該転写プロモーターはファフィアの解糖系遺伝
子
のような前記単離したDNA配列に対して異種である。本実施態様によれば、グ
リセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子プロモーターで
あることが特に好ましい。
また、本発明の方法によって得ることができかつカロテノイド生合成経路遺伝
子に関与する酵素をコード化するDNA配列を発現することができる、好ましく
は過剰発現することができる形質転換したファフィア株が提供される。
本発明は、また、本発明の単離したDNA配列を含む組換えDNA、好ましく
はベクターの形で具体化される。
また、ファフィア株のようなホストを形質転換するためのかかるベクターの使
用が主張される。
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法を用いて形質転換で得られるホスト
、場合によっては祖先のホストは本発明に従ってDNAを過剰発現できることが
好ましい。
実施態様によれば、更に、酵素の生産を伝達する条件下で本発明のホストを培
養することにより、カロテノイド生合成経路に関与する酵素を発現する方法が提
供される。また、カロテノイドの生産を伝達する条件下で本発明のホストを培養
することにより、カロテノイドの生産方法が提供される。
図面の説明
図1.ファフィア・ロドザイマGAPDH遺伝子前後の制限部位のマッピング。臭化
エチジウム染色0.8%アガロースゲル(A)及び染色体DNAのサザンブロット(B)及
び数種の制限酵素で消化しファフィア・ロドザイマGAPDH遺伝子の300bp PCR断片
とハイブリッド形成したコスミドpPRGDHcosI(C)。レーン1,DNA×KpnI;2,×Pst
I;3,×SmaI;4,×SphI;L,BstEIIで消化したλDNA;5,×SstI;6,×XbaI及び7
,×XhoI。
ブロットを6×SSC,5×デンハルト溶液,0.1%SDS,100ng/mlニシン***DNA中
65℃でハイブリッド形成した。オートラジオグラムの露光時間はコスミドについ
ては16時間であり、染色体DNAを含むブロットからは48時間とした。
図2.2つのサブクローンの体制;ファフィア・ロドザイマのGAPDH遺伝子(の
一部)を含むpPRGDH3と誘導体(A)及びpPRGDH6と誘導体(B)。PCRプローブを
黒い枠で示す。配列決定の方向と程度を矢印で示す。
黒い枠: GAPDHコード配列
白い枠: GAPDHの5'上流とプロモーター領域
白い枠: ファフィア・ロドザイマGAPDH3'非コード配列
実線: GAPDHイントロン
斜線枠: 異なる制限酵素に対するポリリンカー含有部位
点線: 欠失断片
図3.ファフィア形質転換ベクターのクローニング図;pPR2。
黒い枠: GAPDHの5'上流とプロモーター
斜線枠: G418
実線: pUC19
白い枠: ファフィア・ロドザイマのリボソームDNA
クローニングに用いられる制限部位のみ示す。
図4.pPR2TからpPR2Tの構築
白い枠(BamHI-HindIII断片):ファフィア由来GAPDH転写ターミネーター。
他の枠と線は全て図3の通りである。適切な詳細のみ示した。
図5.pGB-Ph9の詳細な物理的地図。bps=塩基対;ファフィアのrDNAリボソー
ムDNA座;act.pro 2=アクチン転写プロモーター;act.1オープンリーディング
フレームの5'非翻訳領域とアミノ末端領域;NON COD.=G418遺伝子の下流の非コ
ーディング領域。
図6.pPR2の詳細な物理的地図。GPDHpro=ファフィア由来GAPDH転写プロモータ
ー領域。他の略号は図5の通り。
図7.pPR2Tの詳細な物理的地図。Tgdh=ファフィアのGAPDH転写ターミネーター
。他の略号は図5と図6の通り。
図8.エルウィニア・ウレドボラ(Erwinia uredovora)のカロテノイド生合成経
路の概要。
図9.cDNA断片の例示及びプラスミドpPRcrtE(A),pPRcrtB(B),pPRcrtI(C)
及びpPRcrtY(B)の制限酵素地図。発明の詳細な説明
本発明は、一般的には、形質転換したファフィア株を得る方法であって、
ファフィア株の細胞又はプロトプラストと組換えDNAとをその取込みを伝達
する条件下で接触させ、前記組換えDNAが転写プロモーター及び前記転写プロ
モーターと異種である発現すべき下流配列を作用可能な結合で含む工程、
前記組換えDNAを発現できる形で得たファフィア・ロドザイマ細胞又はプロ
トプラストを同定する工程
を含み、該転写プロモーターが高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリー
ディングフレームの上流に見られる領域を含む、前記方法を提供する。
本発明を実施する様々な方法を具体的に説明するために、実施態様を示し、特
定の用語の意味又は範囲を説明する。
発現組換えDNAの意味は、遺伝子修飾の技術において周知であり、DNA分
子は少なくとも2種の異なる起原の断片の結合を特徴とする一本鎖又は二本鎖、
線状又は環状、ニック等であることを意味する。かかる結合は、一般的であるが
必ずしも試験管内で行われない。従って、異なる生物又は同じ生物の異なる遺伝
子由来のDNA、又は領域が天然には隣接しないが同じ遺伝子の異なる領域由来
のDNAさえも含む分子が請求の範囲内である。本発明の組換えDNAは、異種
DNA配列に融合した高度に発現したファフィア遺伝子のオープンリーディング
フレームの上流に見られる転写プロモーターを特徴とする。異種については、‘
天然には隣接しない’を意味する。従って、非相同DNA配列は、異なる生物由
来、同じ生物由来の異なる遺伝子、又は下流配列が試験管内で一般的に修飾され
るのであればプロモーターと同じ遺伝子とさえすることができる。かかる修飾は
、挿入、欠失又は置換であり、コード化タンパク質及び/又は分泌経路に入るこ
と、及び/又は翻訳後プロセシング、及び/又はコドン使用に働きかけることが
できる。
本発明の強力な転写プロモーターは、転写及び翻訳機構を開始シグナルを認識
させるために異種下流と作用可能な結合でなければならない。高度に発現したフ
ァフィア・ロドザイマ遺伝子のオープンリーディングフレームの上流の領域は、
キャップサイトの上流の26〜約40ヌクレオチドに位置するTATA様構造を含む。後
者は転写開始部位にほぼ一致する。従って、異種下流配列の転写を右の位置から
開始させるために、同じ距離が考えられる。しかしながら、転写開始部位に相対
するTATAシグナルの位置にある種の許容があることは周知の知識である。典型的
には、真核タイプのmRNAは、翻訳の開始までの転写開始部位にかかる領域である
5'非翻訳リーダー配列(5'-utl)を含む。その領域は30ヌクレオチドから200ヌク
レオチドを超えるまで変動させることができる。5'-utlの長さも起原もほとんど
重要ではない。30〜200ヌクレオチドが好ましい。プロモーターと同じ遺伝子由
来とすることができ、異種タンパク質をコードする遺伝子由来とすることもでき
る。真核遺伝子がオープンリーディングフレームの下流の転写及び/又はポリア
デニル化の終結シグナルを含むことは周知である。終結シグナルの位置は可変で
あるが、典型的には翻訳停止部位(オープンリーディングフレームの末端)から
下流の10〜200ヌクレオチド、通常翻訳停止部位から下流の30〜100ヌクレオチド
である。転写ターミネーターの選択は重要ではないが、ターミネーターがファフ
ィア遺伝子の下流の領域、好ましくは高度に発現したファフィア遺伝子の下流の
領域、更に好ましくはGAPDHコード化遺伝子より選ばれる場合には発現レベル及
び形質転換頻度が改善されることがわかる。
非常に高濃度のG418(1mg/ml前後)で増殖することができるかなりの数のクロ
ーンが得られることがわかった。少なくとも200μg/ml、好ましくは400μg/mlを
超え、更に好ましくは600μg/mlを超え、更に好ましくは800μg/mlを超えるG418
の存在下に増殖培地中で実施例に開示されたG418耐性遺伝子に結合したときに形
質転換したファフィア細胞を増殖させるために働くことができる場合、本発明の
転写プロモーターは高度に発現した遺伝子由来であると言われる。かかるプロモ
ーターの例は、ファフィアのGAPDH遺伝子から上流のプロモーターのほかにピキ
ア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyce
s)のような他の酵母、又はトリコデルマ(Trichoderma)、アスペルギルス(Asperg
illus)のような真菌由来の高度に発現した遺伝子と相同であるファフィア・ロド
ザイマ遺伝子由来プロモーター等である。本発明の要件を満たすプロモーターは
、当業者にそのままで全て用いうる分子生物学手法を用いてゲノムDNAから単
離される。本発明は、次のようなファフィア由来の強力なプロモーター
を単離する新規な戦略を提供する。cDNAライブラリーは、既知の方法を用い
てファフィアmRNAから作成される。次に、cDNA挿入断片による多数のク
ローンについては、DNA断片(発現したmRNAのcDNA補体を示す)の配
列が決定される。更に、豊富に発現される遺伝子(解糖プロモーターのような)
がmRNA集団で過剰呈示される。従って、高度に発現した遺伝子を見つけ出す
ために配列決定すべきDNA断片の数は100末満、おそらく50未満に限定される
。そのようなものとしての配列決定は通常のものであり、数週間以内に行われる
。引き続き、この限定した数の断片から得られたヌクレオチド配列はEMBL又はGe
neseqのような電子データベースに記憶された既知の配列と比較される。断片が
一定の長さ(好ましくは100塩基対を超える)にわたって50%を超える相同性を
示す場合には、その断片は電子データベースに見られる遺伝子のファフィア等価
株を示すと思われる。ファフィア以外の酵母においては、多数の高度に発現した
遺伝子が同定されている。それらの遺伝子としては、解糖系遺伝子、ホスホグル
コイソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、ホ
スホグルコムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子(欧州特許第120 551号、同第0 164 556号;Rosenberg S.ら,1990,
Meth.Enzymol.185,341-351;Tuite M.F.1982,EMBOJ.1,603-608;Price V.
ら,1990,Meth.Enzymol.185,308-318)及びガラクトースレギュロン(Johnsto
n,S.A.ら,1987,Cell 50,143-146)が含まれる。従って、高度に発現した酵
母遺伝子にかなり相同であるファフィアcDNA断片(50ヌクレオチドを超える
範囲、好ましくは100ヌクレオチドを超える範囲にわたる最良適合比較の同一性
が40%を超える、好ましくは50%を超える)は、ファフィア由来ゲノムライブラ
リーをスクリーニングするために用いられ、対応する遺伝子を見出すにちがいな
い。この方法を用いてファフィア・ロドザイマ由来の14個の高度に発現したmR
NAがDNAにコピーされ、配列決定され、その(推定)オープンリーディング
フレームが核酸とアミノ酸配列のデータベースに匹敵した。これらの14個のcD
NAの中の13個がリボソームタンパク質遺伝子をコードし、1個が同時にユビキ
チンに対してコードすることが判明した。1個のcDNAはグルコース抑制遺伝
子をコードする。これらの遺伝子のコード領域の上流に通常見られる遺
伝子とプロモーターの単離は進行中であり、これらの転写プロモーターの各々は
カロテノイド生合成遺伝子のような異種遺伝子を発現するために有利に用いられ
ることが予想される。遺伝子の中で、本発明の特に好ましい転写プロモーターは
、配列番号10で示されるcDNAに対応するユビキチンリボソーム40Aタンパク
質、配列番号26で示されるグルコース抑制cDNA、配列番号28で示される40S
リボソームタンパク質S27コード化cDNA、配列番号30で表される60Sリボソー
ムタンパク質P1αコード化cDNA、配列番号32で示される60Sリボソームタン
パク質L37eコード化cDNA、配列番号34で示される60Sリボソームタンパク質L
27aコード化cDNA、配列番号36で示される60Sリボソームタンパク質L25コー
ド化cDNA、配列番号38で示される60Sリボソームタンパク質P2コード化cD
NA、配列番号40で示される40Sリボソームタンパク質S17A/Bコード化cDNA
、配列番号42で示される40Sリボソームタンパク質S31、配列番号44で示される40
Sリボソームタンパク質S10コード化cDNA、配列番号46で示される60Sリボソ
ームタンパク質L37Aコード化cDNA、配列番号48で示される60Sリボソームタ
ンパク質L34コード化cDNA、又は配列番号50で示される40Sリボソームタンパ
ク質S16コード化cDNAの上流に見られるプロモーターである。
これらの又は他の高度に発現した遺伝子由来プロモーターは、次の通常の技術
のみを用いる本発明の方法により集められる。(a)所望の条件下で増殖したファ
フィア株から単離したmRNAについてcDNAライブラリーを作成する工程、
(b)工程(a)で得られた(部分)cDNAのヌクレオチド配列(部分)を求める工
程、(c)工程(b)で得られた配列データを電子データベースに記憶されたもののよ
うな既知の配列データと比較する工程、(d)発現したcDNAに対応する遺伝子
のオープンリーディングフレームのすぐ上流か又は転写開始部位のすぐ上流に位
置する遺伝子の推定プロモーター断片をクローン化する工程、及び(e)G418耐性
遺伝子のような適切なマーカー、又は(d)で得られた断片から下流の適切な非選
択性“リポーター”配列を発現し、そのDNAをファフィア・ロドザイマ株に形
質転換し、形質転換細胞のマーカー遺伝子又はリポーター配列の発現レベルを求
めることによりプロモーター配列が得られたかを証明する工程。転写プロモータ
ーは、培養液1リットルあたり200μgを超える濃度、好ましくは少なくと
も400μg/l、更に好ましくは600μg/lを超える濃度のG418に耐性のあるG418耐性
マーカーの上流に結合した前記プロモーターを含むDNA構築物で形質転換した
ファフィア・ロドザイマ細胞を作成することが可能である場合には高度に発現し
た遺伝子を有すると言われる。特に好ましいプロモーターは、増殖培地中で800
μg/mlを超えるG418に対する耐性を与えるものである。
場合によっては、推定プロモーター配列のクローニング前に高度に発現した遺
伝子に対応するcDNAに対応する遺伝子の転写開始部位が求められる。これに
より、より正確に転写開始部位に位置するように働くことができ、更に、遺伝子
の5'非翻訳リーダーの長さを求めることを援助する。転写開始部位の位置を求め
るために、cDNA配列の知識に基づいて逆プライマーエクステンション又は古
典的S1マッピングが行われる。従って、転写プロモーターの正確な位置が過度の
負担を含まずに求められ、転写開始部位の上流及びプロモーターを含む断片のハ
イブリッド形成ゲノムクローン(例えば、ファージ又はコスミド)からの単離は
通常のものである。コード領域、例えば、G418耐性遺伝子のコード領域の前(上
流)の推定プロモーター断片をクロー化すること、及びG418耐性のレベルを評価
するために遺伝子カセットをファフィアに形質転換すること、よってプロモータ
ーの存在の結果としてのG418耐性遺伝子の発現レベルは通常のものである。
上記の他の強力なプロモーターの単離に記載された実質的な方法においては、
ターミネーターがオープンリーディングフレームから下流に位置するならば転写
ターミネーターが単離される。転写停止部位は、転写開始部位の決定と実質的に
同じ方法を用いて求められる。これらの方法は全て当業者に周知である。有用な
ハンドブックは、Nucleic Acid Hybridisation,Edit.B.D.Hames & S.J.Higgi
ns,IRL Press Ltd.,1985;Sambrook,sub.である。しかしながら、転写ターミ
ネーターが高度に発現したファフィア遺伝子から単離されることは発現した遺伝
子から単離される限り重要ではない。
オープンリーディングフレームがG418に対する感受性低下をコードする本発明
の組換えDNAを用いると、40μg/mlの培地中のG418濃度が線状DNA1μgあ
たり形質転換細胞160個までの形質転換頻度が得られた。
本発明のベクター(pPR2)を用いて欧州特許第0 590 707 A1号に開示される従来
技術のベクターpGB-Ph9より約10〜20倍の形質転換コロニーが得られた(表2;実
施例7の実験においては改良が顕著である)。
本発明の方法は、組換えDNAの取込みを伝達する条件を要求する。かかる条
件は、欧州特許第509 707号に開示されている。当業者に既知の標準操作を用い
るプロトプラストの調製及び続いての組換えDNAとのインキュベーションが含
まれるがこれに限定されない。また、ファフィア細胞はLiAcと組換えDNAの存
在下に一晩インキュベートされる。代替的方法は、粒子加速の使用を必要とする
。好適実施態様によれば、取込みを伝達する条件は、Faberら,(1994,Current
Genetics 25,305-310)に記載されるような組換えDNAのファフィア細胞へ
のエレクトロポレーションを必要とする。特に好ましい条件は、組換えDNAが
ファフィアリボソームDNAを含み、前記組換えDNAが線状形であり、最も好
ましくは前記リボソーム領域の前記組換えDNAを切断することによるエレクト
ロポレーションを含む。条件は、更に、組換えDNAの好ましくは1〜10μg/108
細胞の量での使用を含み、更に好ましくは約5μg/2×108細胞の組換えDNA
が用いられ、21℃で16時間培養される。
細胞が本方法に従って形質転換されると、形質転換細胞の同定が適切な手法を
用いて行われる。従って、同定はハイブリッド形成法、使用した組換えDNAに
基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応のようなDNA増幅法等で行わ
れる。形質転換細胞を同定する好ましい方法は、選択薬剤に対する感受性低下を
コードするインキュベートを含む組換えDNAの選択を用いる方法である。有用
な選択薬剤はG418、ヒグロマイシン、フレオマイシン及びamdSである。これらの
選択薬剤に対する感受性低下をコードする遺伝子は、当該技術において周知であ
る。これらの遺伝子のオープンリーディングフレームは本発明の異種下流配列と
して用いられ、形質転換細胞の同定前に形質転換細胞の選択的濃縮を可能にする
。形質転換細胞が同定されると、更に操作するために用いられるか又は有効な化
合物の生産に、好ましくは大規模発酵槽で直接用いられる。
ファフィア株を形質転換する非常に効率のよい方法が開示されたことは明らか
である。更に、形質転換頻度が高いだけでなく、pGB-Ph9のアクチンプロモータ
ーの制御下のG418耐性遺伝子と比較した場合、G418耐性遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームが本発明のプロモーターに融合した場合の形質転換ファフィア細
胞のG418に対する例外的に高い耐性によって示されるように形質転換DNAの発
現レベルも非常に高い。従って、ファフィア株での高発現レベルを達成するため
に異種配列と共に適切に用いられるGAPDHプロモーターは高レベルの転写プロモ
ーターであることが結論される。
本発明の組換えDNAとしての新しい発現手段の利用可能性がファフィアの新
規で有効な生体分子を生産する多くの可能性を生じることは明らかである。
好ましくは、下流配列は問題のタンパク質をコードするオープンリーディング
フレームを含んでいる。例えば、カロテノイド経路に含まれるもののようなファ
フィア株に既存の遺伝子は、本発明の高レベルプロモーターの制御下でクローン
化することにより操作される。発現増強は、中間体及び/又は最終産物の蓄積を
変化させることができ、β−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチン等
の経路を変化させることもできる。エルウィニア・ウレドボラ由来crtB遺伝子の
過剰発現は、その遺伝子の産物が律速段階に関与するのでアスタキサンチンレベ
ルを上げると思われる。問題のタンパク質の発現は、また、ゼアキサンチンのよ
うなファフィアで天然に産生されないことが知られるキサントフィルを生じるこ
とができる。かかる方法に適切に用いられるオープンリーディングフレームとし
ては、エルウィニア・ウレドボラ(Misawaら,1990,J.Bacteriol.172:6704-6
712)から得られるタンパク質産生ゼアキサンチン(crtZ遺伝子)をコード化する
ものが含まれるがそれに限定されない。他のカロテノイド合成遺伝子は、例えば
、フラボバクテリウム(Flavobacterium)(グラム陽性菌)、シネココッカス(Synec
hococcus)(シアノバクテリウム)又はクラミドモナス(Chlamydomonas)又はデュナ
リエラ(Dunaliella)(藻類)から得られる。ファフィア株のカロテノイド合成遺伝
子は、該遺伝子が単離及びクローン化されると本発明の組換えDNAに適切にク
ローン化され、ファフィア株のカロテノイド含量を修飾するために用いられる。
ファフィア中で適切に過剰発現されるクローン化カロテノイド遺伝子の例は、図
8に述べられるものである。この工程はテルムス・テルモフィルス(Thermus the
rmophylus)(Hoshino T.ら,1994,Journa1 of Fermentation and Bioengineeri
ng 77,No.4,423-424)におけるカロテノイド合成の律速段階で
あると思われるので、ゲラニルゲラニルニリン酸シンターゼをコード化するフィ
コミセス・ブラケスレアナス(Phycomyces blakesleanus)、及びフィコエンシン
ターゼをコード化するcrtBが特に有効である。カロテノイド生合成遺伝子又はc
DNAを単離するのに特に好ましい供給源は、真菌ニューロスポラ・クラサ(Neu
rospora crassa)、ブラケスレア・トリスポラ(Blakeslea trispora)である。カ
ロテノイド生合成遺伝子の交差ハイブリッド形成種をもつことがわかっている他
の酵母は、シストフィロバシジウム(Cystofylobasidium)、例えば、ビスポリジ
イ(bisporidii)及びカピタタム(capitatum)である。
カロテノイド生合成遺伝子は、また、植物でも同定された。植物cDNA又は
植物由来遺伝子も同様に用いられる。場合によっては、ファフィア遺伝子又はc
DNAのコドン使用がホスト生物での好ましい使用に適応される。
本発明によれば配列表に示される、ファフィア・ロドザイマのカロテノイド生
合成経路において4種類の異なる酵素をコードするDNA配列が特に興味深い。
これらのDNA配列が一旦役立つとDNA配列に対するわずかな修飾をアミノ酸
配列を変えずに引き起こすことが可能であることは当業者に明らかである。かか
る修飾は、遺伝コードの縮重に基づき可能である。かかる修飾は、本発明に包含
される。しかしながら、酵素のアミノ酸配列の修飾を生じるコード配列の修飾も
企図される。少しの修飾が酵素活性によって完全に許容されることは当業者に周
知である。欠失、付加又はアミノ酸置換のようなたいていの変化は酵素活性に少
なくとも劇的に影響しない。1個以上のアミノ酸の欠失、付加又は置換を含むよ
うな変異株は、明細書に開示される相補性検定を用いて容易に試験される。当業
者は、“保守的アミノ酸置換”という用語に通じており、アミノ酸を同じグルー
プに属する類似のアミノ酸で置換することを意味する。当業者は、“対立変異株
”という用語に通じており、1つの特定酵素の天然に存在する変異株を意味する
。これらの保守的置換及び対立酵素変異株は本発明からはずれていない。
述べたように、DNAレベルのかなりの変異が許容しうる。本発明は配列番号
12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22で示され
る4種類のDNA配列を開示するが、詳細には配列番号12、配列番号14、配列番
号16、配列番号20又は配列番号22で示されるDNA配列のイソコーディング変異
株も本発明によって包含される。当業者は、P.ロドザイマ以外のホストでのコド
ン使用を最適化するために核酸配列を適応させる点での難しさはない。当業者は
、関連ファフィア株から配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配
列番号20又は配列番号22で示されるDNA配列の対立変異株をどのように単離す
るかを知っている。
更に、プローブとして配列表に開示されるDNA配列、特に配列番号12、配列
番号14、配列番号16又は配列番号18を用いて、対応する遺伝子型、他の株、又は
他の微生物種、又は所望される場合には更に離れた真核種を単離することが可能
であり、十分に配列相同性があるならば当該技術において既知のハイブリッド形
成又は増幅の手法を用いてそれを検出することが可能である。
典型的には、類似のDNA断片を得る方法は、既知の生物からDNA断片を含
む組換えプラスミドで形質転換した又は本発明の酵素を生産するために予想され
るバクテリア又はバクテリオファージプラークのスクリーニングを含む。DNA
の原位置複製後、DNAは細胞又はプラークから遊離し、フィルター(通常はニ
トロセルロース)上に固定化される。次に、配列表に示される配列のいずれかに
基づく標識核酸プローブを用いてフィルター中の相補的DNA断片がスクリーニ
ングされる。スクリーニングすべき生物が密接に又は密接でなく関連があるか否
かによって真のDNA断片を集め虚偽のDNA断片量を減少させるためにハイブ
リッド形成や洗浄条件を適応させなければならない。フィルター固定化DNAの
ハイブリッド形成に典型的な手順は、Nucleic acid hybridisation-a practical
approach,B.D.Hames & S.J.Higgins Eds.,1985,IRL Press,Oxford,Chap
.5,table 3,pp.120 & 121に記載されている。最適条件は通常経験的に求めら
れるが、密接に関連した配列や密接に関連しない配列に対していくつかの有効な
経験法が示される。
プローブに極めて密接に関連のあるDNA断片を同定するために、0.1×SETバ
ッファー(20倍SET=3M NaCl,20mM EDTA,0.4M トリス-HCl,pH7.8,0.1%SDS,6
8℃)中高ストリンジェンシーの最終洗浄工程と共に上記Hames & Higginsの表3
(実質は下記に再現される)に記載されるハイブリッド形成が行われる。
プローブに対する相同性が限定された配列を同定するために行われるべき方法
は、上記Hames & Higginsの表3の通りであるがハイブリッド形成及び洗浄の温
度を下げた。例えば、2×SETバッファー,50℃の最終洗浄は、約75%相同性を有
する配列を同定することができなければならない。当業者に周知である相同性と
ハイブリッド形成条件間の正確な関係は、プローブの長さ、塩基組成(G+Cの%)
及びミスマッチの分布に依存する。ランダム分布は、Tm非ランダム又はクラスタ
ーパターンのミスマッチ時に強い減少作用がある。
Hames & Higginsの表3.Chap.5に記載される手順の実質は次の通りである。(
1)プローブ不在下のフィルターの前ハイブリッド形成する工程、(2)0.1〜4×SET
バッファー(ストリンジェンシーに依存する)、10×デンハルト溶液(100×デン
ハルト溶液は2%ウシ血清アルブミン、2%フィコール、2%ポリビニルピロリ
ドンを含む)、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50μg/mlサケ***DNA(
200〜500bpの長さに音波処理し、水浴中20分間放置し、最終濃度1mg/mlまで水
で希釈した1mg/mlのサケ***を溶解することにより得られる保存液から)中50〜
68℃の温度でのハイブリッド形成する工程。ハイブリッド形成時間はあまり重要
でなく、1〜24時間、好ましくは約16時間(o/n)である。プローブは、典型的に
は、5×107〜5×108c.p.m./μgの比活性まで放射性標識として32Pを用いてニッ
ク翻訳により標識される。(3)フィルターを3×SET,0.1%SDS,0.1%ピロリン酸ナ
トリウム,68℃で50〜68℃の温度(所望のストリンジェンシーに依存する)で(
繰り返し)洗浄し、SET濃度を0.1%まで下げつつ繰り返し洗浄し、4×SET中室温
で20分間1回洗浄し、フィルターを3MM紙上で乾燥し、フィルターをカセットの
X線フィルムに−70℃で1〜96時間露光し、フィルムを現像する工程。
一般的には、前ハイブリッド形成とハイブリッド形成ミックスの容積は、最小
に保持されなければならない。“湿潤”工程は全て予熱水浴中小さな密閉バッグ
内で行われる。
上記手順は、本発明に従ってハイブリッド形成すると言われるDNA断片を作
成するのに役に立つ。本発明のDNA断片を同定及び分離する手順に多くの変更
が行われることは明らかである。そのようにして得られたDNA断片がこの手順
を用いて実際に同定及び/又は単離されたかとは無関係に上記手順に従って検出
される場合には請求の範囲に包含されることは理解されるべきである。
本発明のDNA断片を同定及び単離するために適切に用いられる多くのプロト
コールは引用したもの(上記Hames & Higgins)を含む文献やハンドブックに記
載されている。
定方向PCR又は逆方向PCRのような新しいDNA増幅技術の出現により、
コード領域の配列が既知であるとDNA断片の試験管内クローン化も可能である
。
ニトロセルロースフィルターに結合した場合及びハイブリッド形成条件下での
インキュベーション及び続いての洗浄後に、インキュベーションと洗浄後にフィ
ルターのオートラジオグラフィーで検出可能である配列番号12、配列番号14、配
列番号16又は配列番号18で示される配列をもつ放射能標識DNA断片に対して特
異的にハイブリッド形成することが可能なDNA配列も請求の範囲に包含される
。ここで、ハイブリッド形成条件下の前記インキュベーションと続いての洗浄は
フィルター結合DNAを0.3M NaCl、40mMトリス-HCl、2mM EDTA、0.1%SDS,pH7.8
中前記放射能標識DNAの溶液の存在下に少なくとも50℃、好ましくは少なくと
も55℃、更に好ましくは少なくとも60℃の温度で少なくとも1時間インキュベー
トすることにより行われ、その後オートラジオグラフィーの前にフィルターを0.
3M NaCl、40mMトリス-HCl、2mM EDTA、0.1%SDS,pH7.8中50℃、好ましくは少な
くとも55℃、更に好ましくは少なくとも60℃の温度で約20分間少なくとも2回洗
浄する。
本発明の異種DNA配列は、ヒト血清アルブミン、IL-3、インスリン、VIII因
子、tPA、EPO、α−インターフェロン等の医薬タンパク質、プロテアーゼ及びリ
パーゼ等のデタージェント酵素、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、グ
ルカナーゼ、ポリガラクツロナーゼ等の細胞壁分解酵素、及び食品又は飼料用添
加剤として有用な他の酵素(例えば、キモシン、フィターゼ、ホスホリパーゼ等
)のような有効なタンパク質又はその前駆体をコードするオープンリーディング
フレームを含むことができる。かかる遺伝子は、続いての使用の前に問題のタン
パク質を回収するために発現されるが、タンパク質が未精製の形、例えば、培養
ろ液又はファフィア細胞内に封入された形で生成物又はプロセスに添加される
のでしばしば必要としない。
カロテノイドを含む酵母細胞は、動物飼料の添加剤としてそのままで又は乾燥
形で用いられる。更に、酵母はタンパク質、炭水化物又は油のような他の化合物
と混合される。
本発明の組換えDNAによって生産されるタンパク質又は色素のような有効な
物質は抽出される。カロテノイドは、また、Johnsonら(Appl.Environm.
Microbio1.35:1155-1159(1978))に記載されるように単離される。
精製したカロテノイドは、食品及び/又は飼料の着色剤として用いられる。ま
た、カロテノイドを化粧品又は医薬組成物に適用することも可能である。
異種下流配列は、また、選択薬剤に対する感受性低下をコードするオープンリ
ーディングフレームを含むこともできる。G418耐性を示す酵素をコードするオー
プンリーディングフレームは、本発明の方法に満足に用いられるが、本発明はこ
の選択マーカーに限定されない。欧州特許第590 707号に開示されるフレオマイ
シン耐性遺伝子のような他の有効な選択マーカーも用いられる。これらの遺伝子
の各々は、GAPDHプロモーターのような本発明の強力なプロモーターの制御下で
有利に発現される。
下記の非限定的実施例によって更に詳しく本発明を具体的に説明する。
実験 菌株
:
E.coli DH5α:supE44lacU169(80lacZM15)hsdR17 recA1 endA1 gyrA96thi-
1 relA1
E.coli LE392:supE44 supF58 hsdR514 galK2 galT22 metB1 trpR55 lacY1
P.rhodozyma CBS6938プラスミド
:
pUC19(Gibco BRL)
pTZ19R
PUC-G418
pGB-Ph9(Gist-brocades)
pMT6(1987,Breter H.-J.,Gene 53,181-190)
培地
:
LB:10g/lバクトトリプトン,5g/l酵母エキス,10g/l NaCl.プレート;+20g/l
バクト寒天.適切な場合には50μg/mlアンピシリン.
YePD:10g/l酵母エキス,20g/lバクトペプトン,20g/lグルコース.プレート;+
20g/lバクト寒天.適切な場合には50μg/mlアンピシリン.方法
:分子クローニングの手法は全て実質的にはSambookら,Molecular
Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edit.(1989;Cold Spring Harbor Laborator
y Press)によって記載されるように行った。
酵素インキュベーションは、製造業者によって記載された使用説明書に従って
行った。これらのインキュベーションは、制限酵素消化、脱リン酸化及び連結反
応(Gibco BRL)が含まれる。
ファフィア・ロドザイマ由来の染色体DNAの単離はGist-brocadest特許;欧
州特許第0 590 707 A1号の実施例3に記載される。K.ラクチス(lactis)及びS.セ
レビシエ(cerevisiae)由来の染色体DNAをCryerら(Methods in Cell Biology 12
:39,Prescott D.M.(ed.)Academic Press,New York)に記載されるように単離
した。
大きな(>0.5kb)DNA断片のアガロースからの単離はジーンクリーンIIキット
を用いて行われ、小さな(<0.5kb)DNA断片又はPCRからの断片とWizardTMD
NAクリーンアップシステム(Promega)を用いて単離した。
E.コリ(coli)の形質転換は、Sambrookらにより記載されたCaCl2法に従って行
われた。コスミド連結反応のパッケージング及びE.コリLE392へのトランスフェ
クションは、パッカジーンλDNAパッケージングシステム(Promega)を用いて
プロメガプロトコールに従って行った。
プラスミドDNAのE.コリからの単離は、QIAGEN(Westburg B.V.NL)を用いて
行われた。
ファフィアCBS6938の形質転換は、上記Faberらに記載されるH.ポリモルファ(p
olymorpha)の方法に従って行った。
‐30mlのYePDに1つのCBS6938コロニーを播種する
‐21℃,300rpmで1〜2日増殖する(前培養)
‐200mlのYePDに前培養物をOD600=0〜1まで播種する(1より大きい場合は水
で希釈する)
‐21℃,300rpmでo/n OD600=1.2まで増殖する(測定前に希釈する)
‐8000rpm,室温で5分遠心分離する。上清を完全に除去する
‐沈降物を25ml 50mM KPi pH7.0,25mM DTTに再懸濁する(新しく調製した)
‐浮遊液を30mlの新しい滅菌遠心管に移し、室温で15分間インキュベートする
‐8000rpm4℃で5分遠心分離する,上清を完全に除去する
‐沈降物を25mlの氷冷STM(270mMスクロース,10mMトリスpH7.5,1mMMgCl2)
‐8000rpm,4℃で5分遠心分離する
‐洗浄工程を繰り返す
‐細胞を0.5mlの氷冷STM(3×109細胞/ml)に懸濁する。氷上で保冷する!
‐60μlの細胞浮遊液を5μgの形質転換DNA(予め冷却した先端部を用いる)
を含む予め冷却したエッペンドルフ管に移す,氷上で保冷する
‐細胞/DNAミックスを予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに移
す(上から下まで)
‐パルス:1.5kV,400Ω,25μF
‐直ちに0.5mlの氷冷YePDを加える。滅菌パスツールピペットを用いてepに戻す
‐21℃で2.5時間インキュベートする
‐100μlを40μg/mlのG418を含むYePDプレート上に播種する
‐コロニーが出現するまで21℃でインキュベートする
GENEナビゲータ+アクセサリ(Pharmacia)を用いてパルスフィールド電気泳動を
行った。条件:0.15×TBE,450V,パルス時間0.5s,1.2%アガロース,実験時間2h
.
下記の組成を有する混合液中でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)実験を行った。
‐5ngのプラスミドDNA又は1μg染色体DNA
‐0.5μgのオリゴヌクレオチド(5μg変性オリゴヌクレオチド+染色体DNA)
‐10nmの各dNTP
‐2.5μmのKCl
‐0.5μmトリスpH8.0
‐0.1μm MgCl2
‐0.5μgゼラチン
‐1.3U Taqポリメラーゼ(5U+染色体DNA)
H2Oを全量50μlまで加えた
反応を自動サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)で行った。
条件:5'95℃に続いて次のサイクルを25回繰り返した;2'94℃,2'45℃,3'72℃
最終;10'72℃.
末端が一致する2DNA断片を鋳型として当モル量で加えた以外は上記のよう
に融合PCRを行った。
オリゴヌクレオチド配列は次の通りとした。 実施例1 ファフィア形質転換細胞G418-1のG418耐性
G418耐性遺伝子のpGB-Ph9中での発現を求めるために、形質転換細胞G418-1(
欧州特許第0 590 707 A1号)をG418の増加濃度に曝露した。G418-1培養物の2種
の希釈液を0〜1000μg/mlG418を含むYepD寒天上に播種した(表1)。
表1.増加濃度のG418を含むYepD寒天培地上のファフィア形質転換細胞G418-1の
生存細胞数
600μg/mlG418の濃度においては1%未満の平板培養細胞が生存した。pGB-Ph9の
多コピー組込みにもかかわらずG418-1はG418に対していくぶん弱い耐性を示すと
結論され(Scorerら,1994,Bio/Technology 12,p.181〜,Jimenez &
Davies,1980,Nature 187p.869〜)、おそらくプラスミド中のファフィアアク
チンプロモーター作用が弱いためと思われる。ファフィアアクチンプロモーター
の作用が不十分であるという結果が我々を刺激してプロモーター活性の強いファ
フィアのプロモーター配列を単離した。
実施例2 ファフィア・ロドザイマ由来解糖遺伝子の特定プローブのPCRによる合成
ファフィア・ロドザイマのグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒロゲナーゼ(G
APDH)、ホスホグルセレートキナーゼ(PGK)及びトリオースリン酸イソメラーゼ(T
PI)をコード化する遺伝子の相同プローブを合成する試みにポリメラーゼ連
鎖反応(PCR)の手法を用いた。
GAPDH遺伝子(Michelsら,1986,EMBO j.5:1049-1056),PGK遺伝子(Osingaら
,1985,EMBO J.4:3811-3817)及びTPI遺伝子(Swinkelsら,1986,EMBO J.5:12
91-1298)に基づき変性オリゴヌクレオチドセットを設計した。
鋳型としてファフィア・ロドザイマ(CBS6938株)の染色体DNAを用いてPC
R断片を合成するために可能な全てのオリゴヌクレオチド配列の組合わせを用い
た。増幅の特異性をモニターするために鋳型としてサッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae)及びクルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromycesl
actis)を用いた。上記のようにPCRを行い、PCR条件は、1'95℃、2'アニ
ーリング温度(Ta)、5サイクルの5'アニーリング温度〜72℃、2'72℃に続いて25
サイクルの1'95℃、2'55℃及び2'72℃及び10'72℃の他の伸長工程である。3種
類のTaは40℃、45℃及び50℃を用いた。
これらの条件下で、プライマーの組合わせの1つだけが鋳型としてのファフィ
ア染色体DNA上に予想したサイズの断片を作製した。オリゴヌクレオチド配列
の組合わせNo.3005及びNo.3006及びTa45℃を用いて0.3kb断片が見られた。詳し
くは、GAPDHオリゴヌクレオチドが発表されたS.セレビシエのアミノ酸241-246及
びアミノ酸331-338と一致する。ファフイア由来のPGK遺伝子及びTPI遺伝子に対
応するプロモーターを単離するためにPCR条件の最適化を必要とするか又は相
同プライマーを用いなければならないことが結論された。高レベルプロモーター
を単離する他の代替的方法は上記詳細な説明において開示されている。
PCR反応からの増幅した断片を精製し、BamHIで消化し、pTZ19Rの脱リン酸
化BamHI部位に結合した。連結反応混合液をCa2Cl法により調製したコンピテント
E.コリDH5α細胞に形質転換し、50μg/ml Amp及び0.1mM IPTG/50μg/mI X-galを
含むLBプレート上に細胞を播種した。pPRGDH1と呼ばれる右挿入断片を有するpTZ
19Rクローンを引き続き挿入断片の配列分析に用いた。
S.セレビシエのGAPDH遺伝子配列との比較によって示されるようにクローン化配
列はファフイアGAPDHのカルボキシ末端断片をコード化した(Holland & Holland,
1979,J.of Biol.Chem.254:9839-9845)。実施例3
ファフィアのGAPDH遺伝子の単離
発現シグナルを含む完全GAPDH遺伝子を得るために、pPRGDH1の0.3kb BamHI断
片を用いてファフィアのコスミドライブラリーをスクリーニングした。コスミドクローニング用ベクターの調製
pMT6に二重コス部位が存在することからベクター調製を単純化した。pMT6をブ
ラントエンドカッターPvuIIで完結まで消化してコス部位を遊離した。消化効率
は、E.コリDH5αへの形質転換でチェックし、>99%であることがわかった。
PvuAII消化pMT6をフェノール:クロロホルム抽出及びエタノール沈降で精製し
、最後に30μl TEに2μg/μlの濃度で溶解した。
引き続き、ベクターをクローニング酵素BamHIで消化し、ベクターアームを上記
のように精製した(“実験”)。標的DNAの調製
ファフイア株CBS6938のゲノムDNAの単離を“実験”部分に記載されたよう
に行った。25-38kbのコスミドpMT6含有挿入断片は、最も効率よくパッケージさ
れている。従って、ゲノムDNAを制限酵素Sau3Aによる部分消化に供した。標
的DNAを異なる量の酵素とインキュベートした。消化直後に、制限混合液から
のDNAをフェノールークロロホルムで抽出することにより反応を停止した。エ
タノール法を用いてDNAを沈殿させ、遠心分離後の沈降DNAを少量のTEに溶
解した。輪郭クランプ均一電場(CHEF)電気泳動を用いて断片の濃度とサイズを測
った(Dawkins,1989,J.of Chromatography 492 ,pp.615-639)。ゲノムコスミドライブラリーの構築
約0.5μgのベクターアームDNAと0.5μgの標的DNAの連結反応を5mM ATP
の存在下に(ブラントエンド連結反応を防止する)全量10μlで行った。ファー
ジヘッドのパッケージングとE.コリLE392へのトランスフェクションは実験に記
載される通りとした。一次ライブラリーは、制限分析で求めた平均挿入断片が28
kbである7582個のトランスフェクタントから構成された。ライブラリーは、Samb
rook(上記)に従って算出したライブラリー中全遺伝子の存在の確率が0.97であ
るゲノムの3.5倍を示す。ライブラリー増幅のためにトランスフェクタント
を8mlのLBブイヨンに再懸濁することによりプールした。4.8mlのグリセロールを
追加した。トランスフェクタント混合液を各々800μlの16個の試料に分け、-80
℃で貯蔵した。この増幅ライブラリーは、2.9×109トランスフェクタントから構
成された。コスミドライブラリーのスクリーニング
このライブラリーから100μlの試料を取り、LBブイヨンで更に希釈(106)し、2
00μlをアンピシリンを含む10LBプレート上に播種した。このプレートを37℃で
一晩インキュベートした。各プレートは300〜400コロニーを含み、フィルターを
調製した。これらのフィルターについて上記のハイブリッド形成と洗浄条件(“
実験”)を用いてGAPDHプローブをスクリーニングした。16時間露光した後、オー
トラジオグラムで3個の強いハイブリッド形成シグナルが見られた。これらの陽
性コロニーから単離したコスミドDNAをpPRGDHcos1、pPRGDHcos2及びpPRGDHco
s3と呼んだ。
ファフィア・ロドザイマ株CBS 6938及びコスミドpPRGDHcos1から単離した染色
体DNAを数種の制限酵素で消化した。DNA断片を上記にように分離、ブロッ
ト及びハイブリッド形成した。オートラジオグラフを-80℃で異なる時間露光し
た。フィルムは、GAPDHプローブとハイブリッド形成する異なる制限酵素によっ
て消化した異なる長さのDNA断片を示した(図1)。
更に、プローブとしてGAPDH断片を用いるファフィアのゲノムDNAのサザン
分析から、GAPDHコード化遺伝子がファフィア・ロドザイマの単コピー遺伝子と
して存在するがサッカロミセス・セレビシエGAPDHでは3種の密接に関係するが
結合していない遺伝子によってコードされると結論した(Boucherieら,1995.FE
MS Microb.Letters 135:127-134)。
同じ酵素で消化した染色体DNAの同じ長さの断片が見られるpPRGDHcos1のハ
イブリッド形成断片をアガロースゲルから単離した。その断片をpUC19の対応す
る部位に結合した。連結反応混合液をコンピテントE.コリ細胞に形質転換した。
3.3kb SalI挿入断片と5.5kb EcoRI挿入断片を有するプラスミドを各々pPRGDH3と
pPRGDH6と呼んだ。pPRGDH3とpPRGDH6の制限地図を図2に示す。pPRGDH1の挿入断
片の配列データの分析から、GAPDH遺伝子のC末端部分にHindIII部位
があることがわかった。このデータから、pPRGDH6の挿入断片がプロモーターと
ターミネーターの配列を含むGAPDHの完全コード配列を含まねばならないことが
示された。
実施例4 GAPDH 遺伝子の確認
多数の特定の配列プライマーを合成することを必要とせずに配列分析を行うた
めに、GAPDH遺伝子の推定コード領域に又はその近傍に便利な制限部位を用いて
プラスミドpPRGDH3とpPRGDH6の多くの欠失構築物を作成した。
プラスミドを消化し、インキュベートした後に制限混合液の試料をゲル電気泳
動で分析して完全消化をモニターした。フェノールークロロホルムで抽出した後
、DNAをエタノールで沈殿した。-20℃で30分間インキュベートした後、遠心
分離でDNAを沈降させ、乾燥し、多量(0.1ng/μl)のTEに溶解する。連結反応
後、混合液をE.コリに形質転換した。これらの形質転換細胞から単離したプラス
ミドDNAを制限分析で分析し、右構築物がわかった。このようにして欠失によ
りpPRGDH3δHIII、pPRGDH6δBamHI、pPRGDH6δSstI及びpPRGDH6δSsalIが構築さ
れる(図1)。
このほかに、pPRGDH6由来の0.6kbと0.8kb SstI断片をpUC19の対応する部位で
サブクローン化した。
pUC/M13前向き及び逆向きプライマー(Promega)を用いて配列分析を行った。配列
戦略を図2に示す(矢印参照)。
S.セレビシエ(Holland & Holland,1979,J.of Biol.Chem.254:9839-9845)
とK.ラクチス(Shuster,1990,Nucl.Acids Res.18,4271)のGAPDH遺伝子配列
との相同性と既知のスプライス部位の一致(J.L.Woolford,1989,Yeast 5:439
-457)に基づいて、イントロン及び可能なATG出発を仮定した。
GAPDH遺伝子は、6個のイントロン(図1)をもち、339個のアミノ酸のポリペプ
チドをコード化する。これは全く予想されず、イントロンがなくしかも共に332
個のアミノ酸からなるK.ラクチスとS.セレビシエのGAPDH遺伝子のゲノム体制と
考えた。ファフィアとK.ラクチスとS.セレビシエのGAPDH遺伝子間のアミノ酸レ
ベルの相同性は、各々63%と61%である。
GAPDH遺伝子のたいていのイントロンは、遺伝子の5'部分に位置する。イントロ
ンIIIを除く全てのイントロンは、S.セレビシエとS.ポンベ(pombe)に見られる分
枝部位保存配列5'-CTPuAPy-3'を含む。
PC遺伝子を用いて上流配列のコンピュータ分析により、2つの推定真核プロモ
ーター要素、TATAボックス(配列番号11の位置249-263)と多数のCap推定シグナル
(配列番号11の位置287と302の間に)が同定された。
実施例5 pUCG418 におけるG418に融合したGAPDHプロモーターのクローニング
GAPDHプロモーターとG418耐性をコード化する遺伝子間の転写融合を構築する
ために、融合PCR法を用いた。
プラスミドpPRGDH6を用いて標準PCRプロトコール(“実験”)によりGAPDHプロ
モーターが増幅された。
PCRミックスにおいてはpPRGDH6とオリゴヌクレオチド配列No.5177とNo.512
6(“実験”における配列)を用いた。全GAPDHプロモーター配列を含む416bpDN
A断片を作成した。更に、この断片は、5'端にHindIII、XhoI及びKpnI制限部位
及びG418耐性をコード化する遺伝子の5'端との12個のオーバーラップを含む。
G418コード配列の5'端の217bp部分を、pUC-G418とオリゴヌクレオチド配列420
6と5127を用いてPCRで増幅した。217bpのG418の5'端を含みかつ前に作成した
GAPDHプロモーター断片の3'端との9個のヌクレオチドオーバーラップをもつ226
bpDNA断片が得られた。3端にMscI部位が含まれた。
ウィザードキットを用いてPCR混合液からPCR断片を精製した。約1μg
のGAPDHプロモーター断片と1μgのG418PCR断片をオリゴヌクレオチド配列517
7と4206と共に融合PCR実験(実験)で用いた。G418の5'部分に直接融合したG
APDHプロモーターを含む621bpDNA断片を作成した。精製した後、DNA断片
をMscIとKpnIで消化した。pUC配列とG418の3'部分を含むpUC-G418の3.4kbのMscI
-KpnI断片をベクターとして用いた。
連結反応混合液をコンピテントE.コリDH5α細胞に形質転換した。挿入したPC
RDNAを含む形質転換細胞コロニーを異なる制限酵素で消化することにより同
定した。
従って、G418マーカー遺伝子に直接融合したGAPDHプロモーターを含むプラス
ミドpPR1を得た。独立した形質転換細胞から単離した3種類のpPR1ベクターを更
にクローニング実験に用いた。
形質転換後、特定の組込み部位に対するプラスミドを標的にするためにファフ
ィアのリボソームDNAの一部を含む3.0bpのSstI断片をpPR1中でクローン化し
た。プラスミドpGB-Ph11のSstIで消化した後にアガロースゲルからリボソームD
NA断片を単離した(欧州特許第590 707 A1号)。この断片をpPR1の脱リン酸化
SstI部位で結合した。連結反応混合液をコンピテントE.コリ細胞に形質転換した
。プラスミドDNAを単離し、制限分析を用いて数個のコロニーが予想したプラ
スミドpPR2を含むことがわかった。完全なクローニング戦略を図3に示す。実施例6 pPR2 によるファフィアの形質転換
ファフィア株6938の形質転換は、下記の変更をしてFaberら(1994,Curr.Gene
t.1994:25,305-310)により以前に記載されたエレクトロポレーション法を用い
て行った。
‐電気パルスは、パルスコントローラ及びバイオラド2mmキュベットを備えたバ
イオラドジーンパルサーを用いて行った。
‐ファフィアを21℃で16時間培養した。
‐1形質転換あたり2×108細胞を5μgの線状ベクターと共に用いた。線状化
は、ファフィアゲノムのrDNA座での組込みを可能にするC1aIを用いてrDN
A配列中で行った。電気パルス(7.5kV/cm,400Ω及び25μF)後、0.5mlのYePD培
地を細胞/DNA混合液に加えた。混合液を21℃で2.5時間インキュベートし、引き
続き40μg/mlG418を含む5個の選択YEDP寒天プレート上に広げた。
表2に示されるように、DNA1μgあたり115個の形質転換細胞を含む形質転
換細胞を生成することができた。多くの実験について判断した平均形質転換頻度
は、50形質転換細胞/μg pPR2であった。閉環状pPR2の形質転換は形質転換をも
たらさず、自律複製配列がベクター配列内に存在しないことを示した。pPR2を用
いて、pGB-Ph9と呼ばれるファフィアの以前に構築された形質転換ベクターに比
べて10〜50倍の形質転換頻度の増加が見られた。後者のベクターでは、ファフ
イアとG418のアクチンインキュベートの5'部分間に翻訳融合が行われた。
形質転換細胞の耐性レベルを分析するために、混合液又はDNA/細胞を異な
る量のG418を含む選択プレート上に塗布した。形質転換細胞の総数はG418の増加
量と共に減少するが、なおかなりの数の形質転換細胞を得ることができた(表3)
。
他の実験では、標準選択条件下(40μg/ml)で得られた30個の形質転換細胞を
50、200又は1000μg/mlを含むプレートに移した。そのプレートを21℃で4〜5
日インキュベートした後、試験した30個の中から23個の形質転換細胞が200
μg/mlのG418を含むプレート上で増殖することができた。1個の形質転換細胞は
、1000μg/ml前後のG418を含むプレート上で増殖することができた。
表2. pGB-Ph9 とpPR2の形質転換頻度
Exp.1 Exp.2
-- 69 8
pGB-Ph9×BglII 46 7
pPR2 ccc n.d. n.d.
pPR2(A)×ClaI 714 56
(B) 639 124
(C) 443 153
4〜5日インキュベートした後の異なる形質転換実験における形質転換細胞(>1
mm)の総数表3
.pGB-Ph9 とpPR2における2種類の異なるG418耐性遺伝子の結果としてのG41 8感受性の比較
濃度 形質転換細胞
G418(μg/ml) の数
pPR2×ClaI pGB-Ph9×BglII(=pYac4)
40 480 2
50 346 -
60 155 -
70 61 -
80 141 -
90 72 -
100 64 -pPR2 形質転換細胞の分析
組込み結果と組込まれたベクターコピー数を分析するために、6個の独立した
形質転換細胞由来の全ゲノムDNAを単離した。従って、これらの形質転換を選
択条件、即ち、YePD+50μg/mlG418下で培養した。染色体DNAをClalで消化
した。DNA断片をゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースに移し、サザンブ
ロツトをファフィアDNAでプローブした。
9.1kbのrDNAバンドのほかに7.1kbの類似の蛍光強度の追加バンドが形質転
換細胞に見られた。このバンドは、線状のpPR2に対応する。これらのバンドの強
度から、コピー数が約100〜140コピーのpPR2であると結論された。これらの結果
はpGB-Ph9に見られるものと似ており、G418耐性改善が組込まれたベクターのコ
ピー数の差のみによるものであることを認めなかった。多コピー結果がpPR2の多
コピー組込み又はrDNAの単コピーの増幅又は双方の結果の組合わせによって
引き起こされるかはわからない。
実施例7 GAPDH ターミネーターをpPR2にクローン化することによるpPR2Tの構築
真核mRNAは、修飾末端配列、詳しくは3'末端ポリ(A)を含む。G418耐性を
コード化する原核遺伝子は、正しい転写終結やmRNA安定性を与える真核終結
シグナルが存在しないので(1994,Raue,H.A.,TIBTECH 12:444-449)、GAPDHの3
'非コード配列の一部を導入した。
これを目的として、GAPDHの281bpの3'非コード領域及び他の追加のクローニング
配列からなる307bpをオリゴヌクレオチド配列5137と5138(“実験”)を用いてP
CRで増幅した。オリゴヌクレオチド配列5137の上流は、GAPDHのコード領域の
最後の14ヌクレオチドと3'非コード領域の17ヌクレオチドからなる。非コード配
列の5番目(T--〉A)と8番目(T--〉C)のヌクレオチドの塩基置換によりBamHI制
限部位が導入された。更に、この断片は3'端にXhoIとHindIII制限部位を含む。
PCR断片をウィザード精製キットを用いてPCR混合液から精製し、BamHI
とHindIIIで消化した。288bp断片を単離し、以前に構築したファフィア形質転換
ベクターpPR2の対応する部位にクローン化し、pPR2Tを得た。
選択薬剤としてG418を用いたファフィアの形質転換の際、改良構築物pPR2Tで
得られた形質転換頻度(DNA1μgあたりの形質転換細胞数)はpPR2(即ち、
ファフィア相同転写終結シグナルを含まない)の形質転換頻度より約5〜10倍高
い。典型的な実験結果を表4に示す。
表4 pGB-Ph9 ,pPR2及びpPR2Tの50μg/mlG418における形質転換頻度
ベクター 形質転換細胞 形質転換細胞/μg DNA
pGB-Ph9(ccc) ‐ ‐
pGB-Ph9(×BglII) 60 1
pPR2(ccc) 1 ‐
pPR2(×ClaI) 3000‐9600 50‐160
pPR2T(ccc) ‐ ‐
pPR2T(×ClaI) 45600 760
pPR2T(×SfiI) 1080 18
pPR2Tで形質転換したファフィア細胞について高レベルのG418の増殖能を試験
した。増殖がなお可能であるG418レベルは、ファフィアプロモーター及び/又は
ターミネーターの存在の結果として形質転換細胞におけるG418耐性遺伝子の発現
レベルを尺度とした。予備的結果から、高レベルのG418で増殖できる形質転換細
胞数はターミネーターを含まないものより著しく大きいことが示される。要約
上記の結果から、GAPDHプロモーター(pPR2)の存在はアクチンプロモーターを
含むベクター(pGB-Ph9)と比べた場合に形質転換頻度のかなりの増加(DNA1
μgあたり1〜少なくとも50個)をもたらすことが結論された。これらの結果は
、GAPDHプロモーターの制御下で優れた発現レベルを示すG418感受性試験で得ら
れた結果(表3及び表4)と一致する。形質転換頻度の差が単にベクターを線状
にすることの差によるものである可能性(BglII、ClaI及びSfiIは全てリボソーム
DNAの内部であるが異なる位置で切断する)は、pPR2(×SfiI)とpGB-Ph9(×Sf
iI)との比較により認められなかった。SfiIで線状にした2種のpPR2とpGB-Ph9間
の形質転換頻度の差はなおかなりある。しかしながら、線状化部位の選択が形質
転換頻度に効果があることが結論される。C1aIによる線状化が好ましい。
GAPDHのような高レベルプロモーター用いて得られた改良は、相同ターミネー
ターが用いられるかに無関係である(pPR2(相同ターミネーターを含まない)はG41
8感受性試験及び形質転換頻度の双方でpGB-Ph9よりはるかに良好である)。
相同ターミネーターの存在は、高形質転換頻度と高発現レベルの双方をもたら
す。この結果は、使用プロモーターに依存しないと結論される。予備的結果から
、pGB-Ph9構築物がpPR2Tに用いたGAPDHターミネーターのような転写ターミネー
ターで完結する場合にかなりの改良が得られることが示される。
下記の実施例は、ファフィア・ロドザイマのカロテノイド生合成に関与する酵
素をコード化するDNAの単離を示すものである。これらのDNA配列は様々な
目的に適切に用いられる。例えば、酵母のような他の生物中で類似の酵素をコー
ド化するDNAを通常のハイブリッド形成法によって検出及び単離するために、
発現すべき異種及び同種下流配列の双方の発現ベクターを構築するために用いら
れる転写プロモーター及び/又はターミネーターを単離するために用いられる。
カロテノイド生合成遺伝子をコード化するDNA配列は、それ自体のプロモータ
ーか又は上記の解糖プロモーターのような異種プロモーターの制御下で過剰発現
を実験するために適切に用いられる。例えば、ファフィア・ロドザイマを本発明
のカロテノイドコード化DNA配列で形質転換すると野生型状態、その結果とし
てコード化酵素の過剰発現に対する遺伝子の増幅がもたらされる。
従って、カロテノイド生合成遺伝子をコード化する1個以上の遺伝子の過剰発
現の効果がこのようにして実験される。β−カロテン、カンタキサンチン、ゼア
キサンチン及び/又はアスタキサンチンのような有効なカロテノイドを多量に生
じるファフィア変異株を得ることが企図される。同様に、カロテノイド生合成経
路に関与する酵素をコード化するDNA配列が細菌、例えば、E.コリ、酵母、例
えば、サッカロミセス、クルイベロミセス、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)
、カンジダ(Candida)、ヤロウィア(Yarrowia)、フィコミセス(Phycomyces)、ハ
ンセヌラ(Hansenula)、ピッキア(Picchia)、真菌、例えば、アスペルギルス(Asp
ergillus)、フサリウム(Fusarium)のような他のホスト及びニンジン、トマト等
の植物に導入される。形質転換と発現に要求される手順は当業者に周知である。菌株
:E.コリXL-Blue-MRF'Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 th
i-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F'proAB laqQZΔM15 Tn10(Tetr)]
ExAssistTM妨害耐性ヘルパーファージ(StategeneR)
P.ロドザイマCBS6938又は
P.ロドザイマasta 1043-3クローニングに用いられるプラスミド
pUC19 APr(Gibco BRL)
Uni-ZAP TM XRベクター(EcoRI-XhoIで消化したλZAPR IIベクター,CIAP処理
;StategeneR)培地
:LB:10g/lバクトトリプトン,5g/l酵母エキス,10g/l NaCl.プレート;+20
g/lバクト寒天.
適切な場合には50-100μg/mlアンピシリン(Ap)、30μg/mlクロラムフェニコー
ル(Cm)及び1mMイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を
添加した。
YePD:10g/l酵母エキス,20g/lバクトペプトン,20g/lグルコース.プレート;+
2Og/lバクト寒天.
分子クローニングの手法は全て実質的にSambrookら,Molecular Cloning:aLab
oratory Manual,2nd Edit.(1989;Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記
載されるように行った。E.コリの形質転換はSambrookらに記載されたCaCl2法に
従って行った。
酵素インキュベーションは、製造業者によって記載された使用説明書に従って
行った。これらのインキュベーションとしては制限酵素消化、脱リン酸及び連結
反応(Gibco BRL)が含まれる。プラスミドDNAのE. コリからの単離は、QIAGEN(
Westburg B.V.NL)を用いて行った。
配列分析については、欠失構築物とオリゴヌクレオチドを作成してTaq DYEプ
ライマーサイクルシークエンシングキット(Applied Biosystems)を用いて完全配
列の配列を決定した。
実施例8 プラスミドの説明
エルウィニア・ウレドボラのカロテノイド生合成に関与する遺伝子の種々の組合
わせを含むプラスミド(pACCAR25ΔcrtE,pACCAR25ΔcrtB,pACCRT-EIB,pACCAR
16ΔcrtX及びpACCAR25ΔcrtX)は、ミサワ教授(キリンビール社;日本)から贈
与された。エルウィニア・ウレドボラのカロテノイド生合成の生合成経路を図8
に示す。
更に、pACCAR25ΔcrtXΔcrtIと呼ばれるpACCAR25ΔcrtXの誘導体を我々の実験室
で作成した。BamHI制限部位でのフレームシフトの導入によりcrtI遺伝子を不活
性化した。このプラスミドを保持するE.コリ株は、コロニーの赤色表現型によっ
てモニターされるフィトエンを蓄積する。
プラスミドは全てクロラムフェニコール耐性を与えるマーカーを含むプラスミド
pACYC184(Rose RE;Nucl.Acids Res.16(1988)355)の誘導体である。更に、これ
らのプラスミドとその誘導体はpUCやpBluescriptのようなベクターに適合しうる
複製起原を含む。各プラスミドは、E.コリ中で異なるカロテノイドの生成を仲介
するエルウィニア・ウレドボラのカロテノイド生合成遺伝子セットを含む。本実
験に用いられるプラスミドの全リストを表5に示す。
表5: 本実験に用いられるカロテノイド産生E.コリ株のまとめ
遺伝子コード:crtE,ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ; crtB,フィトエ
ンシンターゼ;crtI,フィトエンデサチュラーゼ;crtY,リコペンシクラーゼ;crt
X,β−カロテンヒドロキシラーゼ;crtZ,ゼアキサンチングリコシラーゼ
実施例9 ファフィア・ロドザイマのcDNAライブラリーの構築 a) 全RNAのファフィア・ロドザイマからの単離
溶液は全てDEPC処理蒸留水中で調製し、器具は全て0.1%DEPCに一晩浸漬してから
オートクレーブにかけた。
60mlのYePD培養液を含む300ml三角フラスコに前培養物からのファフィア・ロド
ザイマ株CBS6938/1043-3を最終OD6000.1まで播種した。この培養物をOD6003〜4
に達するまで21℃(300rpm)でインキュベートした。
細胞を遠心分離(4℃,8000rpm,5分)で回収し、12mlの氷冷抽出緩衝液(0.1Mトリ
ス-HCl,pH7.5;0.1M LiCl;0.1mM EDTA)に再懸濁した。遠心分離後、細胞を2ml
の氷冷抽出緩衝液に再懸濁し、4gのガラスビーズ(0.25mm)と2mlのフェノール
を加えた。
混合液を、30秒の氷上の冷却インキュベーション間隔を含む最大速度で30秒5回
攪拌した。
細胞/ガラスビーズ/フェノール混合液を遠心分離(5分,15,300rpm,4℃)し、
水相(sup1)を新しい試験管に移し、氷上に保った。
フェノール相を、追加量の1ml抽出緩衝液と2mlのフェノールを加えることによ
り後退させた。
遠心分離(5分,15,300rpm,4℃)後、水相をsup1に移し、同量のフェノール:ク
ロロホルムで抽出した。
遠心分離(5分,15,300rpm,4℃)後、水相を新しい試験管に移し、0.1容量の3M
NaAc;pH5.5と2.5容量のEtOHを加えてRNAを沈殿した(-20℃で一晩インキュベ
ーション)。
沈殿を遠心分離(5分,15,300rpm,4℃)で集め、過剰の液体を排出し、RNA沈
降物を70%氷冷EtOHで洗浄した。
過剰の液体を除去した後、RNAを200〜800μl DEPC処理水に再懸濁した。RN
Aを-70℃で貯蔵した。60ml培養物は400〜1500μgの全RNAを生成した。全R
NAの多能性をホルムアルデヒドRNAゲル電気泳動でチェックした。
b)ポリ(A)+RNAの選択
全RNAからのポリ(A)+の単離を、下記の溶液を用いて実質的にSambrookら,19
89(Molecular cloning,a laboratory manual,2edit.)に記載された通り行
った。
溶液は全てDEPC処理水で調製し、オートクレーブにかけた。
RNA変性緩衝液:1M NaCl;18%(v/v)DMSO.
カラム充填緩衝液(HEND):10mMヘペス,pH7.6;1mM EDTA;0.5M NaCl;9%(v/v)DMSO
.
溶離緩衝液(HE):10mMへペス,pH7.6;1mM EDTA.
オリゴ(dT)−セルロース7型をファーマシアバイオテックから購入した。0.1g
(乾燥重量)のオリゴ(dT)−セルロースを1mlのHENDに加え、浮遊液を4℃で1
時間穏やかに振盪した。全RNA(1.5mgを500μlに溶解した)及び1mlの1MNaCl
;18(v/v)DMSOを65℃で5分間加熱した。次に、600μlのNaCl/DMSOをRNAに加
え、混合し、氷上で5分間置いた。ポリ(A)+の単離を2サイクルの精製で行った
。最終収量は、約45μgポリ(A)+RNAであった。
c)cDNA合成
7.5μgのポリ(A)+RNAからcDNA合成キット(#200401;StrategeneR)を用い
てcDNAを合成した。わずかに変更した説明マニュアルに従って合成を行った
。
SuperScriptTMII RNase H-逆転写酵素(Gibco BRL)をMMLV-RTの代わりに一次鎖反
応に用いた。
下記の試薬をミクロ遠心分離管に加えた。
3μlのポリ(A)+RNA
2μlのリンカー−プライマー
23.5μlのDMQ
70℃で10分間インキュベートし、ミクロ遠心分離管で急速回転し、下記の試薬を
加えた。
10μlの5×一次鎖緩衝液(Gibco BRL製)
5μlの0.1M DTT(Gibco BRL製)
3μlの一次鎖メチルヌクレオチド混合液
1μlのRNaseブロックリボヌクレアーゼインヒビター(40U/μl)
鋳型とプライマーの混合液を25℃で10分間、次に42℃で2分間インキュベートす
ることによりアニーリングし、最後に下記の試薬を加える。
2.5μlのSuperscriptTMII RNase H-逆転写酵素
一次鎖反応を42℃で1時間行った。
サイズ分画をGenecleanR IIキット(BIO 101社製)を用いて行った。XhoI消化後に
得られたcDNA混合液の容量を、DMQを加えることにより最終容量200μlにし
た。3容量のNaIを加え、ミクロ遠心分離管を氷上に5分間置いた。ガラスミル
クの沈降物を500μlの新しい洗浄液を用いて3回洗浄した。最後に、cDNAを
20μlのDMQ中で溶離した。
これらの条件を用いたcDNAの収量は約1μgであった。
d)cDNAクローニング
100ngのcDNAを用いてUni-ZAPTMXRベクター中でcDNAライブラリーを構築
した。連結反応は、12℃の一夜インキュベーションを2回行った。PackageneRλ
DNAパッケージングシステム(Promega)を用いて使用説明書のマニュアルに従
ってcDNAライブラリーをパッケージングした。cDNAライブラリーの滴定
計算値は3.5 106pfuであった。
e)集団切除
アクセプター株としてE.コリXL-Blue-MRF'の誘導体を用いるプロトコールで集団
切除を行った(表5参照)。細胞混合液の希釈液をアンピシリン、クロラムフェ
ニコール及びIPTGを含む145mm LB寒天プレート上に播種し、各プレート上で250
〜7000コロニーを得た。プレートを37℃で一晩インキユベートし、室温で1日又
は2日以上更にインキュベートした。
実施例10 ファフィア・ロドザイマのゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子(crtE) のクローニング a) cDNAクローンの単離
全ライブラリーを、プラスミドpACCAR25ΔcrtEを保持するE.コリXL-Blue-MRF'(X
L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE]と表される)のファルネシルピロリン酸/イソペン
テニルピロリン酸蓄積細胞へ切除した。crtE遺伝子のスクリーニングは、形質転
換細胞の呈色に基づいた。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE]の遺伝的バック
グラウンドにcrtE遺伝子を導入することにより、黄色/橙色のコロニーの存在で
モニターされるゼアキサンチン−ジグルコシドの生合成の完全経路の回復がもた
らされる。適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上に約8,000コロニーが
広がった。1コロニーが黄色/橙色に変化したことがわかった。b) 相補的cDNAクローンの確認
これらのコロニーをLBアンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。この黄色コ
ロニーからプラスミドDNAを単離し、1.85kb断片を含むことがわかった(図2A
)。pPRcrtEと呼ばれる得られたプラスミドを形質転換実験に用いた(表6)。X
L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE]のpPRcrtEによる形質転換のみ表現型が白色から黄
色に変化した。色の変化が相補によるものでありcDNAによるものでないかを
試験するためにpPRcrtEだけをXL-Blue-MRF'に形質転換した。IPTGを含むLB-アン
ピシリン寒天プレート上の形質転換細胞の選択は、コロニーの色の変化を生じな
かった(表6)。従って、IPPとFPPのGGPPへの変換に関与するGPPPシンターゼを
コード化するP.ロドザイマのcDNAがクローン化されたと我々は暫定的に結論
した。
表6: pPRcrtEで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色
形質転換:10ngの各プラスミドをCaCl2コンピテントE.コリ細胞に混合した。適切
な抗生物質(角括弧内)を含むLB寒天培地上に1/10〜1/100容量のDNA/細胞
混合液を播種することにより形質転換細胞を選択した。c) cDNA断片の配列分析
プラスミドpPRcrtEを用いて1.85kb cDNAのヌクレオチド配列を求めた。配列
は1830ヌクレオチドと31bpポリ(A)尾部から構成された。375個のアミノ
酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド配列と推定
アミノ酸配列を各々配列番号14及び配列番号15として示す。ブリッツアミノ酸配
列アラインメントプログラムを用いるSWISS-PROTタンパク質配列データベースの
検索から、特に異なる生物のゲラニルゲラニル-PPiシンターゼcDNA酵素の保
存ドメインI(Botellaら,Eur.J.Biochem.(1995)233;238-248)に対するアミノ
酸相同性(52%の132aaオーバーラップ;ニューロスポラ・クラッサ)が示された。
実施例11 ファフィア・ロドザイマのフィトエンシンターゼ遺伝子(crtB)のクローニング a) cDNAクローンの単離
全ライブラリーを、プラスミドpACCAR25ΔcrtBを保持するE.コリXL-Blue-MRF'(X
L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]と表される)のゲラニルゲラニルピロリン酸蓄積細
胞へ切除した。crtB遺伝子のスクリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた
。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]の遺伝的バックグラウンドにcrtE遺伝子を導入
することにより、黄色/橙色に着色したコロニーの存在でモニターされるゼアキ
サンチン−ジグルコシドの生合成の完全経路の回復がもたらされる。
適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約25,000コロニーをインキュベ
ートした。3コロニーが黄色/橙色に変化したことがわかった。b) 相補的cDNAクローンの確認
これらのコロニーをLB-アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。これらの
黄色のコロニーからpPRcrtB1〜3と呼ばれるプラスミドDNAを単離し、2.5kb断
片を含むことがわかった(図2B)。得られたプラスミド、pPRcrtBの1つを形質
転換実験に用いた(表7)。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]のpPRcrtBによる形
質転換のみ表現型が白色から黄色に変化した。従って、GGPP2分子のプレフイト
エンピロリン酸を介してフィトエンへの変換に関与するフィトエンシンターゼを
コード化するP.ロドザイマのcDNAがクローン化されたと我々は暫定的に結論
する。
表7: pPRcrtBで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色説明:表6参照。
c) cDNA断片の配列分析
最長のcDNA挿入断片を含むプラスミドpPRcrtB2を用いて2.5kbcDNAのヌ
クレオチド配列を求めた。配列は2483ヌクレオチドと20bpポリ(A)尾部から構成
された。684個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌ
クレオチド配列と推定アミノ酸配列を各々配列番号12及び配列番号13として示す
。ブリッツアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いるSWISS-PROTタンパク
質配列データベースの検索から、他の生物のcrtB遺伝子とのアミノ酸相同性(ニ
ューロスポラ・クラッサのcrtB遺伝子の441aaオーバーラップの同一性26%)が示
された。
実施例12 ファフィア・ロドザイマのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(crtB)のクローニン グ a) cDNAクローンの単離
全ライブラリーを、プラスミドpACCAR25ΔcrtXΔcrtIを保持するE.コリXL-Blue-
MRF'(XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI]と表される)のフィトエン蓄積細胞へ
切除した。crtI遺伝子のスクリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた。XL
-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI]の遺伝的バックグラウンドにcrtI遺伝子を導
入することにより、黄色/橙色のコロニーの存在でモニターされるゼアキサンチ
ンの生合成の完全経路の回復がもたらされる。
適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約14,000コロニーをインキュベ
ートした。2コロニーが黄色/橙色に変化したことがわかった。b) 相補的cDNAクローンの確認
これらのコロニーをLB−アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。これらの
黄色のコロニーからpPRcrtI.1とpPRcrtI.2と呼ばれるプラスミドDNAを単離し
、2.0kb断片を含むことがわかった(図2C)。得られたプラスミド、pPRcrtI.1
の1つを形質転換実験に用いた(表8)。XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI]
のpPRcrtIによる形質転換のみが表現型の白色から黄色への変化を生じた。従っ
て、フィトエンのリコペンへの変換に関与するフィトエンデサチュラーゼをコー
ド化するP.ロドザイマのcDNAがクローン化されたと我々は暫定的に結論する
。
表8: pPRcrtIで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色
説明:表6参照。
c) cDNA断片の配列分析
プラスミドpPRcrtIの1つを用いて2.0kbcDNAのヌクレオチド配列を求めた。
配列は2038ヌクレオチドと20bpポリ(A)尾部から構成された。582個のアミノ酸の
オープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド配列と推定アミ
ノ酸配列を各々配列番号16及び配列番号17として示す。ブリッツアミノ酸配列ア
ラインメントプログラムを用いるSWISS-PROTタンパク質配列データベースの検索
から、N.クラッサのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子に対するアミノ酸の相同性
が示された(529aaオーバーラップの同一性53%)。実施例13 ファフイア・ロドザイマのリコペンシクラーゼ(crtY)のクローニング a) cDNAクローンの単離
プラスミドpACCRT-EIBを保持するE.コリXL-Blue-MRF'(XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB
]と表される)のリコペン蓄積細胞へ全ライブラリーを切除した。crtY遺伝子のス
クリーニングは、形質転換細胞の呈色に基づいた。XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB]の
遺伝的バックグラウンドにcrtY遺伝子を導入することにより、黄色のコロニーの
存在でモニターされるβ-カロテン生合成の完全経路の回復がもたらされる。適
切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約8,000コロニーをインキュベー
トした。1コロニーが黄色に変化したことがわかった。b) 相補的cDNAクローンの確認
このコロニーをLB−アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。この黄色のコ
ロニーからプラスミドDNAを単離し、2.5kb断片を含むことがわかった(図2B)
。pPRcrtYと呼ばれる得られたプラスミドを形質転換実験に用いた(表9)。驚
くべきことに、XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB]のpPRcrtIによる形質転換だけでなくX
L-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB]の形質転換も表現型の赤色から黄色への変化を生
じた。
表9: pPRcrtYで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色
説明:表6参照。
以前にクローン化したpPRcrtBのcDNAを含む第2形質転換実験を行った。表
6に示されるようにフィトエンシンターゼをコード化するものとして以前に(実
施例3)単離したcDNAはcrtY欠失を相補うことができ、XL-Blue-MRF'[pACC
RT-EIB]のβ−カロテン生合成を生じる。
pPRcrtY(配列番号18及び配列番号19)のcDNA挿入断片の配列分析からpPRcrtB
のcDNA断片の配列と似ていることがわかった。
これらのデータから、GGPP2分子のプレフィトエンピロリン酸を経由するβ−カ
ロテンに対するフィトエンとリコペンへの変換に関与するフィトエンシンターゼ
とリコペンシクラーゼをコード化するP.ロドザイマのcDNAがクローン化され
たと我々は暫定的に結論する。これは、2種の酵素活性をコード化するカロテノ
イド生合成の生合成経路の最初の遺伝子である。
表10:ファフィア・ロドザイマの異なるcDNAで形質転換したカロテノイド産
生E.コリ株(Ap,Cm,IPTG)の表現型の呈色
説明:表6参照。
実施例14 ファフィア・ロドザイマのイソペンテニルニリン酸(IPP)イソメラーゼ(idi)のク ローニング a) cDNAクローンの単離
全ファフィアライブラリーを、各々がプラスミドpACCRT-EIBを保持するE.コリXL
-Blue-MRF'(XL-B1ue-MRF'[pACCRT-EIB]と表される)のフィトエン蓄積細胞へ切除
した。
適切な抗生物質とIPTGを含むLB寒天プレート上で約15,000コロニーをインキュベ
ートした。1コロニーが暗赤色の表現型をもつことがわかった。b) 相補的cDNAクローンの確認
このコロニーをLB−アンピシリン寒天プレート上に線状に塗った。この黄色コロ
ニーからプラスミドDNAを単離し、1.1kb断片を含むことがわかった。pPRcr
txと呼ばれる得られたプラスミドを形質転換実験に用いた(表11)。
pPRcrtXで形質転換したXL-Blue-MRF'[pACCAR-EIB]のコロニーは全て暗赤色表
現型を有した。これらのデータから、遺伝子操作したE.コリ株のリコペン生産の
増加を生じるP.ロドザイマのcDNAがクローン化されたと我々は暫定的に結論
する。
表11: pPRcrtIで形質転換したカロテノイド産生E.コリ株の表現型の呈色
説明:表6参照。
c) cDNA断片の配列分析
この遺伝子の種類を解決するためにpPRcrtXのcDNA挿入断片の完全ヌクレオ
チド配列を求めた。ヌクレオチド配列は1144bpからなる。配列は1126ヌクレオチ
ドと18ヌクレオチドのポリ(A)尾部からを構成された。分子量28.7kDaを有する25
1個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)を予想した。ヌクレオチド
配列と推定アミノ酸配列を各々配列番号20及び配列番号21として示す。ブリッツ
アミノ酸配列アラインメントプログラムデータを用いるSWISS-PROTタンパク質配
列データベースの検索から、S.セレビシエのイソペンテニルニリン酸(IPP)イソ
メラーゼ(idi)に対するアミノ酸の相同性が示された(200アミノ酸オーバーラッ
プの同一性42.2%)。IPPイソメラーゼは、カロテノイドの5-炭素構造ブロックを
合成するイソプレン生合成経路の不可欠な活性化工程を触媒する。酵母と同様に
ファフィアの遺伝子はidi1と呼ばれる。遺伝子を保持するcDNAクローンはpP
Ridiと呼ばれる。
実施例15 カロテン産生E.コリにおけるP.ロドザイマのidi遺伝子の過剰生産
プラスミドpACCRT-EIBを保持するE.コリXL-Blue-MRF'のリコペン蓄積細胞(XL-
Blue-MRF'[pACCRT-EIB]として表される)をpUC19及びpPRidiで形質転換し、
AmpとCmを含む固化LB培地上で形質転換細胞を選択した。XL-Blue-MRF'[pACCRT-E
IB/pUC19]及び[pACCRT-EIB/pPRidi]と呼ばれる形質転換細胞をAmp、CmとIPTGを
含む30mlのLB培地で250rpm,37℃で16時間培養した。これらの培養物から1mlを
カロテノイドの抽出と分析に用いた。遠心分離後、細胞沈降物を200μlのアセト
ンに溶解し、65℃で30分間インキュベートした。次に、50μlの無細胞アセトン
画分を高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に用いた。カラム(クロムパッ
クcat.28265;パッキングヌクレオシル100C18)を水−アセトニトリル−2−プロ
パノール(9:10:81 0〜45分後、2:18:80 45分)で流速0.4ml/分で展開し、ホトダ
イオードアレー検出器で470+/-20nmを記録した。リコペンの保持時間は、これら
の条件下で約23分であることがわかった。ピーク領域を相対リコペン生産(mAu×
s)として用いた。相対リコペン生産は、XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB/pUC19]と[pAC
CRT-EIB/pPRidi]について各々395と1165であった。
これらのデータから、ファフィア・ロドザイマのidiの発現増強がE.コリでカ
ロテノイド生合成の3倍の増加を引き起こすのでファフィアの代謝経路遺伝子工
学の可能性が示される。
このcDNAは、カロテノイド及び/又はキサントフィルレベルを高めるため
に形質転換ファフィア細胞で過剰発現される。cDNAは、本発明の強力なプロ
モーター、例えば、本明細書に開示されたGAPDH遺伝子プロモーターのようなフ
ァフィア解糖系プロモーター、又は本発明のファフィアリボソームタンパク質遺
伝子プロモーター(下記参照)のようなファフィアで活性なプロモーターの制御
下で適切にクローン化される。場合によっては、cDNAはGAPDH遺伝子ターミ
ネーター/ポリアデニル化部位のような本発明の転写ターミネーター及び/又は
ポリアデニル化部位の前でクローン化される。この方法の可能性を、例示として
エルウィニア・ウレドボラ由来crtB遺伝子がファフィア・ロドザイマで過剰発現
される次の実施例に示す。
実施例16 エルウィニア・ウレドボラ由来カロテン産生遺伝子のファフィア・ロドザイマで の異種発現
エルウィニア・ウレドボラ(Misawaら,1990)のフィトエンシンターゼをコー
ド化するコード配列(crtB)をファフィアのgpd(GAPDH遺伝子)のプロモーターとタ
ーミネーター配列間に融合PCRでクローン化した。2つの別のPCR反応にお
いて、gpdのプロモーター配列とcrtBのコード配列を増幅した。前者の配列をプ
ライマー5177と5128及び鋳型としてpPR8を用いて増幅した。この後者のベクター
は、プロモーター配列が拡張しBglII制限部位が除去されたファフィア形質転換
ベクターpPR2の誘導体である。プライマー5226と5307及び鋳型としてpPRgp6を用
いてPCRでgpdのプロモーター配列を増幅した。増幅したプロモーター断片を
単離し、KpnIとBamHIで消化し、ベクターpPR2のKpnI-BglII断片でクローン化し
てpPR8を得た。プライマー5131と5134及び鋳型としてpACCRT-EIBを用いてcrtBの
コード配列を増幅した。プライマー5177と5134を用いる第2融合PCR反応では
、1μgの増幅プロモーターと鋳型としてcrtBコード領域断片を用いて融合産物P
gpd-crtBを得た。プライマー5137と5138及び鋳型としてプラスミドpPRgdh6を用
いる標準PCR条件下でターミネーター配列を増幅した。プライマー5137は、5'
端にE.ウレドボラのcrtB遺伝子のコード領域の最後の11ヌクレオチドとP.ロドザ
イマのgpd遺伝子のターミネーター配列の最初の16ヌクレオチドを含む。2つの
塩基対置換によって、BamHI制限部位を導入した。増幅した融合産物(Pgpd-crtB)
と増幅したターミネーター断片を精製し、HindIIIとBamHIで消化し、クローニン
グベクターpMTL25の脱リン酸化HindIII部位にクローン化した。構築物Pgpd-crtB
-Tgpdを有するベクターをpPREX1.1と名付けた。
発現カセットPgpd-crtB-Tgpdを含むHindIII断片をpPREX1.1から単離し、ファ
フィア形質転換ベクターpPR8の脱リン酸化HindIII部位に結合した。連結反応混
合液のE.コリへの形質転換後、正しい挿入断片を有するベクター(pPR8crtB6.1)
をファフィア形質転換実験に用いた。
発現カセットPgpd-crtB-Tgpdを保持するpPR8crtB61.1でファフィア株CBS6938
を形質転換し、G418を含むプレート上で形質転換細胞を選択した。3種のG418耐
性形質転換細胞と野生型ファフィア株のOD600あたりのアスタキサンチンの相対
量をHPLC分析で求めた(表12)。ファフィアからのカロテノイド単離については
Sedmakら(1990;Biotechn.Techiq.4,107-112)によって記載されたDMSO/ヘキ
サン抽出方法が用いられる。
表12.E.ウレドボラのcrtB遺伝子を保持するファフィア形質転換細胞の相対ア
スタキサンチン生産
gpd配列は太字で示され、crtB配列はイタリックで示され、クローニング用制
限部位は下線が引かれ、塩基置換は二重下線が引かれている。
実施例17 ファフィアのcrtB遺伝子の単離と確認
crtBに対応するファフィア・ロドザイマ遺伝子を発現すること及びそれ自体の
調節領域の制御下又は本発明の高度に発現したプロモーターの制御下で発現する
ことも可能である。本明細書に開示されたファフィア形質転換の手順は、常に導
入DNAの安定に組込まれた高コピー数をもたらし、それ自体のプロモーターの
制御下での遺伝子の発現はアスタキサンチンを含むカロテノイドの生産増加をも
たらすことも予想される。原理を示すために、下記にcrtBゲノム配列のクローニ
ング用プロトコールを示す。
発現シグナルを含むゲノムcrtB遺伝子を得るために、2.5kb BamHI-XhoI断片を
ベクターpPRcrtBから単離し、ファフィアのコスミドライブラリーをスクリーニ
ングするプローブとして用いた。gapdh遺伝子の代わりにプローブとしてcrtB遺
伝子を用いて実施例3に記載されるようにライブラリーの構築とスクリーニング
を行った。
ハイブリッド形成ラウンド後、2コロニーを同定し、露光後のオートラジオグ
ラムで強いハイブリッド形成シグナルを示した。これらのコロニーから単離した
コスミドDNAを各々pPRgcrtB#1.1及びpPRgcrtB#7と呼んだ。
ファフィア・ロドザイマ株CBS 6938とコスミドpPRgcrtB#7から単離した染色体
DNAを数種の制限酵素で消化した。DNA断片を分離し、ブロットし、上記の
条件下でcrtBのアミノ末端特定プローブ(0.45kb XbaI断片)とハイブリッド形成
した。露光後、オートラジオグラムはcrtBプローブとハイブリッド形成した異な
る制限酵素で消化した異なる長さのDNA断片を示した。EcoRI部位がcDNA
クローンに存在しないことに基づいて、約4.5kbのEcoRI断片をサブクローニング
実験に使用してプロモーター領域の配列を求めかつcrtB遺伝子のイントロン配列
の存在を確かめた。似たサイズのハイブリッド形成断片がEcoRIで消化した染色
体DNAにも見られた。その断片をアガロースゲルから単離し、pUC19の対応す
る部位に結合した。連結反応混合液をコンピテントE.コリ細胞に形質転換した。
pPR10.1及びpPR10.2と名付けられた両方向の正しい挿入断片を有するプロモータ
ーを形質転換細胞から単離した。XbaIで消化したpPR10.1/pPR10.2とpPRcrtBの制
限パターンを比較すると、cDNAクローンの内部の2.0kbXbaI断片が前者のベ
クターでは大きいことがわかったので1個以上イントロンの存在を示した。サブ
クローンpPR10.1をいわゆるプライマーウオーキング法によるプロモーター領域
及び構造遺伝子の配列分析に用いた。挿入断片の部分配列を配列番号22に示す。
cDNAとゲノム配列の比較から4個のイントロンの存在がわかった。
実施例18 高発現レベルを有するプロモーター配列の単離
本実施例は、高度に発現した遺伝子から転写プロモーターを得るために詳細な
説明で言及した“cDNA配列法”の可能性を示すものである。
高発現レベルを示すファフィア・ロドザイマ遺伝子からの転写プロモーター配
列の単離と同定については、下記の手順でファフィア・ロドザイマのcDNAラ
イブラリーを分析した。
cDNAライブラリーをAmpを含む固化LB培地上に播種し、プラスミド単離用
に96コロニーをランダムに集めた。精製したプラスミドをXhoIとXbaIで消化し、
アガロースゲルに充填した。cDNA挿入断片のサイズは0.5〜3.0kbで変動した
。引き続き、これらのプラスミドを鋳型としてT3プライマーを用いる単一配列反
応に用いた。17個のcDNAクローンについては、配列データは得られなかった
。得られた配列を3つのリーディングフレームで翻訳した。各cDNA配列につ
いては、最長推定アミノ酸配列をブリッツプログラムを用いてEBIのスイスプロ
ットタンパク質データベースと比較した。18個の推定アミノ酸配列については、
既知のタンパク質に対する相同性が見られないが、6個のアミノ酸配列は仮定の
タンパク質に対してかなりの相同性を示した。55個のアミノ酸配列は機能が既知
のタンパク質に対してかなりの相同性があることがわかった。約50%(38/79)が12
個の全長配列が得られたリボソームタンパク質をコード化することがわかった。
表13.タンパク質をコード化した発現cDNAの概要及び配列表の参照配列相同性によって、ファフィア中で40Sリボソームタンパク質S37が他の生物
にも同様に見られるユビキノンに融合することが結論された。全長cDNAクロ
ーンのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を配列表に示す。6個のリボソーム
タンパク質は1を超える個々のcDNAクローンでランダムプールに示された。
40Sリボソームタンパク質S10(配列番号44)、S37(+ユビキノン)(配列番号24)及び
S27(配列番号28)が2回示され、60S(酸性)リボソームタンパク質P2(配列番号38)
、L37(配列番号46)及びL25(配列番号36)は3回見られた。これらの結果から、こ
れらのタンパク質が複数の遺伝子によってコード化されること及びこれらの遺伝
子が高度に発現されると我々は結論する。従って、これらのプロモーター配列の
単離はファフィア・ロドザイマから高レベルの発現シグナルを単離する新しいか
つ有望な標的である。更に、ニューロスポラ・クラッサ(Curr.genet.14:545-55
1(1988))由来の豊富なグルコース抑制遺伝子に対する50%相同性を示すcDNA
クローンを単離した。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を配列番号26に示す
。かかるプロモーター配列の利点の1つは、大量ファフイア・ロドザイマ発酵で
の別個の増殖(バイオマス蓄積)と遺伝子発現(産物蓄積)に用いられることで
ある。
問題の(上記)プロモーター配列の単離については、GAPDH遺伝子プロモータ
ーに記載された方法(上記実施例3)に従ってファフィア・ロドザイマのゲノム
ライブラリーをスクリーニングするために対応するcDNAクローン由来断片が
プローブとして用いられる。プロモーターの決定されたヌクレオチド配列に基づ
いて、実施例5(上記)に示した手順による融合PCR法によってプロモーター
と問題の遺伝子間の転写融合を構築するために特定のオリゴヌクレオチドが設計
される。
実施例19 異種ハイブリッド形成によるカロテン産生遺伝子の単離
ファフィア・ロドザイマに関係する生物由来の対応するカロテノイド生合成経
路遺伝子の同定と単離については、異種ハイブリッド形成実験を適度なストリン
ジェンシーの条件下で行った。これらの実験では、2種のカロテン産生真菌(ニ
ューロスポラ・クラッサ及びブラケスレア・トリスポラ)由来染色体DNA及び
酵母S.セレビシエと3種の酵母及びシストフィロバシジウム(Cystofylobasidium
)
属の真菌種由来の染色体DNAを用いた。これらの3種のカロテン産生酵母は、
系統分類実験に基づいてP.ロドザイマに最も関係のあるものである。
酵母種シストフィロバシジウム・インフィルモーミニアタム
(Cystofylobasijium infirmo-miniatum)(CBS 323)、C.ビスポリジイ(bisporidii
)(CBS 6346)及びC.カピタタム(capitatum)(CBS 6358)由来染色体DNAを、欧州
特許第0 590 707 A1号の実施例3に記載されるファフィア・ロドザイマに開発さ
れた方法に従って単離した。該特許の関連した部分の記載は本願明細書に含まれ
るものとする。真菌ニューロスポラ・クラッサ及びブラケスエア・トリスポラ由
来染色体DNAの単離は、実質的にKolarら(Gene,62:127-134)に記載されたよ
うに行った。該文献の関連した部分の記載は本願明細書に含まれるものとする。
C.インフィルモーミニアタム、C.ビスポリジイ、C.カピタタム、S.セレビシエ
、P.ロドザイマ、N.クラッサ及びB.トリスポラの染色体DNA(5μg)をEcoRIを
用いて消化した。DNA断片を0.%アガロースゲルで分離し、ブロツトし、下記
の条件を用いてハイブリッド形成した。
ハイブリッド形成を4種類の異なる32P標識ファフィアプローブを用いて2種
の温度(50℃と55℃)で行った。鋳型としてcDNAクローンpPRcrtE、pPRcrtB
、pPRcrtI及びpPRidiからXhoI-XbaI断片を用いてランダム開始ヘキサヌクレオチ
ド標識反応を用いてプローブを作成した。ハイブリッド形成を指定した温度でo/
n(16時間)を行った。ハイブリッド形成後、フィルターを3×SSC;0.1%SDS;0.05%
ピロリン酸ナトリウムの溶液を用いてハイブリッド形成温度で30分間2回洗浄し
た。フィルターをカセットのX線フィルムに-80℃で20時間曝露した後フィルム
を現像した。
P.ロドザイマのcrtEのcDNAクローンを用いて、C.インフィルモーミニアタ
ム、C.カピタタムについてわずかなシグナルが得られた。P.ロドザイマのcrtBの
cDNAクローンを用いて、C.インフィルモーミニアタム及びC.カピタタム由来
DNAの高分子量部分に対するシグナルが得られた。更に、消化したB.トリスポ
ラ由来染色体DNAで充填したレーンに強いシグナルが得られた。P.ロドザイマ
のcrtIのcDNAクローンを用いて50℃でC.カピタタムについてわずかなシグナ
ルが得られた。P.ロドザイマのidiのcDNAクローンを用いてC.インフィルモ
ーミニアタム、C.ビスポリジイ及びC.カピタタムで両方の温度でわずかなシグナ
ルが得られた。消化したB.トリスポラ由来染色体DNAで充填したレーンに強い
シグナルが得られた。
カロテノイド生合成cDNA又は遺伝子、又はidi cDNA又は遺伝子は、適
度なストリンジェントハイブリッド形成及び洗浄条件(50〜55℃,3×SSC)を用い
るP.ロドザイマカロテノイド生合成酵素、又はイソペンテニルピロリン酸イソメ
ラーゼコード配列を各々コードするcDNA断片と交差ハイブリッド形成するこ
とにより他の生物、特に他の酵母種から単離されると我々は結論する。寄託微生物
pGB-Ph9を含むE.コリを、1993年6月23日、Centraal Bureau voor Schimmelcu
ltures,Oosterstraat 1,Baarn,オランダに受託番号CBS 359.3として寄託した
。下記の菌株は、1996年2月26日、Centraal Bureau voor Schimmelcultures,O
osterstraat 1,Baarn,オランダにブダペスト条約に基づいて寄託した。
ID No. 微生物 関連した特徴 寄託No.
DS31855 E.コリ P.ロドザイマのcrtY CBS 232.96
DS31856 E.コリ P.ロドザイマのcrtI CBS 233.96
DS31857 E.コリ P.ロドザイマのcrtE CBS 234.96
DS31858 E.コリ P.ロドザイマのcrtB CBS 235.96
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
//(C12N 1/19
C12R 1:645)
(C12N 9/00
C12R 1:645)
(C12P 21/02
C12R 1:645)
(C12P 23/00
C12R 1:645)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G
E,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,
MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK
,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,
VN
(72)発明者 フェルドゥース ヤン コルネリス
オランダ エヌエル―6706イェーエス ワ
ーヘニンゲン ファン デル ワウストラ
ート 50
(72)発明者 ヴェリー ヤン
オランダ エヌエル―6703セーハー ワー
ヘニンゲン デイクストラート 7