JP2000506835A - Modified cytokines for therapy - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の目的は、サイトカインを治療的に使用するための新しい方法と新しい製品である。この方法は、特別な病理的標的に到達できる成分A（例えばビオチン化抗体）、第２の成分B（例えばアビジン）、さらに続いて成分Bに結合できてサイトカインとコンジュゲートしている成分（成分C、例えばビオチン）の連続的投与に基づくものである。本方法により、修飾サイトカイン（C-サイトカイン）の局所濃度を人工的リセプターＢとの相互作用により上げることができ、人工的リセプターにより仲介される局所的生物学的応答を引き起こす事ができる。   (57) [Summary] The aim of the present invention is a new method and a new product for the therapeutic use of cytokines. This method involves the use of a component A (eg, a biotinylated antibody) that can reach a particular pathological target, a second component B (eg, avidin), and subsequently a component that can bind to component B and is conjugated to a cytokine (component C, for example biotin). By this method, the local concentration of the modified cytokine (C-cytokine) can be increased by interaction with the artificial receptor B, and a local biological response mediated by the artificial receptor can be triggered.

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：治療用の修飾サイトカイン 本発明は治療用修飾サイトカインに関する。免疫機構は、異なる炎症的刺激、 外傷、ウイルス及びバクテリアの感染或いは癌のような細胞の退化のシグナル等 に応答してサイトカイン及び他の体液性因子を生産する。"リンフォカイン"、" モノカイン"及び"サイトカイン"のような用語は元来、リンパ球、単球、及び非 リンパ球細胞から由来する生産物を区別するために作り出されたものであるが、 その後これらのカテゴリーの間に一種のオーバーラップがでてきた。それ故に、 用語"サイトカイン"は"リンフォカイン"、"モノカイン"の同意語として現在使用 されており、今後はこの認められた用語が使用される。当該分野で知られる殆ど のサイトカインのリスト及びそれらの生物活性のリストが、Aggarwal B．B．及 びPocsik E.により報告されている。 異なるサイトカインが抗腫瘍、抗ウイルス、及び抗菌活性を示すことはよく知 られている。インビトロ及び動物モデルのインビボで観察されるその様な活性に 基づいて、いくつかのサイトカインが既に人の治療に使用されてきた（De Vita ら、1995年、"癌の生物学的治療"Lippincott社、Phyladelphia）。例えば、イン ターロイキン-2(ＩＬ-2)及びインターフェロンα(IFNα)のようなサイトカイン は腎転移性癌、ヘアリー細胞白血病、カポシ肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫等 の異なるタイプの腫瘍を持つ患者に有効な抗腫瘍活性を示してきた。IFNβ、腫 瘍壊死因子(ＴＮＦ)α、ＴＮＦβ、ＩＬ-1、４、６、12、15及びコロニー刺激因 子(CFSs)のような他のサイトカインがあるタイプの腫瘍に対しある抗腫瘍活性を 示してきた。従って、これらのサイトカインはさらに研究の対象になっている。 別のサイトカインは感染症の治療に使用されてきた（Aggarwal B．B．及びＰｏ ｃｓｉｋ E．）。 一般に、サイトカインの治療的投与はその全身毒性により非常に制限されてい る。この事は人に治療的に有効な量を使用するときに重大な問題となるので、そ の治療効果を維持しながらこのクラスの生物学的作動体の毒性を低くすることを 目的として、新しいサイトカイン誘導体や新しい治療方法を開発すべく多くの試 みがなされてきている。 腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)αは象徴的な例である。 TNFは主にマクロファージにより分泌され、ある腫瘍の出血的壊死を誘導する 能力に対し始めて発見されたサイトカインである（Carswellら、1975年）。その 後、TNFが、異なる腫痛系に細胞毒性的及び細胞静的効果を与える以外に、炎症 及び免疫応答の制御に重要な他のいくつかの生物学的効果を与えることができる ことが示された(Beutler及びCerami、1989年；Fiers、1991年)。 TNFが、それが生産される生物に対し健康的或いは毒性的効果をその濃度、そ の生産部位、及びその作用部位での持続時間の関数として与えることができると いう考えが、現在信じられている。例えば、少量のTNFに慢性的にさらすと悪液 質が引き起こされる。一方、TNFの急性高生産は重篤な血管障害、ショック及び 死亡すら引き起こす（Beutler及びCerami、1989年）。 TNFの潜在的抗腫瘍活性は動物及び人で実施された種々の試験で評価されてき た。その様な試験により、TNFによりインビボで引き起こされる抗腫瘍活性は、 内皮細胞への直接的効果により及び炎症と免疫応答の活性化により腫瘍の血管系 に損傷を誘導する能力にほとんど依存していることが示唆された(Sidhu及びBoll on、1993年)。逆に、TNFの腫瘍細胞に対する直接的細胞毒性はあまり重要と考え られなかった。 異なるタイプの腫瘍に対し実施されたTNFの臨床試験(第2相)は顕著な抗腫瘍活 性を示さなかったけれど、他の薬剤（IF_γ、IL-2、アルキル化試薬、メルファラ ン等）と併用してTNFを使用することにより元気づける結果が得られた。しかし ながら、種々のタイプのTNF誘導毒性効果がその薬理学的有効量を使用すること を強く限定していることが、一般的に特筆された（Spriggs及びYates、1992年） 。その代わり、全身的毒性効果を減らすように高容量のTNFを局部的な治療（例 えば、メラノーマ患者の脚に還流することにより）に用いることによりかなりの 成功を納めた（Lienardら、1992年）。 別の異なるTNFをベースとする治療法が、抗腫瘍活性を損なうことなしに最高 許容量の増加と全身的毒性効果の減少によりTNFの治療効果を増すことを目的と して、現在評価中である。抗腫瘍効果を引き起こすのに必要な量を約一桁減らす とよく許容できるようになる事が推定されてきた。 この事は以下のように試みられた。 ａ）TNFを腫瘍に届け、その局所的濃度を高めることができる融合蛋白の開発。 例えば、TNFと腫瘍特異的抗体を含む融合蛋白が製造された（Hoogenboomら 、 1991年）； ｂ）抗腫瘍活性を維持し低い全身的毒性を持つTNF変異体の開発。それ故に、選 択的にひとつのリセプターのみを認識することができる変異体（p55または p75）が既に調製された（Loetscher Hら、1993年）。 ｃ）TNFの抗腫瘍活性を損なう事なしにその毒性作用を低下することができる抗 TNF抗体の使用。その様な抗体は既に報告されている(Rathienら、1992年)。 ｄ）より高い半減期を持つTNF誘導体の使用（例えば、TNFとポリエチレングリコ ールとのコンジュゲート）。 この様な方法の薬理学的潜在能力は現在評価中である。 得られたデータはTNFの抗腫瘍剤としての使用を推奨するけれども、その全身 的毒性の問題は現在まだ解決されていない。 ビオチン-アビジン相互作用を利用した常磁性または放射性同位体の細胞毒性 試薬のデリバー・システムが最近報告された（EP251494及びEP496074）。 特に、EP251494には診断もしくは治療剤を投与するためのシステムが記述され ている。この診断若しくは治療剤は、アビジンまたはストレプトアビジンとコン ジュゲートした抗体、コンジュゲートした抗体と複合体を作れる試薬及びビオチ ンとコンジュゲートした診断または治療剤を含む化合物とを含み、抗体により認 識される標的細胞上でのビオチン−ストレプトアビジン相互作用により治療また は診断剤の局在化を可能とするように、連続的にまたは適当に遅延されて投与さ れる。 上述の治療または診断剤は、金属キレート、特に放射性核種と、シスプラスチ ン、ドキソルビシン等のような低分子量抗腫瘍剤とのキレートを含む。実際、こ のシステムは50000ダルトン以上の分子量の化合物には適当ではなく（好ましく は10,000ダルトン以上ではない）、必然的にTNF（51000）のようなサイトカイン には適用できないことが明らかに指摘されている。 EP496074には、ビオチン化抗体、アビジンまたはストレプトアビジン、及びビ オチン化診断または治療剤の連続的な投与を提供する方法が記載されている。又 、このケースではリシン（細胞毒性鎖が約30000ダルトンの分子量を持つ蛋白質 ）のような細胞毒性試薬が記述されているが、大部分は放射能標識化合物に関す る適用が開示されている。 WO95/15979には標的細胞に高度に毒性の試薬（Ｉ）を局在化する方法が開示さ れている。それは、リガンド（Ｌ）または抗リガンド（ＡＬ）とコンジュゲート した特異的標的分子を含む第一コンジュゲート（C1）の投与と、引き続き抗リガ ンド(AL)またはリガンド（L）に結合した毒性剤（Ｉ）を含む第二コンジュゲー ト(C２)の投与に基づくものである。この場合、サイトカインは、Ｌ/ALに対する アビジン/ビオチン系と同様にTNFを含む毒性剤（Ｉ）の例として挙げられるけれ ども、サイトカインが使用されるときはリガンド(L)又は（ＡＬ）の投与はサイ トカインを解離して"フリー"なサイトカインに生物効果を引き起こさせるために 特に好まれるということが推諭される。これは結合したサイトカインがそのリセ プターとは反応できずさらに目的とする生物学的効果を有効に働かすことができ ないという事実のためであろう。L又はALの必要量は細胞表面への結合に対し拮 抗するためには比較的高くなるものと思われるが、毒性の問題が出て来る可能性 がある。さらに、Ｌ/ALがビオチン/アビジンに対応する時、この相互作用が非常 に安定である事を考慮すると（既知の相互作用の中で最も強い非共有結合、Kd＝ 10^-15M）、この結合は実際は解離不能である（D．Savageら、アビジン−ビオチ ンの化学：ハンドブック、Pierce Biotech社（Rockford）。 WO95/15979にはクレームの方法にサイトカインの使用をサポートする特別な実 験データは報告されてなく、その方法をこのクラスの物質の局在化に適用するた めに必要な再生可能で実用的な開示内容を提供するには不十分な一般的記述のみ 報告されている。このクラスの物質は単純な細胞毒性機構によってではなく、直 接的な細胞毒性効果を引き起こさずに抗腫瘍効果を示すことができる複雑な前炎 症的、免疫刺激的、血液凝固的、壊死的機構により作用する。他方、上述の明細 書EP-251494及びEP−496074の試薬を使用することが要求されている。 驚いた事には、WO95/15979に報告されている一般的指示とは反対に、コンジュ ４４ゲートサイトカインと標的特異的コンジュゲート成分との相互作用がリガン ド/ 抗リガンドカップルのコンジュゲーションの場合のように直接的ではなく、むし ろ標的特異的成分とサイトカインの間をブリッジとして結合できる第３の成分に より仲介されるようなシステムによってのみサイトカインが生物学的に活性な形 で有効に局在化することができることが見出された。 本発明の方法により、サイトカインは結合した形でも機能することができ、リ ガンド/抗リガンドカップルのメンバーの投与はサイトカインを活性な形にする のに必要ではない。リガンドにコンジュゲートしたサイトカインは細胞表面上の 膜リセプターと相互作用できる一方、適当なリガンドとコンジュゲートした標的 特異成分との相互作用に含まれる対応する抗リガンドと相互作用することは予期 できなかったので、上記のような結果は思いがけない事と考えることができる。 この様に本発明は連続的な治療剤の使用に対し組み合わせた調剤の形で薬学組 成物を提供するものである。この薬学的組成物は； ａ）少なくとも３成分からなるリガンド/抗リガンド/リガンドのシステムのリガ ンドとコンジュゲートしている抗病理的標的化合物； ｂ）化合物ａ）のリガンドと相補的な抗リガンド； ｃ）抗リガンドｂ）と相補的なリガンドにコンジュゲートしたサイトカイン。但 し、リガンド/抗リガンド/リガンドの相互作用が、サイトカインとその天然 のリセプターとの間の親和力より少なくとも一桁高い親和力により特徴づけ られている。 本発明により、化合物ａ）とサイトカインにコンジュゲートできる化合物の例 としては、ビオチンやヂゴキシケニンのようなハプテンが挙げられる。一方、" 抗リガンド"化合物の例としては抗ハプテン抗体（例えば、抗ビオチン抗体及び 抗−ジゴキシゲニン抗体）または、ビオチンがリガンドとして使用されるときは 、アビジン及びそのアナローグ（例えばストレプトアビジン、ニュートロアビジ ン）が挙げられる。 好ましくは、化合物ａ）とサイトカインの両方がビオチンにコンジュゲートさ れ、一方アビジン（またはその類似化合物）が抗リガンドとして使用される。サ イトカイン及び抗体のコンジュゲーションに使用される技術は広く知られていて 化学的または遺伝子工学的方法諭により結合されることができる。 抗病理学的標的化合物ａ）は好ましくは、全体または部分的抗体またはモノク ローナル抗体である。上述の抗体はすでに報告されており、広く、特に腫瘍抗原 に対する抗体の場合に使用されている。 本発明により使用することのできるサイトカインまたはリンフォカインの例と しては、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因 子（CSF）などが挙げられる。リポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はその誘導体 のような内在性サイトカインの局所的放出を亢進できる生物学的応答調節剤を使 用して局所的効果を高め、全身的効果を下げることも可能である。 さらに、サイトカインは時々相加的または相乗的効果を示すことができる事が 知られているので、本発明の基礎となっている方法は、全身レベルでの効果をよ り少なくして相乗的局所効果を得るために実施することができる。癌の生物学的 治療及び異なるサイトカインの組み合わせの効果は広く記述されており、De Vit aら(1995年、癌の生物学的治療、Lippincott社、Phyladelphia)によりよく要約 されている。 サイトカインの中でTNFの使用が特に好まれる。 好ましくは、コンジュゲート相互の相互作用または人工リセプターとの相互作 用は、サイトカインの膜リセプターの親和定数よりも少なくとも一桁高い親和定 数と、サイトカインが天然のリセプターと相互作用するときよりも少なくとも一 桁低い速度諭的解離定数により特徴づけられるであろう。 抗標的化合物またはコンジュゲート抗体は局所的に投与することができ、ある いは血流に注入することができて、過剰の循環化合物または抗体が身体から除か れるまでインビボで抗原または認識細胞構造と反応することができ、一方有意な 部分が病理学的標的に結合したままである。この時点で抗リガンドｂ）が投与さ れ、引き続きコンジュゲートサイトカインが抗体または抗標的化合物との結合が 形成されることができる濃度で投与される。このようにしてサイトカインが標的 細胞に固定され長時間持続することが可能となる。 修飾サイトカインの"人工"リセプター(抗リガンドにより表される)からの解離 時間は、"天然"リセプターからの解離時間と比べて少なくとも一桁長いならば、 このことは達成できる。本発明の応用に関する実施例が実証しているように、腫 瘍抗原特異的ビオチン化抗体、ニュートラビジン及びビオチン−TNF（bio-TNF） を含むシステムにより本発明は実施できる。このシステムでは、10^-15Ｍに等し いbio-TNFと人工リセプター（アビジン）との間の親和力、及び10^-9Ｍから10^-10 Ｍに等しいbio-TNFとその天然リセプター(TNF-R1及びTNF-R2)との間の親和力は 、人工的リセプターが提示される場所(腫瘍)でのＴＮＦの固定と長い持続が好ま れるようになっている。 本発明の好ましい実施形態では、腫瘍抗原に特異的なビオチン化モノクローナ ル抗体が、病変内または病変側投与、腔内（例えば、膀胱、腹腔）投与、動脈（ 肝臓、中枢神経）投与により、または全身レベル、局所または局部での血管還流 （脚の還流液、肝臓、胸部）により腫瘍と接触させられ、引き続きニュートラビ ジンまたはストレプトアビジン及びＴＮＦ−ビオチンのアナログ的連続投与が行 われる。 好ましくは、数時間のインキュベーション時間が各投与の間に挿入され、血管 系が過剰の試薬を除く事が可能となり、それ故に腫瘍標的へのより優れた局在が 得られる。 さらに、アミノ末端領域（１−11残基、ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫ配列）でビオ チン化したＴＮＦの利用が好ましい。それにより、ＴＮＦとその天然リセプター との多価結合が妨げられず、その作用が不活性化されない。或いは、既知の技術 で容易にビオチン化できる基を持つアミノ酸（リジン、システイン、チロシン、 ヒスチジン等、Savageらによるアビジン−ビオチン化学：ハンドブック、Pierce Biotec社を参照）が同領域に遺伝子工学的手法により挿入できる。また。グリコ シル化シグナルを挿入して、その結果炭水化物残基の特異的ビオチン化が、例え ばビオチン−ヒドラジドまたはその誘導体を用い得られる。アミノ末端領域での TNFのビオチン化は、TNFと直接にビオチン化される蛋白質フラグメントとのコン ジュゲートを発現系により構築する遺伝子工学的手法により同様に容易に得る事 ができる。その様な蛋白質の例としては、E．Coli由来のアセチルCoAカルボキシ ラーゼ及びビオチン化部位を持つそのC端側領域により代表される。 アルファーアミノ基のビオチン化は、ビオチン−TNFの構造を非ビオチン化TNF の構造に最も近い形に維持するために好まれる。このことは、ビオチン-6-アミ ノカプロイル-N-ヒドロキシサクシミドエステルの5.5から7．５の間のpHでの反 応に基づいたビオチン化のプロトコールを用いて達成できる。或いは、アビジン または膜蛋白質との相互作用の能力が、例えば上述のひとつの方法によりビオチ ン化したTNF由来のサブユニットと非ビオチン化TNF由来のサブユニットとを混合 することにより維持されるようにビオチン化TNFを得る事ができることが見出さ れた。 好ましくは、4℃で１：３の割合のビオチン化及び非ビオチン化TNFの混合物を 24から72時間インキュベートして、混合反応が実施される。N-末端でコンジュゲ ートしたこの様な形のTNFは新しく、さらに程度の進んだ発明の局面を表す。 本発明の組成物を商品化してルーティンに利用できるように、適当な治療物質 を含むキットを調製することができる。好ましくは、本発明によるキットは； − 5から10mgのビオチン化抗体を含むヴァイアル； − 5から100mgのアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラビジンを含 むヴァイアル； − 5から10mgのビオチン化TNFを含むヴァイアル(または他のビオチン化サイ トカイン) を含む。 本発明の方法は既知の方法、例えばサイトカインと抗体の直接的コンジュゲー ションから由来する利点と比べて幾つかの利点を提供する； １）例えば、必ずしも高い抗体親和力が要求されない。というのは、比較的高い 量の抗体とアビジンが投与され、引き続き相対的に低い量のビオチン-TNFが 投与され、とにかく、腫瘍が効果的にラベルされる事が可能であるからであ る。他方、抗体の量が常にTNF-量にリンクしている従来の抗体−TNFコンジ ュゲートの場合はこのことは不可能である。 ２）分離した抗体とTNFが腫瘍組織に分散していく可能性は、分子量が低いため に抗体-TNFコンジュゲートで得られるものより良い。 ３）アビジン及びストレプトアビジン（10^-15Ｍ）のような高い親和力の分子で 腫瘍をラベルすることは、人工リセプター（アビジン）との相互作用が熱力 学的及び速度諭的に好まれ、さらに全身レベル（10^-9Ｍから10^-10Ｍ)での天 然 リセプターとの相互作用が妨げられるように、ビオチン-TNFの量を選択する ことが可能である。抗体−TNFコンジュゲートの場合は、10^-15Ｍのオーダー の親和力で腫瘍抗原に結合できる抗体を得ることは極端に困難である。 本発明は以下の実施例においてさらに説明される。実施例は特に腫瘍病理の治 療に言及しているけれども、同じ方法が、サイトカインによる局所治療が使用で きる各々別の病理の治療に対しても採用できることは容易に理解できる。 実施例１ この実施例は次のシステムに基づく本発明の応用を示す。 病理学的標的：Ａ：Ｂ：C-サイトカイン ここで、 病理学的標的＝マウス抗原Thy1.1を発現しているマウスリンパ腫（対立遺伝子Th y1.1(RMA Thy1.1C1.2)を発現するように遺伝子組み替えされているRMA細胞）;A ＝ビオチン化抗Thy1.1モノクローナル抗体（ｍAb bio-19E12） B=ニュートラビジン C-サイトカイン＝ビオチン-TNFコンジュゲート ここで (：)は非共有結合相互作用を表し、 (-)は共有結合を表す。材料 − AH-BNHS（ビオチン6-アミノカプロイル-N-ハイドロキシサクシンイミド エステル）(SPA、B002-61) − SULFO-NHS-LC-ビオチン（Pierce、21335） − ヒトTNFα（1ｘ108 U/mg）(DRG080) − リジン（Sigma cod．L5501） − 培養液：滅菌ＲＰＭI-1640（Gibco 31870-025） − 子牛胎児血清（FCS）（PBI-Biological Industries、cod.04―001―1A） − 子牛胎児血清（FCS）（Sigma、F2442） − Geneticin（G418、Sigma cod.G9516）100ｍＭHepes中 − Hepes（Sigma、H0887） − 200mMグルタミン（Gibco cod.04305030D） − 10,000IU/mlペニシリン、10,000mg/mlストレプトマイシン、25μg/ml アンフォテリシンB（Gibco cod.15240-021） − NaCl（BDH cod.10241） − HCl37％（BDH cod.10125） − 細胞培養用96穴平底PVCプレート（Costar 3595） − 96穴丸底プレート（PBI、650180） − 2-メルカプトエタノール（Merck cod.12006） − アクチノマイシンD（Fluka 01815） − チアゾリルブルー（ＭＴＴ）（Merck 11714） − PBS（NaCl 0.15M、Na-燐酸0.05Ｍ、pH7.3） − ニュートラビジン（Pierce cod.31000） − アジ化ナトリウム（Baker、9099） − mAb 19E12 実施例１．１ ビオチン化19E12mAb抗体（bio-19E12）の調製 1000μlの19E12mAbの溶液（１mg/ml、pH8.5の重曹水中）と34μlの硫黄-NHS-L C-ビオチン溶液(１mg/ml、モル比はｍAb/ビオチン：1/24)がピペットでEppendor fチューブに分注された。混合物は室温（23/24℃）で30分間インキュベートされ た。インキュベーション後、混合物は4℃で2リッターのPBSに対し終夜透析され 、4℃に維持された。 実施例１．２ ビオチン-TNF（bio-TNF）の調製 この章ではビオチン-TNFコンジュゲートの調製に使用されるいくつかのプロト コールの実施例が報告される。 実施例１．２．１（bio-TNF cod.＃Bの調製） 60μlの２回蒸留水中TNF溶液（0．5mg/ml）、6μlの1M炭酸ソーダ水pH6.8、6 μlのAH-BNHS、DMSO中3mg/ml（モル比TNF/ビオチン：1/66）がピペットでEppend orfチューブに分注された。混合物は室温（23/24℃）で３時間インキュベートさ れ、7.5μlの１Ｍリジン溶液と混合された。さらに1時間室温でインキュベート した後、240μlのＲＰＭI溶液（10％FCS、２ｍＭグルタミン、100IU/mlペニシリ ン、100μg/mlストレプトマイシン、250ｎｇ/mlアンフォテリシンB）が混合物に 加えられた。混合物は次に4℃で2リッターの0.9％NaClに対し終夜透析され（3回 交換）、−20℃に維持された。 実施例１．２．２（bio-TNF cod.＃C、cod.＃D、cod.＃E、cod.＃F、cod.＃Gの 調製） bio-TNF cod.＃C生成物は、pH7.８のコンジュゲーションバッファーの使用を 除き実施例１．１．1により調製される。 bio-TNF（cod.＃D、cod.＃E、cod.＃F、cod.＃G）の比較溶液は異なるインキ ュベーションバッファーを用い、種々のTNF/ビオチンのモル比で調製される（表 １参照）。 実施例1.3 ビオチン化TNFのRMA Thy1.1C1.2細胞に対する生物活性の測定 この実験は、RMA Thy1.1C1.2細胞に対する細胞毒性テストにより、異なるコン ジュケーションの条件（実施例1.1参照）で得られた異なるbio-TNF調製物の特異 的生物活性の測定を目指している。方法： 96穴平底プレート（Costar 3595）の各穴に以下の細胞、物質が添加される； ａ）50μlの60000RMA Thy1.1C1.2細胞（マイコプラズマ陰性）のＲＰＭIサスペ ンジョン溶液、但し5％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、100ＩＵ/mlペニシリ ン、100μg/mlのストレプトマイシン、250ng/mlのアンフォテリシンB、50ｎ Ｍ 2-メルカプトエタノール、500μｇ/mlのG418を含む（完全−ＲＰＭI）； ｂ）50μｌの標準ＴＮＦ溶液または50μｌの望ましい濃度のサンプルの完全ＲＰ ＭＩ溶液； ｃ）10μｌのアクチノマイシンDの完全ＲＰＭI溶液（330ｎｇ/ml）。 それからプレートが5％CO₂下37℃で24時間インキュベートされた。さらに、10 μｌのチアゾリルブルー溶液（ＭＴＴ）（PBS中5ｍｇ/ml）が各穴に加えられた 。5％CO₂下37℃でさらに4時間インキュベーションした後、100μｌのライシス溶 液（33％（ｖ/ｖ）N，N-ジメチルフォルムアミド、20％（ｐ/ｖ）ドデシル硫酸 ナトリウムの水溶液で酢酸によりpH4.7に調整される）が各穴に添加された。溶 液は多チャンネルピペットを用い穴で混合され、37℃で24時間インキュベートさ れた。次に、各穴の吸収は570と650ｎｍ（対照）で多チャンネルマイクロプレー トリーダーにより読み取られた。 細胞毒性活性は、非ビオチン化TNFを用いて得られる検量線に吸収を内挿する ことにより計算された。結果 ａ）非ビオチン化TNF（cod.＃A）を用いて得られる検量線を用いて測定された。 実施例１．４ 抗体とニュートラビジンで前処理された細胞によるbio-TNF及びTNFの結合、及 び会合と解離の速度の比較 この実験は、ビオチン化抗体とニュートラビジン前標的システムにより腫瘍細 胞上に人工リセプターを構築すると、天然リセプターに結合できる最大値と比較 して細胞に結合できるbio-TNFの全量を顕著に増加する事を実証する事を目的と している。 さらに、この実験はbio-TNFと、抗体及びニュートラビジンで前処理した細胞 の天然及び人工リセプター（ニュートラビジン）との会合及び解離時間を評価す ることを目的としている。方法 実験は、実施例1.5及び1.6に記述されているようにMRA thy1.1C1.2細胞を処理 して実施された。全結合TNFは、抗−TNFウサギポリクローナル抗体とウサギ蛍光 ヤギ抗−IgG抗体を使用する事に基づく間接法を使用し、FACS解析により検出さ れた。会合速度諭 50μｌのPBS/FCS 2％中50,000個の細胞が丸底プレートの穴にシードされ、1μ ｌのbio-19E12 mAb(PBS/FCS 2％中0.5mg/ml、抗体の最終濃度10μｇ/ml)と混合 され、氷上で10分間インキュベートされた。 細胞は2回200μｌ/穴のPBS/FCS ２％の添加と1300rpm、2分間の遠心で洗浄さ れれた。細胞をボルテックスにより再びサスペンドし、50μｌ/穴の2％PBS/FCS と１μｌの2.5ｍｇ/mlニュートラビジン（PBS/FCS 2%中、ニュートラビジンの最 終濃度50ｍｇ/ml）とを混合した。氷上で10分インキュベートした後、細胞を再 び上述したように2％PBS/FCSで2回洗浄した。 次に50μlのPBS/FCS2％、1μｌの22.2μｇ/mlの濃度のTNFまたはbio-TNF（TNF 及びbio-TNFの最終濃度は450ｎｇ/ml）が各穴に添加され、サンプルが氷上で1時 間インキュベートされた。 2％PBS/FCSでさらに洗浄した後、50μｌのウサギ抗TNFポリクローナル血清（P BS/FCS 2％中1：1000、Genzyme社、cod.＃IP300）が各穴に添加され、氷上で10 分間インキュベートされた。 細胞を2％PBS/FCSの添加（200μl/穴）と遠心により2回洗浄した。その後、蛍 光性色素でコンジュゲートした50μlのヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗血清 （PBS/FCS2％中、ヤギ抗ウサギ-FITC）が各穴に添加され、氷上で10分間インキ ュベートされた。 2％PBS/FCSで最終洗浄した後、サンプルを200μｌの2％PBS/FCSに再サスペンド し、FACSで解析した。解離速度論 50μｌの2％PBS/FCS中100,000個の細胞が丸底プレートの8個の穴にシードされ 、1μｌのbio19E12 mAb(2%PBS/FCS中0.5mg/ml,抗体の最終濃度10mg/ml)と混合さ れ、氷上で10分間インキュベートされた。細胞を2％PBS/FCSの添加（200μｌ/穴 ）と1300rpmの2分間の遠心により2回洗浄した。細胞をボルテックスにより再サ スペンドし、50μｌ/穴の2％PBS/FCSと1μｌのニュートラビジン（2％PBS/FCS中 2.5mg/ml最終ニュートラビジン濃度50μｇ/ml）とを混合した。氷上で10分間イ ンキュベートした後、細胞を上述したように再び2％PBS/FCSで2回洗浄した。 次に、50μｌの2％PBS/FCSと1μｌのTNFまたはbio-TNF（濃度22.2μｇ/ml、最 終TNF及びbio-TNF濃度450ｎｇ/ml）が各穴に添加され、サンプルが氷上で1時間 インキュベートされた。 8個のサンプルが遠心により2回、200μｌの2％PBS/FCSで洗浄された。細胞を5 0μｌのＲＰＭＩ（5％FCS、2ｍＭグルタミン、100 IU/mlペニシリン、100μｇ/m lストレプトマイシン、250ｎｇ/mlのアンフォテリシンＢ）に再サスペンドし、 次に0.25％パラホルムアルデヒドで4℃、1時間固定した。 2％PBS/FCSでさらに洗浄した後、50μｌのウサギ抗TNFポリクローナル血清（P BS/FCS2％中1：1000、Genzyme社、cod.＃IP300）が各穴に添加され、氷上で10分 間インキュベートされた。 細胞を再び2％PBS/FCSの添加（200μｌ/穴）と遠心により2回洗浄した。その 後、蛍光色素でコンジュゲートした50μｌのヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗血清 （2％PBS/FCS中1：12000、ヤギ抗ウサギFITC）が添加され、氷上で10分間インキ ュベートされた。 2％PBS/FCSで最終洗浄した後、サンプルを200μｌの2％PBS/FCSに再サスペンド し、FACSで解析した。結果 ニュートラビジンを予め細胞に対し標的させておくと、単なる天然レセプター で得られる結合（ニュートラビジンなしにまたは非ビオチン化TNFを用いて測定 ）と比べて、細胞へのbio-TNFの結合を少なくとも10から20倍増加させる。最良 の増加はbio-TNF cod.＃Ｂ（pH6.8でビオチン化）で観察された（データは示さ れない）。 さらに、図１（下の図）に示されているように、抗体とアビジンで前処理され たRMA細胞上へのbio-TNFの存続時間は、同じ細胞へのTNFの存続時間（ｔ_1/2＝0. 22h）よりも約30倍高い（ｔ_1/2＝7h）。 この結合結果は、本発明による抗体とニュートラビジンを予め標的化させる方 法の開発により腫瘍細胞に結合するbio-TNFの最大量が10から20倍増加し約30倍 長く細胞膜上に存続できることを実証するものと結論できる。 実施例１．５ インビトロでアクチノマイシンDの存在下ビオチン化抗体とニュートラビジン により前処理された腫瘍細胞に対するTNFとbio-TNFの細胞毒性の比較 この実施例は、ビオチン化抗体/アビジン系がビオチン-TNFを活性形で細胞表 面に届け、単純に天然リセプターを用いて得られるものと比べて、インビトロで 細胞毒性を高めることが出来る事を実証するためのものである。 この目的のために、RMAThy1.1C1.2細胞、ヒトモノクローナル抗Thy1抗体、ビ オチン化(ｍAb bio-19E12)、ニュートラビジン及びbio-TNF cod.＃Ｂが使用され た。 実験はａ）ｍAb bio-19E12とｂ）ニュートラビジン、ｃ）bio-TNFにより細胞 を連続的にインキュベーション、洗浄を行うことにより実施された。 天然リセプターへのTNFの結合がＭｎスーパーオキシドディスムターゼのよう な保護因子の合成を誘導することが知られているので、その様な因子の生産を阻 害することを目的として、さらにTNFの細胞毒性活性を高めることを目的として 、転写阻害剤（アクチノマイシンＤ）の存在下細胞毒性テストが実施された。方法 50μｌの2％PBS/FCS中1,000,000個の細胞と1μｌのｍAb bio-19E12の溶液 （0.5ｍｇ/ml）が96穴丸底プレートの各穴に添加された（Costar3595）。サスペ ンションは氷上で10分間インキュベートされた。細胞は200μｌ/穴の２％PBS/FC Sの添加と1,300rpmの2分間遠心により2回洗浄された。細胞をボルテックスによ り再サスペンドし、2％PBS/FCS（50μｌ/穴）と1μｌの0.5mg/mlニュートラビジ ン（２％PBS/FCS中）とを混合した。氷上で10分間インキュベートした後、細胞 を上述したように再度２％PBS/FCSで2回洗浄した。 それから50μｌの2％PBS/FCS、1μｌの望ましい濃度のTNFまたはbio-TNFが各 穴に添加され、氷上で15分間インキュベートされた。さらに、2％PBS/FCSで洗浄 した後、各穴の細胞を1.5mlのＲＰＭI（5％FCS、2ｍＭグルタミン、100 IU/mlペ ニシリン、100μｇ/mlストレプトマイシン、250ｎｇ/mlのアンフォテリシンＢ、 50ｎＭの2-メルカプトエタノール、500μｇ/mlのG418）（完全ＲＰＭI）に再サ スペンドした。 次に細胞を96穴の平底プレート（60,000細胞数/100μl/穴）にシードし、330 ｎｇ/mlのアクチノマイシンＤの溶液（完全ＲＰＭI中、10μｌ/穴）と混合し、5 ％CO₂下37℃で24時間インキュベートした。 細胞の生存率は実施例1.3に記述されているように測定された。結果 アクチノマイシンＤの存在下実施された実験の結果は図２に示される。ニュー トラビジンの非存在下50％の細胞を殺すのに必要なTNFまたはbio-TNFの量（ＬＤ 50）（吸収を50％低下することから測定できる）は100,000Ｕ/mlよりも高いけれ ども、ニュートラビジンの存在下bio-TNFのＬＤ50は約2000−3000Ｕ/mlである事 が分かる。さらに、ＴＮＦの細胞毒性はニュートラビジンの存在または非存在に より影響されないけれど、bio-TNFの細胞毒性は予期されたようにニュートラビ ジンの存在に強く依存している。この事は、ａ）TNF及びbio-TNFがニュートラビ ジンの非存在下ＲＭＡ細胞に弱い毒性を示すこと、ｂ）ＲＭＡ細胞膜上の人工ニ ュートラビジンリセプターの存在はbio-TNFの細胞毒性を非常に高めること、ｃ ）抗体-ビオチン-アビジンの橋かけにより膜に結合するbio-TNFはそれ自身の天 然のリセプターと相互作用して細胞毒性効果を起こすことができること、等を示 す。 アクチノマイシンDの非存在下実施される実験では、TNF及びbio-TNFの両方が 全然細胞毒性活性を示さなかった（データを示さない）。 実施例１．６ アクチノマイシンDの非存在化、ビオチン化抗体、ニュートラビジン及びTNFま たはbio-TNFで前処理したRMA Thy1.1C1.2細胞のインビボ腫瘍化能（マウス）の 比較 この実験は、抗体-ビオチン-ニュートラビジン系（人工リセプター）により細 胞表面に結合するbio-TNFで前処理した細胞のインビボ腫瘍化性が、天然リセプ ターに排他的に結合するTNFまたはbio-TNFで前処理した細胞に比べて、減少する ことを実証するためのものである。 採用されたモデルはインビトロで前処理したRMA Thy1.1C1.2細胞の皮下投与投 与によるものである。この実験は4群のメスC57BL6マウス（各群5匹）を用いて実 施され、異なる日付で腫瘍の直径を測定して実施された。マウスは表2に示すよ うに前処理細胞で処理された。 本研究で使用されたTNF及びbio-TNFの量（それぞれ50,OOOU/ml及び10,000U/ml ）は、実施例1.5（図２）に実証されるようにアクチノマイシンDの存在下のみに 部分的細胞毒性効果が決定されるようになっていることを思い出すのは重要であ る。本実験では、細胞は完全にアクチノマイシンが存在しない状態、即ちTNF及 びbio-TNFの両方が非細胞毒性的である条件下で処理された。 方法 50μｌの2％PBS/FCS中の180,000個の細胞が丸底プレートの4個の穴にシードさ れ、1μｌのbio-19E12 ｍAb（2％PBS/FCS中0.5mg/ml)と混合され、氷上で10分間 インキュベートされた。 細胞は2回200μｌ/穴のPBS/FCS2％と1300rpm2分間遠心で洗浄された。細胞を ボルテックスにより再びサスペンドし、50μｌ/穴の2％PBS/FCSと1μｌの0.5ｍ ｇ/mlニュートラビジン（PBS/FCS2%中）とを混合した。氷上で10分間インキュベ ートした後、細胞を再び上述したように2％PBS/FCSで2回洗浄した。 次に50μｌの2％PBS/FCS、1μｌのTNFまたはbio-TNF（それぞれの濃度は50,00 0及び10,000U/ml）が各穴に添加され、氷上で15分間インキュベートされた。 さらに2％PBS/FCSで洗浄した後、各穴の細胞が200μｌのPBSに再サスペンドさ れ、Eppendorfチューブに移され、1.2mlのPBSと混合された。インシュリン用の シリンジを用い、30,000個の細胞/200μｌ/マウスがそけい部レベルで皮下投与 された。腫瘍の平均直径（横と縦）がカリブレを用いて異なる時間に測定された 。結果 結果を表3に示す。bio-19E12/ニュートラビジン/bio-TNF ｍAｂ（第4群）によ る細胞の処理は、bio-TNF無しの同じ方法で処理したマウス（第2群）の場合と比 べて、マウスのRMA Thy1.1C1.2細胞の腫瘍化能を低下した事が分かる。bio-19E1 2/ニュートラビジン/TNF ｍAｂによる前処理（第3群）は対照群（第2群）と比べ て腫瘍化能の有意な低下を示さなかった。10,000の代わりに50,000U/mlのbio-TN Fを用いてさらに実験してみると、17日後の腫瘍の体積は検出限界（15mm³）以下 であった（データは示されない）。 これらの結果は、抗体/ビオチン/ニュートラビジン"橋かけ"により細胞膜に結 合したbio-TNFはRMA Thy1.1C1.2細胞のインビボ腫瘍化能が低下するという効果 を生む事ができる事を示す。 さらに、RMA細胞の処理に使用されるbio-TNFの量はアクチノマイシンDの存在 下（実施例1.5を参照）即ちTNFが直接細胞毒性効果を起こすことができない条件 下で細胞の溶解を決める程であったけれど、やはりこの処理は投与17から19日後 腫瘍の体積を5倍以上低下した。このことは、腫瘍化の低下が腫瘍細胞に対する 宿主の間接的効果（炎症、免疫効果等）による事を示す。ａ）縦方向と横方向の直径の平均実施例２ この実施例は以下の系に基づく本発明の応用を示す： 病理学的標的：Ａ：Ｂ：C-サイトカイン放出-誘導物質 ここで：病理学的標的＝ヒトThy1.1抗原を発現しているマウスリンパ腫（RMA Th y1.1C1.2細胞） A＝ビオチン化ヒト抗Thy1モノクローナル抗体（bio-19E12ｍAb） B=ニュートラビジン C-サイトカイン放出誘導物質＝ビオチン-リポポリサッカライドコンジュゲート （LPS） ここで (：)は非共有結合相互作用を表し、 (-)は共有結合を表す。 実施例２．１ LPS-ビオチンの調製材料 サルモネラミネソタからのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）:Sigma社cod．L2137 lot.101H4029 ビオチンアミドカプロイルヒドラジド：Sigma社B-3770 Tris塩基：BDH cod.10235 M-過沃素酸ナトリウム：Sigma社S-1878 酢酸ナトリウム：BOM cod.10235 アジ化ナトリウム：J.T.Baker cod.9099溶液 − "停止液"：0.1ＭTris-HCl pH7.5（水中） − ラベル化溶液：100mM酢酸ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウム、pH5.5方法 100μｌのLPS（ラベル化溶液中0.8ｍｇ/ml）を50μｌのM-過沃素酸ナトリウム （ラベル化溶液中30mM）と混合された。混合物を室温暗所で30分間インキュベー トした。インキュベーション後、混合物は蒸留水に対し透析された（1時間毎に4 回交換した）。 50μｌのビオチン-ヒドラジド（ラベル化溶液中0.5ｍｇ/ml)をサンプルに添加 し、混合物を室温で1時間インキュベートした。 50mlの停止液をサンプルに添加した。混合物を蒸留水に対し透析し（1時間毎 に4回変更）、−20℃に維持した。 実施例２．２ LPS-ビオチンの調製の制御物質 塩化ナトリウム(NaCl)、BDH cod.10241 （NaH₂PO₄・H₂O）：BDH cod.102454R 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：BDH cod.10252 BSA、牛アルブミン：Sigma社A4503 Tween20（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）：BDH lot.zA1645815. ストレプトアビジン：ＳＰＡ（Societa prodotti antibiotici）SAS1-610 STV-HRP：Sigma社S 5512 ＯＰＤ錠剤、５ｍｇ：Sigma社P6912 H₂SO₄：BDH 10276-5G H₂O₂：Carlo Erba A902011404溶液 − PBS：0.15Ｍ NaCl、0.05Ｍ燐酸ナトリウムpH7.3 − PBS-3％BSA − PBS-0.5％BSA-0.05％Tween − PBS-0.05％Tween − OPD：15mlの蒸留水と20mlのH₂O₂中2個の錠剤 − 10％H₂SO₄ 方法 LPS-ビオチンの調製物がPVCマイクロプレート（Becton Dickinson cod.3912） 中でストレプトアビジン（PBS中10μｇ/ml、100μl/穴）と37℃で1時間インキュ ベートされた。プレートを3回PBSで洗浄した。それから、PBS-3％BSA（200μl/ 穴）により室温で2時間ブロックされた。 ビオチン-LPSのPBS-0.5％BSA-0.05％Tweenによる連続的希釈液（1：2）が調製 された。プレートをPBSで再び3回洗浄した。 100μl/穴のサンプルを加え、37℃で1時間インキュベートした。 プレートをPBSで3回洗浄した。100μlの0.5％PBS/BSA/0.05％Tween中のストレ プトアビジン-HRP 1：2000が各穴に添加された。37℃で1時間インキュベートし た後、プレートを3回0.05％PBS-Tweenで洗浄した。100μlのOPD溶液を各穴に加 えた。 反応を100μlの10％H₂SO₄でブロックした。結果 測定吸光度 ビオチン-LPS(μg/ml) 吸光度(492nm) 0.3 1.150 0.1 1.107 0.03 0.986 0.01 0.670 実施例２．３ ビオチン化抗体、ニュートラビジン及びLPSまたはLPS-ビオチンで前処理したR MA Thy1.1C1.2細胞のインビボ腫瘍化能（マウスでの）の比較 この実験は、抗体-ビオチン-ニュートラビジン系（人工リセプター）により細 胞表面に結合するbio-LPSで前処理した細胞のインビボ腫瘍化性が、LPSで前処理 した細胞に比べて、減少することを実証するためのものである。 採用されたモデルはインビトロで前処理したRMA Thy1.1C1.2細胞の皮下投与投 与によるものである。この実験は3個の群のメスC57BL6マウス（各群5匹）を用い 、異なる日付で腫瘍の直径を測定して実施された。マウスは表4に示すように前 処理細胞で処理された。 方法 実験方法は、TNF及びビオチン-TNFの代わりにそれぞれLPSまたはビオチンLPS を用いる事を除いては実施例1.6に報告されているのと同じである。結果 結果を表５に示す。表に示すように、bio-19E12/ニュートラビジン/bio-LPS- ｍAｂ（第3群）による細胞の処理は、bio-LPS無し（第1群）またはLPSを用いる （第2群）以外は同じ方法で処理したマウスの場合と比べて、マウスのRMA Thy1. 1C1.2細胞の腫瘍化能を低下した事が分かる。抗体-ビオチン/ニュートラビジン 橋かけにより細胞膜に結合したbio-LPSが、RMA Thy1.1C1.2細胞の腫瘍化能がイ ンビボで低下するような効果を起こす事をこの結果は示す。 RMA Thy1.1非処理新鮮細胞が、前処理により引き起こされた免疫応答を確かめ るために、30日後生存した2匹のマウスの他方の脇腹に注入された。表5に示すよ うに、2匹のマウスは2回目の注入後もまた生き残った。注入した細胞は処理され ていなかったので、これらの結果は一回めの治療が免疫記憶を誘導したことを証 明する。ａ）2回目の投与：非処理新鮮RMA Thy1.1細胞が2匹の生存マウスに投与された。 参考文献 Aggarwal B.B.&Pocsik E.クローンから臨床へのサイトカイン、Arch．Biochem ．Biophys．292巻，335-359頁，1992年． Beutler，B.,&A．Cerami.カヘキチン/ＴＮＦの生物学、宿主応答の第1のメデ ィエーター、Ann．Rev．Immunol．7巻，625頁，1989年 Carswell，E.A.，L.J．Old，R.L．Kassel，S．Greene，N．Fiore,&B．William 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The immune system has different inflammatory stimuli, Signals of trauma, viral and bacterial infections or degeneration of cells such as cancer To produce cytokines and other humoral factors. "Lymphokine", " Terms such as "monokine" and "cytokine" were originally used for lymphocytes, monocytes, and non-lymphocytes. It was created to distinguish products derived from lymphocyte cells, Since then there has been some sort of overlap between these categories. Therefore, The term "cytokine" is currently used as a synonym for "lymphokine", "monokine" And this recognized term will be used in the future. Most known in the art A list of cytokines and a list of their biological activities can be found in Aggarwal B. et al. B. Passing And Pocsik E.   It is well known that different cytokines exhibit antitumor, antiviral, and antibacterial activities Have been. Due to such activities observed in vitro and in vivo in animal models Based on some cytokines have already been used in human therapy (De Vita Et al., 1995, "Biological Treatment of Cancer", Lippincott, Phyladelphia). For example, in Cytokines such as terleukin-2 (IL-2) and interferon-α (IFNα) Indicates renal metastatic cancer, hairy cell leukemia, Kaposi's sarcoma, melanoma, multiple myeloma, etc. Have shown effective antitumor activity in patients with different types of tumors. IFNβ, tumor Tumor necrosis factor (TNF) α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 and colony stimulators Other cytokines, such as progenitors (CFSs), have some antitumor activity against certain types of tumors Has shown. Therefore, these cytokines are for further study. Other cytokines have been used to treat infections (Aggarwal BB and Po csik E. ).   In general, therapeutic administration of cytokines is very limited due to their systemic toxicity. You. This is a serious problem when using therapeutically effective amounts in humans, Reduce the toxicity of this class of biological agonists while maintaining the therapeutic effect of Many trials have been conducted to develop new cytokine derivatives and new therapeutic methods. It is being done.   Tumor necrosis factor (TNF) α is a symbolic example.   TNF is mainly secreted by macrophages and induces hemorrhagic necrosis in certain tumors It is the first cytokine found to be competent (Carswell et al., 1975). That Later, TNF exerts cytotoxic and cytostatic effects on different pain systems, And some other biological effects that are important in controlling the immune response (Beutler and Cerami, 1989; Fiers, 1991).   TNF exerts a health or toxic effect on the organism in which it is produced, at its concentration, Can be given as a function of the production site and its duration at the site of action That idea is now believed. For example, if you are chronically exposed to a small amount of TNF, Quality is triggered. On the other hand, acute high production of TNF can cause severe vascular disorders, shock and Causes even death (Beutler and Ceram, 1989).   The potential antitumor activity of TNF has been evaluated in various studies performed in animals and humans. Was. According to such tests, the antitumor activity caused by TNF in vivo Tumor vasculature by direct effects on endothelial cells and by activation of inflammation and immune response Suggest that it is largely dependent on the ability to induce damage to rats (Sidhu and Boll). on, 1993). Conversely, direct cytotoxicity of TNF on tumor cells is considered less important I couldn't.   TNF clinical trials conducted on different types of tumors (Phase 2) show significant antitumor activity Other drugs (IF_γ, IL-2, alkylating reagent, melphala The use of TNF in combination with TNF resulted in encouraging results. However Various types of TNF-induced toxic effects, while using its pharmacologically effective amount Was strongly noted (Spriggs and Yates, 1992) . Instead, high-dose TNF is treated locally to reduce systemic toxic effects (eg, For example, by perfusion to the legs of melanoma patients) Successful (Lienard et al., 1992).   Another different TNF-based treatment is best without compromising antitumor activity The aim is to increase the therapeutic effect of TNF by increasing the tolerated dose and decreasing the systemic toxic effect And is currently being evaluated. Reduce the amount needed to cause an antitumor effect by about an order of magnitude It has been presumed that it will be well tolerated. This was attempted as follows. a) Development of a fusion protein that can deliver TNF to a tumor and increase its local concentration.     For example, fusion proteins containing TNF and tumor-specific antibodies have been produced (Hoogenboom et al. ,     1991); b) Development of TNF variants that maintain antitumor activity and have low systemic toxicity. Therefore, the election     Alternatively, a mutant that can recognize only one receptor (p55 or     p75) has already been prepared (Loetscher H et al., 1993). c) an anti-tumor agent that can reduce its toxic effects without impairing its anti-tumor activity     Use of TNF antibodies. Such antibodies have been previously described (Rathien et al., 1992). d) Use of TNF derivatives with higher half-life (eg TNF and polyethyleneglycol)     Conjugate with   The pharmacological potential of such a method is currently being evaluated.   Although the data obtained suggest the use of TNF as an antitumor agent, The toxicological problem has not yet been solved.   Cytotoxicity of paramagnetic or radioactive isotopes using biotin-avidin interaction A reagent delivery system was recently reported (EP251494 and EP496074).   In particular, EP251494 describes a system for administering diagnostic or therapeutic agents. ing. This diagnostic or therapeutic agent is combined with avidin or streptavidin. Conjugated antibodies, reagents and biotin capable of forming complexes with conjugated antibodies And a compound containing a diagnostic or therapeutic agent conjugated to the Biotin-streptavidin interaction on known target cells Is administered continuously or appropriately delayed to allow for localization of the diagnostic agent. It is.   The therapeutic or diagnostic agents described above include metal chelates, particularly radionuclides, and cisplast Chelates with low molecular weight anti-tumor agents such as dexamethasone, doxorubicin and the like. In fact, Is not suitable for compounds with a molecular weight above 50,000 daltons (preferably Is not more than 10,000 daltons), necessarily cytokines like TNF (51000) It is clearly pointed out that this is not applicable.   EP496074 includes biotinylated antibodies, avidin or streptavidin, and Methods have been described that provide for continuous administration of an otination diagnostic or therapeutic agent. or In this case, lysine (a protein whose cytotoxic chain has a molecular weight of about 30,000 daltons) ) Are described, but mostly for radiolabelled compounds. Applications are disclosed.   WO95 / 15979 discloses a method for localizing highly toxic reagent (I) to target cells. Have been. It is conjugated with ligand (L) or anti-ligand (AL) Administration of the first conjugate (C1) containing the specific target molecule Conjugation containing toxic agent (I) conjugated to ligand (AL) or ligand (L) (C2). In this case, the cytokine is Examples of toxic agents (I) containing TNF as well as avidin / biotin systems However, when cytokines are used, administration of ligand (L) or (AL) is To dissociate tocaine and cause "free" cytokines to have biological effects It is suggested that they are particularly preferred. This is because the bound cytokine Can not react with the putter and can exert the intended biological effect effectively Probably because of the fact that there is no. The required amount of L or AL will antagonize cell surface binding. May be relatively expensive to combat, but potential toxicity issues may arise There is. Furthermore, when L / AL corresponds to biotin / avidin, this interaction is very Considering that it is stable (the strongest non-covalent bond among known interactions, Kd = Ten^-15M), this bond is indeed undissociable (D. Savage et al., Avidin-Bioti). Chemistry: Handbook, Pierce Biotech (Rockford).   WO 95/15979 states that special claims to support the use of cytokines in the claimed method No experimental data were reported and the method was applied to the localization of this class of substances. Only general statements insufficient to provide reproducible and practical disclosures necessary for It has been reported. This class of substances does not rely on a simple cytotoxic mechanism, but rather Complex pro-inflammation that can show antitumor effects without causing indirect cytotoxic effects It works by symptomatic, immunostimulatory, blood clotting, necrotic mechanisms. On the other hand, It is required to use the reagents of documents EP-251494 and EP-496074.   Surprisingly, contrary to the general instructions reported in WO95 / 15979, conjugation Interaction between 44-gate cytokine and target-specific conjugate component is ligand Do / Not as direct as in conjugation of anti-ligand couples, A third component that can bind as a bridge between the target-specific component and the cytokine Biologically active forms of cytokines only by more mediated systems Has been found to be able to be effectively localized.   By the method of the present invention, cytokines can also function in a bound form, Administration of Gand / antiligand couple members activates cytokines It is not necessary. The cytokine conjugated to the ligand is located on the cell surface Targets that can interact with membrane receptors, but are conjugated to appropriate ligands Expected to interact with the corresponding anti-ligand involved in the interaction with the specific component Since it could not be done, the above results can be considered unexpected.   Thus, the present invention provides a pharmaceutical composition in the form of a combined preparation for the continuous use of a therapeutic agent. It provides a product. The pharmaceutical composition comprises; a) Rig of a ligand / antiligand / ligand system consisting of at least three components     An antipathological target compound conjugated to a compound; b) an anti-ligand complementary to the ligand of compound a); c) Anti-ligand cytokine conjugated to a ligand complementary to b). However     And the interaction of ligand / antiligand / ligand     Characterized by an affinity that is at least an order of magnitude higher than that of the receptor     Have been.   Examples of compounds that can be conjugated to a compound and a cytokine according to the invention Examples include haptens such as biotin and digoxikenin. on the other hand," Examples of “anti-ligand” compounds include anti-hapten antibodies (eg, anti-biotin antibodies and Anti-digoxigenin antibody) or when biotin is used as ligand , Avidin and its analogs (eg streptavidin, neutroavidin N).   Preferably, both compound a) and the cytokine are conjugated to biotin. Whereas avidin (or analogs thereof) is used as an anti-ligand. Sa The techniques used for conjugation of itokines and antibodies are widely known. It can be linked by chemical or genetic engineering methods.   The anti-pathological target compound a) is preferably a whole or partial antibody or monoclonal antibody. It is a nal antibody. The antibodies mentioned above have already been reported and are widely available, especially for tumor antigens. Used in the case of antibodies to   Examples of cytokines or lymphokines that can be used according to the invention Tumor necrosis factor, interferon, interleukin, colony stimulator Child (CSF). Lipopolysaccharide (LPS) or derivative thereof Use biological response modifiers that can enhance the local release of endogenous cytokines such as It can be used to enhance local effects and reduce systemic effects.   In addition, cytokines can sometimes have additive or synergistic effects. As is known, the method underlying the present invention has a better effect at the whole body level. It can be implemented to obtain a synergistic local effect with less. Cancer Biology The effects of treatment and combinations of different cytokines have been widely described, and De Vit (1995, Biological Treatment of Cancer, Lippincott, Phyladelphia) Have been.   Among the cytokines the use of TNF is particularly preferred.   Preferably, interaction with the conjugate or interaction with the artificial receptor The affinity is at least one order of magnitude higher than the affinity constant of the membrane receptor for cytokines. Number and at least one more than when the cytokine interacts with the natural receptor. It will be characterized by an order of magnitude lower rate dissociation constant.   The anti-target compound or conjugate antibody can be administered locally, Can be injected into the bloodstream to remove excess circulating compounds or antibodies from the body. Can react with antigen or recognition cell structures in vivo until The portion remains bound to the pathological target. At this point antiligand b) is administered Followed by binding of the conjugated cytokine to the antibody or anti-target compound. It is administered at a concentration that can be formed. In this way, cytokines are targeted It is fixed to cells and can last for a long time.   Dissociation of modified cytokines from "artificial" receptors (represented by antiligands) If the time is at least an order of magnitude longer than the dissociation time from the "natural" receptor, This can be achieved. As the examples relating to the application of the present invention demonstrate, Tumor antigen-specific biotinylated antibody, neutravidin and biotin-TNF (bio-TNF) The present invention can be implemented by a system including In this system, 10^-15Equal to M Affinity between bio-TNF and artificial receptor (avidin), and 10^-9From M to 10^-Ten The affinity between bio-TNF equal to M and its natural receptors (TNF-R1 and TNF-R2) is TNF fixation and long lasting where artificial receptors are presented (tumors) are preferred. It is supposed to be.   In a preferred embodiment of the present invention, a biotinylated monoclonal antibody specific for a tumor antigen Antibody is administered intralesional or lesion side, intracavity (eg, bladder, intraperitoneal), artery ( Hepatic, central nervous) administration, or systemic, local or local vascular perfusion (Leg perfusate, liver, chest) to contact the tumor Analogous continuous administration of gin or streptavidin and TNF-biotin Will be   Preferably, several hours of incubation time is inserted between each administration and Allows the system to remove excess reagents and therefore better localization to tumor targets can get.   In addition, the amino terminal region (residues 1-11, VRSSSRTPSDK sequence) The use of tinned TNF is preferred. Thereby, TNF and its natural receptor Is not prevented and its action is not inactivated. Or a known technology Amino acids with groups that can be easily biotinylated with lysine, cysteine, tyrosine, Histidine et al., Avidin-Biotin Chemistry by Savage et al .: Handbook, Pierce Biotec) can be inserted into the same region by genetic engineering techniques. Also. Glico Insertion of the silation signal, resulting in specific biotinylation of carbohydrate residues, for example For example, biotin-hydrazide or a derivative thereof can be used. In the amino-terminal region Biotinylation of TNF is dependent on the interaction of TNF with directly biotinylated protein fragments. Easily obtainable by genetic engineering techniques to construct conjugates with expression systems Can be. Examples of such proteins include: Acetyl-CoA carboxy from Coli Lase and its C-terminal region with a biotinylation site.   Biotinylation of the alpha amino group reduces the structure of biotin-TNF to non-biotinylated TNF. Preferred to maintain the shape closest to the structure. This means that biotin-6-amino Reaction of nocaproyl-N-hydroxysuccinimide ester at a pH between 5.5 and 7.5 This can be achieved using a reaction-based biotinylation protocol. Or avidin Alternatively, the ability to interact with membrane proteins is Of subunits derived from non-biotinylated TNF and non-biotinylated TNF Found that biotinylated TNF can be obtained by maintaining Was.   Preferably, a mixture of biotinylated and non-biotinylated TNF in a ratio of 1: 3 at 4 ° C. Incubation is carried out for 24 to 72 hours to perform the mixing reaction. Conjugation at N-terminus Such a form of TNF represents a new and more advanced aspect of the invention.   A suitable therapeutic substance so that the composition of the present invention can be commercialized and used routinely. Can be prepared. Preferably, the kit according to the invention comprises: A vial containing 5 to 10 mg of biotinylated antibody; -Contains 5 to 100 mg of avidin, streptavidin or neutravidin       Muir vial; -Vials containing 5 to 10 mg of biotinylated TNF (or other biotinylated       Tocaine) including.   The methods of the present invention are known in the art, for example, direct conjugation of cytokines and antibodies. Offers several advantages over those derived from the application: 1) For example, high antibody affinity is not always required. Because it ’s relatively expensive     Doses of antibody and avidin, followed by relatively low doses of biotin-TNF     Administered, and anyway, the tumor can be effectively labeled     You. On the other hand, conventional antibody-TNF conjugation where the amount of antibody is always linked to the amount of TNF-     This is not possible in the case of rugs. 2) The possibility that the separated antibody and TNF are dispersed in the tumor tissue is due to the low molecular weight.     Better than that obtained with an antibody-TNF conjugate. 3) Avidin and streptavidin (10^-15High affinity molecules like M)     Labeling tumors requires interaction with an artificial receptor (avidin).     And physiologic and kinetic, and at the whole body level (10^-9From M to 10^-TenHeaven in M) Naturally     Choose the amount of biotin-TNF so that its interaction with the receptor is prevented     It is possible. 10 for antibody-TNF conjugate^-15Order of M     It is extremely difficult to obtain an antibody that can bind to a tumor antigen with a high affinity.   The present invention is further described in the following examples. The examples are particularly for the treatment of tumor pathology. Although the same method is mentioned, local treatment with cytokines can be used. It can be easily understood that the present invention can be applied to treatment of different pathologies.                                 Example 1   This embodiment shows an application of the present invention based on the following system.   Pathological target: A: B: C-cytokine here, Pathological target = mouse lymphoma expressing mouse antigen Thy1.1 (allele Th y1.1 (RMA cells that have been genetically modified to express RMA Thy1.1C1.2); A = Biotinylated anti-Thy1.1 monoclonal antibody (mAb bio-19E12) B = Neutravidin C-cytokine = biotin-TNF conjugate here (:) represents a non-covalent interaction, (-) Represents a covalent bond.material − AH-BNHS (biotin 6-aminocaproyl-N-hydroxysuccinimide       Ester) (SPA, B002-61) − SULFO-NHS-LC-Biotin (Pierce, 21335) − Human TNFα (1 × 108 U / mg) (DRG080) -Lysine (Sigma cod. L5501) -Culture medium: sterile RPMI-1640 (Gibco 31870-025) − Fetal calf serum (FCS) (PBI-Biological Industries, cod. 04-001-1A) − Fetal calf serum (FCS) (Sigma, F2442) -Geneticin (G418, Sigma cod. G9516) in 100 mM Hepes − Hepes (Sigma, H0887) -200 mM glutamine (Gibco cod. 04305030D) − 10,000 IU / ml penicillin, 10,000 mg / ml streptomycin, 25 μg / ml       Amphotericin B (Gibco cod. 15240-021) − NaCl (BDH cod.10241) -HCl 37% (BDH cod. 10125) − 96-well flat bottom PVC plate for cell culture (Costar 3595) − 96-hole round bottom plate (PBI, 650180) − 2-mercaptoethanol (Merck cod. 12006) -Actinomycin D (Fluka 01815) Thiazolyl blue (MTT) (Merck 11714) -PBS (NaCl 0.15M, Na-phosphoric acid 0.05M, pH 7.3) − Neutravidin (Pierce cod. 31000) -Sodium azide (Baker, 9099) − MAb 19E12                               Example 1.1                 Preparation of biotinylated 19E12mAb antibody (bio-19E12)   1000 μl of 19E12 mAb solution (1 mg / ml in sodium bicarbonate pH 8.5) and 34 μl of sulfur-NHS-L Pipette C-biotin solution (1 mg / ml, molar ratio mAb / biotin: 1/24) f Dispensed into tubes. The mixture is incubated for 30 minutes at room temperature (23/24 ° C) Was. After incubation, the mixture was dialyzed overnight at 4 ° C against 2 liters of PBS. , Maintained at 4 ° C.                               Example 1.2                       Preparation of biotin-TNF (bio-TNF)   This section describes some of the protocols used to prepare biotin-TNF conjugates. An example of the call is reported. Example 1.2.1 (Preparation of bio-TNF cod. #B)   60 μl of TNF solution in double distilled water (0.5 mg / ml), 6 μl of 1 M aqueous sodium carbonate solution pH 6.8, 6 μl AH-BNHS, 3mg / ml in DMSO (molar ratio TNF / biotin: 1/66) Eppend by pipette Dispensed into orf tubes. The mixture is incubated at room temperature (23/24 ° C) for 3 hours. And mixed with 7.5 μl of a 1 M lysine solution. Incubate for another hour at room temperature And then 240 μl of RPMI solution (10% FCS, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicillin) , 100 μg / ml streptomycin, 250 ng / ml amphotericin B) Added. The mixture was then dialyzed overnight at 4 ° C against 2 liters of 0.9% NaCl (3 times Exchange) and maintained at -20 ° C. Example 1.2.2 (for bio-TNF cod. #C, cod. #D, cod. #E, cod. #F, cod. #G Preparation)   The bio-TNF cod. #C product uses a conjugation buffer at pH 7.8. Except prepared according to Example 1.1.1.   Comparative solutions of bio-TNF (cod. #D, cod. #E, cod. #F, cod. #G) are different inks It is prepared in various TNF / biotin molar ratios using the incubation buffer (Table 1).                                 Example 1.3         Measurement of bioactivity of biotinylated TNF on RMA Thy1.1C1.2 cells   This experiment shows that different cytotoxicity tests on RMA Thy1.1C1.2 cells Specificity of different bio-TNF preparations obtained under the conditions of the duplication (see Example 1.1) Aim to measure biological activity.Method:   The following cells and substances are added to each well of a 96-well flat bottom plate (Costar 3595); a) RPMI suspension of 50 μl of 60,000 RMA Thy1.1C1.2 cells (mycoplasma negative)     Solution, 5% FCS, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicilli     , 100 μg / ml streptomycin, 250 ng / ml amphotericin B, 50 n     M2-mercaptoethanol, containing 500 μg / ml G418 (complete-RPMI); b) Complete RP of 50 μl of standard TNF solution or 50 μl of sample at desired concentration     MI solution; c) 10 μl of actinomycin D in complete RPMI (330 ng / ml).   Then the plate is 5% CO_TwoIncubated at 37 ° C for 24 hours. In addition, 10 μl of thiazolyl blue solution (MTT) (5 mg / ml in PBS) was added to each well . 5% CO_TwoAfter a further 4 hours incubation at 37 ° C, 100 μl lysis Liquid (33% (v / v) N, N-dimethylformamide, 20% (p / v) dodecyl sulfate An aqueous solution of sodium, adjusted to pH 4.7 with acetic acid) was added to each well. Dissolution The solution is mixed in a well using a multichannel pipette and incubated at 37 ° C for 24 hours. Was. Next, the absorbance of each well was 570 and 650 nm (control), and multi-channel micro play was performed. Read by the leader.   Cytotoxic activity interpolates absorption into a standard curve obtained using non-biotinylated TNF It was calculated by:result a) Measured using a calibration curve obtained using non-biotinylated TNF (cod. #A).                               Example 1.4   Binding of bio-TNF and TNF by cells pretreated with antibody and neutravidin, and Comparison of the rates of association and dissociation   In this experiment, tumor cells were analyzed using biotinylated antibodies and a neutravidin pre-targeting system. Building an artificial receptor on the vesicles compared to the maximum that can bind to the natural receptor To significantly increase the total amount of bio-TNF that can bind to cells are doing.   In addition, this experiment was performed on cells pretreated with bio-TNF, antibody and neutravidin. Of the association and dissociation times of human with natural and artificial receptors (neutravidin) It is intended to be.Method   Experiments treated MRA thy1.1C1.2 cells as described in Examples 1.5 and 1.6 It was carried out. Total bound TNF was analyzed using anti-TNF rabbit polyclonal antibody and rabbit fluorescence. Detected by FACS analysis using an indirect method based on using goat anti-IgG antibody. Was.Meeting speed teacher   50,000 cells in 50 μl of PBS / FCS 2% were seeded into the wells of a round bottom plate and 1 μl Mix with 1 bio-19E12 mAb (0.5 mg / ml in 2% PBS / FCS, final antibody concentration 10 μg / ml) And incubated on ice for 10 minutes.   The cells are washed twice by adding 200 μl / well of 2% PBS / FCS and centrifuging at 1300 rpm for 2 minutes. Was Resuspend the cells by vortexing and add 50 μl / well of 2% PBS / FCS. And 1 μl of 2.5 mg / ml neutravidin (2% PBS / FCS (Final concentration 50 mg / ml). After a 10 minute incubation on ice, the cells are And washed twice with 2% PBS / FCS as described above.   Then 50 μl of PBS / FCS 2%, 1 μl of 22.2 μg / ml of TNF or bio-TNF (TNF And the final concentration of bio-TNF is 450 ng / ml). Incubated.   After further washing with 2% PBS / FCS, 50 μl of rabbit anti-TNF polyclonal serum (P 1: 1000 in 2% BS / FCS, Genzyme, cod. # IP300) was added to each well and 10% on ice Incubated for minutes.   Cells were washed twice by adding 2% PBS / FCS (200 μl / well) and centrifuging. Then fireflies 50 .mu.l of goat anti-rabbit immunoglobulin antiserum conjugated with a light dye. (Goat anti-rabbit-FITC in 2% PBS / FCS) was added to each well and allowed to incubate on ice for 10 minutes. Was added. After final wash with 2% PBS / FCS, resuspend sample in 200 μl 2% PBS / FCS And analyzed by FACS.Dissociation kinetics   100,000 cells in 50 μl of 2% PBS / FCS are seeded in 8 wells of a round bottom plate Mixed with 1 μl of bio19E12 mAb (0.5 mg / ml in 2% PBS / FCS, final concentration of antibody 10 mg / ml) And incubated on ice for 10 minutes. Add cells with 2% PBS / FCS (200 μl / well) ) And centrifugation at 1300 rpm for 2 minutes for 2 times. Resuspend cells by vortexing. Spend 50 μl / well 2% PBS / FCS and 1 μl neutravidin (in 2% PBS / FCS 2.5 mg / ml final neutravidin concentration of 50 μg / ml). 10 minutes on ice After incubation, cells were washed twice again with 2% PBS / FCS as described above.   Next, 50 μl of 2% PBS / FCS and 1 μl of TNF or bio-TNF (22.2 μg / ml, minimum concentration) (Final TNF and bio-TNF concentration 450 ng / ml) is added to each well and the samples are left on ice for 1 hour Incubated.   Eight samples were washed twice by centrifugation with 200 μl of 2% PBS / FCS. 5 cells 0 μl of RPMI (5% FCS, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / m l Streptomycin, resuspend in 250 ng / ml amphotericin B) Next, the cells were fixed with 0.25% paraformaldehyde at 4 ° C. for 1 hour.   After further washing with 2% PBS / FCS, 50 μl of rabbit anti-TNF polyclonal serum (P 1: 1000 in 2% BS / FCS, Genzyme, cod. # IP300) is added to each well and on ice for 10 minutes Incubated.   Cells were again washed twice by addition of 2% PBS / FCS (200 μl / well) and centrifugation. That 50 μl of goat anti-rabbit immunoglobulin antiserum conjugated with a fluorescent dye (1: 12000 in 2% PBS / FCS, goat anti-rabbit FITC) and incubate on ice for 10 minutes Was added. After final wash with 2% PBS / FCS, resuspend sample in 200 μl 2% PBS / FCS And analyzed by FACS.result   If neutravidin is pre-targeted to cells, it is simply a natural receptor Binding (measured without neutravidin or with non-biotinylated TNF) ) Increases the binding of bio-TNF to cells by at least 10 to 20 times compared to best # Was observed with bio-TNF cod. #B (biotinylated at pH 6.8) (data shown Not).   Further, as shown in FIG. 1 (lower figure), the antibody was pretreated with antibody and avidin. The survival time of bio-TNF on RMA cells that have been_1/2= 0. 22h) about 30 times higher (t_1/2= 7h).   This binding result is based on the pre-targeting of antibodies and neutravidin according to the invention. The development of the method increases the maximum amount of bio-TNF bound to tumor cells by 10 to 20 times and increases by about 30 times It can be concluded that it demonstrates that it can persist on the cell membrane for a long time.                               Example 1.5 In vitroAntibody and neutravidin in the presence of actinomycin D Of the cytotoxicity of TNF and bio-TNF on tumor cells pretreated with lipase   This example demonstrates that the biotinylated antibody / avidin system activates biotin-TNF Surface and compared to those obtained using simply natural receptors in vitro This is to demonstrate that cytotoxicity can be increased.   For this purpose, RMAThy1.1C1.2 cells, human monoclonal anti-Thy1 antibody, Otinization (mAb bio-19E12), Neutravidin and bio-TNF cod. #B were used. Was.   Experiments were performed using a) mAb bio-19E12 and b) neutravidin, c) cells with bio-TNF. Was performed by successive incubation and washing.   TNF binding to natural receptors is like Mn superoxide dismutase It is known to induce the synthesis of various protective factors, thus inhibiting the production of such factors. With the aim of harming and further enhancing the cytotoxic activity of TNF A cytotoxicity test was performed in the presence of a transcription inhibitor (actinomycin D).Method   Solution of 1,000,000 cells and 1 μl of mAb bio-19E12 in 50 μl of 2% PBS / FCS (0.5 mg / ml) was added to each well of a 96-well round bottom plate (Costar3595). Suspe The solution was incubated on ice for 10 minutes. Cells are 200 μl / well of 2% PBS / FC Washing was performed twice by addition of S and centrifugation at 1,300 rpm for 2 minutes. Vortex cells Resuspend, 2% PBS / FCS (50 μl / well) and 1 μl of 0.5 mg / ml Neutravisi (In 2% PBS / FCS). After 10 minutes incubation on ice, cells Was again washed twice with 2% PBS / FCS as described above.   Then 50 μl of 2% PBS / FCS, 1 μl of the desired concentration of TNF or bio-TNF was added to each. Added to wells and incubated on ice for 15 minutes. Wash with 2% PBS / FCS After that, the cells in each well were transferred to 1.5 ml of RPMI (5% FCS, 2 mM glutamine, 100 IU / ml). Nicilin, 100 μg / ml streptomycin, 250 ng / ml amphotericin B, Resuspend in 50 nM 2-mercaptoethanol, 500 μg / ml G418) (complete RPMI). I was suspended.   The cells are then seeded into 96-well flat bottom plates (60,000 cells / 100 μl / well) and ng / ml actinomycin D solution (10 μl / well in complete RPMI) % CO_TwoIncubated at 37 ° C for 24 hours.   Cell viability was measured as described in Example 1.3.result   The results of experiments performed in the presence of actinomycin D are shown in FIG. new The amount of TNF or bio-TNF required to kill 50% of cells in the absence of Travidin (LD 50) (measured by reducing absorption by 50%) should be higher than 100,000 U / ml The LD50 of bio-TNF in the presence of neutravidin should be about 2000-3000 U / ml. I understand. In addition, the cytotoxicity of TNF is reduced by the presence or absence of neutravidin. Although less affected, the cytotoxicity of bio-TNF was It is strongly dependent on the presence of gin. This means that a) TNF and bio-TNF Showing weak toxicity to RMA cells in the absence of gin, b) artificial d Presence of a neutravidin receptor greatly increases the cytotoxicity of bio-TNF, c ) The bio-TNF that binds to the membrane through the antibody-biotin-avidin bridge Can interact with natural receptors to produce cytotoxic effects. You.   In experiments performed in the absence of actinomycin D, both TNF and bio-TNF were No cytotoxic activity was shown (data not shown).                               Example 1.6   Absence of actinomycin D, biotinylated antibodies, neutravidin and TNF Of in vivo tumorigenicity (mouse) of RMA Thy1.1C1.2 cells pretreated with bio-TNF Comparison   This experiment was performed using an antibody-biotin-neutravidin system (artificial receptor). The in vivo tumorigenicity of cells pretreated with bio-TNF that binds to the cell surface Reduced compared to cells pretreated with TNF or bio-TNF that exclusively binds It is to prove that.   The model employed was a subcutaneous injection of RMA Thy1.1C1.2 cells pretreated in vitro. It is due. This experiment was performed using four groups of female C57BL6 mice (five in each group). And performed on different dates by measuring the diameter of the tumor. The mice are shown in Table 2. Pretreated cells.   The amounts of TNF and bio-TNF used in this study (50, OOOU / ml and 10,000U / ml, respectively) ) Is only in the presence of actinomycin D as demonstrated in Example 1.5 (FIG. 2). It is important to remember that the partial cytotoxic effect is being determined. You. In this experiment, cells were completely free of actinomycin, i.e., TNF and And bio-TNF were both treated under conditions that were non-cytotoxic. Method   180,000 cells in 50 μl of 2% PBS / FCS were seeded into four wells of a round bottom plate And mixed with 1 μl of bio-19E12 mAb (0.5 mg / ml in 2% PBS / FCS) for 10 minutes on ice Incubated.   Cells were washed twice with 200 μl / well of PBS / FCS 2% and 1300 rpm for 2 minutes. Cells Resuspend again by vortexing, 50 μl / well of 2% PBS / FCS and 1 μl of 0.5 m g / ml neutravidin (in PBS / FCS 2%). Incubate on ice for 10 minutes After plating, cells were again washed twice with 2% PBS / FCS as described above.   Next, 50 μl of 2% PBS / FCS, 1 μl of TNF or bio-TNF (the respective concentrations were 50,00 0 and 10,000 U / ml) was added to each well and incubated on ice for 15 minutes.   After further washing with 2% PBS / FCS, cells in each well were resuspended in 200 μl PBS. Were transferred to Eppendorf tubes and mixed with 1.2 ml of PBS. For insulin 30,000 cells / 200μl / mouse subcutaneously at the groin level using a syringe Was done. Average tumor diameter (horizontal and vertical) measured at different times using calibre .result   Table 3 shows the results. bio-19E12 / neutravidin / bio-TNF mAb (Group 4) Of cells treated with the same method without bio-TNF (group 2) In all cases, it can be seen that the tumorigenicity of mouse RMA Thy1.1C1.2 cells was reduced. bio-19E1 2 / Pretreatment with Neutravidin / TNF mAb (Group 3) compared to control group (Group 2) Did not show a significant decrease in tumorigenicity. 50,000U / ml bio-TN instead of 10,000 Further experiments using F show that the volume of the tumor after 17 days is below the detection limit (15 mm^Three)Less than (Data not shown).   These results are linked to the cell membrane by antibody / biotin / neutravidin "cross-linking". Combined bio-TNF reduces the in vivo tumorigenicity of RMA Thy1.1C1.2 cells Show that you can produce   In addition, the amount of bio-TNF used to treat RMA cells depends on the presence of actinomycin D. Below (see Example 1.5), ie, the conditions under which TNF cannot produce a direct cytotoxic effect It was enough to determine cell lysis below, but again this treatment was 17 to 19 days after administration Tumor volume was reduced by more than 5 times. This means that the reduction in tumorigenesis This indicates that the indirect effect (inflammation, immune effect, etc.) of the host is caused.a) Average of longitudinal and transverse diametersExample 2   This example illustrates an application of the invention based on the following system: Pathological target: A: B: C-cytokine release-inducer Where: pathological target = mouse lymphoma expressing human Thy1.1 antigen (RMA Th y1.1C1.2 cells) A = Biotinylated human anti-Thy1 monoclonal antibody (bio-19E12 mAb) B = Neutravidin C-cytokine release inducer = biotin-lipopolysaccharide conjugate (LPS) here (:) represents a non-covalent interaction, (-) Represents a covalent bond.                               Example 2.1                             Preparation of LPS-biotinmaterial Lipopolysaccharide (LPS) from Salmonella Minnesota: Sigma cod. L2137 lot.101H4029 Biotinamide caproyl hydrazide: Sigma B-3770 Tris base: BDH cod. 10235 M-sodium periodate: Sigma S-1878 Sodium acetate: BOM cod.10235 Sodium azide: J.T.Baker cod. 9099solution -"Stop solution": 0.1 M Tris-HCl pH7.5 (in water) -Labeling solution: 100 mM sodium acetate, 0.02% sodium azide, pH 5.5Method   100 μl LPS (0.8 mg / ml in labeling solution) with 50 μl sodium M-periodate (30 mM in the labeling solution). Incubate the mixture at room temperature in the dark for 30 minutes. I did it. After incubation, the mixture was dialyzed against distilled water (4 hrs. Exchanged times).   Add 50 μl of biotin-hydrazide (0.5 mg / ml in labeling solution) to the sample And the mixture was incubated for 1 hour at room temperature.   50 ml of stop solution was added to the sample. The mixture is dialyzed against distilled water (every hour) -20 ° C).                               Example 2.2                         Control of preparation of LPS-biotinmaterial Sodium chloride (NaCl), BDH cod.10241 (NaH_TwoPO_Four・ H_TwoO): BDH cod.102454R Sodium hydroxide (NaOH): BDH cod. 10252 BSA, bovine albumin: Sigma A4503 Tween20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate): BDH lot.zA1645815. Streptavidin: SPA (Societa prodotti antibiotici) SAS1-610 STV-HRP: Sigma S 5512 OPD tablet, 5 mg: Sigma P6912 H_TwoSO_Four： BDH 10276-5G H_TwoO_Two: Carlo Erba A902011404solution PBS: 0.15 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate pH 7.3 − PBS-3% BSA -PBS-0.5% BSA-0.05% Tween − PBS-0.05% Tween OPD: 15 ml of distilled water and 20 ml of H_TwoO_Two2 tablets inside −10% H_TwoSO_Four Method   Preparation of LPS-biotin in PVC microplate (Becton Dickinson cod. 3912) Incubate with streptavidin (10 µg / ml in PBS, 100 µl / well) in 37 ° C for 1 hour Was batted. Plates were washed three times with PBS. Then, PBS-3% BSA (200 μl / Hole) for 2 hours at room temperature.   Serial dilutions of biotin-LPS in PBS-0.5% BSA-0.05% Tween (1: 2) prepared Was done. Plates were washed again three times with PBS.   100 μl / well of sample was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour.   Plates were washed three times with PBS. Strain in 100 μl 0.5% PBS / BSA / 0.05% Tween Putavidin-HRP 1: 2000 was added to each well. Incubate at 37 ° C for 1 hour After that, the plate was washed three times with 0.05% PBS-Tween. Add 100 μl of OPD solution to each well I got it.   Reaction is 100 μl of 10% H_TwoSO_FourBlocked by.result Measurement absorbance Biotin-LPS (μg / ml) Absorbance (492nm)         0.3 1.150         0.1 1.107         0.03 0.986         0.01 0.670                               Example 2.3   R pretreated with biotinylated antibody, neutravidin and LPS or LPS-biotin Comparison of in vivo tumorigenic potential of MA Thy1.1C1.2 cells (in mice)   This experiment was performed using an antibody-biotin-neutravidin system (artificial receptor). In vivo tumorigenicity of cells pre-treated with bio-LPS that binds to the vesicle surface, This is for demonstrating that the number of cells decreases as compared with the number of cells obtained.   The model employed was a subcutaneous injection of RMA Thy1.1C1.2 cells pretreated in vitro. It is due. This experiment used three groups of female C57BL6 mice (5 mice per group) It was performed by measuring the diameter of the tumor on different dates. Mouse front as shown in Table 4 Treated with treated cells. Method   The experimental method used LPS or biotin LPS instead of TNF and biotin-TNF, respectively. This is the same as reported in Example 1.6, except that is used.result   Table 5 shows the results. As shown in the table, bio-19E12 / neutravidin / bio-LPS- Treatment of cells with mAb (Group 3) without bio-LPS (Group 1) or with LPS Except for (Group 2), the mouse RMA Thy1. It can be seen that the tumorigenicity of 1C1.2 cells was reduced. Antibody-biotin / neutravidin Bio-LPS bound to the cell membrane by cross-linking has the potential to transform RMA Thy1.1C1.2 cells into tumors. This result shows that the effect is degraded ex vivo.   RMA Thy1.1 untreated fresh cells confirm immune response elicited by pretreatment To survive 30 days later, two surviving mice were injected into the other flank. See Table 5 Thus, the two mice survived also after the second injection. The injected cells are processed Results, these results prove that the first treatment induced immune memory. I will tell.a) Second dose: Untreated fresh RMA Thy1.1 cells were administered to two surviving mice.                                 References   Aggarwal B.B. & Pocsik E. Clones to Clinical Cytokines, Arch. Biochem . Biophys. 292, pp. 335-359, 1992.   Beutler, B., & A. Cerami. Kaechtin / TNF biology, the first med-host response Eater, Ann. Rev. Immunol. 7, 625, 1989   Carswell, E.A., L.J. Old, R.L. Kassel, S .; Greene, N .; Fiore, & B. William son, an endotoxin-induced serum factor that causes tumor necrosis, Proc. Natl. Acad . Sci. U.S.A. 72, 3666, 1975.   Corti A., Bagnasco L., Cassani C, TNF antagonist monoclonal antibody Of the TNF receptor type 1 (p55) epitope recognized by Lymph. Cy tokine Res. 13, 183-190, 1994   FiersW. TNF: characterization at molecular, cellular and in vivo levels, FEBS Lett. 285, 199-212, 1991   Hoogenboom, HR., Volkaert G., & Rausw C. M. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 デッラボナ，パオロ イタリア，アイ―20132 ミラノ，60，ヴ ィア オルジェッティーナ (72)発明者 カソラティ，ジウリア イタリア，アイ―20132 ミラノ，60，ヴ ィア オルジェッティーナ (72)発明者 ペラジ，ミカエラ イタリア，アイ―20132 ミラノ，60，ヴ ィア オルジェッティーナ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Dellabona, Paolo             Italy, i-20132 Milan, 60, V             Oia Orgettina (72) Inventors Casorati, Giulia             Italy, i-20132 Milan, 60, V             Oia Orgettina (72) Inventor Peraj, Michaela             Italy, i-20132 Milan, 60, V             Oia Orgettina

Claims (1)

【特許請求の範囲】 請求項1 以下の成分を含む、連続治療に対する組み合わせ調剤の形での薬学的組成物： ａ）少なくとも3組みからなるリガンド/抗リガンド/リガンド系のリガンドとコ ンジュゲートした抗病理学的標的化合物； ｂ）化合物ａ）のリガンドに相補的な抗リガンド； ｃ）抗リガンドｂ）に相補的なリガンドとコンジュゲートしたサイトカイン、但 しリガンド/抗リガンド/リガンド相互作用はサイトカインとその天然リセプター との間の親和力よりも少なくとも一桁高い親和力により特徴づけられている。 請求項2 ビオチンがリガンドであり、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラ ビジンが抗リガンドである、請求項1による組成物。 請求項3 化合物ａ）とサイトカインの両方がビオチンとコンジュゲートされており、ア ビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラビジンが成分ｂ）である、請求項 1または2による組成物。 請求項4 抗体が抗病理学的標的である、前述の何れかの請求項による組成物。 請求項5 抗体がモノクローナル抗体である、請求項4による組成物。 請求項６ 抗体が腫瘍抗原に対する抗体である、請求項4または5による組成物。 請求項7 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）がサイトカインである、前述の何れかの請求項による 組成物。 請求項８ 腫瘍壊死因子がビオチン化されている、請求項7による組成物。 請求項9 腫瘍壊死因子がアミノ末端でビオチン化されている、請求項8による組成物。 請求項10 アミノ末端でリガンドとコンジュゲートしている腫瘍壊死因子。 請求項11 リガンドが1番めの残基のα-アミノ基とコンジュゲートしている、請求項10に よる腫瘍壊死因子。 請求項12 ビオチンがリガンドである、請求項10または11による腫瘍壊死因子。 請求項13 ビオチン化蛋白質の蛋白質またはフラグメントがリガンドである、請求項10ま たは11による腫瘍壊死因子。 請求項14 腫瘍壊死因子とビオチン-6-アミノカプロイル-N-ハイドロキシサクシミドとの pH5.5から7.5の間での反応を含む、請求項10から13の腫瘍壊死因子の調製方法。 請求項15 ビオチン化及び非ビオチン化腫瘍壊死因子からのサブユニットを1：3の割合で 4℃、24から72時間混合することにより得られる、ビオチン化腫瘍壊死因子。[Claims] Claim 1   Pharmaceutical compositions in the form of a combination preparation for continuous therapy, comprising the following components: a) at least three pairs of ligand / antiligand / ligand based ligand A conjugated anti-pathological target compound; b) an anti-ligand complementary to the ligand of compound a); c) cytokine conjugated to a ligand complementary to anti-ligand b), provided that Ligand / antiligand / ligand interactions are cytokines and their natural receptors Is characterized by an affinity that is at least an order of magnitude higher than the affinity between Claim 2   Biotin is the ligand, avidin, streptavidin or neutral The composition according to claim 1, wherein vidin is an anti-ligand. Claim 3   Both compound a) and the cytokine are conjugated to biotin, The vidin, streptavidin or neutravidin is component b). Composition according to 1 or 2. Claim 4   A composition according to any of the preceding claims, wherein the antibody is an anti-pathological target. Claim 5   5. The composition according to claim 4, wherein the antibody is a monoclonal antibody. Claim 6   The composition according to claim 4 or 5, wherein the antibody is an antibody against a tumor antigen. Claim 7   According to any of the preceding claims, wherein the tumor necrosis factor (TNF) is a cytokine. Composition. Claim 8   8. The composition according to claim 7, wherein the tumor necrosis factor is biotinylated. Claim 9   9. The composition according to claim 8, wherein the tumor necrosis factor is biotinylated at the amino terminus. Claim 10   Tumor necrosis factor conjugated to a ligand at the amino terminus. Claim 11   The method according to claim 10, wherein the ligand is conjugated to the α-amino group of the first residue. Tumor necrosis factor. Claim 12   12. The tumor necrosis factor according to claim 10 or 11, wherein biotin is a ligand. Claim 13   11. The method according to claim 10, wherein the protein or fragment of the biotinylated protein is a ligand. Or tumor necrosis factor by 11. Claim 14   Tumor necrosis factor and biotin-6-aminocaproyl-N-hydroxysuccinimide 14. The method for preparing a tumor necrosis factor according to claim 10, which comprises a reaction at a pH of between 5.5 and 7.5. Claim 15   Subunits from biotinylated and non-biotinylated tumor necrosis factor in a 1: 3 ratio Biotinylated tumor necrosis factor obtained by mixing at 4 ° C. for 24 to 72 hours.