JP2000506601A

JP2000506601A - ヒトの呼気成分の測定のための方法および装置

Info

Publication number: JP2000506601A
Application number: JP09522325A
Authority: JP
Inventors: シルコフ，フィリップ，イー．; マックリーン，パトリシア，エー．
Original assignee: シーヴァースインストルメンツ，インコーポレーテッド
Priority date: 1996-04-09
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 2000-05-30
Also published as: EP0892926B2; AU719940B2; ATE219836T1; DE69713581T3; CA2252024A1; AU2400797A; CA2252024C; DE69713581D1; WO1997038307A1; US6010459A; EP0892926B1; DE892926T1; EP0892926A1; DE69713581T2

Abstract

(57)【要約】呼気を受容するための適当な装置の中に被験者の息を吐き出させること；被験者の口腔内の圧力を、被験者の軟口蓋を閉鎖しかつ呼気の間鼻咽頭を隔離させるのに十分なレベルにまで上昇させること；軟口蓋の閉鎖を確認するために鼻腔ＣＯ₂をモニターする手段；および集められた呼気の１以上の成分のレベルを測定すること；を含んでなる、被験者の呼気の成分を測定するための方法および関連装置を提供する。モニターおよび分析するのに好適な成分は内因性の一酸化窒素である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトの呼気成分の測定のための方法及び装置本発明の分野本発明は、バイオフィードバックを用いて固定した流量での呼息を制御しつつ、鼻腔のような上部呼吸管から生じる物質の混入なしに、下部呼吸管からの呼気成分を測定することに関する。本出願は1996年４月９日に出願した出願番号第08 /629,584号の一部係属出願であり、また1996年５月10日に出願した仮出願番号第 60/017,251号に基いている。両方の親出願の開示内容は、それらの全体を参考として本明細書中に組み入れるものとする。発明の背景ヒトの息の分析による疾患の診断が、医学において長い間実施されてきた。例えば、臭いのみにより、アセトン、アンモニア、又は硫黄化合物のような様々な揮発性の息の成分が検出でき、糖尿病、肝臓の損傷又は腎臓の機能障害のような症状を評価するために用いられる情報を提供している。また、ガスクロマトグラフィー及びマススペクトロメトリーが、毒性物質への曝露、肝臓疾患及び肺ガンを評価するために用いられている。このように、呼気物質の測定は、広範な種々の医学的状態における診断及び予後判定の手段として有用で有り得る。しばしば、重要とされるのは、肺機能を評価する場合に、１以上の様々な呼気物質を測定することである。これらのものとしては、内生気体ガス(すなわち、酸素、二酸化炭素及び酸化窒素)、肺の拡散能力を試験するために用いられる外生気体(すなわち、一酸化炭素、アセチレン、アルゴン及びヘリウム)、揮発性物質(すなわち、エタン及びペンタン)、及び呼気中に存在する液体(すなわち、息の濃縮物)をサンプリングすることにより見出される非揮発性物質(例えば界面活性剤などのタンパク質、ＤＮＡ、過酸化水素) が挙げられる。例えば、呼気中のいくつかの非揮発性高分子の検出は、可能な診断手段としてとして評価されている。しかし同じ分子がまた鼻の通路において生じ得る。一般には、Scheidelerら、Am.Rev.Respir.Dis.148:778-784(1993)を参照のこと。そこに記載のように、呼気濃縮物中のタンパク質は回収され、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される。そのようなサンプルは、インターロイキン-1、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子αのような炎症と関連のあるタンパク質について、免疫測定法により分析される。粘膜炎症のメディエーターのロイコトリエンB4のレベルは、気管支肺疾患を有する患者の呼吸濃縮物において上昇していることが見出された。Becherら、Appl．Cardiopulmonary Path.5:215-219(1 995)。同様に、種々の化合物が気管支ガンを有する患者において上昇していることが見出された。Pretiらの米国特許第4,772,559号を参照のこと。また、気道中の病原微生物DNAの検出がヒトの呼気中の単離されたDNAを検出することより評価されている。Hillebrandら、ATS Abstracts(1996)：181を参照のこと。呼気の成分をモニターすることが重要であることを示す他の例として、安定及び不安定な慢性的な閉塞性肺疾患を有する患者は、気道中に増加した酸化物の産生を示すことである。酸化物は疾患の悪化とともにさらに増加し、そのレベルは吐き出された過酸化水素を測定することによってモニターされ得る。例えば、De khuijzenら、M.J.Resp.＆Crit．Care Med.154：813-816(1996)を参照のこと。このように、吐き出された過酸化水素の測定は、小児喘息患者における急性気道炎症のマーカーである。Dohlmanら、M.Rev.Resp.Disease 148:955-960(1993)。特に関心の高い一つの呼気物質は、吐き出された内生酸化窒素(NO)である。酸化窒素は生物学的システムにおける中心的メディエーターであることが知られており、したがって、内部の吐き出された酸化窒素は、肺機能及び種々の肺疾患の診断及びモニタリングにおいて目的のものになる可能性がある。酸化窒素は動物及びヒト被検体の吐き出された息中に測定され得、気道の疾患、特に気管支喘息、そしてまた気管支拡張症及び肺移植の拒絶及び他の肺の状態を評価することにおける有用な診断ツールとして特に見込みがある。本発明者らにより共に執筆された最近の文献には、吐き出された酸化窒素を測定することの価値及び技術がまとめられている。Silkoffら,Am.J.Resp.Crit.Care Med.155:260-267(1997)、ならびに本明細書で引用されている文献と以下の表１を参照のこと。例えば、喘息患者は、正常な被験者に比較して相対的に高い呼気NOレベルを有し、これらのレベルは抗炎症療法の開始後急速に低下する。Kharitonovら、Lanc et 343：133-135(1994)を参照のこと。従って、既存の試験と組み合わせて呼気N Oを測定することは、喘息の診断及び評価の助けとなり得、そして、治療に対する応答の指標、又は治療における患者のコンプライアンスにもなる。主な健康問題としての喘息の重要性の観点から、重篤度を評価し且つ治療に対する応答性を確認を補助する試験に対する商業的な可能性は大きい。吐き出される息の成分、特に気体を回収しそしてモニターするための種々のシステムが開発されいる。例えば、Fraserの米国特許第3,951,607号には、肺に使用するための気体分析装置が記載されており、これらは、例えば窒素、酸素、二酸化炭素、一酸化炭素、ヘリウム、アセチレン、一酸化二窒素、二酸化硫黄及び麻酔ガス用の適切な検出器に接続されている。吐き出される息を回収及び分析するためのその他の様々な装置としては、Glaserらの米国特許第5,081,871号の呼気サンプラー；Kennyらの米国特許第5,042,501号の装置；Osbornの米国特許第4,202,352号の幼児の吐き出された息を測定するための装置;及びMitsuiらの米国特許第4,734,777号のヒトの尿中の代謝産物及び呼気の並行分析用の装置が挙げられる。コンピューター化されたデータ分析コンポーネントを含む肺診断システムも知られている(例えばSnowら、米国特許第4,796,639号)。検出システムには、吐き出された酸化窒素の測定に好適な、マススペクトログラフィック装置を用いているものもあれば、Sievers Instruments,Inc.(Boulder.CO.)モデル270B のような迅速応答化学発光分析器を用いているものもある。それにもかかわらず、様々な公知の呼気回収及び分析システム、現在までに刊行された方法は、２つの問題をかかえている。第１に、上部呼吸管(すなわち、副鼻腔及び鼻腔)の反対の下部呼吸管から生じる物質の量を測定するためには、より有用なシステムは、上部呼吸管、すなわち軟口蓋から生じる程度までそのような物質を実質的に除去又は排除しなければならないことである。例えば、鼻腔から生じる酸化窒素は、下部呼吸管から生じる酸化窒素のレベルに比べて高濃度（しばしばppmの範囲)で存在し、従って、声門下の気道中のものよりも大きいオーダーのレベルで存在する。そのような、鼻腔の酸化窒素は、鼻咽頭を経由して気流に入り、そして口から出て、そして好ましくは排出されるはずである。本発明者らは、運動中に排出されるガスをモニターするために用いられるような鼻クリップ及び低抵抗のマウスピースを利用する装置が、前記の要件を満足するには適当ではないことを見出した。そのようなシステムは、例えばMorrisonら、 Am.J.Cardiol.64:1180-1184(1989)に記載されている。第二に、例えば呼気NOを測定する場合、濃度は呼気の流量、おそらくは気道における移行時間に影響を及ぼすことにより大きく変化する(すなわち、およそ35 倍)。呼気の流量により、気道における移行時間は変化し、そのため、ＮＯ取込みに利用できる時間が変る。さらに、異なる人々は異なる量で呼吸する。従って、等しく一定の流量を提供する手段も重要である。従って、必要とされるのは、呼気の成分を受容し、回収し、そしてサンプリングするための技術及び関連装置であって、上部呼吸管(例えば鼻腔)に存在するか又はそこから発生する物質の混入が防止されているか又は実質的に低減されている前記技術および関連装置である。さらに、未制御の呼気流量は、サンプルの測定及び評価を複雑にし得るため、変動性を補償し且つ実質的に低減させるための技術及び方法がまた必要とされている。したがって、本発明は、そのような技術及び関連装置に関する。本発明の方法は、入院患者及び外来患者のセッティングの両方に著しく適している。開示する方法は、再現性があり、迅速且つ医学スタッフが容易に実施できるものである。そして各呼吸器の医院における肺機能評価の日常的な部分になり得る。発明の概要本発明は、被験者の呼気の成分を測定する方法を提供する。本発明の方法は、呼気を受容するための適当な装置の中に被験者の呼気を吐き出させ、被験者の口腔内の圧力を、呼気の間中、鼻咽頭を隔離（isolate）するために被験者の軟口蓋（すなわち口蓋帆）の筋肉を閉鎖するのに十分なレベルにまで上昇させ、そして集められた呼気の１以上の成分のレベルを測定するステップを含んでいる。同様の閉鎖は、例えば口笛を吹くときや風船を膨らませるときに自然に生じる。軟口蓋の閉鎖は、軟口蓋が開いたときに下方気道に由来するCO₂のために増加する呼気の間中の鼻からのCO₂レベルを同時にモニターすることで確かめることができる。本方法は、好ましくは一酸化窒素を測定する。しかしながら、二酸化炭素、酸素、一酸化窒素、窒素、二酸化窒素、過酸化水素、タンパク質、界面活性剤、DN A、アセトン、アンモニア、硫黄化合物、アセチレン、一酸化炭素、エタンおよびペンタン等の呼気中の種々の他の成分を測定することができる。本発明の目的のためには、測定すべき呼気の成分は実質的に声門より下の気道に由来するものである。好ましくは、呼気の成分の少なくとも約75％は排除され、より好ましくは上方気道に由来する成分の少なくとも約85％、最も好ましくは少なくとも約95 ％が除かれる(表２参照)。本方法は、選択された成分の測定に先立ち、呼気の成分の１以上を集めるステップをさらに含んでいてもよい。好ましくは、本方法は被験者の呼気の流量を一定に維持するステップを含んでいる。この一定の流量は、呼気を受容する装置と接続するまたは組み込むことによって結合した、呼気に対する抵抗を増大させる手段を含む、抵抗手段によって達成することができる。好ましくは、一定の流量は呼気の圧力の瞬時のディスプレーを呼気を吐き出している被験者に提供することでもたらされ、被験者は一定の圧力を維持するために呼気力を調整する。一定の圧力および固定された抵抗によって呼気の流れが安定化し、従って気流中への安定したNOの取り込み、およびNOプラトーが観察され、これは気管支NOによる気流の安定した状況調整を表す。本発明の装置は、上記の方法で被験者の呼気の成分を測定するための装置を提供する。この装置は、被験者からの呼気を受容するための導管手段、被験者の口腔内の圧力を、軟口蓋を閉鎖し呼気の間中鼻咽頭を隔離するのに十分なレベルにまで上昇させる手段、および受容した呼気の１以上の成分のレベルを測定する手段を含んでいる。この装置は、好ましくは被験者が一定の圧力を維持するために呼気力を調整できるように、呼気の圧力の瞬時のディスプレーを被験者に提供する手段を含む。また、好ましくは、被験者の口腔（例えば口および喉の関連部）内の圧力を上昇させるための手段は、声門より上の鼻の腔路および洞由来の呼気の成分の存在を実質的に排除するために圧力を増加させるのに十分なものである。図面の簡単な説明本発明の以上の、また他の利点は本発明の例示的な態様を示す後の図面の下記説明を参照することでより十分に、そして完全に理解されるであろう：図１は本発明に係る装置の模式図を示す。図２は鼻からのCO₂値の記録（トレーシングＡ）及び呼気中のNOプロフィール（トレーシングＢ）を同時にトレースしたサンプルを示す。矢印はマウスピースの挿入時点を示す。被験者は軟口蓋が開く時にCO₂値の上昇及びNO_PLAT値の下降を示す嚥下（Ｓ）を命じられた。図３は鼻からの吸気後のもの（トレーシングＢ）と比較した口からの吸気による一回の呼吸のNOプロフィールを示す。図4Aは8.5-75.6ｍｌ/sの流量を有する６個の抵抗でのNO_PLATおよび呼気の流れのプロフィールを１人の被験者でトレースしたものを示す。図4Bは850及び1,550 ｍl/sの流量を有する２個の抵抗での同時期のNO_PLAT及び呼気の流れのプロフィールを示す。図5Aは10人の被験者における流量対数に対するNO_PLAT値(ppb)を示す。図5Bは流量対数に対する最低流量（4.2ｍｌ/s）の百分率として表したNO_PLATデータを示す。図６は９個の抵抗で測定した10人の被験者における流量対数に対するNOe値（平均±SEM、n＝10）を示す。図７は、呼気の流れおよび壁から内腔（lumen）へのNOの拡散とともに、肺胞気道を模式的に示すNO***の理論的なモデルを示す。グラフは流量が一定の条件下での内腔中の連続した点における理論的なNO濃度を示す。好ましい実施態様の詳細な説明本発明の好ましい実施態様では、正の口腔内圧力を用いて被験者が軟口蓋 (vellum)を閉鎖するようにさせることにより、鼻腔(鼻)の物質（例えば、NO）の飛沫を排出させる。また、試験回路の呼気リムに固定した呼気抵抗を導入することにより、１以上の低い標準化した流量（例えば、20または40ml/s）が好ましく用いられる。「試験回路(test circuit)」のこの部分は、呼気を受容または収集するのに用いられる装置の「受容」部分を含むであろう。上記の比較的低い流量は下部気道で生じる物質（例えば、NO）の濃度を増幅させるため、被検者の呼気のより再現性の高い測定がもたらされ、しかも、健康と疾患とが、任意の個体についての特定のレベルの各種放出物質またはそのような物質の放出レベルの経時的変化が疾患または悪化と相関し得る程度に大きく区別できるようになるであろう。そのような技術はまた、不正確な現在の分析装置の低い検出限界を回避するのにも役立つであろう。開示の方法はまた、被験者または被験者間または治療後(post-therapeutic)の比較に直接かつ確実に可能である。しかしながら、そのような実施態様が構成（配置）が一定に維持される限り、（例えば小児の）特定の臨床的要件に応じて呼吸回路の圧力／流量(flow)特性を様々に変えることにより、あらゆる流量を測定することが可能である。呼気ＮＯを測定するための標準化された構成または確立したガイドラインはまだ存在しない。しかしながら、特定の構成が設計されれば、その実施態様は再現性の高い結果、例えば以下に詳細に記載するＮＯプラトー(NO plateau)をもたらすはずである。注目すべきことは、種々の低流量を得ることは、固定した呼気抵抗を用いた場合にのみ可能である点である。本発明の好ましい実施態様によれば、被験体またはヒトの肺から吐き出された物質（例えばNO）を測定するための装置は、被験者が吐き出した空気を受容するための導管手段と、呼気の間の該被験者の口腔内の圧力を上昇させて軟口蓋を閉鎖させることにより、鼻咽頭と鼻腔とを隔離して、該被検者が吐き出した空気の実質的に一定な流量を維持するための手段と、吐き出した空気中の特定の対象物質（例えばNO）の濃度を測定するための測定手段とを含む。場合によっては、この装置は、鼻腔（または鼻）ＣＯ₂をモニターして、軟口蓋の閉鎖を確実にすることを含む。軟口蓋を閉鎖するための手段は、導管内に存在する被験者が吐き出した空気の流量を低下させるための抵抗手段、および被験者が吐き出した空気を被験者自身が比較的一定の圧力で維持するのを補助するための圧力測定手段およびディスプレイまたはフィードバック手段を含み得る。例えば、圧力測定手段は、導管内の圧力を瞬時に表示して、被験者が、導管内の一定の圧力を維持するように自身の呼気の力を調整できるようにするための手段を含み得る。ほとんどの被験者は一定の圧力を約±10％以内で維持することができ、精度および再現性を確実にするためには、さらに好ましくは約±５％以内が適切であることがわかっている。軟口蓋を閉鎖するのには約５mmHgの圧力が適当であるが、本発明者らは、呼気が被験者にとって快適なままで被験者にとって維持するのが容易なのは約20mmHgであることを見出した。また、被験者がわずかに圧力を変えた場合、５mmの圧力における±１mmの変化は、20％の開き(divergence)に相当するが、20mmHgにおける±１mmHgの変化はわずかに５％の変化を反映するにすぎない。鼻腔ＣＯ₂をモニターすることにより軟口蓋が実際に閉鎖することを測定することは比較的容易である。何故ならば、測定したＣＯ₂は実質的に増大し、軟口蓋が開くとＣＯ₂の正常な呼気レベルに近づき、また、被験者が鼻で息を吸い、これは関連装置のオペレーターに聞こえるからである。さらに、軟口蓋が開くと、最初のＮＯピークは観察されない。本発明の別の実施態様によれば、被験者の肺から吐き出された物質（例えばＮＯ）の測定方法は、被検者の口腔内の圧力を上昇させて、軟口蓋を閉鎖して鼻咽頭を隔離し、かつ該被験者が吐き出した空気の比較的一定な流量を維持することを含む。吐き出した空気中の物質の濃度（例えばＮＯ濃度）が測定できる。約40〜80mm/sの範囲の流量が好ましい。この流量において、ＮＯシグナルの十分な増幅があり、重要な情報が提供される。流量＝圧力÷抵抗であるので、約± 10％の精度が好ましく、±５％がさらに好ましい。この精度は適切であり、圧力のファクターについて上記で述べたものと同じである。本明細書で用いられる略語は以下のとおりである。ＮＯ：酸化窒素；ＮＯ_PLAT ：プラトー酸化窒素濃度；ＮＯｅ：酸化窒素の排出速度；ＴＬＣ：総肺気量；ＦＲＣ：機能的残気量：ＣＶ：変動係数；rho：クラス内相関因子(intraclass correlation factor)；ＡＮＯＶＡ：分散分析；ＰＥＥＰ：正の最終呼気圧力 (positive end expiratory pressure)。カッコの中の数字で示した文献は、以下の一覧で示すものであり、本明細書中のいずれかにおいて示される全ての特許および雑誌文献は、それらの全文を参考として本明細書に組み入れるものとする。酸化窒素（ＮＯ）は、血管内皮(4)、免疫系(1)および非アドレナリン作用性非コリン作用性神経系(5)を含む生物学的な系における中心的媒介物（central mediator）である(1,2,3)。したがって、内因性の呼気酸化窒素は、喘息(6,7,8) を含む種々の肺疾患の診断およびモニタリングにおいて興昧深いものである可能性がある。呼気ＮＯ濃度の一回の呼気のプロフィール（被験者は鼻クリップを付けたまま行うもの）は、最初のＮＯピークそしてその後に続くＮＯプラトー（ＮＯ_PLAT）として記載されている(9)。収集した空気中のピークＮＯ値、ＮＯ_PLAT値および混合気体濃度は全て、肺疾患のＮＯ生成のパラメーターとして用いられている(表１参照)。しかしながら、最近明らかにされたことによれば、吐き出した空気中の有意な比率のＮＯは、鼻腔（鼻および鼻咽頭）において生じること、およびこれがＮＯピークの原因となり、肺にはほとんど起因しないことが示唆される(2,9,10)。吐き出したＮＯについて報告されている値は非常に様々であり(表１)、この理由は明らかになっていない。本発明者らは、報告されているＮＯ値の広範にわたる変動（挿管した患者または気管切開したサンプル体についての研究を除く）は主に、鼻腔ＮＯの混入によるものであると考えた。何故ならば、軟口蓋は、呼吸サイクルの一部または全部で開いたままであり得るからである。鼻クリップの使用は、口腔の空気流だけを促進することにより上記の問題を解決すると考えられるかもしれないが、これは、鼻腔ＮＯを蓄積させるだけでなく軟口蓋を開かせるために、理論的には悪化させるかもしれない(11)。第２に、公表されている技術で用いられる吐き出し操詐 (expiratory maneuvers)は非常に様々であり、最も一般的なものは、種々の期間の自然な呼吸(tidal breathing)または肺活量による吐き出しを含み、それぞれが独自の流量および流れパターンを有する。何人かの研究者は、呼気ＮＯ濃度およびＮＯ排出量は経時的に変化することを報告している(12,7,13)。これに鑑みて、本発明者らは、公表されたＮＯ値の変動を説明する別の要因が使用される呼気流量であることを報告した。本発明者らは、鼻腔ＮＯを除外した肺起源の呼気ＮＯを測定するための技術の開発を記載する。本発明者らのアプローチは、高い呼気抵抗を用いて、軟口蓋を閉鎖する連続的な呼気の正の口腔内圧力を作り出す。「高い抵抗(high resistance)」とは、約400cm H₂O／l／secよりも大きな抵抗、さらに好ましくは約600〜１,200 H₂O／l／secの範囲の抵抗を意昧する。この技術を用いた場合、一回の呼気のプロフィールでは早期のＮＯピークは存在せず、プラトーまでのＮＯ濃度の急速な上昇が見られ、これは気道を通過することによってコンディショニングされた肺胞の空気に相当する。この技術は、次に、10人の健常な被験者におけるＮＯ_PLATと呼気流量との関係を調べるのに用いた(流量は4.2〜1550ml/s) 。ＮＯ_PLATレベルおよびＮＯ排出量（ＮＯｅ）が顕著に流量依存性であることがわかった。図１に示すように、装置10は、導管手段12、空気供給導管手段14、およびＮＯアナライザー手段16を含む。好ましい実施態様によれば、規定濃度の任意の特定成分（例えばＮＯ）を含む空気がシリンダー20を経由して供給される。規定の品質の空気を用いることにより、測定により求められた吐き出された空気から得られる任意物質（例えばＮＯ）の濃度は、供給した空気中に存在する可能性のある特定物質（例えばＮＯ）の量を考慮に入れて正規化（normalized）される。空気は給湿器22で処理してもよい。次に、被験者の吸入のためにその空気を導管14および導管12に通す。次に被験者は導管12に息を吐き出す。空気は導管12を通って、ルドルフ(Rudolph)バルブ24を通過し、次に導管内の絞り (constriction)26を通過する。絞り２６は、導管12内の圧力を上昇させ、そのために息を吐き出す被験者の口腔内の圧力の上昇が起こる。この圧力の上昇は軟口蓋を閉鎖するのに十分なものであり、したがって、鼻腔に存在するまたは鼻腔で生じた物質を実質的に排除する。適切な絞りは、回路中に標準的な12ゲージまたは18ゲージのスチール製医療用針を用いることにより作製できる。実際の流量を測定して、標準的な方法を用いて精度を確認することができる。被験者が息を吐き出す時に、問題の物質に特異的なアナライザーで空気をサンプリングしてもよい。アナライザー手段16は、吐き出した空気中の特定の物質( 例えばＮＯ)のレベルを測定する。圧力計28は導管12と流れが通じており、好ましくは、導管12の圧力の瞬時の測定をもたらす。息を吐き出している間、被検者は導管12内の圧力をモニターし、その圧力を（好ましくは同じレベルに、または少なくとも実質的に同じレベルに、つまり、好ましくは約±５％以下の変動で）維持するように被験者自身の吐き出す力を調整する。例えばＮＯを測定するために、装置10は任意の市販の迅速応答(rapid response)ＮＯアナライザーと組合せて用い得る。ＮＯを分析するためには、 Sievers 270B(Boulder CO)迅速化学ルミネセンスアナライザーが好ましい。他の物質の場合では、その物質に適切な迅速応答アナライザーと共に受容および収集装置を用いてもよく、当業者であればそのような装置をルーチンに選択することができる。実施例実施例１吐き出した一酸化窒素の一回の呼吸プロフィール吐き出した酸化窒素(eNO)の一回の呼吸プロフィール（鼻をクリップしたもの）は、肺のNOと一致させることができる初期NOピーク(NOP)とそれに続くNOプラトー(NOpl)として報告されてきた。最近の証拠は、鼻の一酸化窒素(nNO)が高く、NOPを生じさせることを示唆する。 NOplはSievers 270Bアナライザーを用いて測定した。測定回路は２方向の非再呼吸バルブに連結されたマウスピースからなり、これを通して腰掛けた被験者が貯蔵器からの湿った「医療用空気」(21%酸素、平衡窒素)を吸入する。鼻クリップは使用しなかった。10人の健常被験者はマウスピースを挿入し、直ちに総肺容量(TLC)まで吸入し、そしてすぐに吐き出した。吐き出す間、被験者は20mmHgの一定の口腔圧力に維持し、圧力計のダイヤルで彼らに表示し、軟口蓋（vellum）を閉じてnNO(鼻CO₂プローブにより確認した)を除外した。９つの分かれた流れを、種々の呼気抵抗を用いてNOpl(4.2〜1550ml/s)を測定した。 NOPは、20mmHg口腔圧力では存在しなかった。呼気流速(EF)が4.2から1550ml/s まで変化したので、LN（呼気流）が平均NOpl(5.1±1.4ppb〜112.5±54.89ppb)の 20倍以上の変化をもって上昇するにつれて(NOpl=e(5^{1727-0.5132(Ln(flow rate)} ⁾⁾ ,R²=0.808)、Ln(NOpl)は直線的に降下した。しかしながら、Ln NO排出(NOpl× EF)は、Ln EFとともに直線的に上昇した。30秒呼吸を止めると、すべての被験者についてNOplの最も高い値(178.1±100.8ppb)を得た。NOplは、TLCと比較してFR Cで減少したが(約-20％，p=0.009)、採用した呼気圧力のレベル(20mm対60mmHg， p=0.09)によって影響は受けなかった。実施例２一回呼吸の肺の一酸化窒素排出プロフィール我々は、呼気口腔圧力を陽圧にする（軟口蓋の閉鎖を確実にする）ことによリ、鼻NOではなく肺のNOを測定し、呼気流量(4.2〜1550ml/s)の範囲に渡ってプラトーNOにおける変化を調べた。プラトーNO値は、NOプラトー＝e^(5.1727- ^{0.5132(In(flow rate)))} により記載される減少した流れをもって、大方20倍(5.1 ±1.4ppb〜112.5±54.8ppb)上昇した。しかしながら、NO排出は上昇した流れとして大方 17.5倍の上昇を示した。従って、開示した技術は、鼻NOの有意なレベルの存在なしに排出したNOを測定する簡単な方法を提供する。特に、吐き出したNO濃度及び排出の顕著な流れ依存性がある。前述のデータに基づくと、吐き出した肺のNOは、NO濃度シグナルを増幅するために非常に低い流速で測定された最もよいものであり、採用した呼気の流れと関係しているに違いない。実施例３吐き出したNOの測定用装置１．NO の測定 90%のフルスケールで応答時間<200msを有する急速応答化学発光アナライザー( Sievers 270B，Boulder，CO.)を用いた。350ppbに対する測定を標準NOガスの連続希釈を用いて行い、アナライザーサンプルの流速を一日250ml/分に調整した。アナライザー応答の直線性を繰り返し測定して立証した。このアナライザーの感度について製造業者が明示した下限は約5ppbであり、我々の装置で繰り返して測定した値は2ppbの下限を示した。一酸化窒素は、サイドポート30を介して口の近くで採取した(図１に示す)。総呼気流速は、アナライザーの流れの合計として得、呼吸流量計32によって測定した。一酸化窒素及び流れのシグナルは、XYYチャート記録紙(Hewlett-Packard 70 46A)上で同時に表示した。測定の終点は少なくとも５秒間持続のプラトー (NO_PLAT)として定義した。再現できる３つのNO_PLAT軌跡(±10%)を９つの呼気の流れのそれぞれについて記録した。低い呼吸NO排出速度(NOe)（安定した呼気の流れの期間に生ずる安定した排出速度）は、NO_PLAT、及び等式NOe(nmol/s)=NO_PLAT(ppb)×流速(ml/s)×kに従った流速から計算した。定数kはk=0.000040であり、STPD及びnmol/sへの変換についての補正因子である。２．選択された実験集団 16〜50歳の健康で喫煙しないボランティアをこの実験のために蟇集した。実験プロトコールは、トロント病院のヒト倫理委員会により承認されたものであり、 1983年のヘルシンキ宣言の原則に従って行った。実施例４：NO_PLAT法を確立するための実験１．高抵抗法を用いるNO_PLATの決定（ｎ＝10）測定回路（図１）は、二方向バルブに連結されたマウスピース34（図１に示すように）から構成されており、これを通じて、座っている被験者は貯蔵器から給湿済みの「医療用空気」(21％酸素、平衡窒素)を吸入した。鼻クリップは使用しなかった。２つの独立した呼吸流量計（Fleisch＃1及び＃3）を使用することにより、流れを低範囲と高範囲でそれぞれ測定し、既知の流量を用いて較正した。被験者は９つの独立の呼気流量で９回息を吐き出した。８つの流量は８つの抵抗（R1〜R8）を用いて測定した。R1は回路のみの抵抗とした。・R2及びR3は内径２及び５mmの内部チューブの短セクションからなっていた。R4〜R8は、通常の医療用針(21,20,19,18及び16Ｇ)を用いて作った。９番目の流れは、アナライザーのみの吸引力によって作られるものであり、呼気用リムはサンプル経路から遠ざけた。作られた９つの流量は、1550，850，75.6，38.2，20.7，17.2，10.3，8.5及び4.2ml/sであった。信頼性のあるNO_PLATを得るのに十分な時間一定の流量を維持することのできる最大流量は、1550ml/sであった。全ての流量において、被験者はマウスピースを挿入し、総肺容量（TLC）まで即座に吸引して即座に吐き出した。被験者は、息を吐き出している間、口腔内圧力を20mmHg一定に維持するように指示されており、圧力計のダイアルにより圧力を表示した。被験者は、頬と唇を手で支えることにより、マウスピースを密閉することができた。頬を膨張させることは、軟口蓋の閉鎖を確実なものとするものではないので、これを防止した。２．息を吐き出している間の軟口蓋閉鎖の確認（ｎ＝５）軟口蓋閉鎖は、前方鼻孔中のプローブを用いる急速応答アナライザー(Ametek ，P61B)を使用してCO₂をモニタリングすることにより評価した。この際には、マウスピース中に息を吐き出している間、口腔内圧力を20mmHg一定に維持した。３．気道内サンプリングを用いる鼻からのNO漏れを評価するための実験２人の健常なボランティアにおいて、４％リドカインによる局所麻酔の後に、細く柔軟なカテーテル（８及び10ゲージ、French）を鼻に通して気管中に配置し (発音障害によって確認)、声帯の高さにあわせて20cmまで引き戻した(発音障害が継続)。該配置は、被験者１については、ファイバーオプティック喉頭鏡を用いて行った。カテーテルが存在することによっては、軟口蓋閉鎖が害されることはなかった。NOアナライザーサンプル経路は、三叉タップを介して、カテーテル及びマウスピースのサイドポートに連結した。次いで、被験者は、20.7ml/sの流量において上述のようにしてNO測定を行った。息の吐き出しそれぞれについて、 NOアナライザーは最初に口からサンプリングし、次いで一旦NO_PLATに達した後に、カテーテルからのサンプルに切り替えるまでの操作を、一度の吐き出し操作の間に行った。これと同じプロトコールを、中咽頭中に配置したカテーテル（発音の回復によって確認）を用いて行い、さらに同様に鼻腔内に配置したカテーテルを用いて行った。４．吸入NOのNO_PLATへの影響を評価するための実験本実験の目的は、潜在的な肺生物学的情報を得るために、NO_PLATを測定することである。しかし、NO_PLATは、吸入気体源からのNO、鼻孔からの吸入中に運ばれるNO及び気管支ツリー（bronchial tree）からのNOにより影響を受ける可能性がある。息の吐き出しのみを行う場合には、口腔内圧力が陽圧となるため、軟口蓋が閉鎖されて鼻NO漏れが防止される。従って、吸入のときに軟口蓋が開き、鼻NO が吸入される可能性がある。本発明者らは、意図的にNOを吸入させることにより NO_PLATが変化するかどうかを調べるために、２つの実験を行った。５．鼻吸入の口吸入との比較（ｎ＝３） NO_PLATは、口から吸入した後に38.2ml/sの流量で上述の方法を用いて測定し、次いで、鼻NO吸入を最大とするために鼻から全肺活量を吸入した直後に同様の測定を行った(測定３回)。６．高NO吸入の効果（ｎ＝４） NO_PLATは、口から「医療用空気」を吸入した後に38.8ml/sの流量で上述の方法を用いて測定した(測定３回)。次いで、被験者は高濃度NO混合物（〜1000ppb）を吸入し、NO_PLATを即座に測定した(測定３回)。実施例５放出NO法についての試験呼気流量、呼気圧、肺活量、並びに日間変動および日内変動のNO_PLATに対する影響を調査するために５つの試験を行った。１．呼気流量によるNO_PLAT変動を評価するための試験被験者は、９つの異なる呼気流量で９つのNO_PLAT測定を行った。２つの異なる呼吸流量計(Fleisch＃1および＃3)を使用して、低域および高域(low and high r anges)のそれぞれにおける流量を測定し、公知の流量で較正した。８つの流量を８つの抵抗(R1からR8)を用いて測定した。R1は巡回路自体の抵抗である。R2およびR3は内径２mmおよび５mmの短く切断した不活性チューブによるものである。R4 からR8は標準医療針(21、20、19、18および16Ｇ)を使用して生じさせたものである。９つ目の流量は、サンプルラインより遠位の呼気縁辺を閉塞して、アナライザの吸引のみにより生じるものとした。このようにして得た９つの流量は1550、850、75.6、38.2、20.7、17.2、10.3 、8.5および4.2ml/sであった。信頼性のあるNO_PLATを得るのに十分に長い間一定の流量が維持された最も高いと思われる流量は1550ml/sであった。９つの呼気流量のそれぞれについて、３つの再現性のあるN0PLAT軌跡(±10％)を記録した。合計呼気流量は、アナライザによる流量と呼気記録器により測定された流量との和とした。低呼吸ＮＯ排出量(ＮＯｅ)、即ち安定した呼気流出の間に生じる安定した呼気流量を、式ＮＯｅ(nmol/s)＝NO_PLAT(ppb)×流量(ml/s)×ｋに基づく流量およびN O_PLATから計算した。定数ｋは、0.000040であり、STPDおよびnmol/sへの変換の際の補正係数である。２．日間および日内変動(ｎ＝６) ４日間の別々の日の朝に、３つの異なる流量(10.3、20.7および38.2ml/s)についてNO_PLAT測定を行った。同じ被験者に対して、通常の実験時間(朝９時からタ方５時まで)の間に、２時間間隔で、同じ流量について４つのNO_PLATの測定を行った。この試験においては、繰り返しの測定を簡易化するために、これらの３つの流量のみを選択した。３．肺活量の影響(ｎ＝１０) この試験は、起こりうるエラーの原因として、ＴＬＣに対して不完全な吸入の影響を評価するために行った。本試験においては、ＴＬＣから測定したＮＯ_PLAT 値を、３つの呼気流量(10.3、20.7、および38.2ml/s)の機能的残気量(ＦＲＣ)から得た値と比較した。ＦＲＣ値については、被験者は、一定の安静周期呼吸後、息を吐出し終わるとマウスピースを咥え、口内圧を20mm Hgに維持しながらマウスピースに息を吐出した。４．呼気口内圧(ｎ＝５)の影響この試験は、起こりうるエラーの原因として、被験者により生じる口内圧の変動による影響を評価するために行った。20mm Hgの呼気圧を用いて得た一酸化窒素のプラトー値を、60mm Hgの呼気圧で得た値と比較した。同じ抵抗に対し60mm Hg圧での流量は20mm Hg圧での流量と異なっていたため、本試験では、ＮＯ_PLAT 値を、５つの流量(15、20、25、30および35ml/s)におけるＮＯ流量曲線から補間して求めた。５．30秒間の無呼吸操作(ｎ＝１０) この試験は、起こりうるエラーの原因として、息の吸込みと息の吐出しとの間の一時停止(無呼吸)による影響を評価するため、また気道中のＮＯ蓄積の限界を試験するために行った。被験者は、ＴＬＣまで息を吸込み、閉塞バルブ（ＮＯアナライザサンプルポートを閉塞）に対して20mm Hgの口内圧を30秒間維持した。3 0秒後、アナライザポートを開口し、ＮＯ濃度を記録した。実施例６統計的方法 Shapiro-Wilkテストにより、ＮＯ濃度および９つの流量について正規ガウス分布からの偏差が示されたため、双方のパラメータに対して自然対数変換(natural logarithm transformations)を行い、歪度、尖度、および正規分布からの偏差を軽減した。Ｉｎ(ＮＯ)とＩｎ(流量)との関係を、最小平方線形回帰を使用して分析した。日内変動および日間変動の記述的な統計を平均変動係数(ＣＶ)とした。日内変動および日間変動の再現性(被験者間の変動と比較して)を、０(再現性が皆無)から1.00(再現性が完全)にわたる信頼性についてのクラス内係数(ｒｈｏ)を抽出して、評価した。ＮＯ濃度に対する肺活量および呼気流量の関係を精査するために、３つの呼気抵抗に対する２つのレベルの肺活量(ＴＬＣ対ＦＲＣ)から、２×３の繰り返し測定分散解析(ＡＮＯＶＡ)が行われた。ＮＯ_PLATに対する圧力および流量の関係を求めるために、２つのレベルの呼気圧と試験された５つの流量から、２×５の繰り返し測定ＡＮＯＶＡが行われた。統計的な識別を確実にするために、全ての試験においてｐ＜0.05を使用した。実施例７ＮＯ_PLAT測定法を確認するために行った試験１．軟口蓋閉鎖の確認５人の被験者において、息を吐出している間の鼻腔におけるＣＯ₂モニタリングにより、被験者がマウスピースを咥えると高くなる鼻腔ＣＯ₂濃度が息を吐出す間に非常に低い量にまで下降し(〜0.2％)、軟口蓋が閉じていることが示された。図２は、１つの軌跡、および被験者に飲み込むように要請し軟口蓋が開いた際に生じたピーク(Ｓ)を示す。ＮＯ_PLATは、軟口蓋が開き、気体が鼻から抜け出たために下降した。２.気道においてサンプリングしたＮＯ_PLATと口腔におけるＮＯ_PLATとの比較( ｎ＝２) 声帯の真下、口咽頭内および鼻腔内でカテーテルによりサンプリングしたＮＯ_PLAT 値を、表２に示し、口および気道内弁が同等であることを示した。口で息を吐出す間に鼻腔において記録した鼻腔ＮＯ量は、気道弁よりも著しく高かった。３．息を吐出す間に流入された鼻腔ＮＯの影響(ｎ＝５) 鼻腔吸息(ｎ＝５)鼻から息を吸込んだ後に吐出したＮＯのプロフィールは、口から息を吸込んで得られたものとは異なっていた（図３）。急速な上昇、およびプラトー(ＮＯ_PLAT)が後続する初期ピークがある。口での吸息後の場合と鼻での吸息後の場合との間に有意なＮＯ_PLATの差はなかった(14.6±4.4対14.2±4.1ppb )。４．高濃度のＮＯ気体を吸込んだ場合のＮＯ_PLATに対する影響(ｎ＝４) 吸込む気体のＮＯ濃度は1059±175.7ppbであった。先の試験と同様、吐出した NOの息プロフィールは、高濃度の混合気体(mixture)を吸込んだ後変化し、非常に高い初期ＮＯピークを示し、その後プラトー(ＮＯ_PLAT)まで下降した。高いＮＯ吸入後、ＮＯ_PLATに有意な変化はなかった(18.9±7.0〜16.6±4.0ppb、ｐ＝0.22)。実施例８ＮＯ測定法についての試験１．呼気流量によるＮＯ_PLATの変動(ｎ＝１０) 全被験者が本方法が概して快適と報告し、ほとんどの被験者が本方法が標準の強制的な呼気よりも簡単であったと報告した。高い抵抗の際に、呼気を最高36秒間維持する努力が必要であり、これが時折口腔筋の一時的な疲労を伴って、一部の被験者に軽い不快感を与えた。ほとんどの被験者において、３〜５回の測定で、それぞれの抵抗に対するＮＯ_PLATの再現性ある値(±10％)を３つ得た。ＮＯ_PLATの軌跡はプラトーまでの急速な上昇を示した(図４)。プラトーに到達するまでの時間は、抵抗が上昇するほど長くなり、結果的に呼気流量を減少した (1550〜4.2ml/sの流量に対してそれぞれ2.7〜36秒の範囲)。20mm Hgの口腔圧を維持した際には初期ＮＯピークは存在しなかった。全被験者において、流量が上昇するとＮＯ_PLATが下降した(図４Ａ)。試験した９つの流量のそれぞれについて、ＮＯ_PLATに非常に有意な差が認められた。流量が400分の１に減少すると、平均ＮＯ_PLAT(5.1±1.4ppb〜112.5±54.8ppb．、ｐ＝0.0001)に20倍を上回る上昇が認められた。標準偏差は、被験者間のＮＯ_PLAT 分布は、高い流量においては狭いが、減少した流量においては著しく広がったことを示した(流量4.2ml/sにおいてＮＯ_PLATは27.5〜215.9ppbにわたった)。自然対数変換によるデータを使用して得た流量に対するＮＯ_PLATの関係は、ＮＯ_PLAT＝ｅ^{(5.1727-0.5132(In(} ^流量))) で表された(Ｒ²＝0.808、ｐ＝0.0001，図５Ａ)。 (流量およびＮＯ_PLATから得た)一酸化窒素排出も流量に依存したが、ＮＯ_PLATとは反対に、全被験者において流量が上昇すると直線的に上昇した(自然対数変換によるデータ、図６)。流量が4.2から1550ml/sまで上昇すると、ＮＯe(0.0189± 0.009〜0.33052±0.087nmol/s)に17.5倍の上昇が認められた。２．ＮＯ_PLATの日間変動および日内変動(n＝6) 同じ被験者に対する日間および日内試験での、３つの流量でのＣＶおよびｒｈｏ値を表３に示す。３つの流量についてのクラス内係数(ｒｈｏ)は、良好な日間再現性、そしてさらに良好な日内再現性があったことを示している。日中を通してＮＯ_PLATの変動に系統的パターンはなかった。３．ＮＯ_PLATに対する肺活量の影響(ｎ＝１０) 試験した３つの流量全てにおいて、ＦＲＣから吐出して得たＮＯ_PLATの値は、ＴＬＣから得た値よりも有意に(約20％)下回っていた(p＝0.0093、表４)。４．ＮＯ_PLATに対する呼気圧の影響(ｎ＝５) ５つの異なる流量における圧力の影響の分析は、20および60mm Hgの呼気圧で測定したＮＯ_PLAT量に有意な差がなかったことを示す(p＝0.0942、表４)。５．無呼吸(30秒)での値および最も速い息の吐出し(ｎ＝１０) 30秒間の無呼吸の後、最も遅い息の吐出しの後(流量＝4.2ml/s)、並びに最も速い息の吐出しの後(流量＝1550ml/s)に得た一酸化窒素プラトー値を表５に示す。全ての被験者において、30秒間の無呼吸操作により、ＮＯ_PLATの最高値を得た (178.1±100.8ppb)。実施例９．吐き出された一酸化窒素（eNO）および一酸化窒素排出率（exNO）は顕著に流量に依存する。鼻一酸化窒素（nasal nitric oxide）(nNO)を用いずにeNOを測定する技術。吐き出された一酸化窒素（eNO）は、肺疾患を監視する上で有用であると考えられる。一回の呼気のeNOプロフィール（鼻クリップ使用）は、初期NOピーク（N OP）に続くNOプラトー（NOpl）として報告されており、これは恐らく肺NOに相当すると考えられる。最近の実験結果が示唆するように、nNOは高く、NOPの上昇をもたらす。発表されたeNO値は、広範囲で相違しており、これはひよっとすると、測定技術の相違に基づくものかもしれない。幾つかの技術では、nNOが口腔内の空気流に入り、使用される呼吸操作方法（reipiratory maneuver）(例えば、自然呼吸（tidal breathing）対様々な速さの肺活量の吐き出し(vital capacity exhalation))により呼気流量（expiratory flow）(EF)が変化する。本発明者らは、Sievers 270 Banalyzerを用いてNOplを測定した。10人の健康な被験者は、一定の呼気口腔内圧力（20mmHg）を維持し、軟口蓋を閉鎖してnNOを排除した(鼻 CO₂探針により確認)。さらに、本発明者らは様々な呼気抵抗を用いて、９つの別々の流量（4.2〜1550ml/s）についてのNOplを調べた。結果 NOPは口腔圧力20mmHgの時には存在しなかった。Ln(NOpl)は、 Ln(EF)の上昇とともに、直線的に減少し(NOpl＝ｅ^{(5.1727-0.5132(Ln(} ^流量)))、 R²=0.808)、この時、EFが4.2から1550ml/sに変化するのに伴って、平均NOpl(5.1 ±1.4ppb〜112.5±54.8ppb)に20倍を超える変化があった。しかし、LnNO排出（N Opl×EF）はLnEFとともに直線的に上昇した。30秒の呼吸の停止の場合、すべての被験者において、最も高いNOpl値であった(178.1±100.8ppb)。NOplは、TLCと比較してFRCで減少した（〜20％、p=0.009）が、これは、使用した呼気圧力レベル（20mm対60mmHg、p=0.09）の影響によるものではない。結論本発明者らの方法によれば、nNOを用いないでeNOを測定すること_-が可能である。eNOは、シグナルを増幅するような非常に低い一定のEFにおいて最もよく測定できる。eNOの顕著な流量依存性に鑑みると、測定技術は使用される呼気流量に関連するにちがいない。実施例１０．サルブタモールおよび臭化イプラトロピウムの吸入後に吐き出される一酸化窒素を用い、鼻NOを用いずに肺NOを測定する技術。吐き出されたNOは、喘息およびその他の気管疾患をもつ被験者を監視する上で、興味深い。NOは新しい技術により測定した(その要約は併せて提出されている) 。６人の健康な被験者は、TLCまで吸入し、一定の低い呼気流量(20.7ml/s)で高抵抗を介して吐き出した。その間、連続的な口腔内呼気圧力を維持し (20mmHg)、軟口蓋を閉鎖させて鼻NOを除去した(鼻CO₂探針により確認)。３つの別々の日に、スペーサーによってMDI吸入器から二重盲式で投与される400μサルブタモール(Ｓ)、80μイプラトロピウム(Ｉ)、又はプラセボ（Ｐ）のいずれかを吸入する前後において、N0を測定した。NOを15分、30分、その後１時間ごとに４時間測定した。予備実験（pilot study）(ｎ＝６)において、一日に測定を繰り返したNOの変動係数は、〜10％であった。結果Ｓ，Ｉおよびｐを用いた場合、平均ＮＯは15分で減少し始め、30分で最小値に達する傾向にあった(基準線Ｓ:0.84±0.15、Ｉ:0.85±0.06、Ｐ:0.91 ±0.13)。これらの小さな変化は、有意ではなかった(p>0.19)。Ｐを用いた場合のNOの基準線への回復は60分までに起こり、Ｉを用いた場合には120分までに起こったが、Ｓを用いた場合には、NOは追跡調査の全期間において低いままであった。FEV1の平均変化は7％（ＳおよびＡ）および2％（Ｐ）であった。結論この実験により、Ｓ、ＩおよびＰの投与後にNOが減少する傾向にあることが判明した。被験者数が少ないため、統計的に有意ではないが、時間経過並びにＳ、ＩおよびＰの間のプロフィールの相違により、実際に効果があることが示唆される。吸入器推進効果が可能である。この減少の作用機序は明らかではないが、そのような作用機序としては、NO取り込み（Ｓ）を増加させる気管支壁の血管拡張、又はNOシンセターゼへの直接の効果が考えられる。この実験は、気管支拡張剤の前投与の少なくとも６時間後にNOを測定することを支持する。考察この実験において、本発明者らは、吐き出された肺ガスの鼻での呼気混入という問題を解決する、吐き出されたNOの測定技術を提案し、それを確認した。この技術を用いることにより、本発明者らは、NO_PLAT濃度およびNOeに顕著な変化があり、この変化は、呼気流量が4.2から1550ml/sに変化するときに起こることを証明した。この知見は吐き出されたNOに関する将来の研究において重要な意昧を有している。この実験は、吐き出されたNOに関する発表された値（表１）の大きな変化を起こす作用機序を明らかにするために始められた。第一に、本発明者らは、吐き出されたNO（９、14、15)と比較して顕著に高い濃度が報告された鼻NOには、呼気空気流が混入しているのではないかと考えた。予備的なNO実験（16）において、被験者に鼻クリップを用いて実験を行い、初期 NOピークを観察した。本発明者らは、鼻からの吸入がNOピークを減衰又は消滅させることから、このピークが鼻腔において生じるのではないかと考えた。鼻NOの混入に関する技術的な解決方法は今日まで提案されていない。第二に、発表された測定技術は研究者間で大きく相違する。Schillingら（17 ）およびAlvingら（６）は自然呼吸を使用し、Kharitonovら（7）は30-45秒の肺活量の吐き出しを使用した。一方、Perssonら（18、19）は10-15秒の肺活量の吐き出しを使用した。その結果、呼気流量およびそのプロフィールは、相応じて変化した。 NO濃度および排出の測定において呼気流量が有し得る重要性は、幾人かの研究者により報告されている(13、12、20)。彼らは、わずかな換気が吐き出されたNO に影響することを、特に運動による換気穴進の条件下において観察した。特に自然呼吸は、呼吸間における速度および容量の有意な変化によって特徴づけられる。さらに、FRCには周期的な変化がある場合があり、特に喘息被験者では、理論上NOレベルを変化させる可能性がある。その他の方法論的な相違としては、例えば、吐き出しの前の短い呼吸の停止の使用(８)、および鼻クリップの使用が挙げられる。Massaroら(22)は、鼻クリップの使用により、吐き出されたNOが肺胞に由来することが保証されたと述べている。しかしながら、鼻クリップの使用は、聴神経反射作用の研究（11）において生じているような、鼻NOの蓄積_-によって、および軟口蓋の開放の促進によって、実際には鼻NOの漏出を悪化させる可能性がある。一回吸気分析と同様に、ガス回収技術は使用される呼吸操作方法によって大きく相違する。従って、本発明者らが望むのは、鼻NOの影響を受けずに口から吐き出されたNOを測定し、技術によって変化し得る重要点である NOレベルの呼気流量に対する関係を調べることである。本発明者らの方法では、連続的な呼気圧力を使用することにより、吐き出しの間、軟口蓋を閉鎖することができ、開放した軟口蓋の存在下での吐き出しを通して漏出する可能性がある鼻NOを排除することができる。鼻CO₂探針では、５人の被験者において呼気の上昇は認められなかったため(図２)、本発明者らは、このことが達成できたと確信している。いずれの場合であっても、鼻クリップを使用せずに一定の正の呼気口腔内圧力を維持することは、軟口蓋を閉鎖することによってのみ可能である。また、本発明者らの技術を用いて得られたNO_PLATトレースにおける初期NOピークの不存在によって、呼気抵抗又は圧力を用いずに実施した吐き出し（９）とは対照的に、軟口蓋が閉鎖されていることが示され、さらに初期NOピークが鼻由来であることが確認される。図２に示すように、軟口蓋が開放されると、NO_PLATは維持されず、トレース自体によって軟口蓋の閉鎖が確認される。口でＮＯ_PLATをサンプリングし、気道内での測定値と比較することにより、さらに確認を行った。２人の被験者では、声門でのカテーテルＮＯレベルが口で測定したＮＯレベルと非常によく一致している。被験者の一人では、口とカテーテルでの測定値に若干の差違（＜２ppb）があり、これは、軟口蓋が開いていれば軟口蓋より上で測定した非常に高いＮＯレベルでロサンプルが著しく汚染されるため、口咽頭ＮＯ産生に起因すると考えられ、おそらく鼻からの漏洩ではない。このカテーテル試験は、軟口蓋のしっかりとした閉鎖と、該測定技術を用いた場合の鼻からの呼気ＮＯ漏洩の防止を支持するものである。(９)に示唆されているように、この技術によって測定したＮＯ_PLATが下気道に起因するものであって、鼻ＮＯに主に起因するものではないことも確認された。ＮＯ_PLATに対する鼻からの吸気の影響（吸気時の鼻ＮＯの最大導入）を検討した結果からは、死腔が鼻ＮＯで満たされることによってＮＯプロフィールが変化するにもかからわず(図３)、死腔ガスが吐き出されるとＮＯ_PLATは変化しないことが判明した。従って、呼気時の軟口蓋の閉鎖を確認するだけでよい。これと同じ知見は、比較的高濃度のＮＯを含むガスの吸入ではＮＯ_PLATが変化しなかった試験にも当てはまる。これらのデータより、吸入されたガスのＮＯ濃度が1000 p pb程度ではＮＯ_PLATに影響を及ぼさないことが判る。これはおそらく、毛細管血中のヘモグロビンによる迅速な取り込みによる。本発明者らのデータより、流量が1550から4.2ml/sへ低下したためＮＯ_PLATが平均でほぼ35倍増加したことが判明した。急激な吐き出しでは最も低いＮＯ_PLAT （2.0〜5.7 ppb）が得られた。ＮＯ_PLATの値の分布は、高流量では非常に狭く(3 .2±1.4ppb)、4.2ml/sの流量ではかなり広がり(110.6±54.8ppb)、最低値と最高値では約８倍変化した(図4A)。この正常被験者群におけるＮＯ_PLATの大きな変化が重要であるか否かは不明である。同じデータを、最低流量(4.2ml/s、図4B)に対するＮＯ_PLATのパーセント変化として示した。10人全ての被験者の変化より、ＮＯ_PLATに対する流量の効果が非常に揃っていることが判明した。ＮＯ／流量の関係が各種疾患群の間で異なるか否か、さらに確認が必要である。ＮＯ_PLATとは対照的に、平均ＮＯｅは同一の流量範囲で11倍に上昇した。この排出速度は、呼気流量が定常的である間だけである。測定技術自体が測定パラメーターにこのような大きな変化をもたらす臨床測定では、他のいずれの実施例も思い付かない。他の研究でも、特に運動時換気亢進および休止時換気亢進の状況下では、吐き出されたＮＯの濃度および排出に流量依存性が認められた(13,20)。Iwamotoら(1 2)には、ＮＯ排出が運動時に上昇し、休止時の随意換気亢進を伴うことが報告されている。Bauerら(23)には、吐き出されたＮＯとＮＯ排出が４人の被験者で運動時に上昇し、吐き出されたＮＯの濃度が休止時換気亢進では低下することが述べられている。しかしながら、Massaroら(22)には、５秒と15秒のVC呼気間ではＮＯ濃度に差はないと報告されている。本発明者らの研究では、1550ml/s〜4.2m l/sの流量スペクトルを試験することによりＮＯ-流量関係の試験を拡張し、休止状態の被験者において臨床測定技術に対する呼気流量の関係を決定した。さらに、大胆にも鼻ＮＯを除きつつ流量に対するＮＯ_PLATの関係を試験した。流量の変化のみがＮＯ排出に影響を与えるという本発明者らの観察に従うと、既に提案されているような(12,23)、吐き出されたＮＯが、肺血管から肺胞へのＮＯの輸送を反映し得るとは考えられない。運動時の換気の変化のみで、運動時に見られるＮＯ排出の変化を説明することができる(13,20)。 20mmHgの連続的な呼気圧を加えることにより静脈還流の低下または肺機能の変化といった生理的効果が引き起こされることが予想されるものの、60mmHgの口腔内圧で得られる値と20mmHgで得られる値とでは有意差はなかった。流量が測定できる限りは、確実に軟口蓋を閉鎖する最低の圧力を吐き出されたＮＯの測定に利用することができる。重要なのは、おそらく60mmHgの口腔内圧を維持したままで起こる心送血量の低下がＮＯ_PLATに及ぼす効果が明らかに欠けていることである。これは、測定されたＮＯが主に気道に由来し、血管系を介して肺胞へ運ばれるＮＯの割合が低いという主張(吐き出されたＮＯに対するPEEPの効果を検討したP erssonら(24)の見解)を支持するものでもある。吐き出されたＮＯを肺血管の変化と相関させたCremonaら(26,27)からは、反対の見解が提案されている。本発明者らの技術を使用しても、考えられる重要な誤差源が複数存在する。主な誤差源は、***／マウスピースの弱い密閉性に起因する空気洩れ、あるいは鼻もしくは装置からの空気洩れである。いかなる空気洩れが存在しても、下流の呼吸流量計(pneumotachygraph)によって測定される流量から、実際に気道を通過する流量が実際よりも少なく見積もられ、測定されたＮＯ_PLATが減少することになる(図２)。低い流量での曲線（図4A）の急勾配の検討より、流量のわずかな変化がＮＯ_PLATに対して多大な影響を及ぼすことが可能である。肺容量が減少するとＮＯ_PLATが低下するTLC対FRCの研究より明らかなように、別の誤差源は肺容量である。吐き出されたＮＯに対する肺容量の影響は、内腔へ拡散するＮＯの量に影響を与える呼吸肺胞表面積の減少によっておそらく説明できる。この考えは、PE EPによるＮＯの増加を説明するためにPerssonら(24)によっても提案されている。本発明者らは、近年、メタコリンによる気管支収縮に続くＮＯ_PLATの低下に注目していた。これは、ＮＯ_PLATに対する肺容量の影響も反映し得るものである。結論としては、息を止める実験からも明らかなように、気道にＮＯが連続的に蓄積するため、息を吸ってから吐くまでに遅れを生じてはならない。ＮＯ_PLATの日間変化（〜20％）より、疾患または薬物療法によるＮＯ_PLATの変化が、いずれも自発的な変化を考慮に入れて判断されなければならないことが判る。しかしながら、ρ値は、良好な日間再現性およびより良好な日内再現性が得られることを示している(表２)。日内変化（〜10％）は、自発的な測定誤差を含むが、通常の実験時間の際の日数に関係なくＮＯ_PLATを測定できるほど充分に小さい値である。DLCO等の他の生理学的パラメーターも、同様の日内および日間変化性を示している。本発明者らは、呼気流量によるＮＯ_PLATの著しい変化(図６)を説明するのに、以下のモデルを提案する。一酸化窒素は主に気道上皮から産生される。これは、この上皮にＮＯ合成酵素が存在することが知られていることと相応している(25) 。ヘモグロビンが貪欲にＮＯを取り込むため(28,26,29)、毛細管血とほぼ平衡状態にある肺胞内空気は最低のＮＯレベルを有する。肺胞内空気は気管支樹に進入して上方へ移動するため、ガス拡散によってＮＯが気管支壁から内腔へ移動する。ＮＯの拡散速度は、壁と内腔との間のＮＯの濃度勾配等の多くの因子に依存する。この勾配は、内腔のＮＯ濃度が低く保たれるため大きな呼気流量で最大となり、従ってＮＯ排出速度は流量の増加に伴って増加する。対照的に、流量が増加すると空気と気管支壁との接触時間が減るため、ＮＯ濃度は低下する。理論的な根拠によれば、気管支壁から内腔へ移動したＮＯの量が一定であれば(気道上皮がＮＯに対して透過性でなく、移動のメカニズムが能動的な分泌のみの場合に生じるとして)、ＮＯ濃度は流量依存性のままであるが、ＮＯ排出は流量に依存しないと考えられる。ＮＯ_PLATによって評価されるように、吐き出されたＮＯは、気管支を通ることによって条件付けられた肺胞内空気である。ＮＯ_PLATと流量の関係と同様の関係が、呼吸による熱損失の生理において見られる(30,21)。流量が増加すると、呼吸による熱損失（Noeに相当）は増加するが、対照的に吐き出されたガスの温度（ＮＯ濃度に相当）は低下する。このモデルが正しければ、吐き出されたＮＯの容積は気道上皮に由来し、気道での過程を主に反映する。さらに、このことは、吐き出されたＮＯが肺胞で産生されたＮＯまたは肺胞に運ばれるＮＯをあまり反映しないことも示唆している。従って、ＮＯレベルを肺血管疾患または肺換気／血流量の関係と相関させる試みは、成功しない可能性がある(23)。本発明者らは、急激な吐き出しを用いると、肺胞内空気に気管支壁ＮＯを取り込む時間が余りないため、肺胞ＮＯ濃度が最もよく推定されると考えている。しかしながら、外来の被験者では、この肺胞内空気は、ＮＯを排出する誘導気道を通った後でしかサンプリングできない。肺胞内空気中に含まれるＮＯは、吸入した環境ＮＯから、肺胞壁の細胞から、または肺血流によって肺胞へ運ばれたＮＯから誘導される。急激な吐き出しによって推定されるような肺胞ＮＯ値が、肺胞ＮＯ輸送と相関するのか、あるいは肺胞内空気に含まれるＮＯと毛細管血中のヘモグロビンに結合したＮＯとの平衡を単に反映するのかは判っていない。息を止めている間、ＮＯは、排出と再吸収との間で定常状態になるまで内腔中に蓄積した。気道におけるＮＯの蓄積の限界値を示す場合には、息を止めている際のＮＯ値が重要である。この値は、鼻のところで記載した濃度と同程度であるが、副鼻腔での濃度よりも遥かに低い(9,10,14,15)。しかしながら、これらの測定は60秒以上息を止める必要があるため、実施が困難であり、臨床用途には適していない。本発明の技術は口経由の空気流に由来する鼻腔NOを確実に排除するものであり、これはいずれの呼気N0測定技術にも欠かせない特徴である。これとは別に、本研究では、一定の(一回の呼気または気体の収集技術のいずれかにより)標準化された呼吸流量におけるNO濃度の測定を必須とするということを主に含意している。一定の流量での肺活量操作は最も実用的であり、肺容量を標準化するものである。一方、自然呼吸は、呼気流量の連続的な周期的変化、短い呼気時間、および呼吸から呼吸への容量変化を特徴とし、適当ではない。正確に低流量を制御するためには、軟口蓋を閉鎖することに加えて高い呼気抵抗(high expiratory resistances)を用いることが必須である。種々の流量およびそのパターンは呼気 NO量に大きな変動をもたらしうるので、排出された気体を収集する場合、流量の増加に伴う平均NOeの劇的な(ほぼ11倍の)変化もまた測定法にとって重要な意昧を有している。本発明者らは、この高い呼気抵抗法、すなわち陽口腔内圧法は、被験者に使用する際に信頼性がありかつ再現性を有する方法であると考えている。流量を10− 40ml/sの範囲とし、試験時間は大体の被験者が許容しうる10-20秒とする。3種の流量で呼気NOを測定することにより３点曲線(three-point curve)を描くことができ、さらにそのNO−流量曲線の傾きを分析することによって該曲線は被験者の呼気NOの状態についてのさらなる情報を提供しうる。しかし、10人の被験者においてNO_PLAT(最低流量％)を変化させた同様の方法では、一つの流量での測定により全ての流量でのNO濃度を予測することが可能で、かつ小児科での実施(特に被験者が実際に罹患している場合)において、充分であると示唆される(図５)。非常に低流量でのNOの測定はNOシグナルを大きく増強し、健常な被験者と疾病状態の被験者との区別をより明確なものとするだろう。さらに、低流量は分析器の検出限界付近での測定を避ける。測定されたNOは主に気道 (airway)に由来するものであると本発明者らは考えているので、この技術は気道に関する疾病に適当であると思われるが、厳密に実質の、もしくは肺の血管病における助けとはなりそうもない。先の著者ら(6、7)に従い、この技術を使用する現在も進行中の研究において、本発明者らは呼気NOが健常な被験者と比較して喘息を有する被験者に非常に多くみられ、吸入ステロイド治療後に急激に減少することも報告している。したがって、喘息における呼気NOは疾病の活性および治療に対する応答の有用な指標としておおいに有望である、と本発明者らは考えている。本発明を上記の例を参考として詳細に記載するが、本発明の趣旨から外れること無く種々の改変が可能であることは理解されよう。例えば、最低流量で測定されたNOプラトーの重量百分率として示される任意の流量でのNOプラトー値は、一定の様式で被験者の間の流量を変化させると思われる。いずれかの特定の流量で測定した場合、NOプラトーのデータは標準化され、標準化されたNOプラトー対流量プロットは「標準流量」に外挿してもどす。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。参考文献表１．呼気NOについて公表された値および技術。全ての文献で排出スピードを特定したりまたは鼻用クリップを使用したりしているわけではない。[VC＝ vital capacity exhalation：肺活量吐き出し、TB＝tidal breathing：自然呼吸、NC＝nose clip：鼻用クリップ、BH=breath hold：呼吸停止、MGC=mixed gas concentration：混合した気体濃度] 表２．口から採取されたNO_PLATと気管上部、中口腔咽頭および鼻腔において測定されたNO_PLATとの、呼気流量20.7ml/sについての比較。各部位において３回の呼気を行なった。表３．使用した３種の流量についての変動係数（CV）およびクラス内の相関(int raclass correlation)(rho)として示されるNO_PLATの日間および日内の変動性の結果。表４．TLCからの呼気を用いて測定したNO_PLAT(平均±s.d.,ppb)とFRCから測定したNO_PLAT(平均±s.d.,ppb)とを比較した結果、および20mmHgの口腔内圧を用いて測定したNO_PLATと60mmHgを用いて測定したNO_PLATとを比較した結果。表５．4.2ml/sの呼気流量、および1550ml/sの速い呼気を用いて30秒間呼吸を止めた後に得られたNO_PLAT(PPb)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／８２７，７０３ (32)優先日平成９年４月９日(1997．4．9) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．被験者の呼気の成分を測定する方法であって、呼気を受容するための適当な装置の中に被験者の息を吐き出させ、被験者の口腔内の圧力を、被験者の軟口蓋を閉鎖しかつ呼気の間中鼻咽頭を隔離するのに十分なレベルにまで上昇させ、そして集められた呼気の１以上の成分のレベルを測定する、各ステップを含んでなる方法。２．前記１以上の成分が一酸化窒素である、請求項１に記載の方法。３．前記測定ステップに先立って呼気の１以上の成分を集めるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。４．前記１以上の成分が実質的に声門より下の気道に由来するものである、請求項１に記載の方法。５．被験者の呼気を一定の流量に維持するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。６．前記一定の流量が前記受容装置と結合されたまたは流れ接続している抵抗手段により達成される、請求項５に記載の方法。７．前記１以上の成分が一酸化窒素である、請求項６に記載の方法。８．前記一定の流量に維持することが、呼気の圧力の瞬時のディスプレーを被験者に提供することによって行われ、該被験者が一定の圧力を維持するように呼気力を調整する、請求項６に記載の方法。９．前記１以上の成分が二酸化炭素、酸素、一酸化窒素、窒素、二酸化窒素、過酸化水素、タンパク質、界面活性剤、ＤＮＡ、アセトン、アンモニア、硫黄化合物、アセチレン、一酸化炭素、エタンおよびペンタンよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 10．被験者の呼気の成分を測定する装置であって、被験者からの呼気を受容するための導管手段、被験者の口腔内の圧力を、被験者の軟口蓋を閉鎖しかつ呼気の間中鼻咽頭を隔離するのに十分なレベルにまで上昇させる手段、および受容した呼気の１以上の成分のレベルを測定する手段、を含んでなる装置。 11．被験者が一定の圧力を維持するために呼気力を調整できるように、呼気の圧力の瞬時のディスプレーを被験者に提供する手段をさらに含む、請求項10に記載の装置。 12．前記圧力上昇手段が軟口蓋より上の気道に由来する呼気の成分の存在を実質的に排除するのに十分である、請求項10に記載の装置。 13．前記１以上の成分が二酸化炭素、酸素、一酸化窒素、窒素、二酸化窒素、過酸化水素、タンパク質、界面活性剤、ＤＮＡ、アセトン、アンモニア、硫黄化合物、アセチレン、一酸化炭素、エタンおよびペンタンよりなる群から選択される、請求項１２に記載の装置。 14．前記１以上の成分が一酸化窒素である、請求項１３に記載の装置。 15．前記１以上の成分の少なくとも約90％が声門より下の気道に由来するものである、請求項４に記載の方法。 16．軟口蓋の閉鎖を確認するために鼻腔ＣＯ₂をモニターするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。 17．軟口蓋の閉鎖を確認するために鼻腔ＣＯ₂をモニターする手段をさらに含む、請求項10に記載の装置。