JP2000501418A

JP2000501418A - 呼吸器合胞体ウィルスサブユニットワクチンの調製

Info

Publication number: JP2000501418A
Application number: JP10505475A
Authority: JP
Inventors: ケイツ、ジョージ、エー．; サンヒューザ、ソニア、イー．; オーメン、レイモンド、ピー．; クライン、マイケル、エイチ．
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2000-02-08
Also published as: ATE282633T1; DE69731659T2; EP0942928B1; EP0942928B2; RU2243234C2; CA2259594A1; DE942928T1; CN1145639C; CN1230197A; ES2141065T1; US6309649B1; BR9712970A; AU716378B2; GR990300042T1; ES2141065T3; DE69731659D1; AU3431197A; EP1477494A1; WO1998002457A1; US6020182A

Abstract

(57)【要約】濃縮したウィルスから洗剤で緩和にタンパク質を抽出し、タンパク質をハイドロキシアパタイトまたは他のイオン交換マトリックスカラムにかけ、緩和な塩処理によりタンパク質を溶離することにより、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）から融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質を単離、精製する。免疫原性組成物として処方したＦ、ＧおよびＭタンパク質は、安全で、免疫原性が高く、関連する動物モデルを呼吸器合胞体ウィルス感染により引き起こされる疾患から保護する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称呼吸器合胞体ウィルスサブユニットワクチンの調製発明の分野本発明は、免疫学の分野に関し、より詳細には、呼吸器合胞体ウィルス感染症に対するワクチン製剤に関する。関連出願に関する参照本出願は、同時係属出願である１９９６年７月１２日出願の米国特許出願第０８／６７９，０６０号の一部継続出願である。発明の背景ヒト呼吸器合胞体ウィルスは乳幼児の下部気道感染症の主な原因である（参考文献１から３：参考文献のリストは開示の最後に示すが、リスト中の各参考文献は参考のために本明細書に組み込むものとする）。毎年、世界中で、６５００万人が感染し、１６万人が死亡している（参考文献４）。米国だけでも、１年に１０万人の小児がＲＳウィルスによる肺炎や細気管支炎のために入院を必要としている可能性がある（参考文献５、６）。ＲＳウィルス感染症の小児の入院治療および外来治療のために、米国では毎年５３億４０００万を超える費用がかかっている（参考文献７）。ＲＳウィルス感染に起因する重篤な下部気道疾患は主として生後２カ月から６カ月の乳児で発症する（参考文献８）。米国では、毎年、約４０００人の乳児が、ＲＶウィルスおよび３型パラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ−３）の感染に起因する重篤な気道疾患の合併症のために死亡している。世界保健機関（ＷＨＯ）および国立アレルギーおよび感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）のワクチン諮問委員会は、ワクチン開発について、ＲＶをＨＩＶに次いで２番目に位置付けている。ＲＳＶの構造および組成は解明されており、教科書であるFields，B.N.他による「Fields Virology」、Raven Press、ニューヨーク、１９９６年の、特に、Co llins，P.、Mcintosh，K.およびChanock，R.M.による第４４章、ｐ１３１３−１３５１の「呼吸器合胞体ウィルス」に詳述されている（参考文献９）。ＲＳＶに対する２つの主な防御抗原はエンベロープ融合（Ｆ）糖タンパク質および結合（Ｇ）糖タンパク質である（参考文献１０）。Ｆタンパク質は約６８ｋＤａの前駆体分子（Ｆ₀）として合成され、これが蛋白分解酵素によりジスルフィド結合したＦ₁（約４８ｋＤａ）とＦ₂（約２０ｋＤａ）のポリペプチド断片に切断される（参考文献１１）。Ｇタンパク質（約３３ｋＤａ）は高度にｏ−グリコシル化されており、見かけ上の分子量が約９０ｋＤａの糖タンパク質となる（参考文献１２）。ＲＳウィルスの大きな２つのサブタイプはＡおよびＢと定義されている（参考文献１３）。Ｇ糖タンパク質ではこれらのサブタイプの間に大きな抗原性の差が認められているが、Ｆ糖タンパク質はより保持されている（参考文献７、１４）。Ｆ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質により生じる抗体応答の他に、ＲＳＶ感染により産生されたヒトの細胞毒性Ｔ細胞は、ＲＳＶのＦタンパク質、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、低分子疎水性タンパク質ＳＨ、非構造タンパク質１ｂを認識することが示されている（参考文献１５）。安全で有効なＲＳＶワクチンは入手できず、緊急に必要とされている。ＲＳウィルスワクチンの開発法には、ホルマリンによるウィルスの不活化（参考文献１６）、低温適応および／または温度感受性変異ウィルスの単離（参考文献１７）および精製したＦ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質の単離（参考文献１８、１９、２０）などがあった。臨床試験の結果は、弱毒化した生ワクチンおよびホルマリンで不活化したワクチンのいずれも、ＲＳウィルス感染症に対するワクチンが適切に保護されないことを示した（参考文献２１から２３）。経鼻投与した弱毒化した低温適応型および／または温度感受性のＲＳウィルス変異株で遭遇する問題には、臨床的な罹患、遺伝的な不安定性、過剰な弱毒化などがあった（参考文献２４から２６）。皮下投与したＲＳウィルス生ワクチンも有効ではなかった（参考文献２７）。不活化したＲＳウィルスワクチンは一般に、不活化剤としてホルマリンを使用して調製してきた。Ｍｕｒｐｈｙ他（参考文献２８）は、ホルマリン不活化ＲＳウィルスで免疫した乳児および小児における免疫応答に関するデータを報告している。乳児（生後２カ月から６カ月）では、Ｆ糖タンパク質に対して高い抗体価が得られたが、Ｇタンパク質に対する応答は弱かった。月齢の高い（生後７カ月から４０カ月）症例では、Ｆタンパク質およびＧタンパク質に対して、ＲＳウィルスに感染した小児と同等の抗体価が得られた。しかし、乳児と小児のいずれでも、天然のＲＳウィルス感染症に罹患した同じ年齢の症例に比べ、中和抗体レベルは低かった。主要な免疫原性ＲＳウィルスタンパク質であるＦ（融合）タンパク質およびＧ（結合）タンパク質に対する抗体の抗体価が高く、中和抗体の抗体価が低いというアンバランスな免疫応答が起こることは、ホルマリン処理によりＦ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質の重要なエピトープに変化が生じたことが一因であるかもしれない。さらに、ホルマリン不活化ＲＳウィルスワクチンを投与された小児の一部では、免疫していない症例に比べ、その後の天然ＲＳウィルスへの曝露後に、より重篤な下部気道疾患を発症した（参考文献２２、２３）。したがって、ホルマリン不活化ＲＳウィルスワクチンはヒトへの使用に許容されないと思われた。ホルマリンで不活化したＲＳウィルスで免疫したコトンラットで、異常な免疫応答が認められた（参考文献２９）。さらに、コトンラットでＲＳウィルスのホルマリンで不活化したウィルスを評価したところ、生ウィルスでチャレンジすると、免疫した動物では肺で強い組織病変が生じることも示された（参考文献３０）。ホルマリンで不活化したＲＳウィルスのワクチン製剤で引き起こされる疾患増強のメカニズムはまだ明らかにされていないが、有効なＲＳウィルスワクチンの開発の主な障害となっている。疾患が増強される原因の一部はＦ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質に対するホルマリンの作用である可能性がある。さらに、疾患増強に対するＲＳウィルスに非特異的なメカニズムも示唆されており、このメカニズムでは、ワクチン製剤中に不純物として存在する細胞成分や血清成分に対する免疫学的反応が疾患を増悪させる原因の一部となっている可能性がある（参考文献３１）。実際に、ＨＥｐ−２細胞の溶解物のワクチンを接種し、ＨＥｐ− ２細胞で増殖させたＲＳウィルスでチャレンジしたマウスおよびコトンラットでは、強い肺の炎症反応が生じた。さらに、酸性ｐＨでの溶離を使用する免疫親和性クロマトグラフィで精製したＲＳウィルス糖タンパク質は免疫原性で防御的であるが、コトンラットで免疫増強を誘導した（参考文献２９、３２）。ＲＳＶにより引き起こされる疾患に対する防御を付与するためにのみ有効であり、免疫増強などの望ましくない副作用を起こさない、ワクチンを含めた免疫原性製剤がまだ必要とされていることは明らかである。また、ＲＳＶ感染を診断する抗原、および、例えば、ＲＳウィルスにより引き起こされる疾患の診断に使用するためのＲＳＶタンパク質を特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体）を生成するための免疫原も必要とされている。発明の概要本発明では、ワクチンの質の細胞株、例えば、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ５またはＷＩ３８細胞で呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）を産生し、培養器からの採取物からウィルスを精製し、精製したウィルスからＦ、ＧおよびＭタンパク質を抽出し、免疫親和性、ヒラマメレクチン、コンカナバリンＡ親和性のステップを含むことなく、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質を同時に精製する。特に、例えば、本発明の譲受人に譲渡され、その開示は参考として本明細書に含むものとするＷＯ９１／００１０４（１９９０年６月２８日出願の米国特許第０７／７７３，９４９号）に記載されたレクチン親和性手順により、リガンドを製品にすることができた。さらに、本発明により、初めて、ＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質を同時に単離し、同時に精製するための手順と、ＲＳＶタンパク質の同時精製した混合物を含む免疫原性組成物が提供される。この同時に単離し、同時に精製したＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質は、非発熱性、非免疫増強性であり、血清および細胞性の汚染物質を実質的に含まない。単離され、精製されたタンパク質は免疫原性で、感染性ＲＳＶやその他の外来物質を含まない。したがって、本発明の１つの態様では、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の精製した融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質の混合物が提供される。融合（Ｆ）タンパク質は、マルチメリックな融合（Ｆ）タンパク質を含むことができ、これは、非還元条件下で分析すると、分子量約７０ｋＤａのヘテロダイマーや二量体および三量体の形を含むことができる。結合（Ｇ）タンパク質は、非還元条件下で分析すると、オリゴマーＧタンパク質、分子量約９５ｋＤａのＧタンパク質および分子量約５５ｋＤａのＧタンパク質を含むことができる。マトリックス（Ｍ）タンパク質は、非還元条件下で分析すると、分子量約２８ｋＤａから３４ｋＤａのタンパク質を含むことができる。本発明で提供されるタンパク質混合物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析すると、分子量約４８ｋＤａのＦ₁と分子量約２３ｋＤａのＦ₂を含む融合（Ｆ）タンパク質と、分子量約９５ｋＤａのＧタンパク質と分子量約５５ｋＤａのＧタンパク質を含む結合（Ｇ）タンパク質と、分子量約３１ｋＤａのＭタンパク質を含むマトリックス（Ｍ）タンパク質とを含むことができる。本発明のこの態様で提供される混合物は、Ｆ約３５重量％〜約７０重量％、Ｇ約５重量％〜約３０重量％、Ｍ約１０重量％〜約４０重量％の相対的な割合でＦ、ＧおよびＭタンパク質を含むことができる。還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、また、銀染色後にデンシトメトリースキャンニングして分析すると、この混合物中の分子量約４８ｋＤａのＦ₁と分子量約２３ｋＤａのＦ₂ の比は約１：１から２：１とすることができる。Ｆ、ＧおよびＭタンパク質の混合物の純度は少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％とすることができる。本発明のこの態様に従って提供される混合物は、下記のように本発明で使用した単離法を考慮すると、モノクローナル抗体を含まず、ヒラマメレクチンおよびコンカナバリンＡを含まない。本発明で一般に提供されるタンパク質の混合物中に提供されるＲＳＶタンパク質は、調製の緩和な条件では実質的に変性せず、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢの一方または両方に由来するＲＳＶタンパク質を含むことができる。本発明の好ましい実施形態によると、本質的にＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の非変性タンパク質の同時単離、同時精製した混合物が提供され、この混合物はコンカナバリンＡを含めたヒラマメレクチンおよびモノクローナル抗体を含まない。本発明の別の態様によると、本発明で提供される混合物を免疫有効量含有する免疫原性製剤が提供される。本発明で提供される免疫原性組成物は、霊長類、特にヒトであってよい宿主に in vivoで投与して、ＲＳＶにより生じる疾患に対する防御を与えるためのＦ、ＧおよびＭタンパク質を含有するワクチンとして処方することができる。本発明の免疫原性組成物は、微小粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソームとして処方することができる。免疫原性組成物はさらに、少なくとも１つの他の免疫原性物質または免疫刺激物質を含むことができ、これは少なくとも１つのアジュバントまたはＩＬＫを含めたサイトカインなどの少なくとも１つの免疫調整物質であってよい。少なくとも１つのアジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡまたはその誘導体もしくは成分、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクトデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、リポタンパク質、ＩＳＣＯＭマトリックス、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡおよびその他のアジュバントならびに細菌毒素、その成分および誘導体、例えば、本発明の譲受人に譲渡され、その開示は参考として本明細書に組み込むものとする、１９９４年６月１０日出願のＵＳＳＮＯ８／２５８，２２８（ＷＯ９５／３４３２３）に記載のものなどからなる群から選択できる。特別な状況下では、Ｔｈ１応答を誘導するアジュバントが好ましい。本発明で提供される免疫原性組成物は、少なくとも１つの別の免疫原を含むように処方することができ、免疫原は簡便には、ＰＩＶＦタンパク質およびＨＮタンパク質などの、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２および／またはＰＩＶ−３由来のヒトパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）を含むことができる。しかし、クラミジア（Chlamydia）、ポリオ、Ｂ型肝炎、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ、ヘモフィリス、百日咳菌（B．pertussis）、肺炎球菌、マイコバクテリア、Ａ型肝炎およびモラクセラ（Moraxella）などの他の免疫原も、多価（複合）ワクチンとしての組成物に含むことができる。本発明の別の態様では、本発明で提供される免疫原性組成物を免疫有効量で宿主に投与することにより、宿主で免疫応答を引き起こす方法を提供する。好ましくは、免疫原性組成物は、宿主へin vivoで投与するためのワクチンとして処方し、ヒトを含めた宿主に投与することにより、ＲＳＶにより引き起こされる疾患に対する防御を与える。免疫応答は体液性免疫応答であっても、細胞性免疫応答であってもよい。本発明は、別の態様で、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）感染により引き起こされる疾患に対する防御のためのワクチンの製造法を提供し、この方法は、本発明で提供される免疫原性組成物を被験宿主に投与して、ＲＳＶが引き起こす疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物の投与量および投与頻度を決定することと、免疫原性組成物を、決定した投与量および投与頻度で治療する宿主に投与するのに好適な形態に処方することとを含む。被験宿主はヒトであってよい。本発明の別の態様では、試料中の、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）のＦ、ＧまたはＭタンパク質と特異的に反応する抗体の存在を測定する方法を提供し、この方法は、（ａ）試料を本発明で提供される混合物と接触させて、呼吸器合胞体ウィルスタンパク質と、試料中に存在するそのタンパク質と特異的に反応する抗体とを含む複合体を生成するステップと、（ｂ）複合体の生成を測定するステップとを含む。本発明の別の態様では、（ａ）対象を本発明で提供される免疫原性組成物で免疫して、ＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質に特異的な抗体を産生するステップと、（ｂ）試料を抗体と接触させて、試料中に存在するＲＳＶタンパク質とこのタンパク質に特異的な抗体とを含む複合体を生成するステップと、（ｃ）複合体の生成を測定するステップとを含む、試料中の呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）のＦ、ＧまたはＭタンパク質の存在を測定する方法を提供する。本発明の別の態様では、試料中の、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）のＦ、ＧまたはＭタンパク質と特異的に反応する抗体の存在を測定する診断用キットを提供し、このキットは、（ａ）本発明で提供される混合物と、（ｂ）混合物を試料と接触させて、呼吸器合胞体ウィルスタンパク質と試料中に存在する抗体とを含む複合体を生成するための手段と、（ｃ）複合体の生成を測定するための手段とを含む。本発明の別の態様では、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）のＦ、ＧまたはＭタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を製造する方法を提供し、この方法は、（ａ）本発明で提供される免疫原性組成物を少なくとも１匹のマウスに投与して、少なくとも１匹の免疫したマウスを作製し、（ｂ）少なくとも１匹の免疫したマウスからＢリンパ球を除去し、（ｃ）少なくとも１匹の免疫したマウス由来のＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製し、（ｄ）選択した抗ＲＳＶタンパク質抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、（ｅ）選択した抗ＲＳＶタンパク質抗体産生クローンを培養し、（ｆ）選択した培養物から抗ＲＳＶタンパク質抗体を単離することを含む。本発明は、別の態様で、呼吸器合胞体ウィルスタンパク質の同時に単離し、同時に精製した混合物を作製する方法を提供し、この方法は、培地中の細胞上でＲＳＶを増殖させ、増殖したウィルスを培地から分離し、少なくとも分離したウィルスからのＦ、ＧおよびＭタンパク質を可溶化し、可溶化したＲＳＶタンパク質を同時に単離し、同時に精製することを含む。同時単離および同時精製は、可溶化したタンパク質をイオン交換マトリックス、好ましくは、リン酸カルシウムマトリックス、特に、ハイドロキシアパタイトマトリックスにかけ、イオン交換マトリックスからＦ、ＧおよびＭタンパク質を選択的に同時溶離することにより実施できる。増殖させたウィルスを先ず、尿素で洗浄して、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質を実質的に除去することなく、汚染物質を除去することができる。本発明の利点には、 −ＲＳＶの、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質の同時単離および同時精製した混合物、 −このようなタンパク質を含有する免疫原性組成物、 −このようなタンパク質を単離する手順、および −ＲＳＶおよびＲＳＶに感染した宿主を同定するための診断用キットが含まれる。図面の簡単な説明図１は、パネルａおよびｂを含み、精製したＲＳＶＡサブユニット製剤の、還元条件（パネル（ａ））および非還元条件（パネル（ｂ））下での、銀染色したアクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。図２は、パネルａ、ｂ、ｃおよびｄを含み、精製したＲＳＶサブユニット製剤の還元条件下でのウェスタンブロット分析を示す図である。図３は、パネルａ、ｂ、ｃおよびｄを含み、精製したＲＳＶサブユニット製剤の非還元条件下でのウェスタンブロット分析を示す図である。図４は、精製したＲＳＶＢサブユニット製剤の、還元条件下での、銀染色したアクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。発明の一般的な説明上記のように、本発明は、ＲＳウィルスから同時に単離し、同時に精製したＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質を提供する。このウィルスは、ＶＥＲＯ細胞およびＭＲＣ５やＷＩ３８などのヒト二倍体細胞などのワクチンの質の細胞株上で増殖させ、増殖したウィルスを採取する。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびトリプシンの存在下で培養することができる。ウィルス採取物を濾過した後、一般に、所望の分子量カットオフの膜を使用したタンジェンシャルフロー限外濾過を使用して濃縮し、透析濾過する。ウィルス採取物濃縮物を遠心し、上清を捨てることができる。遠心後のペレットは、先ず、尿素含有バッファで洗って、可溶性汚染物質を除去するが、この間、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質は実質的に作用を受けず、次いで、再遠心することができる。遠心で得たペレットを洗剤で抽出し、ペレットからＦ、ＧおよびＭタンパク質を可溶化する。このような洗剤抽出は、ＴＲＩＴＯＮ^(R)Ｘ−１００を含めた非イオン性洗剤、オクタジエニルフェノール（エチレングリコール）₁₀である非イオン性洗剤などの洗剤を含有する抽出バッファに、元の採取物濃縮物容量となるように、ペレットを再縣濁することにより、実施できる。その他の洗剤には、オクチルグルコシドおよびＭｅｇａ洗剤が含まれる。遠心して、非溶解性タンパク質を除去した後、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質抽出物をクロマトグラフィ手順で精製する。抽出物は、先ず、イオン交換クロマトグラフィマトリックスにかけて、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質をマトリックスに結合させ、不純物をカラムを通過させることができる。イオン交換クロマトグラフィマトリックスは任意の所望のクロマトグラフィ物質、特に、リン酸カルシウムマトリックス、特にハイドロキシアパタイトであってよいが、ＤＥＡＥおよびＴＭＡＥなどの他の物質も使用できる。次いで、結合したＦ、ＧおよびＭタンパク質を好適な溶離液でカラムから同時に溶離する。得られた同時精製したＦ、ＧおよびＭタンパク質をさらに処理して、純度を上げることができる。本発明で使用する精製したＦ、ＧおよびＭタンパク質は、Ｆ：Ｇヘテロダイマーや、二量体、四量体およびさらに重合度の高いオリゴマーを含めたホモおよびヘテロオリゴマーの形であってよい。この手順で調製するＲＳＶタンパク質製剤では、外来物質、血球吸着性物質および生ウィルスの証拠は認められなかった。本発明製剤を、アジュバントとしてのアラムまたはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ^TMと共に、筋肉内投与して、いくつかの群のコトンラットを免疫した。下記表１および表２に示すように、高い抗融合抗体価および中和抗体価が得られた。下記表３および表４に示すように、上部および下部気道で、ウィルス感染からの完全な防御が得られた。また、本発明製剤を、アジュバントとしてのアラム、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ^TM 、ポリホスファゼンおよびＤＣ−ｃｈｏｌと共に、筋肉内投与して、数群のマウスを免疫した。下記表５および表６に示すように、高い中和抗体価および抗Ｆ抗体価が得られた。また、肺のホモジェネート中にウィルスが存在しないことから示されるように、ウィルス感染に対する完全な防御が得られた（下記表７参照）。また、本発明製剤を、アジュバントとしてのアラムまたはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ^TMと共に、筋肉内投与して、数群のサルを免疫した。下記表８および表９に示すように、高い中和抗体価および抗Ｆ抗体価が得られた。ここで得られた動物での免疫データは、ウィルス由来の主要なＲＳＶタンパク質の緩和な洗剤抽出およびイオン交換マトリックスからのタンパク質の緩和な塩溶離を使用することにより、実験動物モデルで、ＲＳＶのチャレンジに対する防御を付与する免疫応答を誘導することができるＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質の同時精製した混合物が得られる。本発明は、呼吸器合胞体ウィルスによる感染で引き起こされる疾患に対するワクチンの有効成分として、医薬物質として使用するための、呼吸器合胞体ウィルス由来のＦ、ＧおよびＭタンパク質混合物も含む。別の態様で、本発明は、呼吸器合胞体ウィルスによる感染で引き起こされる疾患に対して免疫するワクチン組成物を製造するための、呼吸器合胞体ウィルス由来のＦ、ＧおよびＭタンパク質の使用を提供する。本発明の種々の実施形態は、呼吸器合胞体ウィルス感染に対するワクチン接種、診断および治療ならびに免疫学的薬剤の生成の分野で多くの用途を有していることは当業者に明らかである。このような問題に関する非制限的な議論をさらに以下に示す。１．ワクチン製剤および使用法ワクチンとして使用するのに好適な免疫原性組成物は、本明細書に開示するように、ＲＳＶの免疫原性Ｆ、ＧおよびＭの各タンパク質を含む混合物から生成することができる。免疫原性組成物は、抗−Ｆ、抗−Ｇおよび抗−Ｍの各抗体を含め、抗ＲＳＶ抗体を含む抗体を産生する免疫応答を誘発する。このような抗体はウイルス中和抗体および／または抗融合抗体であってよい。ワクチンを含めた免疫原性組成物は、注射剤として、すなわち液状の液剤、懸濁剤または乳剤として調整することができる。単一または複数の免疫原性の有効成分を、それら成分と適合性の、製薬学上許容し得る賦形剤と混合してもよい。このような賦形剤には水、塩水、ぶどう糖、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物を含めることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、その効果を増進させるために、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助物質を含んでいてもよい。免疫原性組成物およびワクチンを、注射によって、すなわち皮下注射、皮内注射または筋肉内注射によって非経口投与することができる。別法として、本発明に従って生成した免疫原性組成物を、粘膜表面で免疫応答を誘発するような方法で処方および投与することもできる。このように、免疫原性組成物を例えば、経鼻的または経口的（胃内）経路によって粘膜表面に投与してもよい。別法として、座剤および経口剤を含めたその他の投与形式でも望ましい。座剤の場合、結合剤および担体が、例えばポリアルカレングリコールまたはポリアルカレントリグリセリドを含んでいてもよい。このような座剤は、単一または複数の免疫原性有効成分を約０．５％ないし約１０％の範囲で含む混合物から、好ましくは約１％ないし２％の範囲で含む混合物から生成することができる。経口剤は、医薬品等級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用される担体を含むことができる。これらの組成物は液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤などの形態をとることができ、単一または複数の有効成分を約１％ないし９５％、好ましくは約２０％ないし約７５％含む。免疫原性製剤およびワクチンは、用量の製剤と適合性を持つような方法で投与され、また、治療上有効で、免疫原性および防御を与えるような量を投与される。投与される量は、例えば抗体を合成する個人の免疫系の能力、必要に応じて細胞媒介性免疫応答を産生する個人の免疫系の能力などを含めた治療対象によって決まる。投与に必要とされる有効成分の正確な量は診療医の判断によって決まる。しかし、好適な用量範囲は当業者であれば容易に決定可能であって、ワクチン当りの単一または複数の有効成分の量はマイクログラムないしミリグラム程度であればよい。初期投与および補助投量の好適な様式も様々であるが、そのような様式には初期投与の後にひき続いて複数回の補助投量という様式も含まれよう。用量も投与経路によって決まることもあろうし、宿主の大きさによっても異なるであろう。本発明による免疫原性組成物の有効タンパク質成分の濃度は、概して約１％ないし９５％である。唯１つの病原体の抗原性物質を含むワクチンは、一価のワクチンである。幾つかの病原体の抗原性物質を含むワクチンは複合ワクチンであるが、これらもまた本発明に属するものでる。このような複合ワクチンは、例えば、種々の病原体からの物質もしくは同一の病原体の種々の菌株からの物質、または種々の病原体の複合物からの物質を含んでいる。先に言及したように、本発明の場合、ＲＳＶＡとＲＳＶＢのＦ、ＧおよびＭタンパク質が複合されて、また別の免疫原をも含有する単一の多価免疫原性組成物となっている。免疫原性は、抗原をアジュバントと一緒に投与とすると有意に高めることができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自体免疫原性である必要はない。抗原を投与部位付近に局部的に保持し、抗原が免疫系の細胞に対し徐々にかつ持続的に放出され易くなるようなデポー効果を生じさせると、アジュバントは作用することができる。アジュバントはまた、免疫系の細胞を抗原貯留槽に引きつけ、このような細胞を刺激して免疫応答を誘発することもできる。免疫促進剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を高めるために長年使用されている。通常、リポ多糖類などの内在性のアジュバントは、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化菌の成分である。外在性のアジュバントは、宿主の免疫応答を高めるために調剤される免疫調節物質である。このように、非経口的に投与される抗原に対して免疫応答を高めるアジュバントは認定されている。しかし、このようなアジュバントの中には毒性のものがあり、望ましくない副作用を引き起こすためにヒトや多くの動物への使用が不適当なこともある。確かに、ヒトおよび獣医学用ワクチンのアジュバントとしては、決まって水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウム（一般には集合的にアラムと呼ばれる）のみが使用されている。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対して抗原応答を高めるアラムの効果は十分確証されており、ＨＢｓＡｇワクチンには従来アラムがアジュバントとして使用されている。しかし、その有効性が一部の用途については十分確証されているものの、アラムにはやはり限界がある。例えば、アラムはインフルエンザ予防接種には効果がなく、たいていの場合細胞媒介性免疫応答を誘発しない。アラムアジュバント抗原によって誘発される抗体は主としてマウスのＩｇＧ１アイソタイプであって、ある種ワクチン剤による防御には最適とはいえない。広範にわたる外在性のアジュバントは、抗原に対し強い免疫応答を誘発することができる。この中には、膜タンパク質抗原と複合しているサポニン（免疫促進複合体）、鉱油を含有するプルロニック・ポリマー、鉱油中の死滅マイコバクテリウム、不完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）およびリピドＡなどの細菌性生成物、ならびにリポソームが含まれる。体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）を効果的に誘発するために、免疫原をアジュバント中で乳化することが多い。多くのアジュバントは毒性であって、肉芽腫、急性および慢性の炎症（完全フロイントアジュバント、ＦＣＡ）、細胞溶解（サポニンおよびプルロニック・ポリマー）、発熱、関節炎、および前ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）誘発性である。ＦＣＡは優れたアジュバントであり研究に広く用いられているが、その毒性のためにヒトおよび獣医学用ワクチンへの使用は認可されていない。２．免疫検定法本発明のＲＳＶのＦ、ＧおよびＭの各タンパク質は、その抗体生成の免疫原として有効であり、また、酵素結合性免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよびその他の非酵素結合性抗体結合検定法、または当業者には既知の抗体検出法を含めた免疫検定における抗体として有効である。ＥＬＩＳＡ法の場合、選択されたＦ、ＧもしくはＭのタンパク質またはそれらの混合物は、例えばポリスチレンマイクロタイター板壁などのタンパク質結合可能な表面のような、選択された表面に固定される。洗浄して吸着物質を不完全に除去した後、試験標本としては抗原性の点で中性であることが分かっている、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液などの非特異的タンパク質を、選択した表面上に結合させてもよい。こうすることによって、固定表面の非特異的吸着部位をブロッキングすることができ、したがって表面の抗血清中にあるタンパク質の非特異的結合が原因となって生じるバックグラウンドが減ることになる。次いで固定表面を、臨床的物質または生物学的物質などの試料と接触させ、免疫複合体（抗原／抗体）生成に資するような方法で試験する。この方法には、ＢＳＡ溶液、ウシγーグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）／トイーンなどの希釈剤を用いて試料を希釈することを含めることもできる。次いで試料を、約２５℃ないし３７℃程度の温度下で約２時間ないし４時間培養する。培養の後は、試料接触面を洗浄して非免疫複合物質を除去する。洗浄方法には、ＰＢＳ／トイーンまたはホウ酸塩緩衝液などの溶液を用いた洗浄方法を含めることができる。試験試料と結合タンパク質間の特異的免疫複合体を生成し、引き続く洗浄が済んだ後に、その免疫複合体を第１の抗体に特異的な第２の抗体にさらすことによって、免疫複合体の発現およびその量までも決定することができる。試験試料がヒト由来のものである場合は、第２の抗体はヒトの免疫グロブリン、一般にＩｇＧに特異的な抗体である。検出手段を提供するために、第２の抗体は、例えば適切な色素産生基質とともに培養すると色を発現するような酵素活性などに関連した活性を有するものであってよい。次いで、例えば分光光度計などを用いて色の発生度を測定することにより、定量化を達成することができる。例前記開示によって本発明は概ね説明される。しかし、以下に記載の具体例を参照すれば、本発明をより完全に理解することができよう。これらの例は、本発明を説明する目的においてのみ記述するものであり、本発明の範囲をなんら制限するものではない。形態の変更および等価物による代用なども、状況が示唆すれば、または状況によって得策であるということになれば考慮されよう。本明細書では特定の術語を使用しているが、このような述語も説明の意味で用いるものであり、なんら本発明を制限しようとするものではない。本開示では明示的に説明していない組織培養５０％感染量（ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ）ならびにプラークおよび中和抗体価の決定法については、科学文献に十分に報告されており、また、当業者が十分理解できる範囲内の方法である。タンパク質濃度は、ピアスマニュアル（２３２２０，２３２２５；米国ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ社）に記載されるようなビシンコン酸（ＢＣＡ）法によって測定したが、その方法については参照によって本明細書に組み込むものとする。細胞培養およびウイルス増殖には、ＣＭＲＬ１９６９およびIscove's Modif ied Dulbecco's Medium（ＩＭＤＭ）培地を使用した。本研究に使用した細胞は、Institut Merieuxから入手したワクチン品質のアフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏロット番号Ｍ６）である。使用したＲＳウイルスは、American Typecultu re Collection（ＡＴＣＣ）から入手のＲＳウイルスサブタイプＡ（Ｌｏｎｇ株およびＡ２株）、Baylor College of Medicineから入手の最近のサブタイプＡ臨床単離体およびＲＳＶサブタイプＢ臨床単離体であった。例１：本例は、１５０Ｌ調節発酵器内の微粒子担体ビーズ表面で行う、哺乳類細胞株のＲＳＶ産生について説明する。濃度１０⁵個細胞／ｍＬのワクチン品質アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ）を、Ｃｙｔｏｄｅｘ−１微粒子担体ビーズ３６０ｇを含有する１５０Ｌバイオリアクター内のｐＨ７．２のＣＭＲＬ１９６９培地６０Ｌに添加し、２時間撹拌した。ＣＭＲＬ１９６９培地をさらに６０Ｌ添加し、総体積１２０Ｌとした。ウシ胎児血清を添加し、最終濃度を３．５％とした。グルコースを最終濃度が３ｇ／Ｌとなるまで添加し、Ｌーグルタミンを最終濃度が０．６ｇ／Ｌとなるまで添加した。溶解酸素（４０％）、ｐＨ（７．２）、撹拌（３６ｒｐｍ）および温度（３７℃）を調節した。細胞増殖ならびにグルコース、ラクタートおよびグルタミンの各レベルをモニターした。第４日目に、培地を発酵器からすっかり抜き取った後、Ｅ１９９培地（ウシ胎児血清を含まない）１００Ｌを添加し、１０分間撹拌した。発酵器をからにした後、再度Ｅ１９９培地１２０Ｌを充填した。ＲＳＶサブタイプＡのＲＳＶ接種物を感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）を０．００１として添加し、次いで培養菌を３日間保持した後、１／３ないし１／２量の培地を抜き取り、新たな培地で置き替えた。感染後第６日目に、撹拌を中止しビーズを静めた。ウイルス培養液を抜き取り、２０μｍのフィルタで漉過した後３μｍのフィルタで漉過し、さらに処理をすすめた。透明になったウイルスの回収物を、３００ＮＭＷＬ膜を使用したタンジェンシャルフロー限外漉過法を用いて７５倍ないし１５０倍に濃縮し、１０％グリセロールを含有するリン酸緩衝食塩液でダイアフィルトレーションした。ウイルス濃縮物を−７０℃で凍結保存した後、さらに精製をすすめた。例２：本例は、ＲＳＶサブタイプＡのウイルス濃縮物から、ＲＳＶサブユニットを精製する方法を説明する。例１で記述したように調製したウイルス濃縮物のアリコートに、５０％ポリエチレングリコールー８０００溶液を添加し、最終濃度を６％とした。室温にて１時間撹拌した後、その混合物を４℃のＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローター内にて１５，０００ＲＰＭで３０分間遠心した。次いでウイルスのペレットを、ｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、０．１５ＭＮａＣｌ中に浮遊させ、室温で１時間撹拌した後、４℃でＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローター内にて１５，０００ＲＰＭで３０分間再遠心した。次いでウイルスのペレットを、ｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸー１００中に浮遊させ、室温で３０分間撹拌した。不溶性のウイルスのコアを、４℃のＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローター内にて１５，０００ＲＰＭで３０分間遠心して除去した。可溶性のタンパク質の上清を、セラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩＩ、Bio-Rad Laboratories）のカラムに塗布し、次いでそのカラムをカラムの５倍容量のｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％トリトンＸー１００で洗浄した。Ｆ、ＧおよびＭの各タンパク質を含有するＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶサブユニット組成物を、カラムの１０倍容量のｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭＮａＣｌ、０．０２％トリトンＸ−１００で溶離して得た。例３：本例は、ＲＳＶサブタイプＡから得たＲＳＶサブユニット製剤の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびイムノブロット法による分析を説明する。例２で記述したように調製したＲＳＶサブユニット組成物を、１２．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。２−メルカプトエタノール（還元剤）の存在下または不在下で、試料を電気泳動にかけた。ウイルスタンパク質を検出するために、ゲルを銀染色で染色した（図１、パネルａおよびｂ）。レプリケートゲルのイムノブロットを作成し、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ５３５３Ｃ７５）を用いてＦ糖タンパク質を（図２、パネルａおよび図３、パネルａ）、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ１３１−２Ｇ）を用いてＧ糖タンパク質を（図２、パネルｂおよび図３、パネルｂ）、テンジクネズミ抗−血清（ｇｐ１７８）を用いてＲＳＶＭペプチド（ペプチド配列：ＬＫＳＫＮＭＬＴＴＶＫＤＬＴＭＫＴＬＮＰＴＨＤＩＩＡＬＣＥＦＥＮ−ＳＥＱＩＤＮｏ：１）（図２、パネルｃおよび図３、パネルｃ）、またヤギ抗血清（Ｖｉｒｏｓｔａｔ＃０６０５）を用いてＲＳＶ全体を（図２、パネルｄおよび図３、パネルｄ）をそれぞれ探査した。還元条件下で電気泳動にかけたＲＳＶサブユニット製剤の銀染色ゲルのデンシトメーター分析により、下記のような組成物分布が示された。Ｇ糖タンパク質（９５ｋＤａ型）＝１０％Ｆ₁糖タンパク質（４８ｋＤａ）＝３０％Ｍタンパク質（３１ｋＤａ）＝２３％Ｆ₂糖タンパク質（２３ｋＤａ）＝１９％Ｆ糖タンパク質は、非還元条件下では約７０ｋＤａ（Ｆ₀）のヘテロダイマーおよび高級オリゴマー型（二量体および三量体）として（図３、パネルａ）泳動する。例４：本例は、コトンラットにおけるＲＳＶサブユニット製剤の免疫原性を説明する。５匹のコトンラットの群について、それぞれ第０日と第２８日目に、例２で記述したように調製し、１．５ｍｇ／用量のアラムまたは５μｇ／用量のＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ^TM（スウェーデンIscotec社）を複合したＲＳＶサブユニット製剤１μｇまたは１０μｇを用い、筋肉注射（０．１ｍＬ）により免疫した。試料血液を第４１日目に採取し、抗−融合抗体価および中和抗体価を定量した。第４３日目にラットを鼻腔内よりＲＳＶでチャレンジし、４日後に死滅させた。肺および鼻咽腔の洗浄液を採集し、ＲＳＶ力価を定量した。後出の第１表および第２表に示すように、強い抗−融合抗体価および中和抗体価が誘導された。さらに、１匹のラットを除き、上気道および下気道いずれにおいてもウイルス感染に対する完全防御が得られた。（後出の表３および表４）例５：本例は、マウスにおけるＲＳＶサブユニット製剤の免疫原性を説明する。６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群について、それぞれ第０日および第２８日目に、例２で記述したように調製し、１．５ｍｇ／用量のアラム、１０μｇ／用量のＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ^TM、２００μｇ／用量のポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）、または２００μｇ／用量のＤＣ−ｃｈｏｌのいずれかを複合したＲＳＶサブユニット製剤を種々の用量で用い、筋肉注射（０．１ｍＬ）により免疫した。試験した種々の製剤を後出の第５表、第６表および第７表に示す。試料血液を第２８日目および第４２日目に採取し、中和抗体価および抗−Ｆ抗体価を定量した。第４４日目にマウスをＲＳＶでチャレンジし、４日後に死滅させさせた。肺を取り出し、均質化してウイルス力価を測定した。後出の第５表および第６表に示すように、強い中和抗体価および抗−Ｆ抗体価が誘導された。さらに、肺ホモジェネートおよび鼻内洗浄液にウイルスが存在しない（後出第７表）ことから明らかなように、ウイルス感染に対する完全防御が得られた。例６：本例はアフリカミドリザルおけるＲＳＶサブユニット製剤の免疫原性を説明する。４匹のサルの群について、それぞれ第０日および第２１日目に、例２で記述したように調製し、１．５ｍｇ／用量のアラムまたは５０μｇ／用量のＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ^TMのいずれかを複合したＲＳＶサブユニット製剤１００μｇを用いて、筋肉注射（０．５ｍＬ）により免疫した。試料血液を第２１日目、第３５日目および第４９日目に採取し、中和抗体価および抗−Ｆ抗体価を定量した。後出の第８表および第９表に示すように、強い中和抗体価および抗−Ｆ抗体価が得られた。例７：本例は、１５０Ｌ調節発酵器内の微粒子ビーズ表面で行う、哺乳類細胞株におけるＲＳＶの産生についてさらに詳しく説明する。ワクチン品質のアフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ細胞）を、Ｃｙｔｏｄｅｘ−１微粒子担体ビーズ４５０ｇ（３ｇ／Ｌ）を含有する１５０Ｌバイオリアクター内で、３．５％ウシ胎児血清を含有するｐＨ７．２のIscove's Modified Du lbecco's Medium（ＩＭＤＭ）１５０Ｌに添加し、最終濃度を２×１０⁵個細胞／ｍＬ（１．５個ないし３．５個細胞／ｍＬの範囲）とした。細胞を接種した後、溶解酸素（４０パーセント空気飽和（２５ないし４０％の範囲）、ｐＨ（７．１ ±０．２））、撹拌（３６±２ｒｐｍ）および温度（３７℃±０．５℃）を調節した。ビーズへの初期細胞接着、細胞増殖（細胞数測定）ならびにグルコースおよびラクタートの増殖培地レベルを毎日モニターした。Ｖｅｒｏ細胞培養菌の感染は、細胞増殖開始後３ないし４日目に、細胞濃度が１．５ないし２．０×１０⁶ 個細胞／ｍＬの範囲となった時点で発現した。撹拌を中止し、６０分間微粒子担体ビーズを静めた後、静めたビーズのかさの上方約３ｃｍの位置に配置した排液管を用いてバイオリアクターから培地を抜き取った。ウシ胎児血清を含有しないＩＭＤＭ（洗浄培地）７５Ｌを添加し、その混合物を３６ｒｐｍの速度で１０分間撹拌した。撹拌を中止し、３０分間微粒子担体ビーズを静めた。排液管を用いて洗浄培地を除去し、次いでバイオリアクターにウシ胎児血清を含有しないＩＭＤＭを７５Ｌ（１／２容量）まで充填した。感染については、ＲＳＶサブタイプＢのＲＳＶ接種物を感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）を０．００１として添加し、次いで１／２容量でのウイルスの細胞への吸着を、３６ｒｐｍで撹拌しながら２時間実施した。次いでバイオリアクターにＩＭＤＭ７５Ｌを添加し最終体積を１５０Ｌとした。感染後、溶解酸素（４０パーセント空気飽和（１０ないし４０％の範囲）、ｐＨ（７．２５±０．１））、撹拌（３６±２ｒｐｍ）および温度（３７℃±０．５℃）を調節した。感染後、細胞増殖（細胞数測定）培地、グルコースおよびラクタートの各レベル、ＲＳＶＦ抗原およびＧ抗原ならびにＲＳＶ感染力を毎日モニターした。感染後第３日目に、撹拌を中止し、６０分間微粒子担体ビーズを静めた後、培地７５Ｌ（５０％）を排液管を介して除去し、新たな培地で置き替えた。感染後第８日目（７ないし９日の範囲）、完全なるウイルス誘導性細胞変性効果が観察された（すなわち、細胞が微粒子担体ビーズから単離し、酸素は培養菌によって全く消費されなかった）時点で、撹拌を中止し、６０分間微粒子担体ビーズを静めた。培養液を含有するウイルスをバイオリアクターから取り除き、保持容器に移した。バイオリアクターにウシ胎児血清を含有しないＩＭＤＭ７５Ｌを添加し、７５ｒｐｍで３０分間撹拌した。微粒子担体ビーズを３０分間静め、バイオリアクターからすすぎ液を除去してから、保持容器内の回収物質と複合させた。回収物質を、５００もしくは１０００キロダルトン（Ｋ）の限外漉過膜または別法として０．４５μＭの精密ろ過膜を使用して、タンジェンシャルフローろ過法によって約２０倍に濃縮し（すなわち、ウイルス含有物質を膜で保持して）、最終体積を１０Ｌとした。濃縮物質を、１０容積分のｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩液でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションしたウイルス濃縮物を−７０℃で凍結保存した後、さらに精製をすすめた。例８：本例は、ＲＳＶサブタイプＢのウイルス濃縮物からＲＳＶサブユニットを精製する方法について説明する。例７で記述したように調製したウイルス濃縮物を、４℃で、ＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローター内にて１５，０００ＲＰＭで３０分間遠心した。次いでウイルスのペレットを、ｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭＮａＣｌ、２％トリトンＸー１００中に浮遊させ、室温で３０分間撹拌した。不溶性のウイルスのコアを、４℃でＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローター内にて１５，０００ＲＰＭで３０分間遠心して除去した。可溶性のタンパク質の上清を、セラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩ、Bio-Rad Laboratories）のカラムに塗布し、次いでそのカラムをカラムの１０倍容量のｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％トリトンＸー１００で洗浄した。Ｆ、ＧおよびＭの各タンパク質を含有するＲＳＶサブユニット組成物を、カラムの１０倍容量のｐＨ６．８の１ｍＭリン酸ナトリウム、６００ｍＭＮａＣｌ、０．０２％トリトンＸー１００でカラムを溶離することによって得た。ある場合には、先ず第１のセラミックヒドロキシアパタイトカラムからの溶出液を希釈してＮａＣｌ濃度を４００ｍＭＮａＣｌにまで低減し、次いでその希釈サブユニットをセラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩＩ、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のカラムに適用することによって、ＲＳＶサブユニット組成物をさらに精製する。このカラムからの流液は、ＲＳＶサブタイプＢからの精製ＲＳＶサブユニット組成物である。例９：本例は、ＲＳＶサブタイプＢから得たＲＳＶサブユニット製剤の、ＳＤＳーポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析を説明する。例８で記述したように調製したたＲＳＶサブユニット組成物を、１５．０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。２−メルカプトエタノール（還元剤）の存在下で、試料を電気泳動にかけた。ウイルスタンパク質を検出するために、ゲルは銀染色で染色した（図４）。還元条件下でのＲＳＶサブユニット製剤の銀染色ゲルのデンシトメーター分析により、下記のような組成物分布が示された。Ｇ糖タンパク質（９５ｋＤａ型）＝２１％Ｆ₁糖タンパク質（４８ｋＤａ）＝１９％Ｍタンパク質（３１ｋＤａ）＝２２％Ｆ₂糖タンパク質（２３ｋＤａ）＝２０％開示の概要本開示を要約すると、本発明は、問題とする感染症の動物モデルにおいてＲＳＶに対して防御可能な、同時単離され同時精製されたＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質の混合物を提供するものである。本発明の範囲内においては、部分的変更も可能である。 1:アッセイで検出可能な最も低い抗体価ＮＤ＝測定せず 1:アッセイで検出可能な最も低いウィルス抗体価引用文献 1． Glezen，W.P.，Paredes，A．Allison，J.E.，Taber，L.H．and Frank，A.L ．(1981)．J.Pediatr．98，708-715. 2． 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【手続補正書】【提出日】１９９９年１月１４日（１９９９．１．１４）【補正内容】請求の範囲１．呼吸器合胞体ウィルス(ＲＳＶ)の精製した融合(Ｆ)タンパク質、結合(Ｇ)タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質の混合物。２．前記融合（Ｆ）タンパク質がマルチメリックな融合（Ｆ）タンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の混合物。３．非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、前記マルチメリックな融合（Ｆ）タンパク質が、分子量約７０ｋＤａのヘテロダイマーおよび二量体および三量体を含むことを特徴とする請求項２に記載の混合物。４．非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、前記結合（Ｇ）タンパク質が、分子量約９５ｋＤａのＧタンパク質および分子量約５５ｋＤａのＧタンパク質およびオリゴマーＧタンパク質を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の混合物。５．非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、前記マトリックス（Ｍ）タンパク質が、分子量約２８ｋＤａから３４ｋＤａのＭタンパク質を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の混合物。６．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析すると、前記融合（Ｆ）タンパク質が分子量約４８ｋＤａのＦ₁と分子量約２３ｋＤａのＦ₂を含み、前記結合（Ｇ）タンパク質が分子量約９５ｋＤａのＧタンパク質と分子量約５５ｋＤａのＧタンパク質を含み、前記マトリックス（Ｍ）タンパク質が分子量約３１ｋＤａのＭタンパク質を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の混合物。７．前記Ｆ、ＧおよびＭタンパク質が、Ｆ３５重量％〜７０重量％、Ｇ５重量％〜３０重量％、Ｍ１０重量％〜４０重量％の相対的な割合で存在することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の混合物。８．還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色すると、走査デンシトメトリーにより、分子量約４８ｋＤａのＦ₁と分子量約２３ｋＤａのＦ₂の比が約１：１から約２：１の間であることを特徴とする請求項７に記載の混合物。９．少なくとも７５％の純度である請求項１乃至８のいずれか１項に記載の混合物。１０．モノクローナル抗体を含まない請求項１乃至９のいずれか１項に記載の混合物。１１．ヒラマメレクチンおよびコンカナバリンＡを含まない請求項１乃至９のいずれか１項に記載の混合物。１２．前記ＲＳＶタンパク質が変性されていないことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の混合物。１３．前記ＲＳＶタンパク質がサブタイプＲＳＶＡおよびＲＳＶＢの一方または両方由来のものであることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の混合物。１４．同時単離および同時精製された請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の混合物。１５．本質的に、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質からなるＲＳＶの非変性タンパク質の同時単離および同時精製した混合物であって、レクチンおよびモノクローナル抗体を含まない混合物。１６．請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の混合物を免疫有効量含む免疫原性組成物。１７．さらに、少なくとも１つの別の免疫原を含む請求項１６に記載の免疫原性組成物。１８．前記少なくとも１つの別の免疫原が、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３からなる群から選択した少なくとも１つのヒトパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）タンパク質を含むことを特徴とする請求項１７に記載の免疫原性組成物。１９．培地中の細胞上でＲＳＶを増殖させ、増殖したウィルスを培地から分離し、少なくとも分離したウィルスからの融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質を可溶化し、ＲＳＶの可溶化したＦ、ＧおよびＭタンパク質を同時に単離し、同時に精製するステップを特徴とする、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）のタンパク質の同時に単離し、同時に精製した混合物を製造する方法。２０．前記同時単離および同時精製ステップを、可溶化したタンパク質をイオン交換マトリックスにかけ、イオン交換マトリックスからＦ、ＧおよびＭタンパク質を選択的に同時に溶離することにより実施することを特徴とする請求項１９に記載の方法。２１．前記イオン交換マトリックスがハイドロキシアパタイトマトリックスであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。２２．前記可溶化ステップの前に、前記増殖させたウィルスを、尿素で洗浄して、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質を実質的に除去することなく、汚染物質を除去することを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の方法。２３．呼吸器合胞体ウィルスによる感染で引き起こされる疾患に対するワクチンの医薬物質として使用するための、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の精製した融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質の混合物。２４．呼吸器合胞体ウィルスによる感染で引き起こされる疾患にして免疫するためのワクチン組成物を製造するための、呼吸器合胞体ウィルスの精製した融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質混合物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 15/02 33/569 ＬＧ０１Ｎ 33/531 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/569 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者オーメン、レイモンド、ピー. カナダ国エル０ジー１ティー０オンタリオ州スコンバーグアール．アール．１番 (72)発明者クライン、マイケル、エイチ. カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウィロウダールミュンロブールヴァード 16

Claims

【特許請求の範囲】１．精製した、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質の混合物。２．前記融合（Ｆ）タンパク質がマルチメリックな融合（Ｆ）タンパク質を含む請求項１に記載の混合物。３．非還元条件下で分析すると、前記マルチメリックな融合（Ｆ）タンパク質が、分子量約７０ｋＤａのヘテロダイマーおよび二量体および三量体を含む請求項２に記載の混合物。４．非還元条件下で分析すると、前記結合（Ｇ）タンパク質が、分子量約９５ｋＤａのＧタンパク質および分子量約５５ｋＤａのＧタンパク質およびオリゴマーＧタンパク質を含む請求項１に記載の混合物。５．非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、前記マトリックス（Ｍ）タンパク質が、分子量約２８ｋＤａから３４ｋＤａのＭタンパク質を含む請求項１に記載の混合物。６．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析すると、前記融合（Ｆ）タンパク質が分子量約４８ｋＤａのＦ₁と分子量約２３ｋＤａのＦ₂を含み、前記結合（Ｇ）タンパク質が分子量約９５ｋＤａのＧタンパク質と分子量約５５ｋＤａのＧタンパク質を含み、前記マトリックス（Ｍ）タンパク質が分子量約３１ｋＤａのＭタンパク質を含む請求項１に記載の混合物。７．前記Ｆ、ＧおよびＭタンパク質が、Ｆ約３５重量％〜約７０重量％、Ｇ約５重量％〜約３０重量％、Ｍ約１０重量％〜約４０重量％の相対的な割合で存在する請求項１に記載の混合物。８．還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色すると、走査デンシトメトリーにより、分子量約４８ｋＤａのＦ₁と分子量約２３ｋＤａのＦ₂の比が約１：１から２：１である請求項７に記載の混合物。９．少なくとも約７５％の純度である請求項７に記載の混合物。１０．モノクローナル抗体を含まない請求項１に記載の混合物。１１．ヒラマメレクチンおよびコンカナバリンＡを含まない請求項１に記載の混合物。１２．前記ＲＳＶタンパク質が変性されていない請求項１に記載の混合物。１３．前記ＲＳＶタンパク質がサブタイプＲＳＶＡおよびＲＳＶＢの一方または両方由来のものである請求項１に記載の混合物。１４．本質的に、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質からなるＲＳＶの非変性タンパク質の同時単離および同時精製した混合物であって、レクチンおよびモノクローナル抗体を含まない混合物。１５．請求項１に記載の混合物を免疫有効量含む免疫原性組成物。１６．宿主にin vivoで投与して、ＲＳＶに対する防御を付与するためのワクチンとして処方した請求項１５に記載の免疫原性組成物。１７．さらに、少なくとも１つのアジュバントまたは少なくとも１つの免疫調整剤を含む請求項１５に記載の免疫原性組成物。１８．少なくとも１つのアジュバントを、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡまたはその誘導体もしくは成分、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクトデシルエステル、ムラミルジペプチド、リポタンパク質、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＭマトリックス、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＤＡおよび細菌毒素、その誘導体からなる群から選択する請求項１７に記載の免疫原性組成物。１９．宿主が霊長類である請求項１６に記載の免疫原性組成物。２０．霊長類がヒトである請求項１９に記載の免疫原性組成物。２１．さらに、少なくとも１つの別の免疫原を含む請求項１５に記載の免疫原性組成物。２２．前記少なくとも１つの別の免疫原が、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３からなる群から選択した少なくとも１つのヒトパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）タンパク質を含む請求項２１に記載の免疫原性組成物。２３．免疫有効量の請求項１５に記載の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む、宿主で免疫応答を引き起こす方法。２４．前記免疫原性組成物を、宿主にin vivoで投与して、呼吸器合胞体ウィルスに対する防御を付与するためのワクチンとして処方した請求項２３に記載の方法。２５．請求項１５に記載の免疫原性組成物を被験宿主に投与して、ＲＳＶが引き起こす疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物の投与量および投与頻度を決定することと、免疫原性組成物を、決定した投与量および投与頻度で治療する宿主に投与するのに好適な形態に処方することとを含む、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）に対する防御を付与するためのワクチンの製造方法。２６．治療する宿主がヒトである請求項２５に記載の方法。２７．（ａ）請求項１５に記載の免疫原性組成物を少なくとも１匹のマウスに投与して、少なくとも１匹の免疫したマウスを作製し、（ｂ）少なくとも１匹の免疫したマウスからＢリンパ球を除去し、（ｃ）少なくとも１匹の免疫したマウス由来のＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製し、（ｄ）選択した抗ＲＳＶタンパク質抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、（ｅ）選択した抗ＲＳＶタンパク質抗体産生クローンを培養し、（ｆ）選択した培養物から抗ＲＳＶタンパク質抗体を単離することを含む、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を製造する方法。２８．培地中の細胞上でＲＳＶを増殖させ、増殖したウィルスを培地から分離し、少なくとも分離したウィルスからの融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質を可溶化し、可溶化したＲＳＶタンパク質を同時に単離し、同時に精製することを含む、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）のタンパク質の同時に単離し、同時に精製した混合物を製造する方法。２９．前記同時単離および同時精製を、可溶化したタンパク質をイオン交換マトリックスにかけ、イオン交換マトリックスからＦ、ＧおよびＭタンパク質を選択的に同時に溶離することにより実施する請求項２８に記載の方法。３０．前記イオン交換マトリックスがハイドロキシアパタイトマトリックスである請求項２９に記載の方法。３１．可溶化ステップの前に、増殖させたウィルスを先ず、尿素で洗浄して、Ｆ、ＧおよびＭタンパク質を実質的に除去することなく、汚染物質を除去する請求項２８に記載の方法。３２．（ａ）試料を請求項１に記載の混合物と接触させて、呼吸器合胞体ウィルスタンパク質と、試料中に存在するそのタンパク質と特異的に反応する抗体とを含む複合体を生成するステップと、（ｂ）複合体の生成を測定するステップとを含む、試料中の、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質またはマトリックス（Ｍ）タンパク質と特異的に反応する抗体の存在を測定する方法。３３．（ａ）対象を請求項１５に記載の免疫原性組成物で免疫して、ＲＳＶのＦ、ＧおよびＭタンパク質に特異的な抗体を産生するステップと、（ｂ）試料を抗体と接触させて、試料中に存在するＲＳＶタンパク質と前記のタンパク質に特異的な抗体とを含む複合体を生成するステップと、（ｃ）複合体の生成を測定するステップとを含む、試料中の呼吸器合胞体ウィルスのＦ、ＧまたはＭタンパク質の存在を測定する方法。３４．（ａ）請求項１に記載の混合物と、（ｂ）免疫原性組成物を試料と接触させて、呼吸器合胞体ウィルスタンパク質と試料中に存在する抗体とを含む複合体を生成するための手段と、（ｃ）複合体の生成を測定するための手段とを含む、試料中の、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質、およびマトリックス（Ｍ）タンパク質と特異的に反応する抗体の存在を測定する診断用キット。３５．呼吸器合胞体ウィルスによる感染で引き起こされる疾患に対するワクチンの医薬物質として使用するための、精製した呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質混合物。３６．呼吸器合胞体ウィルスによる感染で引き起こされる疾患にして免疫するためのワクチン組成物を製造するための、精製した呼吸器合胞体ウィルスの融合（Ｆ）タンパク質、結合（Ｇ）タンパク質およびマトリックス（Ｍ）タンパク質混合物の使用。