JP2000500983A

JP2000500983A - Selective inactivation of enzyme activity

Info

Publication number: JP2000500983A
Application number: JP9-520879A
Authority: JP
Inventors: エイジラウステン，マッド; ニールソン，スティグ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-11-25
Publication date: 2000-02-02

Abstract

(57)【要約】ｐＨ、温度および維持時間を変えることにより得られる、所望の酵素を含有する酵素混合物中の少なくとも１つの望ましくない酵素を不活性化する方法。 (57) [Summary] A method for inactivating at least one undesired enzyme in an enzyme mixture containing a desired enzyme, obtained by changing pH, temperature and maintenance time.

Description

【発明の詳細な説明】酵素活性の選択的不活性化技術分野本発明は、所望の酵素を含有する酵素混合物中の１または複数の望ましくない酵素の不活性化方法に関する。背景技術所望の酵素を得るために微生物を培養する時、前記微生物によって１または複数の望ましくない酵素もしばしば発現される。それらの望ましくない酵素が効果的に不活性化されなければ、それらが所望の酵素の回収中および／または所望の酵素の貯蔵中に重大な安定性の問題を引き起こしかねない。たとえそれらの別の酵素が安定性問題を引き起こさなくても、様々な目的の産業が副活性を持たない「純粋な」酵素を必要とするので、それらは実際上望ましくないだろう。上記の問題を解決するために、多くの案が提唱されている： Hoerle他は、米国特許第4,086,139号明細書において、アミラーゼ−プロテアーゼ混合物においてアミラーゼを不活性化するための次亜塩素酸および亜塩素酸イオンの使用を開示している。Bock他は、東独国特許第216 955号明細書において、尿素を添加することによってペクチナーゼ混合物からポリガラクツロナーゼを除去できることを記載している。DeStefanis他は、欧州特許第021 197号明細書において、系のpHを5.0〜7.0に調整し、前記混合物を緩衝剤で緩衝化し、そして前記混合物を40℃〜75℃の温度に加熱することにより、プロテアーゼ−アミラーゼ混合物においてバシラス（Bacillus）菌プロテアーゼを不活性化できることを開示している。本発明の目的は、酵素混合物中の望ましくない酵素の不活性化方法であって、短い処理時間を有し、高収率をもたらし、そして同時に単純で、安価で且つ産業上の要件に適合している方法を提供することである。発明の要約驚くべきことに、本発明の使用により、多数の望ましくない酵素を効果的に不活性化できることがわかった。従って、本発明は、所望の酵素を含有する酵素混合物中の少なくとも１つの望ましくない酵素の不活性化方法であって、ａ）該混合物を２℃〜75℃の温度で5. 0より低いpHで少なくとも20秒間維持し；そして／またはｂ）該混合物を２℃〜7 5℃の温度で9.0より高いpHで少なくとも20秒間維持することを含んで成る方法に関する。図面の簡単な説明添付図面への参照により本発明を更に説明する。図１は、実施例１に記載したように実験を実施した、pH 3.5で且つ45℃（Ｉ）、50℃（II）、55℃（III）および70℃（IV）での不活性化時間に対するリパーゼ活性を示す。図２は、実施例１に記載したように実験を実施した、pH 3.5で且つ45℃（Ｉ）、50℃（II）、55℃（III）および70℃（IV）での不活性化時間に対するプロテアーゼ活性を示す。図３は、実施例１に記載したように実験を実施した、未処理の試料（Ｉ）とpH 3.5で45℃にて60分間処理した試料（II）を使った安定性試験を示す。図４は、実施例２に記載したように実験を実施した、pH 3.5で且つ45℃（Ｉ）、50℃（II）、55℃（III）、60℃（IV）および70℃（Ｖ）での不活性化時間に対するリパーゼ活性を示す。図５は、実施例２に記載したように実験を実施した、pH 3.5で且つ45℃（Ｉ）、50℃（II）、55℃（III）、60℃（IV）および70℃（Ｖ）での不活性化時間に対するプロテアーゼ活性を示す。図６は、実施例３に記載したように実験を実施した３つの異なるリパーゼ試料：pH 2.5で20℃にて60分間処理した試料（Ｉ）、pH10.7で20℃にて60秒間処理した試料（II）および未処理の試料（III）を使った安定性試験を示す。発明の詳細な説明本発明は、所望の酵素を含有する酵素混合物中の少なくとも１つの望ましくない酵素の不活性化方法であって、ａ）該混合物を２℃〜75℃の温度で5.0より低いpHで少なくとも20秒間維持し；そして／またはｂ）該混合物を２℃〜75℃の温度で9.０より高いpHで少なくとも20秒間維持する段階を含んで成る方法に関する。本発明において利用する原理は、酵素が酸性（5.0より低いpH）またはアルカリ性（9.０より高いpH）のいずれかの条件を許容できるというものである。本発明者らは、この事実を、問題の酵素の温度許容度（２℃〜75℃）および所望の酵素の大部分が維持され且つ望ましくない酵素の大部分が不活性化される最適条件を得るために酵素混合物を前記条件に維持する時間と組み合わせる。そのために３つのパラメーター、即ちpH、温度および維持時間を変更できる系において該方法を操作する。所望の酵素を安定にする安定剤を加えることが有利な場合がある。この安定剤は本発明の方法を用いる前に加えるべきである。そのような安定剤の例は、所望の酵素のための阻害剤、補因子または基質である。酵素が阻害剤、補因子または基質〔例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）〕に結合されるとより一層安定になることは、当該技術分野で周知である。ＣＭＣを用いる一例が実施例７に与えられる。望ましくない酵素を不安定にする不安定剤を加えることも有利な場合がある。この不安定剤は本発明の方法を用いる前に加えるべきである。有用な不安定剤は錯生成剤、特に金属イオン錯生成剤、例えばEDTAおよびEGTAである。更に、所望の酵素を安定にする安定剤と、望ましくない酵素を不安定にする不安定剤の両者を添加することも有利である場合がある。望ましくない酵素ごく一般的な望ましくない酵素類は、それらがタンパク質を分解することができるのでタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ぺプチダーゼ）であり、しかも酵素はタンパク質であるので、タンパク質分解酵素は所望の酵素を分解し得る。しかしながら、実際は例えば動物、植物または微生物から得られるあらゆる酵素が望ましくない酵素となり得る。なぜなら、産業はますます「純粋な」酵素、または「一成分」酵素を求めており、即ち所望なもの以外のどんな酵素活性でも不必要だからであるからである。望ましくない酵素は、任意の酵素、特にリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、キシラナーゼ、イソメラーゼ、ペプチダーゼおよびプロテアーゼから成る群より選ばれた酵素であり得る。所望の酵素例えば微生物、動物または植物から得られるどんな酵素でも所望の酵素となり得る。特に、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、キシラナーゼ、イソメラーゼ、ペプチダーゼおよびプロテアーゼから成る群より選ばれた酵素が好ましい。本発明の方法は、所望の酵素が微生物、動物または植物、特に真菌、好ましくは糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus ）、例えばＡ．オリゼ（A ． o ryzae ）、Ａ．ニガー（A ．niger）、またはフミコラ（Humicola）、例えばＨ．インソレンス（H. insolens）から得られる時に特に有用である。特に所望の酵素をアスペルギルスやフミコラのような糸状菌中でクローニングする時、望ましくない酵素を取り除くこと、典型的には微量のプロテアーゼ活性を取り除くことに現在問題がある。存在する望ましくない酵素の量は典型的には非常に低く、しばしば標準法により検出できない量であるが、クローン化酵素を使えなくする素はクローン化酵素（所望の酵素）を不安定にする。本発明の方法を用いることにより、それらのごく少量のタンパク質分解活性を不活性化することが可能であり、それにより非常に優れた安定性を有する生成物を得ることができる（実施例１を参照のこと）。酵素混合物本発明の方法は少なくとも２つの酵素を含有するどんな酵素混合物に対しても用いることができる。当該方法は酵素混合物が培養（＝醗酵）ブロスである時に特に有用である。本発明の方法は未処理の培養ブロス（そのままの培養ブロス）；ホモジナイズした培養ブロス；あるいは例えば水での希釈および／または１もしくは複数の固体／液体分離技術、例えば凝集、遠心分離、濾過、例えばドラム濾過もしくはフィルター加圧濾過、または膜分離にかけられており、場合により続いて膜濃縮または蒸発にかけられている、そのままのまたはホモジナイズした培養ブロス、に適用することができる。本発明によれば、膜濃縮は当業界で既知の任意の膜装置を使って実施することができるが、中空繊維、スパイラルラウンドもしくはプレートおよびフレーム装置のような限外濾過技術を使って膜濃縮を行うことが好ましい。好ましいカットオフ値は問題の酵素の性質に依存するが、通常は１〜100 kDの範囲内のカットオフ値が好ましい。本発明に従って望ましくない酵素活性を不活性化する前に、酵素溶液を様々な方法で、例えば濾過、クロマトグラフィー法、吸着および／または沈澱／結晶化方法を使うことにより、更に精製してもよい。。所望の酵素が非常に不安定である場合、醗酵醗酵後、典型的には濾過後、例えば遠心分離またはドラム濾過後できるだけすぐに、１または複数の望ましくない酵素を不活性化することが得策かもしれない。所望の酵素があまり不安定でなければ、醗酵ブロスを精製しそして濃縮するまで、典型的には濾過および限外濾過を行うまで、不活性化を待つことが有利かもしれない。本発明による不活性化を行った後、酵素生成物は通常のやり方で処理され、即ち、様々なやり方で、例えば濾過、濃縮、クロマトグラフィー法、吸着および／または沈澱／結晶化方法を使うことにより更に精製されてもよい。ある場合には１または複数の望ましくない酵素を不活性化だけし、またある場合には１または複数の望ましくない酵素を不活性化しそして除去することが有利かもしれない。望ましくない酵素の除去は典型的には固体／液体分離操作により行われる。本法の使用１つの所望の酵素と１または複数の望ましくない酵素を含有する酵素混合物がある時、まず初めに所望の酵素についてpH曲線を調べ、そしてそれがアルカリ性側と酸性側のどちらに最適値を有するかを知ることが賢明である。所望の酵素が酸性側に最適値を有するならば、それは通常5.0より低いpHで破壊されないことを意味する。かくして様々なpH値（例えばpH 4.5、pH 4.0、pH 3.5）を様々な温度値（例えば40℃、50℃、60℃、70℃）および様々な維持時間（例えば１分、５分、60分、240分）と組み合わせた試験シリーズを行うよう勧められる。これを行うことによって、所望の酵素の大部分が保持され且つ望ましくない酵素の大部分が不活性化される最適条件を見つけることができる。本発明によれば、pHをできるだけ酸性にまたはアルカリ性に保つことが好ましく、前記酵素混合物を4.5より低いpHに、特に4.0より低いpHに、特に3.5より低いpHに調整するか、または前記酵素混合物を9.5より高いpHに、特に約10.0より高いpHに調整する方法が好ましい。本発明によれば、温度は２〜75℃の範囲、特に10〜70℃の範囲、好ましくは25 〜65℃の範囲、より好ましくは40〜60℃の範囲内に維持すべきである。本発明によれば、まずpHを調整した後で溶液を所望の温度に加熱／冷却することができ（実施例１に記載のように）、またはまず溶液を所望の温度に加熱／冷却し、その後でpHをを調整することができる（実施例３に記載のように）。維持時間は20秒から数週間までのいずれでもよく、典型的には維持時間は１分から24時間までの範囲、好ましくは１分から４時間までの範囲であろう。問題の所望の酵素および望ましくない酵素に依存して、望ましくない酵素をどれくらい不活性化すべきであるかと所望の酵素をどれくらい維持すべきであるかを断言することは難しい。一般的に、本発明による不活性化後に初期レベルの15 ％未満のレベルへの望ましくない酵素の減少が好ましく、特に本発明による不活性化後に初期レベルの10％未満のレベルへの望ましくない酵素の減少が好ましく、更に好ましくは、本発明による不活性化後に初期レベルの２％未満のレベルへの減少が好ましく、特に本発明による不活性化後に初期レベルの１％未満のレベルへの減少が好ましい。通常、多くても所望の酵素の半分が不活性化されるしか許されないので、従って所望の酵素のレベルが、本発明による不活性化後に初期レベルの50％より大きい、特に本発明による不活性化後に初期レベルの60％より大きい、好ましくは本発明による不活性化後に初期レベルの75％より大きい、更により好ましくは、本発明による不活性化後に初期レベルの85％より大きいのが好ましい。pH 調整 pHの調整には、事実上どんな酸または塩基でも使用することができる。酸は無機酸または有機酸であることができる。幾つかの例は塩酸、硫酸、亜硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸および蟻酸である。好ましい酸は蟻酸、クエン酸および酢酸である。好ましい塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムであり、特に水酸化ナトリウムが好ましい。下記の実施例は本発明を更に説明する。それらはどんな形にせよ本発明の特許の請求の範囲に限定を行うものではない。実施例において、酵素活性は次のアッセイのうちの１つを使って測定した。リパーゼ活性の測定実施例１，２，３，４および５におけるリパーゼ活性は、基質としてグリセリントリブチレートを使いそして乳化剤としてアラビアゴムを使ってアッセイした。１ＬＵ（リパーゼ単位）は、30℃，pH7.0にて１分間あたり１マイクロモルの滴定可能な酪酸を遊離させる酵素の量である。リパーゼ活性はラジオメーター滴定装置 VIT90（Radiometer，Copenhagen）を使ってpH−スタットにより定量した。プロテアーゼ活性の測定実施例１，２，３および８におけるプロテアーゼ活性は、基質としてala-ala- pro-phe-ｐ−ニトロアニリドを使って定量した。加水分解されるとｐ−ニトロアニリド(pNA)基が遊離され、405 nmで分光光度測定することができる黄色を生じる。反応条件は0.05 Mホウ酸／KCl緩衝液を使って30℃，pH 9.5であり、基質濃度は2.5mM pNA−ペプチドであった。 405 nmでの吸光度の経時変化を、自動測定系〈Cobas〉FARAを使って測定した。活性１単位（１Ｕ）は、１分あたり１マイクロモルのpNA−ペプチドを加水分解することができる酵素の量として定義された。粘度計とＣＭＣを使ったセルラーゼ活性（エンドグルカナーゼ活性）の測定実施例７のセルラーゼ活性は、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（Hercules７LFD）を使って定量した。加水分解されるとインキュベーション混合物の粘度が降下するので、振動型粘度計を使って粘度を測定した。インキュベーションは0.1 Ｍ Tris中pH＝9.0で40℃にて30分間行う。粘度は振動棒粘度計 MIVI 3000型（Sofrase）を使って測定した。ＩＥＦと-ＣＭＣを使ったセルラーゼ活性（エンドグルカナーゼ活性）の測定実施例６のセルラーゼ活性は、ＣＭＣトップアガー上塗層を使った等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を使ってアッセイした。ＩＥＦにはPharmacia Ampholine PAGp late，pH 3.5-9.5を使った（コード番号80-1124-80）。トップアガーは、トリス−マレイン酸緩衝液（pH＝７）中の0.5％ＣＭＣ（Her cules 7 LFD）＋１％アガロース（Litex LSA）を使って調製した。懸濁液を沸点に５分間加熱し、その後55℃に冷却した。等電点電気泳動後、トリス−マレイン酸緩衝液（pH＝７）を使って１時間フラッシュすることにより、pH勾配を取り除いた。続いてトップアガーをゲルの上に流し込んだ。45℃で６時間後に確認を行った。トリス−マレイン酸緩衝液（pH＝７）中の0.7％コンゴーレッドの溶液をトップアガーの上に注入した後、それを1 0分間置いておき、１Ｍ NaCl／H₂Oを使って２×10分間脱色した。エンドグルカナーゼ活性は赤色のバックグラウンドの上の透明ゾーンとして検出される。BioImageゲルスキャン装置の上で定量を行った。スキャンされたゾーンがセルラーゼ活性の量を表す。ＩＥＦとカゼインを使ったプロテアーゼ活性の測定実施例７のプロテアーゼ活性は、カゼイン−トップアガー上塗層を用いた等電点電気泳動を使って実施した。ＩＥＦにはPharmaciaAmpholine PAGplate，pH 3. 5-9.5を使った（コード番号80-1124-80）。トップアガーは、トリス−マレイン酸緩衝液（pH＝７）中の１％カゼイン＋１％アガロース（Litex LSA）の混合物を使って調製した。アガロースを沸点に５分間加熱し、その後55℃に冷却した。等電点電気泳動後、トリス−マレイン酸緩衝液（pH＝７）を使って１時間フラッシュすることにより、pH勾配を取り除いた。１容の１％カゼインと１容の１％アガロースを混合した後、トップアガーをゲルの上に流し込んだ。プロテアーゼ活性は加水分解されたカゼインの沈澱ゾーンとして検出される。 BioImageゲルスキャン装置の上で定量を行った。スキャンされたゾーンがプロテアーゼ活性の量を表す。実施例１プロテアーゼの不活性化この実施例は、所望のリパーゼをそのまま残す低pHにおける濃縮物中の望ましくないプロテアーゼの不活性化を記載する。カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼＢをアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）宿主中でクローニングすることによるWO 8 8/02775に記載のごとく得られたリパーゼＢを含有する培養ブロス中に存在する、望ましくないプロテアーゼを本発明の方法に従って不活性化する。最初に、培養ブロスをドラム濾過による固体／液体分離にかけた。次いで、ドラム濾液を20 kDのカットオフを有する膜上での限外濾過（ＵＦ）濃縮にかけた。濃縮物を10％リン酸を使ってpH＝3.5に調整し、次いで45℃〜70℃ の範囲内の様々な温度〔45℃（Ｉ）、50℃（II）、55℃（III）および70℃（IV ）〕に加熱した。 0〜60分の範囲内の種々の分の後、試料を13％水酸化ナトリウムを使ってpH＝8 .0に調整し、冷却し、そしてリパーゼ活性とプロテアーゼ活性について分析した。所望のリパーゼ活性の収率を図１に示し、望ましくないプロテアーゼ活性の不活性化効率を図２に示す。 pH＝3.5で45℃にて60分間の処理が、92％のリパーゼ活性の残余収率を与え（図１）そして２％未満の望ましくないプロテアーゼ活性を与える（図２）ことがわかる。 pH=3.5で45℃にて60分間の処理を行った試料において、残余リパーゼ活性の20 ℃での安定性試験を実施した。同じバッチからの処理した濃縮物（II）と未処理の濃縮物（Ｉ）の安定性を図３に示す。このグラフは、処理した試料が100％安定であるのに対して、未処理の試料が不安定であり、ほんの貯蔵４日後には初期活性の40％を失ってしまうことを示す。実施例２プロテアーゼの不活性化この実施例は、所望のリパーゼをそのまま残す低pHでのドラム濾液中の望ましくないプロテアーゼの不活性化を記載する（培養ブロスは実施例１に記載のものと同じ）。所望のリパーゼが高度に不安定であるために、実施例１に記載したような濃縮後ではなくてドラム濾液の段階で既に本発明の方法を実施した。初めに、培養ブロスをドラム濾過による固体／液体分離にかけた。次いで、ドラム濾液を10％リン酸を使ってpH＝3.5に調整し、次いで45℃〜70℃ の範囲内の様々な温度〔45℃（Ｉ）、50℃（II）、55℃（III）、60℃（IV）およひ70℃（Ｖ）〕に加熱した。０〜60分の範囲内の種々の分の後、試料を13％水酸化ナトリウムを使ってpH＝ 8.0に調整し、冷却し、そしてリパーゼ活性とプロテアーゼ活性について分析した。所望のリパーゼ活性の収率を図４に示し、望ましくないプロテアーゼ活性の不活性化効率を図５に示す。pH=3.5で45℃にて60分間の処理が、86％のリパーゼ活性の残余収率を与えそして２％未満の望ましくないプロテアーゼ活性を与える（図２）ことがわかる。実施例３安定性試験この実施例は、所望のリパーゼをそのまま残す低pHでのドラム濾液中の望ましくないプロテアーゼの不活性化を更に説明する。初めに、培養ブロス（培養ブロスは実施例１のものと同じ）をドラム濾過による固体／液体分離にかけた。ドラム濾液を３画分に分けた。３画分全てを20℃に加熱した。第一画分を20％リン酸を使ってpH＝2.5に調整し、第二画分を13％水酸化ナトリウムを使ってpH＝10.7に調整し、そして未処理の画分とみなす第三画分をpH＝5.5に調整した。 60分後、低pH画分および高pH画分をpH＝5.5に調整した（低pH画分には13％水酸化ナトリウムを使い、そして高pH画分には20％リン酸を使って）。pH調整後、試料を５℃に冷却し、全ての画分を前記温度で14日間貯蔵した。このやり方で貯蔵中全ての画分をpH＝5.5および５℃で維持した。３画分全てから３，７，10および14日後に試料を取り、リパーゼ活性について分析した。３画分の貯蔵安定性を図６に示す。pH=2.5で60分間の酸性処理（Ｉ）がpH＝10 .7で同じく60分間のアルカリ性処理（II）（ＩもIIも共に20℃）よりも好ましいだろうということがわかる。なぜなら、酸性処理は100％安定性を与えるが、アルカリ性処理は非常に不安定であるからである。比較対照実験は、未処理の試料（III）も非常に不安定であることを示す。 pH＝2.5で20℃で60分間処理した試料は、本発明の方法を使って処理した後に1 00％安定である。所望のリパーゼの収率は60％であった。実施例４アミラーゼの不活性化この実施例は、所望のセルラーゼをそのまま残す低pHでのドラム濾液中の望ましくないアミラーゼの不活性化を記載する。フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼをアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）中でクロ−ニングすることによりWO 91/17243 に記載の通りに得られたセルラーゼを含む培養ブロスにおいて、本発明の方法の使用により、望ましくないアミラーゼを不活性化する。培養ブロスを遠心分離による固体／液体分離にかけた。続いて、遠心上清を20 kDのカットオフを有する膜を使った限外濾過にかけた。濃縮物を素早く70℃に加熱し、20％リン酸を使ってpH＝3.5に調整し、そして前記温度とpHを１分間維持した。前記維持時間の後、13％水酸化ナトリウムを使ってpHをpH＝7.0に再調整し、素早く40℃に冷却した。こうして、下記の表１に見られるように、所望のセルラーゼをそのまま残しながら望ましくないアミラーゼが不活性化された。望ましくないアミラーゼは100 ％不活性化され、所望のセルラーゼ活性の96％がそのまま残った。表１．所望のセルラーゼをそのまま残す、低pHおよび高温でのセルラーゼ／アミラーゼ混合物からの望ましくないアミラーゼの不活性化実施例５アミラーゼの不活性化この実施例は、所望のリパーゼをそのまま残す高pHでの培養ブロス中の望ましくないアミラーゼの不活性化を記載する。フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）リパーゼをアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）中でクローニングすることによりEP 305 216に記載の通りに得られたリパーゼを含む培養ブロスにおいて、本発明の方法の使用により、望ましくないアミラーゼを不活性化する。温度を35℃に維持し、次いで13％水酸化ナトリウムを使ってpHをpH＝10.7に調整し、前記pHを30分間維持することによりアミラーゼを不活性化した。培養ブロスを濾過による固体／液体分離を使って後処理し、スラッジを除去して透明な濾液を残した。13％水酸化ナトリウムを使ってpHをpH＝8.0に調整し、その液体を1 0℃に冷却した。この手順を用いることにより、下の表２に見られるように、所望のリパーゼをそのまま残しながら望ましくないアミラーゼが選択的に不活性化された。望ましくないアミラーゼは高pH処理の間に完全に不活性化され、所望のリパーゼはそのまま残った。表２．所望のリパーゼをそのまま残す、高pHおよび中温でのリパーゼ／アミラーゼ混合物からの望ましくないアミラーゼの不活性化実施例６セルラーゼの不活性化この実施例は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）からの所望のセルラーゼをそのまま残す低pHおよび中温での濃縮物中の望ましくないセルラーゼの不活性化を記載する。米国特許第4,435,307号明細書に記載した通りに得られたフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼを含む培養ブロスを、本発明の方法で処理した。 pI＝4.5を有する所望のセルラーゼは全セルラーゼ活性の約25％を占める。まず初めに、培養ブロスをドラム濾過による固体／液体分離にかけた。続いて、ドラム濾液を20 kDのカットオフを有する膜上でのＵＦ濃縮にかけた。濃縮物を20℃に調整し、次いで20％リン酸を使ってpH＝2.0に調整し、そして前記pHを60分間維持した。前記維持時間の後、13％水酸化ナトリウムを使ってpH をpH＝8.0に調整した。下記の表３に見られるように、所望のセルラーゼ活性をそのまま残しながら望ましくないセルラーゼ活性が不活性化された。表３．所望のセルラーゼをそのまま残す、低pHおよび中温での１種の所望のセルラーゼと数種類の望ましくないセルラーゼを含む混合物からの望ましくないセルラーゼの不活性化実施例７プロテアーゼの不活性化この実施例は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）からの所望のセルラーゼ混合物をそのまま残す低pH並びに低温および中温での濃縮物中の望ましくないプロテアーゼの不活性化を記載する。実施例６からわかるように、完全セルラーゼ複合体は酸性条件下で不安定である。従って、この実施例は所望の完全セルラーゼ活性複合体のための安定化成分を使用する一例である。米国特許第4,435,307号明細書に記載した通りに得られたフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼを含む培養ブロスを、本発明の方法で処理した。まず初めに、培養ブロスをドラム濾過による固体／液体分離にかけた。続いて、ドラム濾液を20 kDのカットオフを有する膜上でのＵＦ濃縮にかけた。濃縮物を表４に示すように６画分に等分した。１つを除く全ての画分に１％の量でＣＭＣを添加して、望ましくないプロテアーゼの不活性化処理中の所望のセルラーゼに対する安定効果を調べた。どの場合にも低pH値を得るのに20％リン酸を使い、どの場合にも前記pH値で60 分間維持した。前記維持時間の後、どの場合にも13％水酸化ナトリウムを使って pHをpH＝8.0に調整した。表４からわかるように、pH＝3.0でのＣＭＣの効果は、不活性化処理中のセルラーゼ収率の増加である。pHを下げる効果は、所望のセルラーゼ収率を減少させるが同時に望ましくないプロテアーゼの不活性化効率を増加させることである。温度を高くした結果は、セルラーゼ収率の減少である。表４．所望のセルラーゼをそのまま残す、ＣＭＣ使用および不使用での低pHおよび低〜中温でのセルラーゼ／プロテアーゼ混合物からの望ましくないプロテアーゼの不活性化実施例８プロテアーゼの不活性化この実施例は、所望のカタラーゼをそのまま残す、低pHでの濃縮物中の望ましくないプロテアーゼの不活性化を記載する。 WO 92/17571に記載のごとく得られたスキタリディウム・テルモフィルム（Scy talidium termophilum ）カタラーゼを含有する培養ブロスを、本発明の方法により処理した。表３に記載の通りに培養ブロスを凝集にかけた。表５．カタラーゼを含むブロスの凝集凝集させたブロスを続いてドラム濾過による固体／液体分離にかけた。濾液を２画分ＡとＢに分けた。この２画分を下表６に記載の処理にかけた。20 ％リン酸を使ってpHを調整した。表６．所望のカタラーゼと望ましくないプロテアーゼを含有する２つの同等画分の処理画分を0.5時間および１時間処理した。前記処理後、13％NaOHを使ってpH＝6.5 に調整し、そして10℃に冷却した。下表７は、処理した画分についてのカタラーゼ収率とプロテアーゼ収率を示す。カタラーゼ活性は過酸化水素の分解を使って測定した。ある特定のH₂O₂濃度における分光光度測定した吸光度の特定の減少に要する時間消費量は、カタラーゼ活性の測度である。上述したala-ala-pro-phe-ｐ−ニトロアニリド基質を使ってプロテアーゼ活性を測定した。表７．所望のカタラーゼ活性と望ましくないプロテアーゼ活性の収率 pH＝2.5で30分間だけ40℃の温度を使った画分Ｂの処理は62％のカタラーゼ活性残余収率と１％未満の望ましくないプロテアーゼ活性残余収率を与えることがわかる。画分Ａの処理は同様なプロテアーゼ不活性化を与えない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Selective inactivation of enzyme activity Technical field The present invention relates to the production of one or more undesired enzymes in an enzyme mixture containing the desired enzyme. The present invention relates to a method for inactivating an enzyme. Background art When culturing a microorganism to obtain a desired enzyme, one or more microorganisms are cultured depending on the microorganism. A number of undesirable enzymes are also often expressed. Those unwanted enzymes are effective If not specifically inactivated, they may be recovered during the recovery of the desired enzyme and / or It can cause significant stability problems during storage of the enzyme. Even those another Industries for various purposes have no side activity, even if enzymes do not cause stability problems Since they require "pure" enzymes, they would be undesirable in practice. Many solutions have been proposed to solve the above problems: Hoerle et al., In U.S. Pat.No. 4,086,139, disclosed amylase-protein Hypochlorite and chlorite for inactivating amylase in Discloses the use of ON. Bock et al. In East German Patent No. 216 955 , Polygalacturonase from the pectinase mixture by adding urea It states that it can be removed. DeStefanis et al., EP 021 197 Adjusting the pH of the system to 5.0-7.0, buffering the mixture with a buffer, and Heating the mixture to a temperature between 40 ° C and 75 ° C results in protease-amylar Bacillus in ze mixtureBacillus) It discloses that fungal proteases can be inactivated. An object of the present invention is a method for inactivating undesired enzymes in an enzyme mixture, It has a short processing time, leads to high yields and at the same time is simple, inexpensive and industrial To provide a method that meets the above requirements. Summary of the Invention Surprisingly, the use of the present invention effectively eliminates many undesirable enzymes. It was found that it could be activated. Accordingly, the present invention relates to at least one desired enzyme in an enzyme mixture containing the desired enzyme. A method of inactivating the undesirable enzymes, comprising: a) subjecting the mixture to a temperature of 2 ° C. to 75 ° C. for 5. Maintaining the pH below 0 for at least 20 seconds; and / or b) keeping the mixture Maintain a pH above 9.0 at a temperature of 5 ° C for at least 20 seconds A method comprising: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The present invention is further described by reference to the accompanying drawings. FIG. 1 shows that the experiment was performed as described in Example 1, pH 3.5 and 45 ° C. (I). Lippers for inactivation times at 50 ° C (II), 55 ° C (III) and 70 ° C (IV) The activity is shown. FIG. 2 shows that the experiment was performed as described in Example 1, pH 3.5 and 45 ° C. (I). , 50 ° C (II), 55 ° C (III) and 70 ° C (IV) Shows ase activity. FIG. 3 shows the untreated sample (I) and the pH, where the experiment was performed as described in Example 1. Using sample (II) treated at 45 ° C for 60 minutes at 3.5 The qualitative test is shown. FIG. 4 shows that the experiment was performed as described in Example 2, at pH 3.5 and at 45 ° C. (I). Inactivation times at 50 ° C (II), 55 ° C (III), 60 ° C (IV) and 70 ° C (V) 2 shows lipase activity for the lipase. FIG. 5 shows that the experiment was performed as described in Example 2, at pH 3.5 and at 45 ° C. (I). Inactivation times at 50 ° C (II), 55 ° C (III), 60 ° C (IV) and 70 ° C (V) 4 shows protease activity for the same. FIG. 6 shows three different lipase samples where the experiment was performed as described in Example 3. : Sample (I) treated at pH 2.5 at 20 ° C for 60 minutes, treated at pH 10.7 at 20 ° C for 60 seconds 3 shows stability tests using a sample (II) and an untreated sample (III). Detailed description of the invention The present invention relates to a method for preparing at least one desired enzyme in an enzyme mixture containing the desired enzyme. A method of inactivating the enzyme, a) maintaining the mixture at a temperature between 2 ° C. and 75 ° C. at a pH below 5.0 for at least 20 seconds; And / or b) maintaining the mixture at a temperature between 2 ° C. and 75 ° C. and at a pH above 9.0 for at least 20 seconds A method comprising the steps of: The principle utilized in the present invention is that the enzyme is acidic (pH below 5.0) or alkaline. Or any condition of pH (higher than 9.0). Departure The authors attribute this fact to the temperature tolerance of the enzyme in question (2 ° C to 75 ° C) and the desired enzyme. Optimal conditions for preserving most of the base and inactivating most of the undesirable enzymes Combined with the time to maintain the enzyme mixture at the above conditions to obtain for that reason A system that can change three parameters: pH, temperature and maintenance time The method is operated in. It may be advantageous to add a stabilizer that stabilizes the desired enzyme. This stabilizer should be added before using the method of the present invention. Of such stabilizers Examples are inhibitors, cofactors or substrates for the desired enzyme. Enzymes are inhibitors, supplements Bound to a factor or substrate, such as carboxymethylcellulose (CMC) It is well known in the art that it becomes even more stable. Example using CMC Is given in Example 7. It may also be advantageous to add a destabilizing agent to destabilize the undesired enzymes. This destabilizing agent should be added before using the method of the present invention. Useful destabilizers Complexing agents, especially metal ion complexing agents, such as EDTA and EGTA. In addition, stabilizers that stabilize the desired enzyme and non-stabilizing agents that destabilize unwanted enzymes It may also be advantageous to add both of the stabilizers.Unwanted enzymes The most common undesirable enzymes are that they can break down proteins. It is a proteolytic enzyme (protease, peptidase) Since the element is a protein, proteolytic enzymes can degrade the desired enzyme. However, in practice, for example, any yeast obtained from animals, plants or microorganisms Element can be an undesirable enzyme. Because the industry is increasingly "pure" enzymes, Or a "one-component" enzyme, i.e. any enzyme activity other than the desired one Because it is unnecessary. Undesirable enzymes include any enzymes, especially lipases, amylases, cellulases, Oxidoreductase, xylanase, isomerase, peptidase and pro An enzyme selected from the group consisting of Can get.Desired enzyme For example, any enzyme obtained from a microorganism, animal or plant will be the desired enzyme. obtain. In particular, lipase, amylase, cellulase, oxidoreductase, Selected from the group consisting of lanase, isomerase, peptidase and protease Preferred enzymes are preferred. The method according to the invention is characterized in that the desired enzyme is a microorganism, animal or plant, especially a fungus, preferably Is a filamentous fungus such as Aspergillus (Aspergillus ), E.g. Orize (A . o ryzae ), A. Niger (A . niger) Or Humicola (Humicola), E.g. Insolence (H. insolensParticularly useful when obtained from Especially clone desired enzymes in filamentous fungi such as Aspergillus and Humicola To remove unwanted enzymes, typically small amounts of protease activity There is currently a problem in getting rid of. The amount of undesirable enzyme present is typically Very low, often undetectable by standard methods, Disable Element destabilizes the cloned enzyme (the desired enzyme). Using the method of the present invention Makes it possible to inactivate those very small amounts of proteolytic activity. To obtain a product with very good stability (see Examples 1).Enzyme mixture The method of the invention can be applied to any enzyme mixture containing at least two enzymes. Can be used. This method is used when the enzyme mixture is a fermentation broth. Particularly useful. The method of the present invention comprises an untreated culture broth (as is culture broth); Homogenized culture broth; or, for example, dilution with water and / or Or one or more solid / liquid separation techniques, such as agglomeration, centrifugation, filtration, e.g. For example, it has been subjected to drum filtration or filter pressure filtration, or membrane separation, Neat or homogenous, optionally followed by membrane concentration or evaporation It can be applied to a cultivated broth. According to the present invention, membrane concentration may be performed using any membrane device known in the art. With hollow fiber, spiral round or plate and frame Preferably, the membrane concentration is performed using an ultrafiltration technique, such as a filtration device. Preferred cut The off value depends on the nature of the enzyme in question, but is usually cut-off in the range of 1-100 kD. Values are preferred. Prior to inactivating unwanted enzyme activity in accordance with the present invention, various enzyme solutions may be used. Methods, such as filtration, chromatographic methods, adsorption and / or precipitation / crystallization Further purification may be achieved by using the method. . If the desired enzyme is very unstable, after fermentation, typically after filtration, One or more undesirable as soon as possible after centrifugation or drum filtration It may be advisable to inactivate the enzyme. If the desired enzyme is not very unstable, the fermentation broth is purified and concentrated. It may be advantageous to wait for inactivation, typically until filtration and ultrafiltration unknown. After performing the inactivation according to the invention, the enzyme product is processed in the usual manner and immediately In various ways, for example, filtration, concentration, chromatography, adsorption and / or Or it may be further purified by using precipitation / crystallization methods. In some cases, it only inactivates one or more undesirable enzymes, and Inactivates one or more undesirable enzymes. It may be advantageous to remove it. Removal of unwanted enzymes is typically This is done by a body / liquid separation operation.Use of the Act Enzyme mixture containing one desired enzyme and one or more undesired enzymes When there is, first examine the pH curve for the desired enzyme, and It is advisable to know which has the optimal value on the sex side or on the acid side. Desired enzyme If has an optimal value on the acidic side, it is usually not destroyed at pH below 5.0. Means Thus, different pH values (eg pH 4.5, pH 4.0, pH 3.5) Temperature values (eg, 40 ° C., 50 ° C., 60 ° C., 70 ° C.) and various maintenance times (eg, 1 minute, (5 minutes, 60 minutes, 240 minutes). this By doing so, most of the desired enzyme is retained and most of the undesired enzyme is retained. The optimal conditions under which the part is inactivated can be found. According to the invention, it is preferred to keep the pH as acidic or alkaline as possible. The enzyme mixture is brought to a pH below 4.5, especially below pH 4.0, especially below 3.5 Adjust the pH of the enzyme mixture to a pH above 9.5, especially above about 10.0. A method of adjusting to a high pH is preferred. According to the invention, the temperature is in the range from 2 to 75 ° C, especially in the range from 10 to 70 ° C, preferably 25 ° C. It should be kept in the range of 6565 ° C., more preferably in the range of 40-60 ° C. According to the present invention, the pH is adjusted first and then the solution is heated / cooled to the desired temperature. Or (as described in Example 1) or first heat / cool the solution to the desired temperature. The pH can be adjusted afterwards (as described in Example 3). The maintenance time can be anywhere from 20 seconds to several weeks, and is typically maintained. The holding time ranges from 1 minute to 24 hours, preferably from 1 minute to 4 hours. Would. Depending on the desired and undesired enzymes in question, How much should be inactivated and how long the desired enzyme should be maintained Is difficult to affirm. In general, the initial level of 15 after inactivation according to the invention is Reduction of undesired enzymes to a level of less than 10% is preferred, especially the inactivation according to the invention. Reduction of undesirable enzymes to less than 10% of the initial level after More preferably to a level of less than 2% of the initial level after inactivation according to the invention Is preferred, especially after inactivation according to the invention, a level of less than 1% of the initial level. Is preferred. Usually only half of the desired enzyme is allowed to be inactivated, so The desired enzyme level is greater than 50% of the initial level after inactivation according to the invention. Especially after the inactivation according to the invention is greater than 60% of the initial level, preferably After inactivation according to the invention is greater than 75% of the initial level, even more preferably It is preferably greater than 85% of the initial level after inactivation according to the invention.pH Adjustment Virtually any acid or base can be used to adjust the pH. No acid It can be a mechanical or organic acid. Some examples are hydrochloric acid, sulfuric acid, nitrous acid, phosphorus Acids, acetic acid, citric acid and formic acid. Preferred acids are formic acid, citric acid and acetic acid. Preferred base is sodium hydroxide Potassium hydroxide and ammonium hydroxide, especially sodium hydroxide. preferable. The following examples further illustrate the invention. They are patented in any form It is not intended to limit the scope of the claims. In an example, the enzyme activity is determined using one of the following assays. It was measured.Measurement of lipase activity The lipase activity in Examples 1, 2, 3, 4 and 5 was determined by using glycerol as a substrate. Assay using tributyrate and gum arabic as emulsifier . 1 LU (lipase unit) is 1 micromol per minute at 30 ° C. and pH 7.0. The amount of enzyme that releases butyric acid that can be titrated. Lipase activity is radiometer drops Determined by pH-stat using VIT90 (Radiometer, Copenhagen) .Measurement of protease activity The protease activity in Examples 1, 2, 3 and 8 was determined by using ala-ala- Quantification was performed using pro-phe-p-nitroanilide. Hydrolyzed to p-nitroa Nilide (pNA) groups are released, producing a yellow color spectrophotometrically at 405 nm You. The reaction conditions are 30 ° C, pH 9.5 using 0.05 M boric acid / KCl buffer, and the substrate concentration Was 2.5 mM pNA-peptide. Temporal changes in absorbance at 405 nm were measured using an automatic measurement system <Cobas> FARA . One unit of activity (1 U) hydrolyzes 1 micromol of pNA-peptide per minute. It was defined as the amount of enzyme that could be solved.Measurement of cellulase activity (endglucanase activity) using a viscometer and CMC The cellulase activity of Example 7 was measured using carboxymethylcellulose (CM C) Quantification was performed using (Hercules 7LFD). Incubation when hydrolyzed Since the viscosity of the mixture decreased, the viscosity was measured using a vibrating viscometer. ink The incubation is performed at pH = 9.0 in 0.1 M Tris at 40 ° C. for 30 minutes. Viscosity is vibrating rod viscosity A total was measured using MIVI 3000 (Sofrase).Measurement of cellulase activity (endoglucanase activity) using IEF and -CMC The cellulase activity of Example 6 was determined by isoelectric focusing using a CMC top agar overcoat layer. Assay was performed using electrophoresis (IEF). Pharmacia Ampholine PAGp for IEF late, pH 3.5-9.5 was used (code number 80-1124-80). Top agar was prepared using 0.5% CMC (Her) in Tris-maleate buffer (pH = 7). cules 7 LFD) + 1% agarose (Litex LSA). Boiling suspension For 5 minutes and then cooled to 55 ° C. After isoelectric focusing, use a Tris-maleate buffer (pH = 7) for 1 hour. To remove the pH gradient. Then put the top agar on the gel I poured it. Confirmation was made after 6 hours at 45 ° C. Tris-maleate buffer (pH = 7) After injecting the solution of 0.7% Congo Red in the top agar, Leave for 0 minutes, 1 M NaCl / H_TwoDecolorize with O for 2 × 10 minutes. Endoglucanase activity is detected as a clear zone above a red background. Will be issued. Quantification was performed on a BioImage gel scan device. Scanned zo Represents the amount of cellulase activity.Measurement of protease activity using IEF and casein The protease activity of Example 7 was determined by isoelectric using casein-top agar overcoat. Performed using point electrophoresis. PharmaciaAmpholine PAGplate, pH 3. I used 5-9.5 (code number 80-1124-80). Top agar is 1% casein + 1 in Tris-maleate buffer (pH = 7) % Agarose (Litex LSA). Agarose to boiling point 5 Heated for minutes and then cooled to 55 ° C. After isoelectric focusing, tris-maleic acid buffer 1 using a buffer (pH = 7) The pH gradient was removed by flushing for hours. 1 volume of 1% casein and 1 After mixing a volume of 1% agarose, the top agar was poured over the gel. Protease activity is detected as a precipitation zone of hydrolyzed casein. Quantification was performed on a BioImage gel scan device. The scanned zone is protected Represents the amount of ase activity.Example 1 Protease inactivation This example demonstrates that the desired lipase in the concentrate at low pH remains intact. Inactivation of unwanted proteases is described. Candida Antarctica (Candida antarctica) Lipase B to Asperghi Lus Orize (Aspergillus oryzaeWO) by cloning in the host Present in culture broth containing lipase B obtained as described in 8/02775 Inactivate unwanted proteases according to the method of the invention. First, the culture broth was subjected to solid / liquid separation by drum filtration. The drum filtrate is then concentrated by ultrafiltration (UF) on a membrane with a cut-off of 20 kD. Shrinking. The concentrate is adjusted to pH = 3.5 using 10% phosphoric acid, then 45-70 ° C Temperature (45 ° C (I), 50 ° C (II), 55 ° C (III) and 70 ° C (IV )]. After various minutes in the range of 0-60 minutes, the sample was pH adjusted to 8 using 13% sodium hydroxide. .0, cooled and analyzed for lipase and protease activity . The yield of the desired lipase activity is shown in FIG. The activation efficiency is shown in FIG. Treatment at pH = 3.5 at 45 ° C for 60 minutes leaves 92% lipase activity residual And yields less than 2% of undesired protease activity (FIG. 1). 2). In a sample treated at 45 ° C. for 60 minutes at pH = 3.5, the residual lipase activity was 20%. A stability test at 0 C was performed. Treated concentrate (II) and untreated from the same batch FIG. 3 shows the stability of the concentrate (I). This graph shows that the treated sample is 100% stable while the untreated sample is not. It is stable, indicating that it loses 40% of its initial activity after only 4 days of storage.Example 2 Protease inactivation This example demonstrates that the desired lipase in the drum filtrate at low pH remains intact. The inactivation of undesired proteases is described (the culture broth is as described in Example 1). Same as). Because the desired lipase is highly unstable, it is described in Example 1. The method of the invention was already carried out at the stage of the drum filtrate, rather than after such concentration. First, the culture broth was subjected to solid / liquid separation by drum filtration. The drum filtrate is then adjusted to pH = 3.5 using 10% phosphoric acid, then 45-70 ° C. Temperature (45 ° C (I), 50 ° C (II), 55 ° C (III), 60 ° C (IV) and To 70 ° C (V)]. After various minutes in the range of 0-60 minutes, the sample was pH adjusted using 13% sodium hydroxide. Adjust to 8.0, cool and analyze for lipase and protease activity Was. The yield of the desired lipase activity is shown in FIG. The activation efficiency is shown in FIG. Treatment at pH = 3.5 at 45 ° C for 60 minutes results in 86% lipase activity And yields less than 2% of undesired protease activity ( 2).Example 3 Stability test This example demonstrates that the desired lipase in the drum filtrate at low pH remains intact. The inactivation of unwanted proteases is further explained. First, the culture broth (the culture broth is the same as that of Example 1) was filtered by drum filtration. Subject to solid / liquid separation. The drum filtrate was divided into three fractions. Bring all three fractions to 20 ° C Heated. The first fraction is adjusted to pH = 2.5 using 20% phosphoric acid and the second fraction is adjusted to 13% water Third fraction, adjusted to pH = 10.7 with sodium oxide and considered as untreated fraction The minute was adjusted to pH = 5.5. After 60 minutes, the low and high pH fractions were adjusted to pH = 5.5 (13% water was added to the low pH fraction). Using sodium oxide and 20% phosphoric acid for the high pH fraction). After pH adjustment The sample was cooled to 5 ° C and all fractions were stored at that temperature for 14 days. Save this way All fractions in the storage were maintained at pH = 5.5 and 5 ° C. 3,7,10 from all 3 fractions Samples were taken after 14 days and analyzed for lipase activity. The storage stability of the three fractions is shown in FIG. Acid treatment (I) for 60 minutes at pH = 2.5, pH = 10 .7 is also preferable to the alkaline treatment (II) for 60 minutes (both I and II at 20 ° C) It will be understood that it will be. Because acid treatment gives 100% stability, This is because the luka treatment is very unstable. Control experiments were performed on untreated samples (III) also shows that it is very unstable. Samples treated at pH = 2.5 at 20 ° C. for 60 minutes are treated with the method of the present invention for 1 minute. 00% stable. The yield of the desired lipase was 60%.Example 4 Amylase inactivation This example demonstrates that the desired cellulase in the drum filtrate at low pH remains intact. Incorrect amylase inactivation is described. Humicola Insolence (Humicola insolens) Cellulase to Aspergillus ・ Orize (Aspergillus oryzaeCloning in WO 91/17243 In a culture broth containing cellulase obtained as described in Use inactivates unwanted amylase. The culture broth was subjected to solid / liquid separation by centrifugation. Then, centrifuge the supernatant for 20 minutes. Ultrafiltration using a membrane with a cut-off of kD. Concentrate quickly to 70 ° C Heat, adjust to pH = 3.5 using 20% phosphoric acid, and maintain the temperature and pH for 1 minute. I carried it. After the maintenance time, adjust the pH to pH = 7.0 using 13% sodium hydroxide. And cooled quickly to 40 ° C. Thus, as seen in Table 1 below, do not leave the desired cellulase intact. Undesirably, the amylase was inactivated. 100 unwanted amylase % Inactivated, leaving 96% of the desired cellulase activity. Table 1. Cellulase / amidation at low pH and high temperature, leaving the desired cellulase intact Inactivation of undesired amylase from an enzyme mixtureExample 5 Amylase inactivation This example demonstrates that the desired lipase can be maintained in culture broth at high pH while leaving it intact. Inactive amylase inactivation is described. Humicola Insolence (Humicola insolens) Lipase to Aspergillus Orize (Aspergillus oryzaeDescribed in EP 305 216 by cloning in Use of the method of the invention in a culture broth containing lipase obtained as described More, it inactivates unwanted amylase. Maintain the temperature at 35 ° C. and then adjust the pH to pH = 10.7 using 13% sodium hydroxide. Amylase was inactivated by maintaining the pH for 30 minutes. Culture broth The sludge is worked up using solid / liquid separation by filtration, the sludge is removed and the The liquid was left. Adjust the pH to pH = 8.0 using 13% sodium hydroxide and dispense the liquid with 1 Cooled to 0 ° C. By using this procedure, the desired lipase can be obtained as seen in Table 2 below. Undesired amylase was selectively inactivated while remaining intact. Desiring The less amylase is completely inactivated during the high pH treatment and the desired lipase is Remained. Table 2. Lipase / Amirror at high pH and medium temperature, leaving desired lipase intact Inactivation of undesired amylase from zeo mixtureExample 6 Cellulase inactivation This embodiment is based on the Humicola Insolence (Humicola insolensDesired from) Unwanted cellular in concentrate at low pH and medium temperature leaving cellulase intact Inactivation of zeolites is described. Humicola insole obtained as described in U.S. Patent No. 4,435,307. (Humicola insolens) The culture broth containing cellulase is treated by the method of the present invention. I understood. The desired cellulase having a pI = 4.5 accounts for about 25% of the total cellulase activity. First, the culture broth was subjected to solid / liquid separation by drum filtration. continue The drum filtrate was subjected to UF concentration on a membrane with a 20 kD cutoff. Adjust the concentrate to 20 ° C., then adjust the pH to 2.0 using 20% phosphoric acid, and The pH was maintained for 60 minutes. After said holding time, the pH is adjusted using 13% sodium hydroxide. Was adjusted to pH = 8.0. As shown in Table 3 below, the desired cellulase activity was Bad cellulase activity was inactivated. Table 3. One desired cell at low pH and medium temperature, leaving the desired cellulase intact Undesired cells from a mixture containing an enzyme and several undesired cellulases Inactivation of the enzymeExample 7 Protease inactivation This embodiment is based on the Humicola Insolence (Humicola insolensDesired from) Desirable in concentrates at low pH and low and medium temperatures leaving the cellulase mixture intact Inactive protease inactivation is described. As can be seen from Example 6, complete Cellulase complexes are unstable under acidic conditions. Therefore, this embodiment has the desired completion. 1 is an example of using a stabilizing component for a whole cellulase activity complex. Humicola insole obtained as described in U.S. Patent No. 4,435,307. (Humicola insolens) The culture broth containing cellulase is treated by the method of the present invention. I understood. First, the culture broth was subjected to solid / liquid separation by drum filtration. continue The drum filtrate was subjected to UF concentration on a membrane with a 20 kD cutoff. The concentrate was divided into six fractions as shown in Table 4.Except one1% for all fractions Of CMC in the desired amount during the inactivation of undesired proteases. The stabilizing effect on lulase was investigated. In each case, 20% phosphoric acid is used to obtain a low pH value, and in each case 60% at said pH value. Maintained for minutes. After said holding time, in each case using 13% sodium hydroxide The pH was adjusted to pH = 8.0. As can be seen from Table 4, the effect of CMC at pH = 3.0 was due to the cell being inactivated. This is an increase in the yield of the enzyme. The effect of lowering the pH reduces the desired cellulase yield But at the same time increase the inactivation efficiency of undesirable proteases. The result of increasing the temperature is a decrease in cellulase yield. Table 4. Low pH and pH with and without CMC leaving the desired cellulase intact Proteases from cellulase / protease mixtures at low and medium to high temperatures Inactivation of zeExample 8 Protease inactivation This example demonstrates the desirability of the desired catalase in concentrate at low pH, leaving the desired catalase intact. Inactivation of unwanted proteases is described. Squitalidium thermofilm obtained as described in WO 92/17571 (Scy talidium termophilum ) A culture broth containing catalase is used in the method of the present invention. More processed. The culture broth was subjected to aggregation as described in Table 3. Table 5. Aggregation of broth containing catalase The agglomerated broth was subsequently subjected to solid / liquid separation by drum filtration. The filtrate was divided into two fractions A and B. These two fractions were subjected to the processing described in Table 6 below. 20 The pH was adjusted using% phosphoric acid. Table 6. Contains desired catalase and unwanted protease Processing of two equivalent fractions Fractions were processed for 0.5 and 1 hour. After the above treatment, pH = 6.5 using 13% NaOH. And cooled to 10 ° C. Table 7 below shows the catalase and protease yields for the treated fractions. You. Catalase activity was measured using the decomposition of hydrogen peroxide. Certain H_TwoO_TwoTo the concentration The time required for a specific decrease in the absorbance measured spectrophotometrically is catalase It is a measure of activity. Protease activity using ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide substrate described above Was measured. Table 7. Yield of desired catalase activity and unwanted protease activity Treatment of Fraction B using a temperature of 40 ° C. for 30 minutes at pH = 2.5 resulted in a 62% catalase activity To provide a residual residue yield of less than 1% and an undesirable residual protease activity. Understand. Treatment of fraction A does not give similar protease inactivation.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月５日（１９９８．１．５）【補正内容】請求の範囲１．所望の酵素を含有する酵素混合物中のプロテアーゼの不活性化方法であって、前記酵素が真菌により生産され、前記混合物を２℃〜75℃の温度で4.5より下のpHに少なくとも20秒間維持する段階を含んで成る方法。２．前記所望の酵素がリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、キシラナーゼ、イソメラーゼ、プロテアーゼおよびペプチダーゼから成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。３．前記酵素混合物が培養ブロス、特に清澄化した培養ブロスである、請求項１に記載の方法。４．前記酵素混合物が、清澄化し且つ濃縮した培養ブロスである、請求項３に記載の方法。５．前記酵素がアスペルギルス（Aspergillus）またはフミコラ（Humicola）により生産される、請求項１に記載の方法。６．前記酵素混合物が4.0より低いpHに調整される、請求項１に記載の方法。７．前記酵素混合物が10〜70℃の範囲、好ましくは25〜65℃の範囲、より好ましくは40〜60℃の範囲の温度で維持される、請求項１に記載の方法。８．前記望ましくない酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの15％未満であり、特に前記不活性化後に初期レベルの２％未満である、請求項１に記載の方法。９．前記所望の酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの50％より高く、特に前記不活性化後に初期レベルの75％より高い、請求項１に記載の方法。 10．前記望ましくない酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レべルの15％未満であり、特に前記不活性化後に初期レベルの２％未満であり、且つ前記所望の酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの50％より高く、特に前記不活性化後に初期レベルの75％より高い、請求項８または９に記載の方法。 11．２以上の酵素が所望である、請求項１に記載の方法。 12．該方法の前に、少なくとも１種の安定剤が添加される、請求項１に記載の方法。 13．該方法の前に、少なくとも１種の不安定剤が添加される、請求項１に記載の方法。 14．該方法の前に、所望の酵素を安定にする少なくとも１種の安定剤と、望ましくない酵素を不安定にする少なくとも１種の不安定剤が添加される、請求項１に記載の方法。 15．請求項１に記載の方法により得られる酵素生成物。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] January 5, 1998 (1998.1.5) [Details of Amendment] Scope of Claim 1. A method for inactivating a protease in an enzyme mixture containing a desired enzyme, wherein the enzyme is produced by a fungus and maintaining the mixture at a temperature of 2C to 75C at a pH below 4.5 for at least 20 seconds. A method comprising steps. 2. The method of claim 1, wherein the desired enzyme is selected from the group consisting of lipase, amylase, cellulase, oxidoreductase, xylanase, isomerase, protease and peptidase. 3. 2. The method according to claim 1, wherein the enzyme mixture is a culture broth, in particular a clarified culture broth. 4. 4. The method of claim 3, wherein the enzyme mixture is a clarified and concentrated culture broth. 5. The method according to claim 1, wherein the enzyme is produced by Aspergillus or Humicola . 6. 2. The method of claim 1, wherein the enzyme mixture is adjusted to a pH below 4.0. 7. The method according to claim 1, wherein the enzyme mixture is maintained at a temperature in the range of 10-70C, preferably in the range of 25-65C, more preferably in the range of 40-60C. 8. 2. The method of claim 1, wherein the level of the undesired enzyme is less than 15% of the initial level after the inactivation, especially less than 2% of the initial level after the inactivation. 9. 2. The method according to claim 1, wherein the level of the desired enzyme is higher than 50% of the initial level after the inactivation, especially higher than 75% of the initial level after the inactivation. Ten. The level of the undesired enzyme is less than 15% of the initial level after the inactivation, particularly less than 2% of the initial level after the inactivation, and the level of the desired enzyme is less than the initial level. 10. The method according to claim 8 or 9, wherein after activation, more than 50% of the initial level, in particular after the inactivation, more than 75% of the initial level. 11. The method of claim 1, wherein two or more enzymes are desired. 12． The method according to claim 1, wherein at least one stabilizer is added before said method. 13. The method of claim 1, wherein at least one destabilizing agent is added prior to said method. 14. The method of claim 1, wherein prior to the method, at least one stabilizer that stabilizes the desired enzyme and at least one destabilizing agent that destabilizes the undesired enzyme are added. 15． An enzyme product obtained by the method according to claim 1.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

【特許請求の範囲】１．所望の酵素を含有する酵素混合物中の少なくとも１つの望ましくない酵素の不活性化方法であって、ａ）該混合物を２℃〜75℃の温度で5.0より低いpHで少なくとも20秒間維持し；そして／またはｂ）該混合物を２℃〜75℃の温度で9.0より高いpHで少なくとも20秒間維持する段階を含んで成る方法。２．前記望ましくない酵素がプロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、オキシドレダクターゼおよびキシラナーゼから成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。３．前記所望の酵素がリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、キシラナーゼ、イソメラーゼ、プロテアーゼおよびペプチダーゼから成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。４．前記酵素混合物が培養ブロス、特に清澄化した培養ブロスである、請求項１に記載の方法。５．前記酵素混合物が、清澄化し且つ濃縮した培養ブロスである、請求項４に記載の方法。６．前記酵素が真菌、特に糸状菌により生産される、請求項１に記載の方法。７．前記酵素がアスペルギルス（Aspergillus）またはフミコラ（Humicola）により生産される、請求項６に記載の方法。８．前記酵素混合物が4.5より低いpH、特に4.0より低いpHに調整される、請求項１に記載の方法。９．前記酵素混合物が9.5より高いpH、特に10.0より高いpHに調整される、請求項１に記載の方法。 10．前記酵素混合物が２〜75℃の範囲、特に10〜70℃の範囲、好ましくは25〜 65℃の範囲、より好ましくは40〜60℃の範囲の温度で維持される、請求項１に記載の方法。 11．前記望ましくない酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの15％未満、特に前記不活性化後に初期レベルの２％未満である、請求項１に記載の方法。 12．前記所望の酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの50％より高い、特に前記不活性化後に初期レベルの75％より高い、請求項１に記載の方法。 13．前記望ましくない酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの15％未満、特に前記不活性化後に初期レベルの２％未満であり、且つ前記所望の酵素のレベルが、前記不活性化後に初期レベルの50％より高い、特に前記不活性化後に初期レベルの75％より高い、請求項11または12に記載の方法。 14．２以上の酵素が所望である、請求項１に記載の方法。 15．該方法の前に、少なくとも１種の安定剤が添加される、請求項１に記載の方法。 16．該方法の前に、少なくとも１種の不安定剤が添加される、請求項１に記載の方法。 17．該方法の前に、所望の酵素を安定にする少なくとも１種の安定剤と、望ましくない酵素を不安定にする少なくとも１種の不安定剤が添加される、請求項１に記載の方法。 18．請求項１に記載の方法により得られる酵素生成物。[Claims] 1. A method for inactivating at least one undesired enzyme in an enzyme mixture containing the desired enzyme, comprising: a) maintaining the mixture at a temperature of 2 ° C to 75 ° C at a pH below 5.0 for at least 20 seconds; and And / or b) maintaining the mixture at a temperature of 2 ° C. to 75 ° C. at a pH above 9.0 for at least 20 seconds. 2. 2. The method according to claim 1, wherein the undesired enzyme is selected from the group consisting of a protease, a peptidase, an amylase, a cellulase, a lipase, an isomerase, an oxidoreductase and a xylanase. 3. The method of claim 1, wherein the desired enzyme is selected from the group consisting of lipase, amylase, cellulase, oxidoreductase, xylanase, isomerase, protease and peptidase. 4. 2. The method according to claim 1, wherein the enzyme mixture is a culture broth, in particular a clarified culture broth. 5. 5. The method of claim 4, wherein the enzyme mixture is a clarified and concentrated culture broth. 6. 2. The method according to claim 1, wherein the enzyme is produced by a fungus, in particular a filamentous fungus. 7. 7. The method of claim 6, wherein the enzyme is produced by Aspergillus or Humicola . 8. The method according to claim 1, wherein the enzyme mixture is adjusted to a pH lower than 4.5, in particular a pH lower than 4.0. 9. 2. The method according to claim 1, wherein the enzyme mixture is adjusted to a pH higher than 9.5, in particular a pH higher than 10.0. Ten. 2. The method according to claim 1, wherein the enzyme mixture is maintained at a temperature in the range from 2 to 75C, especially in the range from 10 to 70C, preferably in the range from 25 to 65C, more preferably in the range from 40 to 60C. Method. 11． 2. The method of claim 1, wherein the level of the undesired enzyme is less than 15% of the initial level after the inactivation, particularly less than 2% of the initial level after the inactivation. 12． 2. The method of claim 1, wherein the level of the desired enzyme is greater than 50% of the initial level after the inactivation, particularly greater than 75% of the initial level after the inactivation. 13. The level of the undesired enzyme is less than 15% of the initial level after the inactivation, particularly less than 2% of the initial level after the inactivation, and the level of the desired enzyme is less than the initial level after the inactivation. 13. The method according to claim 11 or 12, wherein the method is higher than 50% of the level, especially higher than 75% of the initial level after said inactivation. 14. The method of claim 1, wherein two or more enzymes are desired. 15． The method according to claim 1, wherein at least one stabilizer is added before said method. 16． The method of claim 1, wherein at least one destabilizing agent is added prior to said method. 17． The method of claim 1, wherein prior to the method, at least one stabilizer that stabilizes the desired enzyme and at least one destabilizing agent that destabilizes the undesired enzyme are added. 18． An enzyme product obtained by the method according to claim 1.