JP2000346843A - Immunological many-item measuring method - Google Patents
Immunological many-item measuring methodInfo
- Publication number
- JP2000346843A JP2000346843A JP11155521A JP15552199A JP2000346843A JP 2000346843 A JP2000346843 A JP 2000346843A JP 11155521 A JP11155521 A JP 11155521A JP 15552199 A JP15552199 A JP 15552199A JP 2000346843 A JP2000346843 A JP 2000346843A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immunoreactant
- microtiter plate
- complementary
- container
- magnetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に含まれる
２種以上の抗原又は抗体を同一試料から一連の操作で検
定することができる免疫学的多項目検定方法に関する。[0001] The present invention relates to an immunological multi-item assay method capable of assaying two or more antigens or antibodies contained in a sample from the same sample by a series of operations.
【０００２】[0002]
【従来の技術】同一の試料に含まれる二種以上の抗原又
は抗体を検定するには、従来、各抗原又は各抗体ごとに
検定作業を行う必要があった。一つの試料から一連の操
作により簡便、迅速に測定することができる検定方法は
知られていない。2. Description of the Related Art Conventionally, in order to assay two or more antigens or antibodies contained in the same sample, it was necessary to carry out an assay for each antigen or antibody. An assay method that can easily and quickly measure a single sample by a series of operations is not known.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、固相法において不溶性固相として磁性粒子を使用す
ることにより、一つの試料液から一連の操作で複数の抗
原又は抗体を検定することができる免疫学的多項目検定
方法を提供することにある。Accordingly, an object of the present invention is to use a magnetic particle as an insoluble solid phase in a solid phase method to assay a plurality of antigens or antibodies from one sample solution by a series of operations. It is an object of the present invention to provide an immunological multi-item test method that can be used.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記の
目的は、次の方法により達成される。試料中に存在する
免疫反応体を、不溶性固相に固定され前記免疫反応体と
特異的に結合する相補的免疫反応体と容器内で液体媒体
中において反応させる段階と、該反応に関与した免疫反
応体を標識物質を用いて検定する段階とを有する、固相
法により免疫反応体検定する方法において、（ｉ） 前
記試料が検定対象として二種以上の免疫反応体を含有
し、（ii） 該二種以上の免疫反応体のそれぞれと特異
的に結合する二種以上の相補的免疫反応体を用いるこ
と、（iii） 前記不溶性固相として磁性粒子が用いら
れ、前記二種以上の相補的免疫反応体が別々に磁性粒子
に固定されていること、（iv） 前記の免疫反応体と相
補的免疫反応体との反応により得られた複合体を反応液
体からの分離、洗浄を、前記容器外から磁場を印加し、
該複合体を容器内壁に磁気分離し保持して行うこと、
（v） 上記二種以上の免疫反応体ごとに異なる標識物
質とを用いること、（vi） 前記の標識物質を用いる検
定段階が、各免疫反応体ごとに順次行われること、を特
徴とする、免疫学的多項目検定方法。According to the present invention, the above object is achieved by the following method. Reacting an immunoreactant present in the sample with a complementary immunoreactant immobilized on an insoluble solid phase and specifically binding to the immunoreactant in a liquid medium in a container; Assaying the reactant using a labeling substance, the method comprising the steps of: (i) the sample contains two or more immunoreactants to be assayed; and (ii) Using two or more complementary immunoreactants that specifically bind to each of the two or more immunoreactants; (iii) magnetic particles are used as the insoluble solid phase, and the two or more complementary immunoreactants are used. (Iv) separating and washing the complex obtained by the reaction between the immunoreactant and the complementary immunoreactant from the reaction liquid, wherein the immunoreactant is separately fixed to the magnetic particles; Apply a magnetic field from outside,
Magnetically separating and holding the complex on the inner wall of the container;
(V) using a different labeling substance for each of the two or more immunoreactants, and (vi) performing an assay step using the labeling substance for each immunoreactant sequentially. Immunological multi-item test method.
【０００５】[0005]
【発明の実施の形態】本明細書において、「免疫反応
体」とは抗原又は抗体を意味し、「相補的免疫反応体」
とは当該免疫反応体（抗原又は抗体）と特異的に結合す
る対応する免疫反応体（抗体又は抗原）を意味する。以
下、本発明をより具体的に説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION As used herein, the term "immunoreactant" means an antigen or antibody, and "complementary immunoreactant".
Means a corresponding immunoreactant (antibody or antigen) that specifically binds to the immunoreactant (antigen or antibody). Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
【０００６】本発明の方法は、不溶性固相として磁場の
印加により液体試料から容易に分離することができる磁
性粒子を使用してＢ／Ｆ分離をおこない、かつ検定対象
である免疫反応体ごとに標識を使い分けることにより、
一試料の多項目を簡便、迅速に行うことができる方法で
ある。具体的には、従来公知のサンドイッチ法、ワンス
テップサンドイッチ法、競合法に応用することが可能で
ある。さらにビオチン標識抗体または抗原を用いた場合
はビオチンアビジンシステムを用い、酵素や蛍光物質、
化学発光物質を標識したアビジンも反応に用いることも
できる。The method of the present invention performs B / F separation using magnetic particles which can be easily separated from a liquid sample by applying a magnetic field as an insoluble solid phase, and for each immunoreactant to be assayed. By using different signs,
This is a method that can easily and quickly perform multiple items on one sample. Specifically, it can be applied to conventionally known sandwich methods, one-step sandwich methods, and competitive methods. If a biotin-labeled antibody or antigen is used, use a biotin-avidin system to detect enzymes, fluorescent substances,
Avidin labeled with a chemiluminescent substance can also be used in the reaction.
【０００７】本発明の一形態においては、前記の不溶性
固相として前記容器の内壁面が一つの免疫反応体を固定
化するのに使用される。In one embodiment of the present invention, the inner wall surface of the container is used as the insoluble solid phase to immobilize one immunoreactant.
【０００８】シグナルの測定はマイクロプレートのウェ
ルに残った酵素に基質を加えて一定時間反応させた後、
測定する。加える基質を変えることで比色、蛍光、化学
発光、生物発光等の測定方法と検出感度を選ぶことがで
きる。以下、代表的な実施形態について説明するが、本
発明の方法はこれらに限定されるものではない。[0008] The signal is measured by adding a substrate to the enzyme remaining in the well of the microplate and reacting it for a certain period of time.
Measure. By changing the substrate to be added, it is possible to select a measurement method such as colorimetry, fluorescence, chemiluminescence, bioluminescence and the like and detection sensitivity. Hereinafter, typical embodiments will be described, but the method of the present invention is not limited thereto.
【０００９】競合法の場合：公知のように、前記の方法
において、免疫反応体と固定化相補的免疫反応体とを反
応させる前記の段階において、該免疫反応体とともに一
定量の標識免疫反応体とを共存させる。複数種の免疫反
応体ごとにそれに対応する相補的免疫反応体が共存させ
られる。したがって、各免疫反応体ごとに磁性粒子−相
補的免疫反応体−免疫反応体の結合体が生じる。これ
は、容器への磁場の印加により容器内壁に容易に分離で
きる。磁力で壁面に保持したまま、液体試料の廃棄、容
器内の洗浄を行うことができる。こうして、Ｂ／Ｆ分離
が行われる。次は、免疫反応体ごとにそれに用いられた
標識物質により検定を順次行う。各免疫反応体について
の検定方法は定法に従えばよい。一つの検定を行った後
に、容器内の洗浄等は前記磁性粒子−相補的免疫反応体
（標識体と非標識体の混合状態）−免疫反応体の結合体
を磁場の印加で容器内壁に分離、保持して行えばよい。In the case of the competitive method : As is known, in the above-mentioned method, in the step of reacting the immunoreactant with the immobilized complementary immunoreactant, a fixed amount of the labeled immunoreactant together with the immunoreactant is used. And coexist. For each of the plurality of types of immunoreactants, a corresponding complementary immunoreactant is co-present. Thus, a magnetic particle-complementary immunoreactor-immunoreactant conjugate is generated for each immunoreactant. This can be easily separated into the inner wall of the container by applying a magnetic field to the container. The liquid sample can be discarded and the container can be washed while being held on the wall surface by the magnetic force. Thus, B / F separation is performed. Next, the assay is performed sequentially for each immunoreactant using the labeling substance used for it. The assay method for each immunoreactant may follow a standard method. After performing one assay, the washing of the inside of the container is performed by separating the magnetic particle-complementary immunoreactant (mixed state of labeled and unlabeled) -immunoreactant from the inner wall of the container by applying a magnetic field. , May be held.
【００１０】サンドイッチ法の場合：前記本発明の方法
において、公知のように、免疫反応体と固定化相補的免
疫反応体とを反応させる前記の段階の後で、得られた反
応生成物と、一定量の標識相補的免疫反応体とを反応さ
せる。この場合は、磁性粒子−相補的免疫反応体−免疫
反応体（標識体と非標識体の混合状態）の結合体が得ら
れる以外は、上記競合法と同様である。In the case of the sandwich method : In the method of the present invention, after the above-mentioned step of reacting the immunoreactant with the immobilized complementary immunoreactant in a known manner, the reaction product obtained is: React with an amount of labeled complementary immunoreactant. In this case, it is the same as the above-mentioned competition method, except that a conjugate of magnetic particles-complementary immunoreactor-immunoreactant (mixed state of labeled and unlabeled) is obtained.
【００１１】ワンステップサンドイッチ法の場合：該方
法は、免疫反応体と固定化相補的免疫反応体とを反応さ
せる前記の段階において、該免疫反応体とともに一定量
の標識相補的免疫反応体とを共存させて反応させる点以
外は上記のサンドイッチ法と同様である。[0011] In the case of the one-step sandwich method, the method comprises the step of reacting the immunoreactant with the immobilized complementary immunoreactant together with a certain amount of the labeled complementary immunoreactor together with the immunoreactant. It is the same as the above-mentioned sandwich method except that the reaction is caused to coexist.
【００１２】本発明の方法により測定される免疫反応体
（抗原又は抗体）は特に限定されず、いずれの抗原又は
抗体も測定することができる。The immunoreactant (antigen or antibody) measured by the method of the present invention is not particularly limited, and any antigen or antibody can be measured.
【００１３】免疫反応体が担持される磁性粒子としては
公知のいずれのものも使用することができ、例えば市販
の磁性粒子あるいは高分子被覆磁性体含有粒子としてダ
イナル社製 Dynabeads、ＰＥバイオシステムズ社製 B
ioMag、コルテックス社製 MagaBeads、ポリサイエンス
社製 Magnetizable Polystyrene Particles、スフェロ
テック社製 Magnetic Polystyrene Particle等が使用
可能である。また、磁性細菌ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４５８）、磁性細菌ＲＳ−１（ＦＥＲＭＰ−１３
２８３）、磁性細菌ＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６
１７）等の菌体内に磁性粒子を生成する細菌より分離し
た磁性粒子等が挙げられる。磁性粒子の粒度は約５０ｎ
ｍ〜１００μｍ程度が好ましい。As the magnetic particles carrying the immunoreactant, any known magnetic particles can be used. For example, commercially available magnetic particles or polymer-containing magnetic material-containing particles are available from Dynabeads manufactured by Dynal and manufactured by PE Biosystems. B
For example, ioMag, MagaBeads manufactured by Cortex, Magnetizable Polystyrene Particles manufactured by Polyscience, and Magnetic Polystyrene Particle manufactured by Spherotech can be used. In addition, magnetic bacteria AMB-1 (FERM B)
P-5458), magnetic bacteria RS-1 (FERMP-13)
283), magnetic bacteria MGT-1 (FERM P-166)
17) and the like, and magnetic particles separated from bacteria that produce magnetic particles in the cells. Magnetic particle size is about 50n
It is preferably about m to 100 μm.
【００１４】本発明の方法の好ましい一形態として、前
記の容器がマイクロタイタープレートに設けられたウェ
ルであり、前記の容器外からの磁場の印加を、下記の磁
気分離治具をマイクロタイタープレートの上面又は底面
に装着させ、磁石を各ウェルの側方に隣接させて配置す
ることにより行うことが挙げられる。In a preferred embodiment of the method of the present invention, the container is a well provided in a microtiter plate, and the application of a magnetic field from outside the container is performed by using a magnetic separation jig described below. This is performed by mounting the magnet on the top or bottom surface and arranging the magnet adjacent to the side of each well.
【００１５】使用されるマイクロタイタープレートは通
常使用される９６穴タイプのものでよいが、特にこれに
限定されるものではない。ウェルの並び方は通常縦横の
両方向に直線状で格子の交差点に配置される形である
が、この点も限定されない。後述する磁気分離治具の形
態によっては若干の改造が必要なこともある。The microtiter plate used may be a commonly used 96-well type plate, but is not particularly limited thereto. The arrangement of the wells is usually linear in both the vertical and horizontal directions and is arranged at the intersection of the lattice, but this point is not limited. A slight modification may be required depending on the form of the magnetic separation jig described later.
【００１６】磁気分離器具は、マイクロタイタープレー
トが有する多数のウェルに側方から磁場を印加するため
に用いられるもので、マイクロタイタープレートの上面
又は底面と当接する平坦なベースと、該ベースのマイク
ロタイタープレートと当接する側の片面上に、マイクロ
タイタープレートに挿入される複数の磁石とを有してな
り、前記の磁石の各々はマイクロタイタープレートの隣
接するウェルの側方に隣接して挿入されるように設けら
れている分離治具である。The magnetic separation device is used to apply a magnetic field to a plurality of wells of the microtiter plate from the side, and includes a flat base contacting the top or bottom surface of the microtiter plate, and a micro base of the base. A plurality of magnets inserted into the microtiter plate are provided on one side of the side that contacts the titer plate, and each of the magnets is inserted adjacent to a side of an adjacent well of the microtiter plate. It is a separation jig provided so that it may be.
【００１７】この治具の使用により、磁性粒子を磁力に
よりウェルの内側壁に保持させたまま、マイクロタイタ
ープレートを通常のようにして光学的測定に供する。即
ち、マイクロタイタープレートの各ウェルに生じた上清
液に垂直方向に測光を通し、透過度、吸光度、蛍光、化
学発光、生物発光等の光学的特性を測定する。このと
き、磁性粒子は内側壁に集められ保持されているので光
路を妨害することはない。With the use of this jig, the microtiter plate is subjected to optical measurement as usual while the magnetic particles are held on the inner wall of the well by magnetic force. That is, the supernatant liquid generated in each well of the microtiter plate is subjected to photometry in the vertical direction to measure optical characteristics such as transmittance, absorbance, fluorescence, chemiluminescence, and bioluminescence. At this time, since the magnetic particles are collected and held on the inner wall, they do not obstruct the optical path.
【００１８】以下、図面に即して具体的に説明する。図
1は本発明の方法に使用する磁気分離治具１であって、
マイクロタイタープレートの底側に装着するタイプの一
例を示す斜視図である。図２は同分離治具の平面図であ
る。図３はこの分離治具１をマイクロタイタープレート
２の底面に当接して装着した状態を、図２のＡ−Ａ線で
切断したときの部分断面図である。通常マイクロタイタ
ープレートはプラスチック成型品であるので底側から見
ると、ウェルに対応する突起の間に磁石を挿入すること
ができる間隙ができている。Hereinafter, a specific description will be given with reference to the drawings. Figure
1 is a magnetic separation jig 1 used in the method of the present invention,
It is a perspective view which shows an example of the type attached to the bottom side of a microtiter plate. FIG. 2 is a plan view of the separation jig. FIG. 3 is a partial cross-sectional view of the state in which the separation jig 1 is mounted on the bottom surface of the microtiter plate 2 in contact with the bottom surface of the microtiter plate 2 along the line AA in FIG. Usually, since the microtiter plate is a plastic molded product, when viewed from the bottom side, a gap is formed between the protrusions corresponding to the wells so that a magnet can be inserted.
【００１９】治具１は、ベース３と、該ベース３の片面
に垂直に設けられた棒状磁石４とから構成されている。
ベース３は磁石４を支持するとともにヨークの役割を兼
ねている。ベース３を磁化し得る金属材料で作ることで
マイクロプレートリーダーのマイクロタイタープレート
を設置するトレー面（金属面）への磁気的な結合を防ぐ
ことができ、操作性の向上と機器への悪影響を防ぐこと
ができる。実用的には、例えば、ステンレスのような金
属から機械製作される。The jig 1 includes a base 3 and a bar-shaped magnet 4 provided vertically on one surface of the base 3.
The base 3 supports the magnet 4 and also serves as a yoke. By making the base 3 of a metal material that can be magnetized, magnetic coupling to the tray surface (metal surface) on which the microtiter plate of the microplate reader is installed can be prevented, improving operability and adversely affecting equipment. Can be prevented. Practically, it is machined, for example, from a metal such as stainless steel.
【００２０】磁石４は強力磁場を発生する材料から作製
され、好ましくは永久磁石である。磁石は可能な限り体
積が大きいことが好ましく、該治具をマイクロタイター
プレートに装着した際に液体媒体の液面に近い高さであ
ることが好ましい。また、磁石の形状は棒状ないし円筒
状であることが好ましい。磁場が強いほど、かつ磁場勾
配が大きいほど、分離は良好に行われ、かつその分離は
迅速である。The magnet 4 is made of a material that generates a strong magnetic field, and is preferably a permanent magnet. The magnet preferably has the largest possible volume, and preferably has a height close to the liquid surface of the liquid medium when the jig is mounted on the microtiter plate. Further, the shape of the magnet is preferably a rod shape or a cylindrical shape. The stronger the magnetic field and the greater the magnetic field gradient, the better the separation takes place and the faster the separation.
【００２１】磁石はこれに隣接するウェルに対して磁場
を印加することが好ましく、最も好ましくは一つの磁石
はそれを取り巻く周囲の、通常４個のウェルに対して磁
場を印加する。各磁石はいずれかの方向に着磁されてお
り、好ましくは、ベース面に対して平行又は垂直な方向
に、より好ましくは平行な方向に着磁されている。さら
に好ましくは、図６に示すようにベース面と平行な方向
（即ち、使用時の水平方向）である。最も好ましくは、
図７のＡに例示するように隣接する一対の磁石は、ベー
ス面に対して平行に、かつ相互に同一磁極を対向させる
ように（即ち、反発方向に）着磁されている。このよう
に配置することにより、ウェル内に印加される磁場勾配
が増大し、かつ、全てのウェルに対する印加条件が等し
くなる。[0021] The magnet preferably applies a magnetic field to the adjacent well, most preferably one magnet applies a magnetic field to the surrounding, usually four wells. Each magnet is magnetized in either direction, preferably in a direction parallel or perpendicular to the base surface, and more preferably in a direction parallel thereto. More preferably, the direction is parallel to the base surface as shown in FIG. 6 (that is, the horizontal direction at the time of use). Most preferably,
As illustrated in FIG. 7A, a pair of adjacent magnets are magnetized in parallel to the base surface and in such a manner that the same magnetic poles are opposed to each other (that is, in the direction of repulsion). With this arrangement, the magnetic field gradient applied to the wells increases, and the application conditions for all the wells become equal.
【００２２】図３に戻って、ベース３はマイクロタイタ
ープレート２の底面の範囲に収容されるような寸法であ
ることが好ましく、例えば標準的な96ウェルマイクロタ
イタープレート（縦85mm×横127mm）の場合、縦75mm以
下で横115mm以下であることが好ましい。ベース３に
は、光学測定のために測光が通過するようにマイクロタ
イタープレート２のウェル５に対応する位置に穴６を有
する。標準的なマイクロタイタープレートの場合、この
穴の寸法は直径4mm以上であることが好ましく、特に好
ましくは直径7〜8mmである。Returning to FIG. 3, the base 3 is preferably sized to be accommodated in the area of the bottom surface of the microtiter plate 2, for example, a standard 96-well microtiter plate (85 mm long × 127 mm wide). In this case, it is preferable that the height is 75 mm or less and the width is 115 mm or less. The base 3 has a hole 6 at a position corresponding to the well 5 of the microtiter plate 2 so that photometry passes for optical measurement. In the case of a standard microtiter plate, the size of this hole is preferably at least 4 mm in diameter, particularly preferably 7 to 8 mm.
【００２３】磁石４は各ウェルに対して隣接する磁石が
少なくとも１個あるように設ける必要がある。図８は、
４個のウェルに１個の磁石の割合で設けられ、各磁石は
４個のウェルで囲まれて存在するように配置された例
（４ウェル印加タイプ）である。この型の配置の場合、
１個のウェルには１個の磁石が隣接することになる。図
９は任意の隣接する４個のウェルに囲まれた位置(通
常、中央)すべてに磁石が配置された例（フルセットタ
イプ）である。フルセットタイプでは、１個のウェルの
周りに４個の磁石が隣接することになる。The magnets 4 must be provided so that there is at least one magnet adjacent to each well. FIG.
In this example, one magnet is provided in four wells, and each magnet is arranged so as to be surrounded by four wells (four-well application type). For this type of arrangement,
One magnet will be adjacent to one well. FIG. 9 shows an example (full set type) in which magnets are arranged at all positions (usually at the center) surrounded by any four adjacent wells. In the full set type, four magnets are adjacent to one well.
【００２４】磁石４の長さは、図３に示すように、マイ
クロタイタープレート２に装着した時にその高さがウェ
ル５に入れられた液７の水位７ａとほぼ同じ程度である
ことが望ましい。As shown in FIG. 3, it is desirable that the height of the magnet 4 when it is mounted on the microtiter plate 2 is approximately the same as the water level 7a of the liquid 7 placed in the well 5.
【００２５】さて、本発明に用いられる治具はマイクロ
タイタープレートの上面に装着するタイプでもよく、図
４はこの種の形態をマイクロタイタープレートに装着し
た状態の部分的断面図である。この場合、マイクロタイ
タープレートには、磁石を挿入するための穴８がプレー
ト上面の所定位置に穿たれている。磁石の長さは、その
先端が図４に示すように、ウェル５の底とほぼ同じ高さ
となることが好ましい。短すぎるとウェルに入れた試料
液に磁場が効果的に作用しない。The jig used in the present invention may be of a type mounted on the upper surface of a microtiter plate, and FIG. 4 is a partial cross-sectional view showing this type of configuration mounted on the microtiter plate. In this case, a hole 8 for inserting a magnet is formed in a predetermined position on the upper surface of the microtiter plate. The length of the magnet is preferably substantially the same height as the bottom of the well 5, as shown in FIG. If the length is too short, the magnetic field does not effectively act on the sample solution placed in the well.
【００２６】図５はマイクロタイタープレートの上面側
に装着するタイプの治具であって、磁石の変形例を示す
部分断面図である。この例では、ベースに円筒状の支持
部４ａが設けられ、その先端に磁石４ｂが固着されてい
る。支持部４ａは例えば合成樹脂、セラミック等の材料
でよい。治具をマイクロタイタープレートに執着した時
に図５に示すように支持部４ａと磁石４ｂとの接続部が
ウェル５内の試料液７の液面７ａとほぼ同じ高さである
ことが好ましい。FIG. 5 is a partial sectional view showing a jig of a type mounted on the upper surface side of the microtiter plate, showing a modification of the magnet. In this example, a cylindrical supporting portion 4a is provided on a base, and a magnet 4b is fixed to a tip of the supporting portion 4a. The support portion 4a may be made of a material such as a synthetic resin or ceramic. When the jig is attached to the microtiter plate, it is preferable that the connecting portion between the support portion 4a and the magnet 4b is substantially the same height as the liquid surface 7a of the sample liquid 7 in the well 5, as shown in FIG.
【００２７】本発明の方法は、Ｂ／Ｆ分離を伴う、固相
法のいずれのバリエーションにも適用可能であり、サン
ドイッチ法、ワンステップサンドイッチ法、競合法によ
る検定のほか、ビオチン標識抗体または抗原を用いた場
合はビオチンアビジンシステムを用い、酵素や蛍光物
質、化学発光物質を標識したアビジンも反応に用いるこ
ともできる。The method of the present invention can be applied to any variation of the solid phase method involving B / F separation, and can be carried out by a sandwich method, a one-step sandwich method, an assay by a competition method, a biotin-labeled antibody or an antigen. When a is used, a biotin avidin system is used, and avidin labeled with an enzyme, a fluorescent substance, or a chemiluminescent substance can also be used for the reaction.
【００２８】シグナルの測定はマイクロプレートのウェ
ルに残った酵素に基質を加えて一定時間反応させた後、
測定する。加える基質を変えることで比色、蛍光、化学
発光、生物発光等の測定方法と検出感度を選ぶことがで
きる。The signal is measured by adding a substrate to the enzyme remaining in the well of the microplate and reacting it for a certain period of time.
Measure. By changing the substrate to be added, it is possible to select a measurement method such as colorimetry, fluorescence, chemiluminescence, bioluminescence and the like and detection sensitivity.
【００２９】比色による測定は酵素標識抗体の発色基質
の吸光度もしくは透過率を測定する最も一般的な手法で
あり種々の発色基質が市販されている。通常のエンザイ
ムイムノアッセイで用いる酵素であるアルカリフォスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β-ガラクトシダーゼ等の酵素が抗体または抗原に
標識されたものを用いることができる。Measurement by colorimetry is the most common technique for measuring the absorbance or transmittance of a chromogenic substrate of an enzyme-labeled antibody, and various chromogenic substrates are commercially available. Enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, and β-galactosidase, which are enzymes used in ordinary enzyme immunoassays, can be used in which enzymes or antigens are labeled.
【００３０】蛍光による測定は抗体または抗原に標識さ
れた酵素により基質と反応させ溶液中に生成される蛍光
物質の蛍光を測定する。アルカリフォスファターゼに対
し4-メチルウンベリフェリルリン酸、ペルオキシダーゼ
に対しｐ-ヒドロキシフェニルプロピオン酸+過酸化水
素、β-ガラクトシダーゼに対し4-メチルウンベリフェ
リル-β-Ｄ-ガラクトシド等の酵素と基質の組み合わせ
として用いる。また希土類元素であるEu, Tb, Sm, Dt等
の錯体が標識された抗体または抗原を用いることもでき
る。これらの希土類錯体は蛍光寿命が長く、バックグラ
ンドが消失してから測定することができるため高感度に
測定が行える。蛍光測定においては抗原抗体反応により
磁性粒子に結合せず溶液中に残存した蛍光標識物を測定
することでホモジニアスイムノアッセイも行うことがで
きる。ＦＩＴＣ等のそれ自体が蛍光を発する物質で標識
された抗体または抗原の場合、磁性粒子をウェル側面に
磁気分離することで溶液中に未結合の蛍光標識物質を残
すことが可能であり、洗浄によるB/F分離を行わずに測
定も可能である。In the measurement by fluorescence, the fluorescence of a fluorescent substance generated in a solution by reacting with a substrate by an enzyme labeled with an antibody or an antigen is measured. Enzymes and substrates such as 4-methylumbelliferyl phosphate for alkaline phosphatase, p-hydroxyphenylpropionic acid + hydrogen peroxide for peroxidase, and 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside for β-galactosidase. Used as a combination. An antibody or an antigen labeled with a complex of rare earth elements such as Eu, Tb, Sm, and Dt can also be used. These rare earth complexes have a long fluorescence lifetime and can be measured after the background has disappeared, so that measurement can be performed with high sensitivity. In the fluorescence measurement, a homogeneous immunoassay can also be performed by measuring a fluorescent label remaining in the solution without binding to the magnetic particles due to the antigen-antibody reaction. In the case of an antibody or an antigen that is labeled with a substance that emits fluorescence such as FITC, it is possible to leave unbound fluorescently labeled substance in the solution by magnetically separating magnetic particles on the side of the well. Measurement is also possible without B / F separation.
【００３１】化学発光による測定は化学発光物質とし
て、例えばルミノール誘導体、ルシゲニン、アクリジニ
ウム誘導体、ジオキタセン誘導体、シュウ酸誘導体等を
標識した抗体または抗原を用いることができる。For measurement by chemiluminescence, an antibody or antigen labeled with a luminol derivative, lucigenin, acridinium derivative, dioctacene derivative, oxalic acid derivative or the like can be used as a chemiluminescent substance.
【００３２】生物発光による測定は、例えばルシフェラ
ーゼで標識された抗体または抗原に基質であるルシフェ
リンとＡＴＰ、酸素、マグネシウムイオンの添加するこ
とにより発光で測定できる。またエクオリンで標識され
た抗体または抗原はカルシウムイオンの添加により発光
を測定できる。The measurement by bioluminescence can be performed by, for example, adding luciferin as a substrate and ATP, oxygen, and magnesium ions to an antibody or antigen labeled with luciferase, and then measuring the luminescence. In addition, the luminescence of an antibody or antigen labeled with aequorin can be measured by adding calcium ions.
【００３３】[0033]
［実施例１］ １ステップサンドイッチ法による多項目
免疫測定 （試薬の調製）96穴マイクロタイタープレートに抗ヒト
Fc抗体（A-h-Fc）を吸着させた後、１％牛血清アルブミ
ン／リン酸緩衝液（pH7.4）でブロッキング処理を行っ
た。磁性粒子に抗ヒトFab抗体（A-h-Fab）を化学固定
し、１％牛血清アルブミン／リン酸緩衝液（pH7.4）で
ブロッキング処理を行った。[Example 1] Multi-item immunoassay by one-step sandwich method (Preparation of reagent) Anti-human was placed on a 96-well microtiter plate.
After adsorbing the Fc antibody (Ah-Fc), a blocking treatment was performed with 1% bovine serum albumin / phosphate buffer (pH 7.4). Anti-human Fab antibody (Ah-Fab) was chemically fixed to the magnetic particles, and blocking treatment was performed with 1% bovine serum albumin / phosphate buffer (pH 7.4).
【００３４】（操作） （1）抗ヒトFc抗体（A-h-Fc）を固定化した96穴マイク
ロタイタープレートの各ウェルに、種々の濃度に希釈し
た抗原（h-Fabとh-Fc）各50μｌ、抗ヒトFab抗体（A-h-
Fab）固定化磁性粒子50μg、アルカリフォスファターゼ
標識抗ヒトFab抗体（ALP-A-h-Fab）50μｌ、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトFc抗体（POD-A-h-Fc）50μｌを分注し
た。各ウェルに入れたものを室温で60分間振とうして反
応させた。その後、図１に示す磁気分離治具をマイクロ
タイタープレートの下部より装着し、２分程度磁気分離
を行った。磁性粒子をウェルの内側壁に吸引、保持した
まま、マイクロタイタープレートをマイクロプレートウ
ォッシャー（日本バイオ・ラッド社製1575）に移し、上
清液を除去後、0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.4）
で５回洗浄した。一旦、磁気分離治具をマイクロタイタ
ープレートから外し、各ウェルにアルカリフォスファタ
ーゼ発色基質（Moss社製p-NPP）を100μｌ加え、30分間
振とうし、発色させた。その後、磁気分離治具を装着し
て磁気分離を行い、磁性粒子を内側壁に吸引、保持した
ままマイクロプレートリーダー（東ソー社製MPR-A4i）
に移し、波長405nmで吸光度を測定した。その結果を図
１０に示す（黒四角）。(Operation) (1) To each well of a 96-well microtiter plate on which an anti-human Fc antibody (Ah-Fc) was immobilized, 50 μl of each of antigens (h-Fab and h-Fc) diluted to various concentrations was added. , Anti-human Fab antibody (Ah-
Fab) 50 μg of immobilized magnetic particles, 50 μl of alkaline phosphatase-labeled anti-human Fab antibody (ALP-Ah-Fab), and 50 μl of peroxidase-labeled anti-human Fc antibody (POD-Ah-Fc) were dispensed. The reaction in each well was shaken at room temperature for 60 minutes to react. Thereafter, the magnetic separation jig shown in FIG. 1 was mounted from below the microtiter plate, and magnetic separation was performed for about 2 minutes. The microtiter plate was transferred to a microplate washer (Nippon Bio-Rad Co., Ltd., 1575) while the magnetic particles were suctioned and held on the inner side wall of the well, the supernatant was removed, and 0.05% Tween 20 / phosphate buffer (pH 7) was removed. .Four)
And washed 5 times. Once the magnetic separation jig was removed from the microtiter plate, 100 μl of alkaline phosphatase chromogenic substrate (Moss p-NPP) was added to each well and shaken for 30 minutes to develop color. Then, a magnetic separation jig is attached and magnetic separation is performed, and the magnetic plate is suctioned and held on the inner wall, and a microplate reader (MPR-A4i manufactured by Tosoh Corporation)
And the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm. The result is shown in FIG. 10 (black square).
【００３５】(２)次に、このマイクロタイタープレート
を磁気分離治具を装着したままマイクロプレートウォッ
シャーに移し、0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.4）
で５回洗浄した。磁気分離治具を外し、各ウェルにペル
オキシダーゼ発色基質（VECTOR社製TMB）を100μｌ加え
て10分間振とうし発色させた後、磁気分離治具を装着し
て磁気分離を行い、磁性粒子を内側壁に保持したままマ
イクロプレートリーダーに移し、波長650nmで吸光度を
測定した。さらに各ウェルに0.5NHCl（発色停止液）を1
00μｌずつ添加し、波長450nmで吸光度を測定した。そ
の結果を図１１に示す（黒丸）。(2) Next, the microtiter plate was transferred to a microplate washer with the magnetic separation jig attached, and the plate was washed with 0.05% Tween 20 / phosphate buffer (pH 7.4).
And washed 5 times. Remove the magnetic separation jig, add 100 μl of peroxidase chromogenic substrate (TMB, manufactured by VECTOR) to each well, shake for 10 minutes, and attach the magnetic separation jig to perform magnetic separation. The sample was transferred to a microplate reader while being held on the wall, and the absorbance was measured at a wavelength of 650 nm. Then add 0.5N HCl (color stop solution) to each well.
Then, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm. The results are shown in FIG. 11 (black circles).
【００３６】（３）次に、磁性粒子をウェルの内側壁に
吸引、保持したまま、マイクロタイタープレートをマイ
クロプレートウォッシャー（日本バイオ・ラッド社製15
75）に移し、上清液を除去後、0.05%Tween20／リン酸緩
衝液（pH7.4）で５回洗浄した。一旦、磁気分離治具を
マイクロタイタープレートから外し、各ウェルにアルカ
リフォスファターゼ発色基質（Moss社製p-NPP）を100μ
ｌ加え、30分間振とうし、発色させた。その後、磁気分
離治具を装着して磁気分離を行い、磁性粒子を内側壁に
吸引、保持したままマイクロプレートリーダー（東ソー
社製MPR-A4i）に移し、波長405nmで吸光度を測定した。
その結果を図１０に示す（白四角）。（１）で得られた
結果と良く近似しており、再現性が良好であった。(3) Next, a microtiter plate is placed on a microplate washer (Nippon Bio-Rad Co., Ltd.) while the magnetic particles are suctioned and held on the inner wall of the well.
75), the supernatant was removed, and the plate was washed five times with 0.05% Tween 20 / phosphate buffer (pH 7.4). Once the magnetic separation jig was removed from the microtiter plate, 100 µl of alkaline phosphatase chromogenic substrate (Moss p-NPP) was added to each well.
and shaken for 30 minutes to develop color. Thereafter, a magnetic separation jig was mounted to perform magnetic separation, and the magnetic particles were transferred to a microplate reader (MPR-A4i manufactured by Tosoh Corporation) while being suctioned and held on the inner wall, and the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm.
The results are shown in FIG. 10 (open squares). The result was close to the result obtained in (1), and the reproducibility was good.
【００３７】なお、通常ペルオキシダーゼを用いる発色
反応は硫酸や塩酸を用いて停止させるが、上記（２）に
おいてはこのような酸を用いなかった。酸を用いると、
（３）における再現性が著しく低下することがわかっ
た。In general, the color reaction using peroxidase is stopped with sulfuric acid or hydrochloric acid, but in (2) above, no such acid was used. With acid,
It was found that the reproducibility in (3) was significantly reduced.
【００３８】（４）また、上記とは順序を変えて、先に
（２）で行ったペルオキシダーゼを対象とするヒトFc抗
原の検定を（２）と同様に行い、次にアルカリフォスフ
ァターゼを対象とする（１）のヒトFab検定を行い、再度
（２）と同様にヒトFc抗原の検定を行ったところ、図１
１に示す結果が得られた（白丸）。(4) In the same manner as in (2), the order of the above is changed, and the assay for human Fc antigen for peroxidase previously performed in (2) is performed in the same manner as in (2), and then for alkaline phosphatase. When the human Fab assay of (1) was performed and the human Fc antigen was assayed again in the same manner as in (2), FIG.
The result shown in FIG. 1 was obtained (open circle).
【００３９】 ［実施例２］ １ステップサンドイッチ法による多項目
免疫測定 （試薬の調製）磁性粒子に抗ヒトFab抗体（A-h-Fab）を
化学固定し、１％牛血清アルブミン／リン酸緩衝液（pH
7.4）でブロッキング処理を行った。別の磁性粒子に抗
ヒトFc抗体（A-h-Fc）を化学固定し、１％牛血清アルブ
ミン／リン酸緩衝液（pH7.4）でブロッキング処理を行
う。[Example 2] Multi-item immunoassay by one-step sandwich method (Preparation of reagent) An anti-human Fab antibody (Ah-Fab) was chemically fixed to magnetic particles, and 1% bovine serum albumin / phosphate buffer ( pH
The blocking treatment was performed in 7.4). Anti-human Fc antibody (Ah-Fc) is chemically fixed to another magnetic particle, and blocking treatment is performed with 1% bovine serum albumin / phosphate buffer (pH 7.4).
【００４０】（操作） （１）１％牛血清アルブミン／リン酸緩衝液（pH7.4）
によってブロッキング処理を行った96穴マイクロタイタ
ープレートの各ウェルに、任意の濃度に希釈した抗原
（h-Fab，h-Fc）各50μｌ、抗ヒトFab，Fc抗体（A-h-Fa
b，A-h-Fc）付き磁性粒子各50μg、アルカリフォスファ
ターゼ標識抗ヒトFab抗体（ALP-A-h-Fab）50μｌ、ペル
オキシダーゼ標識抗ヒトFc抗体（POD-A-h-Fc）50μｌを
分注した。室温で60分間振とうして反応させた後、磁気
分離治具をマイクロタイタープレートの下部より装着
し、２分程度磁気分離を行った。マイクロタイタープレ
ートを装着したままマイクロプレートウォッシャー（日
本バイオ・ラッド社製1575）に移し、上清液を除去後、
0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.4）で５回洗浄し
た。一旦、磁気分離治具を外し、各ウェルにアルカリフ
ォスファターゼ発色基質（Moss社製p-NPP）を100μｌ加
えて30分間振とうし発色させた後、磁気分離治具を装着
して磁気分離を行い、治具を装着したままマイクロプレ
ートリーダー（東ソー社製MPR-A4i）に移し、波長405nm
で吸光度を測定した。結果を図１２に示す（黒四角）。(Operation) (1) 1% bovine serum albumin / phosphate buffer (pH 7.4)
50 μl each of antigen (h-Fab, h-Fc) diluted to an arbitrary concentration, an anti-human Fab, Fc antibody (Ah-Fa
b, Ah-Fc), 50 μg each of magnetic particles, alkaline phosphatase-labeled anti-human Fab antibody (ALP-Ah-Fab), and 50 μl peroxidase-labeled anti-human Fc antibody (POD-Ah-Fc). After reacting by shaking at room temperature for 60 minutes, a magnetic separation jig was attached from the bottom of the microtiter plate, and magnetic separation was performed for about 2 minutes. Transfer to a microplate washer (Nippon Bio-Rad Co., Ltd. 1575) with the microtiter plate attached, remove the supernatant,
The plate was washed five times with 0.05% Tween 20 / phosphate buffer (pH 7.4). Once the magnetic separation jig was removed, 100 μl of alkaline phosphatase chromogenic substrate (Moss p-NPP) was added to each well, and the mixture was shaken for 30 minutes to develop a color. Then, the magnetic separation jig was attached to perform magnetic separation. , With the jig attached, transferred to a microplate reader (MPR-A4i, manufactured by Tosoh Corporation).
The absorbance was measured with. The results are shown in FIG. 12 (closed squares).
【００４１】（２）次に、このマイクロタイタープレー
トを磁気分離治具を装着したままマイクロプレートウォ
ッシャーに移し、0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.
4）で５回洗浄した。磁気分離治具を外し、各ウェルに
ペルオキシダーゼ発色基質（VECTOR社製TMB）を100μｌ
加えて10分間振とうし発色させた。その後、磁気分離治
具を装着して磁気分離を行い、マイクロプレートリーダ
ーに移し、波長650nmで吸光度を測定した。結果を図１
３に示す（黒丸）。(2) Next, the microtiter plate was transferred to a microplate washer with the magnetic separation jig attached, and the plate was washed with 0.05% Tween 20 / phosphate buffer (pH 7.
Washed 5 times in 4). Remove the magnetic separation jig and add 100 μl of peroxidase chromogenic substrate (TMB, manufactured by VECTOR) to each well.
In addition, the mixture was shaken for 10 minutes to develop color. Thereafter, a magnetic separation jig was mounted thereon to perform magnetic separation, transferred to a microplate reader, and measured for absorbance at a wavelength of 650 nm. Figure 1 shows the results
3 (black circle).
【００４２】（３）再度、（１）と同様にしてヒトFab
抗原を測定したところ、図１２に示す結果を得た（白四
角）。（１）で得られた結果と良く一致し、再現性の高
いことが確認された。(3) Again, as in (1), human Fab
When the antigen was measured, the results shown in FIG. 12 were obtained (open squares). This was in good agreement with the result obtained in (1), and it was confirmed that the reproducibility was high.
【００４３】（４）上記（１）〜（３）とは逆に、初め
に上記（２）と同様にヒトFc抗原の検定をペルオキシダ
ーゼ標識により行い、次に（１）と同様にヒトFab抗原
の検定をアルカリフォスファターゼ標識により行い、再
度ヒトFc抗原の検定をペルオキシダーゼ標識により行っ
た。こうして得られた結果を図１3に示す（白丸）。上
の（２）で得られた結果と良く一致し再現性が良好であ
った。(4) Contrary to the above (1) to (3), a human Fc antigen is first assayed by peroxidase labeling in the same manner as in the above (2), and then a human Fab antigen is assayed in the same manner as in (1). Was performed by alkaline phosphatase labeling, and the human Fc antigen was again assayed by peroxidase labeling. The results thus obtained are shown in FIG. 13 (open circles). The results were in good agreement with the results obtained in (2) above, and the reproducibility was good.
【００４４】なお、この実施例でも、ペルオキシダーゼ
標識による検定の際に発色反応を酸により停止させたに
ちにアルカリフォスファターゼを標識として用いる検定
を行うとアルカリフォアスファターゼ標識による検定の
再現性が著しく低下することがわかった。したがって、
アルカリフォスファターゼとペルオキシダーゼとを標識
として用い、ペルオキシダーゼの発色反応の停止を酸を
用いて行う場合には、検定反応の順序を考慮する必要が
あることがわかった。In this example, when the assay using an alkaline phosphatase was performed after the color reaction was stopped with an acid during the assay using the peroxidase label, the reproducibility of the assay using the alkaline phosphatase label was remarkable. It was found to decrease. Therefore,
When alkaline phosphatase and peroxidase were used as labels and the color reaction of peroxidase was stopped using an acid, it was found that the order of the assay reactions had to be considered.
【００４５】[0045]
【発明の効果】上記実施例により示されるように、本発
明の方法によれば、１試料から二種以上の免疫反応体の
検定が一連の操作により行うことができる。マイクロタ
イタープレートを用いる形態では、免疫反応の後ウェル
の内壁側面に磁気微粒子を凝集させることができ、しか
もそのままマイクロタイタープレートごと測定治具にセ
ットし、上清の吸光度を測定することができるので、簡
便に免疫学的測定を行うこともできる。さらに具体的に
述べると、次の利点を挙げることができる。 1.マイクロタイタープレートのウェルという同一の反応
容器内で、反応から測定まで行うことが可能である。 2.一般的に普及している分光光度計あるいはマイクロプ
レートリーダーを使用し、磁気分離を維持したまま測定
が可能である。 3.上清液の吸光度を測定するため、測定値が磁性粒子の
懸濁状態に影響されないという利点がある。 4.隣接する磁石を水平方向かつ反発方向に配置し、さら
に４ウェル印加型の配置とすると、印加する磁力および
磁場勾配が大きくすることが容易であり、迅速かつ確実
な磁気分離が可能である。 6.全てのウェルにおいて同一条件の磁場印加が可能であ
る。 7.磁石を固定するベースがヨークとしての機能を兼ねる
ため、治具底面への磁界の漏れがほとんど無い。 8.材質は全て金属とした場合には、堅牢で破損の心配が
なく半永久的に使用できる。As shown in the above examples, according to the method of the present invention, two or more immunoreactants can be assayed from one sample by a series of operations. In the case of using a microtiter plate, the magnetic fine particles can be aggregated on the inner wall surface of the well after the immunoreaction, and the microtiter plate can be directly set on a measuring jig and the absorbance of the supernatant can be measured. In addition, an immunological measurement can be easily performed. More specifically, the following advantages can be obtained. 1. It is possible to perform from reaction to measurement in the same reaction vessel called the well of a microtiter plate. 2. Measurement can be performed using a commonly-used spectrophotometer or microplate reader while maintaining magnetic separation. 3. Since the absorbance of the supernatant is measured, there is an advantage that the measured value is not affected by the suspension state of the magnetic particles. 4. If adjacent magnets are arranged in the horizontal and repulsive directions, and a four-well application type arrangement is used, it is easy to increase the applied magnetic force and magnetic field gradient, and quick and reliable magnetic separation is possible. . 6. The same magnetic field can be applied to all wells. 7. Since the base for fixing the magnet also functions as a yoke, there is almost no leakage of the magnetic field to the jig bottom. 8. When all materials are metal, they are robust and can be used semi-permanently without any fear of damage.
【図１】本発明の方法に使用する磁気分離治具であっ
て、マイクロタイタープレートの底側に装着するタイプ
の一例を示す斜視図である。FIG. 1 is a perspective view showing an example of a magnetic separation jig used in the method of the present invention, which is mounted on a bottom side of a microtiter plate.
【図２】同分離治具の平面図である。FIG. 2 is a plan view of the separation jig.
【図３】図２のＡ−Ａ線で切断した部分断面図である。FIG. 3 is a partial sectional view taken along line AA of FIG. 2;
【図４】本発明の方法に使用する磁気分離治具であっ
て、マイクロタイタープレートの上面側から装着するタ
イプの一例を示す断面図である。FIG. 4 is a cross-sectional view showing an example of a magnetic separation jig used in the method of the present invention, which is mounted from the upper surface side of a microtiter plate.
【図５】マイクロタイタープレートの上面側に装着する
タイプの磁気分離治具の磁石部分の一形態を説明する部
分断面図である。FIG. 5 is a partial cross-sectional view illustrating one embodiment of a magnet portion of a magnetic separation jig of a type mounted on an upper surface side of a microtiter plate.
【図６】磁石の着磁方向を示す斜視図である。FIG. 6 is a perspective view showing a magnetizing direction of a magnet.
【図７】磁石の配置方向を説明する図で、Ａは反発方向
配置を示し、Ｂは同一方向配置を示す。FIGS. 7A and 7B are diagrams for explaining the arrangement direction of the magnets, where A indicates the repulsion direction arrangement and B indicates the same direction arrangement.
【図８】４個のウェルに１個の磁石が隣接するように磁
石が配置された、４ウェル印加タイプの配置を説明する
図である。FIG. 8 is a diagram illustrating a four-well application type arrangement in which magnets are arranged so that one magnet is adjacent to four wells.
【図９】任意の隣接する４個のウェルに囲まれた中央す
べてに磁石が配置された、フルセットタイプの配置を説
明する図である。FIG. 9 is a view for explaining a full-set type arrangement in which magnets are arranged at the entire center surrounded by any four adjacent wells.
【図１０】実施例１で得られた、ヒトＦａｂ濃度−吸光
度の検量線を示す。FIG. 10 shows a calibration curve of human Fab concentration-absorbance obtained in Example 1.
【図１１】実施例１で得られた、ヒトＦｃ濃度−吸光度
の検量線を示す。FIG. 11 shows a calibration curve of human Fc concentration-absorbance obtained in Example 1.
【図１２】実施例２で得られた、ヒトＦａｂ濃度−吸光
度の検量線を示す。FIG. 12 shows a calibration curve of human Fab concentration-absorbance obtained in Example 2.
【図１３】実施例２で得られた、ヒトＦｃ濃度−吸光度
の検量線を示す。FIG. 13 shows a calibration curve of human Fc concentration-absorbance obtained in Example 2.
１．磁気分離治具 ２．マイクロタイタープレート ３．ベース ４．磁石 ５．ウェル ６．穴 ７．液 ８．穴 1. Magnetic separation jig 2. Microtiter plate 3. Base 4. Magnet 5. Well 6. Hole 7. Liquid 8. hole
Claims (8)
相に固定され前記免疫反応体と特異的に結合する相補的
免疫反応体と容器内で液体媒体中において反応させる段
階と、該反応に関与した免疫反応体を標識物質を用いて
検定する段階とを有する、固相法により免疫反応体検定
する方法において、（ｉ） 前記試料が検定対象として
二種以上の免疫反応体を含有し、（ii） 該二種以上の
免疫反応体のそれぞれと特異的に結合する二種以上の相
補的免疫反応体を用いること、（iii） 前記不溶性固
相として磁性粒子が用いられ、前記二種以上の相補的免
疫反応体が別々に磁性粒子に固定されていること、（i
v） 前記の免疫反応体と相補的免疫反応体との反応に
より得られた複合体を反応液体からの分離、洗浄を、前
記容器外から磁場を印加し、該複合体を容器内壁に磁気
分離し保持して行うこと、（v） 上記二種以上の免疫
反応体ごとに異なる標識物質とを用いること、（vi）
前記の標識物質を用いる検定段階が、各免疫反応体ごと
に順次行われること、を特徴とする、免疫学的多項目検
定方法。Reacting an immunoreactant present in a sample with a complementary immunoreactant immobilized on an insoluble solid phase and specifically binding to said immunoreactant in a liquid medium in a container; Assaying the immunoreactant involved in the reaction using a labeling substance, wherein (i) the sample contains two or more immunoreactants as an object of the assay. (Ii) using two or more complementary immunoreactants that specifically bind to each of the two or more immunoreactants; and (iii) using magnetic particles as the insoluble solid phase, That at least one species of complementary immunoreactant is separately immobilized on the magnetic particles, (i
v) Separation and washing of the complex obtained by the reaction between the immunoreactant and the complementary immunoreactant from the reaction liquid, and applying a magnetic field from outside the container to magnetically separate the complex on the inner wall of the container (V) using a different labeling substance for each of the two or more immunoreactants, (vi)
An immunological multi-item assay method, wherein the assay step using the labeling substance is performed sequentially for each immunoreactant.
体と固定化相補的免疫反応体とを反応させる前記の段階
において、該免疫反応体とともに一定量の標識免疫反応
体とを共存させて、競合法により行うことを特徴とする
方法。2. The method according to claim 1, wherein in said step of reacting the immunoreactant with the immobilized complementary immunoreactant, a fixed amount of a labeled immunoreactant together with the immunoreactant is used. A method comprising coexisting and being performed by a competitive method.
体と固定化相補的免疫反応体とを反応させる前記の段階
の後で、得られた反応生成物と、一定量の標識相補的免
疫反応体とを反応させるサンドイッチ法により行うこと
を特徴とする方法。3. The method according to claim 1, wherein after the step of reacting the immunoreactant with the immobilized complementary immunoreactant, the resulting reaction product and a fixed amount of label are obtained. A method comprising reacting with a complementary immunoreactant by a sandwich method.
体と固定化相補的免疫反応体とを反応させる前記の段階
において、該免疫反応体とともに一定量の標識相補的免
疫反応体とを共存させて、ワンステップサンドイッチ法
により行うことを特徴とする方法。4. The method of claim 1, wherein in said step of reacting the immunoreactant with an immobilized complementary immunoreactant, a fixed amount of a labeled complementary immunoreactor together with the immunoreactant. And coexisting by a one-step sandwich method.
において、 前記の容器がマイクロタイタープレートの各ウェルであ
り、前記の容器外からの磁場の印加を、下記の磁気分離
治具をマイクロタイタープレートの上面又は底面に装着
させ、磁石を各ウェルの側方に隣接させて配置すること
により行うことを特徴とする方法：マイクロタイタープ
レートが有する多数のウェルに側方から磁場を印加する
ための治具であって、 マイクロタイタープレートの上面又は底面と当接する平
坦なベースと、 該ベースのマイクロタイタープレートと当接する側の片
面上に、マイクロタイタープレートに挿入される複数の
磁石とを有してなり、前記の磁石の各々はマイクロタイ
タープレートの隣接するウェルの側方に隣接して挿入さ
れるように設けられている。5. The method according to claim 1, wherein the container is each well of a microtiter plate, and the application of a magnetic field from outside the container is performed by the following magnetic separation treatment. The method is carried out by mounting a tool on the top or bottom surface of the microtiter plate and arranging a magnet adjacent to the side of each well: applying a magnetic field from the side to a number of wells of the microtiter plate. A jig for applying, a flat base in contact with the top or bottom surface of the microtiter plate, and a plurality of magnets inserted into the microtiter plate on one side of the base in contact with the microtiter plate And each of the magnets is provided to be inserted adjacent to a side of an adjacent well of a microtiter plate. That.
ース上に設けられたすべての磁石がベースに対して平行
又は垂直方向に着磁されていることを特徴とする方法。6. The method according to claim 5, wherein all magnets provided on the base are magnetized parallel or perpendicular to the base.
ース面に平行に着磁されていて、さらに任意の磁石が隣
接する少なくとも一つの磁石と同一磁極が対向するよう
に配されていることを特徴とする方法。7. The method according to claim 6, wherein the magnets are magnetized in parallel to the base surface, and any magnet is arranged so that the same magnetic pole faces at least one adjacent magnet. A method characterized in that:
であって、前記の不溶性固相として前記容器の内壁面が
一つの免疫反応体を固定化するのに使用される方法。8. The method according to claim 1, wherein the inner wall surface of the container is used as the insoluble solid phase to immobilize one immunoreactant. .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11155521A JP2000346843A (en) | 1999-06-02 | 1999-06-02 | Immunological many-item measuring method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11155521A JP2000346843A (en) | 1999-06-02 | 1999-06-02 | Immunological many-item measuring method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000346843A true JP2000346843A (en) | 2000-12-15 |
Family
ID=15607893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11155521A Withdrawn JP2000346843A (en) | 1999-06-02 | 1999-06-02 | Immunological many-item measuring method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000346843A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7105359B2 (en) | 2002-11-12 | 2006-09-12 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Specific coupling reaction measuring method and reagent kit and specific coupling reaction measuring apparatus for use in the same |
| JP2006528337A (en) * | 2003-06-19 | 2006-12-14 | アボット・ラボラトリーズ | Apparatus and method for handling fluid for analysis |
| JP2007512543A (en) * | 2003-12-01 | 2007-05-17 | デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Homogeneous detection method |
| JP2012507703A (en) * | 2008-10-31 | 2012-03-29 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | Biosensor with multi-chamber cartridge |
| CN103765214A (en) * | 2012-08-31 | 2014-04-30 | 株式会社东芝 | Sample testing device |
-
1999
- 1999-06-02 JP JP11155521A patent/JP2000346843A/en not_active Withdrawn
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7105359B2 (en) | 2002-11-12 | 2006-09-12 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Specific coupling reaction measuring method and reagent kit and specific coupling reaction measuring apparatus for use in the same |
| US7553676B2 (en) | 2002-11-12 | 2009-06-30 | Panasonic Corporation | Specific coupling reaction measuring method |
| JP2006528337A (en) * | 2003-06-19 | 2006-12-14 | アボット・ラボラトリーズ | Apparatus and method for handling fluid for analysis |
| JP2007512543A (en) * | 2003-12-01 | 2007-05-17 | デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Homogeneous detection method |
| US8399209B2 (en) | 2003-12-01 | 2013-03-19 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Homogeneous detection method |
| US8628933B2 (en) | 2003-12-01 | 2014-01-14 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Homogeneous detection method |
| JP2012507703A (en) * | 2008-10-31 | 2012-03-29 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | Biosensor with multi-chamber cartridge |
| CN103765214A (en) * | 2012-08-31 | 2014-04-30 | 株式会社东芝 | Sample testing device |
| US9470700B2 (en) | 2012-08-31 | 2016-10-18 | Toshiba Medical Systems Corporation | Automatic analyzer |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7332353B2 (en) | Method for detecting analyte(s) using magnetic colloidal particles | |
| EP2488871B1 (en) | An assay method involving the use of magnetic particles | |
| US5145784A (en) | Double capture assay method employing a capillary flow device | |
| JP4324212B2 (en) | Magnetically assisted binding assay using magnetically responsive reagents | |
| JPH0670630B2 (en) | Analytical method | |
| US20140274784A1 (en) | Automated immunoanalyzer system for performing diagnostic assays for allergies and autoimmune diseases | |
| KR101003534B1 (en) | Quantative detection method of biomolecules using magnetic nano particle and frequency mixing magnetic reader | |
| US7700298B2 (en) | Methods for determination of an analyte | |
| US20080268481A1 (en) | Sensitive Magnetic Catch Assay By Building a Strong Binding Couple | |
| JPH11502625A (en) | Apparatus and method for reagent separation in a chemical analyzer | |
| JP2000292426A (en) | Immunoassay using microtiter plate | |
| Yu et al. | Development of a magnetic microplate chemifluorimmunoassay for rapid detection of bacteria and toxin in blood | |
| JPWO2002073203A1 (en) | Whole blood measurement method | |
| JP2000346843A (en) | Immunological many-item measuring method | |
| US6479302B1 (en) | Method for the immunological determination of an analyte | |
| US20130122517A1 (en) | Method of performing an assay | |
| KR20010025027A (en) | Immunoassay reagents and immunoassay method | |
| JPH0580052A (en) | Apparatus and method for measuring substance in vivo | |
| US20080227111A1 (en) | Reagent kit and method for measuring hcv antibody | |
| JPH05504828A (en) | Capillary flow device and dual capture assay method | |
| US20220397572A1 (en) | Bead systems, methods, and apparatus for magnetic bead-based analyte detection | |
| JPH09229936A (en) | Measuring method for material under inspection using magnetic particles, and carrier and measuring instrument used in the method | |
| EP0417301A1 (en) | Method for assaying indirect agglutination | |
| KR102220357B1 (en) | Immunodiagnostic kit and immunodiagnostic method using the same | |
| JPH02275360A (en) | Build-up of signal in magnetic immnoassay by depression of enzyme catalysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060905 |