JP2000329768A - Immunoassay reagent and production thereof - Google Patents
Immunoassay reagent and production thereofInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を利用
した免疫測定試薬及び免疫測定試薬の製造方法、特に、
被測定物質を高感度で測定できる免疫測定試薬及び免疫
測定試薬の製造方法に関する。[0001] The present invention relates to an immunoassay reagent using an insoluble carrier and a method for producing the immunoassay reagent.
The present invention relates to an immunoassay reagent capable of measuring a substance to be measured with high sensitivity and a method for producing the immunoassay reagent.
【０００２】[0002]
【従来の技術】臨床検査の分野では、生体試料（例え
ば、 血液、尿など）を用いて種々の疾患の診断を行って
おり、これらを診断する方法として、種々の測定法が開
発され、利用されている。これらの測定方法の代表的方
法として、酵素反応を利用する生化学測定法や、抗原抗
体反応を利用する免疫測定法が挙げられる。近年におい
ては、生体試料中の成分を精度良く測定することが望ま
れ、特異性の高い抗原抗体反応を利用した免疫測定法が
盛んに用いられている。2. Description of the Related Art In the field of clinical examination, various diseases are diagnosed using biological samples (eg, blood, urine, etc.). Various diagnostic methods have been developed and used as methods for diagnosing these diseases. Have been. Representative methods of these measurement methods include a biochemical measurement method using an enzyme reaction and an immunoassay method using an antigen-antibody reaction. In recent years, it has been desired to accurately measure components in a biological sample, and an immunoassay utilizing a highly specific antigen-antibody reaction has been actively used.
【０００３】特開平８−１０５８９７号公報では、ラテ
ックスを利用した免疫測定試薬において、抗原をラテッ
クスに感作させた後、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳ
Ａと略す）でブロッキングと呼ばれる操作を行って製造
される免疫測定試薬について開示されている。これは、
抗原を感作した後、ＢＳＡを感作することにより、検体
中の物質によるラテックスへの非特異反応を防ぎ、測定
感度を向上させたものである。しかしながら、このよう
にＢＳＡを抗原感作後にブロッキングすると、ラテック
ス表面だけでなく、抗原上にもＢＳＡがブロッキングさ
れ、測定の際、十分な感度が得られないことが多いとい
う問題点があった。Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-1085897 discloses that in an immunoassay reagent using latex, an antigen is sensitized to latex, and then a bovine serum albumin (hereinafter, BS) is used.
A), and discloses an immunoassay reagent produced by performing an operation called blocking. this is,
By sensitizing with BSA after sensitizing with the antigen, non-specific reaction of the substance in the sample with latex is prevented, and measurement sensitivity is improved. However, when BSA is blocked after sensitization with an antigen, BSA is blocked not only on the surface of the latex but also on the antigen, and there is a problem that sufficient sensitivity is often not obtained at the time of measurement.
【０００４】また、特開平９−２９７１４１号公報に
は、測定の迅速化かつ高感度化を目指して、抗原とキャ
リアータンパク質との化学結合により調製した複合抗原
を固相に感作させた試薬について開示されている。しか
しながら、この試薬については、その製造工程におい
て、抗原とキャリアータンパク質を化学結合させる方法
に限界があり、例えば、 化学結合により複合抗原の溶解
性が下がり、 その結果、固相への感作量が減り測定感度
が低下するという問題点や、 キャリアータンパク質と結
合させた際に、 結合方法によっては抗原性を失活させて
しまうという問題点があった。特に、 上記公報に記載の
ある測定試薬は、ＨＣＶ抗原のコアにあたるｃ２２やＮ
Ｓ４タンパクの一部のエピトープを取り出したタンパク
を用いているので、キャリアータンパク質と化学結合さ
せた場合、 水に対する溶解性が低く、 これらを固相に感
作させても十分な感度が得られないという問題点があっ
た。Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-297141 discloses a reagent obtained by sensitizing a solid phase with a complex antigen prepared by chemical bonding of an antigen and a carrier protein, with the aim of speeding up measurement and increasing sensitivity. It has been disclosed. However, in the production process of this reagent, there is a limit in the method of chemically bonding the antigen and the carrier protein. For example, the solubility of the complex antigen is reduced by the chemical bond, and as a result, the amount of sensitization to the solid phase is reduced. Thus, there is a problem that the measurement sensitivity is reduced and that the antigenicity is deactivated depending on the binding method when the protein is bound to a carrier protein. In particular, the measurement reagents described in the above publications include c22 and N, which are the core of the HCV antigen.
Since a protein obtained by extracting a part of the epitope of S4 protein is used, its solubility in water is low when chemically bonded to a carrier protein, and sufficient sensitivity cannot be obtained even when these are sensitized to a solid phase. There was a problem.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点を
解決するためのものであり、その目的は、試料中の抗原
または抗体など微量の被測定物質を高感度で測定するこ
とのできる免疫測定試薬及び免疫測定試薬の製造方法を
提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide an immunoassay capable of measuring a trace amount of a substance to be measured such as an antigen or antibody in a sample with high sensitivity. An object of the present invention is to provide a method for producing a measurement reagent and an immunoassay reagent.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本明細書中において、一
文章中に、抗原（または抗体）という表現と、抗体（ま
たは抗原）という表現がある場合、括弧内は括弧内同士
が対応し、括弧外は括弧外同士が対応するものとする。Means for Solving the Problems In the present specification, when the expression "antigen (or antibody)" and the expression "antibody (or antigen)" are contained in one sentence, the values in parentheses correspond to each other in parentheses. The parts outside the parentheses correspond to each other.
【０００７】請求項１記載の発明は、 被測定物質である
抗原（または抗体）との抗原抗体反応による不溶性担体
の凝集の度合いを検出することにより被測定物質を測定
する免疫測定試薬の製造方法であって、第１の工程とし
て、キャリアータンパク質を不溶性担体に担持させる工
程を行った後、第２の工程として、被測定物質に対する
抗体（または抗原）を上記第１の工程が行われた不溶性
担体に担持させる工程を行うことを特徴とする免疫測定
試薬の製造方法である。The invention according to claim 1 is a method for producing an immunoassay reagent for measuring a substance to be measured by detecting the degree of aggregation of an insoluble carrier by an antigen-antibody reaction with an antigen (or antibody) as the substance to be measured. In a first step, a step of supporting a carrier protein on an insoluble carrier is performed, and then, as a second step, an antibody (or antigen) against the substance to be measured is insoluble in the first step. This is a method for producing an immunoassay reagent, which comprises a step of supporting the reagent on a carrier.
【０００８】上記被測定物質としては、生体試料中の抗
原または抗体が挙げられ、例えば、肝炎（Ｂ型、Ｃ型）
由来抗原または抗体、ＨＩＶ抗原または抗体、梅毒由来
抗原または抗体、α−フェトプロテインに代表される癌
マーカー、インシュリンに代表されるホルモン、オータ
コイドなどが挙げられるが、特にこれらのみに限定され
るものではない。[0008] Examples of the substance to be measured include an antigen or an antibody in a biological sample, and examples thereof include hepatitis (types B and C).
Derived antigens or antibodies, HIV antigens or antibodies, syphilis-derived antigens or antibodies, cancer markers represented by α-fetoprotein, hormones represented by insulin, autakoids, and the like, but are not particularly limited thereto. .
【０００９】本発明で用いられる不溶性担体としては、
例えば、 有機高分子粉末、 微生物、血球または細胞膜片
等が挙げられる。The insoluble carrier used in the present invention includes:
For example, organic polymer powders, microorganisms, blood cells or cell membrane fragments can be used.
【００１０】上記有機高分子粉末としては、例えば、 不
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の
天然高分子粉末；ポリスチレン、スチレン−スルホン酸
（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ア
クリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化
ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−ア
クリル酸エステル共重合体などの合成高分子粉末などが
挙げられる。Examples of the organic polymer powder include natural polymer powders such as insoluble agarose, cellulose and insoluble dextran; polystyrene, styrene-sulfonic acid (salt) copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile- Synthetic polymer powders such as butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, and vinyl acetate-acrylate copolymer are exemplified.
【００１１】上記不溶性担体として、特に、合成高分子
粉末を均一に懸濁させたラテックスを用いるのが好まし
い。 この場合、 ラテックス粒子の粒径は、０．０５〜
１．５μｍが好ましく、 ０．１〜０．８μｍがより好ま
しい。As the insoluble carrier, it is particularly preferable to use a latex in which a synthetic polymer powder is uniformly suspended. In this case, the particle size of the latex particles is 0.05 to
1.5 μm is preferred, and 0.1 to 0.8 μm is more preferred.
【００１２】また、上記不溶性担体として、表面にスル
ホン酸基やカルボキシル基などを導入した不溶性担体も
適宜使用することができる。Further, as the above-mentioned insoluble carrier, an insoluble carrier having a sulfonic acid group, a carboxyl group, or the like introduced on its surface can be used as appropriate.
【００１３】本発明の免疫測定試薬の製造方法において
は、まず第１の工程として、 キャリアータンパク質を不
溶性担体に担持させる工程が行われる。 キャリアータン
パク質の不溶性担体への担持方法は、 物理吸着、化学結
合のいずれでも良い。In the method for producing an immunoassay reagent of the present invention, first, a step of carrying a carrier protein on an insoluble carrier is performed as a first step. The method for loading the carrier protein on the insoluble carrier may be either physical adsorption or chemical bonding.
【００１４】上記物理吸着を利用する場合には、キャリ
アータンパク質を含む溶液に不溶性担体の懸濁液を添加
し、 攪拌することにより担持させることができる。When utilizing the above-mentioned physical adsorption, a suspension of an insoluble carrier is added to a solution containing a carrier protein, and the carrier can be supported by stirring.
【００１５】また、上記化学結合を利用する場合には、
表面にスルホン酸基やカルボキシル基が導入されている
不溶性担体を用い、 適当な架橋剤を反応させることによ
り、キャリアータンパク質を不溶性担体に担持させるこ
とができる。架橋剤としては、例えば、 Ｎ−サクシイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−１−カルボキシ
レート等を用いることができる。When utilizing the above chemical bond,
The carrier protein can be supported on the insoluble carrier by using an insoluble carrier having a sulfonic acid group or a carboxyl group introduced on its surface and reacting with an appropriate crosslinking agent. As the crosslinking agent, for example, N-succiimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -1-carboxylate and the like can be used.
【００１６】上記キャリアータンパク質を担持させる
際、溶液のｐＨは、３〜１０、温度は２〜５０℃が好ま
しい。 これは、ｐＨがこの範囲を外れると、キャリアー
タンパク質が変性してしまうなどの問題点があるためで
ある。また、温度については、２℃未満であれば、反応
速度が遅く、 所望の感度を有する試薬が得られにくくな
り、５０℃を超えると、 キャリアータンパク質が変性し
てしまうなどの問題点があるため、上記範囲であるのが
好ましい。When carrying the carrier protein, the pH of the solution is preferably 3 to 10 and the temperature is preferably 2 to 50 ° C. This is because if the pH is out of this range, there is a problem that the carrier protein is denatured. If the temperature is lower than 2 ° C., the reaction rate is low, and it is difficult to obtain a reagent having a desired sensitivity. If the temperature is higher than 50 ° C., there is a problem that the carrier protein is denatured. And the above range is preferable.
【００１７】本発明において不溶性担体に担持させるキ
ャリアータンパク質としては、例えば、 血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、ヘモシアニン等が挙げられ、 特に
限定されるものではないが、入手の容易さからウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を用いるのが好ましい。 また、糖
と結合した糖タンパクや脂質と結合したリポタンパクの
ように、タンパク質と他の物質が結合したものでも良
い。In the present invention, the carrier protein to be carried on the insoluble carrier includes, for example, serum albumin, ovalbumin, hemocyanin, etc., but is not particularly limited, but bovine serum albumin (BSA) is easily available. It is preferable to use Further, a protein and another substance may be bonded, such as a glycoprotein bonded to a sugar or a lipoprotein bonded to a lipid.
【００１８】本発明の免疫測定試薬の製造方法において
は、第２の工程として、被測定物質に対する抗体（また
は抗原）を上記第１の工程が行われた不溶性担体に担持
させる工程が行なわれる。In the method for producing an immunoassay reagent of the present invention, as a second step, an antibody (or antigen) for the substance to be measured is supported on the insoluble carrier subjected to the first step.
【００１９】本発明において不溶性担体に担持される抗
体の種類としては、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体のいずれでもよい。また、その製造方法について
も、特に限定されず、 公知の方法のいずれをも用いるこ
とができる。ポリクローナル抗体を用いる場合であれ
ば、 ウサギ、 山羊、メン山羊などの動物に使用する酵素
を免疫して産生させればよい。モノクローナル抗体につ
いても、公知のものを用いることができる。このように
して得られた抗体については公知のクロマトグラフィー
などによって、適宜精製してもよいし、 場合によって
は、特別の精製をせずに用いてもよい。In the present invention, the type of the antibody carried on the insoluble carrier may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Also, the method for producing the same is not particularly limited, and any known method can be used. When a polyclonal antibody is used, it may be produced by immunizing an enzyme used in animals such as rabbits, goats, and goats. Known monoclonal antibodies can also be used. The antibody thus obtained may be appropriately purified by known chromatography or the like, or may be used without special purification in some cases.
【００２０】被測定物質に対する抗体（または抗原）の
上記第１の工程が行われた不溶性担体への担持方法は、
物理吸着あるいは化学結合のいずれでも良い。物理吸着
を利用する場合には、 抗体（または抗原）を含む溶液
に、上述のキャリアータンパク質を不溶性担体に担持さ
せたものの懸濁液を添加し攪拌することによって担持さ
せることができる。また、化学結合を利用する場合に
は、 キャリアータンパク質あるいは不溶性担体表面のア
ミノ基やカルボキシル基を利用し、適当な架橋剤を添加
することにより、キャリアータンパク質に抗体（または
抗原）を担持させることができる。The method for supporting an antibody (or antigen) against the substance to be measured on the insoluble carrier in which the first step has been performed is as follows.
Either physical adsorption or chemical bonding may be used. When physical adsorption is used, the carrier can be supported by adding a suspension of the above-described carrier protein supported on an insoluble carrier to a solution containing the antibody (or antigen) and stirring the solution. When chemical bonding is used, an antibody (or antigen) can be carried on the carrier protein by using an amino group or a carboxyl group on the surface of the carrier protein or the insoluble carrier and adding an appropriate crosslinking agent. it can.
【００２１】上記物理吸着または化学結合により抗体
（または抗原）を担持させる際、溶液のｐＨは、３〜１
０、温度は、２〜５０℃が好ましい。When carrying an antibody (or antigen) by the above physical adsorption or chemical bonding, the pH of the solution is 3 to 1
0, temperature is preferably 2 to 50 ° C.
【００２２】本発明によって得られた免疫測定試薬を使
用する際には、 適当な緩衝液などで希釈して用いてもよ
い。When the immunoassay reagent obtained according to the present invention is used, it may be used after diluting it with an appropriate buffer or the like.
【００２３】上記緩衝液としては、例えば、 リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液な
どが挙げられるが、 特に限定されず、 使用する基質等の
特性を考慮し、 適宜選択して用いればよい。The buffer includes, for example, phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, Good buffer, and the like, but is not particularly limited, and may be appropriately selected in consideration of the characteristics of the substrate to be used. It may be used.
【００２４】請求項３記載の発明は、被測定物質である
抗原（または抗体）との抗原抗体反応による不溶性担体
の凝集の度合いを検出することにより被測定物質を測定
する免疫測定試薬であって、被測定物質に対する抗体
（または抗原）の少なくとも一部が、 キャリアータンパ
ク質を介して不溶性担体に担持されていることを特徴と
する免疫測定試薬である。According to a third aspect of the present invention, there is provided an immunoassay reagent for measuring a substance to be measured by detecting the degree of aggregation of an insoluble carrier due to an antigen-antibody reaction with an antigen (or antibody) as the substance to be measured. An immunoassay reagent characterized in that at least a part of an antibody (or antigen) against a substance to be measured is carried on an insoluble carrier via a carrier protein.
【００２５】上記免疫測定試薬は、被測定物質に対する
抗体（または抗原）の少なくとも一部が、 キャリアータ
ンパク質を介して不溶性担体に担持されていればよく、
被測定物質に対する抗体（または抗原）の一部分におい
ては、直接、不溶性担体に担持されていてもよい。この
免疫測定試薬は、特に限定されるものではないが、 上記
請求項１または２記載の免疫測定試薬の製造方法により
製造することができる。The immunoassay reagent only needs to have at least a part of an antibody (or antigen) against the substance to be measured supported on an insoluble carrier via a carrier protein.
A part of the antibody (or antigen) for the substance to be measured may be directly supported on an insoluble carrier. This immunoassay reagent is not particularly limited, but can be produced by the method for producing an immunoassay reagent according to claim 1 or 2.
【００２６】[0026]
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００２７】 ［実施例１］ ： 物理吸着を利用した免疫測定試薬 （１）梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液の調製 ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）２ｍＬを、平均粒径０．４μｍのポリ
スチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化
学工業社製）１００μＬに添加し、４℃で１．５時間攪
拌した。次に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に
１５μｇ／ｍＬの蛋白濃度で溶解させた梅毒トレポネー
マ抗原液４００μＬを添加し、１時間攪拌した。この液
を１０℃にて３０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心し
た。得られた沈殿物にＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）含
有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍＬを
添加し、ラテックスを懸濁させ、梅毒トレポネーマ抗原
感作ラテックス液を調製した。[Example 1]: Reagent for immunoassay utilizing physical adsorption (1) Preparation of Treponema pallidum antigen-sensitized latex solution 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) BSA 2 mL was added to 100 μL of polystyrene latex having an average particle size of 0.4 μm (solid content: 10% (w / v), manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) and stirred at 4 ° C. for 1.5 hours. Next, 400 μL of Treponema pallidum antigen solution dissolved in a 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) at a protein concentration of 15 μg / mL was added and stirred for 1 hour. This solution was centrifuged at 18,000 rpm at 10 ° C. for 30 minutes. To the obtained precipitate, 5 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.25% (w / v) of BSA was added, and the latex was suspended to prepare a T. pallidum antigen-sensitized latex solution. .
【００２８】（２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）及びｐＧＥＭＡ（グリコ
シルエチルメタクリレートのホモポリマー、平均分子量
１１４万、日本精化社製）を１％（ｗ／ｖ）含有する１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウムをその濃度が５ｍＭとなるように溶
解させ、検体希釈液とした。(2) Preparation of Sample Dilution Solution BSA was 0.25% (w / v) and pGEMA (glycosylethyl methacrylate homopolymer, average molecular weight 1.14 million, manufactured by Nippon Seika) was 1% (w / v). 1) containing
Sodium ethylenediaminetetraacetate was dissolved in a 00 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 5 mM to prepare a sample diluent.
【００２９】（３）抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬は、上記（１）項の梅
毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液からなる第１試薬
と、上記（２）項の検体希釈液からなる第２試薬とから
構成される２液系の試薬である。(3) Reagent for measuring anti-Treponemal antibody in Treponema pallidum The reagent for measuring anti-Treponemal antibody in Treponema pallidum is obtained from the first reagent consisting of the latex solution sensitized to Treponema pallidum antigen in the above item (1) and the sample diluent in the above item (2). And a second reagent.
【００３０】（４）標準物質 抗梅毒トレポネーマ抗体を０、１７、６７、４７５Ｔ．
Ｕ．（タイターユニット）含むヒト血清を標準抗梅毒ト
レポネーマ抗体液として使用した。(4) Standard substance Anti-Treponemal anti-Syphilis antibody was used at 0, 17, 67, 475T.
U. (Titer unit) -containing human serum was used as a standard anti-treponema pallidum antibody solution.
【００３１】（５）自動分析装置による抗梅毒トレポネ
ーマ抗体価測定 以下に、生化学自動分析装置「日立７０５０型」（日立
製作所社製）により、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体
を測定する方法を示す。 測定モード ： Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ａｂｓ パラメーター： 検体量 ２０μＬ ラテックス試薬（第１試薬）量 ５０μＬ 検体希釈液（第２試薬）量 ３５０μＬ 測定波長 ： ５７０ｎｍ 測定時間 ： 検体分注後、直ちに検体希釈液が添加・混合され、その後、 ラテックス試薬が添加・混合される。ラテックス試薬の添加後、８０秒から３２ ０秒までの吸光度変化量を求め、これを反応量とした。反応系のｐＨは、７．４ で行った。(5) Measurement of anti-Treponemal antibody titer of anti-Syphilis by an automatic analyzer The following shows a method of measuring an anti-Treponemal antibody in a sample by an automatic biochemical analyzer "Hitachi 7050" (manufactured by Hitachi, Ltd.). . Measurement mode: Original Abs Parameters: Sample volume 20 μL Latex reagent (first reagent) volume 50 μL Sample diluent (second reagent) volume 350 μL Measurement wavelength: 570 nm Measurement time: Sample diluent is added and mixed immediately after sample dispensing Then, the latex reagent is added and mixed. After the addition of the latex reagent, the amount of change in absorbance from 80 seconds to 320 seconds was determined and used as the reaction amount. The pH of the reaction system was 7.4.
【００３２】 ［実施例２］ ： 化学結合を利用した免疫測定試薬 実施例１の（１）項を以下のようにしたこと以外は、 実
施例１と同様に行った。 （１）梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液の調製 ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）２ｍＬを、平均粒径０．４μｍのポリ
スチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化
学工業社製）１００μＬに添加し、４℃にて１．５時間
攪拌した。これにＳＭＣＣ（Ｎ−サクシイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）−１−カルボキシレート）８
ｍｇ／ｍＬジメチルホルムアミド溶液０．４ｍＬを加
え、３０℃で１０分間攪拌し、ＢＳＡとＳＭＣＣを結合
させた。ついで、上記溶液を透析膜（ＵＣ−３２−１０
０：サイズ２０／３２、三光純薬社製）を用い、生理食
塩水（０．９％ ＮａＣｌ）３Ｌで一昼夜透析した。透
析後、上記溶液に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に溶解した梅毒トレポネーマ抗原液４００μＬを添
加し、４℃で１時間攪拌した。この液を１０℃にて、３
０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心した。得られた沈殿
物にＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍＬを添加し、ラテック
スを懸濁させ、梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液
を調製した。Example 2 Immunoassay Reagent Utilizing Chemical Bonding The procedure of Example 1 was repeated, except that item (1) of Example 1 was changed as follows. (1) Preparation of Treponema pallidum antigen-sensitized latex solution 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% (w / v) of BSA was added to polystyrene latex having an average particle size of 0.4 μm (solid content: 10% (W / v), manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) and stirred at 4 ° C. for 1.5 hours. In addition to this, SMCC (N-succiimidyl-4-
(N-maleimidomethyl) -1-carboxylate) 8
0.4 mL of a mg / mL dimethylformamide solution was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 10 minutes to bind BSA and SMCC. Next, the above solution was applied to a dialysis membrane (UC-32-10).
0: Size 20/32, manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.), and dialyzed with 3 L of physiological saline (0.9% NaCl) all day and night. After dialysis, the above solution was treated with 100 mM phosphate buffer (pH 7.
400 μL of the Treponema pallidum antigen solution dissolved in 4) was added thereto, followed by stirring at 4 ° C. for 1 hour. This solution is heated at 10 ° C for 3
Centrifuged at 18,000 rpm for 0 minutes. The obtained precipitate is 100 mM containing 0.25% (w / v) of BSA.
5 mL of a phosphate buffer (pH 7.4) was added to suspend the latex, thereby preparing a Treponema pallidum antigen-sensitized latex solution.
【００３３】［比較例１］ ： 従来の免疫測定試薬 実施例１の（１）項を以下のようにしたこと以外は、 実
施例１と同様に行った。 （１）梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液の調製 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬに１５μ
ｇ／ｍＬの蛋白濃度で溶解させた梅毒トレポネーマ抗原
液４００μＬを、平均粒径０．４μｍのポリスチレンラ
テックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社
製）１００μＬに添加し、４℃にて１．５時間攪拌し
た。ついで、ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬを添加し、１．５
時間攪拌した。この液を１０℃にて３０分間、１８，０
００ｒｐｍで遠心した。得られた沈殿物にＢＳＡを０．
２５％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）５ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、梅
毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液を調製した。[Comparative Example 1]: Conventional immunoassay reagent The same procedure as in Example 1 was carried out except that item (1) of Example 1 was changed as follows. (1) Preparation of T. pallidum antigen-sensitized latex solution 15 μl in 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.4)
400 μL of Treponema pallidum antigen solution dissolved at a protein concentration of g / mL was added to 100 μL of polystyrene latex (solid content: 10% (w / v), manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) having an average particle size of 0.4 μm, and the solution was added at 4 ° C. For 1.5 hours. Then, 100m containing 1% (w / v) of BSA
M phosphate buffer (pH 7.4) 2 mL, add 1.5 mL
Stirred for hours. This solution was added at 18.0 ° C for 30 minutes and
Centrifuge at 00 rpm. BSA was added to the resulting precipitate in an amount of 0.
100 mM phosphate buffer containing 25% (w / v) (p
H7.4) 5 mL was added, and the latex was suspended to prepare a Treponema pallidum antigen-sensitized latex solution.
【００３４】測定結果 上記実施例１・２、比較例１で得られた検体の吸光度変
化量を表１に示した。いずれもｎ＝２回の平均値を示し
た。Measurement Results Table 1 shows the change in absorbance of the samples obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1. In each case, the average value of n = 2 times was shown.
【００３５】[0035]
【表１】 [Table 1]
【００３６】[0036]
【発明の効果】本発明により製造された免疫測定試薬
は、従来法による免疫測定試薬のように、不溶性担体に
担持された抗原または抗体の上にキャリアータンパク質
が担持されてしまうということがない。この結果、 本発
明による免疫測定試薬を用いると、吸光度変化量が大き
くなり、検出感度を向上させることが可能となる。According to the immunoassay reagent produced by the present invention, the carrier protein is not carried on the antigen or antibody carried on the insoluble carrier, unlike the immunoassay reagent according to the conventional method. As a result, when the immunoassay reagent according to the present invention is used, the amount of change in absorbance increases, and the detection sensitivity can be improved.
Claims (3)
の抗原抗体反応による不溶性担体の凝集の度合いを検出
することにより被測定物質を測定する免疫測定試薬の製
造方法であって、第１の工程として、キャリアータンパ
ク質を不溶性担体に担持させる工程を行った後、第２の
工程として、被測定物質に対する抗体（または抗原）を
上記第１の工程が行われた不溶性担体に担持させる工程
を行うことを特徴とする免疫測定試薬の製造方法。1. A method for producing an immunoassay reagent for measuring a substance to be measured by detecting the degree of aggregation of an insoluble carrier by an antigen-antibody reaction with an antigen (or antibody) as the substance to be measured, comprising: After the step of carrying the carrier protein on the insoluble carrier as the step, the step of carrying the antibody (or antigen) against the substance to be measured on the insoluble carrier after the first step is carried out as the second step. A method for producing an immunoassay reagent.
ブミンであることを特徴とする請求項１記載の免疫測定
試薬の製造方法。2. The method according to claim 1, wherein the carrier protein is serum albumin.
の抗原抗体反応による不溶性担体の凝集の度合いを検出
することにより被測定物質を測定する免疫測定試薬であ
って、被測定物質に対する抗体（または抗原）の少なく
とも一部が、 キャリアータンパク質を介して不溶性担体
に担持されていることを特徴とする免疫測定試薬。3. An immunoassay reagent for measuring a substance to be measured by detecting the degree of aggregation of an insoluble carrier by an antigen-antibody reaction with an antigen (or antibody) as the substance to be measured, wherein the antibody against the substance to be measured is used. An immunoassay reagent characterized in that at least a part of (or an antigen) is carried on an insoluble carrier via a carrier protein.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11137469A JP2000329768A (en) | 1999-05-18 | 1999-05-18 | Immunoassay reagent and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11137469A JP2000329768A (en) | 1999-05-18 | 1999-05-18 | Immunoassay reagent and production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000329768A true JP2000329768A (en) | 2000-11-30 |
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ID=15199342
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| JP11137469A Withdrawn JP2000329768A (en) | 1999-05-18 | 1999-05-18 | Immunoassay reagent and production thereof |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000329768A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004069677A (en) * | 2002-06-13 | 2004-03-04 | Canon Inc | Immunological measuring method, reagent for immunological measurement, and its manufacturing method |
-
1999
- 1999-05-18 JP JP11137469A patent/JP2000329768A/en not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004069677A (en) * | 2002-06-13 | 2004-03-04 | Canon Inc | Immunological measuring method, reagent for immunological measurement, and its manufacturing method |
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