JP2000253896A - Production of l-threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject derivative useful for, e.g., a remedy against Parkinson's disease at a high purity and in a high yield by treating an isomer mixture of dihydroxyphenylserine derivatives under a specific condition to make the decomposition of unnecessary isomers efficiently progress. SOLUTION: When producing a L-threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative by decomposing unnecessary isomers in an isomer mixture of 3-(3,4- dihydroxyphenyl)serine derivatives including a L-threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative of the formula (wherein, R1 and R2 are each H, a lower alkyl or the like) under the action of D-threoninealdolase alone or together with L-allothreoninealdolase into glycine and corresponding aldehydes, the decomposition reaction of the unnecessary isomers is carried out in the presence of an organic solvent such as ethyl acetate or diethyl ether, capable of forming two phases with water, and an aqueous medium. The weight ratio of the organic solvent to the aqueous medium is preferably (90/10)-(10/90).

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、パーキンソン病等
の治療薬に用いられているＬ−スレオ−３−（３，４−
ジヒドロキシフェニル）セリン（以下、Ｌ−スレオ−Ｄ
ＯＰＳと略す）、あるいはその誘導体の製造方法に関す
る。[0001] The present invention relates to L-threo-3- (3,4-) which has been used as a therapeutic drug for Parkinson's disease and the like.
Dihydroxyphenyl) serine (hereinafter L-threo-D)
OPS) or a derivative thereof.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体の合
成は、以下の方法により行われていた。すなわち、必要
に応じて保護基を導入したアルデヒド誘導体とグリシン
を強アルカリ下で縮合させることによりラセミ−スレオ
／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を合成する。得られたＤＯ
ＰＳ誘導体の保護基を除去し、アミノ基部分に置換基を
導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて
光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去す
るというものである。スレオ／エリスロ体の相互分離処
理が必要な場合は、縮合反応後のいずれかのステップに
おいて行う。2. Description of the Related Art Conventionally, the synthesis of L-threo-DOPS derivatives has been carried out by the following method. That is, a racemic-threo / erythro-DOPS derivative is synthesized by condensing an aldehyde derivative having a protecting group introduced therein and glycine under a strong alkali, if necessary. DO obtained
After removing the protecting group of the PS derivative and introducing a substituent into the amino group, optical resolution is performed using an optical resolving agent such as quinine or brucine, and finally the substituent in the amino group is removed. is there. If the threo / erythro isomers need to be separated from each other, they are performed in any step after the condensation reaction.

【０００３】このようなＬ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体の
化学的合成に当たっては、必要に応じて各種の特定の保
護基を導入したり、除去することが必要であるのに加え
て、その合成工程において２種以上の立体異性体が生じ
ることから、それら異性体の分離には少なくとも複数の
工程が必須であり、さらに各種置換基の導入除去工程も
それに伴って必要であることから、工業的製造の上で大
きな問題となっていた。[0003] In the chemical synthesis of such L-threo-DOPS derivatives, it is necessary to introduce or remove various specific protecting groups as required, and in addition to the above, in the synthesis process. Since two or more types of stereoisomers are generated, at least a plurality of steps are essential for separating these isomers, and a step of introducing and removing various substituents is also required. Was a big problem above.

【０００４】このうち特に、光学分割工程は、複雑で収
率が悪いばかりでなく、それに使用する光学分割剤も高
価であり、工業的製造法としては問題があった。さらに
従来の光学分割法では、結果として得られる不要な異性
体は、再度それを利用するために別途ラセミ化したり、
分解したりする必要があり、ますます製造設備などが複
雑となることになっていた。[0004] Among them, the optical resolution step is not only complicated and has a low yield, but also the optical resolution agent used for it is expensive, and thus has a problem as an industrial production method. Further, in the conventional optical resolution method, the resulting unnecessary isomer is separately racemized to utilize it again,
It had to be disassembled, and the production equipment was becoming more and more complicated.

【０００５】このような化学的光学分割法に対し、ＤＯ
ＰＳ誘導体の異性体混合物のうち不要な異性体を特異的
にグリシンと対応するアルデヒドに分解する酵素を用
い、所望の異性体を製造する酵素的光学分割法が開示さ
れている（特開平４−３３０２９７号公報、特開平４−
３４６７９５号公報）。For such a chemical optical resolution method, DO
An enzymatic optical resolution method for producing a desired isomer using an enzyme that specifically decomposes an unnecessary isomer into an isomer mixture of a PS derivative into glycine and a corresponding aldehyde has been disclosed (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-1992). No. 330297, Japanese Unexamined Patent Publication No.
No. 346795).

【０００６】この方法は、ＤＯＰＳ誘導体の異性体混合
物のうち不要な異性体のみを特異的にグリシンと対応す
るアルデヒドに分解する酵素を、水性媒体中にて、ＤＯ
ＰＳ誘導体の異性体混合物に作用させることにより、残
存した目的の異性体を取得するものであり、分解生成物
は再度異性体混合物の合成原料として利用できる。よっ
て、化学的光学分割において必要な各種置換基の導入除
去工程が不要であるばかりでなく、不要な異性体を利用
するためのラセミ化あるいは分解も不要であり、結果と
して安価かつ高効率で目的物が得られるという利点を有
している。In this method, an enzyme which specifically decomposes only an unnecessary isomer of a mixture of isomers of a DOPS derivative into glycine and a corresponding aldehyde is converted into a DO medium in an aqueous medium.
The remaining target isomer is obtained by acting on the isomer mixture of the PS derivative, and the decomposition product can be reused as a raw material for synthesizing the isomer mixture. Therefore, not only is the step of introducing and removing various substituents necessary in the chemical optical resolution unnecessary, but also the need for racemization or decomposition for utilizing unnecessary isomers is eliminated, resulting in low cost and high efficiency. It has the advantage that a product can be obtained.

【０００７】しかしながら、上記公報において記載され
ている水性媒体中での反応においては、基質濃度が比較
的低濃度である場合には不要な異性体の分解が効率的に
進行するものの、実用的な基質濃度で実施した場合には
分解反応が途中で停止してしまい、結果として目的とす
る異性体の光学純度が向上しないという問題点が見出さ
れた。また、分解反応により生成するアルデヒドの種類
によっては、水性媒体中での安定性が低いために副反応
により失われ、反応阻害や回収率の低下等の問題も生じ
ることが明らかとなった。However, in the reaction in an aqueous medium described in the above publication, when the substrate concentration is relatively low, the decomposition of unnecessary isomers proceeds efficiently, When the reaction was carried out at a substrate concentration, the decomposition reaction was stopped halfway, resulting in a problem that the optical purity of the target isomer was not improved. In addition, it was clarified that, depending on the type of the aldehyde generated by the decomposition reaction, the stability in an aqueous medium was low, so that the aldehyde was lost by a side reaction, and problems such as inhibition of the reaction and a decrease in the recovery rate occurred.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記問
題を解決するために鋭意検討した結果、酵素的分割反応
を行うに際し、水と二相を形成しうる有機溶媒を存在さ
せることにより、基質濃度を高くした場合でも不要な異
性体の分解が効率よく進行し、分解反応により生成した
アルデヒドに起因する副反応も抑制され、分解生成物の
分離も反応と同時に行うことができるため工程の簡略化
が可能であることを見出し、本発明を完成するにいたっ
た。SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that when an enzymatic resolution reaction is carried out, an organic solvent capable of forming two phases with water is present. Even when the substrate concentration is increased, the decomposition of unnecessary isomers proceeds efficiently, side reactions caused by aldehydes generated by the decomposition reaction are suppressed, and the separation of decomposition products can be performed simultaneously with the reaction. Have been found to be possible, and have completed the present invention.

【０００９】[0009]

【課題を解決しようとする手段】すなわち、本発明は、
（１）一般式That is, the present invention provides:
(1) General formula

【化２】 （式中、Ｒ₁，Ｒ₂は、同一又は相異なり、水素、低級ア
ルキル又は低級アラルキル基を示すが、Ｒ₁、Ｒ₂共にア
ルキレン基で置換されて環を形成してしていてもよい）
で表わされるＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシ
フェニル）セリン誘導体を含む３−（３，４−ジヒドロ
キシフェニル）セリン誘導体の異性体混合物から、酵素
触媒であるＤ−スレオニンアルドラーゼを単独又はＬ−
アロスレオニンアルドラーゼとともに用いて不要な異性
体をグリシンと対応するアルデヒドに分解することによ
りＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）
セリン誘導体を製造するに際し、不要な異性体の分解反
応を水と二相を形成しうる有機溶媒と水性媒体の存在下
で行うことを特徴とするＬ−スレオ−３−（３，４−ジ
ヒドロキシフェニル）セリン誘導体の製造方法、（２）
水と二相を形成しうる有機溶媒がエステル類、アルコー
ル類、芳香族類及びエーテル類からなる群より選ばれた
少なくとも１種である（１）記載の製造方法、（３）水
と二相を形成しうる有機溶媒が酢酸エチル又はジエチル
エーテルである（１）又は（２）記載の製造方法、
（４）水と二相を形成しうる有機溶媒と水性媒体の比率
が重量基準で９０／１０〜１０／９０である（１）〜
（３）のいずれかに記載の製造方法、（５）不要な異性
体の分解反応がｐＨ７〜９で行われる（１）〜（４）の
いずれかに記載の製造方法、（６）Ｌ−スレオ−３−
（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体が、Ｌ
−スレオ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）
セリン又はＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシフ
ェニル）セリンである（１）〜（５）のいずれかに記載
の製造方法である。Embedded image (In the formula, R ₁ and R ₂ are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl or lower aralkyl group, but R ₁ and R ₂ may be substituted with an alkylene group to form a ring. )
From an isomer mixture of a 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative including an L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative represented by the formula, D-threonine aldolase as an enzyme catalyst is used alone or L-
L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) can be used together with alothreonine aldolase to decompose unwanted isomers into glycine and the corresponding aldehyde.
In producing a serine derivative, a decomposition reaction of an unnecessary isomer is carried out in the presence of an aqueous medium and an organic solvent capable of forming two phases with water, characterized in that L-threo-3- (3,4-dihydroxy Method for producing phenyl) serine derivative, (2)
The method according to (1), wherein the organic solvent capable of forming a two-phase with water is at least one selected from the group consisting of esters, alcohols, aromatics, and ethers; The method according to (1) or (2), wherein the organic solvent capable of forming is ethyl acetate or diethyl ether,
(4) The ratio of the organic solvent capable of forming two phases with water to the aqueous medium is from 90/10 to 10/90 on a weight basis.
(5) the production method according to any one of (1) to (4), wherein the decomposition reaction of unnecessary isomers is carried out at pH 7 to 9, (6) L- Threo-3-
(3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative is represented by L
-Threo-3- (3,4-methylenedioxyphenyl)
The method according to any one of (1) to (5), which is serine or L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine.

【００１０】[0010]

【発明の実施の形態】以下、さらに本発明について詳し
く説明する。本発明で用いられる原料のＤＯＰＳ誘導体
は、一般式BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The starting DOPS derivative used in the present invention has the general formula

【化３】 （式中、Ｒ₁，Ｒ₂は、同一又は相異なり、水素、低級ア
ルキル又は低級アラルキル基を示すが、Ｒ₁、Ｒ₂共にア
ルキレン基で置換されて環を形成してしていてもよい）
で表わされる化合物であればよい。このような化合物の
代表的なものとしては、３−（３，４−メチレンジオキ
シフェニル）セリン、３−（３，４−ジベンジルキシフ
ェニル）セリン、３−（３，４−ジメチルオキシフェニ
ル）セリン、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セ
リン等があげられる。Embedded image (In the formula, R ₁ and R ₂ are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl or lower aralkyl group, but R ₁ and R ₂ may be substituted with an alkylene group to form a ring. )
Any compound represented by Representative examples of such compounds include 3- (3,4-methylenedioxyphenyl) serine, 3- (3,4-dibenzyloxyphenyl) serine, 3- (3,4-dimethyloxyphenyl) ) Serine, 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine and the like.

【００１１】また、原料のＤＯＰＳ誘導体は、Ｌ−スレ
オ体が含まれていれば、スレオ／エリスロ異性体の混合
物であっても、スレオ体のラセミ混合物であってもよ
い。本発明においては、Ｌ−スレオ体以外の異性体を特
異的にグリシンと対応するアルデヒドとに分解すること
から、こうして得られたグリシンと対応するアルデヒド
は回収後、再度合成に使用できる。The DOPS derivative as a raw material may be a mixture of threo / erythro isomers or a racemic mixture of threo isomers as long as it contains the L-threo isomer. In the present invention, isomers other than the L-threo form are specifically decomposed into glycine and the corresponding aldehyde, and thus the glycine and the corresponding aldehyde thus obtained can be used again for synthesis after recovery.

【００１２】本発明で使用されるＬ−スレオ体以外の異
性体を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解す
る能力を有する酵素としては、Ｄ−スレオニンアルドラ
ーゼとＬ−アロスレオニンアルドラーゼが挙げられる。
原料であるＤＯＰＳ誘導体がスレオ体のみの異性体混合
物である場合はＤ−スレオニンアルドラーゼ単独で、ス
レオ／エリスロ異性体の混合物である場合にはＤ−スレ
オニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼを用いればよい。The enzymes used in the present invention which have the ability to specifically degrade isomers other than L-threon to glycine and the corresponding aldehyde include D-threonine aldolase and L-arothreonine aldolase.
When the starting DOPS derivative is a mixture of isomers of only threon, D-threonine aldolase alone may be used, and when the mixture is a mixture of threo / erythro isomers, D-threonine aldolase and L-arothreonine aldolase may be used. .

【００１３】Ｄ−スレオニンアルドラーゼとしては、特
公昭６４−１１２７９号や特開平１−２７３５８６号に
記載されたものを挙げることができるが、これらと実質
的に同様の機能を有する酵素であれば由来や製法は限定
されず、また、遺伝子組換え等の手法により一部のアミ
ノ酸の置換や欠失・付加を行った変異酵素も、Ｄ−スレ
オニンアルドラーゼとしての機能を有していれば用いる
ことが可能である。Examples of D-threonine aldolase include those described in JP-B-64-11279 and JP-A-1-273586. If D-threonine aldolase is an enzyme having substantially the same function as these, The production method is not limited, and a mutant enzyme obtained by substituting, deleting or adding some amino acids by a method such as gene recombination may be used as long as it has a function as D-threonine aldolase. It is possible.

【００１４】これらＤ−スレオニンアルドラーゼは、Ｄ
−型の立体配位には非常に高い特異性を有するにも拘ら
ず、エリスロ／スレオといった立体配位に対しては、許
容されうる寛容性を有するのみでなく、種々のＤＯＰＳ
誘導体に作用することができ、さらにグリシンと対応す
るアルデヒドとを生成せしめるという優れた特性を有し
ている。These D-threonine aldolases are
Despite having a very high specificity for the type of configuration, it has not only an acceptable tolerance for the erythro / threo configuration, but also various DOPS
It has the excellent properties of being able to act on derivatives and also producing glycine and the corresponding aldehyde.

【００１５】本発明で用いられるＤ−スレオニンアルド
ラーゼは、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ生産菌あるいは
その変異株等から得ることができる。The D-threonine aldolase used in the present invention can be obtained from a D-threonine aldolase-producing bacterium or a mutant thereof.

【００１６】Ｄ−スレオニンアルドラーゼ産生菌として
は、例えば、アルカリゲネス フェカリス（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＩＦＯ １２６６
９）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＤＫ
−２（微工研菌寄６２００号）、アスロバクター（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０
１号）、キサントモナス オリゼー（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＩＡＭ１６５７）等が知られ
ているが、これらに限定することなく使用することもで
きる。Examples of D-threonine aldolase-producing bacteria include, for example, Alcaligenes faecalis (Alcal
geneses faecalis) (IFO 1266)
9), Pseudomonas DK
-2 (Microtechnical Laboratories No. 6200), Asrobacter (Ar
throbacter) DK-19 (620)
No. 1), Xanthomonas oryzae (Xanthomomo)
nas oryzae) (IAM1657) and the like are known, but they can be used without being limited to these.

【００１７】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成
に関与する遺伝子を担うＤＮＡを遺伝子組換えの手法を
用いて導入して作成された組換え体は、本酵素の生産性
が非常に高いため、本発明に好適に利用することができ
る。例えば、キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１
（ｐＤＴ６４８）は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを高
度に生産する能力を有しており（特開平５−１６８４８
４号公報）、特に好適なものである。In addition, a recombinant produced by introducing a DNA carrying a gene involved in the synthesis of D-threonine aldolase using a gene recombination technique has a very high productivity of the present enzyme. It can be suitably used for the invention. For example, Xanthomonas citri IFO 3311
(PDT648) has the ability to highly produce D-threonine aldolase (JP-A-5-16848).
No. 4), which is particularly suitable.

【００１８】また、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼと
しては、特公昭６３−５４３５９号に記載されたものを
挙げることができるが、これらと実質的に同様の機能を
有する酵素であれば由来や製法は限定されず、また、遺
伝子組換え等の手法により一部のアミノ酸の置換や欠失
・付加を行った変異酵素も、Ｌ−アロスレオニンアルド
ラーゼとしての機能を有していれば用いることができ
る。Examples of the L-arothreonine aldolase include those described in JP-B-63-54359. However, as long as the enzyme has a function substantially similar to these, the origin and production method are limited. Alternatively, a mutant enzyme obtained by substituting, deleting, or adding some amino acids by a method such as gene recombination can also be used as long as it has a function as L-arothreonine aldolase.

【００１９】これらＬ−アロスレオニンアルドラーゼ
は、種々のＤＯＰＳ誘導体のＬ−エリスロ体に特異性に
作用し、これをグリシンと対応するアルデヒドに分解せ
しめるという優れた特性を有している。These L-allothreonine aldolases have an excellent property of acting specifically on the L-erythro forms of various DOPS derivatives and decomposing them into glycine and the corresponding aldehyde.

【００２０】本発明で用いられるＬ−アロスレオニンア
ルドラーゼは、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌
あるいはその変異株等から得ることができる。[0020] The L-arothreonine aldolase used in the present invention can be obtained from an L-arothreonine aldolase-producing bacterium or a mutant thereof.

【００２１】Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌と
しては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＤＫ−
３９（微工研菌寄６２０２号）、アルカリゲネス・フェ
カリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
ＩＦＯ １２６６９、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、アース
ロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＤＫ−１９
（微工研菌寄６２０１号）、キサントモナス・オリゼー
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＩＡＭ１
６５７）等が知られているが、これらのものに限定する
ことなく使用することもできる。[0021] Examples of L-arothreonine aldolase-producing bacteria include, for example, Bacillus DK-
39 (No. 6202), Alcaligenes faecalis
IFO 12669, Pseudomonas
onas) DK-2 (Microtechnical Laboratory No. 6200), Arthrobacter DK-19
(No. 6201), Xanthomonas oryzae (IAM1)
657) are known, but they can be used without being limited to these.

【００２２】また、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの合成
に関与する遺伝子を担うＤＮＡを遺伝子組換えの手法を
用いて導入して作成された組換え体は、本酵素の生産性
が非常に高いため、本発明に好適に利用することができ
る。例えば、キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１
（ｐＬＡ５５６）は、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ
を高度に生産する能力を有しており（特開平６−１６５
６９３号公報）、特に好適なものである。A recombinant produced by introducing a DNA carrying a gene involved in the synthesis of L-threonine aldolase by a gene recombination technique has a very high productivity of the enzyme. It can be suitably used for the invention. For example, Xanthomonas citri IFO 3311
(PLA556) has the ability to highly produce L-arothreonine aldolase (JP-A-6-165).
No. 693), which is particularly suitable.

【００２３】使用する酵素触媒の形態としては、精製酵
素、粗精製酵素、酵素を産生する微生物菌体そのものあ
るいはその処理物や固定化物、その他何れも使用できる
が、使用する酵素液や菌体に目的とするＬ−スレオ体を
分解するような活性が含まれている場合には、目的物の
収率を向上させるために、その活性を除去してから反応
に用いるのが好ましい。これらの分解活性を除去する方
法としては、クロマト分画や熱処理等を挙げることがで
きるが、これらに限定されることなく分解活性を選択的
に除去できる方法であれば何れも用いることができる。As the form of the enzyme catalyst to be used, a purified enzyme, a crudely purified enzyme, a microbial cell producing the enzyme itself, or a processed or immobilized product thereof can be used. When an activity decomposing the target L-threo form is contained, it is preferable to remove the activity before use in the reaction in order to improve the yield of the target product. Examples of the method for removing these decomposition activities include chromatographic fractionation and heat treatment, but are not limited thereto, and any method capable of selectively removing the decomposition activity can be used.

【００２４】また、遺伝子操作で目的のアルドラーゼの
生産性を大幅に向上せしめた組換え体であれば、これら
の分解活性を除去することなく反応に用いることが可能
である。In addition, a recombinant in which the productivity of the target aldolase has been significantly improved by genetic manipulation can be used for the reaction without removing its decomposition activity.

【００２５】酵素反応を実施する方法は、水と二相を形
成しうる有機溶媒と水性媒体の存在下で、基質であるＬ
−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体を含む異性体混合物を上に記
した酵素触媒と接触させれば良い。The method for carrying out the enzymatic reaction is carried out in the presence of an organic solvent capable of forming a two-phase with water and an aqueous medium in the presence of the substrate L
The mixture of isomers containing the -threo-DOPS derivative may be brought into contact with the enzyme catalyst described above.

【００２６】かかる反応時の水性媒体としては、例え
ば、水、緩衝液等が使用できる。また、有機溶媒として
は、以下の条件を満たす溶媒であれば本発明に使用する
ことができる。 (1) 生成物であるアルデヒドを溶解できる (2) 水性媒体と二相を形成しうる (3) アルドラーゼ酵素に対する反応阻害性及び不活性化
作用が低いAs the aqueous medium at the time of such a reaction, for example, water, a buffer or the like can be used. As the organic solvent, any solvent satisfying the following conditions can be used in the present invention. (1) Can dissolve aldehyde as a product (2) Can form two phases with aqueous medium (3) Low reaction inhibitory and inactivating effect on aldolase enzyme

【００２７】具体的には、ギ酸エステル、酢酸エステ
ル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル等の有機酸エ
ステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコー
ル、ｎ−オクチルアルコール等のアルキル基の炭素数４
以上にアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等
の芳香族系溶媒類、ジエチルエーテル、メチルエチルエ
ーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類等が挙げ
られる。Specifically, organic acid esters such as formate, acetate, propionate and butyrate, and alkyl groups having 4 carbon atoms such as n-butyl alcohol, n-amyl alcohol and n-octyl alcohol.
As described above, alcohols, aromatic solvents such as benzene, toluene, and xylene, and ethers such as diethyl ether, methyl ethyl ether, and isopropyl ether are exemplified.

【００２８】これらの溶媒は、単独あるいは２種以上を
組み合わせて用いることができる。例えば、ＤＯＰＳ誘
導体が、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セ
リンや３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリンで
ある場合には、酢酸エチルやジエチルエーテルが好適に
使用できる。These solvents can be used alone or in combination of two or more. For example, when the DOPS derivative is 3- (3,4-methylenedioxyphenyl) serine or 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine, ethyl acetate and diethyl ether can be suitably used.

【００２９】反応時には、これらの有機溶媒類と水性媒
体は２相を形成することが必要であり、その比率は、ア
ルデヒドの両相への分配係数や原料に含まれるＬ−スレ
オ体以外のＤＯＰＳ誘導体の異性体の量にもよるが、重
量基準で有機溶媒／水性媒体＝９０／１０〜１０／９０
の範囲が好ましく、実用性等を考慮すると、８０／２０
〜２０／８０の範囲が特に好ましい。At the time of the reaction, it is necessary that these organic solvents and the aqueous medium form two phases, the ratio of which depends on the partition coefficient of the aldehyde to both phases and the DOPS other than the L-threo compound contained in the raw material. The organic solvent / aqueous medium = 90/10 to 10/90 by weight, depending on the amount of the isomer of the derivative.
Is preferable, and considering practicality and the like, 80/20
A range of ２０20/80 is particularly preferred.

【００３０】両相は、面状の界面を形成するように接触
させてもよいし、乳化状態になるように激しく混合して
もよい。例えば、基質が３−（３，４−メチレンジオキ
シフェニル）セリンや３−（３，４−ジヒドロキシフェ
ニル）セリンである場合には、酢酸エチルやジエチルエ
ーテルを酵素触媒が存在する反応器中で水性媒体と混合
し接触させる方法で本発明の効果を十分に発揮すること
ができる。The two phases may be brought into contact with each other to form a planar interface, or they may be mixed vigorously so as to be emulsified. For example, when the substrate is 3- (3,4-methylenedioxyphenyl) serine or 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine, ethyl acetate or diethyl ether is reacted in a reactor having an enzyme catalyst. The effect of the present invention can be sufficiently exhibited by a method of mixing and contacting with an aqueous medium.

【００３１】反応における酵素触媒の濃度は、Ｌ−スレ
オ−ＤＯＰＳ誘導体以外の不要な異性体を完全に分解で
きるならば特に制限はなく、基質濃度にもよるが、スレ
オニンアルドラーゼ活性（１Ｕはスレオニンから１分間
に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵素量
を表わす）が、水性媒体１ｍｌ当たり０.１Ｕ以上であ
ることが望ましい。特に、１Ｕ以上であれば反応を速や
かに終了させることができる。The concentration of the enzyme catalyst in the reaction is not particularly limited as long as unnecessary isomers other than the L-threo-DOPS derivative can be completely decomposed. Although it depends on the substrate concentration, threonine aldolase activity (1 U is converted from threonine to threonine) (Representing the amount of enzyme required to produce 1 μmole of glycine per minute) is preferably 0.1 U or more per ml of aqueous medium. In particular, if it is 1 U or more, the reaction can be immediately terminated.

【００３２】両酵素を使用する場合には、原料に同時に
作用させてもよいし、別々に作用させてもよい。When both enzymes are used, they may act on the starting materials simultaneously or separately.

【００３３】基質であるＤＯＰＳ誘導体の濃度は、反応
を著しく阻害しない程度であれば特に制限はないが、一
般的には水性媒体１リットル当たり０.０１〜１モル程
度が好ましい。しかし、例えばＤＯＰＳ誘導体が３−
（３，４−メチレンジオキシフェニル）セリンや３−
（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン等である場合
には、溶解性が低いので溶解度以上の基質濃度では反応
液中での溶解濃度は低く一定に保たれ、残りは不溶体と
して存在する。よって、上記の阻害等の問題は回避さ
れ、さらに高濃度でも効率的に反応が進行する。また、
基質の供給は、一括、連続、分割の何れの手段でも行う
ことができる。The concentration of the DOPS derivative as a substrate is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the reaction, but is generally preferably about 0.01 to 1 mol per liter of the aqueous medium. However, for example, if the DOPS derivative is 3-
(3,4-methylenedioxyphenyl) serine or 3-
In the case of (3,4-dihydroxyphenyl) serine or the like, since the solubility is low, the solubility in the reaction solution is kept low at a substrate concentration higher than the solubility, and the rest exists as an insoluble substance. Therefore, the above-described problems such as inhibition are avoided, and the reaction proceeds efficiently even at a higher concentration. Also,
The substrate can be supplied by any of batch, continuous and divided means.

【００３４】反応温度は、１０〜５５℃が好ましく、２
０〜４５℃がより好ましい。また、反応時のｐＨは６〜
１０で実施可能であるが、より好ましくは７〜９であ
る。The reaction temperature is preferably from 10 to 55 ° C.,
0-45 degreeC is more preferable. The pH during the reaction is 6 to
Although it can be carried out at 10, it is more preferably 7-9.

【００３５】Ｄ−スレオニンアルドラーゼとＬ−アロス
レオニンアルドラーゼはともに、ピリドキサール−５’
−リン酸を補酵素として要求するするため、反応系に水
性媒体１リットル当たり０.１ｎｍｏｌｅ〜１ｍｍｏ
ｌ、好ましくは１ｎｍｏｌｅ〜１００μｍｏｌｅの濃度
で添加することにより反応が促進される。Both D-threonine aldolase and L-arothreonine aldolase are pyridoxal-5 '
The reaction system requires 0.1 nmole to 1 mmol per liter of aqueous medium to require phosphoric acid as a coenzyme
The reaction is promoted by adding at a concentration of 1, preferably 1 nmole to 100 μmole.

【００３６】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼは２価
金属イオンを補欠因子として要求するため、Ｍｇ²⁺、Ｍ
ｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｆｅ²⁺等を塩の形で水性媒体１リットル
当たり１０μｍｏｌｅ〜１００ｍｍｏｌｅ、好ましくは
１００μｍｏｌｅ〜１０ｍｍｏｌｅの濃度で添加するこ
とにより反応が促進される。Since D-threonine aldolase requires a divalent metal ion as a prosthetic factor, Mg ²⁺ , M
The reaction is promoted by adding n ²⁺ , Co ²⁺ , Fe ^2+, etc. in the form of a salt at a concentration of 10 μmole to 100 mmole, preferably 100 μmole to 10 mmole per liter of the aqueous medium.

【００３７】反応形式はバッチ方式、連続方式の何れで
もよいが、かくして、反応は０.５〜５０時間程度で終
了する。The reaction system may be either a batch system or a continuous system, and the reaction is completed in about 0.5 to 50 hours.

【００３８】反応終了後、反応液を静置あるいは遠心分
離等の方法により二相分離させ、生成アルデヒドが溶解
している有機溶媒相を分離する。水性媒体相に残存して
いるアルデヒドは必要に応じて同一又は他の抽出溶媒等
で回収することもできる。アルデヒドが溶解している有
機溶媒層は、そのまま、あるいは、硫酸ナトリウム等の
脱水剤で脱水、減圧下での有機溶媒の除去、減圧蒸留や
クロマト分離等の処理を必要に応じて行った後、グリシ
ンとの化学的縮合反応の原料としてリサイクル使用する
ことができる。また、有機溶媒もアルデヒドの除去後再
使用することが可能である。After completion of the reaction, the reaction solution is subjected to two-phase separation by a method such as standing or centrifugation, and the organic solvent phase in which the produced aldehyde is dissolved is separated. The aldehyde remaining in the aqueous medium phase can be recovered with the same or another extraction solvent, if necessary. The organic solvent layer in which the aldehyde is dissolved, as it is, or after dehydration with a dehydrating agent such as sodium sulfate, removal of the organic solvent under reduced pressure, and distillation and chromatographic separation under reduced pressure, if necessary, are performed. It can be recycled as a raw material for a chemical condensation reaction with glycine. Further, the organic solvent can be reused after removing the aldehyde.

【００３９】水性媒体層からのＬ−スレオ−ＤＯＰＳ誘
導体とグリシンの単離回収は、イオン交換樹脂を用いた
クロマト分離や金属錯体化による分別晶析法等の公知の
方法を用いて行うことができる。例えば、陽イオン交換
樹脂を充填したカラムに通液、水洗後、希アンモニア水
等により順次溶出を行い、純度が低い場合には、さらに
晶析・水再結晶を行うことにより精製度を高めることが
できる。回収したグリシンは、有機溶媒層から回収した
アルデヒドとともに化学的縮合反応の原料としてリサイ
クル使用することができる。The L-threo-DOPS derivative and glycine can be isolated and recovered from the aqueous medium layer by a known method such as chromatographic separation using an ion exchange resin or fractional crystallization by metal complexation. it can. For example, the solution is passed through a column filled with a cation exchange resin, washed with water, and then sequentially eluted with dilute aqueous ammonia. If the purity is low, the purity is further increased by crystallization and recrystallization with water. Can be. The recovered glycine can be recycled as a raw material for a chemical condensation reaction together with the aldehyde recovered from the organic solvent layer.

【００４０】[0040]

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
実施例中、％は特に示さない限り重量％を示す。ＤＯＰ
Ｓ誘導体及びグリシンの定量はポストカラムＯＰＡ（ｏ
−フタルアルデヒド）誘導体化法を用いたアミノ酸分析
機（島津製作所製）にて行った。また、ＤＯＰＳ誘導体
の異性体分析は、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル
−Ｌ−システィンによる誘導体化後ＯＤＳカラムにて分
離し蛍光検出するプレカラム誘導体化法にて行った。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but it should not be construed that the invention is limited thereto.
In Examples,% indicates% by weight unless otherwise specified. DOP
The quantification of the S derivative and glycine was performed using post-column OPA (o
(Phthalaldehyde) derivatization method using an amino acid analyzer (manufactured by Shimadzu Corporation). The isomer analysis of the DOPS derivative was performed by a precolumn derivatization method in which derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine was performed, followed by separation on an ODS column and fluorescence detection.

【００４１】酵素触媒製造例１ ポリペプトン１％、酵母エキス０.５％、塩化ナトリウ
ム１％からなるｐＨ７.２の培地を調製し、５０リット
ル容の培養槽にその培地３５リットルを添加し、１２０
℃で１５分間加熱殺菌した。その培地にアリスロバクタ
ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）を接種し、ｐＨ
７.５に保ちながら３０℃で２０時間通気及び撹拌をし
つつ培養した。Preparation Example 1 of Enzyme Catalyst A medium of pH 7.2 consisting of 1% of polypeptone, 0.5% of yeast extract and 1% of sodium chloride was prepared, and 35 liters of the medium was added to a 50-liter culture tank.
Heat sterilization at 150C for 15 minutes. The medium was inoculated with Arislobacta DK-19 (Microtechnical Laboratories No. 6201) and the pH was adjusted.
The culture was carried out at 30 ° C. for 20 hours with aeration and agitation while maintaining at 7.5.

【００４２】培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で
集菌、水洗後、０.０１ｍＭピリドキサ−ル−５'−リン
酸、及び１.０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７.５の
０.１ＭＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2
-ethanesulfonic acid）緩衝液５００mlに懸濁し、この
菌体懸濁液を２０ｋＨｚ、３分間の超音波破砕処理を４
回行い、破砕液の懸濁物質を遠心分離で除去して粗酵素
液を調製した。After completion of the culture, the cells were collected from the culture by centrifugation, washed with water, and then washed with 0.1 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 mM magnesium chloride in 0.1 M HEPES at pH 7.5. (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2
-Ethanolsulfonic acid) buffer solution (500 ml), and this cell suspension is subjected to ultrasonic crushing at 20 kHz for 3 minutes for 4 minutes.
The suspension was centrifuged to remove a suspended substance in the crushed liquid to prepare a crude enzyme solution.

【００４３】次に、この粗酵素液を陰イオン交換樹脂Ｄ
ＥＡＥ−ＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＡ−５００（生化学工
業株式会社製）を充填したカラムに通液、上記緩衝液で
洗浄後、塩化ナトリウム直線グラジエントにより溶出・
分画し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有する画分
とＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を有する画分を
得た。得られた両画分は、それぞれ限外ろ過（分画分子
量１万）により濃縮・脱塩し、上記緩衝液にて各２５ｍ
ｌとした。この分画濃縮酵素液のＤ−スレオニンアルド
ラーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニンから１分間に１μｍ
ｏｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵素量を表わ
す）及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性（１Ｕは
Ｌ−アロスレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグリシ
ンを生成するのに必要な酵素量を表わす）を測定した結
果を表１に示す。Next, the crude enzyme solution was added to an anion exchange resin D
The solution was passed through a column packed with EAE-Cellulofine A-500 (manufactured by Seikagaku Corporation), washed with the above buffer, and eluted with a linear sodium chloride gradient.
By fractionation, a fraction having D-threonine aldolase activity and a fraction having L-arothreonine aldolase activity were obtained. The obtained two fractions were concentrated and desalted by ultrafiltration (fraction molecular weight: 10,000), and 25 m
l. The D-threonine aldolase activity of this concentrated concentrated enzyme solution (1 U is 1 μm / minute from D-threonine)
Measurement of the amount of enzyme required to produce ole glycine) and L-arothreonine aldolase activity (1 U represents the amount of enzyme required to produce 1 μmole of glycine per minute from L-allothreonine) Table 1 shows the results.

【００４４】[0044]

【表１】 [Table 1]

【００４５】酵素触媒製造例２ ポリペプトン１％、酵母エキス０.５％、塩化ナトリウ
ム１％からなるｐＨ７.２の培地を調製し、５０リット
ル容の培養槽にその培地３５リットルを添加し、１２０
℃で１５分間加熱殺菌した。その培地にクロラムフェニ
コールを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加した後、キサン
トモナス・シトリー（Xanthomonas citri）ＩＦＯ３３
１１（ｐＤＴ６４８）を接種し、ｐＨ７.５に保ちなが
ら３０℃で２０時間通気及び撹拌をしつつ培養した。Preparation Example 2 of Enzyme Catalyst A medium of pH 7.2 consisting of 1% of polypeptone, 0.5% of yeast extract and 1% of sodium chloride was prepared, and 35 liters of the medium was added to a 50-liter culture tank.
Heat sterilization at 150C for 15 minutes. After chloramphenicol was added to the medium to a concentration of 50 μg / ml, Xanthomonas citri IFO33
11 (pDT648) was inoculated and cultured at 30 ° C. for 20 hours with aeration and stirring while maintaining the pH at 7.5.

【００４６】培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で
集菌し、０.０１ｍＭピリドキサ−ル−５'−リン酸、及
び１.０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７.５の０.１
ＭＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄後、再び遠心分離で集菌し、
凍結乾燥を行った。また、同様の方法によりキサントモ
ナス・シトリー（Xanthomonas citri）ＩＦＯ３３１１
（ｐＬＡ５５６）の凍結乾燥菌体を調製した。得られた
凍結乾燥菌体のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性及びＬ
−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定した結果を表
２に示す。After the completion of the culture, the cells were collected from the culture by centrifugation, and 0.1% of pH 7.5 containing 0.01 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 mM magnesium chloride.
After washing with MHEPES buffer, the cells were collected by centrifugation again,
Lyophilization was performed. In a similar manner, Xanthomonas citri IFO3311
Lyophilized cells of (pLA556) were prepared. D-threonine aldolase activity and L
Table 2 shows the results of measuring the activity of alosreonine aldolase.

【００４７】[0047]

【表２】 [Table 2]

【００４８】実施例１ 酵素触媒製造例１で得たＤ−スレオニンアルドラーゼ活
性を有する分画濃縮酵素液１０ｍｌに、Ｄ，Ｌ−スレオ
−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン２．１
３ｇと酢酸エチル２０ｍｌを加え、３０℃で撹拌下、１
５時間反応させた。反応終了後、反応液の遠心分離によ
り酢酸エチル相を分離、硫酸ナトリウムによる脱水後、
減圧乾固を行い、０.６６ｇのプロトカテキュアルデヒ
ドを得た。水相は、１Ｎ塩酸を加えて５０ｍｌにメスア
ップした後、遠心分離で不溶物を除去した。この水相希
釈液に含まれている残存ジヒドロキシフェニルセリンと
生成グリシンをアミノ酸分析により定量したところ、メ
チレンジオキシフェニルセリンは添加量の４９.５％残
存し、グリシンはモル換算でジヒドロキシフェニルセリ
ン分解量の９９％が生成していた。Example 1 D, L-Threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine 2.1 was added to 10 ml of the concentrated concentrated enzyme solution having D-threonine aldolase activity obtained in Enzyme Catalyst Production Example 1.
3 g and 20 ml of ethyl acetate were added, and the mixture was stirred at 30 ° C.
The reaction was performed for 5 hours. After completion of the reaction, the ethyl acetate phase was separated by centrifugation of the reaction solution, and after dehydration with sodium sulfate,
The residue was dried under reduced pressure to obtain 0.66 g of protocatechualdehyde. The aqueous phase was made up to 50 ml by adding 1N hydrochloric acid, and then insoluble substances were removed by centrifugation. The residual dihydroxyphenylserine and glycine formed in the aqueous phase diluent were quantified by amino acid analysis. As a result, 49.5% of the added amount of methylenedioxyphenylserine remained, and glycine was decomposed in terms of moles of dihydroxyphenylserine. 99% of the amount had formed.

【００４９】水相希釈液を、強酸性陽イオン交換樹脂Ｄ
ＯＷＥＸ５０Ｗ×８を充填したカラム（２６ｍｍφ×１
００ｍｍ）に通液、脱イオン水による十分な洗浄後、希
アンモニア水で吸着物質を溶出させ、ジヒドロキシフェ
ニルセリン画分とグリシン画分に分けて採取した。両画
分それぞれ減圧乾固を行ったところ、それぞれ１.０３
ｇ、０.３３ｇの結晶を得た。ジヒドロキシフェニルセ
リン画分より得られた結晶の異性体分析を行ったとこ
ろ、ピークはＬ−スレオ体の位置にのみ見られ、残存ジ
ヒドロキシフェニルセリンは全てＬ−スレオ体であるこ
とが確認できた。The aqueous diluent was washed with a strongly acidic cation exchange resin D
A column packed with OWEX 50W × 8 (26 mmφ × 1
Then, the adsorbed substance was eluted with dilute aqueous ammonia, and collected separately in dihydroxyphenylserine fraction and glycine fraction. Both fractions were dried under reduced pressure to give 1.03, respectively.
g, 0.33 g of crystals were obtained. When the isomer analysis of the crystals obtained from the dihydroxyphenylserine fraction was performed, the peak was observed only at the position of the L-threo form, and it was confirmed that all the remaining dihydroxyphenylserine was the L-threo form.

【００５０】比較例１ 反応時に酢酸エチルを添加しない以外は実施例１と同様
に反応を行い、反応終了後に酢酸エチルを添加混合し、
その後は実施例１と同様の処理を行った。酢酸エチル相
から得たプロトカテキュアルデヒドは、０.２６ｇであ
った。また、水相は実施例１では観察されなかった茶色
の着色が見られ、ジヒドロキシフェニルセリンは添加量
の７２％残存し、グリシンはモル換算でジヒドロキシフ
ェニルセリン分解量の８９％相当が生成していた。ジヒ
ドロキシフェニルセリン画分より得られた結晶の異性体
分析により、Ｌ−スレオ体とＤ−スレオ体の比は、１０
０：５７であった。Comparative Example 1 The reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that ethyl acetate was not added during the reaction. After the reaction was completed, ethyl acetate was added and mixed.
Thereafter, the same processing as in Example 1 was performed. The protocatechualdehyde obtained from the ethyl acetate phase weighed 0.26 g. The aqueous phase was brownish in color, which was not observed in Example 1. Dihydroxyphenylserine remained 72% of the amount added, and glycine produced 89% of the amount of decomposed dihydroxyphenylserine in terms of mol. Was. According to the isomer analysis of the crystals obtained from the dihydroxyphenylserine fraction, the ratio of the L-threo form to the D-threo form was 10%.
0:57.

【００５１】実施例２ ０.０１ｍＭピリドキサ−ル−５'−リン酸及び１.０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含むｐＨ７.５の０.１ＭＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液１０ｍｌに、酵素触媒製造例２で得たキサント
モナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍
結乾燥菌体とキサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１
（ｐＬＡ５５６）の凍結乾燥菌体をそれぞれ０．３ｇ、
Ｄ，Ｌ−スレオ体とＤ，Ｌ−エリスロ体の比が８５：１
５である３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セ
リン２．２５ｇと酢酸エチル２０ｍｌを加え、３０℃で
撹拌下、１５時間反応させた。反応終了後、反応液の遠
心分離により酢酸エチル相を分離、硫酸ナトリウムによ
る脱水後、減圧乾固を行い、０.８５ｇのピペロナール
を得た。水相は、１Ｎ塩酸を加えて５０ｍｌにメスアッ
プした後、遠心分離で不溶物を除去した。この水相希釈
液に含まれている残存メチレンジオキシフェニルセリン
と生成グリシンをアミノ酸分析により定量したところ、
メチレンジオキシフェニルセリンは添加量の４２.０％
残存し、グリシンはモル換算でメチレンジオキシフェニ
ルセリン分解量の９９％相当が生成していた。Example 2 0.01 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 m
0.1 MHEPE at pH 7.5 containing M magnesium chloride
Lyophilized cells of Xanthomonas citri IFO 3311 (pDT648) obtained in Enzyme Catalyst Production Example 2 and Xanthomonas citri IFO 3311 in 10 ml of S buffer
0.3 g of freeze-dried cells of (pLA556),
The ratio of D, L-threo form to D, L-erythro form is 85: 1
5.25 g of 3- (3,4-methylenedioxyphenyl) serine and 20 ml of ethyl acetate were added, and the mixture was reacted at 30 ° C. with stirring for 15 hours. After completion of the reaction, the ethyl acetate phase was separated by centrifugation of the reaction solution, dehydrated with sodium sulfate, and dried under reduced pressure to obtain 0.85 g of piperonal. The aqueous phase was made up to 50 ml by adding 1N hydrochloric acid, and then insoluble substances were removed by centrifugation. When residual methylenedioxyphenylserine and glycine formed in the aqueous phase diluent were quantified by amino acid analysis,
Methylenedioxyphenylserine is 42.0% of the amount added
Glycine was generated in an amount equivalent to 99% of the decomposition amount of methylenedioxyphenylserine on a molar basis.

【００５２】水相希釈液を、強酸性陽イオン交換樹脂Ｄ
ＯＷＥＸ５０Ｗ×８を充填したカラム（２６ｍｍφ×１
００ｍｍ）に通液、脱イオン水による十分な洗浄後、希
アンモニア水で吸着物質を溶出させ、メチレンジオキシ
フェニルセリン画分とグリシン画分に分けて採取した。
両画分それぞれ減圧乾固を行ったところ、それぞれ０.
９０ｇ、０.４１ｇの結晶を得た。メチレンジオキシフ
ェニルセリン画分より得られた結晶の異性体分析を行っ
たところ、ピークはＬ−スレオ体の位置にのみ見られ、
残存メチレンジオキシフェニルセリンは全てＬ−スレオ
体であることが確認できた。The aqueous phase diluent was added to a strongly acidic cation exchange resin D
A column packed with OWEX 50W × 8 (26 mmφ × 1
Then, the adsorbed substance was eluted with dilute aqueous ammonia and collected separately in a methylenedioxyphenylserine fraction and a glycine fraction.
When both fractions were dried under reduced pressure, each fraction was 0.1%.
90 g and 0.41 g of crystals were obtained. When isomer analysis of the crystals obtained from the methylenedioxyphenylserine fraction was performed, the peak was found only at the position of the L-threo form,
It was confirmed that all the remaining methylenedioxyphenylserine was in the L-threo form.

【００５３】実施例３ ０.０１ｍＭピリドキサ−ル−５'−リン酸及び１.０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含むｐＨ７.５の０.１ＭＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液１０ｍｌに、酵素触媒製造例２で得たキサント
モナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍
結乾燥菌体を０．５ｇ、Ｄ，Ｌ−スレオ−３−（３，４
−メチレンジオキシフェニル）セリン２．２５ｇと、表
３に示す各種有機溶媒を２０ｍｌを加え、３０℃で撹拌
下、１５時間反応させた。反応終了後、反応液の遠心分
離により有機溶媒相を分離・除去した。得られた水相に
１Ｎ塩酸を加えて５０ｍｌにメスアップした後、遠心分
離で不溶物を除去した。この水相希釈液の異性体分析に
より測定された濃度から各異性体の残存率を算出した結
果を表３に示す。Example 3 0.01 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 m
0.1 MHEPE at pH 7.5 containing M magnesium chloride
In 10 ml of S buffer, 0.5 g of freeze-dried bacterial cells of Xanthomonas citri IFO 3311 (pDT648) obtained in Enzyme Catalyst Production Example 2 were added, and D, L-threo-3- (3,4).
2.25 g of (methylenedioxyphenyl) serine and 20 ml of various organic solvents shown in Table 3 were added, and the mixture was reacted at 30 ° C. with stirring for 15 hours. After completion of the reaction, the organic solvent phase was separated and removed by centrifugation of the reaction solution. After 1N hydrochloric acid was added to the obtained aqueous phase to make up to 50 ml, insoluble materials were removed by centrifugation. Table 3 shows the result of calculating the residual ratio of each isomer from the concentration measured by the isomer analysis of the aqueous phase diluent.

【００５４】[0054]

【表３】 [Table 3]

【００５５】表３より、クロロホルム以外の有機溶媒を
用いた場合には、無添加と比べてＤ−スレオ体の残存率
が低くなり、また、Ｌ−スレオ体の残存率は高くなっ
た。特に、酢酸エチル又はジエチルエーテルを用いた場
合には、Ｄ−スレオ体の残存率が０％であった。As shown in Table 3, when an organic solvent other than chloroform was used, the residual ratio of the D-threo compound was lower and the residual ratio of the L-threo compound was higher than when no organic solvent was added. In particular, when ethyl acetate or diethyl ether was used, the residual ratio of the D-threo compound was 0%.

【００５６】実施例４ ０.０１ｍＭピリドキサ−ル−５'−リン酸及び１.０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含むｐＨ７.５の０.１ＭＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液１０ｍｌに、酵素触媒製造例２で得たキサント
モナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍
結乾燥菌体を０．５ｇ、Ｄ，Ｌ−スレオ−３−（３，４
−メチレンジオキシフェニル）セリン２．２５ｇと、酢
酸エチルを０.５ｍｌから１００ｍｌの範囲で加え、３
０℃で撹拌下、１５時間反応させた。添加酢酸エチルが
０.５ｍｌである場合のみ緩衝液と２相を形成しなかっ
た。酢酸エチルが反応終了後、反応液の遠心分離により
有機溶媒相を分離・除去した。得られた水相に１Ｎ塩酸
を加えて５０ｍｌにメスアップした後、遠心分離で不溶
物を除去した。この水相希釈液の異性体分析により測定
された濃度から各異性体の残存率を算出した結果を表４
に示す。Example 4 0.01 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 m
0.1 MHEPE at pH 7.5 containing M magnesium chloride
In 10 ml of S buffer, 0.5 g of freeze-dried cells of Xanthomonas citri IFO 3311 (pDT648) obtained in Enzyme Catalyst Production Example 2 were added, and D, L-threo-3- (3,4).
-Methylenedioxyphenyl) serine and ethyl acetate in the range of 0.5 ml to 100 ml were added.
The reaction was carried out at 0 ° C. with stirring for 15 hours. Only when the added ethyl acetate was 0.5 ml did not form two phases with the buffer. After the reaction of ethyl acetate was completed, the organic solvent phase was separated and removed by centrifugation of the reaction solution. After 1N hydrochloric acid was added to the obtained aqueous phase to make up to 50 ml, insoluble materials were removed by centrifugation. Table 4 shows the results of calculating the residual ratio of each isomer from the concentration measured by the isomer analysis of the aqueous phase diluent.
Shown in

【００５７】[0057]

【表４】 [Table 4]

【００５８】表４より、酢酸エチルを１．５ｍｌ以上添
加することにより、Ｄ−スレオ体の残存率は大きく低減
した。特に２．５ｍｌ以上の添加によりさらに低減し
た。As shown in Table 4, the residual ratio of the D-threo compound was significantly reduced by adding 1.5 ml or more of ethyl acetate. In particular, it was further reduced by adding 2.5 ml or more.

【００５９】実施例５ 表５に示す各種緩衝剤（ＭＥＳは2-Morpholinoethanesu
lfonic acid、ＣＨＥＳはN-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-am
inopropanesulfonic acidを示す）を１リットル当たり
０.１モルの濃度で用いて、０.０１ｍＭピリドキサ−ル
−５'−リン酸及び１.０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐ
Ｈ６から１０の緩衝液を作製した。これらの緩衝液１０
ｍｌに、酵素触媒製造例２で得たキサントモナス・シト
リーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍結乾燥菌体を
０．５ｇ，Ｄ，Ｌ−スレオ−３−（３，４−メチレンジ
オキシフェニル）セリン２．２５ｇと酢酸エチル２０ｍ
ｌを加え、３０℃で撹拌下、１５時間反応させた。反応
終了後、反応液の遠心分離により酢酸エチル相を分離・
除去した。得られた水相に１Ｎ塩酸を加えて５０ｍｌに
メスアップした後、遠心分離で不溶物を除去した。この
水相希釈液の異性体分析により測定された濃度から各異
性体の残存率を算出した結果を表５に示す。Example 5 Various buffers shown in Table 5 (MES was 2-Morpholinoethanesu)
lfonic acid, CHES is N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-am
inopropanesulfonic acid) at a concentration of 0.1 molar per liter containing 0.01 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 mM magnesium chloride.
Buffers from H6 to 10 were made. These buffers 10
0.5 ml of freeze-dried cells of Xanthomonas citri IFO 3311 (pDT648) obtained in Enzyme Catalyst Production Example 2 and 2.25 g of D, L-threo-3- (3,4-methylenedioxyphenyl) serine per ml. And ethyl acetate 20m
1 was added and reacted at 30 ° C. with stirring for 15 hours. After the reaction, the ethyl acetate phase was separated by centrifugation of the reaction solution.
Removed. After 1N hydrochloric acid was added to the obtained aqueous phase to make up to 50 ml, insoluble materials were removed by centrifugation. Table 5 shows the results of calculating the residual ratio of each isomer from the concentration measured by the isomer analysis of the aqueous phase diluent.

【００６０】[0060]

【表５】 [Table 5]

【００６１】表５より、ｐＨ６．０とｐＨ１０．０の条
件では、Ｄ−スレオ体が残存したが、ｐＨ７〜９の条件
では、Ｄ−スレオ体の残存率は０％であった。From Table 5, it was found that the D-threo form remained under the conditions of pH 6.0 and pH 10.0, but the residual ratio of the D-threo form was 0% under the conditions of pH 7 to 9.

【００６２】実施例６ ０.０１ｍＭピリドキサ−ル−５'−リン酸及び１.０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含むｐＨ７.５の０.１ＭＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液１０ｍｌに、酵素触媒製造例２で得たキサント
モナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍
結乾燥菌体を０．３ｇ、表６に示すＤＯＰＳ誘導体の
Ｄ，Ｌ-スレオ体を０.００５モルと、酢酸エチル２０ｍ
ｌを加え、３０℃で撹拌下、１５時間反応させた。反応
終了後、反応液の遠心分離により酢酸エチル相を分離・
除去した。得られた水相に１Ｎ塩酸を加えて５０ｍｌに
メスアップした後、遠心分離で不溶物を除去した。この
水相希釈液の異性体分析により測定された濃度から各異
性体の残存率を算出した結果を表６に示す。また、比較
のために、反応時には酢酸エチルを添加せず、反応終了
後に酢酸エチルを添加混合し、その後は同様の処理を行
った結果を表７に示す。Example 6 0.01 mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0 m
0.1 MHEPE at pH 7.5 containing M magnesium chloride
In 10 ml of S buffer, 0.3 g of freeze-dried cells of Xanthomonas citri IFO3311 (pDT648) obtained in Enzyme Catalyst Production Example 2 and 0.005 mol of D, L-threo of DOPS derivatives shown in Table 6 were added. , Ethyl acetate 20m
1 was added and reacted at 30 ° C. with stirring for 15 hours. After the reaction, the ethyl acetate phase was separated by centrifugation of the reaction solution.
Removed. After 1N hydrochloric acid was added to the obtained aqueous phase to make up to 50 ml, insoluble materials were removed by centrifugation. Table 6 shows the results of calculating the residual ratio of each isomer from the concentration measured by the isomer analysis of the aqueous phase diluent. For comparison, Table 7 shows the results obtained by adding and mixing ethyl acetate after completion of the reaction without adding ethyl acetate during the reaction, and then performing the same treatment.

【００６３】[0063]

【表６】 [Table 6]

【００６４】[0064]

【表７】 [Table 7]

【００６５】表６、７より、いずれのＤＯＰＳ誘導体で
も、反応時に酢酸エチルを添加すると、Ｄ−スレオ体残
存率が０％となり、Ｌ−スレオ体残存率は高かった。こ
れと比べて、酢酸エチル無添加ではＤ−スレオ体残存率
が高く、Ｌ−スレオ体残存率は低かった。As can be seen from Tables 6 and 7, for all DOPS derivatives, when ethyl acetate was added during the reaction, the residual ratio of the D-threo compound was 0%, and the residual ratio of the L-threo compound was high. In comparison, when ethyl acetate was not added, the residual ratio of the D-threo compound was high, and the residual ratio of the L-threo compound was low.

【００６６】[0066]

【発明の効果】本発明によれば、酵素的光学分割法を用
いたＬ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体の製造において、不要
な異性体の酵素的分解反応を従来の水性媒体単独で行う
のに比べて、以下の利点を有する。 （１）実用的な基質濃度においても不要異性体の分解が
効率よく進行するため、目的の異性体を高い光学純度で
得ることができる。 （２）分解反応により生成するアルデヒドに起因する副
反応も抑制されるため、目的の異性体や分解生成物の収
率や純度が向上する。 （３）分解反応により生成するアルデヒドの分離を、分
解反応と同時に行い、また、酵素反応と同一容器内で行
うことが可能であるため、工程が簡略化されて装置のた
めの設備費を大幅に節約することができる。According to the present invention, in the production of an L-threo-DOPS derivative using an enzymatic optical resolution method, an enzymatic decomposition reaction of an unnecessary isomer is performed in comparison with a conventional aqueous medium alone. Has the following advantages. (1) Since the decomposition of the unnecessary isomer proceeds efficiently even at a practical substrate concentration, the target isomer can be obtained with high optical purity. (2) Since the side reaction caused by the aldehyde generated by the decomposition reaction is also suppressed, the yield and purity of the target isomer and the decomposition product are improved. (3) Separation of the aldehyde generated by the decomposition reaction can be performed simultaneously with the decomposition reaction, and can be performed in the same container as the enzymatic reaction, thus simplifying the process and greatly increasing equipment costs for the apparatus. Can be saved.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、Ｒ₁，Ｒ₂は、同一又は相異なり、水素、低級ア
ルキル又は低級アラルキル基を示すが、Ｒ₁、Ｒ₂共にア
ルキレン基で置換されて環を形成してしていてもよい）
で表わされるＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシ
フェニル）セリン誘導体を含む３−（３，４−ジヒドロ
キシフェニル）セリン誘導体の異性体混合物から、酵素
触媒であるＤ−スレオニンアルドラーゼを単独又はＬ−
アロスレオニンアルドラーゼとともに用いて不要な異性
体をグリシンと対応するアルデヒドに分解することによ
りＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）
セリン誘導体を製造するに際し、不要な異性体の分解反
応を水と二相を形成しうる有機溶媒と水性媒体の存在下
で行うことを特徴とするＬ−スレオ−３−（３，４−ジ
ヒドロキシフェニル）セリン誘導体の製造方法。1. A compound of the general formula (In the formula, R ₁ and R ₂ are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl or lower aralkyl group, but R ₁ and R ₂ may be substituted with an alkylene group to form a ring. )
From an isomer mixture of a 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative including an L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative represented by the formula, D-threonine aldolase as an enzyme catalyst is used alone or L-
L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) can be used together with alothreonine aldolase to decompose unwanted isomers into glycine and the corresponding aldehyde.
In producing a serine derivative, the decomposition reaction of an unnecessary isomer is carried out in the presence of an aqueous medium and an organic solvent capable of forming two phases with water, characterized in that L-threo-3- (3,4-dihydroxy A method for producing a phenyl) serine derivative. 【請求項２】 水と二相を形成しうる有機溶媒がエステ
ル類、アルコール類、芳香族類及びエーテル類からなる
群より選ばれた少なくとも１種である請求項１記載の製
造方法。2. The method according to claim 1, wherein the organic solvent capable of forming two phases with water is at least one selected from the group consisting of esters, alcohols, aromatics and ethers. 【請求項３】 水と二相を形成しうる有機溶媒が酢酸エ
チル又はジエチルエーテルである請求項１又は２記載の
製造方法。3. The method according to claim 1, wherein the organic solvent capable of forming two phases with water is ethyl acetate or diethyl ether. 【請求項４】 水と二相を形成しうる有機溶媒と水性媒
体の比率が重量基準で９０／１０〜１０／９０である請
求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。4. The method according to claim 1, wherein the ratio of the organic solvent capable of forming two phases with water to the aqueous medium is 90/10 to 10/90 on a weight basis. 【請求項５】 不要な異性体の分解反応がｐＨ７〜９で
行われる請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。5. The production method according to claim 1, wherein the decomposition reaction of the unnecessary isomer is performed at pH 7 to 9. 【請求項６】 Ｌ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキ
シフェニル）セリン誘導体が、Ｌ−スレオ−３−（３，
４−メチレンジオキシフェニル）セリン又はＬ−スレオ
−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリンである
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。6. An L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative, wherein the L-threo-3- (3,3
The method according to any one of claims 1 to 5, which is 4-methylenedioxyphenyl) serine or L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine.