JP2000247997A - Il-6 receptor-il-6 fusion protein having alpha helix type linker sequence - Google Patents
Il-6 receptor-il-6 fusion protein having alpha helix type linker sequenceInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、αヘリックス型の
リンカー配列をもつインターロイキン−６レセプター
（以下、ＩＬ−６Ｒと記載する）とインターロイキン−
６（以下、ＩＬ−６と記載する）の融合蛋白質に関する
ものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an interleukin-6 receptor (hereinafter referred to as IL-6R) having an α-helix type linker sequence and an interleukin-
6 (hereinafter referred to as IL-6).
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞上にＩＬ−６Ｒを全く発現しないか
少量しか発現しない標的細胞にＩＬ−６の刺激を伝える
ためには、ＩＬ−６のみならずＩＬ−６Ｒの細胞外領域
を有する可溶性のＩＬ−６Ｒが必須であることが知られ
ている。これまでかかる可溶性ＩＬ−６Ｒの医薬品とし
ての効果が調べられ、増血幹細胞増幅効果と血小板増多
効果が報告される等、ＩＬ−６Ｒは医薬品としての開発
が期待されている（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、ｐ２８５９、１９９５
年参照）。BACKGROUND OF THE INVENTION In order to deliver IL-6 stimulation to target cells that do not express IL-6R at all or only a small amount on cells, it is necessary to use not only IL-6 but also IL-6R having an extracellular region of IL-6R. It is known that IL-6R is essential. The effect of soluble IL-6R as a drug has been examined so far, and the effect of expanding blood stem cells and the effect of increasing platelets have been reported. IL-6R is expected to be developed as a drug (Sui et al., Proc). Natl.A
cad. Sci. USA, 92, p2859, 1995
Year).
【０００３】遺伝子工学の手法を用いると、天然ではそ
れぞれ別の蛋白質として製造される２種類の蛋白質を１
本のポリペプチド鎖から成る融合蛋白質として発現させ
ることができる。従って、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの様
に、互いに結合する性質をもつ２種類の蛋白質を融合蛋
白質として発現させた場合には、これら２種類の蛋白質
が本来の構造をとり得れば両者の解離が起こり難くな
る。[0003] When the genetic engineering technique is used, two types of proteins, each of which is naturally produced as a separate protein, can be converted into one protein.
It can be expressed as a fusion protein consisting of the polypeptide chains of the present invention. Therefore, when two types of proteins, such as IL-6 and IL-6R, having the property of binding to each other are expressed as a fusion protein, if these two types of proteins can have the original structure, the two proteins can have the original structure. Dissociation is less likely to occur.
【０００４】融合蛋白質において２種類の蛋白質が本来
の構造をとるためには、いずれの蛋白質にも立体障害が
起こらないことが必要である。このため、これまでに報
告された融合蛋白質では、融合された蛋白質の運動を比
較的自由にして立体障害が起こらないようにするため、
主にグリシン残基やセリン残基のような自由度の高いア
ミノ酸残基を用い、しかもこれらを５〜２０個つないで
リンカーとするのが一般的である。例えば、互いに結合
する性質をもつ抗体のＨ鎖のＶ領域とＬ鎖のＶ領域を融
合蛋白質として発現させる場合は、配列番号１０に示し
たようなリンカー配列が報告されている（Ｈｏｕｓｔｏ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８５、ｐ５８７９、１９８８年参照）。[0004] In order for the two types of proteins to have the original structure in the fusion protein, it is necessary that neither protein has steric hindrance. For this reason, in the fusion proteins reported so far, the movement of the fused protein is relatively free so that steric hindrance does not occur.
It is general to use mainly amino acid residues having a high degree of freedom, such as glycine residues and serine residues, and to connect 5 to 20 of them to form a linker. For example, when expressing the V region of the H chain and the V region of the L chain of an antibody having the property of binding to each other as a fusion protein, a linker sequence as shown in SEQ ID NO: 10 has been reported (Housto).
n et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85, p5879, 1988).
【０００５】ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質として
は、ＩＬ−６ＲのＮ末端から数えて３２３番目のアラニ
ン残基のＣ末端に、配列番号１１のように、自由度の高
いアミノ酸残基からなるリンカー配列を介してＩＬ−６
を結合させた融合蛋白質が報告されている（Ｆｉｓｃｈ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、ｐ１４
２、１９９７年参照）。また他にも、ＩＬ−６ＲのＮ末
端から数えて３５６番目のバリン残基のＣ末端にＧｌｎ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔというリンカー配列を介してＩＬ−６
を結合させた融合蛋白質も報告されている（Ｃｈｅｂａ
ｔｈら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ、８、ｐ
３５９、１９９７年参照）。[0005] As a fusion protein of IL-6R and IL-6, amino acid residues having a high degree of freedom, such as SEQ ID NO: 11, are located at the C-terminal of the 323rd alanine residue counted from the N-terminal of IL-6R. IL-6 via a linker sequence consisting of
Has been reported (Fisch)
er et al., Nature Biotech, 15, p14.
2, 1997). In addition, Gln is added to the C-terminal of the 356th valine residue counted from the N-terminal of IL-6R.
IL-6 via a linker sequence -Phe-Met
Has also been reported (Cheba
th et al., Eur. Cytokine Network, 8, p
359, 1997).
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】一般的に、自由度の高
いリンカー配列を介して２種類の蛋白質を結合した融合
蛋白質を体内に投与する医薬品として使用する場合に
は、このリンカー配列の構造自体が不安定で、しかも独
自の構造をとるために高い抗原性を有し、免疫防御機構
によって効果を発揮する前に排除されてしまい、当該効
果を持続的に発揮する医薬品とすることは困難である。Generally, when a fusion protein in which two types of proteins are linked via a linker sequence having a high degree of freedom is used as a drug to be administered into the body, the structure of the linker sequence itself is used. Is unstable and has a high antigenicity due to its unique structure, and is eliminated before exerting its effect by the immune defense mechanism, making it difficult to produce a drug that exerts the effect continuously. is there.
【０００７】そこで本発明の目的は、ＩＬ−６ＲとＩＬ
−６を従来報告されているリンカー配列に比較してより
安定かつ抗原性の減少したリンカーで結合することで、
より医薬品としての可能性を高めたＩＬ−６ＲとＩＬ−
６の融合蛋白質を提供することにある。Accordingly, an object of the present invention is to provide an IL-6R and an IL-6R.
-6 with a more stable and less antigenic linker as compared to previously reported linker sequences,
IL-6R and IL- with enhanced potential as pharmaceuticals
6 fusion proteins.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成すべく鋭意検討を行う中で、ペプチド等がとり得
る構造の中で最も安定なαヘリックス型構造に着目し、
本発明を完成するに至った。即ち本願請求項１の発明
は、ＩＬ−６Ｒのアミノ酸配列のＣ末端に、αヘリック
ス型の構造をとるペプチドリンカーを介してＩＬ−６の
アミノ酸配列がそのＮ末端側から結合された、ＩＬ−６
ＲとＩＬ−６の融合蛋白質である。そして本願請求項２
の発明は、前記αヘリックス型のペプチドリンカーが特
に３個から６個のアミノ酸残基で構成されるペプチドリ
ンカーであることを特徴とし、本願請求項３の発明は、
αヘリックス型のリンカーを構成するアミノ酸配列が特
に配列番号１から９のいずれかであることを特徴とする
前記融合蛋白質である。以下に本発明を詳細に説明す
る。Means for Solving the Problems While diligently studying to achieve the above object, the present inventors have focused on the most stable α-helical structure among structures that can be taken by peptides and the like,
The present invention has been completed. That is, the invention of claim 1 of the present application relates to an IL-6R amino acid sequence, wherein the IL-6R amino acid sequence is linked to the C-terminal of the IL-6R from the N-terminal side thereof via a peptide linker having an α-helix structure. 6
It is a fusion protein of R and IL-6. And Claim 2 of the present application
The invention of claim 3 is characterized in that the α-helix peptide linker is a peptide linker composed of 3 to 6 amino acid residues in particular.
The fusion protein described above, wherein the amino acid sequence constituting the α-helix linker is any one of SEQ ID NOs: 1 to 9. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【０００９】αヘリックス型構造は、ペプチド等がとり
得る構造の中で、構造的に最も安定である。αヘリック
ス構造をとるリンカーによりＩＬ−６ＲとＩＬ−６を結
合させて融合蛋白質が製造できれば、自由度が高い代わ
りに独自の不安定な構造をとり、しかも高い抗原性を有
する通常のリンカー配列を用いて製造した融合蛋白質よ
りも安定かつ低抗原性の融合蛋白質を提供できるはずで
ある。しかしながら、αヘリックス型構造の様な高次構
造をとるリンカーを使用してＩＬ−６ＲとＩＬ−６を結
合させることが可能であったとしても、両蛋白質がとも
に本来の構造をとり得るのかどうかについては何ら知見
はなく、ましてや両蛋白質を本来の構造をとり得る状態
で結合することのできるαヘリックス型構造を有するリ
ンカーがどの程度のアミノ酸残基により実現できるのか
についても知見はなかった。The α-helix structure is the most structurally stable among the structures that can be taken by peptides and the like. If a fusion protein can be produced by linking IL-6R and IL-6 with a linker having an α-helix structure, a conventional linker sequence having a high degree of freedom and a unique unstable structure instead of a high degree of freedom may be used. It should be possible to provide a fusion protein that is more stable and has lower antigenicity than the fusion protein produced using the fusion protein. However, even if it is possible to bind IL-6R and IL-6 using a linker having a higher-order structure such as an α-helix structure, whether or not both proteins can assume the original structure. No information was known, and even less was known as to how many amino acid residues a linker having an α-helix structure capable of binding both proteins in a state capable of forming an original structure can be realized.
【００１０】本発明は、最終的に、αヘリックス型構造
を有するリンカーを介してＩＬ−６ＲとＩＬ−６を融合
させることにより、両蛋白質が本来の構造をとり、標的
細胞に対してＩＬ−６のシグナルを効率的に伝達し得る
という知見に基づき成されたのである。[0010] The present invention finally provides a fusion between IL-6R and IL-6 via a linker having an α-helix structure, whereby both proteins take on their original structures, and IL- No. 6 was found to be able to transmit efficiently.
【００１１】ＩＬ−６Ｒは本来膜蛋白質であり、その全
長は４６８アミノ酸残基で構成され、シグナル領域、細
胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域の各領域に大別さ
れる（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、
ｐ８２５、１９８８年参照）。ヒトＩＬ−６Ｒの場合、
シグナル領域はＮ末端側から数えておよそ１番目のメチ
オニン残基から１９番目のアラニン残基までであり、細
胞外領域はＮ末端側から数えておよそ２０番目のロイシ
ン残基から３５８番目のアスパラギン酸残基までであ
り、膜貫通領域はＮ末端側から数えておよそ３５９番目
のセリン残基から３８６番目のロイシン残基までであ
り、細胞内領域はＮ末端側から数えておよそ３８７番目
のアルギニン残基から４６８番目のアルギニン残基まで
であると考えられている。[0011] IL-6R is essentially a membrane protein, and its full length is composed of 468 amino acid residues and is roughly classified into signal, extracellular, transmembrane and intracellular regions (Yamasaki et al. Science, 241,
p825, 1988). In the case of human IL-6R,
The signal region extends from the approximately 1st methionine residue to the 19th alanine residue counted from the N-terminal side, and the extracellular region extends from the approximately 20th leucine residue to 358th aspartic acid counted from the N-terminal side. The transmembrane region extends from the serine residue at position 359 from the N-terminal to the leucine residue at position 386, and the intracellular region is the arginine residue at the position 387 from the N-terminal. It is believed to be from the group to the 468th arginine residue.
【００１２】細胞外領域は更にイムノグロブリン様領域
とサイトカインレセプター領域に分けられ、イムノグロ
ブリン様領域はＮ末端側から数えておよそ２０番目のロ
イシン残基から１１１番目のアスパラギン酸残基までで
あり、サイトカインレセプター領域はＮ末端側から数え
ておよそ１１２番目のバリン残基から３２３番目のアラ
ニン残基までであると考えられている。The extracellular region is further divided into an immunoglobulin-like region and a cytokine receptor region, and the immunoglobulin-like region extends from the approximately 20th leucine residue to the 111th aspartic acid residue counted from the N-terminal side, It is thought that the cytokine receptor region extends from the valine residue at position 112 to the alanine residue at position 323, counted from the N-terminal side.
【００１３】ＩＬ−６Ｒの前記各領域のうち、ＩＬ−６
との結合に関与するのは細胞外領域であるが、その中で
も必須なのはサイトカインレセプター領域のみで、イム
ノグロブリン様領域は不要である。サイトカインレセプ
ター領域は、７つのβシートから構成されるバレル
（樽）用の構造体が短いリンカーで２個つながった構造
体である（Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ Ｊ、１２、ｐ１
７０５、１９９３年参照）。In each of the above-mentioned regions of IL-6R, IL-6
It is the extracellular region that participates in the binding to, but among them, only the cytokine receptor region is essential, and the immunoglobulin-like region is unnecessary. The cytokine receptor region is a structure in which a barrel structure composed of seven β sheets is connected by two short linkers (Yawata et al., EMBO J, 12, p1).
705, 1993).
【００１４】以上の点から、本発明が提供する融合蛋白
質のうち、ＩＬ−６Ｒの部分には、ＩＬ−６Ｒのサイト
カインレセプター領域を用いれば良いが、遺伝子工学的
手法により発現量を高くするためには細胞外領域全体を
用いることが好ましい。またＩＬ−６Ｒ部分は、後の実
施例に示すように、Ｎ末端側から数えて３４４番目のロ
イシン残基までを使用することが例示できるが、Ｎ末端
側から数えて３２３番目のアラニン残基から３６１番目
のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のうちのどれ
かひとつまでとすれば良い。[0014] From the above points, the IL-6R portion of the fusion protein provided by the present invention may use the cytokine receptor region of IL-6R. It is preferable to use the entire extracellular region for In addition, as shown in Examples below, the IL-6R portion can be exemplified by using up to the 344th leucine residue counted from the N-terminal side, and the 323rd alanine residue counted from the N-terminal side. To 361 serine residues to any one of the 39 amino acid residues.
【００１５】上記したＩＬ−６Ｒ部分のＣ末端側は、α
ヘリックス型構造をとるペプチドリンカーのＮ末端と結
合される。このペプチドリンカーがとるαヘリックス型
構造は、１ターン毎に３．６個のアミノ酸残基を含み、
ｎ番目のアミノ酸残基のカルボキシル基の酸素原子とｎ
＋４番目のアミノ酸残基の水素残基の間が水素結合を形
成したものである。それぞれのペプチド結合はこの水素
結合に関与し、この水素結合によって安定性が最大にな
るため、αヘリックス型構造は、ポリペプチド鎖にとっ
て最も安定な状態である。The C-terminal side of the above-mentioned IL-6R moiety is α
It is connected to the N-terminus of a peptide linker having a helical structure. The α-helical structure taken by this peptide linker contains 3.6 amino acid residues per turn,
the oxygen atom of the carboxyl group of the nth amino acid residue and n
A hydrogen bond is formed between the hydrogen residues of the + 4th amino acid residue. The α-helical structure is the most stable state for a polypeptide chain, since each peptide bond participates in this hydrogen bond, which maximizes stability.
【００１６】本発明が提供する融合蛋白質においてＩＬ
−６Ｒ部分と後述するＩＬ−６部分を結合するペプチド
リンカーは、αヘリックス型構造をとる配列であればい
かなる配列でも良く、該リンカーを構成するアミノ酸残
基としてはαヘリックスを切断するプロリン以外のもの
であれば制限はない。融合蛋白質の抗原性を減少させる
目的では、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の
数を可能な限り短くすることが好ましく、例えば３〜６
個のアミノ酸残基で構成されるものがかかる好ましいペ
プチドリンカーとして例示できる。前記したようにαヘ
リックス型構造を形成するには４個以上のアミノ酸配列
が必要となるため、３個のアミノ酸残基で構成されるリ
ンカーペプチドを使用する場合には、そのＮ末端側のＩ
Ｌ−６Ｒ部分又はそのＣ末端側のＩＬ−６部分に含まれ
るアミノ酸残基との間でαヘリックス型構造が形成され
るようにすれば良い。In the fusion protein provided by the present invention, IL
The peptide linker that binds the −6R portion and the IL-6 portion described below may be any sequence as long as it has an α-helix structure, and the amino acid residues constituting the linker are other than proline that cuts the α-helix. There is no limit if it is a thing. For the purpose of reducing the antigenicity of the fusion protein, it is preferable to minimize the number of amino acid residues constituting the peptide linker, for example, from 3 to 6
A preferable example of such a peptide linker is one composed of amino acid residues. As described above, four or more amino acid sequences are required to form an α-helix structure. Therefore, when a linker peptide composed of three amino acid residues is used, the N-terminal I
An α-helical structure may be formed between the L-6R portion and the amino acid residues contained in the IL-6 portion on the C-terminal side thereof.
【００１７】前記した３〜６個のアミノ酸残基で構成さ
れる好ましいペプチドリンカーとして、より具体的に、
配列番号１〜配列番号９で示したいずれかの配列を例示
することができる。As the preferred peptide linker composed of 3 to 6 amino acid residues, more specifically,
Any of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 9 can be exemplified.
【００１８】ペプチドリンカーのＣ末端側には、融合蛋
白質を構成するもう一方の蛋白質であるＩＬ−６部分が
結合される。ＩＬ−６は分泌型蛋白質であり、その全長
は２１２アミノ酸残基で構成され（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３２４、ｐ７３１、１９８６年参照）、４
つのαヘリックスを含む。そしてＩＬ−６が生理活性を
示すためには、この４つのαヘリックスの全てが必要で
ある。The IL-6 portion, which is another protein constituting the fusion protein, is bound to the C-terminal side of the peptide linker. IL-6 is a secreted protein whose total length is made up of 212 amino acid residues (Hirano et al., N.
atature, 324, p731, 1986), 4
Includes two alpha helices. Then, in order for IL-6 to exhibit bioactivity, all of these four α helices are necessary.
【００１９】従って本発明が提供する融合蛋白質におい
ては、ＩＬ−６部分として上記４つのαヘリックス全て
を用いる。即ち、生理活性を有するＩＬ−６の発現例
（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．
１２、ｐ４１９、１９９０年）や生理活性を有するＩＬ
−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質の発現例（Ｆｉｓｃｈ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５、ｐ１
４２、１９９７年）を参考として、全長２１２アミノ酸
残基のうちどのアミノ酸残基からどのアミノ酸残基まで
をＩＬ−６部分として使用するかを決定すれば良いが、
例えば、Ｎ末端側から数えて２８番目のアラニン残基又
は２９番目のプロリン残基から２１２番目のメチオニン
残基までを用いることが好ましく例示できる。Therefore, in the fusion protein provided by the present invention, all of the above four α helices are used as the IL-6 portion. That is, an expression example of IL-6 having a biological activity (Yasukawa et al., Biotech. Lett.
12, p419, 1990) and biologically active IL
Example of Expression of Fusion Protein of IL-6R and IL-6 (Fisch
er et al., Nature Biotech. , 15, p1
42, 1997), it is sufficient to determine which amino acid residue to which amino acid residue of the total length of 212 amino acid residues are to be used as the IL-6 portion.
For example, it is preferable to use from the 28th alanine residue or the 29th proline residue to the 212th methionine residue counted from the N-terminal side.
【００２０】遺伝子工学的手法で用いる宿主は、例えば
ＣＨＯ細胞に代表される動物細胞等を用いることもで
き、特別の制限はないが、取扱いや培養操作が容易で、
融合蛋白質の発現量も良好な酵母が本発明の融合蛋白質
を製造するために使用する宿主として好適である。中で
もピキア・パストリス種（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ）の酵母は、後の実施例でも示したように、メタノ
ールを唯一の炭素源として生育できる酵母であり、ＣＨ
Ｏ細胞等と比較して安価に培養できるという利点を有す
る特に好ましい宿主である。As the host used in the genetic engineering technique, for example, animal cells such as CHO cells can be used, and there is no particular limitation.
Yeast having a good expression level of the fusion protein is suitable as a host used for producing the fusion protein of the present invention. Among them, Pichia pastoris (Pichia pastor)
The is) yeast is a yeast that can grow with methanol as the sole carbon source, as shown in the examples below,
It is a particularly preferred host having the advantage that it can be cultured at a lower cost than O cells and the like.
【００２１】本発明が提供する融合蛋白質を遺伝子工学
的に製造するためには、該融合蛋白質をコードする遺伝
子を含む発現ベクターを調製した後、これを適当な宿主
細胞に導入して該宿主細胞を形質転換するという、通常
の手法を適用すれば良い。なお、本発明が提供する融合
蛋白質を好ましくピキア・パストリス種の酵母において
発現させる場合には、シグナルペプチドとしてＩＬ−６
Ｒ本来のシグナルペプチド等を用いることもできるが、
α因子のシグナルぺプチドを用いることが発現量の増加
効果という面では特に好ましい。また酵母等の宿主細胞
中に本発明が提供する融合蛋白質をコードする遺伝子を
導入するために使用する発現ベクターは、使用する宿主
細胞との関連で適宜選択して使用すれば良い。例えばピ
キア・パストリス種の酵母を宿主細胞として用いるので
あれば、その染色体ＤＮＡ中に本発明の融合蛋白質をコ
ードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を導入するためのアルコー
ルオキシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列、大腸菌で
の組み換えのためのアンピシリン耐性遺伝子、融合蛋白
質をコードする遺伝子が導入された酵母を選択するため
の指標として用いるヒスチジン合成遺伝子、そして、ピ
キア・パストリス種の酵母中で融合蛋白質を発現させる
ためのアルコールオキシダーゼ遺伝子プロモーター配列
があらかじめ含まれているものを用いることが例示でき
るが、かかる発現ベクターとしては市販のもの（インビ
トロジェン社製、ｐＰＩＣ９）を用いることもできる。In order to produce the fusion protein provided by the present invention by genetic engineering, an expression vector containing a gene encoding the fusion protein is prepared and then introduced into an appropriate host cell. May be applied by the usual method of transforming When the fusion protein provided by the present invention is preferably expressed in yeast of the species Pichia pastoris, IL-6 may be used as a signal peptide.
Although the original signal peptide of R can be used,
It is particularly preferable to use an α-factor signal peptide from the viewpoint of increasing the expression level. The expression vector used to introduce the gene encoding the fusion protein provided by the present invention into a host cell such as yeast may be appropriately selected and used in relation to the host cell to be used. For example, if yeast of the species Pichia pastoris is used as a host cell, the upstream and downstream sequences of the alcohol oxidase gene for introducing the gene (cDNA) encoding the fusion protein of the present invention into its chromosomal DNA, Ampicillin resistance gene for recombination, a histidine synthesis gene used as an indicator for selecting a yeast into which a gene encoding the fusion protein has been introduced, and an alcohol for expressing the fusion protein in yeast of the Pichia pastoris species For example, a vector containing an oxidase gene promoter sequence in advance can be used, and a commercially available expression vector (pPIC9, manufactured by Invitrogen) can also be used.
【００２２】このような発現ベクターにより例えばピキ
ア・パストリス種の酵母を形質転換し、培養することに
より、本発明の融合蛋白質を製造することができる。ピ
キア・パストリス種の酵母の培養法は、例えばジャーフ
ァーメンターを用いることにより行うことができる。よ
り具体的には、例えば特願平９−３５９８３８号や特願
平１０−１４７８号に記載された培養方法を例示するこ
とができる。The fusion protein of the present invention can be produced by transforming, for example, a yeast of the species Pichia pastoris with such an expression vector and culturing it. The method for culturing Pichia pastoris yeast can be carried out, for example, by using a jar fermenter. More specifically, for example, the culture methods described in Japanese Patent Application Nos. 9-359838 and 10-1478 can be exemplified.
【００２３】培養後、発現した融合蛋白質を培養上清か
ら得るには、液体クロマトグラフィー操作等、蛋白質を
精製するための通常の操作を行えば良いが、例えばピキ
ア・パストリス種の酵母の培養上清からの精製操作であ
れば、例えば特願平９−３２３１９５号に記載された方
法を例示することができる。To obtain the expressed fusion protein from the culture supernatant after the cultivation, ordinary procedures for purifying the protein such as liquid chromatography may be performed. For example, in the cultivation of yeast of the species Pichia pastoris, In the case of a purification operation from pure water, for example, a method described in Japanese Patent Application No. 9-323195 can be exemplified.
【００２４】[0024]
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態として
実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。Embodiments of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these embodiments.
【００２５】実施例１ 中間体プラスミドの作製 以下のようにして、各種リンカー配列をコードするオリ
ゴヌクレオチドを挿入することにより、対応するリンカ
ー配列を有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡが作製できることを特徴とする中間体
プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌを作製した。Example 1 Preparation of Intermediate Plasmid By inserting oligonucleotides encoding various linker sequences as follows, a fusion protein of IL-6R and IL-6 having the corresponding linker sequence is encoded. An intermediate plasmid pBS6R6L characterized by being capable of producing cDNA was prepared.
【００２６】最初に、クローニングベクター（東洋紡
（株）製、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（-））を
制限酵素ＫｐｎＩで切断し、クレノウフラグメントで処
理した後、ライゲーション反応をすることにより、Ｋｐ
ｎＩサイトがつぶれたプラスミドｐＢＳを作製した。First, a cloning vector (pBluescript II KS (-), manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is digested with a restriction enzyme KpnI, treated with Klenow fragment, and then subjected to a ligation reaction.
A plasmid pBS in which the nI site was crushed was prepared.
【００２７】プライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌ（配列番号１
２）とプライマーｐ６ＲＦ３２０Ｓ（配列番号１３）を
用いてＰＣＲ（ポリメレースチェーンリアクション）を
行い、ＩＬ−６ＲのｃＤＮＡを増幅した。増幅したｃＤ
ＮＡをＸｈｏＩで切断した後、あらかじめＸｈｏＩとＥ
ｃｏＲＶで切断したプラスミドｐＢＳに挿入してプラス
ミドｐＢＳ６Ｒを得た。The primer p6RAB20L (SEQ ID NO: 1)
PCR (polymerase chain reaction) was performed using 2) and the primer p6RF320S (SEQ ID NO: 13) to amplify the IL-6R cDNA. Amplified cD
After cutting NA with XhoI, XhoI and E
Plasmid pBS6R was obtained by insertion into plasmid pBS cut with coRV.
【００２８】次に、プライマーｐＩＬ６Ｂ２（配列番号
１４）とプライマーｐＩＬ６Ｆ（配列番号１５）を用い
てＰＣＲを行い、ＩＬ−６のｃＤＮＡを増幅した。増幅
したｃＤＮＡをＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切断した後、あ
らかじめＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切断したプラスミドｐ
ＢＳ６Ｒに挿入してプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓを得た。
プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓの構造を図１に示す。Next, PCR was performed using primers pIL6B2 (SEQ ID NO: 14) and primer pIL6F (SEQ ID NO: 15) to amplify the IL-6 cDNA. After digesting the amplified cDNA with BglII and NotI, the plasmid p previously cut with BglII and NotI is used.
Plasmid pBS6R6S was obtained by insertion into BS6R.
The structure of plasmid pBS6R6S is shown in FIG.
【００２９】次に、オリゴマー３２０Ｓ３３３Ａｂ（配
列番号１６）とプライマー３２０Ｓ３３３Ａｆ（配列番
号１７）を通常の方法でアニールさせた後、あらかじめ
ＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで切断したプラスミドｐＢＳ６Ｒ
６Ｓに挿入してプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌを得た。得ら
れたｐＢＳ６Ｒ６Ｌの構造を図３に示す。Next, after the oligomer 320S333Ab (SEQ ID NO: 16) and the primer 320S333Af (SEQ ID NO: 17) were annealed by a conventional method, the plasmid pBS6R previously cut with BglII and KpnI was used.
The plasmid pBS6R6L was obtained by insertion into 6S. FIG. 3 shows the structure of the obtained pBS6R6L.
【００３０】実施例２ 発現プラスミドの作製 あらかじめＥｃｏ４７ＩＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＢ
Ｓ６Ｒ６Ｌに、オリゴヌクレオチド２種をアニールさせ
たものを挿入し、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質を
コードする遺伝子をインサートにもつプラスミド１０種
類を作製した。アニールさせたオリゴヌクレオチドは、
以下の通りである。Example 2 Preparation of Expression Plasmid pB previously cut with Eco47III and KpnI
Annealed two types of oligonucleotides were inserted into S6R6L to prepare 10 types of plasmids having as their insert a gene encoding a fusion protein of IL-6R and IL-6. The annealed oligonucleotide is
It is as follows.
【００３１】配列番号１８（αＬ３−１，３４４Ｌ，Ｅ
ＬＶ，ＡＰＶＰＰ，センス側） 配列番号１９（αＬ３−１，３４４Ｌ，ＥＬＶ，ＡＰＶ
ＰＰ，アンチセンス側） 配列番号２０（αＬ３−２，３４４Ｌ，ＧＳＥ，ＡＰＶ
ＰＰ，センス側） 配列番号２１（αＬ３−２，３４４Ｌ，ＧＳＥ，ＡＰＶ
ＰＰ，アンチセンス側） 配列番号２２（αＬ４−１，３４４Ｌ，ＳＳＥＬ，ＡＶ
ＰＰＧ，センス側） 配列番号２３（αＬ４−１，３４４Ｌ，ＳＳＥＬ，ＡＶ
ＰＰＧ，アンチセンス側） 配列番号２４（αＬ４−２，３４４Ｌ，ＳＥＬＶ，ＡＰ
ＶＰＰ，センス側） 配列番号２５（αＬ４−２，３４４Ｌ，ＳＥＬＶ，ＡＰ
ＶＰＰ，アンチセンス側） 配列番号２６（αＬ４−３，３４４Ｌ，ＳＳＥＬ，ＡＰ
ＶＰＰ，センス側） 配列番号２７（αＬ４−３，３４４Ｌ，ＳＳＥＬ，ＡＰ
ＶＰＰ，アンチセンス側） 配列番号２８（αＬ５−１，３４４Ｌ，ＳＳＥＬＥ，Ａ
ＰＶＰＰ，センス側） 配列番号２９（αＬ５−１，３４４Ｌ，ＳＳＥＬＥ，Ａ
ＰＶＰＰ，アンチセンス側） 配列番号３０（αＬ５−２，３４４Ｌ，ＳＳＥＬＶ，Ａ
ＧＶＰＰ，センス側） 配列番号３１（αＬ５−２，３４４Ｌ，ＳＳＥＬＶ，Ａ
ＧＶＰＰ，アンチセンス側） 配列番号３２（αＬ５−３，３４４Ｌ，ＳＳＥＱＬ，Ｐ
ＶＰＰＧ，センス側） 配列番号３３（αＬ５−３，３４４Ｌ，ＳＳＥＱＬ，Ｐ
ＶＰＰＧ，アンチセンス側） 配列番号３４（αＬ６−１，３４４Ｌ，ＧＳＳＥＬＶ，
ＡＰＶＰＰ，センス側） 配列番号３５（αＬ６−１，３４４Ｌ，ＧＳＳＥＬＶ，
ＡＰＶＰＰ，アンチセンス側） 配列番号３６（αＬ６−２，３４４Ｌ，ＳＳＥＬＥＶ，
ＡＰＶＰＰ，センス側） 配列番号３７（αＬ６−２，３４４Ｌ，ＳＳＥＬＥＶ，
ＡＰＶＰＰ，アンチセンス側） なお、（ ）内は順に、誘導体名、ＩＬ−６Ｒ部分のＣ
末端に位置するのアミノ酸残基の番号（全長ＩＬ−６Ｒ
のＮ末端から数えた番号）とその種別、リンカーの配列
（アミノ酸残基の一文字表記）、ＩＬ−６部分のアミノ
酸配列のＮ末端から５残基の配列（アミノ酸の一文字表
記）、当該オリゴヌクレオチドのセンス側とアンチセン
ス側の種別をそれぞれ意味する。SEQ ID NO: 18 (αL3-1, 344L, E
LV, APVPP, sense side) SEQ ID NO: 19 (αL3-1, 344L, ELV, APV
PP, antisense side) SEQ ID NO: 20 (αL3-2, 344L, GSE, APV
PP, sense side) SEQ ID NO: 21 (αL3-2, 344L, GSE, APV
PP, antisense side) SEQ ID NO: 22 (αL4-1, 344L, SSEL, AV
PPG, sense side) SEQ ID NO: 23 (αL4-1, 344L, SSEL, AV
PPG, antisense side) SEQ ID NO: 24 (αL4-2, 344L, SELV, AP
VPP, sense side) SEQ ID NO: 25 (αL4-2, 344L, SELV, AP
VPP, antisense side) SEQ ID NO: 26 (αL4-3, 344L, SSEL, AP
VPP, sense side) SEQ ID NO: 27 (αL4-3, 344L, SSEL, AP
VPP, antisense side) SEQ ID NO: 28 (αL5-1, 344L, SSELE, A
PVPP, sense side) SEQ ID NO: 29 (αL5-1, 344L, SSELE, A
PVPP, antisense side) SEQ ID NO: 30 (αL5-2, 344L, SSELV, A
GVPP, sense side) SEQ ID NO: 31 (αL5-2, 344L, SSELV, A
GVPP, antisense side) SEQ ID NO: 32 (αL5-3, 344L, SSEQL, P
VPPG, sense side) SEQ ID NO: 33 (αL5-3, 344L, SSEQL, P
VPPG, antisense side) SEQ ID NO: 34 (αL6-1, 344L, GSSELV,
APVPP, sense side) SEQ ID NO: 35 (αL6-1, 344L, GSSELV,
APVPP, antisense side) SEQ ID NO: 36 (αL6-2, 344L, SSELEV,
APVPP, sense side) SEQ ID NO: 37 (αL6-2, 344L, SSELEV,
(APVPP, antisense side) Note that, in parentheses, the derivative name and IL-6R portion C
The number of the amino acid residue located at the end (full length IL-6R
No. counted from the N-terminus), its type, linker sequence (one-letter notation of amino acid residues), sequence of five residues from the N-terminus of the amino acid sequence of IL-6 portion (one-letter notation of amino acids), the oligonucleotide Of the sense side and the antisense side respectively.
【００３２】上記方法で作製したプラスミド１０種をそ
れぞれＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＩＬ−６ＲとＩＬ
−６の融合蛋白質をコードする遺伝子断片を、あらかじ
めＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入して
発現プラスミド１０種を作製した。このうちの一例とし
て、誘導体名αＬ３−１を挿入した発現プラスミドの構
造を図５に示す。The ten plasmids prepared by the above method were digested with XhoI and NotI, respectively, and IL-6R and IL-6R were digested.
The gene fragment encoding the -6 fusion protein was inserted into pPIC9 previously cut with XhoI and NotI to prepare 10 types of expression plasmids. As one example, the structure of an expression plasmid into which the derivative name αL3-1 has been inserted is shown in FIG.
【００３３】実施例３ 形質転換体の作製 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（イン
ビトロジェン社）から、Ｃｒｅｇｇ Ｊ． Ｍ．らの方
法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，ｐ３３７６，
１９８５年）及び特開平２−１０４９２０号公報に記載
の方法に従ってスフェロプラストを調製し、ＢｇｌＩＩ
によって線状化した実施例２記載の発現プラスミド１０
種をそれぞれ以下の方法で導入した。Example 3 Preparation of Transformant [0034] From Pichia pastoris strain GS115 (Invitrogen), Cregg J. M. Et al. (Mol. Cell. Biol., 5, p3376,
1985) and JP-A-2-104920, and spheroplasts were prepared.
Expression plasmid 10 described in Example 2 linearized by
The seeds were each introduced in the following manner.
【００３４】即ち、ＧＳ１１５株を３０℃条件下、ＹＰ
Ｄ培地５０ｍｌ中でＯＤ６００が１になるまで振とう培
養した後、菌を集め、スフェロプラストを作製し、発現
プラスミドを導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培
養し、ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選別し
た。That is, the GS115 strain was transformed at 30 ° C. into YP
After shaking culture until the OD600 became 1 in 50 ml of D medium, the bacteria were collected, spheroplasts were prepared, and the expression plasmid was introduced. Transformants were cultured in a minimal nutrient medium, and those that lost histidine auxotrophy were selected.
【００３５】次に、得られた形質転換体をＭＤプレート
（１．３４％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓ
ｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ
ｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン、２
％グルコース）と０．５％ＭＭプレート（１．３４％
（ｗ／ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．４ｍｇ／ｌビオ
チン、０．５％メタノール）にそれぞれ接種し、各形質
転換体に対し、ｍｕｔ+であるかｍｕｔsであるかを調べ
た。得られたｍｕｔs菌の数を表１に示す。Next, the obtained transformant was placed on an MD plate (1.34% (w / v) YNB wo AA (Yeas).
t Nitrogen Base with a
mino acids), 0.4 mg / l biotin, 2
% Glucose and 0.5% MM plate (1.34%
(W / v) YNB wo AA, 0.4 mg / l biotin, 0.5% methanol), and each transformant was examined for mut + or mut s . The number of mut s strains thus obtained are shown in Table 1.
【００３６】[0036]
【表１】 [Table 1]
【００３７】表１から明らかなように、各誘導体ごとに
１個から８個、平均４．２個のｍｕｔs菌が取得でき
た。As it is apparent from Table 1, eight from one for each derivative, average 4.2 pieces of mut s bacteria can be acquired.
【００３８】実施例４ 形質転換体の培養 実施例３において取得されたｍｕｔs菌４２種を、それ
ぞれ試験管を用いて３０℃条件下、５％（ｖ／ｖ）のメ
タノールを含むＢＭＧＹ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキ
ス、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、１．３４％（ｗ／ｖ）Ｙ
ＮＢ ｗｏＡＡ、０．４ｍｇ／ｌビオチン、１００ｍ
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％（ｗ／ｖ）グリ
セロール）３ｍｌの中で１２０時間培養し、上清を集め
た。[0038] Example 4 mut s strains 42 species obtained in culture example 3 of the transformants, 30 ° C. conditions using test tubes, BMGY medium containing methanol 5% (v / v) ( 1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v) peptone, 1.34% (w / v) Y
NB woAA, 0.4mg / l biotin, 100m
The cells were cultured in 3 ml of potassium M phosphate (pH 6.0), 1% (w / v) glycerol for 120 hours, and the supernatant was collected.
【００３９】実施例５ 生物活性の測定 実施例４における各培養上清中の、ＩＬ−６ＲとＩＬ−
６の融合蛋白質の生物活性を、ＢＡＦｈ１３０細胞を用
いた生物活性評価法により測定した。ＢＡＦ１３０は、
本来ヒトｇｐ１３０蛋白質を発現していないマウス細胞
ＢＡＦ（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｃｅｌｌ、６３、ｐ
１５４、１９８９年）にヒトｇｐ１３０蛋白質をコード
する遺伝子を導入して形質転換させ、当該蛋白質を発現
させた細胞であり、ヒトＩＬ−６Ｒ及びヒトＩＬ−６が
共存すると増殖活性を示す細胞である。Example 5 Measurement of Biological Activity In each culture supernatant in Example 4, IL-6R and IL-
The biological activity of the fusion protein No. 6 was measured by a biological activity evaluation method using BAFh130 cells. BAF130 is
Mouse cells BAF that do not naturally express the human gp130 protein (Hatakeya et al., Cell, 63, p.
154, 1989), which was transformed by introducing a gene encoding the human gp130 protein and expressing the protein. The cell showed a proliferative activity when human IL-6R and human IL-6 coexisted. .
【００４０】ＢＡＦｈ１３０細胞の懸濁液を、９６穴プ
レートに２×１０4細胞／穴となるように添加し、４２
種類の培養上清をそれぞれ、１％、０．２５％、０．０
６１％、０．０１５％に希釈して添加した。２日後、Ｃ
ｅｌｌ ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（和光純薬工業製）を
用い、参照波長を６００ｎｍとしたときの４０５ｎｍの
吸光度を測定した。A suspension of BAFh130 cells was added to a 96-well plate at a concentration of 2 × 10 4 cells / well, and 42
1%, 0.25%, 0.0%
It diluted and added to 61% and 0.015%. Two days later, C
Using an Cell Counting Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), the absorbance at 405 nm when the reference wavelength was 600 nm was measured.
【００４１】培養上清の代わりに１μｇ／ｍｌのＩＬ−
６を各濃度に希釈してそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌの可溶
性ＩＬ−６Ｒとともに添加したときの吸光度と同じ濃度
依存性を示す培養上清の活性を１ｕｎｉｔ／ｍｌと定義
した。表２に各誘導体の培養上清の生物活性の平均値を
示す。Instead of the culture supernatant, 1 μg / ml of IL-
The activity of the culture supernatant showing the same concentration dependence as the absorbance when 6 was diluted to each concentration and added together with 100 ng / ml of soluble IL-6R was defined as 1 unit / ml. Table 2 shows the average biological activity of the culture supernatant of each derivative.
【００４２】[0042]
【表２】 [Table 2]
【００４３】実施例６ 融合蛋白質濃度の測定 実施例４により得られた培養上清中の融合蛋白質濃度
を、ヤギ由来抗ヒトＩＬ−６ポリクローナル抗体とウサ
ギ由来抗ヒトＩＬ−６Ｒポリクローナル抗体とのサンド
イッチＥＬＩＳＡ法で測定した。Example 6 Measurement of Fusion Protein Concentration The fusion protein concentration in the culture supernatant obtained in Example 4 was determined by sandwiching a goat-derived anti-human IL-6 polyclonal antibody with a rabbit-derived anti-human IL-6R polyclonal antibody. It was measured by the ELISA method.
【００４４】培養上清中の各融合蛋白質の濃度は、特願
平１１−２１７８８号に記載した方法で精製した融合蛋
白質３３３Ａ△Ａ（ＩＬ−６ＲのＮ末端側から数えて２
０番目のロイシン残基から３３３番目のアラニン残基ま
でのアミノ酸配列の後ろに、ＩＬ−６のＮ末端側から数
えて２８番目のアラニン残基から２１２番目のメチオニ
ン残基までのアミノ酸配列が融合した蛋白質）を標準物
質として定量した。表３には培養上清中の各融合蛋白質
濃度の平均値を示す。The concentration of each fusion protein in the culture supernatant was determined by measuring the fusion protein 333AΔA purified by the method described in Japanese Patent Application No. 11-21788 (counting from the N-terminal side of IL-6R).
After the amino acid sequence from the 0th leucine residue to the 333th alanine residue, the amino acid sequence from the 28th alanine residue to the 212th methionine residue counted from the N-terminal side of IL-6 is fused. Was determined as a standard substance. Table 3 shows the average value of the concentration of each fusion protein in the culture supernatant.
【００４５】また表４には、実施例５で得た各誘導体の
培養上清の生物活性値を実施例６で得た各融合蛋白質の
濃度で割り、比活性（融合蛋白質１ｍｇあたりの生物活
性）の平均値と標準偏差を示す。In Table 4, the biological activity of the culture supernatant of each derivative obtained in Example 5 was divided by the concentration of each fusion protein obtained in Example 6, and the specific activity (biological activity per 1 mg of fusion protein) was obtained. ) Mean and standard deviation.
【００４６】[0046]
【表３】 [Table 3]
【００４７】[0047]
【表４】 [Table 4]
【００４８】表２〜表４から明らかなように、αヘリッ
クス構造のリンカーをもつ本発明の融合蛋白質１０種類
の全てにおいて、同一の融合蛋白質発現ベクターで形質
転換された、少なくとも一つ以上のｍｕｔs菌の培養上
清中には、生物活性を有する融合蛋白質の発現が認めら
れた。これは、αヘリックス構造のリンカーをもつＩＬ
−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が機能することを示すもの
である。As is clear from Tables 2 to 4, at least one or more muts transformed with the same fusion protein expression vector were used in all of the ten types of fusion proteins of the present invention having a linker having an α-helix structure. Expression of a biologically active fusion protein was observed in the culture supernatant of the s . This is an IL with an α-helical linker
This shows that the -6R-IL-6 fusion protein functions.
【００４９】[0049]
【発明の効果】本発明が提供する、ＩＬ−６Ｒのアミノ
酸配列のＣ末端に、αヘリックス型の構造をとるペプチ
ドリンカーを介してＩＬ−６のアミノ酸配列がそのＮ末
端側から結合されたＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質
は、通常のペプチドリンカーを介する融合蛋白質に比較
して安定であるという特徴を有する。この結果、本願発
明の融合蛋白質は、体内に投与する医薬品として使用す
る場合に従来のペプチドリンカーを用いるものに比較し
て抗原性を低くでき、免疫防御機構に対抗して長時間効
果を発揮し得るという効果を有する。According to the present invention, there is provided an IL having an amino acid sequence of IL-6 bound to the C-terminus of the amino acid sequence of IL-6R from the N-terminal side thereof via a peptide linker having an α-helix structure. A fusion protein of -6R and IL-6 has a feature that it is more stable than a fusion protein via a normal peptide linker. As a result, when the fusion protein of the present invention is used as a drug administered to the body, the fusion protein can have lower antigenicity than that using a conventional peptide linker, and exerts a long-term effect against the immune defense mechanism. It has the effect of gaining.
【００５０】[0050]
【００５１】[0051]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> αヘリックス型のリンカー配列をもつＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合 蛋白質 <130> ２１０−９７４７ <160> 37 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 1 Glu Leu Val 3 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 2 Gly Ser Glu 3 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 3 Ser Ser Glu Leu 4 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 4 Ser Glu Leu Val 4 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 5 Ser Ser Glu Leu Glu 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 6 Ser Ser Glu Leu Val 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 7 Ser Ser Glu Gln Leu 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 8 Gly Ser Ser Glu Leu Val 6 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 9 Ser Ser Glu Leu Glu Val 6 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ペプチドリンカー <400> 11 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu 13 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 12 ctcgagaaga ggctggcccc aaggcgctgc cc 32 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 13 agatctggat tctgtccaag gcgtgcccat ggc 33 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 14 agatctggta cccccaggag aagattcc 28 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 15 atgcggccgc tacatttgcc gaagagccc 29 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴマー <400> 16 gatcccctcc agctgagaac gaggtgtcca cccccatgca agcgctggta c 51 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 17 cagcgcttgc atgggggtgg acacctcgtt ctcagctgga ggg 43 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ３−１用アニール配列（センス側） <400> 18 acttactact aataaagacg atgataatat tctcgaattg gttgctccgg tac 53 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ３−１用アニール配列（アンチセンス側） <400> 19 cggagcaacc aattcgagaa tattatcatc gtctttatta gtagtaagt 49 <210> 20 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ３−２用アニール配列（センス側） <400> 20 acttactact aataaagacg atgataatat tctcggttct gaagctccgg tac 53 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ３−２用アニール配列（アンチセンス側） <400> 21 cggagcttca gaaccgagaa tattatcatc gtctttatta gtagtaagt 49 <210> 22 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ４−１用アニール配列（センス側） <400> 22 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggctg tac 53 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ４−１用アニール配列（アンチセンス側） <400> 23 agccaattca gaagagagaa tattatcatc gtctttatta gtagtaagt 49 <210> 24 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ４−２用アニール配列（センス側） <400> 24 acttactact aataaagacg atgataatat tctctctgaa ttggttgctc cggtac 56 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ４−２用アニール配列（アンチセンス側） <400> 25 cggagcaacc aattcagaga gaatattatc atcgtcttta ttagtagtaa gt 52 <210> 26 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ４−３用アニール配列（センス側） <400> 26 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggttg ctccggtac 59 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ４−３用アニール配列（アンチセンス側） <400> 27 cggagcaacc aattcagaag agagaatatt atcatcgtct ttattagtag taagt 55 <210> 28 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ５−１用アニール配列（センス側） <400> 28 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggagg ctccggtac 59 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ５−１用アニール配列（アンチセンス側） <400> 29 cggagcctcc aattcagaag agagaatatt atcatcgtct ttattagtag taagt 55 <210> 30 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ５−２用アニール配列（センス側） <400> 30 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggttg ctggtgtac 59 <210> 31 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ５−２用アニール配列（アンチセンス側） <400> 31 accagcaacc aattcagaag agagaatatt atcatcgtct ttattagtag taagt 55 <210> 32 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ５−３用アニール配列（センス側） <400> 32 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaacaattgc cggtac 56 <210> 33 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ５−３用アニール配列（アンチセンス側） <400> 33 cggcaattgt tcagaagaga gaatattatc atcgtcttta ttagtagtaa gt 52 <210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ６−１用アニール配列（センス側） <400> 34 acttactact aataaagacg atgataatat tctccggtct tctgaattgg ttgctccggt 60 ac 62 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ６−１用アニール配列（アンチセンス側） <400> 35 cggagcaacc aattcagaag aaccgagaat attatcatcg tctttattag tagtaagt 58 <210> 36 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ６−２用アニール配列（センス側） <400> 36 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggagg ttgctccggt 60 ac 62 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αＬ６−２用アニール配列（アンチセンス側） <400> 37 cggagcaacc tccaattcag aagagagaat attatcatcg tctttattag tagtaagt 58[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> IL-6 receptor / IL-6 fusion protein with α-helix linker sequence <130> 210-9747 <160> 37 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 1 Glu Leu Val 3 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 2 Gly Ser Glu 3 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 3 Ser Ser Glu Leu 4 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 4 Ser Glu Leu Val 4 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 5 Ser Ser Glu Leu Glu 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 6 Ser Ser Glu Leu Val 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 7 S er Ser Glu Gln Leu 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 8 Gly Ser Ser Glu Leu Val 6 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 9 Ser Ser Glu Leu Glu Val 6 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223 > Peptide linker <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400 > 11 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu 13 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ctcgagaaga ggctggcccc aaggcgctgc cc 32 < 210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 agatctggat tctgtccaag gcgtgcccat ggc 33 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Primer <400> 14 agatctggta cccccaggag aagattcc 28 <210> 15 <211> 29 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 atgcggccgc tacatttgcc gaagagccc 29 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer <400> 16 gatcccctcc agctgagaac gaggtgtcca cccccatgca agcgctggta c 51 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cagcgcttgc atgggggtgg acacctcgtt ctcagctgga ggg 43 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL3-1 (sense side) <400> 18 acttactact aataaagacg atgataatat tctcgaattg gttgctccgg tac 53 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Annealed sequence for αL3-1 (antisense side) <400> 19 cggagcaacc aattcgagaa tattatcatc gtctttatta gtagtaagt 49 <210> 20 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αL3 -2 annealing sequence (sense side) <400> 20 acttactact aataaagacg atgataatat tctcggttct gaagctccgg tac 53 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL3-2 (antisense side) <400> 21 cggagcttca gaaccgagaa tattatcatc gtctttatta gtagtaagt 49 <210> 22 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> < 223> Annealed sequence for αL4-1 (sense side) <400> 22 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggctg tac 53 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> For αL4-1 Annealed sequence (antisense side) <400> 23 agccaattca gaagagagaa tattatcatc gtctttatta gtagtaagt 49 <210> 24 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL4-2 (sense side) <400> 24 acttactact aataaagacg atgataatat tctctctgaa ttggttgctc cggtac 56 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL4-2 (antisense side) <400> 25 cggagcaacc aattcagaga gaatattatc atcgtcttta ttagtagtaa gt 52 <210> 26 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Annealed sequence for αL4-3 (sense side) <400> 26 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggttg ctccggtac 59 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αL4- Annealing sequence for 3 (antisense side) <400> 27 cggagcaacc aattcagaag agagaatatt atcatcgtct ttattagtag taagt 55 <210> 28 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealing sequence for αL5-1 ( <Sense> <400> 28 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggagg ctccggtac 59 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL5-1 (antisense side) <400 > 29 cggagcctcc aattcagaag agagaatatt atcatcgtct ttattagtag taagt 55 <210> 30 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL5-2 (sense side) <400> 30 acttactact aataaagacg atgataatat tctctctctctctct gaattggttg ctggtgtac 59 <210> 31 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <2 23> Annealed sequence for αL5-2 (antisense side) <400> 31 accagcaacc aattcagaag agagaatatt atcatcgtct ttattagtag taagt 55 <210> 32 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> αL5-3 <400> 32 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaacaattgc cggtac 56 <210> 33 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealing sequence for αL5-3 (antisense) Side) <400> 33 cggcaattgt tcagaagaga gaatattatc atcgtcttta ttagtagtaa gt 52 <210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL6-1 (sense side) <400> 34 acttactact aataaagacg atgataatat tctccggtct tctgaattgg ttgctccggt 60 ac 62 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Annealed sequence for αL6-1 (antisense side) <400> 35 cggagcaacc aattcagaag aaccgagaat attatcatcg tctttattag tagtaagt 58 <210> 36 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Annealed sequence for αL6-2 (sense side) <400> 36 acttactact aataaagacg atgataatat tctctcttct gaattggagg ttgctccggt 60 ac 62 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Annealed sequence for αL6-2 (antisense side) <400> 37 cggagcaacc tccaattcag aagagagaat attatcatcg tctttattag tagtaagt 58
【図１】図１は、実施例１で作製したプラスミドｐＢＳ
６Ｒ６Ｓの構造を示す図である。ａｍｐはアンピシリン
耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＩＬ−６はＩ
Ｌ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子をそれ
ぞれ示す。FIG. 1 shows the plasmid pBS prepared in Example 1.
It is a figure which shows the structure of 6R6S. amp is the ampicillin resistance gene, ori is the transcription initiation site, IL-6 is I
L-6 gene and IL-6R indicate the IL-6R gene, respectively.
【図２】図２は、図１に示したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６
Ｓに実施例１に示す方法でオリゴヌクレオチド２種をア
ニールさせたものを挿入する手順を示す図である。FIG. 2 shows the plasmid pBS6R6 shown in FIG.
FIG. 3 is a diagram showing a procedure for inserting a product obtained by annealing two types of oligonucleotides in S by the method shown in Example 1.
【図３】図３は、実施例１で作製したプラスミドｐＢＳ
６Ｒ６Ｌの構造を示す図である。ａｍｐはアンピシリン
耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＩＬ−６はＩ
Ｌ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子をそれ
ぞれ示す。FIG. 3 shows the plasmid pBS prepared in Example 1.
It is a figure which shows the structure of 6R6L. amp is the ampicillin resistance gene, ori is the transcription initiation site, IL-6 is I
L-6 gene and IL-6R indicate the IL-6R gene, respectively.
【図４】図４は、図３に示したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６
Ｌに実施例２に示す方法でオリゴヌクレオチド２種をア
ニールさせたものを挿入する手順を示す図である。FIG. 4 shows the plasmid pBS6R6 shown in FIG.
FIG. 7 is a diagram showing a procedure for inserting into L two oligonucleotides annealed by the method shown in Example 2;
【図５】図５は、実施例２で作製した誘導体αＬ３−１
の発現プラスミドの構造を示す図である。図中、ａｍｐ
はアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位
を、ＨＩＳ４はヒスチジン合成遺伝子を、３'ＡＯＸＴ
Ｔはターミネーターを、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、
ｌｉｎｋｅｒはαヘリックス型リンカーを、ＩＬ−６Ｒ
はＩＬ−６Ｒ遺伝子を、Ｓはシグナル配列をコードする
遺伝子を、５'ＡＯＸ１はプロモーター配列を含むアル
コールオキシダーゼ遺伝子の上流領域をそれぞれ示す。FIG. 5 shows the derivative αL3-1 prepared in Example 2.
FIG. 3 is a view showing the structure of an expression plasmid of FIG. In the figure, amp
Is the ampicillin resistance gene, ori is the transcription initiation site, HIS4 is the histidine synthesis gene, 3'AOXT
T is a terminator, IL-6 is an IL-6 gene,
The linker has an α-helical linker, IL-6R
Indicates an IL-6R gene, S indicates a gene encoding a signal sequence, and 5′AOX1 indicates an upstream region of an alcohol oxidase gene including a promoter sequence.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4H045 AA10 BA05 BA12 BA13 BA14 BA41 CA40 DA02 DA51 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4H045 AA10 BA05 BA12 BA13 BA14 BA41 CA40 DA02 DA51 FA74
Claims (3)
酸配列のＣ末端に、αヘリックス型の構造をとるペプチ
ドリンカーを介してインターロイキン−６のアミノ酸配
列がそのＮ末端側から結合された、インターロイキン−
６レセプターとインターロイキン−６の融合蛋白質。(1) an interleukin-6 receptor having an amino acid sequence of interleukin-6 bound to the C-terminus of the amino acid sequence of the interleukin-6 receptor from the N-terminal side thereof via a peptide linker having an α-helix structure;
6 fusion protein of 6 receptor and interleukin-6.
から６個のアミノ酸残基で構成されるペプチドリンカー
であることを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。2. The fusion protein according to claim 1, wherein the α-helix peptide linker is a peptide linker composed of 3 to 6 amino acid residues.
ノ酸配列が配列番号１から９のいずれかであることを特
徴とする請求項２の融合蛋白質。3. The fusion protein according to claim 2, wherein the amino acid sequence constituting the α-helix linker is any one of SEQ ID NOs: 1 to 9.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4462099A JP2000247997A (en) | 1999-02-23 | 1999-02-23 | Il-6 receptor-il-6 fusion protein having alpha helix type linker sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4462099A JP2000247997A (en) | 1999-02-23 | 1999-02-23 | Il-6 receptor-il-6 fusion protein having alpha helix type linker sequence |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000247997A true JP2000247997A (en) | 2000-09-12 |
Family
ID=12696489
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP4462099A Pending JP2000247997A (en) | 1999-02-23 | 1999-02-23 | Il-6 receptor-il-6 fusion protein having alpha helix type linker sequence |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000247997A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110551729A (en) * | 2019-07-26 | 2019-12-10 | 中山大学 | Fugu rubripes interleukin 15 receptor gene IL-15R alpha and application thereof |
-
1999
- 1999-02-23 JP JP4462099A patent/JP2000247997A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110551729A (en) * | 2019-07-26 | 2019-12-10 | 中山大学 | Fugu rubripes interleukin 15 receptor gene IL-15R alpha and application thereof |
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