JP2000212196A - Physiologically active substance dm9809 and medicine containing the same as active ingredient - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a medicine effective as a therapeutic agent for AIDS and hardly having side effect. SOLUTION: This physiologically active substance DM9809 has the following physicochemical properties. (1) High-performance liquid chromatography detects peaks at 1.967 min, 2.400 min, 2.767 min and 3.800 min in (A) 205 nm and detects peak at 2.405 min in (B) 280 nm; (2) nuclear magnetic resonance spectrum has characteristic multiplet signals in 0.6-1.4 ppm; (3) infrared absorption spectrum has characteristic signals in 3336, 2958, 2925, 2854, 1654, 1560 and 1406 cm-1 and (4) mass spectrum has characteristic signals in 537.8, 1074.6, 1610.0 and 2121.2 mHz.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な生理活性物
質に関し、さらに詳細には、高い抗ＨＩＶ活性を有し、
医薬、動物薬等の用途に有用な新規生理活性物質ＤＭ９
８０９に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel bioactive substance, and more particularly, to a novel bioactive substance having high anti-HIV activity,
Novel bioactive substance DM9 useful for applications such as medicines and animal drugs
809.

【０００２】[0002]

【従来の技術】後天性免疫不全症候群（エイズ）の患者
は、近年増加の一途を辿っているが、その有効な治療法
は未だ確立されていない現状にある。エイズは、ＨＩＶ
（Human Immunodeficiency Virus）により引き起こされ
るため、このＨＩＶの増殖もしくは感染性を阻害するこ
とにより、エイズの発症を抑えあるいは病気の進行を遅
らせることができると考えられている。これまで実用化
されたエイズ治療薬としては、アミドチミジン（ＡＺ
Ｔ）が挙げられるが、その有効性や、細胞毒性など副作
用の点で必ずしも十分に満足できるものとは言い難かっ
た。2. Description of the Related Art The number of patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has been increasing in recent years, but an effective therapeutic method has not yet been established. AIDS is HIV
(Human Immunodeficiency Virus), it is thought that inhibiting the growth or infectivity of HIV can suppress the development of AIDS or delay the progress of the disease. The AIDS treatments that have been put to practical use include amidothymidine (AZ)
T), but it has not always been sufficiently satisfactory in terms of its efficacy and side effects such as cytotoxicity.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】従って、エイズの治療
薬として有効で、しかも人体に対する副作用の少ない薬
剤の提供が求められていた。Therefore, there is a need for a drug which is effective as a remedy for AIDS and has few side effects on the human body.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、枯草菌の培養物に
由来する特定の物質が、高い抗ＨＩＶ活性を有すること
を見出し本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that a specific substance derived from a culture of Bacillus subtilis has high anti-HIV activity. The present invention has been completed.

【０００５】すなわち本発明は、次の物理化学的性質、 （１）高速液体クロマトグラフィー： ２０５ｎｍにおいて、１.９６７分、２.４００分、
２.７６７分および３.８００分に検出される。 ２８０ｎｍにおいて、２.４０５分に検出される。 （２）核磁気共鳴スペクトル：０.６〜１.４ｐｐｍにお
いて、特徴的なマルチプレットなシグナルを有する。 （３）赤外線吸収スペクトル：３３３６、２９５８、２
９２５、２８５４、１６５４、１５６０、１４０６ｃｍ
^−１に特徴的なシグナルを有する。 （４）マススペクトル：５３７.８、１０７４.６、１６
１０.０、２１２１.２に特徴的なシグナルを有する。 を有する生理活性物質ＤＭ９８０９を提供するものであ
る。That is, the present invention provides the following physicochemical properties: (1) High-performance liquid chromatography: At 205 nm, 1.967 minutes, 2.400 minutes,
Detected at 2.767 minutes and 3.800 minutes. At 280 nm, it is detected at 2.405 minutes. (2) Nuclear magnetic resonance spectrum: has a characteristic multiplet signal at 0.6 to 1.4 ppm. (3) Infrared absorption spectrum: 3336, 2958, 2
925, 2854, 1654, 1560, 1406cm
^-1 has a characteristic signal. (4) Mass spectrum: 537.8, 1074.6, 16
It has a characteristic signal at 10.0, 2121.2. A biologically active substance DM9809 having the following formula:

【０００６】また本発明は、前記生理活性物質を有効成
分として含有する医薬を提供するものである。[0006] The present invention also provides a medicine containing the above-mentioned physiologically active substance as an active ingredient.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】本発明の生理活性物質ＤＭ９８０
９は、以下に例示するように、枯草菌の培養物中から溶
媒抽出、カラムクロマトグラフィー等の手段を組み合わ
せ用いて分画、精製することによって単離できる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The biologically active substance DM980 of the present invention
9 can be isolated from a culture of Bacillus subtilis by fractionation and purification using a combination of means such as solvent extraction and column chromatography, as exemplified below.

【０００８】その好ましい方法の一例としては、次の工
程よりなる方法が挙げられる。 枯草菌を培養し、 得られた培養物をｐＨ３に調整した後、酢酸エチル
で抽出し、 酢酸エチル相を炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９）で洗浄し、 酢酸エチル相を水酸化物−塩化物緩衝液（ｐＨ１
２）で抽出し、 得られた水相をｐＨ６に調整した後、酢酸エチルで
抽出し、 この酢酸エチル相をカラムクロマトグラフィーに付
し、 このカラムクロマトグラフィーに、順次ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチルおよびメタノールを流し、 メタノールで溶出される画分を採取する。An example of the preferred method is a method comprising the following steps. After culturing Bacillus subtilis, the resulting culture is adjusted to pH 3, extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate phase is washed with a sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer (pH 9), and the ethyl acetate phase is treated with hydroxide. -Chloride buffer (pH 1
After the extraction in 2), the obtained aqueous phase was adjusted to pH 6, and then extracted with ethyl acetate. This ethyl acetate phase was subjected to column chromatography.
Flow chloroform, ethyl acetate and methanol, and collect the fraction eluted with methanol.

【０００９】上記方法を実施するには、まず、枯草菌の
培養を行うことが必要である（工程）。この培養は常
法により行われるが、好適に用いられる枯草菌として
は、ＤＢ９０１１株（Bacillus subtilis DB9011）が例
示される。この菌は、ＦＥＲＭＢＰ−３４１８として１
９９１年５月２１日付けで工業技術院生命工学工業技術
研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託済で
ある。[0009] In order to carry out the above method, it is first necessary to culture Bacillus subtilis (step). This cultivation is carried out by a conventional method, and the Bacillus subtilis preferably used is exemplified by strain DB9011 (Bacillus subtilis DB9011). This bacterium is designated as FERMBP-3418 as 1
It has been deposited on May 21, 991 at the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology (I 1-3, Higashi 1-3-1, Tsukuba, Ibaraki Prefecture).

【００１０】本発明の生理活性物質を枯草菌に産生させ
るための好ましい培養方法としては、例えば、ｐＨ６.
９５に調整したＤＢ９０１１培地を用い、３７℃で４日
間程度培養する方法が挙げられる。ここで使用されるＤ
Ｂ９０１１培地の組成は、以下に示すとおりである。 ＜培地組成＞ （成 分） （配合量） ブドウ糖 ２０ｇ ポリペプトン １０ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 肉エキス ３ｇ 酵母エキス ２ｇ リン酸ーカリウム １ｇ 硫酸マグネシウム ０.５ｇ 塩化カルシウム−２Ｈ_２Ｏ ０.１５ｇ 塩化第二鉄−６Ｈ_２Ｏ ０.００８１ｇ 塩化マンガン−４Ｈ_２０ ０.００２４ｇ 硫酸第一鉄−７Ｈ_２Ｏ ０.０００３ｇ イオン交換水 １リットルA preferred culture method for producing the physiologically active substance of the present invention in Bacillus subtilis is, for example, pH 6.
A method of culturing at 37 ° C. for about 4 days using a DB9011 medium adjusted to 95 is used. D used here
The composition of the B9011 medium is as shown below. <Medium composition> (Ingredients) (Mixing amount) glucose 20g polypeptone 10g sodium chloride 5g beef extract 3g Yeast extract 2g phosphate over potassium 1g magnesium 0.5g calcium chloride _sulfate-2H 2 O 0.15 g ferric chloride -6H ₂ O 0.0081 g Manganese chloride-4H ₂ 0.0024 g Ferrous sulfate-7H ₂ O 0.0003 g Ion-exchanged water 1 liter

【００１１】次に、上で得られた培養物は、ｐＨ３に調
整した後、酢酸エチルで抽出する（工程）。この工程
において、培養物（好ましくは培養上清）は、予め遠心
分離、濾過等の慣用手段により菌体等の不溶物を除去し
ておくことが好ましい。また、ｐＨ調整は、例えば６規
定塩酸を用いて行い、また、酢酸エチルによる抽出は、
分液ロート、ロータリーシェーカー等を用い、例えば９
２ｒｐｍで室温にて１時間程度行うことが好ましい。Next, the culture obtained above is adjusted to pH 3 and extracted with ethyl acetate (step). In this step, the culture (preferably the culture supernatant) is preferably subjected to conventional means such as centrifugation and filtration to remove insoluble substances such as cells. The pH adjustment is performed using, for example, 6N hydrochloric acid, and the extraction with ethyl acetate is performed as follows.
Using a separating funnel, a rotary shaker, etc., for example, 9
It is preferable to carry out at 2 rpm at room temperature for about 1 hour.

【００１２】上記抽出により得られた酢酸エチル相は、
次いで炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９）で洗浄される（工程）。この洗浄は、例えば９
２ｒｐｍで室温にて１時間程度行うことが好ましく、ま
た、この洗浄液中にも本発明の生理活性物質あるいはこ
れに類似する物質が微量含まれているので、必要な場合
は、この洗浄液を酢酸エチルで抽出し、元の酢酸エチル
相に加えても良い。The ethyl acetate phase obtained by the above extraction is
Then a sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer (p
H9) for washing (step). This cleaning is performed, for example, in 9
It is preferable to carry out the reaction at 2 rpm at room temperature for about 1 hour. Since the washing solution contains a trace amount of the physiologically active substance of the present invention or a substance similar thereto, if necessary, wash the washing solution with ethyl acetate. And may be added to the original ethyl acetate phase.

【００１３】洗浄された酢酸エチル相は、水酸化物−塩
化物緩衝液（ｐＨ１２）加えた後、抽出に付され、水相
を分取する（工程）。この抽出は、例えば９２ｒｐｍ
で室温にて１時間程度行うことが好ましい。The washed ethyl acetate phase is subjected to extraction after adding a hydroxide-chloride buffer (pH 12), and the aqueous phase is separated (step). This extraction is performed, for example, at 92 rpm.
At room temperature for about 1 hour.

【００１４】得られた水相は、ｐＨ６に調整された後、
再度酢酸エチルで抽出される（工程）。この抽出は、
分液ロート、ロータリーシェーカー等を用い、例えば９
２ｒｐｍで室温にて１時間程度の条件で行うことが好ま
しい。After the obtained aqueous phase is adjusted to pH 6,
Extracted again with ethyl acetate (step). This extraction
Using a separating funnel, a rotary shaker, etc., for example, 9
It is preferable to carry out at 2 rpm at room temperature for about 1 hour.

【００１５】上記の如くして得られた酢酸エチル相に本
発明の生理活性物質ＤＭ９８０９が含まれているので、
次にカラムクロマトグラフィーにより精製する（工程
）。カラムクロマトグラフィーに用いられる担体とし
ては、シリカゲル等を用いることができ、好ましい市販
品の例としては、ＷＡＫＯ Ｃ−２００（和光純薬社
製）等を挙げることができる。Since the physiologically active substance DM9809 of the present invention is contained in the ethyl acetate phase obtained as described above,
Next, purification is performed by column chromatography (step). As a carrier used for column chromatography, silica gel or the like can be used. Preferred examples of commercially available products include WAKO C-200 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

【００１６】上記酢酸エチル画分が担持されたカラムク
ロマトグラフィーに、順次ヘキサン、クロロホルム、酢
酸エチルおよびメタノールを流し、それぞれの溶媒で溶
出される画分に分ける（工程）。Hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol are successively passed through the column chromatography supporting the above ethyl acetate fraction to separate into fractions eluted with each solvent (step).

【００１７】本発明の生理活性物質ＤＭ９８０９は、上
記溶媒のうち、メタノールにより溶出されるので、これ
を採取し、メタノール画分として生理活性物質ＤＭ９８
０９を得る（工程）。なお、得られたメタノール画分
は、必要に応じでさらに精製、溶媒留去、粉末化等の処
理に付され、精製度の高い生理活性物質ＤＭ９８０９を
行うことができる。以上の全体の工程を図示すれば図１
の通りである。Since the biologically active substance DM9809 of the present invention is eluted with methanol among the above-mentioned solvents, it is collected and collected as a methanol fraction.
09 (step). In addition, the obtained methanol fraction is further subjected to treatment such as purification, solvent evaporation, powdering, and the like, as necessary, to thereby perform a highly purified physiologically active substance DM9809. FIG. 1 shows the entire process described above.
It is as follows.

【００１８】かくして得られた本発明の生理活性物質Ｄ
Ｍ９８０９の、高速液体クロマトグラフィー（以下、
「ＨＰＬＣ」）、核磁気共鳴スペクトル（以下、「ＮＭ
Ｒ」）、赤外線吸収スペクトル（以下、「ＩＲ」）およ
びマススペクトル（以下、「ＭＳ」）は次の通りであ
る。The physiologically active substance D of the present invention thus obtained
M9809, high performance liquid chromatography (hereinafter, referred to as M9809)
“HPLC”), nuclear magnetic resonance spectrum (hereinafter “NM”).
R "), infrared absorption spectrum (hereinafter" IR ") and mass spectrum (hereinafter" MS ") are as follows.

【００１９】（ ＨＰＬＣ ）下記条件での、クロマト
グラムは図２および３に示す通りである。この図によれ
ば、２０５ｎｍにおいて、１.９６７分、２.４００分、
２.７６７分および３.８００分に、また、２８０ｎｍに
おいて、２.４０５分に、それぞれ特徴的なピークを有
している。(HPLC) Chromatograms under the following conditions are as shown in FIGS. According to this figure, at 205 nm, 1.967 minutes, 2.400 minutes,
It has characteristic peaks at 2.767 minutes and 3.800 minutes, and at 280 nm at 2.405 minutes, respectively.

【００２０】＜ＨＰＬＣ条件＞ 機 種：ベックマンＨＰＬＣシステム カ ラ ム：ＳＨＩＭＡＺＵ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ
５ｍ ４.６×２５０ｍ／ｍ 溶出溶媒：アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸アンモニウム
＝３／４（ｖ／ｖ） 溶出速度：１.０ｍｌ／ｍｉｎ 検 出：２０５ｎｍおよび２８０ｎｍ、ベックマン紫
外線検出器を使用 温 度：室温<HPLC conditions> Model: Beckman HPLC system Column: SHIMAZU Prodigy ODS
5 m 4.6 × 250 m / m Elution solvent: acetonitrile / 10 mM ammonium acetate = 3/4 (v / v) Elution rate: 1.0 ml / min Detection: 205 nm and 280 nm, using Beckman UV detector Temperature: room temperature

【００２１】（ ＮＭＲ ）下記条件で測定したＮＭＲ
スペクトルは、図４の通りである。このスペクトルから
は、０.６〜１.４ｐｐｍに特徴的なシグナルを有してい
ることが理解される。(NMR) NMR measured under the following conditions
The spectrum is as shown in FIG. From this spectrum, it is understood that it has a characteristic signal in the range of 0.6 to 1.4 ppm.

【００２２】＜ＮＭＲ条件＞ 機 種：ＶＡＲＩＡＮ社製Ｇｅｍｉｎｉ２００ 溶 媒：重水素化クロロホルム 温 度：室温<NMR conditions> Model: Gemini 200 manufactured by VARIAN Solvent: deuterated chloroform Temperature: room temperature

【００２３】（ Ｉ Ｒ ）下記条件で測定したＩＲス
ペクトルは、図５の通りである。この図によれば、３３
３６、２９５８、２９２５、２８５４、１６５４、１５
６０、１４０６ｃｍ^−１に特徴的なピークを有してい
る。(IR) The IR spectrum measured under the following conditions is as shown in FIG. According to this figure, 33
36, 2958, 2925, 2854, 1654, 15
It has a characteristic peak at 60, 1406 cm ^-1 .

【００２４】＜ＩＲ条件＞ 機 種：日立製作所（株）２７０−５０型赤外分光高
度計 測定方法：ＫＢｒ法 温 度：室温<IR condition> Model: 270-50 type infrared spectroscopic altimeter, Hitachi, Ltd. Measurement method: KBr method Temperature: room temperature

【００２５】（ Ｍ Ｓ ）下記条件で測定したＭＳス
ペクトルは、図６〜１０の通りである。このスペクトル
からは、５３７.８、１０７４.６、１６１０.０、２１
２１.２にピークを有することが理解される。(MS) MS spectra measured under the following conditions are as shown in FIGS. From this spectrum, 537.8, 1074.6, 1610.0, 21
It is seen that it has a peak at 21.2.

【００２６】＜ＭＳ条件＞ 機 種：パーキンエルマー社製 ＡＰＩ−１００Ｇ 高性能四重極一連質量分析装置 測定モード：ポジティブ 温 度：室温<MS conditions> Model: API-100G, high performance quadrupole mass spectrometer manufactured by Perkin Elmer Co., Ltd. Measurement mode: Positive Temperature: Room temperature

【００２７】生理活性物質ＤＭ９８０９の化学構造につ
いては、上記物理化学的性状から現在検討を重ねている
が、高い抗ＨＩＶ活性を有する化合物で、上記物理化学
的性質有するものが見あたらないことから新規物質であ
ると推測される。Although the chemical structure of the physiologically active substance DM9809 is currently being studied from the above-mentioned physicochemical properties, a novel substance having the above-mentioned physicochemical properties has not been found as a compound having high anti-HIV activity. Is assumed.

【００２８】斯くして得られた本発明の生理活性物質Ｄ
Ｍ９８０９は、後記実施例で示すように、高い抗ＨＩＶ
活性を有する化合物であるため、エイズの予防・治療
薬、抗ウイルス剤等の医薬や動物薬として有用なもので
ある。The physiologically active substance D of the present invention thus obtained
M9809 has high anti-HIV as shown in the Examples below.
Since it is a compound having activity, it is useful as a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent for AIDS, an antiviral agent or an animal drug.

【００２９】この生理活性物質ＤＭ９８０９を医薬や動
物薬等の薬剤として用いる場合は、薬学的に許容されう
る種々の溶媒や担体とともに任意の剤型に調製すること
ができ、また、その作用を損なわない範囲で、薬学的に
許容されうる種々の添加物を配合することも可能であ
る。When this physiologically active substance DM9809 is used as a drug such as a drug or an animal drug, it can be prepared in any dosage form together with various pharmaceutically acceptable solvents and carriers, and its action is impaired. It is also possible to mix various pharmaceutically acceptable additives to the extent that they are not present.

【００３０】[0030]

【作用】本発明の生理活性物質ＤＭ９８０９は、高い抗
ＨＩＶ活性を有するものであるが、その作用機構は未だ
完全には明らかにされていない。しかし、ＡＺＴのよう
にＨＩＶの逆転写過程を阻害するのではなく、ＨＩＶの
Ｔ細胞への吸着または融合過程を阻害することによっ
て、その感染性を低下させるものであることが確認され
ている。また、ウイルス粒子の外皮タンパク質に特異的
に、かつ直接結合してウイルスを溶解させている可能性
も示唆され、画期的な抗ウイルス剤あるいはエイズの予
防・治療薬となりうるものである。The biologically active substance DM9809 of the present invention has high anti-HIV activity, but its mechanism of action has not yet been completely elucidated. However, it has been confirmed that, instead of inhibiting the reverse transcription process of HIV as in AZT, it inhibits the process of adsorption or fusion of HIV to T cells, thereby reducing its infectivity. It is also suggested that the virus may be lysed by specifically and directly binding to the outer coat protein of the virus particle, and may be a revolutionary antiviral agent or a preventive or therapeutic agent for AIDS.

【００３１】[0031]

【実施例】次に実施例および試験例により本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約され
るものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples and Test Examples, which by no means limit the present invention.

【００３２】実 施 例 １ ＤＭ９８０９の単離：枯草菌（Bacillus subtilis DB9
011株；FERM BP-3418）を、ＤＢ９０１１培地に接種
し、３７℃で４日間培養した。培養後、培養上清１３リ
ットルを遠心分離（８,０００ｒｐｍ、３回）にかけ不
溶物を除去した。得られた培養液は濃塩酸によりｐＨ３
に調整した後、酢酸エチル６リットルで抽出して酢酸エ
チル相を分取した。次に、この酢酸エチル相に炭酸ナト
リウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）３リット
ルを加え、振とうして洗浄した。さらに、酢酸エチル相
を水酸化物−塩化物緩衝液（ｐＨ１２）３リットルで抽
出して水相を分取した。この水相を塩酸でｐＨ６に調整
し、酢酸エチル２リットルで抽出して酢酸エチル相を分
取した。Example 1 Isolation of DM9809: Bacillus subtilis DB9
011 strain; FERM BP-3418) was inoculated into a DB9011 medium and cultured at 37 ° C. for 4 days. After the culture, 13 liters of the culture supernatant was centrifuged (8,000 rpm, three times) to remove insolubles. The obtained culture solution was adjusted to pH 3 with concentrated hydrochloric acid.
Then, the mixture was extracted with 6 liters of ethyl acetate to separate the ethyl acetate phase. Next, 3 liters of a sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer solution (pH 9) was added to the ethyl acetate phase, and the mixture was washed by shaking. Further, the ethyl acetate phase was extracted with 3 liters of a hydroxide-chloride buffer (pH 12) to separate the aqueous phase. The aqueous phase was adjusted to pH 6 with hydrochloric acid and extracted with 2 liters of ethyl acetate to separate the ethyl acetate phase.

【００３３】得られた酢酸エチル相は、一旦溶媒を留去
した後、ヘキサン０.５ｍｌに懸濁し、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー［ＷＡＫＯ Ｃ−２００（和光純
薬社製）、１０ｇ、予めメタノールで充分に洗浄したも
の；カラム直径２ｃｍ、長さ８ｃｍ］に付した。溶出溶
媒としてヘキサン１００ｍｌ、クロロホルム１００ｍ
ｌ、酢酸エチル１００ｍｌおよびメタノール１００ｍｌ
を用いて順次溶出し、それぞれに対応するフラクション
を得た。各フラクションは溶媒を留去した後、エタノー
ル溶液とした。The obtained ethyl acetate phase was suspended in 0.5 ml of hexane after evaporating the solvent, and silica gel column chromatography [WAKO C-200 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g. After washing; column diameter 2 cm, length 8 cm]. Hexane 100ml, chloroform 100m as elution solvent
1, 100 ml of ethyl acetate and 100 ml of methanol
And eluted sequentially to obtain corresponding fractions. After evaporating the solvent, each fraction was used as an ethanol solution.

【００３４】得られた各フラクションについて、抗ＨＩ
Ｖ活性を調べたところ、メタノール溶出画分に抗ＨＩＶ
活性が確認された。このメタノール画分について、さら
に、高速液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴スペクト
ル、赤外線吸収スペクトルおよびマススペクトルにより
物理化学的性質を測定した。その結果は前記の図２〜図
１０に示す通りである。For each of the obtained fractions, anti-HI
When V activity was examined, anti-HIV was added to the fraction eluted with methanol.
Activity was confirmed. The physicochemical properties of this methanol fraction were further measured by high performance liquid chromatography, nuclear magnetic resonance spectrum, infrared absorption spectrum and mass spectrum. The results are as shown in FIGS.

【００３５】試 験 例 １ 抗ＨＩＶ活性のスクリーニング：実施例１で得た各フラ
クションをサンプルとし、その抗ＨＩＶ活性をＣ８１６
６細胞を用いたアッセイによりスクリーニングした。TEST EXAMPLE 1 Screening for anti-HIV activity: Each fraction obtained in Example 1 was used as a sample, and its anti-HIV activity was measured using C816.
Screening was performed by an assay using 6 cells.

【００３６】すなわち、ヒト樹立Ｔ細胞株であるＣ８１
６６細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた懸濁液
（３.０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、４８ウェルの
プレートに１００μｌずつ接種し、それぞれに上記各サ
ンプル５μｌ（×２回）を、０.５％、０.０５％、０.
００５％の最終濃度となるように添加した。３７℃で１
時間インキュべートした後、新鮮分離株であり、Ｔ細胞
株およびマクロファージに感染能を持つＨＩＶ−１ＧＵ
Ｎ１ＷＴ株（１００μｌ）を感染させ、さらに３７℃で
２日間インキュべートした。That is, C81 which is a human established T cell line
A suspension of 66 cells in RPMI1640 medium (3.0 × 10 ⁵ cells / ml) was inoculated into a 48-well plate in an amount of 100 μl each, and 5 μl (× 2 times) of each of the above samples was added to each well. 0.5%, 0.05%, 0.5%
Added to a final concentration of 005%. 1 at 37 ° C
HIV-1 GU, fresh isolate after incubating for hours, capable of infecting T cell lines and macrophages
The N1WT strain (100 μl) was infected and further incubated at 37 ° C. for 2 days.

【００３７】抗ＨＩＶ活性の判定は、形成される合胞体
（Ｓｙｎｃｙｔｉａ）の数（１ウェルあたり）を、光学
顕微鏡で計測することによって行った。その結果を表１
に示す。The anti-HIV activity was determined by measuring the number of syncytia (Synchia) formed (per well) with an optical microscope. Table 1 shows the results.
Shown in

【００３８】[0038]

【表１】 ───────────────────────────────── 合 胞 体 数 ───────────────────── 濃 度（％） サ ン プ ル 番号 ０.５ ０.０５ ０.００５ ───────────────────────────────── ｎ−ヘキサン溶出画分（１） ８２ ＞１００ ＞１００ （２） ６７ ＞１００ ＞１００ クロロホルム溶出画分（１） ７０ ＞１００ ＞１００ （２） ＞１００ ＞１００ ＞１００ 酢酸エチル溶出画分 （１） ８８ ＞１００ ＞１００ （２） ７２ ＞１００ ＞１００ メタノール溶出画分 （１） ０ ４２ ＞１００ （２） ０ ３０ ＞１００ ───────────────────────────────── 対 照 （１） ＞１００ （２） ＞１００ ─────────────────────────────────[Table 1] ───────────────────────────────── Number of syncytia ───────── ──────────── Concentration (%) Sample No. 0.5 0.05 0.005 ─────────────────── Ｎ N-hexane eluted fraction (1) 82> 100> 100 (2) 67> 100> 100 Chloroform eluted fraction (1) 70> 100> 100 (2) )> 100> 100> 100 Fraction eluted with ethyl acetate (1) 88> 100> 100 (2) 72> 100> 100 Fraction eluted with methanol (1) 0 42> 100 (2) 0 30> 100 ───────────────────────────── Control (1)> 100 (2)> 100 ───────── ─ ──────────────────────

【００３９】表１の結果から明らかなように、メタノー
ル溶出画分に強いＨＩＶ−１感染阻害活性が認められ
た。As is evident from the results shown in Table 1, a strong HIV-1 infection inhibitory activity was observed in the fraction eluted with methanol.

【００４０】試 験 例 ２ ＭＴ−４／ＩＩＩＢアッセイ：ヒト樹立Ｔ細胞株ＭＴ−
４にＨＩＶ−１ IIIＢ株を感染させ、感染後に生成する
ウイルス蛋白質を間接蛍光抗体法（ＩＦＡ法）を用いて
調べ、薬剤のウイルス阻害活性を確認した。TEST EXAMPLE 2 MT-4 / IIIB Assay: Human Established T Cell Line MT-
No. 4 was infected with the HIV-1 IIIB strain, and the virus protein generated after the infection was examined by the indirect fluorescent antibody method (IFA method) to confirm the virus inhibitory activity of the drug.

【００４１】ＨＩＶ感受性のヒト樹立Ｔ細胞であるＭＴ
−４細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた懸濁液
（１.０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、４８ウェルの
プレートに５００μｌずつ接種し、それぞれに実施例１
で得た本発明のＤＭ９８０９（メタノール溶出画分）
を、０.５％、０.０５％、０.００５％の濃度となるよ
うに添加した。３７℃で１時間インキュべートした後、
Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ株を感染させ、さらに
３７℃で４日間インキュべートした。MT, an HIV-sensitive human established T cell
-4 cells were suspended in an RPMI 1640 medium (1.0 × 10 ⁵ cells / ml), and a 48-well plate was inoculated in an amount of 500 μl into each of the wells.
DM9809 of the present invention (methanol eluted fraction) obtained in
Was added to give concentrations of 0.5%, 0.05% and 0.005%. After incubating at 37 ° C for 1 hour,
The cells were infected with the T cell-tropic HIV-1IIIB strain and incubated at 37 ° C. for 4 days.

【００４２】インキュベート後、被験細胞中のＨＩＶ−
１抗原陽性細胞をＩＦＡ法（間接蛍光抗体法）により判
定した。その結果を表２に示すAfter the incubation, the HIV-
One antigen-positive cell was determined by the IFA method (indirect fluorescent antibody method). Table 2 shows the results.

【００４３】[0043]

【表２】 ────────────────────────────────── ＨＩＶ抗原陽性細胞の割合（％） ────────────────────── 濃 度（％） サ ン プ ル ０.５ ０.０５ ０.００５ ────────────────────────────────── ＤＭ９８０９ ０.１ ５０ ＞９０ ────────────────────────────────── 対 照 ＞９０ ──────────────────────────────────Table 2: Ratio of HIV antigen-positive cells (%) ─────────────────── Concentration (%) sample 0.5 0.05 0.005 ───────────── ─────────────────────DM9809 0.150> 90────────────────────── ──────────── Reference> 90 ──────────────────────────────────

【００４４】表２の結果から、本発明の生理活性物質Ｄ
Ｍ９８０９は、ＭＴ−４細胞およびＨＩＶ−１ IIIＢ株
を用いた試験でも、強い抗ＨＩＶ−１活性を示すことが
明らかとなった。From the results shown in Table 2, the physiologically active substance D of the present invention was obtained.
M9809 was also found to show strong anti-HIV-1 activity in tests using MT-4 cells and HIV-1 IIIB strain.

【００４５】試 験 例 ３ 抗ＨＩＶ活性の作用機構の検討（１）：Ｓｙｎｃｙｔｉ
ｕｍアッセイ法により、本発明のＤＭ９８０９がＨＩＶ
の細胞への吸着、融合過程に作用するものであるかどう
かを判定した。Test Example 3 Examination of Action Mechanism of Anti-HIV Activity (1): Syncyti
um assay showed that DM9809 of the present invention was HIV
Was determined to act on the cell adsorption and fusion processes.

【００４６】ヒト樹立Ｔ細胞であるＣ８１６６細胞をＲ
ＰＭＩ１６４０培地に懸濁した懸濁液（５.０×１０^５
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を４８ウェルのプレートに１００μ
ｌずつ接種し、それぞれに実施例１で得たＤＭ９８０９
（メタノール溶出画分）を、０.５％、０.０５％、０.
００５％の濃度となるように添加した。３７℃で１時間
インキュべートした後、Ｍｏｌｔ−４／IIIＢ細胞（Ｈ
ＩＶ−１ IIIＢ株が持続感染したＭｏｌｔ−４細胞）
５.０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌを１００μｌ混合し、
３７℃で１４時間インキュべートした。C8166 cells, human established T cells, were
Suspension (5.0 × 10 ⁵⁾ suspended in PMI1640 medium
cells / ml) in a 48-well plate
of DM9809 obtained in Example 1.
(Methanol eluted fraction) was 0.5%, 0.05%, 0.5%
005%. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, Molt-4 / IIIB cells (H
(Molt-4 cells persistently infected with IV-1 IIIB strain)
Mix 100 μl of 5.0 × 10 ⁴ cells / ml,
Incubated at 37 ° C for 14 hours.

【００４７】抗ＨＩＶ活性の作用機構の判定は、形成さ
れる合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）の数（１ウェルあた
り）を、光学顕微鏡で計測することによって行った。そ
の結果を表３に示す。The action mechanism of the anti-HIV activity was determined by measuring the number of syncytium (Synchium) formed (per well) with an optical microscope. Table 3 shows the results.

【００４８】[0048]

【表３】 ────────────────────────────────── 合 胞 体 数 ────────────────────── 濃 度（％） サ ン プ ル 番号 ０.５ ０.０５ ０.００５ ────────────────────────────────── ＤＭ９８０９ （１） ０ ５５ ＞１００ （２） ０ ３９ ＞１００ ────────────────────────────────── 対 照 （１） ＞１００ （２） ＞１００ ──────────────────────────────────[Table 3] ────────────────────────────────── Number of syncytia ──────── ────────────── Concentration (%) Sample No. 0.5 0.05 0.005 ───────────────── {DM9809 (1) 055> 100 (2) 039> 100} ──────────────── Control (1)> 100 (2)> 100 ────────────────────── ────────────

【００４９】表３の結果と、既に公知の抗ＨＩＶ薬であ
るデキストラン硫酸（ＨＩＶの融合阻害剤）およびＡＺ
Ｔ（逆転写阻害剤）の同様の試験の結果から、ＤＭ９８
０９はＨＩＶ−１の細胞への吸着または融合過程を阻害
することが明らかとなった。The results in Table 3 show that the already known anti-HIV drugs dextran sulfate (a fusion inhibitor of HIV) and AZ
From the results of a similar test for T (reverse transcription inhibitor), DM98
09 was found to inhibit the process of adsorption or fusion of HIV-1 to cells.

【００５０】試 験 例 ４ 抗ＨＩＶ活性の作用機構の検討（２） ＨＩＶまたは細胞を予めＤＭ９８０９によって処理する
ことにより、ＤＭ９８０９の抗ＨＩＶ活性阻害が、ＨＩ
Ｖに作用して生じるのか、あるいは細胞に作用して生じ
るのかを検討した。Test Example 4 Examination of the Mechanism of Action of Anti-HIV Activity (2) By treating HIV or cells in advance with DM9809, the inhibition of the anti-HIV activity of DM9809 was reduced by HI.
It was examined whether it occurs by acting on V or by acting on cells.

【００５１】（１）ウイルス処理：被験ウイルス（ＨＩ
Ｖ−１ＧＵＮ１ＷＴ）１００μｌに、前記実施例１で得
た本発明のＤＭ９８０９（メタノール溶出画分）５μｌ
を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、遠心分
離（１５,０００ｒｐｍ、９０分）を行った。得られた
沈渣（ＨＩＶ−１ＧＵＮ１ＷＴ）をＲＰＭＩ１６４０培
地（２００μｌ）中のＣ８１６６細胞（ヒト樹立Ｔ細
胞）に接種して感染させた。接種後、２日間インキュベ
ートし、形成される合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉａ）の数
（１ウェルあたり）を、光学顕微鏡で計測した。(1) Virus treatment: Test virus (HI
V-1GUN1WT) in 100 μl, 5 μl of DM9809 (methanol eluted fraction) of the present invention obtained in Example 1 above
Was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour, followed by centrifugation (15,000 rpm, 90 minutes). The obtained precipitate (HIV-1GUN1WT) was inoculated to C8166 cells (human established T cells) in RPMI1640 medium (200 μl) to infect. After inoculation, the plate was incubated for 2 days, and the number of syncytia (Synchia) formed (per well) was measured with a light microscope.

【００５２】（２）細胞処理 Ｃ８１６６細胞（ヒト樹立Ｔ細胞）のＲＰＭＩ１６４０
培地１００μｌに、前記実施例１で得た本発明のＤＭ９
８０９（メタノール溶出画分）５μｌのＤＭ９８０９を
加え、３７℃で１時間インキュベートした後、遠心分離
（５,０００ｒｐｍ、５分）を行った。得られた沈渣
（Ｃ８１６６細胞）を、予め３７℃で１時間保温した
後、遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、９０分）処理後、
ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させたＨＩＶ−１ＧＵＮ１
ＷＴに感染させた。感染後、２日間インキュベートし、
形成される合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉａ）の数（１ウェル
あたり）を、光学顕微鏡で計測した。上記の結果をを併
せて表４に示す。(2) Cell treatment RPMI1640 of C8166 cells (human established T cells)
The DM9 of the present invention obtained in Example 1 was added to 100 μl of the medium.
809 (methanol eluted fraction) 5 μl of DM9809 was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, followed by centrifugation (5,000 rpm, 5 minutes). The obtained sediment (C8166 cells) was previously kept at 37 ° C. for 1 hour, and then centrifuged (15,000 rpm, 90 minutes).
HIV-1 GUN1 suspended in RPMI 1640 medium
Infected with WT. Incubate for 2 days after infection,
The number of syncytia (Synchia) formed (per well) was measured with a light microscope. Table 4 also shows the results.

【００５３】[0053]

【表４】 ──────────────────────────────── Ｓｙｎｃｙｔｉａ数 サ ン プ ル 番号 ウイルス処理 細胞処理 ──────────────────────────────── ＤＭ９８０９ （１） ０ ＞１００ （２） ０ ＞１００ ────────────────────────────────[Table 4] 数 Number of Syncyria Sample No. Virus treatment Cell treatment ─── ＤＭ DM9809 (1) 0> 100 (2) 0> 100 ＤＭ ────────────────────────

【００５４】表４の結果から、ＤＭ９８０９は、例えば
ウイルスの外被タンパク質に結合して溶解させるなど、
ウイルス粒子に直接かつ特異的に作用し、ウイルスの感
染性を低下させることが示唆された。From the results in Table 4, it is clear that DM9809 was dissolved by binding to the coat protein of the virus, for example.
It was suggested that it acts directly and specifically on virus particles and reduces virus infectivity.

【００５５】[0055]

【発明の効果】本発明の新規な生理活性物質ＤＭ９８０
９は、特異的かつ高い抗ＨＩＶ活性を有するため、抗ウ
イルス剤やエイズの予防・治療薬などの医薬として有用
なものである。また、サル、ネコ等のヒト以外の哺乳動
物の免疫不全疾患に対する抗ウイルス剤等の動物薬とし
ても利用されうる。The novel physiologically active substance DM980 of the present invention
No. 9 has specific and high anti-HIV activity, and thus is useful as a drug such as an antiviral agent or a prophylactic / therapeutic agent for AIDS. It can also be used as an animal drug such as an antiviral agent for immunodeficiency diseases of mammals other than humans such as monkeys and cats.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 枯草菌培養物の分画操作の概略を示す図面。FIG. 1 is a drawing showing an outline of a fractionation operation of a Bacillus subtilis culture.

【図２】 ＤＭ９８０９を含むメタノール溶出画分の高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す図面（２０５ｎ
ｍ）。FIG. 2 shows the results of high performance liquid chromatography of a methanol eluted fraction containing DM9809 (205n).
m).

【図３】 ＤＭ９８０９を含むメタノール溶出画分の高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す図面（２８０ｎ
ｍ）。FIG. 3 shows the results of high performance liquid chromatography of a methanol eluted fraction containing DM9809 (280n).
m).

【図４】 ＤＭ９８０９を含むメタノール溶出画分の核
磁気共鳴スペクトルの結果を示す図面。FIG. 4 is a drawing showing the result of a nuclear magnetic resonance spectrum of a methanol eluted fraction containing DM9809.

【図５】 ＤＭ９８０９を含むメタノール溶出画分の赤
外線吸収スペクトルの結果を示す図面。FIG. 5 is a drawing showing the results of an infrared absorption spectrum of a methanol eluted fraction containing DM9809.

【図６】 ＤＭ９８０９を含むメタノール溶出画分のマ
ススペクトルの結果を示す図面。FIG. 6 is a view showing the result of mass spectrum of a methanol eluted fraction containing DM9809.

【図７】 図６のスペクトルの一部を拡大した図面（５
２０〜５７０ｍ／ｚ）。FIG. 7 is an enlarged view of a part of the spectrum of FIG.
20-570 m / z).

【図８】 図６のスペクトルの一部を拡大した図面（１
０２０〜１１１０ｍ／ｚ）。FIG. 8 is an enlarged view of a part of the spectrum of FIG.
020-1110 m / z).

【図９】 図６のスペクトルの一部を拡大した図面（１
５８０〜１６４０ｍ／ｚ）。9 is an enlarged view of a part of the spectrum shown in FIG.
580-1640 m / z).

【図１０】 図６のスペクトルの一部を拡大した図面
（２０８０〜２２００ｍ／ｚ）。 以 上FIG. 10 is an enlarged view (2080 to 2200 m / z) of a part of the spectrum in FIG. that's all

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｆターム(参考） 4B064 AH19 BH02 BH03 BH07 CA02 CE03 CE07 CE08 DA01 4B065 AA19X BA22 BC02 BD15 BD16 BD18 CA44 4C087 AA01 AA02 BC65 CA10 MA01 MA11 NA01 NA14 ZC55 4H055 AA01 AA02 AA03 AB29 AC62 AD20 BA31 CA11 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 1/04 C12P 1/04 Z // C12N 1/20 C12N 1/20 A (C12P 1/04 C12R 1 : 125) (C12N 1/20 C12R 1: 125) F term (reference) 4B064 AH19 BH02 BH03 BH07 CA02 CE03 CE07 CE08 DA01 4B065 AA19X BA22 BC02 BD15 BD16 BD18 CA44 4C087 AA01 AA02 BC65 CA10 MA01 MA11 NA01 NA14 ZC55 4H0A AB29 AC62 AD20 BA31 CA11

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 次の物理化学的性質、 （１）高速液体クロマトグラフィー： ２０５ｎｍにおいて、１.９６７分、２.４００分、
２.７６７分および３.８００分に検出される。 ２８０ｎｍにおいて、２.４０５分に検出される。 （２）核磁気共鳴スペクトル：０.６〜１.４ｐｐｍにお
いて、特徴的なマルチプレットなシグナルを有する。 （３）赤外線吸収スペクトル：３３３６、２９５８、２
９２５、２８５４、１６５４、１５６０、１４０６ｃｍ
^−１に特徴的なシグナルを有する。 （４）マススペクトル：５３７.８、１０７４.６、１６
１０.０、２１２１.２に特徴的なシグナルを有する。 を有する生理活性物質ＤＭ９８０９。1. The following physicochemical properties: (1) High performance liquid chromatography: At 205 nm, 1.967 minutes, 2.400 minutes,
Detected at 2.767 minutes and 3.800 minutes. At 280 nm, it is detected at 2.405 minutes. (2) Nuclear magnetic resonance spectrum: has a characteristic multiplet signal at 0.6 to 1.4 ppm. (3) Infrared absorption spectrum: 3336, 2958, 2
925, 2854, 1654, 1560, 1406cm
^-1 has a characteristic signal. (4) Mass spectrum: 537.8, 1074.6, 16
It has a characteristic signal at 10.0, 2121.2. A physiologically active substance DM9809 having the following formula: 【請求項２】 以下の製法により得られるものである請
求項第１項記載の生理活性物質ＤＭ９８０９： 枯草菌を培養し、 得られた培養物をｐＨ３に調整した後、酢酸エチル
で抽出し、 酢酸エチル相を炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９）で洗浄し、 酢酸エチル相を水酸化物−塩化物緩衝液（ｐＨ１
２）で抽出し、 得られた水相をｐＨ６に調整した後、酢酸エチルで
抽出し、 この酢酸エチル相をカラムクロマトグラフィーに付
し、 このカラムクロマトグラフィーに、順次ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチルおよびメタノールを流し、 メタノールで溶出される画分を採取する。2. The biologically active substance DM9809 according to claim 1, which is obtained by the following production method: culturing Bacillus subtilis, adjusting the obtained culture to pH 3, and extracting with ethyl acetate. The ethyl acetate phase was washed with a sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer (pH 9), and the ethyl acetate phase was washed with a hydroxide-chloride buffer (pH 1).
After the extraction in 2), the obtained aqueous phase was adjusted to pH 6, and then extracted with ethyl acetate. This ethyl acetate phase was subjected to column chromatography.
Flow chloroform, ethyl acetate and methanol, and collect the fraction eluted with methanol. 【請求項３】 枯草菌が、ＤＢ９０１１株（Bacillus s
ubtilis DB9011）である請求項第２項記載の生理活性物
質ＤＭ９８０９。3. Bacillus subtilis strain DB9011 (Bacillus s.
The biologically active substance DM9809 according to claim 2, which is ubtilis DB9011). 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの項記載の
生理活性物質を有効成分とする医薬。4. A medicament comprising the physiologically active substance according to claim 1 as an active ingredient. 【請求項５】 抗ウイルス剤である請求項４記載の医
薬。5. The medicament according to claim 4, which is an antiviral agent. 【請求項６】 ウイルスがＨＩＶである請求項５記載の
医薬。6. The medicament according to claim 5, wherein the virus is HIV. 【請求項７】 エイズの予防もしくは治療薬である請求
項４記載の医薬。7. The medicament according to claim 4, which is a prophylactic or therapeutic agent for AIDS. 【請求項８】 枯草菌の培養抽出物を有効成分とする哺
乳動物のウイルス性免疫不全疾患の予防もしくは治療
薬。8. A preventive or therapeutic agent for a viral immunodeficiency disease in mammals, comprising a culture extract of Bacillus subtilis as an active ingredient.