JP2000209980A - Interleukin-1-related disease model knockout animal - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
１（IL-1）関連遺伝子を欠損した疾患モデル動物に関す
る。詳しくは、IL-1ファミリーを形成するIL-1α遺伝
子、IL-1β遺伝子およびIL-1受容体アンタゴニスト（IL
-1ra）遺伝子のうち、少なくとも一つのゲノム配列を一
部欠失等により変更させ外来性の配列に置換することに
より、当該遺伝子が機能しないようにした、疾患モデル
動物に関する。さらに、これらの遺伝子うちIL-1α遺伝
子とIL-1β遺伝子について同時に欠損した疾患モデル動
物にも関する。[0001] The present invention relates to a disease model animal deficient in an interleukin 1 (IL-1) -related gene. Specifically, IL-1α gene, IL-1β gene and IL-1 receptor antagonist (IL-1
-1ra) a disease model animal in which at least one genomic sequence of a gene is altered by partial deletion or the like and replaced with an exogenous sequence so that the gene does not function. Furthermore, the present invention relates to a disease model animal in which the IL-1α gene and the IL-1β gene among these genes are simultaneously deleted.
【０００２】[0002]
【従来の技術】IL-1の機能 サイトカインは、生理学的作用および病理学的作用を調
節する細胞間シグナル伝達分子であり、免疫系、神経系
そして内分泌系における細胞を含む様々な細胞に対して
効果を発揮し、そして恒常性の維持に重要な働きをす
る。2. Description of the Related Art IL-1 functional cytokines are intercellular signaling molecules that regulate physiological and pathological effects. It is effective and plays an important role in maintaining homeostasis.
【０００３】IL-1は、炎症や宿主防御応答だけでなく神
経-免疫-内分泌系においても重要な機能を果たすサイト
カインである（総説として、Dinarello, 1996, Blood 8
7,2095-2147; Durum and Oppenheim, 1993, Proinflamm
atory cytokines and immunity, in Fundamental Immun
ology, 3rd ed. (W.E. Paul ed.), Raven Press,Ltd.,
New York; Tocci and Schmidt, 1997, Interleukin-1:
Structure and function, in Cytokines in health and
disease, 2nd ed. (D.G. Remick and J.S.Friedland e
ds), Marcel Dekker Inc., 1-27を参照）。IL-1は、も
ともと内在性の発熱物質、リンパ球活性化因子、ヘモポ
エチン-1、および破骨細胞活性化因子として同定された
ことからもわかる様に、多様な生理活性を有する（Dina
rello, 1996,上述）。IL-1はIL-1αおよびIL-1βの2種
類の分子種からなり、それらはマウスゲノムの第2染色
体上で50 kb離れたところに位置する別個の遺伝子に由
来する（D'Eustachio et al., 1987, Immunogenetics 2
6, 339-343; Silver etal., 1990, Somatic Cell Mol.
Genet. 16, 549-556）。IL-1α分子とIL-1β分子とのア
ミノ酸配列相同性は25％しかないが（Dinarello, 1996,
上述）、I型IL-1受容体（IL-1RI）を介して、完全には
オーバーラップしていないものの同様の生物学的活性を
発揮する（Sims et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 90, 6155-6159）。さらに、IL-1遺伝子ファミリ
ーのもう一つの構成分子であるIL-1受容体アンタゴニス
ト（IL-1ra）は、アゴニストとしての活性を発揮するこ
となくIL-1受容体に結合する（Carter et al., 1990, N
ature, 344, 633-638; Hannum et al., 1990, Nature 3
43, 336-340）。一方、もう一つの受容体であるII型IL-
1受容体（IL-1RII）も存在するが、この受容体はシグナ
ル伝達には関与していないと考えられており、むしろデ
コイとして調節的な役割をしている（Colotta et al.,
1993, Science 261, 472-475）。IL-1ファミリーの構成
分子の活性は、転写レベル、翻訳レベルおよび翻訳後レ
ベルで調節されており、シグナル伝達分子の複雑なネッ
トワークに関与している（Dinarello, 1996,上述）。し
かしながら、IL-1シグナル伝達の分子機構は、未だに完
全には解明されていない。[0003] IL-1 is a cytokine that plays an important role not only in inflammatory and host defense responses but also in the neuro-immune-endocrine system (for review, Dinarello, 1996, Blood 8).
7,2095-2147; Durum and Oppenheim, 1993, Proinflamm
atory cytokines and immunity, in Fundamental Immun
ology, 3rd ed. (WE Paul ed.), Raven Press, Ltd.,
New York; Tocci and Schmidt, 1997, Interleukin-1:
Structure and function, in Cytokines in health and
disease, 2nd ed. (DG Remick and JSFriedland e
ds), Marcel Dekker Inc., 1-27). IL-1 has diverse biological activities, as can be seen from the fact that it was originally identified as an endogenous pyrogen, lymphocyte activator, hemopoietin-1, and osteoclast activator (Dina
rello, 1996, supra). IL-1 consists of two species, IL-1α and IL-1β, which are derived from distinct genes located 50 kb apart on chromosome 2 of the mouse genome (D'Eustachio et al. ., 1987, Immunogenetics 2
6, 339-343; Silver etal., 1990, Somatic Cell Mol.
Genet. 16, 549-556). Although the amino acid sequence homology between IL-1α and IL-1β molecules is only 25% (Dinarello, 1996,
(See above), exert similar, though not completely overlapping, biological activities through the type I IL-1 receptor (IL-1RI) (Sims et al., 1993, Proc. Natl. Acad. . Sc
i. USA 90, 6155-6159). In addition, another member of the IL-1 gene family, the IL-1 receptor antagonist (IL-1ra), binds to the IL-1 receptor without exerting its activity as an agonist (Carter et al. , 1990, N
ature, 344, 633-638; Hannum et al., 1990, Nature 3
43, 336-340). On the other hand, another receptor, type II IL-
1 receptor (IL-1RII) also exists, but this receptor is not thought to be involved in signal transduction, but rather plays a regulatory role as a decoy (Colotta et al.,
1993, Science 261, 472-475). The activity of IL-1 family members is regulated at the transcriptional, translational, and post-translational levels and is involved in a complex network of signaling molecules (Dinarello, 1996, supra). However, the molecular mechanism of IL-1 signaling has not yet been fully elucidated.
【０００４】IL-1の生理的・病理的機能は、炎症、急性
期反応、細菌感染やウィルス感染に対する宿主応答、胸
腺細胞成熟やTh2細胞増殖を含む免疫系の活性化、破骨
細胞活性化やメタロプロテアーゼの分泌を含む骨代謝、
発熱、そして視床下部-脳下垂体-副腎（HPA）軸におい
て示唆された（Dinarello, 1996,上述; Durum andOppen
heim, 1993,上述）。特にこれらの諸機能が中枢神経系
からの恒常性維持と免疫系調節において重要であるた
め、神経-免疫-内分泌系におけるIL-1の機能が注目され
ている。[0004] The physiological and pathological functions of IL-1 include inflammation, acute phase response, host response to bacterial and viral infections, activation of the immune system including thymocyte maturation and Th2 cell proliferation, and osteoclast activation. Bone metabolism, including secretion of and metalloproteases,
Fever and suggested in the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis (Dinarello, 1996, supra; Durum and Oppen
heim, 1993, supra). In particular, since these functions are important in maintaining homeostasis from the central nervous system and regulating the immune system, the function of IL-1 in the neuro-immune-endocrine system has attracted attention.
【０００５】これまで、IL-1による生理的・病理的機能
を解明するための研究が多岐にわたって行われてきた。
すなわち、脳内におけるIL-1の機能、炎症、組織損傷ま
たは感染が血清中のグルココルチコイド濃度に対してIL
-1の与える影響、細菌感染に対する感染防御におけるIL
-1の関与、あるいは自己抗体産生を伴うリウマチ性関節
炎に対するIL-1の与える影響を解明する努力が行われて
きた。[0005] A wide variety of studies have been conducted to elucidate the physiological and pathological functions of IL-1.
That is, the function, inflammation, tissue damage or infection of IL-1 in the brain is dependent on the serum glucocorticoid concentration.
Of IL-1 on IL protection against bacterial infection
Efforts have been made to elucidate the involvement of IL-1 or the effect of IL-1 on rheumatoid arthritis with autoantibody production.
【０００６】IL-1αおよびIL-1βの両方ともが発熱を誘
導することができ、そしてIL-1βに対する中和抗体の投
与により細菌由来LPS誘導発熱を阻害することが知られ
ている（Kluger, 1991, Physiol. Rev. 71, 93-127; Lo
ng et al., 1990, Am. J.Physiol. 259, R724-R728）。
最近、IL-1β遺伝子を欠損したマウス（IL-1βのKOマウ
ス）が作出され、これらを用いてLPS誘導発熱が調べら
れている。これらの実験の結果、IL-1β遺伝子の欠損に
よって、LPSに対する発熱応答が低下する場合（Kozak e
t al., 1995, Am. J. Physiol. 269, R969-R977）と、
過剰反応する場合（Alheim et al., 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 2681-2686）とがあることが報告
された。現時点ではこのような矛盾した結果が生じた理
由については、完全には明らかにされていない。さらに
テレピン油誘導性発熱についても、IL-1βのKOマウス
（Zheng et al., 1995, Immunity 3, 9-19）およびIL-1
RI遺伝子欠損マウス（IL-1RIのKOマウス）（Leon et a
l., 1996, Am. J. Physiol.259, R724-R728）を用いて
調べられた。これらの研究から、内在性のIL-1βは局所
炎症後の発熱応答を調節する際に重要な機能を果たして
いることが示唆されている。しかしながら、炎症時には
IL-1αおよびIL-1βの両方が産生され、両方のIL-1種と
もが発熱応答を誘導するため、IL-1βの欠損が発熱を抑
制するために十分であるとする理由についてははっきり
とは示されていない。[0006] Both IL-1α and IL-1β are capable of inducing fever, and are known to inhibit bacterial LPS-induced fever by administration of neutralizing antibodies against IL-1β (Kluger, 1991, Physiol. Rev. 71, 93-127; Lo
ng et al., 1990, Am. J. Physiol. 259, R724-R728).
Recently, mice deficient in the IL-1β gene (IL-1β KO mice) have been created, and LPS-induced fever has been investigated using these mice. As a result of these experiments, when the IL-1β gene deficiency reduces the fever response to LPS (Kozak e
t al., 1995, Am. J. Physiol. 269, R969-R977)
Overreaction (Alheim et al., 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 2681-2686). At this time, the reasons for these contradictory results have not been fully elucidated. In addition, for turpentine-induced fever, IL-1β KO mice (Zheng et al., 1995, Immunity 3, 9-19) and IL-1β
RI gene-deficient mice (IL-1RI KO mice) (Leon et a
l, 1996, Am. J. Physiol. 259, R724-R728). These studies suggest that endogenous IL-1β plays an important role in regulating the fever response after local inflammation. However, during inflammation
Because both IL-1α and IL-1β are produced and both IL-1 species induce a fever response, it is clear why the lack of IL-1β is sufficient to suppress fever. Is not shown.
【０００７】IL-1、IL-6およびTNF-αなどの炎症性サイ
トカインは、視床下部を刺激してコルチコトロピン（co
rticotropin、副腎皮質刺激ホルモン）放出ホルモン（C
RH）を放出させ、次いでCRHが下垂体からのコルチコト
ロピン（adrenocorticotropic hormone、副腎皮質刺激
ホルモン; ACTH）の分泌および副腎皮質からのコルチコ
ステロン分泌を誘導する。炎症、組織損傷または感染に
より血中グルココルチコイド濃度も影響を受けることが
示されたが（Chrousos, 1995, New Eng. J. Med. 332,
1351-1362）、炎症性サイトカインが、HPA軸を介してこ
の活性化に関与していることが示唆されている（Dunn,
1992, Brain Res. Bull. 29, 807-812;Perlstein et a
l., 1993, Endocrinology 132, 946-952）。動物におい
て全身性および局所性の炎症を引き起こすLPSおよびテ
レピン油は、それぞれHPA軸の活性化を介したコルチコ
ステロンの分泌を促進する（River et al., 1989, Endo
crinology 125, 2800-2805; Turnbull and Rivier, 199
6, Endocrinology 137, 455-463）。IL-1はこのような
ストレス下においてHPA軸を調節するための主要なメデ
ィエーターであることが考えられたが（Dunn, 1992, 上
述; Ebisui et al., 1994, Am. J. Physiol. 266, E986
-E992）。しかし最近の研究では、LPS（Fantuzziet a
l., 1996, J. Immunol. 157, 291-296）又はテレピン油
（Fantuzzi and Dinarello, 1996, J. Leukoc. Biol. 5
9, 489-493）処理を行った場合にIL-1βの欠損がコルチ
コステロンの誘導に与える影響を示すことができないこ
とがわかった。これらの結果からは、二つの可能性が示
唆される。一つは、IL-1がHPA軸の活性化に関与してい
ないとする可能性、またはもう一つは、IL-1αがIL-1β
の欠損を補っているという可能性である。細菌感染防御 リステリア菌（L. monocytogenes）の感染により、宿主
中のIFN-γ、IFN-α、TNF-α、IL-1およびIL-6を含むサ
イトカインの誘導が引き起こされることが知られている
（Nakane et al., 1990, Infect. Immun. 58, 2386-138
8; Nakane etal., 1992, Infect. Immun. 60, 523-528;
Rogers et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 8
9, 1011-1015）。これらのサイトカインはこの細菌に対
する宿主防御のために機能していると考えられている。
例えば、遺伝子ターゲティングによりIFN-γ受容体また
はTNF受容体p55のいずれかを欠損するマウスは、野生型
マウスにとっては致死量以下のL. monocytogenes感染さ
せた場合にも致死となる（Huang et al., 1993, Scienc
e 259, 1742-1745; Pfeffer et al., 1993, Cell 73, 4
57-467; Rothe et al., 1993, Nature 364, 798-80
2）。IL-6欠損マウスもまた、L. monocytogenes感染に
対して感受性が高い（Dalrymple et al., 1995, Infec
t. Immun. 63, 2262-2268; Kopf et al., 1994, Nature
368, 339-342）。またIL-1α、IL-1βおよびIL-1RIに
対するそれぞれのモノクローナル抗体を同時に投与し
て、in vivoにおいてIL-1活性を中和すると、L. monocy
togenesに対する抵抗性が低下した（Rogers et al., 19
94, J. Immunol. 153, 2093-2101）。一方、IL-1を投与
すると、L. monocytogenesに対する抵抗性が増加した
（Czuprynski et al., 1988, J. Leukoc. Biol. 35, 19
3-197）。しかしながら、現在までのところ、細菌増殖
に対するこれらのサイトカインの効果およびこれらのサ
イトカインが最近増殖に対して関与する機構は完全には
解明されていない。IL-1と疾患 IL-1、IL-2、IL-6、TNF-αおよびIFN-γを含む様々なサ
イトカインがリウマチ性関節炎（RA）を患っている患者
の関節において過剰発現していることが知られている
（Feldmann et al., 1996, Annu. Rev. Immunol. 14, 3
97-440; Firestein et al., 1990, J. Immunol. 144, 3
347-3353）。RAは、全身性の慢性炎症性疾患であり、そ
の病態（病変）は主として関節にみられる。環境因子、
細菌そしてウィルスなどの様々な外因性物質がヒトにお
けるRAの原因と示唆されている。患者はしばしば、Ig
G、II型コラーゲン（IIC）および熱ショックタンパク質
（HSP）を含む様々な自己成分に対して自己抗体および
細胞性免疫を生じる。IgGのFc部分に対する自己抗体
（リウマチ因子；RF）は、滑液腔および周囲の血管中に
免疫複合体を形成する。この複合体はおそらく、滑液腔
組織および周囲の血管の表層の細胞から炎症性サイトカ
インの放出を刺激し、放出された炎症性サイトカインに
よりこれらの組織に炎症が誘導される。これらのサイト
カインが滑膜細胞の増殖を促進し、そして免疫系を活性
化することから、これらのサイトカインがリウマチ性関
節炎などの疾患の発症に重要な機能を果たしていると考
えられている。[0007] Inflammatory cytokines such as IL-1, IL-6 and TNF-α stimulate the hypothalamus to cause corticotropin (co
rticotropin, corticotropin-releasing hormone (C)
RH), and then CRH induces secretion of adrenocorticotropic hormone (ACTH) from the pituitary gland and corticosterone secretion from the adrenal cortex. Inflammation, tissue damage or infection has also been shown to affect blood glucocorticoid levels (Chrousos, 1995, New Eng. J. Med. 332,
1351-1362), and it has been suggested that inflammatory cytokines are involved in this activation via the HPA axis (Dunn,
1992, Brain Res. Bull. 29, 807-812; Perlstein et a
l., 1993, Endocrinology 132, 946-952). LPS and turpentine oils, which cause systemic and local inflammation in animals, promote the secretion of corticosterone via activation of the HPA axis, respectively (River et al., 1989, Endo
crinology 125, 2800-2805; Turnbull and Rivier, 199
6, Endocrinology 137, 455-463). IL-1 was thought to be a major mediator for regulating the HPA axis under such stress (Dunn, 1992, supra; Ebisui et al., 1994, Am. J. Physiol. 266, E986
-E992). However, recent studies have shown that LPS (Fantuzziet a
l., 1996, J. Immunol. 157, 291-296) or turpentine oil (Fantuzzi and Dinarello, 1996, J. Leukoc. Biol. 5).
9, 489-493) showed that the IL-1β deficiency did not show any effect on corticosterone induction when treated. These results suggest two possibilities. One is that IL-1 may not be involved in activation of the HPA axis, or the other is that IL-1α is IL-1β
It is possible that the loss is compensated for. By infection of a bacterial infection defense Listeria (L. monocytogenes), IFN-γ in the host, IFN-α, TNF-α , are known to induce cytokines, including IL-1 and IL-6 is caused (Nakane et al., 1990, Infect. Immun. 58, 2386-138
8; Nakane et al., 1992, Infect. Immun. 60, 523-528;
Rogers et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
9, 1011-1015). These cytokines are thought to function for host defense against this bacterium.
For example, mice deficient in either IFN-γ receptor or TNF receptor p55 due to gene targeting are lethal to wild-type mice when infected with sublethal L. monocytogenes (Huang et al. , 1993, Scienc
e 259, 1742-1745; Pfeffer et al., 1993, Cell 73, 4
57-467; Rothe et al., 1993, Nature 364, 798-80
2). Mice deficient in IL-6 are also susceptible to L. monocytogenes infection (Dalrymple et al., 1995, Infec
t. Immun. 63, 2262-2268; Kopf et al., 1994, Nature
368, 339-342). When IL-1α, IL-1β and IL-1RI are simultaneously administered to neutralize IL-1 activity in vivo, L. monocy
reduced resistance to togenes (Rogers et al., 19
94, J. Immunol. 153, 2093-2101). On the other hand, administration of IL-1 increased the resistance to L. monocytogenes (Czuprynski et al., 1988, J. Leukoc. Biol. 35, 19
3-197). However, to date, the effects of these cytokines on bacterial growth and the mechanism by which these cytokines are recently involved in growth are not completely elucidated. Overexpression of IL-1 and various cytokines including IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α and IFN-γ in joints of patients with rheumatoid arthritis (RA) (Feldmann et al., 1996, Annu. Rev. Immunol. 14, 3
97-440; Firestein et al., 1990, J. Immunol. 144, 3
347-3353). RA is a systemic chronic inflammatory disease whose pathology (lesion) is mainly found in joints. Environmental factors,
Various exogenous substances, such as bacteria and viruses, have been suggested as causes of RA in humans. Patients often have Ig
It produces autoantibodies and cellular immunity against various self components including G, type II collagen (IIC) and heat shock protein (HSP). Autoantibodies to the Fc portion of IgG (rheumatic factor; RF) form immune complexes in the synovial space and surrounding blood vessels. This complex probably stimulates the release of inflammatory cytokines from synovial cavity tissues and the cells of the superficial layers of surrounding blood vessels, and the released inflammatory cytokines induce inflammation in these tissues. Because these cytokines promote synovial cell proliferation and activate the immune system, it is believed that these cytokines play important functions in the development of diseases such as rheumatoid arthritis.
【０００８】以前本発明者らは、HTLV-I env-pX領域を
その遺伝子自体のLTRの調節下において保持するトラン
スジェニックマウスが慢性炎症性多発関節症を高い頻度
で発症することを報告した（Iwakura et al., 1991, Sc
ience 253, 1026-1028）。関節の組織病理はヒトにおけ
るリウマチ性関節炎の組織病理と非常によく似ており、
そしてこのトランスジェニック動物は自己免疫状態にな
っていることが示された（Iwakura et al., 1995, J. I
mmunol. 155, 1588-1598; Yamamoto et al., 1993, Art
hritis Rheum. 36, 1612-1620）。興味深いことに、炎
症を起こしている関節において、IL-1α、IL-1β、IL-
6、TNF-αそしてIFN-γを含む炎症性サイトカイン遺伝
子の発現が亢進していた（Iwakura et al., 1995, 上
述）。IIC誘導関節炎などのRAの別のモデルでも、IL-1
が関与していることが観察された（Kasama et al., 199
0, Immunol. Lett. 26, 171-175; Marinova-Mutafchiev
a et al., 1997, Clin. Exp. Immunol. 107, 507-51
2）。さらに、正常ウサギ関節内へIL-1を投与すること
により、重度の関節炎を引き起こすことができることも
報告されている（Pettipher et al., 1986, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 83, 8749-8753）。また、β-アクチ
ンプロモーターの調節下でヒトIL-1α遺伝子を発現する
トランスジェニックマウスにおいて、炎症性関節炎が発
症することが示された。一方、患部関節中への抗IL-1抗
体またはIL-1raを投与することにより、疾患が改善され
ることも示されている（Joosten et al., 1996, Arthri
tis Rheum. 39,797-809; Makarov et al., 1996, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93, 402-406;Van den Berg et
al., 1994, Clin. Exp. Immunol. 95, 237-243）。これ
らの知見から、IL-1がRAの病因において重要な機能を果
たしていることが示唆される。しかしながら、サイトカ
インの過剰産生が生じる原因が、単に炎症反応の結果と
して増加しているためだけなのか、あるいは疾患の発症
において引き金となる機能を果たしているためなのかに
ついては、未だに解明されていない。Previously, the present inventors have reported that transgenic mice, which retain the HTLV-I env-pX region under the control of the LTR of the gene itself, develop chronic inflammatory polyarthritis at a high frequency ( Iwakura et al., 1991, Sc
ience 253, 1026-1028). Joint histopathology is very similar to that of rheumatoid arthritis in humans,
This transgenic animal was shown to be autoimmune (Iwakura et al., 1995, J.I.
mmunol. 155, 1588-1598; Yamamoto et al., 1993, Art
hritis Rheum. 36, 1612-1620). Interestingly, IL-1α, IL-1β, IL-
6. The expression of inflammatory cytokine genes including TNF-α and IFN-γ was enhanced (Iwakura et al., 1995, supra). In other models of RA, such as IIC-induced arthritis, IL-1
Was observed to be involved (Kasama et al., 199
0, Immunol. Lett. 26, 171-175; Marinova-Mutafchiev
a et al., 1997, Clin. Exp. Immunol. 107, 507-51
2). Furthermore, it has been reported that administration of IL-1 into normal rabbit joints can cause severe arthritis (Pettipher et al., 1986, Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA 83, 8749-8753). In addition, it was shown that inflammatory arthritis develops in transgenic mice that express the human IL-1α gene under the control of the β-actin promoter. On the other hand, it has also been shown that administration of anti-IL-1 antibody or IL-1ra into affected joints improves the disease (Joosten et al., 1996, Arthri
tis Rheum. 39,797-809; Makarov et al., 1996, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93, 402-406; Van den Berg et.
al., 1994, Clin. Exp. Immunol. 95, 237-243). These findings suggest that IL-1 plays an important role in the pathogenesis of RA. However, it remains to be elucidated whether the overproduction of cytokines is due solely to an increase as a result of the inflammatory response, or to fulfilling a function that triggers the development of the disease.
【０００９】このように、IL-1を含むサイトカイン類
は、体内で様々な生理的あるいは病理的機能を果たすこ
とが示唆されている。しかしながら、IL-1ファミリーが
他のサイトカイン（特に腫瘍壊死因子（TNF）-αおよび
IL-6）との間で相補性あるいは重複性を有するために、
上述した様々な生理および病理において、IL-1ファミリ
ーのそれぞれの構成分子が果たす正確な機能および重要
性は未だにはっきりとは明らかにされていない。Thus, it has been suggested that cytokines including IL-1 perform various physiological or pathological functions in the body. However, the IL-1 family has other cytokines, especially tumor necrosis factor (TNF) -α and
IL-6) has complementarity or overlap with
In the various physiologies and pathologies described above, the exact functions and significances of the respective members of the IL-1 family have not yet been clarified.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】特定の遺伝子の機能を
解析するための実験遺伝学的手段として、受精卵へのDN
A注入によるトランスジェニック動物の作製が知られて
いる。トランスジェニック技術は、適当な調節因子と結
合した遺伝子（DNA）を受精卵に注入し、その遺伝子を
染色体中に組み込み、そして発現させることができると
いう特徴を有する。しかしこの方法には、いくつかの問
題点が存在する。すなわち、（１）目的とする遺伝子の
過剰発現による効果しか調べられない、（２）目的とす
る遺伝子が染色体中にランダムに組み込まれるため、組
み込み部位の影響を予測することが難しく、発現の形態
は各々のトランスジェニックマウスにより異なる、
（３）トランスジーン（導入遺伝子）の発現のために使
用することができるプロモーターやエンハンサーが限ら
れている、などの問題点が存在する。As an experimental genetic means for analyzing the function of a specific gene, DN
The production of transgenic animals by A injection is known. Transgenic technology is characterized in that a gene (DNA) conjugated with an appropriate regulator can be injected into a fertilized egg, and the gene can be integrated into a chromosome and expressed. However, this method has several problems. That is, (1) the effect of overexpression of the target gene can be examined only, and (2) the target gene is randomly integrated into the chromosome, so it is difficult to predict the effect of the integration site, and the form of expression Is different for each transgenic mouse,
(3) There are problems such as that the promoters and enhancers that can be used for the expression of the transgene (transgene) are limited.
【００１１】そこで本発明は、正常生理および病理にお
けるIL-1ファミリーのそれぞれの構成分子の機能を明ら
かにするために、トランスジェニック技術とは別のアプ
ローチとして、相同組換えを用いた遺伝子ターゲティン
グ法により作製したIL-1関連遺伝子欠損（KO）マウスを
提供する。これらのKOマウスには、IL-1αのKOマウス、
IL-1βのKOマウス、IL-1α/βのKOマウスそしてIL-1ra
のKOマウスが含まれる。KOマウスは、IL-1関連遺伝子を
過剰発現させるのではなく、むしろその機能をなくする
ことによりそれらの遺伝子が生体内で果たしている機能
を解明することができる。[0011] Accordingly, the present invention provides a gene targeting method using homologous recombination as an approach different from transgenic technology in order to clarify the functions of the respective constituent molecules of the IL-1 family in normal physiology and pathology. The present invention provides an IL-1-related gene deficient (KO) mouse prepared by the method described above. These KO mice include IL-1α KO mice,
KO mouse for IL-1β, KO mouse for IL-1α / β and IL-1ra
KO mice are included. KO mice can elucidate the functions played by those genes in vivo by eliminating their functions rather than overexpressing IL-1 related genes.
【００１２】従って、本発明の一態様において、これら
のKOマウスを用いることで、IL-1系の機能を解明し、in
vivoにおけるIL-1αおよびIL-1βの機能を調べるだけ
でなく、IL-1シグナル伝達を調節するためのIL-1raの重
要性を調べることができる。すなわち、IL-1α遺伝子、
IL-1β遺伝子、IL-1ra遺伝子のいずれか一つが欠損した
動物、あるいは、これらのうち２または全部を組み合わ
せて欠損した動物を用いて、正常の生理およびストレス
応答に対する効果を調べることができる。これにより、
IL-1関連遺伝子ファミリーのそれぞれの構成分子が、発
熱応答および神経-免疫-内分泌応答において果たしてい
る機能について明らかにすることができる。さらに、IL
-1遺伝子発現の相互誘導（IL-1α、IL-1βおよびIL-1ra
の相互誘導）についても検討する。Therefore, in one embodiment of the present invention, the function of the IL-1 system is clarified by using these KO mice,
In addition to examining the function of IL-1α and IL-1β in vivo, the importance of IL-1ra in regulating IL-1 signaling can be examined. That is, the IL-1α gene,
Using an animal deficient in any one of the IL-1β gene and the IL-1ra gene, or an animal deficient in combination of two or all of them, the effect on normal physiology and stress response can be examined. This allows
The function of each member of the IL-1-related gene family in the fever and neuro-immuno-endocrine responses can be revealed. In addition, IL
-1 gene expression (IL-1α, IL-1β and IL-1ra
Is also considered.
【００１３】さらに本発明の一態様において、これらの
マウスを用いてテレピン油による局所炎症ストレスに対
する発熱やグルココルチコイド合成などの宿主応答、お
よびLPSまたは細菌の刺激に対する敗血性ショックに対
する宿主応答について調べ、そして神経-免疫-内分泌系
におけるIL-1の機能を検討する。さらに、IL-1のKOマウ
スおよびIL-1raのKOマウスを用いて細菌感染に対する宿
主応答についても調べ、細菌を排除する際のIL-1の重要
性を検討する。Further, in one embodiment of the present invention, these mice are used to examine host responses to fever and glucocorticoid synthesis to local inflammatory stress caused by turpentine oil, and host responses to septic shock to LPS or bacterial stimulation. Then, the function of IL-1 in the neuro-immune-endocrine system will be examined. Furthermore, the host response to bacterial infection will be examined using IL-1 KO mice and IL-1ra KO mice, and the importance of IL-1 in eliminating bacteria will be examined.
【００１４】さらに本発明の一態様において、IL-1raの
KOマウスが異常な免疫応答を示すことから、IL-1raのKO
マウスを使用して自己免疫疾患の発症におけるIL-1の病
理学的機能について検討することができる。これによ
り、免疫系におけるIL-1の機能について調べ、自己免疫
および関節炎の発症におけるIL-1およびIL-1raの機能を
検討する。Further, in one embodiment of the present invention, IL-1ra
Since KO mice show abnormal immune responses, IL-1ra KO
Using mice, the pathological function of IL-1 in the development of autoimmune diseases can be examined. Thus, the function of IL-1 in the immune system is examined, and the functions of IL-1 and IL-1ra in the development of autoimmunity and arthritis are examined.
【００１５】[0015]
【課題を解決するための手段】本発明のKO動物は、都合
よくは遺伝子ターゲティング法により作製することがで
きる。遺伝子ターゲティング法は、目的とするIL-1関連
遺伝子のゲノムDNAの一部を別個の遺伝子DNAにより置換
し、ゲノム上のその遺伝子本来の機能を失わせることを
目的とする方法である。そのため、遺伝子ターゲティン
グを行うためには、まず、機能を欠損させようとする目
的のIL-1関連遺伝子についてゲノムDNAを単離すること
が必要である。IL-1関連遺伝子ゲノムの単離 ゲノムDNAは、胚性幹細胞（ES細胞）の相同組換えを行
うための、ターゲティングベクターを構築するために使
用する。従って、ゲノムDNAは、相同組換えを行うとき
により効率よく組換えが生じるよう、作製しようとする
ES細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離、使用
することが望ましい。より望ましくは、相同組換えの効
率をさらに上げるために、ES細胞が由来する同一種の動
物のうち同じ系統の動物から、ゲノムDNAを単離して使
用する。同種であっても系統が異なるとゲノム中にDNA
の配列変異が散在し、それらの変異が相同組換えの確率
を下げる可能性があるからである。Means for Solving the Problems The KO animal of the present invention can be conveniently prepared by a gene targeting method. The gene targeting method is a method for replacing a part of the genomic DNA of a target IL-1-related gene with a separate gene DNA to lose the original function of the gene on the genome. Therefore, in order to perform gene targeting, it is necessary to first isolate genomic DNA for the IL-1 related gene whose function is to be lost. The isolated genomic DNA of the IL-1 related gene genome is used to construct a targeting vector for homologous recombination of embryonic stem cells (ES cells). Therefore, genomic DNA is to be produced so that recombination occurs more efficiently when performing homologous recombination.
It is desirable to isolate and use the same animal species from which the ES cells are derived. More desirably, in order to further increase the efficiency of homologous recombination, genomic DNA is isolated and used from animals of the same strain among animals of the same species from which ES cells are derived. Even in the same species, if the strain is different, the DNA in the genome
Are scattered, and these mutations may lower the probability of homologous recombination.
【００１６】マウスIL-1関連遺伝子のゲノムクローンを
採取する場合には、マウス由来のcDNAプローブまたはゲ
ノムDNAプローブを使用して、マウスゲノムライブラリ
ーからスクリーニングすることができる。cDNAプローブ
を使用する場合は、目的とするIL-1関連遺伝子について
のcDNAの全長を使用しても、その一部を使用してもよ
い。When a genomic clone of a mouse IL-1 related gene is collected, screening can be performed from a mouse genomic library using a mouse-derived cDNA probe or genomic DNA probe. When a cDNA probe is used, the full-length cDNA for the target IL-1-related gene or a part thereof may be used.
【００１７】プローブに結合したIL-1関連遺伝子ゲノム
DNAを制限酵素で切り出し、市販のクローニング用ベク
ター中に挿入する。クローニング用ベクターとしては、
市販されているpBluescript、pBR322、pUCなどのいずれ
のプラスミドを用いてもよい。このようにして単離され
たゲノムクローンを部分配列決定することにより、単離
されたゲノムクローンが目的とするIL-1関連遺伝子につ
いてのゲノムクローンであることを確認することができ
る。ターゲティングベクターの構築 ターゲティングベクターは、改変して機能不能にしたIL
-1関連遺伝子により、ES細胞中のIL-1関連遺伝子ゲノム
DNAを相同組換えするために使用するものである。従っ
て、本発明におけるIL-1関連遺伝子のターゲティングベ
クターは、一部を改変することにより機能不能にしたIL
-1関連遺伝子ゲノムDNAを含むことを必要とする。IL-1
関連遺伝子のゲノムDNAを挿入したプラスミドは、in vi
troにおいて当該IL-1関連遺伝子ゲノムDNA配列を改変す
ることにより、ゲノムDNAの切り出し・ライゲーション
などの工程を行うことなくターゲティングベクターとす
ることができる。The IL-1 related gene genome bound to the probe
The DNA is cut out with a restriction enzyme and inserted into a commercially available cloning vector. As a cloning vector,
Any commercially available plasmid such as pBluescript, pBR322, and pUC may be used. By determining the partial sequence of the genomic clone isolated in this way, it can be confirmed that the isolated genomic clone is a genomic clone for the target IL-1-related gene. Construction of targeting vector The targeting vector is a modified IL
IL-1 related gene genome in ES cells by -1 related gene
It is used for homologous recombination of DNA. Therefore, the targeting vector of the IL-1 related gene in the present invention, IL
-1 related genes need to contain genomic DNA. IL-1
The plasmid into which the genomic DNA of the related gene has been inserted
By modifying the genomic DNA sequence of the IL-1 related gene in tro, a targeting vector can be obtained without performing steps such as excision and ligation of genomic DNA.
【００１８】本発明において「IL-1関連遺伝子ゲノムDN
Aの一部を改変する」とは、IL-1関連遺伝子ゲノムDNAの
一部に変更、削除、挿入または置換を生じさせることを
いう。IL-1関連遺伝子を機能不能にするためには、IL-1
関連遺伝子に対して、変更、削除、挿入または置換のう
ち２またはそれ以上の方法を同時に使用してもよい。ま
た、改変を生じさせるIL-1関連遺伝子は、１つの遺伝子
のみに限られず、２以上の遺伝子について同時に改変を
生じさせてもよい。In the present invention, "IL-1 related gene genome DN"
"Altering part of A" refers to causing a change, deletion, insertion or substitution in a part of genomic DNA of an IL-1-related gene. To render IL-1 related genes inoperable, IL-1
Two or more methods of altering, deleting, inserting, or replacing the related gene may be used simultaneously. Further, the IL-1 related gene that causes the modification is not limited to one gene, and two or more genes may be modified simultaneously.
【００１９】本発明において、ゲノムDNAの「変更」と
は、IL-1関連遺伝子のゲノムDNA配列中に1またはそれ以
上の塩基置換を導入し、当該変更したIL-1関連遺伝子の
発現産物がIL-1関連分子として機能しないようにするこ
とをいう。本発明においてゲノムDNAの「削除」とは、I
L-1関連遺伝子のゲノムの一部または全部を欠失させる
ことにより、IL-1関連遺伝子の発現産物がIL-1関連分子
として機能しないかまたは存在しないようにすることを
いう。本発明において、ゲノムDNAに対して「挿入」と
は、IL-1関連遺伝子中に、IL-1関連遺伝子以外の配列を
有するDNAを挿入することにより、当該IL-1関連遺伝子
以外のDNAを挿入したIL-1関連遺伝子の発現産物がIL-1
関連分子として機能しないようにすることをいう。本発
明において、ゲノムDNAの「置換」とは、IL-1関連遺伝
子のゲノムの一部または全部をIL-1関連遺伝子とは関連
しない別個の配列により置換し、IL-1遺伝子の発現産物
がIL-1関連分子として機能しないかまたは存在しないよ
うにすることをいう。In the present invention, “alteration” of genomic DNA means that one or more base substitutions are introduced into the genomic DNA sequence of an IL-1-related gene, and the altered expression product of the IL-1-related gene is obtained. It means not functioning as an IL-1 related molecule. In the present invention, `` deletion '' of genomic DNA means
Deletion of part or all of the genome of an L-1 related gene means that the expression product of the IL-1 related gene does not function or is not present as an IL-1 related molecule. In the present invention, the term `` insertion '' with respect to genomic DNA means that by inserting a DNA having a sequence other than the IL-1 related gene into the IL-1 related gene, the DNA other than the IL-1 related gene is inserted. The expression product of the inserted IL-1 related gene is IL-1
It means not functioning as a related molecule. In the present invention, "replacement" of genomic DNA means that part or all of the genome of an IL-1 related gene is replaced by a separate sequence not related to the IL-1 related gene, and the expression product of the IL-1 gene is It means not functioning or being absent as an IL-1 related molecule.
【００２０】ターゲティングベクターの構築についてデ
ザインする場合、後の工程において行わなければならな
い相同組換え体のスクリーニングを、より容易に行うこ
とができるように考慮することが望ましい。たとえば、
相同組換え体のスクリーニングは、（１）ターゲティン
グベクターにより組換え体内に導入した薬剤耐性遺伝子
を用いて、培養中で行う細胞レベルの第一段階のスクリ
ーニング、そして（２）第一段階のスクリーニングによ
り選択された組換え体について、さらにPCR法、サザン
ブロットハイブリダイゼーション法などを行うことから
なるDNAレベルの第二段階のスクリーニングの２工程に
より行うことが好ましい。従って、この２工程のスクリ
ーニングをより容易に行うことができるようにターゲテ
ィングベクターをデザインすることが好ましい。When designing the construction of a targeting vector, it is desirable to consider so that screening of homologous recombinants that must be performed in a later step can be performed more easily. For example,
The screening of homologous recombinants is carried out by (1) first-stage screening at the cell level performed in culture using a drug resistance gene introduced into a recombinant by a targeting vector, and (2) first-stage screening. The selected recombinants are preferably subjected to two steps of a second-stage screening at the DNA level, which comprises further performing PCR, Southern blot hybridization, and the like. Therefore, it is preferable to design a targeting vector so that the two-step screening can be performed more easily.
【００２１】本発明においては、IL-1関連遺伝子のゲノ
ムDNA配列を、IL-1関連遺伝子とは関連しないDNA配列、
たとえば選択マーカー遺伝子DNA配列などと置換する方
法により、ターゲティングベクターを作製する。これ
は、ターゲティングベクター中のDNAによって相同組換
えされた相同組換え体を、選択マーカーなどを用いるこ
とで、より容易にスクリーニングすることができるよう
にするためである。より具体的には、単離されたIL-1関
連遺伝子のゲノムDNAの一部を制限酵素処理により削除
し、削除されたDNA領域の代わりにプロモーターを連結
した選択マーカー遺伝子を挿入することにより、IL-1関
連遺伝子のターゲティングベクターを作製する。In the present invention, the genomic DNA sequence of the IL-1 related gene is replaced with a DNA sequence not related to the IL-1 related gene,
For example, a targeting vector is prepared by a method of substituting a selection marker gene DNA sequence or the like. This is because the homologous recombination that has been homologously recombined with the DNA in the targeting vector can be more easily screened by using a selection marker or the like. More specifically, by removing a part of the genomic DNA of the isolated IL-1 related gene by restriction enzyme treatment, by inserting a selectable marker gene linked to a promoter instead of the deleted DNA region, A targeting vector for an IL-1-related gene is prepared.
【００２２】ES細胞中で強い発現活性を有するプロモー
ターとしてはホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK-1）
プロモーター、伸長因子2（EF-2）プロモーター、MC-1
プロモーターなどを使用することができる。ターゲティ
ングを行う遺伝子座、およびそのDNA領域により、プロ
モーター活性は大きく影響されるため、一般にはプロモ
ーターは強力であるほどよい。従ってより望ましくは、
PGK-1プロモータを使用する。A promoter having strong expression activity in ES cells is phosphoglycerate kinase-1 (PGK-1).
Promoter, elongation factor 2 (EF-2) promoter, MC-1
A promoter or the like can be used. Since the promoter activity is greatly affected by the locus to be targeted and its DNA region, generally, the stronger the promoter, the better. Therefore, more desirably,
Use the PGK-1 promoter.
【００２３】選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシ
ン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子、ネガティブ選択用にはチミジンキナーゼ
遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子断片、lacZ遺伝子など
を目的に応じて使用することができる。As the selectable marker gene, a neomycin resistance gene, a hygromycin B phosphotransferase gene, a thymidine kinase gene, a diphtheria toxin A gene fragment, a lacZ gene and the like can be used according to the purpose.
【００２４】プロモーターと連結した選択マーカー遺伝
子は、たとえばネオマイシン耐性遺伝子カセット（neo
カセット、pKJ2として供与）、ハイグロマイシンBホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子カセット（hphカセッ
ト）、チミジンキナーゼ遺伝子カセット（tkカセット、
pMCtkとして供与）、ジフテリア毒素A遺伝子断片カセッ
ト（DT-Aカセット、pMCDT-AまたはpMC1DT-Aとして供
与）、lacZ遺伝子カセット（pBSlacZとして供与）など
の、プラスミドに挿入された状態で市販されている選択
マーカー遺伝子を使用してもよい。ターゲティングベク
ターは、これらのプロモーターを連結した選択マーカー
のうち、どの選択マーカーを使用して構築してもよい。ターゲティングベクターによる相同組換え 次いで、上記の方法により作製したターゲティングベク
ターを使用して、相同組換えを行う。本発明において
「IL-1関連遺伝子の相同組換え」とは、IL-1関連遺伝子
と同一または類似の塩基配列を有する改変したIL-1関連
遺伝子を、IL-1関連遺伝子ゲノム上に、人工的に組み換
えさせることをいう。The selectable marker gene linked to the promoter is, for example, a neomycin resistance gene cassette (neo
Cassette, provided as pKJ2), hygromycin B phosphotransferase gene cassette (hph cassette), thymidine kinase gene cassette (tk cassette,
It is commercially available as inserted into a plasmid, such as a diphtheria toxin A gene fragment cassette (provided as DT-A cassette, pMCDT-A or pMC1DT-A), a lacZ gene cassette (provided as pBSlacZ), etc. A selectable marker gene may be used. The targeting vector may be constructed using any of the selectable markers linked to these promoters. Homologous recombination with targeting vector Next, homologous recombination is performed using the targeting vector prepared by the above method. In the present invention, the term "homologous recombination of an IL-1 related gene" means that a modified IL-1 related gene having the same or similar nucleotide sequence as an IL-1 related gene is artificially synthesized on the IL-1 related gene genome. It means to be recombined.
【００２５】目的とする遺伝子の相同組換えが起こる頻
度は10-6程度であることが知られている。したがって目
的とする相同組換え体を得るためには、理論上106以上
の細胞に組換え操作を行う必要があり、少なくとも数十
〜数百検体の組換え体をスクリーニングする必要があ
る。しかしながら、106個の受精卵を使用することは事
実上不可能であることから、受精卵に変わるものとし
て、受精卵と同様の多分化能を有し、かつin vitroで培
養することが可能な細胞を使用することが必要である。
このような目的を達成することができる方法として、胚
性幹細胞（ES細胞）を用いる方法、クローン動物作成技
術を用いた方法などを使用することができるが、これだ
けに限定されるものではない。It is known that the frequency of homologous recombination of the gene of interest is about 10 -6 . To obtain a homologous recombinant of interest, therefore, it is necessary to perform the recombination operation theoretically 10 6 or more cells, it is necessary to screen at least several tens to several hundreds analyte recombinants. However, since it is possible to use 106 fertilized eggs is virtually impossible, as an alternative to a fertilized egg, have the same pluripotency and embryo, and can be cultured in vitro It is necessary to use appropriate cells.
As a method that can achieve such an object, a method using embryonic stem cells (ES cells), a method using a cloned animal production technique, and the like can be used, but are not limited thereto.
【００２６】現在確立されている遺伝子ターゲティング
法では、ES細胞を使用することが望ましい。現時点にお
いてES細胞はマウス由来のものしか作製されていない
が、将来多種の動物でマウスES細胞と同様な細胞が樹立
されれば、同様な方法を用いて遺伝子欠損動物を作製す
ることができる。In the currently established gene targeting method, it is desirable to use ES cells. At present, only ES cells derived from mice have been produced, but if cells similar to mouse ES cells are established in various animals in the future, gene-deficient animals can be produced using similar methods.
【００２７】現在使用することができるマウス由来のES
細胞は、TT2細胞、AB-1細胞、J1細胞、R1細胞、E14.1細
胞などがある。ターゲティング動物を作出するために、
これらのうちいずれのES細胞を用いるかは、採取したゲ
ノムDNAの由来するマウス系統、キメラ動物の選別方法
など、実験の目的や方法により任意に決定することがで
きる。Currently available mouse-derived ESs
Cells include TT2 cells, AB-1 cells, J1 cells, R1 cells, E14.1 cells and the like. To create targeting animals,
Which of the ES cells to use can be arbitrarily determined depending on the purpose and method of the experiment, such as a mouse strain from which the collected genomic DNA is derived and a method for selecting chimeric animals.
【００２８】IL-1関連遺伝子を機能不能な配列にしたタ
ーゲティングベクターをES細胞中に導入する。そしてES
細胞中の目的とするIL-1関連遺伝子のゲノムDNA配列
を、ターゲティングベクター中の機能不能にしたIL-1関
連遺伝子DNA配列による相同組換えによって置換する。
相同組換えは、IL-1関連遺伝子ゲノムDNA配列と、ター
ゲティングベクター中の非改変部分の配列との相同性を
利用して、確率的に生じさせることができる。A targeting vector in which an IL-1 related gene has a non-functional sequence is introduced into ES cells. And ES
The genomic DNA sequence of the IL-1 related gene of interest in the cell is replaced by homologous recombination with the disabled IL-1 related gene DNA sequence in the targeting vector.
Homologous recombination can be generated stochastically by utilizing the homology between the genomic DNA sequence of the IL-1 related gene and the sequence of the non-modified portion in the targeting vector.
【００２９】ターゲティングベクターをES細胞に導入す
る方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カ
ルシウム法、DEAE-デキストラン法などを使用すること
ができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレク
トロポレーション法を用いることが好ましい。相同組換え体のスクリーニング 得られた組換えES細胞を、マイトマイシンC-処理したNH
L7細胞あるいはネオマイシン耐性の初代培養細胞からな
るフィーダーレイヤー上にプレーティングする。そして
ES培養液中で、相同組換えによってES細胞に導入された
選択マーカーを用いて、第一段階のスクリーニングであ
る選択培養を行う。当該第一段階の選択工程において
は、前述した選択マーカーのうち、複数の選択マーカー
遺伝子を用いることもできる。ES細胞を培養するための
培養液は毎日交換するとよい。培養液中には、選択マー
カー遺伝子の種類に依存して、たとえばネオマイシン
（G418, GIBCO BRL）やハイグロマイシンB（Calbioche
m）が含まれている。選択培養6-8日目に生存するコロニ
ーを耐性クローンとして採取する。As a method for introducing a targeting vector into ES cells, an electroporation method, a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, or the like can be used. It is preferable to use the electroporation method in consideration of efficiency, ease of operation, and the like. Screening of homologous recombinants The resulting recombinant ES cells were treated with mitomycin C-treated NH
Plate on a feeder layer consisting of L7 cells or primary culture cells resistant to neomycin. And
In an ES culture solution, a selective culture, which is a first-stage screening, is performed using a selection marker introduced into ES cells by homologous recombination. In the first-stage selection step, a plurality of selection marker genes can be used among the selection markers described above. The culture medium for culturing ES cells may be changed daily. Depending on the type of selectable marker gene, for example, neomycin (G418, GIBCO BRL) or hygromycin B (Calbioche)
m) is included. On day 6-8 of the selective culture, surviving colonies are collected as resistant clones.
【００３０】耐性クローンをピックアップし、増殖させ
る。その後、目的とするIL-1関連遺伝子がターゲティン
グされているかどうかを確実に調べるため、第二段階の
スクリーニングを行うことができる。第二段階のスクリ
ーニングは、DNAレベルで目的とするIL-1関連遺伝子が
ターゲティングされたかどうかを確認する工程である。
このような方法としては、PCR法、サザンブロットハイ
ブリダイゼーション法などが存在するが、そのうちのい
ずれを用いてもよく、またその中から2以上の方法を組
み合わせて用いてもよい。[0030] Resistant clones are picked up and propagated. Thereafter, a second stage of screening can be performed to ensure that the desired IL-1 related gene is targeted. The second stage of screening is a step of confirming whether the target IL-1 related gene has been targeted at the DNA level.
As such a method, there are a PCR method, a Southern blot hybridization method and the like, and any of them may be used, or two or more of them may be used in combination.
【００３１】本発明においては、まず、第一段階のスク
リーニングにより選択されたES細胞クローンのプールの
それぞれからゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型
としてPCR法を行うことで、ES細胞について第二段階の
スクリーニングをする。このPCR法を用いたスクリーニ
ングにより組換えが起こったクローンを単離する。In the present invention, first, genomic DNA is prepared from each of the pools of ES cell clones selected by the first-stage screening, and PCR is performed using this genomic DNA as a template, whereby ES cells can be transformed into ES cells. Perform a two-step screening. A clone in which recombination has occurred is isolated by screening using this PCR method.
【００３２】PCRプライマーは、ターゲティングにより
目的とするゲノムDNA領域を外来性の遺伝子により置換
することができたか否かをより効率的に確認できるよう
に設計することが望ましい。そのためにはターゲティン
グベクターの配列のうち目的とする遺伝子の外側のゲノ
ムDNA領域上と、選択マーカー遺伝子カセット領域上と
に設定し、挿入部位を増幅することができるように設計
するとよい。The PCR primer is desirably designed so that it can be more efficiently confirmed whether or not the target genomic DNA region can be replaced with a foreign gene by targeting. For this purpose, it is preferable to set the target vector sequence on the genomic DNA region outside the target gene and on the selectable marker gene cassette region so as to amplify the insertion site.
【００３３】第二段階のスクリーニングにおいて、ES細
胞が相同組換え体であることを確認するため、ES細胞ク
ローンに対してサザンブロットハイブリダイゼーション
法による解析を行うことことができる。サザンブロット
ハイブリダイゼーション解析は、ターゲティングベクタ
ーに含まれないゲノム領域を認識するプローブとターゲ
ティングベクター中に存在する領域を認識するプローブ
を併用して行うことが望ましい。二種類のプローブを用
いることにより相同組換えのほかに非相同組換えが存在
するか否かを知ることができ、目的とするゲノム領域に
相同組換えが起こったことをより正確に確認することが
できるからである。In the second stage screening, ES cell clones can be analyzed by Southern blot hybridization to confirm that the ES cells are homologous recombinants. The Southern blot hybridization analysis is desirably performed using a probe that recognizes a genomic region not contained in the targeting vector and a probe that recognizes a region present in the targeting vector. By using two types of probes, it is possible to know whether there is non-homologous recombination in addition to homologous recombination, and to more accurately confirm that homologous recombination has occurred in the target genomic region. Because it can be.
【００３４】これらのプローブをどのように設計するか
は、ターゲティングベクターを構築する際にどの選択マ
ーカーを使用するかにより、個々具体的に異なる。本発
明のIL-1関連遺伝子についてのサザンブロットハイブリ
ダイゼーション解析においては、プローブとして、ゲノ
ムクローンを適宜制限酵素処理することにより得られる
ゲノムDNA断片と、選択マーカーとして使用する薬剤耐
性遺伝子に対するプローブとを使用することが望まし
い。このようにサザンブロットハイブリダイゼーション
の条件は、当業者が適宜改変を加えることができ、必要
に応じてサザンブロットハイブリダイゼーション解析に
用いるプローブ数を増やして、さらに確実に相同組換え
体を選択することもできる。KO動物の作出 次いで、相同組換えの結果得られた組換えES細胞を、8
細胞期または胚盤胞の胚内に移植する。このES細胞移植
胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによ
りキメラ動物を作製することができる。KO動物は、現在
はマウスについてのみ作出することができる。しかし将
来的に種々の動物について受精卵または胚の遺伝子組換
え技術が使用できる用になった場合には、それぞれの動
物についても作出することができる。[0034] How to design these probes depends on which selection marker is used in constructing the targeting vector. In the Southern blot hybridization analysis of the IL-1 related gene of the present invention, a genomic DNA fragment obtained by appropriately treating a genomic clone with a restriction enzyme and a probe for a drug resistance gene used as a selection marker are used as probes. It is desirable to use. As described above, the conditions for Southern blot hybridization can be appropriately modified by those skilled in the art, and if necessary, increase the number of probes used for Southern blot hybridization analysis to more reliably select homologous recombinants. Can also. Production of KO animals then homologous recombination resulting recombinant ES cells, 8
Implanted into cell-stage or blastocyst embryos. A chimeric animal can be prepared by transplanting the ES cell-transplanted embryo into the uterus of a pseudopregnant foster mother and giving birth. KO animals can currently be produced only for mice. However, in the future, when the technology for genetic modification of fertilized eggs or embryos can be used for various animals, each animal can be produced.
【００３５】ES細胞を胚内に移植する方法としては、た
とえばマイクロマニピュレーション法、凝集法などが知
られているがいずれを用いてもよい。また移植する方法
は当業者が適宜改変することができる。マウスの場合、
まず、ホルモン剤（たとえば、FSH様作用を有するPMSG
およびLH作用を有するhCGを使用）により過***処理を
施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、8
細胞期胚を用いる場合には受精から2.5日目に、胚盤胞
を用いる場合には受精から3.5日目に、それぞれ子宮か
ら初期発生胚を回収する。このように回収した胚に対し
て、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行っ
たES細胞をin vitroにおいて注入し、キメラ胚を作製す
る。As a method for transplanting the ES cells into the embryo, for example, a micromanipulation method, an agglutination method and the like are known, and any method may be used. The method of transplantation can be appropriately modified by those skilled in the art. For a mouse,
First, hormonal agents (for example, PMSG with FSH-like action)
And the use of hCG having LH action) is used to breed the female mice that have undergone superovulation. Then 8
Early embryos are collected from the uterus 2.5 days after fertilization when using cell-stage embryos and 3.5 days after fertilization when using blastocysts. ES cells that have undergone homologous recombination using a targeting vector are injected in vitro into the embryos recovered in this way to produce chimeric embryos.
【００３６】一方、仮親にするための偽妊娠雌マウス
は、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢
した雄マウスと交配することにより得ることができる。
作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成
したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることに
よりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着
床、妊娠がより確実に起こるようにするために、受精卵
を採取する雌マウスと仮親になる偽妊娠マウスとを、同
一の性周期にある雌マウス群から作出することが望まし
い。On the other hand, a pseudopregnant female mouse to be a foster mother can be obtained by mating a female mouse in a normal cycle with a male mouse castrated by vasectomy or the like.
A chimeric animal can be prepared by implanting the chimeric embryo prepared by the above-mentioned method into the uterus of the pseudopregnant mouse thus produced and causing the mouse to become pregnant and give birth. In order to ensure that the implantation of the chimeric embryo and pregnancy occur, it is desirable to create a female mouse that collects a fertilized egg and a pseudopregnant mouse that becomes a foster mother from a group of female mice in the same estrous cycle .
【００３７】このようなキメラマウスの中から、ES細胞
移植胚由来の雄マウスを選択する。選択したES細胞移植
胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウス
を純系マウス系統のメスマウスと交配させ、そして次世
代産仔にES細胞由来の被毛色が現れることにより、ES細
胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認す
ることができる。ES細胞が生殖系列へ導入されたことを
確認するためには、様々な形質を指標として用いること
ができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色により行
うことが望ましい。マウスにおいては、野ネズミ色（ag
outi）、黒色（black）、黄土色（cinnamon）、チョコ
レート色（chocolate）、および白色（アルビノ、albin
o）の被毛色が知られているが、使用するES細胞の由来
系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統
を適宜選択することができる。例えば本発明において
は、野ネズミ色（agouti）系統（129マウス）由来のES
細胞を使用して作出したオスのキメラマウスを、黒色で
あるC57BL/6メスマウスと交配させる。そして次世代産
仔の被毛色が野ネズミ色（agouti）であることにより、
ES細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確
認することができる。このように、胚内に移植された組
換えES細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、その
キメラ動物を繁殖することにより目的とする遺伝子を欠
損する個体を得ることができる。得られたIL-1関連遺伝
子欠損ヘテロ接合体マウスどうしを交配させることによ
り、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ること
ができる。From these chimeric mice, male mice derived from embryos transplanted with ES cells are selected. After maturation of the selected male chimeric mouse derived from the ES cell-transplanted embryo, the mouse is mated with a female mouse of a pure mouse strain, and the coat color derived from the ES cell appears in the next generation of offspring. It can be confirmed that the gene was introduced into the mouse germ line. To confirm that the ES cells have been introduced into the germ line, various traits can be used as indices, but it is preferable to use the coat color in consideration of the ease of confirmation. In mice, the mouse color (ag
outi), black, cinnamon, chocolate, and white (albino, albin)
Although the coat color of o) is known, a mouse strain to be crossed with a chimeric mouse can be appropriately selected in consideration of the ES cell origin used. For example, in the present invention, ES derived from a murine agouti strain (129 mice)
Male chimeric mice created using the cells are bred to black C57BL / 6 female mice. And because the coat color of the next generation of offspring is wild rat (agouti),
It can be confirmed that the ES cells were introduced into the germ line of the chimeric mouse. As described above, an animal in which a recombinant ES cell implanted in an embryo is introduced into a germ line is selected, and an individual deficient in a target gene can be obtained by breeding the chimeric animal. By mating the obtained IL-1-related gene-deficient heterozygous mice, a target gene-deficient homozygous mouse can be obtained.
【００３８】一般に実験動物を用いて研究するために
は、系統として確立された動物、すなわち遺伝的にホモ
の状態の動物を用いることが望ましい。このような動物
では、遺伝的背景が詳細に調べられているため、かかる
既知の遺伝的背景のもとで、当該動物に施した処置の効
果のみを特定できるからである。一方、雑種動物におい
ては種々の遺伝子がヘテロの状態で存在するため、当該
動物に対する処置の結果生じた効果が、当該処置にのみ
由来するものかまたは遺伝的背景に由来するものかを判
別することが困難である。Generally, in order to conduct research using experimental animals, it is desirable to use animals that have been established as strains, that is, animals that are genetically homozygous. This is because the genetic background of such an animal has been examined in detail, and only the effect of the treatment applied to the animal can be specified under such a known genetic background. On the other hand, since various genes are present in a heterozygous state in a hybrid animal, it is necessary to determine whether the effect resulting from the treatment on the animal is derived only from the treatment or the genetic background. Is difficult.
【００３９】KOマウスの作成の過程では、ES細胞が生殖
系列に導入されたか否かを被毛色の違いを指標にして確
認するために、交雑を行い雑種子孫を作製することが工
程を必ず行う必要がある。したがって、多くの遺伝子が
ヘテロの状態で存在するため、結果としてIL-1関連遺伝
子が欠損することのみによる特有の効果を調べることが
困難となってしまう。そこで、遺伝子欠損の特有の効果
のみを抽出するために、得られた遺伝子欠損マウスを純
系のマウス系統と戻し交配し、ターゲティングを行った
遺伝子を含むすべての遺伝子について可能な限り遺伝的
にホモの状態にすることが好ましい。目的とする遺伝的
構成の動物を得るためには、5世代〜8世代程度同一系統
と戻し交配を行うことが好ましい。戻し交配に用いるマ
ウスは当業者が適宜選択することができる。使用するこ
とができるマウスとしては、例えばBALB/c、C57BL/6、D
BA11、ICRなどが挙げられるが、これらに限定されな
い。また、自然交配のみにより戻し交配を行うと長い年
月がかかる場合があるので、世代交代を早めたい場合に
は適宜体外受精技術を用いることもできる。In the process of preparing KO mice, it is necessary to carry out crossing to prepare hybrid progeny in order to confirm whether or not ES cells have been introduced into the germ line using the difference in coat color as an index. There is a need. Therefore, many genes exist in a heterogeneous state, and as a result, it becomes difficult to examine a specific effect caused only by deletion of the IL-1-related gene. Therefore, in order to extract only the specific effects of gene deletion, the resulting gene-deficient mice were backcrossed with a pure mouse strain, and all the genes including the targeted gene were genetically homozygous as much as possible. Preferably, it is in a state. In order to obtain an animal having a desired genetic constitution, it is preferable to perform backcrossing with the same line for about 5 to 8 generations. Those skilled in the art can appropriately select a mouse used for backcrossing. Examples of mice that can be used include BALB / c, C57BL / 6, D
Examples include, but are not limited to, BA11, ICR, and the like. In addition, if backcrossing is performed only by natural crossing, it may take a long time. Therefore, if it is desired to change generations quickly, an in vitro fertilization technique can be used as appropriate.
【００４０】作出された遺伝子欠損マウスを用いたそれ
ぞれの実験では、性別および年齢が適合した成熟マウス
を用いることが好ましい。性別や年齢に依存する因子が
実験の結果に与える影響を排除するためである。また、
実験は、動物実験に対する研究所内倫理ガイドラインお
よび遺伝子操作実験に対する安全性ガイドラインに基づ
いて行う。In each experiment using the generated gene-deficient mice, it is preferable to use mature mice whose sex and age are matched. This is to eliminate the effects of gender and age-dependent factors on the results of the experiment. Also,
The experiments are performed based on in-house ethical guidelines for animal experiments and safety guidelines for genetic engineering experiments.
【００４１】[0041]
【発明の効果】以上のようにして作出したIL-1関連遺伝
子欠損マウスは、IL-1関連遺伝子が、炎症、細菌感染そ
して自己免疫疾患においてどのような働きをしているか
を調べるための試験に用いることができる。Effects of the Invention The IL-1 related gene-deficient mice created as described above are tested for examining the role of IL-1 related genes in inflammation, bacterial infection and autoimmune diseases. Can be used.
【００４２】特に、本発明の自己免疫疾患を発症するIL
-1ra遺伝子欠損動物は、自己免疫疾患、例えばリウマチ
の発症の研究に使用できるばかりでなく、それら疾患の
治療薬の探索に使用することもできる。In particular, the IL which develops the autoimmune disease of the present invention
-1ra gene-deficient animals can be used not only to study the development of autoimmune diseases such as rheumatism, but also to search for therapeutics for those diseases.
【００４３】したがって、本発明は本発明の疾患モデル
動物を使用して、自己免疫疾患の予防および／または治
療薬を探索する方法も提供する。本発明の探索方法は、
当業者が適宜定めることができるが、例えば次の工程か
らなる：自己免疫疾患モデル動物、好ましくは約4〜8週
齢の自己免疫疾患モデルマウスに、薬剤候補の化合物ま
たは物質を静脈、皮下、筋肉内、経口等のルートで1日1
〜数回に分けて、1または複数回投与する。投与する化
合物または物質は、医薬用の溶媒または医薬用の希釈媒
体により希釈して用いてもよく、あるいは水もしくは餌
に混合して与えてもよい。自己免疫疾患の予防もしくは
治療効果の判定は、候補化合物の代わりに、同量の溶媒
または媒体を投与したモデル動物に比べて、疾患の発症
が抑制され、もしくは症状が軽減されていることにより
判定する。試験には、陽性対照として、市販の抗リウマ
チ剤であるインドメタシンやスリンダクを与えた群を含
めてもよい。Therefore, the present invention also provides a method for searching for a prophylactic and / or therapeutic agent for an autoimmune disease using the disease model animal of the present invention. The search method of the present invention comprises:
A person skilled in the art can appropriately determine, for example, the following steps: an autoimmune disease model animal, preferably an autoimmune disease model mouse of about 4 to 8 weeks old, is intravenously, subcutaneously or intravenously administered with a drug candidate compound or substance. Intramuscular, oral route 1 daily
It is administered once or several times in several divided doses. The compound or substance to be administered may be used diluted with a pharmaceutical solvent or a pharmaceutical diluent medium, or may be given as a mixture with water or feed. Determination of the preventive or therapeutic effect of an autoimmune disease is determined by suppressing the onset of the disease or reducing the symptoms as compared to a model animal to which the same amount of a solvent or vehicle was administered instead of the candidate compound. I do. The test may include, as a positive control, a group that received indomethacin or sulindac, which are commercially available antirheumatic drugs.
【００４４】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するためのもの
ではない。実施例においてすべてのマウスは、東京大学
医科学研究所実験動物研究施設（Laboratory Animal Re
search Center, Instituteof Medical Science, Univer
sity of Tokyo）において、特定病原体フリー（SPF）の
条件下、環境的に調節されたクリーンルーム内で飼育し
た。ケージ、水ビン、木クズそして餌粒を含めたすべて
の器具および糧食は、滅菌して用いた。また、本明細書
中を通じて、結果の統計学的評価のために、Studentのt
-検定を使用した。Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention. In the examples, all mice were used at Laboratory Animal Research Laboratory, Institute of Medical Science, University of Tokyo.
search Center, Instituteof Medical Science, Univer
sity of Tokyo) in an environmentally controlled clean room under specific pathogen-free (SPF) conditions. All utensils and food, including cages, water bottles, wood chips and food grains, were used sterile. Also, throughout this specification, Student's t
-The test was used.
【００４５】[0045]
【実施例】試験例１：IL-1αのKOマウスの作出 IL-1α遺伝子のゲノムDNAクローニング マウスIL-1αに対するゲノムDNAは、マウスIL-1αのcDN
A全長（SEQ ID No:1）、およびIL-1βのcDNA全長（SEQ
ID No:2）の混合物をプローブとして、AntonBerns博士
から譲渡された129OLAマウスゲノムファージライブラリ
から単離した。マウスIL-1αのcDNAはTetsuo Sudo博士
（Toray Industry）の好意により入手した。およそ9×1
05のファージクローンをプラークハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングし、そして9個の陽性クローン
を得た。これらのクローンがIL-1αをコードしているか
否かを決定するために、IL-1αプローブを用いた第２ス
クリーニングを別個に行った。この結果単一のファージ
クローン由来の6個のIL-1α陽性クローンを得た。マウ
スIL-1αゲノム構造はこれまでに報告されていないた
め、本発明者はいくつかの制限酵素によるゲノムクロー
ンの消化および部分配列決定により、ゲノムクローンの
構造地図を作製した（図１）。得られたIL-1αクローン
は、遺伝子の15 kbをカバーし、そしてヒトIL-1α遺伝
子のエクソン5からエクソン7に対応する相同配列を含ん
でいた。 EXPERIMENTAL EXAMPLE 1: Preparation of IL-1α KO Mouse Genomic DNA Cloning of IL-1α Gene
A full length (SEQ ID No: 1) and full length cDNA of IL-1β (SEQ
The mixture of ID No. 2) was used as a probe and isolated from a 129OLA mouse genomic phage library provided by Dr. Anton Berns. Mouse IL-1α cDNA was obtained courtesy of Dr. Tetsuo Sudo (Toray Industry). Approx. 9 × 1
0 5 phage clones were screened by plaque hybridization, and gave the nine positive clones. To determine whether these clones encode IL-1α, a second screen using an IL-1α probe was performed separately. As a result, six IL-1α positive clones derived from a single phage clone were obtained. Since the mouse IL-1α genomic structure has not been reported before, the present inventor created a structural map of the genomic clone by digestion and partial sequencing of the genomic clone with several restriction enzymes (FIG. 1). The resulting IL-1α clone covered 15 kb of the gene and contained homologous sequences corresponding to exons 5 to 7 of the human IL-1α gene.
【００４６】IL-1αターゲティングベクターの構築 IL-1α遺伝子のターゲティングストラテジーを図1に示
す。IL-1α遺伝子のターゲティングベクターを作製する
ために、単離したゲノムクローンの一部を制限酵素によ
り削除し、そこにプロモーターを結合した選択マーカー
遺伝子を挿入した。ハイグロマイシンBホスホトランス
フェラーゼ遺伝子（hph）をES細胞中での陽性選択マー
カーとして、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK-1）
プロモーターの調節下において使用した。IL-1α遺伝子
の発現をモニターするために、β-ガラクトシダーゼ遺
伝子（lacZ）（Pharmacia）をIL-1α遺伝子中に挿入
し、IL-1α-lacZ融合タンパク質を作製した。 Construction of IL-1α Targeting Vector The targeting strategy of the IL-1α gene is shown in FIG. In order to prepare a targeting vector for the IL-1α gene, a part of the isolated genomic clone was deleted with a restriction enzyme, and a selectable marker gene linked to a promoter was inserted therein. Hygromycin B phosphotransferase gene (hph) is used as a positive selection marker in ES cells, and phosphoglycerate kinase-1 (PGK-1)
Used under the control of a promoter. To monitor the expression of the IL-1α gene, the β-galactosidase gene (lacZ) (Pharmacia) was inserted into the IL-1α gene to produce an IL-1α-lacZ fusion protein.
【００４７】IL-1αのターゲティングベクターの構築
は、それぞれエクソン5およびイントロン5中のSau3A I
およびKpn I部位間の成熟IL-1αについてのN-末端コー
ド領域を含む1.5 kbのDNA断片を削除し、そしてlacZ-pA
-PGK-hph-pAカセットをDNA断片の代わりに挿入した（こ
こでpAはポリAを意味する）。MC1プロモーター調節下の
ジフテリア毒素A断片遺伝子（DT）を、ネガティブ選択
のためにベクターの5'末端にライゲーションした（図
1）。5'-および3'-末端の相同領域は、それぞれ1.5 kb
および5.5 kbであった。The construction of the targeting vector for IL-1α was carried out using Sau3A I in exon 5 and intron 5, respectively.
And a 1.5 kb DNA fragment containing the N-terminal coding region for mature IL-1α between the Kpn I site and lacZ-pA
The -PGK-hph-pA cassette was inserted instead of a DNA fragment (where pA means polyA). The diphtheria toxin A fragment gene (DT) under the control of the MC1 promoter was ligated to the 5 'end of the vector for negative selection (Fig.
1). 5'- and 3'-end homologous regions are 1.5 kb each
And 5.5 kb.
【００４８】ターゲティングベクターを導入したES細胞
の作製 本発明において使用するES細胞は、129/SvJ×129/Sv-CP
マウスから得られたR1細胞である。R1細胞は、Andras N
agy博士（Nagy et al., 1993, Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 90, 8424-8428）に記載されているように取得する
ことができる。ES細胞に対してエレクトロポレーション
を行うことにより、107細胞あたり約20-25μgの直鎖化
ターゲティングベクターを導入する。エレクトロポレー
ションは例えばBio-Rad Gene Pulsar中で、250 Vおよび
500μFで行うことができる。次いで細胞を、ES培地（15
-20％ウシ胎児血清（Bioserum）、マウス白血病阻止因
子（LIF, ESGROTM; GIBCO BRL）、ピルビン酸ナトリウ
ム（GIBCO BRL）、非必須アミノ酸（GIBCO BRL）および
β-メルカプトエタノール（Sigma）を添加したDulbecco
改変Eagle培地（GIBCO BRL））中で、マイトマイシンC-
処理したNHL7細胞あるいはネオマイシン耐性の初代培養
細胞からなるフィーダーレイヤー上にプレーティング
し、そしてハイグロマイシンB（140μg/ml, Calbioche
m）を選択薬剤として用いて選択培養する。薬剤を含む
培地は毎日交換する。 ES cells transfected with targeting vector
The ES cells used in the production the present invention, 129 / SvJ × 129 / Sv -CP
R1 cells obtained from mice. R1 cells are Andras N
Dr. agy (Nagy et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 8424-8428). By performing electroporation against ES cells, introduce a linearized targeting vector about 20-25μg per 10 7 cells. Electroporation is performed, for example, at 250 V and in a Bio-Rad Gene Pulsar.
It can be performed at 500 μF. The cells were then transferred to ES medium (15
-20% fetal calf serum (Bioserum), mouse leukemia inhibitory factor (LIF, ESGRO ™ ; GIBCO BRL), sodium pyruvate (GIBCO BRL), non-essential amino acids (GIBCO BRL) and β-mercaptoethanol (Sigma) were added. Dulbecco
In modified Eagle's medium (GIBCO BRL)), mitomycin C-
Plate on a feeder layer consisting of treated NHL7 cells or neomycin-resistant primary culture cells, and add hygromycin B (140 μg / ml, Calbioche
Selective culture using m) as selection agent. The medium containing the drug is changed daily.
【００４９】ハイグロマイシン存在下に生育した4つのE
Sクローンをプールし、それらからゲノムDNAを単離し
た。クローンは相同組換えが起こったかどうかを確認す
るため、プライマーP1：5'-CTT GGC CAT ACT GCA AAG G
TC ATG-3'（SEQ ID No:4）およびP2：5'-GAG GTG CTG T
TT CTG GTC TTC ACC-3'（SEQ ID No:5）を用いたPCRに
よってスクリーニングした。PCR反応バッファーは、50
mMのKCl、10 mMのTris-HCl（pH 9.0）、0.1％のTriton
X-100、1.5 mMのMgCl2、0.2 mMの各dNTP、1μMのプライ
マー、そして2.5 U/50μlのTaqポリメラーゼ（Boehring
er）を含む。PCRサイクルの条件は、94℃で1分、66℃で
2分、72℃で3分を1サイクルとして40サイクルの反応を
行った。Four E grown in the presence of hygromycin
S clones were pooled and genomic DNA was isolated from them. To confirm whether the clone has undergone homologous recombination, primer P1: 5′-CTT GGC CAT ACT GCA AAG G
TC ATG-3 '(SEQ ID No: 4) and P2: 5'-GAG GTG CTG T
Screening was performed by PCR using TT CTG GTC TTC ACC-3 ′ (SEQ ID No. 5). PCR reaction buffer is 50
mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.1% Triton
X-100, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM each dNTP, 1 μM primer, and 2.5 U / 50 μl Taq polymerase (Boehring
er). PCR cycle conditions are 94 ° C for 1 minute and 66 ° C
The reaction was carried out for 40 cycles, each cycle consisting of 2 minutes and 3 minutes at 72 ° C.
【００５０】さらにES細胞から単離したゲノムDNA中に
目的とする遺伝子が相同組換えされたことを確認するた
めに、NheI-SpeI断片を5'プローブ（図1の下段を参照）
として、そしてSmaI-SmaI断片を3'プローブ（図1の下段
を参照）として使用し、ターゲティングされたIL-1α遺
伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解
析を行った。サザンブロットハイブリダイゼーション解
析に関しては後述する。Further, in order to confirm that the gene of interest has been homologously recombined into the genomic DNA isolated from the ES cells, the NheI-SpeI fragment was subjected to a 5 ′ probe (see the lower part of FIG. 1).
And the SmaI-SmaI fragment was used as a 3 ′ probe (see lower part of FIG. 1) to perform Southern blot hybridization analysis on the targeted IL-1α gene. The Southern blot hybridization analysis will be described later.
【００５１】目的とする遺伝子をターゲティングしたES
細胞を、改変した凝集法により受精卵中に移植し、キメ
ラマウスを作製した。このES細胞を用いて作製したキメ
ラマウスを用いて、IL-1α遺伝子欠損変異についてホモ
接合体のマウスを作出した。これら作出されたマウスが
目的とする遺伝子欠損を起こしているかどうかを確認す
るために、サザンブロットハイブリダイゼーション解析
を行った。ES targeting the target gene
Cells were implanted into fertilized eggs by a modified aggregation method to produce chimeric mice. Using the chimeric mouse prepared using this ES cell, a mouse homozygous for the IL-1α gene deficient mutation was created. Southern blot hybridization analysis was performed to confirm whether the generated mice had the desired gene deficiency.
【００５２】サザンブロットハイブリダイゼーション解
析は、クローン化したES細胞由来のゲノムDNA（図4A）
または遺伝子ターゲティング産仔由来のゲノムDNA（図4
B）を単離し、得られたゲノムDNAをEcoR I（図4A）また
はBamH I（図4B）のいずれかにより消化し、そしてNheI
-SpeI切断断片およびSmaI-SmaI切断断片をそれぞれ5'お
よび3'プローブとして、そして同時にhphプローブ（図
1）を用いて行った。プローブは、ランダムプライム法
（Amersham）を用いて、32P-dCTPで標識する。サザンハ
イブリダイゼーションは、以下の方法により行った。適
切な制限酵素で消化したDNA（10μg）を0.7％アガロー
スゲル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Ge
ne Screen Plus, NEN）に転写する。ハイブリダイゼー
ションは5×SSCP、50％ホルムアミド、2×Denhardt溶
液、1％SDS、そして100μg/mlサケ精巣DNAを含むバッフ
ァー中で、32P標識プローブを用いて42℃で行う。メン
ブレンは、室温で1％SDSを含む2×SSCで、そして65℃で
1％SDSを含む0.1×SSCで洗浄する。このメンブレンを用
いてイメージプレートに感光し、放射線標識されたバン
ドをBAS2000により検出した。The Southern blot hybridization analysis was performed using genomic DNA derived from cloned ES cells (FIG. 4A).
Alternatively, genomic DNA from gene-targeted litters (Fig. 4
B) is isolated, the resulting genomic DNA is digested with either EcoRI (FIG. 4A) or BamHI (FIG. 4B), and NheI
-SpeI and SmaI-SmaI cleavage fragments as 5 ′ and 3 ′ probes, respectively, and simultaneously with the hph probe
This was performed using 1). Probes are labeled with 32 P-dCTP using the random prime method (Amersham). Southern hybridization was performed by the following method. DNA (10 μg) digested with the appropriate restriction enzymes was electrophoresed on a 0.7% agarose gel, and a nylon membrane (Ge
ne Screen Plus, NEN). Hybridization is performed at 42 ° C. with a 32 P-labeled probe in a buffer containing 5 × SSCP, 50% formamide, 2 × Denhardt solution, 1% SDS, and 100 μg / ml salmon testis DNA. The membrane is 2 × SSC with 1% SDS at room temperature and at 65 ° C.
Wash with 0.1 × SSC containing 1% SDS. The membrane was exposed to an image plate using the membrane, and a radiolabeled band was detected by BAS2000.
【００５３】5'プローブによるハイブリダイゼーション
により、IL-1αの野生型アリル由来のバンドに相当する
4.7 kbの予想されるバンド、および変異アリル由来のバ
ンドに相当する6.7 kbのDNAバンドを検出した。3'プロ
ーブおよびhphプローブによりハイブリダイゼーション
されるすべてのバンドもまた予想される長さであり、そ
れらからターゲティングされるESクローン中の野生型ア
リルのうちの一つが、変異遺伝子により正しく置換され
ていることを示していた。IL-1α遺伝子のターゲティン
グ効率は、4/282（1.4％）であった（表1）。このうち
ターゲティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、4
クローン中３クローンで確認された。Hybridization with the 5 ′ probe corresponds to a band derived from wild-type allele of IL-1α.
An expected band of 4.7 kb and a 6.7 kb DNA band corresponding to the band from the mutant allele were detected. All bands hybridized by the 3 'probe and the hph probe are also of expected length, and one of the wild-type alleles in the ES clone targeted therefrom has been correctly replaced by the mutant gene It was showing that. The targeting efficiency of the IL-1α gene was 4/282 (1.4%) (Table 1). Of these, the introduction of the targeted gene into the germline
It was confirmed in 3 of the clones.
【００５４】[0054]
【表１】 [Table 1]
【００５５】IL-1αのKOマウスの作出 IL-1α遺伝子をターゲティングしたES細胞を、受精胚中
に移植する。移植する方法は当業者が適宜改変すること
ができるが、本発明においては、例えば、オリジナルの
報告（Nagy et al., 1993,上述）から改変した凝集法に
より、キメラ胚を作製した。すなわち、プラスチックデ
ィッシュ上の穴の中で、約10-15のES細胞塊を2個の8細
胞期胚と凝集させ、そしてBWW培地またはM16培地などの
適当な培地中で一晩培養し（Biggers et al., 1971, Th
e culture of mouse embryo invitro, in Methods in M
ammalian Embryology (J.C. Daniel, Jr., ed), W.H.Fr
eeman and Company, San Francisco, 86-116; Iwakura
and Nozaki, 1985, Dev. Biol. 112, 135-144）、その
後十分に形成した胞胚を偽妊娠メスマウスの子宮内に移
植する。凝集法において8細胞期胚として使用すること
ができる胚の由来する系統は、純系どうしの交配に由来
するものでも純系間での交配に由来するものでもよい。
本発明においては、C57BL/6×DBA/2のF1由来の胚を使用
することが好ましい。Creation of IL-1α KO Mouse ES cells targeting the IL-1α gene are transplanted into a fertilized embryo. The transplantation method can be appropriately modified by those skilled in the art. In the present invention, for example, chimeric embryos were produced by an aggregation method modified from the original report (Nagy et al., 1993, supra). That is, in a hole on a plastic dish, about 10-15 ES cell clumps are aggregated with two 8-cell stage embryos, and cultured overnight in a suitable medium such as BWW medium or M16 medium (Biggers et al., 1971, Th
e culture of mouse embryo invitro, in Methods in M
ammalian Embryology (JC Daniel, Jr., ed), WHFr
eeman and Company, San Francisco, 86-116; Iwakura
and Nozaki, 1985, Dev. Biol. 112, 135-144), and subsequently well-formed blastocysts are implanted into the uterus of pseudopregnant female mice. The strain derived from the embryo that can be used as the 8-cell stage embryo in the agglutination method may be one derived from crossing pure lines or one derived from crossing between pure lines.
In the present invention, it is preferred to use C57BL / 6 × DBA / 2 of F 1 from the embryo.
【００５６】ES細胞導入胚由来のオスのキメラマウスが
成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウス
と交配させ、そして次世代産仔の被毛色により、ES細胞
がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認す
る。例えば本発明においては、前述した様に野生色（ag
outi）系統（129マウス）由来のES細胞を使用するた
め、作出したオスのキメラマウスを、黒色であるC57BL/
6メスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色が
野ネズミ色（agouti）であることにより、ES細胞がキメ
ラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することが
できる。得られたIL-1関連遺伝子欠損ヘテロ接合体マウ
スを交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ
接合体マウスを得ることができる。After the male chimeric mouse derived from the ES cell-introduced embryo matures, the mouse is mated with a female mouse of a pure mouse strain, and the ES cell is introduced into the germ line of the chimeric mouse depending on the coat color of the next-generation offspring. Confirm that it was done. For example, in the present invention, as described above, the wild color (ag
outi) In order to use ES cells derived from the strain (129 mice), the male chimeric mice created were transformed into black C57BL /
By mating with 6 female mice, and the coat color of the next-generation offspring being the gray mouse color (agouti), it can be confirmed that the ES cells have been introduced into the germ line of the chimeric mouse. By mating the obtained IL-1-related gene-deficient heterozygous mice, a target gene-deficient homozygous mouse can be obtained.
【００５７】表現型解析 本実施例で作出されたIL-1αのKOマウスの仔は、ヘテロ
接合体同士の交配でメンデル比に従って産まれることを
見いだした。このことから、IL-1αはマウスの胚発生中
において重要ではないことを示している。IL-1αの変異
ホモ接合体マウスは、SPF条件下では健康で繁殖能力も
有していた。 Phenotypic Analysis It was found that the pups of KO mice of IL-1α produced in this example were born according to the Mendelian ratio by crossing heterozygotes. This indicates that IL-1α is not important during mouse embryonic development. Mutant homozygous mice for IL-1α were healthy and capable of reproducing under SPF conditions.
【００５８】作出したそれぞれのKOマウス由来免疫系細
胞がどのような表現型を有するかを調べるため、フロー
サイトメトリー解析を行う。胸腺、脾臓およびリンパ節
（LN）由来の単一細胞懸濁液を調製し、そして106の細
胞をFc受容体ブロック抗体により前処理して以下のモノ
クローナル抗体で45分間染色する。細胞はFACS溶液（HA
NKS-20％FCS）で洗浄し、そしてLysis IIプログラムを
用いるFACScan細胞計測器（Becton-Dickinson）で解析
する。染色用のモノクローナル抗体として、蛍光イソチ
オシアネート（FITC）-抗-B220、フィコエリトリン（P
E）-抗-CD3、FITC-抗-CD8、そしてPE-抗-CD4（Pharming
en）を使用する。フローサイトメトリー解析によれば、
T細胞とB細胞の比率、そして脾臓および胸腺におけるCD
4+T細胞とCD8+T細胞の比率は、IL-1αのKOマウスにおい
て顕著な影響を受けていないことを示した。In order to examine the phenotype of each of the created KO mouse-derived immune system cells, flow cytometry analysis is performed. Thymus, spleen and lymph node (LN) single cell suspensions were prepared from, and 10 6 cells are stained pretreated with 45 minutes following monoclonal antibodies by Fc receptors blocking antibodies. Cells are stored in FACS solution (HA
Wash with NKS-20% FCS) and analyze on a FACScan cytometer (Becton-Dickinson) using the Lysis II program. Monoclonal antibodies for staining include fluorescent isothiocyanate (FITC) -anti-B220, phycoerythrin (P
E) -anti-CD3, FITC-anti-CD8, and PE-anti-CD4 (Pharming
en). According to flow cytometry analysis,
T cell to B cell ratio and CD in spleen and thymus
The ratio of 4 + T cells to CD8 + T cells showed that IL-1α was not significantly affected in KO mice.
【００５９】試験例２：IL-1βのKOマウスの作出 IL-1β遺伝子のゲノムDNAクローニング IL-1βのゲノムクローンを、マウスIL-1βのcDNAの全長
（SEQ ID No.2）をプローブとして、129SvJマウスゲノ
ムライブラリー（λFIXII、Stratagene）から単離し
た。マウスIL-1βのcDNAはTetsuo Sudo博士（Toray Ind
ustry）の好意により入手した。ターゲティングベクタ
ーを構築する前に、これらのクローンのDNA配列を部分
配列決定し、すべてのエクソン（エクソン1〜エクソン
7）を含むIL-1β遺伝子の17 kbをカバーするクローン
（SEQ. ID. No:13）を得た。 Test Example 2: Production of IL-1β KO Mouse Genomic DNA Cloning of IL-1β Gene Using a genomic clone of IL-1β as a probe, the full-length mouse IL-1β cDNA (SEQ ID No. 2) was used as a probe. Isolated from the 129SvJ mouse genomic library (λFIXII, Stratagene). Mouse IL-1β cDNA is from Dr. Tetsuo Sudo (Toray Ind
ustry). Prior to construction of the targeting vector, the DNA sequences of these clones were partially sequenced and all exons (exon 1 to exon
A clone (SEQ. ID. No. 13) covering 17 kb of the IL-1β gene containing 7) was obtained.
【００６０】IL-1βターゲティングベクターの構築 IL-1β遺伝子のターゲティングストラテジーを図2に示
す。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）を、ES細胞中での
相同組換えに対する陽性選択マーカーとして、ホスホグ
リセリン酸キナーゼ-1（PGK-1）プロモーターの調節下
において使用した。IL-1β遺伝子の発現をモニターする
ために、β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）（Pharmac
ia）をIL-1β遺伝子中に挿入し、IL-1β-lacZ融合タン
パク質を作製した。 Construction of IL-1β Targeting Vector FIG. 2 shows the targeting strategy of the IL-1β gene. The neomycin resistance gene (neo) was used under the control of the phosphoglycerate kinase-1 (PGK-1) promoter as a positive selection marker for homologous recombination in ES cells. To monitor the expression of the IL-1β gene, the β-galactosidase gene (lacZ) (Pharmac
ia) was inserted into the IL-1β gene to generate an IL-1β-lacZ fusion protein.
【００６１】IL-1βのターゲティングベクターの構築
は、それぞれエクソン3およびエクソン5中のHinc IIお
よびBstX I部位間の成熟IL-1βについてのN-末端コード
領域を含む2.45 kbのDNA断片を削除し、そしてlacZ-pA-
PGK-neo-pAカセットをDNA断片の代わりに挿入した（こ
こではpAはポリAを意味する）（図2）。5'-および3'-末
端の相同領域は、それぞれ1.5 kbおよび3.9 kbであっ
た。Construction of the IL-1β targeting vector removes a 2.45 kb DNA fragment containing the N-terminal coding region for mature IL-1β between the Hinc II and BstX I sites in exon 3 and exon 5. , And lacZ-pA-
The PGK-neo-pA cassette was inserted instead of the DNA fragment (here pA stands for poly A) (FIG. 2). The homology regions at the 5'- and 3'-ends were 1.5 kb and 3.9 kb, respectively.
【００６２】ターゲティングベクターを導入したES細胞
の作製IL-1βのKOマウスの作出 IL-1β遺伝子のターゲティングベクターを前述したよう
に調製した。当該ベクターを導入したES細胞を試験例１
と同一のES培地中でマイトマイシンC-処理したネオマイ
シン耐性初代培養線維芽細胞のフィーダーレイヤー上に
プレーティングし、G418（300μg/ml、GIBCO BRL）を用
いて選択した。G418存在下に生育した1つのESクローン
をプールし、それらからゲノムDNAを単離した。クロー
ンは相同組換えが起こったかどうかを確認するため、プ
ライマーP2：5'-GAG GTG CTG TTTCTG GTC TTC ACC-3'
（SEQ ID No:5）およびP3：5'-GCG AAT GTG TCA CTA TC
T GCC ACC-3'（SEQ ID No:6）を用いて、試験例１と同
一の条件下でPCRによってスクリーニングした。 ES cells transfected with targeting vector
Preparation of IL-1β KO Mouse Targeting vector for IL-1β gene was prepared as described above. Test Example 1 using ES cells transfected with the vector
Were plated on feeder layers of neomycin-resistant primary fibroblasts treated with mitomycin C in the same ES medium as described above and selected using G418 (300 μg / ml, GIBCO BRL). One ES clone grown in the presence of G418 was pooled and genomic DNA was isolated from them. To confirm whether the clone has undergone homologous recombination, primer P2: 5′-GAG GTG CTG TTTCTG GTC TTC ACC-3 ′
(SEQ ID No: 5) and P3: 5'-GCG AAT GTG TCA CTA TC
Using TGCC ACC-3 '(SEQ ID No: 6), screening was performed by PCR under the same conditions as in Test Example 1.
【００６３】さらにES細胞から単離したゲノムDNA中に
目的とする遺伝子が相同組換えされたことを確認するた
めに、XbaI-EcoRI断片を5'プローブ（図2の下段参照）
として、そしてHindIII-HindIII断片を3'プローブ（図2
の下段参照）として使用し、ターゲティングされたIL-1
β遺伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーショ
ン解析を行った。Further, in order to confirm that the gene of interest has been homologously recombined into the genomic DNA isolated from the ES cells, the XbaI-EcoRI fragment was probed with a 5 ′ probe (see the lower part of FIG. 2).
And the HindIII-HindIII fragment as a 3 ′ probe (FIG. 2).
Targeted IL-1
Southern blot hybridization analysis was performed on the β gene.
【００６４】IL-1βのKOマウスの作出 試験例１に記載した方法と同様に、IL-1β遺伝子欠損変
異についてホモ接合体のマウスを作出した。これら作出
されたマウスが目的とする遺伝子欠損を起こしているか
どうかを確認するために、サザンブロットハイブリダイ
ゼーション解析を行った。 Production of IL-1β KO Mice In the same manner as described in Test Example 1, mice homozygous for the IL-1β gene deletion mutation were produced. Southern blot hybridization analysis was performed to confirm whether the generated mice had the desired gene deficiency.
【００６５】サザンブロットハイブリダイゼーション解
析を行った結果、5'プローブによるハイブリダイゼーシ
ョンにより、IL-1β遺伝子の野生型アリル由来のバンド
に相当する10 kbの予想されるバンド、および変異アリ
ル由来のバンドに相当する6.2 kbのDNAバンドを検出し
た。3'プローブおよびneoプローブによりハイブリダイ
ゼーションされるすべてのバンドもまた予想される長さ
であり、それらからターゲティングされるESクローン中
の野生型アリルのうちの一つが、変異遺伝子により正し
く置換されていることを示していた。IL-1β遺伝子のタ
ーゲティング効率は、1/501（0.2％）であった（表
1）。このうちターゲティングされる遺伝子の生殖系列
への導入は、1クローン中１クローンで確認された。As a result of Southern blot hybridization analysis, hybridization with the 5 ′ probe revealed a 10 kb expected band corresponding to the wild-type allele of the IL-1β gene and a band derived from the mutant allele. The corresponding 6.2 kb DNA band was detected. All bands hybridized by the 3 'probe and the neo probe are also of the expected length, and one of the wild-type alleles in the ES clone targeted therefrom has been correctly replaced by the mutant gene It was showing that. The targeting efficiency of the IL-1β gene was 1/501 (0.2%) (Table
1). Of these, the introduction of the targeted gene into the germ line was confirmed in one out of one clone.
【００６６】表現型解析 本試験例において作出されたIL-1β欠損ヘテロ接合体同
士の交配によりIL-1β変異を有するホモ接合体の仔は、
メンデル比に従って産まれることを見いだした。このこ
とから、IL-1βはマウスの胚発生中において重要ではな
いことを示している。IL-1βの変異ホモ接合体マウス
は、SPF条件下では健康で繁殖能力も有していた。 Phenotypic analysis Homozygous offspring having an IL-1β mutation by mating between IL-1β deficient heterozygotes created in this test example were:
Found to be born according to Mendel ratio. This indicates that IL-1β is not important during mouse embryonic development. Mutant homozygous mice for IL-1β were healthy and reproductive under SPF conditions.
【００６７】作出したそれぞれのKOマウス由来免疫系細
胞がどのような表現型を有するかを調べるため、試験例
１において記載した方法と同一の方法によりフローサイ
トメトリー解析を行う。フローサイトメトリー解析によ
れば、T細胞とB細胞の比率、そして脾臓および胸腺にお
けるCD4+T細胞とCD8+T細胞の比率は、IL-1βのKOマウス
において顕著な影響を受けていなかった。In order to examine the phenotype of each KO mouse-derived immune system cell thus produced, flow cytometry analysis is performed by the same method as described in Test Example 1. According to flow cytometric analysis, the ratio of T cells to B cells, and the ratio of CD4 + T cells to CD8 + T cells in the spleen and thymus was not significantly affected in IL-1β KO mice.
【００６８】試験例３：IL-1α/βのKOマウスの作出 IL-1α/βのKOマウスの作出 試験例２において作製したIL-1β遺伝子欠損ES細胞に対
して、さらに試験例１において作製したIL-1α遺伝子タ
ーゲティングベクターを相同組換えにより導入すること
により、IL-1αおよびIL-1βの両方をターゲティングし
たES細胞を作製した。IL-1αのターゲティングベクター
およびIL-1βのターゲティングベクターは、使用する選
択マーカー遺伝子がそれぞれhph遺伝子およびneo遺伝子
と異なるため、それぞれのターゲティングベクターを導
入する際に、選択を容易に行うことができる。 Test Example 3 Production of IL-1α / β KO Mouse Production of IL-1α / β KO Mouse The IL-1β gene-deficient ES cell prepared in Test Example 2 was further prepared in Test Example 1. By introducing the obtained IL-1α gene targeting vector by homologous recombination, ES cells targeting both IL-1α and IL-1β were produced. Since the IL-1α targeting vector and the IL-1β targeting vector use different selectable marker genes from the hph gene and the neo gene, respectively, selection can be easily performed when introducing the respective targeting vectors.
【００６９】このようにして作製したIL-1α/β二重欠
損ES細胞を用いて、上述した方法と同一の方法によりキ
メラマウスを作出し、IL-1α/β二重欠損ホモ接合体マ
ウスを作出した。Using the IL-1α / β double-deficient ES cells thus prepared, a chimeric mouse was produced by the same method as described above, and an IL-1α / β double-deficient homozygous mouse was obtained. Created.
【００７０】表現型解析 本試験例において作出した、IL-1α/βの二重変異を有
するホモ接合体の子供も、メンデル比に従って産まれる
ことを見いだした。このことから、IL-1αおよびIL-1β
の両方とも、マウスの胚発生中において重要ではないこ
とを示している。またIL-1α/βのKOマウスでは、成長
遅延も成長促進もみられなかった（表2）。IL-1α/βの
変異ホモ接合体マウスは、SPF条件下では健康で繁殖能
力も有していた。 Phenotypic Analysis It was found that the homozygous offspring having a double IL-1α / β mutation created in this test example were also born according to the Mendelian ratio. From this, IL-1α and IL-1β
Both show that they are not important during mouse embryonic development. In addition, in KO mice of IL-1α / β, neither growth retardation nor growth promotion was observed (Table 2). Mutant homozygous mice for IL-1α / β were healthy and reproductive under SPF conditions.
【００７１】[0071]
【表２】 [Table 2]
【００７２】実施例１：IL-1raのKOマウスの作出 IL-1ra遺伝子のゲノムDNAクローニング IL-1raのゲノムクローンを、マウスIL-1raのcDNAのうち
分泌型IL-1raのコード領域の全長に相当する42番塩基か
ら599番塩基までの断片をプローブとして用いて、129Sv
Jマウスゲノムライブラリー（λFIXII、Stratagene）か
ら単離した。さらに、IL-1ra遺伝子のゲノム配列のう
ち、エクソン1を含むIL-1raゲノムDNAの5'末端部分のク
ローニングを行うため、SEQ ID No.14の配列中66番塩基
から548番塩基に相当するゲノムDNA断片を使用してクロ
ーニングを行った。 Example 1 Production of IL-1ra KO Mouse Genomic DNA Cloning of IL-1ra Gene The IL-1ra genomic clone was cloned into the full length of the secretory IL-1ra coding region of mouse IL-1ra cDNA. Using the corresponding fragment from base 42 to base 599 as a probe, 129Sv
Isolated from the J mouse genomic library (λFIXII, Stratagene). Furthermore, in the genomic sequence of the IL-1ra gene, in order to perform cloning of the 5′-terminal portion of the IL-1ra genomic DNA including exon 1, it corresponds to nucleotides 66 to 548 in the sequence of SEQ ID No. 14. Cloning was performed using genomic DNA fragments.
【００７３】マウスIL-1raのcDNAのコード領域は、脾臓
cDNAからPCRプライマー、5'-CCTCGG GAT GGA AAT CTG C
TG-3'（SEQ ID No:9）および5'-AGG CCT CGG CAG TAC T
AT TGG-3'（SEQ ID No:10）を用いてPCRにより増幅し
た。マウスIL-1raの523塩基対のゲノムDNAは、プライマ
ー5'-GAC TCG GAG TAC CTG TCA TGC-3'（SEQ ID No:1
1）および5'-GCT CTG GAC ATA TGG CAT GTG-3'（SEQ ID
No:12）を用いて増幅した。PCR法は、94℃にて1分、60
℃にて2分、72℃にて3分を1サイクルとして、40サイク
ル反応させることで行った。得られた断片を配列決定
し、そしてIL-1raのcDNAであることを確認した。The coding region of the mouse IL-1ra cDNA was expressed in the spleen
PCR primer from cDNA, 5'-CCTCGG GAT GGA AAT CTG C
TG-3 '(SEQ ID No: 9) and 5'-AGG CCT CGG CAG TAC T
It was amplified by PCR using AT TGG-3 '(SEQ ID No: 10). The 523 base pair genomic DNA of mouse IL-1ra was prepared using primer 5′-GAC TCG GAG TAC CTG TCA TGC-3 ′ (SEQ ID No: 1).
1) and 5'-GCT CTG GAC ATA TGG CAT GTG-3 '(SEQ ID
No: 12). PCR method is 1 minute at 94 ° C, 60 minutes
The reaction was carried out by performing 40 cycles of 2 minutes at 72 ° C and 3 minutes at 72 ° C. The resulting fragment was sequenced and confirmed to be IL-1ra cDNA.
【００７４】プラークハイブリダイゼーションによる最
初のスクリーニングを行った9×105のファージクローン
の中から、7個の陽性クローンを得た。しかしながら、
その中の1個だけが第二スクリーニングにおいて陽性で
あることが確認された。以前の報告（Zahedi et al., 1
991, J. Immunol., 146, 4228-4233）に従い当該クロー
ンの構造地図を作製したところ、当該クローンはエクソ
ン4から下流を含むIL-1ra遺伝子の15 kbをカバーしてい
た。IL-1ra遺伝子の上流配列を得るために、エクソン1
周辺のIL-1raゲノムDNAについてのプライマーを設計
し、そして別の1×106個のファージクローンをライブラ
リからスクリーニングした。最終的に、IL-1ra遺伝子の
5'領域13 kbを含むクローンを得た。これらの2クローン
により、sIL-1raのすべてのエクソン（エクソン1〜エク
ソン4）を含む、IL-1ra遺伝子の28kbがカバーされた（S
EQ. ID. No:14）。From the 9 × 10 5 phage clones that were initially screened by plaque hybridization, seven positive clones were obtained. However,
Only one of them was confirmed to be positive in the second screening. Previous reports (Zahedi et al., 1
991, J. Immunol., 146, 4228-4233), a structural map of the clone was prepared. As a result, the clone covered 15 kb of the IL-1ra gene including downstream from exon 4. To obtain the upstream sequence of the IL-1ra gene, exon 1
Primers for surrounding IL-1ra genomic DNA were designed and another 1 × 10 6 phage clones were screened from the library. Finally, the IL-1ra gene
A clone containing 13 kb of the 5 'region was obtained. These two clones covered 28 kb of the IL-1ra gene, including all exons of sIL-1ra (exon 1 to exon 4) (S
EQ. ID. No: 14).
【００７５】IL-1raターゲティングベクターの構築 IL-1ra遺伝子のターゲティングストラテジーを図3に示
す。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）を、ES細胞中での
陽性選択マーカーとして、ホスホグリセリン酸キナーゼ
-1（PGK-1）プロモーターの調節下において使用した。 Construction of IL-1ra Targeting Vector The targeting strategy of the IL-1ra gene is shown in FIG. The neomycin resistance gene (neo) is used as a positive selectable marker in ES cells as phosphoglycerate kinase.
-1 (PGK-1) was used under the control of the promoter.
【００７６】IL-1ra遺伝子産物の3種類すべてのアイソ
フォームを破壊するために、分泌型IL-1raに対するコー
ド領域すべてを含むAva IおよびSph I部位間の5.2 kbの
DNA断片を削除し、PGK-neo-pAカセットをDNA断片の代わ
りに挿入した（ここでpAはポリAを意味する）。ジフテ
リア毒素A断片遺伝子（DT）をネガティブ選択のために
ベクターの5'末端にライゲーションした（図3）。5'-お
よび3'-末端の相同領域は、それぞれ1.8 kbおよび4.5 k
bであった。In order to disrupt all three isoforms of the IL-1ra gene product, a 5.2 kb site between the Ava I and Sph I sites containing all coding regions for secreted IL-1ra.
The DNA fragment was deleted and the PGK-neo-pA cassette was inserted instead of the DNA fragment (where pA stands for polyA). The diphtheria toxin A fragment gene (DT) was ligated to the 5 'end of the vector for negative selection (Figure 3). The 5'- and 3'-end homologous regions are 1.8 kb and 4.5 k, respectively.
b.
【００７７】IL-1raのKOマウスの作出 IL-1ra遺伝子のターゲティングベクターを前述したよう
に調製した。当該ベクターを導入したES細胞を血清（JR
H Bioscience）以外は試験例１と同一であるES培地中
で、マイトマイシンC-処理したNHL7細胞のフィーダーレ
イヤー上にプレーティングし、G418（300μg/ml、GIBCO
BRL）を用いて選択した。G418存在下に生育した6つのE
Sクローンをプールし、それらからゲノムDNAを単離し
た。クローンは相同組換えが起こったかどうかを確認す
るため、プライマーP4：5'-GCT GTGATA GCA ACA GTT TG
T ACC-3'（SEQ ID No:7）およびP5：5'-GAC TGC CTT GG
G AAA AGC GCC TCC-3'（SEQ ID No:8）を用いて、試験
例１と同一の条件下でPCRによってスクリーニングし
た。 Production of IL-1ra KO Mice A targeting vector for the IL-1ra gene was prepared as described above. Serum (JR
HBioscience) was plated on the feeder layer of mitomycin C-treated NHL7 cells in the same ES medium as in Test Example 1, and G418 (300 μg / ml, GIBCO
(BRL). 6 E grown in the presence of G418
S clones were pooled and genomic DNA was isolated from them. To confirm whether the clone has undergone homologous recombination, primer P4: 5′-GCT GTGATA GCA ACA GTT TG
T ACC-3 '(SEQ ID No: 7) and P5: 5'-GAC TGC CTT GG
Screening was performed by PCR under the same conditions as in Test Example 1 using G AAA AGC GCC TCC-3 ′ (SEQ ID No: 8).
【００７８】さらにES細胞から単離したゲノムDNA中に
目的とする遺伝子が相同組換えされたことを確認するた
めに、ScaI-HindIII断片を5'上流プローブ（図3の下段
を参照）として使用し、ターゲティングされたIL-1ra遺
伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解
析を行った。Further, in order to confirm that the target gene was homologously recombined in the genomic DNA isolated from the ES cells, the ScaI-HindIII fragment was used as a 5 ′ upstream probe (see the lower part of FIG. 3). Then, Southern blot hybridization analysis was performed on the targeted IL-1ra gene.
【００７９】試験例１に記載した方法と同様に、IL-1ra
遺伝子欠損変異についてホモ接合体のマウスを作出し
た。これら作出されたマウスが目的とする遺伝子欠損を
起こしているかどうかを確認するために、サザンブロッ
トハイブリダイゼーション解析を行った。As in the method described in Test Example 1, IL-1ra
Mice homozygous for the gene-deficient mutation were generated. Southern blot hybridization analysis was performed to confirm whether the generated mice had the desired gene deficiency.
【００８０】5'プローブによるハイブリダイゼーション
により、IL-1ra遺伝子の野生型アリル由来のバンドに相
当する5.0 kbの予想されるバンド、および変異アリル由
来のバンドに相当する7.0 kbのDNAバンドを検出した
（図4）。neoプローブによりハイブリダイゼーションさ
れるすべてのバンドもまた予想される長さであり、それ
らからターゲティングされるESクローン中の野生型アリ
ルのうちの一つが、変異遺伝子により正しく置換されて
いることを示していた。IL-1ra遺伝子のターゲティング
効率は、3/462（0.6％）であった（表1）。このうちタ
ーゲティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、3ク
ローン中2クローン（IL-1ra）で確認された。Hybridization with the 5 'probe detected a 5.0 kb expected band corresponding to the wild-type allele of the IL-1ra gene and a 7.0 kb DNA band corresponding to the mutant allele-derived band. (Figure 4). All bands hybridized by the neo probe were also of expected length, indicating that one of the wild-type alleles in the ES clones targeted therefrom was correctly replaced by the mutated gene. Was. The targeting efficiency of the IL-1ra gene was 3/462 (0.6%) (Table 1). Of these, the introduction of the targeted gene into the germ line was confirmed in 2 out of 3 clones (IL-1ra).
【００８１】表現型解析 本実施例において作出したIL-1ra変異を有するホモ接合
体の子供も、メンデル比に従って産まれることを見いだ
した。このことから、IL-1raもマウスの胚発生中におい
て重要ではないことを示している。IL-1raに対する変異
ホモ接合体マウスもまた、通常は4週齢の離乳前まで野
生型と同様に成長し、生殖能力を有していた。しかしな
がら、その成長は6-8週齢以降遅延し始めた（表3）。こ
の異常は、マウスが加齢するに従って顕著になった。こ
れらの観察から、成長および恒常性の維持におけるIL-1
raの有益な機能が示唆される。 Phenotypic Analysis It was found that homozygous offspring having the IL-1ra mutation created in this example were also born according to the Mendelian ratio. This indicates that IL-1ra is also not important during mouse embryonic development. Mutant homozygous mice for IL-1ra also grew like wild type and were fertile until usually 4 weeks of age before weaning. However, its growth began to delay after 6-8 weeks of age (Table 3). This abnormality became more pronounced as the mice aged. These observations indicate that IL-1 in growth and maintenance of homeostasis
A useful function of ra is suggested.
【００８２】[0082]
【表３】 [Table 3]
【００８３】作出したそれぞれのKOマウス由来免疫系細
胞がどのような表現型を有するかを調べるため、試験例
１において記載した方法と同一の方法によりフローサイ
トメトリー解析を行う。フローサイトメトリー解析によ
れば、T細胞とB細胞の比率、そして脾臓、胸腺およびリ
ンパ節におけるCD4+T細胞およびCD8+T細胞の比率は、10
-12週齢時のIL-1raのKOマウスにおいて顕著な影響を受
けなかった。これらから、体重の増加が起こらないの
は、そのリンパ組織の異常によるものではないことが示
唆された。In order to examine the phenotype of each KO mouse-derived immune system cell thus produced, flow cytometry analysis is performed by the same method as described in Test Example 1. According to flow cytometry analysis, the ratio of T cells to B cells, and the ratio of CD4 + and CD8 + T cells in the spleen, thymus and lymph nodes was 10
It was not significantly affected in IL-1ra KO mice at -12 weeks of age. These results suggested that the lack of weight gain was not due to abnormal lymphoid tissue.
【００８４】実施例２：遺伝子欠損の確認 試験例１〜３および実施例１において作出したIL-1αの
KOマウス、IL-1βのKOマウス、IL-1α/βのKOマウス、
およびIL-1raのKOマウスにおいて、それぞれIL-1α遺伝
子、IL-1β遺伝子、IL-1αおよびIL-1βの両遺伝子、お
よびIL-1ra遺伝子が欠損していることを調べる。腹腔マ
クロファージをLPSにより刺激すると、通常IL-1関連遺
伝子の発現が増加する。この現象をもとに、作出したそ
れぞれのIL-1関連遺伝子のKOマウスについてLPS刺激後
のそれぞれIL-1α遺伝子、IL-1β遺伝子、およびIL-1ra
遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーション法を用い
て調べることにより、それぞれの遺伝子が確実に欠損し
ているかどうかを調べることができる。そこで、それぞ
れのKOマウスから腹腔マクロファージを調製し、LPS刺
激後の腹腔マクロファージ内でのそれぞれの遺伝子の発
現をノザンハイブリダイゼーションにより調べた（図
5）。 Example 2 Confirmation of Gene Deletion IL-1α produced in Test Examples 1 to 3 and Example 1
KO mouse, KO mouse of IL-1β, KO mouse of IL-1α / β,
And KO mice of IL-1ra are examined to be deficient in IL-1α gene, IL-1β gene, both IL-1α and IL-1β genes, and IL-1ra gene, respectively. Stimulation of peritoneal macrophages with LPS usually increases the expression of IL-1-related genes. Based on this phenomenon, the IL-1α gene, the IL-1β gene, and the IL-1ra gene after stimulating LPS for the KO mice of each IL-1 related gene created respectively.
By examining the expression of the gene using the Northern hybridization method, it can be confirmed whether or not each gene is deficient. Therefore, peritoneal macrophages were prepared from each KO mouse, and the expression of each gene in the peritoneal macrophages after LPS stimulation was examined by Northern hybridization (Fig.
Five).
【００８５】2 mlの2％チオグリコレート培地（Nissu
i）を腹腔内（i.p.）投与し、4日後にマウスから腹腔滲
出細胞（PEC）を採取し、そして10％FCSを添加したRPMI
-1640培地（GIBCO）中で培養した。106のPECを60 mmの
ディッシュに数時間または一晩かけて接着させた後、そ
れらを10μg/mlのLPS（O55:B5, Difco）の存在下または
非存在下でインキュベートした。2 ml of 2% thioglycolate medium (Nissu
i) was administered intraperitoneally (ip), 4 days later, peritoneal exudate cells (PEC) were collected from the mice, and RPMI supplemented with 10% FCS
Cultured in -1640 medium (GIBCO). After a 10 6 PEC of adhered over several hours or overnight to 60 mm dishes, they 10 [mu] g / ml of LPS (O55: B5, Difco) and incubated in the presence or absence of.
【００８６】LPS刺激後のPEC細胞から、全RNAを酸性グ
アニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出
法（AGPC法）を用いて単離し、そしてポリA+RNAをQuick
Prep Micro mRNA精製キット（Pharmacia）を用いて精製
した。全RNAまたはポリA+RNAを1.2％変性アガロースゲ
ル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレンに転写し
た。ノザンハイブリダイゼーションは、32P標識したIL-
1α、IL-1βおよびIL-1raのcDNAを使用して（それぞ
れ、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3）、50％
ホルムアミド、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 M NaCl、
5×Denhardt溶液、10％硫酸デキストラン、0.1％リン酸
二ナトリウム、1％SDS、そして200μg/mlサケ精巣DNAを
含むバッファー中42℃で行い、そしてメンブレンは、室
温で1％SDSを含む2×SSCで、そして65℃で1％SDSを含む
0.1×SSCで洗浄した。32P放射活性は、BAS-2000システ
ム（Fuji Film）を用いて測定した。From PEC cells after LPS stimulation, total RNA was isolated using acidic guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction method (AGPC method), and poly A + RNA was isolated from Quick
Purification was performed using Prep Micro mRNA purification kit (Pharmacia). Total RNA or poly A + RNA was electrophoresed on a 1.2% denaturing agarose gel and transferred to a nylon membrane. Northern hybridization, was 32 P-labeled IL-
Using 1α, IL-1β and IL-1ra cDNAs (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, respectively), 50%
Formamide, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M NaCl,
Performed at 42 ° C. in a buffer containing 5 × Denhardt solution, 10% dextran sulfate, 0.1% disodium phosphate, 1% SDS, and 200 μg / ml salmon testis DNA, and the membrane was washed with 2 × In SSC and at 65 ° C with 1% SDS
Washed with 0.1 × SSC. 32 P radioactivity was measured using a BAS-2000 system (Fuji Film).
【００８７】この結果、IL-1αのKOマウス、IL-1βのKO
マウスおよびIL-1raのKOマウスではそれぞれ、IL-1α、
IL-1βおよびIL-1raのmRNA遺伝子の発現は全く検出され
なかった。また、IL-1α/βの二重KOマウスにおいてはI
L-1αおよびIL-1βの両方のmRNAがともに全く検出され
なかった。以上の結果から、これらの遺伝子が完全に欠
損していることが示された（図5）。As a result, the KO mouse of IL-1α and the KO mouse of IL-1β
In mice and IL-1ra KO mice, IL-1α,
No expression of IL-1β and IL-1ra mRNA genes was detected. In the double KO mouse of IL-1α / β,
Neither L-1α nor IL-1β mRNA was detected at all. The above results indicated that these genes were completely deleted (FIG. 5).
【００８８】実施例３：敗血症性ショックに対する感受
性 以前の研究において、IL-1はLPSにより誘導される敗血
症性ショックの主要メディエーターであることが示唆さ
れた（Alexander et al., 1991, J. Exp. Med. 173, 10
29-1032; Ohlsson et al., 1990, Cell 85, 1-4）。IL-
1関連遺伝子欠損マウスの敗血症性ショックに対する感
受性を調べるため、LPS投与後に生じる敗血症性ショッ
ク症状の観察を行った。 Example 3 Sensitivity to Septic Shock
Pre- sex studies suggest that IL-1 is a major mediator of septic shock induced by LPS (Alexander et al., 1991, J. Exp. Med. 173, 10
29-1032; Ohlsson et al., 1990, Cell 85, 1-4). IL-
In order to examine the sensitivity of 1-related gene-deficient mice to septic shock, septic shock symptoms occurring after LPS administration were observed.
【００８９】野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体の
マウスに、高濃度のE. coli由来LPS（O55:B5, Difco）
をi.p.投与した。IL-1αのKOマウスに対しては40μg/g
体重、IL-1βのKOマウスに対しては60μg/g体重、そし
てIL-1raのKOマウスに対しては10μg/g体重を投与し
た。それぞれの実験において別ロットのLPSを使用しな
ければならなかったため、対照マウスにおけるLPSの致
死量を各実験の前に試験した。Wild type, heterozygous and homozygous mice were given high concentrations of LPS from E. coli (O55: B5, Difco)
Was administered ip. 40 μg / g for KO mice with IL-1α
Body weights were administered at 60 μg / g body weight for IL-1β KO mice and at 10 μg / g body weight for IL-1ra KO mice. The lethal dose of LPS in control mice was tested prior to each experiment, as a separate lot of LPS had to be used in each experiment.
【００９０】IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウス
は、野生型マウスおよびヘテロ接合体マウスと同様に致
死量のLPS（40-60μg/g体重）に対して感受性であった
（図6A、B）。これと対照的に、IL-1raのKOマウスは対
照マウスに比べて、致死量以下のLPS（10μg/g体重）に
対してより感受性が高かった（図6C）。The IL-1α KO mice and IL-1β KO mice were as sensitive to lethal LPS (40-60 μg / g body weight) as wild-type mice and heterozygous mice (FIG. 4). 6A, B). In contrast, IL-1ra KO mice were more sensitive to sublethal LPS (10 μg / g body weight) than control mice (FIG. 6C).
【００９１】実施例４：炎症ストレスにおけるIL-1の機
能解析 in vitroにおけるIL-1αとIL-1βの相互誘導 マクロファージは、IL-1、IL-6およびTNF-αを含む炎症
性サイトカインの主要な産生細胞である。IL-1の欠損が
他のサイトカインの誘導に与える影響を調べるために、
チオグリコレート活性化マクロファージを腹腔から採取
し、様々な炎症性サイトカイン遺伝子の発現レベルを、
in vitroにおいてLPS刺激後0、3、6、および12時間の時
点で、ノザンブロットハイブリダイゼーション解析によ
り測定した。マウスIL-6およびTNF-αのcDNAはTakashi
Yokota博士（Institute of Medical Science, Universi
ty of Tokyo）より提供された。IL-1αのKOマウス由来
のマクロファージは、野生型マウス由来マクロファージ
のIL-1βのmRNAと比較して、IL-1β mRNAの発現がほぼ
半減した（図7A）。IL-1βのKOマウス由来のマクロファ
ージにおいても、IL-1α mRNAの発現レベルが低下した
（図7B）。これらの結果から、IL-1αはIL-1βの発現を
誘導することができ、そしてその逆にIL-1βもIL-1αの
発現を誘導することができると考えられる。IL-1ra、IL
-6およびTNF-αの発現レベルは、これらのマウスにおい
て顕著に影響されることはなかった（図7C-図7E）。 Example 4: Mechanism of IL-1 in inflammatory stress
Mutagenesis in vitro Mutagenesis of IL-1α and IL-1β is a major producer of inflammatory cytokines, including IL-1, IL-6 and TNF-α. To investigate the effect of IL-1 deficiency on the induction of other cytokines,
Thioglycolate-activated macrophages were collected from the peritoneal cavity, and the expression levels of various inflammatory cytokine genes were
Measured by Northern blot hybridization analysis at 0, 3, 6, and 12 hours after LPS stimulation in vitro. Mouse IL-6 and TNF-α cDNAs are
Dr. Yokota (Institute of Medical Science, Universi
ty of Tokyo). Macrophages derived from KO mice of IL-1α had almost half the expression of IL-1β mRNA compared to IL-1β mRNA of macrophages derived from wild-type mice (FIG. 7A). In IL-1β KO mouse-derived macrophages, the expression level of IL-1α mRNA also decreased (FIG. 7B). These results suggest that IL-1α can induce IL-1β expression, and conversely, IL-1β can also induce IL-1α expression. IL-1ra, IL
-6 and TNF-α expression levels were not significantly affected in these mice (FIGS. 7C-E).
【００９２】テレピン油誘導局所炎症に対する発熱応答
の機能不全 発熱は、多数の外来性の刺激物質により誘導することが
できる全身性の応答である。IL-1α、IL-1β、TNF-αお
よびIL-6は、内在性の発熱物質であると示唆されてきた
（Kluger, 1991）。マウスの後肢にテレピン油を皮下注
射することにより、局所炎症を引き起こし発熱を誘導す
ることができる。本発明者は、IL-1α/βのKOマウスを
用いて、テレピン油誘導発熱モデルにおけるIL-1の機能
を調べた。 Fever response to turpentine oil-induced local inflammation
Dysfunction heat generation is the response of the systemic, which can be induced by a number of exogenous stimuli. IL-1α, IL-1β, TNF-α and IL-6 have been suggested to be endogenous pyrogens (Kluger, 1991). Subcutaneous injection of turpentine oil into the hind limbs of mice can cause local inflammation and induce fever. The present inventors examined the function of IL-1 in a turpentine oil-induced fever model using IL-1α / β KO mice.
【００９３】オスマウスの腹腔内体温を、電子体温計と
チップ（ELAMSTMシステム、Bio Medical Research Comm
unity）を用いて精度±0.1℃で測定した。マウスをネン
ブタールで麻酔し、そしてチップを腹腔内に移植した。
それぞれの動物を別個のケージにわけ、そして1週間か
けて回復させた。通常の昼-夜体温リズムを、実験前の1
週間測定した。室温は24±1℃に維持した。およそ3ヶ月
齢のマウスに、150μlのテレピン油（Nakarai）を両後
肢の皮下（s.c.）に注射した。体温は正常のレベルに戻
るまで毎日正午に測定した。The intraperitoneal body temperature of a male mouse was measured with an electronic thermometer and a tip (ELAMS ™ system, Bio Medical Research Comm.
unity) with an accuracy of ± 0.1 ° C. Mice were anesthetized with Nembutal and the chips were implanted intraperitoneally.
Each animal was separated into separate cages and allowed to recover over a week. Normal day-night body temperature rhythm, one before the experiment
Measured weekly. Room temperature was maintained at 24 ± 1 ° C. Approximately 3 months old mice were injected subcutaneously (sc) in both hind limbs with 150 μl turpentine oil (Nakarai). Body temperature was measured daily at noon until normal levels returned.
【００９４】図8Aに示したように、IL-1α/βのKOマウ
スにおける発熱応答は、野生型マウスと比較して顕著に
低下し、このことからIL-1αまたはIL-1βのいずれかま
たはその両方が発熱誘導に重要な働きをしていることが
示唆される。次いで、IL-1αとIL-1βの機能を区別する
ために、IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウスを調
べた。IL-1βのKOマウスにおいては、テレピン油を注射
した対照マウスと比較して、テレピン油処置後に顕著な
体温の上昇はなかった（図8B）。一方、IL-1αのKOマウ
スにおいては、注射後1日目から5日目にかけて対照マウ
スと同様に体温上昇し、そして6日目までに正常に回復
した（図8B）。これらの結果は、追試により確認した。
これらの結果から、局所炎症に対する発熱応答におい
て、IL-1βは重要な機能をしているものの、IL-1αはそ
のような機能をしていないことが示された。As shown in FIG. 8A, the fever response of KO mice to IL-1α / β was significantly reduced as compared to wild type mice, indicating that either IL-1α or IL-1β or It is suggested that both play important roles in inducing fever. Next, to distinguish the functions of IL-1α and IL-1β, KO mice of IL-1α and KO mice of IL-1β were examined. There was no significant increase in body temperature following turpentine treatment in IL-1β KO mice compared to control mice injected with turpentine oil (FIG. 8B). On the other hand, in the IL-1α KO mouse, the body temperature increased from day 1 to day 5 after injection in the same manner as the control mouse, and recovered to normal by day 6 (FIG. 8B). These results were confirmed by additional tests.
These results indicated that IL-1β had an important function in the fever response to local inflammation, but IL-1α did not.
【００９５】一方、IL-1raのKOマウスにおける体温の変
化は、テレピン油を注射した対照マウスにおける体温の
変化と比較して、注射後1日目に顕著に大きかった（p<
0.01）（図8C）。IL-1raのKOマウスにおける体温は、テ
レピン油注射後1週間経っても正常の概日的な体温に回
帰しなかった（図8C）。これらの結果から、発熱応答に
おけるIL-1raの有する調節的機能が示唆される。On the other hand, the change in body temperature in KO mice of IL-1ra was remarkably larger on the first day after injection as compared to the change in body temperature in control mice injected with turpentine oil (p <
0.01) (Figure 8C). Body temperature in KO mice with IL-1ra did not return to normal circadian temperature one week after injection of turpentine oil (FIG. 8C). These results suggest a regulatory function of IL-1ra in the fever response.
【００９６】マウス脳におけるテレピン油処理後のIL-1
関連遺伝子の発現抑制 本発明者は、IL-1αの欠損ではなくIL-1βの欠損がテレ
ピン油による発熱の抑制を引き起こす理由について確認
するために、IL-1の欠損およびIL-1raの欠損が、テレピ
ン油注射後の脳内での関連遺伝子の発現に対して与える
影響を調べた。野生型マウスにおいては、テレピン油処
理後6時間の時点でIL-1α mRNAおよびIL-1β mRNAの両
方の誘導が観察され、そして12時間の時点でピークに達
し、その後の発熱反応と一致した（図9A）。両方のmRNA
レベルは類似しており、処理していない対照マウスにお
けるmRNAレベルと比較すると10-20倍高い範囲にあっ
た。興味深いことに本発明者は、IL-1αのmRNA発現がIL
-1βのKOマウスにおいてはほとんど検出されないことを
見いだした。この発現は野生型マウスにおけるIL-1αの
mRNAの発現と比較して1/30以下に抑制されていた（図9
A）。一方、IL-1βのmRNAは、対照マウスのIL-1β mRNA
の発現と比較して1/10に減少したものの、IL-1αのKOマ
ウスにおいては依然として検出することができた。これ
らの結果は、別の2回の実験により確認した。従って、I
L-1βの欠損により、脳内におけるIL-1βの発現だけで
なくIL-1αの発現も消失し、一方IL-1αの欠損によりIL
-1βの発現は完全に抑制されなかったことを示した。 IL-1 after treatment with turpentine oil in mouse brain
In order to confirm why IL-1β deficiency, but not IL-1α deficiency, causes suppression of turpentine-induced fever, the present inventors investigated the absence of IL-1 and IL-1ra deficiencies. The effect of turpentine oil on the expression of related genes in the brain after injection was investigated. In wild-type mice, induction of both IL-1α and IL-1β mRNA was observed at 6 hours after turpentine oil treatment, and peaked at 12 hours, consistent with a subsequent pyrogenic response ( (Figure 9A). Both mRNAs
Levels were similar and ranged 10-20 fold higher when compared to mRNA levels in untreated control mice. Interestingly, we found that IL-1α mRNA expression
It was found that it was hardly detected in -1β KO mice. This expression of IL-1α in wild-type mice
It was suppressed to 1/30 or less compared to mRNA expression (Fig. 9
A). On the other hand, the IL-1β mRNA is the IL-1β mRNA of the control mouse.
Although the expression was reduced to 1/10 as compared with the expression of IL-1α, it was still detectable in KO mice of IL-1α. These results were confirmed by two other experiments. Therefore, I
L-1β deficiency abolishes not only IL-1β expression but also IL-1α expression in the brain, whereas IL-1α deficiency
-1β expression was not completely suppressed.
【００９７】IL-1raのKOマウスにおけるIL-1β mRNAの
発現は、テレピン油注射後12時間の時点で、野生型マウ
スと比較して増加していた。一方、IL-1α mRNAの発現
レベルは影響を受けなかった（図9B）。これらの結果は
IL-1raのKOマウスにおける発熱応答の増大と一致してい
た（図8C）。予想されたように、IL-1α mRNAおよびIL-
1β mRNAのどちらも、IL-1α/βの二重KOマウスにおい
ては検出されなかった（図9B）。The expression of IL-1β mRNA in KO mice of IL-1ra was increased at 12 hours after injection of turpentine oil as compared with wild-type mice. On the other hand, the expression level of IL-1α mRNA was not affected (FIG. 9B). These results are
This was consistent with an increased pyrogenic response in IL-1ra KO mice (FIG. 8C). As expected, IL-1α mRNA and IL-
Neither 1β mRNA was detected in IL-1α / β double KO mice (FIG. 9B).
【００９８】IL-1の発現を発熱と相関させるために、テ
レピン油注射後の脳内特定領域におけるIL-1α mRNAお
よびIL-1β mRNAの発現レベルを、ノザンブロットハイ
ブリダイゼーション解析により調べた。IL-1α mRNAお
よびIL-1β mRNAの強い発現が野生型マウスにおいては
大脳皮質および間脳において観察されたが、一方海馬お
よび小脳においては発現レベルが低かった（図10A）。
体温を調節していると考えられている間脳におけるIL-1
βの発現レベルは、IL-1αのKOマウスにおいては2/3に
低下したが、IL-1βのKOマウスにおいてはIL-1αもIL-1
βも検出されなかった。このことは、IL-1βKOマウスで
のIL-1αの発現が、野生型のIL-1αの発現に比べて1/30
以下に低下したことを示している（図10A）。これらの
データは、IL-1αの欠損がIL-1βの発現に与える影響は
間脳においては脳全体と比べて顕著でなかったが、脳全
体を解析に用いた図9Aのデータと一致する。本発明者は
これらの結果について2種類の別個の実験により確認し
た。これらの結果から、間脳におけるIL-1α遺伝子の発
現がほとんどIL-1βの発現に依存しているが、IL-1βの
発現はIL-1αの発現からは相対的に独立していることが
示される。In order to correlate the expression of IL-1 with fever, the expression levels of IL-1α mRNA and IL-1β mRNA in specific regions in the brain after injection of turpentine oil were examined by Northern blot hybridization analysis. Strong expression of IL-1α and IL-1β mRNA was observed in the cerebral cortex and diencephalon in wild-type mice, while the expression level was low in hippocampus and cerebellum (FIG. 10A).
IL-1 in the brain, which is thought to regulate body temperature
The expression level of β was reduced to 2/3 in KO mice of IL-1α, but in KO mice of IL-1β,
β was not detected. This indicates that the expression of IL-1α in IL-1βKO mice was 1/30 of that of wild-type IL-1α.
The following shows the decrease (FIG. 10A). These data are consistent with the data of FIG. 9A in which the entire brain was used for analysis, although the effect of IL-1α deficiency on IL-1β expression was not significant in the diencephalon compared to the whole brain. We confirmed these results by two separate experiments. These results indicate that the expression of the IL-1α gene in the diencephalon depends almost exclusively on the expression of IL-1β, but that the expression of IL-1β is relatively independent of the expression of IL-1α. Is shown.
【００９９】IL-1αのKOマウス間脳におけるIL-1ra mRN
Aの発現レベルは、野生型マウスのIL-1ra mRNA発現レベ
ルと同様であった（図10A）。これに対して、IL-1ra発
現レベルは、IL-1βのKOマウスにおいて遙かに減少した
（野生型のレベルに対して1/10以下）（図10A）。IL-1r
aのKOマウス間脳におけるIL-1α mRNAおよびIL-1βmRNA
の発現レベルは、野生型マウスのそれぞれの発現と比較
して、1.5倍および2倍高かった（図10B）。これらの結
果から、IL-1raがストレス下においてIL-1発現の抑制物
質として機能している可能性が示唆される。IL-1ra mRN in KO mouse diencephalon of IL-1α
The expression level of A was similar to the IL-1ra mRNA expression level in wild-type mice (FIG. 10A). In contrast, IL-1ra expression levels were much reduced in IL-1β KO mice (less than 1/10 that of wild-type) (FIG. 10A). IL-1r
IL-1α mRNA and IL-1β mRNA in KO mouse diencephalon
Was 1.5- and 2-fold higher compared to the respective expression in wild-type mice (FIG. 10B). These results suggest that IL-1ra may function as a suppressor of IL-1 expression under stress.
【０１００】脳内でのIL-1によるシクロオキシゲナーゼ
（COX-2）の誘導 IL-1は、COX-2遺伝子の転写を誘導することが知られて
いる（Ballou et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 200
44-20050）。COX-2は、プロスタグランジンE2（PGE2）
を含むプロスタグランジン類の合成を触媒する酵素であ
る。PGE2が体内での発熱応答の強力なメディエーターで
あるため（Kluger, 1991, 上述）、テレピン油誘導発熱
中のCOX-2発現を調べた。マウスCOX-1およびCOX-2のcDN
AはShozoYamamoto博士（Tokushima University School
of Medicine）より提供された。図9Aに示したように、
構成的に発現することが知られているCOX-1遺伝子では
なくCOX-2遺伝子の発現は、テレピン油処理後の脳内で3
倍誘導され、12時間の時点でのIL-1発現のピークと一致
した。この誘導は、野生型マウスよりも若干低いもの
の、IL-1αのKOマウスにおいても観察された。対照的
に、テレピン油処理後の脳内COX-2発現の誘導は、IL-1
βのKOマウスにおいては観察されなかった。このことか
ら、IL-1βがCOX-2誘導の主要なメディエーターである
ことが示された（図9A）。 Cyclooxygenase by IL-1 in the brain
Induction of (COX-2) IL-1 is known to induce transcription of the COX-2 gene (Ballou et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 200).
44-20050). COX-2 is a prostaglandin E 2 (PGE 2 )
It is an enzyme that catalyzes the synthesis of prostaglandins containing. Since PGE 2 is a potent mediator of the fever response in the body (Kluger, 1991, supra), the expression of COX-2 during turpentine-induced fever was examined. Mouse COX-1 and COX-2 cDN
A is Dr. ShozoYamamoto (Tokushima University School
of Medicine). As shown in FIG. 9A,
The expression of the COX-2 gene, but not the COX-1 gene, which is known to be constitutively expressed, is 3% in the brain after turpentine treatment.
Fold induction, consistent with the peak IL-1 expression at 12 hours. This induction was also observed in IL-1α KO mice, although slightly lower than in wild-type mice. In contrast, induction of COX-2 expression in the brain after turpentine oil treatment was similar to IL-1
It was not observed in β KO mice. This indicated that IL-1β was a major mediator of COX-2 induction (FIG. 9A).
【０１０１】IL-1raのKOマウスにおけるCOX-2の発現
は、野生型マウスと比較して、12時間の時点で1.5倍高
く、このデータはこれらのマウスにおけるIL-1βの発現
増大と相関していた（図9B）。これらの結果から、COX-
2の発現レベルはIL-1とIL-1raのバランスにより調節さ
れていることが示唆される。The expression of COX-2 in IL-1ra KO mice was 1.5-fold higher at 12 hours compared to wild-type mice, and this data correlates with increased IL-1β expression in these mice. (Figure 9B). From these results, COX-
It is suggested that the expression level of 2 is regulated by the balance between IL-1 and IL-1ra.
【０１０２】間脳におけるCOX-2の発現は、テレピン油
処理後のIL-1βのKOマウスにおいては誘導されなかった
が、一方でIL-1αのKOマウスにおける間脳COX-2の発現
は野生型マウスと同様に誘導された（図10A）。IL-1ra
のKOマウスにおけるCOX-2発現は、野生型マウスのCOX-2
発現と比べて2.5倍高かった。これらのKOマウスにおい
て、脳内における発熱のメディエーター候補であるTNF-
α mRNAの発現レベルは、影響を受けなかった（図9
A）。これらのデータから、COX-2は主としてIL-1βによ
り誘導され、この誘導はIL-1raにより拮抗されることが
示される。The expression of COX-2 in the diencephalon was not induced in KO mice of IL-1β after treatment with turpentine oil, whereas the expression of diencephalic COX-2 in KO mice of IL-1α was wild-type. It was induced in the same manner as in the mouse (Fig. 10A). IL-1ra
COX-2 expression in KO mice
2.5 times higher than expression. In these KO mice, TNF-, a candidate mediator of fever in the brain,
The expression level of α mRNA was not affected (FIG. 9).
A). These data indicate that COX-2 is mainly induced by IL-1β, and this induction is antagonized by IL-1ra.
【０１０３】IL-1のKOマウスにおける、HPA軸活性化の
抑制 急性炎症刺激は、HPA軸の活性化を介して、循環血中コ
ルチコステロン濃度を上昇させることが知られている。
神経-免疫-内分泌系におけるIL-1の機能をさらにはっき
りさせるために、本発明者はIL-1欠損およびIL-1ra欠損
がテレピン油処置後の血清コルチコステロン濃度に対し
て与える影響について調べた。[0103] HPA axis activation in KO mice with IL-1
Suppressed acute inflammatory stimuli are known to increase circulating corticosterone levels through activation of the HPA axis.
To further clarify the function of IL-1 in the neuro-immuno-endocrine system, we investigated the effects of IL-1 and IL-1ra deficiencies on serum corticosterone levels after turpentine oil treatment Was.
【０１０４】テレピン油誘導HPA軸活性化のために、各
実験群5匹のマウスに対して、塩類溶液または100μlの
テレピン油をs.c.に注射し、そして投与後2時間および8
時間の時点で断頭させ、採血を行った。20μlの血清を
蒸留水で1 mlに希釈し、そして4 mlのジエチルエーテル
で抽出した。以前に記載されたように、コルチコステロ
ンに対する特異抗体を用いて、抽出物についてラジオイ
ムノアッセイを行った。テストステロン、プロゲステロ
ンおよびデオキシコルチコステロンに対する抗体の比交
差反応性は、それぞれ0.1％未満、4％そして10％であっ
た。血清中での検出下方限界は、10 ng/mlであった。For turpentine oil-induced HPA axis activation, 5 mice in each experimental group were injected sc with saline or 100 μl turpentine oil and administered 2 hours and 8 hours after administration.
The animals were decapitated at the time point and blood was collected. 20 μl of serum was diluted to 1 ml with distilled water and extracted with 4 ml of diethyl ether. Extracts were subjected to radioimmunoassay using specific antibodies to corticosterone as previously described. The specific cross-reactivity of the antibodies to testosterone, progesterone and deoxycorticosterone was less than 0.1%, 4% and 10%, respectively. The lower limit of detection in serum was 10 ng / ml.
【０１０５】マウスをテレピン油で処置すると、血清コ
ルチコステロン濃度が注射後2時間で2-4倍に増加した。
この時点で、誘導レベルはIL-1α/βのKOマウスおよび
野生型マウスの間で相違はなかった（図11A）。しかし
ながら二次的増加が起こるテレピン油注射後8時間の時
点で、野生型マウスの誘導レベルが3-5倍に増加したの
に対して、IL-1α/βのKOマウスにおいては顕著に低か
った（図11B、p<0.01）。When mice were treated with turpentine oil, serum corticosterone levels increased 2-4 fold 2 hours after injection.
At this point, induction levels did not differ between IL-1α / β KO and wild-type mice (FIG. 11A). However, at 8 hours after turpentine oil injection, where the secondary increase occurred, induction levels in wild-type mice increased 3-5 fold, whereas in IL-1α / β KO mice were significantly lower. (FIG. 11B, p <0.01).
【０１０６】次いで、IL-1と関連する分子種を区別する
ために、IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウスにテ
レピン油を注射し、8時間後の血清コルチコステロン濃
度を測定した。図12Aおよび図12Bにおいて示したよう
に、IL-1βのKOマウスにおいては、血清コルチコステロ
ン濃度は増加しなかった（p<0.001）。これに対して、I
L-1αのKOマウスにおけるコルチコステロン濃度は、対
照マウスと同様に増加した。これらのデータから明らか
に示されるように、IL-1はテレピン油によるHPA軸の初
期の活性化には関与していないが、しかしコルチコステ
ロンの二次的増加は関与しており、IL-1αではなくIL-1
βがこの活性化の主要なメディエーターである。Next, in order to distinguish molecular species related to IL-1, KO mice of IL-1α and KO mice of IL-1β were injected with turpentine oil, and serum corticosterone concentration was measured 8 hours later. did. As shown in FIGS. 12A and 12B, serum corticosterone concentration was not increased in IL-1β KO mice (p <0.001). In contrast, I
Corticosterone levels in L-1α KO mice increased as in control mice. These data clearly show that IL-1 is not involved in the initial activation of the HPA axis by turpentine oil, but that secondary increases in corticosterone are involved, and IL- IL-1 instead of 1α
β is the major mediator of this activation.
【０１０７】IL-1ra欠損の効果もまた調べた。図12Cに
おいて示されるように、IL-1raのKOマウスにおけるテレ
ピン油注射後8時間のコルチコステロン濃度は、ヘテロ
接合体の対照マウスにおけるコルチコステロン濃度と同
様に増加した。従って、IL-1raは、テレピン油処置後の
血清コルチコステロン濃度の調節には関与していないこ
とがわかった。The effect of IL-1ra deficiency was also examined. As shown in FIG. 12C, corticosterone concentrations 8 hours after turpentine oil injection in IL-1ra KO mice were increased similarly to corticosterone concentrations in heterozygous control mice. Therefore, it was found that IL-1ra was not involved in regulating serum corticosterone concentration after turpentine oil treatment.
【０１０８】実施例５：細菌感染に対する宿主防御にお
けるIL-1の機能 L. monocytogenes感染および解析 L. monocytogenes 1b 1684細胞は、Akio Nakane博士（H
irosaki Universityof Medicine）より提供を受けた。
感染のための生存したL. monocytogenesを、0.01 Mのリ
ン酸緩衝化塩類溶液（PBS）により希釈し、感染のため
の様々な濃度にした。 Example 5: Host defense against bacterial infection
Function of IL-1 in L. monocytogenes infection and analysis L. monocytogenes 1b 1684 cells were isolated from Dr. Akio Nakane (H.
irosaki University of Medicine).
Surviving L. monocytogenes for infection were diluted with 0.01 M phosphate buffered saline (PBS) to various concentrations for infection.
【０１０９】感染に使用したIL-1α/βのKOマウスおよ
びIL-1raのKOマウスは、129×C57BL/6ランダム雑種系統
であった。齢が2-4ヶ月齢の間で適合したメスマウスを
使用し、マウスはSPF条件下において飼育した。The IL-1α / β KO mice and IL-1ra KO mice used for infection were 129 × C57BL / 6 random hybrid lines. Female mice aged between 2-4 months were used, and the mice were bred under SPF conditions.
【０１１０】マウスに104CFU（IL-1のKOマウス）または
2×105 CFU（IL-1raのKOマウス）の生存したL. monocyt
ogenesを静脈内（i.v.）注射した。細菌の平板培養のた
めに、動物から注射後2または5日後に肝臓および脾臓を
無菌的に摘出し、重量を測定し、そして1％の3-（（コ
ラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）-1-プロパンス
ルホネート（CHAPS）を含むRPMI-1640培地中で、Dounce
グラインダーを用いて10％のホモジネートを調製した。
組織溶解液は、Triptic大豆アガー（Difco Laboratorie
s, Detroit, Mich.）上で、連続10倍希釈をして平板培
養し、37℃で一晩インキュベートしそしてコロニー数を
計測した。Mice were given 10 4 CFU (KO mice of IL-1) or
Survived L. monocyt of 2 × 10 5 CFU (KO mouse of IL-1ra)
Ogenes were injected intravenously (iv). For bacterial plating, the liver and spleen were aseptically removed from the animals 2 or 5 days after injection, weighed, and 1% 3-((colamidopropyl) dimethylammonio) -1. -Dounce in RPMI-1640 medium containing propane sulfonate (CHAPS)
A 10% homogenate was prepared using a grinder.
Tissue lysate is from Triptic soy agar (Difco Laboratorie
s, Detroit, Mich.), plated at 10-fold serial dilutions, incubated at 37 ° C. overnight, and counted colonies.
【０１１１】死亡曲線のために、マウスのそれぞれの群
に、2×105 CFU（IL-1α/βのKOマウス）または2×106
CFU（IL-1raのKOマウス）の生存したL. monocytogenes
を含む0.2 mlの溶液をi.v.投与した。感染したマウス
は、生存について毎日モニターした。For the death curve, each group of mice received 2 × 10 5 CFU (KO mice with IL-1α / β) or 2 × 10 6
Surviving L. monocytogenes of CFU (KO mouse of IL-1ra)
Was administered iv. Infected mice were monitored daily for survival.
【０１１２】脾臓および肝臓における、L. monocytogen
esの複製 IL-1α/βのKOマウスおよびIL-1raのKOマウスに、L. mo
nocytogenesをi.v.感染させた。非致死量（104 CFU）の
L. monocytogenesをIL-1α/βのKOマウスに対して感染
させた場合、図13Aに示されるように、IL-1α/βのKOマ
ウスは、対照群よりも感染に対してより感受性が高かっ
た。2日目および5日目の時点でのIL-1α/βのKOマウス
脾臓および肝臓における菌数は、対照マウスにおける菌
数よりも高かった。このことから、非特異的（2日目）
および特異的（5日目）の免疫応答が、これらのマウス
においては欠損していたことが示唆される。 L. monocytogen in spleen and liver
es replicating IL-1α / β KO mice and IL-1ra KO mice were
Nocytogenes were infected iv. Non-lethal dose (10 4 CFU)
When L. monocytogenes was infected to IL-1α / β KO mice, IL-1α / β KO mice were more susceptible to infection than the control group, as shown in FIG. 13A. Was. The counts of IL-1α / β in KO mice spleen and liver at day 2 and 5 were higher than those in control mice. From this, non-specific (day 2)
And suggest that a specific (day 5) immune response was defective in these mice.
【０１１３】対照的に、IL-1raのKOマウスには細菌をよ
り高い濃度で感染させた（2×105 CFU）にもかかわら
ず、対照マウスよりも菌数が少なかった。このことか
ら、2日目および5日目の両方において対照マウスよりも
IL-1raのKOマウスの方がより効率的に細菌を排除してい
ることが示唆される（図13B）。In contrast, bacteria were not present in KO mice of IL-1ra.
Higher concentrations (2 x 10Five CFU)
And the number of bacteria was lower than that of control mice. This thing
Compared to control mice on both days 2 and 5.
IL-1ra KO mice eliminate bacteria more efficiently
(FIG. 13B).
【０１１４】L. monocytogenesに対する欠損マウスの感
受性 L. monocytogenesに対する致死性を調べるため、動物を
多量の細菌に感染させた。感染させたマウスは、通常、
感染後4日目および7日目の間に死亡する。図14Aに示す
ように、2×105の細菌を感染させた場合、IL-1α/βのK
Oマウスでは生存率がわずか20-30％を示すのみであるの
に対して、野生型の動物では同量の細菌感染で80％が生
存する。これに対して、IL-1raのKOマウスは、IL-1α/
βのKOマウスを使用した実験よりも10倍量のL. monocyt
ogenesに対してさえも死亡しなかった（図14B）。その
ヘテロ接合体の産仔では、その菌数で50％の死亡率であ
った。これらのデータから、L. monocytogenes感染に対
する宿主防御においてIL-1α、IL-1βおよびIL-1raのバ
ランスがその機能に対して中心的であることが示唆され
る。 Sensitivity of defective mice to L. monocytogenes
Animals were infected with large amounts of bacteria to determine the lethality to the recipient L. monocytogenes. Infected mice are usually
Dies between days 4 and 7 after infection. As shown in FIG.14A, when 2 × 10 5 bacteria were infected, the IL-1α / β K
O mice show only 20-30% survival, while wild-type animals survive 80% with the same amount of bacterial infection. In contrast, KO mice of IL-1ra have IL-1α /
10 times more L. monocyt than in experiments using β KO mice
There was no death even for ogenes (FIG. 14B). Offspring of the heterozygote had a 50% mortality rate based on the bacterial count. These data suggest that the balance of IL-1α, IL-1β and IL-1ra in host defense against L. monocytogenes infection is central to its function.
【０１１５】実施例６：自己免疫疾患におけるIL-1 マウス IL-1raのKOマウスは、実施例１に記載したように作製し
た。IL-1ra遺伝子欠損129×C57BL/6雑種マウスは、IL-1
ra遺伝子の欠損を原因として、C57BL/6またはBALB/cマ
ウスの遺伝的背景のもとでどのような表現系を示すかを
調べる目的で、C57BL/6またはBALB/cのいずれかの系統
に5世代にわたって戻し交配した。戻し交配にかかる時
間を節約するために、人工授精を以下の様に行った。そ
れぞれの世代においておよそ5週齢のヘテロ接合体メス
マウスに、過***処理のために、ろ胞刺激ホルモン（FS
H）および性腺刺激ホルモン（黄体形成ホルモンとし
て、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；hCG）を投与し、野
生型オスマウスと交配した。交配後2日目に、8細胞期胚
を回収し、一晩インキュベートし、そして胞胚を偽妊娠
マウスに移植した。次いで、F5ヘテロ接合体マウスを兄
妹交配させてホモ接合体変異マウスを得た。 Example 6: IL-1 mouse in autoimmune disease KO mice of IL-1ra were prepared as described in Example 1. 129 x C57BL / 6 hybrid mice lacking the IL-1ra gene
In order to determine the phenotype of the C57BL / 6 or BALB / c mice under the genetic background due to the ra gene deficiency, the C57BL / 6 or BALB / c strain Backcrossed for 5 generations. To save the time required for backcrossing, artificial insemination was performed as follows. Heterozygous female mice of approximately 5 weeks of age in each generation were treated with follicle-stimulating hormone (FS) for superovulation.
H) and gonadotropin (human chorionic gonadotropin; hCG as luteinizing hormone) were administered and mated with wild-type male mice. Two days after mating, 8-cell stage embryos were collected, incubated overnight, and blastocysts were implanted into pseudopregnant mice. Then the F 5 heterozygous mice by sib mating obtain a homozygous mutant mice.
【０１１６】臨床評価 関節炎の発生率は、肉眼的に判断する。それぞれの関節
は、腫脹と発赤の程度について毎週調べ、そして重症度
をそれぞれの足について以下のように0から3まで等級づ
ける。等級0＝腫脹なし、赤みなし。等級1＝関節の軽度
の腫脹および／または肉趾の発赤。等級2＝関節の明ら
かな腫脹。等級3＝関節の重度の腫脹および固定。重症
度のスコアは、四肢に対して測定する（個々のマウスに
対して最大12ポイントである）。 Clinical Evaluation The incidence of arthritis is determined visually. Each joint is examined weekly for the degree of swelling and redness, and the severity is rated from 0 to 3 for each foot as follows. Grade 0 = no swelling, no redness. Grade 1 = mild swelling of joints and / or redness of the toes. Grade 2 = obvious swelling of the joint. Grade 3 = severe swelling and fixation of the joint. Severity scores are measured on the limbs (up to 12 points for each mouse).
【０１１７】組織学 踵関節を10％リン酸緩衝化ホルマリン中で固定し、10％
EDTA-4Na中で脱灰し、そしてパラフィンに包埋した。切
片はヘマトキシリン／エオジンで染色した。 Histology The heel joint was fixed in 10% phosphate buffered formalin and
Decalcified in EDTA-4Na and embedded in paraffin. Sections were stained with hematoxylin / eosin.
【０１１８】抗体力価 血清中のIgGおよびIgMの濃度は、酵素結合イムノソルベ
ントアッセイ（ELISA）により以前に報告されたように
決定した。簡単に述べると、ポリビニル製のマイクロタ
イタープレートを、PBS中50μlのモノクローナルラット
抗IgG抗体（γ鎖特異的、0.5μg/ml、Zymed）または抗I
gM抗体（2μg/ml、Zymed）で、4℃で一晩コートした。
血清中のIgGに対する自己抗体（リウマチ因子：RF）の
力価測定には、プレートをTBS（25 mM Tris-HCl、140 m
M NaCl、pH 7.4）中50μlの熱変性ウサギIgGで、4℃で
一晩コートした。プレートをTBSで洗浄した後、プレー
トを1％のスキムミルク（Coop）-5 mM EDTA-0.02％NaN3
-TBS（ブロッキング緩衝液）で、室温で1時間ブロッキ
ングした。次いで50μlのブロッキング緩衝液希釈マウ
ス血清をそれぞれのウェルに添加し、そして室温で1時
間インキュベートした後、0.05％Tween 20-TBSで洗浄し
た。ブロッキング緩衝液中50μlのアルカリフォスファ
ターゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Zymed, San Francisc
o, CA）または抗マウスIgM抗体（Zymed、1/250希釈）を
二次抗体として添加し、そして室温で1時間インキュベ
ートした。Tween 20-TBSで洗浄した後、50 mM NaHCO3-5
mM MgCl2（pH 9.5）中1 mg/ml p-ニトロフェニルリン
酸（Sigma Chemical Co.）100μlを添加し、そして室温
で1時間インキュベートした後、415 nmでの吸光度をELI
SAマイクロリーダー（Colona, MTP-120）により測定し
た。Antibody titers The concentration of IgG and IgM in serum was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as previously reported. Briefly, a microtiter plate made of polyvinyl was added to 50 μl of monoclonal rat anti-IgG antibody (γ-chain specific, 0.5 μg / ml, Zymed) or anti-I
Coated with gM antibody (2 μg / ml, Zymed) at 4 ° C. overnight.
For titration of autoantibodies (rheumatic factor: RF) against IgG in serum, plates were washed with TBS (25 mM Tris-HCl, 140 mM
M NaCl, pH 7.4) was coated overnight at 4 ° C. with 50 μl of heat-denatured rabbit IgG. After washing the plate with TBS, the plate was washed with 1% skim milk (Coop) -5 mM EDTA-0.02% NaN 3
Blocking was performed with -TBS (blocking buffer) at room temperature for 1 hour. Then 50 μl of blocking buffer diluted mouse serum was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature before washing with 0.05% Tween 20-TBS. 50 μl of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody in blocking buffer (Zymed, San Francisc
o, CA) or anti-mouse IgM antibody (Zymed, 1/250 dilution) was added as a secondary antibody and incubated for 1 hour at room temperature. After washing with Tween 20-TBS, 50 mM NaHCO 3 -5
After addition of 100 μl of 1 mg / ml p-nitrophenyl phosphate (Sigma Chemical Co.) in mM MgCl 2 (pH 9.5) and incubation for 1 hour at room temperature, the absorbance at 415 nm was measured by ELISA.
The measurement was performed using an SA microreader (Colona, MTP-120).
【０１１９】加齢IL-1raのKOマウスにおける、リンパ組
織の拡張 IL-1raのKOマウスの体重増加が不十分であるため、それ
らマウスを6ヶ月まで飼育し、その身体的状態を観察し
た。IL-1raのKOマウスは、そのヘテロ接合体産仔と比べ
て6ヶ月齢の時点でかなり痩せていた（p<0.02）。129×
C57BL/6の背景を有するIL-1raのKOマウスのほとんどす
べてにおいて、巨脾腫症（splenomegaly）が観察された
（図15A）。脾臓細胞数は、脾臓重量にしたがって増加
した（表4）。IL-1raのKOマウスがそのヘテロ接合体産
仔より小型であるため、脾臓重量／体重比はIL-1raのKO
マウスにおいてより顕著に増加した（p<0.05、オスマウ
スおよびメスマウスの両方において）。これらマウスの
脾臓細胞の全数は増加したが、FACS解析ではT細胞およ
びB細胞、そして脾臓中のCD4+細胞およびCD8+細胞の集
団中に明らかな変化はないことが示された（図15C）。
これと対照的に、リンパ節細胞集団は若干影響を受ける
ようであった。B220+細胞の比率はヘテロ接合体産仔と
比較して3.5倍に増加した（図15D）。IL-1raのKOマウス
の巨脾腫症と比べてそれほど顕著ではなかったが、IL-1
raのKOマウスのリンパ節腫脹も観察された（図15B）。 Lymphoid groups in aging IL-1ra KO mice
Due to insufficient weight gain of KO mice with expanded IL-1ra, we bred them for up to 6 months and observed their physical condition. IL-1ra KO mice were significantly leaner at 6 months of age than their heterozygous offspring (p <0.02). 129 ×
Splenomegaly was observed in almost all of the IL-1ra KO mice with a C57BL / 6 background (FIG. 15A). Spleen cell numbers increased with spleen weight (Table 4). Since the IL-1ra KO mice are smaller than their heterozygous offspring, the spleen weight / body weight ratio is
It was more pronounced in mice (p <0.05, in both male and female mice). Although the total number of spleen cells in these mice increased, FACS analysis showed no apparent changes in the populations of T and B cells, and CD4 + and CD8 + cells in the spleen (FIG. 15C). .
In contrast, the lymph node cell population appeared to be slightly affected. The ratio of B220 + cells increased 3.5-fold compared to heterozygous offspring (FIG. 15D). Although less pronounced compared to splenomegaly in KO mice with IL-1ra, IL-1ra
Lymphadenopathy was also observed in ra KO mice (FIG. 15B).
【０１２０】[0120]
【表４】 ｎ；実験で用いたマウスの数* 平均±SDを示した。 § p<0.05IL-1raのKO BALB/cマウスにおける関節炎の発症 本発明者は、異常リンパ組織および異常免疫応答が129
×C57BL/6の背景を有するIL-1raのKOマウスにおいて観
察されたことを示した。近交系IL-1raのKOマウスにおい
て免疫応答を研究するために、これらのマウスをC57BL/
6およびBALB/cの背景を有するマウスと戻し交配を行っ
た。興味深いことに、BALB/c系統と戻し交配したIL-1ra
のKOマウスにおいては、関節炎に似た関節の腫脹および
赤みが観察された。関節腫脹は後跂において顕著であっ
た（図16A）。これらの表現型は、5週齢で早くもあらわ
れ始め、そして発症率はマウスが13週齢を迎える頃まで
徐々に増加した（図18A）。13週齢までにすべてのIL-1r
aのKOマウスは関節炎を発症したが、野生型またはヘテ
ロ接合体産仔では全く起こらなかった。[Table 4] n: Number of mice used in the experiment * mean ± SD was shown. § p <0.05 Development of arthritis in KO BALB / c mice with IL-1ra.
X IL-57a / 6 background with IL-1ra KO mice. To study the immune response in inbred IL-1ra KO mice, these mice were cloned into C57BL /
Backcrossing was performed with mice having a background of 6 and BALB / c. Interestingly, IL-1ra backcrossed with the BALB / c strain
In KO mice, joint swelling and redness similar to arthritis were observed. Joint swelling was prominent in the posterior ribs (FIG. 16A). These phenotypes began to appear as early as 5 weeks of age, and the incidence gradually increased until the mice reached 13 weeks of age (FIG. 18A). All IL-1r by 13 weeks of age
The KO mice in a developed arthritis but did not occur in wild-type or heterozygous offspring.
【０１２１】関節炎スコアはまた、IL-1raのKO BALB/c
マウスにおいて徐々に増加し（図18B）、そして患った
マウスのほとんどすべてにおいて、13週齢時に重度の腫
脹と赤みが両側の足関節にみられた（6ポイント）。関
節炎の発生率およびスコアは、オスとメスとで顕著な相
違はなかった（図18）。The arthritis score was also determined by the IL-1ra KO BALB / c
Gradually increased in mice (FIG. 18B), and almost all affected mice showed severe swelling and redness at 13 weeks of age in the bilateral ankles (6 points). The incidence and score of arthritis were not significantly different between males and females (FIG. 18).
【０１２２】組織学的解析により、IL-1raのKO BALB/c
マウスにおいて、肉芽組織の侵襲により引き起こされる
関節のびらんを伴う顕著な滑膜炎症および関節周囲炎が
示された（図16BおよびC）。滑膜細胞の増殖および好中
球の侵襲、そしてフィブリンの沈着が、関節腔内で観察
された（図16Cおよび図17D）。関節のびらんは顕著であ
り、そして破骨細胞が観察された（図17E）。これらの
炎症性像は足根骨関節および中足骨関節において、そし
てさらにいくつかのケースでは、距骨および脛骨中でみ
られた。足関節の病変はヒトの関節リウマチの病変と類
似した。この結果から、これらのマウスは関節リウマチ
の病態モデルとして利用できることが分かった。Histological analysis revealed that KO BALB / c of IL-1ra
Mice showed marked synovial inflammation and periarthritis with joint erosion caused by invasion of granulation tissue (FIGS. 16B and C). Synovial cell proliferation and neutrophil invasion and fibrin deposition were observed in the joint cavity (FIGS. 16C and 17D). Joint erosion was prominent and osteoclasts were observed (FIG. 17E). These inflammatory features were found in the tarsal and metatarsal joints and, in some cases, in the talus and tibia. Lesions of the ankle joint were similar to those of human rheumatoid arthritis. These results indicate that these mice can be used as a pathological model for rheumatoid arthritis.
【０１２３】一方、C57BL/6系統と戻し交配したIL-1ra
のKOマウスは、6ヶ月齢時点でも関節炎を発症しなかっ
た。このことから、疾患に対する遺伝的背景の影響が示
唆された。On the other hand, IL-1ra backcrossed with the C57BL / 6 line
KO mice did not develop arthritis even at 6 months of age. This suggested the effect of genetic background on the disease.
【０１２４】IL-1raのKO BALB/cマウス血清におけるIg
濃度 RAの発症において自己免疫の関与が示唆されるため、本
発明者は関節炎を起こしているIL-1raのKOマウスにおけ
る血清中自己抗体濃度を測定した。これらKOマウスの血
清中IgM濃度は、その対照産仔と比較して上昇していな
かった（図19A）。 Ig in IL-1ra KO BALB / c Mouse Serum
Since the involvement of autoimmunity in the onset of the concentration RA was suggested, the present inventor measured the serum autoantibody concentration in KO mice of IL-1ra having arthritis. The serum IgM levels of these KO mice were not elevated compared to their control offspring (FIG. 19A).
【０１２５】次いで本発明者は、IgGクラスRFの血清濃
度を測定した。図19Bに示されるように、マウス間の変
化は比較的大きいものの、血清中RF濃度はこれらのKOマ
ウス中で増加した。RF濃度は、必ずしも関節炎の重症度
スコアとは相関しなかった。関節炎を発症しなかった野
生型産仔およびIL-1raのKOマウスのヘテロ接合体産仔中
では、RF濃度の上昇はみられなかった。この結果、これ
らのマウスでは自己抗体価が上昇しており、自己免疫疾
患のモデルとして利用できることが示された。Next, the present inventors measured the serum concentration of IgG class RF. As shown in FIG. 19B, although the inter-mouse changes were relatively large, serum RF levels increased in these KO mice. RF levels did not always correlate with arthritis severity scores. RF levels were not increased in wild-type offspring that did not develop arthritis and in heterozygous offspring of IL-1ra KO mice. As a result, the autoantibody titer was increased in these mice, indicating that they can be used as a model for autoimmune diseases.
【０１２６】[0126]
【配列表】 <110> Oriental Yeast Industry Co. Ltd. Yoichiro, IWAKURA <120> Knockout model animal for Interleukin-1 associated diseases. <130> 981207 <160> 14 <210> 1 <211> 1974 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 alpha gene. <400> 1 aagtctccag ggcagagagg gagtcaactc attggcgctt gagtcggcaa agaaatcaag 60 atggccaaag ttcctgactt gtttgaagac ctaaagaact gttacagtga aaacgaagac 120 tacagttctg ccattgacca tctctctctg aatcagaaat ccttctatga tgcaagctat 180 ggctcacttc atgagacttg cacagatcag tttgtatctc tgagaacctc tgaaacgtca 240 aagatgtcca acttcacctt caaggagagc cgggtgacag tatcagcaac gtcaagcaac 300 gggaagattc tgaagaagag acggctgagt ttcagtgaga ccttcactga agatgacctg 360 cagtccataa cccatgatct ggaagagacc atccaaccca gatcagcacc ttacacctac 420 cagagtgatt tgagatacaa actgatgaag ctcgtcaggc agaagtttgt catgaatgat 480 tccctcaacc aaactatata tcaggatgtg gacaaacact atctcagcac cacttggtta 540 aatgacctgc aacaggaagt aaaatttgac atgtatgcct actcgtcggg aggagacgac 600 tctaaatatc ctgttactct aaaaatctca gattcacaac tgttcgtgag cgctcaagga 660 gaagaccagc ccgtgttgct gaaggagttg ccagaaacac caaaactcat cacaggtagt 720 gagaccgacc tcattttctt ctggaaaagt atcaactcta agaactactt cacatcagct 780 gcttatccag agctgtttat tgccaccaaa gaacaaagtc gggtgcacct ggcacgggga 840 ctgccctcta tgacagactt ccagatatca taaaagcagc cttatttcgg gagtctattc 900 acttgggaag tgctgacagt ctgtatgtac catgtacagg aaccttcctc accctgagtc 960 acttgcacag catgtgctga gtctctgtaa ttctaaatga atgtttaccc tctttgtaag 1020 agaagagcaa accctagtgg agccaccccg acatatgata ctatctgtta ttttaaagag 1080 taccctatag tttgctcagt actaatcatt ttaattacta ttctgcatgg cattcttagg 1140 aggatcaaaa agactctaca catattacag atgggttaac aaagggataa aacaactgaa 1200 aagcacactc aatgcatttg gaatataaat tcacagacca atctcactgt gcaccttcgg 1260 cttcaaaatg ccagttgagt aggataaagg tataagaact taatgctgtc attttcaaaa 1320 ggaaggggac aatagctaca tctttcctac ctcagtgggt tttactccag tgagatcatt 1380 tggatgaaat cctcctgtaa cagacctcaa gaaggagaca gactgttgaa tgttattttt 1440 aagttatttt atatatgtat ttataaatat atttatgata attatattat ttatggaaca 1500 tccttaaatc ctctgagctt gacaggcatc ctcacagcag gattttctag gtggtcagtt 1560 agatatagtt tcctctagag caccatgcta cagactttac actttttcca cagccacgaa 1620 gctctctgta cattcctgta cttgggagcc ctttcatcat gatcttaatc tgtactgttt 1680 actttgttca tctaaaatga taattgagtc agtctttttc cctcccatcc ttaaagctgt 1740 ctgggtattc ttacatcatt cagtctcacc tgtaactaac accaaccatc taaagatgga 1800 aagagcttaa ctgtgacaac cacatcactg ttacctgaag tttcttttct agaatgtaat 1860 cagtgtttcc cctggattcc aatttttttt tcaaaccaca gtatcatgta actatcaaca 1920 ataacaatca actcattatt attaatcata attaaataaa acaagtttga gctg 1974 <210> 2 <211> 1339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 beta gene. <400> 2 tgcagggttc gaggcctaat aggctcatct gggatcctct ccagccaagc ttccttgtgc 60 aagtgtctga agcagctatg gcaactgttc ctgaactcaa ctgtgaaatg ccaccttttg 120 acagtgatga gaatgacctg ttctttgaag ttgacggacc ccaaaagatg aagggctgct 180 tccaaacctt tgacctgggc tgtccagatg agagcatcca gcttcaaatc tcacagcagc 240 acatcaacaa gagcttcagg caggcagtat cactcattgt ggctgtggag aagctgtggc 300 agctacctgt gtctttcccg tggaccttcc aggatgagga catgagcacc ttcttttcct 360 tcatctttga agaagagccc atcctctgtg actcatggga tgatgatgat aacctgctgg 420 tgtgtgacgt tcccattaga cagctgcact acaggctccg agatgaacaa caaaaaagcc 480 tcgtgctgtc ggacccatat gagctgaaag ctctccacct caatggacag aatatcaacc 540 aacaagtgat attctccatg agctttgtac aaggagaacc aagcaacgac aaaatacctg 600 tggccttggg cctcaaagga aagaatctat acctgtcctg tgtaatgaaa gacggcacac 660 ccaccctgca gctggagagt gtggatccca agcaataccc aaagaagaag atggaaaagc 720 ggtttgtctt caacaagata gaagtcaaga gcaaagtgga gtttgagtct gcagagttcc 780 ccaactggta catcagcacc tcacaagcag agcacaagcc tgtcttcctg ggaaacaaca 840 gtggtcagga cataattgac ttcaccatgg aatctgtgtc ttcctaaagt atgggctgga 900 ctgtttctaa tgccttcccc agggcatgtg aaggagctcc cttgtcatga atgagcagac 960 agctcaatct ctaggacact ccttagtcct cggccaagac aggtcgctca gggtcacaag 1020 aaaccatggc acattctgtt caaagagagc ctgtgtttcc tccttgcctc tgatgggcaa 1080 ccacttacct atttatttat gtatttattg attggttgat ctatttaagt tgattcaagg 1140 ggacattagg cagcactctc tagaacagaa cctagctgtc aacgtgtggg ggatgaattg 1200 gtcatagcct tgcacttgag gtctttcatt gaagctgaga ataaataggt tcctataata 1260 tggatgagaa tttttatgaa tgaagcatta gcacattgct ttgatgagta tgaaataaat 1320 ttcattaaac aaacaaaca 1339 <210> 3 <211> 1877 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 3 ccctgaaatg gcagtcgcta gtctctattg ccttgctgtg gcctcgggat ggaaatctgc 60 tggggaccct acagtcacct aatctctctc cttctcatcc ttctgtttca ttcagaggca 120 gcctgccgcc cttctgggaa aagaccctgc aagatgcaag ccttcagaat ctgggatact 180 aaccagaaga ccttttacct gagaaacaac cagctcattg ctgggtactt acaaggacca 240 aatatcaaac tagaagaaaa gatagacatg gtgcctattg accttcatag tgtgttcttg 300 ggcatccacg ggggcaagct gtgcctgtct tgtgccaagt ctggagatga tatcaagctc 360 cagctggagg aagttaacat cactgatctg agcaagaaca aagaagaaga caagcgcttt 420 accttcatcc gctctgagaa aggccccacc accagctttg agtcagctgc ctgtccagga 480 tggttcctct gcacaacact agaggctgac cgtcctgtga gcctcaccaa cacaccggaa 540 gagcccctta tagtcacgaa gttctacttc caggaagacc aatagtactg ccgaggcctg 600 taataatcac caactgcctg atcactctgg ccatcattgg ggcctgagga acaacttttg 660 cagggtgtat gtacagtaga aggagacaga agagttctga tgatagatct ctgcctcagt 720 ctgttggctg gcctaatccc catgatgatt ccagaataat cttgcaaatt ggatcatggc 780 aggtgcttgt tcaaagccct ttcttgttgc ctctgccatc tgggtgaagt ctagaccact 840 tgcttggcct aggtgtcttc tgctctacca cccaccctac ccctgccaca aacacacact 900 ttttttgttt ttgttttttc cattgttctg cacttccaca gtccagacca atcaagtcac 960 ttgacaatat gccccaagtg actcccttac cctgttttat aaacctgtgc ctgtctatgg 1020 agaaggtttt aattctcctt gttattcatt ttgggctttt tgatgaaacc accagggcat 1080 cacatatact aagcatgtgc tctaccatca tgctatgctt ccagctcagg ggggcacttt 1140 taaggatcta gaaaacagaa attaaggatc tcatagttat tttattaggc cagccttatt 1200 ccatgtcggc aagaggtttc ttgtggaaat tatgtccttt ctgagaggag ctggggatta 1260 gatgctcctg catttgtgaa atggttataa gcatagaaaa ataggtggta agctttcctt 1320 ctttccttat tttgtgtgat gccttaaact gaaaagttaa aaattgatgg attgtagcat 1380 tcccataatc tcccccttct ttttttttcc tttggaaatg tccaatagtc tatattcctc 1440 tgtcccgccc aaacaccatc ttcactccaa gcctaccaca gatgcctgaa gaagttcctc 1500 actatctgca aatgtggctc tcaggccctt cctgatgtga tgaatgaatc tactaatcat 1560 ttcttgacca ttcattttat cacttctaac cttgaaacat gtggaagtag ctatgttcct 1620 gactgtttcc tctgccagac aatgaactct ggagatcagg gagcttcgtg tgtgtgtgtg 1680 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg tgcgcgcgca cgtgcatgca catgctatgt 1740 attgggtccc tccaaggatg aaccctctct ttggcttaga aggcactcag agaatatgtg 1800 ttattcgtgc tcacggaaag tttcttactc atccctgtga ctttggcttt attttacaat 1860 aaaacactga aaatgtc 1877 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 alpha. <400> 4 cttggccata ctgcaaaggt catg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence in lacZ-pA cassette. <400> 5 gaggtgctgt ttctggtctt cacc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 beta. <400> 6 gcgaatgtgt cactatctgc cacc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 receptor antagonist. <400> 7 gctgtgatag caacagtttg tacc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence in neo cassette. <400> 8 gactgccttg ggaaaagcgc ctcc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying cDNA sequence for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 9 cctcgggatg gaaatctgct g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying cDNA sequence for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 10 aggcctcggc agtactattg g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying genomic sequence of IL-1 receptor antagonis t gene. <400> 11 gactcggagt acctgtcatg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying genomic sequence of IL-1 receptor antagonis t gene. <400> 12 gctctggaca tatggcatgt g 21 <210> 13 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Genome sequence of mouse IL-1 beta gene <400> 13 aagtgcgtgt ctctccagaa gcccctgcta acacagttga tggagagcac agaagcacca 60 tccagttacc aaactccaac tgcaaagctc cctcagctta agcacaagga ggcgagagag 120 gtgacacact tctgggtgtg catctacgtg cctacctttg ttccgcacat cctgacttaa 180 aatgtacagc taacccagga aaacccaata tttttaatat tgacaccatc tgcacaattg 240 tccaggggga aataatgccc atttccacca cgatgacaca cttgcgaatg tgtcactatc 300 tgccacccct tgacttccag ggattagaaa ttatttcagg gtagcaatag cctcttcccc 360 taagaattcc catcaagctt ctcccccctc ccccaccctt cagttttgtt gtgaaatcag 420 ttaacccaag ggaaaatttc acagctcttc acttctgctt tttaggacta taaaacaagg 480 gagggaaaac aagttggaca acaaaccctg cagtggttcg aggcctaata ggctcatctg 540 ggatcctctc cagccaagct tccttgtgca agtaagtctc tctctctctc tgtctctctc 600 tctctctgtc tctctctatc tctctctctc tgtctctctc tctctgtctc tgtctgtctc 660 tctctctgtc tctgtctgtc tatctctctc tctctctgtc tgtctctgtc tctctctgtc 720 tgtctctctc tgtctctctg tctctctctc tgtctctctc tgtctctctc tctctctctc 780 tttccccccc ccccactgat ggactttggg ctttttattt ataaaaagta gctgtacctc 840 catggtttgt gaagtactct ggaaatgagt actgtctgta tagccgctga catctaaaag 900 gcagctcctg tcttgtagga aagcttcttt attagggttt ggctctgctg ttgcttcctt 960 ccagagcatc ttcctaatgc tgttccccat gttgtagtga ccccccacac accctaaaat 1020 tattttcatt gctacttcat aactataatt ttgctactgt tatgaagtgt aaatatctgt 1080 gttatccaat ggtcttaggt gacccctgtg aaagggccac ttgactccaa aagggccact 1140 ggtctagacc tatacaacgg ctcctccgtt ccttcattcc tcagagacca gtttagcatg 1200 cctgccctga actagagcta agagaaacac atatgaagga cgcccctcgg ggagctaacg 1260 ctggatgccc acccactttc tttcttcaca caggtgtctg aagcagctat ggcaactgtt 1320 cctgaactca actgtgaaat gccacctttt gacaggtcag tgggtactgg agagtggtca 1380 catatccagc actctgcttt caggaatgga gggctatcta ctttcagagg ccagagagtt 1440 ccccaactca tctccttcag tggctataga gttcaagcaa cctagcttaa agactgacct 1500 cttcactccc aagcccaacc tagggactta ggtgctgtca ctacagggac tcctacagat 1560 gcaatggtaa gaaaaacttc cacatggaca ggataagaga ctcttttgca aagtctggct 1620 tggaagcaaa aggcagagag ctcagacttt agctaactct gctagtctag aatttaggtg 1680 tcagaagtca acagagagca accagagcac ccacttacct ggcccagaat ctgcttctag 1740 actgttactt acgtagcact gtagaacttc ccagaagtct ttgggaagct ttaagagtca 1800 tggtaggtgt ggttttatga acaatggaag tctgtctgct cagtattgat aaggagctat 1860 cacttgacca catctgtttt cattacagtg atgagaatga cctgttcttt gaagttgacg 1920 gaccccaaaa gatgaaggtg agactctgag cttggctcct aacctgtgga gggactgtgg 1980 catgggaaaa aaaaacccaa acgggaaggg atatgggact gccttgctcc caggctattt 2040 tgtgatggga ttattttgcc tctttcagtg acatagataa ggcaacccac acactgacct 2100 ggctcccaca caggtttcat ttaccacagc cacagaccaa ggcttgctga tggcaatcat 2160 ggtcttttat gctaagaaga cagtatggtc ttcaacatac atttagtccc cccttgagag 2220 agatggagct taatctgacc acttaaatcg aactctggat ctagagagca tgaccttcag 2280 aattagcatc tcttccttct ctgccaaaga ccagtttcgc atgttcctgg ggagattaag 2340 ataataagaa ataagtgata taaacaaaaa gttagttagg atttttaaaa ataacctgtg 2400 gccttagaca agacctttca ttgctgtgtg atcatagaca gtccccactg tgtcctttgg 2460 gaaacacagg tcagaagatc tctgaaatgt tggcgatctg tcacaacctt ccattctgaa 2520 gtgttttaag tgctggccaa gtccatccta gcacaagggc acctttccag acttgctctc 2580 atgaagagcc atgttgcatc ccagcttgcc cttcctatga tgactgagaa cgctctaatg 2640 ccacatggcg tcagtccagc cacgtcactg cccactcagg aggcagctgt ttctctcaga 2700 cctcttccca atccctcaac agtctccccc agctacagaa tctagtcctt agcttacatg 2760 aatgtatttt aagaccactc taactagtta gttcagcctt gggtgacgcc tctcactttc 2820 cagccaggct ctgtccccac tgcctgctcc agaacatggc tttccctgga gcctctactc 2880 tggacagaaa cttctctccc aatcaacctt tcctttacac tattgaaatg atctatcgct 2940 gtccttcaag ctttgaaact gttatcatgc ctcaaggcaa ctgtgtttag gccttaatgt 3000 ggtgtttctc caaagaacag aaaagtggtg acatatttta caaacaaaag ctatgcttat 3060 agtgtctgct aaatattcct atgagaaaaa gaatgtatgg gaagccattg agagcctgtt 3120 gggtgatctc cgttgaatag aagacaacat gacatactga catgagaaat taaataacat 3180 gatgtttgag cagcaaggat accaaaagat gaaacgttta agtaggtcta attatacagt 3240 gaggcaaggt ctgtacaaga aagataaagt agaaatgagg tttactatag agaatgccag 3300 gaagcctgtg tctggttgcc atgtacccct gggtaggcca attaaattct ctgggctcca 3360 catagacagg gattgtggtt aagaacttat ctcccgggcc cttggtgttc tctggggttg 3420 atgtaggagt cctctggtct gatgacttga tgtgctcact gcctggtttc tccacagggc 3480 tgcttccaaa cctttgacct gggctgtcct gatgagagca tccagcttca aatctcgcag 3540 cagcacatca acaagagctt caggcaggca gtatcactca ttgtggctgt ggagaagctg 3600 tggcagctac ctgtgtcttt cccgtggacc ttccaggatg aggacatgag caccttcttt 3660 tccttcatct ttgaagaagg tacttaatga ggactgagag cagacagcag accttcgctc 3720 tggtccttct cagcccacct cttagaactc acacgcccct caagtgcaag acccttagtg 3780 ctagacattc caaccattag aagaaaatga ggaaacctcc aaacaaatca gttctatctt 3840 gagctgatta acttataaaa aggctttaat gatgcttaca cttgcaactc aaccattgac 3900 ttgccaagta ctttggctta tactagaggt tgtgaatctc acaatttccc agttaagctg 3960 gtcttattac tggcatcgtt tcatgcaagg accactactg ctagtcccta gtgactggtt 4020 ataacactgc agcttatctc acgatgccaa atccaatgtt gttgcccagc ccactcccag 4080 tgtttttata cccccactaa aattagaata gaatcttgac tgcacatgct taggtgttgc 4140 tcaataagcc aaattctgct gcttcacttc acagtgcttg catttctaat tatctgccta 4200 aacaacatct gctcttgaac tttcagagcc catcctctgt gactcatggg atgatgatga 4260 taacctgctg gtgtgtgacg ttcccattag acaactgcac tacaggctcc gagatgaaca 4320 acaaaaaagc ctcgtgctgt cggacccata tgagctgaaa gctctccacc tcaatggaca 4380 gaatatcaac caacaaggta agtaggagca tcttggtttc cctttctggc ctcctggcag 4440 cctactgggt ccctgtgttt taaaatggaa cactatggtc attatacaaa aaaagaaaag 4500 gaaaaagaaa gggaaaggaa agaaggaagg aaggagagag agacagagac agagacagag 4560 acagaacgaa aaaggaccat ttttccagcc cagtcatata gggataacac attagtgtga 4620 agtcatttga tggacatgca ataactgcct gtgggttctt tttccctcat ttgaggctga 4680 aatgtagatg gtagagaatt gatatgtcca tttttgttcc cagtcctatc cctcgtgctg 4740 atatccttcc caccaatacc acacacacag ttccttgaag ggaggtttgc tgactatcag 4800 gagcatacat ctctcttcca taataacaag cattccaagc gcggtcaggg cctctttaga 4860 tgatggtgtg gacctggcac cacaccacca cagctgaggg gacaagagct aacagcagca 4920 gtgtgtgctg tctcctttta gcttctgatc ttagaagctt tggagggagc tgtctactct 4980 ggtccaggtg aaaagaatct tattgcttta taccttttaa aaagaataat tcttatttct 5040 tgataaagtc ataaaagcag ccaggggcct ccaattgagg tactgtggct aagatcaaag 5100 tggggggggt ctcttttttg gagccactct ccccagctaa tagagttcta cctgcctcct 5160 gctctatttt cctcaaaacg tgctggcccc taggtccttt taggagcaca gctttgtttt 5220 catagcgacc aaactgtact tctcacgtag acggacacac agcctgccag ccacataaca 5280 gctttagccc ttagagctta acagttagac acctttcgtt cttcattgct gctcctaaga 5340 ggtcctgagg gaatcctgga tcggcctact gaccttgcta ctgtctatga ctatgactgt 5400 atagccctgc tagtccatat cttgtgtctg aggaggctca ttctgggttc acacggggga 5460 ctgcataggc tttgcctgtc acgtctaatg cttgagcccc accctgcatt gctgttccct 5520 tgacccagac tactctcctt tctccagtga tattctccat gagctttgta caaggagaac 5580 caagcaacga caaaatacct gtggccttgg gcctcaaagg aaagaatcta tacctgtcct 5640 gtgtaatgaa agacggcaca cccaccctgc agctggaggt gagtccatca gtagagaagc 5700 ctcccccact gctcaccgaa gactctgcct ttacttactt cccagacatc cacctgcctg 5760 acccgccaga aaacattaga ggtcttcttg acgatttaca taaatataga ataaaattag 5820 cataactttt aagtgcacat aaacctcact gccaccatgg gaaatcaatc ctttttgatg 5880 ctgttgtcat gtcaggccac cgttatcacc cccaacagaa gtcgtagcat caaggatgaa 5940 agagttgtat atggtgacag tttttcctcc tttgacagag aacagtttgg gagaatgcag 6000 tgaaaggttc aaccaacgat cctcagacct gtactggcac ttgtgacatt cctaacaaaa 6060 gcttcatttc caagctgatg ccactctatc cagggattta gggggaactg tgacaaaaat 6120 gcctggaaac tgggtaccct tgggagcttt aatataattc tcacccatat ggtaggattc 6180 agaaaaaata tatatataac aaaggttcct tcagtgatta tagaaagatg gggttcagca 6240 gtaaagaatg aggcctcaag ttccacaacc ttctttttca ttctcttctc cagcagccct 6300 gagaatatgt ctaccgtggt agctttatcc tttctgtcat acatgcaaca tgcacacgga 6360 cacagacgtt aacacaattc tttttctact ttctgcagag tgtggatccc aagcaatacc 6420 caaagaagaa gatggaaaaa cggtttgtct tcaacaagat agaagtcaag agcaaagtgg 6480 agtttgagtc tgcagagttc cccaactggt acatcagcac ctcacaagca gagcacaagc 6540 ctgtcttcct gggaaacaac agtggtcagg acataattga cttcaccatg gaatccgtgt 6600 cttcctaaag tatgggctgg actgtttcta atgccttccc agggccattg ttaaggagct 6660 cccttttcgg tgaatgagca gacagctcaa tctccagggg actccttagt cctcggccaa 6720 gactggtcgc tcagggtcac aagaaaccat ggcacattct gttcaaagag agcctgtgtt 6780 ttcctccttg cctctgatgg gcaaccactt acctatttat ttatgtattt attgattggt 6840 tgatctattt aagttgattc aaggggacat taggcagcac tctctagaca gaacctagct 6900 gtcaacgtgt ggggatgaat tggtcatagc ccgcactgag gtctttcatt gaagctgaga 6960 ataaataggt tcctataata tggatgagac tttttatgaa tgaagcacca gcacattgct 7020 ttgatgagta tgaaataaat ttcattaaaa caaacaaaca aaaaaaagtt ctgcctggct 7080 attgacttct cttagagttt <210> 14 <211> 6350 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Genome sequence of mouse IL-1 receptor antagonist gene <400> 14 ggatctggtt tttttttggg ggggaggggg atcgggacag ggggatcagc aaatagactc 60 ggagtacctg tcatgcaaat gagggagtct ggttttcatt gtgctcttct tcccaggaac 120 accatgaagg ggaaacagag aacttaattt tggggaaatt acacagggta agggggagga 180 gatcagttac aacacaccat tgcgacactt tcagggttga cagcgacagc agtaaaggtt 240 tctctttttg gaaatatgag ggtttttccg cttctgacag tggaacggaa tgacagcagc 300 acaggctggt gaatgactac tttctttata agcaaccacc ttgagcctga aatggcagtc 360 gctagtctct attgccttgc tgtggcctcg ggatggaaat ctgctgggga ccctacagtc 420 acctaatctc tctccttctc atccttctgt ttcattcaga ggcagcctgc cgcccttctg 480 ggaaaagacc ctgcaagatg caagccttca ggtaagtctt ccaaagacac aggattgcat 540 agaccaagga ccagagacac atgccatatg tccagagcat atgcaggaat aggagatata 600 tatacatgta taatatatat aatgcgtgtg tgtatgtgtg tatacacata tgtatgtatg 660 tatgtgtata tatatatata tatatataat gtgtgtgtat acacatatgt atgtatgtgt 720 atatatatat atatatatat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatcc ttgattcaag 780 aacagcatgc taaatgcagt ctttaagtct tatgttttaa aatattccat gcatggacaa 840 caagacagtt aactgtgctc actttctcag acacctagat gttcagtaag tgatggacag 900 gcatccggga ataatgctag ctttgggatc gagcaaagag gaatacttca gcaggacaca 960 gtcaaaggct cagaccaaca gtctacactc tgtatctgtg ttgacttgga agatatctct 1020 cgttggagtc cccagtttcc ttatctgtaa catgatactg ctctgatgat aaccccttgt 1080 gtgccttaca gggtgaacac taaatacatg agtgatactg taaccatgtt ctgagaccta 1140 tgctctgaga actgtaaagt gcctgaaaaa taacctgagt tttaaaaatt ggatcaaaag 1200 ccttgggaga tgccatcaac cttatagtaa aaatggcagg cctcgatttt gattttaaaa 1260 tgaataaaga gattgttggt gcatatgatc tgttcttgat ccttcctgag agtgaagtct 1320 gtgttgagtc acttcccctt tgaccctgtc tgctttggat ccacagctgg aggctgggac 1380 tctaactgtg attctataca tctatcccaa ggcaagtctg tcccacagat ccagtaactg 1440 cttcgtgaga tttaccatca tcacatcctc ttagcagcct caagagaggt ccctggagtc 1500 ctgttagcaa gactattgag tcccttgagt ttgaagctca ccagagatat agacaccagt 1560 cacaaaggca caaatactct ttcacgtgca gagtacttgg tttgtcctcc acccatccct 1620 gagctcctag gctgctccaa gctactcaaa aagtcctgtc agctctgctg accaggtaaa 1680 gagataaggg acagatccaa ggtcatatca tcaggcctct taccacacct cacaggtgcc 1740 tgcctctctg gaagccagag ggcctttcac caagaagtca gagagtaaca aacaggccct 1800 ggctgagcta gacaggaagc tgacttattt ccaaggacag ctgtccctgt caggcccaga 1860 gcagatggtc ccacaagagg ttttagttgt agacttgcag gtctaagtag agtagcttga 1920 ggtaggagta gtgaagccag actagcttgg ctacaataca ttctaaccct tgaacctgta 1980 acactatgat gtggtggcca cgagctacaa gtggccatct aaatttacac ataaacgcat 2040 gaaagcagaa gaaagtcctg tacctggcaa ctctatttag tggagtgact ataggatgtg 2100 cttgcatcgc ctaagtttct atcagatgct gacgctctat agaaaattct gctaaagtca 2160 tggatgtcca tgctgggatt ctgaggtgag gaacaagaaa aagaggtttt ctgttcacca 2220 gatgtgagag atgggctcat ttcttacatg gtatttgctt aaatcttccc atttgtgtta 2280 tgaacttggt aagtacgaca cttccagcaa gtctagatgt aaattaggtg actctgagga 2340 agctggaaag ggctctgtac tgcctactcc agctaggcca ttttgctttt cagaatctgg 2400 gatactaacc agaagacctt ttacctgaga aacaaccagc tcattgctgg gtacttacaa 2460 ggaccaaata tcaaactaga aggtgagtgg ataacaggga agctggtgta atatggacat 2520 agagtccttt gccctgctcc tctgcctgga ggtgggatgt cctcatttct gttgagttgg 2580 aaatgagaga tttgaccacc aggggacata tgggagtggc ctcaagagag cagaaaagat 2640 aaagactggg tcacaatgct ccagggacac agctgagagg aacagaggcc agaaggcacc 2700 cgggcacctc cttagtcctt ctgtgctggt agtccactat accccagtgt tattcgaact 2760 ctacccttgc cctaggctaa tataacatgt atgtgggctg ggtagcattt ttactgtgga 2820 caccaccctc atcatgtacc ctctaaacta ggacaaagcc acatgaactt ggaggagcat 2880 tacccacaga ttcttcagtt tttcttagtt caggcactta gttgacagaa tctctgtttg 2940 tgagggaacg aagcattact tgtatctcct caggatcccc caagccttct gctttcctgt 3000 atcactcagc agttatgcaa ctggcttttc ctgtctttct agtaattctc ccatgaacac 3060 actcaagcat agaaggtgct ggctttctat tgctacccag taacaggatg gaaaggtgaa 3120 ctgtgtggaa cctattcatg ggccttgtga gcttttgtgc ctctgtctac taacagcaaa 3180 tctgttgact tggaggtctg gttcactgta gaaagtaaag gaaagttggg agcagtgtag 3240 aatctaggaa gctggtcctt acatagagtg tgctcatttg gatcttttgc ttggaggcag 3300 actagaaaga tagagccttc ttgaccttct tgaccttcta gttttataaa aaggaagaca 3360 gaaaatacac acagacgctc ccctaccctt gcctcctctt ctctctttct gacaccatcc 3420 tctactcttc tccagaaaag atagacatgg tgcctattga ccttcatagt gtgttcttgg 3480 gcatccacgg gggcaagctg tgcctgtctt gtgccaagtc tggagatgat atcaagctcc 3540 agctggaggt aagaatctgg tttagctatc aaatccttct aaaacccaat ggttatgaca 3600 acctcaggtg tttctcataa ccctgagcat gcaaagatga gggaggcttt tccttcttca 3660 cagagtacta ttttgaggtc actccttaag cagtttccac aatgttcttg gttgatattg 3720 ggtgtccaag gtggtttctc attctctcaa ctacccttta cgtaacttct ttgcattcag 3780 tcaacactct gagcttcctt aagcgtggtg accaactttt atgagagatt gttccagaaa 3840 gatgagcctc aatgtgaaag tgcttattaa gcttgggctt atgtaagtct attggcagaa 3900 gcctgtgacg tggttgatat ggactcattg tagaaaggta ctgcacaagg atctaaactt 3960 taggaggaga catggtcatt agaggagcac gacctgaacc accatgggtc ttgtgcctcc 4020 taaaccagtt gagcctacct tcttctagca aggtcaattc tcaagactat acactcccaa 4080 gcatcatcta tgctatttat tatctacgct cctaatttac atcccacaca gacctgtgtc 4140 acttactcct ttacctagtc agtagtaatg ggctgttcaa acattatctt gagggattag 4200 ctggacaaac ttttaatcca actgcaaata gccacaagca tgagtttgtt gataactctt 4260 accaatggac aggaacacct tttagaggac tttctcagcc ctcggcaatt acctgaccat 4320 ttcttgactt ccaggaagtt aacatcactg atctgagcaa gaacaaagaa gaagacaagc 4380 gctttacctt catccgctct gagaaaggcc ccaccaccag ctttgagtca gctgcctgtc 4440 caggatggtt cctctgcaca acactagagg ctgaccgtcc tgtgagcctc accaacacac 4500 cggaagagcc ccttatagtc acgaagttct acttccagga agaccaatag tactgccgag 4560 gcctgtaata atcaccaact gcctgatcac tctggccatc attggggcct gaggaacaac 4620 ttttgcaggg tgtacagtag aaggagacag aagagttctg atgatagatc tctgcctcag 4680 tctgttggct ggcctaatcc ccatgatgat tccagaataa tcttgcaaat tggatcatgg 4740 caggtgcttg ttcaaagccc tttcttgttg cctctgccat ctgggtgaag tctagaccac 4800 ttgcttggcc taggtgtctt ctgctctacc acccacccta cccctgccac aaacacacac 4860 tttttttgtt tttgtttttt ccattgttct gcacttccac agtccagacc aatcaagtca 4920 cttgacaata tgccccaagt gactccctta ccctgtttta taaacctgtg cctgtctatg 4980 gagaaggttt taattctcct tgttattcat tttgggcttt ttgatgaaac caccagggca 5040 tcacatatac taagcatgtg ctctaccatc atgttatgct tccagctcag gggggcactt 5100 ttaaggatct agaaaacaga aattaaggat ctcatagtta ttttattagg ccagccttat 5160 tccatgtcgg caagaggttt cttgtggaaa ttatgtcctt tctgagagga gctggggatt 5220 agatgctcct gcatttgtga aatggttata agcatagaaa aataggtggt aagctttcct 5280 tctttcctta ttttgtgtga tgccttaaac tgaaaagtta aaaattgatg gattgtagca 5340 ttcccataat ctcccccttc tttttttttc ctttggaaat gtccaatagt ctatattcct 5400 ctgtcccgcc caaacaccat cttcactcca agcctaccac agatgcctga agaagttcct 5460 cactatctgc aaatgtggct ctcaggccct tcctgatgtg atgaatgaat ctactaatca 5520 tttcttgacc gttcatttta tcacttctaa ccttgaaaca tgtggaagta gctatgttcc 5580 taactgtttc ctctgccaga caatgaactc tggagatcag ggagcttcgt gtgtgtgtgt 5640 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgcgcgc acgtgcatgc acatgctacg 5700 tattgggtcc ctccaaggat gaaccctctc tttggcttag aaggcactca gagaatatgt 5760 gttattcgtg ctcacggaaa gtttcttact catccctgtg actttggctt tattttacaa 5820 taaaacactg aaaatgtcca ctttgttagt tgtgaacatg agcccaggcc taaggtgctg 5880 ggaaacagaa agggcgggag atttttcttt attctatggc tagaaaatag ttacctcctc 5940 tctgaaagtc ttcttcctca tttctgggta acagaatatc aaacaccttg cttataagtt 6000 ataaagtagt gttgtccacc atgaacccac caagtaaaaa caacccaaat acctatcatg 6060 gatgaataat catgcaagta tcagatctgc actcaatgcc acacaatgac aaagatagca 6120 aatgagccac agacggctcc acccaaccca atagatgaac acttggttca aaatcactaa 6180 agctcaaata ctcccaggtc aaacaccagg taacaagtta atactcaaca aaggggggaa 6240 acaaatgttc cactgaatcc tgtgaccctg tggcgtggtt cacctcctgt gttgtttgcc 6300 atgtgtgctc aggatgagct gattaaagct cttctcaggg gttcagtttt 6350[Sequence List] <110> Oriental Yeast Industry Co. Ltd. Yoichiro, IWAKURA <120> Knockout model animal for Interleukin-1 associated diseases. <130> 981207 <160> 14 <210> 1 <211> 1974 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 alpha gene. <400> 1 aagtctccag ggcagagagg gagtcaactc attggcgctt gagtcggcaa agaaatcaag 60 atggccaaag ttcctgactt gtttgaagac ctaaagaact gttacagtga aaacgaagac 120 tacagttctg ccattgacca tctctctctg aatcagaaat ccttctatga tgcaagctat 180 ggctcacttc atgagacttg cacagatcag tttgtatctc tgagaacctc tgaaacgtca 240 aagatgtcca acttcacctt caaggagagc cgggtgacag tatcagcaac gtcaagcaac 300 gggaagattc tgaagaagag acggctgagt ttcagtgaga ccttcactga agatgacctg 360 cagtccataa cccatgatct ggaagagacc atccaaccca gatcagcacc ttacacctac 420 cagagtgatt tgagatacaa actgatgaag ctcgtcaggc agaagtttgt catgaatgat 480 tccctcaacc aaactatata tcaggatgtg gacaaacact atctcagcac cacttggtta 540 aatgacctgc aacaggaagt aaaatttgac atgtatgcct actcgtcggg aggagacgac 600 tctaaatatc ctgttactct aaaaatctca gatt cacaac tgttcgtgag cgctcaagga 660 gaagaccagc ccgtgttgct gaaggagttg ccagaaacac caaaactcat cacaggtagt 720 gagaccgacc tcattttctt ctggaaaagt atcaactcta agaactactt cacatcagct 780 gcttatccag agctgtttat tgccaccaaa gaacaaagtc gggtgcacct ggcacgggga 840 ctgccctcta tgacagactt ccagatatca taaaagcagc cttatttcgg gagtctattc 900 acttgggaag tgctgacagt ctgtatgtac catgtacagg aaccttcctc accctgagtc 960 acttgcacag catgtgctga gtctctgtaa ttctaaatga atgtttaccc tctttgtaag 1020 agaagagcaa accctagtgg agccaccccg acatatgata ctatctgtta ttttaaagag 1080 taccctatag tttgctcagt actaatcatt ttaattacta ttctgcatgg cattcttagg 1140 aggatcaaaa agactctaca catattacag atgggttaac aaagggataa aacaactgaa 1200 aagcacactc aatgcatttg gaatataaat tcacagacca atctcactgt gcaccttcgg 1260 cttcaaaatg ccagttgagt aggataaagg tataagaact taatgctgtc attttcaaaa 1320 ggaaggggac aatagctaca tctttcctac ctcagtgggt tttactccag tgagatcatt 1380 tggatgaaat cctcctgtaa cagacctcaa gaaggagaca gactgttgaa tgttattttt 1440 aagttatttt atatatgtat ttataaatat atttatgata attat attat ttatggaaca 1500 tccttaaatc ctctgagctt gacaggcatc ctcacagcag gattttctag gtggtcagtt 1560 agatatagtt tcctctagag caccatgcta cagactttac actttttcca cagccacgaa 1620 gctctctgta cattcctgta cttgggagcc ctttcatcat gatcttaatc tgtactgttt 1680 actttgttca tctaaaatga taattgagtc agtctttttc cctcccatcc ttaaagctgt 1740 ctgggtattc ttacatcatt cagtctcacc tgtaactaac accaaccatc taaagatgga 1800 aagagcttaa ctgtgacaac cacatcactg ttacctgaag tttcttttct agaatgtaat 1860 cagtgtttcc cctggattcc aatttttttt tcaaaccaca gtatcatgta actatcaaca 1920 ataacaatca actcattatt attaatcata attaaataaa acaagtttga gctg 1974 <210> 2 <211> 1339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 beta gene. <400> 2 tgcagggttc gaggcctaat aggctcatgggatct ccagccaagc ttccttgtgc 60 aagtgtctga agcagctatg gcaactgttc ctgaactcaa ctgtgaaatg ccaccttttg 120 acagtgatga gaatgacctg ttctttgaag ttgacggacc ccaaaagatg aagggctgct 180 tccaaacctt tgacctgggc tgtccagatg agagcatcca gcttcaaatc tcacagcagc 240 acatcaacaa gagcttcagg caggcagtat cac tcattgt ggctgtggag aagctgtggc 300 agctacctgt gtctttcccg tggaccttcc aggatgagga catgagcacc ttcttttcct 360 tcatctttga agaagagccc atcctctgtg actcatggga tgatgatgat aacctgctgg 420 tgtgtgacgt tcccattaga cagctgcact acaggctccg agatgaacaa caaaaaagcc 480 tcgtgctgtc ggacccatat gagctgaaag ctctccacct caatggacag aatatcaacc 540 aacaagtgat attctccatg agctttgtac aaggagaacc aagcaacgac aaaatacctg 600 tggccttggg cctcaaagga aagaatctat acctgtcctg tgtaatgaaa gacggcacac 660 ccaccctgca gctggagagt gtggatccca agcaataccc aaagaagaag atggaaaagc 720 ggtttgtctt caacaagata gaagtcaaga gcaaagtgga gtttgagtct gcagagttcc 780 ccaactggta catcagcacc tcacaagcag agcacaagcc tgtcttcctg ggaaacaaca 840 gtggtcagga cataattgac ttcaccatgg aatctgtgtc ttcctaaagt atgggctgga 900 ctgtttctaa tgccttcccc agggcatgtg aaggagctcc cttgtcatga atgagcagac 960 agctcaatct ctaggacact ccttagtcct cggccaagac aggtcgctca gggtcacaag 1020 aaaccatggc acattctgtt caaagagagc ctgtgtttcc tccttgcctc tgatgggcaa 1080 ccacttacct atttatttat gtatttattg attggttgat ctatttaagt tgattcaagg 1140 ggacattagg cagcactctc tagaacagaa cctagctgtc aacgtgtggg ggatgaattg 1200 gtcatagcct tgcacttgag gtctttcatt gaagctgaga ataaataggt tcctataata 1260 tggatgagaa tttttatgaa tgaagcatta gcacattgct ttgatgagta tgaaataaat 1320 ttcattaaac aaacaaaca 1339 <210> 3 <211> 1877 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 3 ccctgaaatg gcagtcgcta gtctctattg ccttgctgtg gcctcgggat ggaaatctgc 60 tggggaccct acagtcacct aatctctctc cttctcatcc ttctgtttca ttcagaggca 120 gcctgccgcc cttctgggaa aagaccctgc aagatgcaag ccttcagaat ctgggatact 180 aaccagaaga ccttttacct gagaaacaac cagctcattg ctgggtactt acaaggacca 240 aatatcaaac tagaagaaaa gatagacatg gtgcctattg accttcatag tgtgttcttg 300 ggcatccacg ggggcaagct gtgcctgtct tgtgccaagt ctggagatga tatcaagctc 360 cagctggagg aagttaacat cactgatctg agcaagaaca aagaagaaga caagcgcttt 420 accttcatcc gctctgagaa aggccccacc accagag gg gcctgcc cctgcctgcc gcctccctgcctgcctgcc gagcccctta tagtcacgaa gttctacttc caggaagacc aatagtactg ccgaggcctg 600 taataatcac caactgcctg atcactctgg ccatcattgg ggcctgagga acaacttttg 660 cagggtgtat gtacagtaga aggagacaga agagttctga tgatagatct ctgcctcagt 720 ctgttggctg gcctaatccc catgatgatt ccagaataat cttgcaaatt ggatcatggc 780 aggtgcttgt tcaaagccct ttcttgttgc ctctgccatc tgggtgaagt ctagaccact 840 tgcttggcct aggtgtcttc tgctctacca cccaccctac ccctgccaca aacacacact 900 ttttttgttt ttgttttttc cattgttctg cacttccaca gtccagacca atcaagtcac 960 ttgacaatat gccccaagtg actcccttac cctgttttat aaacctgtgc ctgtctatgg 1020 agaaggtttt aattctcctt gttattcatt ttgggctttt tgatgaaacc accagggcat 1080 cacatatact aagcatgtgc tctaccatca tgctatgctt ccagctcagg ggggcacttt 1140 taaggatcta gaaaacagaa attaaggatc tcatagttat tttattaggc cagccttatt 1200 ccatgtcggc aagaggtttc ttgtggaaat tatgtccttt ctgagaggag ctggggatta 1260 gatgctcctg catttgtgaa atggttataa gcatagaaaa ataggtggta agctttcctt 1320 ctttccttat tttgtgtgat gccttaaact gaaaagttaa aaattgatgg attgtagcat 1380 tcccataatc t cccccttct ttttttttcc tttggaaatg tccaatagtc tatattcctc 1440 tgtcccgccc aaacaccatc ttcactccaa gcctaccaca gatgcctgaa gaagttcctc 1500 actatctgca aatgtggctc tcaggccctt cctgatgtga tgaatgaatc tactaatcat 1560 ttcttgacca ttcattttat cacttctaac cttgaaacat gtggaagtag ctatgttcct 1620 gactgtttcc tctgccagac aatgaactct ggagatcagg gagcttcgtg tgtgtgtgtg 1680 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg tgcgcgcgca cgtgcatgca catgctatgt 1740 attgggtccc tccaaggatg aaccctctct ttggcttaga aggcactcag agaatatgtg 1800 ttattcgtgc tcacggaaag tttcttactc atccctgtga ctttggcttt attttacaat 1860 aaaacactga aaatgtc 1877 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 alpha. <400> 4 cttggccata ctgcaaagg catg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence in lacZ-pA cassette. <400> 5 gaggtgctgt ttctggtctt cacc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 beta. <400> 6 gcgaatgtgt cactatctgc cacc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 receptor antagonist. <400> 7 gctgtgatag caacagtttg tacc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence in neo cassette. <400> 8 gactgccttg ggaaaagcgc ctcc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying cDNA sequence for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 9 cctcgggatg gaaatctgct g 21 <210 > 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying cDNA sequence for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 10 aggcctcggc agtactattg g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying genomic sequence of IL-1 receptor antagonist gene. <400> 11 gactcggagt acctgtcatg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA < 213> A rtificial sequence <220> <223> Primer for amplifying genomic sequence of IL-1 receptor antagonist gene. <400> 12 gctctggaca tatggcatgt g 21 <210> 13 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <220> < 223> Genome sequence of mouse IL-1 beta gene <400> 13 aagtgcgtgt ctctccagaa gcccctgcta acacagttga tggagagcac agaagcacca 60 tccagttacc aaactccaac tgcaaagctc cctcagctta agcacaagga ggcgagagag 120 gtgacacact tctgggtgtg catctacgtg cctacctttg ttccgcacat cctgacttaa 180 aatgtacagc taacccagga aaacccaata tttttaatat tgacaccatc tgcacaattg 240 tccaggggga aataatgccc atttccacca cgatgacaca cttgcgaatg tgtcactatc 300 tgccacccct tgacttccag ggattagaaa ttatttcagg gtagcaatag cctcttcccc 360 taagaattcc catcaagctt ctcccccctc ccccaccctt cagttttgtt gtgaaatcag 420 ttaacccaag ggaaaatttc acagctcttc acttctgctt tttaggacta taaaacaagg 480 gagggaaaac aagttggaca acaaaccctg cagtggttcg aggcctaata ggctcatctg 540 ggatcctctc cagccaagct tccttgtgca agtaagtctc tctctctctc tgtctctctc 600 tctctctgtc tctctctatc tctctctctc tgtctctctc tctctgtctc tgtctgtctc 660 tctctctgtc tctgtctgtc tatctctctc tctctctgtc tgtctctgtc tctctctgtc 720 tgtctctctc tgtctctctg tctctctctc tgtctctctc tgtctctctc tctctctctc 780 tttccccccc ccccactgat ggactttggg ctttttattt ataaaaagta gctgtacctc 840 catggtttgt gaagtactct ggaaatgagt actgtctgta tagccgctga catctaaaag 900 gcagctcctg tcttgtagga aagcttcttt attagggttt ggctctgctg ttgcttcctt 960 ccagagcatc ttcctaatgc tgttccccat gttgtagtga ccccccacac accctaaaat 1020 tattttcatt gctacttcat aactataatt ttgctactgt tatgaagtgt aaatatctgt 1080 gttatccaat ggtcttaggt gacccctgtg aaagggccac ttgactccaa aagggccact 1140 ggtctagacc tatacaacgg ctcctccgtt ccttcattcc tcagagacca gtttagcatg 1200 cctgccctga actagagcta agagaaacac atatgaagga cgcccctcgg ggagctaacg 1260 ctggatgccc acccactttc tttcttcaca caggtgtctg aagcagctat ggcaactgtt 1320 cctgaactca actgtgaaat gccacctttt gacaggtcag tgggtactgg agagtggtca 1380 catatccagc actctgcttt caggaatgga gggctatcta ctttcagagg ccagagagtt 1440 ccccaactca tctccttcag tggctataga gttcaagcaa cctagcttaa agactgacct 1 500 cttcactccc aagcccaacc tagggactta ggtgctgtca ctacagggac tcctacagat 1560 gcaatggtaa gaaaaacttc cacatggaca ggataagaga ctcttttgca aagtctggct 1620 tggaagcaaa aggcagagag ctcagacttt agctaactct gctagtctag aatttaggtg 1680 tcagaagtca acagagagca accagagcac ccacttacct ggcccagaat ctgcttctag 1740 actgttactt acgtagcact gtagaacttc ccagaagtct ttgggaagct ttaagagtca 1800 tggtaggtgt ggttttatga acaatggaag tctgtctgct cagtattgat aaggagctat 1860 cacttgacca catctgtttt cattacagtg atgagaatga cctgttcttt gaagttgacg 1920 gaccccaaaa gatgaaggtg agactctgag cttggctcct aacctgtgga gggactgtgg 1980 catgggaaaa aaaaacccaa acgggaaggg atatgggact gccttgctcc caggctattt 2040 tgtgatggga ttattttgcc tctttcagtg acatagataa ggcaacccac acactgacct 2100 ggctcccaca caggtttcat ttaccacagc cacagaccaa ggcttgctga tggcaatcat 2160 ggtcttttat gctaagaaga cagtatggtc ttcaacatac atttagtccc cccttgagag 2220 agatggagct taatctgacc acttaaatcg aactctggat ctagagagca tgaccttcag 2280 aattagcatc tcttccttct ctgccaaaga ccagtttcgc atgttcctgg ggagattaag 2340 at aataagaa ataagtgata taaacaaaaa gttagttagg atttttaaaa ataacctgtg 2400 gccttagaca agacctttca ttgctgtgtg atcatagaca gtccccactg tgtcctttgg 2460 gaaacacagg tcagaagatc tctgaaatgt tggcgatctg tcacaacctt ccattctgaa 2520 gtgttttaag tgctggccaa gtccatccta gcacaagggc acctttccag acttgctctc 2580 atgaagagcc atgttgcatc ccagcttgcc cttcctatga tgactgagaa cgctctaatg 2640 ccacatggcg tcagtccagc cacgtcactg cccactcagg aggcagctgt ttctctcaga 2700 cctcttccca atccctcaac agtctccccc agctacagaa tctagtcctt agcttacatg 2760 aatgtatttt aagaccactc taactagtta gttcagcctt gggtgacgcc tctcactttc 2820 cagccaggct ctgtccccac tgcctgctcc agaacatggc tttccctgga gcctctactc 2880 tggacagaaa cttctctccc aatcaacctt tcctttacac tattgaaatg atctatcgct 2940 gtccttcaag ctttgaaact gttatcatgc ctcaaggcaa ctgtgtttag gccttaatgt 3000 ggtgtttctc caaagaacag aaaagtggtg acatatttta caaacaaaag ctatgcttat 3060 agtgtctgct aaatattcct atgagaaaaa gaatgtatgg gaagccattg agagcctgtt 3120 gggtgatctc cgttgaatag aagacaacat gacatactga catgagaaat taaataacat 3180 gatgtttg ag cagcaaggat accaaaagat gaaacgttta agtaggtcta attatacagt 3240 gaggcaaggt ctgtacaaga aagataaagt agaaatgagg tttactatag agaatgccag 3300 gaagcctgtg tctggttgcc atgtacccct gggtaggcca attaaattct ctgggctcca 3360 catagacagg gattgtggtt aagaacttat ctcccgggcc cttggtgttc tctggggttg 3420 atgtaggagt cctctggtct gatgacttga tgtgctcact gcctggtttc tccacagggc 3480 tgcttccaaa cctttgacct gggctgtcct gatgagagca tccagcttca aatctcgcag 3540 cagcacatca acaagagctt caggcaggca gtatcactca ttgtggctgt ggagaagctg 3600 tggcagctac ctgtgtcttt cccgtggacc ttccaggatg aggacatgag caccttcttt 3660 tccttcatct ttgaagaagg tacttaatga ggactgagag cagacagcag accttcgctc 3720 tggtccttct cagcccacct cttagaactc acacgcccct caagtgcaag acccttagtg 3780 ctagacattc caaccattag aagaaaatga ggaaacctcc aaacaaatca gttctatctt 3840 gagctgatta acttataaaa aggctttaat gatgcttaca cttgcaactc aaccattgac 3900 ttgccaagta ctttggctta tactagaggt tgtgaatctc acaatttccc agttaagctg 3960 gtcttattac tggcatcgtt tcatgcaagg accactactg ctagtcccta gtgactggtt 4020 ataacactgc agc ttatctc acgatgccaa atccaatgtt gttgcccagc ccactcccag 4080 tgtttttata cccccactaa aattagaata gaatcttgac tgcacatgct taggtgttgc 4140 tcaataagcc aaattctgct gcttcacttc acagtgcttg catttctaat tatctgccta 4200 aacaacatct gctcttgaac tttcagagcc catcctctgt gactcatggg atgatgatga 4260 taacctgctg gtgtgtgacg ttcccattag acaactgcac tacaggctcc gagatgaaca 4320 acaaaaaagc ctcgtgctgt cggacccata tgagctgaaa gctctccacc tcaatggaca 4380 gaatatcaac caacaaggta agtaggagca tcttggtttc cctttctggc ctcctggcag 4440 cctactgggt ccctgtgttt taaaatggaa cactatggtc attatacaaa aaaagaaaag 4500 gaaaaagaaa gggaaaggaa agaaggaagg aaggagagag agacagagac agagacagag 4560 acagaacgaa aaaggaccat ttttccagcc cagtcatata gggataacac attagtgtga 4620 agtcatttga tggacatgca ataactgcct gtgggttctt tttccctcat ttgaggctga 4680 aatgtagatg gtagagaatt gatatgtcca tttttgttcc cagtcctatc cctcgtgctg 4740 atatccttcc caccaatacc acacacacag ttccttgaag ggaggtttgc tgactatcag 4800 gagcatacat ctctcttcca taataacaag cattccaagc gcggtcaggg cctctttaga 4860 tgatggtgtg gacctggca c cacaccacca cagctgaggg gacaagagct aacagcagca 4920 gtgtgtgctg tctcctttta gcttctgatc ttagaagctt tggagggagc tgtctactct 4980 ggtccaggtg aaaagaatct tattgcttta taccttttaa aaagaataat tcttatttct 5040 tgataaagtc ataaaagcag ccaggggcct ccaattgagg tactgtggct aagatcaaag 5100 tggggggggt ctcttttttg gagccactct ccccagctaa tagagttcta cctgcctcct 5160 gctctatttt cctcaaaacg tgctggcccc taggtccttt taggagcaca gctttgtttt 5220 catagcgacc aaactgtact tctcacgtag acggacacac agcctgccag ccacataaca 5280 gctttagccc ttagagctta acagttagac acctttcgtt cttcattgct gctcctaaga 5340 ggtcctgagg gaatcctgga tcggcctact gaccttgcta ctgtctatga ctatgactgt 5400 atagccctgc tagtccatat cttgtgtctg aggaggctca ttctgggttc acacggggga 5460 ctgcataggc tttgcctgtc acgtctaatg cttgagcccc accctgcatt gctgttccct 5520 tgacccagac tactctcctt tctccagtga tattctccat gagctttgta caaggagaac 5580 caagcaacga caaaatacct gtggccttgg gcctcaaagg aaagaatcta tacctgtcct 5640 gtgtaatgaa agacggcaca cccaccctgc agctggaggt gagtccatca gtagagaagc 5700 ctcccccact gctcaccgaa gact ctgcct ttacttactt cccagacatc cacctgcctg 5760 acccgccaga aaacattaga ggtcttcttg acgatttaca taaatataga ataaaattag 5820 cataactttt aagtgcacat aaacctcact gccaccatgg gaaatcaatc ctttttgatg 5880 ctgttgtcat gtcaggccac cgttatcacc cccaacagaa gtcgtagcat caaggatgaa 5940 agagttgtat atggtgacag tttttcctcc tttgacagag aacagtttgg gagaatgcag 6000 tgaaaggttc aaccaacgat cctcagacct gtactggcac ttgtgacatt cctaacaaaa 6060 gcttcatttc caagctgatg ccactctatc cagggattta gggggaactg tgacaaaaat 6120 gcctggaaac tgggtaccct tgggagcttt aatataattc tcacccatat ggtaggattc 6180 agaaaaaata tatatataac aaaggttcct tcagtgatta tagaaagatg gggttcagca 6240 gtaaagaatg aggcctcaag ttccacaacc ttctttttca ttctcttctc cagcagccct 6300 gagaatatgt ctaccgtggt agctttatcc tttctgtcat acatgcaaca tgcacacgga 6360 cacagacgtt aacacaattc tttttctact ttctgcagag tgtggatccc aagcaatacc 6420 caaagaagaa gatggaaaaa cggtttgtct tcaacaagat agaagtcaag agcaaagtgg 6480 agtttgagtc tgcagagttc cccaactggt acatcagcac ctcacaagca gagcacaagc 6540 ctgtcttcct gggaaacaac agtggtcagg acataattga cttcaccatg gaatccgtgt 6600 cttcctaaag tatgggctgg actgtttcta atgccttccc agggccattg ttaaggagct 6660 cccttttcgg tgaatgagca gacagctcaa tctccagggg actccttagt cctcggccaa 6720 gactggtcgc tcagggtcac aagaaaccat ggcacattct gttcaaagag agcctgtgtt 6780 ttcctccttg cctctgatgg gcaaccactt acctatttat ttatgtattt attgattggt 6840 tgatctattt aagttgattc aaggggacat taggcagcac tctctagaca gaacctagct 6900 gtcaacgtgt ggggatgaat tggtcatagc ccgcactgag gtctttcatt gaagctgaga 6960 ataaataggt tcctataata tggatgagac tttttatgaa tgaagcacca gcacattgct 7020 ttgatgagta tgaaataaat ttcattaaaa caaacaaaca aaaaaaagtt ctgcctggct 7080 attgacttct cttagagttt <210> 14 <211> 6350 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Genome sequence of mouse IL1 antagonist tttttttggg ggggaggggg atcgggacag ggggatcagc aaatagactc 60 ggagtacctg tcatgcaaat gagggagtct ggttttcatt gtgctcttct tcccaggaac 120 accatgaagg ggaaacagag aactta tgggggag tacgagtag acacgagtag acactg ggttga cagcgacagc agtaaaggtt 240 tctctttttg gaaatatgag ggtttttccg cttctgacag tggaacggaa tgacagcagc 300 acaggctggt gaatgactac tttctttata agcaaccacc ttgagcctga aatggcagtc 360 gctagtctct attgccttgc tgtggcctcg ggatggaaat ctgctgggga ccctacagtc 420 acctaatctc tctccttctc atccttctgt ttcattcaga ggcagcctgc cgcccttctg 480 ggaaaagacc ctgcaagatg caagccttca ggtaagtctt ccaaagacac aggattgcat 540 agaccaagga ccagagacac atgccatatg tccagagcat atgcaggaat aggagatata 600 tatacatgta taatatatat aatgcgtgtg tgtatgtgtg tatacacata tgtatgtatg 660 tatgtgtata tatatatata tatatataat gtgtgtgtat acacatatgt atgtatgtgt 720 atatatatat atatatatat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatcc ttgattcaag 780 aacagcatgc taaatgcagt ctttaagtct tatgttttaa aatattccat gcatggacaa 840 caagacagtt aactgtgctc actttctcag acacctagat gttcagtaag tgatggacag 900 gcatccggga ataatgctag ctttgggatc gagcaaagag gaatacttca gcaggacaca 960 gtcaaaggct cagaccaaca gtctacactc tgtatctgtg ttgacttgga agatatctct 1020 cgttggagtc cccagtttcc ttatctgtaa catgatactg ctctgatgat a accccttgt 1080 gtgccttaca gggtgaacac taaatacatg agtgatactg taaccatgtt ctgagaccta 1140 tgctctgaga actgtaaagt gcctgaaaaa taacctgagt tttaaaaatt ggatcaaaag 1200 ccttgggaga tgccatcaac cttatagtaa aaatggcagg cctcgatttt gattttaaaa 1260 tgaataaaga gattgttggt gcatatgatc tgttcttgat ccttcctgag agtgaagtct 1320 gtgttgagtc acttcccctt tgaccctgtc tgctttggat ccacagctgg aggctgggac 1380 tctaactgtg attctataca tctatcccaa ggcaagtctg tcccacagat ccagtaactg 1440 cttcgtgaga tttaccatca tcacatcctc ttagcagcct caagagaggt ccctggagtc 1500 ctgttagcaa gactattgag tcccttgagt ttgaagctca ccagagatat agacaccagt 1560 cacaaaggca caaatactct ttcacgtgca gagtacttgg tttgtcctcc acccatccct 1620 gagctcctag gctgctccaa gctactcaaa aagtcctgtc agctctgctg accaggtaaa 1680 gagataaggg acagatccaa ggtcatatca tcaggcctct taccacacct cacaggtgcc 1740 tgcctctctg gaagccagag ggcctttcac caagaagtca gagagtaaca aacaggccct 1800 ggctgagcta gacaggaagc tgacttattt ccaaggacag ctgtccctgt caggcccaga 1860 gcagatggtc ccacaagagg ttttagttgt agacttgcag gtctaagtag agtagct tga 1920 ggtaggagta gtgaagccag actagcttgg ctacaataca ttctaaccct tgaacctgta 1980 acactatgat gtggtggcca cgagctacaa gtggccatct aaatttacac ataaacgcat 2040 gaaagcagaa gaaagtcctg tacctggcaa ctctatttag tggagtgact ataggatgtg 2100 cttgcatcgc ctaagtttct atcagatgct gacgctctat agaaaattct gctaaagtca 2160 tggatgtcca tgctgggatt ctgaggtgag gaacaagaaa aagaggtttt ctgttcacca 2220 gatgtgagag atgggctcat ttcttacatg gtatttgctt aaatcttccc atttgtgtta 2280 tgaacttggt aagtacgaca cttccagcaa gtctagatgt aaattaggtg actctgagga 2340 agctggaaag ggctctgtac tgcctactcc agctaggcca ttttgctttt cagaatctgg 2400 gatactaacc agaagacctt ttacctgaga aacaaccagc tcattgctgg gtacttacaa 2460 ggaccaaata tcaaactaga aggtgagtgg ataacaggga agctggtgta atatggacat 2520 agagtccttt gccctgctcc tctgcctgga ggtgggatgt cctcatttct gttgagttgg 2580 aaatgagaga tttgaccacc aggggacata tgggagtggc ctcaagagag cagaaaagat 2640 aaagactggg tcacaatgct ccagggacac agctgagagg aacagaggcc agaaggcacc 2700 cgggcacctc cttagtcctt ctgtgctggt agtccactat accccagtgt tattcgaact 27 60 ctacccttgc cctaggctaa tataacatgt atgtgggctg ggtagcattt ttactgtgga 2820 caccaccctc atcatgtacc ctctaaacta ggacaaagcc acatgaactt ggaggagcat 2880 tacccacaga ttcttcagtt tttcttagtt caggcactta gttgacagaa tctctgtttg 2940 tgagggaacg aagcattact tgtatctcct caggatcccc caagccttct gctttcctgt 3000 atcactcagc agttatgcaa ctggcttttc ctgtctttct agtaattctc ccatgaacac 3060 actcaagcat agaaggtgct ggctttctat tgctacccag taacaggatg gaaaggtgaa 3120 ctgtgtggaa cctattcatg ggccttgtga gcttttgtgc ctctgtctac taacagcaaa 3180 tctgttgact tggaggtctg gttcactgta gaaagtaaag gaaagttggg agcagtgtag 3240 aatctaggaa gctggtcctt acatagagtg tgctcatttg gatcttttgc ttggaggcag 3300 actagaaaga tagagccttc ttgaccttct tgaccttcta gttttataaa aaggaagaca 3360 gaaaatacac acagacgctc ccctaccctt gcctcctctt ctctctttct gacaccatcc 3420 tctactcttc tccagaaaag atagacatgg tgcctattga ccttcatagt gtgttcttgg 3480 gcatccacgg gggcaagctg tgcctgtctt gtgccaagtc tggagatgat atcaagctcc 3540 agctggaggt aagaatctgg tttagctatc aaatccttct aaaacccaat ggttatgaca 3600 acc tcaggtg tttctcataa ccctgagcat gcaaagatga gggaggcttt tccttcttca 3660 cagagtacta ttttgaggtc actccttaag cagtttccac aatgttcttg gttgatattg 3720 ggtgtccaag gtggtttctc attctctcaa ctacccttta cgtaacttct ttgcattcag 3780 tcaacactct gagcttcctt aagcgtggtg accaactttt atgagagatt gttccagaaa 3840 gatgagcctc aatgtgaaag tgcttattaa gcttgggctt atgtaagtct attggcagaa 3900 gcctgtgacg tggttgatat ggactcattg tagaaaggta ctgcacaagg atctaaactt 3960 taggaggaga catggtcatt agaggagcac gacctgaacc accatgggtc ttgtgcctcc 4020 taaaccagtt gagcctacct tcttctagca aggtcaattc tcaagactat acactcccaa 4080 gcatcatcta tgctatttat tatctacgct cctaatttac atcccacaca gacctgtgtc 4140 acttactcct ttacctagtc agtagtaatg ggctgttcaa acattatctt gagggattag 4200 ctggacaaac ttttaatcca actgcaaata gccacaagca tgagtttgtt gataactctt 4260 accaatggac aggaacacct tttagaggac tttctcagcc ctcggcaatt acctgaccat 4320 ttcttgactt ccaggaagtt aacatcactg atctgagcaa gaacaaagaa gaagacaagc 4380 gctttacctt catccgctct gagaaaggcc ccaccaccag ctttgagtca gctgcctgtc 4440 caggatggt t cctctgcaca acactagagg ctgaccgtcc tgtgagcctc accaacacac 4500 cggaagagcc ccttatagtc acgaagttct acttccagga agaccaatag tactgccgag 4560 gcctgtaata atcaccaact gcctgatcac tctggccatc attggggcct gaggaacaac 4620 ttttgcaggg tgtacagtag aaggagacag aagagttctg atgatagatc tctgcctcag 4680 tctgttggct ggcctaatcc ccatgatgat tccagaataa tcttgcaaat tggatcatgg 4740 caggtgcttg ttcaaagccc tttcttgttg cctctgccat ctgggtgaag tctagaccac 4800 ttgcttggcc taggtgtctt ctgctctacc acccacccta cccctgccac aaacacacac 4860 tttttttgtt tttgtttttt ccattgttct gcacttccac agtccagacc aatcaagtca 4920 cttgacaata tgccccaagt gactccctta ccctgtttta taaacctgtg cctgtctatg 4980 gagaaggttt taattctcct tgttattcat tttgggcttt ttgatgaaac caccagggca 5040 tcacatatac taagcatgtg ctctaccatc atgttatgct tccagctcag gggggcactt 5100 ttaaggatct agaaaacaga aattaaggat ctcatagtta ttttattagg ccagccttat 5160 tccatgtcgg caagaggttt cttgtggaaa ttatgtcctt tctgagagga gctggggatt 5220 agatgctcct gcatttgtga aatggttata agcatagaaa aataggtggt aagctttcct 5280 tctttcctta tttt gtgtga tgccttaaac tgaaaagtta aaaattgatg gattgtagca 5340 ttcccataat ctcccccttc tttttttttc ctttggaaat gtccaatagt ctatattcct 5400 ctgtcccgcc caaacaccat cttcactcca agcctaccac agatgcctga agaagttcct 5460 cactatctgc aaatgtggct ctcaggccct tcctgatgtg atgaatgaat ctactaatca 5520 tttcttgacc gttcatttta tcacttctaa ccttgaaaca tgtggaagta gctatgttcc 5580 taactgtttc ctctgccaga caatgaactc tggagatcag ggagcttcgt gtgtgtgtgt 5640 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgcgcgc acgtgcatgc acatgctacg 5700 tattgggtcc ctccaaggat gaaccctctc tttggcttag aaggcactca gagaatatgt 5760 gttattcgtg ctcacggaaa gtttcttact catccctgtg actttggctt tattttacaa 5820 taaaacactg aaaatgtcca ctttgttagt tgtgaacatg agcccaggcc taaggtgctg 5880 ggaaacagaa agggcgggag atttttcttt attctatggc tagaaaatag ttacctcctc 5940 tctgaaagtc ttcttcctca tttctgggta acagaatatc aaacaccttg cttataagtt 6000 ataaagtagt gttgtccacc atgaacccac caagtaaaaa caacccaaat acctatcatg 6060 gatgaataat catgcaagta tcagatctgc actcaatgcc acacaatgac aaagatagca 6120 aatgagccac agacggctcc acccaaccca atagatgaac acttggttca aaatcactaa 6180 agctcaaata ctcccaggtc aaacaccagg taacaagtta atactcaaca aaggggggaa 6240 acaaatgttc cactgaatcc tgtgaccctg tggcgtggtt cacctcctgt gttgtttgcc 6300 atgtgct6gt attgct 6g
【図１】 IL-1α遺伝子のターゲティングストラテジー
を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing a targeting strategy of the IL-1α gene.
【図２】 IL-1β遺伝子のターゲティングストラテジー
を示した図である。FIG. 2 is a diagram showing a targeting strategy of the IL-1β gene.
【図３】 IL-1ra遺伝子のターゲティングストラテジー
を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a targeting strategy of the IL-1ra gene.
【図４】 クローン化ES細胞およびヘテロ接合体種間交
配により交配した遺伝子欠損マウスの尾から採取したDN
Aのサザンブロットハイブリダイゼーション解析を示す
写真である。ハイブリダイゼーションは、IL-1α欠損ES
細胞由来のDNAをEcoRIにより制限酵素消化したもの（上
パネル）、IL-1ra欠損産仔由来のDNAをBamHIにより制限
酵素消化したもの（下パネル）のそれぞれに対して、5'
プローブを用いて行った。FIG. 4. DNs collected from the tails of gene-deficient mice bred by cross-breeding between cloned ES cells and heterozygous species
3 is a photograph showing Southern blot hybridization analysis of A. Hybridization was performed using IL-1α-deficient ES
5 ′ was obtained for each of cell-derived DNA digested with EcoRI (upper panel) and DNA derived from IL-1ra-deficient offspring digested with BamHI (lower panel).
This was performed using a probe.
【図５】 IL-1αのKOマウス（パネルA）、IL-1βのKO
マウス（パネルB）、IL-1raのKOマウス（パネルC）、IL
-1α／βのKOマウス（パネルD）から採取したマクロフ
ァージ由来のRNAを用いたノザンブロット解析の結果を
表す写真である。FIG. 5: KO mouse of IL-1α (panel A), KO of IL-1β
Mouse (Panel B), KO mouse of IL-1ra (Panel C), IL
9 is a photograph showing the results of Northern blot analysis using macrophage-derived RNA collected from -1α / β KO mice (panel D).
【図６】 致死量のLPSを投与した場合のIL-1αのKOマ
ウス（パネルA）、IL-1βのKOマウス（パネルB）および
IL-1raのKOマウス（パネルC）の感受性を示す図であ
る。FIG. 6 shows KO mice of IL-1α (panel A), KO mice of IL-1β (panel B), and a lethal dose of LPS.
FIG. 4 shows the sensitivity of KO mice (panel C) of IL-1ra.
【図７】 IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウスか
ら採取した腹腔マクロファージにおける炎症性サイトカ
インの発現について示す図である。FIG. 7 shows the expression of inflammatory cytokines in peritoneal macrophages collected from IL-1α KO mice and IL-1β KO mice.
【図８】 テレピン油投与後の発熱について示す図であ
る。FIG. 8 is a diagram showing heat generation after administration of turpentine oil.
【図９】 IL-1αのKOマウス、IL-1βのKOマウス、IL-1
raのKOマウスおよびIL-1α／βのKOマウスにおける、テ
レピン油投与後の脳全体におけるIL-1α、IL-1β、COX-
1およびCOX2のmRNAの経時的発現について示す写真であ
る。FIG. 9: KO mouse of IL-1α, KO mouse of IL-1β, IL-1
In the KO mice of ra and KO mice of IL-1α / β, IL-1α, IL-1β, COX-
1 is a photograph showing the time-dependent expression of mRNAs of 1 and COX2.
【図１０】 IL-1αのKOマウス、IL-1βのKOマウス、IL
-1raのKOマウスおよびIL-1α／βのKOマウスにおける、
テレピン油投与後の脳内においてmRNA発現の領域特異性
について示す写真である。このうち、レーン1は大脳皮
質、レーン2は間脳、レーン3は海馬およびレーン4は小
脳における発現を示している。FIG. 10: KO mouse of IL-1α, KO mouse of IL-1β, IL
-1ra KO mouse and IL-1α / β KO mouse,
4 is a photograph showing the region specificity of mRNA expression in the brain after administration of turpentine oil. Among them, lane 1 shows expression in the cerebral cortex, lane 2 shows expression in the diencephalon, lane 3 shows expression in the hippocampus and lane 4 shows expression in the cerebellum.
【図１１】 IL-1α／βのKOマウスにおけるテレピン油
誘導2時間後および8時間後の血清コルチコステロン濃度
を示す図である。FIG. 11 shows serum corticosterone concentrations 2 hours and 8 hours after induction of turpentine oil in IL-1α / β KO mice.
【図１２】 IL-1αのKOマウス（パネルA）、IL-1βのK
Oマウス（パネルB）、IL-1raのKOマウス（パネルC）に
おけるテレピン油誘導8時間後の血清コルチコステロン
濃度を示す図である。FIG. 12: KO mouse of IL-1α (panel A), K of IL-1β
FIG. 9 shows serum corticosterone concentrations 8 hours after turpentine induction in O mice (panel B) and KO mice with IL-1ra (panel C).
【図１３】 L. monocytogenes感染に対する、IL-1α／
βのKOマウス（パネルA）およびIL-1raのKOマウス（パ
ネルB）の脾臓および肝臓における菌数を示す図であ
る。[FIG. 13] IL-1α / L against monocytogenes infection
FIG. 2 shows the numbers of bacteria in the spleen and liver of β KO mice (panel A) and IL-1ra KO mice (panel B).
【図１４】 L. monocytogenes感染後のIL-1α／βのKO
マウス（パネルA）およびIL-1raのKOマウス（パネルB）
の生存率を示す図である。FIG. 14: KO of IL-1α / β after infection with L. monocytogenes
Mouse (Panel A) and IL-1ra KO mouse (Panel B)
FIG.
【図１５】 5〜6ヶ月齢のIL-1raのKOマウスにおけるリ
ンパ組織異常について示す図面であり、巨脾症について
（パネルA）、リンパ節腫脹について（パネルB）、脾臓
細胞のFACS解析について（パネルC）そしてリンパ節細
胞のFACS解析について（パネルD）それぞれ示す図であ
る。FIG. 15 is a drawing showing lymphoid tissue abnormalities in 5- to 6-month-old IL-1ra KO mice, for splenomegaly (panel A), lymphadenopathy (panel B), and FACS analysis of spleen cells. (Panel C) and FACS analysis of lymph node cells (Panel D).
【図１６】 BALB/C背景のIL-1raのKOマウス足関節の組
織学的所見を示す写真である。FIG. 16 is a photograph showing histological findings of an ankle joint of a KO mouse of IL-1ra on a BALB / C background.
【図１７】 BALB/C背景のIL-1raのKOマウス足関節の組
織学的所見を示す写真である。パネルAは、関節腫脹を
起こした後跂の肉眼所見である。パネルBおよびパネルC
は、関節腔内の顕微鏡所見である。FIG. 17 is a photograph showing histological findings of the IL-1ra KO mouse ankle joint on a BALB / C background. Panel A is the gross findings of the shank after joint swelling. Panel B and Panel C
Is a microscopic finding in the joint cavity.
【図１８】 BALB/C背景のIL-1raのKOマウスにおける関
節炎の発生率を示す図である。パネルDおよびEは、関節
腔内の顕微鏡所見である。FIG. 18 shows the incidence of arthritis in KO mice with IL-1ra against BALB / C background. Panels D and E are microscopic findings in the joint cavity.
【図１９】 IL-1ra欠損BALB/CマウスにおけるIgMおよ
びIgG型リウマチ因子産生について示す図である。FIG. 19 shows IgM and IgG-type rheumatoid factor production in IL-1ra-deficient BALB / C mice.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅野 雅秀 東京都品川区大崎１−３−21−205 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (72) Inventor Masahide Asano 1-3-21-205 Osaki, Shinagawa-ku, Tokyo
Claims (17)
ンタゴニスト（IL-1ra）遺伝子のDNA領域の一部または
全部を改変することにより、IL-1ra遺伝子を機能不能に
した非ヒト哺乳動物よりなる、自己免疫疾患モデル動
物。1. A non-human mammal in which the IL-1ra gene is rendered inoperable by modifying a part or all of a DNA region of an interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) gene in a genome. , Autoimmune disease model animals.
部のDNA領域が、外来のIL-1ra遺伝子の対応する領域で
置換されており、その際置換された領域中の一部が改変
されていることにより、ゲノム中のIL-1ra遺伝子が機能
不能にされている、請求項１に記載の疾患モデル動物。2. The DNA region of at least a part of the IL-1ra gene in the genome is replaced with a corresponding region of a foreign IL-1ra gene, and a part of the replaced region is modified. The disease model animal according to claim 1, wherein the IL-1ra gene in the genome has been rendered inoperable by doing so.
は２に記載の疾患モデル動物。3. The disease model animal according to claim 1, wherein the mammal is a mouse.
改変したマウスIL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域である、
請求項３に記載の疾患モデル動物。4. The region corresponding to a foreign IL-1ra gene,
It is a genomic DNA region of the modified mouse IL-1ra gene,
The disease model animal according to claim 3.
が、BALB/cマウス系統の遺伝的背景を有する、請求項３
または４に記載の疾患モデル動物。5. The mouse in which the IL-1ra gene has become inoperable has a genetic background of a BALB / c mouse strain.
Or the disease model animal according to 4.
する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の疾患モデル
動物。6. The disease model animal according to claim 1, wherein the autoimmune disease spontaneously develops by about 13 weeks of age.
ある、請求項６に記載の疾患モデル動物。7. The disease model animal according to claim 6, wherein the autoimmune disease is chronic rheumatoid arthritis.
ることを特徴とする、請求項６または７に記載の疾患モ
デル動物。8. The disease model animal according to claim 6, wherein the blood IgG concentration is increased as compared to a normal animal.
マチ因子）濃度が正常動物に比べて増加する、請求項８
に記載の疾患モデル動物。9. The blood IgG antibody (rheumatic factor) concentration against the Fc portion of IgG is increased as compared to a normal animal.
The disease model animal according to 1.
するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疾患
モデル動物の使用。10. Use of the disease model animal according to any one of claims 1 to 9 for screening a therapeutic agent for an autoimmune disease.
ための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疾患モデ
ル動物の使用。11. Use of the disease model animal according to any one of claims 1 to 9 for screening a therapeutic agent for rheumatism.
クローニングすること； ｂ）IL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域の一部をIL-1ra遺伝
子とは関連しない配列を有するDNAにより置換、または
突然変異を導入することにより改変することを特徴とす
るターゲティングベクターを作製すること； ｃ）胚性幹細胞を前記ターゲティングベクターにより相
同組換えして、IL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域の一部ま
たは全部を改変して、IL-1ra遺伝子を機能不能にしたタ
ーゲティングされた胚性幹細胞を作製すること； ｄ）IL-1ra遺伝子をターゲティングされた前記胚性幹細
胞を胚盤胞内に注入、または8細胞期胚と凝集させるこ
とにより、キメラ動物を作製すること； ｅ）前記キメラ動物のうち、ターゲティングされた胚性
幹細胞が生殖細胞に導入された動物を選択すること；そ
して ｆ）前記選択されたキメラ動物を交配し、IL-1ra遺伝子
を欠損した動物を作製すること；の工程を含む、自己免
疫疾患モデル動物の作製方法。12. a) cloning the genomic DNA region of the IL-1ra gene; b) replacing a part of the genomic DNA region of the IL-1ra gene with DNA having a sequence unrelated to the IL-1ra gene; or Producing a targeting vector characterized by being modified by introducing a mutation; c) homologous recombination of the embryonic stem cells with the targeting vector to partially or entirely the genomic DNA region of the IL-1ra gene. To produce a targeted embryonic stem cell that renders the IL-1ra gene inoperable; d) injecting the IL-1ra gene-targeted embryonic stem cell into a blastocyst, or Producing a chimeric animal by coagulation with a cell stage embryo; e) selecting an animal in which the targeted embryonic stem cells have been introduced into germ cells from among the chimeric animals. ; And f) crossed the selected chimeric animals to produce animals lacking IL-1ra gene; including the step, a manufacturing method of an autoimmune disease model animal.
世代の戻し交配をして、BALB/cの遺伝的背景を有するIL
-1raのKOマウスを作製すること；の工程をさらに含む、
請求項１２に記載の自己免疫疾患モデル動物の作製方
法。G) BALB / c strain mouse and at least 5
Backcrossing generations, IL with a genetic background of BALB / c
Producing a -1ra KO mouse;
A method for producing an autoimmune disease model animal according to claim 12.
が、SEQ ID No:14の配列を有するDNAである、請求項１
２または１３に記載の自己免疫疾患モデル動物の作製方
法。14. The genomic DNA region of the IL-1ra gene is a DNA having the sequence of SEQ ID No. 14.
14. The method for producing an autoimmune disease model animal according to 2 or 13.
ス由来のIL-1ra遺伝子ゲノムDNA領域のうち、エクソン1
のAva I部位からエクソン4のSph I部位までの5.2kbのDN
A領域をIL-1ra遺伝子とは関連しない配列を有するDNAに
より置換することを特徴とする、請求項１２〜１４のい
ずれか１項に記載の自己免疫疾患モデル動物の作製方
法。15. The exon 1 of the mouse-derived genomic DNA region of the IL-1ra gene,
5.2 kb DN from Ava I site to exon 4 Sph I site
The method for producing an autoimmune disease model animal according to any one of claims 12 to 14, wherein the A region is replaced with a DNA having a sequence unrelated to the IL-1ra gene.
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の自己免疫疾患
モデル動物の作製方法。16. The embryonic stem cell is derived from a mouse,
The method for producing an autoimmune disease model animal according to any one of claims 12 to 15.
項１２〜１６のいずれか１項に記載の自己免疫疾患モデ
ル動物の作製方法。17. The method for producing an animal model for an autoimmune disease according to claim 12, wherein the blastocyst is derived from a mouse.
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|---|---|---|---|
| JP11130789A JP2000209980A (en) | 1998-11-20 | 1999-05-12 | Interleukin-1-related disease model knockout animal |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33129198 | 1998-11-20 | ||
| JP10-331291 | 1998-11-20 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP11130789A Pending JP2000209980A (en) | 1998-11-20 | 1999-05-12 | Interleukin-1-related disease model knockout animal |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000209980A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008001498A1 (en) | 2006-06-28 | 2008-01-03 | Genodive Pharma Inc. | Model animal of dendritic cell immunoreceptor gene knockout disease |
| JP2015019617A (en) * | 2013-07-19 | 2015-02-02 | 国立大学法人三重大学 | Non-human mammal as arteriosclerosis obliterans model animal, emaciation research model animal and generalized amyloidosis model animal |
| EA033750B1 (en) * | 2002-09-06 | 2019-11-21 | Amgen Inc | Isolated nucleic acid molecule encoding a human antibody to interleukin-1 receptor and use thereof |
| CN113853433A (en) * | 2019-05-27 | 2021-12-28 | 转基因股份有限公司 | Exon humanized mouse |
-
1999
- 1999-05-12 JP JP11130789A patent/JP2000209980A/en active Pending
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|---|---|---|---|---|
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